KR102097254B1

KR102097254B1 - 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물 및 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법

Info

Publication number: KR102097254B1
Application number: KR1020190178590A
Authority: KR
Inventors: 이옥란; 장진훈
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2019-12-30
Publication date: 2020-04-03

Abstract

본 발명은 식물 종자의 크기 증진용 조성물, 식물 종자의 크기를 증진시키는 방법, 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물 및 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 pPLAIIIα 유전자가 과발현되면 식물 종자의 크기가 커지고 초기 발아속도가 증진되므로, 이를 효과적으로 식물의 생산성 증대 방법으로 이용할 수 있다.

Description

식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물 및 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법{a composition for promoting the initial germination speed of plant seeds, and a method for promoting the same}

본 발명은 식물 종자의 크기 증진용 조성물, 식물 종자의 크기를 증진시키는 방법, 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물 및 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 pPLAIIIα 유전자의 과발현에 의한 식물 종자의 크기 증진과 초기 발아속도 증진에 관한 것이다.

지질분해효소는 아실-지질을 분해하는 가수분해 효소의 다양한 그룹이다. 시험관 내에서 그들의 바람직한 기질에 기초하여 지질분해효소는 일반적으로 트리아실글리세롤 지질분해효소, 포스포지질분해효소, 갈락토지질분해효소 등으로 분류된다.

그러나 많은 지질분해효소는 종종 다양한 지질 클래스에서 시험관 내에서 작용할 수 있으며 생리학적 역할의 결정은 사소하지 않다. 애기장대(Arabidopsis)의 게놈 분석은 잠재적으로 지질 분해에 관여하는 것으로 보이는 많은 유전자가 있음을 나타냈다. 많은 식물성 지질분해효소의 세포 기능을 해독하는 것이 중요한 과제이다.

포스포 지질분해효소(Phospholipases; PLA)는 막을 가수 분해함으로써 신호 전달, 세포 성장 조절, 환경 스트레스 및 지질 대사에 반응하는 막 리모델링을 수행한다. PLA 계통은 저분자량 PLA2(PLA2α, β, γ 및 δ)와 감자(Solanum tuber) 결절 저장 단백질 파타틴과 상동인 파타틴 관련 PLA(pPLAs)의 두 그룹으로 분류된다. pPLA는 인산 또는 갈락토-글리세린 지질에 작용하여 유리 지방산과 용질 지질을 방출한다.

파타틴 관련 포스포 지질분해효소 A(Patatin-related phospholipase A; pPLA)는 주요 지질 아실 가수 분해 효소로 세 그룹으로 분류된다. pPLAIII 그룹 구성원 (α, β, γ, δ)은 표준 촉매성 세린 모티프가 없기 때문에 다른 PLA와 구별된다. pPLAIII

및 δ에 대한 상세한 연구가 수행되었지만 pPLAIIIα의 효소 활성 및 세포 기능은 아직 애기장대에서 조사되지 않았다.

애기장대에서 pPLA 계통의 10개 구성원은 pPLAI, pPLAII(α, β, γ, δ, ε) 및 pPLAIII(α, β, γ, δ) 유전자 구조와 아미노산 서열 유사성에 기초하여 3개의 그룹으로 분류되었다. pPLAI와 pPLAII는 병원균, 옥신 신호 전달 및 인산염 결핍에 대한 식물 반응에 관여한다. 최근에 특성화된 pPLAIII는 표준 촉매성 세린 함유 모티프 GXSXG가 부족하지만, 이들은 넓은 기질 특이성을 가진 지질분해효소 활성을 보인다.

애기장대에서 pPLAIIIδ는 옥신에 대한 식물 반응에 관여한다는 것이 밝혀졌다. 또한, 쌀 OspPLAIIIα의 과발현과 넉아웃은 지베렐린 신호 전달 경로에서 성장 억제자 SLENDER1의 발현에 반대되는 효과를 가지는 것으로 알려져 있다.

pPLAIII의 과발현은 pPLAIIIβ 과발현의 셀룰로오스 함량 감소와 pPLAIII58E의 씨앗 기름 증가와 같은 추가적인 기능을 가진 유사한 왜소 생장(stunted growth) 패턴을 보였다. pPLAIIIβ의 활성화 태깅은 또한 pPLAIIIβOE에서 관찰된 바와 같이 종 방향 세포 신장이 감소하고 발육이 약화되었다.

OspPLAIIIδ가 결핍된 열성 쌀 돌연변이형 dep3은 짧고 넓은 표피 세포를 가진 조밀하고 직립적인 표현형을 보였다. pPLAIII 과발현이 이러한 변화를 초래하는 방법을 이해하기 위해 pPLAIII58E와 WT의 비교 프로테오믹(proteomic) 분석이 수행되었다. WT와 비교하여 OE 라인에서 하나의 단백질 스폿이 이동했다. 이것은 미세소관결합단백질(microtubule-associated protein; MAP) 18로 확인되었다.

그러나, pPLAIIIβ, γ 및 δ 사이의 상기 생리학적 기능을 고려하면 pPLAIII의 많은 분자 기능이 아직 밝혀지지 않았다. 게다가, 넉아웃 돌연변이체의 생리학적 표현형 및 지질 프로파일은 애기장대 pPLAIIIα에 대해 보고된 바 없다.

이에 본 발명자들은 pPLAIIIα 유전자의 과발현에 의하여 식물 종자의 크기가 증진되고 초기 발아속도 또한 증진되는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα(Patatin-related phospholipase A) 단백질 또는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 식물 종자의 크기 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물 종자의 크기를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα 단백질 또는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 pPLAIIIα 유전자의 과발현에 의한 종자 크기 증진 및 종자의 초기 발아속도 증진 용도에 관한 것이다.

본 발명은 식물 종자의 크기 증진용 조성물, 식물 종자의 크기를 증진시키는 방법, 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물 및 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 방법에 의해 pPLAIIIα(At2g39220) 유전자가 과발현되면 식물 종자의 크기가 커지고 초기 발아속도가 증진되는 효과를 나타낸다.

본 발명자들은 pPLAIIIα의 기능을 밝히기 위해 애기장대의 과발현 돌연변이를 특성화하였고, 이에 따라 종자의 크기가 증가하고 초기 발아 속도가 증진되는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα(Patatin-related phospholipase A) 단백질 또는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 식물 종자의 크기 증진용 조성물이다.

상기 핵산 서열은 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열인 것일 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물 종자의 크기를 증진시키는 방법이다.

상기 조절 단계는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합벡터로 식물을 형질전환하여 수행되는 것일 수 있다.

상기 용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 의미하며, DNA를 복제하고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다.

"발현 벡터"는 목적단백질을 코딩하는 염기서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 당분야에 공지된 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 상기 단백질을 코딩하는 서열은 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동가능하게 연결된 염기서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 상기 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. "발현 조절 서열(expression control sequence)"이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 이러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

공지된 벡터로는 pBI121, pBIG, pOCA18, pJJ1881, pGreen 및 pCAMBIA가 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 발현 벡터이다.

식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다.

본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 제미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(Kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 식물 발현 벡터의 프로모터는 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "구성적 (constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 구성적 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 구성적 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다. 또한 상기 벡터는 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 β-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양 기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다.

식물의 형질전환에 이용되는 "식물 세포"는 배양 세포, 배양 조직, 배양기관 또는 전체 식물, 바람직하게는 배양 세포, 배양 조직 또는 배양 기관 및 더욱 바람직하게는 배양 세포의 어떤 형태도 된다.

"식물 조직"은 분화된 또는 미분화된 식물의 조직, 예를 들면 이에 한정되진 않으나, 뿌리, 줄기, 잎, 꽃가루, 종자, 암 조직 및 배양에 이용되는 다양한 형태의 세포들, 즉 단일 세포, 원형질체(protoplast), 싹 및 캘러스 조직을 포함한다. 식물 조직은 인 플란타(in planta)이거나 기관 배양, 조직 배양 또는 세포 배양 상태일 수 있다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당 업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα 단백질 또는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물이다.

본 발명의 또 다른 양태는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법이다.

도 1a는 애기장대 특유의 보존된 pPLAIIIα 모티프와 공간 및 일시적인 유전자 발현을 나타낸 모식도이다.
도 1b는 pplalllα 돌연변이의 T-DNA 삽입 사이트 및 C- 말단에서 YFP 융합을 갖는 35S 프로모터의 제어하에 pPLAIIIα의 과발현 라인을 나타낸 모식도이다.
도 1c는 WT 및 pplaIIIa 넉아웃 라인에서 pPLAIIIα 발현의 RT-PCR결과를 나타낸 사진이다.
도 1d는 pPLAIIIα-YFP(상) 및 pPLAIIIα-mRFP(하)의 세포 내 위치를 나타낸 사진이다.
도 1e는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인의 pPLAIIIα 유전자 전사 수준을 나타낸 그래프이다.
도 2a는 Col-0와 pPLAIIIα 과발현 라인에서 꽃의 기관 크기를 비교하여 나타낸 사진이다.
도 2b는 Col-0에서 꽃의 기관과 꽃가루의 구조를 나타낸 사진이다.
도 2c는 pPLAIIIα 과발현 라인에서 꽃의 기관과 꽃가루의 구조를 나타낸 사진이다.
도 2d는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서 모종 재배 4 일 및 9 일의 뿌리 길이를 비교한 사진이다.
도 2e는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서 모종 재배 4 일과 9 일의 배축 길이를 비교한 사진이다.
도 2f는 3주 동안 재배한 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인의 잎자루 길이를 비교한 그래프이다.
도 2g는 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 줄기 세포 신장 및 이로 인한 줄기의 넓이를 나타낸 사진이다.
도 2h는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 종자의 크기를 비교한 사진이다.
도 2i는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 종자의 크기를 비교한 그래프이다.
도 2j는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 종자의 무게를 비교한 그래프이다.
도 2k는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 장각(silique) 당 종자의 개수를 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3a는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 발아율을 비교한 그래프이다.
도 3b는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 GA₃ 1μM을 포함하는 배양 조건에서의 발아율을 비교한 그래프이다.
도 3c는 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인에서의 ABA 함량을 비교한 그래프이다.
도 3d는 20시간 동안 재배한 pplalllα 돌연변이 및 pPLAIIIα 과발현 라인 종자에서의 지베렐린 산화효소(GA2ox1, GA2ox2, GA3ox1 및 GA20ox1)의 유전자 발현 양상을 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 애기장대에서 pPLAIIIα의 넉아웃, 과발현 라인의 확인

아미노산 서열을 분석하여 온라인 프로그램 (www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)을 사용하여 보존된 도메인 또는 활성 사이트를 예측하고 확인하였다. BioEdit 프로그램 (버전 7.1.9)을 사용하여 다중 서열 정렬을 수행하였다. MEGA6(version 6.06) 프로그램을 사용하여 이웃 참여 방법에 의해 계통 발생 트리가 생성되었다.

도 1a에서 확인할 수 있듯이, 모든 pPLAIII(At2g06925) 단백질과 마찬가지로, pPLAIIIα는 표준 GxSxG 모티프에 존재하는 S가 G로 대체되었기 때문에 S-D 추정 다이 옥사이드의 세린(serine; S)이 결핍되었다.

그러나, 추정된 촉매 성 S-D 염색체인 아스파테이트(aspartate; D)의 두 번째 잔기는 DGG 모티프에 존재하였다. 또한, 제 2의 글리신(Glycine; G)이 세린(S)으로 대체되었기 때문에, 인산염 또는 음이온 결합 요소 DSGGXXG는 pPLAIIIα 단백질에서 완전히 보존되지 않았다는 것이 주목되었다.

pPLAIIIα(patatin-related PLAs; At2g39220)는 ProtParam을 사용하여 예측된 pI가 6.24이고 분자량이 54495.06 kDa 인 499 아미노산의 단백질을 코딩하는 단일 유전자로 표현된다.

pPLAIIIα의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열
1	pPLAIIIα의 아미노산 서열	MLTTMQRVHNKPIDSIGGFKHLVKQSNGGDGGVTATDMQEPSIETDKLSYEIFSILESKFLFGYDDDLKLMESRSRDPSPEQETASPAMVEALNGVVPGTVKNQRGKVCVLSIDSGGMRGIIPGKALAYLEHALKSKSGDPNARIADYFDVASGSGIGGIFTAMLFASSDGNRPIFKAEDTWRFLAMKGKSFYNKSPPGILNRVMKTGSGGSGGSGSKLEKAMKESFEELTLKDTLKPVLIPCYDLTSSAPFLFSRADALETDGYDFKLWEVCRATWAEPGVFEPVEMRSVDGKTRCVAVDGGLAMSNPTAAAITHVLHNKQEFPFVRGVEDLLVLSLGTGQLVDVKYDCDKVMKWKAKHWARPAVRISADGAADTVDQAVSMAFGQCRRSNYVRIQANGSSFGPCKPNIDTDASPSNVNMLVGVAEEMLKQKNAESVLFGGKKINEESNYEKLDWLAGELVLEHQRRSCRIAPTVAFKQSGDRRVDQQTIFKDIDCMF
2	pPLAIIIα의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열	CACACCTCAAAATTCTCAAATTCTTGTCAGTTCAATAAAACAATTTCCTTGAATTATTGTCAGACACTTAAAAGATTTGTATGCATGTAACTGCTGGTCCCGTATTAATATTTATTGCTTCATTCCTTATTACTAAGCAACAAAAGTCACGCGTGAGATATAAAAGAAGATCCTTTGCAGTTTCTCTGTTCTTGCTCCTTCTTCTTCATCTCCCTTTATTGATACTGTCTGAGTAATAATAAAAATTCACTCTTTTTGTCTTCTCAAGACAGATTTCAAAATAGAAATCATTCTCCTTTTTTCTTTTTGAAAATTTCGAGTGATTTAAGGAGGGAAAATAAAGACAGAAACAAGAACAAAAGCATCGTTTGCGAATAAGACTTCTCGTACTCTGTTTTCTTTTCTCGTGTTCTTATGACAGATTTATAAAAAAGATTAGGTTTTTGTCTTGTCTTGGCGATAATGCCTAGAGAGTGTTTTAAAGATTTGATTTAAATACTCTTTTATGTTAACTACGATGCAAAGAGTACACAACAAACCGATTGATTCTATCGGAGGTTTTAAGCATTTGGTAAAACAGAGTAACGGCGGTGACGGTGGAGTGACGGCGACGGATATGCAAGAACCGAGCATCGAGACTGATAAGCTTAGCTACGAGATTTTCTCTATTCTCGAAAGCAAGTTTCTTTTCGGGTATGATGATGACCTGAAGCTTATGGAATCAAGAAGCAGAGACCCGAGTCCAGAGCAAGAAACGGCATCACCGGCGATGGTGGAAGCTTTAAACGGCGTTGTTCCGGGTACAGTTAAGAACCAGAGAGGTAAAGTTTGTGTTTTGAGTATCGATAGTGGTGGAATGAGAGGGATTATACCTGGAAAAGCTTTGGCTTATCTGGAACATGCTCTGAAATCGAAATCGGGTGACCCGAATGCTCGAATCGCTGATTACTTCGACGTAGCTTCCGGTTCCGGTATCGGTGGGATTTTCACGGCGATGCTTTTTGCGTCGAGCGATGGTAACCGTCCGATCTTCAAAGCGGAAGACACGTGGCGGTTTTTAGCTATGAAAGGTAAAAGCTTTTACAACAAATCACCACCGGGGATACTAAACAGGGTTATGAAAACCGGGTCGGGTGGTTCGGGTGGGTCAGGTTCGAAGCTTGAGAAAGCGATGAAGGAGTCTTTCGAAGAGCTTACGCTTAAGGATACGCTTAAACCGGTTTTGATTCCTTGTTACGACCTCACGAGCTCTGCACCGTTCTTGTTCTCACGTGCTGATGCGTTGGAAACGGACGGTTATGATTTTAAGCTGTGGGAAGTTTGTAGAGCTACTTGGGCTGAGCCAGGAGTGTTTGAGCCGGTGGAGATGAGATCAGTTGATGGTAAGACACGGTGTGTAGCTGTTGATGGTGGTTTAGCAATGAGTAATCCAACGGCTGCAGCGATTACTCATGTGTTGCATAATAAGCAAGAGTTTCCTTTTGTTAGAGGTGTTGAGGATTTGCTTGTGTTGTCACTTGGTACGGGACAGTTGGTTGATGTTAAGTATGATTGTGATAAGGTTATGAAGTGGAAGGCTAAGCATTGGGCTCGACCTGCGGTTCGGATTTCTGCTGATGGAGCAGCTGATACTGTGGATCAGGCTGTTTCCATGGCGTTTGGTCAGTGTAGGAGGAGTAACTACGTCCGTATTCAGGCGAATGGATCAAGCTTTGGTCCGTGCAAACCAAACATAGACACAGATGCGAGTCCAAGCAATGTGAATATGCTTGTGGGAGTAGCAGAGGAGATGCTGAAGCAGAAGAATGCAGAGTCTGTTCTGTTTGGTGGTAAGAAAATCAATGAAGAAAGCAATTATGAGAAGCTGGATTGGTTAGCCGGTGAACTAGTGCTAGAACACCAGAGGAGGAGTTGTAGAATCGCTCCCACTGTAGCGTTCAAGCAATCCGGCGACAGAAGAGTCGATCAACAGACCATTTTCAAGGATATTGATTGTATGTTTTGAATATTTTTAAATTGTATAGATTTGTGTTTAAGTCCAGAAGAAAGCAACATTATATTCGAATTAGGCTTTTTATTAAATCTTAAAGATATGTGTAATTTTTGTTTTACTGAATTGTTATTTTCTATTGACTCTAAAAGAGCTTCGTCAACAAAATTTTGGAATGCAGAGAGCGTC

도 1b와 같이, 애기장대 pPLAIIIα의 기능을 연구하기 위하여 pPLAIIIα에 대해 동형 접합체 T-DNA 삽입 돌연변이를 분리하였다.

본 발명에서는 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 컬럼비아 생태형(Col-0)을 모델 야생형 식물로 사용 하였다. 넉아웃 pPLAIIIα 돌연변이체(SALI830G12)는 애기장대 스톡(Arabidopsis stock) 센터 (www.arabidopsis.org/)에서 구입 하였다.

구체적으로, 세척 단계 직전에 DNase I 분해효소(digestion)를 포함한 RNeasy 식물 미니 키트(Qiagen, USA)로 냉동된 시료에서 총 RNA를 추출하였다. RNA 농도는 Nano-MD UV-Vis 분광 광도계(Scinco, Seoul, Korea)를 사용하여 측정하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하기 위해 역전사효소(RevertAid Reverse transcriptase, Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 3 mg의 전체 RNA를 역전사시켰다. SYBR® Premix EX Taq ? (Takara, Shiga, Japan)을 사용하여 25 uL 반응 부피에서 100 ng의 cDNA를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다.

95℃에서 30초, 95℃에서 5초, 58℃에서 10초, 72℃에서 20초, 45 사이클을 제조사에서 권장하는대로 사용하였다. 각 주기의 최종 단계에서 형광이 검출되었다.증폭, 검출 및 데이터 분석은 실시간 PCR 시스템(Thermal Cycle Dice, Takara, Shiga, Japan)에서 수행되었다. 각 샘플에 대한 template abundance의 상대적 배수-차(fold-difference)를 결정하기 위해, 각 유전자의 Ct 값은 β-actin (At5g09810)에 대한 Ct 값을 사용하여 정규화되었고 공식 2-ΔCt를 사용하여 캘리브레이터에 대해 계산되었다.도 1c에서 확인할 수 있듯이, RT-PCR에 의해 pPLAIIIα에 대한 전사 인자가 검출되지 않아 넉아웃 돌연변이체임을 확인하였다.

또한, 애기장대 pPLAIIIα의 전장 게놈 DNA 서열은 C 말단에서 황색 형광 단백질(yellow fluorescence protein; YFP) 또는 단량체 적색 형광 단백질(monomeric red fluorescent protein; mRFP) 태그를 갖는 35S 프로모터의 제어하에 애기장대에서 과발현되었다.

구체적으로, 파타틴 관련 포스포 리파아제 A(patatin-related phospholipase A; pPLAIIIα)의 기능을 규명하고 세포 내 지방화 패턴을 시각화하기 위해, 콜리 플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus; CaMV) 35S 프로모터의 제어하에 pPLAIIIα의 전체 게놈 서열을 발현시켰다. CaMV 35S 프로모터, YFP, 및/또는 mRFP를 함유하는 개조된 pCAMBIA1390 벡터(E. Blancaflor로부터의 선물)가 이들 구조물에 사용되었다. pPLAIIIα 게놈 단편은 SalI 및 AvrII 부위를 갖는 프라이머를 사용하여 다음과 같이 증폭시켰다.

서열번호	명칭	서열
3	pPLAIIIα 게놈 단편 증폭용 정방향 프라이머	TCGTCGACATGTTAACTACGATGCAA
4	pPLAIIIα 게놈 단편 증폭용 역방향 프라이머	GGCCTAGGAACATAATCAATATC

효소 소화 PCR 산물을 pPLAIIIα-YFP 및/또는 mRFP 융합 단백질(Pro35s: pPLAIIIα-YFP / mRFP)과 같은 벡터 Pro35s:YFP/mRFP에 클로닝하였다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens C58C1)(pMP90)를 사용하여 모든 형질전환체를 뉴클레오티드 시퀀싱으로 확인하고 애기장대로 형질 전환시켰다. 형질전환체의 공초점 현미경 또는 PCR 분석에 의해 형질전환체 삽입이 확인되었다.

종자를 1% 수크로스, 0.5 g/L MES(2- [N-모르폴리노] 에탄 술폰산), pH 5.7의 KOH 및 0.8% 아가로오스를 함유하는 1/2 MS 배지(Duchefa Biochemie, The Netherlands)에 뿌렸다. 2일 동안 저온 처리한 씨앗은 23시간 동안 16시간의 빛/8 시간의 어두운 조건에서 발아되었다. 형질전환체는 하이그로마이신 함유 플레이트(50 ug/mL)에서 선택하였다. 종자 코트가 열렸을 때 종자 발아를 계수하고 2일 동안 저온처리한 후 1/2 MS 배지에서 연속적으로 빛을 발하여 방사를 일으켰다.

리포터 단백질 및 세포소기관(organelle) 마커에서 방출된 형광은 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 510 META, Carl Zeiss, Jena, Germany)에 의해 관찰되었다. YFP 및 mRFP는 각각 514 / >530 및 543 / 560 - 615 nm 여기 / 방출 필터 세트를 사용하여 검출되었다. 형광 이미지를 Zeiss LSM 이미지 브라우저로 디지털화하였다.

추가 분석을 위해 하이그로마이신 함유 플레이트(50 ug/mL)에서 3:1 분리 비율의 동형 접합 식물을 선별하였다. 구체적으로, 각각의 구조물에 대해, 20 내지 30개의 T1 독립적인 라인을 수득하였고, 형질전환 유전자의 표현형의 중요성을 선택된 라인 중에서 추가로 분석하였다.

도 1d에서 확인할 수 있듯이, C 말단 YFP 및 mRFP 태깅 모두는 pPLAIIIα가 뿌리 세포의 원형질 막에 국한되었음을 보여 주었다.

도 1e에서 확인할 수 있듯이, 4개의 독립적인 동형 접합체 과발현 라인에서 pPLAIIIα에 대한 전사 수준의 정량화 결과에 따르면 pPLAIIIα가 과발현 라인(OE) #6, #7 및 #13에서 매우 강하게(약 600배), #8에서 적당히(6배) 과발현되었음을 보여 주었다.

실시예 2: pPLAIIIα의 과발현에 따른 식물체의 크기, 꽃가루 구조 및 종자 크기

애기장대 pplaIIIα의 생리 기능은 pPLAIIIα에 대한 과발현 및 넉아웃 라인에서 여러 기관의 상세한 표현형 분석을 수행하여 조사되었다. 변형된 종방향 세포 신장을 갖는 횡단적으로 확장된 세포 형태는 이전에 pPLAIIIβ(At3g54950) 및 pPLAIIIδ(AT3G63200)의 과발현에 의해 보고되었다.

데이터는 각각 P <0.05 (*) 및 P <0.01 (**)에서 세 번의 독립적 인 반복의 평균 ± 표준 오차 (SE)를 나타낸다. 모든 표면 영상은 저진공 주사형 전자 현미경 (JSM-IT300, JEOL Korea)으로 작업 거리 10.8 mm 및 20.0 kV에서 촬영하였다.

도 2a 내지 2c에서 확인할 수 있듯이, 꽃, 장각과(siliques) 및 잎과 같은 기관은 pPLAIIIα-OE에서 더 작았다. 또한 과발현 라인에서 꽃가루 구조가 변화하는 것으로 밝혀졌다. Col-0과 비교하여 짧고 두꺼운 장각과를 갖는 pPLAIIIα-OE 라인에서는 꽃의 장기 크기가 감소하였다. 스케일바는 0.2 mm(상단), 2 mm(중간) 및 5 mm(하단)로 나타내었다.

도 2b 및 2c에서 나타나는 과발현 라인에서 꽃가루 구조에 결함이 있는 꽃 기관은 작게 나타났다. 스케일바는 500 um(좌측), 100 um(우측 상단) 및 10 um(우측 하단)로 나타내었다.

도 2d에서 확인할 수 있듯이, OE 계통에서 세 개의 강력한 pPLAIIIα-OE 라인(#6, #7, #13)의 뿌리 길이는 Col-0 대조군과 비교하여 증가하는 반면, pplaIIIa 넉아웃 돌연변이체의 뿌리 길이는 약간 감소한 것으로 나타났다.

도 2e 및 2f에서 확인할 수 있듯이, pplaIIIa 돌연변이체의 배축 및 잎자루 길이는 두 개의 대조구(Col-0 및 vector control)와 OE 라인은 식물 호르몬인 옥신(ouxin)과 지베렐린(gibberellin)의 관련 가능성을 나타낸다. 스케일바는 1 mm로 나타내었다.

도 2g에서 확인할 수 있듯이, pPLAIIIα가 과발현되었을 때, 줄기 세포로부터 종방향 연장 패턴이 감소되었다. 다른 한편으로, 이들은 횡방향으로 확장되었다. 스케일바는 500 um(상단) 및 100um(하단)으로 나타내었다.

도 2h 및 2i에서 확인할 수 있듯이, 흥미롭게도, OE 계통에서 장기의 크기 감소에 대한 예외는 pPLAIIIα가 과다 발현될 때 종자의 폭과 길이가 증가하는 것이었다(n= 23).

도 2j에서 확인할 수 있듯이, 일관되게, 종자의 무게는 pPLAIIIα-OE에서 23% 증가하고 pplaIIIα 돌연변이에서 10% 감소하여, pPLAIIIα가 WT 식물에서 종자 발달에 관여한다는 것을 보여주었다(n= 10).

도 2k에서 확인할 수 있듯이, 고도로 과발현된 OE 계통에서, 종자 무게의 증가는 장각과 당 종자 수를 희생시키면서 명백하게 나타났다(n= 10).

결과적으로 pPLAIIIα의 과발현은 종자에서의 세포 성장을 감소시켰지만 종자의 크기를 증가시켰다.

실시예 3: pPLAIIIα의 과발현에 따른 종자의 발아

pplaIII 돌연변이체의 생육이 감소된 4-9 일 후의 종자 크기와 뿌리 길이에서 종자 발아율 및 생장을 확인하였다. 종자를 4℃에서 2일 동안 암조건으로 1/2 MS 배지에 배양한 후, 빛 아래의 성장 챔버로 옮겼다.

데이터는 각각 P <0.05 (*) 및 P <0.01 (**)에서 세 번의 독립적 인 반복의 평균 ± 표준 오차 (SE)를 나타낸다.

도 3a에서 확인할 수 있듯이, 20시간 후 pplaIIIα 돌연변이체는 발아율이 대조구보다 13% 감소하였으며 OE 라인은 16% 증가하였다. 모든 넉아웃 종자는 30 시간까지 발아를 완료하였고, 발아율은 영향을 받지 않았지만 WT에 비해 발아가 지연되었다(n= 48 내지 56).

도 3b에서 확인할 수 있듯이, GA₃의 처리에 의해 pplaIIIα 돌연변이체의 발아 지연이 약간 회복되었다. 20시간 배양 시에 비해 24시간 배양하였을 때 WT가 1.16 배, OE가 1.13 배였던 것에 비해 pplaIIIα 돌연변이체는 1.28 배 증가하였다.

도 3c에서 확인할 수 있듯이, 넉아웃 종자의 초기 발아 지연은 아브시스산(abscisic acid; ABA)의 함량의 증가에 기인한 것일 수 있다.

생체 활성 지베렐린 생합성의 역할을 시험하기 위하여, 4개의 지베렐린(gibberellin; GA) 산화효소 유전자를 분석하였다. GA20ox 및 GA3ox는 생체 활성 지베렐린 생합성을 촉매하는 효소이며, GA2ox는 생체 활성 지베렐린의 불활성 형태로의 전환에 관여한다.

도 3d에서 확인할 수 있듯이, GA 산화효소 유전자 GA2ox1(AT1G78440)은 pplaIIIα 돌연변이체에서 2배 증가하였고, GA20ox1(AT4G25420)은 GA2ox2(AT1G30040)를 0.7배 더 하향 조절하면서 OE 라인에서 1.3배 증가하였다. 이는 pplaIIIa 돌연변이에서 활성형 GA의 함량이 낮고, OE에서의 활성이 낮고 상대적으로 덜 활성인 GA 형태의 함량이 낮기 때문에 발아 지연이 유발될 수 있음을 나타낸다.

<110> Industry-University Cooperation Foundation Chonnam University <120> a composition for promoting the initial germination speed of plant seeds, and a method for promoting the same <130> PN180325D <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 499 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Leu Thr Thr Met Gln Arg Val His Asn Lys Pro Ile Asp Ser Ile 1 5 10 15 Gly Gly Phe Lys His Leu Val Lys Gln Ser Asn Gly Gly Asp Gly Gly 20 25 30 Val Thr Ala Thr Asp Met Gln Glu Pro Ser Ile Glu Thr Asp Lys Leu 35 40 45 Ser Tyr Glu Ile Phe Ser Ile Leu Glu Ser Lys Phe Leu Phe Gly Tyr 50 55 60 Asp Asp Asp Leu Lys Leu Met Glu Ser Arg Ser Arg Asp Pro Ser Pro 65 70 75 80 Glu Gln Glu Thr Ala Ser Pro Ala Met Val Glu Ala Leu Asn Gly Val 85 90 95 Val Pro Gly Thr Val Lys Asn Gln Arg Gly Lys Val Cys Val Leu Ser 100 105 110 Ile Asp Ser Gly Gly Met Arg Gly Ile Ile Pro Gly Lys Ala Leu Ala 115 120 125 Tyr Leu Glu His Ala Leu Lys Ser Lys Ser Gly Asp Pro Asn Ala Arg 130 135 140 Ile Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ala Ser Gly Ser Gly Ile Gly Gly Ile 145 150 155 160 Phe Thr Ala Met Leu Phe Ala Ser Ser Asp Gly Asn Arg Pro Ile Phe 165 170 175 Lys Ala Glu Asp Thr Trp Arg Phe Leu Ala Met Lys Gly Lys Ser Phe 180 185 190 Tyr Asn Lys Ser Pro Pro Gly Ile Leu Asn Arg Val Met Lys Thr Gly 195 200 205 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Lys Leu Glu Lys Ala Met Lys 210 215 220 Glu Ser Phe Glu Glu Leu Thr Leu Lys Asp Thr Leu Lys Pro Val Leu 225 230 235 240 Ile Pro Cys Tyr Asp Leu Thr Ser Ser Ala Pro Phe Leu Phe Ser Arg 245 250 255 Ala Asp Ala Leu Glu Thr Asp Gly Tyr Asp Phe Lys Leu Trp Glu Val 260 265 270 Cys Arg Ala Thr Trp Ala Glu Pro Gly Val Phe Glu Pro Val Glu Met 275 280 285 Arg Ser Val Asp Gly Lys Thr Arg Cys Val Ala Val Asp Gly Gly Leu 290 295 300 Ala Met Ser Asn Pro Thr Ala Ala Ala Ile Thr His Val Leu His Asn 305 310 315 320 Lys Gln Glu Phe Pro Phe Val Arg Gly Val Glu Asp Leu Leu Val Leu 325 330 335 Ser Leu Gly Thr Gly Gln Leu Val Asp Val Lys Tyr Asp Cys Asp Lys 340 345 350 Val Met Lys Trp Lys Ala Lys His Trp Ala Arg Pro Ala Val Arg Ile 355 360 365 Ser Ala Asp Gly Ala Ala Asp Thr Val Asp Gln Ala Val Ser Met Ala 370 375 380 Phe Gly Gln Cys Arg Arg Ser Asn Tyr Val Arg Ile Gln Ala Asn Gly 385 390 395 400 Ser Ser Phe Gly Pro Cys Lys Pro Asn Ile Asp Thr Asp Ala Ser Pro 405 410 415 Ser Asn Val Asn Met Leu Val Gly Val Ala Glu Glu Met Leu Lys Gln 420 425 430 Lys Asn Ala Glu Ser Val Leu Phe Gly Gly Lys Lys Ile Asn Glu Glu 435 440 445 Ser Asn Tyr Glu Lys Leu Asp Trp Leu Ala Gly Glu Leu Val Leu Glu 450 455 460 His Gln Arg Arg Ser Cys Arg Ile Ala Pro Thr Val Ala Phe Lys Gln 465 470 475 480 Ser Gly Asp Arg Arg Val Asp Gln Gln Thr Ile Phe Lys Asp Ile Asp 485 490 495 Cys Met Phe <210> 2 <211> 2179 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 2 cacacctcaa aattctcaaa ttcttgtcag ttcaataaaa caatttcctt gaattattgt 60 cagacactta aaagatttgt atgcatgtaa ctgctggtcc cgtattaata tttattgctt 120 cattccttat tactaagcaa caaaagtcac gcgtgagata taaaagaaga tcctttgcag 180 tttctctgtt cttgctcctt cttcttcatc tccctttatt gatactgtct 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ttacaacaaa tcaccaccgg ggatactaaa cagggttatg aaaaccgggt cgggtggttc 1140 gggtgggtca ggttcgaagc ttgagaaagc gatgaaggag tctttcgaag agcttacgct 1200 taaggatacg cttaaaccgg ttttgattcc ttgttacgac ctcacgagct ctgcaccgtt 1260 cttgttctca cgtgctgatg cgttggaaac ggacggttat gattttaagc tgtgggaagt 1320 ttgtagagct acttgggctg agccaggagt gtttgagccg gtggagatga gatcagttga 1380 tggtaagaca cggtgtgtag ctgttgatgg tggtttagca atgagtaatc caacggctgc 1440 agcgattact catgtgttgc ataataagca agagtttcct tttgttagag gtgttgagga 1500 tttgcttgtg ttgtcacttg gtacgggaca gttggttgat gttaagtatg attgtgataa 1560 ggttatgaag tggaaggcta agcattgggc tcgacctgcg gttcggattt ctgctgatgg 1620 agcagctgat actgtggatc aggctgtttc catggcgttt ggtcagtgta ggaggagtaa 1680 ctacgtccgt attcaggcga atggatcaag ctttggtccg tgcaaaccaa acatagacac 1740 agatgcgagt ccaagcaatg tgaatatgct tgtgggagta gcagaggaga tgctgaagca 1800 gaagaatgca gagtctgttc tgtttggtgg taagaaaatc aatgaagaaa gcaattatga 1860 gaagctggat tggttagccg gtgaactagt gctagaacac cagaggagga gttgtagaat 1920 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Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα(Patatin-related phospholipase A) 단백질 또는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열인 것인, 식물 종자의 초기 발아속도 증진용 조성물.
서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 pPLAIIIα(Patatin-related phospholipase A) 단백질을 코딩하는 핵산 서열의 발현을 증가시키는 조절 단계를 포함하는 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 핵산 서열은 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열인 것인, 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법.
제3항에 있어서, 상기 조절 단계는 pPLAIIIα 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합벡터로 식물을 형질전환하여 수행되는 것인, 식물 종자의 초기 발아속도를 증진시키는 방법.