ES2348668T3

ES2348668T3 - Un mã‰todo para aumentar el peso de semillas.

Info

Publication number: ES2348668T3
Application number: ES05786335T
Authority: ES
Inventors: Rebecca Monsanto Company STRATFORD; Rothamsted Research Ltd. PHILLIPS. Andrew L.; John R. Rothamsted Research Ltd. LENTON; Daniel J. Evans; Peter Rothamsted Research Ltd. HEDDEN
Original assignee: Rothamsted Research Ltd
Current assignee: Rothamsted Research Ltd
Priority date: 2004-09-23
Filing date: 2005-09-23
Publication date: 2010-12-10
Anticipated expiration: 2025-09-23
Also published as: EP1794302B1; ATE474056T1; DK1794302T3; CN101048507B; BRPI0515591A; PT1794302E; WO2006032916A3; CA2579920A1; WO2006032916A2; GB0421241D0; PL1794302T3; DE602005022328D1; CA2579920C; CN101048507A; EP1794302A2; US7985888B2; US20090007295A1

Abstract

Un método para incrementar el peso de semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por A) (i) transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación; (ii) transformar la célula vegetal para expresar una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de inactivación de giberelina o (iii) mutagénesis de la célula vegetal y B) regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de la célula vegetal.

Description

Un método para aumentar el peso de semillas.

La presente invención se refiere a un método para incrementar el peso de semillas.

Se han desarrollado técnicas de cultivo de plantas desde métodos tradicionales hasta el uso de tecnología de ADN recombinante para introducir deseables características genéticas en plantas, particularmente especies de plantas de cultivo agrícola, de interés.

Los estudios previos en este área han descubierto que el crecimiento vegetal se puede regular por la expresión de enzimas importantes en la biosíntesis de giberelinas (GAs). Las giberelinas son un gran grupo de ácidos carboxílicos diterpenoides que están presentes en todas las plantas superiores y algunos hongos. Ciertos miembros del grupo funcionan como hormonas vegetales y están implicadas en muchos procesos del desarrollo, que incluyen la germinación de la semilla, extensión del tallo, expansión de las hojas, inicio y desarrollo de las flores, y crecimiento de las semillas y frutos. Las GAs biológicamente activas son usualmente compuestos de C_{19} que contienen una 19-10 lactona, un ácido carboxílico de C-7 y un grupo 3\beta-hidroxilo. Las últimas etapas de su biosíntesis implican la retirada oxidativa de C-20 y la hidroxilación en C-3. La hidroxilación en la posición 2\beta da como resultado la producción de productos biológicamente inactivos. Esta reacción es la ruta más importante para el metabolismo de GA en plantas y asegura que las hormonas activas no se acumulan en los tejidos vegetales. Las enzimas biosintéticas de GA 7-oxidasa, 20-oxidasa, 3\beta-hidroxilasa y 2\beta-hidroxilasa son todas dioxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato. Estas son un gran grupo de enzimas para las que el 2-oxoglutarato es un co-substrato que se descarboxila a succinato como parte de la reacción (véase la revisión por Hedden, P. and Kamiya, Y., en Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48. 431-460
(1997)).

Los reguladores químicos del crecimiento vegetal se han usado en horticultura y agricultura durante muchos años. Muchos de estos compuestos funcionan cambiando la concentración de GA en los tejidos vegetales. Por ejemplo, los retardantes del crecimiento inhiben la actividad de las enzimas implicadas en la biosíntesis de GA y por ello reducen el contenido de GA. Tales productos químicos se usan comúnmente, por ejemplo, para prevenir el encamado en cereales y para controlar el crecimiento de plantas hortícolas y ornamentales. A la inversa, se pueden aplicar GAs a plantas, tales como en la aplicación de GA_{3} a uvas sin semillas para mejorar el tamaño y forma de la uva, y a grano de cebada para mejorar la producción de malta. Las mezclas de GA_{4} y GA_{7} se aplican a manzanas para mejorar la calidad de la fruta y a ciertas coníferas para estimular la producción de piñas. Hay varios problemas asociados al uso de reguladores de crecimiento. Algunos de los retardantes del crecimiento son muy persistentes en el suelo haciendo difícil cultivar otros cultivos después del cultivo tratado. Otros requieren aplicaciones repetidas para mantener el efecto requerido. Es difícil restringir la aplicación a los órganos objetivo de la planta sin que se extienda a otros órganos o plantas y sin que tengan efectos indeseables. La administración precisa de la aplicación del regulador del crecimiento puede ser una labor muy intensa. Una opción no química para controlar la morfología de la planta es, de este modo, muy
deseable.

La biosíntesis de giberelina ha sido modificada en plantas transgénicas. Véase por ejemplo, el documento WO 94/28141 que publica la clonación y expresión de un gen de giberelina (GA) 20-oxidasa que cataliza la penúltima etapa en al biosíntesis de GA, o el documento WO 99/66029 que publica la clonación y expresión de secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima giberelina 2\beta-hidroxilasa (GA 2-oxidasa) que es una enzima de inactivación de giberelina. Cataliza la 2\beta-oxidación (2-oxidación) de una molécula de giberelina para introducir un grupo hidroxilo en C-2 y cataliza adicionalmente la oxidación del grupo hidroxilo introducido en C-2 para dar el derivado de cetona.

Se ha introducido ahora un sistema de nomenclatura para los genes de biosíntesis de GA (Coles et al. The Plant Journal 17(5) 547-556 (1999). Las referencias a "giberelina" incluyen todas las moléculas de giberelina bioactiva, a menos que el contexto lo especifique de otro modo.

Ha sido un objetivo desde hace mucho tiempo en agricultura ser capaces de incrementar el tamaño de las semillas producidas por especies vegetales de interés. Para muchas plantas, las semillas son el principal producto a ser cosechado y un incremento de tamaño sería beneficioso para mejorar los rendimientos totales de la cosecha. Para todas las especies de plantas agrícolas, un incremento del tamaño de la semilla puede ayudar al éxito de trasplantar un cultivo proporcionando a la planta en desarrollo un mayor recurso para la germinación de la semilla.

Se ha encontrado ahora sorprendentemente que por la manipulación de la expresión de enzimas giberelina se puede conseguir un incremento del peso de las semillas.

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para incrementar el peso de semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por A) (i) transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación; (ii) transformar la célula vegetal para expresar una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de inactivación de giberelina; o (iii) mutagénesis de la célula vegetal y B) regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de la célula vegetal.

Las semillas producidas según un método de la invención tienen un peso incrementado en comparación con las semillas de las plantas de control. Las plantas y sus semillas derivadas de dichas plantas obtenibles directamente por el método de la invención no están incluidas dentro del alcance de la presente invención.

Las semillas son los óvulos vegetales maduros que contienen un embrión de una planta gimnosperma o angiosperma.

Las especies de plantas preferidas incluyen pero no están limitadas a plantas monocotiledóneas que incluyen semillas y su progenie o propágulos, por ejemplo, Lolium, Zea, Triticum, Sorghum, Triticale, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum, Secale y Setaria. Las plantas transgénicas especialmente útiles son plantas de maíz, trigo, cebada y sus semillas. Apropiadamente, las monocotiledóneas se seleccionan del grupo que consiste en trigo, maíz, centeno, arroz, avena, cebada, sorgo y mijo.

Las plantas dicotiledóneas para su transformación según la presente invención y las plantas transgénicas preferidas incluyen pero no están limitadas a las especies Fabaceae, Solatium, Brassicaceae, especialmente patatas, alubias, repollo, árboles forestales, rosas, clemátide, canola, girasol, crisantemo, flor de pascua y boca de dragón. Alternativamente, la planta transgénica puede ser una planta dicotiledónea. Apropiadamente, la dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en soja, canola y girasol.

Las plantas usadas en los métodos de la invención están modificadas para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina, o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación, o para expresar moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina, o para manipular de otro modo el contenido de giberelina en la semilla, tal como por ejemplo por mutagénesis, convenientemente por mutagénesis química. La expresión de una secuencia de ácido nucleico incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos, que se puede definir con respecto a los niveles de expresión en una planta sin alterar o de control de la misma especie. La expresión de tales secuencias de ácido nucleico por lo tanto incluye la expresión de un gen exógeno introducido dentro de la planta, así como la introducción de secuencias de promotor para dirigir la expresión del gen endógeno, tal como, por ejemplo, recombinación homóloga.

La secuencia de ácido nucleico puede ser como se muestra en una cualquiera de las Figuras 4, 6, 8 o 10, o su cadena complementaria o una secuencia homóloga de ella. Alternativamente, el ácido nucleico puede ser una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácido o una secuencia de proteína como se muestra en una cualquiera de las Figuras 5, 7, 9 o 11, o su cadena complementaria o una secuencia homóloga de ella.

El grado de identidad entre las secuencias de aminoácido puede ser por lo menos 40%, apropiadamente 50% o más alto, por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Al nivel del nucleótido, el grado de identidad puede ser por lo menos 50%, apropiadamente 60% o más alto, por ejemplo, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Una secuencia homóloga puede tener una identidad de secuencia como se describe anteriormente. La homología de la secuencia se puede determinar usando cualquier protocolo convenientemente disponible, por ejemplo, usando Clustal X^{TM} de la Universidad de Estrasburgo y las tablas e identidades producidas usando Genedoc^{TM} (Karl B. Nicholas).

Las secuencias de ácido nucleico usadas en los métodos de la invención se hibridan con una secuencia definida anteriormente en condiciones exigentes, o son homólogas o se hibridarían en condiciones exigentes a tal secuencia sino fuera por la degeneración del código genético, o una secuencia de oligonucleótido específica para cualquiera de tales secuencias.

Las condiciones exigentes de hibridación pueden estar caracterizadas por bajas concentraciones de sal o condiciones de alta temperatura. Por ejemplo, se puede definir que son condiciones muy exigentes la hibridación a ADN ligado a un soporte sólido en NaHPO_{4} 0,5M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, ImM EDTA a 65ºC, y lavado en 0,1xSSC/0,1% SDS a 68ºC (Ausubel et al. Eds. "Current Protocols in Molecular Biology" 1, página 2.10.3, publicado por Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York (1989)). En algunas circunstancias se pueden requerir condiciones menos exigentes. Tal como se usa en la presente solicitud, se pueden definir condiciones moderadamente exigentes que comprenden lavar en 0,2xSSC/0,1% SDS a 42ºC (Ausubel et al. (1989) supra). La hibridación se puede hacer también más exigente por la adición de cantidades crecientes de formamida para desestabilizar el dúplex híbrido de ácido nucleico. De este modo las condiciones particulares de hibridación se pueden manipular fácilmente, y se seleccionarán generalmente según los resultados deseados. En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de formamida al 50% son 42ºC para una sonda que es de 95 a 100% homóloga al ADN objetivo, 37ºC para 90 a 95% de homología, y 32ºC para 70 a 90% de homología.

La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima del metabolismo de giberelina (es decir, una enzima de biosíntesis o catabolismo de giberelina) puede comprender la expresión de (i) la enzima giberelina 20-oxidasa (GA20ox), que cataliza la penúltima etapa en la biosíntesis de GA, como en el ejemplo incluido (Figuras 4 & 5); o (ii) la enzima giberelina 3[beta]-hidroxilasa (GA 3-oxidasa, GA3ox, por ejemplo, AtGA3ox1, Figuras 6 & 7) que cataliza la última etapa en la biosíntesis de GA, por ejemplo, AtGA3ox1, Genbank No. L37126, Chiang HH et al., Plant Cell 7: 195-201; 1995). La expresión incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basal o endógeno.

La expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación puede comprender la producción de la enzima giberelina 1,2-desaturasa (por ejemplo, Figuras 8 & 9) que vuelve las GAs resistentes a la inactivación (GAdes; Genbank No. AJ417493, Tudzynski B, et al., J. Biol. Chem. 278: 28635-28643; 2003). La expresión incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos, por ejemplo, la sobreexpresión del ácido nucleico puede comprender la sobreproducción de la enzima con respecto a los niveles basales o endógenos de expresión.

La expresión de moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina (es decir, por reducción o abolición de la expresión del gen) puede comprender la reducción de actividad o concentración de la enzima de inactivación de giberelina endógena giberelina 2\beta-hidroxilasa (GA 2-oxidasa); GA2ox, por ejemplo. Figuras 10 & 11:TaGA2ox2).

La mutagénesis de la planta se puede conseguir convenientemente por cualquier técnica de mutagénesis química o inducida por radionúclido, o por ejemplo por TILLING (McCallum CM, et al., Plant Physiol. 123: 439-442; 2000).

Otras secuencias de ácido nucleico según este aspecto del método o uso de la presente invención pueden comprender también una secuencia de ácido nucleico como se define previamente en el que la secuencia codificante está unida operativamente a un promotor. El promotor puede ser constitutivo y/o específico para la expresión en una célula o tejido vegetal particular, preferentemente en semillas.

Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico comprende un promotor que dirige la expresión de una secuencia de ácido nucleico descrita anteriormente. Tales secuencias promotoras incluyen promotores naturales en 5' respecto a la secuencia de codificación de las secuencias mostradas en las Figuras 4, 6, 8 o 10. Los promotores se pueden seleccionar también para expresar constitutivamente el ácido nucleico que codifica para las secuencias génicas preferidas definidas aquí. La expresión del ácido nucleico incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos. Se podrían usar también promotores que son inducidos por factores internos o externos, tales como productos químicos, hormonas vegetales, luz o estrés. Los ejemplos son los genes relacionados con la patogénesis inducibles por ácido salicílico, la expresión génica controlable por cobre (Mett et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90 4567-4571 (1993)) y la expresión génica regulada por tetraciclina (Gatz et al. Plant Journal 2 397-404 (1992)). Los ejemplos de genes inducibles por giberelina son \gamma-TIP (Phillips, A.L., & Huttly, A.K., Plant Mol. Biol. 24 603-615 (1994)) y GAST (Jacobsen, S.E., & Olszewski, N.E., Planta 198 78-86 (1996).

Los promotores apropiados para dirigir la expresión transgénica para desarrollar semillas incluyen:

(i): Promotor de Glutenina-1-D1 de alto peso molecular de trigo (Figura 3; Lamacchia et al., 2001);

(ii): Promotor End-1 de cebada (Clarke BC, et al., Aust. J. Agric. Res. 52: 1181-1193; 2001);

(iii): Promotor MAC-1 de maíz (Sheridan et al., Genetics 142: 1009-1020, 1996);

(iv): Promotor Cat3 de maíz (Genbank No. L05934, Abler et al., Plant Mol. Biol. 22: 10131-10138, 1993);

(v): Atimyc1 de Arabidopsis (Urao et al., Plant J. Mol. Biol. 32: 571-57, 1996; Conceicao et al., Plant 5: 493-505, 1994);

(vi): napA de Brassica napus (GenBank No. J02798);

(vii): Familia del gen Napin de Brassica napus (Sjodahl et al., Planta 197: 264-271, 1995);

(viii): Promotor de proteína de almacenamiento 2S de Brassica napus (Dasgupta et al., Gene 133: 301-302, 1993);

(ix): Promotor de la familia de genes de proteína de almacenamiento 2S de Arabidopsis;

(x): Oleosina 20 kD de Brassica napsus (GenBank No. M63985);

(xi): Promotor de oleosina A (GenBank No. U09118) o promotor de oleosina B (GenBank No. U09119) de soja;

(xii): Promotor de oleosina de Arabidopsis (GenBank No. Z17657);

(xiii): Promotor de oleosina 18 kD de maíz (GenBank No. J05212), Lee, Plant Mol. Biol. 26: 1981-1987, 1994);

(xiv): Promotor de proteína rica en azufre de bajo peso molecular de soja (Choi et al., Mol. Gen. Genet. 246: 266-268, 1995);

(xv): Promotores derivados de genes que codifican zein (que incluyen los genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD y gamma zeina, Pedersen et al, Cell 29: 1015-1026, 1982).

El intrón de actina-1 de arroz se puede usar también para incrementar la acumulación de ARNm transgénico, pero esto no es necesario para la invención.

Las secuencias de ácido nucleico del método o uso de la presente invención puede también codificar ARN que es antisentido al ARN que se encuentra normalmente en una célula vegetal o puede codificar ARN que es capaz de escindir ARN que se encuentra normalmente en una célula vegetal. En tal planteamiento, todo el ADNc o fragmentos menores (>200 bp) se pueden amplificar por PCR e insertar en un vector de expresión apropiado en orientación inversa al cebador. Por consiguiente, la presente invención proporciona también una secuencia de ácido nucleico que codifica una ribozima capaz de escisión específica de ARN codificado por un gen para una enzima de inactivación de giberelina, tal como el gen de giberelina 2-oxidasa. Tal ADN que codifica ribozima sería útil generalmente para inhibir la desactivación de giberelinas. Alternativamente, el ARN puede codificar una secuencia corta de ARN de interferencia capaz de activar el procedimiento celular de ARNi para degradar una especie de ARN objetivo de interés, tal como codificación de ARN de una enzima de desactivación de giberelina.

El ARNi puede implicar construcciones de horquilla separadas por un intrón "hairpin intron-spliced" (ihpARN) (Smith, N.A., et al. (2000) Nature, 407: 319-320), usando 300-600 bp de la región transcrita del objetivo insertado en una orientación sentido y antisentido flanqueando el intrón de un vector ihpARN tal como pHELLSGATE (Wesley, S.V., et al. (2001) Plant J., 27: 581-590). El diseño de ribozimas cabeza de martillo contra secuencias objetivo, por ejemplo, GA2ox, puede seguir pautas, por ejemplo, Fritz, JJ., et al. (Methods (2002), 28: 276-285). La ribozima se produciría a partir de oligonucleótidos sintéticos, templados e insertados en un vector apropiado. Es preferible usar promotores específicos del tejido para la expresión de ribozimas/ARNi/antisentido en plantas transgénicas para evitar efectos pleyotrópicos en otros tejidos. Los promotores listados en la solicitud son apropiados. Las construcciones o fragmentos de ARNi se introducen en las especies objetivo por métodos de rutina en la técnica como se describe
aquí.

Las secuencias de ácido nucleico según el método o uso de la presente invención pueden comprender adicionalmente secuencias de señal 5' para dirigir la expresión del producto de la proteína expresada. Tales secuencias de señal pueden incluir también secuencias de dirección de proteína que pueden dirigir una proteína expresada a una localización particular dentro o fuera de una célula hospedante que expresa tal secuencia de ácido nucleico. Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede comprender también una señal 3' tal como una señal de poliadenilación u otra señal reguladora.

La preparación de plantas transgénicas que tienen peso de la semilla incrementado se puede preparar por lo tanto por modificación de una célula vegetal para que contenga una secuencia de ácido nucleico como se describe anteriormente que proporciona la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación, o para expresión de moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina. Tales secuencias de ácido nucleico como se define aquí se pueden introducir en células vegetales por cualquier medio apropiado. La expresión de un ácido nucleico incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos.

Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico del método o uso de la presente invención se introducen en células vegetales por transformación usando un vector apropiado, por ejemplo, pMON57004 como se muestra en la Figura 1. Alternativamente, un vector binario, por ejemplo, una versión modificada de pGPTV-Kan (Becker et al. Plant Mol. Biol. 20 1195-1197 (1992)) en el que el gen reportero de \beta-glucuronidasa se reemplaza con el casete de expresión HMWGIu-GA20ox1. Tales plásmidos se pueden introducir a continuación en Agrobacterium tumefaciens por electroporación y se pueden transferir a continuación a las células hospedantes vía un procedimiento de filtración a vacío. Alternativamente, se puede conseguir la transformación usando un vector de plásmido Ti desarmado y llevado por Agrobacterium por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en los documentos EP-A-0116718 y EP-A-0270822. Cuando Agrobacterium es inefectiva, el ADN extraño se podría introducir directamente en las células vegetales usando un aparato de descarga eléctrica solo, tal como, por ejemplo, en la transformación de plantas monocotiledóneas. Cualquier otro método que proporciona la incorporación estable de la secuencia de ácido nucleico dentro del ADN nuclear o ADN mitocondrial de cualquier célula vegetal sería también apropiado. Esto incluye especies de planta que no son aún capaces de transformación genética.

Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico como se describe aquí para la introducción en células hospedante contienen también un segundo gen quimérico (o gen "marcador") que permite que una planta transformada que contiene el ADN extraño se distinga fácilmente de otras plantas que no contienen el ADN extraño. Los ejemplos de tal gen marcador incluyen resistencia a antibióticos (Herrera-Estrella et al. EMBO J. 2987-2995 (1983)), resistencia a herbicidas (EP-A-0242246) y expresión de glucuronidasa (GUS) (EP-A-0344029). La expresión del gen marcador se controla preferentemente por un segundo promotor que permite la expresión en células en todas las etapas de desarrollo de modo que la presencia del gen marcador puede ser determinada en todas las etapas de regeneración de la planta.

Una planta entera se puede regenerar a partir de una única célula vegetal transformada u otras partes de ella, tal como material de propagación, es decir, protoplastos, callos, tejidos, órganos, semillas, embriones, óvulos, cigotos, tubérculos, raíces, etc.) que incluyen secuencias de ácido nucleico como se describe anteriormente.

En el contexto de la presente invención, se debe advertir que la expresión "genéticamente modificado" no se debe considerar que está limitada al referirse a un organismo como se define anteriormente que contiene en su línea germinal uno o más genes de otras especies, aunque muchos de tales organismos contendrán tal gen o genes, es decir, una planta "transgénica". Mejor dicho, la expresión "genéticamente modificado" se refiere más ampliamente a cualquier organismo cuya línea germinal ha sido objeto de intervención técnica, por ejemplo, por tecnología de ADN recombinante o mutagénesis química. De modo que, por ejemplo, un organismo en cuya línea germinal se ha suprimido, duplicado, activado o modificado un gen endógeno es un organismo genéticamente modificado para los propósitos de esta invención tanto como un organismo a cuya línea de germinación se ha añadido una secuencia de ADN exógeno.

El análisis de células vegetales, tejido y plantas para ver la presencia de secuencias de ADN específico se puede realizar por análisis Southern como se describe en Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition (1989)). Este análisis se puede realizar también usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por técnicas bien conocidas en la técnica.

La transformación de células vegetales incluye separar las células transformadas de aquellas que no han sido transformadas. Un método conveniente para tal separación o selección es incorporar dentro del material que se va a insertar en la célula transformada un gen para un marcador de selección. Como resultado solo las células que han sido transformadas con éxito contendrán el gen marcador. El producto de traducción del gen marcador conferirá a continuación una característica fenotípica que hará posible la selección. Usualmente, la característica fenotípica es la capacidad para sobrevivir en presencia de algún agente químico, tal como un antibiótico, por ejemplo, kanamicina, G418, paromomicina, etc., que se coloca en un medio de selección. Algunos ejemplos de genes que confieren resistencia a antibióticos, incluyen por ejemplo, aquellos que codifican para neomicina fosfotransferasa para resistencia a kanamicina (Velten et al EMBO J. 3 2723-2730 (1984)), resistencia a higromicina (van den Elzen et al., Plant Mol. Biol. 5 299-392 (1985)), el gen de resistencia a kanamicina (NPT II) derivado de Tn5 (Bevan et al. Nature 304 184-187 (1983); McBride et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990)) y cloranfenicol acetiltransferasa. El gen PAT descrito en Thompson et al. (EMBO J. 6 2519-2523 (1987)) se puede usar para conferir resistencia a herbicidas.

Un ejemplo de un gen útil principalmente como marcador analizable en cultivos de tejido para identificación de células vegetales que contienen vectores genéticamente manipulados es un gen que codifica una enzima que produce un producto cromógeno. Un ejemplo es el gen que codifica la producción de \beta-glucuronidasa (GUS). Esta enzima se usa mucho y su preparación y uso se describe en Jefferson (Plant Mol. Biol. Reporter 5 387-405 (1987)).

Una vez que las células vegetales transformadas se han cultivado en el medio de selección, se seleccionan las células supervivientes para estudio y manipulación adicional. Los métodos de selección y los materiales son bien conocidos por los expertos en la técnica, permitiéndole a uno escoger células supervivientes con un alto grado de previsibilidad de que las células escogidas habrán sido transformadas con éxito con ADN exógeno.

Después de la transformación de la célula vegetal o planta usando, por ejemplo, el plásmido Ti de Agrobacterium, cuyas células vegetales o plantas transformadas por el plásmido Ti de modo que se exprese la enzima, se puede seleccionar por medio de un marcador fenotípico apropiado. Estos marcadores fenotípicos incluyen pero no están limitados a, resistencia a antibióticos. Otros marcadores fenotípicos son conocidos en la técnica y se pueden usar en esta invención.

Se generan clones positivos siguiendo procedimientos bien conocidos en la técnica. Las plantas subsecuentemente transformadas se evalúan para ver la presencia de las deseadas propiedades y/o el punto hasta el que se expresan las deseadas propiedades. Una primera evaluación puede incluir, por ejemplo, el nivel de resistencia bacterial/fúngica de las plantas transformadas, heredabilidad estable de las propiedades deseadas, ensayos de campo y similares.

El metabolismo de giberelina es el término usado para describir el camino de la enzima para la biosíntesis en la célula de las moléculas de giberelina activa y para la regulación del camino biosintético por la actividad de las enzimas inhibidoras o degradantes u otros mecanismos, que incluye el catabolismo de giberelinas.

La manipulación del contenido de giberelina, preferentemente el contenido de giberelina bioactiva como se describe aquí comprende la expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima del metabolismo de giberelina (es decir, biosíntesis o catabolismo de giberelina) o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación, o la expresión de moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina. La expresión incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos. Preferentemente, la manipulación del metabolismo de giberelina está provocada por la expresión de las secuencias de ácido nucleico como se define aquí en las semillas de la planta, o por la ablación de la expresión de los genes que controlan la inactivación de giberelinas en las semillas de la planta. El resultado de tales manipulaciones es un incremento del nivel de giberelina en las semillas comparado con los niveles normales de giberelinas en una semilla de control de la misma especie.

Las moléculas de giberelina que se sabe que aparecen como moléculas biológicamente activas en tejidos vegetales, incluyendo semillas son GA_{1}, GA_{3}, GA_{4} y GA_{7}. Sin embargo, el uso del término "giberelinas" también incluye otras giberelinas bioactivas. De hecho, el método de la invención se refiere a la abundancia creciente de GAs bioactivas en su conjunto.

La sobreproducción de enzimas implicadas en la biosíntesis de giberelina codificadas por estos genes a los que nos referimos anteriormente se puede conseguir por la expresión que incluye la sobreexpresión del gen en un promotor apropiado activo para desarrollar semillas como se describe anteriormente. La expresión incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos. Por ejemplo, la sobreexpresión del gen puede comprender la sobreproducción de las enzimas implicadas en la biosíntesis de giberelina codificada por el gen con respecto a niveles de expresión basales o endógenos.

La reducción o abolición de la expresión génica como se describe anteriormente se puede conseguir usando la supresión sentido o antisentido, ARNi o la identificación de mutantes con expresión reducida. La reducción o abolición de la actividad enzimática se puede conseguir por la identificación de líneas existentes o inducidas por mutágeno con propiedades alteradas, por ejemplo, por TILLING (McCallum CM, et al., Plant Physiol. 123: 439-442; 2000).

Incrementar la concentración de GA por manipulación de la biosíntesis o producción de GA durante el desarrollo de la semilla según la presente invención conduce a un volumen y peso incrementados de la semilla. Se pueden conseguir incrementos de peso por grano de por lo menos 5%, apropiadamente en el intervalo de 5% a 40%, preferentemente de 10% a 40%, lo más preferentemente de 20% a 30%, comparado con la semilla de las plantas de control cultivadas en condiciones normales que no han sido sometidas a manipulación genética. Un incremento de peso de por lo menos 5% es estadísticamente significativo y representa una mejora medible y real en el rendimiento del
cultivo.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima del metabolismo de giberelina (es decir, biosíntesis o catabolismo de giberelina) en la preparación de semillas con un peso incrementado.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima del metabolismo de giberelina que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación en la preparación de semillas con un peso incrementado.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de enzimas de la inactivación de giberelina en la preparación de semillas con un peso incrementado.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para incrementar la resistencia a la sequía de una semilla, que comprende preparar una planta genéticamente modificada en la que el contenido de giberelina ha sido manipulado en la semilla de la planta, incrementando por ello el peso de la semilla.

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A modo de ilustración y sumario, el siguiente esquema expone un procedimiento típico por el cual se puede preparar material vegetal genéticamente modificado, que incluye plantas enteras, según un método de la presente invención para incrementar el tamaño de la semilla. Se puede considerar que el procedimiento incluye cinco
etapas:

(1): Aislar primero de una fuente apropiada (o librería de ADN) o sintetizar por medio de procedimientos conocidos una secuencia de ADN que codifica una proteína que exhibe actividad enzimática de giberelina, o una secuencia de ADN que al expresarse da una secuencia de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de tales enzimas;

(2): Unir funcionalmente dicha secuencia de ADN en una dirección 5' a 3' a las secuencias de expresión de la planta como se define aquí;

(3): Transformar la construcción de la etapa (2) en material vegetal por medio de procedimientos conocidos y expresarlo ahí;

(4): Análisis del material vegetal tratado según la etapa (3) para ver la presencia de una secuencia de ADN que codifica una proteína que exhibe actividad sintética de giberelina o para una secuencia de ácido nucleico que tiene actividad inhibidora de giberelina; y

(5): Regenerar opcionalmente el material vegetal transformado según la etapa (3) en una planta completa.

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Alternativamente, las plantas genéticamente modificadas en las que el contenido de giberelina ha sido incrementado en la semilla de la planta por medio de inactivación reducida, dando como resultado un peso incrementado de la semilla, se pueden generar como sigue:

(1): Identificar una fuente apropiada de ADN que codifica una enzima o enzimas implicadas en la biosíntesis de giberelina, por ejemplo, GA 2-oxidasas (GA2ox);

(2): Identificar los miembros de la familia genética que codifican la(s) enzima(s) que se expresa(n) en las semillas de la planta, por ejemplo, por análisis de transcripción por Northern blotting, RT-PCR o microarrays;

(3): Diseñar una única construcción de ARN, ARNi o ribozima antisentido que apuntará a todos los genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de giberelina que son expresadas en la semilla, si estos genes tienen alta identidad de secuencia. Alternativamente, diseñar construcciones de ARN, ARNi o ribozima antisentido separadas si la homología de la secuencia es más baja;

(3a): Para ARN antisentido, amplificar todo el ADNc o fragmentos menores (>200 bp) por PCR e insertar en un vector de expresión apropiado en orientación inversa al promotor; o

(3b): Diseñar una construcción de horquilla separada por un intrón (ihpARN); o

(3c): Diseñar una ribozima cabeza de martillo e insertarla en un vector apropiado;

(4): Las construcciones ribozima/ARNi/antisentido se pueden introducir en las especies diana por transformación mediada por Agrobacterium o bombardeo con microproyectil según sea apropiado, seguido de la verificación de los efectos en la expresión de GA2ox y el desarrollo de semillas.

Otro ejemplo de un enfoque para identificar una fuente de ADN apropiada es identificar la pérdida de función o las variantes de función reducida de los genes diana usando TILLING u otros métodos de detección de variantes de la secuencia. TILLING puede identificar variantes de la secuencia en el(los) gen(es) diana en poblaciones naturales o inducidas de especies de cultivo (McCallum, C.M., et al. (2000) Plant Physiol., 123: 439-442; Comai, L., et al. (2004) Plant J., 37: 778-786; Slade, A.J. et al. (2005) Nature Biotechnology, 23: 75-81). Un protocolo simplificado podría ser:

(1): Determinar los patrones de expresión génica (por ejemplo GA2ox) para identificar genes diana como anteriormente;

(2): Diseñar cebadores específicos de la secuencia para amplificar regiones ricas en exones de ADN genómico (cebadores específicos de homólogos para especies alopoliploides);

(3): Llevar a cabo el método TILLING, que implica PCR, templado del heterodúplex, escisión de células y detección de producto, para identificar variantes de secuencia y confirmar esto por secuenciación de ADN; y

(4): Retrocruzar para retirar mutaciones no deseadas y evaluar los efectos.

Una secuencia de ADN que codifica una proteína que exhibe actividad enzimática de giberelina como la usada aquí incluye secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima de metabolismo de giberelina, que puede ser biosíntesis de giberelina o catabolismo de giberelina, o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación. Una secuencia de ADN que codifica una molécula de ácido nucleico que es capaz de inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina puede ser una secuencia de ADN antisentido o una secuencia de ARN corto de interferencia capaz de activar un procedimiento de ARNi en la célula vegetal que conduce a la inhibición de la expresión génica del gen afectado de biosíntesis de giberelina.

En su más amplio aspecto, la invención se puede describir como un método para incrementar el rendimiento de cultivos vegetales por unidad de área de cultivo. Tales métodos de preparar plantas transgénicas que tienen tamaño de la semilla incrementado ofrecen varias ventajas, no siendo la menor de ellas un incremento general del rendimiento. Además, sustanciales ventajas están asociadas con la mayor capacidad de almacenamiento del tamaño de semilla incrementado. Estas incluyen vigor de las plántulas, por lo que semillas más grandes nutrirán durante un periodo mayor de tiempo la plántula en crecimiento antes de que se vuelva fotosintéticamente competente y autosostenible. Esto permitiría la plantación más profunda y de este modo mejoraría la resistencia a la sequía.

Las características preferidas para el segundo y subsecuentes aspectos de la invención son como para el primer aspecto cambiando lo que haya que cambiar.

La invención se describirá ahora adicionalmente por medio de referencias a los siguientes Ejemplos y Figuras que se proporcionan para los propósitos de ilustración solo y no se debe considerar que son limitantes de la invención. Se hace referencia a varias Figuras en las que:

La Figura 1 muestra un mapa de plásmido pMON57004. El plásmido pMON57004 usado como base para la construcción pDE45.

La Figura 2 muestra fotografías de semillas T3 de líneas (T2) transgénicas DE45 y una línea nula (azigótica).

La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos del promotor del gen Glutenin-1-D1 de alto peso molecular de trigo (Triticum aestivum cv Cheyenne; EMBL entrada AJ301618; Lamacchia et al., 2001) con sitios de restricción PacI y StuI añadidos en los extremos 5' y 3', respectivamente.

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de la región de codificación del gen de giberelina 20-oxidasa-1 de Arabidopsis thaliana (entrada Landsberg erecta); EMBL entrada X83379; Philips, et al., 1995) con sitios XhoI y SacI añadidos en los extremos 5' y 3' respectivamente.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos de la isozima-1 giberelina 20-oxidasa de Arabidopsis thaliana codificada por la Figura 4 (secuencia 2).

La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos del gen de giberelina 3\beta-hidroxilasa-1 de Arabidopsis (AtGA3ox1, Genbank No. L37126, Chiang HH et al., Plant Cell 7: 195-201; 1995).

La Figura 7 muestra la secuencia de proteínas del gen de giberelina 3\beta-hidroxilasa-1 de Arabidopsis (AtGA3ox1, Genbank No. L37126, Chiang HH et al., Plant Cell 7: 195-201; 1995).

La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos de la giberelina 1,2-desaturasa de Gibberella fujikuroi que vuelve las GAs resistentes a la inactivación (GAdes; Genbank No. AJ417493, Tudzynski B. et al., J. Biol. Chem. 278: 28635-28643; 2003).

La Figura 9 muestra la secuencia de proteínas de la giberelina 1,2-desaturasa de Gibberella fujikuroi que vuelve las GAs resistentes a la inactivación (Secuencias 5 & 6 GAdes; Genbank No. AJ417493, Tudzynski B. et al., J. Biol. Chem. 278: 28635-28643; 2003).

La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos de la enzima de inactivación de giberelina de trigo, giberelina 2\beta-hidroxilasa-2 (GA 2-oxidasa-2; TaGA2ox2; Phillips AL., et al., sin publicar).

La Figura 11 muestra la secuencia de proteínas de la enzima de inactivación de giberelina de trigo, giberelina 2\beta-hidroxilasa-2 (GA 2-oxidasa-2; TaGA2ox2; Phillips AL., et al., sin publicar).

La Figura 12 muestra los caminos principales de la biosíntesis de giberelina (GA) en plantas. Las enzimas marcadas son: (1) ent-copalildifosfato sintasa, (2) ent-kaureno sintasa, (3) ent-kaureno oxidasa, (4,5,6), ent-ácido kaurénico oxidasa, (7) GA 13-hidroxilasa, (8) GA 20-oxidasa, (9,a,b) GA 3\beta-hidroxilasa, (10) GA 2-oxidasa.

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Ejemplo 1

Construcción de un casete de expresión de HMWGlu::AtGA20ox1

El promotor del gen de Glutenin-1-D1 de alto peso molecular de trigo (Triticum aestivum cv Cheyenne; EMBL entrada AJ301618; Lamacchia et al., 2001) se amplificó por PCR de plásmido pHMWGlu-1-D1 usando los cebadores HMW-L (5'-AAATTAATTAAAAATATGCAACATAATTTCC-3') y HMW-R (5'-AAAAGGCCTGGTGATTAT
CAGTAATTGA-3') para crear sitios de restricción Pacl y Stul en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento de promotor de HMWGlu-1-D1 (Secuencia 1) se insertó en los sitios Pacl-Stul del plásmido pMON57004 (Figura 1) aguas arriba del intrón Actin-1 de arroz para dar el plásmido pMON57004-HMWG. La región de codificación del gen de giberelina 20-oxidasa-1 de Arabidopsis thaliana (entrada Landsberg erecta); EMBL entrada X83379; Phillips, et al., 1995) se amplificó por PCR del plásmido pAtGA20ox1 usando los cebadores 20ox1-L 5'-AAACTCGA
GATGGCCGTAAGTTTCGTAAC-3') y 20ox1-R (5'-AAAGAGCTCTTAGATGGGTTTGGTGAGCC-3') para crear sitios XhoI and SacI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento AtGA20ox1 (Secuencia 2), que codifica la isozima 1 de giberelina 20-oxidasa (Secuencia 3) se insertó en los sitios XhoI-SacI de pMON57004-HMWG, entre el intrón Actin-1 de arroz y el terminador NOS, para dar el plásmido pDE45.

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Ejemplo 2

Transformación de trigo

Se transformó trigo de pan (Triticum aestivum cv Cadenza) con el plásmido pDE45 por bombardeo con partículas de tejido embrionario inmaduro. Se cultivaron las plantas de trigo, en tiestos de 5 por 20 cm de diámetro, en una habitación medioambientalmente controlada con temperaturas del aire de 18ºC/15ºC (día/noche), una humedad relativa de 50-70% bajo ca. 350 \mumol/m^{2}/s de irradiación con un fotoperiodo de 16 horas. Escutelos inmaduros aislados de las semillas aproximadamente 14-16 días después de la antesis se co-transformaron usando el dispositivo de bombardeo con microproyectiles PDS1000/He (BioRad, Hemel Hempstead, UK) con pDE45 y pAHC25 (que contiene el gen marcador bar seleccionable; Christensen & Qual P 1996) con una relación molar 1:1. Las plantas se recuperaron vía cultivo de tejido in vitro usando los protocolos de seguimiento de selección Bialaphos desarrollados por Barcelo y Lazzeri (1995) y modificados por Pastori et al. (2001), Rasco-Gaunt et al. (2001) y Sparks & Jones (2004). Cuatro líneas T_{1} transgénicas (de T45-2 a T45-5) que sobrevivieron a la selección se transfirieron al suelo y se cultivaron hasta la madurez en un invernadero medioambientalmente controlado para producir semillas T_{2}. Veinte (20) semillas T_{2} de cada línea se re-sembraron y se analizo material de las hojas por PCR para identificar los agregantes que contenían el transgen DE45. Todas las líneas se cultivaron hasta la madurez y se recogió el grano T_{3}. Se produjeron plántulas de T_{3} y se analizaron para ver la presencia de la construcción por PCR para identificar líneas homocigóticas para el transgen.

Ejemplo 3

Análisis de semillas

Las semillas de las cuatro líneas transgénicas primarias, de T45-2 a T45-5, tenían semilla más grande que las líneas de control (no transformadas). Los pesos medios de las semillas (Tabla 1) indicaron que las plantas que contienen pDE45 tenían semillas que eran entre 10% y 40% más pesadas que el control.

Se observaron también semillas más grandes en las plantas T_{2} que dieron positivo para el transgen DE45 - véase la Figura 2. Los pesos medios de grano de estas semillas T_{3} se incrementaron también el 19-32% sobre las semillas de líneas nulas (azigóticas, no transgénicas) (Tabla 2).

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TABLA 1 Pesos y rendimientos del grano de las líneas transgénicas (T_{1}) primarias (semillas T_{2})

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1

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2 Pesos del grano de plantas T_{2} (semillas T_{3}) y líneas Nulas (azigóticas)

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2

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Ejemplo 4

Cultivo de una generación (T_{3}) subsecuente de plantas de trigo transgénico y análisis de la semilla (semillas T_{4})

Se cultivaron tres líneas transgénicas independientes (T_{3}), homocigóticas del casete HMWGlu-GA20ox, junto con el Control (trigo no transgénico cv. Cadenza), 15 plantas por línea, en un medio controlado. Las plantas se cultivaron en luz blanca a 700 micromoles por metro cuadrado por segundo durante 16 h al día, a una temperatura de 20ºC (día), 18ºC (noche) y 80% de humedad relativa. Se usó un patrón de bloques al azar para evitar los efectos de posición dentro de la cabina. En la etapa inicial, cada planta se redujo a tres vástagos principales; después del crecimiento y maduración de las semillas, se dejaron secar las plantas completamente y se recogieron las espigas. Se recogieron dos semillas de cada una de las dos espiguillas centrales de cada espiga y se pesaron individualmente las cuatro semillas. Todas las semillas de cada línea se mezclaron a continuación y se midió el volumen de 50 semillas por desplazamiento de etanol usando un medidor de densidades de vidrio de 10 ml (Tabla 3).

TABLA 3 Pesos y rendimientos del grano de líneas transgénicas (T_{3}) (semillas T_{4})

3

Referencias

Barcelo P, & Lazzeri P. (1995). In Methods in Molecular Biology: Plant Gene Transfer and Expression Protocols, p. 113-123. Eds H. Jones. Humana Press: Totowa N.J.

Christensen A H, & Quail P H. (1996). Transgenic Research. 5:213-218.

Lamacchia et al., (2001) J. Exp. Bot. 52:243-250.

Pastori et al., (2001) Journal of Experimental Botany. 52:857-863.

Phillips et al., (1995) Plant Physiol. 108:1049-1057.

Rasco-Gaunt et al., (2001) Journal of Experimental Botany. 52:865-874.

Sparks C A, & Jones H D. (2004). Transformation of wheat by biolistics, In Transgenic Crops of the World-Essential Protocols. Ed I. S. Curtis. Kluwer: Dordrecht: Netherlands.

Claims

1. Un método para incrementar el peso de semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por

A) {}\hskip0.2cm (i): transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación;

(ii): transformar la célula vegetal para expresar una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de inactivación de giberelina o

(iii): mutagénesis de la célula vegetal y

B): regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de la célula vegetal.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la planta es monocotiledónea.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que la planta monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste en trigo, maíz, centeno, arroz, avena, cebada, sorgo y mijo.

4. Un método según la reivindicación 1, en el que la planta es dicotiledónea.

5. Un método según la reivindicación 4, en el que la planta dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en soja, canola, y girasol.

6. Un método según la reivindicación 1, en el que el contenido de giberelina se ha incrementado por expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima del metabolismo de giberelina que comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 4 o la Figura 6, o su cadena complementaria o una secuencia homóloga a ella.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que la enzima del metabolismo de giberelina es giberelina 20-oxidasa (GA20ox) o giberelina 3\beta-hidroxilasa (GA 3-oxidasa).

8. Un método según la reivindicación 1, en el que se ha incrementado el contenido de giberelina por expresión de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación que comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 8.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que la enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación es giberelina 1,2-desaturasa (GAdes).

10. Un método según la reivindicación 1, en el que se ha incrementado el contenido de giberelina por expresión de una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina que comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 10.

11. Un método según la reivindicación 10, en el que la enzima de inactivación de giberelina es la enzima giberelina 2\beta-hidroxilasa (GA 2-oxidasa).

12. Un método según cualquier reivindicación precedente, en el que el incremento del peso de la semilla es por lo menos del 5%.

13. Un método según la reivindicación 12, en el que el incremento del peso de la semilla está en el intervalo de 5% a 40%.

14. El uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina para la preparación de semillas con un peso incrementado.

15. El uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación en la preparación de semillas con un peso incrementado.

16. El uso de una secuencia de ácido nucleico que inhibe la expresión de enzimas de inactivación de giberelina en la preparación de semillas con un peso incrementado.

17. Un método para incrementar la resistencia a la sequía de una semilla, que comprende preparar una planta genéticamente modificada en la que se ha incrementado el contenido de giberelina en la semilla de la planta, incrementando por ello el peso de la semilla.