CN102127158A - 植物油脂代谢相关调控蛋白GmMYB73及其编码基因和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物油脂代谢相关调控蛋白GmMYB73(转录因子)及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物油脂代谢调控相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了所述蛋白的编码基因及含有所述编码基因的重组表达载体。本发明所述编码基因的活性高低同大豆含油量、油脂积累速率正相关，具有提高植物油脂含量的功能。转基因种子中的油脂含量明显高于非转基因植物，如转基因拟南芥，其种子中油脂含量比对照增加约14％。该基因对提高和改良作物油脂成份、特别是对于提高大豆等油料植物籽粒中油脂成份，培育高油脂品种具有重要的理论和现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物油脂代谢相关调控蛋白GmMYB73及其编码基因和应用。
背景技术
人类饮食中71％的油脂来自于植物。在世界上的几种主要产油作物中，大豆总产油量约占30％，居世界植物油产量的第一位，棕榈油及油菜子油分别位居第二及第三(世界上主要的产油作物如表1所示)。
表1世界上主要的产油作物
| 种类 | 生产量(百万吨) | 占总产量百分比 | 相对顺序 |
| 大豆(Soybean) | 15.50 | 29.1 | 1 |
| 棕榈(Palm) | 8.52 | 16.0 | 2 |
| 油菜籽(Rapeseed) | 7.03 | 13.2 | 3 |
| 向日葵(Sunflower) | 7.00 | 13.1 | 4 |
| 棉花籽(Cottonseed) | 3.31 | 6.2 | 5 |
| 椰子(Coconut) | 2.71 | 5.1 | 6 |
| 花生(Peanut) | 2.69 | 5.0 | 7 |
| 橄榄(Olive) | 1.63 | 3.1 | 8 |
脂肪酸的合成是植物体中最重要的代谢途径之一，它存在于植物体的任何一个细胞中，是生长发育所必须的。对它的阻断会导致细胞的死亡，因而至今为止还没有发现一个阻断脂肪酸合成的植物突变体。植物中脂肪酸的合成主要是在质体中进行，而动物及真菌的脂肪酸合成发生于胞质。因此植物需要存在一种不同于动物及真菌的机制——从质体运出脂肪酸到细胞的其它部位。因而在细胞中必定存在脂肪酸生产和运输的控制机制，但是迄今尚不清楚在脂肪酸的合成中质体内外是如何联系的。植物同其它真核生物在参与脂肪酸合成途径的酶上有很大差异。从乙酰CoA和丙二酰CoA合成16或18个碳原子的脂肪酸至少需要30个不同的酶催化的反应来完成这一过程，而在动物、真菌及一些细菌中，以上反应是由一个存在于胞质中的多酶复合体来完成的。植物中，参加脂肪酸合成的酶分别以可溶的形式独立存在于质体的胞质中。尽管植物中参与脂肪代谢的酶很容易被分离，但问题是这些酶是否在体内也可形成一个多酶复合体。
脂肪酸合成途径中最重要的碳源是由ACCase合成的丙二酰CoA，在进入脂肪酸合成途径之前，丙二酰由CoA转移到酰基载体蛋白(ACP)上，从此脂肪酸合成都需要ACP的参与，直到形成16或18个碳原子的脂肪酸，并被用于合成甘油或被运出质体。ACP是一个分子量为9KD的酸性蛋白，它具有一个可以通过硫酯化结合乙酰基的基团。当丙二酰由CoA转移到ACP后，硫酯化的丙二酰由CoA进行一系列的聚合反应，接受乙酰ACP或乙酰CoA的乙酰基团。这一聚合反应是通过释放一个CO2分子来形成一个C-C键，CO2的释放使这一反应变得不可逆，从而使聚合反应不断进行。大多数植物中，油脂都以三酰甘油(Triacylglycerols，TAG)的形式储藏，它的含量是一个非常重要的农艺性状，TAG的生物合成称之为Kennedy途径，如同真核生物中合成膜甘油酯的途径，脂肪酸去除CoA后被转移到3-磷酸甘油的1和2位，形成中间产物PA。PA去磷酸化产生DAG。在TAG合成的最后一步，第三个脂肪酸分子被转移到空的DAG 3’-OH位置，这一步反应是由二酰甘油乙酰转移酶(diacylglycerol acyltransferase，DGAT)催化的，此反应被认为是TAG生物合成中唯一的限速步骤。人们已对脂类合成途径有了认知，并且已经克隆了很多参与脂类合成的酶基因。然而，对脂类合成的调控机理及其相关基因仍然知之甚少。
发明内容
本发明的目的是提供一种植物油脂代谢相关调控蛋白GmMYB73及其编码基因和应用。
本发明所提供的植物油脂代谢相关调控蛋白为与油脂代谢调控相关的转录因子，名称为GmMYB73，来源于大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)，是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物油脂代谢相关的由序列2衍生的蛋白质；
(c)由与序列表中序列2所示的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的氨基酸序列组成的且与植物油脂相关调控的蛋白质。
序列表中的序列2由74个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第24-72位氨基酸残基为SANT结构域。
为了使(a)或(b)中的蛋白便于纯化，可在所述蛋白的N端或C端连接上如表2所示的标签。
表2标签的序列
| 标签 | 残基 | 序列 |
| Poly-Arg | 5-6(通常为5个) | RRRRR |
| Poly-His | 2-10(通常为6个) | HHHHHH |
| FLAG | 8 | DYKDDDDK |
| Strep-tag II | 8 | WSHPQFEK |
| c-myc | 10 | EQKLISEEDL |
上述(a)、(b)或(c)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表2所示的标签的编码序列得到。
上述蛋白的氨基酸序列中一个或几个氨基酸残基的取代、替换和/或添加，有的是由于自然发生的变异引起的，有的是由人工诱变处理引起的。
编码所述蛋白(GmMYB73)的基因(GmMYB73)也属于本发明的保护范围。
所述基因(GmMYB73)可为如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物油脂代谢相关调控蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述植物油脂代谢相关调控蛋白的DNA分子。
所述特异性杂交条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5MNaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
序列表中的序列1由225个核苷酸组成。含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒均属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为重组表达载体，如可为在pPROKII的多克隆位点插入自序列表中序列1的自5’末端的第1-225位脱氧核苷酸得到的重组质粒。所述重组表达载体具体可为将pPROKII的BamHI和KpnI位点间的小片段替换为序列表中序列1的自5’末端的第1-225位脱氧核苷酸得到的重组质粒。
可用现有的植物表达载体构建含有GmMYB73基因的重组表达载体。
所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。
使用GmMYB73构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子(如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin))，或组织特异表达启动子(如种子特异表达的启动子)，它们可单独使用或与其它植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。
扩增上述任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对具体可为如下1)或2)：
1)由序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对；此引物是扩增全长基因的引物对；
2)由序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对；此引物对是扩增基因部分片段的引物对。
本发明的最后一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将所述基因导入目的植物中，得到总油脂含量和/或脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因植物。
所述基因具体可通过所述重组表达载体导入所述植物。
所述总油脂含量和/或脂肪酸含量具体可为植物种子中的总油脂含量和/或脂肪酸含量。所述脂肪酸可为如下脂肪酸中的至少一种：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生烯酸。
所述植物可为单子叶或双子叶植物，优选为豆科植物(如大豆、百脉根、苜蓿、水黄皮等)或油料作物(如油菜、向日葵、玉米等)或油料树种等。
转化的细胞、组织或植物理解为不仅包含转化过程的最终产物，也包含其转基因子代。
本发明中所述的“多核苷酸”、“多核苷酸分子”、“多核苷酸序列”、“编码序列”、“开放阅读框(ORF)”等包括单链或双链的DNA和RNA分子，可包含一个或多个原核序列，cDNA序列，包含外显子和内含子的基因组DNA序列，化学合成的DNA和RNA序列，以及有义和相应的反义链。
本发明基因可通过如下方式导入宿主中：将本发明基因插入表达盒中，再将表达盒通过植物表达载体、非致病自我复制的病毒或农杆菌导入宿主。携带本发明基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织。
转入本发明基因的植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。
转入本发明基因的植物中，会有相应的本发明的植物油脂代谢相关调控蛋白的生物合成，进而使转入本发明基因的植物产生改良性状。
本发明的基因可以在序列1的基础上进行以下修饰，再导入宿主中，以达到更好的表达效果：
1)为了在转基因植物中表达本发明核苷酸序列，本发明核苷酸序列可根据实际需要进行修饰和优化。如可根据受体植物所偏爱的密码子，在保持本发明所述核苷酸序列编码的氨基酸的同时改变其密码子以符合植物偏爱性。而且，优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35％，优选为多于45％，更优选为多于50％，最优选多于约60％。
2)为了翻译的有效起始，可以修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列。例如，利用在植物中已知的有效的序列进行修饰。
3)将本发明基因与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达。所述启动子可包括组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子。启动子的选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种。例如组织或器官的特异性表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定。尽管证明了来源于双子叶植物的许多启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达。
优选的组成型启动子包括CaMV 35S和19S启动子。所述启动子还可为来源于在大多数细胞类型中表达的几种肌动蛋白基因中的启动子。另一个优选的组成型启动子为泛素启动子。上述启动子还可为在根、木髓、叶或花粉中引导表达的启动子，即组织特异性启动子。棉花核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶启动子(美国专利US 6,040,504)、水稻蔗糖合酶启动子(美国专利US 5,604,121)、夜香树黄化叶卷曲病毒启动子(WO 01/73087)。
化学诱导型启动子可为Rab29A启动子(美国专利US 5,614,395)。
4)将本发明基因与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率。例如来源于CaMV的tml，来源于rbcS的E9。任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明基因进行连接。
5)可向本发明基因中引入增强子序列，如内含子序列(例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列(例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
在实际操作中，也可以将本发明基因进行细胞靶向定位。可利用本领域现有的技术实现。例如，将来源于靶向细胞器的靶基因序列与本发明基因序列融合，再导入植物细胞中，就可定位了。
上述重组载体中的出发载体可根据所使用的转化技术及靶植物物种的特性进行选择。上述选择可体现在载体中的抗性标记的选择上。对于一些靶物种，可以优选不同的抗生素或除草剂选择性标记。通常用在转化中的选择性标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因，和提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。
在优选的实施方式中，将本发明的核苷酸序列直接转化到质体基因组中。质体转化的主要优点是质体通常不需要实质修饰就能表达细菌基因，并且质体能表达单启动子控制下的多个开放读框。通过同源重组将基因插入每个植物细胞中存在的所有几千个环形质体基因组拷贝中的质体表达利用了拷贝数大大高于核表达基因的优势，使得表达水平可以容易地超过总可溶植物蛋白质的10％。将本发明基因插入到质体靶向载体中，并且转化进入期望的植物宿主质体基因组中。获得了对于含有本发明核苷酸序列的质体基因组而言属同质的植物，该植物具有高水平地表达核苷酸序列的能力。
实验证明，本发明的蛋白及其编码基因具有提高植物含油量的功能，转入本发明基因的植物的种子含油量明显高于未转入本发明基因的植物，如转基因拟南芥，和百脉根，其种子中的油脂含量较对照组有显著提高。本发明的油脂相关调控蛋白及其编码基因对培育高含油植物品种，从而提高植物，特别是植物种子中油脂含量具有重要意义。因此，本发明蛋白及其编码基因在高含油植物的培育中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为大豆种子发育过程中取材标准。
图2为大豆种子发育过程不同阶段脂肪酸的积累情况；A：HN44；B：ZYD7。
图3为GmMYB73植物表达载体的示意图。
图4为GmMYB73异源表达转基因株系鉴定；1：转空载体植株；2：GmMYB73-1；3：GmMYB73-2；4：GmMYB73-3；5：GmMYB73-5；6：GmMYB73-10；7：GmMYB73-11；8：GmMYB73-13；9：GmMYB73-15；10：GmMYB73-17；11：GmMYB73-18。
图5为异源表达GmMYB73拟南芥种子脂肪酸测定；A：转基因株系和对照籽粒中各脂肪酸含量比较；B：转基因株系和对照籽粒中总油脂含量比较；16:0，棕榈酸；18:0，硬脂酸；18:1，油酸；18:2，亚油酸；18:3，亚麻酸；20:1，花生烯酸。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。所用引物均由三博生物公司合成；生物芯片由上海生物芯片公司操作分析。
大豆黑农44(HN44)：中国科学院遗传与发育生物学研究所；满为群等，大豆新品种黑农44的选育及不同种植方式对其产量和品种的影响，黑龙江农业科学2004年5期，1-5；2006年获自黑龙江农业科学院大豆研究所；由黑龙江农业科学院大豆研究所2002年经黑龙江省农作物品种审定委员会审定的大豆品种，第一育成人为杜维广研究员，专利号为：CNA20020216.2，审定号为：黑审豆2002003。
pPROKII载体(双元表达载体)：中国科学院遗传与发育生物学研究所；D.C.Baulcombe，G.R.Saunders，M.W.Bevan，M.A.Mayo and B.D.Harrison，Expression of biologically active viral satellite RNA from the nucleargenome of transformed plants.Nature 321(1986)，pp.446-449。
农杆菌GV3101：中国科学院遗传与发育生物学研究所；Lee CW等，Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogendefense in Arabidopsis thaliana，PlantCell，2009，21(9)，2948-62。
哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)：种子购自Arabidopsis Biological ResourceCenter(ABRC)。
实施例1、大豆与油脂代谢调控相关的转录因子GmMYB73编码基因的筛选及其cDNA克隆
一、大豆种子发育过程中脂肪酸积累代谢分析
以两个脂肪酸含量有差异的大豆品种或种质：黑农44(HN44)、ZYD7。其中，HN44籽粒中油脂含量为23％，而ZYD7籽粒的油脂含量为12％。如图1所示，两个品种种子发育过程的七个不同阶段分别取材保存。
用气相色谱测量HN44、ZYD7种子在各自7个发育阶段中的油脂含量，分析在种子发育过程中油脂积累曲线(图2)。如图2箭头所示分别取油脂含量增长曲线的两个拐点阶段：HN44中取HN44-5和HN44-6；ZYD7中取ZYD7-4和ZYD7-5。分别提取上述4个材料的总RNA，通过基因芯片比较其RNA的表达。基因芯片的结果通过GOEAST聚类分析，从中筛选出有差异的转录因子。其中在HN44中上调的转录因子有68个，下调的有59个；ZYD7中上调的有65个，下调的有68个。在两个品种的两个阶段中共同上调的基因有6个(包括GmMYB73)；共同下调的基因有16个。
二、GmMYB73基因的克隆
根据大豆基因组序列分析获得全长基因信息，根据全长基因序列设计一对特异引物如下：
GmMYB73-F：5’-ggatccATGGCTGACATAGATC-3’；
GmMYB73-R：5’-gggtACCGATCATTGGCTAGTCG-3’。
将黑农44发育至图1所示第6期籽粒，在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA。将RNA用逆转录酶合成cDNA。
以上述cDNA为模板进行PCR扩增，对PCR产物进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量约为0.2kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒(TIANGEN)回收该片段。将该回收片段与pGEM-T Easy(Promega)连接，参照Cohen等的方法，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，根据pGEM-T Easy载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定。测序结果表明，扩增到的基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，该基因由225个脱氧核糖核苷酸组成，其开放阅读框(ORF)为序列表中序列1的自5′末端第1至225位脱氧核糖核苷酸，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示(由74个氨基酸组成)。
将序列2所示的蛋白命名为GmMYB73，将GmMYB73的编码基因命名为GmMYB73，将含有序列1所示基因的pGEM-T Easy载体命名为pTE-GmMYB73。
实施例2、GmMYB73转基因拟南芥的获得
一、植物表达载体pPROKII-GmMYB73的构建
1、引物设计
根据GmMYB73的cDNA序列(DQ822927)设计引物，引物序列如下：
GmMYB73 up(带BamHI酶切位点的上游引物)：
5’-ggatccAATGGCTGACATAGATC-3’；
GmMYB73dp(带KpnI酶切位点的下游引物)：
5’-ggtACCGATCATTGGCTAGTCG-3’。
2、植物表达载体pPROKII-GmMYB73的构建
①将黑农44发育至图1所示第6期的籽粒(即开花后第37天)，在液氮中研碎，悬于4mol/L硫氢酸胍中，用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入无水乙醇沉淀总RNA。将RNA用逆转录酶合成cDNA。
②以cDNA为模板，用步骤1设计的引物进行PCR扩增，得到GmMYB73编码序列；
③将GmMYB73编码序列连接到TaKaRa公司的T载体pMD-18上，进行测序，测序结果表明得到正确的GmMYB73编码序列；
④用限制性内切酶BamHI、KpnI对GmMYB73编码序列进行双酶切，回收225bp左右的GmMYB73片段；用限制性内切酶BamHI、KpnI对双元表达载体pPROKII载体进行双酶切；将酶切得到的GmMYB73片段与酶切pPROKII载体得到的骨架载体连接，得到GmMYB73的植物表达载体，命名为pPROKII438-GmMYB73(序列1所示的GmMYB73插入了pPROKII载体的BamHI和KpnI酶切位点之间，GmMYB73位于CaMV 35S启动子下游；载体部分示意图见图3)。
二、重组农杆菌的制备
将pPROKII-GmMYB73用电击法导入农杆菌GV3101，挑取转化的GV3101单菌落，提质粒并通过BamhI、KpnI酶切和PCR鉴定验证转化成功的单菌落，得到重组农杆菌GV3101/pPROKII-GmMYB73。
将pPROKII转入农杆菌GV3101，得到对照农杆菌GV3101/pPROKII。
三、转基因植株的获得和鉴定
1、转基因植株的获得
重组农杆菌GV3101/pPROKII-GmMYB73(或对照农杆菌GV3101/pPROKII)通过花浸泡的方法(Clough-SJ，Bent-AF.Floral dip：a simplified method forAgrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.Plant-Journal.1998，16：6，735-743)转化哥伦比亚生态型拟南芥(col-0)。培育植株至结实，收获成熟种子(T0代)。将干燥一周后的种子播种于0.5×MS培养基(含50μg/ml卡那霉素)上，每皿500粒左右。23℃培养。只有含外源片段的转基因植株才能在培养基上生长。长出的植株生长到6片真叶时，移至种植盆中生长，待成熟后分单株收取种子(T1代)。
2、Northern鉴定
将步骤1收获的T1代种子播于MS筛选培养基(含50mg/L卡那霉素)上，筛选得到的T1代植株长至4-6叶时移到蛭石上生长，收获T1代单株；各单株种子分别播种，用相同的MS筛选培养基继续筛选以观察T2代的分离情况；如此重复数代直至每个单株的后代均可在筛选培养基中生长，即视为获得遗传稳定的转基因纯合株系，一般经4代筛选即可，共获得GmMYB73过量表达的转基因拟南芥阳性植株20余株。获得转空载体对照植株(CK)10余株。
提取转基因阳性植株(或转空载体对照植株)的RNA，反转录为cDNA，以Northern鉴定转基因植株。在有目的基因的转基因植株中检测到GmMYB73的表达，而转空载体的转基因植株中没有GmMYB73的表达(部分结果见图4)。筛选转基因阳性植株中目的基因表达较高的4株，GmMYB73-1、GmMYB73-2、GmMYB73-5和GmMYB73-17作进一步表型分析。
3、转基因植株的鉴定
将筛选出的4个转基因植株的各单株种子作为T0代分别播种，用卡那霉素继续筛选以观察T1代的分离情况(如此重复数代直至每个单株的后代均可在筛选培养基中生长，即视为获得遗传稳定的转基因纯合株系)，T3代获得遗传稳定的转基因株系。转空载体的转基因植株同样处理，获得稳定遗传的株系作为观察表型的对照。
将对照、4个转基因株系和哥伦比亚生态型拟南芥(每个株系100株，结果取平均值)的种子种于相同条件的蛭石中，对其籽粒的脂肪组分及含量进行分析。
脂肪酸的测定方法参照Pritam等(Pritam S.Sukhija and D.L.Palmquist(1988)Rapid Method for Determination of Total Fatty Acid Content andComposition of Feedstuffs and Feces J.Agric.Food Chem.，36：1202-1206)的方法进行：种子经充分研磨后，称重，加入盐酸甲醇溶液，再加入正己烷及内标液，80℃水浴2h，取出加入K2CO3溶液中和产生的酸，最后取上清液用气相色谱(AGILENT 6890 GC)法进行测定，以Sigma公司的脂肪酸甲酯作为标准对照。
测定结果如图5所示(白色柱为哥伦比亚生态型拟南芥，有填充色的柱为转基因植株GmMYB73-1，-2，-5和-17)。对照的各脂肪酸和总油脂含量与哥伦比亚生态型拟南芥相近。GmMYB73异源表达的拟南芥种子中各脂肪酸(图5A)和总油脂(图5B)含量较哥伦比亚生态型拟南芥显著提高，GmMYB73-1，-2，-5和-17株系总油脂含量分别较哥伦比亚生态型拟南芥提高8.26％，14.81％，24.6％和10.45％，说明GmMYB73是与植物的油脂代谢调控相关的基因，其过量表达提高了籽粒中油脂含量。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>植物油脂代谢相关调控蛋白GmMYB73及其编码基因和应用
<130>CGGNARY102024
<160>6
<210>1
<211>225
<212>DNA
<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)
<400>1
atggctgaca tagatcgctc ctttgataat aatgtttctg ctgtttctac tgagaaatca 60
agccaagttt cagatgttga attttctgaa gctgaggaaa tccttattgc catggtgtat 120
aatctggttg gggagaggtg gtctttgatt gctggaagaa ttcctggaag aactgcagaa 180
gagatagaga aatattggac ttcaagattt tcgactagcc aatga 225
<210>2
<211>74
<212>PRT
<213>大豆属大豆(Glycine max(L.)Merrill)
<400>2
Met Ala Asp Ile Asp Arg Ser Phe Asp Asn Asn Val Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Thr Glu Lys Ser Ser Gln Val Ser Asp Val Glu Phe Ser Glu Ala Glu
20 25 30
Glu Ile Leu Ile Ala Met Val Tyr Asn Leu Val Gly Glu Arg Trp Ser
35 40 45
Leu Ile Ala Gly Arg Ile Pro Gly Arg Thr Ala Glu Glu Ile Glu Lys
50 55 60
Tyr Trp Thr Ser Arg Phe Ser Thr Ser Gln
65 70
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ggatccatgg ctgacataga tc 22
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
gggtaccgat cattggctag tcg 23
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
ggatccaatg gctgacatag atc 23
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
ggtaccgatc attggctagt cg 22
Claims (10)
1.一种蛋白质，是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物油脂代谢相关的由序列2衍生的蛋白质；
(c)由与序列表中序列2所示的氨基酸序列至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性的氨基酸序列组成的且与植物油脂代谢相关的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子：
1)序列表中序列1所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码植物油脂代谢相关蛋白的DNA分子；
3)与1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码所述植物油脂代谢相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是将权利要求2或3所述基因插入pPROKII载体的多克隆位点得到的重组表达载体。
6.扩增权利要求2或3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
7.如权利要求6所述的引物对，其特征在于：所述引物对为如下1)或2)：
1)由序列表的序列3所示核苷酸和序列表的序列4所示核苷酸组成的引物对；
2)由序列表的序列5所示核苷酸和序列表的序列6所示核苷酸组成的引物对。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2或3所述基因导入目的植物中，得到总油脂含量和/或脂肪酸含量高于所述目的植物的转基因植物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求2或3所述基因通过权利要求5所述重组表达载体导入所述目的植物中。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：所述总油脂含量和/或脂肪酸含量为植物种子中的总油脂含量和/或脂肪酸含量；所述脂肪酸为如下脂肪酸中的至少一种：棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸和花生烯酸；所述目的植物为大豆、百脉根、苜蓿、水黄皮、油菜、向日葵、拟南芥或玉米。
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Granted publication date: 20130904 |