CN102070706B - 与种子脂肪酸合成相关的蛋白AtL1L及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种与种子脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用。该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与种子脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。将该蛋白的编码基因导入植物中，可以提高油菜种子中的含油量。这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

Description

与种子脂肪酸合成相关的蛋白AtL1L及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及与种子脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

植物中的脂肪酸又被称为植物油，它广泛存在于植物的种子中。植物油用途广泛，运用生物技术改良植物体内脂肪酸的组分和含量具有重要的经济价值。其中，遗传工程技术所选用的操作基因必需是植物体内脂肪酸生物合成过程中的关键基因，但是目前人们对于植物脂肪酸生物合成的分子调控机制还不甚了解，因此，利用遗传工程技术提高油料作物含油量的工作目前进展缓慢。以双子叶模式植物拟南芥为例，植物的胚胎发生主要分为两个阶段：早期形态发生过程和晚期成熟过程。整个胚胎发育过程中伴随着淀粉、蛋白质和脂肪酸等贮藏物质的积累。在胚胎发育早期，主要是淀粉的大量积累，在组织和器官形成以后，淀粉被转化为蛋白质和脂肪酸。在发育的种子中，碳水化合物通过糖酵解途径被分解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被运输到质体后再转化成丙酮酸和乙酰CoA，乙酰CoA作为底物参与脂肪酸的合成(Ruuska，S.A.，Girke，T.，Benning，C.，andOhlrogge，J.B.(2002).Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsisseed filling.Plant Cell 14，1191-1206.)。

在种子发育过程中，质体内的脂肪酸合成酶复合物中的酶类负责脂肪酸的合成，所合成的脂肪酸被导入胞质酰基CoA库中以维持三酯酰甘油(TAG)积累。植物种子中的TAG的生物合成是在内质网中进行的。TAG的前体是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的过程共需要三种酰基转移酶和一种磷酸水解酶，分别是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)，二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase)(Ohlrogge等，1979，Proc Natl AcadSci，USA，76：1194-1198)。这三种酰基转移酶催化甘油骨架的逐步酰基化过程。近十余年来，科学家们对利用遗传工程技术提高植物体内，特别是种子中的脂肪酸含量进行了各种有益的探索。Shintani等在烟草中过量表达了ACCase的一个亚基-生物素羧化酶(BC亚基)，在烟草叶片中BC的表达水平提高了3倍，其它三个亚基的表达水平没有发生明显变化，但脂肪酸的含量和组成也没有明显改变(Shintani，D.，Roesler，K.，Shorrosh，B.，Savage，L.，and Ohlrogge，J.(1997).Antisenseexpression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves.Plant Physiol 114，881-886.)。另一项研究表明，增加丙酰CoA的含量能够提高脂肪酸的含量。Roeseler等利用种子特异性表达启动子在油菜中过量表达拟南芥中的HO-ACCase基因，结果使ACCase的活性明显提高，种子中的含油量提高3-5％(Roesler，K.，Shintani，D.，Savage，L.，Boddupalli，S.，and Ohlrogge，J.(1997).Targeting of the Arabidopsishomomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds.Plant Physiol 113，75-81.)。Roeseler等的研究结果表明，丙酰CoA水平能够提高脂肪酸的含量，但提高幅度较小。Dechesh等将菠菜的KASIII基因在烟草中过量表达，结果使KASIII的酶活性提高了100-300倍，但脂肪酸的含量却降低了5-10％(Dehesh等，2001，PlantPhysiol.，125：1103-1114)。上述研究结果表明，植物体内的脂肪酸代谢是一个复杂和高度协调的过程，通过对脂肪酸代谢途径中的个别或单个基因进行遗传操作并不能够有效地改变脂肪酸的含量。因此，Girke等人预言在脂肪酸的代谢过程中，很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因子(例如转录因子)在起调控作用(Girke，T.，Todd，J.，Ruuska，S.，White，J.，Benning，C.，and Ohlrogge，J.(2000).Microarrayanalysis of developing Arabidopsis seeds.Plant Physiol 124，1570-1581.)。

目前，已发现的参与植物脂肪酸代谢的转录因子有拟南芥的WRI1和LEC1等。其中，WRI1编码一个AP2/EREB转录因子蛋白，它可能是植物体内由蔗糖向TAG转化的一个关键的调节因子(Cernac，A.，and Benning，C.(2004).WRINKLED1encodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compoundbiosynthesis in Arabidopsis.Plant J 40，575-585.)。LEC1属于能结合启动子中顺式作用元件CCAAT盒的一类转录因子，调控胚胎的发生与种子成熟，同时可能对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控(Lotan，T.，Ohto，M.，Yee，K.M.，West，M.A.，Lo，R.，Kwong，R.W.，Yamagishi，K.，Fischer，R.L.，Goldberg，R.B.，and Harada，J.J.(1998).Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryodevelopment in vegetative cells.Cell 93，1195-1205.)。过量表达LEC1能大幅度增加转基因拟南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu，J.，Tan，H.，Zheng，Q.，Fu，F.，Liang，Y.，Zhang，J.，Yang，X.，Wang，T.，Chong，K.，Wang，X.J.，et al.(2008).LEAFYCOTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis.PlantPhysiol 148，1042-1054.)。

在拟南芥基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，至少有1500个，占整个基因组的5％以上(Riechmann等，2000，Science，290：2110-2113)。这些转录因子大多属于大的基因家族，有的基因家族又包括许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有的。对转录因子的研究结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节控制，从而有效改变植物的相关特性。CCAAT盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式作用元件，与CCAAT序列结合的转录因子又称为nuclear factor Y(NF-Y)或CCAAT binding factor(CBF)。NF-Y是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物，它特异性地识别DNA上的CCAAT序列，并与之结合，从而调节基因的表达。NF-Y的三种不同亚基分别属于3个亚族：NF-YA(又称为HAP2或CBF-B)，NF-YB(又称为HAP3或CBF-A)和NF-YC(又称为HAP5或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心结构域在序列上与组蛋白H2A和H2B有很高的同源性。NF-YB/NF-YC形成一个紧密结合的异源二聚体复合物，NF-YA再结合在这个复合物的表面，形成异源三聚体复合物。该三聚体复合物对DNA有很高的亲和力(Gusmaroli，G.，Tonelli，C.，and Mantovani，R.(2002).Regulation of novelmembers of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits.Gene283，41-48.；Romier，C.，Cocchiarella，F.，Mantovani，R.，and Moras，D.(2003).TheNF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation byCCAAT factor NF-Y.J Biol Chem 278，1336-1345)。

编码NF-Y亚基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母与动物体中，各种亚基都是由单基因编码的。而在植物的基因组中，NF-Y亚基是由多种不同基因编码的。在拟南芥中，Gusmaroli等人先后于2001年和2002年报道了三个NF-Y亚族中的共29个ESTs的序列(Gusmaroli，G.，Tonelli，C.，and Mantovani，R.(2001).Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana.Gene 264，173-185)，本发明的发明人于2004年完成了该家族32个基因cDNA的克隆，其中9个HAP2，11个HAP3，12个HAP5(Wei等，2004，Plant Physiol.，135：773-782)。NF-YB亚族的转录因子在基因内部都含有一个保守的B结构域，依据B结构域序列的差异，该家族被分为两类：LEAFY COTYLEDON1(LEC1)类型和非LEC1类型(Kwong，R.W.，Bui，A.Q.，Lee，H.，Kwong，L.W.，Fischer，R.L.，Goldberg，R.B.，and Harada，J.J.(2003).LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regulators essential for embryo development.Plant Cell 15，5-18)。LEC1类型包括两个基因：LEC1和LEAFY COTYLEDON1-like(L1L)。这两个基因都是特异性地在胚胎和种子发育过程中表达。LEC1类型的转录因子的B结构域含有16个保守的氨基酸残基，这16个氨基酸残基在非LEC1类型的转录因子中是不存在的。B结构域是决定LEC1类转录因子在功能上区别于其它非LEC1类转录因子的关键因素(Hyeseung等，2003，Proc Natl Acad Sci，USA，100：2152-2156)。LEC1是HAP3家族中功能研究的较为清楚的一个蛋白。LEC1是拟南芥胚胎发生过程中一个关键的调控因子。LEC1参与了种子成熟的多个过程，包括种子的干燥和养分的积累。目前，在玉米、向日葵和胡萝卜中，均发现了LEC1基因的同源基因(Zhang，S.，Wong，L.，Meng，L.，and Lemaux，P.G.(2002).Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zeamays L.).Planta 215，191-194.；Yazawa，K.，Takahata，K.，and Kamada，H.(2004).Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledonl and expression analysisduring somatic and zygotic embryogenesis.Plant Physiol Biochem 42，215-223.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与种子脂肪酸合成相关的蛋白。

本发明提供与种子脂肪酸合成相关的蛋白，是调控种子脂肪酸代谢的转录因子，来源于拟南芥属拟南芥(Arabidopsis thaliana)，名称为LEAFY COTYLEDON1-LIKE(简称AtL1L)，该蛋白是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与种子脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由234个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第61-126位氨基酸残基为NF-YB结构域。

所述取代和/或缺失和/或添加的一至几个氨基酸残基是1-10个氨基酸残基，可以是非结构域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。

为了使1)中的AtL1L便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-mvc	10	EQKLISEEDL

上述2)中的AtL1L可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述2)中的AtL1L的编码基因可通过将序列表中序列2自5′末端第39-743位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述与种子脂肪酸合成相关蛋白的编码基因(命名为AtL1L)也属于本发明的保护范围。

与种子脂肪酸合成相关蛋白的编码基因具体可为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第39-743位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2；

3)在严格条件下与1)或2)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

序列表中的序列2由937个碱基组成，其开放阅读框架(open reading frame，简称ORF)为自5′末端第39-743位碱基，编码具有序列表中序列1的氨基酸序列的AtL1L蛋白；序列2的自5′端第219-416位碱基编码NF-YB结构域。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

上述3)或4)的基因具体可指序列表中序列3所示的基因，序列3所示的基因是上述cDNA的基因组DNA，序列表中的SEQ ID NO：3基因组DNA序列由1147个碱基组成，包括38个碱基的5′UTR区，3′UTR区为954到1147位碱基。自5′端第39-105位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第106-315位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第316-953位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第954-1147位碱基为该基因组基因的3′非编码区。

所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因既可为AtL1L的cDNA序列，也可为AtL1L的基因组基因序列；与AtL1L具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列，是将AtL1L的cDNA用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变异的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

所述编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因AtL1L或其同源序列可以正义方向或反义方向导入植物组织、细胞或器官。

扩增上述AtL1L基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

含有上述与种子脂肪酸合成相关的蛋白编码基因的重组载体、转基因细胞系和重组菌也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有AtL1L基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA2300、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。

使用AtL1L或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子；所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子，玉米Ubiquitin启动子或水稻Actin1启动子等；所述组织特异性表达启动子可为种子特异性表达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号：X87764)；所述诱导型启动子可为受ABA、乙烯或化学等诱导的启动子；上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或潮霉素标记物等或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素或其替代衍生物如G418等进行筛选，含潮霉素磷酸转移酶基因的宿主植物细胞、组织或器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

上述重组载体是按照下述1)或2)的方法制备得到的重组表达载体：

1)将序列表中序列4的自5’端第832-1145位所示的启动子与任一上述基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到重组表达载体。

2)将序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示的启动子与任一上述基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到重组表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培育种子含油量高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育种子含油量高的转基因植物的方法，是将上述与种子脂肪酸合成相关的蛋白的编码基因AtL1L导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物种子的含油量高于所述目的植物种子的含油量。

所述与种子脂肪酸合成相关的蛋白的编码基因AtL1L是通过上述重组表达载体导入植物中的。

携带有本发明编码调控植物种子脂肪酸代谢转录因子AtL1L的基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca²⁺、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

此外，通过将转化有本发明编码调控植物脂肪酸代谢转录因子的基因AtL1L或AtL1L具有90％以上同源性且编码相同蛋白的DNA序列的转基因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。转基因植株脂肪酸含量和组分的改变包括植物体内各组织和器官内各种脂肪酸含量包括饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的改善和提高，及各种脂肪酸组分的提高或降低。

本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。

实验证明：本发明保护的基因AtL1L适量表达后可以提高油菜种子中的含油量。本发明的发明人构建了一个在种子特异并适度表达的启动子，用于驱动转基因油菜中AtL1L基因表达。转基因实验表明能显著提高油料作物油菜种子中的油含量，为转基因方法提高油料作物的脂肪酸含量提供一条行之有效的途径。这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。

附图说明

图1为AtL1L蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，61-126为保守的NF-YB结构域。

图2为油菜napinA启动子缺失片段与GUS基因融合表达载体简图，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；数字表示napinA启动子以及相应突变体(D系列突变体)的长度与突变的相对位置，GUS编码区未按长度比列绘制。

图3为napinA启动子缺失片段驱动GUS表达酶活分析D0、D4、D6和D7为油菜napinA启动子的缺失驱动GUS的转基因拟南芥果荚中GUS酶活，每个缺失片段启动子测定5个独立家系，以典型家系表示该缺失片段启动子驱动能力。数据为三次独立测定的平均值。

图4为D4和D6启动子驱动AtL1L表达载体，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；D4、D6表示不同长度的napinA启动子突变体，启动子按照长度比例绘制，AtL1L基因未按长度比列绘制。

图5为D4::AtL1L转基因油菜种子中油含量，中油821为非转基因油菜野生型对照；D4::AtL1L#1、D4::AtL1L#2、D4::AtL1L#3、D4::AtL1L#4为以中油821为背景的转基因油菜株系。

图6为D6::AtL1L转基因油菜种子中油含量，Westar油菜为非转基因野生型油菜对照；D6::AtL1L#1、D6::AtL1L#2、D6::AtL1L#3、D6::AtL1L#4为以Westar为背景的转基因油菜株系。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

中油821、Westar油菜均由西南大学李加纳老师在2007年7月赠送，其原始来源不清楚。拟南芥(Col-0)种子由2001年5月ABRC(http://www.arabidopsis.org)赠送，其原始来源不清楚。

实施例1、种子含油量高的转基因油菜的获得

一、启动子的获得及其检测

1、启动子的获得

根据napin A启动子的核苷酸序列(GenBank号：J02798.1)，按照图2设计napin A启动子缺失片段引物(F为前端引物，R为反向引物)，用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的种子胚胎特异表达的启动子，引物序列如下：(划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基))

D0 F：5′-CGAAAGCTTTCTTCATCGGTGATTGATTC-3′；

D7 F：5′-CGAAAGCTTCCATGCCAGAACATTAGCTACACG-3′；

D6 F：5′-CGAAAGCTTAAGAATCGTTCATAAGATGCCATGC-3′；

D4 F：5′-CGAAAGCTTTTTTAATTTTATGAAGTTAAGTTT-3′；

napinA R：5′-TTAGTCGACTCGTGTATGTTTTTAATCTTG-3′。

用CTAB法提取油菜中油821(谢柱存.中油821的特性与栽培[J].广西农业科学，1991，(05)：213)基因组DNA，在napin A前端引物(D0 F、D4 F、D6 F和D7 F)和后端引物napinA R的分别引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回目的片段并对其进行纯化，得到D0、D4、D6和D7扩增片段。将回收纯化的D0、D4、D6和D7片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中。然后将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提取质粒，得到含有回收片段的重组质粒，分别命名为pGEM-D0、pGEM-D4、pGEM-D6和pGEM-D7。对上述重组质粒进行DNA测序分析，测序结果表明扩增得到的4个片段与napin A启动子(GenBank号：J02798.1)序列相对应部分相同。各个启动子序列分别如下：D0的序列如序列表中序列4所示；D4的序列如序列表中序列4的自5’端第832-1145位所示；D6的序列如序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示；D7的序列如序列表中序列4的自5’端第891-1145位所示。

2、启动子的检测

1)napin A启动子缺失片段(D系列启动子)与GUS编码区的融合表达载体构建

分别挑选pGEM-D0、pGEM-D4、pGEM-D6和pGEM-D7序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，用购于NEB公司的HindIII/Sal I双酶切得到相应启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D0、D4、D6和D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过同样酶切的pBI121(购自Clontech)载体连接，形成pBI121-D0::GUS、pBI121-D4::GUS、pBI121-D6::GUS和pBI121-D7::GUS的GUS表达载体。热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。载体的构建简图，见图2。

2)转基因拟南芥中启动子驱动GUS蛋白表达的检测

A、转基因拟南芥的获得

将步骤1)得到的pBI121-D0::GUS、pBI121-D4::GUS、pBI121-D6::GUS和pBI121-D7::GUS四种表达载体分别用电激转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀。转化液转入250ml烧杯中，将已去掉花和果荚的Col-0野生型拟南芥(Feng，H.，An，F.，Zhang，S.，Ji，Z.，Ling，H.Q.，and Zuo，J.(2006).Light-regulated，tissue-specifc，and cell differentiation-specific expression of the ArabidopsisFe(III)-chelate reductase gene AtFRO6.Plant Physiol 140，1345-1354.)倒置于烧杯中，真空抽20秒为宜。为提高转化效率，一周后可再重复转化一次。将转化后的拟南芥培养得到种子，将得到的拟南芥种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥。

B、GUS酶活性的检测

取步骤A中的转基因拟南芥T3代的相同标记时间的同期拟南芥果荚100mg，用液氮研磨成干粉，加500μl提取液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0；10mmol/L巯基乙醇；1mmol/L EDTA，pH8.0；0.1％月桂酸肌氨酸钠；0.1％ Triton X-100)，13,000rpm离心10分钟，上清液用于GUS活性及蛋白浓度测定。取5μl酶提取液加入到45μl检测液中(酶提取液中加入2mmol/L 4-甲基伞型酮酰-

-葡萄糖醛酸苷[4-Methyl umbelliferyl β-D glucuronide，MUG])，立即混匀，快速取5μl反应混合液，加入到195μl反应终止液(0.2mol/L Na₂CO₃)中，混匀，即酶活性测定0点；反应混合液于37℃保温，一小时后取5μl反应混合液加入到195μl反应终止液中终止反应；用Tecan GENios荧光分光光度计(激发光波长为365nm，发射光为455nm)测定每个样品的荧光强度，计算反应生成的4-甲基伞型酮(4-methylumbelliferone，MU)的量；按照Bradford方法，用Tecan GENios测定样品中蛋白含量；计算样品中GUS活性，GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位：pmolMU·mg^-1·min^-1)，结果如图3所示，结果表明随着启动子长度的缩短，GUS酶活性逐渐降低，表明启动子的驱动GUS报告基因表达的能力降低。

二、种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测

1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因AtL1L的克隆

根据核苷酸序列(GenBank号：AB025628.1)设计引物P1和P2，用于扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型(Col-0)中的调控植物脂肪酸代谢的转录因子基因，引物序列如下：(划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基)

P1(AtL1L上游引物)：5′-TTAGTCGACCACAAACACAAAAGTCGTGT-3′

P2(AtL1L下游引物)：5′-CGAGGATCC GCAAAACTAATGCTTTATTGA-3′

用TRIZAL试剂(购自Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书提取拟南芥哥伦比亚生态型(Col-0)新鲜果荚的总RNA，然后用Invitrogen公司的SuperScript^TM IIReverse Transcriptase试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链cDNA，再以所合成的cDNA为模板，在引物P1和P2的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约0.8Kb的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中，再将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM-AtL1L，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO：2的序列，序列2由937个碱基组成，包括38个碱基的5′UTR区，其编码序列为自5′端第39-743位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5′端第219-416位碱基编码NF-YB结构域。自5′端第744-937位碱基为该基因组基因的3′非编码区。将该基因命名为AtL1L，将其编码蛋白命名为AtL1L，该基因蛋白的框架结构图见图1。AtL1L的基因组DNA(序列表中的SEQ ID NO：3)的序列由1147个碱基组成，包括38个碱基的5′UTR区，3′UTR区为954到1147位碱基。自5′端第39-105位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第106-315位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第316-953位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第954-1147位碱基为该基因组基因的3′非编码区。

2、用D4和D6启动子驱动AtL1L表达的转基因载体的构建

挑选步骤二的步骤1中的序列正确的pGEM-AtL1L阳性克隆，大量制备质粒DNA，用从NEB公司购得的Sal I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收AtL1L基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pCAMBIA-2300(简称pC2300)(CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)连接，形成pC2300::AtL1L的中间载体。

然后把步骤一中步骤2得到的pGEM-D4、pGEM-D6正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，经HindIII/Sal I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D4、D6启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pC2300::AtL1L中间载体连接，形成pC2300-D4::AtL1L和pC2300-D6::AtL1L的最终载体。

热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定，表达载体的构建图，见图4。

3、转基因油菜的获得

1)转化农杆菌

将步骤2得到的表达载体(pC2300-D4::AtL1L和pC2300-D6::AtL1L)分别用电激转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。然后，所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀，得到含有pC2300-D4::AtL1L的转化液和含有pC2300-D6::AtL1L的转化液。

2)转化油菜

A、转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜

把上述含有pC2300-D4::AtL1L的转化液转入塑料袋中，将已经去掉果荚和花的中油821油菜花序浸泡在转化液中；浸泡时间为1分钟为宜，浸泡期间不停晃动浸染液。为提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的油菜培养，得油菜种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗)，至此获得转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜。

B、转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜

按照上述步骤A的方法，将含有pC2300-D4::AtL1L的转化液换成含有pC2300-D6::AtL1L的转化液，将油菜品种换成Westar油菜(Chandler，S.F.，and Thorpe，T.A.(1987).Characterization of Growth，Water Relations，and Proline Accumulation inSodium Sulfate Tolerant Callus of Brassica napus L.cv Westar(Canola).Plant Physiol84，106-111.)，其余操作完全相同，得到转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜。

4、转基因油菜的检测

A、转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜的检测

以非转基因中油821为野生型对照1。

将转基因油菜苗培养，得到T1代种子，对T1代种子(转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜和野生型对照1)进行含油量的测定与计算，其中含油量＝种子油脂(质量)/种子干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECTOR22/N型傅立叶变换近红外光谱仪测定，运用OPUS 5.5软件进行分析得到的。光谱采集条件：分辨率8cm^-1，扫描次数32次，谱区范围12000-4000cm^-1，室温23-25℃。测定结果如图5所示，用D4启动子驱动AtL1L过表达，转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜的种子含油量高于野生型对照1的种子含油量。

B、转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜的检测

以非转基因Westar油菜为野生型对照2。

将转基因油菜苗继代培养，得到T1代种子，对T1代种子(转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜和野生型对照2)进行含油量的测定，测定方法同上述步骤A。测定结果如图6所示，用D6启动子驱动AtL1L过表达，转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜的种子含油量高于野生型对照2的种子含油量

以上可知，D4和D6启动子驱动AtL1L过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。

序列表

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120>与种子脂肪酸合成相关的蛋  AtL1L及其编码基因与应用

<130>CGGNARL92690

<160>4

<210>1

<211>234

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

Met Glu Arg Gly Gly Phe His Gly Tyr Arg Lys Leu Ser Val Asn Asn

1               5                   10                  15

Thr Thr Pro Ser Pro Pro Gly Leu Ala Ala Asn Phe Leu Met Ala Glu

            20                  25                  30

Gly Ser Met Arg Pro Pro Glu Phe Asn Gln Pro Asn Lys Thr Ser Asn

        35                  40                  45

Gly Gly Glu Glu Glu Cys Thr Val Arg Glu Gln Asp Arg Phe Met Pro

    50                  55                  60

Ile Ala Asn Val Ile Arg Ile Met Arg Arg Ile Leu Pro Ala His Ala

65                  70                  75                  80

Lys Ile Ser Asp Asp Ser Lys Glu Thr Ile Gln Glu Cys Val Ser Glu

                85                  90                  95

Tyr Ile Ser Phe Ile Thr Gly Glu Ala Asn Glu Arg Cys Gln Arg Glu

            100                 105                 110

Gln Arg Lys Thr Ile Thr Ala Glu Asp Val Leu Trp Ala Met Ser Lys

        115                 120                 125

Leu Gly Phe Asp Asp Tyr Ile Glu Pro Leu Thr Leu Tyr Leu His Arg

    130                 135                 140

Tyr Arg Glu Leu Glu Gly Glu Arg Gly Val Ser Cys Ser Ala Gly Ser

145                 150                 155                 160

Val Ser Met Thr Asn Gly Leu Val Val Lys Arg Pro Asn Gly Thr Met

                165                 170                 175

Thr Glu Tyr Gly Ala Tyr Gly Pro Val Pro Gly Ile His Met Ala Gln

            180                 185                 190

Tyr His Tyr Arg His Gln Asn Gly Phe Val Phe Ser Gly Asn Glu Pro

        195                 200                 205

Asn Ser Lys Met Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Ser Gly Ala Arg Val

    210                 215                 220

Glu Val Phe Pro Thr Gln Gln His Lys Tyr

225                 230

<210>2

<211>937

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

cacaaacaca aaagtcgtgt atttagaaca agaaagatat ggaacgtgga ggcttccatg    60

gctaccgcaa gctgtccgtg aacaacacca ctccttctcc accaggatta gcagcgaatt    120

ttctgatggc agagggcagt atgcgtcctc cagaattcaa ccagcctaac aaaaccagta    180

atggtggtga ggaggagtgc acggtgaggg agcaagacag gttcatgcct attgccaacg    240

tgatacggat catgcggagg atcttacctg ctcacgccaa gatctcagat gactccaagg    300

agacgatcca agagtgtgtt tcggagtaca tcagcttcat aacaggggag gctaatgagc    360

ggtgccagcg ggaacagcgc aagaccatca ctgctgagga cgtcttgtgg gcaatgagca    420

agctcggttt tgatgactac atcgaacccc tcacgttgta cctccaccgc tacagagagt    480

tggaaggtga aagaggggtt agctgcagtg ctgggtccgt tagtatgacc aacggcttgg    540

tggtcaagag gcctaatggg accatgaccg agtatggagc ctacgggcct gtgccaggga    600

ttcacatggc gcagtaccat tatcgtcatc agaacgggtt tgttttcagt ggtaacgaac    660

ctaattctaa gatgagtggt tcatcttcag gagcaagtgg cgccagagtt gaagtatttc    720

cgactcaaca acataagtac tgagaacaat ggctaataac atagacagct gacagagtca    780

taactgttag taggtgcaag ctgtagctta tgaattcaag tttaagcgaa aacaatgctg    840

ctttttcttt gtttattatc tatctagttg aaagaacatt gtgtttttca tctgatctgt    900

cttgtggtaa agtatgtcaa taaagcatta gttttgc                             937

<210>3

<211>1147

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>3

cacaaacaca aaagtcgtgt atttagaaca agaaagatat ggaacgtgga ggcttccatg    60

gctaccgcaa gctgtccgtg aacaacacca ctccttctcc accaggtagt gccattctct    120

ataccccctc ttttcacagg ctctcttcat ttcagttgca tgcgaaacca ttctctgcaa    180

tccctccatt gtcatgtctg tactcttttc atgacgaaca gttaatgaaa tagcttttca    240

atcttataaa ccgcgcatgc agacgtcatc gaagccatta tgcactaaaa cttccatttt    300

tcttattttt gttaggatta gcagcgaatt ttctgatggc agagggcagt atgcgtcctc    360

cagaattcaa ccagcctaac aaaaccagta atggtggtga ggaggagtgc acggtgaggg    420

agcaagacag gttcatgcct attgccaacg tgatacggat catgcggagg atcttacctg    480

ctcacgccaa gatctcagat gactccaagg agacgatcca agagtgtgtt tcggagtaca    540

tcagcttcat aacaggggag gctaatgagc ggtgccagcg ggaacagcgc aagaccatca    600

ctgctgagga cgtcttgtgg gcaatgagca agctcggttt tgatgactac atcgaacccc    660

tcacgttgta cctccaccgc tacagagagt tggaaggtga aagaggggtt agctgcagtg    720

ctgggtccgt tagtatgacc aacggcttgg tggtcaagag gcctaatggg accatgaccg    780

agtatggagc ctacgggcct gtgccaggga ttcacatggc gcagtaccat tatcgtcatc    840

agaacgggtt tgttttcagt ggtaacgaac ctaattctaa gatgagtggt tcatcttcag    900

gagcaagtgg cgccagagtt gaagtatttc cgactcaaca acataagtac tgagaacaat    960

ggctaataac atagacagct gacagagtca taactgttag taggtgcaag ctgtagctta    1020

tgaattcaag tttaagcgaa aacaatgctg ctttttcttt gtttattatc tatctagttg   1080

aaagaacatt gtgtttttca tctgatctgt cttgtggtaa agtatgtcaa taaagcatta   1140

gttttgc                                                             1147

<210>4

<211>1145

<212>DNA

<213>甘蓝油菜(Brassica napus)

<400>4

aagctttctt catcggtgat tgattccttt aaagacttat gtttcttatc ttgcttctga    60

ggcaagtatt cagttaccag ttaccactta tattctggac tttctgactg catcctcatt    120

tttccaacat tttaaatttc actattggct gaatgcttct tctttgagga agaaacaatt    180

cagatggcag aaatgtatca accaatgcat atatacaaat gtacctcttg ttctcaaaac    240

atctatcgga tggttccatt tgctttgtca tccaattagt gactacttta tattattcac    300

tcctctttat tactattttc atgcgaggtt gccatgtaca ttatatttgt aaggattgac    360

gctattgagc gtttttcttc aattttcttt attttagaca tgggtatgaa atgtgtgtta    420

gagttgggtt gaatgagata tacgttcaag tgaagtggca taccgttctc gagtaaggat    480

gacctaccca ttcttgagac aaatgttaca ttttagtatc agagtaaaat gtgtacctat    540

aactcaaatt cgattgacat gtatccattc aacataaaat taaaccagcc tgcacctgca    600

tccacatttc aagtattttc aaaccgttcg gctcctatcc accgggtgta acaagacgga    660

ttccgaattt ggaagatttt gactcaaatt cccaatttat attgaccgtg actaaatcaa    720

ctttaacttc tataattctg attaagctcc caatttatat tcccaacggc actacctcca    780

aaatttatag actctcatcc ccttttaaac caacttagta aacgtttttt tttttaattt    840

tatgaagtta agtttttacc ttgtttttaa aaagaatcgt tcataagatg ccatgccaga    900

acattagcta cacgttacac atagcatgca gccgcggaga attgtttttc ttcgccactt    960

gtcactccct tcaaacacct aagagcttct ctctcacagc acacacatac aatcacatgc    1020

gtgcatgcat tattacacgt gatcgccatg caaatctcct ttatagccta taaattaact    1080

catccgcttc actctttact caaaccaaaa ctcatcaata caaacaagat taaaaacata    1140

cacga                                                                1145

Claims (3)

1.一种培育种子含油量高的转基因植物的方法，是将由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因转入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物种子的含油量高于所述目的植物种子的含油量；

所述编码基因通过如下1)或2)的重组表达载体导入所述目的植物中：1)将序列表中序列4的自5’端第832-1145位所示的启动子与所述编码基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到的重组表达载体；

2)将序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示的启动子与所述编码基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到的重组表达载体；

所述目的植物为油菜。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述编码基因是如下1)或2)所述的基因：

1)其编码序列是序列表中序列2的自5′末端第39-743位脱氧核糖核苷酸；

2)其核苷酸序列是序列表中的序列2。

3.含有由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体是按照下述1)或2)的方法制备：

1)将序列表中序列4的自5’端第832-1145位所示的启动子与所述编码基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到重组表达载体；

2)将序列表中序列4的自5’端第872-1145位所示的启动子与所述编码基因一起插入pCAMBIA-2300的多克隆位点间，得到重组表达载体。

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