CN113717264A

CN113717264A - 与油脂代谢调控相关的大豆RNA结合蛋白GmTSN990及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN113717264A
Application number: CN202010429235.8A
Authority: CN
Inventors: 张劲松; 陈受宜; 金萌; 张万科; 韦伟; 林晴; 陶建军; 阴翠翠
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2020-05-20
Filing date: 2020-05-20
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-05-20
Also published as: CN113717264B

Abstract

本发明公开了与油脂代谢调控相关的大豆RNA结合蛋白GmTSN990及其编码基因与应用。本发明公开的GmTSN990为如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的GmTSN990及其编码基因，在植物中转入表达该转基因可以提高种子中的油脂含量，说明GmTSN990及其编码基因可以正调控植物种子中油脂含量，该基因对提高种子油脂含量，培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。

Description

与油脂代谢调控相关的大豆RNA结合蛋白GmTSN990及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，与油脂代谢调控相关的大豆RNA结合蛋白GmTSN990及其编码基因与应用。

背景技术

人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位(表1)。

表1世界上主要的产油作物

脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对它的阻断会导致细胞的死亡，因而至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。

大多数植物中，油脂都以三酰甘油(Triacylglycerols，TAG)的形式储藏，它的含量是一个非常重要的农艺性状，TAG的生物合成称之为Kennedy途径，如同真核生物中合成膜甘油酯的途径，脂肪酸去除CoA后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物PA。PA去磷酸化产生DAG。在TAG合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的DAG 3’-OH位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催化的，此反应被认为是TAG生物合成中唯一的限速步骤。人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。然而，植物中，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍然知之甚少。

Tudor-SN(TSN)RNA结合蛋白，在动物细胞中为转录共激活因子，植物中其参与RNA代谢过程、胞内对热反应、RNA的基因沉默、mRNA代谢和加工等过程调控生长发育的各个阶段。目前尚未见报道此类蛋白参与脂肪酸合成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高植物种子油脂含量。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物油脂含量；

D2)制备调控植物油脂含量产品；

D3)培育油脂含量增加植物；

D4)制备培育油脂含量增加植物产品；

D5)植物育种；

所述蛋白质来源于大豆，其名称为GmTSN990，为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述A2)中的GmTSN990蛋白质，为与序列2所示蛋白质的氨基酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的蛋白质。所述具有75％或75％以上同一性为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

上述A2)中的GmTSN990蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述A2)中的GmTSN990蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上上表所示的标签的编码序列得到。其中，序列1所示的DNA分子编码序列2所示的GmTSN990蛋白质。

本发明还提供了与GmTSN990相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物油脂含量；

D2)制备调控植物油脂含量产品；

D3)培育油脂含量增加植物；

D4)制备培育油脂含量增加植物产品；

D5)植物育种；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码GmTSN990的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

上述应用中，B1)所述核酸分子可为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码GmTSN990的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码GmTSN990的cDNA分子或DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GmTSN990蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的GmTSN990蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GmTSN990蛋白质且具有GmTSN990蛋白质功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述应用中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，B2)所述的含有编码GmTSN990蛋白质的核酸分子的表达盒(GmTSN990基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达GmTSN990蛋白质的DNA，该DNA不但可包括启动GmTSN990基因转录的启动子，还可包括终止GmTSN990基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120：979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用茉莉酮酸甲酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4：3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev.,5:141；Mogen等人(1990)Plant Cell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res.,15:9627)。

可用现有的表达载体构建含有所述GmTSN990基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa、PSN1301或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为pBin438载体。

B3)所述重组载体具体可为pBin438-GmTSN990。所述pBin438-GmTSN990为在pBin438中插入为序列表中序列1所示的GmTSN990基因得到的重组载体，该重组载体表达GmTSN990，且GmTSN990基因的表达由35S驱动。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可为农杆菌，如农杆菌GV3101。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

本发明还提供了下述任一方法：

X1)培育油脂含量增加植物的方法，包括使受体植物中表达GmTSN990，或提高受体植物中GmTSN990的含量，或提高受体植物中GmTSN990的活性，得到油脂含量增加的目的植物；

X2)提高植物油脂含量的方法，包括使受体植物中表达GmTSN990，或提高受体植物中GmTSN990的含量，或提高受体植物中GmTSN990的活性，得到油脂含量增加的目的植物，实现植物油脂含量的提高。

上述方法中，X1)和X2)中提高受体植物中GmTSN990的含量可通过向所述受体植物导入GmTSN990的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

上述方法中，所述编码基因可为B1)所述核酸分子。

上述方法中，其中所述GmTSN990的编码基因可先进行如下修饰，再导入受体植物中，以达到更好的表达效果：

1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达；例如，可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述GmTSN990的编码基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物偏爱性；优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％、多于45％、多于50％或多于约60％；

2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰；

3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达；所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定；尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；

4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接；

5)引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV,MCMV和AMV)。

所述GmTSN990的编码基因可利用含有所述GmTSN990的编码基因的重组载体导入受体植物。所述重组载体具体可为所述pCAMBIA1301-GmTSN990。

所述重组载体可通过使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，显微注射，电穿孔，农杆菌介导等常规生物方法导入植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以干旱处理筛选转化植株。

所述目的植物理解为不仅包含GmTSN990蛋白或其编码基因被改变的第一代植物，也包括其子代。对于所述目的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述目的植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

上述方法中，所述受体植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

本发明还提供了提高植物油脂含量产品，所述产品含有GmTSN990或所述生物材料。

所述产品可以GmTSN990或所述生物材料为其活性成分，还可将GmTSN990或所述生物材料与具有相同功能的物质组合在一起作为其活性成分。

上述产品中，所述植物可为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

GmTSN990或所述生物材料，也属于本发明的保护范围。

本发明中，所述油脂含量可为种子中油脂含量。所述油脂可为亚油酸、油酸、亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、贡多酸、花生四烯酸和/或芥子酸。

本发明的实验证明，本发明的与植物组织油脂含量相关的RNA结合蛋白GmTSN990及其编码基因，在植物中转入表达该转基因可以提高种子中的油脂含量。说明RNA结合蛋白GmTSN990及其编码基因可以正调控植物种子中油脂含量。该基因对提高种子油脂含量，培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1为GmTSN990基因在大豆不同器官的表达分析。

图2为植物表达载体pBin438-GmTSN990示意图。

图3为GmTSN990相对表达量检测结果。对照表示野生型拟南芥。

图4为GmTSN990转基因株系总油脂含量检测结果。对照表示野生型拟南芥。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA/RNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3′末端核苷酸。

大豆材料：大豆Williams 82(W82)记载在如下文献中：Scott A Jackson等，Genome sequence of the palaeopolyploid soybean,Nature,2010,Vol.463,178-183，该大豆材料为美国栽培品种，由Purdue University,Department of Agronomy,ScottJackson教授赠送，经urdue University,Department of Agronomy,Scott Jackson教授同意后公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

pBin438载体(双元表达载体)由方荣祥院士惠赐，记载于“李太元,田颖川,秦晓峰,等.高效抗虫转基因烟草的研究[J].中国科学(B辑),1994,24(3):276-282.)”一文中，公众经方荣祥院士同意后可以从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

农杆菌GV3101菌株记载在“Clough-SJ,Bent-AF.Floral dip:a simplifiedmethod for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743”一文中，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)：Arabidopsis Biological Resource Center(ABRC)，以下简称野生型拟南芥。

实施例1、大豆油脂代谢调控相关蛋白GmTSN990编码基因GmTSN990的克隆和组织特异性表达检测

本发明以种子脂肪含量有差异的大豆品种为材料，分析了种子发育中油脂快速积累的前期和中期的转录组，获得一个参与调控籽粒油脂含量的候选基因，根据Williams 82(W82)基因组序列，设计引物从W82中克隆了目的基因，并检测了其在大豆不同器官中的表达水平。

1、GmTSN990的克隆

采用CTAB提取W82种子总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。

根据W82基因组序列中Glyma.04G203000全长cDNA序列的信息，设计引物，引物序列如下：

Glyma.04G203000-F:5’-ATGGCATCAACGGCGAGT-3’；

Glyma.04G203000-R:5’-TTATTTACGGCCACCAGCAG-3’。

以W82的cDNA为模板，用Glyma.04G203000-F和Glyma.04G203000-R为引物，进行PCR扩增,得到约3.0Kb的PCR产物。经过测序，该PCR产物为2973bp,具有序列表中序列1所示的核苷酸，经比对，该核苷酸序列包含Tudor-SN结构域，为RNA结合蛋白，将该基因编码的蛋白命名为GmTSN990，该蛋白包含990个氨基酸，其氨基酸序列为序列表中的序列2。

2、GmTSN990在大豆不同器官中的表达分析

取大豆W82根、苗、叶、荚和籽粒的总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA，进行RealTime-PCR鉴定，引物步骤1。以大豆Tublin基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-AACCTCCTCCTCATCGTACT3’，和Primer-TR：5’-GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。

结果如图2所示，GmTSN990基因的转录在种子中表达量最高，依次是荚、叶、苗、和根。

实施例2、GmTSN990基因可以调控拟南芥种子中油脂的合成和积累

一、重组农杆菌的获得

GmTSN990基因表达植物载体的构建：所用植物表达载体为pBin438，运用同源重组连接，将GmTSN990基因插入至该载体中。

所用pBin438的同源臂序列为：

F：5’-CAATTACTGCAGGGATCCGTCGAC-3’；

R：5’-CTTATCGTCGTCATCCTTGTAATC-3’。

具体的是利用pBin438的同源臂序列将序列1所示的GmTSN990基因替换pBin438的上述两条同源臂间的DNA片段，将所得到的重组载体记为pBin438-GmTSN990，pBin438-GmTSN990的结构示意图如图2所示，pBin438-GmTSN990能表达序列2所示的GmTSN990蛋白质，其中，GmTSN990基因的表达由35S驱动。

重组菌的构建：将上述含有GmTSN990基因的重组载体pBin438-GmTSN990导入农杆GV3101，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/GmTSN990；将pBin438导入农杆GV3101，得到重组农杆菌，将该重组农杆菌命名为GV3101/pBin438，作为空载体对照。

二、转GmTSN990拟南芥的获得及鉴定

将重组农杆菌GV3101/GmTSN990培养至对数期，然后用抽真空法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)中。经培育后收获种子，将种子播于含卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，待筛选得到的T₁代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获T₁代单株，各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T₂代的分离情况，如此重复数代直至获得遗传稳定的转基因纯合株系，获得10个转GmTSN990拟南芥纯系。

按照相同的转化方法，利用重组农杆菌GV3101/pBin438转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)，得到空载体对照株系。经检测，野生型和空载体对照株系全生育期的生长发育及其它性状均未见明显差异。因此下述对照为野生型拟南芥。

提取上述各个株系苗RNA，反转录得到cDNA作为模板，利用引物(F:5’-ATGGCATCAACGGCGAGT-3’和R:5’-TTATTTACGGCCACCAGCAG-3’)进行Real Time-PCR鉴定。以野生型拟南芥(Col-0)为对照。拟南芥AtActin2基因为内标，所用引物为Primer-TF：5’-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3’，和Primer-TR：5’-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3’。

结果显示，OE1、OE9、OE3和OE13中GmTSN990基因的相对表达量分别约为0.126、0.053、0.045、0.036，作为对照的野生型拟南芥(Col-0)中均未能检测出GmTSN990基因的表达量，图3。表明，GmTSN990成功基因转入拟南芥中，且得到了表达。选取纯系OE1、OE9、OE3和OE13做进一步检测。

三、转GmTSN990基因拟南芥的表型分析

测定GmTSN990转基因纯系OE1、OE9、OE3和OE13种子中总油脂含量，以野生型拟南芥为对照，每个株系取30株的籽粒，生物学实验重复三次，结果取平均值±标准差。

步骤如下：

彻底干燥待测籽粒，研磨成粉，取10mg加入螺口的2ml离心管中，每份样品平行称取四份；然后向样品中加入10μl的17:0十七烷酸(10mg/ml)做内标，而后再加入含2.5％浓硫酸的甲醇溶液1ml，85℃水浴中保温1小时，期间晃动数次；自然冷却后，取上清500μl到新管中，加入600μl的0.9％(质量百分比)NaCl水溶液、300μl正己烷，震荡混匀几分钟，4000转离心10分钟，取上清至新管中；通风橱中过夜使正己烷挥发完全，然后加入50μl乙酸乙酯溶解甲酯化的脂肪酸；将甲酯化的脂肪酸样品用气相色谱质谱联用仪测各个组分的相对含量，然后将各个组分的脂肪酸与加入的内标比较得出绝对含量，而后计算总油脂含量，即各个组分绝对含量之和。(Shen,B.,et al.,The homeobox gene GLABRA2 affects seed oilcontent in Arabidopsis,Plant Mol.Biol.,60,377-387,2006.)

其中，气相色谱仪：日本岛津公司(GC-2014,Shimadzu)。检测条件：色谱柱：FAMEWAX，载气：氮气，柱流量：4.21mL/min，柱温：170℃，进样温度：250℃，检测器温度：250℃，压力：163.8kPa，分析时间：25min，内标：十七烷酸(17:0,四川省维克奇生物科技有限公司,货号：506-12-7)，进样体积：1μL，溶剂：乙酸乙酯。

所检测的脂肪酸为亚油酸、油酸、亚麻酸、棕榈酸、硬脂酸、贡多酸、花生四烯酸和芥子酸。

结果如图4所示，野生型拟南芥籽粒总油脂含量为29.5±0.3％，即为籽粒总重量的百分比。转GmTSN990拟南芥株系OE1、OE9、OE3和OE13种子总油脂质量含量分别为33.9±1.8、33.1±2.0、31.8和35.1±0.3％。结果表明，4个转基因株系种子中的油脂含量均显著高于野生型对照。

上述实验表明，大豆RNA结合蛋白GmTSN990可以正调控种子中油脂的合成和积累，其编码基因GmTSN990的表达，可提高转基因植株种子中总油脂的含量。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 与油脂代谢调控相关的大豆RNA结合蛋白GmTSN990及其编码基因与应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2973

<212> DNA

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 1

atggcatcaa cggcgagtgg ggccaccgga tggtacaggg gaagagtgaa ggcggttcct 60

tccggggact gtttggtcat tgtggcgatc tccagcacca aacctggtcc tttgcctgaa 120

aagaccatta ctctttcttc tttaattgca cctagactgg cgcgtagagg tggtgtggac 180

gagccttttg catgggaaag cagagagttt ctgaggaagc tctgcatagg gaaggaagtg 240

actttcagag tggactacaa cgtgccgtcc ataagtcggg actttggaac cgtttttgtc 300

ggggacaaga atgttgccat gcttgttgtt tctcagggat gggttaaggt cagggaacag 360

gggcagcaga aaggagaagt tagtccgtac ctggcagaat tgttgcggtt ggaagaacag 420

gctaaacaag aaggccttgg gcggtggagc aaggttcccg gtgctgcaga ggcttcaatc 480

agaaatttac caccttctgc ccttggtgac cctagtaact ttgatgctat gactttttta 540

aatgcaaaga agggattgcc catggaggca gttgttgagc aggttcgtga tggcagtaca 600

ctccgtatct atttgctccc ggagtttcag tttgtccaag tttttgttgc tggaattcag 660

tctccacaaa tgggaaggag agctgcacct gaaagtgttg ttgaaccaga gttgacatct 720

gatgacacca acggagatgt tcctggggaa cctcgagccc cacttacatc tgcacaaagg 780

cttgcagttt caacatctgc tgctgaaact gcagccgatc cttttgcaca tgatgctaaa 840

tttttcactg agatgcgtgt attgaatcga gaagttcggc ttgtcctgga aggtgtcgat 900

aagtttagca atttaattgg gtcagtgtat tatcctgatg gtgaatcagc aaaggacctg 960

gcattggagc ttgtagaaaa cggttatgca aaatacgttg attggagtgc aaatatgatg 1020

gaagaagagg caaagcaaaa gctgaagact gctgaactgc aggctaagaa agacaggtta 1080

aggatgtgga caaactatgt accaccgcct tcaaattcaa aggcaattca taaccagaat 1140

ttttctggca aggtggttga ggttgtgagt ggagactgta ttgttgttgc tgatgattcc 1200

attccatatg gtagtcctct agctgagagg cgagttaacc tttcaagtat taggtgtcca 1260

aaaatgggca atcctcgtcg agacgaaaaa ccagctccct atgcccgtga agcaaaggag 1320

ttcttgagaa cacgcctcat tggtcgtcaa gttaatgttc agatggaata ttctagaaag 1380

gtttctccca cggatggatc tgtagttcca tcagccgctg attcccgagt aatggatttt 1440

ggatcagtct ttctattgtc tggtgccaag gttgacaatg atgatgcccc atcatcggct 1500

ccacctgctg gaagtcagca aaatggggtg aatgttgctg agttaatagt gggccgtggc 1560

tttggaactg tcattagaca tcgtgacttt gaagagagat ctaactatta tgattctctt 1620

cttgctgctg aatcgcgtgc aatttctgga aggaaaggca cccactctgc caaggatcct 1680

ccagtgatgc atataactga tttgaccatg gcatcggcta agaaagccag agacttcttg 1740

cctttcctgc accgaagtag aagagttcct gctgttgtgg aatatgtgct cagtggccat 1800

cgttttaaat tgttaattcc aaaagaaact tgcagcattg cgttctcttt ttctggagtc 1860

aggtgtcctg gtcgtgatga accatattca gacgaagcaa ttgctctgat gaggagaaag 1920

ataatgcaaa gagatgttga gatagaggtt gaaaccgttg atagaactgg aacgttcttg 1980

ggatccttat gggagtcgag gaccaatgtg gcaattacac tgcttgaagc tggtcttgca 2040

aaacttcata catcctttgg cagtgataga attcctgatt ttcatcttct ggatcaggct 2100

gaacaatctg ctaagaggca aaagctgaaa atctgggaga attttgttga aggagaggaa 2160

gtatctaatg gtgcagcagt tgaaaacaaa cagcaagaag tacttaaggt aattgttaca 2220

gaagtcttgg gtggtggtaa attctatgtc cagacagttg gagatcaaaa gatcgcatcc 2280

attcagcaac aacttgcttc tttgaacctg aaggatgctc ctgtgcttgg tgctttcaat 2340

cctaagaagg gtgacatagt cctttgttat tttcatgctg acaagtcttg gtaccgggca 2400

atggttgtca atacaccccg aggaccagtt gaatcaccta acgacttgtt cgaagtattc 2460

tatattgatt atggaaatca agaagtagta ccctacagtc aactacggcc tgttgatcca 2520

tctgtgtctg ctgctccggg tcttgctcaa ctgtgtagcc ttgcatacat caagattcca 2580

aacttggaag aggattttgg ccaagaagca gctgaatatt tgagtgaact cactttaaac 2640

agtggaaaag agttcagggc caaggttgag gagaaagata cttccggagg aaaagtgaaa 2700

gggcagggaa ctgggacagt ccttgctgta actcttgttg ccgtggatgc tgaaatcagc 2760

gttaatgctg ccatgctaca ggaagggctt gctaggacag aaaaaagaaa caggtgggac 2820

agaaaagaca gacagacagc tcttgataat ttggagaatt tccaggaaga agcaaagacc 2880

agcaggcgcg gaatgtggca gtatggagat attcagtcag atgacgagga cactgctcct 2940

cctcctagaa aggctgctgg tggccgtaaa taa 2973

<210> 2

<211> 990

<212> PRT

<213> 大豆属大豆（Glycine max (L.) Merrill）

<400> 2

Met Ala Ser Thr Ala Ser Gly Ala Thr Gly Trp Tyr Arg Gly Arg Val

1 5 10 15

Lys Ala Val Pro Ser Gly Asp Cys Leu Val Ile Val Ala Ile Ser Ser

20 25 30

Thr Lys Pro Gly Pro Leu Pro Glu Lys Thr Ile Thr Leu Ser Ser Leu

35 40 45

Ile Ala Pro Arg Leu Ala Arg Arg Gly Gly Val Asp Glu Pro Phe Ala

50 55 60

Trp Glu Ser Arg Glu Phe Leu Arg Lys Leu Cys Ile Gly Lys Glu Val

65 70 75 80

Thr Phe Arg Val Asp Tyr Asn Val Pro Ser Ile Ser Arg Asp Phe Gly

85 90 95

Thr Val Phe Val Gly Asp Lys Asn Val Ala Met Leu Val Val Ser Gln

100 105 110

Gly Trp Val Lys Val Arg Glu Gln Gly Gln Gln Lys Gly Glu Val Ser

115 120 125

Pro Tyr Leu Ala Glu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Gln Ala Lys Gln Glu

130 135 140

Gly Leu Gly Arg Trp Ser Lys Val Pro Gly Ala Ala Glu Ala Ser Ile

145 150 155 160

Arg Asn Leu Pro Pro Ser Ala Leu Gly Asp Pro Ser Asn Phe Asp Ala

165 170 175

Met Thr Phe Leu Asn Ala Lys Lys Gly Leu Pro Met Glu Ala Val Val

180 185 190

Glu Gln Val Arg Asp Gly Ser Thr Leu Arg Ile Tyr Leu Leu Pro Glu

195 200 205

Phe Gln Phe Val Gln Val Phe Val Ala Gly Ile Gln Ser Pro Gln Met

210 215 220

Gly Arg Arg Ala Ala Pro Glu Ser Val Val Glu Pro Glu Leu Thr Ser

225 230 235 240

Asp Asp Thr Asn Gly Asp Val Pro Gly Glu Pro Arg Ala Pro Leu Thr

245 250 255

Ser Ala Gln Arg Leu Ala Val Ser Thr Ser Ala Ala Glu Thr Ala Ala

260 265 270

Asp Pro Phe Ala His Asp Ala Lys Phe Phe Thr Glu Met Arg Val Leu

275 280 285

Asn Arg Glu Val Arg Leu Val Leu Glu Gly Val Asp Lys Phe Ser Asn

290 295 300

Leu Ile Gly Ser Val Tyr Tyr Pro Asp Gly Glu Ser Ala Lys Asp Leu

305 310 315 320

Ala Leu Glu Leu Val Glu Asn Gly Tyr Ala Lys Tyr Val Asp Trp Ser

325 330 335

Ala Asn Met Met Glu Glu Glu Ala Lys Gln Lys Leu Lys Thr Ala Glu

340 345 350

Leu Gln Ala Lys Lys Asp Arg Leu Arg Met Trp Thr Asn Tyr Val Pro

355 360 365

Pro Pro Ser Asn Ser Lys Ala Ile His Asn Gln Asn Phe Ser Gly Lys

370 375 380

Val Val Glu Val Val Ser Gly Asp Cys Ile Val Val Ala Asp Asp Ser

385 390 395 400

Ile Pro Tyr Gly Ser Pro Leu Ala Glu Arg Arg Val Asn Leu Ser Ser

405 410 415

Ile Arg Cys Pro Lys Met Gly Asn Pro Arg Arg Asp Glu Lys Pro Ala

420 425 430

Pro Tyr Ala Arg Glu Ala Lys Glu Phe Leu Arg Thr Arg Leu Ile Gly

435 440 445

Arg Gln Val Asn Val Gln Met Glu Tyr Ser Arg Lys Val Ser Pro Thr

450 455 460

Asp Gly Ser Val Val Pro Ser Ala Ala Asp Ser Arg Val Met Asp Phe

465 470 475 480

Gly Ser Val Phe Leu Leu Ser Gly Ala Lys Val Asp Asn Asp Asp Ala

485 490 495

Pro Ser Ser Ala Pro Pro Ala Gly Ser Gln Gln Asn Gly Val Asn Val

500 505 510

Ala Glu Leu Ile Val Gly Arg Gly Phe Gly Thr Val Ile Arg His Arg

515 520 525

Asp Phe Glu Glu Arg Ser Asn Tyr Tyr Asp Ser Leu Leu Ala Ala Glu

530 535 540

Ser Arg Ala Ile Ser Gly Arg Lys Gly Thr His Ser Ala Lys Asp Pro

545 550 555 560

Pro Val Met His Ile Thr Asp Leu Thr Met Ala Ser Ala Lys Lys Ala

565 570 575

Arg Asp Phe Leu Pro Phe Leu His Arg Ser Arg Arg Val Pro Ala Val

580 585 590

Val Glu Tyr Val Leu Ser Gly His Arg Phe Lys Leu Leu Ile Pro Lys

595 600 605

Glu Thr Cys Ser Ile Ala Phe Ser Phe Ser Gly Val Arg Cys Pro Gly

610 615 620

Arg Asp Glu Pro Tyr Ser Asp Glu Ala Ile Ala Leu Met Arg Arg Lys

625 630 635 640

Ile Met Gln Arg Asp Val Glu Ile Glu Val Glu Thr Val Asp Arg Thr

645 650 655

Gly Thr Phe Leu Gly Ser Leu Trp Glu Ser Arg Thr Asn Val Ala Ile

660 665 670

Thr Leu Leu Glu Ala Gly Leu Ala Lys Leu His Thr Ser Phe Gly Ser

675 680 685

Asp Arg Ile Pro Asp Phe His Leu Leu Asp Gln Ala Glu Gln Ser Ala

690 695 700

Lys Arg Gln Lys Leu Lys Ile Trp Glu Asn Phe Val Glu Gly Glu Glu

705 710 715 720

Val Ser Asn Gly Ala Ala Val Glu Asn Lys Gln Gln Glu Val Leu Lys

725 730 735

Val Ile Val Thr Glu Val Leu Gly Gly Gly Lys Phe Tyr Val Gln Thr

740 745 750

Val Gly Asp Gln Lys Ile Ala Ser Ile Gln Gln Gln Leu Ala Ser Leu

755 760 765

Asn Leu Lys Asp Ala Pro Val Leu Gly Ala Phe Asn Pro Lys Lys Gly

770 775 780

Asp Ile Val Leu Cys Tyr Phe His Ala Asp Lys Ser Trp Tyr Arg Ala

785 790 795 800

Met Val Val Asn Thr Pro Arg Gly Pro Val Glu Ser Pro Asn Asp Leu

805 810 815

Phe Glu Val Phe Tyr Ile Asp Tyr Gly Asn Gln Glu Val Val Pro Tyr

820 825 830

Ser Gln Leu Arg Pro Val Asp Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Leu

835 840 845

Ala Gln Leu Cys Ser Leu Ala Tyr Ile Lys Ile Pro Asn Leu Glu Glu

850 855 860

Asp Phe Gly Gln Glu Ala Ala Glu Tyr Leu Ser Glu Leu Thr Leu Asn

865 870 875 880

Ser Gly Lys Glu Phe Arg Ala Lys Val Glu Glu Lys Asp Thr Ser Gly

885 890 895

Gly Lys Val Lys Gly Gln Gly Thr Gly Thr Val Leu Ala Val Thr Leu

900 905 910

Val Ala Val Asp Ala Glu Ile Ser Val Asn Ala Ala Met Leu Gln Glu

915 920 925

Gly Leu Ala Arg Thr Glu Lys Arg Asn Arg Trp Asp Arg Lys Asp Arg

930 935 940

Gln Thr Ala Leu Asp Asn Leu Glu Asn Phe Gln Glu Glu Ala Lys Thr

945 950 955 960

Ser Arg Arg Gly Met Trp Gln Tyr Gly Asp Ile Gln Ser Asp Asp Glu

965 970 975

Asp Thr Ala Pro Pro Pro Arg Lys Ala Ala Gly Gly Arg Lys

980 985 990

Claims

1.蛋白质或调控所述蛋白质活性或含量的物质的下述任一应用：

D1)调控植物油脂含量；

D2)制备调控植物油脂含量产品；

D3)培育油脂含量增加植物；

D4)制备培育油脂含量增加植物产品；

D5)植物育种；

所述蛋白质为如下A1)、A2)或A3)：

A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.与权利要求1中所述蛋白质相关的生物材料的下述任一应用：

D1)调控植物油脂含量；

D2)制备调控植物油脂含量产品；

D3)培育油脂含量增加植物；

D4)制备培育油脂含量增加植物产品；

D5)植物育种；

所述生物材料为下述B1)至B7)中的任一种：

B1)编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下b11)或b12)或b13)或b14)：

b11)编码序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b12)序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；

b13)与b11)或b12)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子；

b14)在严格条件下与b11)或b12)或b13)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述植物为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

5.下述任一方法：

X1)培育油脂含量增加植物的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到油脂含量增加的目的植物；

X2)提高植物油脂含量的方法，包括使受体植物中表达权利要求1中所述蛋白质，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量，或提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的活性，得到油脂含量增加的目的植物，实现植物油脂含量的提高。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：X1)和X2)中提高受体植物中权利要求1中所述蛋白质的含量通过向所述受体植物导入权利要求1中所述蛋白质的编码基因并使所述编码基因得到表达实现。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子。

8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述受体植物为M1)或M2)或M3)：

M1)双子叶植物或单子叶植物；

M2)豆科植物；

M3)大豆。

9.提高植物油脂含量产品，含有权利要求1中所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料。

10.权利要求1中所述蛋白质或权利要求2或3中所述生物材料。