CN101193550A - 生产和培育具有提高的磷利用的植物的方法 - Google Patents

生产和培育具有提高的磷利用的植物的方法 Download PDF

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Abstract

公开了对于外源甘油－3－磷酸脱氢酶而言为转基因的植物，该植物具有提高的磷利用，以及生产该植物的方法，和在磷含量降低的土壤中培育该植物的方法。与野生型相比，转基因植物具有提高水平的甘油－3－磷酸，其导致提高的胁迫耐受性，甘油酯中改变的脂肪酸含量以及对磷缺乏土壤的耐受性。

Description

生产和培育具有提高的磷利用的植物的方法
相关申请的交叉参考
本申请要求2005年05月04日提交的11/122,943的优先权，其是2002年07月19日提交的待审美国专利申请10/088,079的部分继续申请，10/088,079要求2000年09月21日提交的PCT国际申请PCT/CA00/01096的优先权，该PCT国际申请对应于2001年03月29日以英语公开的WO 01/21820，其本身要求1999年09月22提交的美国临时申请60/155,133的优先权，其中每个申请的内容都引入这里作为参考。
技术领域
本发明涉及生物技术。更特别地，本发明涉及植物遗传工程领域。更具体地说，本发明涉及生产和培育具有提高的磷利用的转基因植物的方法。
背景技术
磷(P)是植物生长，发育和繁殖所必需的营养素。氮之后，P被认为是限制农业生产的第二种最重要的营养素。尽管土壤中磷的总量可能比较高，但是它常常以植物摄取不可利用的形式存在。例如，Saskatchewan土壤天生可利用的P含量低，P在土壤的上部6英寸处为400到20001b/A，但是在生长季节期间只有极少量的总P是作物植物可利用的。为了减轻P缺乏并确保植物生产力，全世界每年几乎3千万吨的P肥料被应用于土壤(例如，在大约85％的Saskatchewan耕地中需要P肥料)。高达80％的来自肥料的P丧失，因为它变成固定的并且由于吸附，沉淀或转化成有机形态对于植物摄取是不可利用的。而且，近年来已经日益关注过度使用肥料，尤其是P对环境污染的影响。
P帮助植物储存和使用来自光合作用的能量以将养分传送给植物，和在细胞之间传送养分，并产生生长所需的糖，淀粉和蛋白质。响应无机P的限制，一些植物经历生理和发育适应以清除来自环境的有限的磷酸盐，包括减少它们的无机P消耗和调动它们的无机P贮存。磷脂是细胞无机P贮存的主要形式，而且在无机P饥饿期间它们的含量在植物中显著下降。在植物中，甘油-3-磷酸(G-3-P)是磷脂合成的专性前体。进一步地，G-3-P代谢反映了总的代谢网络的扰乱。
G-3-P合成酶，NAD+依赖性甘油-3-磷酸脱氢酶，可能是胞质与线粒体之间的代谢连接，其是细胞氧化还原控制必要的和不可缺少的。因此，G-3-P代谢，尤其是胞质G-3-P脱氢酶的活性是植物胁迫耐受性的许多方面，包括无机P限制适应的关键。
甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)(EC 1.1.1.8)是原核生物和真核生物必需的酶。使用NADH作为还原当量，GPDH催化磷酸二羟丙酮(DHAP)还原为甘油-3-磷酸(G-3-P)。植物细胞具有GPDH的至少两种同工型，一种位于质体上，另一种位于胞质中1。已经报道了从菠菜中纯化胞质GPDH2。由GPDH催化的反应的产物，G-3-P，是所有甘油脂种类，包括膜和贮存脂合成的前体。细菌中该酶的生物合成作用，体内通过缺乏其活性的大肠杆菌突变株的甘油和G-3-P营养缺陷型的分离建立3。这些突变体在缺乏补充的G-3-P时不能合成磷脂。
没有GPDH活性缺陷的植物突变体的报道。
除了对于脂生物合成是必需的之外，GPDH还参与几种其他重要的生物过程。最值得注意的是，GPDH，通过消耗NADH和再生NAD+，在保持细胞的氧化还原状态中起重要作用。NAD+/NADH对起着作为细胞氧化还原反应中还原当量的储存器和载体的重要作用。为了进行分解代谢反应，NAD+/NADH的比例应该较高。在正常的有氧条件下，过量的NADH被导入线粒体中并通过呼吸被消耗。在缺氧情况下，GPDH反应用作氧化还原阀以除掉额外的还原力。这样，细胞的NAD+/NADH比例可以被维持在允许分解代谢过程进行的水平。在啤酒糖酵母中，GPDH基因的表达易受氧化还原控制并由无氧条件诱导。GPD2基因(GPDH的两种同工型中的一种)的缺失导致在缺氧情况下的缺陷生长4。
在啤酒糖酵母中，GPDH也显示出在适应渗透胁迫中起重要作用。GPDH在渗透和盐浓度胁迫响应中通过它在甘油合成中的功能发挥它的作用。甘油是一种已知的渗透保护剂。它通过特异性甘油3-磷酸酶所引起的脱磷酸作用由G-3-P产生。为了响应高的外部渗透环境，酵母细胞积累甘油以补偿细胞外与细胞内水势之间的差异5。GPDH基因，GPD1的表达已经证明是渗透响应性的。一种啤酒糖酵母菌株，其中GPD1基因已经缺失，对NaCl超敏感7。在一些嗜盐绿藻，包括杜氏藻属，虫黄藻科，Asteromonas和Chlamydonas reinhardtii中已经报道了甘油作为渗透调节溶质的积累8。
已经报道了植物Cuphea lanceolata的编码GPDH活性的cDNA的序列。编码的蛋白质暂时被指定为胞质同工型。
迄今为止，还没有关于植物GPDH的遗传操作的报道。
发明概述
发明人意外地发现，能过量表达甘油-3-磷酸脱氢酶的转基因植物在磷(P)限制条件下能较好地生长。因此，开发这里描述的转基因植物表示一种获得更能持续的农业的方式，其可有助于满足人们不断增加的对食物的需求。而且，具有增强的P获得能力的转基因植物，其更有效的利用P，对于不能提供商品P肥料的供给粮食的农场应该是极为重要的并且帮助降低商业农场的成本。
在一个实施方案中，一种大肠杆菌基因，编码在强组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S启动子的转录控制下的G-3-P脱氢酶的gpsA，被用于在拟南芥和芸苔中产生转基因植物，以生产具有比野生型植物高几倍的G3P水平的转基因植物。在该转基因植物中，调节原核生物与真核生物的甘油脂途径之间的甘油脂生物合成代谢通量来响应G-3-P变化。与野生型植物相比，较高的细胞膜脂分子比例来源于质体原核生物甘油脂途径，其主要产生单半乳糖二酰甘油(MGDG)和双半乳糖二酰甘油(DGDG)。从而，转基因植物中磷脂对非磷脂的比例降低。因此，虽然使用较少的P用于膜脂生物合成，但是这些转基因植物能保留细胞活性。结果表明，当与对照相比较时，转基因植物(拟南芥和油菜)产生更多的叶子和种子生物量，同时叶绿素含量较高，当在P限制条件下生长时，其产生较少的花色素苷(anthocynines)和淀粉。这些结果表明，转基因植物对P限制更能复原。
在一个实施方案中，一种用于培育转基因植物，植物种子，或其后代的方法包括种植具有掺入基因组中的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具的转基因植物，植物种子或其后代。使该转基因植物，植物种子或其后代生长至成熟并收获成熟的转基因植物，植物种子或其后代的种子。
如这里使用的，短语“植物，植物种子或其后代”用于指植物或它的后代或种子。例如，“植物，植物种子或其后代”指植物的T1，T2和T3世代以及用无性繁殖方法生产的植物。
在另外的实施方案中，转基因canola植物，种子或其后代含有具有整合到基因组中的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具的基因组。编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因与启动子可操作地连接。
在另外的实施方案中，一种用于生产植物，植物种子或其后代的体系包括具有降低的磷含量的土壤和具有整合到基因组中的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具的转基因植物，植物种子或其后代。转基因植物，植物种子或其后代能在具有降低的磷含量的土壤中生长大约60天或植物的生长季节(或产生种子的时间)。
仍然在另外的实施方案中，一种用于降低培育作物植物所需的磷量的方法包括获得能在具有降低的磷含量的土壤中生长至少60天或产生作物植物的时间的转基因作物植物，植物种子或其后代，并在土壤中种植该转基因作物植物，植物种子或后代。
如这里使用的，短语“编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因”用于指编码gpsA基因的基因。在一个实施方案中，gpsA基因是原核生物来源的。在另一个实施方案中，gpsA基因是细菌来源的。gpsA基因的示例性实施方案包括，但不限于，来源于大肠杆菌(E.coli)(SEQ ID NO：1)，弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(SEQ ID NO：7)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(SEQ ID NO：9)，肠沙门氏菌(Salmonella enterica)(SEQ ID NO：11)，鼠疫耶尔森氏菌(Yersinis pestis)(SEQ ID NO：13)，假结核耶尔森氏菌(Yersinispseudotuberculosis)(SEQ ID NO：15)，粘质沙雷氏杆菌(Serratiamarcescens)(SEQ ID NO：17)，Photorhabdus luminescens(SEQ IDNO：19)，胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)(SEQ ID NO：21)的那些基因或其保守性置换。编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具也包括示例性gpsA基因的变体或突变体，其编码具有或拥有与野生型或突变型gpsA基因所编码的甘油-3-磷酸脱氢酶相同的功能的蛋白质。例如，基因中的沉默突变和保守性置换已知是存在的，而且，仍然，编码具有野生型基因相同功能的蛋白质。在另一个实施方案中，编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶蛋白的核苷酸序列，该蛋白具有来源于大肠杆菌(SEQ ID NO：2)，弗氏志贺氏菌(SEQID NO：8)，鼠伤寒沙门氏杆菌(SEQ ED NO：10)，肠沙门氏菌(SEQ IDNO：12)，鼠疫耶尔森氏菌(SEQ ID NO：14)，假结核耶尔森氏菌(SEQ ID NO：16)，粘质沙雷氏杆菌(SEQ ID NO：18)，Photorhabdusluminescens(SEQ ID NO：20)，胡萝卜软腐欧文氏菌(SEQ ID NO：22)的氨基酸序列或其保守性置换。
在另一个实施方案中，公开了一种生产具有较低P的作物植物的方法。该方法包括种植能过量表达甘油-3-磷酸脱氢酶的转基因种子。在一个实施方案中，转基因种子包含编码原核生物，细菌，真核生物，酵母或植物来源的甘油-3-磷酸脱氢酶蛋白的异源基因，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶蛋白的异源基因为转基因植物提供在具有降低的P含量的土壤中生长的能力。转基因种子能在具有降低的P含量的土壤中生长，而且，仍然以与野生型植物基本上相同的方式，在已经用P施肥的土壤或具有适合的P含量的土壤中生长。如这里使用的，术语“降低的磷含量”用于指需要外源的P或Pi来支持作物植物生长的土壤，或P含量小于大约百万分之二十(20ppm)的土壤。
仍然在一个另外的实施方案中，能过量表达甘油-3-磷酸脱氢酶，并因此在P含量降低的土壤中生长的转基因种子是市售的。转基因种子与指导转基因种子的用户支持转基因种子生长的土壤中所需的P含量的说明一起放在容器中销售。用这样的方式，转基因种子的用户能降低施用于土壤中的P肥料的含量，或甚至避免施用P肥料到土壤中，从而，降低转基因种子的用户的操作成本。
在一个实施方案中，表明了甘油-3-磷酸脱氢酶基因如gpsA的转基因的过量表达增加了G-3-P的含量，降低了磷脂的含量，并因此增强了植物对低Pi利用率的耐受性。作物植物类，如玉米，小麦，大豆，水稻，蔬菜，以及对低P利用率敏感的树种，也是用于引入参与G-3-P和磷脂代谢的基因的靶(作物植物)。
在一个实施方案中，公开了一种用于在植物中表达异源甘油-3-磷酸脱氢酶的方法。
在另一个实施方案中，描述了表达异源甘油-3-磷酸脱氢酶的植物，其中该异源甘油-3-磷酸脱氢酶经受比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶低的反馈抑制。
仍然在另外的实施方案中，公开了显示在它的甘油脂中脂肪酸含量改变的遗传改造植物。
在一个实施方案中，描述了与野生型植物相比，显示对渗透胁迫增强的耐受性的遗传改造植物。
仍然在另外的实施方案中，描述了与野生型植物相比，显示增强的胁迫耐受性的遗传改造植物。
在一个另外的实施方案中，本发明公开了一种表达异源甘油-3-磷酸脱氢酶的方法，该酶在植物中比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低，该方法包括提供含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶的DNA序列的载体，该甘油-3-磷酸脱氢酶比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低；并用该载体转化植物。
在另一个实施方案中，本发明描述了一种表达异源甘油-3-磷酸脱氢酶的植物，该异源甘油-3-磷酸脱氢酶比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低。
在一个实施方案中，本发明公开了一种生产在它的甘油脂中具有改变的脂肪酸含量的遗传改造植物的方法，该方法包括提供含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶的DNA序列的载体，该甘油-3-磷酸脱氢酶比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低；并用该载体转化植物。
在另外的实施方案中，本发明公开了一种生产具有增加的甘油和/或甘油-3-磷酸酯水平的植物的方法，该方法包括提供含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶的DNA序列的载体，该甘油-3-磷酸脱氢酶比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低；并用该载体转化植物。
在一个另外的实施方案中，本发明公开了一种生产相对于野生型，具有增强的胁迫耐受性的遗传改造植物的方法，该方法包括提供含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶的DNA序列的载体，该甘油-3-磷酸脱氢酶比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低；并用该载体转化植物。
在另外的实施方案中，本发明公开了一种生产相对于野生型，具有增强的渗透胁迫耐受性的遗传改造植物的方法，该方法包括提供含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶的DNA序列的载体，该甘油-3-磷酸脱氢酶比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低；并用该载体转化植物。
仍然在一个另外的实施方案中，本发明公开了一种增强植物中的细胞甘油-3-磷酸脱氢酶活性的方法，该方法包括提供含有编码甘油-3-磷酸脱氢酶的DNA序列的载体，该甘油-3-磷酸脱氢酶比野生型甘油-3-磷酸脱氢酶对反馈抑制的敏感性低；并用该载体转化植物。
仍然在另一个实施方案中，本发明公开了一种用于遗传转化植物的载体，其中该载体含有编码具有甘油-3-磷酸脱氢酶活性的蛋白的DNA，而且转化以后，该植物显示增强的甘油和/或甘油-3-磷酸酯产生。
附图简述
本专利或申请文件包含至少一幅以颜色制作的附图。带有彩色附图的本专利或专利申请出版物的副本经请求并支付必要的费用由专利局提供。
图1显示了大肠杆菌gpsA2FR基因的核苷酸序列和推断的氨基酸序列。点突变用*突出和表示；
图2显示了gpsA2FR植物转化载体，pGPSA-VI的图示，没有按比例绘制；
图3显示了选择的独立拟南芥转基因系中关于gpsA2FR基因的Southern印迹分析。
图4显示了在拟南芥转基因系中gpsA2FR基因表达的Northern印迹分析。
图5显示了选择的gpsA2FR转基因拟南芥系的叶脂肪酸分布。
图6显示了在有或没有225mM NaCl的1/2 MS培养基中，由选择的拟南芥转基因系产生的种子的发芽率。
图7显示了在补充了各种浓度的NaCl的1/2 MS培养基中，野生型拟南芥和转基因系#13种子的发芽率。
图8显示了在各种盐度胁迫程度下，土壤中生长的转基因植物的特性，如实验细节中详述的。
图9举例说明了拟南芥叶子中gpsA的G3P含量。
图10显示了拟南芥叶子中G3P代谢对磷脂含量的影响。
图11描述了gpsA转基因系的土壤生长的叶子中的磷含量。
图12举例说明了在低和高Pi培养基中发育的拟南芥的G3P和磷脂含量。
图13描述了转基因拟南芥gpsA系能耐受低Pi胁迫。
图14是表明拟南芥gpsA系能耐受低Pi胁迫的另一个实施方案。
图15是表明拟南芥gpsA系能耐受低Pi胁迫的一个另外的实施方案。使种子在高Pi条件(0.5mM)下生长于石棉中2周，并将籽苗移植到降低的Pi含量条件(4μm)10天。
图1 6描述了缺乏甘油-3-磷酸脱氢酶基因(AtGPDHc)的拟南芥突变体atgpdhcl-1具有低的G3P含量并对低Pi胁迫敏感。
图17举例说明了gpsA转基因canola能耐受低Pi胁迫。使籽苗生长于沙土中3周并每2天用+Pi溶液(100ml/盆)浇灌(图17A)。图17B显示了每天用无Pi溶液(80ml/盆)浇灌。图17A描述了在沙土中生长68天的canola籽苗，图17B举例说明了在沙土中生长100天的canola。
图18举例说明了表明gpsA转基因canola能耐受低Pi胁迫的另一个实施方案。将在沙土中生长4天的籽苗移植到含有0.5mM Pi的培养基中7天，然后每周将培养基转换为10μm和50μm，共2周。2周以后，每周将培养基转换为无Pi培养基直到植物成熟。
图19表明gpsA转基因canola在低Pi和低温条件下从早期生长阶段发育成大的植物结构。将种子种植在滤纸中并在8℃下用-Pi养分溶液浇灌16天。
发明的最佳模式
发明人对转基因植物应用的发现已经继续。例如，发明人发现了转基因拟南芥植物能具有增强的渗透胁迫耐受性和甘油脂中脂肪酸含量改变(参见，PCT国际公开WO 01/21820 A1，2001年03月29日公开，以其全部内容引入这里作为参考)。
由于它在脂生物合成，以及在胁迫响应中的作用，植物中增强的GPDH活性是需要的。在植物中过量表达植物或者非植物GPDH基因的转基因方法，原则上，可望增强GPDH活性。不过，将非植物基因插入到植物基因组中存在几个固有的优点。已充分确立了，将相同的植物基因引回到它的来源物种中，甚至在有义方向下，由于共抑制地会导致全部酶活性的降低。不同来源的基因(异源的)，特别是来自于进化上远缘相关物种的那些基因，可望免于这种阻碍。更重要地，相同酶促功能的蛋白质在不同的物种中常常通过不同的模式受到调控。异源酶可能免于抑制内源酶的控制因素。
本发明的方法中在植物中表达的异源酶可以是在植物中显示降低的甘油-3-磷酸酯产生抑制的任何甘油-3-磷酸脱氢酶。这种酶称为反馈缺陷的。在一个实施方案中，异源酶是具有单个氨基酸突变的甘油-3-磷酸脱氢酶。该突变不应当大大降低甘油-3-磷酸脱氢酶活性，但是应当降低甘油-3-磷酸酯对该酶的抑制。已经报道大肠杆菌gpsA基因的一个等位基因，gpsA2FR，编码反馈抑制缺陷的GPDH蛋白的一种改变型。在一个优选的实施方案中，本发明的方法使用含有基因gpsA2FR的载体。发明人鉴定了gpsA2FR序列中的一个点突变：gpsA中密码子255的第3个核苷酸中A被C取代。该突变导致编码的蛋白质中Glu255(GAA)取代为Asp255(GAC)。gpsA2FR基因的序列和该基因的推断的氨基酸序列显示于图1。基因序列列于SEQ ID NO：1，而编码的蛋白质列于SEQ ID NO：2。在其它的实施方案中，基因序列是下列序列中的任何一个：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：9，SEQID NO：11，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：19，SEQ ID NO：21及其保守性突变体。
载体可以是适于转化使用的植物物种的任何载体。适合的载体的例子包括pHS737，pHS738，pRD400；pBin19；和pCGN322313。
GPDH是所有植物的生物合成途径所共有的。因此，本发明的方法，可以用于任何植物。在一个实施方案中，发明人使用模式植物物种拟南芥。由于该植物容易以经典遗传学和分子遗传学的方式进行操作，所以拟南芥已经广泛用作植物分子遗传学，发育，生理学和生物化学中的模式生物14，15，16。该双子叶植物也与芸苔作物植物属紧密相关并且愈加明显的是，有关拟南芥中基础生物过程的遗传控制的信息可以转移到其它的种中17。
实际上，存在许多例子，其中特定代谢途径或发育过程的分子生物学和生物化学，以及对植物进行遗传改造而导致所述的代谢途径或过程改变的可能性的研究，已经首先在模式植物拟南芥中进行了测试，然后表明能在其他的植物，特别是作物植物中产生类似的表型。
根据本发明的方法，在植物中表达异源GPDH，导致植物的三酰甘油中脂肪酸含量改变。在油料种子中改变甘油脂的脂肪酸含量以获得某些所需的特性常常是需要的。例如，对于供人类消费的油类，可能希望增加不饱和脂肪酸含量。为了其他的用途，增加饱和脂肪酸含量可能是合乎需要的。发明人已经发现，过量表达gpsA2FR基因的植物转化体产生甘油脂，其具有增加的16碳脂肪酸比例和同时降低的18碳脂肪酸。
由于GPDH与甘油脂合成的关系，本发明的方法特别适合用于产生油料种子的植物。术语“产生油料种子的植物”包括任何植物或作物植物，可以从其分离可销售量的油。培育一些具有特别感兴趣的脂肪酸组成的甘油脂的植物或作物植物，用于生产甘油脂，即使脂含量较低(例如，低于1wt％)。本发明的方法可用于这种植物，以改变甘油脂的脂肪酸含量。优选的植物或作物植物是那些种子脂含量至少为1wt％的植物或作物植物。油料种子作物植物的一些示例性例子如下(括号中给出了俗名)：
Borago officinalis(玻璃苣)；芸苔属(Brassia)物种，例如芥末，canola，油菜，B.campestris，B.napus，B.rapa；大麻(大麻，在亚洲广泛用作植物油)；红花(红花)；椰子树(椰子)；Crambe abyssinica(crambe)；萼距花属(Cuphea)物种(萼距花属生产工业感兴趣的中链脂肪酸)；Elaeis guinensis(非洲油棕)；Elaeis oleifera(美国油棕榈)；大豆(Glycine max)(大豆)；Gossypium hiristum(棉花-美国)；海岛棉(Gossypium barbadense)(棉花-埃及)；草本棉(Gossypium herbaceum)(棉花-亚洲)；Helianthus annus(向日葵)；亚麻(Linum usitatissimum)(亚麻籽或亚麻)；Oenethera biennis(月见草)；洋橄榄(Olea europea)(橄榄)；稻(Oryza sativa)(水稻)；篦麻(Ricinus communis)(蓖麻)；芝麻(Sesamum indicum)(芝麻)；大豆(Soja max)(大豆-注意，大豆(Glycine max)是大种)；小麦属(Triticum)物种(小麦)和玉米(Zea maize)(玉米)。
GPDH消耗NADH，并因此在保持健康细胞的氧化还原平衡中起重要作用。胁迫条件经常导致植物代谢，尤其是氧化还原状态的扰乱。胁迫条件包括这样的情况如干燥，过分潮湿，过热，过冷，过多的日照，和对植物的物理损害。这些因素会导致高于正常水平的NADH。过多的NADH会产生高浓度的活性氧中间体(ROS)，其对蛋白质和核酸是危险的，甚至会导致细胞死亡。提高的GPDH活性，如由本发明的方法诱导的，可提高植物保持细胞的氧化还原平衡的能力，从而导致对胁迫增强的耐受性。
植物遭受的另一种类型的胁迫是渗透胁迫。当植物被迫在其中外部水供给具有异常高浓度的溶质的环境中生长时，这样的情况就产生了。遇到的最常见的溶质包括盐(尤其是NaCl)，不过，在污染的区域，也可能遇到其他的溶质。本发明的方法导致转化植物的组织中增加水平的甘油和/或甘油-3-磷酸。甘油用作渗透保护剂，允许转化植物生长在通常不支持它的条件中。
使用常规的遗传工程技术可以将编码GPDH活性的异源基因导入到植物的基因组中并表达。用于将基因插入到植物基因组中的最完善的方法是根癌土壤杆菌介导的转化。将DNA导入到植物中的本领域已知的其他技术包括电穿孔法，化学介导的DNA吸收，和使用微粒。
参考下面的实施例将对本发明进行更详细的描述。这些实施例只是用于举例说明本发明。
实施例
实施例I.分子生物技术。
对使用的一些技术的概述，参见Ausebel等Current protocolsin Molecular Biology，Vols 1，2，3，(1995)New York：Wiley，引入这里作为参考。
实施例II.鉴定来自大肠杆菌菌株BB26R的gpsA2FR基因的点突变。
为了研究gpsA2FR基因的结构，发明人合成了两个引物，TTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPS A3，SEQ ID NO：3)和AACAATGAACCAACGTAA(GPSA5，SEQ ID NO：4)，其分别与对应于gpsA基因的3′和5′端的序列互补。分别用分离自野生型大肠杆菌K12和菌株BB26R的模板DNA进行PCR扩增。根据Cronan等获得拥有gpsA2FR等位基因的BB26R菌株。用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(QiagenTM)纯化PCR产物并完全测序。通过使用计算机程序DNAstarTM的序列比对来比较gpsA(野生型)和gpsA2FR(突变型)的序列。
实施例III.构建用于gpsAFR的植物转化载体。
根据gpsA2FR的序列设计引物GAGAGCTCTTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPSA31，SEQ ID NO：5)和GAAGAAGGATCCAACAATGAACCAACGTAA(GPSA51，SEQ ED NO：6)。在GPSA31的5′末端，添加SacI限制性位点，同时在GPSA5的5′末端添加BamHI限制性位点。将该引物用于进行gpsA2FR序列的PCR扩增。用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(QiagenTM)纯化PCR产物并用SacI/BamHI消化。将SacI/BamHI消化的gpsA2FRDNA片段随后插入到土壤杆菌二元载体pBI121(Clontech)中来置换含有GUS基因的SacI/BamHI区域。得到的植物转化载体被命名为pGPSA-VI(2000年08月31保藏于美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd.，Manassa，VA 20110-2209，保藏号PTA-2433)。pGPSA-VI中的gpsA2FR基因表达盒含有由组成型35S启动子驱动的gpsA2FR编码区域。它的3′末端的侧翼为NOS终止子。pGPSA-VI中35S启动子与gpsA2FR编码序列之间的连接区通过测序得到证实。一旦该基因表达盒掺入到植物基因组中，gpsA2FR蛋白因而将在所有的植物组织包括营养与生殖(种子)组织中表达。
实施例IV.植物生长条件。
挑选拟南芥作为植物宿主来测试gpsA2FR基因的影响，因为拟南芥被普遍公认为用于遗传和生化研究的实验室模式植物。而且，拟南芥在许多方面与canola如，例如，芸苔类似，并被认为是含油种子植物。用拟南芥进行的成功的遗传操作可应用于其他的物种18。使所有的拟南芥对照和转基因植物同时生长于人工生长室中，16小时荧光照明(150-200μE/m/秒)，8小时黑暗，22℃，如之前所述19。
实施例V.植物转化。
质粒pGPSA-VI通过电穿孔法导入到根瘤土壤杆菌菌株GV3101中，该菌株带有辅助胭脂碱质粒pMP90。使生态型哥伦比亚的野生型拟南芥植物生长于土壤中。将抽苔后1周的植物用带有pGPSA-VI的根瘤土壤杆菌菌株GV3101的悬浮液真空渗入过夜20。
渗入以后，使植物生长至产生种子(T1)。大量收获干种子(T1)并在含有50mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选。选择培养基上2至3周以后，将表现为绿色的卡那霉素抗性籽苗(T1)转移到土壤中，允许其生长到成熟。收获来自T1植物的种子(T2)并在卡那霉素平板上萌发以测试分离比率。典型的单基因插入事件将引起3∶1的卡那霉素抗性/敏感比例。为了进一步地证实gpsA2FR基因的整合，从选择的转基因系分离DNA来用利用gpsA2FR DNA制备的探针进行Southern印迹分析。还分离了总的RNA用于Northern分析以证实gpsA2FR基因的表达。保留转基因植物的转基因性状的植物的随后的世代被称为植物，植物种子或其后代，例如，植物的T1，T2和T3世代。
实施例VI.脂肪酸分布分析。
如Katavic等21所述从发育中的叶子分离脂类，并通过气相色谱法对脂肪酸组成进行分析。
实施例VII.植物对盐度胁迫的耐受性分析。
使用Apse等22报道的方案，对拟南芥生态型哥伦比亚(野生型)植物和过量表达gpsA2FR基因的植物的耐盐性进行了测定。栽有野生型植物和过量表达gpsA2FR基因的4个转基因系中的每个系(被命名为#7，#13，#54和#58)的盆被分成5组(标记为A到E)。植物被种植在4′盆中，每个盆都含有4个植物。使植物生长2周，培养液中仅含营养素(22g溶于80升水中的20∶20∶20植物营养素(Plant Products Co.Ltd.，Canada)，以确保甚至所有植物的生长。以后，每隔一天，以16天的浇灌方式，使用25ml稀释的营养液。对照(A)组接受仅含营养素，而不补加NaCl的溶液。剩余的组用补充有NaCl的营养液浇灌。NaCl补加的浓度每组每4天以50mM逐步增加，到所示的最大值：(A)0mM NaCl，(B)50mM NaCl，(C)100mM NaCl，(D)150mM NaCl和(E)200mM NaCl。监控植物的表型，开花期，等等。
用野生型和选择的T3转基因系的表面灭菌的拟南芥种子进行种子萌发分析，所述种子播种于含有20ml 1/2 MS培养基23，补加了B5维生素和2％蔗糖的培养皿中。为了进行盐胁迫萌发测定，添加了各种浓度的NaCl。使培养物于22℃，在荧光灯，16小时光照和8小时黑暗下生长。在10天的时段以后记录种子萌发。胚根和子叶的出现被认为是萌发的证据。
实施例VIII.gpsA2FR基因具有在GPDH蛋白(gpsA2FR)中改变一个氨基酸残基的点突变。
Kito和Pizer24最初对大肠杆菌中G-3-P的生物合成进行了研究。Cronan和Bell25将位于大肠杆菌遗传图谱的染色体小片71上的gpsA基因座确定为生物合成的甘油-3-磷酸脱氢酶的结构基因。以前报道了大肠杆菌gpsA基因的核苷酸序列和推断的氨基酸序列26。对磷脂生物合成突变体的生物化学研究表明，细胞水平的G-3-P必须被严密地调控，Bell(1974)，J.Bacteriol.117，1065-1076。大肠杆菌突变体，plsB，具有甘油-P酰基转移酶，该酶对G-3-P的表观Km比正常的大肠杆菌高10倍以上。随后，鉴定了plsB突变体的回复子，BB26R。这些回复子的甘油-3-磷酸脱氢酶活性对G-3-P所致的反馈抑制的敏感性低大约20倍。这些反馈抗性gpsA等位基因被命名为gpsA2FR。基于gpsA2FR蛋白的分子机制是未知的。从菌株BB26R27克隆gpsA2FR基因并确定它的核苷酸序列。序列分析表明，gpsA2FR与gpsA只有一个核苷酸碱基不同。点突变，gpsA中的密码子255的第3个核苷酸上的C取代为A(图1)被发现于gpsA2FR基因中。该点突变导致甘油-3-磷酸脱氢酶酶蛋白中从Asp255(GAC)变为Glu255(GAA)。
目前已经表明，与野生型gpsA基因相比，gpsA2FR基因含有一个点突变。发明人已经证明，该点突变是GPDH酶为什么比野生型对G-3-P反馈抑制的敏感性低20倍的原因。因此，细胞的G-3-P能够达到高于野生型gpsA能产生的水平。
实施例IX.引入gpsA2FR基因到植物基因组中不影响植物发育。
产生了很多gpsA2FR转基因植物。这些转基因植物(T1)最初在补充有卡那霉素的1/2 MS培养基中筛选卡那霉素抗性。在我们的培育条件下，所有的T1转基因植物似乎都不能与野生型拟南芥对照区别开来，而且当转移到土壤中时，以与野生型植物的生长速度相同的速度发育。生育力和种子产量没有受转基因影响。因此证明了gpsA2FR基因的整合对植物生长和繁殖没有任何不利的影响。确定了就卡那霉素抗性而论来自T1植株的(T2)种子的分离比率。选择转基因系#7，#13，#54，#58用于进一步的研究，因为分离分析表明这些系是单插入的转基因系。为了进一步地证实gpsA2FR基因掺入到植物基因组中，分别从#7，#13，#54，#58系的T3植物籽苗分离出基因组DNA。用3种不同的限制性内切酶消化的基因组DNA的Southern分析表明，这些系含有单拷贝的gpsA2FR基因，而且转基因是固有地稳定的(图4)。用从这些系提取的RNA进行的Northern分析进一步证实了gpsA2FR基因在这些转基因系中以高水平表达。因此，实现了将gpsA2FR基因引入到高等植物中并在高等植物中表达。
实施例X.拟南芥gpsA2FR转化体具有改变的脂肪酸分布。
从转基因植物以及野生型对照的叶组织提取总脂类，以及使用气相色谱法对脂肪酸组成进行分析。为了最小化植物发育期间可能存在的任何差异，小心以确保收集的全部植物叶子处于相同的发育阶段。用从几株野生型植物收集的叶子获得了可重复的结果，从而证实野生型植物之间的脂肪酸分布没有显著差异。然而，来自拟南芥转基因植物的叶子的数据表明，gpsA2FR基因产物影响脂肪酸组成。如图5所示，gpsA2FR转基因植物一致地显示出升高水平的16碳脂肪酸，和成比例地降低水平的18碳脂肪酸。具体地说，转基因植物显示出16∶0脂肪酸2-5％的增加，和16∶3脂肪酸大约1.5-3.5％的增加。伴随地，18∶2和18∶3脂肪酸降低的范围为2-5％(图5)。转基因植物与对照之间的差异也是明显的，如果对总的16碳(16C)脂肪酸对总的18碳(18C)脂肪酸的比率进行比较。例如，在描述的生长条件下，转基因系#58，系#13和系#54的16C/18C比率分别为0.53，0.6和0.68，而对照植物的比率为0.43。这种表型很可能是由转基因植物中高GPDH活性产生的G-3-P增加的供给量的直接结果。它与Gardiner等以前的报道是一致的，其中当提高量的G-3-P供应给分离的质体时，在新合成的脂肪酸当中观察到16C/18C脂肪酸的比例增加28。
实施例XI.gpsA2FR基因提高了植物的胁迫耐受性。
如前面所述，GPDH消耗NADH并再生NAD+。使细胞的NADH降低对线粒体呼吸和能荷具有有益的影响。GPDH参与细胞氧化还原状态的控制，而且也许能降低可能损伤活性氧中间体的浓度。植物细胞已知在胁迫条件下经历氧化裂解，因而常常导致细胞死亡。
目前的研究揭示了gpsA2FR转基因植物具有增强的耐盐性。
可以在不同的发育阶段观察到增强的耐盐性。转基因植物种子以与在1/2MS培养基上的非转基因对照植物相同的频率萌发(图6，上面的画面)。然而，在添加了盐的培养基上(图6，下面的画面)，野生型仅仅萌发大约55％，而转基因系#54，#58，#7和#13分别以90％，86％，87％和95％的比率萌发。用各种NaCl浓度进一步地评估系#13种子的萌发频率。如图7所示，在检验的所有NaCl浓度中，系#13种子一致显示高于野生型植物种子的萌发率。用250mM NaCl观察到最显著的效果，其中低于40％的野生型种子萌发，而80％的系#13种子萌发。在两种情况都不能从萌发的种子确定营养缺陷型生长。
野生型拟南芥在含有175mM NaCl的培养基上萌发相当好(80％)。然而，籽苗生长和发育却严重延迟。相反，转基因植物的生长速率基本上较高。6周以后，野生型植物的叶组织发生萎黄病并最终死亡，而在相同的条件下，转基因植物仍然保持相对健康的绿叶。还研究了生长于土壤中的植物的耐盐性。发明人按照Apse等报道的处理方案39，其设计为模仿田间胁迫条件。如图8所示，与野生型植物相比，转基因植物显示改进的生长和发育模式。用50mM NaCl反复处理的大部分野生型植物出现严重地胁迫反应，叶片颜色变暗。相同的处理似乎没有影响转基因系的生长和繁殖。当应用含有100mM盐的溶液时，野生型植物停止生长并最终死亡，而大多数转基因植物发育成熟并产生种子。当实施一种浇灌方案以达到150mM NaCl的盐浓度时，转基因植物显示明显的胁迫表型，但是仍然能产生种子，虽然具有较短的角果和极少的种子产量。来自系#54的植物在测试的转基因系当中显示最高的盐度。甚至当浇灌达到200mM NaCl的盐浓度时，它们也产生种子。
实施例XII.gpsA转基因拟南芥具有提高的G3P含量。
使拟南芥生态型哥伦比亚和gpsA转基因植物在长日照条件(16小时光照/8小时黑暗光周期)下，在人工生长室(21℃白天/16℃夜间，55％RH，和100μmol.m-2.s-1PAR)中生长3周。收获莲座叶，用于确定细胞的G-3-P含量。如图9所示，gpsA植物的叶组织的G-3-P含量为野生型植物的3倍。
实施例XIII.gpsA转基因拟南芥在细胞膜脂类分布中具有降低的磷脂摩尔比。
为了研究增加的G-3-P产生对甘油脂合成的影响，通过2-D薄层色谱法(TLC)分离主叶甘油脂种类，并在叶组织中分析它们的摩尔比和脂肪酸组成(标准生长条件，参见上面)。结果概括于表1中。
表1*来自野生型(WT)和gpsA转基因拟南芥的叶脂类的脂肪酸组成。数值表示3个样本的平均值。
Figure A20068002082700231
在gpsA植物中，非磷脂分子，包括单半乳糖二酰甘油(MGDG)，二半乳糖二酰甘油(DGDG)和硫脂(SL)的比例基本上都得到增加。另一方面，磷脂分子包括磷脂酰胆碱(PC)，磷脂酰乙醇胺(PE)和磷脂酰肌醇(PI)以及磷脂酰甘油(PG)的含量全部被降低。磷脂对非磷脂的比例也降低(图10)。从在甘油脂分子中检测到的脂肪酸组成的改变可以推断，质体原核生物甘油脂途径对转基因系中总的细胞膜脂合成的贡献比对野生型对照中的更大。
实施例XIV.标准生长条件下，gpsA转基因拟南芥中的Pi含量没有被降低。
由于增加的G-3-P将不可避免地需要更多的P，Pi利用率在转基因植物中有可能受到影响。通过与在标准条件下生长于土壤中的野生型植物相比较，分析转基因系中的P含量来解决该问题。如图11所示，转基因植物实际上具有稍微增加的总P含量。重要地，无机P水平的提高几乎完全能解释转基因植物中P含量的稍微增加。有机P含量保持在与野生型植物相当的水平。因此，转基因植物不处于一般的无机磷(Pi)限制胁迫下，并且这两种甘油脂途径改变的相对贡献不是对Pi限制的代谢响应的结果。
实施例XV.在Pi限制下在野生型植物中G-3-P和磷脂含量也显示负相关。
也确立了在野生型植物中存在Pi限制胁迫响应与细胞G-3-P代谢的表现相关。对在正常(足够的P)与Pi限制条件下生长的野生型植物的G-3-P含量进行了比较。在无机P限制(0.1mM)条件下(与以1mM的Pi供给量相比较)，野生型植物的叶子中的G-3-P含量增加5x，图12A。
在Pi限制条件下，野生型和转基因系都具有降低的磷脂含量。因此，在野生型和转基因系中，细胞膜系统中的G-3-P含量与磷脂比率之间都存在负相关(图12B)。
实施例XVI.在Pi限制条件下，gpsA转基因拟南芥生长增强。
当在低Pi(0.1mM)培养基上直接萌发种子时，3周以后，gpsA转基因拟南芥生长得比野生型植物好(图13A)。而且，野生型植物显示出紫色，其是在低Pi供给量下经常观察到的花色素苷积累的指示，相比之下，gpsA系要好得多，其显示出绿叶，而且没有可见的花色素苷积累的征兆。当对花色素苷含量进行定量时，发现野生型中的水平比gpsA系中的水平高2-3倍(图13B)。相比之下，野生型中的叶绿素含量比gpsA系低45％(图13C)。这些结果表明，gpsA系没有经历与野生型植物相同程度的低Pi利用率。
当将籽苗在正常Pi条件中种植10天并移植到低Pi培养基中再生长10天时，获得了相似的结果。如图14A所示，gpsA系表现出较高的生长速率。gpsA系的叶绿素含量比野生型植物的高50％(图14C)，并且gpsA系的花色素苷含量比野生型植物的低4倍(图14D)。在低Pi条件下25天以后，gpsA系的表现趋势仍然较好(图14B)。当估算gpsA系的鲜重与干重时，与野生型植物相比一致地存在40％到45％的增加(图14E和14F)。已知在Pi限制条件下，植物积累淀粉。因此，当与gpsA植物进行比较时，在低Pi条件下，在野生型植物中观察到较高水平的淀粉积累(图14G)。
当将植物在低Pi(4μM)(0.124ppm)条件下，在石棉中水培3周时，gpsA植物的鲜重与干重也比野生型植物的高30％-70％(图15B和15C)。而且，与野生型植物相比，在gpsA叶子中检测到较高水平的无机Pi含量(图15D)。
实施例XVII.当与野生型植物相比时，在Pi限制条件下拟南芥中内源G-3-P脱氢酶的缺乏导致受损的生长。
通过筛选威斯康星大学现有的T-DNA标记群体，鉴定了带有中断拟南芥内源G-3-P脱氢酶基因，AtGPDHcl的T-DNA插入的拟南芥突变体atgpdhcl-1(生态型Wassilewskija)。该突变体具有G-3-P脱氢酶活性，因此其细胞G-3-P的含量甚至低于野生型植物的水平。不过该突变体对Pi饥饿将是超敏感的，而且当Pi是限制性的时，表现比野生型植物差。确定了在低Pi条件下atgpdhcl1突变系的生长，如图16A所示，具有显著降低的总G-3-P含量，其在atgpdhcl突变体的籽苗和根中检测到。该降低也与相较于对照植物Ws降低的生长速率相关。60天以后，atgpdhcl突变体全部死亡，但是它们的对照植物Ws仍然是有生活力的，虽然产生严重的胁迫反应。
实施例XVIII.在Pi限制条件下，gpsA转基因Canola的生长增强。
B.napus是一种世界上重要的油料作物植物，而且canola高产所需的磷大于小麦或大麦。因此，产生了具有gpsA基因构建体的转基因canola，并估价其在低Pi耐受性方面的表现。如图17A和17B所示，当植物在沙培中经受低Pi条件时，gpsA canola植物显示出比野生型对照明显的生长优势，还较早到达开花期。重要地，gpsA canola植物的种子产量基本上高于野生型植物(图17B)。
引入gpsA基因到canola中对于低Pi生长的益处通过水培得到进一步证实。与沙培类似，gpsA canola植物长出更好的茎和叶片；开花早(图18A和18B)；而且在10μM(0.31ppm)和50μM(1.55ppm)(低)Pi条件下，gpsA植物的种子产量都高50-100％(图18C)。
寒冷气候下土壤磷的充足供应量已经公认是植物在早期生长阶段形成强壮的，健康的根系的主要限制因素，其将承受从头到尾使用水分和养分的后果。促进早期营养生长和较大籽苗的发育因此是重要的农学性状。此外，早期生长导致更早而且更一致的开花，因此增进较高产量的荚果和种子发育，也更能经受住来自生物和非生物胁迫的胁迫。土壤温度是早期籽苗生长的一个关键因素，通常，温度低于10℃导致逐渐较差的萌发和突出体。确定了gpsA canola籽苗对组合的低Pi和低温条件的响应。如图19A所示，gpsA canola以与提高的建立早期生长能力一致的方式长出较大的籽苗。在低Pi和低温条件下，在gpsA籽苗中存在比野生型植物增加25-45％的籽苗长度和鲜重(图19B和19C)。
实施例XIX.在细菌中鉴定gpsA基因。
使用计算机程序DNAstarTM或blast程序，其是已知的而且很容易从因特网上可用的国家生物技术信息中心(NCBI)购买到，通过序列比对，鉴定与大肠杆菌gpsA基因同源的gpsA基因的序列。
实施例XX.用于其它细菌的gpsA基因的植物转化载体的构建。
将引物TTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPSA3，SEQ ID NO：3)和AACAATGAACCAACGTAA(GPSA5，SEQ ID NO：4)，其分别与对应于大肠杆菌中gpsA基因的3′和5′末端的序列互补，用于使用从包含野生型gpsA基因的弗氏志贺氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，肠沙门氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，粘质沙雷氏杆菌，Photorhabdusluminescens和胡萝卜软腐欧文氏菌的菌株分离的模板DNA进行PCR扩增。用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(QiagenTM)纯化PCR产物并完全测序。
实施例XXI.植物转化载体的构建。
将引物GAGAGCTCTTAGTGGCTGCTGCGCTC(GPSA31，SEQ ID NO：5)和GAAGAAGGATCCAACAATGAACCAACGTAA(GPSA51，SEQ ID NO：6)，其分别与大肠杆菌中gpsA基因的3′和5′末端互补，而且在GPSA 31的5′末端含有SacI限制性位点以及在GPSA 5的5′末端含有BamHI限制性位点，用于PCR扩增弗氏志贺氏菌(SEQ ID NO：7)，鼠伤寒沙门氏菌(SEQ ID NO：9)，肠沙门氏菌(SEQ ID NO：11)，鼠疫耶尔森氏菌(SEQ ID NO：13)，假结核耶尔森氏菌(SEQ ID NO：15)，粘质沙雷氏杆菌(SEQ ID NO：17)，P.luminescens(SEQ ID NO：19)和胡萝卜软腐欧文氏菌(SEQ ID NO：21)的gpsA序列。用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物并用SacI/BamHI消化。将SacI/BamHI消化的gpsA2FR DNA片段插入到土壤杆菌二元载体pBI121(Clontech)中，由此置换GUS基因的SacI/BamHI区域。得到的植物转化载体包含含有弗氏志贺氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，肠沙门氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，粘质沙雷氏杆菌，P.luminescens和胡萝卜软腐欧文氏菌的gpsA编码区的表达盒，其由组成型35S启动子驱动。它的3′末端的侧翼为NOS终止子。35S启动子与gpsA编码序列之间的连接区通过测序得到进一步证实，每个载体都含有弗氏志贺氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，肠沙门氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，粘质沙雷氏杆菌，P.luminescens和胡萝卜软腐欧文氏菌的gpsA编码区。弗氏志贺氏菌(SEQ ID NO：8)，鼠伤寒沙门氏菌(SEQ ID NO：10)，肠沙门氏菌(SEQ ID NO：12)，鼠疫耶尔森氏菌(SEQ ID NO：14)，假结核耶尔森氏菌(SEQ ID NO：16)，粘质沙雷氏杆菌，(SEQ ID NO：18)，P.luminescens(SEQ ID NO：20)和胡萝卜软腐欧文氏菌(SEQ ID NO：22)的gpsA蛋白，因此在植物组织包括营养和生殖(种子)组织中得到表达，一旦该基因表达盒被掺入到植物基因组中。
实施例XXII.植物生长条件。
将拟南芥和canola选作为植物宿主用于测试弗氏志贺氏菌，鼠伤寒沙门氏菌，肠沙门氏菌，鼠疫耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌，粘质沙雷氏杆菌，P.luminescens和胡萝卜软腐欧文氏菌的gpsA基因，以及具有保守突变的gpsA基因的影响。使所有的拟南芥和canola对照以及转基因植物，同时生长在人工生长室中，在16小时荧光照明(150-200μE/m/秒)，8小时黑暗，22℃条件下，如之前所述19。
实施例XXIII.植物转化。
将含有弗氏志贺氏菌(SEQ ID NO：7)，鼠伤寒沙门氏菌(SEQ IDNO：9)，肠沙门氏菌(SEQ ID NO：11)，鼠疫耶尔森氏菌(SEQ ID NO：13)，假结核耶尔森氏菌(SEQ ID NO：15)，粘质沙雷氏杆菌(SEQ IDNO：17)，P.luminescens(SEQ ID NO：19)和胡萝卜软腐欧文氏菌(SEQ ID NO：21)中的每个的gpsA基因及其保守性突变的质粒，通过电穿孔法，引入到根瘤土壤杆菌菌株GV3101中，该菌株带有辅助胭脂碱质粒pMP90。培育生态型哥伦比亚的野生型拟南芥植物和canola。在抽苔后1周，植物用带有该质粒的根瘤土壤杆菌菌株GV3101的悬浮液真空渗入过夜，所述质粒含有弗氏志贺氏菌(SEQ ID NO：7)，鼠伤寒沙门氏菌(SEQ ID NO：9)，肠沙门氏菌(SEQ ID NO：11)，鼠疫耶尔森氏菌(SEQ ID NO：13)，假结核耶尔森氏菌(SEQ ID NO：15)，粘质沙雷氏杆菌(SEQ ID NO：17)，P.luminescens(SEQ ID NO：19)和胡萝卜软腐欧文氏菌(SEQ ID NO：21)中每个的gpsA基因及其保守性突变。
渗入以后，使植物生长产生种子(T1)。大量收获干种子(T1)并在含有50mg/L卡那霉素的选择培养基上筛选。选择培养基上2到3周以后，将表现为绿色的卡那霉素抗性籽苗(T1)转移到土壤中，允许其生长到成熟。收获来自T1植物的种子(T2)并在卡那霉素平板上萌发，以测试分离比率。典型的单基因插入事件引起3∶1的卡那霉素抗性/敏感比例。为了进一步证实gpsA基因的整合，从选择的转基因系分离DNA并用利用gpsA DNA制备的探针进行Southern印迹分析。还分离了总的RNA用于Northern分析以进一步证实弗氏志贺氏菌(SEQ IDNO：7)，鼠伤寒沙门氏菌(SEQ ID NO：9)，肠沙门氏菌(SEQ ID NO：11)，鼠疫耶尔森氏菌(SEQ ID NO：13)，假结核耶尔森氏菌(SEQ IDNO：15)，粘质沙雷氏杆菌(SEQ ID NO：17)，P.luminescens(SEQID NO：19)和胡萝卜软腐欧文氏菌(SEQ ID NO：21)中每个的gpsA基因及其保守性突变的表达。
实施例XXIV.在无机P限制条件下，gpsA转基因拟南芥和Canola的生长。
使含有弗氏志贺氏菌(SEQ ID NO：7)，鼠伤寒沙门氏菌(SEQ IDNO：9)，肠沙门氏菌(SEQ ID NO：11)，鼠疫耶尔森氏菌(SEQ ID NO：13)，假结核耶尔森氏菌(SEQ ID NO：15)，粘质沙雷氏杆菌(SEQ IDNO：17)，P.luminescens(SEQ ID NO：19)和胡萝卜软腐欧文氏菌(SEQ ID NO：21)的gpsA基因及其保守性突变的转基因野生型拟南芥生态型哥伦比亚植物和canola生长于具有降低的P含量(小于20ppm)的土壤中或生长于低Pi培养基(0.1mM)(大约3.1ppm)上。3周以后，比较野生型植物与转基因植物的生长，并对花色素苷含量和叶绿素含量进行定量。
植物还在低Pi(4μM)(大约0.124ppm)条件下，在石棉上水培3周。也测定野生型与转基因gpsA植物的鲜重，干重和无机Pi含量。
尽管已经用各种示例性实施方案对本发明进行了说明和描述，但是对本发明所属领域的普通技术人员来说显而易见的各种添加，删除和修改，即使这里没有说明或具体描述，也认为属于下面的权利要求所包含的本发明的范围内。而且，不同的实施方案的特征或要素可以组合应用。
参考文献(引入这里作为参考)
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18see for example：Zou et al.，United States Patent No：6,051,755，April 18，2000.
19Katavic et al.，(1995)，Plant Physiol.108，399-409.
20Bechtolds et al.，(C.R.Acad.Sci.Paris，Sciences de Iavie/Life sciences 316，1194-1199.
21Katavic et al.，(1995)Plant Physiol.108：399-409.
22Apse et al.，(1999)Science 285，1256-1258.
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27Bell and Cronan(1975)，J.Biol.Chem.250，7147-7152.
28Gardiner et al.，(1982)，Plant Physiol.70，1316-1320.
29Apse et al.，(1999)Science 285，1256-1258.
序列表
<110>Jitao Zou
     Wenyun Shen
     Wilf Keller
<120>具有提高的磷利用的植物及其培育方法
<130>11067-98A
<140>11/122,043
<141>2005-05-04
<150>US 10/088,079
<151>2002-07-19
<150>PCT/CA00/01096
<151>2000-09-21
<150>US 60/155133
<151>1999-09-22
<160>22
<170>Patent In Ver.2.1
<210>1
<211>1020
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>1
atgaaccaac gtaatgcttc aatgactgtg atcggtgccg gctcgtacgg caccgctctt  60
gccatcaccc tggcaagaaa tggccacgag gttgtcctct ggggccatga ccctgaacat 120
atcgcaacgc ttgaacgcga ccgctgtaac gccgcgtttc tccccgatgt gccttttccc 180
gatacgctcc atcttgaaag cgatctcgcc actgcgctgg cagccagccg taatattctc 240
gtcgtcgtac ccagccatgt ctttggtgaa gtgctgcgcc agattaaacc actgatgcgt 300
cctgatgcgc gtctggtgtg ggcgaccaaa gggctggaag cggaaaccgg acgtctgtta 360
caggacgtgg cgcgtgaggc cttaggcgat caaattccgc tggcggttat ctctggccca 420
acgtttgcga aagaactggc ggcaggttta ccgacagcta tttcgctggc ctcgaccgat 480
cagacctttg ccgatgatct ccagcagctg ctgcactgcg gcaaaagttt ccgcgtttac 540
agcaatccgg atttcattgg cgtgcagctt ggcggcgcgg tgaaaaacgt tattgccatt 600
ggtgcgggga tgtccgacgg tatcggtttt ggtgcgaatg cgcgtacggc gctgatcacc 660
cgtgggctgg ctgaaatgtc gcgtcttggt gcggcgctgg gtgccgaccc tgccaccttt 720
atgggcatgg cggggcttgg cgatctggtg cttacctgta ccgaaaacca gtcgcgtaac  780
cgccgttttg gcatgatgct cggtcagggc atggatgtac aaagcgcgca ggagaagatt  840
ggtcaggtgg tggaaggcta ccgcaatacg aaagaagtcc gcgaactggc gcatcgcttc  900
ggcgttgaaa tgccaataac cgaggaaatt tatcaagtat tatattgcgg aaaaaacgcg  960
cgcgaggcag cattgacttt actaggtcgt gcacgcaagg acgagcgcag cagccactaa 1020
<210>2
<211>339
<212>PRT
<213>大肠杆菌
<400>2
Met Asn Gln Arg Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Glu Val Val
            20                  25                  30
Leu Trp Gly His Asp Pro Glu His Ile Ala Thr Leu Glu Arg Asp Arg
        35                  40                  45
Cys Asn Ala Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu His
    50                  55                  60
Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu
65                  70                  75                  80
Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Glu Val Leu Arg Gln Ile Lys
                85                  90                   95
Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu
        115                 120                 125
Gly Asp Gln Ile Pro Leu Ala Val Ile Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys
    130                 135                 140
Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ser Leu Ala Ser Thr Asp
145                 150                 155                 160
Gln Thr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser
                165                 170                 175
Phe Arg Val Tyr Ser Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly
            180                 185                 190
Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile
        195                 200                 205
Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala
    210                 215                 220
Glu Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Thr Phe
225                 230                 235                 240
Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Glu Asn
                245                 250                 255
Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Met Asp
            260                 265                 270
Val Gln Ser Ala Gln Glu Lys Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg
        275                 280                 285
Asn Thr Lys Glu Val Arg Glu Leu Ala His Arg Phe Gly Val Glu Met
    290                 295                 300
Pro Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Gln Val Leu Tyr Cys Gly Lys Asn Ala
305                 310                 315                 320
Arg Glu Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ala Arg Lys Asp Glu Arg
                325                 330                 335
Ser Ser His
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物GPSA3
<400>3
ttagtggctg ctgcgctc 18
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物GPSA5
<400>4
aacaatgaac caacgtaa 18
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物GPSA31
<400>5
gagagctctt agtggctgct gcgctc    26
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：PCR引物GPSA51
<400>6
gaagaaggat ccaacaatga accaacgtaa    30
<210>7
<211>1020
<212>DNA
<213>弗氏志贺氏菌
<400>7
atgaaccaac gtaatgcttc aatgactgtg atcggtgccg gctcgtacgg caccgctctt     60
gccattaccc tggcaagaaa tggccacgag gttgtcctct ggggccatga ccctgaacat    120
atcgcaacgc ttgaacgcga ccgctgtaac gccgcgtttc tccccgatgt gccttttccc    180
gatacgctcc atcttgaaag cgatctcgcc actgcgctgg cagccagtcg taatattctc    240
gtcgtcgtac ccagccatgt ctttggtgaa gtgctgcgcc agattaaacc gctgatgcgt    300
cctgatgcgc gtctggtgtg ggcgaccaaa gggctggaag cggaaaccgg acgtctgtta    360
caggacgtgg cgcgtgaggc cttaggcgat caaattccgc tggcggttat ctctggccca    420
acgtttgcga aagaactggc ggcaggttta ccgacagcta tttcgctggc ctcgaccgat    480
cagacctttg ccgatgatct ccagcagctg ctgcactgcg gcaaaagttt ccgcgtttac    540
agcaacccgg atttcattgg cgtgcagctt ggcggcgcgg tgaaaaacgt cattgccatt    600
ggcgcgggga tgtctgacgg tatcggtttt ggtgcgaatg cgcgtacggc gctgatcacc    660
cgtgggctgg ctgaaatgtc gcgtcttggt gcggcgctgg gtgccgatcc tgccaccttt    720
atgggcatgg cggggctggg cgatctggtg cttacctgta ccgacaacca gtcgcgtaac    780
cgccgttttg gtatgatgct cggtcagggc atggatgtac aaagcgcgca ggagaagatt    840
ggtcaggtgg tggaaggcta ccgcaatacg aaagaagtcc gcgaactggc gcatcgcttc    900
ggcgttgaaa tgccaataac cgaggaaatt tatcaagtat tatattgcgg aaaaaacgcg    960
cgcgaggcag cattgacatt attaggtcgt gcacgcaagg acgagcgcag cagtcactaa   1020
<210>8
<211>339
<212>PRT
<213>弗氏志贺氏菌
<400>8
Met Asn Gln Arg Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Glu Val Val
            20                  25                  30
Leu Trp Gly His Asp Pro Glu His Ile Ala Thr Leu Glu Arg Asp Arg
        35                  40                  45
Cys Asn Ala Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu His
    50                  55                  60
Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu
65                  70                  75                  80
Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Glu Val Leu Arg Gln Ile Lys
                85                  90                  95
Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu
        115                 120                 125
Gly Asp Gln Ile Pro Leu Ala Val Ile Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys
    130                 135                 140
Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ser Leu Ala Ser Thr Asp
145                 150                 155                 160
Gln Thr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser
                165                 170                 175
Phe Arg Val Tyr Ser Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly
            180                 185                 190
Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile
        195                 200                 205
Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala
    210                 215                 220
Glu Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Thr Phe
225                 230                 235                 240
Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn
                245                 250                 255
Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Met Asp
            260                 265                 270
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        275                 280                 285
Asn Thr Lys Glu Val Arg Glu Leu Ala His Arg Phe Gly Val Glu Met
    290                 295                 300
Pro Ile Thr Glu Glu Ile Tyr Gln Val Leu Tyr Cys Gly Lys Asn Ala
305                 310                 315                 320
Arg Glu Ala Ala Leu Thr Leu Leu Gly Arg Ala Arg Lys Asp Glu Arg
                325                 330                 335
Ser Ser His
<210>9
<211>1006
<212>DNA
<213>鼠伤寒沙门氏菌
<400>9
atgaaccaaa gtaatgcgtc aatgacagtc atcggtgccg gctcgtacgg caccgctctt     60
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gatacgttac acctggaaag cgacttagca accgcgctgg cggccagtcg taacattctg    240
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atggggatgg cgggtttagg cgatctggtg ctgacctgta ccgacaacca gtcgcgcaac    780
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cgcgaggcag cattaacgtt attaggtcgc gcccgcaagg aagagc                  1006
<210>10
<211>339
<212>PRT
<213>鼠伤寒沙门氏菌
<400>10
Met Asn Gln Ser Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Gln Val Val
            20                  25                  30
Leu Trp Gly His Asp Pro Lys His Ile Ala Thr Leu Glu His Asp Arg
        35                  40                  45
Cys Asn Val Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu His
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Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu
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Val Val Val Pro Ser His Val Phe Ser Asp Val Leu Arg Gln Ile Lys
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Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu
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Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu
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Gly Asp Gln Ile Pro Leu Ala Val Ile Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys
    130                 135                 140
Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ser Leu Ala Ser Thr Asp
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Glu Thr Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser
                165                 170                 175
Phe Arg Val Tyr Ile Asn Ala Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly
            180                 185                 190
Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile
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Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Thr
    210                 215                 220
Glu Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Thr Phe
225                 230                 235                 240
Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn
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Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Met Asp
            260                 265                 270
Val Lys Gly Ala Gln Asp Lys Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg
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Asn Thr Lys Glu Val Arg Glu Leu Ala His Arg Phe Gly Val Glu Met
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Ser Arg His
<210>11
<211>1006
<212>DNA
<213>肠沙门氏菌
<400>11
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<210>12
<211>339
<212>PRT
<213>肠沙门氏菌
<400>12
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1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Gln Val Val
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Leu Trp Gly His Asp Pro Lys His Ile Ala Thr Leu Glu His Asp Arg
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Cys Asn Val Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu Hi s
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Leu Glu Ser Asp Leu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Ile Leu
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Val Val Val Pro Ser His Val Phe Ser Asp Val Leu Arg Gln Ile Lys
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Pro Leu Met Arg Pro Asp Ala Arg Leu Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu
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Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile
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Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Thr
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Glu Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ala Thr Phe
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Ser Arg His
<210>13
<211>1020
<212>DNA
<213>鼠疫耶尔森氏菌
<400>13
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<210>14
<211>339
<212>PRT
<213>鼠疫耶尔森氏菌
<400>14
Met Asn Thr Asn Pro Ala Ser Met Ala Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Gln Val Val
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Leu Trp Gly His Asp Pro Lys His Ile Gln Gln Leu Gln Gln Asp Arg
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Leu Glu Thr Asp Leu Ala Cys Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asp Val Leu
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Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Ala Val Leu His Gln Leu Lys
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Gly Glu Ala Ile Pro Leu Ala Val Ile Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys
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Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ala Leu Ala Ser Thr Asp
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Val Gln Phe Ser Glu Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser
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Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile
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Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala
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Glu Met Thr Arg Leu Gly Thr Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ser Thr Phe
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Val Lys Glu Ala Gln Asp Asn Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg
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Asn Thr Lys Glu Val Leu Ala Leu Ala Gln Arg His Gly Val Glu Met
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Ile Gly Ile
<210>15
<211>1020
<212>DNA
<213>假结核耶尔森氏菌
<400>15
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gtgcaattta gcgaagatct gcaacagtta ttgcactgtg gaaaaagctt tcgagtttac    540
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cgccgatttg gcattatgct gggtcagggg ttgggggtga aggaggcgca ggacaacatt    840
ggtcaagtgg tagaaggtta ccgtaatacc aaggaagttc tggcattagc acagcgtcat    900
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<210>16
<211>339
<212>PRT
<213>假结核耶尔森氏菌
<400>16
Met Asn Thr Asn Pro Ala Ser Met Ala Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Gln Val Val
            20                  25                  30
Leu Trp Gly His Asp Pro Lys His Ile Gln Gln Leu Gln Gln Asp Arg
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Cys Asn Arg Ala Phe Leu Pro Asp Ala Ala Phe Pro Asp Thr Leu Arg
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Leu Glu Thr Asp Leu Ala Cys Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asp Val Leu
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Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Ala Val Leu His Gln Leu Lys
                85                  90                  95
Pro His Leu Arg Lys Asp Ala Arg Ile Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu
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Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly Ile
        195                 200                 205
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Ile Gly Ile
<210>17
<211>1023
<212>DNA
<213>粘氏沙雷氏杆菌
<400>17
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attcaaacgt tgcagcacga tcgctgcaat caggcgtttc tgcccgacgt tcccttcccc  180
gataccctgc tgcttgaagc cgatttggcg cgtgcgctgg ccgccagccg cgacgtgctg  240
gtggtggtgc cgagccacgt gttcggcgac gtgctgcgcc agctgaagcc gcatctgcgc  300
ccggacgccc gcatcgtgtg ggccaccaag ggattggaag cggaaaccgg tcggttgctg  360
cagaacgtgg cgcgtgaggc gctgggcgag acgatcccgc tggcggtgct ctccgggccg  420
acgttcgcca aagagctggc cgccggcctg ccgacggcga tcgcgctggc ggcgaccgat  480
gcgcagttcg ccgacgatct gcaacagggc tgcatgcact gcggcaagag cttccgtgtc  540
tacagcaatc ccgacttcat cggcgtgcag cttggcggcg cggtgaagaa cgtgatcgcc  600
atcggcgccg gcatgtccga cggcatcggt ttcggcgcta acgcccgtac cgcgttgatt  660
acacgcgggc tggcggaaat gagccgtctg ggttctgcgc tgggcgccga tccttcgacg  720
ttcatgggca tggcggggct gggggatctg gtgctaacct gcacggacaa ccagtcgcgc  780
aaccgtcgct tcggcattat gctggggcag ggtaaaggcg tgcaggaagc gcaggacagt  840
atcggtcagg tggtcgaggg ctatcgcaat accaaagagg tgttggcgtt ggcgcagcgg  900
cagggtgtgg aaatgccgat caccgaacag atttatcagg tgctttactg ccacaaggac  960
gcccgcgaag cggcgctgag cctgctgggg cgagcccgaa aggacgaaaa acccagcgtg 1020
tga                                                               1023
<210>18
<211>340
<212>PRT
<213>粘氏沙雷氏杆菌
<400>18
Met Asn Thr Val Asn Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Ser Val Val
            20                  25                  30
Leu Trp Gly His Asn Pro Ala Gln Ile Gln Thr Leu Gln His Asp Arg
        35                  40                  45
Cys Asn Gln Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Thr Leu Leu
    50                  55                  60
Leu Glu Ala Asp Leu Ala Arg Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asp Val Leu
65                  70                  75                  80
Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Asp Val Leu Arg Gln Leu Lys
                85                  90                  95
Pro His Leu Arg Pro Asp Ala Arg Ile Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asn Val Ala Arg Glu Ala Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Thr Ile Pro Leu Ala Val Leu Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys
    130                 135                 140
Glu Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ala Leu Ala Ala Thr Asp
145                 150                 155                 160
Ala Gln Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Gly Cys Met His Cys Gly Lys
                165                 170                 175
Ser Phe Arg Val Tyr Ser Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly
            180                 185                 190
Gly Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp Gly
        195                 200                 205
Ile Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu
    210                 215                 220
Ala Glu Met Ser Arg Leu Gly Ser Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ser Thr
225                 230                 235                 240
Phe Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp
                245                 250                 255
Asn Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Ile Met Leu Gly Gln Gly Lys
            260                 265                 270
Gly Val Gln Glu Ala Gln Asp Ser Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr
        275                 280                 285
Arg Asn Thr Lys Glu Val Leu Ala Leu Ala Gln Arg Gln Gly Val Glu
    290                 295                 300
Met Pro Ile Thr Glu GlnIle Tyr Gln Val Leu Tyr Cys His Lys Asp
305                 310                 315                 320
Ala Arg Glu Ala Ala Leu Ser Leu Leu Gly Arg Ala Arg Lys Asp Glu
                325                 330                 335
Lys Pro Ser Val
        340
<210>19
<211>1052
<212>DNA
<213>Photorhabdus luminescens
<400>19
atgaatagta ctgtttctat gacagtgatt ggtgccggct catacggcac ctcattagcc     60
attacgctgg ctcgtaatgg tcataatgtt gtactttggg ggcataatcc agagcatgtt    120
ggggcattgc aacgggtgcg ttgtaatcaa aaatttctgc cggatgtttc ctttcctgat    180
agtttattgc ttgaaacgga cctaataaaa gcactaacag cgagccgcga tattcttgtt    240
gtggtaccta gccatgtgtt tggtgaagtg ttaaagcaga taaaaccaca tttacggcct    300
gattcacgta tcgtatgggc aactaaaggc ttggaagcgg ataccggtcg gttattgcag    360
gatgtggccc gtgagatatt aggcaatgaa ataccgctag cggtgctctc tgggccaaca    420
tttgctaaag agttagcggc tggtttgcct accgcgattg ctatttccgc gacggaatct    480
gcttttggcg atggacttca acaattattc cactgtggca aaagtttccg ggtttataaa    540
aatcctgatt ttattggtgt tcaactcggt ggtgccgtaa aaaacgtgat cgccattggc    600
gcgggaatat ctgatggcat gggatttggt gctaatgctc gtaccgcatt gattactcgt    660
ggattggcgg aaatgagtcg ccttggtgca gcgcttggtg ctgatccttc tacctttatg    720
ggcatggcgg gattgggcga tttggtctta acttgtactg ataaccaatc acgtaaccgt    780
cgttttggca tgatgctggg gcagggaatc agtgttgaag aagcgcagta tcagattggg    840
caggttgttg aaggttatcg caataccaaa gaagtacgtg cattggctaa tcgcgccaat    900
gtagaaatgc cgattgcaga acaaatctac cagatactct attgcaataa aaatgtgata    960
gaagctgctc aggcattatt aggaagagcc agaaaggatg agagcgataa tgtgcgctct    1020
taaataaaaa tctaatgaga taggttctaa tg                                  1052
<210>20
<211>340
<212>PRT
<213>Photorhabdus luminescens
<400>20
Met Asn Ser Thr Val Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr Gly
1               5                   10                  15
Thr Ser Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Asn Val Val Leu
            20                  25                  30
Trp Gly His Asn Pro Glu His Val Gly Ala Leu Gln Arg Val Arg Cys
        35                  40                  45
Asn Gln Lys Phe Leu Pro Asp Val Ser Phe Pro Asp Ser Leu Leu Leu
    50                  55                  60
Glu Thr Asp Leu Ile Lys Ala Leu Thr Ala Ser Arg Asp Ile Leu Val
65                  70                  75                  80
Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Glu Val Leu Lys Gln Ile Lys Pro
                85                  90                  95
His Leu Arg Pro Asp Ser Arg Ile Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu Glu
            100                 105                 110
Ala Asp Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ile Leu Gly
        115                 120                 125
Asn Glu Ile Pro Leu Ala Val Leu Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys Glu
    130                 135                 140
Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala Ile Ala Ile Ser Ala Thr Glu Ser
145                 150                 155                 160
Ala Phe Gly Asp Gly Leu Gln Gln Leu Phe His Cys Gly Lys Ser Phe
                165                 170                 175
Arg Val Tyr Lys Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly Ala
            180                 185                 190
Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Ile Ser Asp Gly Met Gly
        195                 200                 205
Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala Glu
    210                 215                 220
Met Ser Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Ser Thr Phe Met
225                 230                 235                 240
Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn Gln
                245                 250                 255
Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Ile Ser Val
            260                 265                 270
Glu Glu Ala Gln Tyr Gln Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg Asn
        275                 280                 285
Thr Lys Glu Val Arg Ala Leu Ala Asn Arg Ala Asn Val Glu Met Pro
    290                 295                 300
Ile Ala Glu Gln Ile Tyr Gln Ile Leu Tyr Cys Asn Lys Asn Val Ile
305                 310                 315                 320
Glu Ala Ala Gln Ala Leu Leu Gly Arg Ala Arg Lys Asp Glu Ser Asp
                325                 330                 335
Asn Val Arg Ser
            340
<210>21
<211>1020
<212>DNA
<213>胡萝卜软腐欧文氏菌
<400>21
atgaacgcgt ctgacgcttc catgaccgtc atcggtgccg gttcatacgg caccgcatta     60
gccattacgc tggcgcgtaa tggccatcga gtcgtgctgt ggggtcacaa ccctacgcac    120
attcaggcct tacaggccgc tcgttgtaat caggcattcc tgccggatgt ccctttcccc    180
gattcgctac agttggaaac taatctggct catgcgctcg ctgccagtag aaacgtgctg    240
gttgtcgtgc cgagccatgt attcggcgat gttttgcgtc agttgaaacc tcatttgcgt    300
gccgatgcac gtatcgtgtg ggcgaccaaa gggctggaag cagaaacggg gcgtctgttg    360
caggatgtcg cacgcgaagc gttgggtgaa accatcccgc ttgcggtggt atctggcccg    420
acatttgcca aagaattagc ggccggcatg ccgacggcta ttgctctggc atcaccggac    480
agtgaatttg ctgacgacct gcaacagcta ctgcattgcg ggaagagctt ccgtgtttac    540
agcaacccag attttatcgg cgtgcagttg ggcggagcgg tgaaaaacgt cattgctatc    600
ggtgctggga tgtctgacgg cattgggttt ggtgctaatg cacgtactgc attgatcacc    660
cgcgggctgg cagaaatgac ccggcttggt gcagcactgg gcgcggatcc tactaccttc    720
atggggatgg ctgggcttgg cgatttggtg ctgacctgta ctgataatca gtcccgtaac    780
cgacgctttg gcatgatgct ggggcaggga atggacgtgc agagcgcaca ggatagcatt    840
ggtcaggttg ttgaaggata ccgcaatacg aaagaagtat tggcattagc acagcgctac    900
ggcgttgaaa tgccgattac ggagcaactc tggcaggttc tgtattgtgg gaaagacgcc    960
cgcgaggcgg cgttaagcct attggggcga acgcgtaaag acgaaaccgc caaattataa   1020
<210>22
<211>339
<212>PRT
<213>胡萝卜软腐欧文氏菌
<400>22
Met Asn Ala Ser Asp Ala Ser Met Thr Val Ile Gly Ala Gly Ser Tyr
1               5                   10                  15
Gly Thr Ala Leu Ala Ile Thr Leu Ala Arg Asn Gly His Arg Val Val
            20                  25                  30
Leu Trp Gly His Asn Pro Thr His Ile Gln Ala Leu Gln Ala Ala Arg
        35                  40                  45
Cys Asn Gln Ala Phe Leu Pro Asp Val Pro Phe Pro Asp Ser Leu Gln
    50                  55                  60
Leu Glu Thr Asn Leu Ala His Ala Leu Ala Ala Ser Arg Asn Val Leu
65                  70                  75                  80
Val Val Val Pro Ser His Val Phe Gly Asp Val Leu Arg Gln Leu Lys
                85                  90                  95
Pro His Leu Arg Ala Asp Ala Arg Ile Val Trp Ala Thr Lys Gly Leu
            100                 105                 110
Glu Ala Glu Thr Gly Arg Leu Leu Gln Asp Val Ala Arg Glu Ala Leu
        115                 120                 125
Gly Glu Thr Ile Pro Leu Ala Val Val Ser Gly Pro Thr Phe Ala Lys
    130                 135                 140
Glu Leu Ala Ala Gly Met Pro Thr Ala Ile Ala Leu Ala Ser Pro Asp
145                 150                 155                 160
Ser Glu Phe Ala Asp Asp Leu Gln Gln Leu Leu His Cys Gly Lys Ser
                165                 170                 175
Phe Arg Val Tyr Ser Asn Pro Asp Phe Ile Gly Val Gln Leu Gly Gly
            180                 185                 190
Ala Val Lys Asn Val Ile Ala Ile Gly Ala Gly Met Ser Asp GlyIle
        195                 200                 205
Gly Phe Gly Ala Asn Ala Arg Thr Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala
    210                 215                 220
Glu Met Thr Arg Leu Gly Ala Ala Leu Gly Ala Asp Pro Thr Thr Phe
225                 230                 235                 240
Met Gly Met Ala Gly Leu Gly Asp Leu Val Leu Thr Cys Thr Asp Asn
                245                 250                 255
Gln Ser Arg Asn Arg Arg Phe Gly Met Met Leu Gly Gln Gly Met Asp
            260                 265                 270
Val Gln Ser Ala Gln Asp Ser Ile Gly Gln Val Val Glu Gly Tyr Arg
        275                 280                 285
Asn Thr Lys Glu Val Leu Ala Leu Ala Gln Arg Tyr Gly Val Glu Met
    290                 295                 300
Pro Ile Thr Glu Gln Leu Trp Gln Val Leu Tyr Cys Gly Lys Asp Ala
305                 310                 315                 320
Arg Glu Ala Ala Leu Ser Leu Leu Gly Arg Thr Arg Lys Asp Glu Thr
                325                 330                 335
Ala Lys Leu

Claims (23)

1.一种收获转基因种子的方法，该方法包括：
种植转基因植物，植物种子或其后代；
其中该转基因植物，植物种子或其后代具有掺入基因组中的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具；
使转基因植物，植物种子或其后代生长到成熟；和
从成熟的转基因植物，植物种子或其后代收获种子。
2.权利要求1的方法，进一步包括用编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具转化植物细胞，以产生转基因植物，植物种子或其后代。
3.权利要求2的方法，进一步包括选择用编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具转化的植物细胞。
4.权利要求1的方法，其中使转基因植物，植物种子或其后代生长到成熟进行至少60天。
5.权利要求1的方法，其中将转基因植物，植物种子或其后代种植在具有降低的磷含量的土壤中。
6.权利要求5的方法，其中该土壤的磷含量为低于20ppm的磷。
7.权利要求1的方法，进一步包括从收获的种子提取油。
8.通过权利要求7的方法生产的油。
9.权利要求1的方法，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具包括原核生物来源的核苷酸序列。
10.一种转基因canola植物，种子或其后代，包含：
基因组；
整合到该基因组中的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具；和与编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具可操作地连接的启动子。
11.权利要求10的转基因canola植物，种子或其后代，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具是原核生物来源的核苷酸序列。
12.权利要求10的转基因canola植物，种子或其后代，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具是细菌来源的核苷酸序列。
13.权利要求10的转基因canola植物，种子或其后代，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具包含原核生物来源的核苷酸序列。
14.一种配置用于装运权利要求10的转基因canola植物，种子或其后代的容器，其中该容器带有指导转基因canola植物，种子或其后代的用户使该转基因canola植物，种子或其后代生长所必需的磷含量的说明。
15.一种用于生产植物，植物种子或其后代的系统，包括：
具有降低的磷含量的土壤；和
具有整合到该转基因植物，植物种子或其后代的基因组中的异源基因的转基因植物，植物种子或其后代，该异源基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶；
其中该转基因植物，植物种子或其后代能在具有降低的磷含量的土壤中生长大约60天。
16.权利要求15的系统，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的异源基因包含原核生物来源的核苷酸序列。
17.权利要求15的系统，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的异源基因包含细菌来源的核苷酸序列。
18.权利要求15的系统，其中该具有降低的磷含量的土壤的磷含量为低于大约20ppm的磷。
19.一种用于降低使作物植物生长所需的磷含量的方法，该方法包括：
获得具有整合到该转基因作物植物，植物种子或其后代的基因组中的异源基因的转基因作物植物，植物种子或其后代，该异源基因编码甘油-3-磷酸脱氢酶；
其中该转基因作物植物，植物种子或其后代能在具有降低的磷含量的土壤中生长至少60天；和
种植该转基因作物植物，植物种子或其后代。
20.权利要求19的方法，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的基因包含原核生物来源的核苷酸序列。
21.权利要求19的方法，其中将转基因植物，植物种子或其后代种植在磷含量低于大约20ppm磷的土壤中。
22.一种生长在田地中的作物植物，该作物植物包括至少一种含有整合到基因组中的编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具的转基因植物，其中编码甘油-3-磷酸脱氢酶的工具与启动子可操作地连接，其中该作物植物能在具有降低的磷含量的土壤中生长至少60天。
23.一种在磷含量降低的土壤中培育植物的方法的改进，所述的磷含量降低的土壤的平均磷含量低于20ppm，该改进包括：
培育该植物，一种通常在这种磷含量降低的土壤中存活不超过60天的商业上有价值的植物，但是与非遗传修饰植物相比，已经对该植物进行了遗传修饰，以在该遗传修饰植物的基因组中包含编码甘油-3-磷酸脱氢酶的异源基因，以便该遗传修饰植物能在所述的磷含量降低的土壤中生长超过60天。
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