CN102070707B - 与种子脂肪酸合成相关的蛋白BnLEC1及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与种子脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与种子脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入植物中，可以提高油菜种子中的含油量。这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

Description

与种子脂肪酸合成相关的蛋白BnLEC1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及与种子脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物中的脂肪酸又被称为植物油，它广泛存在于植物的种子中。植物油用途广泛，运用生物技术改良植物体内脂肪酸的组分和含量具有重要的经济价值。其中，遗传工程技术所选用的操作基因必需是植物体内脂肪酸生物合成过程中的关键基因，但是目前人们对于植物脂肪酸生物合成的分子调控机制还不甚了解，因此，利用遗传工程技术提高油料作物含油量的工作目前进展缓慢。以双子叶模式植物拟南芥为例，植物的胚胎发生主要分为两个阶段：早期形态发生过程和晚期成熟过程。整个胚胎发育过程中伴随着淀粉、蛋白质和脂肪酸等贮藏物质的积累。在胚胎发育早期，主要是淀粉的大量积累，在组织和器官形成以后，淀粉被转化为蛋白质和脂肪酸。在发育的种子中，碳水化合物通过糖酵解途径被分解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被运输到质体后再转化成丙酮酸和乙酰CoA，乙酰CoA作为底物参与脂肪酸的合成(Ruuska，S.A.，Girke，T.，Benning，C.，andOhlrogge，J.B.(2002).Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsisseed filling.Plant Cell 14，1191-1206.)。

在种子发育过程中，质体内的脂肪酸合成酶复合物中的酶类负责脂肪酸的合成，所合成的脂肪酸被导入胞质酰基CoA库中以维持三酯酰甘油(TAG)积累。植物种子中的TAG的生物合成是在内质网中进行的。TAG的前体是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的过程共需要三种酰基转移酶和一种磷酸水解酶，分别是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)，二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase)(Ohlrogge等，1979，Proc Natl AcadSci，USA，76：1194-1198)。这三种酰基转移酶催化甘油骨架的逐步酰基化过程。近十余年来，科学家们对利用遗传工程技术提高植物体内，特别是种子中的脂肪酸含量进行了各种有益的探索。Shintani等在烟草中过量表达了ACCase的一个亚基-生物素羧化酶(BC亚基)，在烟草叶片中BC的表达水平提高了3倍，其它三个亚基的表达水平没有发生明显变化，但脂肪酸的含量和组成也没有明显改变(Shintani，D.，Roesler，K.，Shorrosh，B.，Savage，L.，and Ohlrogge，J.(1997).Antisenseexpression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves.Plant Physiol 114，881-886.)。另一项研究表明，增加丙酰CoA的含量能够提高脂肪酸的含量。Roeseler等利用种子特异性表达启动子在油菜中过量表达拟南芥中的HO-ACCase基因，结果使ACCase的活性明显提高，种子中的含油量提高3-5％(Roesler，K.，Shintani，D.，Savage，L.，Boddupalli，S.，and Ohlrogge，J.(1997).Targeting of the Arabidopsishomomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds.Plant Physiol 113，75-81.)。Roeseler等的研究结果表明，丙酰CoA水平能够提高脂肪酸的含量，但提高幅度较小。Dechesh等将菠菜的KASIII基因在烟草中过量表达，结果使KASIII的酶活性提高了100-300倍，但脂肪酸的含量却降低了5-10％(Dehesh等，2001，PlantPhysiol.，125：1103-1114)。上述研究结果表明，植物体内的脂肪酸代谢是一个复杂和高度协调的过程，通过对脂肪酸代谢途径中的个别或单个基因进行遗传操作并不能够有效地改变脂肪酸的含量。因此，Girke等人预言在脂肪酸的代谢过程中，很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因子(例如转录因子)在起调控作用(Girke，T.，Todd，J.，Ruuska，S.，White，J.，Benning，C.，and Ohlrogge，J.(2000).Microarrayanalysis of developing Arabidopsis seeds.Plant Physiol 124，1570-1581.)。

目前，已发现的参与植物脂肪酸代谢的转录因子有拟南芥的WRI1和LEC1等。其中，WRI1编码一个AP2/EREB转录因子蛋白，它可能是植物体内由蔗糖向TAG转化的一个关键的调节因子(Cernac，A.，and Benning，C.(2004).WRINKLED1encodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compoundbiosynthesis in Arabidopsis.Plant J 40，575-585.)。LEC1属于能结合启动子中顺式作用元件CCAAT盒的一类转录因子，调控胚胎的发生与种子成熟，同时可能对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控(Lotan，T.，Ohto，M.，Yee，K.M.，West，M.A.，Lo，R.，Kwong，R.W.，Yamagishi，K.，Fischer，R.L.，Goldberg，R.B.，and Harada，J.J.(1998).Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryodevelopment in vegetative cells.Cell 93，1195-1205.)。过量表达LEC1能大幅度增加转基因拟南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu，J.，Tan，H.，Zheng，Q.，Fu，F.，Liang，Y.，Zhang，J.，Yang，X.，Wang，T.，Chong，K.，Wang，X.J.，et al.(2008).LEAFYCOTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis.PlantPhysiol 148，1042-1054.)。

在拟南芥基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，至少有1500个，占整个基因组的5％以上(Riechmann等，2000，Science，290：2110-2113)。这些转录因子大多属于大的基因家族，有的基因家族又包括许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有的。对转录因子的研究结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节控制，从而有效改变植物的相关特性。CCAAT盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式作用元件，与CCAAT序列结合的转录因子又称为nuclear factor Y(NF-Y)或CCAAT binding factor(CBF)。NF-Y是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物，它特异性地识别DNA上的CCAAT序列，并与之结合，从而调节基因的表达。NF-Y的三种不同亚基分别属于3个亚族：NF-YA(又称为HAP2或CBF-B)，NF-YB(又称为HAP3或CBF-A)和NF-YC(又称为HAP5或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心结构域在序列上与组蛋白H2A和H2B有很高的同源性。NF-YB/NF-YC形成一个紧密结合的异源二聚体复合物，NF-YA再结合在这个复合物的表面，形成异源三聚体复合物。该三聚体复合物对DNA有很高的亲和力(Gusmaroli，G.，Tonelli，C.，and Mantovani，R.(2002).Regulation of novelmembers of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits.Gene283，41-48.；Romier，C.，Cocchiarella，F.，Mantovani，R.，and Moras，D.(2003).TheNF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation byCCAAT factor NF-Y.J Biol Chem 278，1336-1345)。

编码NF-Y亚基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母与动物体中，各种亚基都是由单基因编码的。而在植物的基因组中，NF-Y亚基是由多种不同基因编码的。在拟南芥中，Gusmaroli等人先后于2001年和2002年报道了三个NF-Y亚族中的共29个ESTs的序列(Gusmaroli，G.，Tonelli，C.，and Mantovani，R.(2001).Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana.Gene 264，173-185)，本发明的发明人于2004年完成了该家族32个基因cDNA的克隆，其中9个HAP2，11个HAP3，12个HAP5(Wei等，2004，Plant Physiol.，135：773-782)。NF-YB亚族的转录因子在基因内部都含有一个保守的B结构域，依据B结构域序列的差异，该家族被分为两类：LEAFY COTYLEDON1(LEC1)类型和非LEC1类型(Kwong，R.W.，Bui，A.Q.，Lee，H.，Kwong，L.W.，Fischer，R.L.，Goldberg，R.B.，and Harada，J.J.(2003).LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regulators essential for embryo development.Plant Cell 15，5-18)。LEC1类型包括两个基因：LEC1和LEAFY COTYLEDON1-like(L1L)。这两个基因都是特异性地在胚胎和种子发育过程中表达。LEC1类型的转录因子的B结构域含有16个保守的氨基酸残基，这16个氨基酸残基在非LEC1类型的转录因子中是不存在的。B结构域是决定LEC1类转录因子在功能上区别于其它非LEC1类转录因子的关键因素(Hyeseung等，2003，Proc Natl Acad Sci，USA，100：2152-2156)。LEC1是HAP3家族中功能研究的较为清楚的一个蛋白。LEC1是拟南芥胚胎发生过程中一个关键的调控因子。LEC1参与了种子成熟的多个过程，包括种子的干燥和养分的积累。目前，在玉米、向日葵和胡萝卜中，均发现了LEC1基因的同源基因(Zhang，S.，Wong，L.，Meng，L.，and Lemaux，P.G.(2002).Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zeamays L.).Planta 215，191-194.；Yazawa，K.，Takahata，K.，and Kamada，H.(2004).Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledon1 and expression analysisduring somatic and zygotic embryogenesis.Plant Physiol Biochem 42，215-223.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与种子脂肪酸合成相关的蛋白。

本发明提供与种子脂肪酸合成相关的蛋白，是调控种子脂肪酸代谢的转录因子，来源于十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)名称为LEAFYCOTYLEDON1(简称BnLEC1)，该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与种子脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由231个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第59-126位氨基酸残基为NF-YB结构域。

所述取代和/或缺失和/或添加的一至几个氨基酸残基是1-10个氨基酸残基，可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

为了使1)中的BnLEC1便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	1O	EQKLISEEDL

上述2)中的BnLEC1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的BnLEC1的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第20-715位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与种子脂肪酸合成相关蛋白的cDNA基因(命名为BnLEC1)也属于本发明的保护范围。

与种子脂肪酸合成相关蛋白的cDNA基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第20-715位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

3)在严格条件下与与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列2由724个碱基组成，其开放阅读框架(open reading frame，简称ORF)为自5′末端第20-715位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的BnLEC1蛋白；序列2的自5′端第194-397位碱基编码NF-YB结构域。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

上述3)或4)的基因具体可指序列表中序列3所示的基因，序列3所示的基因是上述cDNA的基因组DNA，序列表中的SEQ ID NO：3基因组DNA序列由1898个碱基组成，包括19个碱基的5′UTR区，3′UTR区为1889到1898位碱基。自5′端第20-72位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第73-1246位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第1247-1889位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1889-1898位碱基为该基因组基因的3′非编码区。

所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因既可为BnLEC1的cDNA序列，也可为BnLEC1的基因组基因序列；与BnLEC1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列，是将BnLEC1的cDNA用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变异的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因BnLEC1或其同源序列可以正义方向或反义方向导入植物组织、细胞或器官。

扩增上述BnLEC1基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与种子脂肪酸合成相关的蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有BnLEC1基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

使用BnLEC1或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻Actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：X87764)；所述诱导型启动子可为受ABA、乙烯或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或潮霉素标记物等或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素或其替代衍生物如G 418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

上述重组载体是按照下述的方法制备得到的重组表达载体：

将序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示的启动子与任一所述基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育种子含油量高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育种子含油量高的转基因植物的方法，是将上述与种子脂肪酸合成相关的蛋白的编码基因BnLEC1导入植物中，得到转基因植物，所述转基因植物种子的含油量高于所述目的植物种子的含油量。

所述与种子脂肪酸合成相关的蛋白的编码基因BnLEC1是通过上述重组表达载体导入目的植物中的。

携带有本发明编码调控植物种子脂肪酸代谢转录因子BnLEC1的基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因BnLEC1或BnLEC1具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。转基因植株脂肪酸含量和组分的改变包括植物体内各组织和器官内各种脂肪酸含量包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的改善和提高，及各种脂肪酸组分的提高或降低。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

实验证明：本发明保护的基因BnLEC1适量表达后可以提高油菜种子中的含油量。本发明的发明人构建了在种子特异并适度表达的启动子，用于驱动转基因油菜BnLEC1基因表达。转基因实验表明能显著提高油料作物油菜种子中的油含量，为转基因方法提高油料作物的脂肪酸含量提供一条行之有效的途径。这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1为BnLEC1蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，59-126为保守的NF-YB结构域。

图2为napin A启动子缺失片段与GUS基因融合表达载体简图，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；数字表示napin A启动子以及相应突变体(D系列突变体)的长度与突变的相对位置，GUS编码区未按长度比列绘制。

图3为napin A启动子缺失片段驱动GUS表达酶活分析，D0、D4、D6和D7为napin A启动子的缺失片段驱动GUS的转基因拟南芥果荚中GUS酶活，每个缺失片段启动子测定5个独立家系，以典型家系表示该缺失片段启动子驱动能力，数据为三次独立测定的平均值。

图4为D7启动子驱动BnLEC1表达载体，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；D7表示napin A启动子突变体的长度，启动子按照长度比例绘制，BnLEC1基因未按长度比列绘制。

图5为D7::BnLEC1转基因油菜种子中油含量，Westar为非转基因野生型油菜对照；D7::BnLEC1#2、D7::BnLEC1#3、D7::BnLEC1#4、D7::BnLEC1#5为以Westar为背景的转基因油菜株系。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

中油821、Westar油菜均由西南大学李加纳老师在2007年7月赠送，其原始来源不清楚。拟南芥(Col-0)种子由2001年5月ABRC(http://www.arabidopsis.org)赠送，其原始来源不清楚。

实施例1、种子含油量高的转基因油菜的获得

一、启动子的获得及其检测

1、启动子的获得

根据napin A启动子的核苷酸序列(GenBank号：J02798.1)，按照图2设计napin A启动子缺失片段引物(F为前端引物，R为反向引物)，用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的种子胚胎特异表达的启动子，引物序列如下：(划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基))

D0 F：5′-CGAAAGCTTTCTTCATCGGTGATTGATTC-3′；

D7 F：5′-CGAAAGCTTCCATGCCAGAACATTAGCTACACG-3′；

D6 F：5′-CGAAAGCTTAAGAATCGTTCATAAGATGCCATGC-3′；

D4 F：5′-CGAAAGCTTTTTTAATTTTATGAAGTTAAGTTT-3′；

napinA R：5′-TTAGTCGACTCGTGTATGTTTTTAATCTTG-3′。

用CTAB法提取油菜中油821(谢柱存.中油821的特性与栽培[J].广西农业科学，1991，(05)：213)基因组DNA，在napin A前端引物(D0 F、D4 F、D6 F和D7 F)和后端引物napinA R的分别引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回目的片段并对其进行纯化，得到D0、D4、D6和D7扩增片段。将回收纯化的D0、D4、D6和D7片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中。然后将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提取质粒，得到含有回收片段的重组质粒，分别命名为pGEM-D0、pGEM-D4、pGEM-D6和pGEM-D7。对上述重组质粒进行DNA测序分析，测序结果表明扩增得到的4个片段与napin A启动子(GenBank号：J02798.1)序列相对应部分相同。各个启动子序列分别如下：

D0的序列如序列表中序列4所示；D4的序列如序列表中序列4的自5’端第832-1145位所示；D6的序列如序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示；D7的序列如序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示。

2、启动子的检测

1)napin A启动子缺失片段(D系列启动子)与GUS编码区的融合表达载体构建

分别挑选pGEM-D0、pGEM-D4、pGEM-D6和pGEM-D7序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，用购于NEB公司的HindIII/Sal I双酶切得到相应启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D0、D4、D6和D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过同样酶切的pBI121(购自Clontech)载体连接，形成pBI121-D0::GUS、pBI121-D4::GUS、pBI121-D6::GUS和pBI121-D7::GUS的GUS表达载体。热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。载体的构建简图，见图2。

2)转基因拟南芥中启动子驱动GUS蛋白表达的检测

A、转基因拟南芥的获得

将步骤1)得到的pBI121-D0::GUS、pBI121-D4::GUS、pBI121-D6::GUS和pBI121-D7::GUS四种表达载体分别用电激转化方法转入不同的农杆菌GV3101菌株中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀。转化液转入250ml烧杯中，将已去掉花和果荚的拟南芥Col-0野生型(Feng，H.，An，F.，Zhang，S.，Ji，Z.，Ling，H.Q.，and Zuo，J.(2006).Light-regulated，tissue-specific，and cell differentiation-specific expression of theArabidopsis Fe(III)-chelate reductase gene AtFRO6.Plant Physiol 140，1345-1354.)倒置于烧杯中，真空抽20秒为宜。为提高转化效率，一周后可再重复转化一次。将转化后的拟南芥培养得到种子，将得到的拟南芥种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥。

B、GUS酶活性的检测

取步骤A中的转基因拟南芥T3代的相同标记时间的同期拟南芥果荚100mg，用液氮研磨成干粉，加500μl提取液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0；10mmol/L巯基乙醇；1mmol/L EDTA，pH8.0；0.1％月桂酸肌氨酸钠；0.1％ Triton X-100)，13,000rpm离心10分钟，上清液用于GUS活性及蛋白浓度测定。取5μl酶提取液加入到45μl检测液中(酶提取液中加入2mmol/L 4-甲基伞型酮酰-

-葡萄糖醛酸苷[4-Methyl umbelliferyl β-D glucuronide，MUG])，立即混匀，快速取5μl反应混合液，加入到195μl反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃)中，混匀，即酶活性测定0点；反应混合液于37℃保温，一小时后取5μl反应混合液加入到195μl反应终止液中终止反应；用Tecan GENios荧光分光光度计(激发光波长为365nm，发射光为455nm)测定每个样品的荧光强度，计算反应生成的4-甲基伞型酮(4-methylumbelliferone，MU)的量；按照Bradford方法，用Tecan GENios测定样品中蛋白含量；计算样品中GUS活性，GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位：pmol MU·mg^-1·min^-1)，结果如图3所示，结果表明随着启动子长度的缩短，启动子的驱动能力降低。

二、种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测

1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因BnLEC1的克隆

根据拟南芥L1L的核苷酸序列(GenBank号：AB025628)设计引物P3和P4，用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的调控种子脂肪酸代谢的转录因子BnLEC1基因基因组DNA序列，引物序列如下：

P3(BnLEC1上游引物)：5′-TTAGTCGACCGAGGACGGCAGAGAAACAAT-3′

P4(BnLEC1下游引物)：5′-CGAGGATCCTTTACTAGTTCACTTATACTG-3′

用CTAB法提取油菜基因组DNA，在引物P3和P4的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约为1.8Kb的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-Tcasy(Promega公司)中。将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM-BnLEC1。对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO.3的核苷酸序列，包括19个碱基的5′UTR区，放阅读框架为5′端第20到第1889位碱基，3′UTR区为1889到1898位碱基。自5′端第20-72位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第73-1246位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第1247-1889位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1889-1898位碱基为该基因组基因的3′非编码区。将该基因命名为BnLEC1，将其编码蛋白命名为BnLEC1，该基因蛋白一级结构中所含保守的NF-YB结构域简图，见图1。BnLEC1的cDNA的序列如序列表中序列2所示，序列2由724个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第20-715位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的BnLEC1蛋白；序列2的自5′端第194-397位碱基编码NF-YB结构域。

2、用D7启动子驱动BnLEC1表达的转基因载体的构建

挑选步骤二的步骤1中pGEM-BnLEC1序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，用从NEB公司购得的Sal I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收BnLEC1基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pCAMBIA-2300(简称pC2300)(CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html))连接，形成pC2300::BnLEC1的中间载体。

然后分别把步骤一中步骤2得到pGEM-D7正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，经HindIII/Sal I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pC2300::BnLEC1中间载体连接，分别形成pC2300-D7::BnLEC1的最终载体。

热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。表达载体的构建图，见图4。

3、转基因油菜的获得

1)转化农杆菌

将步骤2得到的表达载体pC2300-D7::BnLEC1)用电激转化方法转入农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。然后，所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀，得到含有pC2300-D7::BnLEC1的转化液。

2)转化油菜

转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜

把含有pC2300-D7::BnLEC1的转化液转入塑料袋中，将已经去掉果荚和花的Westar油菜花序(该油菜是Westar，Chandler，S.F.，and Thorpe，T.A.(1987).Characterization of Growth，Water Relations，and Proline Accumulation in SodiumSulfate Tolerant Callus of Brassica napus L.cv Westar(Canola).Plant Physiol 84，106-111.)浸泡在转化液中，浸泡1分钟为宜，浸泡期间不停晃动浸染液。为提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的油菜培养，得油菜种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗，至此获得转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜。

4、转基因油菜的检测

以非转基因油菜Westar为野生型对照。

将转基因油菜苗培养，得到T1代种子，对T1代种子(转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜和野生型对照)进行含油量的测定与计算，其中含油量＝种子油脂(质量)/种子干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECTOR22/N型傅立叶变换近红外光谱仪测定，运用OPUS 5.5软件进行分析得到的。光谱采集条件：分辨率8cm^-1，扫描次数32次，谱区范围12000-4000cm^-1，室温23-25℃。测定结果如图5所示，D7启动子驱动BnLEC1过表达，转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜种子含油量高于Westar野生型对照种子含油量，说明D7启动子驱动BnLEC1过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>与种子脂肪酸合成相关的蛋白BnLEC1及其编码基因与应用

<160>4

<210>1

<211>231

<212>PRT

<213>甘蓝油菜(Brassica napus L.)

<400>1

Met Glu Arg Gly Ala Pro Leu Ser His Tyr Gln Leu Pro Lys Ser Asn

1               5                   10                  15

Ser Gly Leu Asn Leu Asp Gln His Asn Asn Ser Ile Pro Thr Met Thr

            20                  25                  30

Gly Ser Ile Gly Ala Cys Asp Asp Lys Asn Lys Thr Ile Leu Pro Gln

        35                  40                  45

Gln Gln Pro Ser Met Pro Arg Glu Gln Asp Gln Tyr Met Pro Ile Ala

    50                  55                  60

Asn Val Ile Arg Ile Met Arg Lys Ile Leu Pro Pro His Ala Lys Ile

65                  70                  75                  80

Ser Asp Asp Ala Lys Glu Thr Ile Gln Glu Cys Val Ser Glu Tyr Ile

                85                  90                  95

Ser Phe Val Thr Gly Glu Ala Asn Glu Arg Cys Gln Arg Glu Gln Arg

            100                 105                 110

Lys Thr Ile Thr Ala Glu Asp Ile Leu Trp Ala Met Ser Lys Leu Gly

        115                 120                 125

Phe Asp Asp Tyr Val Gly Pro Leu Asn Val Phe Ile Asn Arg Tyr Arg

    130                 135                 140

Glu Phe Glu Thr Asp Arg Gly Cys Ser Leu Arg Gly Glu Ser Ser Phe

145                 150                 155                 160

Lys Pro Val Tyr Gly Gly Ser Gly Met Gly Phe His Gly Pro Pro Pro

                165                 170                 175

Pro Gly Ser Tyr Gly Tyr Gly Met Leu Asp Gln Ser Met Val Met Gly

            180                 185                 190

Gly Gly Arg Tyr Tyr His Asn Gly Ser Gly Pro Asp Gly Ser Val Gly

        195                 200                 205

Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Ser Met Asn Gly Met Pro Val Asn Tyr

    210                 215                 220

Asp Gln Tyr Gly Gln Tyr Lys

225                 230

<210>2

<211>724

<212>DNA

<213>甘蓝油菜(Brassica napus L.)

<400>2

cgaggacggc agagaaacaa tggaacgtgg agctcctctc tctcactatc agctacccaa    60

atctaactct ggactgaact tggaccagca caacaactca atcccgacaa tgaccggctc    120

catcggtgca tgcgacgaca agaacaagac tatcttgccg cagcaacaac caagcatgcc    180

tcgtgagcaa gaccaataca tgccaatcgc aaacgtgata aggatcatgc gtaaaatctt    240

accgccacac gccaaaatct ctgacgacgc aaaagaaacg attcaagaat gcgtctccga    300

gtacatcagc ttcgtgaccg gtgaagctaa cgagcgttgc caacgtgagc aacgtaagac    360

aataactgct gaagatatcc tttgggcaat gagcaaactt gggttcgatg attacgttgg    420

accactcaac gtgttcatta accggtaccg tgagttcgag accgatcgtg ggtgttcact    480

tagaggtgag tcatcattta aaccggtcta tggaggaagt ggtatggggt ttcacggccc    540

acctccaccg ggttcttatg gttatggtat gttggatcag tctatggtca tgggtggtgg    600

tcggtactac cataacggat cgggtccgga tggatcagta ggtggtggcg gtggatcttc    660

ctcttctatg aatggaatgc cggttaatta tgaccagtat ggtcagtata agtgaactag    720

taaa                                                                 724

<210>3

<211>1898

<212>DNA

<213>甘蓝油菜(Brassica napus L.)

<400>3

cgaggacggc agagaaacaa tggaacgtgg agctcctctc tctcactatc agctacccaa     60

atctaactct ggtaatcaaa taataagtgc ctatttatgt atatacgtgc ctgcactatg     120

tatactcacg aatcataaac ttgttttgag attttttgta tatcaacaaa gaactagaga     180

ctttcatgtc ttcttaaaac agtagagatt tttatttctt agattttttt aaaggtacgg     240

agaagagtct actcacatgc aagacgctta tatatatatg catgcatgaa tgagtttgat     300

atatctatat atttatttgc atattcgtgt atacatccaa gcaggaacca atccttaatt     360

caaatatttc gtgatatggt atataagaac aatttttaat gggggatgat agatcttcat     420

atgtttgtcc attgacaata ccggtgcatg cacaagaaat attgagtttc gatttctttt     480

tctatctttt agatttatat tctggctttt taaaaatata gaggtgggaa ttgtatgtgt     540

tggtttagtt taaaggccga ctcaaaatct aaaaaaactt aatttatttt caattggaaa     600

tattaaatta ctcttatgat attttcttta ttagtttatt cgctttactg taacggttgt     660

tttttttttc gtttcaaaac gaaattctcg tttgtccaac ctgatttgga aatatccaat     720

gaatctaaat acacttttta gccaaatata atataaatac tattgtaaac tcctctattt     780

aaagccaaaa aagtaatata aatatattgt aattctagtt cacaggggat gaaatcgttt     840

cacctaatcc aaatcgtttt attaattagt aaaagaattg gttaaccaat aaccaacttt     900

aattcttttt aagtaataaa acaaattttg aattaagcaa gctagaaatt tgacaaagaa     960

aattgggaat acgcgctgta cttgtaaaat catcaaattt caagtatttc gagaagtgga     1020

aagatccttt tgactttttc gttctatgaa tgtaaacgta acgtcaagaa tctgaacagt     1080

ctacataatg gaaccgggac ctgtaaactt atcttttatc ttattggtta ggacttaact     1140

aagcacgtgt cttcacttga tagtcctcgt tttcaactat taaatccgct  ttctaaaaat    1200

gtaatttcat ttagtattcc aaacaacttc aatttatgta aacaggactg aacttggacc  1260

agcacaacaa ctcaatcccg acaatgaccg gctccatcgg tgcatgcgac gacaagaaca  1320

agactatctt gccgcagcaa caaccaagca tgcctcgtga gcaagaccaa tacatgccaa  1380

tcgcaaacgt gataaggatc atgcgtaaaa tcttaccgcc acacgccaaa atctctgacg  1440

acgcaaaaga aacgattcaa gaatgcgtct ccgagtacat cagcttcgtg accggtgaag  1500

ctaacgagcg ttgccaacgt gagcaacgta agacaataac tgctgaagat atcctttggg  1560

caatgagcaa acttgggttc gatgattacg ttggaccact caacgtgttc attaaccggt  1620

accgtgagtt cgagaccgat cgtgggtgtt cacttagagg tgagtcatca tttaaaccgg  1680

tctatggagg aagtggtatg gggtttcacg gcccacctcc accgggttct tatggttatg  1740

gtatgttgga tcagtctatg gtcatgggtg gtggtcggta ctaccataac ggatcgggtc  1800

cggatggatc agtaggtggt ggcggtggat cttcctcttc tatgaatgga atgccggtta  1860

attatgacca gtatggtcag tataagtgaa ctagtaaa                          1898

<210>4

<211>1145

<212>DNA

<213>甘蓝油菜(Brassica napus)

<400>4

aagctttctt catcggtgat tgattccttt aaagacttat gtttcttatc ttgcttctga    60

ggcaagtatt cagttaccag ttaccactta tattctggac tttctgactg catcctcatt    120

tttccaacat tttaaatttc actattggct gaatgcttct tctttgagga agaaacaatt    180

cagatggcag aaatgtatca accaatgcat atatacaaat gtacctcttg ttctcaaaac    240

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gacctaccca ttcttgagac aaatgttaca ttttagtatc agagtaaaat gtgtacctat    540

aactcaaatt cgattgacat gtatccattc aacataaaat taaaccagcc tgcacctgca    600

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ttccgaattt ggaagatttt gactcaaatt cccaatttat attgaccgtg actaaatcaa    720

ctttaacttc tataattctg attaagctcc caatttatat tcccaacggc actacctcca    780

aaatttatag actctcatcc ccttttaaac caacttagta aacgtttttt tttttaattt    840

tatgaagtta agtttttacc ttgtttttaa aaagaatcgt tcataagatg ccatgccaga    900

acattagcta cacgttacac atagcatgca gccgcggaga attgtttttc ttcgccactt    960

gtcactccct tcaaacacct aagagcttct ctctcacagc acacacatac aatcacatgc    1020

gtgcatgcat tattacacgt gatcgccatg caaatctcct ttatagccta taaattaact    1080

catccgcttc actctttact caaaccaaaa ctcatcaata caaacaagat taaaaacata    1140

cacga                                                                1145

Claims (3)

1.一种培育种子含油量高的转基因植物的方法，是将由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物种子的含油量高于所述目的植物种子的含油量；

所述编码基因通过如下重组表达载体导入所述目的植物中：将序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示的启动子与所述编码基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到重组表达载体；

所述目的植物为油菜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码基因是如下1)或2)所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第20-715位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2。

3.含有由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体是按照下述的方法制备得到的重组表达载体：将序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示的启动子与所述编码基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到重组表达载体。

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