CN109161550B - 一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法 - Google Patents

一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，公开一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法，克隆的SlbHLH59基因的gDNA序列如序列表SEQ ID NO：1所示，cDNA序列如序列表SEQ ID NO：2所示，该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：3所示，该基因包含功能突变位点的启动子序列如SEQ ID NO：4所示。本发明通过全基因组关联分析(GWAS)在番茄9号染色体定位到的转录因子SlbHLH59在调控番茄果实抗坏血酸积累方面具有显著的功能，同时该基因可以增强番茄对氧化逆境的抗性。因此，该基因可以在番茄品质改良，特别是在植物抗氧化等方面进行应用。

Description

一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，尤其涉及一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
抗坏血酸(L-ascorbic acid,AsA)，又称维生素C，是一种水溶性小分子还原性物质，是植物和大多数动物体内合成的一种己糖内酯化合物，对保护人类的身体健康和疾病预防有着重要的作用。AsA可以清除人体内产生的活性氧自由基，从而可以预防癌症；可以降低血液中胆固醇的含量，从而可以预防和治疗高血压、中风等疾病；可以阻止致癌物亚硝酸铵的形成，因此可以预防和降低癌症的发病率；可以作为参与人体表观修饰酶的辅因子，从而调控细胞铁的吸收；能够增强造血干细胞功能，抑制白血病发生。由于人体及灵长类动物丧失了自身合成抗坏血酸的能力，新鲜的蔬菜与水果是人类日常抗坏血酸的天然摄入来源。AsA在植物中也具有重要的作用，例如清除植物体内的活性氧(ROS)，充当一些酶的辅酶，影响细胞有丝分裂、细胞膨大以及提高植物的抗逆性等。基于AsA对人体健康和植物生长发育都有重要影响，以及科学研究技术的不断发展，对抗坏血酸的研究越来越受到重视。
植物抗坏血酸的合成途径一直不是很清楚，直到1998年，结合同位素示踪、生化分析及早期的研究结果，才提出了植物中抗坏血酸合成的第一条途径，即D-甘露糖/L-半乳糖途径。随后其他的合成途径也陆续被提出，主要有半乳糖醛酸途径、古洛糖途径和肌醇途径。其中甘露糖/半乳糖途径中的基因在拟南芥及番茄等植物中基本上被鉴定和克隆，其它三条途径中的关键基因也被鉴定和克隆。另一方面，从EMS化学诱变处理的拟南芥材料中筛选出对臭氧敏感及抗坏血酸含量降低的拟南芥突变体，这些突变体为解析植物抗坏血酸合成途径起到了关键的作用。目前，关于AsA生物合成的调控途径研究较少，相关调控因子的克隆和鉴定主要集中在拟南芥等模式植物中。近期，在番茄中鉴定了一个调控AsA合成的转录因子SlHZ24，对AsA生物合成途径多个基因同步调控，而最终增加AsA含量。此外，还发现超量表达SlHZ24转基因株系对氧化逆境的抗性提高。由于转录调控具有强表达效应和多点协同调控效应，因此在基础研究及应用研究中这种调控越来越受到重视。
bHLH(basic helix-loop-helix)转录因子是一种普遍存在于动植物中的转录因子家族,是植物中第二大转录因子家族,具有重要的生物学功能。目前，报道的植物基因组中bHLH转录因子数目已远超动物的bHLH转录因子数量，其中,重要农作物中发现的bHLH转录因子已超过630个。利用基因组学、生物信息学等方法，前人在番茄基因组中共鉴定了159个bHLH转录因子。bHLH结构域是由50-60个氨基酸组成的一个保守结构域，可分为长度为10-15个氨基酸的碱性氨基酸区和40个氨基酸左右的α-螺旋-环-α-螺旋区(HLH区)。碱性氨基酸区位于bHLH结构域的N端，具有DNA识别和结合位点。植物中50％以上的碱性氨基酸区含有高度保守的His5-Glu9-Arg13序列，其对bHLH和靶标DNA的结合必不可缺。大多数bHLH转录因子通过识别和结合下游基因启动子区的E-box元件(一种有6个碱基排列的特殊回文序列，CANNTG)，进而激发基因进行转录。相对于bHLH转录因子庞大的总数,真正详细研究功能的基因则很少。植物bHLH转录因子在植物的生长发育、抗逆性和信号转导等方面发挥着重要作用。近年来，相关报道证明了bHLH转录因子参与调节植物类黄酮、生物碱和萜类等生物活性分子的生物合成途径，但是在调控植物AsA合成方面中还鲜有报道。
番茄是一种在全世界范围内普遍种植的蔬菜作物，番茄的成熟果实中AsA的含量较高，可为人类提供丰富的维生素C及其它营养物质。同时在科学研究上作为研究果实的一种模式植物，与其它果实植物相比，它的基因组较小，生长周期较短，且具有成熟的遗传转化体系，因此番茄具有极高的实际应用价值及理论研究意义。随着生活水平的提高，人们对园艺作物的选育不光追求产量，也更加注重品质。AsA的含量是衡量番茄品质高低的重要标准，但目前对园艺作物中AsA的调控机制的认识较少。
综上所述，现有技术存在的问题是：
相对于拟南芥等模式植物而言，目前对园艺作物中AsA的调控机制的认识和研究较少，主要原因在于目前园艺作物例如番茄中并没有系统的基因突变体库，AsA相关突变体的发掘和鉴定没有拟南芥等模式植物成熟。因此，材料的匮乏限制了园艺作物AsA相关功能基因的挖掘。
现有技术中，不能利用传统的双亲群体进行QTL定位。
在调控植物AsA合成方面中还鲜有报道。
解决上述技术问题的难度和意义：
难度在于：AsA作为一个初级代谢性状，属于微效多基因调控的复杂性状，利用传统的双亲群体进行QTL定位也存在一定的难度。
解决上述问题后带来的意义：
本发明通过对302份番茄核心种质成熟果实进行代谢组分析，鉴定了一批AsA含量显著差异的番茄材料，丰富了番茄品质种质资源库。相对于传统的QTL定位，GWAS能更加有效的鉴定数量性状的遗传调控位点。因此，本发明克服现有材料和技术的缺点，通过对AsA变异丰富的自然群体进行GWAS分析，鉴定了AsA的主效调控基因SlbHLH59。通过对SlbHLH59基因的变异研究不仅有助于选择对抗坏血酸积累更高效的天然变异，还可以进一步认识植物抗坏血酸合成代谢的进化规律和调控机制，对于研究高品质番茄选育和番茄的栽培环境改良具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的技术缺陷，提供一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法。
本发明通过全基因组关联分析获得一个调控番茄果实抗坏血酸积累的重要基因SlbHLH59，该基因启动子中的一个关键的插入/缺失(片段命名为indel_8)片段是导致自然群体中抗坏血酸差异的主要原因。通过在番茄中超量表达SlbHLH59能够提高番茄果实中抗坏血酸的含量。并且本发明中的InDel_8可作为高抗坏血酸品种的分子标记。
本发明是这样实现的，一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因，所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因gDNA序列为：SEQ ID NO：1。
进一步，所述的调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因cDNA序列为SEQ IDNO：2。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因编码的蛋白质，所述蛋白质的编码区氨基酸序列为：SEQ ID NO:3。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因插入/缺失获得的分子标记，所述分子标记的多态性位点为indel_8，核苷酸序列为：SEQ ID NO:4。
本发明的另一目的在于提供一种所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因在调控番茄果实中抗坏血酸含量的应用方法，所述SlbHLH59基因在调控番茄果实中抗坏血酸含量的应用方法包括：
步骤一：选取302份番茄核心种质红熟果实，利用其代谢物的GC-MS测定数据和4.2M重测序获得的SNP数据，采用全基因组关联分析从番茄中克隆获得SlbHLH基因，命名为SlbHLH59；所述分子标记为启动子；
步骤二：根据SlbHLH59基因启动子和编码区中的突变位点，分别设计瞬时表达实验和转基因实验，确定功能突变位点；
所述SlbHLH59基因的gDNA序列为SEQ ID NO:1，包含4025个碱基对：cDNA序列为SEQ ID NO:2，包含909个碱基对；
编码区氨基酸序列为SEQ ID NO:3，包括302个氨基酸；
启动子序列为SEQ ID NO:4，包含8个碱基的插入/缺失。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述分子标记在调控番茄果实抗坏血酸含量的应用方法，所述分子标记在调控番茄果实抗坏血酸含量的应用方法包括：
步骤A：对SlbHLH59基因启动子的1个indel突变和3个SNP突变将SlbHLH59基因的启动子分为8种基因型P1-P8，其中：P1，P2，P3和P4基因型包含indel_8缺失的启动子；P5，P6，P7和P8基因型包含indel_8插入的启动子；所述启动子为分子标记；
步骤B：以TS186的gDNA为模板，用Phanta酶进行PCR扩增获得不同基因型启动子，所有的PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段，用SpeI+XbaI双酶切pCAMBIA1304空载，切胶回收载体骨架并与8种不同基因型SlbHLH59基因的启动子片段进行同源重组得到不同启动子；
步骤C：将1μl双酶切线性化的pCAMBIA1304质粒和1μl不同基因型启动子扩增片段混合，加入1μl的ExnaseTM II，2μl 5xCE II buffer，最后用ddH2O补齐至10μl，37℃反应30min后立即冰浴5min，热激法转化T1感受态细胞，对单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆；
步骤D：pCAMBIA1304载体选择标记基因为卡那霉素Kan，抽提PCR阳性克隆的质粒进行测序验证，以CaMV35S::LUC空载为对照，将不同基因型启动子的表达载体pCAMBIA1304-Promoter和CaMV35S::LUC空载共转入拟南芥原生质体，进行转化和GUS活性测定。
进一步，步骤B中基因型SlbHLH59基因的重组表达载体为：pCAMBIA1304-P1到pCAMBIA1304-P8。
进一步，步骤C中单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆所用的引物是：正向引物：5'TGCAAAAACCTTACATATTTTCCTC 3'，反向引物：5'AGGTCCCTCAGAAGGGTTGT 3'。
本发明利用302份番茄核心种质红熟果实代谢物的GC-MS测定数据和4.2M重测序获得的SNP数据，采用全基因组关联分析从番茄中克隆获得了SlbHLH(Solyc09g065820)基因。根据前人对番茄全基因组bHLH基因家族的研究结果命名为SlbHLH59。SlbHLH59是番茄bHLH(basic helix-loop-helix)家族成员之一，该基因的gDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示，它包含4025个碱基对：cDNA序列如序列表SEQ ID NO:2所示，它包含909个碱基对：其编码区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，它包括302个氨基酸；该基因的启动子序列如SEQID NO:4所示，它包含8个碱基的插入/缺失。本发明根据SlbHLH59基因启动子和编码区中的突变位点，分别设计瞬时表达实验和转基因实验，最终确定了功能突变位点证明indel_8，可用于高抗坏血酸番茄选育的辅助选择。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
①本发明揭示了番茄自然群体中AsA含量变异丰富(附图5)，为番茄品质育种提供了材料基础。②与现有的传统QTL定位相比，本发明能快速有效的鉴定AsA的关键调控基因SlbHLH59，定位快速有效(附图6)。③根据对自然群体中目的基因SlbHLH59的序列进行分析，结合分子生物学技术能有效的鉴定关键基因SlbHLH59的功能突变位点(附图8，9)。根据自然群体中鉴定的功能突变位点InDel_8能够开发出高效的分析标记辅助番茄品质育种。④SlbHLH59基因的鉴定丰富和完善了已有的AsA合成及调控网络，揭示了番茄在进化过程中AsA变化的分子机制。
本发明通过全基因组关联分析得到一个与番茄抗坏血酸含量显著相关的候选基因SlbHLH59，该转录因子不同变异对抗坏血酸含量具有不同的影响以及对抗坏血酸积累具有不同的调控机制。
通过对不同基因型载体GUS活性测定发现P5，P6，P7和P8基因型GUS活性显著高于P1，P2，P3和P4基因型(见图9中的b图)，说明启动子中的indel_8能影响SlbHLH59的表达和抗坏血酸的含量，可作为高抗坏血酸材料选育的辅助标记。
通过对阳性的转基因植株抗坏血酸含量测定发现SlbHLH59SNP9A和SlbHLH59SNP9G基因型超量转基因番茄植株果实抗坏血酸含量显著增加，而SlbHLH59干涉转基因番茄植株果实抗坏血酸含量显著降低。
本发明通过全基因组关联分析(GWAS)在番茄9号染色体定位到的转录因子SlbHLH59在调控番茄果实抗坏血酸积累方面具有显著的功能，同时该基因可以增强番茄对氧化逆境的抗性。因此，该基因可以在番茄品质改良，特别是在植物抗氧化等方面进行应用。
本发明利用302份番茄核心种质红熟果实代谢物的GC-MS测定数据和4.2M重测序获得的SNP数据，采用全基因组关联分析从番茄中克隆获得了SlbHLH(Solyc09g065820)基因。根据前人对番茄全基因组bHLH基因家族的研究结果命名为SlbHLH59。SlbHLH59是番茄bHLH(basic helix-loop-helix)家族成员之一，该基因的gDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示，它包含4025个碱基对：cDNA序列如序列表SEQ ID NO:2所示，它包含909个碱基对：其编码区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，它包括302个氨基酸；该基因的启动子序列如SEQID NO:4所示，它包含8个碱基的插入/缺失。本发明根据SlbHLH59基因启动子和编码区中的突变位点，分别设计瞬时表达实验和转基因实验，最终确定了功能突变位点证明indel_8，可用于高抗坏血酸番茄选育的辅助选择。
附图说明
图1是本发明实施例提供的调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法流程图，
图2是本发明实施例提供的SlbHLH59基因的定位方法流程图。
图3是本发明实施例提供的确定SlbHLH59基因功能突变位点方法流程图。
图4是本发明实施例提供的转基因实验的实验方法流程图。
图5是本发明实施例提供的番茄自然群体的不同亚组果实中AsA的相对含量示意图；
图中：PIM：野生醋栗番茄，SA_CER：起源于南美的樱桃番茄，NSA_CER：起源于非南美的樱桃番茄，UO_CER：起源未知的樱桃番茄，NP_BIG：非加工大果番茄，P_BIG：加工大果番茄。
图6是本发明实施例提供的GWAS定位调控番茄果实苹果酸含量的关键基因示意图；
图中：a：AsA全基因组关联分析的曼哈顿图；b：六号染色上候选区间(64M-64.2M)的关联分析；c：六号染色上候选区间(64M-64.2M)的连锁不平衡block分析；红色星号表示包含绝大部分显著SNP的block23；d：候选LD block 23包含的两个候选基因SlbHLH59和DHUFS。
图7是本发明实施例提供的随机选择的30份番茄材料(15份高AsA材料和15份低AsA材料)果实中AsA的含量图。
图中：(a)和SlbHLH59基因的表达量；(b)检测示意图。
图8是本发明实施例提供的367份重测序番茄材料中SlbHLH59基因的单倍型分析示意图：
图中：a：SlbHLH59基因中检测到的11个多态性位点将SlbHLH59基因分为了四种单倍型：Hap1，Hap2，Hap3和Hap4；图中蓝色模块代表启动子和UTR区域，黑色细长模块代表内含子区域，灰色方框代表外显子区域；其中启动子中的InDel_8导致了启动子中顺式元件5’UTR Py-rich stretch motif的有无；b：SlbHLH59基因四种单倍型材料中AsA的相对含量；c：SlbHLH59基因四种单倍型材料中SlbHLH59基因的表达量。
图9是本发明实施例提供的影响SlbHLH59基因启动子活性的关键突变位点的鉴定示意图；
图中：a：瞬时表达载体pCAMBIA1304的载体图；b：SlbHLH59基因8种不同基因型启动子在拟南芥原生质体中GUS活性的检测。
图10是本发明实施例提供的SlbHLH59基因超量及干涉转基因植株果实中SlbHLH59基因表达量及AsA含量分析示意图；
图中：a：超量表达载体pHELLSGATE8的图谱；b：超量表达载体pHGRV的图谱；c图和d图分别表示SlbHLH59SNP9A超量转基因植株及对照果实中SlbHLH59表达量(c)及AsA含量(d)；e图和f图分别表示SlbHLH59SNP9G超量转基因植株及对照果实中SlbHLH59表达量(c)及AsA含量(d)；g图和h图分别表示SlbHLH59干涉转基因植株及对照果实中SlbHLH59表达量(g)及AsA含量(h)。
图11是本发明实施例提供的SlbHLH59基因在番茄抗氧化胁迫中的作用示意图；
图中：a：MV处理后SlbHLH59SNP9A超量转基因植株及对照叶片细胞坏死情况；b：DAB染色检测叶片H2O2的积累。
图12是本发明实施例提供的SlbHLH59转基因植株及对照果实中AsA代谢相关结构基因的表达量检测示意图；
图中：a：SlbHLH59超量转基因植株及对照果实中AsA代谢相关结构基因的表达量；b：SlbHLH59干涉转基因植株及对照果实中AsA代谢相关结构基因的表达量。
图13是本发明实施例提供的SlbHLH59结合并调控AsA代谢结构基因SlPMM,SlGMP2和SlGMP3的鉴定示意图；
图中：a图和b图分别是酵母单杂交载体pGADT7(a)和pAbAi(b)；c：SlPMM,SlGMP2和SlGMP3基因启动子中E-box元件的位置；d：SlbHLH59与SlPMM,SlGMP2和SlGMP3基因启动子中的E-box元件结合的酵母单杂交验证；e图和f图分别表示双荧光素酶系统中pGreenII62-SK(e)和pGreen II 0800Luc(f)载体图；g图表示构建的SlbHLH59-pGreen II62-SK载体及SlPMM-,SlGMP2-和SlGMP3-pGreen II 0800载体；h：不同载体瞬时表达烟草叶片中LUC/RLU活性检测。
图14是本发明实施例提供的SlbHLH59基因在番茄驯化和改良过程中的分子多样性分析示意图；
图中：a：番茄野生种(WILD)、醋栗番茄(PIM)、樱桃番茄(CER)及大果番茄(BIG)中insertion_8及deletion_8的分布；b：醋栗番茄(PIM)、樱桃番茄(CER)及大果番茄(BIG)中SlbHLH59基因启动子和编码区核苷酸多样性(π)；c：醋栗番茄与樱桃番茄(红线)、樱桃番茄与大果番茄(蓝线)核苷酸多样性(π)频率分析。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供的调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因，所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因gDNA序列为：SEQ ID NO：1。gDNA序列(4025bp)：
ATGGCTAACAACCCTTCTGAGGGACCTTCTGATGATTTCTTTGACCAAATCTTGGGATTTCCTGCTTACAATGGAGCAGAACCTAATTTGGCGGGAAATGATGCCGGAGCTATACCGCCGGCGATGATGCTCCAGCTTAACTCTGGTGATGGGTCAAGTCAGTTTACTGGAGTGGGTCTTGGGGTTGGTTTAGGTGGTGGGGGGTTCCATGGTCATGGTGGGGGTGGTTCTTTTCCTTTAGGGTTGAGTTTAGAACAAGGGAAAGGTGGGTTCTTGAAGATGGATGATGTTTCAGCACCTGGAAGGAGGTTTAGAGATGATGTTGTTGATAGCAGAGCTTCTTCTTCTGTCAAACCTGTAATTATTGCTTATACCTTTTCTTGGTTATTCAGTTTCTTGATTTCTTGTTGGTTGTCATATAATGACTTATACTGTGATGTTCTGCTTCTTTACTTAGAAAGTTTGCTCCTTTTTCTGTGCAAATTGGTGTAGTGTTACCGAAGAAGTTTTTCACTAAAAAAGTTGTTTGTTTTTTCTGAATTTGTTTCTTTCTAGGATTTGTGTATGTGCTTGGTATATGGGAAGTTGTGTTTTTGCTTTCCCTAAACAGAGAGTCTATTGGAAACAACCTCTCTATCTACCTGGCAAGGTAGGATAAAGTCTGCGTGAACTCGACACTCCTCATACCCCAATGGTTGGACTATACTATGTTCTTGGTGGTGGTGGTGTATGGGAAATTCAATTCTGACTTTCTTTTCCTTTTCTGGACTGGTTGCCTTTACTCCAGTATAATTTGGAGTTAAGAATGAGGTTTTTTAAAAATAAGGCTTATATTTGTGTATTCAAGCTAGAGATCATATAGCCTGTTGATTTTAAGACTACTGTTGCTGGCTTTAGAAAATTGGAATTGCACACTTGCCTAGAAAAAGGGGCTTGACATGTAACATTACTTTTTTCTATTCAAGGTGATGTAAGCAAAACCATGGTCCGAGATCTGAATATGAATAAATCTGGCCATTTATTAAGTGATTTTACCAATTGCTTCCTTGAGATACAATCAAAAGCAATGACAAGGTTCTATCTTTACAGGGTTTTCATGGACAACCGATGCCTTCAATGCCGCATCCCCCTGCAATACGTCCAAGGGTGAGAGCTAGGCGAGGACAAGCTACTGATCCACATAGCATAGCGGAGAGGGTATTTTTTTTTTTGCAGCGAAGAGTATTCTAAAGTTATTTAGATTGTCTAACAAGCGGCATATTTTTCTGTTGCTTCTAGCGTTTGGACAGAAGAAAATAATATCCCTTCCTTTATTTGATTGCAACTGTTCAGGGTAAATGAACGAGTTCCTCAGAGTGAAACATTAATCTTTTCACAAGAGGTCATCTAACTAGTTCATATTGTTTCGGGTTATACATAGTTTCTACGAGCATAAGATGTTCTGATAATGCACTGATAAATTACCAAGCCCGATGACCCTAAGCTGCAAATAATGTGTTATTTTAGAATTCAGTTCTGTGTTAGGAAGAATAACATCCTATTTCCGAGCATCAGTTCAAGGTTGAATACTATGTATAAAGGCTTAGGTCCTACTATTCAGTTGCCGCTACTTTACCATTCTAACTGATTTTATTCTTTTCCTGCAGTTACGTAGAGAGAGGATAGCAGAAAGAATTAGAGCATTGCAAGAGTTGGTTCCCAGTGTCAATAAGGTTAGTTTTCTTTCTTCTATATACTGAACTATGTTTCACTTACTGCGAGCATCATTTTGAAAAGATCAAAAAGAAGAGGATTAAACATTGAGACCCCTTTCTTCTCACAGTTTTCTTTTGTGGGCTTGTGCTTATGTACCCAAAGAACTCAGGAATTTGATGGAGCAATATTTGCAGAATTTATGAAAAAACTAAAATCACTACCTCCTCCAACTTTCTTTGTCTGTTCAAGTTATGATGCTATTTTATTGACAGAGAAGCAATAAGGACTTCATAATGAAGAACTATAAGAGACTTCTTTCAGAAATAGTAGGGTCTCATCACATGGATATGACTTCCCCATGTGTACAGTTTTCAATTTTTGTCCCGTGTTTTTTGGTCTTCCCGGAAGAATGTAAAAAAGTCAAAGTTGATTCATTAGGTAACTTTGTCTTCCCTATTTTTCTTCCATAAAGTTTAGTACAGAGTAGCTGATACGCATGATATTATTAGGATACTGCATGACGTATATTGTGGTCCTTATTTCATGTTTGATAGTCACTATTAGAAGATAGTTGTACATATACTGGGTAAAGAGAATTTATTTCAGTATAGTTCGATACGTTAACTGAAGCAGATCTTCAAATTGGTTTAGTTCACTAGGTCTACTTTTGATAATTGAGGGAGGTTGGATTCACACAGAAGCAAAACCAGAAGATGATAGAAATGATAGTCGTTATGAAAATTATTTCGAGAATTAGTTTTTGCATGCTTAAACAAGGTGTCTTGTGCTTAGAAATTGCCAACAAATGTCACAGAAAAGAAGTTAGATCTTTTATTTTATAAGTAGACCAAAATCTATGAATAGGTAAAAACGTGTCTGCATCATTTTCTCTGATTATTCTATAACTTCCCCATCCCCATCAGAGATTGTGGGACAAAGTAAAACGGGTTTATGTATGTTTTATCTCAAGTGATCTTTAGAAGGTTTTGAGAAATTATACGCTTGTATAGGTTTAATGCAAATGTTCAGCCACCCATTTCTAATTCTTCTGGTGCAATAAATCAACGCATTTACAATGTTTGGCATGTTGTAGTTACTGTGCTTTTATCATTCTGTTACGTTTGTCATATCAGTATTCAACTGTTTCCTTTGTCCGTTGGTGTTGCAGACTGATAGAGCTGTAATGCTTGATGAAATTGTAGATTATATCAAATTCCTACGGCTGCAAGTGAAGGTGAGTTGACATACAATCTTTTCAAAAGTTACAATCACGGGTCGCTCTAAATCATTTTGAACCTATCGATGTTGATTTTGGTTGTGAAGGTTCTTTAGAAATGCATTCTGGTACTACTGATAATACTCGGAGCTTCATGTAACTTCTACTTATTAGTTTTTTAAAAAAAAAATGTGTCATGAACGTAATACTTCCAAGGTGCTGAAACTAGCATCTTGACATGATTGGATTTTCTGCATAAAATTCTTTTAAAATGTACTCTCCACGGAATATTCTCACACTTTGCTTTTGCATTGCTCTTTTCAATGACTTTTCATTTCATTCAACAAATGTTCGGATGTCATTTTCTGCGCAGCATATTCCTTAATGGTTAGTTGAATTCGATGTCTATATCAACTGATCAGTAAACAGTCCCCACCCACCCACCCACCCCACGGATATTCGTGTTCAAAGGAAGTTTTGCTGGATGGAAACCGCTCAAATAATTTGAACATGAAAAAGAATTTAATAGTGTAAATGAGAAATGCCATAAAGGATCTCCCACTCACATCATGGAAAAGTTACCTTTCCTCTTTTGAGGGTATAGCACTAGATTTTCTCCTGCTTTTGAATCAATACTTTTTTCCTTGCATTATTGAACCATTTTGGGTACTTTTCTAAGTTAAAAATTATATTTGACACTACAGGTGTTGAGCATGAGTAGGTTAGGAGGAGCTGGTGCAGTAGCACCACTTGTTACAGACATTCCAATATCATCAGTAGAGGTACTTTTTTTTAATTATAATAAGCTTGTTAGACTTCTTTTCTGGAAGATTTGTCCACCTTATTAATTTCTTAATACTTGTGGCTTTGTCTTATTTAGGAAGAGAGCAGTGAAGGTGGAAATAATAACCAACCAGCTTGGGAAAAGTGGTCAAGTGATGGCACAGAAAGGCAAGTGGCTAAACTCATGGAAGAAAATGTTGGTGCTGCAATGCAATTTCTTCAGTCTAAAGCACTATGTATAATGCCTATTTCTCTTGCATCAGCAATTTATCACTCTCAGCCACCAGATACATCAAGTCTTGTTAAGCCAGAAACAAATCCTCCTTCATAG。
本发明实施例提供的调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因cDNA序列为SEQID NO：2。cDNA序列(909bp)：
ATGGCTAACAACCCTTCTGAGGGACCTTCTGATGATTTCTTTGACCAAATCTTGGGATTTCCTGCTTACAATGGAGCAGAACCTAATTTGGCGGGAAATGATGCCGGAGCTATACCGCCGGCGATGATGCTCCAGCTTAACTCTGGTGATGGGTCAAGTCAGTTTACTGGAGTGGGTCTTGGGGTTGGTTTAGGTGGTGGGGGGTTCCATGGTCATGGTGGGGGTGGTTCTTTTCCTTTAGGGTTGAGTTTAGAACAAGGGAAAGGTGGGTTCTTGAAGATGGATGATGTTTCAGCACCTGGAAGGAGGTTTAGAGATGATGTTGTTGATAGCAGAGCTTCTTCTTCTGTCAAACCTGGTTTTCATGGACAACCGATGCCTTCAATGCCGCATCCCCCTGCAATACGTCCAAGGGTGAGAGCTAGGCGAGGACAAGCTACTGATCCACATAGCATAGCGGAGAGGTTACGTAGAGAGAGGATAGCAGAAAGAATTAGAGCATTGCAAGAGTTGGTTCCCAGTGTCAATAAGACTGATAGAGCTGTAATGCTTGATGAAATTGTAGATTATATCAAATTCCTACGGCTGCAAGTGAAGGTGTTGAGCATGAGTAGGTTAGGAGGAGCTGGTGCAGTAGCACCACTTGTTACAGACATTCCAATATCATCAGTAGAGGAAGAGAGCAGTGAAGGTGGAAATAATAACCAACCAGCTTGGGAAAAGTGGTCAAGTGATGGCACAGAAAGGCAAGTGGCTAAACTCATGGAAGAAAATGTTGGTGCTGCAATGCAATTTCTTCAGTCTAAAGCACTATGTATAATGCCTATTTCTCTTGCATCAGCAATTTATCACTCTCAGCCACCAGATACATCAAGTCTTGTTAAGCCAGAAACAAATCCTCCTTCATAG。
本发明实施例提供的利用所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因编码的蛋白质，所述蛋白质的编码区氨基酸序列为：SEQ ID NO:3。氨基酸序列(302AA)
MANNPSEGPSDDFFDQILGFPAYNGAEPNLAGNDAGAIPPAMMLQLNSGDGSSQFTGVGLGVGLGGGGFHGHGGGGSFPLGLSLEQGKGGFLKMDDVSAPGRRFRDDVVDSRASSSVKPGFHGQPMPSMPHPPAIRPRVRARRGQATDPHSIAERLRRERIAERIRALQELVPSVNKTDRAVMLDEIVDYIKFLRLQVKVLSMSRLGGAGAVAPLVTDIPISSVEEESSEGGNNNQPAWEKWSSDGTERQVAKLMEENVGAAMQFLQSKALCIMPISLASAIYHSQPPDTSSLVKPETNPPS。
本发明实施例提供的一种利用所述调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因插入/缺失获得的分子标记，所述分子标记的多态性位点为indel_8，核苷酸序列为：SEQ IDNO:4。
启动子序列(ATG上游3323bp)
ACACAATTCATACATTATTATATACATGTATTTTGGTCCAATGCTATGTCGAAATGTTGCAAAATATAAAGTAAAGAAATGATAAAATATCTCATTTAAAGAAGTTAATATCTTTTTCTTACAGAATATGTTTGTTGAATGTCATTATTGAAGGTTCTTTTATACAATCCAGGAAGCACATATTCTTTTAATAAGGAATTATTCATTTGTGCTAATGACATAAATGTTTTGATTAGAAAGAGATTAATTTACAACAAAAGCATTTGTGTTGTATATATTTTTAGCAAAACTAGATTCTTTGGTACTAGATACTAGATGCCTAAAATGTTTTGTTTACAGTATAATACAGGTTGAGTCTATATATAATGCTAAATATTAACTACATTTTATTAATTTGCATTTATATAAAAAATGATAGCTTGTTTCAATTAGCTCAATAACTTAATAATACATAATAATTTGACTATGCAAGTTTACATATATAAACATGAAAATTATGCAAAAACCTTACATATTTTCCTCCAGGAAATGCATTTTTGGTTTTTTGTTCTTTCTATAGATGTATCTTTTAGTCACTTTAGACTTGCTATGAGTTTTTAGCCATTATTTGAATTTAAATAGCGGAATGAATTATATTTCAATGCAAAAATATTCCTATTGACATTAAAAAAAAAAAAAAAAACTTATAACGACCTGAACCTATGAATCATTTCTTGATTTCGTTGGGGATATTTTGATCCATTTTTATTCGTGTCAAAAGAATATGGTTAAATGATTATTTAGAACTTTTGAAATAGTGGTTAATATTTGATAGGAGGTGTTAAAAATAGGTATTTACCTAATTCATCCATCTTGTTATATCAGCTTTTATCTATTAACAAACTCTCTATTATAATTATGTTTTACTTAGTTATGAGTGATTATAGTAACTCCCATGTGATTTGGTAAGGAGTTAATCAACTTTTAATAATTTGAGTTAGGTAGTGTTTGGCATATTTTAATGAGTTAGTTTATAACACTAATCTCTATTAGATTAGATAATAAAGTAGAGGTTTAGTTAAAGTGGAAGTGCTTAGGACAAACAAGTAAGGTCAAATTCCATCAAATTATTAGTTTATGTCCAACTTTATAACCACTTTCTCAAATTTATCTAGTGTGCAAATTGGCATGAATGTAATTTTTGGCCATACTACTTGTTTGCTTCTAATTTTATTTTTAATAAAATAACTCAAAATTGTACTAACAAATTTTTAGCTTGTTTGATTAAGATTTAAAATTTATTTATTTGATAAATATGTTTTGCTAAATAATTTATGTTTGATTAGTTTATTGAAAAAATATTTTTATTAATAATAAAGCAATGATTTATTAATGATCAAAGATTTCGAAAATGCTTCTGAAGTATAAAAAATATTATTGATATATAGGAGTAAACTTTAAGCGTGAGATAAAATTTAGGGAAAATTGTATCTAATGGTAAATTAATAAATTAAATTAATTGCTATAATCACCCTTTGATTTAATTGTGTCTCGTAGCAAATTGTTTGTCAGTCACCTCTCTCCCTCAAACTCTCGCTCGCCACTCTCCTCTCTCGCTCGCTTCCTCTCACTTTTATACAAACATAAGTGTATAAAATTTGTTTCTATTTGTATAAAGAGAGAGAAAGTTGTATAAATACATATAATTTTGTTCCCCTCTCTCCCCTCTCCCAGATCTCGCTCGCCACTCTCCCTGATCTCGCTCGCCTCTCTCGCTTATACAAATAGAAACGAAATGTATAAATTGTGTTTTTGTTTGTATAAAGCGAGAGAAAATTGTATATACACATGGAAGTACATATATTTTCGTCATATACACTTATAATTATATAATAAAATACTTTCCTGCCCAGTTTCTTTTGCCTTTCTCTCTTTCTCATTTTATACAAATTCAAATTGTATATAATTTCTTTCTTTCTCGTTTATACAATTAGATTCAATTATATATTTTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCATTTTATACAATTCTAATTGTATATAATCGTTCTATACACTTATAATATACAATTCATTTTATACACTTCGTTTTATACAATTCTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCTTTCTCGTTTTATACACTTCTATTTTATACAATTTGCTTCAATTGTATATGTATAGCGAATTATATATTTATATGTTTGTTATGGAGTGCAATTATGCAAACTTTGCTATAGCATACAAATATGAATTTTATGTTTGCTATATGTGAAAGTTGACTAAAATTTATAGCATCTTTGATTAACGGTAATAGATAAATTTATATTGTTAACTAAACCACTTAAATTTTTGTCTCAAACTTAATCATAGATATATCATCTTATCGCATCATCTATCTCTTAAATCTGAGCGGGAATAAATTAATCCAAATATATAGTTTTAAAAATATAATGTTGAGATAATCTAATCCACAAATTAAAAAAAAAAAAGAGTTTAAATAATTTCCTTGTTTATTCATATCATCTTTATACAAAAGTCATAGACGTATTAATTTTTATTACCTTTTTAGTCCCACTTGAATGTCTTTCTTTCCAATATATTATATAAATATACAAAACATGAAACACTAGAGAGTATATTTAAGCTAGTCTTTTTTAACAAAGAAAAAAGGATACTTTTTCTCAAAATTTTTCATTTTTAAATTATTGATGGTCTTAAAAATATGTTTTCACTTGATTAATTAAATTTAAATATGAATTTTTGTCTAATTTAATAATAATTTTAAAATTTCTCTCAATTTTTCATTAAAAGTCTCATACAAATTTGTAATTCTAATGTTGTAAGATGGTAGATCGAAATGTAATAAATTTAATTAATTAAATAAAAAATAATTTTTAAAGCTAATAATAGTTCAAGAATAAAAATAATAATTTATTCCAAACTATAAAAAAACTCAAAATACTTCTCTCAAATAAATATTTATTTAAGCAATTGCTTTTAGTGACACCATTGAAGCAAACAATATATTTAAGCAAAGCTTTAGGTGACTCCCTTTCCTTTATTTTCTTCATGGCTCTCACTGCTCTTTAGAAAGTAGCAAAACACACACACAAACAACCCAAAACACACACTTCCATTTCCATTTTTTGCCTATATATATATATATATATGTAACAAGTACTTGTTAGAGTACTAATTTGTACACCCTCTTATCAATTCCGTTGTAAAGAACACTTTTTTAACTAGTATTTGTTCAATTGAATGCTTTTCTGAGGAATTAAGGTGGTCGAAAACAGCTCCGATCCAAGAAAGATTGAATCTTTATAGTTTCTGCT。
下面结合附图对本发明的应用原理做详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供的调控番茄果实中抗坏血酸含量的SlbHLH59基因应用方法为：
S101：选取302份番茄核心种质红熟果实，利用其代谢物的GC-MS测定数据和4.2M重测序获得的SNP数据，采用全基因组关联分析从番茄中克隆获得了SlbHLH基因，并命名为SlbHLH59；
S102：根据SlbHLH59基因启动子和编码区中的突变位点，分别设计瞬时表达实验和转基因实验，确定功能突变位点。
本发明实施例提供的SlbHLH59基因的gDNA序列如序列表SEQ ID NO:1所示，它包含4025个碱基对：cDNA序列如序列表SEQ ID NO:2所示，它包含909个碱基对：其编码区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，它包括302个氨基酸；该基因的启动子序列如SEQ ID NO:4所示，它包含8个碱基的插入/缺失。
如图2所示，本发明实施例提供的SlbHLH59基因的定位方法为：
S201：利用4.2M高质量SNP在302个番茄品种中对果实AsA进行关联分析，基于番茄基因组序列版本SL 2.50鉴定了SNP的物理位置；
S202：基于显著显著SNP的位置，对包含大多数显著SNP的Block23进行鉴定，确定两个基因SlbHLH59和DHUFS；
S203：根据极端材料中AsA含量的分析及基因表达量分析，确定SlbHLH59基因是最可能的候选基因。
本发明实施例提供的SlbHLH59基因的定位方法的对果实AsA进行关联分析采用的是TASSEL 4.052软件中的压缩混合线性模型，SNP的P-value阈值设为2.4×10-7。
如图3所示，本发明实施例提供的确定SlbHLH59基因启动子功能突变位点方法为：
S301：针对SlbHLH59基因启动子的1个indel突变和3个SNP突变将SlbHLH59基因的启动子分为8种基因型(P1-P8)，其中：P1，P2，P3和P4基因型包含indel_8缺失的启动子；P5，P6，P7和P8基因型包含indel_8插入的启动子；
S302：以TS186的gDNA为模板，用Phanta酶进行PCR扩增获得不同基因型启动子，所有的PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段，用SpeI+XbaI双酶切pCAMBIA1304空载(图9a)，切胶回收载体骨架并与8种不同基因型SlbHLH59基因的启动子片段进行同源重组得到不同启动子；
S303：将1μl双酶切线性化的pCAMBIA1304质粒和1μl不同基因型启动子扩增片段混合，加入1μl的ExnaseTM II，2μl 5xCE II buffer，最后用ddH2O补齐至10μl，37℃反应30min后立即冰浴5min，热激法转化T1感受态细胞，对单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆；
S304：pCAMBIA1304载体选择标记基因为卡那霉素(Kan)，抽提PCR阳性克隆的质粒进行测序验证，以CaMV35S::LUC空载为对照，将不同基因型启动子的表达载体pCAMBIA1304-Promoter和CaMV35S::LUC空载共转入拟南芥原生质体，进行转化和GUS活性测定。
本发明实施例提供的确定SlbHLH59基因功能突变位点方法中基因型SlbHLH59基因的重组表达载体为：pCAMBIA1304-P1到pCAMBIA1304-P8；
SEQ ID NO:11
pCAMBIA1304-P1TGCAAAAACCTTACATATTTTCCTCCAGGAAATGCATTTTTGGTTTTTTGTTCTTTCTATAGATGTATCTTTTAGTCACTTTAGACTTGCTATGAGTTTTTAGCCATTATTTGAATTTAAATAGCGGAATGAATTATATTTCAATGCAAAAATATTCCTATTGACATTAAAAAAAAAAAAAAAAACTTATAACGACCTGAACCTATGAATCATTTCTTGATTTCGTTGGGGATATTTTGATCCATTTTTATTCGTGTCAAAAGAATATGGTTAAATGATTATTTAGAACTTTTGAAATAGTGGTTAATATTTGATAGGAGGTGTTAAAAATAGGTATTTACCTAATTCATCCATCTTGTTATATCAGCTTTTATCTATTAACAAACTCTCTATTATAATTATGTTTTACTTAGTTATGAGTGATTATAGTAACTCCCATGTGATTTGGTAAGGAGTTAATCAACTTTTAATAATTTGAGTTAGGTAGTGTTTGGCATATTTTAATGAGTTAGTTTATAACACTAATCTCTATTAGATTAGATAATAAAGTAGAGGTTTAGTTAAAGTGGAAGTGCTTAGGACAAACAAGTAAGGTCAAATTCCATCAAATTATTAGTTTATGTCCAACTTTATAACCACTTTCTCAAATTTATCTAGTGTGCAAATTGGCATGAATGTAATTTTTGGCCATACTACTTGTTTGCTTCTAATTTTATTTTTAATAAAATAACTCAAAATTGTACTAACAAATTTTTAGCTTGTTTGATTAAGATTTAAAATTTATTTATTTGATAAATATGTTTTGCTAAATAATTTATGTTTGATTAGTTTATTGAAAAAATATTTTTATTAATAATAAAGCAATGATTTATTAATGATCAAAGATTTCGAAAATGCTTCTGAAGTATAAAAAATATTATTGATATATAGGAGTAAACTTTAAGCGTGAGATAAAATTTAGGGAAAATTGTATCTAATGGTAAATTAATAAATTAAATTAATTGCTATAATCACCCTTTGATTTAATTGTGTCTCGTAGCAAATTGTTTGTCAGTCACCTCTCTCCCTCAAACTCTCGCTCGCCACTCTCCTCTCTCGCTCGCTTCCTCTCACTTTTATACAAACATAAGTGTATAAAATTTGTTTCTATTTGTATAAAGAGAGAGAAAGTTGTATAAATACATATAATTTTGTTCCCCTCTCTCCCCTCTCCCAGATCTCGCTCGCCACTCTCCCTGATCTCGCTCGCCTCTCTCGCTTATACAAATAGAAACGAAATGTATAAATTGTGTTTTTGTTTGTATAAAGCGAGAGAAAATTGTATATACACATGGAAGTACATATATTTTCGTCATATACACTTATAATTATATAATAAAATACTTTCCTGCCCAGTTTCTTTTGCCTTTCTCTCTTTCTCATTTTATACAAATTCAAATTGTATATAATTTCTTTCTTTCTCGTTTATACAATTAGATTCAATTATATATTTTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCATTTTATACAATTCTAATTGTATATAATCGTTCTATACACTTATAATATACAATTCATTTTATACACTTCGTTTTATACAATTCTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCTTTCTCGTTTTATACACTTCTATTTTATACAATTTGCTTCAATTGTATATGTATAGCGAATTATATATTTATATGTTTGTTATGGAGTGCAATTATGCAAACTTTGCTATAGCATACAAATATGAATTTTATGTTTGCTATATGTGAAAGTTGACTAAAATTTATAGCATCTTTGATTAACGGTAATAGATAAATTTATATTGTTAACTAAACCACTTAAATTTTTGTCTCAAACTTAATCATAGATATATCATCTTATCGCATCATCTATCTCTTAAATCTGAGCGGGAATAAATTAATCCAAATATATAGTTTTAAAAATATAATGTTGAGATAATCTAATCCACAAATTAAAAAAAAAAAAGAGTTTAAATAATTTCCTTGTTTATTCATATCATCTTTATACAAAAGTCATAGACGTATTAATTTTTATTACCTTTTTAGTCCCACTTGAATGTCTTTCTTTCCAATATATTATATAAATATACAAAACATGAAACACTAGAGAGTATATTTAAGCTAGTCTTTTTTAACAAAGAAAAAAGGATACTTTTTCTCAAAATTTTTCATTTTTAAATTATTGATGGTCTTAAAAATATGTTTTCACTTGATTAATTAAATTTAAATATGAATTTTTGTCTAATTTAATAATAATTTTAAAATTTCTCTCAATTTTTCATTAAAAGTCTCATACAAATTTGTAATTCTAATGTTGTAAGATGGTAGATCGAAATGTAATAAATTTAATTAATTAAATAAAAAATAATTTTTAAAGCTAATAATAGTTCAAGAATAAAAATAATAATTTATTCCAAACTATAAAAAAACTCAAAATACTTCTCTCAAATAAATATTTATTTAAGCAATTGCTTTTAGTGACACCATTGAAGCAAACAATATATTTAAGCAAAGCTTTAGGTGACTCCCTTTCCTTTATTTTCTTCATGGCTCTCACTGCTCTTTAGAAAGTAGCAAAACACACACACAAACAACCCAAAACACACACTTCCATTTCCATTTTTTGCCTATATATATATATATATATGTAACAAGTACTTGTTAGAGTACTAATTTGTACACCCTCTTATCAATTCCGTTGTAAAGAACACTTTTTTAACTAGTATTTGTTCAATTGAATGCTTTTCTGAGGAATTAAGGTGGTCGAAAACAGCTCCGATCCAAGAAAGATTGAATCTTTATAGTTTCTGCT
SEQ ID NO:12
pCAMBIA1304-P2TGCAAAAACCTTACATATTTTCCTCCAGGAAATGCATTTTTGGTTTTTTGTTCTTTCTATAGATGTATCTTTTAGTCACTTTAGACTTGCTATGAGTTTTTAGCCATTATTTGAATTTAAATAGCGGAATGAATTATATTTCAATGCAAAAATATTCCTATTGACATTAAAAAAAAAAAAAAAAACTTATAACGACCTGAACCTATGAATCATTTCTTGATTTCGTTGGGGATATTTTGATCCATTTTTATTCGTGTCAAAAGAATATGGTTAAATGATTATTTAGAACTTTTGAAATAGTGGTTAATATTTGATAGGAGGTGTTAAAAATAGGTATTTACCTAATTCATCCATCTTGTTATATCAGCTTTTATCTATTAACAAACTCTCTATTATAATTATGTTTTACTTAGTTATGAGTGATTATAGTAACTCCCATGTGATTTGGTAAGGAGTTAATCAACTTTTAATAATTTGAGTTAGGTAGTGTTTGGCATATTTTAATGAGTTAGTTTATAACACTAATCTCTATTAGATTAGATAATAAAGTAGAGGTTTAGTTAAAGTGGAAGTGCTTAGGACAAACAAGTAAGGTCAAATTCCATCAAATTATTAGTTTATGTCCAACTTTATAACCACTTTCTCAAATTTATCTAGTGTGCAAATTGGCATGAATGTAATTTTTGGCCATACTACTTGTTTGCTTCTAATTTTATTTTTAATAAAATAACTCAAAATTGTACTAACAAATTTTTAGCTTGTTTGATTAAGATTTAAAATTTATTTATTTGATAAATATGTTTTGCTAAATAATTTATGTTTGATTAGTTTATTGAAAAAATATTTTTATTAATAATAAAGCAATGATTTATTAATGATCAAAGATTTCGAAAATGCTTCTGAAGTATAAAAAATATTATTGATATATAGGAGTAAACTTTAAGCGTGAGATAAAATTTAGGGAAAATTGTATCTAATGGTAAATTAATAAATTAAATTAATTGCTATAATCACCCTTTGATTTAATTGTGTCTCGTAGCAAATTGTTTGTCAGTCACCTCTCTCCCTCAAACTCTCGCTCGCCACTCTCCTCTCTCGCTCGCTTCCTCTCACTTTTATACAAACATAAGTGTATAAAATTTGTTTCTATTTGTATAAAGAGAGAGAAAGTTGTATAAATACATATAATTTTGTTCCCCTCTCTCCCCTCTCCCAGATCTCGCTCGCCACTCTCCCTGATCTCGCTCGCCTCTCTCGCTTATACAAATAGAAACGAAATGTATAAATTGTGTTTTTGTTTGTATAAAGCGAGAGAAAATTGTATATACACATGGAAGTACATATATTTTCGTCATATACACTTATAATTATATAATAAAATACTTTCCTGCCCAGTTTCTTTTGCCTTTCTCTCTTTCTCATTTTATACAAATTCAAATTGTATATAATTTCTTTCTTTCTCGTTTATACAATTAGATTCAATTATATATTTTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCATTTTATACAATTCTAATTGTATATAATCGTTCTATACACTTATAATATACAATTCATTTTATACACTTCGTTTTATACAATTCTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCTTTCTCGTTTTATACACTTCTATTTTATACAATTTGCTTCAATTGTATATGTATAGCGAATTATATATTTATATGTTTGTTATGGAGTGCAATTATGCAAACTTTGCTATAGCATACAAATATGAATTTTATGTTTGCTATATGTGAAAGTTGACTAAAATTTATAGCATCTTTGATTAACGGTAATAGATAAATTTATATTGTTAACTAAACCACTTAAATTTTTGTCTCAAACTTAATCATAGATATATCATCTTATCGCATCATCTATCTCTTAAATCTGAGCGGGAATAAATTAATCCAAATATATAGTTTTAAAAATATAATGTTGAGATAATCTAATCCACAAATTAAAAAAAAAAAAGAGTTTAAATAATTTCCTTGTTTATTCATATCATCTTTATACAAAAGTCATAGACGTATTAATTTTTATTACCTTTTTAGTCCCACTTGAATGTCTTTCTTTCCAATATATTATATAAATATACAAAACATGAAACACTAGAGAGTATATTTAAGCTAGTCTTTTTTAACAAAGAAAAAAGGATACTTTTTCTCAAAATTTTTCATTTTTAAATTATTGATGGTCTTAAAAATATGTTTTCACTTGATTAATTAAATTTAAATATGAATTTTTGTCTAATTTAATAATAATTTTAAAATTTCTCTCAATTTTTCATTAAAAGTCTCATACAAATTTGTAATTCTAATGTTGTAAGATGGTAGATCGAAATGTAATAAATTTAATTAATTAAATAAAAAATAATTTTTAAAGCTAATAATAGTTCAAGAATAAAAATAATAATTTATTGCAAACTATAAAAAAACTCAAAATACTTCTCTCAAATAAATATTTATTTAAGCAATTGCTTTTAGTGACACCATTGAAGCAAACAATATATTTAAGCAAAGCTTTAGGTGACTCCCTTTCCTTTATTTTCTTCATGGCTCTCACTGCTCTTTAGAAAGTAGCAAAACACACACACAAACAACCCAAAACACACACTTCCATTTCCATTTTTTGCCTATATATATATATATATATGTAACAAGTACTTGTTAGAGTACTAATTTGTACACCCTCTTATCAATTCCGTTGTAAAGAACACTTTTTTAACTAGTATTTGTTCAATTGAATGCTTTTCTGAGGAATTAAGGTGGTCGAAAACAGCTCCGATCCAAGAAAGATTGAATCTTTATAGTTTCTGCT
SEQ ID NO:13
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SEQ ID NO:14 pCAMBIA1304-P4
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SEQ ID NO:15 pCAMBIA1304-P5
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SEQ ID NO:16 pCAMBIA1304-P6
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SEQ ID NO:17 pCAMBIA1304-P7
TGCAAAAACCTTACATATTTTCCTCCAGGAAATGCATTTTTGGTTTTTTGTTCTTTCTATAGATGTATCTTTTAGTCACTTTAGACTTGCTATGAGTTTTTAGCCATTATTTGAATTTAAATAGCGGAATGAATTATATTTCAATGCAAAAATATTCCTATTGACATTAAAAAAAAAAAAAAAAACTTATAACGACCTGAACCTATGAATCATTTCTTGATTTCGTTGGGGATATTTTGATCCATTTTTATTCGTGTCAAAAGAATATGGTTAAATGATTATTTAGAACTTTTGAAATAGTGGTTAATATTTGATAGGAGGTGTTAAAAATAGGTATTTACCTAATTCATCCATCTTGTTATATCAGCTTTTATCTATTAACAAACTCTCTATTATAATTATGTTTTACTTAGTTATGAGTGATTATAGTAACTCCCATGTGATTTGGTAAGGAGTTAATCAACTTTTAATAATTTGAGTTAGGTAGTGTTTGGCATATTTTAATGAGTTAGTTTATAACACTAATCTCTATTAGATTAGATAATAAAGTAGAGGTTTAGTTAAAGTGGAAGTGCTTAGGACAAACAAGTAAGGTCAAATTCCATCAAATTATTAGTTTATGTCCAACTTTATAACCACTTTCTCAAATTTATCTAGTGTGCAAATTGGCATGAATGTAATTTTTGGCCATACTACTTGTTTGCTTCTAATTTTATTTTTAATAAAATAACTCAAAATTGTACTAACAAATTTTTAGCTTGTTTGATTAAGATTTAAAATTTATTTATTTGATAAATATGTTTTGCTAAATAATTTATGTTTGATTAGTTTATTGAAAAAATATTTTTATTAATAATAAAGCAATGATTTATTAATGATCAAAGATTTCGAAAATGCTTCTGAAGTATAAAAAATATTATTGATATATAGGAGTAAACTTTAAGCGTGAGATAAAATTTAGGGAAAATTGTATCTAATGGTAAATTAATAAATTAAATTAATTGCTATAATCACCCTTTGATTTAATTGTGTCTCGTAGCAAATTGTTTGTCAGTCACCTCTCTCCCTCAAACTCTCGCTCGCCACTCTCCTCTCTCGCTCGCTTCCTCTCACTTTTATACAAACATAAGTGTATAAAATTTGTTTCTATTTGTATAAAGAGAGAGAAAGTTGTATAAATACATATAATTTTGTTCCCCTCTCTCCCCTCTCCCAGATCTCGCTCGCCACTCTCCCTGATCTCGCTCGCCTCTCTCGCTTATACAAATAGAAACGAAATGTATAAATTGTGTTTTTGTTTGTATAAAGCGAGAGAAAATTGTATATACACATGGAAGTACATATATTTTCGTCATATACACTTATAATTATATAATAAAATACTTTCCTGCCCAGTTTCTTTTGCCTTTCTCTCTTTCTCATTTTATACAAATTCAAATTGTATATAATTTCTTTCTTTCTCGTTTATACAATTAGATTCAATTATATATTTTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCTCTTTCTCATTTTATACAATTCTAATTGTATATAATCGTTCTATACACTTATAATATACAATTCATTTTATACACTTCGTTTTATACAATTCTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCTTTCTCGTTTTATACACTTCTATTTTATACAATTTGCTTCAATTGTATATGTATAGCGAATTATATATTTATATGTTTGTTATGGAGTGCAATTATGCAAACTTTGCTATAGCATACAAATATGAATTTTATGTTTGCTATATGTGAAAGTTGACTAAAATTTATAGCATCTTTGATTAACGGTAATAGATAAATTTATATTGTTAACTAAACCACTTAAATTTTTGTCTCAAACTTAATCATAGATATATCATCTTATCGCATCATCTATCTCTTAAATCTGAGCGGGAATAAATTAATCCAAATATATAGTTTTAAAAATATAATGTTGAGATAATCTAATCCACAAATTAAAAAAAAAAAAGAGTTTAAATAATTTCCTTGTTTATTCATATCATCTTTATACAAAAGTCATAGACGTATTAATTTTTATTACCTTTTTAGTCCCACTTGAATGTCTTTCTTTCCAATATATTATATAAATATACAAAACATGAAACACTAGAGAGTATATTTAAGCTAGTCTTTTTTAACAAAGAAAAAAGGATACTTTTTCTCAAAATTTTTCATTTTTAAATTATTGATGGTCTTAAAAATATGTTTTCACTTGATTAATTAAATTTAAATATGAATTTTTGTCTAATTTAATAATAATTTTAAAATTTCTCTCAATTTTTCATTAAAAGTCTCATACAAATTTGTAATTCTAATGCTGTAAGATGGTAGATCGAAATGTAATAAATTTAATTAATTAAATAAAAAATAATTTTTAAAGCTAATAATAGTTCAAGAATAAAAATAATAATTTATTCCAAACTATAAAAAAACTCAAAATACTTCTCTCAAATAAATATTTATTTAAGCAATTGCTTTTAGTGACACCATTGAAGCAAACAATATATTTAAGCAAAGCTTTAGGTGACTCCCTTTCCTTTATTTTCTTCATGGCTCTCACTGCTCTTTAGAAAGTAGCAAAACACACACACAAACAACCCAAAACACACACTTCCATTTCCATTTTTTGCCTATATATATATATATATATGTAACAAGTACTTGTTAGAGTACTAATTTGTACACCCTCTTATCAATTCCGTTGTAAAGAACACTTTTTTAACTAGTATTTGTTCAATTGAATGCTTTTCTGAGGAATTAAGGTGGTCGAAAACAGCTCCGATCCAAGAAAGATTGAATCTTTATAGTTTCTGCT
SEQ ID NO:18pCAMBIA1304-P8
TGCAAAAACCTTACATATTTTCCTCCAGGAAATGCATTTTTGGTTTTTTGTTCTTTCTATAGATGTATCTTTTAGTCACTTTAGACTTGCTATGAGTTTTTAGCCATTATTTGAATTTAAATAGCGGAATGAATTATATTTCAATGCAAAAATATTCCTATTGACATTAAAAAAAAAAAAAAAAACTTATAACGACCTGAACCTATGAATCATTTCTTGATTTCGTTGGGGATATTTTGATCCATTTTTATTCGTGTCAAAAGAATATGGTTAAATGATTATTTAGAACTTTTGAAATAGTGGTTAATATTTGATAGGAGGTGTTAAAAATAGGTATTTACCTAATTCATCCATCTTGTTATATCAGCTTTTATCTATTAACAAACTCTCTATTATAATTATGTTTTACTTAGTTATGAGTGATTATAGTAACTCCCATGTGATTTGGTAAGGAGTTAATCAACTTTTAATAATTTGAGTTAGGTAGTGTTTGGCATATTTTAATGAGTTAGTTTATAACACTAATCTCTATTAGATTAGATAATAAAGTAGAGGTTTAGTTAAAGTGGAAGTGCTTAGGACAAACAAGTAAGGTCAAATTCCATCAAATTATTAGTTTATGTCCAACTTTATAACCACTTTCTCAAATTTATCTAGTGTGCAAATTGGCATGAATGTAATTTTTGGCCATACTACTTGTTTGCTTCTAATTTTATTTTTAATAAAATAACTCAAAATTGTACTAACAAATTTTTAGCTTGTTTGATTAAGATTTAAAATTTATTTATTTGATAAATATGTTTTGCTAAATAATTTATGTTTGATTAGTTTATTGAAAAAATATTTTTATTAATAATAAAGCAATGATTTATTAATGATCAAAGATTTCGAAAATGCTTCTGAAGTATAAAAAATATTATTGATATATAGGAGTAAACTTTAAGCGTGAGATAAAATTTAGGGAAAATTGTATCTAATGGTAAATTAATAAATTAAATTAATTGCTATAATCACCCTTTGATTTAATTGTGTCTCGTAGCAAATTGTTTGTCAGTCACCTCTCTCCCTCAAACTCTCGCTCGCCACTCTCCTCTCTCGCTCGCTTCCTCTCACTTTTATACAAACATAAGTGTATAAAATTTGTTTCTATTTGTATAAAGAGAGAGAAAGTTGTATAAATACATATAATTTTGTTCCCCTCTCTCCCCTCTCCCAGATCTCGCTCGCCACTCTCCCTGATCTCGCTCGCCTCTCTCGCTTATACAAATAGAAACGAAATGTATAAATTGTGTTTTTGTTTGTATAAAGCGAGAGAAAATTGTATATACACATGGAAGTACATATATTTTCGTCATATACACTTATAATTATATAATAAAATACTTTCCTGCCCAGTTTCTTTTGCCTTTCTCTCTTTCTCATTTTATACAAATTCAAATTGTATATAATTTCTTTCTTTCTCGTTTATACAATTAGATTCAATTATATATTTTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCTCTTTCTCATTTTATACAATTCTAATTGTATATAATCGTTCTATACACTTATAATATACAATTCATTTTATACACTTCGTTTTATACAATTCTCTGTCCAAGTCTCTTTCTCTTTCTCGTTTTATACACTTCTATTTTATACAATTTGCTTCAATTGTATATGTATAGCGAATTATATATTTATATGTTTGTTATGGAGTGCAATTATGCAAACTTTGCTATAGCATACAAATATGAATTTTATGTTTGCTATATGTGAAAGTTGACTAAAATTTATAGCATCTTTGATTAACGGTAATAGATAAATTTATATTGTTAACTAAACCACTTAAATTTTTGTCTCAAACTTAATCATAGATATATCATCTTATCGCATCATCTATCTCTTAAATCTGAGCGGGAATAAATTAATCCAAATATATAGTTTTAAAAATATAATGTTGAGATAATCTAATCCACAAATTAAAAAAAAAAAAGAGTTTAAATAATTTCCTTGTTTATTCATATCATCTTTATACAAAAGTCATAGACGTATTAATTTTTATTACCTTTTTAGTCCCACTTGAATGTCTTTCTTTCCAATATATTATATAAATATACAAAACATGAAACACTAGAGAGTATATTTAAGCTAGTCTTTTTTAACAAAGAAAAAAGGATACTTTTTCTCAAAATTTTTCATTTTTAAATTATTGATGGTCTTAAAAATATGTTTTCACTTGATTAATTAAATTTAAATATGAATTTTTGTCTAATTTAATAATAATTTTAAAATTTCTCTCAATTTTTCATTAAAAGTCTCATACAAATTTGTAATTCTAATGTTGTAAGATGGTAGATCGAAATGTAATAAATTTAATTAATTAAATAAAAAATAATTTTTAAAGCTAATAATAGTTCAAGAATAAAAATAATAATTTATTCCAAACTATAAAAAAACTCAAAATACTTCTCTCAAATAAATATTTATTTAAGCAATTGCTTTTAGTGACACCATTGAAGCAAACAATATATTTAAGCAAAGCTTTAGGTGACTCCCTTTCCTTTATTTTCTTCATGGCTCTCACTGCTCTTTAGAAAGTAGCAAAACACACACACAAACAACCCAAAACACACACTTCCATTTCCATTTTTTGCCTATATATATATATATATATGTAACAAGTACTTGTTAGAGTACTAATTTGTACACCCTCTTATCAATTCCGTTGTAAAGAACACTTTTTTAACTAGTATTTGTTCAATTGAATGCTTTTCTGAGGAATTAAGGTGGTCGAAAACAGCTCCGATCCAAGAAAGATTGAATCTTTATAGTTTCTGCT
本发明实施例提供的确定SlbHLH59基因功能突变位点方法中步骤三中单克隆进行菌落PCR鉴定阳性克隆所用的引物是：
正向引物：5'TGCAAAAACCTTACATATTTTCCTC 3'，SEQ ID NO:5.
反向引物：5'AGGTCCCTCAGAAGGGTTGT 3'，SEQ ID NO:6。
如图4所示，本发明实施例提供的转基因实验的实验方法为：
S401：分别以不同抗坏血酸含量的材料样本TS186和TS265的cDNA为模板，用Phanta酶进行PCR扩增获得SlbHLH59基因第四个外显子的非同义突变基因型，即SlbHLH59SNP9A和SlbHLH59SNP9G；
S402：所有的PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段，用XhoI+XbaI双酶切pHELLSGATE8空载，切胶回收载体骨架并与基因型SNP9A和SNP9G的SlbHLH59基因片段进行同源重组得到不同基因型SlbHLH59基因的重组表达载体GATE8-SlbHLH59SNP9A和GATE8-SlbHLH59SNP9G；
S403：以TS-186为模板扩增SlbHLH59基因的干涉片段，PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段，利用BP酶将回收的干涉片段与pHGRV进行BP反应，
S404：将超量和干涉的重组载体，热激法转化T1感受态细胞，将不同基因型的超量表达载体GATE8-SlbHLH59转入低抗坏血酸番茄材料TS186，将pHGRV-SlbHLH59转入高抗坏血酸番茄材料TS265获得了转基因植株。
本发明实施例提供的转基因实验的实验方法中用到的引物序列为：
正向引物
5'CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGGTTTCTGCTATGGCTAACAACCCTT3'，SEQ ID NO:7；
反向引物
5'TCTCATTAAAGCAGGACTCTAGACTATGAAGGAGGATTTGTTTCTGGC3'，SEQ ID NO:8。
本发明实施例提供的转基因实验的实验方法中用到的特异引物正向引物5'AAAAAGCAGGCTGTCAAGTCAGTTTACTGGAGTGGG3'，SEQ ID NO:9；
反向引物5'AGAAAGCTGGGTTATTGACACTGGGAACCAACTCTT3'，SEQ ID NO:10。
下面结合具体实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
番茄材料果实抗坏血酸测定
抗坏血酸的测定包括还原型抗坏血酸和总抗坏血酸的测定，其中总抗坏血酸包括还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸。具体步骤如下：
步骤一：样品制备：选取待测样品鲜样，用液氮速冻，研磨成粉末状，用液氮预冷的2mL离心管称取0.2g左右的叶片粉末或者0.4g左右的果实粉末，加入1mL冰上预冷的6％的TCA溶液，充分混匀，在冰上避光抽提15min，4℃离心机12000r/min离心15min；样品的处理与抗坏血酸测定；
步骤二：总抗坏血酸测定：取20μL样品上清液于干净的酶标板中，加入20μL浓度为5mmol/L的DTT溶液，平板离心机离心混匀后37℃培养箱温浴20min，反应完成后，加入10μL浓度为0.5％的NEM，室温反应1min，然后加入80μL的Color Reagent，平板离心机混匀后在37℃培养箱暗反应60min，酶标仪测定550nm波长下的吸光值。
还原型抗坏血酸的含量测定：取20μL样品上清液于干净的酶标板中，加入30μL0.4mol/L的PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4)，再加入80μL Color Reagent，平板离心机混匀后在37℃培养箱暗反应60min，酶标仪测定550nm波长下的吸光值。
抗坏血酸标准曲线的制备：以还原型抗坏血酸为标样，用6％TCA溶液稀释成不同浓度梯度的抗坏血酸溶液，吸取20μL于酶标板中，按还原性型抗坏血酸的测定方法进行测定，以横坐标为吸光值、纵坐标为20μL中抗坏血酸的质量(μg)绘制标准曲线。
试剂配制:
表1试剂与配置方法
Figure BDA0001812513260000081
实施例2
番茄材料果实中各基因表达量分析
提取相关材料果实RNA，用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA。利用LightCycler480SYBR Green I Master Kit，根据试剂盒步骤进行荧光定量PCR(qRT-PCR)检测抗坏血酸合成代谢基因的相对表达量。实验所用到的qRT-PCR引物如表1：
表2实验用到的qRT-PCR引物
Figure BDA0001812513260000082
Figure BDA0001812513260000091
实施例3
SlbHLH59基因的序列分析
根据在NCBI中对候选基因SlbHLH59(Solyc09g065820)进行序列分析，设计了包括SlbHLH59启动子和编码区的PCR引物：启动子引物(正向引物：5'TGCAAAAACCTTACATATTTTCCTC 3'，反向引物：5'AGGTCCCTCAGAAGGGTTGT 3')；编码区引物(正向引物：5'AACAGCTCCGATCCAAGAAA 3'，反向引物：5'AGGAACCATCCACTGCAAGA 3')。以番茄叶片gDNA为模板，用Phanta酶进行PCR扩增。对所有的PCR产物经凝胶电泳检测：PCR产物用用加有EB(溴化乙锭)的1％琼脂糖在100-120V电压条件下电泳30min，最终结果在凝胶成像系统上显示。
本发明调取重测序数据中SlbHLH59基因的序列，进一步利用Geneious软件中的MUSCEL Alignment分析了367不同材料(野生番茄，樱桃番茄，大果番茄)中SlbHLH59基因的序列变异，结果见图8a。在SlbHLH598基因区间共发现了11个多态性位点，包括：启动子中1个8bp的插入/缺失和三个SNP，第四个外现在中的一个非同义突变；内含子中的6个SNP。值得注意的是启动子中8bp的插入/缺失使得启动子区多了一个5UTR Py-rich stretch元件(TTTCTCTCTTTCTC)，该元件对促进基因的表达非常重要。
实施例4
SlbHLH59基因与番茄抗氧化相关性验证
以MV(甲基紫精，鼎国生物)模拟氧化逆境，喷施番茄幼苗，观察植株对MV的响应。具体步骤如下：植物材料的准备。番茄种子播种于5×10孔的育苗穴盘中，每孔播2粒，置于绿化间进行培养。为保证出苗一致，可提前催芽。待幼苗长至两叶一心时(约15d左右)用浓度为100mg/L的卡那霉素喷施转基因幼苗进行阳性检测，1天2次，连续喷施3天，喷施后将叶片出现黄斑(没有卡那霉素抗性)的转基因幼苗去除。将长势健康一致的幼苗(剔除畸形苗)移至7cm×7cm规格的钵子，并对转基因幼苗进行PCR阳性检测。当番茄幼苗长至5到7片真叶时可进行处理，此时苗龄约为40d左右；MV喷施。配置浓度为75μmol/L的MV溶液。为排除水溶液喷施对植株造成的影响，还需准备相同体积的水作为空白对照。将长势一致的番茄幼苗分成2组，1组喷施MV溶液，1组喷施水，喷施部位为叶片表面，以叶面液体不下滴为宜，1天1次，连续喷施2d。1周以后观察植株表型；表型观察。记录MV和水喷施后植株的生长情况。一般MV处理后叶片会出现坏死黄斑、叶绿素含量下降、植株长势减弱等现象。
可用以下方法反映植株对氧化胁迫的耐受能力差异(图11)：叶片表面坏死黄斑数量与面积的比较，拍照记录；DAB染色观察活性氧暴发。用浓度为1mg/mL的DAB溶液浸泡处理过的番茄叶片，常温黑暗反映24h。将反应后的叶片置于装有95％酒精的三角瓶中，沸水浴10min，进行叶片叶绿素脱色。待叶片完全脱绿后停止沸水浴，倒去脱色酒精废液，并用干净的95％酒精洗去叶片表面浮色。至此，能用肉眼观察到叶片棕色斑块处即为活性氧积累的地方。
实施例5
SlbHLH59基因结合Vc代谢途径中结构基因PMM,GMP2和SlGMP3的启动子
本发明以Alisa Crag品种的gDNA和cDNA为模板，用Phanta酶进行PCR扩增获得的。引物序列如表3：
表3引物序列
Figure BDA0001812513260000092
Figure BDA0001812513260000101
所有的PCR产物经1％琼脂糖凝胶检测，用回收试剂盒回收目的片段。将SlbHLH59基因的全长ORF通过同源重组分别导入pGADT7载体和pGreen62-SK载体；将PMM,GMP2和SlGMP3的启动子片段通过同源重组分别导入pAbAi载体和pGreenⅡ0800-Luc载体。
首先将PMM,GMP2和SlGMP3-pAbAi载体转入GOLD1酵母菌株，在SD/-Ura的培养基上培养。然后将SlbHLH59-pGADT7钓饵载体转入包含promoter-pAbAi载体的酵母菌株，并在SD/-Leu的培养基上生长。将生长4天的阳性酵母菌株用无菌的超纯水稀释到OD600为0.1，然后将稀释好的酵母重悬液滴到包含不同浓度ABA(0–20ng/mL)的SD/Leu培养基上观察3到7天后酵母的长势。
为了进一部分分析PMM,GMP2和SlGMP3启动子上的顺式元件与转录因子之间的互作关系，采用包含顺式元件的启动子片段与转录因子一起通过农杆菌转到烟草叶片中，检测报告基因荧光素梅(LUC)与海肾蛋白(RLU)活性的比值来反映它们之间的互作关系。LUC/RLU活性检测是通过烟草瞬时表达实现的。将PMM,GMP2和SlGMP3-pGreen II 0800-LUC的重组载体分别与SlbHLH59-pGreen62-SK载体共转入农杆菌菌株GV3101中。转化过程中需要辅助质粒pSoup。报告基因测定用Dual luciferase assay reagents。具体方法如下：挑转化载体的农杆菌单克隆于1mL LB(含100μg/mL Kan及25μg/mL Rif)，28℃，250r/min震荡培养24h。将200μL菌液接种于20mL的新鲜LB中，并加入400μL的0.5M MES及8μL的100mM的乙酰丁香酮，28℃，250r/min震荡培养12-18h，至OD600≈1.0。4000r/min离心10min，收集菌液，用10mM的MgCl2重悬菌体沉淀至OD600＝1.0，每1mL重悬夜中加入2μL 100mM的乙酰丁香酮溶液，将带启动子片段的重悬夜与带转录因子的重悬夜按体积比1:9混匀并静置3h以上。注射烟草叶片，烟草苗龄月1个月，且不能开花，注射后25℃环境放置2-5d。用打孔器取2cm的叶盘，加入500μL PLB，磨碎，12000r/min离心10min。取5μL上清，加入40μL Luciferase assaybuffer，在酶标仪测定LUC的荧光。在加入40μL Stop and Glow buffer，测定RLU的荧光。计算LUC/RLU比率，并分析数据。
图5是本发明实施例提供的番茄自然群体的不同亚组果实中AsA的相对含量示意图；图中：PIM：野生醋栗番茄，SA_CER：起源于南美的樱桃番茄，NSA_CER：起源于非南美的樱桃番茄，UO_CER：起源未知的樱桃番茄，NP_BIG：非加工大果番茄，P_BIG：加工大果番茄。
图6是本发明实施例提供的GWAS定位调控番茄果实苹果酸含量的关键基因示意图；图中：a：AsA全基因组关联分析的曼哈顿图；b：六号染色上候选区间(64M-64.2M)的关联分析；c：六号染色上候选区间(64M-64.2M)的连锁不平衡block分析；红色星号表示包含绝大部分显著SNP的block23；d：候选LD block 23包含的两个候选基因SlbHLH59和DHUFS。
图7是本发明实施例提供的随机选择的30份番茄材料(15份高AsA材料和15份低AsA材料)果实中AsA的含量(a)和SlbHLH59基因的表达量(b)检测示意图。
图8是本发明实施例提供的367份重测序番茄材料中SlbHLH59基因的单倍型分析示意图：图中：a：SlbHLH59基因中检测到的11个多态性位点将SlbHLH59基因分为了四种单倍型：Hap1，Hap2，Hap3和Hap4；图中蓝色模块代表启动子和UTR区域，黑色细长模块代表内含子区域，灰色方框代表外显子区域；其中启动子中的InDel_8导致了启动子中顺式元件5’UTR Py-rich stretch motif的有无；b：SlbHLH59基因四种单倍型材料中AsA的相对含量；c：SlbHLH59基因四种单倍型材料中SlbHLH59基因的表达量。
图9是本发明实施例提供的影响SlbHLH59基因启动子活性的关键突变位点的鉴定示意图；图中：a：瞬时表达载体pCAMBIA1304的载体图；b：SlbHLH59基因8种不同基因型启动子在拟南芥原生质体中GUS活性的检测。
图10是本发明实施例提供的SlbHLH59基因超量及干涉转基因植株果实中SlbHLH59基因表达量及AsA含量分析示意图；图中：a：超量表达载体pHELLSGATE8的图谱；b：超量表达载体pHGRV的图谱；c图和d图分别表示SlbHLH59SNP9A超量转基因植株及对照果实中SlbHLH59表达量(c)及AsA含量(d)；e图和f图分别表示SlbHLH59SNP9G超量转基因植株及对照果实中SlbHLH59表达量(c)及AsA含量(d)；g图和h图分别表示SlbHLH59干涉转基因植株及对照果实中SlbHLH59表达量(g)及AsA含量(h)。
图11是本发明实施例提供的SlbHLH59基因在番茄抗氧化胁迫中的作用示意图；图中：a：MV处理后SlbHLH59SNP9A超量转基因植株及对照叶片细胞坏死情况；b：DAB染色检测叶片H2O2的积累。
图12是本发明实施例提供的SlbHLH59转基因植株及对照果实中AsA代谢相关结构基因的表达量检测示意图；图中：a：SlbHLH59超量转基因植株及对照果实中AsA代谢相关结构基因的表达量；b：SlbHLH59干涉转基因植株及对照果实中AsA代谢相关结构基因的表达量。
图13是本发明实施例提供的SlbHLH59结合并调控AsA代谢结构基因SlPMM,SlGMP2和SlGMP3的鉴定示意图；图中：a图和b图分别是酵母单杂交载体pGADT7(a)和pAbAi(b)；c：SlPMM,SlGMP2和SlGMP3基因启动子中E-box元件的位置；d：SlbHLH59与SlPMM,SlGMP2和SlGMP3基因启动子中的E-box元件结合的酵母单杂交验证；e图和f图分别表示双荧光素酶系统中pGreen II62-SK(e)和pGreen II 0800Luc(f)载体图；g图表示构建的SlbHLH59-pGreen II62-SK载体及SlPMM-,SlGMP2-和SlGMP3-pGreen II 0800载体；h：不同载体瞬时表达烟草叶片中LUC/RLU活性检测。
图14是本发明实施例提供的SlbHLH59基因在番茄驯化和改良过程中的分子多样性分析示意图；图中：a：番茄野生种(WILD)、醋栗番茄(PIM)、樱桃番茄(CER)及大果番茄(BIG)中insertion_8及deletion_8的分布；b：醋栗番茄(PIM)、樱桃番茄(CER)及大果番茄(BIG)中SlbHLH59基因启动子和编码区核苷酸多样性(π)；c：醋栗番茄与樱桃番茄(红线)、樱桃番茄与大果番茄(蓝线)核苷酸多样性(π)频率分析。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种调控番茄果实抗坏血酸含量的SlbHLH59基因及应用方法
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4025
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggctaaca acccttctga gggaccttct gatgatttct ttgaccaaat cttgggattt 60
cctgcttaca atggagcaga acctaatttg gcgggaaatg atgccggagc tataccgccg 120
gcgatgatgc tccagcttaa ctctggtgat gggtcaagtc agtttactgg agtgggtctt 180
ggggttggtt taggtggtgg ggggttccat ggtcatggtg ggggtggttc ttttccttta 240
gggttgagtt tagaacaagg gaaaggtggg ttcttgaaga tggatgatgt ttcagcacct 300
ggaaggaggt ttagagatga tgttgttgat agcagagctt cttcttctgt caaacctgta 360
attattgctt ataccttttc ttggttattc agtttcttga tttcttgttg gttgtcatat 420
aatgacttat actgtgatgt tctgcttctt tacttagaaa gtttgctcct ttttctgtgc 480
aaattggtgt agtgttaccg aagaagtttt tcactaaaaa agttgtttgt tttttctgaa 540
tttgtttctt tctaggattt gtgtatgtgc ttggtatatg ggaagttgtg tttttgcttt 600
ccctaaacag agagtctatt ggaaacaacc tctctatcta cctggcaagg taggataaag 660
tctgcgtgaa ctcgacactc ctcatacccc aatggttgga ctatactatg ttcttggtgg 720
tggtggtgta tgggaaattc aattctgact ttcttttcct tttctggact ggttgccttt 780
actccagtat aatttggagt taagaatgag gttttttaaa aataaggctt atatttgtgt 840
attcaagcta gagatcatat agcctgttga ttttaagact actgttgctg gctttagaaa 900
attggaattg cacacttgcc tagaaaaagg ggcttgacat gtaacattac ttttttctat 960
tcaaggtgat gtaagcaaaa ccatggtccg agatctgaat atgaataaat ctggccattt 1020
attaagtgat tttaccaatt gcttccttga gatacaatca aaagcaatga caaggttcta 1080
tctttacagg gttttcatgg acaaccgatg ccttcaatgc cgcatccccc tgcaatacgt 1140
ccaagggtga gagctaggcg aggacaagct actgatccac atagcatagc ggagagggta 1200
tttttttttt tgcagcgaag agtattctaa agttatttag attgtctaac aagcggcata 1260
tttttctgtt gcttctagcg tttggacaga agaaaataat atcccttcct ttatttgatt 1320
gcaactgttc agggtaaatg aacgagttcc tcagagtgaa acattaatct tttcacaaga 1380
ggtcatctaa ctagttcata ttgtttcggg ttatacatag tttctacgag cataagatgt 1440
tctgataatg cactgataaa ttaccaagcc cgatgaccct aagctgcaaa taatgtgtta 1500
ttttagaatt cagttctgtg ttaggaagaa taacatccta tttccgagca tcagttcaag 1560
gttgaatact atgtataaag gcttaggtcc tactattcag ttgccgctac tttaccattc 1620
taactgattt tattcttttc ctgcagttac gtagagagag gatagcagaa agaattagag 1680
cattgcaaga gttggttccc agtgtcaata aggttagttt tctttcttct atatactgaa 1740
ctatgtttca cttactgcga gcatcatttt gaaaagatca aaaagaagag gattaaacat 1800
tgagacccct ttcttctcac agttttcttt tgtgggcttg tgcttatgta cccaaagaac 1860
tcaggaattt gatggagcaa tatttgcaga atttatgaaa aaactaaaat cactacctcc 1920
tccaactttc tttgtctgtt caagttatga tgctatttta ttgacagaga agcaataagg 1980
acttcataat gaagaactat aagagacttc tttcagaaat agtagggtct catcacatgg 2040
atatgacttc cccatgtgta cagttttcaa tttttgtccc gtgttttttg gtcttcccgg 2100
aagaatgtaa aaaagtcaaa gttgattcat taggtaactt tgtcttccct atttttcttc 2160
cataaagttt agtacagagt agctgatacg catgatatta ttaggatact gcatgacgta 2220
tattgtggtc cttatttcat gtttgatagt cactattaga agatagttgt acatatactg 2280
ggtaaagaga atttatttca gtatagttcg atacgttaac tgaagcagat cttcaaattg 2340
gtttagttca ctaggtctac ttttgataat tgagggaggt tggattcaca cagaagcaaa 2400
accagaagat gatagaaatg atagtcgtta tgaaaattat ttcgagaatt agtttttgca 2460
tgcttaaaca aggtgtcttg tgcttagaaa ttgccaacaa atgtcacaga aaagaagtta 2520
gatcttttat tttataagta gaccaaaatc tatgaatagg taaaaacgtg tctgcatcat 2580
tttctctgat tattctataa cttccccatc cccatcagag attgtgggac aaagtaaaac 2640
gggtttatgt atgttttatc tcaagtgatc tttagaaggt tttgagaaat tatacgcttg 2700
tataggttta atgcaaatgt tcagccaccc atttctaatt cttctggtgc aataaatcaa 2760
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tacaatcttt tcaaaagtta caatcacggg tcgctctaaa tcattttgaa cctatcgatg 3000
ttgattttgg ttgtgaaggt tctttagaaa tgcattctgg tactactgat aatactcgga 3060
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tttcatttca ttcaacaaat gttcggatgt cattttctgc gcagcatatt ccttaatggt 3300
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ccacggatat tcgtgttcaa aggaagtttt gctggatgga aaccgctcaa ataatttgaa 3420
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atggaaaagt tacctttcct cttttgaggg tatagcacta gattttctcc tgcttttgaa 3540
tcaatacttt tttccttgca ttattgaacc attttgggta cttttctaag ttaaaaatta 3600
tatttgacac tacaggtgtt gagcatgagt aggttaggag gagctggtgc agtagcacca 3660
cttgttacag acattccaat atcatcagta gaggtacttt tttttaatta taataagctt 3720
gttagacttc ttttctggaa gatttgtcca ccttattaat ttcttaatac ttgtggcttt 3780
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tttatcactc tcagccacca gatacatcaa gtcttgttaa gccagaaaca aatcctcctt 4020
catag 4025
<210> 2
<211> 909
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctaaca acccttctga gggaccttct gatgatttct ttgaccaaat cttgggattt 60
cctgcttaca atggagcaga acctaatttg gcgggaaatg atgccggagc tataccgccg 120
gcgatgatgc tccagcttaa ctctggtgat gggtcaagtc agtttactgg agtgggtctt 180
ggggttggtt taggtggtgg ggggttccat ggtcatggtg ggggtggttc ttttccttta 240
gggttgagtt tagaacaagg gaaaggtggg ttcttgaaga tggatgatgt ttcagcacct 300
ggaaggaggt ttagagatga tgttgttgat agcagagctt cttcttctgt caaacctggt 360
tttcatggac aaccgatgcc ttcaatgccg catccccctg caatacgtcc aagggtgaga 420
gctaggcgag gacaagctac tgatccacat agcatagcgg agaggttacg tagagagagg 480
atagcagaaa gaattagagc attgcaagag ttggttccca gtgtcaataa gactgataga 540
gctgtaatgc ttgatgaaat tgtagattat atcaaattcc tacggctgca agtgaaggtg 600
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gctgcaatgc aatttcttca gtctaaagca ctatgtataa tgcctatttc tcttgcatca 840
gcaatttatc actctcagcc accagataca tcaagtcttg ttaagccaga aacaaatcct 900
ccttcatag 909
<210> 3
<211> 302
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Asn Asn Pro Ser Glu Gly Pro Ser Asp Asp Phe Phe Asp Gln
1 5 10 15
Ile Leu Gly Phe Pro Ala Tyr Asn Gly Ala Glu Pro Asn Leu Ala Gly
20 25 30
Asn Asp Ala Gly Ala Ile Pro Pro Ala Met Met Leu Gln Leu Asn Ser
35 40 45
Gly Asp Gly Ser Ser Gln Phe Thr Gly Val Gly Leu Gly Val Gly Leu
50 55 60
Gly Gly Gly Gly Phe His Gly His Gly Gly Gly Gly Ser Phe Pro Leu
65 70 75 80
Gly Leu Ser Leu Glu Gln Gly Lys Gly Gly Phe Leu Lys Met Asp Asp
85 90 95
Val Ser Ala Pro Gly Arg Arg Phe Arg Asp Asp Val Val Asp Ser Arg
100 105 110
Ala Ser Ser Ser Val Lys Pro Gly Phe His Gly Gln Pro Met Pro Ser
115 120 125
Met Pro His Pro Pro Ala Ile Arg Pro Arg Val Arg Ala Arg Arg Gly
130 135 140
Gln Ala Thr Asp Pro His Ser Ile Ala Glu Arg Leu Arg Arg Glu Arg
145 150 155 160
Ile Ala Glu Arg Ile Arg Ala Leu Gln Glu Leu Val Pro Ser Val Asn
165 170 175
Lys Thr Asp Arg Ala Val Met Leu Asp Glu Ile Val Asp Tyr Ile Lys
180 185 190
Phe Leu Arg Leu Gln Val Lys Val Leu Ser Met Ser Arg Leu Gly Gly
195 200 205
Ala Gly Ala Val Ala Pro Leu Val Thr Asp Ile Pro Ile Ser Ser Val
210 215 220
Glu Glu Glu Ser Ser Glu Gly Gly Asn Asn Asn Gln Pro Ala Trp Glu
225 230 235 240
Lys Trp Ser Ser Asp Gly Thr Glu Arg Gln Val Ala Lys Leu Met Glu
245 250 255
Glu Asn Val Gly Ala Ala Met Gln Phe Leu Gln Ser Lys Ala Leu Cys
260 265 270
Ile Met Pro Ile Ser Leu Ala Ser Ala Ile Tyr His Ser Gln Pro Pro
275 280 285
Asp Thr Ser Ser Leu Val Lys Pro Glu Thr Asn Pro Pro Ser
290 295 300
<210> 4
<211> 3323
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acacaattca tacattatta tatacatgta ttttggtcca atgctatgtc gaaatgttgc 60
aaaatataaa gtaaagaaat gataaaatat ctcatttaaa gaagttaata tctttttctt 120
acagaatatg tttgttgaat gtcattattg aaggttcttt tatacaatcc aggaagcaca 180
tattctttta ataaggaatt attcatttgt gctaatgaca taaatgtttt gattagaaag 240
agattaattt acaacaaaag catttgtgtt gtatatattt ttagcaaaac tagattcttt 300
ggtactagat actagatgcc taaaatgttt tgtttacagt ataatacagg ttgagtctat 360
atataatgct aaatattaac tacattttat taatttgcat ttatataaaa aatgatagct 420
tgtttcaatt agctcaataa cttaataata cataataatt tgactatgca agtttacata 480
tataaacatg aaaattatgc aaaaacctta catattttcc tccaggaaat gcatttttgg 540
ttttttgttc tttctataga tgtatctttt agtcacttta gacttgctat gagtttttag 600
ccattatttg aatttaaata gcggaatgaa ttatatttca atgcaaaaat attcctattg 660
acattaaaaa aaaaaaaaaa aacttataac gacctgaacc tatgaatcat ttcttgattt 720
cgttggggat attttgatcc atttttattc gtgtcaaaag aatatggtta aatgattatt 780
tagaactttt gaaatagtgg ttaatatttg ataggaggtg ttaaaaatag gtatttacct 840
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attagtttat tgaaaaaata tttttattaa taataaagca atgatttatt aatgatcaaa 1380
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tatatatttt ctgtccaagt ctctttctca ttttatacaa ttctaattgt atataatcgt 2040
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aagtctcttt ctctttctcg ttttatacac ttctatttta tacaatttgc ttcaattgta 2160
tatgtatagc gaattatata tttatatgtt tgttatggag tgcaattatg caaactttgc 2220
tatagcatac aaatatgaat tttatgtttg ctatatgtga aagttgacta aaatttatag 2280
catctttgat taacggtaat agataaattt atattgttaa ctaaaccact taaatttttg 2340
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aaattaaaaa aaaaaaagag tttaaataat ttccttgttt attcatatca tctttataca 2520
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caatatatta tataaatata caaaacatga aacactagag agtatattta agctagtctt 2640
ttttaacaaa gaaaaaagga tactttttct caaaattttt catttttaaa ttattgatgg 2700
tcttaaaaat atgttttcac ttgattaatt aaatttaaat atgaattttt gtctaattta 2760
ataataattt taaaatttct ctcaattttt cattaaaagt ctcatacaaa tttgtaattc 2820
taatgttgta agatggtaga tcgaaatgta ataaatttaa ttaattaaat aaaaaataat 2880
ttttaaagct aataatagtt caagaataaa aataataatt tattccaaac tataaaaaaa 2940
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aagcaaacaa tatatttaag caaagcttta ggtgactccc tttcctttat tttcttcatg 3060
gctctcactg ctctttagaa agtagcaaaa cacacacaca aacaacccaa aacacacact 3120
tccatttcca ttttttgcct atatatatat atatatatgt aacaagtact tgttagagta 3180
ctaatttgta caccctctta tcaattccgt tgtaaagaac acttttttaa ctagtatttg 3240
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
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catttggaga ggacacgctc gaggtttctg ctatggctaa caaccctt 48
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<211> 48
<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agaaagctgg gttattgaca ctgggaacca actctt 36
<210> 11
<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgcaaaaacc ttacatattt tcctccagga aatgcatttt tggttttttg ttctttctat 60
agatgtatct tttagtcact ttagacttgc tatgagtttt tagccattat ttgaatttaa 120
atagcggaat gaattatatt tcaatgcaaa aatattccta ttgacattaa aaaaaaaaaa 180
aaaaacttat aacgacctga acctatgaat catttcttga tttcgttggg gatattttga 240
tccattttta ttcgtgtcaa aagaatatgg ttaaatgatt atttagaact tttgaaatag 300
tggttaatat ttgataggag gtgttaaaaa taggtattta cctaattcat ccatcttgtt 360
atatcagctt ttatctatta acaaactctc tattataatt atgttttact tagttatgag 420
tgattatagt aactcccatg tgatttggta aggagttaat caacttttaa taatttgagt 480
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ttatttattt gataaatatg ttttgctaaa taatttatgt ttgattagtt tattgaaaaa 840
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gatatatcat cttatcgcat catctatctc ttaaatctga gcgggaataa attaatccaa 1920
atatatagtt ttaaaaatat aatgttgaga taatctaatc cacaaattaa aaaaaaaaaa 1980
gagtttaaat aatttccttg tttattcata tcatctttat acaaaagtca tagacgtatt 2040
aatttttatt acctttttag tcccacttga atgtctttct ttccaatata ttatataaat 2100
atacaaaaca tgaaacacta gagagtatat ttaagctagt cttttttaac aaagaaaaaa 2160
ggatactttt tctcaaaatt tttcattttt aaattattga tggtcttaaa aatatgtttt 2220
cacttgatta attaaattta aatatgaatt tttgtctaat ttaataataa ttttaaaatt 2280
tctctcaatt tttcattaaa agtctcatac aaatttgtaa ttctaatgtt gtaagatggt 2340
agatcgaaat gtaataaatt taattaatta aataaaaaat aatttttaaa gctaataata 2400
gttcaagaat aaaaataata atttattcca aactataaaa aaactcaaaa tacttctctc 2460
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cctatatata tatatatata tgtaacaagt acttgttaga gtactaattt gtacaccctc 2700
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ctgaggaatt aaggtggtcg aaaacagctc cgatccaaga aagattgaat ctttatagtt 2820
tctgct 2826
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<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tggttaatat ttgataggag gtgttaaaaa taggtattta cctaattcat ccatcttgtt 360
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gcaaattggc atgaatgtaa tttttggcca tactacttgt ttgcttctaa ttttattttt 720
aataaaataa ctcaaaattg tactaacaaa tttttagctt gtttgattaa gatttaaaat 780
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atacaaatag aaacgaaatg tataaattgt gtttttgttt gtataaagcg agagaaaatt 1320
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tacaattcat tttatacact tcgttttata caattctctg tccaagtctc tttctctttc 1620
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aattttatgt ttgctatatg tgaaagttga ctaaaattta tagcatcttt gattaacggt 1800
aatagataaa tttatattgt taactaaacc acttaaattt ttgtctcaaa cttaatcata 1860
gatatatcat cttatcgcat catctatctc ttaaatctga gcgggaataa attaatccaa 1920
atatatagtt ttaaaaatat aatgttgaga taatctaatc cacaaattaa aaaaaaaaaa 1980
gagtttaaat aatttccttg tttattcata tcatctttat acaaaagtca tagacgtatt 2040
aatttttatt acctttttag tcccacttga atgtctttct ttccaatata ttatataaat 2100
atacaaaaca tgaaacacta gagagtatat ttaagctagt cttttttaac aaagaaaaaa 2160
ggatactttt tctcaaaatt tttcattttt aaattattga tggtcttaaa aatatgtttt 2220
cacttgatta attaaattta aatatgaatt tttgtctaat ttaataataa ttttaaaatt 2280
tctctcaatt tttcattaaa agtctcatac aaatttgtaa ttctaatgtt gtaagatggt 2340
agatcgaaat gtaataaatt taattaatta aataaaaaat aatttttaaa gctaataata 2400
gttcaagaat aaaaataata atttattgca aactataaaa aaactcaaaa tacttctctc 2460
aaataaatat ttatttaagc aattgctttt agtgacacca ttgaagcaaa caatatattt 2520
aagcaaagct ttaggtgact ccctttcctt tattttcttc atggctctca ctgctcttta 2580
gaaagtagca aaacacacac acaaacaacc caaaacacac acttccattt ccattttttg 2640
cctatatata tatatatata tgtaacaagt acttgttaga gtactaattt gtacaccctc 2700
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tctgct 2826
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<211> 2826
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgcaaaaacc ttacatattt tcctccagga aatgcatttt tggttttttg ttctttctat 60
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tgattatagt aactcccatg tgatttggta aggagttaat caacttttaa taatttgagt 480
taggtagtgt ttggcatatt ttaatgagtt agtttataac actaatctct attagattag 540
ataataaagt agaggtttag ttaaagtgga agtgcttagg acaaacaagt aaggtcaaat 600
tccatcaaat tattagttta tgtccaactt tataaccact ttctcaaatt tatctagtgt 660
gcaaattggc atgaatgtaa tttttggcca tactacttgt ttgcttctaa ttttattttt 720
aataaaataa ctcaaaattg tactaacaaa tttttagctt gtttgattaa gatttaaaat 780
ttatttattt gataaatatg ttttgctaaa taatttatgt ttgattagtt tattgaaaaa 840
atatttttat taataataaa gcaatgattt attaatgatc aaagatttcg aaaatgcttc 900
tgaagtataa aaaatattat tgatatatag gagtaaactt taagcgtgag ataaaattta 960
gggaaaattg tatctaatgg taaattaata aattaaatta attgctataa tcaccctttg 1020
atttaattgt gtctcgtagc aaattgtttg tcagtcacct ctctccctca aactctcgct 1080
cgccactctc ctctctcgct cgcttcctct cacttttata caaacataag tgtataaaat 1140
ttgtttctat ttgtataaag agagagaaag ttgtataaat acatataatt ttgttcccct 1200
ctctcccctc tcccagatct cgctcgccac tctccctgat ctcgctcgcc tctctcgctt 1260
atacaaatag aaacgaaatg tataaattgt gtttttgttt gtataaagcg agagaaaatt 1320
gtatatacac atggaagtac atatattttc gtcatataca cttataatta tataataaaa 1380
tactttcctg cccagtttct tttgcctttc tctctttctc attttataca aattcaaatt 1440
gtatataatt tctttctttc tcgtttatac aattagattc aattatatat tttctgtcca 1500
agtctctttc tctctttctc attttataca attctaattg tatataatcg ttctatacac 1560
ttataatata caattcattt tatacacttc gttttataca attctctgtc caagtctctt 1620
tctctttctc gttttataca cttctatttt atacaatttg cttcaattgt atatgtatag 1680
cgaattatat atttatatgt ttgttatgga gtgcaattat gcaaactttg ctatagcata 1740
caaatatgaa ttttatgttt gctatatgtg aaagttgact aaaatttata gcatctttga 1800
ttaacggtaa tagataaatt tatattgtta actaaaccac ttaaattttt gtctcaaact 1860
taatcataga tatatcatct tatcgcatca tctatctctt aaatctgagc gggaataaat 1920
taatccaaat atatagtttt aaaaatataa tgttgagata atctaatcca caaattaaaa 1980
aaaaaaaaga gtttaaataa tttccttgtt tattcatatc atctttatac aaaagtcata 2040
gacgtattaa tttttattac ctttttagtc ccacttgaat gtctttcttt ccaatatatt 2100
atataaatat acaaaacatg aaacactaga gagtatattt aagctagtct tttttaacaa 2160
agaaaaaagg atactttttc tcaaaatttt tcatttttaa attattgatg gtcttaaaaa 2220
tatgttttca cttgattaat taaatttaaa tatgaatttt tgtctaattt aataataatt 2280
ttaaaatttc tctcaatttt tcattaaaag tctcatacaa atttgtaatt ctaatgttgt 2340
aagatggtag atcgaaatgt aataaattta attaattaaa taaaaaataa tttttaaagc 2400
taataatagt tcaagaataa aaataataat ttattccaaa ctataaaaaa actcaaaata 2460
cttctctcaa ataaatattt atttaagcaa ttgcttttag tgacaccatt gaagcaaaca 2520
atatatttaa gcaaagcttt aggtgactcc ctttccttta ttttcttcat ggctctcact 2580
gctctttaga aagtagcaaa acacacacac aaacaaccca aaacacacac ttccatttcc 2640
attttttgcc tatatatata tatatatatg taacaagtac ttgttagagt actaatttgt 2700
acaccctctt atcaattccg ttgtaaagaa cactttttta actagtattt gttcaattga 2760
atgcttttct gaggaattaa ggtggtcgaa aacagctccg atccaagaaa gattgaatct 2820
ttatagtttc tgct 2834

Claims (2)

1.SlbHLH59基因在调控番茄果实抗坏血酸含量中的用途，其中，所述SlbHLH59基因的gDNA序列为SEQ ID NO:1，cDNA序列为SEQ ID NO:2，编码区氨基酸序列为SEQ ID NO:3，该基因超表达提高番茄果实抗坏血酸含量。
2.如权利要求1所述SlbHLH59基因的启动子在调控番茄果实抗坏血酸含量中的用途，该SlbHLH59基因的启动子序列为SEQ ID NO:4，其中，包括元件TTTCTCTCTTTCTC，该元件促进SlbHLH59基因表达，提高番茄果实抗坏血酸含量。
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