CN109295078B - 吡喃糖氧化酶基因及制备、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及应用 - Google Patents

吡喃糖氧化酶基因及制备、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种吡喃糖氧化酶基因、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及应用。本发明主要利用密码子优化软件对吡喃糖氧化酶的密码子进行优化，使其均成为毕赤酵母偏爱密码子，然后利用基因合成的手段合成目的基因；转化至毕赤酵母实现目的蛋白的高效表达，利用本发明制备的重组毕赤酵母具有发酵酶活高，为吡喃糖氧化酶的应用奠定了良好的基础，有效避免了在大肠杆菌中表达产生的弊端，开辟了一条全新的吡喃糖氧化酶的工业化高效生产途径等优点。

Description

吡喃糖氧化酶基因及制备、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及 应用
技术领域
本发明属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种吡喃糖氧化酶基因及制备、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及应用。
背景技术
吡喃糖氧化酶(pyranose/oxygen 2-oxidase，P2O；EC 1.1.3.10)属于葡萄糖-甲醇-胆碱(glucose-methanol-choline，GMC)氧化还原酶家族，是一种以FAD为辅基的黄素蛋白酶。它可以催化葡萄糖等几种吡喃糖的C-2位发生氧化生成相应的2-酮糖，并将O2还原成H2O2。
由于P2O可以催化多种糖类生成相应的酮糖，所以P2O在糖化学方面有重要的应用价值。一些常见糖类经P2O转化，可以为多种稀有糖类、精细化学品和药物的生产提供大量中间体。P2O还可以应用于分析检测，制作诊断试剂盒和生物传感器。比如，P2O可以用于定量测定血糖浓度和制作葡萄糖生物传感器。在临床化学中，P2O可以用于检测糖尿病人血糖控制的重要指标1,5-脱水-D-葡糖醇。
以工程菌株异源表达蛋白具有较多优势。工程菌一般遗传背景清楚，培养条件成熟，生长速率较快，蛋白表达调控较易操作。目前使用较多的异源表达有原核和真核表达系统，利用大肠杆菌作为异源表达宿主时，要进行细胞破碎、离心，且经常会遇到包涵体问题，包涵体变性过程容易，而复性却比较复杂，操作不方便。而酵母表达系统作为一种真核表达系统，与原核表达系统相比，具有很多优势，如可以分泌表达、能够对外源蛋白进行翻译后的加工修饰、表达量高等。省去了超声破壁和纯化的步骤，且不会产生包涵体，更容易进行工业生产。
申请人经查阅文献发现，截至目前吡喃糖氧化酶基因的克隆与表达仅在大肠杆菌中进行并成功实现，如湖南大学的张可可等曾利用大肠杆菌作为宿主菌表达吡喃糖氧化酶，虽能检测到活性，但表达量极低。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种吡喃糖氧化酶基因及其制备方法。
本发明的目的之二在于提供一种利用吡喃糖氧化酶基因构建的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.16552。
本发明的目的之三在于提供巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.16552在制备吡喃糖氧化酶中的应用。
本发明的整体技术构思是：
吡喃糖氧化酶基因，其基因序列为：
GAATTCATGTCTACTTCCTCCTCCGATCCATTCTTCAACTTTACCAAGTCCTCCTTCAGATCCGCTGCTGCTCAAAAGGCTTCTGCTACTTCTTTGCCACCATTGCCAGGTCCAGACAAGAAAGTTCCAGGTATGGACATCAAGTACGACGTGGTTATCGTTGGTTCCGGTCCAATCGGTTGTACTTACGCTAGAGAATTGGTTGAGGCCGGTTACAAGGTTGCCATGTTCGACATTGGTGAGATCGACTCCGGTTTGAAGATTGGTGCTCACAAGAAGAACACCGTCGAGTACCAGAAGAACATCGACAAGTTCGTCAACGTCATCCAGGGTCAGTTGATGTCTGTTTCCGTTCCAGTTAACACCCTGGTCATCGATACTTTGTCTCCAACTTCTTGGCAGGCCTCCTCATTCTTCGTTAGGAACGGTTCTAACCCAGAGCAGGACCCATTGAGAAACTTGTCTGGTCAGGCTGTTACCAGAGTTGTTGGTGGTATGTCTACTCACTGGACTTGTGCTACTCCAAGATTCGACAGAGAGCAAAGACCATTGCTGGTTAAGGATGACACTGATGCTGATGACGCTGAATGGGACAGACTGTACACTAAGGCTGAGTCCTACTTCAAGACTGGTACTGACCAGTTCAAAGAGTCCATCAGACACAACCTGGTCTTGAACAAGTTGGCCGAAGAGTACAAGGGTCAGAGAGACTTCCAACAGATTCCATTGGCTGCCACTAGAAGATCCCCAACTTTTGTTGAATGGTCCTCCGCCAACACCGTTTTCGACTTGCAAAACAGACCAAACACTGACGCTCCAAACGAGAGATTCAACTTGTTTCCAGCTGTTGCCTGTGAGAGAGTCGTTAGAAACACTTCCAACTCCGAGATCGAGTCCTTGCACATTCACGACTTGATTTCCGGTGACAGATTCGAGATCAAGGCCGACGTTTTCGTTTTGACTGCTGGTGCTGTTCACAACGCTCAGCTGTTGGTTAACTCTGGTTTCGGTCAATTGGGTAGACCAGATCCAGCTAACCCACCAAGATTGCTTCCATCTTTGGGTTCCTACATCACCGAGCAGTCCTTGGTTTTCTGTCAGACTGTTATGTCCACCGAGCTGATTGACTCTGTCAAGTCCGACATGATCATCAGAGGTAACCCAGGTGATCCAGGTTACTCCGTTACTTACACTCCAGGTGCCTCCACTAACAAGCACCCAGATTGGTGGAACGAGAAGGTCAAGAACCACATGATGCAACACCAAGAGGACCCACTGCCAATTCCATTCGAAGATCCAGAGCCACAGGTTACCACTTTGTTTCAACCATCTCACCCATGGCACACCCAGATCCATAGAGATGCTTTTTCTTACGGTGCCGTCCAGCAATCCATTGACTCCAGATTGATCGTTGACTGGCGTTTCTTCGGTAGAACCGAGCCAAAAGAAGAGAACAAGCTTTGGTTCTCCGACAAGATCACCGACACCTACAACATGCCACAACCTACCTTCGACTTCAGATTCCCAGCTGGTAGAACTTCCAAAGAGGCTGAGGATATGATGACCGACATGTGTGTTATGTCTGCCAAGATCGGTGGTTTCTTGCCAGGTTCTTTGCCCCAATTCATGGAACCAGGTTTGGTCTTGCACCTTGGTGGTACTCACAGAATGGGTTTCGATGAGCAAGAGGACAAGTGTTGTGTCAACACCGACTCCAGAGTGTTCGGTTTCAAGAACTTGTTCCTTGGTGGCTGCGGTAACATCCCAACTGCTTATGGTGCTAACCCAACTTTGACTGCCATGTCCTTGGCTATCAAGTCCTGCGAGTACATCAAGAACAACTTCACCCCATCTCCATTCACTGACCAGGCTCAGCACCATCACCATCACCATTAAGCGGCCGC。
吡喃糖氧化酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：
以美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)登录号为XM_008046051.1的变色栓菌pyranose2-oxidase基因为基础，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因的密码子进行优化，利用网址为www.jcat.de的密码子优化软件分析，发现蛋白酶基因中有多处是毕赤酵母的稀有密码子，利用网址为www.jcat.de的密码子优化软件对蛋白酶基因进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的前提下，获得优化后的蛋白酶的基因序列，在序列的5’端加上EcoRⅠ限制酶切位点，EcoRⅠ限制酶切位点为GAATTC；3’端加上六个组氨酸标签后再加上NotⅠ限制酶切位点，NotⅠ限制酶切位点为GCGGCCGC，将优化构建的基因序列合成，合成的基因连接到pPIC9K表达载体上，得到重组表达质粒pPIC9K-P2O；重组表达质粒pPIC9K-P2O经EcoRⅠ-NotⅠ双酶切得到9kb和1.9kb左右的条带，分别为载体片段和优化后目的基因片段，说明该重组表达载体构建成功。
利用吡喃糖氧化酶基因构建的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCCNo.16552。
巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.16552在制备吡喃糖氧化酶中的应用。
本发明主要利用密码子优化软件对吡喃糖氧化酶的密码子进行优化，使其均成为毕赤酵母偏爱密码子，然后利用基因合成的手段合成目的基因；转化至毕赤酵母实现目的蛋白的高效表达。
本发明中的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris申请人已于2018年9月29日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.16552，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。
本发明的具体技术构思还有：
利用吡喃糖氧化酶基因所构建的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCCNo.16552表达的蛋白，其氨基酸序列为：
EFMSTSSSDPFFNFTKSSFRSAAAQKASATSLPPLPGPDKKVPGMDIKYDVVIVGSGPIGCTYARELVEAGYKVAMFDIGEIDSGLKIGAHKKNTVEYQKNIDKFVNVIQGQLMSVSVPVNTLVIDTLSPTSWQASSFFVRNGSNPEQDPLRNLSGQAVTRVVGGMSTHWTCATPRFDREQRPLLVKDDTDADDAEWDRLYTKAESYFKTGTDQFKESIRHNLVLNKLAEEYKGQRDFQQIPLAATRRSPTFVEWSSANTVFDLQNRPNTDAPNERFNLFPAVACERVVRNTSNSEIESLHIHDLISGDRFEIKADVFVLTAGAVHNAQLLVNSGFGQLGRPDPANPPRLLPSLGSYITEQSLVFCQTVMSTELIDSVKSDMIIRGNPGDPGYSVTYTPGASTNKHPDWWNEKVKNHMMQHQEDPLPIPFEDPEPQVTTLFQPSHPWHTQIHRDAFSYGAVQQSIDSRLIVDWRFFGRTEPKEENKLWFSDKITDTYNMPQPTFDFRFPAGRTSKEAEDMMTDMCVMSAKIGGFLPGSLPQFMEPGLVLHLGGTHRMGFDEQEDKCCVNTDSRVFGFKNLFLGGCGNIPTAYGANPTLTAMSLAIKSCEYIKNNFTPSPFTDQAQHHHHHH*AA。
巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.16552在制备吡喃糖氧化酶中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将转化子挑取单菌落接种到5ml含100μg/mLG418的YPCS液体培养基的试管中，在温度为30℃、转速为200转/分的条件下振荡培养3天，培养期间每隔24小时按照体积比添加1％的甲醇进行诱导，12000转/分离心，收集上清液，测定吡喃糖氧化酶的活力，筛选出高酶活重组菌株；
B、挑取单克隆接种于5ml的YPD液体培养基培养10小时，按3％接种量转接于150mL的BMGY培养基至OD600≈6接种于发酵罐中，10L发酵罐的装液量为5.4L的BSM培养基，灭菌后以10％发酵体积接种，以浓氨水控制pH＝5.0，培养温度为30℃，培养阶段甘油耗尽时，开始流加50％甘油4h后至OD600≈180，停止流加甘油，待培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇诱导，甲醇溶液的体积百分浓度为1％，期间每隔24h加维生素C水溶液至终浓度80μg/L，每12h取样测定发酵液酶活，当酶活不再升高时停止发酵。
测定吡喃糖氧化酶的活力的方法如下：
反应体系包括终浓度100μM的D-葡萄糖溶液，1μM的ABTS溶液，2U辣根过氧化物酶，50mM、pH＝6.5的磷酸钾缓冲液，具体如下：
在反应总体积为1ml的反应体系中，依次添加浓度为50mM、pH＝6.5的磷酸钾缓冲液580μl，浓度为0.01M的ABTS溶液100μl，浓度为1M的D-葡萄糖溶液100μl，浓度为100U/ml的辣根过氧化物酶储液20μl，添加200μl酶液启动反应，测定该反应在吸收波长为420nm处三分钟之内的连续变化；
计算公式：
酶活(U/ml)＝△A×1×稀释倍数D/43.2×0.2×3min。
本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于：
利用本发明合成的基因P2O，转化毕赤酵母GS115获得基因工程菌,发酵酶活显著提高，为吡喃糖氧化酶的应用奠定了良好的基础。在为吡喃糖氧化酶在真核表达系统中的表达提供了试验及应用的依据的同时，有效避免了在大肠杆菌中表达产生的弊端，开辟了一条全新的吡喃糖氧化酶的工业化高效生产途径。
附图说明
本发明的附图有：
图1是本发明中的吡喃糖氧化酶基因基因及利用其构建的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris CGMCC No.16552所表达的蛋白序列表。
图2是本发明中重组质粒pPIC9K-P2O酶切验证示意图。
图2中M：1Kb DNA Marker；Lane 1:Plasmid Digested with EcoRⅠ-Not Ⅰ；Lane2：Plasmid。
由图2中可知，重组表达质粒pPIC9K-P2O经EcoRⅠ-NotⅠ双酶切得到9kb和1.9kb左右的条带，分别为载体片段和优化后目的基因片段，说明该重组表达载体构建成功。
图3是重组酶的表达及SDS-PAGE检测结果。
图3中M代表Protein Marker，泳道1和2为诱导后蛋白，泳道3为诱导前空白。
Protein Marker分子量从大到小依次为200kDa，150kDa，120kDa，100kDa，85kDa，70kDa，60kDa，50kDa，40kDa，30kDa，25kDa，20kDa，15kDa，10kDa。
由图3中可知，经SDS-PAGE检测目的蛋白分子量在85-100kD之间。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作进一步描述，但不作为对本发明的限定。本发明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均不脱离本发明的保护范畴。本发明实施例中未注明具体条件的方法，均按照本领域常用的技术手段或厂商所建议的条件进行。
实施例
1、吡喃糖氧化酶基因，其基因序列为：
GAATTCATGTCTACTTCCTCCTCCGATCCATTCTTCAACTTTACCAAGTCCTCCTTCAGATCCGCTGCTGCTCAAAAGGCTTCTGCTACTTCTTTGCCACCATTGCCAGGTCCAGACAAGAAAGTTCCAGGTATGGACATCAAGTACGACGTGGTTATCGTTGGTTCCGGTCCAATCGGTTGTACTTACGCTAGAGAATTGGTTGAGGCCGGTTACAAGGTTGCCATGTTCGACATTGGTGAGATCGACTCCGGTTTGAAGATTGGTGCTCACAAGAAGAACACCGTCGAGTACCAGAAGAACATCGACAAGTTCGTCAACGTCATCCAGGGTCAGTTGATGTCTGTTTCCGTTCCAGTTAACACCCTGGTCATCGATACTTTGTCTCCAACTTCTTGGCAGGCCTCCTCATTCTTCGTTAGGAACGGTTCTAACCCAGAGCAGGACCCATTGAGAAACTTGTCTGGTCAGGCTGTTACCAGAGTTGTTGGTGGTATGTCTACTCACTGGACTTGTGCTACTCCAAGATTCGACAGAGAGCAAAGACCATTGCTGGTTAAGGATGACACTGATGCTGATGACGCTGAATGGGACAGACTGTACACTAAGGCTGAGTCCTACTTCAAGACTGGTACTGACCAGTTCAAAGAGTCCATCAGACACAACCTGGTCTTGAACAAGTTGGCCGAAGAGTACAAGGGTCAGAGAGACTTCCAACAGATTCCATTGGCTGCCACTAGAAGATCCCCAACTTTTGTTGAATGGTCCTCCGCCAACACCGTTTTCGACTTGCAAAACAGACCAAACACTGACGCTCCAAACGAGAGATTCAACTTGTTTCCAGCTGTTGCCTGTGAGAGAGTCGTTAGAAACACTTCCAACTCCGAGATCGAGTCCTTGCACATTCACGACTTGATTTCCGGTGACAGATTCGAGATCAAGGCCGACGTTTTCGTTTTGACTGCTGGTGCTGTTCACAACGCTCAGCTGTTGGTTAACTCTGGTTTCGGTCAATTGGGTAGACCAGATCCAGCTAACCCACCAAGATTGCTTCCATCTTTGGGTTCCTACATCACCGAGCAGTCCTTGGTTTTCTGTCAGACTGTTATGTCCACCGAGCTGATTGACTCTGTCAAGTCCGACATGATCATCAGAGGTAACCCAGGTGATCCAGGTTACTCCGTTACTTACACTCCAGGTGCCTCCACTAACAAGCACCCAGATTGGTGGAACGAGAAGGTCAAGAACCACATGATGCAACACCAAGAGGACCCACTGCCAATTCCATTCGAAGATCCAGAGCCACAGGTTACCACTTTGTTTCAACCATCTCACCCATGGCACACCCAGATCCATAGAGATGCTTTTTCTTACGGTGCCGTCCAGCAATCCATTGACTCCAGATTGATCGTTGACTGGCGTTTCTTCGGTAGAACCGAGCCAAAAGAAGAGAACAAGCTTTGGTTCTCCGACAAGATCACCGACACCTACAACATGCCACAACCTACCTTCGACTTCAGATTCCCAGCTGGTAGAACTTCCAAAGAGGCTGAGGATATGATGACCGACATGTGTGTTATGTCTGCCAAGATCGGTGGTTTCTTGCCAGGTTCTTTGCCCCAATTCATGGAACCAGGTTTGGTCTTGCACCTTGGTGGTACTCACAGAATGGGTTTCGATGAGCAAGAGGACAAGTGTTGTGTCAACACCGACTCCAGAGTGTTCGGTTTCAAGAACTTGTTCCTTGGTGGCTGCGGTAACATCCCAACTGCTTATGGTGCTAACCCAACTTTGACTGCCATGTCCTTGGCTATCAAGTCCTGCGAGTACATCAAGAACAACTTCACCCCATCTCCATTCACTGACCAGGCTCAGCACCATCACCATCACCATTAAGCGGCCGC。
2、吡喃糖氧化酶基因的制备方法，包括如下工艺步骤：
以美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)登录号为XM_008046051.1的变色栓菌pyranose2-oxidase基因为基础，根据毕赤酵母的密码子偏爱性对该基因的密码子进行优化，利用网址为www.jcat.de的密码子优化软件分析，发现蛋白酶基因中有多处是毕赤酵母的稀有密码子，利用网址为www.jcat.de的密码子优化软件对蛋白酶基因进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的前提下，获得优化后的蛋白酶的基因序列，在序列的5’端加上EcoRⅠ限制酶切位点，EcoRⅠ限制酶切位点为GAATTC；3’端加上六个组氨酸标签后再加上NotⅠ限制酶切位点，NotⅠ限制酶切位点为GCGGCCGC，将优化构建的基因序列合成，合成的基因连接到pPIC9K表达载体上，得到重组表达质粒pPIC9K-P2O；重组表达质粒pPIC9K-P2O经EcoRⅠ-NotⅠ双酶切得到9kb和1.9kb左右的条带，分别为载体片段和优化后目的基因片段，说明该重组表达载体构建成功。
3、重组菌株的构建
将构建好的重组表达载体利用SacⅠ进行线性化酶切，回收酶切产物并纯化。取纯化产物8μL一并加入毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯，选好电击程序(1.5kv，3-5ms)，电击结束后立即加入1mlYPDS液体培养基，混匀后转到无菌离心管中，30℃静置培养2-6h，5000rpm离心2min，弃上清，用1ml过滤除菌的饱和生理盐水洗3次，取200μl涂布于YPDS平板(含100μg/mL G418)上，静置培养3d后获得转化子。
利用吡喃糖氧化酶基因转化的重组毕赤酵母产吡喃糖氧化酶的菌株GS115/pPIC9K-P2O-4，其保藏编号为CGMCC No.16552。
利用吡喃糖氧化酶基因所构建的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCCNo.16552表达的蛋白，其氨基酸序列为：
EFMSTSSSDPFFNFTKSSFRSAAAQKASATSLPPLPGPDKKVPGMDIKYDVVIVGSGPIGCTYARELVEAGYKVAMFDIGEIDSGLKIGAHKKNTVEYQKNIDKFVNVIQGQLMSVSVPVNTLVIDTLSPTSWQASSFFVRNGSNPEQDPLRNLSGQAVTRVVGGMSTHWTCATPRFDREQRPLLVKDDTDADDAEWDRLYTKAESYFKTGTDQFKESIRHNLVLNKLAEEYKGQRDFQQIPLAATRRSPTFVEWSSANTVFDLQNRPNTDAPNERFNLFPAVACERVVRNTSNSEIESLHIHDLISGDRFEIKADVFVLTAGAVHNAQLLVNSGFGQLGRPDPANPPRLLPSLGSYITEQSLVFCQTVMSTELIDSVKSDMIIRGNPGDPGYSVTYTPGASTNKHPDWWNEKVKNHMMQHQEDPLPIPFEDPEPQVTTLFQPSHPWHTQIHRDAFSYGAVQQSIDSRLIVDWRFFGRTEPKEENKLWFSDKITDTYNMPQPTFDFRFPAGRTSKEAEDMMTDMCVMSAKIGGFLPGSLPQFMEPGLVLHLGGTHRMGFDEQEDKCCVNTDSRVFGFKNLFLGGCGNIPTAYGANPTLTAMSLAIKSCEYIKNNFTPSPFTDQAQHHHHHH*AA。
4、重组毕赤酵母产吡喃糖氧化酶的菌株GS115/pPIC9K-P2O-4在制备吡喃糖氧化酶中的应用，包括如下工艺步骤：
A、将转化子挑取单菌落接种到5ml含100μg/mLG418的YPCS液体培养基的试管中，在温度为30℃、转速为200转/分的条件下振荡培养3天，培养期间每隔24小时按照体积比添加1％的甲醇进行诱导，12000转/分离心，收集上清液，测定吡喃糖氧化酶的活力，筛选出高酶活重组菌株；
B、挑取单克隆接种于5ml的YPD液体培养基培养10小时，按3％接种量转接于150mL的BMGY培养基至OD600≈6接种于发酵罐中，10L发酵罐的装液量为5.4L的BSM培养基，灭菌后，以10％发酵体积接种，以浓氨水控制pH＝5.0，培养温度＝30℃，培养阶段甘油耗尽时，开始流加50％甘油4h后至OD600≈180，停止流加甘油，待培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇诱导，甲醇溶液的体积百分浓度为1％，期间每隔24h加维生素C水溶液至终浓度80μg/L，每12h取样测定发酵液酶活，当酶活不再升高时停止发酵。
测定吡喃糖氧化酶的活力的方法如下：
反应体系包括终浓度100μM的D-葡萄糖溶液，1μM的ABTS溶液，2U辣根过氧化物酶，50mM、pH＝6.5的磷酸钾缓冲液，具体如下：
在反应总体积为1ml的反应体系中，依次添加浓度为50mM、pH＝6.5的磷酸钾缓冲液580μl，浓度为0.01M的ABTS溶液100μl，浓度为1M的D-葡萄糖溶液100μl，浓度为100U/ml的辣根过氧化物酶储液20μl，添加200μl酶液启动反应，测定该反应在吸收波长为420nm处三分钟之内的连续变化；
计算公式：
酶活(U/ml)＝△A×1×稀释倍数D/43.2×0.2×3min。
申请人采用上述方法对本实施例中制备的的吡喃糖氧化酶酶活进行测定，其酶活为198U/ml。
序列表
<110> 河北省微生物研究所
<120> 吡喃糖氧化酶基因及制备、利用其构建的巴斯德毕赤酵母及应用
<130> none
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1904
<212> DNA
<213> An artificial sequence
<400> 1
gaattcatgt ctacttcctc ctccgatcca ttcttcaact ttaccaagtc ctccttcaga 60
tccgctgctg ctcaaaaggc ttctgctact tctttgccac cattgccagg tccagacaag 120
aaagttccag gtatggacat caagtacgac gtggttatcg ttggttccgg tccaatcggt 180
tgtacttacg ctagagaatt ggttgaggcc ggttacaagg ttgccatgtt cgacattggt 240
gagatcgact ccggtttgaa gattggtgct cacaagaaga acaccgtcga gtaccagaag 300
aacatcgaca agttcgtcaa cgtcatccag ggtcagttga tgtctgtttc cgttccagtt 360
aacaccctgg tcatcgatac tttgtctcca acttcttggc aggcctcctc attcttcgtt 420
aggaacggtt ctaacccaga gcaggaccca ttgagaaact tgtctggtca ggctgttacc 480
agagttgttg gtggtatgtc tactcactgg acttgtgcta ctccaagatt cgacagagag 540
caaagaccat tgctggttaa ggatgacact gatgctgatg acgctgaatg ggacagactg 600
tacactaagg ctgagtccta cttcaagact ggtactgacc agttcaaaga gtccatcaga 660
cacaacctgg tcttgaacaa gttggccgaa gagtacaagg gtcagagaga cttccaacag 720
attccattgg ctgccactag aagatcccca acttttgttg aatggtcctc cgccaacacc 780
gttttcgact tgcaaaacag accaaacact gacgctccaa acgagagatt caacttgttt 840
ccagctgttg cctgtgagag agtcgttaga aacacttcca actccgagat cgagtccttg 900
cacattcacg acttgatttc cggtgacaga ttcgagatca aggccgacgt tttcgttttg 960
actgctggtg ctgttcacaa cgctcagctg ttggttaact ctggtttcgg tcaattgggt 1020
agaccagatc cagctaaccc accaagattg cttccatctt tgggttccta catcaccgag 1080
cagtccttgg ttttctgtca gactgttatg tccaccgagc tgattgactc tgtcaagtcc 1140
gacatgatca tcagaggtaa cccaggtgat ccaggttact ccgttactta cactccaggt 1200
gcctccacta acaagcaccc agattggtgg aacgagaagg tcaagaacca catgatgcaa 1260
caccaagagg acccactgcc aattccattc gaagatccag agccacaggt taccactttg 1320
tttcaaccat ctcacccatg gcacacccag atccatagag atgctttttc ttacggtgcc 1380
gtccagcaat ccattgactc cagattgatc gttgactggc gtttcttcgg tagaaccgag 1440
ccaaaagaag agaacaagct ttggttctcc gacaagatca ccgacaccta caacatgcca 1500
caacctacct tcgacttcag attcccagct ggtagaactt ccaaagaggc tgaggatatg 1560
atgaccgaca tgtgtgttat gtctgccaag atcggtggtt tcttgccagg ttctttgccc 1620
caattcatgg aaccaggttt ggtcttgcac cttggtggta ctcacagaat gggtttcgat 1680
gagcaagagg acaagtgttg tgtcaacacc gactccagag tgttcggttt caagaacttg 1740
ttccttggtg gctgcggtaa catcccaact gcttatggtg ctaacccaac tttgactgcc 1800
atgtccttgg ctatcaagtc ctgcgagtac atcaagaaca acttcacccc atctccattc 1860
actgaccagg ctcagcacca tcaccatcac cattaagcgg ccgc 1904
<210> 2
<211> 633
<212> PRT
<213> An artificial sequence
<400> 2
Glu Phe Met Ser Thr Ser Ser Ser Asp Pro Phe Phe Asn Phe Thr Lys
1 5 10 15
Ser Ser Phe Arg Ser Ala Ala Ala Gln Lys Ala Ser Ala Thr Ser Leu
20 25 30
Pro Pro Leu Pro Gly Pro Asp Lys Lys Val Pro Gly Met Asp Ile Lys
35 40 45
Tyr Asp Val Val Ile Val Gly Ser Gly Pro Ile Gly Cys Thr Tyr Ala
50 55 60
Arg Glu Leu Val Glu Ala Gly Tyr Lys Val Ala Met Phe Asp Ile Gly
65 70 75 80
Glu Ile Asp Ser Gly Leu Lys Ile Gly Ala His Lys Lys Asn Thr Val
85 90 95
Glu Tyr Gln Lys Asn Ile Asp Lys Phe Val Asn Val Ile Gln Gly Gln
100 105 110
Leu Met Ser Val Ser Val Pro Val Asn Thr Leu Val Ile Asp Thr Leu
115 120 125
Ser Pro Thr Ser Trp Gln Ala Ser Ser Phe Phe Val Arg Asn Gly Ser
130 135 140
Asn Pro Glu Gln Asp Pro Leu Arg Asn Leu Ser Gly Gln Ala Val Thr
145 150 155 160
Arg Val Val Gly Gly Met Ser Thr His Trp Thr Cys Ala Thr Pro Arg
165 170 175
Phe Asp Arg Glu Gln Arg Pro Leu Leu Val Lys Asp Asp Thr Asp Ala
180 185 190
Asp Asp Ala Glu Trp Asp Arg Leu Tyr Thr Lys Ala Glu Ser Tyr Phe
195 200 205
Lys Thr Gly Thr Asp Gln Phe Lys Glu Ser Ile Arg His Asn Leu Val
210 215 220
Leu Asn Lys Leu Ala Glu Glu Tyr Lys Gly Gln Arg Asp Phe Gln Gln
225 230 235 240
Ile Pro Leu Ala Ala Thr Arg Arg Ser Pro Thr Phe Val Glu Trp Ser
245 250 255
Ser Ala Asn Thr Val Phe Asp Leu Gln Asn Arg Pro Asn Thr Asp Ala
260 265 270
Pro Asn Glu Arg Phe Asn Leu Phe Pro Ala Val Ala Cys Glu Arg Val
275 280 285
Val Arg Asn Thr Ser Asn Ser Glu Ile Glu Ser Leu His Ile His Asp
290 295 300
Leu Ile Ser Gly Asp Arg Phe Glu Ile Lys Ala Asp Val Phe Val Leu
305 310 315 320
Thr Ala Gly Ala Val His Asn Ala Gln Leu Leu Val Asn Ser Gly Phe
325 330 335
Gly Gln Leu Gly Arg Pro Asp Pro Ala Asn Pro Pro Arg Leu Leu Pro
340 345 350
Ser Leu Gly Ser Tyr Ile Thr Glu Gln Ser Leu Val Phe Cys Gln Thr
355 360 365
Val Met Ser Thr Glu Leu Ile Asp Ser Val Lys Ser Asp Met Ile Ile
370 375 380
Arg Gly Asn Pro Gly Asp Pro Gly Tyr Ser Val Thr Tyr Thr Pro Gly
385 390 395 400
Ala Ser Thr Asn Lys His Pro Asp Trp Trp Asn Glu Lys Val Lys Asn
405 410 415
His Met Met Gln His Gln Glu Asp Pro Leu Pro Ile Pro Phe Glu Asp
420 425 430
Pro Glu Pro Gln Val Thr Thr Leu Phe Gln Pro Ser His Pro Trp His
435 440 445
Thr Gln Ile His Arg Asp Ala Phe Ser Tyr Gly Ala Val Gln Gln Ser
450 455 460
Ile Asp Ser Arg Leu Ile Val Asp Trp Arg Phe Phe Gly Arg Thr Glu
465 470 475 480
Pro Lys Glu Glu Asn Lys Leu Trp Phe Ser Asp Lys Ile Thr Asp Thr
485 490 495
Tyr Asn Met Pro Gln Pro Thr Phe Asp Phe Arg Phe Pro Ala Gly Arg
500 505 510
Thr Ser Lys Glu Ala Glu Asp Met Met Thr Asp Met Cys Val Met Ser
515 520 525
Ala Lys Ile Gly Gly Phe Leu Pro Gly Ser Leu Pro Gln Phe Met Glu
530 535 540
Pro Gly Leu Val Leu His Leu Gly Gly Thr His Arg Met Gly Phe Asp
545 550 555 560
Glu Gln Glu Asp Lys Cys Cys Val Asn Thr Asp Ser Arg Val Phe Gly
565 570 575
Phe Lys Asn Leu Phe Leu Gly Gly Cys Gly Asn Ile Pro Thr Ala Tyr
580 585 590
Gly Ala Asn Pro Thr Leu Thr Ala Met Ser Leu Ala Ile Lys Ser Cys
595 600 605
Glu Tyr Ile Lys Asn Asn Phe Thr Pro Ser Pro Phe Thr Asp Gln Ala
610 615 620
Gln His His His His His His Ala Ala
625 630

Claims (2)

1.利用吡喃糖氧化酶基因构建的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，其特征在于其保藏编号为CGMCC No.16552。
2.根据权利要求1所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris CGMCC No.16552在制备吡喃糖氧化酶中的应用。
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Citations (2)

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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102517304A (zh) * 2011-12-16 2012-06-27 中国农业科学院生物技术研究所 重组葡萄糖氧化酶的优化基因及其表达载体和应用
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"Trametes versicolor FP-101664 SS1 pyranose 2-oxidase partial mRNA，NCBI Reference Sequence: XM_008046051.1;Floudas,D等;《GenBank》;20140521;全文 *
Floudas,D等."Trametes versicolor FP-101664 SS1 pyranose 2-oxidase partial mRNA，NCBI Reference Sequence: XM_008046051.1.《GenBank》.2014, *

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