CN109006917B - 小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用 - Google Patents

小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN109006917B
CN109006917B CN201811004480.3A CN201811004480A CN109006917B CN 109006917 B CN109006917 B CN 109006917B CN 201811004480 A CN201811004480 A CN 201811004480A CN 109006917 B CN109006917 B CN 109006917B
Authority
CN
China
Prior art keywords
wheat
catalase
flour
recombinant expression
ammonium sulfate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201811004480.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN109006917A (zh
Inventor
胡松青
张亚萍
侯轶
刘光毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China University of Technology SCUT
Original Assignee
South China University of Technology SCUT
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China University of Technology SCUT filed Critical South China University of Technology SCUT
Priority to CN201811004480.3A priority Critical patent/CN109006917B/zh
Publication of CN109006917A publication Critical patent/CN109006917A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN109006917B publication Critical patent/CN109006917B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D8/00—Methods for preparing or baking dough
    • A21D8/02—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking
    • A21D8/04—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes
    • A21D8/042—Methods for preparing dough; Treating dough prior to baking treating dough with microorganisms or enzymes with enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/01—Peroxidases (1.11.1)
    • C12Y111/01006—Catalase (1.11.1.6)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开一种小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用，属于基因工程和谷物科学领域。本发明采用真核表达的方法，获得了具有生物活性的重组小麦过氧化氢酶，具备表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。本发明还提供一种单独应用重组小麦过氧化氢酶改善面粉加工品质的方法，该重组酶能有效增强面粉粉质特性，改善面包的比容、硬度等烘焙品质。且应用过程中不需再添加其它酶制剂，简化了生产工序，有利于降低生产成本。本发明提供的重组小麦过氧化氢酶属于小麦内源酶，所添加酶制剂在面制品蒸煮、烘焙过程会失活降解为多肽或氨基酸，因此，本发明为面制品加工业提供了一种绿色、安全的新型生物面粉改良剂，用于面制品加工行业。

Description

小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用
技术领域
本发明属于基因工程和谷物科学领域，具体涉及一种毕赤酵母重组小麦过氧化氢酶及其制备方法，以及毕赤酵母重组小麦过氧化氢酶在面粉加工中的应用。
背景技术
小麦是人类赖以生存的粮食作物之一，具有种植面积广，产量高，环境适应性强等优点。小麦粉能够形成粘弹性面团，赋予了面团独特的加工品质，进而满足不同质地、不同形状面制品的加工需要。但是由于小麦生长环境和采后储藏等的影响，天然面粉的加工品质并不能完全满足面粉加工业的要求。小麦内源组分的含量主要由品种和种植条件决定，因而育种工作者希望通过品质选育和栽培条件的改善提高小麦加工性能，通过添加外源氧化剂及酶改善面粉加工性能是食品行业科学家和食品加工企业考虑的问题。近些年来，化学改良剂的危害受到人们越来越多的关注，因此，人们将目光投向更为安全有效的酶制剂，特别是以小麦内源酶为主体的面粉改良剂，成为一个新的发展方向。
过氧化氢酶是一类广泛存在于植物、动物以及微生物体内的氧化还原酶，也是在生物演化过程中建立起来的生物防御系统的关键酶之一，该酶在纺织、食品、医药、环保等行业具有重要的应用前景。目前，过氧化氢酶的常规获取途径是从天然产物中分离，但是，这种方法提取工艺复杂、纯化困难、纯度低、产量低，基因异源重组已成为制备重组蛋白的重要手段。
添加含有过氧化氢酶的复合酶制剂可以提高面制品的品质，2001年OrientalYeast公司发现，同时添加葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶(来源不详)和抗坏血酸可以提高面包质量，包括面包芯硬度和面包比容；2012年，Novozymes公司发现添加含有柱顶孢霉来源过氧化氢酶和磷脂酶的酶制剂可以提高烘焙制品的风味。上述工作将过氧化氢酶作为其它酶制剂的辅佐材料应用，尚未见单独添加过氧化氢酶改善面粉加工品质的相关应用。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供一种小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用，特别是单独添加以小麦过氧化氢酶为主的酶制剂在改善面粉加工品质中的应用。
具体的，小麦过氧化氢酶在改善面团及面包品质中的应用。
仅在面粉中添加小麦过氧化氢酶即能达到增强面粉粉质特性，改善面包烘焙品质的目的。
所述的小麦过氧化氢酶在面粉中的添加水平为1000～3000U(酶活单位)/g面粉。添加量为1000～3000U(酶活单位)/g面粉时，可以增加面粉的稳定时间，降低面粉的弱化度，提高面包的比容，降低面包的硬度、胶黏性和咀嚼性。
所述的小麦过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明提供了编码所述小麦过氧化氢酶的DNA分子，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。该序列来源于“烟农19”品种小麦。
所述的小麦过氧化氢酶可以通过对转化有真核重组表达载体的毕赤酵母进行发酵获得。
所述的真核重组表达载体为包含小麦过氧化氢酶基因的真核重组表达载体。
所述的小麦过氧化氢酶的毕赤酵母重组表达方法，包括如下步骤：
(1)小麦过氧化氢酶基因的克隆
以小麦基因组为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到过氧化氢酶基因，纯化回收PCR产物；
F2：5′-CTTCTCGAGAAAAGAGAGATGGACCCCTACAAGTAC-3′；
R2：5′-GGGTCTAGAAACATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′；
(2)重组表达载体的构建
将酵母真核表达载体与步骤(1)所得的PCR产物分别用Xho I和Xba I双酶切，连接所得双酶切产物并转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆菌株，抽提质粒，得到小麦过氧化氢酶重组表达载体；
(3)小麦过氧化氢酶重组表达菌株的构建
将步骤(2)所述的小麦过氧化氢酶重组表达载体线性化后转化至毕赤酵母中，使用步骤(1)所述的引物进行毕赤酵母基因组PCR，筛选得到阳性重组表达菌株；
(4)将步骤(3)所得的阳性重组表达菌株接种至BMGY液体培养基中，25～35℃、150～250r/min条件下过夜振荡培养；3000g条件下常温离心5min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀转接至BMMY液体培养基中，转接后的菌液OD600nm为1.0～5.0；25～35℃、150～250r/min条件下继续培养48～120h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为0.5％～2.5％(v/v)，固液分离后获得发酵上清液；即得小麦过氧化氢酶重组表达产物。
为了更好的实现本发明的目的，还包括：
(5)将步骤(4)所得发酵上清液经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后，获得纯的重组小麦过氧化氢酶。
步骤(1)中，所述的小麦为“烟农19”品种小麦。
步骤(2)中，所述的酵母真核表达载体为酵母真核表达载体pPICZαA；
步骤(2)中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5a。
步骤(3)中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33。
步骤(4)中，所述的BMGY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L。
步骤(4)中，所述的BMMY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L、甲醇5mL/L。
步骤(5)中，所述的硫酸铵盐析分级沉淀第一次沉淀所用硫酸铵浓度为15～30％饱和度，第二次沉淀为45～60％饱和度；所述的阴离子交换层析所用层析柱优选为Mono Q柱。
步骤(5)中，具体包括如下步骤：
(a)将步骤(4)所得发酵上清液进行硫酸铵分级沉淀；
(b)4℃条件下静置2h后，并于4℃以8000g离心10min，收集沉淀；
(c)向沉淀中加入少量缓冲液A，重悬后，并于4℃以8000g离心10min，收集上清液；
(d)将步骤(c)所得上清液转移至透析袋中，放入缓冲液A中，4℃条件下透析24h，中间更换两次缓冲液A；
(e)将透析后的样品于0.22μm微孔滤膜过滤；
(f)以缓冲液A为结合缓冲液，缓冲液B为洗脱缓冲液，进行阴离子交换层析，检测各个洗脱峰活性，并收集含有目的蛋白的样品，以过氧化氢为底物测量过氧化氢酶活；收集具有过氧化氢酶活性的洗脱峰并合并，获得纯的重组小麦过氧化氢酶。
所述的缓冲液A：20mmol/L Tris-HCl，pH 8.0；
所述的缓冲液B：20mmol/L Tris-HCl、1mol/L NaCl，pH 8.0。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)本发明采用真核表达的方法，获得了具有生物活性的重组小麦过氧化氢酶，具备表达量高，纯化简便，易于放大，适合工业化应用等特点。
(2)本发明提供了一种单独应用重组小麦过氧化氢酶改善面粉加工品质的方法，该重组酶能有效增强面粉粉质特性，改善面包的比容、硬度等烘焙品质。而且，应用过程中不需再添加其它的酶制剂，简化了生产工序，有利于降低生产成本。
(3)本发明提供的重组小麦过氧化氢酶属于小麦内源酶，所添加酶制剂在面制品蒸煮、烘焙过程会失活降解为多肽或氨基酸，因此，本发明为面制品加工业提供了一种绿色、安全的新型生物面粉改良剂，用于面制品加工行业。
附图说明
图1是实施例1中重组毕赤酵母的基因组PCR鉴定；其中，泳道M：DL5000DNAMarker；泳道1～3：重组转化子基因组PCR产物。
图2是实施例2中不同纯化过程小麦过氧化氢酶的SDS-PAGE分析；其中，M：蛋白质marker；泳道1：发酵液上清粗酶液；泳道2：硫酸铵分级沉淀后酶液；泳道3：阴离子交换层析收集的目的组分。
图3是实施例4中重组小麦过氧化氢酶对面包比容的影响；其中，实验重复3次，每一列不同上标字母表示差异性显著(p＜0.05)，图中的WCAT1为重组小麦过氧化氢酶的缩写。
图4是实施例5中重组小麦过氧化氢酶对面包烘焙品质的影响；其中，A1，A2：对照；B1，B2：小麦过氧化氢酶添加量为1000U/g面粉；C1，C2：小麦过氧化氢酶添加量为2000U/g面粉；D1，D2：小麦过氧化氢酶添加量为3000U/g面粉。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除有特别说明，本发明中用到的各种试剂、原料均为可以从市场上购买的商品或者可以通过公认的方法制得的产品。
实施例中所用的BMGY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L。
所用的BMMY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L、甲醇5mL/L。
实施例1
(1)小麦过氧化氢酶基因的提取
将“烟农19”小麦种子埋入土壤中，于恒温恒湿箱中避光培养10天左右(温度30℃，湿度85％，隔天浇水)。剪取小麦黄化苗叶片，进行小麦黄化苗叶片总RNA的提取。以提取得到的总RNA为模板，在反转录酶M-MLV作用下42℃反转录60min后，于70℃温育5min终止反应。反转录产物cDNA随后进行PCR扩增，获得小麦过氧化氢酶基因。
PCR扩增上、下游引物分别为：
上游引物F1：5′-ATGGACCCCTACAAGTAC-3′；
下游引物R1：5′-CATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′。
反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃，延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。最后72℃延伸5min扩增结束后，利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，并用DNA凝胶回收试剂盒回收小麦过氧化氢酶基因。纯化后的小麦过氧化氢酶基因连接到pMD19-T载体上，即为克隆载体pMD19-T-wcat1。
(2)小麦过氧化氢酶表达载体的构建
设计上游引物F2和下游引物R2，以pMD19-T-wcat1为模板进行目的基因PCR扩增。扩增反应条件如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，65℃退火30s，72℃，延伸90s，30个循环；72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳回收全长约1.5kb的目的基因片段，以Xho I和Xba I双酶切目的基因片段和载体pPICZαA，并用T4DNA酶进行连接反应，连接产物转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞中。挑取形态饱满的单克隆菌落进行菌落PCR鉴定和质粒的抽提，所获得的质粒即为含有编码小麦过氧化氢酶的DNA分子的重组表达载体。
F2：5′-CTTCTCGAGAAAAGAGAGATGGACCCCTACAAGTAC-3′；
R2：5′-GGGTCTAGAAACATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′。
(3)重组小麦过氧化氢酶表达菌株的构建
将上述重组表达载体转化到宿主细胞毕赤酵母X33中，酵母基因组PCR可检测到目的基因已重组到酵母基因组上(图1)。将重组转化菌接种到BMGY培养基中过夜培养，常温3000g离心5min后，收集菌体转接至等量BMMY培养基中，每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，诱导表达72h。收集发酵上清液，western-blot检测目的蛋白的表达，发现所制备的转化体能够高效表达小麦过氧化氢酶。
实施例2
将实施例1获得的能够表达小麦过氧化氢酶的阳性转化体菌种，接种至50mL BMGY培养基中，25℃、250r/min条件下过夜培养，常温3000g离心5min后，收集菌体转接至200mLBMMY培养基中，转接后的菌液OD600nm为1.0；35℃、250r/min条件下继续培养120h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为0.5％(v/v)，培养完成后固液分离后获得发酵上清液。
将硫酸铵研磨成粉后，在冰浴条件下，向发酵液上清中缓慢加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的15％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，弃沉淀，向上清中继续加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的45％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，收集沉淀，用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解后，转移至透析袋中，在20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，4℃下透析24h，中间更换两次缓冲液。
透析完成后，将透析袋中的溶液于0.22μm微孔滤膜过滤，然后上样进行阴离子交换层析。所用层析柱为Mono Q(购自GE Healthcare)，所用的结合缓冲液为缓冲液A(20mmol/L Tris-HCl、pH 8.0)；洗脱缓冲液为缓冲液B(20mmol/L Tris-HCl、1mol/L NaCl，pH 8.0)，洗脱方式为梯度洗脱，收集具有过氧化氢酶活性的洗脱峰并合并。
应用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检验硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后收集的目的蛋白溶液，发现阴离子交换层析后的蛋白溶液达到了电泳纯(图2)。使用BCA蛋白质试剂盒测定蛋白质浓度，按如下所述方法测定小麦过氧化氢酶活性，阴离子交换层析后小麦过氧化氢酶的比活为10812U/mg。
酶活测定方法：用20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)将过氧化氢稀释至30mmol/L，取199μL稀释后的过氧化氢，向其中加入1μL酶液，在37℃条件下测定其在240nm波长下吸光度值的变化。小麦过氧化氢酶酶活定义：37℃、pH 7.4条件下，1min内分解1μmol的过氧化氢为1U。溶液中每分钟过氧化氢含量的变化计算公式为：c(mmol/L)＝40.146×ΔA，其中，ΔA为实验样品中每分钟240nm处吸光度值的变化。
实施例3
将实施例1获得的能够表达小麦过氧化氢酶的阳性转化体菌种，接种至50mL BMGY培养基中，30℃、200r/min条件下过夜培养，常温3000g离心5min后，收集菌体转接至200mLBMMY培养基中，转接后的菌液OD600nm为3.0；30℃、200r/min条件下继续培养72h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为1.0％(v/v)，固液分离后获得发酵上清液。
将硫酸铵研磨成粉后，在冰浴条件下，向发酵液上清中缓慢加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的20％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，弃沉淀，向上清中继续加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的50％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，收集沉淀，用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解后，转移至透析袋中，在20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，4℃下透析24h，中间更换两次缓冲液，所得酶液备用。使用BCA蛋白质试剂盒测定蛋白质浓度，按实施例2所述方法测定小麦过氧化氢酶活性，透析袋中小麦过氧化氢酶的比活为3367U/mg。
取透析后重组小麦过氧化氢酶，按每克面粉中添加1000U、2000U和3000U酶为实验组，以不添加重组小麦过氧化氢酶的实验组为对照组，采用微量粉质仪测试添加重组小麦过氧化氢酶对其面粉粉质特性的影响。测试面粉粉质特性时，取4g面粉加入粉钵中，63r/min预混1min后，加入一定量的蒸馏水和透析后重组小麦过氧化氢酶，使面团的最大稠度接近500FU(480±20FU)，当面团形成后，根据粉质曲线得到面粉的形成时间、稳定时间、弱化度、质量评分等指标。重组小麦过氧化氢酶对面粉粉质特性的影响如表1所示，表中的WCAT1为重组小麦过氧化氢酶的缩写。与对照组相比，面粉的形成时间、稳定时间和质量评分随小麦过氧化氢酶添加量的提高而增加，弱化度随小麦过氧化氢酶添加量的提高而降低，表明小麦过氧化氢酶可以改善面粉的品质。
表1透析后重组小麦过氧化氢酶对面粉粉质特性的影响
Figure BDA0001783698230000081
注：n＝3，每一列不同上标字母表示差异性显著(p＜0.05)
实施例4
将实施例1获得的能够表达小麦过氧化氢酶的阳性转化体菌种，接种至50mL BMGY培养基中，35℃、150r/min条件下过夜培养，常温3000g离心5min后，收集菌体转接至200mLBMMY培养基中，转接后的菌液OD600nm为5.0；25℃、150r/min条件下继续培养48h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为2.5％(v/v)，固液分离后获得发酵上清液。
将硫酸铵研磨成粉后，在冰浴条件下，向发酵液上清中缓慢加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的25％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，弃沉淀，向上清中继续加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的55％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，收集沉淀，用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解后，转移至透析袋中，在20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，4℃下透析24h，中间更换两次缓冲液，所得酶液备用。使用BCA蛋白质试剂盒测定蛋白质浓度，按实施例2所述方法测定小麦过氧化氢酶活性，硫酸铵沉淀后小麦过氧化氢酶的比活为5516U/mg。
取100g市售面粉，加入60g水、1.6g盐、6g糖、3g植物油和1g酵母粉，按每克面粉加入0U、1000U、2000U和3000U上述硫酸铵沉淀分离后的小麦过氧化氢酶，100r/min的速度搅拌20min后，将面团分成45g/个，揉成圆形，置于30℃下发酵60min。发酵好的面团放入180℃烘箱中烘烤10min，取出冷却至室温，利用小米体积置换法测定面包的比容，结果如图3所示。结果表明，与对照相比，加入小麦过氧化氢酶后，面包比容增加，表明重组小麦过氧化氢酶可以提高面包的品质。
实施例5
将实施例1获得的能够表达小麦过氧化氢酶的阳性转化体菌种，接种至50mL BMGY培养基中，30℃、250r/min条件下过夜培养，常温3000g离心5min后，收集菌体转接至200mLBMMY培养基中，转接后的菌液OD600nm为5.0；25℃、200r/min条件下继续培养96h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为0.1％(v/v)，固液分离后获得发酵上清液。
将硫酸铵研磨成粉后，在冰浴条件下，向发酵液上清中缓慢加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的30％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，弃沉淀，向上清中继续加入硫酸铵，使其浓度达到饱和浓度的60％，同时，用磁力搅拌器搅拌溶解，4℃静置2h后，在8000g的条件下离心10min，收集沉淀，用20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)溶解后，转移至透析袋中，在20mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，4℃下透析24h，中间更换两次缓冲液，所得酶液备用。使用BCA蛋白质试剂盒测定蛋白质浓度，按实施例2所述方法测定小麦过氧化氢酶活性，硫酸铵沉淀后小麦过氧化氢酶的比活为8332U/mg。
取100g市售面粉，加入60g水、1.6g盐、6g糖、3g植物油和1g酵母粉，按每克面粉加入0U、1000U、2000U和3000U上述硫酸铵沉淀分离后的小麦过氧化氢酶，100r/min的速度搅拌20min后，将面团分成45g/个，揉成圆形，置于30℃下发酵60min。发酵好的面团放入180℃烘箱中烘烤10min，取出冷却至室温，切片。面包与面包片的照片如图4所示，从图中可以看出，对照组的气孔较小，而小麦过氧化氢酶处理后的发酵面团气孔增大，表明小麦过氧化氢酶能够提高面包烘培品质。
进一步进行面包质构品质分析。将面包竖切成2cm/块，面包质构测定条件：p/25探头，测前和测试速度1mm/s，测后速度5mm/s，压缩比50％，下压间隔10s。不同小麦过氧化氢酶添加量的面包质构如表2所示，表中的WCAT1为重组小麦过氧化氢酶的缩写。面包质构结果表明，添加重组小麦过氧化氢酶能够降低面包硬度、胶粘性和咀嚼性，表明重组小麦过氧化氢酶可以提高面包的质构特性。
表2透析后重组小麦过氧化氢酶对面包质构特性的影响
Figure BDA0001783698230000101
注：n＝3，每一列不同上标字母表示差异性显著(p＜0.05)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码小麦过氧化氢酶基因的氨基酸序列
<400> 1
Met Asp Pro Tyr Lys Tyr Arg Pro Ser Ser Ser Phe Asn Ala Pro Met
1 5 10 15
Trp Ser Thr Asn Ser Gly Ala Pro Val Trp Asn Asn Asp Asn Ser Leu
20 25 30
Thr Val Gly Ser Arg Gly Pro Ile Leu Leu Glu Asp Tyr His Leu Val
35 40 45
Glu Lys Ile Ala Asp Phe Asp Gly Glu Arg Ile Pro Glu Arg Val Val
50 55 60
His Ala Arg Gly Ala Ser Ala Lys Gly Phe Phe Glu Val Thr His Asp
65 70 75 80
Val Ser His Leu Thr Cys Ala Asp Phe Leu Arg Ala Pro Gly Val Gln
85 90 95
Thr Pro Val Ile Val Arg Phe Ser Thr Val Ile His Glu Arg Gly Ser
100 105 110
Pro Glu Thr Leu Arg Asp Pro Arg Gly Phe Ala Ile Lys Phe Tyr Thr
115 120 125
Arg Glu Gly Asn Trp Asp Leu Val Gly Asn Asn Phe Pro Val Phe Phe
130 135 140
Ile Arg Asp Gly Met Lys Phe Pro Asp Met Val His Ala Leu Lys Pro
145 150 155 160
Asn Pro Lys Thr His Ile Gln Glu Asn Trp Arg Ile Leu Asp Phe Phe
165 170 175
Ser His His Pro Glu Ser Leu His Met Phe Thr Phe Leu Phe Asp Asp
180 185 190
Ile Gly Val Pro Ala Asp Tyr Arg His Met Asp Gly Ser Gly Val Asn
195 200 205
Thr Tyr Thr Leu Val Asn Arg Ala Gly Lys Ala His Tyr Val Lys Phe
210 215 220
His Trp Lys Pro Thr Cys Gly Val Lys Ser Leu Leu Glu Glu Glu Ala
225 230 235 240
Val Thr Val Gly Gly Thr Asn His Ser His Ala Thr Lys Asp Leu Thr
245 250 255
Asp Ser Ile Ala Ala Gly Asn Tyr Pro Glu Trp Thr Phe Tyr Ile Gln
260 265 270
Thr Ile Asp Pro Asp Tyr Glu Glu Arg Phe Asp Phe Asp Pro Leu Asp
275 280 285
Val Thr Lys Thr Trp Pro Glu Asp Val Val Pro Leu Gln Pro Val Gly
290 295 300
Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Ile Asp Asn Phe Phe Ser Glu Asn Glu
305 310 315 320
Gln Leu Ala Phe Cys Pro Gly Ile Ile Val Pro Gly Val Tyr Tyr Ser
325 330 335
Asp Asp Lys Leu Leu Gln Thr Arg Ile Phe Ser Tyr Ser Asp Thr Gln
340 345 350
Arg His Arg Leu Gly Pro Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Ala Asn Ala Pro
355 360 365
Lys Cys Ser His His Asn Asn His Tyr Asp Gly Leu Met Asn Phe Met
370 375 380
His Arg Asp Glu Glu Val Asp Tyr Phe Pro Ser Arg Phe Asp Pro Ala
385 390 395 400
Lys His Ala Pro Arg Tyr Pro Ile Pro Ser Arg Thr Leu Asn Gly Arg
405 410 415
Arg Glu Lys Met Val Ile Glu Lys Glu Asn Asn Phe Lys Gln Pro Gly
420 425 430
Glu Arg Tyr Arg Ser Met Asp Pro Ala Arg Gln Glu Arg Phe Ile Asn
435 440 445
Arg Trp Ile Asp Ala Leu Ser Asp Pro Arg Leu Thr His Glu Ile Lys
450 455 460
Ala Ile Trp Leu Ser Tyr Trp Ser Gln Ala Asp Lys Ser Leu Gly Gln
465 470 475 480
Lys Leu Ala Ser Arg Leu Ser Ser Lys Pro Ser Met
485 490
<210> 2
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码小麦过氧化氢酶基因的核苷酸序列
<400> 2
atggacccct acaagtaccg tccgtcgagc tccttcaacg ccccgatgtg gagcaccaac 60
tccggcgcgc ccgtctggaa caacgacaac tccctcaccg tcggatcccg aggtccgatc 120
ctgctggagg actaccacct ggtggagaag atcgccgact ttgacggtga gcgcatcccg 180
gagcgggtgg tacacgcccg gggcgccagc gccaagggct tcttcgaggt cacccacgac 240
gtctcccacc tgacctgcgc cgacttcctc cgcgcgccgg gggtgcagac ccccgtcata 300
gtgcgcttct ccaccgtgat ccacgagcgc ggctcccccg agacgctccg cgacccgcgc 360
ggcttcgcca tcaagttcta cacccgggag ggcaactggg acctggtcgg caacaacttc 420
cccgtcttct tcatccgcga cggcatgaag ttcccggaca tggtgcacgc gctcaagccc 480
aaccccaaga cccacatcca ggagaactgg cgcatcctcg acttcttctc ccaccacccg 540
gagtcgctcc acatgttcac cttcctcttc gacgacatcg gcgtgcccgc cgactaccgc 600
cacatggacg gctccggcgt caacacctat acgctggtga accgcgccgg caaggcgcac 660
tacgtcaagt tccactggaa gcccacctgc ggcgtcaagt cgctgctgga ggaggaggcg 720
gtcacggtgg gcggcaccaa ccacagccac gccaccaagg acctcaccga ctccatcgcc 780
gccggcaact acccggagtg gaccttctac atccagacca tcgacccgga ctatgaggag 840
cggttcgact tcgacccgct ggacgtgacc aagacgtggc ccgaggacgt ggtgccgctg 900
cagcccgtgg ggcggctggt gctgaaccgc aacatcgaca acttcttctc ggagaacgag 960
cagctggcct tctgccccgg gatcatcgtc cccggggtgt actactcgga cgacaagctg 1020
ctgcagacga ggatcttctc ctactccgac acgcagcgcc accgtctagg gcccaactac 1080
ctgctgctgc cggccaacgc gcccaagtgc tcccaccaca acaaccacta cgacgggctc 1140
atgaacttca tgcaccgcga cgaggaggtc gactacttcc cctcaaggtt cgaccccgcc 1200
aagcacgcgc cccgctaccc catcccctcc cgcaccctca acggccgccg cgagaagatg 1260
gtgatcgaga aggagaacaa cttcaagcag cccggggaga ggtaccgctc catggacccg 1320
gcaaggcaag agcgattcat caacagatgg atcgacgcgc tgtcggaccc ccgcctcacc 1380
catgagatca aggccatctg gctctcctac tggtctcagg ctgacaagtc tctcggccag 1440
aagctcgcga gccgtctcag ctccaagccg agcatgtaa 1479
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F1
<400> 3
atggacccct acaagtac 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R1
<400> 4
catgctcggc ttggagctga g 21
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F2
<400> 5
cttctcgaga aaagagagat ggacccctac aagtac 36
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> R2
<400> 6
gggtctagaa acatgctcgg cttggagctg ag 32

Claims (8)

1.小麦过氧化氢酶在改善面团及面包品质中的应用，其特征在于：所述的小麦过氧化氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述的小麦过氧化氢酶在面粉中的添加水平为1000～3000U/g面粉。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
编码所述小麦过氧化氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：
所述的小麦过氧化氢酶通过对转化有真核重组表达载体的毕赤酵母进行发酵获得；
所述的真核重组表达载体为包含小麦过氧化氢酶基因的真核重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：
所述的小麦过氧化氢酶的毕赤酵母重组表达方法，包括如下步骤：
（1）小麦过氧化氢酶基因的克隆
以小麦基因组为模板，以F2和R2为引物进行PCR扩增，得到过氧化氢酶基因，纯化回收PCR产物；
F2：5′-CTTCTCGAGAAAAGAGAGATGGACCCCTACAAGTAC-3′；
R2：5′-GGGTCTAGAAACATGCTCGGCTTGGAGCTGAG-3′；
（2）重组表达载体的构建
将酵母真核表达载体与步骤（1）所得的PCR产物分别用Xho I和Xba I双酶切，连接所得双酶切产物并转化大肠杆菌，筛选得到阳性克隆菌株，抽提质粒，得到小麦过氧化氢酶重组表达载体；
（3）小麦过氧化氢酶重组表达菌株的构建
将步骤（2）所述的小麦过氧化氢酶重组表达载体线性化后转化至毕赤酵母中，使用步骤（1）所述的引物进行毕赤酵母基因组PCR，筛选得到阳性重组表达菌株；
（4）将步骤（3）所得的阳性重组表达菌株接种至BMGY液体培养基中，25～35 ℃、150～250 r/min条件下过夜振荡培养；3000g条件下常温离心5min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀转接至BMMY液体培养基中，转接后的菌液OD600nm为1.0～5.0；25～35 ℃、150～250 r/min条件下继续培养48～120h，期间每隔24h向培养基添加甲醇至终浓度为0.5%～2.5%v/v，固液分离后获得发酵上清液；即得小麦过氧化氢酶重组表达产物。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：
所述的小麦过氧化氢酶的毕赤酵母重组表达方法，还包括：
（5）将步骤（4）所得发酵上清液经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后，获得纯的重组小麦过氧化氢酶。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：
步骤（1）中，所述的小麦为“烟农19”品种小麦；
步骤（2）中，所述的酵母真核表达载体为酵母真核表达载体pPICZαA；
步骤（2）中，所述的大肠杆菌为大肠杆菌DH5a；
步骤（3）中，所述的毕赤酵母为毕赤酵母X33；
步骤（4）中，所述的BMGY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、甘油10mL/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L；
步骤（4）中，所述的BMMY液体培养基包含胰蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、无氨基酵母氮源13.4g/L、磷酸盐0.1mol/L、生物素0.4mg/L、甲醇5mL/L。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：
步骤（5）中，所述的硫酸铵盐析分级沉淀第一次沉淀所用硫酸铵浓度为15～30%饱和度，第二次沉淀为45～60%饱和度；所述的阴离子交换层析所用层析柱为Mono Q柱。
CN201811004480.3A 2018-08-30 2018-08-30 小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用 Active CN109006917B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811004480.3A CN109006917B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201811004480.3A CN109006917B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN109006917A CN109006917A (zh) 2018-12-18
CN109006917B true CN109006917B (zh) 2021-09-21

Family

ID=64625911

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201811004480.3A Active CN109006917B (zh) 2018-08-30 2018-08-30 小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN109006917B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114164221A (zh) * 2022-01-17 2022-03-11 李宪臻 一种异源表达重组过氧化氢酶的毕赤酵母基因工程菌与应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1552872A (zh) * 2003-06-03 2004-12-08 天津师范大学 耐热植酸酶及其基因的克隆和表达
CN101993828A (zh) * 2010-11-08 2011-03-30 江南大学 6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(s)-羰基还原酶偶联提高(s)-苯基乙二醇转化效率的方法
CN104293752A (zh) * 2014-09-19 2015-01-21 浙江工业大学 重组酰胺酶Dt-Ami 2、编码基因、载体、工程菌及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1552872A (zh) * 2003-06-03 2004-12-08 天津师范大学 耐热植酸酶及其基因的克隆和表达
CN101993828A (zh) * 2010-11-08 2011-03-30 江南大学 6-磷酸葡萄糖脱氢酶和(s)-羰基还原酶偶联提高(s)-苯基乙二醇转化效率的方法
CN104293752A (zh) * 2014-09-19 2015-01-21 浙江工业大学 重组酰胺酶Dt-Ami 2、编码基因、载体、工程菌及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
脂氧合酶及相关酶在面包加工中的作用;李兴军;《粮食科技与经济》;20110930;第36卷(第5期);第38页左栏第5段第5行-第6段第2行 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109006917A (zh) 2018-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8709766B2 (en) Use of endogenous promoters in genetic engineering of Nannochloropsis gaditana
CN109161550B (zh) 一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法
CN103289972A (zh) 一种稻类长粒相关基因及其应用
CN105802943B (zh) 一种性能改善的普鲁兰酶嵌合体及高产该嵌合体的巴斯德毕赤酵母突变株
CN108795956B (zh) GmMDH12基因在促进大豆结瘤固氮能力方面的应用
CN114395540B (zh) 一种冠突曲霉葡萄糖氧化酶在改善面粉加工品质中的应用
CN114921474B (zh) 一种提高白桦耐盐能力的BpbHLH10基因及其编码的蛋白
CN110628738B (zh) 提高葡萄糖氧化酶活性的方法、突变体及其应用
CN109006917B (zh) 小麦过氧化氢酶在改善面粉加工品质中的应用
EP1763578A2 (de) Polypeptide mit tannase-und/oder lipase-aktivität
CN110885840A (zh) 一种提高里氏木霉生产纤维素酶产量的方法
CN101348795A (zh) 一种葡萄糖氧化酶的编码基因及制备方法和应用
CN116640195B (zh) 柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用
KR101567308B1 (ko) 미세조류의 바이오매스와 지질 생산성을 증가시키기 위한 재조합 벡터 및 이의 용도
CN107058263B (zh) 一种新型β-淀粉酶的高效制备方法
CN108588098A (zh) 尾叶桉cad基因及其应用
JP2018068292A (ja) 糸状菌の形質転換方法
CN113355334B (zh) 一种玉米耐盐基因及其应用
AU2019385785B2 (en) Glucose oxidase M5GOD and coding genes and applications thereof
CN112708603B (zh) 水稻are2基因在植物氮代谢调控中的应用
CN104031927A (zh) 一种与香稻香气含量相关的基因OsPRO及其编码蛋白的应用
CN114807172A (zh) 一种盐响应的玉米功能基因
JP6698993B2 (ja) ピキア酵母を用いた遺伝子組換えによるアスパルティックプロテアーゼの製造方法
CN108276481B (zh) 陆地棉GhLEA3基因及其在抗低温胁迫方面的应用
CN109161489B (zh) 一种高产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant