ES2348668T3 - Un mã‰todo para aumentar el peso de semillas. - Google Patents
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Abstract
Un método para incrementar el peso de semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por A) (i) transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación; (ii) transformar la célula vegetal para expresar una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de inactivación de giberelina o (iii) mutagénesis de la célula vegetal y B) regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de la célula vegetal.
Description
Un método para aumentar el peso de semillas.
La presente invención se refiere a un método
para incrementar el peso de semillas.
Se han desarrollado técnicas de cultivo de
plantas desde métodos tradicionales hasta el uso de tecnología de
ADN recombinante para introducir deseables características genéticas
en plantas, particularmente especies de plantas de cultivo
agrícola, de interés.
Los estudios previos en este área han
descubierto que el crecimiento vegetal se puede regular por la
expresión de enzimas importantes en la biosíntesis de giberelinas
(GAs). Las giberelinas son un gran grupo de ácidos carboxílicos
diterpenoides que están presentes en todas las plantas superiores y
algunos hongos. Ciertos miembros del grupo funcionan como hormonas
vegetales y están implicadas en muchos procesos del desarrollo, que
incluyen la germinación de la semilla, extensión del tallo,
expansión de las hojas, inicio y desarrollo de las flores, y
crecimiento de las semillas y frutos. Las GAs biológicamente activas
son usualmente compuestos de C_{19} que contienen una
19-10 lactona, un ácido carboxílico de
C-7 y un grupo 3\beta-hidroxilo.
Las últimas etapas de su biosíntesis implican la retirada oxidativa
de C-20 y la hidroxilación en C-3.
La hidroxilación en la posición 2\beta da como resultado la
producción de productos biológicamente inactivos. Esta reacción es
la ruta más importante para el metabolismo de GA en plantas y
asegura que las hormonas activas no se acumulan en los tejidos
vegetales. Las enzimas biosintéticas de GA
7-oxidasa, 20-oxidasa,
3\beta-hidroxilasa y
2\beta-hidroxilasa son todas dioxigenasas
dependientes de 2-oxoglutarato. Estas son un gran
grupo de enzimas para las que el 2-oxoglutarato es
un co-substrato que se descarboxila a succinato como
parte de la reacción (véase la revisión por Hedden, P. and Kamiya,
Y., en Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48.
431-460
(1997)).
(1997)).
Los reguladores químicos del crecimiento vegetal
se han usado en horticultura y agricultura durante muchos años.
Muchos de estos compuestos funcionan cambiando la concentración de
GA en los tejidos vegetales. Por ejemplo, los retardantes del
crecimiento inhiben la actividad de las enzimas implicadas en la
biosíntesis de GA y por ello reducen el contenido de GA. Tales
productos químicos se usan comúnmente, por ejemplo, para prevenir
el encamado en cereales y para controlar el crecimiento de plantas
hortícolas y ornamentales. A la inversa, se pueden aplicar GAs a
plantas, tales como en la aplicación de GA_{3} a uvas sin semillas
para mejorar el tamaño y forma de la uva, y a grano de cebada para
mejorar la producción de malta. Las mezclas de GA_{4} y GA_{7}
se aplican a manzanas para mejorar la calidad de la fruta y a
ciertas coníferas para estimular la producción de piñas. Hay varios
problemas asociados al uso de reguladores de crecimiento. Algunos
de los retardantes del crecimiento son muy persistentes en el suelo
haciendo difícil cultivar otros cultivos después del cultivo
tratado. Otros requieren aplicaciones repetidas para mantener el
efecto requerido. Es difícil restringir la aplicación a los órganos
objetivo de la planta sin que se extienda a otros órganos o plantas
y sin que tengan efectos indeseables. La administración precisa de
la aplicación del regulador del crecimiento puede ser una labor muy
intensa. Una opción no química para controlar la morfología de la
planta es, de este modo, muy
deseable.
deseable.
La biosíntesis de giberelina ha sido modificada
en plantas transgénicas. Véase por ejemplo, el documento WO
94/28141 que publica la clonación y expresión de un gen de
giberelina (GA) 20-oxidasa que cataliza la penúltima
etapa en al biosíntesis de GA, o el documento WO 99/66029 que
publica la clonación y expresión de secuencias de ácido nucleico
que codifican una enzima giberelina
2\beta-hidroxilasa (GA 2-oxidasa)
que es una enzima de inactivación de giberelina. Cataliza la
2\beta-oxidación (2-oxidación) de
una molécula de giberelina para introducir un grupo hidroxilo en
C-2 y cataliza adicionalmente la oxidación del grupo
hidroxilo introducido en C-2 para dar el derivado
de cetona.
Se ha introducido ahora un sistema de
nomenclatura para los genes de biosíntesis de GA (Coles et
al. The Plant Journal 17(5) 547-556
(1999). Las referencias a "giberelina" incluyen todas las
moléculas de giberelina bioactiva, a menos que el contexto lo
especifique de otro modo.
Ha sido un objetivo desde hace mucho tiempo en
agricultura ser capaces de incrementar el tamaño de las semillas
producidas por especies vegetales de interés. Para muchas plantas,
las semillas son el principal producto a ser cosechado y un
incremento de tamaño sería beneficioso para mejorar los rendimientos
totales de la cosecha. Para todas las especies de plantas
agrícolas, un incremento del tamaño de la semilla puede ayudar al
éxito de trasplantar un cultivo proporcionando a la planta en
desarrollo un mayor recurso para la germinación de la semilla.
Se ha encontrado ahora sorprendentemente que por
la manipulación de la expresión de enzimas giberelina se puede
conseguir un incremento del peso de las semillas.
Según un primer aspecto de la invención, se
proporciona un método para incrementar el peso de semillas,
comprendiendo el método modificar genéticamente una célula vegetal
para incrementar el contenido de giberelina de la semilla por A)
(i) transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de
ácido nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina
o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la
inactivación; (ii) transformar la célula vegetal para expresar una
molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de
inactivación de giberelina; o (iii) mutagénesis de la célula
vegetal y B) regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de
la célula vegetal.
Las semillas producidas según un método de la
invención tienen un peso incrementado en comparación con las
semillas de las plantas de control. Las plantas y sus semillas
derivadas de dichas plantas obtenibles directamente por el método
de la invención no están incluidas dentro del alcance de la presente
invención.
Las semillas son los óvulos vegetales maduros
que contienen un embrión de una planta gimnosperma o
angiosperma.
Las especies de plantas preferidas incluyen pero
no están limitadas a plantas monocotiledóneas que incluyen semillas
y su progenie o propágulos, por ejemplo, Lolium, Zea, Triticum,
Sorghum, Triticale, Saccharum, Bromus, Oryzae, Avena, Hordeum,
Secale y Setaria. Las plantas transgénicas especialmente útiles son
plantas de maíz, trigo, cebada y sus semillas. Apropiadamente, las
monocotiledóneas se seleccionan del grupo que consiste en trigo,
maíz, centeno, arroz, avena, cebada, sorgo y mijo.
Las plantas dicotiledóneas para su
transformación según la presente invención y las plantas
transgénicas preferidas incluyen pero no están limitadas a las
especies Fabaceae, Solatium, Brassicaceae, especialmente patatas,
alubias, repollo, árboles forestales, rosas, clemátide, canola,
girasol, crisantemo, flor de pascua y boca de dragón.
Alternativamente, la planta transgénica puede ser una planta
dicotiledónea. Apropiadamente, la dicotiledónea se selecciona del
grupo que consiste en soja, canola y girasol.
Las plantas usadas en los métodos de la
invención están modificadas para expresar una secuencia de ácido
nucleico que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina, o
una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la
inactivación, o para expresar moléculas de ácido nucleico para
inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina, o
para manipular de otro modo el contenido de giberelina en la
semilla, tal como por ejemplo por mutagénesis, convenientemente por
mutagénesis química. La expresión de una secuencia de ácido nucleico
incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o
endógenos, que se puede definir con respecto a los niveles de
expresión en una planta sin alterar o de control de la misma
especie. La expresión de tales secuencias de ácido nucleico por lo
tanto incluye la expresión de un gen exógeno introducido dentro de
la planta, así como la introducción de secuencias de promotor para
dirigir la expresión del gen endógeno, tal como, por ejemplo,
recombinación homóloga.
La secuencia de ácido nucleico puede ser como se
muestra en una cualquiera de las Figuras 4, 6, 8 o 10, o su cadena
complementaria o una secuencia homóloga de ella. Alternativamente,
el ácido nucleico puede ser una secuencia de ácido nucleico que
codifica una secuencia de aminoácido o una secuencia de proteína
como se muestra en una cualquiera de las Figuras 5, 7, 9 o 11, o su
cadena complementaria o una secuencia homóloga de ella.
El grado de identidad entre las secuencias de
aminoácido puede ser por lo menos 40%, apropiadamente 50% o más
alto, por ejemplo, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%. Al
nivel del nucleótido, el grado de identidad puede ser por lo menos
50%, apropiadamente 60% o más alto, por ejemplo, 65%, 70%, 75%, 80%,
85%, 90% o 95%. Una secuencia homóloga puede tener una identidad de
secuencia como se describe anteriormente. La homología de la
secuencia se puede determinar usando cualquier protocolo
convenientemente disponible, por ejemplo, usando Clustal X^{TM}
de la Universidad de Estrasburgo y las tablas e identidades
producidas usando Genedoc^{TM} (Karl B. Nicholas).
Las secuencias de ácido nucleico usadas en los
métodos de la invención se hibridan con una secuencia definida
anteriormente en condiciones exigentes, o son homólogas o se
hibridarían en condiciones exigentes a tal secuencia sino fuera por
la degeneración del código genético, o una secuencia de
oligonucleótido específica para cualquiera de tales secuencias.
Las condiciones exigentes de hibridación pueden
estar caracterizadas por bajas concentraciones de sal o condiciones
de alta temperatura. Por ejemplo, se puede definir que son
condiciones muy exigentes la hibridación a ADN ligado a un soporte
sólido en NaHPO_{4} 0,5M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7%, ImM
EDTA a 65ºC, y lavado en 0,1xSSC/0,1% SDS a 68ºC (Ausubel et
al. Eds. "Current Protocols in Molecular Biology" 1, página
2.10.3, publicado por Green Publishing Associates, Inc. and John
Wiley & Sons, Inc., New York (1989)). En algunas circunstancias
se pueden requerir condiciones menos exigentes. Tal como se usa en
la presente solicitud, se pueden definir condiciones moderadamente
exigentes que comprenden lavar en 0,2xSSC/0,1% SDS a 42ºC (Ausubel
et al. (1989) supra). La hibridación se puede hacer
también más exigente por la adición de cantidades crecientes de
formamida para desestabilizar el dúplex híbrido de ácido nucleico.
De este modo las condiciones particulares de hibridación se pueden
manipular fácilmente, y se seleccionarán generalmente según los
resultados deseados. En general, las temperaturas de hibridación
convenientes en presencia de formamida al 50% son 42ºC para una
sonda que es de 95 a 100% homóloga al ADN objetivo, 37ºC para 90 a
95% de homología, y 32ºC para 70 a 90% de homología.
La expresión de una secuencia de ácido nucleico
que codifica una enzima del metabolismo de giberelina (es decir,
una enzima de biosíntesis o catabolismo de giberelina) puede
comprender la expresión de (i) la enzima giberelina
20-oxidasa (GA20ox), que cataliza la penúltima etapa
en la biosíntesis de GA, como en el ejemplo incluido (Figuras 4
& 5); o (ii) la enzima giberelina
3[beta]-hidroxilasa (GA
3-oxidasa, GA3ox, por ejemplo, AtGA3ox1, Figuras 6
& 7) que cataliza la última etapa en la biosíntesis de GA, por
ejemplo, AtGA3ox1, Genbank No. L37126, Chiang HH et al.,
Plant Cell 7: 195-201; 1995). La expresión incluye
la sobreexpresión por encima de los niveles basal o endógeno.
La expresión de una secuencia de ácido nucleico
que codifica una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la
inactivación puede comprender la producción de la enzima giberelina
1,2-desaturasa (por ejemplo, Figuras 8 & 9) que
vuelve las GAs resistentes a la inactivación (GAdes; Genbank No.
AJ417493, Tudzynski B, et al., J. Biol. Chem. 278:
28635-28643; 2003). La expresión incluye la
sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos, por
ejemplo, la sobreexpresión del ácido nucleico puede comprender la
sobreproducción de la enzima con respecto a los niveles basales o
endógenos de expresión.
La expresión de moléculas de ácido nucleico para
inhibir la expresión de enzimas de inactivación de giberelina (es
decir, por reducción o abolición de la expresión del gen) puede
comprender la reducción de actividad o concentración de la enzima
de inactivación de giberelina endógena giberelina
2\beta-hidroxilasa (GA 2-oxidasa);
GA2ox, por ejemplo. Figuras 10 & 11:TaGA2ox2).
La mutagénesis de la planta se puede conseguir
convenientemente por cualquier técnica de mutagénesis química o
inducida por radionúclido, o por ejemplo por TILLING (McCallum CM,
et al., Plant Physiol. 123: 439-442;
2000).
Otras secuencias de ácido nucleico según este
aspecto del método o uso de la presente invención pueden comprender
también una secuencia de ácido nucleico como se define previamente
en el que la secuencia codificante está unida operativamente a un
promotor. El promotor puede ser constitutivo y/o específico para la
expresión en una célula o tejido vegetal particular,
preferentemente en semillas.
Preferentemente, la secuencia de ácido nucleico
comprende un promotor que dirige la expresión de una secuencia de
ácido nucleico descrita anteriormente. Tales secuencias promotoras
incluyen promotores naturales en 5' respecto a la secuencia de
codificación de las secuencias mostradas en las Figuras 4, 6, 8 o
10. Los promotores se pueden seleccionar también para expresar
constitutivamente el ácido nucleico que codifica para las secuencias
génicas preferidas definidas aquí. La expresión del ácido nucleico
incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales o
endógenos. Se podrían usar también promotores que son inducidos por
factores internos o externos, tales como productos químicos,
hormonas vegetales, luz o estrés. Los ejemplos son los genes
relacionados con la patogénesis inducibles por ácido salicílico, la
expresión génica controlable por cobre (Mett et al. Proc.
Nat'l Acad. Sci. USA 90 4567-4571 (1993)) y la
expresión génica regulada por tetraciclina (Gatz et al.
Plant Journal 2 397-404 (1992)). Los ejemplos de
genes inducibles por giberelina son \gamma-TIP
(Phillips, A.L., & Huttly, A.K., Plant Mol. Biol. 24
603-615 (1994)) y GAST (Jacobsen, S.E., &
Olszewski, N.E., Planta 198 78-86 (1996).
Los promotores apropiados para dirigir la
expresión transgénica para desarrollar semillas incluyen:
- (i)
- Promotor de Glutenina-1-D1 de alto peso molecular de trigo (Figura 3; Lamacchia et al., 2001);
- (ii)
- Promotor End-1 de cebada (Clarke BC, et al., Aust. J. Agric. Res. 52: 1181-1193; 2001);
- (iii)
- Promotor MAC-1 de maíz (Sheridan et al., Genetics 142: 1009-1020, 1996);
- (iv)
- Promotor Cat3 de maíz (Genbank No. L05934, Abler et al., Plant Mol. Biol. 22: 10131-10138, 1993);
- (v)
- Atimyc1 de Arabidopsis (Urao et al., Plant J. Mol. Biol. 32: 571-57, 1996; Conceicao et al., Plant 5: 493-505, 1994);
- (vi)
- napA de Brassica napus (GenBank No. J02798);
- (vii)
- Familia del gen Napin de Brassica napus (Sjodahl et al., Planta 197: 264-271, 1995);
- (viii)
- Promotor de proteína de almacenamiento 2S de Brassica napus (Dasgupta et al., Gene 133: 301-302, 1993);
- (ix)
- Promotor de la familia de genes de proteína de almacenamiento 2S de Arabidopsis;
- (x)
- Oleosina 20 kD de Brassica napsus (GenBank No. M63985);
- (xi)
- Promotor de oleosina A (GenBank No. U09118) o promotor de oleosina B (GenBank No. U09119) de soja;
- (xii)
- Promotor de oleosina de Arabidopsis (GenBank No. Z17657);
- (xiii)
- Promotor de oleosina 18 kD de maíz (GenBank No. J05212), Lee, Plant Mol. Biol. 26: 1981-1987, 1994);
- (xiv)
- Promotor de proteína rica en azufre de bajo peso molecular de soja (Choi et al., Mol. Gen. Genet. 246: 266-268, 1995);
- (xv)
- Promotores derivados de genes que codifican zein (que incluyen los genes de 15 kD, 16 kD, 19 kD, 22 kD y gamma zeina, Pedersen et al, Cell 29: 1015-1026, 1982).
El intrón de actina-1 de arroz
se puede usar también para incrementar la acumulación de ARNm
transgénico, pero esto no es necesario para la invención.
Las secuencias de ácido nucleico del método o
uso de la presente invención puede también codificar ARN que es
antisentido al ARN que se encuentra normalmente en una célula
vegetal o puede codificar ARN que es capaz de escindir ARN que se
encuentra normalmente en una célula vegetal. En tal planteamiento,
todo el ADNc o fragmentos menores (>200 bp) se pueden amplificar
por PCR e insertar en un vector de expresión apropiado en
orientación inversa al cebador. Por consiguiente, la presente
invención proporciona también una secuencia de ácido nucleico que
codifica una ribozima capaz de escisión específica de ARN codificado
por un gen para una enzima de inactivación de giberelina, tal como
el gen de giberelina 2-oxidasa. Tal ADN que codifica
ribozima sería útil generalmente para inhibir la desactivación de
giberelinas. Alternativamente, el ARN puede codificar una secuencia
corta de ARN de interferencia capaz de activar el procedimiento
celular de ARNi para degradar una especie de ARN objetivo de
interés, tal como codificación de ARN de una enzima de desactivación
de giberelina.
El ARNi puede implicar construcciones de
horquilla separadas por un intrón "hairpin
intron-spliced" (ihpARN) (Smith, N.A., et
al. (2000) Nature, 407: 319-320), usando
300-600 bp de la región transcrita del objetivo
insertado en una orientación sentido y antisentido flanqueando el
intrón de un vector ihpARN tal como pHELLSGATE (Wesley, S.V., et
al. (2001) Plant J., 27: 581-590). El diseño de
ribozimas cabeza de martillo contra secuencias objetivo, por
ejemplo, GA2ox, puede seguir pautas, por ejemplo, Fritz, JJ., et
al. (Methods (2002), 28: 276-285). La ribozima
se produciría a partir de oligonucleótidos sintéticos, templados e
insertados en un vector apropiado. Es preferible usar promotores
específicos del tejido para la expresión de
ribozimas/ARNi/antisentido en plantas transgénicas para evitar
efectos pleyotrópicos en otros tejidos. Los promotores listados en
la solicitud son apropiados. Las construcciones o fragmentos de
ARNi se introducen en las especies objetivo por métodos de rutina
en la técnica como se describe
aquí.
aquí.
Las secuencias de ácido nucleico según el método
o uso de la presente invención pueden comprender adicionalmente
secuencias de señal 5' para dirigir la expresión del producto de la
proteína expresada. Tales secuencias de señal pueden incluir
también secuencias de dirección de proteína que pueden dirigir una
proteína expresada a una localización particular dentro o fuera de
una célula hospedante que expresa tal secuencia de ácido nucleico.
Alternativamente, la secuencia de ácido nucleico puede comprender
también una señal 3' tal como una señal de poliadenilación u otra
señal reguladora.
La preparación de plantas transgénicas que
tienen peso de la semilla incrementado se puede preparar por lo
tanto por modificación de una célula vegetal para que contenga una
secuencia de ácido nucleico como se describe anteriormente que
proporciona la expresión de una secuencia de ácido nucleico que
codifica una enzima de biosíntesis de giberelina o una enzima que
vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación, o para
expresión de moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión
de enzimas de inactivación de giberelina. Tales secuencias de ácido
nucleico como se define aquí se pueden introducir en células
vegetales por cualquier medio apropiado. La expresión de un ácido
nucleico incluye la sobreexpresión por encima de los niveles basales
o endógenos.
Preferentemente, las secuencias de ácido
nucleico del método o uso de la presente invención se introducen en
células vegetales por transformación usando un vector apropiado, por
ejemplo, pMON57004 como se muestra en la Figura 1.
Alternativamente, un vector binario, por ejemplo, una versión
modificada de pGPTV-Kan (Becker et al. Plant
Mol. Biol. 20 1195-1197 (1992)) en el que el gen
reportero de \beta-glucuronidasa se reemplaza con
el casete de expresión HMWGIu-GA20ox1. Tales
plásmidos se pueden introducir a continuación en Agrobacterium
tumefaciens por electroporación y se pueden transferir a
continuación a las células hospedantes vía un procedimiento de
filtración a vacío. Alternativamente, se puede conseguir la
transformación usando un vector de plásmido Ti desarmado y llevado
por Agrobacterium por procedimientos conocidos en la técnica, por
ejemplo, como se describe en los documentos
EP-A-0116718 y
EP-A-0270822. Cuando Agrobacterium
es inefectiva, el ADN extraño se podría introducir directamente en
las células vegetales usando un aparato de descarga eléctrica solo,
tal como, por ejemplo, en la transformación de plantas
monocotiledóneas. Cualquier otro método que proporciona la
incorporación estable de la secuencia de ácido nucleico dentro del
ADN nuclear o ADN mitocondrial de cualquier célula vegetal sería
también apropiado. Esto incluye especies de planta que no son aún
capaces de transformación genética.
Preferentemente, las secuencias de ácido
nucleico como se describe aquí para la introducción en células
hospedante contienen también un segundo gen quimérico (o gen
"marcador") que permite que una planta transformada que
contiene el ADN extraño se distinga fácilmente de otras plantas que
no contienen el ADN extraño. Los ejemplos de tal gen marcador
incluyen resistencia a antibióticos
(Herrera-Estrella et al. EMBO J.
2987-2995 (1983)), resistencia a herbicidas
(EP-A-0242246) y expresión de
glucuronidasa (GUS) (EP-A-0344029).
La expresión del gen marcador se controla preferentemente por un
segundo promotor que permite la expresión en células en todas las
etapas de desarrollo de modo que la presencia del gen marcador puede
ser determinada en todas las etapas de regeneración de la
planta.
Una planta entera se puede regenerar a partir de
una única célula vegetal transformada u otras partes de ella, tal
como material de propagación, es decir, protoplastos, callos,
tejidos, órganos, semillas, embriones, óvulos, cigotos, tubérculos,
raíces, etc.) que incluyen secuencias de ácido nucleico como se
describe anteriormente.
En el contexto de la presente invención, se debe
advertir que la expresión "genéticamente modificado" no se
debe considerar que está limitada al referirse a un organismo como
se define anteriormente que contiene en su línea germinal uno o más
genes de otras especies, aunque muchos de tales organismos
contendrán tal gen o genes, es decir, una planta
"transgénica". Mejor dicho, la expresión "genéticamente
modificado" se refiere más ampliamente a cualquier organismo
cuya línea germinal ha sido objeto de intervención técnica, por
ejemplo, por tecnología de ADN recombinante o mutagénesis química.
De modo que, por ejemplo, un organismo en cuya línea germinal se ha
suprimido, duplicado, activado o modificado un gen endógeno es un
organismo genéticamente modificado para los propósitos de esta
invención tanto como un organismo a cuya línea de germinación se ha
añadido una secuencia de ADN exógeno.
El análisis de células vegetales, tejido y
plantas para ver la presencia de secuencias de ADN específico se
puede realizar por análisis Southern como se describe en Sambrook
et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
edition (1989)). Este análisis se puede realizar también usando la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por técnicas bien
conocidas en la técnica.
La transformación de células vegetales incluye
separar las células transformadas de aquellas que no han sido
transformadas. Un método conveniente para tal separación o selección
es incorporar dentro del material que se va a insertar en la célula
transformada un gen para un marcador de selección. Como resultado
solo las células que han sido transformadas con éxito contendrán el
gen marcador. El producto de traducción del gen marcador conferirá
a continuación una característica fenotípica que hará posible la
selección. Usualmente, la característica fenotípica es la capacidad
para sobrevivir en presencia de algún agente químico, tal como un
antibiótico, por ejemplo, kanamicina, G418, paromomicina, etc., que
se coloca en un medio de selección. Algunos ejemplos de genes que
confieren resistencia a antibióticos, incluyen por ejemplo, aquellos
que codifican para neomicina fosfotransferasa para resistencia a
kanamicina (Velten et al EMBO J. 3 2723-2730
(1984)), resistencia a higromicina (van den Elzen et al.,
Plant Mol. Biol. 5 299-392 (1985)), el gen de
resistencia a kanamicina (NPT II) derivado de Tn5 (Bevan et
al. Nature 304 184-187 (1983); McBride et
al., Plant Mol. Biol. 14 (1990)) y cloranfenicol
acetiltransferasa. El gen PAT descrito en Thompson et al.
(EMBO J. 6 2519-2523 (1987)) se puede usar para
conferir resistencia a herbicidas.
Un ejemplo de un gen útil principalmente como
marcador analizable en cultivos de tejido para identificación de
células vegetales que contienen vectores genéticamente manipulados
es un gen que codifica una enzima que produce un producto
cromógeno. Un ejemplo es el gen que codifica la producción de
\beta-glucuronidasa (GUS). Esta enzima se usa
mucho y su preparación y uso se describe en Jefferson (Plant Mol.
Biol. Reporter 5 387-405 (1987)).
Una vez que las células vegetales transformadas
se han cultivado en el medio de selección, se seleccionan las
células supervivientes para estudio y manipulación adicional. Los
métodos de selección y los materiales son bien conocidos por los
expertos en la técnica, permitiéndole a uno escoger células
supervivientes con un alto grado de previsibilidad de que las
células escogidas habrán sido transformadas con éxito con ADN
exógeno.
Después de la transformación de la célula
vegetal o planta usando, por ejemplo, el plásmido Ti de
Agrobacterium, cuyas células vegetales o plantas transformadas por
el plásmido Ti de modo que se exprese la enzima, se puede
seleccionar por medio de un marcador fenotípico apropiado. Estos
marcadores fenotípicos incluyen pero no están limitados a,
resistencia a antibióticos. Otros marcadores fenotípicos son
conocidos en la técnica y se pueden usar en esta invención.
Se generan clones positivos siguiendo
procedimientos bien conocidos en la técnica. Las plantas
subsecuentemente transformadas se evalúan para ver la presencia de
las deseadas propiedades y/o el punto hasta el que se expresan las
deseadas propiedades. Una primera evaluación puede incluir, por
ejemplo, el nivel de resistencia bacterial/fúngica de las plantas
transformadas, heredabilidad estable de las propiedades deseadas,
ensayos de campo y similares.
El metabolismo de giberelina es el término usado
para describir el camino de la enzima para la biosíntesis en la
célula de las moléculas de giberelina activa y para la regulación
del camino biosintético por la actividad de las enzimas inhibidoras
o degradantes u otros mecanismos, que incluye el catabolismo de
giberelinas.
La manipulación del contenido de giberelina,
preferentemente el contenido de giberelina bioactiva como se
describe aquí comprende la expresión de una secuencia de ácido
nucleico que codifica una enzima del metabolismo de giberelina (es
decir, biosíntesis o catabolismo de giberelina) o una enzima que
vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación, o la
expresión de moléculas de ácido nucleico para inhibir la expresión
de enzimas de inactivación de giberelina. La expresión incluye la
sobreexpresión por encima de los niveles basales o endógenos.
Preferentemente, la manipulación del metabolismo de giberelina está
provocada por la expresión de las secuencias de ácido nucleico como
se define aquí en las semillas de la planta, o por la ablación de
la expresión de los genes que controlan la inactivación de
giberelinas en las semillas de la planta. El resultado de tales
manipulaciones es un incremento del nivel de giberelina en las
semillas comparado con los niveles normales de giberelinas en una
semilla de control de la misma especie.
Las moléculas de giberelina que se sabe que
aparecen como moléculas biológicamente activas en tejidos vegetales,
incluyendo semillas son GA_{1}, GA_{3}, GA_{4} y GA_{7}.
Sin embargo, el uso del término "giberelinas" también incluye
otras giberelinas bioactivas. De hecho, el método de la invención se
refiere a la abundancia creciente de GAs bioactivas en su
conjunto.
La sobreproducción de enzimas implicadas en la
biosíntesis de giberelina codificadas por estos genes a los que nos
referimos anteriormente se puede conseguir por la expresión que
incluye la sobreexpresión del gen en un promotor apropiado activo
para desarrollar semillas como se describe anteriormente. La
expresión incluye la sobreexpresión por encima de los niveles
basales o endógenos. Por ejemplo, la sobreexpresión del gen puede
comprender la sobreproducción de las enzimas implicadas en la
biosíntesis de giberelina codificada por el gen con respecto a
niveles de expresión basales o endógenos.
La reducción o abolición de la expresión génica
como se describe anteriormente se puede conseguir usando la
supresión sentido o antisentido, ARNi o la identificación de
mutantes con expresión reducida. La reducción o abolición de la
actividad enzimática se puede conseguir por la identificación de
líneas existentes o inducidas por mutágeno con propiedades
alteradas, por ejemplo, por TILLING (McCallum CM, et al.,
Plant Physiol. 123: 439-442; 2000).
Incrementar la concentración de GA por
manipulación de la biosíntesis o producción de GA durante el
desarrollo de la semilla según la presente invención conduce a un
volumen y peso incrementados de la semilla. Se pueden conseguir
incrementos de peso por grano de por lo menos 5%, apropiadamente en
el intervalo de 5% a 40%, preferentemente de 10% a 40%, lo más
preferentemente de 20% a 30%, comparado con la semilla de las
plantas de control cultivadas en condiciones normales que no han
sido sometidas a manipulación genética. Un incremento de peso de por
lo menos 5% es estadísticamente significativo y representa una
mejora medible y real en el rendimiento del
cultivo.
cultivo.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica
una enzima del metabolismo de giberelina (es decir, biosíntesis o
catabolismo de giberelina) en la preparación de semillas con un
peso incrementado.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica
una enzima del metabolismo de giberelina que vuelve las giberelinas
resistentes a la inactivación en la preparación de semillas con un
peso incrementado.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica
una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de enzimas de
la inactivación de giberelina en la preparación de semillas con un
peso incrementado.
Según un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un método para incrementar la resistencia a la sequía
de una semilla, que comprende preparar una planta genéticamente
modificada en la que el contenido de giberelina ha sido manipulado
en la semilla de la planta, incrementando por ello el peso de la
semilla.
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A modo de ilustración y sumario, el siguiente
esquema expone un procedimiento típico por el cual se puede
preparar material vegetal genéticamente modificado, que incluye
plantas enteras, según un método de la presente invención para
incrementar el tamaño de la semilla. Se puede considerar que el
procedimiento incluye cinco
etapas:
etapas:
- (1)
- Aislar primero de una fuente apropiada (o librería de ADN) o sintetizar por medio de procedimientos conocidos una secuencia de ADN que codifica una proteína que exhibe actividad enzimática de giberelina, o una secuencia de ADN que al expresarse da una secuencia de ácido nucleico capaz de inhibir la expresión de tales enzimas;
- (2)
- Unir funcionalmente dicha secuencia de ADN en una dirección 5' a 3' a las secuencias de expresión de la planta como se define aquí;
- (3)
- Transformar la construcción de la etapa (2) en material vegetal por medio de procedimientos conocidos y expresarlo ahí;
- (4)
- Análisis del material vegetal tratado según la etapa (3) para ver la presencia de una secuencia de ADN que codifica una proteína que exhibe actividad sintética de giberelina o para una secuencia de ácido nucleico que tiene actividad inhibidora de giberelina; y
- (5)
- Regenerar opcionalmente el material vegetal transformado según la etapa (3) en una planta completa.
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Alternativamente, las plantas genéticamente
modificadas en las que el contenido de giberelina ha sido
incrementado en la semilla de la planta por medio de inactivación
reducida, dando como resultado un peso incrementado de la semilla,
se pueden generar como sigue:
- (1)
- Identificar una fuente apropiada de ADN que codifica una enzima o enzimas implicadas en la biosíntesis de giberelina, por ejemplo, GA 2-oxidasas (GA2ox);
- (2)
- Identificar los miembros de la familia genética que codifican la(s) enzima(s) que se expresa(n) en las semillas de la planta, por ejemplo, por análisis de transcripción por Northern blotting, RT-PCR o microarrays;
- (3)
- Diseñar una única construcción de ARN, ARNi o ribozima antisentido que apuntará a todos los genes que codifican enzimas implicadas en la biosíntesis de giberelina que son expresadas en la semilla, si estos genes tienen alta identidad de secuencia. Alternativamente, diseñar construcciones de ARN, ARNi o ribozima antisentido separadas si la homología de la secuencia es más baja;
- (3a)
- Para ARN antisentido, amplificar todo el ADNc o fragmentos menores (>200 bp) por PCR e insertar en un vector de expresión apropiado en orientación inversa al promotor; o
- (3b)
- Diseñar una construcción de horquilla separada por un intrón (ihpARN); o
- (3c)
- Diseñar una ribozima cabeza de martillo e insertarla en un vector apropiado;
- (4)
- Las construcciones ribozima/ARNi/antisentido se pueden introducir en las especies diana por transformación mediada por Agrobacterium o bombardeo con microproyectil según sea apropiado, seguido de la verificación de los efectos en la expresión de GA2ox y el desarrollo de semillas.
Otro ejemplo de un enfoque para identificar una
fuente de ADN apropiada es identificar la pérdida de función o las
variantes de función reducida de los genes diana usando TILLING u
otros métodos de detección de variantes de la secuencia. TILLING
puede identificar variantes de la secuencia en el(los)
gen(es) diana en poblaciones naturales o inducidas de
especies de cultivo (McCallum, C.M., et al. (2000) Plant
Physiol., 123: 439-442; Comai, L., et al.
(2004) Plant J., 37: 778-786; Slade, A.J. et
al. (2005) Nature Biotechnology, 23: 75-81). Un
protocolo simplificado podría ser:
- (1)
- Determinar los patrones de expresión génica (por ejemplo GA2ox) para identificar genes diana como anteriormente;
- (2)
- Diseñar cebadores específicos de la secuencia para amplificar regiones ricas en exones de ADN genómico (cebadores específicos de homólogos para especies alopoliploides);
- (3)
- Llevar a cabo el método TILLING, que implica PCR, templado del heterodúplex, escisión de células y detección de producto, para identificar variantes de secuencia y confirmar esto por secuenciación de ADN; y
- (4)
- Retrocruzar para retirar mutaciones no deseadas y evaluar los efectos.
Una secuencia de ADN que codifica una proteína
que exhibe actividad enzimática de giberelina como la usada aquí
incluye secuencias de ácido nucleico que codifican una enzima de
metabolismo de giberelina, que puede ser biosíntesis de giberelina
o catabolismo de giberelina, o una enzima que vuelve las giberelinas
resistentes a la inactivación. Una secuencia de ADN que codifica
una molécula de ácido nucleico que es capaz de inhibir la expresión
de enzimas de inactivación de giberelina puede ser una secuencia de
ADN antisentido o una secuencia de ARN corto de interferencia capaz
de activar un procedimiento de ARNi en la célula vegetal que conduce
a la inhibición de la expresión génica del gen afectado de
biosíntesis de giberelina.
En su más amplio aspecto, la invención se puede
describir como un método para incrementar el rendimiento de
cultivos vegetales por unidad de área de cultivo. Tales métodos de
preparar plantas transgénicas que tienen tamaño de la semilla
incrementado ofrecen varias ventajas, no siendo la menor de ellas un
incremento general del rendimiento. Además, sustanciales ventajas
están asociadas con la mayor capacidad de almacenamiento del tamaño
de semilla incrementado. Estas incluyen vigor de las plántulas, por
lo que semillas más grandes nutrirán durante un periodo mayor de
tiempo la plántula en crecimiento antes de que se vuelva
fotosintéticamente competente y autosostenible. Esto permitiría la
plantación más profunda y de este modo mejoraría la resistencia a la
sequía.
Las características preferidas para el segundo y
subsecuentes aspectos de la invención son como para el primer
aspecto cambiando lo que haya que cambiar.
La invención se describirá ahora adicionalmente
por medio de referencias a los siguientes Ejemplos y Figuras que se
proporcionan para los propósitos de ilustración solo y no se debe
considerar que son limitantes de la invención. Se hace referencia a
varias Figuras en las que:
La Figura 1 muestra un mapa de plásmido
pMON57004. El plásmido pMON57004 usado como base para la
construcción pDE45.
La Figura 2 muestra fotografías de semillas T3
de líneas (T2) transgénicas DE45 y una línea nula (azigótica).
La Figura 3 muestra la secuencia de nucleótidos
del promotor del gen Glutenin-1-D1
de alto peso molecular de trigo (Triticum aestivum cv
Cheyenne; EMBL entrada AJ301618; Lamacchia et al., 2001) con
sitios de restricción PacI y StuI añadidos en los extremos 5' y 3',
respectivamente.
La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos
de la región de codificación del gen de giberelina
20-oxidasa-1 de Arabidopsis
thaliana (entrada Landsberg erecta); EMBL entrada X83379;
Philips, et al., 1995) con sitios XhoI y SacI añadidos en
los extremos 5' y 3' respectivamente.
La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos
de la isozima-1 giberelina
20-oxidasa de Arabidopsis thaliana codificada
por la Figura 4 (secuencia 2).
La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos
del gen de giberelina
3\beta-hidroxilasa-1 de
Arabidopsis (AtGA3ox1, Genbank No. L37126, Chiang HH et al.,
Plant Cell 7: 195-201; 1995).
La Figura 7 muestra la secuencia de proteínas
del gen de giberelina
3\beta-hidroxilasa-1 de
Arabidopsis (AtGA3ox1, Genbank No. L37126, Chiang HH et al.,
Plant Cell 7: 195-201; 1995).
La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos
de la giberelina 1,2-desaturasa de Gibberella
fujikuroi que vuelve las GAs resistentes a la inactivación (GAdes;
Genbank No. AJ417493, Tudzynski B. et al., J. Biol. Chem.
278: 28635-28643; 2003).
La Figura 9 muestra la secuencia de proteínas de
la giberelina 1,2-desaturasa de Gibberella fujikuroi
que vuelve las GAs resistentes a la inactivación (Secuencias 5
& 6 GAdes; Genbank No. AJ417493, Tudzynski B. et al., J.
Biol. Chem. 278: 28635-28643; 2003).
La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos
de la enzima de inactivación de giberelina de trigo, giberelina
2\beta-hidroxilasa-2 (GA
2-oxidasa-2; TaGA2ox2; Phillips AL.,
et al., sin publicar).
La Figura 11 muestra la secuencia de proteínas
de la enzima de inactivación de giberelina de trigo, giberelina
2\beta-hidroxilasa-2 (GA
2-oxidasa-2; TaGA2ox2; Phillips AL.,
et al., sin publicar).
La Figura 12 muestra los caminos principales de
la biosíntesis de giberelina (GA) en plantas. Las enzimas marcadas
son: (1) ent-copalildifosfato sintasa, (2)
ent-kaureno sintasa, (3) ent-kaureno
oxidasa, (4,5,6), ent-ácido kaurénico oxidasa, (7) GA
13-hidroxilasa, (8) GA 20-oxidasa,
(9,a,b) GA 3\beta-hidroxilasa, (10) GA
2-oxidasa.
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Ejemplo
1
El promotor del gen de
Glutenin-1-D1 de alto peso molecular
de trigo (Triticum aestivum cv Cheyenne; EMBL entrada
AJ301618; Lamacchia et al., 2001) se amplificó por PCR de
plásmido pHMWGlu-1-D1 usando los
cebadores HMW-L
(5'-AAATTAATTAAAAATATGCAACATAATTTCC-3')
y HMW-R
(5'-AAAAGGCCTGGTGATTAT
CAGTAATTGA-3') para crear sitios de restricción Pacl y Stul en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento de promotor de HMWGlu-1-D1 (Secuencia 1) se insertó en los sitios Pacl-Stul del plásmido pMON57004 (Figura 1) aguas arriba del intrón Actin-1 de arroz para dar el plásmido pMON57004-HMWG. La región de codificación del gen de giberelina 20-oxidasa-1 de Arabidopsis thaliana (entrada Landsberg erecta); EMBL entrada X83379; Phillips, et al., 1995) se amplificó por PCR del plásmido pAtGA20ox1 usando los cebadores 20ox1-L 5'-AAACTCGA
GATGGCCGTAAGTTTCGTAAC-3') y 20ox1-R (5'-AAAGAGCTCTTAGATGGGTTTGGTGAGCC-3') para crear sitios XhoI and SacI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento AtGA20ox1 (Secuencia 2), que codifica la isozima 1 de giberelina 20-oxidasa (Secuencia 3) se insertó en los sitios XhoI-SacI de pMON57004-HMWG, entre el intrón Actin-1 de arroz y el terminador NOS, para dar el plásmido pDE45.
CAGTAATTGA-3') para crear sitios de restricción Pacl y Stul en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento de promotor de HMWGlu-1-D1 (Secuencia 1) se insertó en los sitios Pacl-Stul del plásmido pMON57004 (Figura 1) aguas arriba del intrón Actin-1 de arroz para dar el plásmido pMON57004-HMWG. La región de codificación del gen de giberelina 20-oxidasa-1 de Arabidopsis thaliana (entrada Landsberg erecta); EMBL entrada X83379; Phillips, et al., 1995) se amplificó por PCR del plásmido pAtGA20ox1 usando los cebadores 20ox1-L 5'-AAACTCGA
GATGGCCGTAAGTTTCGTAAC-3') y 20ox1-R (5'-AAAGAGCTCTTAGATGGGTTTGGTGAGCC-3') para crear sitios XhoI and SacI en los extremos 5' y 3', respectivamente. Este fragmento AtGA20ox1 (Secuencia 2), que codifica la isozima 1 de giberelina 20-oxidasa (Secuencia 3) se insertó en los sitios XhoI-SacI de pMON57004-HMWG, entre el intrón Actin-1 de arroz y el terminador NOS, para dar el plásmido pDE45.
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Ejemplo
2
Se transformó trigo de pan (Triticum
aestivum cv Cadenza) con el plásmido pDE45 por bombardeo con
partículas de tejido embrionario inmaduro. Se cultivaron las
plantas de trigo, en tiestos de 5 por 20 cm de diámetro, en una
habitación medioambientalmente controlada con temperaturas del aire
de 18ºC/15ºC (día/noche), una humedad relativa de
50-70% bajo ca. 350 \mumol/m^{2}/s de
irradiación con un fotoperiodo de 16 horas. Escutelos inmaduros
aislados de las semillas aproximadamente 14-16 días
después de la antesis se co-transformaron usando el
dispositivo de bombardeo con microproyectiles PDS1000/He (BioRad,
Hemel Hempstead, UK) con pDE45 y pAHC25 (que contiene el gen
marcador bar seleccionable; Christensen & Qual P 1996) con una
relación molar 1:1. Las plantas se recuperaron vía cultivo de
tejido in vitro usando los protocolos de seguimiento de
selección Bialaphos desarrollados por Barcelo y Lazzeri (1995) y
modificados por Pastori et al. (2001),
Rasco-Gaunt et al. (2001) y Sparks &
Jones (2004). Cuatro líneas T_{1} transgénicas (de
T45-2 a T45-5) que sobrevivieron a
la selección se transfirieron al suelo y se cultivaron hasta la
madurez en un invernadero medioambientalmente controlado para
producir semillas T_{2}. Veinte (20) semillas T_{2} de cada
línea se re-sembraron y se analizo material de las
hojas por PCR para identificar los agregantes que contenían el
transgen DE45. Todas las líneas se cultivaron hasta la madurez y se
recogió el grano T_{3}. Se produjeron plántulas de T_{3} y se
analizaron para ver la presencia de la construcción por PCR para
identificar líneas homocigóticas para el transgen.
Ejemplo
3
Las semillas de las cuatro líneas transgénicas
primarias, de T45-2 a T45-5, tenían
semilla más grande que las líneas de control (no transformadas).
Los pesos medios de las semillas (Tabla 1) indicaron que las plantas
que contienen pDE45 tenían semillas que eran entre 10% y 40% más
pesadas que el control.
Se observaron también semillas más grandes en
las plantas T_{2} que dieron positivo para el transgen DE45 -
véase la Figura 2. Los pesos medios de grano de estas semillas
T_{3} se incrementaron también el 19-32% sobre
las semillas de líneas nulas (azigóticas, no transgénicas) (Tabla
2).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Ejemplo
4
Se cultivaron tres líneas transgénicas
independientes (T_{3}), homocigóticas del casete
HMWGlu-GA20ox, junto con el Control (trigo no
transgénico cv. Cadenza), 15 plantas por línea, en un medio
controlado. Las plantas se cultivaron en luz blanca a 700
micromoles por metro cuadrado por segundo durante 16 h al día, a una
temperatura de 20ºC (día), 18ºC (noche) y 80% de humedad relativa.
Se usó un patrón de bloques al azar para evitar los efectos de
posición dentro de la cabina. En la etapa inicial, cada planta se
redujo a tres vástagos principales; después del crecimiento y
maduración de las semillas, se dejaron secar las plantas
completamente y se recogieron las espigas. Se recogieron dos
semillas de cada una de las dos espiguillas centrales de cada espiga
y se pesaron individualmente las cuatro semillas. Todas las
semillas de cada línea se mezclaron a continuación y se midió el
volumen de 50 semillas por desplazamiento de etanol usando un
medidor de densidades de vidrio de 10 ml (Tabla 3).
Barcelo P, & Lazzeri P.
(1995). In Methods in Molecular Biology: Plant Gene Transfer
and Expression Protocols, p. 113-123. Eds H. Jones.
Humana Press: Totowa N.J.
Christensen A H, & Quail P H.
(1996). Transgenic Research.
5:213-218.
Lamacchia et al., (2001)
J. Exp. Bot. 52:243-250.
Pastori et al., (2001)
Journal of Experimental Botany.
52:857-863.
Phillips et al., (1995)
Plant Physiol. 108:1049-1057.
Rasco-Gaunt et
al., (2001) Journal of Experimental Botany.
52:865-874.
Sparks C A, & Jones H D.
(2004). Transformation of wheat by biolistics, In Transgenic
Crops of the World-Essential Protocols. Ed I. S.
Curtis. Kluwer: Dordrecht: Netherlands.
Claims (17)
1. Un método para incrementar el peso de
semillas, comprendiendo el método modificar genéticamente una célula
vegetal para incrementar el contenido de giberelina de la semilla
por
- A) {}\hskip0.2cm (i)
- transformar la célula vegetal para expresar una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima de la biosíntesis de giberelina o una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la inactivación;
- (ii)
- transformar la célula vegetal para expresar una molécula de ácido nucleico que inhibe la expresión de una enzima de inactivación de giberelina o
- (iii)
- mutagénesis de la célula vegetal y
- B)
- regenerar una planta incluyendo la semilla a partir de la célula vegetal.
2. Un método según la reivindicación 1, en el
que la planta es monocotiledónea.
3. Un método según la reivindicación 2, en el
que la planta monocotiledónea se selecciona del grupo que consiste
en trigo, maíz, centeno, arroz, avena, cebada, sorgo y mijo.
4. Un método según la reivindicación 1, en el
que la planta es dicotiledónea.
5. Un método según la reivindicación 4, en el
que la planta dicotiledónea se selecciona del grupo que consiste en
soja, canola, y girasol.
6. Un método según la reivindicación 1, en el
que el contenido de giberelina se ha incrementado por expresión de
una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima del
metabolismo de giberelina que comprende una secuencia de ácido
nucleico como se muestra en la Figura 4 o la Figura 6, o su cadena
complementaria o una secuencia homóloga a ella.
7. Un método según la reivindicación 6, en el
que la enzima del metabolismo de giberelina es giberelina
20-oxidasa (GA20ox) o giberelina
3\beta-hidroxilasa (GA
3-oxidasa).
8. Un método según la reivindicación 1, en el
que se ha incrementado el contenido de giberelina por expresión de
una secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima que vuelve
las giberelinas resistentes a la inactivación que comprende una
secuencia de ácido nucleico como se muestra en la Figura 8.
9. Un método según la reivindicación 8, en el
que la enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la
inactivación es giberelina 1,2-desaturasa
(GAdes).
10. Un método según la reivindicación 1, en el
que se ha incrementado el contenido de giberelina por expresión de
una molécula de ácido nucleico para inhibir la expresión de enzimas
de inactivación de giberelina que comprende una secuencia de ácido
nucleico como se muestra en la Figura 10.
11. Un método según la reivindicación 10, en el
que la enzima de inactivación de giberelina es la enzima giberelina
2\beta-hidroxilasa (GA
2-oxidasa).
12. Un método según cualquier reivindicación
precedente, en el que el incremento del peso de la semilla es por
lo menos del 5%.
13. Un método según la reivindicación 12, en el
que el incremento del peso de la semilla está en el intervalo de 5%
a 40%.
14. El uso de una secuencia de ácido nucleico
que codifica una enzima de biosíntesis de giberelina para la
preparación de semillas con un peso incrementado.
15. El uso de una secuencia de ácido nucleico
que codifica una enzima que vuelve las giberelinas resistentes a la
inactivación en la preparación de semillas con un peso
incrementado.
16. El uso de una secuencia de ácido nucleico
que inhibe la expresión de enzimas de inactivación de giberelina en
la preparación de semillas con un peso incrementado.
17. Un método para incrementar la resistencia a
la sequía de una semilla, que comprende preparar una planta
genéticamente modificada en la que se ha incrementado el contenido
de giberelina en la semilla de la planta, incrementando por ello el
peso de la semilla.
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