CN111548400A

CN111548400A - 一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用

Info

Publication number: CN111548400A
Application number: CN202010418791.5A
Authority: CN
Inventors: 冯立国; 朱敏; 王建文; 魏恬恬; 邢勇翔
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-05-18
Filing date: 2020-05-18
Publication date: 2020-08-18
Anticipated expiration: 2040-05-18
Also published as: CN111548400B

Abstract

本发明公开了一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用，RrMYB114基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过RrMYB114基因时空表达模式分析和过表达矮牵牛植株的花香代谢物含量分析，证明RrMYB114可正向调控矮牵牛花香代谢物，在增强花香物质合成、改良精油品品质和产量等花卉育种领域有重要应用价值。

Description

一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用。

背景技术

玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是蔷薇科蔷薇属重要的观赏与经济兼用植物，玫瑰花中提取的玫瑰精油有“液体黄金”之美誉，广泛应用于高档化妆品和香水中，国际国内市场对玫瑰及其制品的需求量逐年递增。玫瑰花芳香成分包含数百种挥发性化合物，单萜醇和2-苯乙醇是组成玫瑰香味的主要成分，其中，2-苯乙醇含量高低是国际上评判玫瑰精油质量优劣的重要参考标准。2-苯乙醇作为植物生长发育过程中的天然产物，具有抗菌、保护等作用，有着广泛的用途，目前，市售2-苯乙醇多是人工合成，而消费者更倾向纯天然的2-苯乙醇，如从玫瑰中提取的2-苯乙醇在使用上更安全，感官上也更为舒适，但玫瑰中纯天然2-苯乙醇的含量非常低，利用现代生物技术提高玫瑰2-苯乙醇含量，对降低天然2-苯乙醇获取成本意义重大。

在玫瑰花器官不同部位中的研究发现，花瓣中2-苯乙醇含量最高，雄蕊中2-苯乙醇仅次于花瓣，是产生芳香物质的主要场所，一些调节花冠、雄蕊的发育R2R3-MYB转录因子成员是潜在的影响花香物质合成的调控基因，其中MYB114在植物花青素合成调控中发挥重要功能，同时也可能影响着蔷薇类植物花香化合物的代谢：一方面，L-苯丙氨酸是2-苯乙醇合成的前体物质，花青素主要通过苯丙烷途径消耗前体苯丙氨酸合成，与2-苯乙醇存在前体的竞争关系，MYB114很可能影响着L-苯丙氨酸转化为2-苯乙醇的效率；另一方面，花青素合成途径中会产生肉桂酸、香豆素等芳香物质，MYB114对花青素合成途径的调控也一定程度上能改变花香物质比例组成。MYB114功能研究主要源于拟南芥等模式植物，尚未有玫瑰MYB114相关报道，克隆并利用玫瑰花香调控相关基因MYB114，有助于阐明玫瑰花香调控的分子机制，为高芳香物质含量玫瑰的基因工程育种提供分子工具，具有提高提高玫瑰精油产量和品质的潜在的经济价值。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种玫瑰花香调控基因RrMYB114，满足使用需求。本发明的另一目的是提供一种上述玫瑰花香调控基因RrMYB114的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种玫瑰花香调控基因RrMYB114，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述玫瑰花香调控基因RrMYB114的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的玫瑰花香调控基因RrMYB114的过表达载体。

含有所述的玫瑰花香调控基因RrMYB114的宿主细胞。

所述玫瑰花香调控基因RrMYB114在增强植物花香代谢物合成中的应用。

有益效果：本发明以玫瑰主栽品种‘平阴一号’为材料，通过RACE技术克隆了RrMYB114基因。通过实时荧光定量检测技术，检测RrMYB114基因在不同花期和花器官不同部位的表达模式，同时通过构建过表达载体转化矮牵牛，证明其为芳香物质合成的正调控因子，在增强花香物质合成、改良精油品品质和产量等花卉育种领域有重要应用价值。

附图说明

图1是RrMYB114基因时空表达模式图；

图2是植物过表达载体pCAMBIA1304质粒图谱；

图3是RrMYB114过表达矮牵牛和野生型矮牵牛的花器官；

图4是RrMYB114过表达矮牵牛和野生型矮牵牛的花香物质含量测定。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

1、通过RACE技术克隆RrMYB114基因

基于玫瑰转录本，设计RACE引物，以为玫瑰花器官总RNA为模板，获取5’和3’末端片段，克隆入T-载体，对插入片段进行阳性筛选后进行测序，测序结果序列通过重叠区拼接，得到cDNA全长。

I.引物设计

RrMYB114 RACE引物：

接头含有特定的Adaptor序列5’CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT3’用于通用接头引物。

3’RACE正向(特异性)引物：

Outer Primer：5’-TCCACTTCTTTACCAACAGCACCACCAC-3’；

Inner Primer：5'-AGGACGACTTCTTCACAAACTTCTGGGTTG-3’；

3’RACE反向(接头)引物：

Outer Primer：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

Inner Primer：5-'CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；

5’RACE正向(接头)引物：

Outer Primer：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’；

Inner Primer：5'-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3’；

5’RACE反向(特异性)引物：

Outer Primer：5'-TGTACAACCAGATATGCACGACAAACCAAA-3’；

Inner Primer：5'-AAGTCGCTCATGTCACTCATGCGTAGAAG-3’。

II.3'RACE反应过程：

(1)反转录，将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：1μgTotal RNA，4μL dNTP Mix，2μL 3'RACE Adapter，2μL 10X RT Buffer，1μL RNaseInhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补至20μL。

(2)轻轻混匀，短暂离心，42℃温育1h；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物；

(3)3'RACE巢式PCR；

反应体系为：50μL的Outer 3'RACE组成：5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μL MgCl₂(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，2.0μL 3'RACE gene-specificouter primer，2.0μL 3'RACE Outer Primer(10μM)，1μL RT reaction product，0.5μLTakaRa LA Taq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。

50μL的Inner 3'RACE组成：5.0μL 10×LA PCR Buffer(Mg²⁺Free)，5.0μL MgCl₂(25mM)，8.0μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，2.0μL 3'RACE gene specific in nerprimer，2.0μL 3'RACE Inner Primer(10μM)，1μL Outer 3'RACE PCR product，0.5μLTakaRa LA Taq(5U/μL)，26.5μL Nuclease-free Water。

反应程序：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，35cycles；72℃7min。

(4)纯化片段与克隆载体的连接反应

采用TaKaRa公司的pMD19-T simple Vetor克隆目的DNA分子。

反应体系(5μL)：2.2μL纯化回收的PCR产物，0.3μL pMD-19Simple Vector，2.5μLSolution I。

反应条件：16℃30min；4℃保存。

(5)大肠杆菌转化：将新鲜制备或-70℃冻存的大肠杆菌TOP10感受态细胞在冰上融化；取5μL纯化片段与克隆载体的连接产物，加入到100μL感受态细胞中，并轻轻混匀，冰浴30min左右；42℃水浴中热击90sec，迅速置于冰上3-5min；加入800μL LB液体培养基，37℃&100rmp摇菌1h；4000rmp离心3min，吸掉上层800μL培养基，混匀剩余菌液；将菌液涂抹于含有Amp的LB筛选培养板上，37℃倒置培养过夜。

(6)阳性克隆筛选及测序分析

从筛选培养板上挑选单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，250rmp，摇菌过夜；直接以培养过夜的菌液为模板进行重组转化子的PCR检测。

反应体系(20.0μL)：2.0μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺free)，1.5μL MgCl₂(25mM)，1.3μL dNTP Mixture(each 2.5mM)，1.0μL 3'RACE gene specific inner primer(10μM)，1.0μL 3'RACE Inner Primer(10μM)，0.1μL菌液，1.0μL rTaq，12.1μL Milli-Q Water，，

反应程序：94℃3min；94℃30sec，60℃30sec，72℃1min，28cycles；72℃7min。

菌液PCR检测为阳性的克隆送生工生物公司(上海)测序。

III.5'RACE反应过程

(1)RNA处理：CIP反应，将如下成分加入到RNase-free的小离心管中：10μg TotalRNA，2μL 10X CIP buffer，2μL Calf Intestine Alkaline Phosphatase(CIP)，Nuclease-free Water至20μL。

(2)轻轻混匀，短暂离心；37℃温育1h；

(3)加入以下试剂到CIP反应离心管：15μL Ammonium Acetate Solution，115μLNuclease-free Water，150μL acid phenol:chloroform。

(4)充分涡旋，室温高速离心(≧10000g)5min；

(5)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μl氯仿，充分涡旋，室温高速离心(≧10000g)5min；

(6)转移上层水相到一个新的离心管中，加入150μl异丙醇，充分涡旋，冰浴10min；

(7)最大转速离心20min，用0.5ml预冷的70％乙醇冲洗沉淀，最大转速离心5min，小心弃乙醇，气干沉淀；

(8)以11μL Nuclease-free Water重悬沉淀，即得CIP’RNA，冰上放置进一步用于TAP反应，或者-20℃保存；

(9)TAP反应，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：5μL CIP’d RNA(from f above)，1μL 10X TAP buffer，2μL Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)，2μLNuclease-free Water；

(10)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得CIP/TAP-treated RNA；进入接头连接步骤，或-20℃保存反应物；

(11)5'RACE接头连接，把以下成分加入到一个RNase-free的小离心管中：2μLCIP/TAP-treated RNA，1μL 5'RACE Adapter，1μL 10×RNA Ligase Buffer，2μL T4 RNALigase(2.5U/μl)，4μL Nuclease-free Water。

(12)轻轻混匀，短暂离心，37℃温育1h，即得Ligated RNA；进入反转录步骤，或-20℃保存反应物。

IV.反转录

(1)将以下成分加入到一个置于冰上的RNase-free的小离心管中：2μL Li gatedRNA，4μL dNTP Mix，2μL Random Decamers，2μL 10X RT Buffer，1μL RNase Inhibitor，1μL M-MLV Reverse Transcriptase，Nuclease-free Water补至20μL。

(2)轻轻混匀，短暂离心；42℃温育1h，即得RT reaction；进入PCR步骤，或-20℃保存反应物。

(3)5'RACE巢式PCR：反应体系、反应条件与3'RACE的巢式PCR一致。

(4)PCR产物克隆测序，操作与3'RACE克隆一致。

拼接3'RACE和5'RACE序列得到全长cDNA，并利用NCBI-ORF finder工具预测其开放阅读框，并设计正向引物5'-ATGGGGAGAGCAATTAGCTTA-3’和反向引物5'-TCATGCGTAGAAGTTGTTGACT-3'，扩增RrMYB114基因的表达框验证其真实性。RrMYB114的cDNA全长898bp，其序列如SEQ ID NO.1所示，具有完整的开放阅读框(735bp)、5'非编码区(25bp)、3′非编码区(128bp)，poly(A)尾(10bp)，对应的RrMYB114蛋白序列为244个氨基酸残基，其序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2

通过荧光定量PCR技术探究RrMYB114基因时空表达模式，基于RrMYB114基因的外显子区域设计荧光定量PCR引物正向引物5’-ACTACCGGGAAGAACAGCCA-3’和反向引物5'-TGAAGGTTCGTGGTCGAGGT-3’，基于Actin基因设计内参引物正向引物5’-TGGAGTAACTGAACCAGGGAGGAG-3’和反向引物5’-GGCTGTAGGTGCCTGAACTGG-3’。利用SYBRPremix Ex Taq(Takara公司)和荧光定量PCR仪CFX96TM(Bio-RAD公司)，参照生产商说明书的PCR体系和程序，进行荧光定量PCR获取达到荧光阈值的循环数，计算出RrMYB114基因在不同花期和花器官不同部位的相对表达量。

如图1所示，RrMYB114基因在花蕾期(S1)、初开期(S2)、半开期(S3)、盛开期(S4)和衰败期(S5)5个时期的花朵中，初开期显著下调表达，整个开花期稳定在低丰度表达水平，在花瓣(P1)、花萼(P2)、雌蕊(P3)、雄蕊(P4)、花柄(P5)、花托(P6)6个部位中，在雌蕊和花柄中相对表达量较高，其他部位丰度较低。RrMYB114基因表达模式具有一定的组织特异性，集中表达于雌蕊和花柄，且随着开花下调表达。

实施例3

RrMYB114过表达载体构建和矮牵牛遗传转化

I.载体构建

利用NcoI酶切位点将RrMYB114表达框插入过表达载体pCAMBIA1304的多克隆位点(图2)，获得的质粒通过液氮冻融法转化农杆菌EHA105感受态，鉴定pCAMBIA1304：RrMYB114农杆菌阳性菌株。

II.叶片预处理

材料选取生长高度5cm左右的健壮矮牵牛无菌植株，在超净工作台中，从矮牵牛植株上选取长宽在1.5cm以上的叶片，在灭菌滤纸上将叶片切成1cm²的正方形，叶片四周均有切口，叶正面朝上置于矮牵牛预培养基上，25℃，暗培养2d。

III.侵染液的准备

取1mL阳性菌株的菌液接种50ml的YEB液体培养基(含Rif和Kan)，28℃，200rpm，暗培至OD₆₀₀ 0.8-1.0，4℃，5000rpm，离心10min，去上清液，加入事先预冷的侵染液，稀释至OD₆₀₀至0.3-0.5。

IV.叶片共培养

在超净工作台中，将暗培养2天的矮牵牛叶片置于侵染液中，均匀慢速摇晃侵染5分钟，取出叶片，滤纸吸干叶片表面菌液，叶面朝上置于共培养基上，放置叶片前可在共培养基上可加一片灭菌且无无污染的滤纸，以抑制农杆菌在培养基上大面积扩增，25℃，暗培养3d。

V.分化筛选培养

取出共培养3天的矮牵牛叶片，用无菌水冲净叶表面的农杆菌，用灭菌滤纸吸干叶表面的无菌水及菌液，叶面朝上移入筛选培养基上，培养温度为25℃，光照强度为2000LUX。两周更换一次培养基，叶片分化出较大的愈伤组织后应将愈伤组织与叶片分离，单独置于分化筛选培养基中培养。

VI.生根筛选培养

将筛选培养基上愈伤组织分化出的芽株在超净工作台中切下，转移于生根培养基中，每瓶放置1-2株，当矮牵牛生长出健壮的根并植株高度达到5cm时，将矮牵牛植物从培养基中移栽至加入蛭石和珍珠岩的无菌营养土中，放入气候箱中培养，气候箱培养环境设置为：25℃，2000LUX，16h·d^-1。

VII.转基因矮牵牛的鉴定

利用GUS染色液将筛选培养基中培养得到的愈伤组织进行染色，用无水乙醇可洗脱样品中的叶绿素，转基因愈伤组织会出现蓝色的块状斑点，野生型样品则不会染出蓝色，更方便于观察。

图3为过量表达RrMYB114基因的矮牵牛(右)与野生型矮牵牛(左)的花器官图，两者无显著形态差异(花瓣厚度、花朵直径、鲜重、干重等)，以3-壬酮为内标，采用GC-MS法对野生型和转RrMYB114基因的矮牵牛花香成分进行检测，并选取了9种主要香气成分进行比较分析，主要香气成分及其含量如图4所示，在过表达RrMYB114基因的矮牵牛花香中，最主要的花香成分苯甲酸甲酯的含量为野生型矮牵牛的2.3倍，丙烯基苯酚含量为野生型矮牵牛的4倍多。另外，矮牵牛的花器官中2-苯乙醇和苯甲酸苄酯的含量整体较低，但是转基因的矮牵牛中也显著增加了近10倍(2-苯乙醇0.32μg/mg增加到3μg/mg，苯甲酸苄酯0.0023μg/mg增加到0.022μg/mg)，说明过表达RrMYB114基因能够调控苯丙烷代谢途径，通过促进矮牵牛中2-苯乙醇、苯甲酸甲酯、苯甲酸甲酯、丙烯基苯酚等产物的积累，从而提高花香代谢物含量。玫瑰的RrMYB114基因对增强花卉的花香物质合成、改良精油品质和产量有重要应用价值。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 898

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag actacatggg gagagcaatt agcttaattt tcatggaggg 60

tttcggcgtg agaaaaggtg catggactaa agaggaagat gaacttctga gacaggtcat 120

cgaaaagcat ggagaaggaa aatggcatca ggttcctttc aaagcaggct taaacagatg 180

caggaagagc tgtagactga ggtggctaaa ttatttgaag ccaaatatca agagagggga 240

gtttacagtt gatgaagttg atatgatcat cagacttcat aagcttctag gaaacaggtg 300

gtctttaatt gctggaagac taccgggaag aacagccaac gatgtaaaga actattggaa 360

tacttatcaa cggaaaaaga atcaaaagat gacttcaggc ccaaaaaaaa tgaaagataa 420

atcccaaaaa aacacaatcg cccctttggt tgtaagacct cgaccacgaa ccttcatcaa 480

aaggttgaat tttttggaaa gagatgccaa tttagagcat attcattcag aagagaattc 540

ttccacttct ttaccaacag caccaccaca aactctagaa ttagagaatg taattgattg 600

gtggaaagtt gtatctgaag acagtacagg aagcattgat agaacaacat gttctagtct 660

tggtttagag gacgacttct tcacaaactt ctgggttgaa gatatggtac aattgtccag 720

tatagatggc catgatctag tcaacaactt ctacgcatga gtgacatgag cgacttttct 780

atgtcttcct attccatatt agtatttgta ctcttttttt atttggtttg tcgtgcatat 840

ctggttgtac actactaata tatttccaat gctgtatttc gttttgacaa aaaaaaaa 898

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

MGRAISLIFM EGFGVRKGAW TKEEDELLRQ VIEKHGEGKW HQVPFKAGLN RCRKSCRLRW 60

LNYLKPNIKR GEFTVDEVDM IIRLHKLLGN RWSLIAGRLP GRTANDVKNY WNTYQRKKNQ 120

KMTSGPKKMK DKSQKNTIAP LVVRPRPRTF IKRLNFLERD ANLEHIHSEE NSSTSLPTAP 180

PQTLELENVI DWWKVVSEDS TGSIDRTTCS SLGLEDDFFT NFWVEDMVQL SSIDGHDLVN 240

NFYA 244

Claims

1.一种玫瑰花香调控基因RrMYB114，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的玫瑰花香调控基因RrMYB114的表达蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的玫瑰花香调控基因RrMYB114植物过表达载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体在RrMYB114基因的5’端组装组成型强表达启动子P35S，3’端组装了强终止子NOS，可在植株中超量表达。

5.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体组装有HPT基因表达盒和GUS报告基因，作为筛选标记，可通过潮霉素和GUS染色进行转基因植物材料的筛选。

6.含有权利要求1所述的玫瑰花香调控基因RrMYB114的植物宿主细胞。

7.权利要求1所述的玫瑰花香调控基因RrMYB114在调控花香物质代谢中的应用。