CN109206495B

CN109206495B - 棉花转录因子GaMAN1在植物油脂代谢调控中的应用

Info

Publication number: CN109206495B
Application number: CN201811293901.9A
Authority: CN
Inventors: 马磊; 时萌; 方丹; 徐双娇; 田新权
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2021-08-03
Anticipated expiration: 2038-11-01
Also published as: CN109206495A

Abstract

本发明公开了棉花转录因子GaMAN1在植物油脂代谢调控中的应用。转录因子GaMAN1是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。通过实验证明：棉花转录因子GaMAN1可提高作物油脂含量和脂肪酸含量，该基因对提高和改良作物油脂成分、特别是对于提高棉花种子中油脂成分，培育出高油脂品种具有重要的理论和现实意义。

Description

棉花转录因子GaMAN1在植物油脂代谢调控中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及棉花转录因子GaMAN1在植物油脂代谢调控中的应用。

背景技术

棉花作为重要的经济作物，除皮棉作为纺织原料外，其棉籽也是我国重要的油料资源。根据国家粮油信息中心数据，在世界上的几种主要产油作物中，2015年我国八大油料的总产量为5724.4万吨，其中棉籽产量为1008.9万吨，占比达到17.62％，为我国第四大油料作物。

植物油是由脂肪酸和甘油合成的高级脂肪酸甘油酯，以三酰甘油(TAG)的形式储存。在种子发育过程中，首先在质体中合成16或18碳饱和脂肪酸及油酸(18:1)；接着，这些脂肪酸进入内质网，脂肪酸碳链可延伸生成超长脂肪酸或者去脱饱和酶的催化下继续脱饱和生成多不饱和脂肪酸；最后，各种脂肪酸与3-磷酸甘油结合生成三酰甘油。油脂合成过程涉及到一系列的脂肪酸合成酶在不同细胞器间发挥作用。为了提高种子油脂的产出，到目前为止，参与油酯生物合成的一些关键酶被克隆并用于改良，但结果表明单纯的改变一个基因并不能显著增加油脂含量(Song，Li et al.2013)。种子成熟过程的调控网络涉及到转录因子、激素信号传导、营养物质积累与代谢，以及它们之间的交互作用等各个方面。转录因子一般可以调节多个基因，能够同时参与到油脂合成的糖代谢、脂肪酸合成、TAG组装、油体合成等各环节，进而成为遗传改良的可行路径。

发明内容

本发明的一个目的是提供GaMAN1蛋白质的新用途。

本发明提供了GaMAN1蛋白质在调控植物油脂含量和/或脂肪酸含量中的应用。

所述GaMAN1蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有70％、具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同源性且具有相同功能的蛋白质。

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上下表所示的标签的编码序列得到。

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

本发明的另一个目的是提供与GaMAN1蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与GaMAN1蛋白质相关的生物材料在调控植物油脂含量和/或脂肪酸含量中的应用；

所述与GaMAN1蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码GaMAN1蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码GaMAN1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码GaMAN1蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码GaMAN1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码GaMAN1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码GaMAN1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述应用中，所述重组载体是将上述GaMAN1蛋白质的编码基因插入表达载体中，得到表达GaMAN1蛋白质的重组载体。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种植物表达载体，例如Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)。构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛生素基因Ubiquitin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明GaMAN1的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是双子叶植物，如油菜、大豆、苜蓿、向日葵、拟南芥或棉花等，也可以是单子叶植物，如水稻、小麦、玉米等。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。

上述应用中，所述调控为提高；所述调控植物油脂含量和/或脂肪酸含量体现在提高植物组织油脂含量和/或脂肪酸含量，具体体现在提高植物种子中的油脂含量和/或脂肪酸含量。

所述油脂含量为总油脂含量；所述总油脂含量通过种子中脂类重量与种子总重量的百分比体现。

所述脂肪酸可为棕榈酸和/或油酸和/或亚油酸和/或亚麻酸和/或花生烯酸。

本发明还提供了GaMAN1蛋白质或与GaMAN1蛋白质相关的生物材料在培育油脂含量高和/或脂肪酸含量高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了GaMAN1蛋白质或与GaMAN1蛋白质相关的生物材料在植物育种中的应用。

本发明最后一个目的是提供一种培育油脂含量高和/或脂肪酸含量高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育油脂含量高和/或脂肪酸含量高的转基因植物的方法包括提高受体植物中GaMAN1蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的油脂含量和/或脂肪酸含量高于受体植物。

上述方法中，所述油脂含量为植物组织油脂含量；所述植物组织具体为植物种子；

所述油脂含量为总油脂含量；所述总油脂含量通过种子中脂类重量与种子总重量的百分比体现；

上述方法中，所述提高受体植物中GaMAN1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达GaMAN1蛋白质。

进一步的，所述过表达的方法为将GaMAN1蛋白质的编码基因导入受体植物。

更进一步的，所述GaMAN1蛋白质的编码基因是通过重组载体pCAMBIA2300-GaMAN1或pCAMBIA2301-GaMAN1导入受体植物。

所述重组载体pCAMBIA2300-GaMAN1为将载体pCAMBIA2300中Kpn I和Sal I酶切位点间的小片段替换为序列1所示的GaMAN1基因，且保持载体pCAMBIA2300的其他序列不变后得到载体。

所述重组载体pCAMBIA2301-GaMAN1为将载体pCAMBIA2301中EcoR I和Sal I酶切位点间的小片段替换为序列1所示的GaMAN1基因，且保持载体pCAMBIA2301的其他序列不变后得到载体。

上述方法中，所述GaMAN1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。

上述应用或方法中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述双子叶植物可以是油菜、大豆、苜蓿、向日葵、拟南芥或棉花等；所述单子叶植物可以是水稻、小麦、玉米等。

在本发明的具体实施例中，所述双子叶植物具体为拟南芥或棉花；所述拟南芥品种具体为哥伦比亚生态型拟南芥(Col-0)；所述棉花的品种具体为中棉所24。

本发明将转录因子GaMAN1的编码基因转入野生型拟南芥和棉花中，得到转基因拟南芥和转基因棉花，转基因拟南芥与野生型拟南芥相比，其种子的油脂含量和部分脂肪酸含量(如棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生烯酸)均提高，转基因棉花与野生型棉花相比，其种子的油脂含量显著提高。说明转录因子GaMAN1及其编码基因可以调控植物种子中油脂含量和/或脂肪酸含量。该基因对提高和改良作物油脂成分、特别是对于提高棉花种子中油脂成分，培育出高油脂品种具有重要的理论和现实意义。

附图说明

图1为GaMAN1在棉花不同器官的表达分析。

图2为表达盒结构示意图。

图3为转GaMAN1拟南芥植株纯系的分子鉴定。

图4为转GaMAN1拟南芥植株种子千粒重。

图5为转GaMAN1拟南芥植株种子中油脂含量测定。

图6为转GaMAN1拟南芥植株种子中脂肪酸含量的测定。

图7为转GaMAN1棉花的PCR鉴定图。

图8为转GaMAN1棉花植株种子总油脂含量测定。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、GaMAN1在棉花不同器官中的表达分析

1、cDNA的合成

分别提取亚洲棉石系亚1号(中国农业科学院棉花所提供)的根、茎、叶、花和胚珠的总RNA，用逆转录酶反转录合成cDNA。

2、Real Time-PCR

分别以步骤1中的cDNA为模板，采用引物F：5'-CATGGTGAAGGCAATTGGGC-3'和引物R：5'-ATCAAAGCAACGAACCGCAC-3'进行Real Time-PCR。将棉花His3基因作为内参，内参基因引物为Primer-F：5'-TCAAGACTGATTTGCGTTTCCA-3'和Primer-R：5'-GCGCAAAGGTTGGTGTCTTC-3'。同时以野生型拟南芥为对照。

结果如图1所示，结果表明：在根、茎、叶和花中几乎检测不到GaMAN1基因的转录，而在胚珠中的表达量高，因此GaMAN1是种子特异表达的基因。

实施例2、转GaMAN1拟南芥的获得及其总油脂与脂肪酸含量分析

一、转GaMAN1拟南芥的获得

1、转录因子GaMAN1的获得

1)cDNA的合成

提取亚洲棉石系亚1号(中国农业科学院棉花所提供)胚珠的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。

2)PCR扩增及测序

根据在CottonFGD的棉花基因组序列中GaMAN1全长cDNA序列的信息，设计如下引物序列：GaMAN1-F：5'-GGGGTACCATGTCAGAAGAAATGAATCTATC-3'和GaMAN1-R：5'-ACGTCGACTTATACCGACAGGTGGCACAAG-3'。以步骤1)获得的cDNA为模板，采用GaMAN1-F/R引物进行PCR扩增。

PCR反应体系和反应程序如下：

反应体系：10×Buffer(含MgCl₂)2μL，10mM dNTPs 0.4μL，2.5U/μl Taq酶0.2μL，10μM正向引物0.25μL，10μM反向引物0.25μL，DNA模板1μL，15.9μL ddH₂O。

反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

最终得到约1Kb的PCR产物。经测序，该产物大小为1221bp，其具有序列表中序列1所示的核苷酸，该核苷酸所示的基因为GaMAN1，该基因编码的蛋白为GaMAN1，GaMAN1蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。

2、植物表达载体的构建

使用Kpn I和Sal I分别对步骤1获得的PCR产物和载体pCAMBIA2300(购自北京华越洋生物科技有限公司)进行双酶切，分别回收酶切产物并连接，将上述步骤1得到的PCR产物克隆至载体pCAMBIA2300上，得到重组载体并对其进行测序验证。

经过测序表明：重组载体为将载体pCAMBIA2300中Kpn I和Sal I酶切位点间的小片段替换为序列1所示的GaMAN1基因，且保持载体pCAMBIA2300的其他序列不变后得到载体，并将其记作重组载体pCAMBIA2300-GaMAN1。

重组载体pCAMBIA2300-GaMAN1中包括GaMAN1基因表达盒，该表达盒依次由用于启动GaMAN1基因表达的CaMV 35S启动子、GaMAN1基因和用于终止GaMAN1基因表达的NOS终止子组成，其结构如图2所示。

3、重组农杆菌的获得及鉴定

1)重组农杆菌的获得

将步骤2中的重组载体pCAMBIA2300-GaMAN1用电击法转化农杆菌GV3101(购自上海生工生物技术有限公司)，得到重组菌。

2)重组农杆菌的鉴定

提取重组菌的质粒，经测序，该质粒是pCAMBIA2300-GaMAN1，并将含有pCAMBIA2300-GaMAN1质粒的重组菌命名为GV3101/GaMAN1，即重组农杆菌GV3101/GaMAN1。

4、转GaMAN1拟南芥的获得及鉴定

1)转GaMAN1拟南芥的获得

将步骤3中获得的重组农杆菌GV3101/GaMAN1培养至对数期，然后采用沾花法将其转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)(种子购买于Arabidopsis Biological ResourceCenter)花中，经过培养后，收获种子，将种子播撒在含有卡那霉素(50mg/L)的MS筛选培养基上，待筛选得到的T₁代植株长至6-8叶时，将其移栽含有蛭石的营养土上生长，待成熟时，T₁代单株收种子，并将单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选并观察T₂代的分离比，如此重复数代直到获得遗传稳定的转基因纯合株系，并将获得的3个T₂代转GaMAN1拟南芥纯系命名为OE-46、OE-5和OE-18。

2)转GaMAN1拟南芥的鉴定

提取编号为OE-46、OE-5和OE-18的T₂代转GaMAN1拟南芥株系苗的RNA，反转录得到cDNA，以cDNA为模板，采用引物F：5'-CATGGTGAAGGCAATTGGGC-3'和引物R：5'-ATCAAAGCAACGAACCGCAC-3'进行Real Time-RCR鉴定。将拟南芥AtActin基因作为内参基因，内参基因引物为F：5'-ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3'和R：5'-TGCTCATACGGTCAGCGATA-3'。同时以野生型拟南芥(col-0)作为对照。重复实验三次，结果取平均值±标准差。

结果如图3所示，结果表明：OE-46、OE-5和OE-18中GaMAN1的相对表达量较高，分别为2.7±0.3、3.3±0.2和3.5±0.5；而在野生型拟南芥(col-0)中几乎检测不出GaMAN1的表达。

上述结果进一步证明，GaMAN1已成功转入拟南芥中，且得到表达，说明编号OE-46、OE-5和OE-18的T₂代转GaMAN1拟南芥均为阳性转GaMAN1拟南芥植株。

三、转GaMAN1拟南芥的表型分析

测定野生型拟南芥(col-0)、编号为OE-46、OE-5和OE-18的T₂代转GaMAN1拟南芥种子的千粒重。具体方法如下：首先将收获成熟的拟南芥种子自然风干，随机均分，取1000粒种子，并用电子天平称重，重复实验三次，结果取平均值±标准差。

结果如图4所示，OE-46、OE-5和OE-18的种子千粒重与野生型拟南芥(col-0)相比并无明显差异。

四、转GaMAN1拟南芥的总油脂或脂肪酸含量的分析

测定野生型拟南芥(col-0)、编号为OE-46、OE-5和OE-18的T₂代转GaMAN1拟南芥种子的总油脂含量和脂肪酸含量。

1、总油脂含量

种子总油脂含量的计算方法如下：总油脂量(％)＝(提取的脂类重量/种子总重量)×100％。每个株系取10株的种子，实验重复三次，结果取平均值±标准差。提取的脂类重量的测定方法如下：将干燥的种子研磨成粉，取100mg放入全自动索氏抽提系统中，用正己烷溶液(80mL)做回流溶剂，经过溶剂浸泡(20min)、淋洗(40min)和回收(10min)，将含有油脂的浸提烧杯于80℃烘干至恒质量，冷却称质量。

结果如图5所示，结果表明：编号为OE-46、OE-5和OE-18的T₂代转GaMAN1拟南芥种子中的总油脂含量明显高于野生型对照。其中，野生型拟南芥种子总油脂量为25±2％(即种子总重量的百分比)；T₂代转GaMAN1拟南芥株系OE-46种子总油脂量为29±1％；T₂代转GaMAN1拟南芥株系OE-5种子总油脂量为33±1％；T₂代转GaMAN1拟南芥株系OE-18种子总油脂量为34±1％。

上述实验表明：棉花NAC类转录因子GaMAN1对种子总油脂的合成呈正调控作用，过表达GaMAN1基因，可以提高转基因植株种子中的总油脂含量。

2、脂肪酸含量

脂肪酸含量检测具体包括如下脂肪酸：棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2)、亚麻酸(C18:3)、花生酸(C20:0)、花生一烯酸(C20:1)、花生二烯酸(C20:2)和二十碳三烯酸甘油三酯N3(C20:3)。种子中脂肪酸含量的检测步骤参照文献(王美霞等，棉籽油脂肪酸组成分析与评价，2016)中的方法。具体如下：将待测种子自然风干，研磨成粉，取10mg加入2mL的离心管中，每份样品平行称取四份。加入内标液和含2.5％浓硫酸的甲醇溶液1mL，85℃水浴中保温1h，期间摇晃混匀数次。自然冷却后，取上清500μL到新管中，加入600μL的0.9％NaCl溶液、300μL正己烷，震荡混匀几分钟，4000rpm离心10min，取上清至新管中。通风橱中过夜，使正己烷挥发完全，然后加入50μL乙酸乙酯溶解甲脂化的脂肪酸。将甲脂化的脂肪酸样品用气相色谱质谱联用仪器测定每个组分的相对含量，然后各个成分的脂肪酸与加入的内标液相比较得出其相对含量。每个株系取10株的种子，实验重复三次，结果取平均值±标准值。

脂肪酸的甲酯化反应如下：称取30mg拟南芥种子于10mL离心管中，加入600μL0.5mol/L氢氧化钠-甲醇溶液，70℃水浴加热10min，冷却至室温，加入饱和氯化钠溶液和正己烷溶液各2.0mL，涡旋30s，10 000r/min离心5min。取上层溶液于GC-MS和GC分析。

GC-MS条件如下：DB-23石英毛细管柱(60m×0.25mm×0.15μm)；升温程序：50℃保持1min，以25℃/min升至175℃，以4℃/min升至230℃，保持1min；氦气(He)流速1.0mL/min；进样方式为分流进样，分流比50∶1；进样量1μL；电子电离源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；监测方式为全扫描；质量扫描范围40～450m/z；溶剂延迟时间6min。

GC条件如下：色谱柱和升温程序同上；氮气为载气；进样口温度250℃；氢火焰离子化检测器温度280℃。

结果如图6所示，结果表明：T₂代转GaMAN1拟南芥种子的脂肪酸含量(棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生一烯酸)较野生型植株显著提高。证明GaMAN1是与植物的油脂代谢调控相关的基因。

实施例3、转GaMAN1棉花的获得及其油脂含量分析

一、转GaMAN1棉花的获得

1、转录因子GaMAN1的获得

1)cDNA的合成

提取棉花石系亚1号(中国农业科学院棉花所提供)胚珠的总RNA，将RNA用逆转录酶反转录合成cDNA。

2)PCR扩增

以步骤1)获得的cDNA为模板，采用GaMAN1-F’/R’引物进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：

GaMAN1-F’：5'-CGGAATTCATGTCAGAAGAAATGAATCTATC-3'；

GaMAN1-R’：5'-ACGTCGACTTATACCGACAGGTGGCACAAG-3'。

2、pCAMBIA2301-GaMAN1超表达载体的构建

使用EcoR I和Sal I分别对步骤1获得的PCR产物和载体pCAMBIA2301(购自北京华越洋生物科技有限公司)进行双酶切，分别回收酶切产物，用T4连接酶连接，将上述步骤1得到的PCR产物克隆至载体pCAMBIA2301上，得到重组载体并对其进行测序验证。

经过测序表明：重组载体为将载体pCAMBIA2301中EcoR I和Sal I酶切位点间的小片段替换为序列1所示的GaMAN1基因，且保持载体pCAMBIA2301的其他序列不变后得到载体，并将其记作超表达载体pCAMBIA2301-GaMAN1。

3、重组农杆菌的获得及鉴定

1)重组农杆菌的获得

将步骤2中的超表达载体pCAMBIA2301-GaMAN1用电击法转化农杆菌GV3101，得到重组菌。

2)重组农杆菌的鉴定

提取重组菌的质粒，经测序，该质粒是pCAMBIA2301-GaMAN1，并将含有pCAMBIA2301-GaMAN1质粒的重组菌命名为GV3101/GaMAN1，即重组农杆菌GV3101/GaMAN1。

4、转GaMAN1棉花的获得及鉴定

1)转GaMAN1棉花的获得

首先将陆地棉种子(中棉所24)(中国农业科学院棉花所提供)消毒，在无菌苗培养基上避光培养；5d后将下胚轴切成1cm左右的小段，利用超表达载体pCAMBIA2301-GaMAN1转化的重组农杆菌GV3101/GaMAN1转化中棉所24的下胚轴；然后在含卡那霉素(50mg/L)的筛选培养基培养，一个月继代一次；待胚型愈伤组织出现后，转至分化培养基上继续培养，一个月继代一次；待植物幼芽长出后，插入生根培养基上进行培养；当转化幼苗长出真叶时，转到光照培养箱，最后种植于大田繁种。

2)转GaMAN1棉花的鉴定

用CTAB法提取T₁代转基因棉花的基因组DNA。分别用35S-F：ATATCCGGAAACCTCCTCGGA和GaMAN1-R1：TCAAGCCTGTACTCGTGCAT引物检测T₁代GaMAN1转基因棉花植株，琼脂糖凝胶电泳分析结果表明，T₁代GaMAN1转基因棉花植株有明显的特异性扩增条带，而中棉所24无特异性条带(图7)，说明GhMAN1基因已成功转入受体中棉所24中。分别将经PCR鉴定为阳性的4株T₁代转GaMAN1棉花命名为p35S-GaMAN1-OE1、p35S-GaMAN1-OE2、p35S-GaMAN1-OE3、p35S-GaMAN1-OE4。

三、转GaMAN1棉花棉籽的总油脂含量测定

为提高转基因后代的遗传稳定性，将获得的T₁代阳性转GaMAN1棉花植株p35S-GaMAN1-OE1、p35S-GaMAN1-OE2、p35S-GaMAN1-OE3、p35S-GaMAN1-OE4进行自交，收获T₂代种子，并按照实施例2中的拟南芥总油脂含量的操作流程检测棉籽的总油脂含量。同时以野生型棉花中棉所24作为对照。

结果如图8所示，结果表明：在普通生长状态下，转GaMAN1棉花棉籽体内的总油脂含量与野生型对照相比显著上调，说明GaMAN1基因过表达能提高种子油分的含量。

上述实验表明，棉花NAC类转录因子GaMAN1对种子中油脂的合成呈正调控作用，其编码基因GaMAN1的过量表达，可提高转基因植株种子中总油脂的含量和一些脂肪酸如棕榈酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生烯酸等的含量。

序列表

<110>中国农业科学院棉花研究所

<120>棉花转录因子GaMAN1在植物油脂代谢调控中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1221

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atgtcagaag aaatgaatct atcaataaat ggtcagtctc aggtccctcc tggttttaga 60

tttcatccca cagaggagga gcttcttcac tattacctca gaaagaaagt agcttatgaa 120

aagatagact tggatgttat tcgggaagtt gatcttaaca agcttgagcc ctgggatata 180

caagagaagt gcagaatagg atccacccca caaaatgatt ggtacttctt cagccacaag 240

gacaagaaat accccacggg gaccagaacg aatcgggcaa cagctgccgg attctggaaa 300

gctactggac gtgacaagat catttatagt agctttagaa gaattgggtt gaggaagaca 360

ttggtttttt ataaaggaag agctccacat ggtcaaaaat ctgattggat tatgcacgag 420

tacaggcttg acgataccaa cacccttgac tctaatgcac ccaatcccat tggcgattct 480

atggctgaag aaggctgggt ggtttgccgt gtatttagaa agaagaatta tcagaaaacc 540

ctagagagtc ccaaaagctc ctcctccact tcccttgatt ccaagacgca gatgctttgc 600

tcaggcaacg acggggtttt agatcaattt tttctttata tgggaaggac ttgcaagatg 660

gagaacgatt cattgaatat tcccaacgcc aacaccaaca atcatctaag aatgctagtt 720

gcgaacaacg caggaggaat cagcgatggg ttacatgaaa gttttatgca cctccagagg 780

ctggaaagcc aatctctccc agcccttccc atctataccg cacactttga tcagcatcga 840

agcttcaagc catgttccca gtccatagac gatatgctga ctgaaattga accctctgct 900

gctgctgctg gttttgacaa tactaataat gagtccaaaa atggcgttaa tgactgggtc 960

actctggacc gccttgtagc atcccagcta aatggtcaag tagagacaag caagcaacta 1020

tcatgtttta ctgaccctaa tgcggttttc ggtctttgtc acgatgatga tgaagatgat 1080

gatgatattc aattatcgca cataaatatg cacagatcaa atcaaaaccc ccaggtctac 1140

agcaacgaga atgatctatg gagcttgact aagtcatcgt caccgtcgtc atcagatccc 1200

ttgtgccacc tgtcggtata a 1221

<210>2

<211>406

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Ser Glu Glu Met Asn Leu Ser Ile Asn Gly Gln Ser Gln Val Pro

1 5 10 15

Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Glu Glu Glu Leu Leu His Tyr Tyr

20 25 30

Leu Arg Lys Lys Val Ala Tyr Glu Lys Ile Asp Leu Asp Val Ile Arg

35 40 45

Glu Val Asp Leu Asn Lys Leu Glu Pro Trp Asp Ile Gln Glu Lys Cys

50 55 60

Arg Ile Gly Ser Thr Pro Gln Asn Asp Trp Tyr Phe Phe Ser His Lys

65 70 75 80

Asp Lys Lys Tyr Pro Thr Gly Thr Arg Thr Asn Arg Ala Thr Ala Ala

85 90 95

Gly Phe Trp Lys Ala Thr Gly Arg Asp Lys Ile Ile Tyr Ser Ser Phe

100 105 110

Arg Arg Ile Gly Leu Arg Lys Thr Leu Val Phe Tyr Lys Gly Arg Ala

115 120 125

Pro His Gly Gln Lys Ser Asp Trp Ile Met His Glu Tyr Arg Leu Asp

130 135 140

Asp Thr Asn Thr Leu Asp Ser Asn Ala Pro Asn Pro Ile Gly Asp Ser

145 150 155 160

Met Ala Glu Glu Gly Trp Val Val Cys Arg Val Phe Arg Lys Lys Asn

165 170 175

Tyr Gln Lys Thr Leu Glu Ser Pro Lys Ser Ser Ser Ser Thr Ser Leu

180 185 190

Asp Ser Lys Thr Gln Met Leu Cys Ser Gly Asn Asp Gly Val Leu Asp

195 200 205

Gln Phe Phe Leu Tyr Met Gly Arg Thr Cys Lys Met Glu Asn Asp Ser

210 215 220

Leu Asn Ile Pro Asn Ala Asn Thr Asn Asn His Leu Arg Met Leu Val

225 230 235 240

Ala Asn Asn Ala Gly Gly Ile Ser Asp Gly Leu His Glu Ser Phe Met

245 250 255

His Leu Gln Arg Leu Glu Ser Gln Ser Leu Pro Ala Leu Pro Ile Tyr

260 265 270

Thr Ala His Phe Asp Gln His Arg Ser Phe Lys Pro Cys Ser Gln Ser

275 280 285

Ile Asp Asp Met Leu Thr Glu Ile Glu Pro Ser Ala Ala Ala Ala Gly

290 295 300

Phe Asp Asn Thr Asn Asn Glu Ser Lys Asn Gly Val Asn Asp Trp Val

305 310 315 320

Thr Leu Asp Arg Leu Val Ala Ser Gln Leu Asn Gly Gln Val Glu Thr

325 330 335

Ser Lys Gln Leu Ser Cys Phe Thr Asp Pro Asn Ala Val Phe Gly Leu

340 345 350

Cys His Asp Asp Asp Glu Asp Asp Asp Asp Ile Gln Leu Ser His Ile

355 360 365

Asn Met His Arg Ser Asn Gln Asn Pro Gln Val Tyr Ser Asn Glu Asn

370 375 380

Asp Leu Trp Ser Leu Thr Lys Ser Ser Ser Pro Ser Ser Ser Asp Pro

385 390 395 400

Leu Cys His Leu Ser Val

405

Claims

1.GaMAN1蛋白质在提高植物油脂含量和/或脂肪酸含量中的应用；

所述GaMAN1蛋白质为如下a)或b)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

所述植物为双子叶植物。

2.与权利要求1中所述的GaMAN1蛋白质相关的生物材料在提高植物油脂含量和/或油脂代谢中的应用；

所述生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：

A1)编码权利要求1中所述的蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；

A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

所述植物为双子叶植物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为序列1所示的DNA分子。

4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述脂肪酸为棕榈酸和/或油酸和/或亚油酸和/或亚麻酸和/或花生烯酸。

5.权利要求1中所述的GaMAN1蛋白质或权利要求2或3中所述的生物材料在培育油脂含量高和/或脂肪酸含量高的转基因植物中的应用；所述植物为双子叶植物。

6.一种培育油脂含量高和/或脂肪酸含量高的转基因植物的方法，包括提高受体植物中权利要求1中所述的GaMAN1蛋白质的表达量，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的油脂含量和/或脂肪酸含量高于受体植物；所述植物为双子叶植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高受体植物中权利要求1中所述的GaMAN1蛋白质的表达量的方法为在受体植物中过表达所述GaMAN1蛋白质。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述过表达的方法为将权利要求1中所述的GaMAN1蛋白质的编码基因导入受体植物。

9.根据权利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于：所述GaMAN1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。