CN102071193B - 来源于甘蓝油菜的启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了来源于甘蓝油菜的启动子及其应用。该启动子核苷酸序列是如下1)或2)或3)：1)序列表中序列1的自5’端第832-1145位所示的核苷酸序列；2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。将该启动子适度表达AtL1L基因、BnLEC1基因和BnL1L基因，可以提高油料作物油菜种子中的油含量，这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及来源于甘蓝油菜的启动子及其应用。
背景技术
植物中的脂肪酸又被称为植物油，它广泛存在于植物的种子中。植物油用途广泛，运用生物技术改良植物体内脂肪酸的组分和含量具有重要的经济价值。其中，遗传工程技术所选用的操作基因必需是植物体内脂肪酸生物合成过程中的关键基因，但是目前人们对于植物脂肪酸生物合成的分子调控机制还不甚了解，因此，利用遗传工程技术提高油料作物含油量的工作目前进展缓慢。以双子叶模式植物拟南芥为例，植物的胚胎发生主要分为两个阶段：早期形态发生过程和晚期成熟过程。整个胚胎发育过程中伴随着淀粉、蛋白质和脂肪酸等贮藏物质的积累。在胚胎发育早期，主要是淀粉的大量积累，在组织和器官形成以后，淀粉被转化为蛋白质和脂肪酸。在发育的种子中，碳水化合物通过糖酵解途径被分解成磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate，PEP)，PEP被运输到质体后再转化成丙酮酸和乙酰CoA，乙酰CoA作为底物参与脂肪酸的合成(Ruuska，S.A.，Girke，T.，Benning，C.，andOhlrogge，J.B.(2002).Contrapuntal networks of gene expression during Arabidopsisseed filling.Plant Cell 14，1191-1206.)。
在种子发育过程中，质体内的脂肪酸合成酶复合物中的酶类负责脂肪酸的合成，所合成的脂肪酸被导入胞质酰基CoA库中以维持三酯酰甘油(TAG)积累。植物种子中的TAG的生物合成是在内质网中进行的。TAG的前体是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成TAG的过程共需要三种酰基转移酶和一种磷酸水解酶，分别是甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)，溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAT)，二脂酰甘油酰基转移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase)(Ohlrogge等，1979，Proc Natl AcadSci，USA，76：1194-1198)。这三种酰基转移酶催化甘油骨架的逐步酰基化过程。近十余年来，科学家们对利用遗传工程技术提高植物体内，特别是种子中的脂肪酸含量进行了各种有益的探索。Shintani等在烟草中过量表达了ACCase的一个亚基-生物素羧化酶(BC亚基)，在烟草叶片中BC的表达水平提高了3倍，其它三个亚基的表达水平没有发生明显变化，但脂肪酸的含量和组成也没有明显改变(Shintani，D.，Roesler，K.，Shorrosh，B.，Savage，L.，and Ohlrogge，J.(1997).Antisenseexpression and overexpression of biotin carboxylase in tobacco leaves.Plant Physiol 114，881-886.)。另一项研究表明，增加丙酰CoA的含量能够提高脂肪酸的含量。Roeseler等利用种子特异性表达启动子在油菜中过量表达拟南芥中的HO-ACCase基因，结果使ACCase的活性明显提高，种子中的含油量提高3-5％(Roesler，K.，Shintani，D.，Savage，L.，Boddupalli，S.，and Ohlrogge，J.(1997).Targeting of the Arabidopsishomomeric acetyl-coenzyme A carboxylase to plastids of rapeseeds.Plant Physiol 113，75-81.)。Roeseler等的研究结果表明，丙酰CoA水平能够提高脂肪酸的含量，但提高幅度较小。Dechesh等将菠菜的KASIII基因在烟草中过量表达，结果使KASIII的酶活性提高了100-300倍，但脂肪酸的含量却降低了5-10％(Dehesh等，2001，PlantPhysiol.，125：1103-1114)。上述研究结果表明，植物体内的脂肪酸代谢是一个复杂和高度协调的过程，通过对脂肪酸代谢途径中的个别或单个基因进行遗传操作并不能够有效地改变脂肪酸的含量。因此，Girke等人预言在脂肪酸的代谢过程中，很可能存在一种蛋白激酶或其它调控因子(例如转录因子)在起调控作用(Girke，T.，Todd，J.，Ruuska，S.，White，J.，Benning，C.，and Ohlrogge，J.(2000).Microarrayanalysis of developing Arabidopsis seeds.Plant Physiol 124，1570-1581.)。
目前，已发现的参与植物脂肪酸代谢的转录因子有拟南芥的WRI1和LEC1等。其中，WRI1编码一个AP2/EREB转录因子蛋白，它可能是植物体内由蔗糖向TAG转化的一个关键的调节因子(Cernac，A.，and Benning，C.(2004).WRINKLED1encodes an AP2/EREB domain protein involved in the control of storage compoundbiosynthesis in Arabidopsis.Plant J 40，575-585.)。LEC1属于能结合启动子中顺式作用元件CCAAT盒的一类转录因子，调控胚胎的发生与种子成熟，同时可能对胚胎形成过程中胚胎储存物的积累进行调控(Lotan，T.，Ohto，M.，Yee，K.M.，West，M.A.，Lo，R.，Kwong，R.W.，Yamagishi，K.，Fischer，R.L.，Goldberg，R.B.，and Harada，J.J.(1998).Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 is sufficient to induce embryodevelopment in vegetative cells.Cell 93，1195-1205.)。过量表达LEC1能大幅度增加转基因拟南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu，J.，Tan，H.，Zheng，Q.，Fu，F.，Liang，Y.，Zhang，J.，Yang，X.，Wang，T.，Chong，K.，Wang，X.J.，et al.(2008).LEAFYCOTYLEDON1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in Arabidopsis.PlantPhysiol 148，1042-1054.)。
在拟南芥基因组中，编码转录因子的基因占了很大一部分，至少有1500个，占整个基因组的5％以上(Riechmann等，2000，Science，290：2110-2113)。这些转录因子大多属于大的基因家族，有的基因家族又包括许多亚族，而且有些转录因子家族是植物所特有的。对转录因子的研究结果表明，一个转录因子可能对一类相关性状的很多基因实施调节控制，从而有效改变植物的相关特性。CCAAT盒是一个广泛存在于基因启动子上的顺式作用元件，与CCAAT序列结合的转录因子又称为nuclear factor Y(NF-Y)或CCAAT binding factor(CBF)。NF-Y是一个由三种不同亚基构成的异源三聚体复合物，它特异性地识别DNA上的CCAAT序列，并与之结合，从而调节基因的表达。NF-Y的三种不同亚基分别属于3个亚族：NF-YA(又称为HAP2或CBF-B)，NF-YB(又称为HAP3或CBF-A)和NF-YC(又称为HAP5或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心结构域在序列上与组蛋白H2A和H2B有很高的同源性。NF-YB/NF-YC形成一个紧密结合的异源二聚体复合物，NF-YA再结合在这个复合物的表面，形成异源三聚体复合物。该三聚体复合物对DNA有很高的亲和力(Gusmaroli，G.，Tonelli，C.，and Mantovani，R.(2002).Regulation of novelmembers of the Arabidopsis thaliana CCAAT-binding nuclear factor Y subunits.Gene283，41-48.；Romier，C.，Cocchiarella，F.，Mantovani，R.，and Moras，D.(2003).TheNF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation byCCAAT factor NF-Y.J Biol Chem 278，1336-1345)。
编码NF-Y亚基的基因普遍存在于真核生物中，其中在酵母与动物体中，各种亚基都是由单基因编码的。而在植物的基因组中，NF-Y亚基是由多种不同基因编码的。在拟南芥中，Gusmaroli等人先后于2001年和2002年报道了三个NF-Y亚族中的共29个ESTs的序列(Gusmaroli，G.，Tonelli，C.，and Mantovani，R.(2001).Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana.Gene 264，173-185)，本发明的发明人于2004年完成了该家族32个基因cDNA的克隆，其中9个HAP2，11个HAP3，12个HAP5(Wei等，2004，Plant Physiol.，135：773-782)。NF-YB亚族的转录因子在基因内部都含有一个保守的B结构域，依据B结构域序列的差异，该家族被分为两类：LEAFY COTYLEDON1(LEC1)类型和非LEC1类型(Kwong，R.W.，Bui，A.Q.，Lee，H.，Kwong，L.W.，Fischer，R.L.，Goldberg，R.B.，and Harada，J.J.(2003).LEAFY COTYLEDON1-LIKE defines a class of regulators essential for embryo development.Plant Cell 15，5-18)。LEC1类型包括两个基因：LEC1和LEAFY COTYLEDON1-like(L1L)。这两个基因都是特异性地在胚胎和种子发育过程中表达。LEC1类型的转录因子的B结构域含有16个保守的氨基酸残基，这16个氨基酸残基在非LEC1类型的转录因子中是不存在的。B结构域是决定LEC1类转录因子在功能上区别于其它非LEC1类转录因子的关键因素(Hyeseung等，2003，Proc Natl Acad Sci，USA，100：2152-2156)。LEC1是HAP3家族中功能研究的较为清楚的一个蛋白。LEC1是拟南芥胚胎发生过程中一个关键的调控因子。LEC1参与了种子成熟的多个过程，包括种子的干燥和养分的积累。目前，在玉米、向日葵和胡萝卜中，均发现了LEC1基因的同源基因(Zhang，S.，Wong，L.，Meng，L.，and Lemaux，P.G.(2002).Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize(Zeamays L.).Planta 215，191-194.；Yazawa，K.，Takahata，K.，and Kamada，H.(2004).Isolation of the gene encoding Carrot leafy cotyledon1 and expression analysisduring somatic and zygotic embryogenesis.Plant Physiol Biochem 42，215-223.)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种启动子。
本发明提供的启动子，其核苷酸序列是如下1)或2)或3)：
1)序列表中序列1的自5’端第832-1145位所示的核苷酸序列；
2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；
3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
本发明的目的在于提供另一种启动子。
所述另一种启动子的核苷酸序列是如下1)或2)或3)：
1)序列表中序列1的自5’端第872-1145位所示的核苷酸序列；
2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；
3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
本发明的目的在于提供又一种启动子。
所述又一种启动子的核苷酸序列是如下1)或2)或3)：
1)序列表中序列1的自5’端第891-1145位所示的核苷酸序列；
2)在高严谨条件下与所述1)的核苷酸序列杂交且具有启动子活性的核苷酸序列；
3)与所述1)的核苷酸序列具有70％以上的同源性且具有启动子活性的核苷酸序列。
所述高严谨条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
本发明的启动子活性片段还包括与来自SEQ ID NO.1的片段的核苷酸序列互补的核苷酸序列。这里使用的术语“互补的”系指遵循碱基配对原则产生的之意。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的启动子核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的启动子核苷酸序列70％或者更高同源性的核苷酸，只要保持了表达靶基因的启动子活性，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同源性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同源性”包括与本发明的启动子核苷酸序列具有优选地75％或更高，更优选地85％或更高，甚至更优选地90％或更高，以及最优选地95％或更高同一性的核苷酸序列。同源性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同源性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同源性。
含有任一上述的启动子的重组载体也属于本发明的保护范围之内。
上述重组载体具体是任一上述的启动子与下述1)或2)或3)的基因一起插入载体pCAMBIA-2300的多克隆位点制成的重组表达载体：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
含有任一上述的启动子的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。
含有任一上述的启动子的重组菌也属于本发明的保护范围之内。
任一上述的启动子在驱动目的基因在胚胎或种子组织中特异表达中的应用也属于本发明的保护范围之内。
上述目的基因是下述1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、组织或器官既可来源于拟南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕榈树、橄榄树、蓖麻、马铃薯或烟草等双子叶植物，也可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、燕麦、黑麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。
实验证明：本发明的发明人构建了3个在种子特异并适度表达的启动子，用于驱动转基因油菜中AtL1L基因、BnLEC1基因和BnL1L基因表达。转基因实验表明能显著提高油料作物油菜种子中的油含量，为转基因方法提高油料作物的脂肪酸含量提供一条行之有效的途径。这对提高植物(特别是油料作物)的脂肪酸含量及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，在农业领域具有广阔的应用和市场前景。
附图说明
图1为AtL1L蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，61-126为保守的NF-YB结构域。
图2为油菜napin A启动子缺失片段与GUS基因融合表达载体简图，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；数字表示napin A启动子以及相应突变体(D系列突变体)的长度与突变的相对位置，GUS编码区未按长度比列绘制。
图3为napin A启动子缺失片段驱动GUS表达酶活分析D0、D4、D6和D7为油菜napin A启动子的缺失驱动GUS的转基因拟南芥果荚中GUS酶活，每个缺失片段启动子测定5个独立家系，以典型家系表示该缺失片段启动子驱动能力。数据为三次独立测定的平均值。
图4为D4和D6启动子驱动AtL1L表达载体，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；D4、D6表示不同长度的napin A启动子突变体，启动子按照长度比例绘制，AtL1L基因未按长度比列绘制。
图5为D4::AtL1L转基因油菜种子中油含量，中油821为非转基因油菜野生型对照；D4::AtL1L#1、D4::AtL1L#2、D4::AtL1L#3、D4::AtL1L#4为以中油821为背景的转基因油菜株系。
图6为D6::AtL1L转基因油菜种子中油含量，Westar油菜为非转基因野生型油菜对照；D6::AtL1L#1、D6::AtL1L#2、D6::AtL1L#3、D6::AtL1L#4为以Westar为背景的转基因油菜株系。
图7为BnLEC1蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，59-126为保守的NF-YB结构域。
图8为为D7启动子驱动BnLEC1表达载体，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；D7表示napin A启动子突变体的长度，启动子按照长度比例绘制，BnLEC1基因未按长度比列绘制。
图9为为D7::BnLEC1转基因油菜种子中油含量，Westar为非转基因野生型油菜对照；D7::BnLEC1#2、D7::BnLEC1#3、D7::BnLEC1#4、D7::BnLEC1#5为以Westar为背景的转基因油菜株系。
图10为为BnL1L蛋白的保守结构域，数字表示氨基酸残基位置，56～121为保守的NF-YB结构域。
图11为D7和D6启动子驱动BnL1L表达载体简图，+1表示预测的转录起始点，箭头指示转录方向；D0、D6和D7表示napin A启动子以及相应突变体的长度，启动子按照长度比例绘制，BnL1L基因未按长度比列绘制。
图12为D0::BnL1L转基因油菜种子中油含量，中油821为非转基因油菜野生型对照；D0::BnL1L#1、D0::BnL1L#2、D0::BnL1L#3、D0::BnL1L#4为以中油821为背景的转基因油菜株系。
图13为D6::BnL1L转基因油菜种子中油含量，中油821为非转基因油菜野生型对照；D6::BnL1L#3、D6::BnL1L#4、D6::BnL1L#5、D6::BnL1L#6为以中油821为背景的转基因油菜株系。
图14为D6::BnL1L转基因油菜种子中油含量，Westar为非转基因野生型油菜对照；D6::BnL1L#6、D6::BnL1L#7、D6::BnL1L#8、D6::BnL1L#9为以Westar为背景的转基因油菜株系。
图15为D7::BnL1L转基因油菜种子中油含量，Westar为非转基因野生型油菜对照；D7::BnL1L#5、D7::BnL1L#6、D7::BnL1L#7、D7::BnL1L#8为以Westar为背景的转基因油菜株系。
图16为D0::BnL1L转基因拟南芥幼苗表型，Col-0野生型对照种子和以Col-0为背景的转基因种子在MS培养基上萌发，培养条件为22℃，光照强度80-120μE-2S-1，16小时光照的温室中培养生长12天，左边为Col-0非转基因野生型对照苗；右边为D0::BnL1L转基因苗；转基因幼苗子叶缺乏或畸形变小，红色箭头指示为子叶。
图17为D0::BnL1L转基因拟南芥种子中油含量，Col-0为非转基因野生型拟南芥对照；D0::BnL1L#9、D0::BnL1L#10、D0::BnL1L#11为以Col-0为背景的转基因拟南芥株系；*表示与对照比较有显著差异，P＜0.01；拟南芥种子中油含量测定采用GC/MS方法，数据为三次独立测定的平均值。
图18为D7::BnL1L转基因拟南芥种子中油含量，Col-0为非转基因野生型拟南芥对照；D7::BnL1L#4、D7::BnL1L#6、D7::BnL1L#12、D7::BnL1L#13为以Col-0为背景的转基因拟南芥株系；*表示与对照比较有显著差异，P＜0.01；拟南芥种子中油含量测定采用GC/MS方法，数据为三次独立测定的平均值。
具体实施方式
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。中油821、Westar油菜均由西南大学李加纳老师在2007年7月赠送，其原始来源不清楚。拟南芥(Col-0)种子由2001年5月ABRC(http://www.arabidopsis.org)赠送，其原始来源不清楚。
实施例1、种子含油量高的转基因油菜的获得
一、启动子的获得及其检测
1、启动子的获得
根据napin A启动子的核苷酸序列(GenBank号：J02798.1)，按照图2设计napin A启动子缺失片段引物(F为前端引物，R为反向引物)，用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的种子胚胎特异表达的启动子，引物序列如下：(划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基)
D0 F：5′-CGAAAGCTTTCTTCATCGGTGATTGATTC-3′；
D7 F：5′-CGAAAGCTTCCATGCCAGAACATTAGCTACACG-3′；
D6 F：5′-CGAAAGCTTAAGAATCGTTCATAAGATGCCATGC-3′；
D4 F：5′-CGAAAGCTTTTTTAATTTTATGAAGTTAAGTTT-3′；
napinA R：5′-TTAGTCGACTCGTGTATGTTTTTAATCTTG-3′。
用CTAB法提取油菜中油821(谢柱存.中油821的特性与栽培[J].广西农业科学，1991，(05)：213)基因组DNA，在napin A前端引物(D0 F、D4 F、D6 F和D7 F)和后端引物napinA R的分别引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回目的片段并对其进行纯化，得到D0、D4、D6和D7扩增片段。将回收纯化的D0、D4、D6和D7片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中。然后将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提取质粒，得到含有回收片段的重组质粒，分别命名为pGEM-D0、pGEM-D4、pGEM-D6和pGEM-D7。对上述重组质粒进行DNA测序分析，测序结果表明扩增得到的4个片段与napin A启动子(GenBank号：J02798.1)序列相对应部分相同。各个启动子序列分别如下：
D0的序列如序列表中序列1所示；D4的序列如序列表中序列1的自5’端第832-1145位所示；D6的序列如序列表中序列1的自5’端第872-1145位所示；D7的序列如序列表中序列1的自5’端第891-1145位所示。
2、启动子的检测
1)napin A启动子缺失片段(D系列启动子)与GUS编码区的融合表达载体构建
分别挑选pGEM-D0、pGEM-D4、pGEM-D6和pGEM-D7序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，用购于NEB公司的HindIII/Sal I双酶切得到相应启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D0、D4、D6和D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过同样酶切的pBI121(购自Clontech)载体连接，形成pBI121-D0::GUS、pBI121-D4::GUS、pBI121-D6::GUS和pBI121-D7::GUS的GUS表达载体。热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。载体的构建简图，见图2。
2)转基因拟南芥中启动子驱动GUS蛋白表达的检测
A、转基因拟南芥的获得
将步骤1)得到的pBI121-D0::GUS、pBI121-D4::GUS、pBI121-D6::GUS和pBI121-D7::GUS四种表达载体分别用电激转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀。转化液转入250ml烧杯中，将已去掉花和果荚的Col-0野生型拟南芥(Feng，H.，An，F.，Zhang，S.，Ji，Z.，Ling，H.Q.，and Zuo，J.(2006).Light-regulated，tissue-specific，and cell differentiation-specific expression of the ArabidopsisFe(III)-chelate reductase gene AtFRO6.Plant Physiol 140，1345-1354.)倒置于烧杯中，真空抽20秒为宜。为提高转化效率，一周后可再重复转化一次。将转化后的拟南芥培养得到种子，将得到的拟南芥种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因拟南芥。
B、GUS酶活性的检测
取步骤A中的转基因拟南芥T3代的相同标记时间的同期拟南芥果荚100mg，用液氮研磨成干粉，加500μl提取液(50mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.0；10mmol/L巯基乙醇；1mmol/L EDTA，pH8.0；0.1％月桂酸肌氨酸钠；0.1％ Triton X-100)，13,000rpm离心10分钟，上清液用于GUS活性及蛋白浓度测定。取5μl酶提取液加入到45μl检测液中(酶提取液中加入2mmol/L 4-甲基伞型酮酰--葡萄糖醛酸苷[4-Methyl umbelliferyl β-D glucuronide，MUG])，立即混匀，快速取5μl反应混合液，加入到195μl反应终止液(0.2mol/L Na2CO3)中，混匀，即酶活性测定0点；反应混合液于37℃保温，一小时后取5μl反应混合液加入到195μl反应终止液中终止反应；用Tecan GENios荧光分光光度计(激发光波长为365nm，发射光为455nm)测定每个样品的荧光强度，计算反应生成的4-甲基伞型酮(4-methylumbelliferone，MU)的量；按照Bradford方法，用Tecan GENios测定样品中蛋白含量；计算样品中GUS活性，GUS活性＝单位时间内反应生成的MU/蛋白量(单位：pmolMU·mg-1·min-1)，结果如图3所示，结果表明随着启动子长度的缩短，GUS酶活性逐渐降低，表明启动子的驱动GUS报告基因表达的能力降低。
二、种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测
1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因AtL1L的克隆
根据核苷酸序列(GenBank号：AB025628.1)设计引物P1和P2，用于扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)哥伦比亚生态型(Col-0)中的调控植物脂肪酸代谢的转录因子基因，引物序列如下：(划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基)
P1(AtL1L上游引物)：5′-TTAGTCGACCACAAACACAAAAGTCGTGT-3′
P2(AtL1L下游引物)：5′-CGAGGATCCGCAAAACTAATGCTTTATTGA-3′
用TRIZAL试剂(购自Invitrogen公司)并参照试剂盒说明书提取拟南芥哥伦比亚生态型(Col-0)新鲜果荚的总RNA，然后用Invitrogen公司的SuperScriptTM IIReverse Transcriptase试剂盒并参照试剂盒说明书反转录合成其第一链cDNA，再以所合成的cDNA为模板，在引物P1和P2的引导下进行PCR扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约0.8Kb的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中，再将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM-AtL1L，对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO：2的序列，序列2由937个碱基组成，包括38个碱基的5′UTR区，其编码序列为自5′端第39-743位碱基，自5′端第219-416位碱基编码NF-YB结构域。自5′端第744-937位碱基为该基因组基因的3′非编码区。将该基因命名为AtL1L，将其编码蛋白命名为AtL1L，该基因蛋白的框架结构图见图1。
2、用D4和D6启动子驱动AtL1L表达的转基因载体的构建
挑选步骤二的步骤1中的序列正确的pGEM-AtL1L阳性克隆，大量制备质粒DNA，用从NEB公司购得的Sal I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收AtL1L基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pCAMBIA-2300(简称pC2300)(CAMBIA公司，http://www.cambia.org/daisy/cambia/585.html)连接，形成pC2300::AtL1L的中间载体。
然后把步骤一中步骤2得到的pGEM-D4、pGEM-D6正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，经HindIII/Sal I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D4、D6启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pC2300::AtL1L中间载体连接，形成pC2300-D4::AtL1L和pC2300-D6::AtL1L的最终载体。
热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定，表达载体的构建图，见图4。
3、转基因油菜的获得
1)转化农杆菌
将步骤2得到的表达载体(pC2300-D4::AtL1L和pC2300-D6::AtL1L)分别用电激转化方法转入不同的农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。然后，所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀，得到含有pC2300-D4::AtL1L的转化液和含有pC2300-D6::AtL1L的转化液。
2)转化油菜
A、转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜
把上述含有pC2300-D4::AtL1L的转化液转入塑料袋中，将已经去掉果荚和花的中油821油菜花序浸泡在转化液中；浸泡时间为1分钟为宜，浸泡期间不停晃动浸染液。为提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的油菜培养，得油菜种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗)，至此获得转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜。
B、转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜
按照上述步骤A的方法，将含有pC2300-D4::AtL1L的转化液换成含有pC2300-D6::AtL1L的转化液，将油菜品种换成Westar油菜(Chandler，S.F.，and Thorpe，T.A.(1987).Characterization of Growth，Water Relations，and Proline Accumulation inSodium Sulfate Tolerant Callus of Brassica napus L.cv Westar(Canola).Plant Physiol84，106-111.)，其余操作完全相同，得到转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜。
4、转基因油菜的检测
A、转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜的检测
以非转基因中油821为野生型对照1。
将转基因油菜苗培养，得到T1代种子，对T1代种子(转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜和野生型对照1)进行含油量的测定与计算，其中含油量＝种子油脂(质量)/种子干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECTOR22/N型傅立叶变换近红外光谱仪测定，运用OPUS 5.5软件进行分析得到的。光谱采集条件：分辨率8cm-1，扫描次数32次，谱区范围12000-4000cm-1，室温23-25℃。测定结果如图5所示，用D4启动子驱动AtL1L过表达，转pC2300-D4::AtL1L的转基因油菜的种子含油量高于野生型对照1的种子含油量。
B、转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜的检测
以非转基因Westar油菜为野生型对照2。
将转基因油菜苗继代培养，得到T1代种子，对T1代种子(转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜和野生型对照2)进行含油量的测定，测定方法同上述步骤A。测定结果如图6所示，用D6启动子驱动AtL1L过表达，转pC2300-D6::AtL1L的转基因油菜的种子含油量高于野生型对照2的种子含油量
以上可知，D4和D6启动子驱动AtL1L过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。
实施例2、种子含油量高的转基因油菜的获得及其检测
1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因BnLEC1的克隆
根据拟南芥L1L的核苷酸序列(GenBank号：AB025628)设计引物P3和P4，用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的调控种子脂肪酸代谢的转录因子BnLEC1基因基因组DNA序列，引物序列如下：
P3(BnLEC1上游引物)：5′-TTAGTCGACCGAGGACGGCAGAGAAACAAT-3′
P4(BnLEC1下游引物)：5′-CGAGGATCCTTTACTAGTTCACTTATACTG-3′
用CTAB法提取油菜中油821基因组DNA，在引物P3和P4的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约为1.8Kb的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中。将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM-BnLEC1。对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO.3的核苷酸序列，包括19个碱基的5′UTR区，3′UTR区为1889到1898位碱基。自5′端第20-72位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第73-1246位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第1247-1889位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第1889-1898位碱基为该基因组基因的3′非编码区。将该基因命名为BnLEC1，将其编码蛋白命名为BnLEC1，该基因蛋白一级结构中所含保守的NF-YB结构域简图，见图7。
2、用D7启动子驱动BnLEC1表达的转基因载体的构建
挑选实施例2中步骤1中pGEM-BnLEC1序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，用从NEB公司购得的Sal I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收BnLEC1基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pCAMBIA-2300(简称pC2300)连接，形成pC2300::BnLEC1的中间载体。
然后分别把实施例1中步骤一中步骤2得到pGEM-D7正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，经HindIII/Sal I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pC2300::BnLEC1中间载体连接，分别形成pC2300-D7::BnLEC1的最终载体。
热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。表达载体的构建图，见图8。
3、转基因油菜的获得
1)转化农杆菌
将步骤2得到的表达载体pC2300-D7::BnLEC1用电激转化方法转入农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20ml LB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。然后，所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀，得到含有pC2300-D7::BnLEC1的转化液。
2)转化油菜
转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜
把含有pC2300-D7::BnLEC1的转化液转入塑料袋中，将已经去掉果荚和花的油菜花序(该油菜是Westar)浸泡在转化液中，浸泡1分钟为宜，浸泡期间不停晃动浸染液。为提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的油菜培养，得油菜种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗，至此获得转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜。
4、转基因油菜的检测
以非转基因油菜Westar为野生型对照。
将转基因油菜苗培养，得到T1代种子，对T1代种子(转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜和野生型对照)进行含油量的测定与计算，其中含油量＝种子油脂(质量)/种子干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECTOR22/N型傅立叶变换近红外光谱仪测定，运用OPUS 5.5软件进行分析得到的。光谱采集条件：分辨率8cm-1，扫描次数32次，谱区范围12000-4000cm-1，室温23-25℃。测定结果如图9所示，D7启动子驱动BnLEC1过表达，转pC2300-D7::BnLEC1的转基因油菜种子含油量高于Westar野生型对照种子含油量，说明D7启动子驱动BnLEC1过量表达后可以提高油菜种子中的含油量。
实施例3、种子含油量高的转基因拟南芥和转基因油菜的获得及其检测
1、调控种子脂肪酸代谢的转录因子基因BnL1L的克隆
根据拟南芥L1L的核苷酸序列(GenBank号：AB025628)设计引物P5和P6，用于扩增十字花科芸薹属甘蓝油菜(Brassica napus L.)中的调控种子脂肪酸代谢的转录因子BnL1L基因基因组DNA序列，引物序列如下：(酶切位点划线为酶切位点，前面三个碱基为保护碱基)
P5(BnL1L上游引物)：5′-TTAGTCGACAGGGTTTGGTGATTGGGATC-3′
P6(BnL1L下游引物)：5′-CGAGGATCCGGTATGCGTTGAAGCTCCTC-3′
用CTAB法提取油菜中油821基因组DNA，在引物P5和P6的引导下进行PCR扩增。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，用购自鼎国公司的DNA回收试剂盒回收长度约为1.1Kb的目的片段并对其进行纯化，将回收片段连接入到载体pGEM-Teasy(Promega公司)中。将连接产物用热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将其接种于含50mg/L氨苄青霉素的5mL LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养12-16小时，提质粒，得到含有回收片段的重组质粒，命名为pGEM-BnL1L。对其进行测序，测序结果表明扩增片段具有序列表中的SEQ ID NO.4的核苷酸序列，包括260个碱基的5′端非编码区，3′端非编码区为911到1170位碱基。自5′端第216-276位碱基为该基因组基因的第一个外显子，自5′端第277-341位碱基为该基因组基因的第一个内含子，自5′端第342-910位碱基为该基因组基因的第二个外显子，自5′端第911-1170位碱基为该基因组基因3′非编码区。将该基因命名为BnL1L，将其编码蛋白命名为BnL1L，该基因蛋白一级结构中所含保守的NF-YB结构域简图，见图10。
2、用D0、D6和D7启动子驱动BnL1L表达的转基因载体的构建
挑选实施例3中步骤1中pGEM-BnL1L序列正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，用从NEB公司购得的Sal I/BamH I双酶切得到基因插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收BnL1L基因片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过Sal I/BamH I(购于NEB公司)双酶切过的pCAMBIA-2300(简称pC2300)连接，形成pC2300::BnL1L的中间载体。
然后分别把实施例1中步骤一中步骤2得到pGEM-D0、pGEM-D6和pGEM-D7正确的阳性克隆，大量制备质粒DNA，经HindIII/Sal I双酶切得到启动子插入片段，用胶回收试剂盒(购自鼎国公司)回收D0、D6和D7启动子片段，纯化后的片段用T4连接酶(Roche公司)与经过相同酶切过的pC2300::BnL1L中间载体连接，分别形成pC2300-D0::BnL1L、pC2300-D6::BnL1L和pC2300-D7::BnL1L的最终载体。
热激法转化大肠杆菌(E.coli)DH5α菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养12-16小时，提取质粒，进行PCR鉴定和酶切鉴定。表达载体的构建图，见图11。
3、种子含油量高的转基因油菜的获得
1)转化农杆菌
将步骤2得到的表达载体(pC2300-D0::BnL1L、pC2300-D6::BnL1L和pC2300-D7::BnL1L)用电激转化方法转入农杆菌中。挑取转基因农杆菌单菌落接种于20mlLB液体培养基(含卡那霉素50mg/L，利福平50mg/L)中，28℃，150rpm振荡培养2天。然后，所获菌液以2％接种量接菌于含有利福平和卡那霉素的300ml LB培养基，按照上述条件振荡培养16-18小时。所获菌液经5,000rpm、20分钟离心收集菌体，菌体重悬于250ml含有5％蔗糖和Silwet L-77转化液中，慢慢摇匀，分别得到含有pC2300-D0::BnL1L、pC2300-D6::BnL1L和pC2300-D7::BnL1L的转化液。
2)转基因油菜中油821的获得
本步骤所指的油菜品种是中油821。
把含有pC2300-D0::BnL1L的转化液和含有pC2300-D6::BnL1L的转化液分别转入塑料袋中，将已经去掉果荚和花的油菜花序浸泡在转化液中，浸泡1分钟为宜，浸泡期间不停晃动浸染液。为提高转化效率，隔两天后可重复浸染转化一次，共转化三次。将转化后的油菜培养，得油菜种子，将油菜种子在含卡那霉素的培养基中培养，长出绿叶和根系的苗为转基因油菜苗，至此获得转pC2300-D0::BnL1L的转基因油菜和转pC2300-D6::BnL1L的转基因油菜。
a、转pC2300-D0::BnL1L的转基因油菜种子含量检测
以非转基因油菜中油821为野生型对照。
将转基因油菜苗继代培养，得到T1代种子，对T1代种子(转pC2300-D0::BnL1L的转基因油菜和野生型对照)进行含油量的测定与计算，其中含油量＝种子油脂(质量)/种子干重(质量)。种子油脂的质量是采用德国BRUKE公司的VECTOR22/N型傅立叶变换近红外光谱仪测定，运用OPUS 5.5软件进行分析得到的。光谱采集条件：分辨率8cm-1，扫描次数32次，谱区范围12000-4000cm-1，室温23-25℃。
测定结果如图12所示，D0启动子驱动BnL1L表达，由于BnL1L表达量过高，使得转基因油菜种子中的油含量低于非转基因野生型对照中油821。
b、转pC2300-D6::BnL1L的转基因油菜种子含量检测
将转pC2300-D6::BnL1L的转基因油菜和野生型对照的T1代种子按照上述的测定方法进行含油量的测定，测定结果如图13所示，用D6启动子驱动BnL1L过表达，转基因油菜种子含油量高于中油821野生型对照的种子含油量。
3)转基因油菜Westar的获得及其种子含油量的检测
本步骤所指的油菜品种是Westar。
按照步骤2)中获得转基因油菜中油821的方法，制备转pC2300-D6::BnL1L的转基因油菜Westar和转pC2300-D7::BnL1L的转基因油菜Westar。
a、转pC2300-D6::BnL1L的转基因油菜种子含油量检测
转基因油菜Westar的含油量检测
以非转基因油菜Westar为野生型对照。
将转pC2300-D6::BnL1L的转基因油菜和野生型对照的T1代种子按照步骤2)的测定方法进行含油量的测定，测定结果如图14所示，用D6启动子驱动BnL1L过表达，转基因油菜种子含油量高于野生型对照的种子含油量。
b、转pC2300-D7::BnL1L的转基因油菜种子含油量检测
将转pC2300-D7::BnL1L的转基因油菜和野生型对照的T1代种子按照步骤2)的测定方法进行含油量的测定，测定结果如图15所示，用D7启动子驱动BnL1L过表达，转基因油菜种子含油量高于野生型对照的种子含油量。
4、种子含油量高的转基因拟南芥的获得
将实施例3的步骤2得到的pC2300-D0::BnL1L和pC2300-D7::BnL1L按照步骤一的步骤2的步骤2)提供的方法导入拟南芥Col-0，制备出转pC2300-D0::BnL1L的转基因拟南芥和转pC2300-D7::BnL1L的转基因拟南芥。
1)转pC2300-D0::BnL1L的转基因拟南芥的检测
a、转pC2300-D0::BnL1L的转基因拟南芥的幼苗表型
将转pC2300-D0::BnL1L的转基因拟南芥种子进行卡那霉素筛选，得到阳性转基因植株，将阳性植株的种子播在MS培养基上，以Col-0非转基因野生型种子作为对照，在培养条件为22℃，光照强度80-120μE-2S-1，16小时光照的温室中培养。转基因拟南芥种子在MS培养基上萌发生长12天的表型为发育相对迟缓，幼苗相对弱小，幼苗期没有子叶或子叶变小，见图16。说明转pC2300-D0::BnL1L的转基因拟南芥种子胚胎在发育时受到影响，导致胚胎发育异常，从而影响幼苗的生长发育，导致子叶消失或子叶变得短小。
b、种子含油量测定
以非转基因Col-0为野生型对照。
分别取同批次转pC2300-D0::BnL1L的转基因拟南芥和野生型对照种子各100毫克，在液氮中研磨成干粉，然后转移到带密封盖的试管中，加入3ml甲醇(含2.5％，v/v)，在80℃水浴加热90分钟.再加入4.5ml 0.9％NaCl和1ml正己烷，混匀，4,000rpm离心10分钟，收集正己烷相。真空抽干正己烷，用100μl乙酸乙酯溶解真空干燥残留物，取1μl上样分析。所用GC/MS仪为TurboMass(PerkinElmer公司)，所用GC柱为30m×0.25mm BPX-70柱，GC升温程序为：初始温度120℃，保持1分钟，以每分钟10℃的速率升至150℃，然后以每分钟4℃的速率升温至230℃，保持10分钟.以C17:0的三酯酰甘油作内标。
结果如图17所示，D0::BnL1L转基因拟南芥种子含油量明显低于Col-0非转基因野生型种子含油量。
2)转pC2300-D7::BnL1L的转基因拟南芥的检测
以非转基因Col-0为野生型对照。
按照步骤4中测转pC2300-D0::BnL1L的转基因拟南芥种子含油量的方法，测定转pC2300-D7::BnL1L的转基因拟南芥和野生型对照中种子的含油量。
结果如图18所示，转pC2300-D7::BnL1L的转基因拟南芥的种子含油量明显高于Col-0非转基因野生型种子含油量。
上述结果表明D7启动子驱动BnL1L适度过量表达后可以显著提高拟南芥种子的含油量，而D0启动子驱动BnL1L由于表达量过高反而使得拟南芥种子中的含油量下降。
序列表
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>来源于甘蓝油菜的启动子及其应用
<160>4
<210>1
<211>1145
<212>DNA
<213>甘蓝油菜(Brassica napus)
<400>1
aagctttctt catcggtgat tgattccttt aaagacttat gtttcttatc ttgcttctga 60
ggcaagtatt cagttaccag ttaccactta tattctggac tttctgactg catcctcatt 120
tttccaacat tttaaatttc actattggct gaatgcttct tctttgagga agaaacaatt 180
cagatggcag aaatgtatca accaatgcat atatacaaat gtacctcttg ttctcaaaac 240
atctatcgga tggttccatt tgctttgtca tccaattagt gactacttta tattattcac 300
tcctctttat tactattttc atgcgaggtt gccatgtaca ttatatttgt aaggattgac 360
gctattgagc gtttttcttc aattttcttt attttagaca tgggtatgaa atgtgtgtta 420
gagttgggtt gaatgagata tacgttcaag tgaagtggca taccgttctc gagtaaggat 480
gacctaccca ttcttgagac aaatgttaca ttttagtatc agagtaaaat gtgtacctat 540
aactcaaatt cgattgacat gtatccattc aacataaaat taaaccagcc tgcacctgca 600
tccacatttc aagtattttc aaaccgttcg gctcctatcc accgggtgta acaagacgga 660
ttccgaattt ggaagatttt gactcaaatt cccaatttat attgaccgtg actaaatcaa 720
ctttaacttc tataattctg attaagctcc caatttatat tcccaacggc actacctcca 780
aaatttatag actctcatcc ccttttaaac caacttagta aacgtttttt tttttaattt 840
tatgaagtta agtttttacc ttgtttttaa aaagaatcgt tcataagatg ccatgccaga 900
acattagcta cacgttacac atagcatgca gccgcggaga attgtttttc ttcgccactt 960
gtcactccct tcaaacacct aagagcttct ctctcacagc acacacatac aatcacatgc 1020
gtgcatgcat tattacacgt gatcgccatg caaatctcct ttatagccta taaattaact 1080
catccgcttc actctttact caaaccaaaa ctcatcaata caaacaagat taaaaacata 1140
cacga 1145
<210>2
<211>937
<212>DNA
<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)
<400>2
cacaaacaca aaagtcgtgt atttagaaca agaaagatat ggaacgtgga ggcttccatg 60
gctaccgcaa gctgtccgtg aacaacacca ctccttctcc accaggatta gcagcgaatt 120
ttctgatggc agagggcagt atgcgtcctc cagaattcaa ccagcctaac aaaaccagta 180
atggtggtga ggaggagtgc acggtgaggg agcaagacag gttcatgcct attgccaacg 240
tgatacggat catgcggagg atcttacctg ctcacgccaa gatctcagat gactccaagg 300
agacgatcca agagtgtgtt tcggagtaca tcagcttcat aacaggggag gctaatgagc 360
ggtgccagcg ggaacagcgc aagaccatca ctgctgagga cgtcttgtgg gcaatgagca 420
agctcggttt tgatgactac atcgaacccc tcacgttgta cctccaccgc tacagagagt 480
tggaaggtga aagaggggtt agctgcagtg ctgggtccgt tagtatgacc aacggcttgg 540
tggtcaagag gcctaatggg accatgaccg agtatggagc ctacgggcct gtgccaggga 600
ttcacatggc gcagtaccat tatcgtcatc agaacgggtt tgttttcagt ggtaacgaac 660
ctaattctaa gatgagtggt tcatcttcag gagcaagtgg cgccagagtt gaagtatttc 720
cgactcaaca acataagtac tgagaacaat ggctaataac atagacagct gacagagtca 780
taactgttag taggtgcaag ctgtagctta tgaattcaag tttaagcgaa aacaatgctg 840
ctttttcttt gtttattatc tatctagttg aaagaacatt gtgtttttca tctgatctgt 900
cttgtggtaa agtatgtcaa taaagcatta gttttgc 937
<210>3
<211>1898
<212>DNA
<213>甘蓝油菜(Brassica napus L.)
<400>3
cgaggacggc agagaaacaa tggaacgtgg agctcctctc tctcactatc agctacccaa 60
atctaactct ggtaatcaaa taataagtgc ctatttatgt atatacgtgc ctgcactatg 120
tatactcacg aatcataaac ttgttttgag attttttgta tatcaacaaa gaactagaga 180
ctttcatgtc ttcttaaaac agtagagatt tttatttctt agattttttt aaaggtacgg 240
agaagagtct actcacatgc aagacgctta tatatatatg catgcatgaa tgagtttgat 300
atatctatat atttatttgc atattcgtgt atacatccaa gcaggaacca atccttaatt 360
caaatatttc gtgatatggt atataagaac aatttttaat gggggatgat agatcttcat 420
atgtttgtcc attgacaata ccggtgcatg cacaagaaat attgagtttc gatttctttt 480
tctatctttt agatttatat tctggctttt taaaaatata gaggtgggaa ttgtatgtgt 540
tggtttagtt taaaggccga ctcaaaatct aaaaaaactt aatttatttt caattggaaa 600
tattaaatta ctcttatgat attttcttta ttagtttatt cgctttactg taacggttgt 660
tttttttttc gtttcaaaac gaaattctcg tttgtccaac ctgatttgga aatatccaat 720
gaatctaaat acacttttta gccaaatata atataaatac tattgtaaac tcctctattt 780
aaagccaaaa aagtaatata aatatattgt aattctagtt cacaggggat gaaatcgttt 840
cacctaatcc aaatcgtttt attaattagt aaaagaattg gttaaccaat aaccaacttt 900
aattcttttt aagtaataaa acaaattttg aattaagcaa gctagaaatt tgacaaagaa 960
aattgggaat acgcgctgta cttgtaaaat catcaaattt caagtatttc gagaagtgga 1020
aagatccttt tgactttttc gttctatgaa tgtaaacgta acgtcaagaa tctgaacagt 1080
ctacataatg gaaccgggac ctgtaaactt atcttttatc ttattggtta ggacttaact 1140
aagcacgtgt cttcacttga tagtcctcgt tttcaactat taaatccgct ttctaaaaat 1200
gtaatttcat ttagtattcc aaacaacttc aatttatgta aacaggactg aacttggacc 1260
agcacaacaa ctcaatcccg acaatgaccg gctccatcgg tgcatgcgac gacaagaaca 1320
agactatctt gccgcagcaa caaccaagca tgcctcgtga gcaagaccaa tacatgccaa 1380
tcgcaaacgt gataaggatc atgcgtaaaa tcttaccgcc acacgccaaa atctctgacg 1440
acgcaaaaga aacgattcaa gaatgcgtct ccgagtacat cagcttcgtg accggtgaag 1500
ctaacgagcg ttgccaacgt gagcaacgta agacaataac tgctgaagat atcctttggg 1560
caatgagcaa acttgggttc gatgattacg ttggaccact caacgtgttc attaaccggt 1620
accgtgagtt cgagaccgat cgtgggtgtt cacttagagg tgagtcatca tttaaaccgg 1680
tctatggagg aagtggtatg gggtttcacg gcccacctcc accgggttct tatggttatg 1740
gtatgttgga tcagtctatg gtcatgggtg gtggtcggta ctaccataac ggatcgggtc 1800
cggatggatc agtaggtggt ggcggtggat cttcctcttc tatgaatgga atgccggtta 1860
attatgacca gtatggtcag tataagtgaa ctagtaaa 1898
<210>4
<211>1170
<212>DNA
<213>甘蓝油菜(Brassica napus L.)
<400>4
agggtttggt gattgggatc ttgtaacgcc tgtgggagac gaaaaggatc atcggttaca 60
tcgactgtga ctgacacgtt cttgagcttg tgaggtctgc aattacatat gctgacactt 120
gccaaaaaaa ttttagtttt attctttcta tctctcttta tcttcttgtt ttcttcaaat 180
gcacaaacac aagctcgtgg ctttgaagaa aggatatgga acgtggaggc ttccatggct 240
acggcaagtt ctccctcaac accaccacca atccaggtaa tgttatttta agttgcatgt 300
gaaaacattc tctcatgttg taattcttcc aatgttacca gggaagcttt tgatggcaga 360
gagcggcatg cagctaccag aacccaacca gcctaccaaa accgctaacg gcggccaaga 420
ggagtgcacg gtgagagagc aagacaggtt catgcctatc gccaacgtga tacggatcat 480
gcggaggatc ttacctgctc acgccaagat ctctgacgac tccaaggaga cgatccaaga 540
gtgtgtctcc gagtacatca gcttcgtaac aggggaggcc aatgagcgtt gccagcggga 600
acagcgcaag accatcactg ccgaggatgt cttgtgggca atgagcaagc tcggttttga 660
tgattacatc gaacccttaa cattgtatct ccaccgctac agagagttgg agggtgatag 720
aggagtaaac tgcggtgttg gatccgttag tatgaccaat ggcatggtgc tcaagaggcc 780
taatggtacc atggccgagt atggtcccta cgggactatg gcgccgtacc gttatcatca 840
tcagaacggg tttgcttaca gtggtaacga ccctaattct aaaatgggtg gttcatcatc 900
tagtttttga acacaaagtt ttcaagcaaa aaaacaatga tgctttgtct ctatgtatct 960
tctccttgaa cgaacctagt gttttcattt gatcttttca tgtgataaac tgtgtcaata 1020
aagcattagg ttccaaacag cacgattgtg atcttgactc aacataaata aaaggactta 1080
aaacattcaa aattcaaatt ctcagctaca gaacagatat gcataatctt catttagcta 1140
ccactttcca gaggagcttc aacgcatacc 1170
Claims (9)
1.一种启动子，其核苷酸序列是序列表中序列1的自5’端第832-1145位所示的核苷酸序列。
2.一种启动子，其核苷酸序列是序列表中序列1的自5’端第872-1145位所示的核苷酸序列。
3.一种启动子，其核苷酸序列是序列表中序列1的自5’端第891-1145位所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求1-3任一所述的启动子的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是权利要求1-3任一所述的启动子与下述1)或2)或3)的基因一起插入载体pCAMBIA-2300的多克隆位点制成的重组载体：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
6.含有权利要求1-3任一所述的启动子的转基因细胞系。
7.含有权利要求1-3任一所述的启动子的重组菌。
8.权利要求1-3任一所述的启动子在驱动目的基因在种子组织中特异表达中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述目的基因是下述1)或2)或3)的基因：
1)其核苷酸序列是序列表中的序列2；
2)其核苷酸序列是序列表中的序列3；
3)其核苷酸序列是序列表中的序列4。
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| jinye Mu et al..Leafy cotyledon1 is a key regulator of fatty acid biosynthesis in arabidopsis.《plant physiology》.2008,第148卷 * |
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