CN114457056A

CN114457056A - 一种盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用

Info

Publication number: CN114457056A
Application number: CN202210085888.8A
Authority: CN
Inventors: 韩双艳; 张亚萍; 赵风光; 林影; 郑穗平
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2022-01-25
Filing date: 2022-01-25
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-01-25
Also published as: CN114457056B

Abstract

本发明公开一种盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用，属于基因工程和谷物科学领域。本发明采用真核表达的方法，获得了具有生物活性的重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。本发明提供了一种单独添加盐乳芽孢杆菌木聚糖酶改善面粉加工品质的方法，直接添加盐乳芽孢杆菌木聚糖酶能改善面团的微观结构，显著增加全麦面包的比容，降低全麦面包的硬度和咀嚼性，提高全麦面包的品质，是一种潜在的面粉改良剂。

Description

一种盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用

技术领域

本发明属于基因工程和谷物科学领域，具体涉及一种毕赤酵母重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶及其制备方法，以及毕赤酵母重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用。

背景技术

面制品是中国北方地区的传统主食，由于小麦的品种以及地理因素的限制，在制作面制品时，往往需要面粉改良剂的辅助。传统的化学添加剂，如溴酸钾，偶氮甲酰胺等由于存在安全隐患，已经被禁止在面粉中使用。寻找和开发天然无害的面粉改良酶制剂正逐渐进入人们的视野。

木聚糖是植物细胞中半纤维素的主要成分，在小麦面粉中约含有2％～3％的阿拉伯木聚糖，其中水溶性的阿拉伯木聚糖酶约占25～30％，水不溶性阿拉伯木糖约占70～75％，水溶性的阿拉伯木聚糖对面包品质有积极影响，而水不溶性阿拉伯木糖却会产生负作用。

木聚糖酶在面包制作中具有潜在有效性，有些木聚糖酶能够特异性水解这些水不溶性阿拉伯木糖，进而提高面制品的加工品质。盐乳芽孢杆菌木聚糖酶是一种潜在的面粉改良酶制剂，目前对于该酶的研究，主要集中于基因鉴定和生物信息学方面，对于其在改善面制品加工品质上的研究尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用，特别是单独添加以盐乳芽孢杆菌木聚糖酶为主的酶制剂在改善面粉加工品质中的应用。

具体的，盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面团及面包品质中的应用。

单独添加盐乳芽孢杆菌木聚糖酶即能达到改善面包烘焙品质的目的。

所述的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在面粉中的添加水平为3ppm～12ppm(面粉基)，进一步为3ppm～6ppm(面粉基)，可以提高面包的比容，降低面包的硬度和咀嚼性。

所述的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了编码盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

优选的，将盐乳芽孢杆菌木聚糖酶、面粉、糖、盐、植物油、酵母粉和水搅拌均匀，形成的面团经分割称重、成形以及醒发后，焙烤得到面包成品；

进一步的，所述各组分添加量为：面粉90～110重量份，酵母粉0.6～1.8重量份，盐1～3重量份，水50～70重量份，糖5～10重量份，植物油2～5重量份。

所述的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶可以通过对转化有真核重组表达载体的毕赤酵母进行发酵获得。

所述的真核重组表达载体为包含盐乳芽孢杆菌木聚糖酶基因的真核重组表达载体。

优选的，所述的真核重组表达载体的出发载体包括但不限于pPICZαA；

优选的，所述的毕赤酵母包括但不限于毕赤酵母X33。

所述的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的毕赤酵母重组表达方法，包括如下步骤：

(1)利用全基因合成的方法获得了密码子优化的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶基因(序列如SEQ ID NO.2所示)，将其与真核表达载体连接，将获得的真核重组表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞中，获得重组表达菌；

所述的真核表达载体包括但不限于pPICZαA，所述的毕赤酵母包括但不限于毕赤酵母X33。

(2)将步骤(1)构建的重组表达菌接种至BMGY液体培养集中，过夜振荡培养；常温离心，收集菌体沉淀；将菌体沉淀转接至BMMY液体培养集中，转接后的菌液OD₆₀₀为0.5～1.0；继续培养，期间每隔24h向培养基中添加甲醇至0.5％～2.0％v/v，固液分离后，收集发酵上清液；

(3)收集步骤(2)的发酵上清液，利用Ni-NTA柱层析，获得纯化的重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶蛋白。

所述的BMGY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L。

所述的BMMY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、甲醇10mL/L。

步骤(2)中，

所述的过夜振荡培养为25～35℃，150～250rpm条件下过夜振荡培养；进一步为30℃，250rpm条件下过夜振荡培养；

所述的常温离心的条件为2500～3000g条件下常温离心2～5min；进一步为3000g条件下常温离心2min。

所述的继续培养的条件为25～35℃，150～250rpm条件下继续培养24～144h；进一步为30℃，250rpm条件下继续培养24～144h；

优选的，添加甲醇至1.0％v/v。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明采用真核表达的方法，获得了具有生物活性的重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶，具有表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。

(2)本发明提供了一种单独添加盐乳芽孢杆菌木聚糖酶改善面粉加工品质的方法，直接添加盐乳芽孢杆菌木聚糖酶能改善面团的微观结构，显著增加全麦面包的比容，降低全麦面包的硬度和咀嚼性，提高全麦面包的品质，是一种潜在的面粉改良剂。

附图说明

图1是实施例1重组表达质粒的双酶切结果；其中，泳道M：分子量Marker；泳道1：重组表达质粒双酶切产物。

图2是实施例2重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶Ni-NTA亲和层析后SDS-PAGE分析；其中，泳道M：分子量Marker；泳道1：经还原剂β-巯基乙醇处理；泳道2：无还原剂处理。

图3是实施例3重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶酶学性质法分析；其中，A：最适反应温度；B最适反应pH；C：温度稳定性；D：pH稳定性。

图4是实施例4中重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶对面团微观结构的影响；其中，A：对照组；B：3ppm；C：6ppm；D：12ppm；G代表面筋网络结构，S代表淀粉颗粒。

图5是实施例5中重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶对面包比容的影响；其中，实验重复3次，每一列不同上标字母表示差异性显著(p＜0.05)。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公认的方法制得的产品。

实施例中所用的BMGY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L。

所用的BMMY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、甲醇10mL/L。

实施例1木聚糖酶基因密码子优化及克隆

利用全基因合成技术，合成了毕赤酵母密码子优化的盐乳芽孢杆菌(Halolactibacillus miurensis)木聚糖酶的全基因序列。其中，盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。之后利用EcoRI和NotI对盐乳芽孢杆菌木聚糖酶序列和载体质粒pPICZαA进行双酶切，并用T4 DNA酶进行连接反应，连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。挑取单菌落，然后提取质粒电泳检测，并在-20℃保存质粒。再利用EcoRI与NotI酶切检测目的片段(图1)，之后送质粒由公司进行测序，测序正确的质粒即为密码子优化的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶重组表达质粒pPICZαA-hxyl。

实施例2木聚糖酶的诱导表达及纯化

1.诱导表达

将实施例1获得的上述重组表达载体pPICZαA-hxyl用SacI进行线性化，利用电转化的方法将其转化至宿主细胞毕赤酵母X33中。对转化的抗性筛选平板上的单菌落进行菌落PCR验证，确保外源基因的整合。接种筛选出来的毕赤酵母重组子于10mL BMGY液体培养基中，30℃，250rpm，振荡培养过夜；常温3000g离心2min后，收集菌体，将其转接至BMMY培养基中，转接后的菌液OD₆₀₀为0.5～1.0；30℃，250rpm条件下继续培养24～144h，期间每隔24h取样并向培养基中添加甲醇至1.0％v/v，培养完成后，固液分离获得发酵上清液。SDS-PAGE分析表明，在24～144h的发酵时间内，该重组菌都能够诱导表达重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶。

2.亲和纯化

收集发酵上清液，然后使用AKTA蛋白纯化系统对获得的发酵上清液进行Ni-NTA柱层析。用含有100mM咪唑的20mM磷酸盐缓冲液洗脱，用超滤管(Millipore)浓缩收集目标蛋白溶液，通过SDS-PAGE分析判断蛋白质纯度(图2)。结果表明通过Ni-NTA一步纯化，可以获得电泳纯的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶目的蛋白。

实施例3木聚糖酶酶学性质测定

1.酶活力的测定

(1)绘制标准曲线

准确称取0.5g木糖，用pH7.0的磷酸盐缓冲溶液定容至100mL，获得5mg/mL木糖的溶液。取7支2mL的EP管，分别加入0.00mL，0.01mL，0.02mL，0.03mL，0.04mL，0.05mL，0.10mL木糖标准溶液，补加蒸馏水至0.5mL。分别取0.2mL木糖稀释液于2mL的EP管中，加入0.30mLDNS试剂并摇匀，立即置沸水中显色5min。冷却后取200μL于酶标板中，测定其在540nm下的吸光度值，以木糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

DNS试剂：用400mL蒸馏水溶解6.3g 3,5-二硝基水杨酸(DNS)，逐步加入21g氢氧化钠，依次加入185g四水合酒石酸钾钠、5.0g苯酚、5.0g无水亚硫酸钠，温水浴(不超过48℃)，不断搅拌，直至溶液清澈透明。用蒸馏水定容至1000mL，保存在棕色瓶中，与二氧化碳隔绝，静置5～7天后使用，贮存期为6个月。

(2)样品测定

将酶液适当稀释后，取0.1mL于2mL EP管中，加入0.1mL 1％山毛榉木聚糖底物，在45℃下准确反应10min，加入0.3mL DNS，沸水浴5分钟后在540nm下测定其吸光度，根据被测液的吸光度，由木糖标准曲线计算样品中的总还原糖的浓度，并计算木聚糖酶活。酶活性单位定义：在上述测定条件下，以每分钟水解底物生成1μmoL还原糖所需酶量定义为一个酶活性单位为1U。

2.酶学性质测定

按照上述酶活测定方法，测定实施例2所制备的重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在不同的温度(30～70℃)下的酶活和不同pH(5.0～9.0)下的酶活，确定其最适反应温度和最适反应pH。将酶液分别置于不同温度(4℃～80℃)中保温1h后，测定其残余酶活力，确定其温度稳定性。将酶液置于不同pH(4.0～11.0)的缓冲液中，室温下处理12h，测定残余酶活性，以研究木聚糖酶的pH稳定性。所用缓冲液pH3.0～6.0范围内采用100mM柠檬酸盐缓冲液(Citrate buffer)，pH6.0～8.0范围内采用100mM磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer)，pH8.0～9.0范围内采用100mM的Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl buffer)，pH9.0～11.0采用100mM甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(Glycine-NaOH buffer)。

结果表明，盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的最适温度为45℃(图3A)，最适反应pH为7.0(图3B)；在温度小于50℃时处理1h，重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶能保持80％以上的酶活力(图3C)；在pH6.0～9.0范围内处理12h，木聚糖酶能保持80％以上的酶活力(图3D)。

实施例4应用盐乳芽孢杆菌木聚糖酶改善面团的结构

1.面团的制备

将100g全面粉，58g纯净水，重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶(3ppm、6ppm、12ppm，面粉基)加入到和面钵中，搅拌后形成均匀的面团。将和好的面团置于30℃醒发30min后，收集面团进行冷冻干燥。以不加酶组为对照组。

2.面团的扫描电子显微镜分析

将冷冻干燥后的面团用用镊子掰开后获取含有自然断面的面团样品，并将其固定在含有导电胶的载物台上，用离子溅射仪对面团表面进行镀金。随后将载物台转移到Merlin高分辨场发射扫描电镜中，并在5.0kV的电压下观察，放大倍数为500倍。

从图4中可以看出，对照组(图4A)面团中淀粉颗粒(S)镶嵌在面筋网络结构(G)内外，但由于表面的面筋网络结构并不发达，导致大部分的淀粉颗粒暴露在外。当添加重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶后，面筋基质表面形成了一种类似于胶状但并不连续的面筋网络，包埋住了暴露的淀粉颗粒(图4B-4D)。表明，在重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的作用下，面筋蛋白发生聚集，全麦面团的微观结构得到改善。

实施例5应用重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶改善面包的比容

1.面包制备

面包烘焙的配方为：面粉100重量份，酵母粉1重量份，盐1.6重量份，水58重量份，糖6重量份，植物油3重量份，重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶。以不加酶组为对照组。

面包制备步骤为：将称量好的水、小麦粉(面粉)、白砂糖、食用盐、酵母粉和木聚糖酶加入到和面钵中，搅拌18min，使其形成均匀的面团。将和好的面团置于天平上，分成50g/个，揉成圆形，至于38℃发酵60min，发酵好的面团放入180℃烤箱中焙烤10min，得到面包成品。将制得的面包室温下冷却2h，测定面包的质量和体积。其中面包的体积采用菜籽替代法，比容为面包的体积/面包的质量。

结果表明(图5)，与对照组相比，加入盐乳芽孢杆菌木聚糖酶后，面包比容增加，表明单独添加盐乳芽孢杆菌木聚糖酶可以提高面包的品质。

实施例6应用重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶改善面包的质构

1.面包制备

面包制备步骤为：将称量好的水、小麦粉(面粉)、白砂糖、食用盐、酵母粉和木聚糖酶加入到和面钵中，搅拌18min，使其形成均匀的面团。将和好的面团置于天平上，分成50g/个，揉成圆形，至于38℃发酵60min，发酵好的面团放入180℃烤箱中焙烤10min，得到面包成品。将制得的面包室温下冷却2h，测量面包的质构。

面包质构测定条件为：面包切成2cm/块，采用P/25探头，测前和测试速度设置为1mm/s，测后速度设置为5mm/s，压缩比50％，下压间隔10s。记录面包的硬度和咀嚼性。

结果表明(表1)，与对照组相比，加入盐乳芽孢杆菌木聚糖酶后，面包的硬度和咀嚼性显著性下降，表明添加盐乳芽孢杆菌木聚糖酶可以提高面包的质构特性。

表1重组盐乳芽孢杆菌木聚糖酶对面包质构特性的影响

注：实验重复3次，每一列不同上标字母表示差异性显著(p＜0.05)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 一种盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 331

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的氨基酸序列

<400> 1

Ala Val Thr Ser Asn Glu Thr Gly Thr His Gly Gly Tyr Asp Tyr Glu

1 5 10 15

Tyr Trp Lys Asp Ser Gly Gly Ser Gly Ile Met Thr Leu Asn Ser Gly

20 25 30

Gly Thr Phe Ser Ala Glu Trp Ser Asn Val Asn Asn Ile Leu Phe Arg

35 40 45

Lys Gly Lys Lys Phe Asp Glu Thr Gln Thr His Gln Gln Ile Gly Asn

50 55 60

Met Ser Ile Asn Tyr Gly Ala Asn Tyr Gln Pro Asn Gly Asn Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Thr Val Tyr Gly Trp Ala Val Asp Pro Leu Val Glu Phe Tyr Ile

85 90 95

Val Asp Ser Trp Gly Ser Tyr Arg Pro Thr Gly Thr His Lys Gly Thr

100 105 110

Ile Asn Val Asp Gly Gly Thr Tyr Asp Ile Tyr Glu Thr Thr Arg Thr

115 120 125

Asn Gln Pro Ser Ile Lys Gly Thr Ala Thr Phe Lys Gln Tyr Trp Ser

130 135 140

Val Arg Thr Ser Lys Arg Thr Ser Gly Thr Ile Ser Val Ser Glu His

145 150 155 160

Phe Lys Ala Trp Glu Asn Leu Gly Met Gln Met Gly Asn Met Tyr Glu

165 170 175

Val Ala Leu Thr Val Glu Gly Tyr Gln Ser Ser Gly Ser Ala Asp Val

180 185 190

Tyr Ser Asn Thr Phe Thr Ile Gly Gly Ser Ser Gly Gly Asp Ser Gly

195 200 205

Ser Asp Gly Ser Thr Thr Lys Val Glu Thr Glu Asp Met Thr Lys Gly

210 215 220

Gly Gln Tyr Thr Gly Asn Ile Ser Ser Pro Phe Asn Gly Val Ala Leu

225 230 235 240

Tyr Ala Asn Asn Asp Ser Val Ser Tyr Thr Gln Tyr Phe Ala Asn Asn

245 250 255

Thr His Ser Phe Ser Leu Arg Gly Ala Ser Asp Asn Ser Glu Met Ala

260 265 270

Arg Val Asp Leu Ile Ile Gly Gly Gln Asn Lys Gly Thr Phe Tyr Phe

275 280 285

Gly Gly Ser Tyr Pro Ala Val Tyr Thr Ile Asp Asn Val Ser His Gly

290 295 300

Thr Gly Asn Gln Thr Ile Glu Leu Val Val Thr Ala Asp Asp Gly Thr

305 310 315 320

Trp Asp Ala Phe Ile Asp Tyr Leu Glu Ile Gln

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 编码盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的DNA分子

<400> 2

gctgttactt ccaacgaaac tggaactcat ggtggatacg attacgaata ctggaaggat 60

tccggaggtt caggaattat gactttgaac tccggaggta ctttttctgc tgaatggtcc 120

aacgttaaca acattttgtt tagaaagggt aagaagtttg atgaaactca aactcatcaa 180

caaattggta acatgtctat taactacggt gctaactacc aacctaacgg taactcctac 240

ttgactgttt acggatgggc tgttgatcca ttggttgaat tttacattgt tgattcctgg 300

ggatcataca gacctactgg tactcataag ggtactatta acgttgatgg aggaacttac 360

gatatttacg aaactactag aactaaccaa ccatctatta agggaactgc tacttttaag 420

caatactggt cagttagaac ttctaagaga acttcaggta ctatttcagt ttctgaacat 480

tttaaggctt gggaaaactt gggtatgcaa atgggtaaca tgtacgaagt tgctttgact 540

gttgaaggat accaatcatc cgggtctgct gatgtttact ccaacacttt tactattgga 600

ggttcttcag gtggagattc cggttcagat ggttctacta ctaaggttga aactgaagat 660

atgactaagg gaggacaata cactggaaac atttcctctc catttaacgg agttgctttg 720

tacgctaaca acgattccgt ttcttacact caatactttg ctaacaacac tcattccttt 780

tccttgagag gagcttcaga taactccgaa atggctagag ttgatttgat tattggtggt 840

caaaacaagg gtacttttta ctttggtgga tcatacccag ctgtttacac tattgataac 900

gtttcacatg gtactggaaa ccaaactatt gaattggttg ttactgctga tgatggaact 960

tgggatgctt ttattgatta cttggaaatt caa 993

Claims

1.盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面粉加工品质中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

单独添加以盐乳芽孢杆菌木聚糖酶为主的酶制剂在改善面粉加工品质中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在改善面团及面包品质中的应用。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶在面粉中的添加水平为3ppm～12ppm，面粉基；进一步为3ppm～6ppm，面粉基。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

编码盐乳芽孢杆菌木聚糖酶的DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

将盐乳芽孢杆菌木聚糖酶、面粉、糖、盐、植物油、酵母粉和水搅拌均匀，形成的面团经分割称重、成形以及醒发后，焙烤得到面包成品。

8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶通过对转化有真核重组表达载体的毕赤酵母进行发酵获得；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

(1)利用全基因合成的方法获得了密码子优化的盐乳芽孢杆菌木聚糖酶基因，将其与真核表达载体连接，将获得的真核重组表达载体转化到毕赤酵母感受态细胞中，获得重组表达菌；

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

步骤(1)中，所述的真核表达载体为pPICZαA，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33；

步骤(2)中，所述的过夜振荡培养为25～35℃，150～250rpm条件下过夜振荡培养；

步骤(2)中，所述的常温离心的条件为2500～3000g条件下常温离心2～5min；

步骤(2)中，所述的继续培养的条件为25～35℃，150～250rpm条件下继续培养24～144h。