CN101048507B - 一种增大种子大小的方法 - Google Patents

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Abstract

一种增加植物种子重量的方法，该方法包括制备其中植物种子中的赤霉素含量已经被控制的基因修饰植物。

Description

一种增大种子大小的方法 
技术领域
本发明是关于一种增大植物种子大小的方法，所述植物种子大小的增大可以表征为种子重量或体积的增加。 
背景技术
植物育种技术已经从传统的方法发展到使用重组DNA技术以将想要的遗传特性引入到感兴趣的植物中，特别是农作物植物品种中。 
该领域之前研究已经发现植物生长可以由赤霉素(GAs)生物合成中重要酶的表达来调控。赤霉素(GAs)是存在于所有高等植物和某些真菌中的一大组二萜类羧酸。该组中的某些成员起到植物激素的作用并且与包括种子萌发、茎部生长、展叶、花的发端和发育，以及种子和果实生长在内的许多发育过程有关。生物活性的GAs通常为含有19-10内酯、C-7羧酸和3β-羟基的C19化合物。它们生物合成的后期阶段包括氧化性去除C-20以及C-3上的羟基化。2β位上的羟基化的结果是生成无生物活性的产物。该反应是植物体内最重要的GA代谢途径并且确保活性激素不在植物组织中积聚。GA生物合成酶7-氧化酶、20-氧化酶、3β-羟化酶和2β-羟化酶都是2-酮戊二酸依赖型双加氧酶。这些是2-酮戊二酸作为共底物的一大组酶，作为反应的一部分，所述共底物被去羧基化而成为琥珀酸酯(参见review by Hedden，P.andKamiya，Y.，in Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.48431-460(1997))。 
植物生长的化学调节剂已经在园艺和农业中使用了许多年。这些化合物中的许多通过改变植物组织中的GA浓度而起作用。例如，生长延缓剂抑制与GA生物合成有关的酶的活性，从而降低GA含量。这些化学药品通常用 于例如防止谷类植物倒伏和控制装饰性植物及园艺植物的生长。相反地，可以将GAs施用到植物上，例如，将GA3施用到无核葡萄上以改善浆果的大小和形状，以及施用到大麦上以提高麦芽产量。将GA4和GA7的混合物施用到苹果上以改善水果质量，并施用到某些针叶树上以刺激球果生长。使用生长调节剂有一些问题。某些生长延缓剂在土壤中高度存留，使得在受处理作物之后的其它作物难以生长。其它的调节剂需要反复施用以维持所需的效果。难以将施用限定至目标植物器官，从而避免扩散至其它器官或植物并具有不良结果。精确目标地施用生长调节剂的劳动强度很大。因此，非常需要用于控制植物形态的非化学性选择。 
转基因植物中的赤霉素生物合成已经得到改进。例如，WO 94/28141报道了催化GA生物合成倒数第二个步骤的赤霉素(GA)20-氧化酶的基因的克隆和表达，或者，WO 99/66029报道了编码为赤霉素灭活酶的赤霉素2β-羟化酶(GA2-氧化酶)的核酸序列的克隆和表达。它催化赤霉素分子的2β-氧化(2-氧化)以在C-2上引入羟基，并且进一步催化在C-2上引入的羟基的氧化以得到酮衍生物。 
现在已经介绍了GA生物合成基因的命名系统(Coles et alThe PlantJournal 17(5)547-556(1999))。除非文中特别限定，提及的“赤霉素”包括所有生物活性赤霉素分子。 
长久以来，能够增大由感兴趣的植物品种生产的种子的大小已经是农业目标。对于许多植物来说，种子是主要的待收获产品，增大种子大小将有助于提高作物总产率。对于所有的农业植物品种，增大种子大小可以有助于通过提供具有用于种子发芽的更多营养的发育植物而成功地把作物移植户外。 
发明内容
现在已经意外地发现，通过控制赤霉素酶的表达可以增大种子大小。 
根据本发明的第一方面，提供了一种增加植物种子重量的方法，该方法包括制备其中植物种子中的赤霉素含量已经被控制的基因修饰植物。 
与由对照植物得到的植物种子相比，根据本发明的方法得到的植物种子的大小增大。植物种子大小的增大可以表征为种子体积增大和重量增加。 
植物种子为裸子植物或被子植物的含有胚胎的成熟植物胚珠。 
优选的植物种包括但不限于包括种子及其子代或繁殖体的单子叶植物，例如黑麦草属(Lolium)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、高梁属(Sorghum)、黑小麦(Triticale)、甘蔗属(Saccharum)、雀麦属(Bromus)、稻属(Oryzae)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)和狗尾草属(Setaria)。特别有用的转基因植物为玉米、小麦、大麦植物、以及它们的种子。单子叶植物合适地选自由小麦、玉米、黑麦、稻米、燕麦、大麦、高梁和小米所组成的组中。 
双子叶植物也在本发明的范围之内，优选的转基因植物种包括但不限于豆科(Fabaceae)、茄属(Solanum)、十字花科(Brassicaceae)，特别是马铃薯、豆、卷心菜、林木、蔷薇、铁线莲、油菜、向日葵、菊花、一品红和金鱼草属(金鱼草)。此外，转基因植物还可以为双子叶植物。双子叶植物合适地选自由大豆、油菜和向日葵所组成的组中。 
根据本发明的方法的基因修饰植物可以由任何便利的方法制得，下面介绍其例子。将植物修饰以表达编码赤霉素生物合成酶或使赤霉素耐失活的酶的核酸序列，或者表达抑制赤霉素失活酶表达的核酸分子，或者以另外的方式控制种子中的赤霉素含量，例如通过诱变，方便地通过化学诱变。核酸序列的表达包括超过基础或内源水平的过量表达，所述过量表达可以相对于同种的未改变的或对照植物的表达水平来定义。因此，此类核酸序列的表达包括引入植物中的外源基因的表达，以及为了驱使内源基因表达而引入启动子序列，例如同源重组。 
所述核酸序列可以如图4、图6、图8或图10中任意一幅所示，或者为它们的互补链或同源序列。另外，所述核酸还可以为编码如图5、图7、图9或图11中任意一幅所示的氨基酸序列或蛋白序列的核酸序列，或者它们的互补链或同源序列。 
在本发明的上下文中，氨基酸序列之间的同一性的程度可以为至少40％，合适地为50％或更高，例如55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。在核苷酸水平上，同一性的程度可以为至少50％，合适地为60％或更高，例如65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。因此，根据本发明的同源序列可以具有如上所述的序列同一性。序列同源性可以使用任何便于利用的方案来测定，例如，使用来自斯特拉斯堡大学的Clustal XTM和通过使用GenedocTM(Karl B.Nicholas)得到的同一性表。 
下列核酸序列也包括在本发明的范围之内：与根据本发明的第一方面的序列在严格的条件下杂交的核酸序列，或与该序列同源的核酸序列或者如果没有遗传密码简并将在严格条件下与该序列杂交的序列，或任何该序列特定的寡核苷酸序列。 
杂交的严格条件可以表征为低盐浓度或高温条件。例如，高度严格的条件可以定义为在65℃下在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate，SDS)、1mM乙二胺四乙酸(EDTA)中和与固相支持体相结合的DNA杂交，并且在68℃下在0.1x标准柠檬酸缓冲液(SSC)/0.1％SDS中洗涤(Ausubel et al eds.″Current Protocols in Molecular Biology″1，page2.10.3，published by Green Publishing Associates，Inc.and John Wiley & Sons，Inc.，New York，(1989))。在某些情况下，可能需要不太严格的条件。如本申请中所使用的中等严格条件定义为包括在42℃下在0.2xSSC/0.1％SDS中洗涤(Ausubel et al(1989)supra)。还可以通过添加增加量的甲酰胺以使杂交核酸双链体不稳定而使杂交更加严格。因此特定的杂交条件容易控制并且通常 根据所要的结果来选择。一般地，在50％甲酰胺存在下，对于与目标DNA95-100％同源的探针，合适的杂交温度为42℃，对于90-95％同源的为37℃，对于70-90％同源的为32℃。 
编码赤霉素新陈代谢酶(即赤霉素生物合成或分解代谢的酶)的核酸序列的表达可以包括下列酶的表达：(i)如包含的实施例(图4和图5)中的、对GA生物合成的倒数第二个步骤起催化作用的酶赤霉素20-氧化酶(GA20ox)；或者(ii)对GA生物合成的最后步骤起催化作用的酶赤霉素3β-羟化酶(GA 3-氧化酶，GA3ox，例如，AtGA3ox1，图6和图7)(AtGA3ox1，Genbank No.L37126Chiang HH et al.，Plant Cell 7：195-201；1995)。所述表达包括超过基础水平或内源水平的过量表达。 
编码使赤霉素耐失活的酶的核酸序列的表达可以包括生成使GAs耐失活的酶赤霉素1，2-去饱和酶(例如，图8和图9)(GAdes；Genbank No.AJ417493，Tudzynski B，et al.，J.Biol.Chem.278：28635-28643；2003)。所述表达包括超过基础水平或内源水平的过量表达，例如，核酸的过量表达可以包括相对于基础水平或内源水平表达的酶的过量生成。 
抑制赤霉素失活酶表达(即通过减少或禁止基因表达)的核酸分子的表达可以包括降低内源赤霉素失活酶赤霉素2β-羟化酶(GA 2-氧化酶；GA2ox，例如，图10和图11：TaGA2ox2)的活性或浓度。 
植物诱变可以通过任何化学诱变或放射性核素诱导(radionucleide-induced)诱变技术来实现，例如通过TILLING(McCallum CM，et al.，Plant Physiol.123：439-442；2000)。 
根据本发明该方面的其它核酸序列还可以包括之前限定的其中编码序列与启动子有效相连的核酸序列。所述启动子对于特定植物细胞或组织优选种子中的表达来说是组成型的和/或特异性的。 
核酸序列优选包括启动上述核酸序列表达的启动子。该启动子序列包括 如图4、图6、图8或图10所示的天然地出现在所述序列的编码序列5′的启动子。还可以挑选启动子，以组成型地表达编码在此所限定的优选基因序列的核酸。核酸的表达包括超过基础水平或内源水平的过量表达。也可以使用由内部或外部因素如化学药品、植物激素、光或压力诱导的启动子。例子为可受水杨酸、铜可控基因表达(Mett et al Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 904567-4571(1993))和四环素调控的基因表达(Gatz etal Plant Journal 2397-404(1992))诱导的发病有关的基因。赤霉素可诱导的基因的例子为γ-TIP(Phillips，A.L.，& Huttly，A.K.，Plant Mol.Biol.24603-615(1994))和GAST(Jacobsen，S.E.，& Olszewski，N.E.，Planta 19878-86(1996))。 
用于启动种子开发中转基因表达的合适的启动子包括： 
(i)来自小麦的高分子量麦谷蛋白-1-D1启动子(图3；Lamacchia et al.，2001)； 
(ii)来自大麦的端-1启动子(Clarke BC，et al.，Aust.J.Agric.Res.52：1181-1193；2001)； 
(iii)来自玉米的MAC1启动子(Sheridan et al.，Genetics 142：1009-1020，1996)； 
(iv)来自玉米的Cat3启动子(GenBank No.L05934，Abler et al.，PlantMol.Biol.22：10131-1038，1993)； 
(v)来自拟南芥(Arabidopsis)的Atimycl(Urao et al.，Plant J.Mol.Biol.32：571-57，1996；Conceicao et al.，Plant 5：493-505，1994)； 
(vi)来自甘蓝型油菜(Brassica napus)的napA(GenBank No.J02798)； 
(vii)来自甘蓝型油菜的Napin基因家族(sjodahl et al.，Planta197：264-271，1995)； 
(viii)来自甘蓝型油菜的2S存储蛋白启动子(Dasgupta et al.，Gene133：301-302，1993)； 
(ix)来自拟南芥的2S种子存储蛋白基因家族启动子； 
(x)来自甘蓝型油菜的Oleosin 20千道尔顿(kD)(GenBank No.M63985)； 
(xi)来自大豆的OleosinA启动子(GenBank No.U09118)或Oleosin B启动子(GenBank No.U09119)； 
(xii)来自拟南芥的Oleosin启动子(GenBank No.Z17657)； 
(xiii)来自玉米的Oleosin 18千道尔顿启动子(GenBank No.J05212，Lee，Plant Mol.Biol.26：1981-1987，1994)； 
(xiv)来自大豆的低分子量富硫蛋白启动子(Choi et al.，Mol.Gen.Genet.246：266-268，1995)； 
(xv)源自玉米蛋白编码基因的启动子(包括15kD、16kD、19kD、22kD、27kD和γ-玉米蛋白基因，Pedersen et al.，Cell 29：1015-1026，1982)。 
稻米肌动蛋白-1内含子还可以用于增加转基因mRNA积聚，但是这对于本发明并不是必需的。 
本发明的核酸序列还可以编码与通常在植物细胞内发现的RNA反义的RNA，或者编码能够裂解通常在植物细胞内发现的RNA的RNA。在该方法中，完整cDNA或较小的片段(＞200bp)可以通过PCR而扩增并以与引物相反的方向插入到合适的表达载体中。因此，本发明还提供了编码能够对RNA进行特异性裂解的核酶的核酸序列，所述RNA由赤霉素失活酶基因如赤霉素2-氧化酶基因编码。该核酶编码DNA将通常用于抑制赤霉素失活。此外，该RNA还可以编码能够激活RNAi细胞过程的干扰RNA短序列，所述RNAi细胞过程使感兴趣的目标RNA种类如编码赤霉素失活酶的RNA降解。 
通过使用以正义和反义方向插入的位于ihpRNA载体如pHELLSGATE内含子侧翼的300-600bp转录区靶标(Wesley，S.V.，et al.(2001)Plant J.， 27：581-590.)，RNAi可以包括内含子剪接的发夹状(intron-spliced hairpin，ihpRNA)构建体(Smith，N.A.，et al.(2000)Nature，407：319-320)。可以按照准则，例如Fritz，J.J.，et al.(Methods(2002)，28：276-285)，设计与目标序列例如GA2ox相反的锤头状核酶。该核酶可以由合成的寡核苷酸制得、退火并插入到合适的载体中。优选使用用于表达转基因植物中的反义/RNAi/核酶的组织特异性启动子，以避免其它组织中的多效性作用(pleiotropic effects)。本申请中所列的启动子是合适的。通过在此所述的本领域的常规方法将构建体或RNAi片段引入到目标种类中。 
根据本发明的核酸序列还可以包括5′信号序列，以指导所述被表达的蛋白产物的表达。该信号序列还可以包括可以指导表达的蛋白到表达所述核酸序列的宿主细胞内部或外部特定位置的蛋白靶向序列。此外，所述核酸序列还可以包括3′信号例如聚腺苷酸化信号或其它调控信号。 
因此，根据本发明的种子重量增加的转基因植物的制备可以通过植物细胞的修饰而制得，所述修饰使植物细胞含有如上所述的核酸序列，并提供了编码赤霉素生物合成酶或使赤霉素耐失活的酶的核酸序列的表达，或者提供了抑制赤霉素失活酶表达的核酸序列的表达。在此所限定的核酸序列可以通过合适的方法引入到植物细胞中。核酸表达包括超过基础水平或内源水平的过量表达。 
优选地，本发明的核酸序列可以使用合适的载体如图1所示的pMON57004通过转化而引入到植物细胞中。此外可选二元载体，例如，其中β-葡糖苷酸酶报告基因被HMWGlu-GA20ox1表达盒替换的改良版pGPTV-Kan(Becker et al Plant Mol.Biol.201195-1197(1992))。然后该质粒可以通过电穿孔而引入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中并可以通过真空过滤法转移到宿主细胞中。此外，可以通过使用卸装Ti质粒(disarmed Ti-plasmid)载体而实现所述转化并通过本领域公知的如EP 0116718A 和EP 0270822A所述的方法由农杆菌进行所述转化。当农杆菌无效时，可以只使用放电装置将外源DNA直接引入到植物细胞中，例如在单子叶植物的转化中。其它任何使核酸序列稳定地掺入到任何植物细胞的核DNA或线粒体DNA中的方法也是合适的。这包括还不能基因转化的植物品种。 
优选地，在此所述的用于引入到宿主细胞中的核酸序列还含有第二嵌合基因(或“标记”基因)，该第二嵌合基因能够使含有外源DNA的转化植物容易地与不含外源DNA的其它植物区别开。该标记基因的例子包括抗生素抗性(Herrera-Estrella et alEMBO J.2987-995(1983))、抗除草剂性(herbicide resistance)(EP 0242246A)和葡糖苷酸酶(glucuronidase，GUS)表达(EP 0344029A)。所述标记基因的表达优选由第二启动子控制，所述第二启动子允许在所有发育阶段的细胞中表达，因此可以在植物再生的所有阶段测定标记基因的存在。 
整个植物可以由单个的转化植物细胞再生，因此，本发明提供了含有如上所述核酸序列的转基因植物(或者它们的一部分，例如繁殖材料，即原生质体、细胞、愈伤组织(calli)、组织、器官、种子、胚胎、胚珠、合子(zygotes)、块茎、根等)。 
在本发明的上下文中应当注意的是，术语“基因修饰”不应限于指如上所述在它们的种系中含有一种或多种来自其它种的基因的有机体，尽管许多有机体将含有基因或多种基因，即“转基因”植物。更合适地，术语“基因修饰”更广泛地指其种系如通过重组DNA技术或化学诱变而经过技术干预的任何有机体。因此，例如，与其种系添加有外源DNA序列的有机体一样，在其种系中内源基因已经被删除、复制、激活或修饰的有机体为用于本发明目的的基因修饰有机体。 
可以通过如Sambrook等所述的DNA分析(Southern analysis)来筛选存在特定DNA序列的植物细胞、组织和植物(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second edition(1989))。该筛选还可以使用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)通过本领域公知的技术来进行。 
植物细胞的转化包括分离转化的细胞与未转化的细胞。用于这种分离或选择的一个方便的方法是将用于选择标记的基因掺入到待插入转化细胞中的材料中。结果，将只有成功转化的细胞才含有标记基因。然后标记基因的翻译产物将赋予使选择可行的表型特征。一般地，所述表型特征为置于选择培养基中在一些化学药品例如抗生素如卡那霉素、G418、巴龙霉素等存在下存活的能力。能够赋予抗生素抗性的基因的一些例子例如包括编码新霉素磷酸转移酶卡那霉素抗性(Velten et al EMBO J.32723-2730(1984))、潮霉素抗性(van den Elzen et al Plant Mol.Biol.5299-392(1985))、源自Tn5的卡那霉素抗性(NPT II)基因的基因(Bevan et al Nature 304 184-187(1983)；McBride et al Plant Mol.Biol.14(1990))和编码氯霉素乙酰基转移酶的基因。Thompson等(EMBO J.62519-2523(1987))所述的PAT基因可用于赋予抗除草剂性。 
最初用作组织培养中识别含有基因工程载体的植物细胞的可筛选标记的基因的例子为编码生成发色产物的酶的基因。一个例子为编码β-葡糖苷酸酶(GUS)的产物的基因。该酶被广泛使用，其制备和使用如Jefferson所述(Plant Mol.Biol.Reporter 5387-405(1987))。 
一经在选择培养基上培养转化的植物细胞，选择存活的细胞用于进一步的研究和操控。选择方法和材料已为本领域技术人员所公知，允许以所选细胞已经用外源DNA成功转化的高度可预测性来选择存活细胞。 
使用例如农杆菌Ti质粒进行植物细胞或植物转化后，这些由Ti质粒转化的植物细胞或植物因此表达酶，可以通过合适的表型标记进行选择。这些表型标记包括但不限于抗生素抗性。其它的表型标记已为本领域公知，可以用于本发明。 
阳性克隆按照本领域公知的方法进行再生。随后对转化的植物存在想要的性质和/或想要的性质的表达程度进行评价。第一评价可以包括例如转化植物的耐细菌/霉菌性水平、想要的性质的稳定遗传性能、现场实验(field trial)等。 
本发明的方法延及用于制备由在此所述的重组DNA序列转化的转基因植物及其有性和/或无性后代。植物的再生可以通过公知的便利方法由适合的如上所述制备的繁殖材料或源自该材料的繁殖材料来进行。 
根据本发明的定义，短语“转基因植物的无性或有性后代”包括可以通过公知的方法如细胞融合或突变体选择、与转化植物材料的所有交叉融合产物一起获得的、仍然表现初始转化植物的特征的所有突变体和变异体。 
本发明的方法还涉及转基因植物的增殖材料。与本发明有关的转基因植物增殖材料定义为能够在体内或体外有性繁殖的任何植物材料。与从转基因植物获得其它任何繁殖材料一起，本发明范围内特别优选原生质体、细胞、愈伤组织、组织、器官、种子、胚胎、卵细胞、合子。 
赤霉素新陈代谢是用于描述活性赤霉素分子细胞内生物合成的酶途径以及通过抑制性或降解性酶或其它机理进行的生物合成途径调节的酶途径的术语，所述新陈代谢包括赤霉素的分解代谢。 
在此所述的赤霉素含量优选是生物活性赤霉素含量的调控包括表达编码赤霉素新陈代谢(即，赤霉素生物合成或分解代谢)酶或使赤霉素耐失活的酶的核酸序列，或者表达抑制赤霉素失活酶表达的核酸分子。表达包括超过基础或内源水平的过量表达。优选地，通过在此所述的核酸序列在植物种子中的表达或部分去除(ablation)控制植物种子内赤霉素失活的基因的表达，调控赤霉素新陈代谢。这种调控的结果是，与同类的对照植物种子中的赤霉素正常水平相比，种子中的赤霉素水平升高。 
已知作为生物活性分子出现在包括种子在内的植物组织中的赤霉素分 子为GA1、GA3、GA4和GA7。但是，术语“赤霉素”的使用还包括其它生物活性赤霉素。实际上，本发明的方法涉及整体上增加生物活性GAs的方法。 
由如上提及的基因编码的与赤霉素生物合成有关的酶的过量生成可以通过包括如上所述在发育的种子中有活性的合适启动子下过量表达基因在内的表达来实现。表达包括超过基础或内源水平的过量表达。例如，基因的过量表达可以包括与基础或内源水平的表达相比由基因编码的与赤霉素生物合成有关的酶的过量生成。 
如上所述的基因表达的降低或消除(abolition)可以使用反义或正义抑制、RNAi或识别表达降低的突变体来实现。酶活性的降低或消除可以通过识别诱变剂诱导的或现有的改变性质的系来实现，例如，通过TILLING(McCallum CM，et al.，Plant Physiol.123：439-442；2000)。 
根据本发明，通过在种子发育过程中调控GA生物合成或周转(turnover)而增加GA浓度，使种子体积增大、重量增加。与来自在正常条件下中种植未经过基因修饰的对照植物的植物种子相比，可以实现使每颗种子的重量增加至少5％，合适地在5-40％的范围内，优选10-40％，最优选20-30％。重量增加至少5％在统计学上是显著的，并且代表了作物产量的可测量的真实的改善。 
如上所述，种子大小的增加可以表征为种子体积的增大和重量的增加。因此，本发明的方法还延及增大每单位植物种子的体积的方法，该方法包括制备其中植物种子中的赤霉素含量已经被控制的基因修饰植物。 
根据本发明的又一方面，提供了编码赤霉素新陈代谢(即赤霉素生物合成或分解代谢)酶的核酸序列在制备重量增加的植物种子中的应用。 
根据本发明的又一方面，提供了编码使赤霉素耐失活的酶的核酸序列在制备重量增加的植物种子中的应用。 
根据本发明的又一方面，提供了编码抑制赤霉素失活酶表达的核酸分子的核酸序列在制备重量增加的植物种子中的应用。 
根据本发明的又一方面，提供了增强植物种子耐干旱性的方法，该方法包括制备其中植物种子中的赤霉素含量已经被控制的基因修饰植物，从而增加植物种子的重量。 
通过例证和概要的方式，下面的方案给出了可以依据本发明的增大种子大小的方法制备包括整个植物在内的基因修饰植物材料在内的典型过程。可以认为该过程包括五个步骤： 
(1)首先，通过已知方法从合适的来源(或DNA库)分离或合成编码显示赤霉素酶活性的蛋白的DNA序列，或者在表达时产生能够抑制所述酶表达的核酸序列的DNA序列； 
(2)可操作地以5′到3′的方向将所述DNA序列连接到在此所限定的植物表达序列上； 
(3)通过已知方法将步骤(2)的构建体转化至植物材料并在该植物材料中表达该构建体； 
(4)从根据步骤(3)处理的植物材料中筛选存在编码显示赤霉素合成活性的蛋白的DNA序列或具有赤霉素抑制活性的核酸序列的植物材料；和 
(5)选择性地将根据步骤(3)转化的植物材料再生为整个植物。 
另外，其中通过降低失活而使植物种子中的赤霉素含量增加并导致植物种子重量增加的基因修饰植物还可以如下产生： 
(1)识别编码与赤霉素生物合成有关的一种或多种酶如GA 2-氧化酶(GA2ox)的DNA的合适来源； 
(2)通过例如RNA印迹法、RT-PCR或微阵列(microarray)进行转录分析，识别编码在植物种子中表达的酶的基因家族成员； 
(3)如果所有编码在植物种子中表达的酶的基因具有高度的序列同一 性，则设计将靶向所述基因的单一的反义RNA、RNAi或核酶构建体。如果序列同源性较低，则设计个别的反义RNA、RNAi或核酶构建体； 
(3a)对于反义RNA，通过PCR扩增整个cDNA或较小的片段(＞200bp)并以与启动子相反的方向插入到合适的表达载体中；或 
(3b)设计内含子剪接的发夹状(ihpRNA)构建体；或 
(3c)设计锤头状核酶并插入到合适的载体中； 
(4)可以通过农杆菌介导转化法(Agrobacterium-mediatedtransformation)或基因枪法(microprojectile bombardment)将反义/RNAi/核酶构建体引入到目标种中，然后评价GA2ox表达和种子发育的效果。 
识别合适的DNA来源的方法的另一例子是使用TILLING或其它序列变异体检测方法来识别目标基因的功能丧失或功能降低的变异体。TILLING可以识别自然或诱导的作物物种种群的目标基因中的序列变异体(McCallum，C.M.，et al.(2000)Plant Physiol.，123：439-442；Comai，L.，et al.(2004)Plant J.，37：778-786；Slade，A.J.，et al.(2005)Nature Biotechnology，23：75-81)。简化的方案可以为： 
(1)确定基因表达模式(例如GA2ox)以识别如上的目标基因； 
(2)设计序列特异性引物以由基因组DNA扩增保守的富外显子区域(用于异源多倍体种的部分同源染色体特异性(homoeologue-specific)引物)； 
(3)实施包括PCR、异源双链核酸分子退火、细胞分裂和产物检测的TILLING法来识别序列变异体，并通过DNA测序确认所述序列变异体；和 
(4)反交，以去除不想要的突变并评定效果。 
在此所用的编码显示赤霉素酶活性的蛋白的DNA序列包括编码赤霉素新陈代谢酶或使赤霉素耐失活的酶的核酸序列，所述赤霉素新陈代谢可以为赤霉素生物合成或赤霉素分解代谢。编码抑制赤霉素失活酶表达的核酸分子 的DNA序列可以为反义DNA序列或能够激活植物细胞内的RNAi过程的干扰RNA短序列，从而抑制赤霉素生物合成受影响的基因的基因表达。 
此外，如上所述，基因修饰植物还可以通过受试植物或植物组织的化学诱导诱变作用而生成，然后进行筛选以识别具有所需基因特性的植物或植物组织。 
在其最广泛的方面，本发明可以被描述为一种增加每单位面积作物的植物作物产量的手段。所述种子大小增大的转基因植物的制备方法提供了几个优势，特别是整体增加产量。此外，实质的优势与增大的种子大小的储存能力更强有关。这些优势包括幼苗活力，因为更大的种子在生长的幼苗具备光合作用能力并自给之前在较长时间内滋养生长的幼苗。这将允许更深的栽培并因此提高耐干旱性。 
本发明的第二及随后的方面的优选特征如第一方面，同时加上必要的变更。 
附图说明
本发明将以参考以下实施例和附图的方式进行进一步的描述，实施例和附图只是为了描述的目的而提供的，而不能理解为对本发明的限制。参考了许多附图，其中： 
图1示出了质粒pMON57004的图谱，质粒pMON57004用作构建体pDE45的基础； 
图2示出了来自DE45转基因系(T2)和无效(不成对的)系的T3种子的照片； 
图3示出了来自小麦的高分子量麦谷蛋白-1-D1基因的启动子(Triticumaestivum cv Cheyenne；EMBL accession AJ301618；Lamacchia，et al.，2001)的核苷序列(nucleotide sequence)，所述启动子在5’和3’末端分别具有添加的 PacI和StuI限制位点； 
图4示出了来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的赤霉素20-氧化酶-1基因(accession Landsberg erecta)；EMBL accession X83379；Phillips，et al.，1995)的编码区的核苷酸序列，赤霉素20-氧化酶-1基因在5’和3’末端分别具有添加的XhoI和SacI位点； 
图5示出了由图4(序列2)编码的、来自拟南芥的赤霉素20-氧化酶同工酶-1的氨基酸序列； 
图6示出了来自拟南芥的赤霉素3β-羟化酶-1基因的核苷序列(AtGA3ox1，Genbank No.L37126，Chiang HH et al.，Plant Cell 7：195-201；1995)； 
图7示出了来自拟南芥的赤霉素3β-羟化酶-1基因的蛋白序列(AtGA3ox1，Genbank No.L37126，Chiang HH et al.，Plant Cell 7：195-201；1995)； 
图8示出了来自藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)的使GAs耐失活的赤霉素1，2-去饱和酶的核苷序列(GAdes；Genbank No.AJ417493，Tudzynski B，etal.，J.Biol.Chem.278：28635-28643；2003)； 
图9示出了来自藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)的使GAs耐失活的赤霉素1，2-去饱和酶的蛋白序列(GAdes；Genbank No.AJ417493，Tudzynski B，et al.，J.Biol.Chem.278：28635-28643；2003)； 
图10示出了来自小麦的赤霉素失活酶赤霉素2β-羟化酶-2(GA 2-氧化酶-2；TaGA2ox2；Phillips AL.，et al.，unpublished)的核苷序列； 
图11示出了来自小麦的赤霉素失活酶赤霉素2β-羟化酶-2(GA 2-氧化酶-2；TaGA2ox2；Phillips AL.，et al.，unpublished)的蛋白序列； 
图12示出了植物的赤霉素(GA)生物合成的主要途径，标注的酶为：(1)内-柯巴基二磷酸合酶(ent-copalyldiphosphate synthase)、(2)内-贝壳杉烯合酶、(3)内-贝壳杉烯氧化酶、(4，5，6)内-异贝壳杉烯酸氧化酶、(7)GA 13-羟化酶、(8)GA 20-氧化酶、(9，a，b)GA 3β-羟化酶、(10)GA 2-氧化酶。 
具体实施方式
实施例1构建HMWGlu::AtGA20ox1表达盒 
使用引物HMW-L(5’-AAATTAATTAAAAATATGCAACATAATTTCC-3’)和HMW-R(5’-AAAAGGCCTGGTGGACTATCAGTAATTGA-3’)以在5’和3’末端分别创建PacI和StuI限制位点，通过PCR从质粒pHMWGlu-1-D1对来自小麦的高分子量麦谷蛋白-1-D1基因的启动子(Triticum aestivum cvCheyenne；EMBL accession AJ301618；Lamacchia，et al.，2001)进行扩增。该HMWGlu-1-D1启动子片段(序列1)插入到稻米肌动蛋白-1内含子上游的质粒pMON57004的PacI-StuI位点(图1)，以得到质粒pMON57004-HMWG。使用引物20ox1-L(5’-AAACTCGAGATGGCCGTAAGTTTCGTAAC-3’)和20ox1-R(5’-AAAGAGCTCTTAGATGGGTTTGGTGAGCC-3’)以在5’和3’末端分别创建XhoI和SacI限制位点，从质粒pAtGA20ox1对来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的赤霉素20-氧化酶-1基因(accession Landsbergerecta)；EMBL accession X83379；Phillips，et al.，1995)的编码区进行PCR扩增。编码赤霉素20-氧化酶同工酶(序列3)的AtGA20ox1片段(序列2)插入到位于稻米肌动蛋白-1内含子和NOS终止子之间的pMON57004-HMWG的XhoI-SacI位点，以得到质粒pDE45。 
实施例2小麦转化 
通过粒子轰击(particle bombardment)未成熟的胚胎组织，使用质粒pDE45对面包小麦(Triticum aestivum cv Cadenza)进行转化。在空气温度为 18℃/15℃(白天/黑夜)、相对湿度为50-70％、辐照度为大约350微摩尔/平方米/秒(μmol/m2/s)、光周期为16小时的环境控制室中，在直径为20厘米的每个罐中种植5棵小麦。利用PDS1000/He基因枪(micro-projectilebombardment)设备(BioRad，Hemel Hempstead，UK)，将从开花期大约14-16天后的种子中分离的不成熟角质鳞片(scutella)与摩尔比为1∶1的pDE45和pAHC25(含有可选择的标记基因条(bar)；Christensen&Quail P 1996)共转化。按照由Barcelo和Lazzeri(1995)创建并由Pastori et al.(2001)、Rasco-Gaunt et al.(2001)和Sparks和Jones(2004)改进的方案，使用Bialaphos选择通过体外组织培养而重新获得植物。在选择中存活的四种转基因T1系(T45-2至T45-5)转移至土壤中并在环境控制温室(environmentally-contained glasshouse)中长到成熟，以生产T2种子。将每系的各二十个(20)T2种子重新播种并通过PCR分析叶材料，以识别含有DE45转基因的分离子。所有系都长到成熟，并收集T3麦粒。培养T3幼苗，并通过PCR测试DE45构建体的存在以鉴别转基因的纯合系。 
实施例3种子分析 
四个初级转基因系T45-2至T45-5的种子比对照(未转化的)系的大。平均种子重量(表1)表明含有pDE45的植物的种子比对照的植物种子重10％-40％。 
在DE45转基因测试为阳性的T2植物上也观察到较大的种子，见图2。与无效(不成对的，非转基因的)系(null line)的种子相比，T3种子的平均颗粒重量增加19-32％(表2)。 
表1：初级转基因(T1)系(T2种子)的颗粒重量和产量 
  植物   构建体   平均颗粒数量/穗(Ear)   平均颗粒重量(克)   平均颗粒重量(克/植物)
  T45.2   DE45   60.08   0.049   17.79
  T45.3   DE45   63.22   0.056   21.09
  T45.4   DE45   54.38   0.063   20.49
  T45.5   DE45   56.76   0.061   20.74
  对照   n/a   58.45   0.044   15.56
表2：T2植物(T3种子)和无效(不成对)系的颗粒重量 
Figure G05831811720070323D000191
实施例4种植转基因小麦植物的后代(T3)并分析种子(T4种子) 
HMWGlu-GA20ox盒纯合的三种独立的转基因(T3)系和对照(非转基因小麦cv.Cadenza)一起在控制的环境中生长，每系15棵。植物在每天16小时的700微摩尔每平方米每秒的白光下、在20℃(白天)和18℃(黑夜)的温度以及80％的相对湿度下生长。使用随机的妨碍模式(block pattern)， 以避免室内的位置效应。在孕穗期，各株降低至三个主要的分蘖(tiller)；鼓粒(seed filling)并成熟后，将植物完全变干并收获耳穗。从各耳穗的两个中心小穗各得到两粒种子，将四粒种子分别称重。将从各系得到的所有种子汇集在一起，使用10毫升玻璃密度瓶(glass density bottle)和乙醇，通过乙醇置换量来测定50粒种子的体积(表3)。 
表3转基因(T3)系(T4种子)的颗粒重量(grain weight)和产量 
  对照   系45.2.3   系45.3.11   系45.5.8
  平均种子体积(微升)   39.1   46.9   49.6   45.7
  相对于对照的增量   20％   27％   17％
  平均种子重量(毫克)   51.4   59.8   60.9   57.2
  相对于对照的增量   16％   19％   11％
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Figure B2005800318117D00011
Figure B2005800318117D00021
Figure B2005800318117D00031
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Claims (18)

1.一种增加植物种子重量的方法，该方法包括制备其中植物种子中的赤霉素含量已经被增加的基因修饰植物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植物为单子叶植物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述单子叶植物选自由小麦、玉米、黑麦、稻米、燕麦、大麦、高梁和小米所组成的组中。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述植物为双子叶植物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述双子叶植物选自由大豆、油菜和向日葵所组成的组中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，赤霉素含量已经通过(i)表达编码赤霉素生物合成酶或使赤霉素耐失活的酶的核酸序列、或(ii)表达抑制赤霉素失活酶表达的核酸分子而被增加。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，赤霉素含量已经通过表达编码赤霉素新陈代谢酶的核酸序列而被控制，所述赤霉素新陈代谢酶的核酸序列为如图4或图6所示的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述赤霉素新陈代谢酶为赤霉素20-氧化酶或赤霉素3β-羟化酶。
9.根据权利要求6所述的方法，其中，赤霉素含量已经通过表达编码使赤霉素耐失活的酶的核酸序列而被增加，所述编码使赤霉素耐失活的酶的核酸序列为如图8所示的核酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述使赤霉素耐失活的酶为赤霉素1，2-去饱和酶。
11.根据权利要求6所述的方法，其中，赤霉素含量已经通过表达抑制赤霉素失活酶表达的核酸分子而被增加，所述抑制赤霉素失活酶表达的核酸分子的核酸序列为如图10所示的核酸序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述赤霉素失活酶为酶赤霉素2β-羟化酶。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，种子重量增加至少5％。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，种子重量增加5-40％。
15.核酸序列在制备重量增加的植物种子中的应用，该核酸序列编码赤霉素生物合成酶。
16.核酸序列在制备重量增加的植物种子中的应用，该核酸序列编码使赤霉素耐失活的酶。
17.核酸序列在制备重量增加的植物种子中的应用，该核酸序列能够抑制赤霉素失活酶的表达。
18.一种增强植物种子耐干旱性的方法，该方法包括制备其中植物种子中的赤霉素含量已经被增加的基因修饰植物，从而增加植物种子的重量。
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Davinder P.Singh et al.Gibberellins Are Required for Seed Developmentand PollenTube Growth in Arabidopsis".The Plant Cell14 12.2002,第3134页左栏第10-17行，第35-42行，第3141页右栏第3行-3142页右栏第20行.
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