JPH08508412A

JPH08508412A - エチレンに対する修正された応答をもつ植物

Info

Publication number: JPH08508412A
Application number: JP7503651A
Authority: JP
Inventors: エム．メイロウィッツ，エリオット; チャン，カレン; ビー．ブリーカー，アンソニー
Original assignee: カリフォルニアインスティテュートオブテクノロジー
Priority date: 1993-07-01
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 1996-09-10
Anticipated expiration: 2016-07-09
Also published as: EP0706570A1; DE69433424D1; KR960703435A; JP3183407B2; US6294716B1; AU7396594A; AU680029B2; CO4370126A1; BR9406988A; ES2213747T3; ATE256741T1; NZ269640A; CA2165678A1; DE69433424T2; WO1995001439A2; US5824868A; CA2165678C; EP0706570B1; WO1995001439A3

Abstract

(57)【要約】本発明は変性されたETR核酸により形質転換された少なくとも１種の細胞を有する形質転換された植物を包含する。そのような植物は、形質転換された植物細胞を含まない植物と比較して、エチレンに対して少なくとも１種の形質転換された植物細胞の応答の低下により特徴づけられる表現型を有する。変性されたETR核酸の発現のための組織及び／又は一過性特異性は、形質転換された核酸の発現の位置及び／又は時間を標的化するように適切な発現調節配列を選択することによって制御される。植物は、適切な変性されたETR核酸により少なくとも１種の植物細胞を形質転換し、１又は複数の形質転換された植物細胞から植物を再生し、そして所望する表現型を有する少なくとも１種の植物を選択することによって製造される。

Description

【発明の詳細な説明】エチレンに対する修正された応答をもつ植物これは、1993年７月１日に提出された出願等08/086,555号の部分継続出願である。米国政府は、エネルギー省契約番号DE-FG03-88ER13873号に準じて、本発明に対し一定の権利を有する。発明の技術分野本発明は一般に、修正されたETR核酸及び、エチレンに対する正常な応答における修正を特徴とする表現型をもちかかる核酸で形質転換された植物に関する。発明の背景エチレンは、エンドウマメの実生の発育に対するその効果について初めて記述された今世紀初頭以降、植物ホルモンとして認められてきた。Neljubow（1901），Pflanzen Beih，Bot．Zentralb，10：128-139。その後以来、エチレンが高等植物における成長及び発育の内因性調節因子であることを実証する数多くの報告書が現われた。例えば、エチレンは、種子の休眠、実生成長、花の初発、葉の脱離、老化及び果実の成熟に関与してきた。エチレンは、酸素欠乏、外傷、病原体侵入及び洪水といった環境ストレスによってその生合成が誘発される植物ホルモンである。エチレン生合成に関与する酵素のいくつかをコードする遺伝子が最近クローニングされてきた。Sato，et al.（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．86：66 21-6625；Nakajima et al.（1990）Pla nt Cell Phys．Physiol．29：989-996：Van DerStraeten et al.（1990）Proc． Natl．Acad．Sci．U.S.A．87：4859-4963；Hamilton et al.（1991），Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A．88：7434-7437；及びSpanu，et al.（1991）EMBO J．10 ：2007〜2013。エチレン生合成の経路が図１に示されている。ここでわかるように、アミノ酸メチオニンは、それ自体ACCシンターゼにより１−アミノシクロプロパン−１−カルボキシル酸（ACC）に変換されるSAMシンセターゼによりＳ−アデノシル−メチオニン（SAM）に変換される。Adams，et al.（1979）Proc．Natl ．Acad．Sci．U.S.A．76：170-174。その後ACCは、酵素ACCオキシダーゼを用いてエチレンに変換される。Yang，et al.（1984）Annu．Rev．Plant．Physiol．3 5：155〜189。エチレン生合成を制御して果実の成熟を制御しようとして、数多くのアプローチが構じられてきた。Oeller et al.（1991）Science 254：437〜439は、ACCシンターゼに対するアンチセンスRNAの発現がトマト植物の果実成熟を阻害する、ということを報告している。Hamilton，et al.（1990）Nature 346：284-287は、トランスジェニック（遺伝子導入）植物内でのアンチセンスTOM13（ACCオキシダーゼ）遺伝子の使用について報告している。Picton et al.（1993），Plant J ournal ３：469-481は、アンチセンスエチレン形成酵素を発現するトマトにおける果実の成熟及び葉の老化の変化について報告している。第２のアプローチでは、エチレンへの変換のために利用可能なACCのレベルを低下させるため植物組織内でACCデアミナーゼを発現することにより、エチレン生合成が調整されたということであった。1992年７月23日に公示されたPCT刊行物第WO92/12249号及びKleeet al.,（1991）Plant Cell ３：1187-1193を参照のこと。エチレンの生合成については充分な量の情報が収集されてきたが、エチレンがどのように植物の発育を制御するかについては、ほとんど知られていない。いくつかの報告書で、植物組織内にエチレンのための高親和力の結合部位が存在することが示されているが、このようなレセプタは同定されたことがない。Jerie，e t al.（1979）Planta 144：503；Sisler（1979）Plant Physiol．64：538；Sisl er，et al.（1990）Plant Growth Reg．９：157-164、及びSisler（1990）「植物内のエチレン結合成分」、植物ホルモン、エチレン、A.K．Mattoo及びJ.C．Sa ttle，eds.（Boston） C.R.C．Press，Inc.，p81〜90。Arabidopsisの中には、いくつかのカテゴリの突然変異体が報告されてきた。最初の２つのカテゴリでは、野生型に比べて余剰のエチレン又は減少したエチレンを産生する突然変異体が報告された。Guzman et al.（1990）The Plant Cell（植物細胞）２：513〜523 。３番目のカテゴリでは、突然変異体はエチレンに応答できなかった。同上；Bl eecker et al.（1988），Sciencｅ 241：1086-1089，Harpham，et al.（1991）A nn．of Botany 68：55-61。視察されたエチレンに対する不感応性は、優性又は劣性突然変異のいずれかであるものとして記述された。同上。上述のことに基づいて、植物とのエチレン相互作用の遺伝的基礎及び分子メカニズムが明確に描写されたことはなかった、というのは明白である。エチレンによって調節される機能の範囲が広く、エチレン合成を調整することによってその機能を制御しようとする試みがこれまでになされてきたことからみて、植物組織とエチレンの相互作用を変更することにより果実、野菜及び花といったさまざまな植物組織内での成長及び発育を変調させる代替的なアプローチを得ることが望ましいだろう。従って、本発明の目的は、エチレン応答（ETR）核酸を含む分離された核酸を提供することが本発明の目的である。さらに、ETR核酸によってコードされたタンパク質の中で単数又は複数のアミノ酸残基を置換、挿入及び／又は欠失させるべく、単数又は複数のヌクレオチドを置換、挿入及び／又は欠失させるためこのようなETR核酸に対し修正を提供することも１つの目的である。さらに又、単数又は複数の修正されたETR核酸で形質転換された植物細胞を提供することも１つの目的である。このような形質転換された植物細胞は、エチレンに対する植物の単数又は複数の組織の応答に対する表現型が変調されている形質転換された植物を産生するために使用することができる。発明の要約以上の目的に従って、本発明には、修正されたETR核酸で形質転換された少なくとも１つの細胞をもつ形質転換された植物が含まれている。このような植物は、形質転換された植物細胞を含まない植物に比べて、エチレンに対する少なくとも１つの形質転換植物細胞の応答の減少によって特徴づけられる表現型を有する。本発明には又、エチレンに対する応答を変えるべく植物細胞を形質転換することのできるベクターも含まれる。１つの実施形態では、このベクターは、エチレンに対する細胞応答の減少をひき起こす修正されたETR核酸を含んで成る。修正されたETR核酸の発現のための組織及び／又は時間的な特異性は、形質転換された核酸の発現の場所及び／又は時間をターゲティングするのに適切な発現調節配列を選択することによって制御される。本発明には同様に、形質転換細胞を含まない野生型植物に比べて、少なくとも１つの形質転換植物細胞のエチレンに対する応答が減少していることを特徴とする表現型をもつ植物を産生するための方法も含まれている。この方法は、修正されたETR核酸で少なくとも１つの植物細胞を形質転換すること、形質転換された植物細胞のうちの単数又は複数のものから植物を再生すること及び望ましい表現型をもつ少なくとも１つの植物を選択すること含んで成る。図面の簡単な説明図１は、エチレンのための生合成経路を描いている。図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃは、Arabidopsis thaliana（シロイスナズナ）からのETR遺伝子についてのゲノミック核酸配列を描いている（配列番号１）。図３Ａ，３Ｂ，３Ｃ及び３Ｄは、Arabidopsis thalianaからのETR遺伝子についてのcDNA核酸（配列番号２）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号３）を表わしている。図４Ａ，４Ｂ，４Ｃ及び４Ｄから図７Ａ，７Ｂ，７Ｃ及び７Ｄまでは、エチレン不感応性を付与するArabidopsis thalianaからの４つの突然変異体ETR遺伝子についてのcDNA及び演繹されたアミノ酸配列を表わしている。各々の配列は、１つのアミノ酸残基の置換によって、図３に記されている野生型配列と異なっている。図４（配列番号８及び９）内のetr1-3（前einl-1）突然変異は、バリンでのアラニン−31の置換を含む。図５（配列番号10及び11）内のetr1-4突然変異は、フェニルアラニンでのイソロイシン−62の置換を含む。図６（配列番号４及び５）内のetr1-1（前etr）突然変異は、チロシンでのシステイン−65の置換を含む。 Arabidopsis thalianaからのETRI遺伝子を位置決定するのに使用されたコスシドインサートの構造を表わしている。染色体歩行のための出発位置は、斜線入り棒により表わされている。開放した棒は、組換え破断点を検出するためのプローブとして使用されるDNAセグメントの場所及び長さを示している。各プローブによって検出される破断点の最大数が示されている。ETR1遺伝子の右側の数は、etr1-1とap-1の間の74のＦ２組換え体のうちの数であり、ETR-1遺伝子の左側の数はetr1-1とclv2の間の25のＦ２組換え体のうちの数である。重複するYACクローンEG4E4及びEG2G11も同様に示されている。図９Ａ及び図９Ｂは、いくつかの細菌性ヒスチジンキナーゼ及び応答調節因子の保存されたドメイン及び予想されたETR1タンパク質のアミノ酸配列のアラインメントを表わしている。ETR1との少なくとも２つの同一性がある位置では、アミノ酸が肉太活字で示されている。図９Ａでは、演繹されたETR1アミノ酸配列（配列番号12及び27）（残基326〜562）は、E．coli BarA（配列番号13及び28），P ．syringae Lem A（配列番号14及び29）及びX．campestris Rpfc（配列番号15及び30）のヒスチジンキナーゼドメインと整列した。囲みは、Parkinson及びKvfoi d（Perkinson et al.（1992）Annu．Rev．Genet．26：71）により編集された通りの細菌性ヒスチジンキナーゼドメインの特徴である５つの保存されたモチーフをとり囲んでいる。自己リン酸化の推定部位である保存されたヒスチジン残基は、星印で表わされている。示されていないアミノ酸の数及び位置は、カッコ内に示されている。図９Ｂでは、演繹されたETR1アミノ酸配列（残基610〜729）（配列番号15及び31）は、B．parapertussis BvgS（配列番号17及び32），P．syring ae Lem A（配列番号19及び34）及びE．coli RscC（配列番号18及び33）の応答調節因子と整列させられている。ETR1との同一性が少なくとも２つある場合、アミノ酸が肉太文字で示されている。囲みは、細菌性応答調節因子内の４つのきわめて保存レベルの高い残基をとり囲んでいる。リン酸化の部位である保存されたアスパラギン酸塩残基は、星印によって示されている。示されていないアミノ酸の数及び位置は、カッコ内に与えられている。アラインメントを目的として、ギャップ（）がETR1配列内に導入された。図10Ａ及び10Ｂは、トマト及びArabidopsis thalianaからのETR核酸についての特異的DNA配列を表わす。図10Ａは、アミノ酸残基１〜123をコードするDNA配列（配列番号20及び21）を比較する。図10Ｂは、アミノ酸306〜403をコードする ETR核酸配列（配列番号22及び23）を比較する。各々の図の中の垂直ラインは相同なヌクレオチドを同定している。図11Ａ及び図11Ｂは、トマト及びArabidopsis thalianaからのETRタンパク質についての（一文字呼称を用いた）部分的アミノ酸配列を比較する。図11Ａは、アミノ酸１〜123についてETRタンパク質についてのアミノ酸配列（配列番号24及び25）を比較している。図11Ｂは、残基301〜403についてETRタンパク質についてのアミノ酸配列（配列番号26及び27）を比較している。垂直ラインは、正確な配列相同性を表わす。２つの垂直ドットは、アミノ酸残基が機能的に保存されていることを表わす。１つのドットは、アミノ酸残基間のような、弱い機能的保存を表わす。図12Ａ，12Ｂ，12Ｃ及び12Ｄは、Arabidopsis thalianaからのQITR ETR遺伝子についてのゲノミック核酸（配列番号45）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号46）を表わす。図13は、Arabidopsis thalianaからのQITR ETR遺伝子についてのcDNA核酸配列及び演繹されたタンパク質配列を表わす。図14は、Arabidopsis thalianaからのQ8 ETR遺伝子についてのゲノミック核酸配列（配列番号41）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号42）を示している。図15は、Arabidopsis thalianaからのQ8 ETR遺伝子についてのcDNA核酸配列（ SEQID43）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号44）を示している。図16は、トマトからのTETR核酸についての核酸配列（配列番号35）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号36）を示している。図17は、それぞれトマト及びArabidopsisからのTETR及びETR1タンパク質のアミノ末端部分の比較である。上部ラインはTETR配列であり、アミノ酸残基315まで延びている。下部ラインはETR1タンパク質配列を表わし、アミノ酸残基316まで延びている。垂直ライン及びシングル及びダブルの垂直ドットは、図11Ａ及び 11Ｂの説明の中で記したものと同じ意味をもつ。これらの配列部分の間の同一性百分率は73.33％である。類似性百分率は84.76％である。図18は、トマトからのTGETR1 ETR核酸についての核酸配列（配列番号37）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号３８）を示している。図19は、トマトからのTGETR ETR核酸の部分的配列についての核酸配列（配列番号39）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号40）を示している。図20は、それぞれトマト及びArabidopsisからのTGETR1及びETR1タンパク質についてのアミノ末端部分の比較である。上部ラインは、アミノ酸残基316までのT GETR1配列である。下部ラインは、アミノ酸残基316までのETR1タンパク質配列を表わす。これら２つの配列の間の同一性は91.75％である。類似性百分率は、95. 87％である。垂直ライン及びシングル及びダブルドットは、図11Ａ及び11Ｂと同じ意味をもつ。図21は、TGETR2タンパク質のアミノ末端部分とそれに対応するETR1配列の比較である。上部ラインは、アミノ酸残基11からアミノ酸残基245までのTGETR2配列である。下部ラインはアミノ酸残基１からアミノ酸残基235までのETR1配列である。配列同一性は、これら２つの配列の間で85.11％である。配列類似性は92.34％である。垂直ライン及びシングル及びダブルドットは、図11Ａ及び図11Ｂと同じ意味をもつ。図22は、ネバーライプトマトからのNr（ネバーライプ）ETR核酸についての核酸配列（配列番号50）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号51）を表わしている。図22中のアミノ酸配列は、残基36にあるアミノ酸残基プロリンがロイシンで置換されているという点で、図16のTETR配列とは異なっている。詳細な説明本発明は、一部には、ETR核酸又は修正されたETR核酸を含むベクターで形質転換された細胞をもつ植物を提供している。このような形質転換された植物細胞はエチレンに対する、変調された応答を有している。１つの好ましい実施形態においては、修正されたETR核酸の発現は、対応する形質転換されていない植物に比較して少なくとも修正済みETR核酸を発現する細胞についてエチレンに対する応答性が減少していることを特徴とする植物上の表現型を付与する。従って、例えば、修正されたETR核酸がトマトといった果実の中で発現される場合、果実成熟プロセスは遅延され、かくして損傷高は減少し、貯蔵寿命及び／又は果実の収穫期は延びる。本発明は同様に、栄養組織の損傷を防ぎ、切り花の寿命を増長させるのにも有用である。ここで使用する「植物ETR核酸」は、「植物ETRタンパク質」の全て又は一部分をコードする核酸のことを意味する。ETR核酸は最初、ここで開示するETRアミノ酸配列に対する相同性により同定され得るが、同定済みのあらゆるETR核酸又はアミノ酸配列に対する相同性によっても同定することができる。ETR核酸の例としては、ArabidopsisからのETR1，QI TR及びＱ８、及びトマトからのTETR，TGETR1及びTGETR2がある。しかしながら、 ETR核酸は同様に、植物組織内への形質転換の時点で変調されたエチレン応答を付与するその能力によって機能的に定義づけされる。例えば、ETR核酸又は修正済みETR核酸のアンチセンス構成体は、アンチセンス又は修正済みETR核酸を発現する植物組織内でエチレン応答を減少させることができる。さらに、ETR核酸又は修正済みETR核酸での形質転換は、それ自体エチレン応答を修正する内因性のE TR対立遺伝子の同時抑制という結果をもたらすことができる。その上、植物組織を形質転換するために使用した場合にそれを発現する組織内でのさまざまな度合のエチレン不感応性という結果をもたらすような修正済みETR核酸を産生するように、本書で記述する通りにETR核酸を修正することもできる。ETR核酸の修正形がもつエチレン不感応性付与能力について推定上のETR核酸を評価する場合、特定された残基について本書で開示されているもののような異なるアミノ酸配列を置換するべく、Arabidopsis thalianaのETR1タンパク質中のAla-31，Ile-62，Cy s-65又はTyr-102又はトマトの中のTETRタンパク質中のPro-36と同等のアミノ酸残基をコードするコドン又はコドンの組合せが修正されることが好ましい。植物ETR核酸には、センス及びアンチセンス核酸ならびにそのRNA写しを含むゲノミックDNA，cDNA及びオリゴヌクレオチドが含まれる。Arabidopsis thaliana からのETR1遺伝子についてのゲノミックDNA配列（配列番号１）は図２に示されている。対応するcDNA配列（配列番号２）及び演繹されたETRアミノ酸配列（配列番号３）は、図３に示されている。予想されたETRタンパク質配列のアミノ末端ドメイン（すなわち残基１から約16まで）は、既知のタンパク質配列に対するいかなる相同性も有していない。ETRタンパク質中のほぼ中央（すなわち残基2 95から313まで）には、推定上の細胞間ドメイン（すなわち残基314〜738）が後に続いている推定上の膜内外ドメインがある。この推定上の細胞内ドメインは、予想外に、細菌中で知られている２成分環境センサー・調節因子に対する配列相同性を有する。これら２つの細菌中の系統群は、細菌が広範な環境的変動に対応できるようにする保存されたセンサー・調節因子系を形成する。ETRタンパク質のアミノ末端部分はエチレンと直接にか又は間接的に（例えばエチレン結合タンパク質又はもう１つのタンパク質と）相互作用し、かかる相互作用の時点で、細胞内ドメインを通してのシグナルトランスダクションが起こるものと考えられている。 ETR核酸又はETRタンパク質は、既知のETR配列に対する実質的核酸及び／又はアミノ酸配列相同性によって、同定され得る。かかる相同性は、全体的な核酸又はアミノ酸配列に基づいている可能性があり、この場合、タンパク質配列の全体的相同性は好ましくは約50％以上、好ましくは60％、さらに好ましくは75％以上、最も好ましくは90％以上である。全体的配列相同性にもかかわらず、ETRタンパク質又はETR核酸を同定するために、ETRタンパク質配列の唯一のアミノ末端部分か又は分子のこの部分（すなわち５′末端部分）をコードする核酸配列を使用することが好ましい。このアミノ末端配列部分を使用する場合には、既知のETR 配列とのアミノ酸配列相同性が約55％以上、より好ましくは約60％以上、さらに好ましくは約70％以上、より好ましくは85％以上、最も好ましくは95％以上であることが好ましい。核酸配列に基づく相同性は、アミノ酸相同性と比例するが、異なる植物中の遺伝子コード及びコドンバイアス中の縮退が考慮に入れられる。従って核酸配列相同性は、実質的に、タンパク質配列に基づくものよりも低いものでありうる。かくして、ETRタンパク質は、既知のETRタンパク質のアミノ末端ドメインと実質的な相同性をもつアミノ末端部分を有するあらゆるタンパク質である。かかる既知のETRタンパク質の１つは、A rabidopsis thalianaからのETR1タンパク質（図３参照）である。ETR核酸は、類推により、ETRタンパク質の少なくともアミノ末端ドメインもコードする。 Arabidopsis thaliana以外の植物種からのETR核酸は、既知のETR核酸を利用した標準的方法によって直ちに同定することができる。例えば、特定の植物種の中のETR遺伝子の存在を検出するべく、インサイチュハイブリダイゼーションのために、既知のETR核酸に対応するか又は唯一のアミノ末端ドメインをコードする標識づけされたプローブを使用することができる。さらに、かかるプローブを用いて、異なる植物種のゲノミック又はcDNAライブラリをスクリーニングするか又は、単数又は複数の制限エンドヌクレアーゼで消化されたゲノミックDNAの電気泳動により分離された調製物に対するハイブリダイゼーションによってETR遺伝子の全て又は一部を含む単数又は複数のバンドを同定することもできる。ハイブリダイゼーション条件は、使用されるプローブによって左右される。アミノ末端ドメインの全て又は一部分をコードするオリゴヌクレオチドといったET R核酸の唯一のヌクレオチド配列が使用される場合、例えば65℃で約0.1×SSPEといった比較的高い緊縮性が用いられる。ハイブリダイゼーションプローブが既知のETR核酸に対する潜在的に低い配列相同性をもつ領域、例えば唯一のアミノ末端ドメインの一部分を網羅する領域及び膜内ドメインを網羅する一部分をカバーしている場合、ハイブリダイゼーションは好ましくは、例えば50℃で約５×SSPEといった中庸の緊縮性条件下で行なわれる。例えば、前述の基準を用いて、成熟しているトマトのcDNAライブラリ（Strata gene，La Jolla，California、カタログ番号936004）が、図３Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ内で本書に開示されているArabidopsis ETRタンパク質配列のアミノ末端部分をコードする核酸配列を含む標識付けプローブでスクリーニングされた。標準的な技術により、いくつかのクローンが同定され、配列決定された。アミノ酸残基１〜123（配列番号20及び21）及びアミノ酸306〜403（配列番号22及び23）をコードするトマト（TETR）及びArabidopsis thaliana（ETR1）からのこのETR核酸についてのDNA配列は、それぞれ図10Ａ及びI0Ｂに記されている。残基１−123（配列番号25及び24）及び306〜403（配列番号27及び26）についてのArabidopsis thaliana及びトマト（TETR）からのETR1タンパク質についてのアミノ酸配列は、それぞれ、図11Ａ及び11Ｂに記されている。 TETRについての完全なETR核酸（配列番号35）及びアミノ酸配列（配列番号36 ）は図16に示されている。アミノ末端316アミノ酸残基についてのTETR及びETR1 タンパク質の間のアミノ酸配列の直接的比較が、図17に示されている。これを見ればわかるように、DNA配列及びアミノ酸配列の両方のレベルで、これらの特定のArabidopsis及びトマトのETR配列の間には実質的な相同性が存在する。特にアミノ酸１〜45をコードする配列についてのDNAレベルでの相同性は、7 2％よりもわずかに大きい。アミノ酸残基１〜123についてのアミノ酸レベルでの相同性は、約79％である。アミノ末端部分については（残基１〜316）、全体的相同性は約73％である。アミノ酸配列相同性の場合、等価の残基におけるアミノ酸の間の差異が比較され、かかる差異が保存された残基すなわち機能的に等価であるアミノ酸残基の置換を含んでいる場合、アミノ酸配列の類似性は、最初の123の残基について約90％にのぼる。アミノ末端316アミノ酸についての配列抗体は、ほぼ85％にのぼる。このような配列類似性は、Devereux et al .（1984）Nucl，Acids Res．12：387〜395により記述された通りの「ベストフィット」配列プログラムを用いて決定された。比較配列中の２重及び単一のデータによって、機能的に等価の（すなわち保存された）残基が同定される。同様にして、アミノ酸残基306〜403をコードする配列についてのArabidopsisとトマトの間の核酸配列相同性は約75％である。同一のアミノ酸についてのアミノ酸レベルでの配列相同性はほぼ86％であり、一方類似性はほぼ96％である。 ArabidopsisからのETR1及びトマトからのTETR（時としてTXTRとも呼ばれる）に加えて、Arabidopsis及びトマトの中で数多くのその他のETR核酸が同定されてきた。Arabidopsisでは、QITR及びQ8 ETR核酸及びタンパク質が同定された。図1 2，13，14及び15ならびに配列番号41〜48を参照のこと。QITRについては、ETR1 での全体的核酸相同性は約69％である。残基１と316の間のアミノ末端部分に関しては、相同性は、アミノ酸配列については約71％同一であり、核酸配列に関しては約72％同一である。Ｑ８に関しては、ArabidopsisからのETR1に対する全体的配列相同性は、アミノ末端316アミノ酸をコードするＱ８の部分については約8 1％の相同性であるのに対し、全体的核酸配列については約69％である。アミノ末端部分についてのアミノ酸レベルでの相同性は、Ｑ８とETR1の間で約72％である。トマトの中で同定されたその他のETR核酸としては、TGETR1（配列番号37）及びTGETR2（配列番号39）がある。TGETR1（配列番号38 ）及びTGETR2（配列番号40）についての演繹されたタンパク質配列はそれぞれ図 18及び19に記されている。TGETR2の配列は不完全である。TGETR1タンパク質とET R1タンパク質の最初の316のアミノ酸残基についての配列相同性の比較は、図20 に示されている。配列同一性はちょうど92％以下である。配列類似性は、これら２つのタンパク質のこの部分の間でほぼ96％にまでのぼる。TGETR2に関しては、図21に、この分子のアミノ末端部分（アミノ酸245まで）とETR1タンパク質の対応する部分の比較が記されている。これら２つの配列部分の間の配列同一性は約 85％である。配列類似性はちょうど92％以上にまでのぼる。 ArabidopsisからのETR核酸のクローニング及び配列決定は、本書の例中にて記述されている。しかしながら、これらのETR核酸についての配列が広範に開示されていることから、当業者であれば、オリゴヌクレオチドプローブを直ちに構築し、PCR増幅を行なうか、又は開示されている遺伝子ならびにその他の種からのこの遺伝子に対する相同性をもつその他のETR核酸を分離するために当業者にとっては既知のその他の標準的プロトコルを利用することができる。同じ植物の種をスクリーニングする場合には、５×SSPE内で55℃〜65℃まで変動する比較的中位から高い緊縮性条件を使用することができる。より低い相同性について又はその他の植物種内でプローブ探査することが望まれる場合、５×SSPEで50℃といったより低い緊縮性条件を使用することができる。しかしながら洗浄条件は0.2×S SPEを必要とした。トマトからのTETR1 ETR核酸の分離は、例中に記述されている。この配列の分離には、ArabidopsisからのETR1遺伝子のアミノ末端部分が利用された。本書に開示されているその他のトマトETR核酸（TGETR1及びTGETR2）は、ETR1プローブでトマトゲノミックライブラリをプローブ探査することにより同定された。ゲノミックライブラリは、トマトの部分的にSau 3A消化されたゲノミックDNA抽出物が連結されたEMBL3から作られた。条件は２×SSCでの洗浄を伴い65℃で５×SSCであった。これまでに同定されたさまざまなETR核酸及びタンパク質の全体的構造を再検討すると、少なくとも１つのクラスのETRタンパク質が唯一のアミノ末端部分とそれに続くヒスチジンキナーゼドメインとそれに続く応答調節領域を含んでいるように思われる。これはArabidopsis内のETR1タンパク質である。第２のクラスのETRタンパク質は、応答調節領域を含んでいない。かかるETRタンパク質の例としては、Arabidopsis内のQITR及びトマト内のTETRがある。このことがもつ意味は、今のところわかっていない。しかしながら、以下で記述するように、各クラスからのメンバーをコードするETR核酸の中の突然変異は、かかる核酸を含むトランスジェニック植物に対する優勢なエチレン不感応性を付与することができる。以下で記述する通り、異なるアミノ酸残基Ala-31，Ile-62，Cys-65及びTyr-10 2を異なるアミノ酸で置換することにより、形質転換された植物の中でエチレン不感応性を付与することのできる修正されたArabidopsis ETR核酸が結果としてもたらされる。これらの残基の各々は、トマト（TETR）とArabidopsis thaliana （ETR1）のETRタンパク質の間と同一である。 ETR核酸は、ひとたび同定されると、クローニングされ得、必要とあらば、その成分部分を組み合わせて完全なETR核酸を形成することができる。例えば１つのプラスミド又はその他のベクターの中に含まれているか又は線状核酸セグメントとしてそれから切除された状態でその天然供給源からひとたび分離されると、 ETR核酸は、その他のETR核酸を同定し分離するプローブとしてさらに利用可能である。同様に、修正されたETR核酸及びタンパク質を作るための「前駆体」核酸としてこれを使用することもできる。ここで使用する「修正されたETR核酸」という語は、前駆体ETR核酸の単数又は複数のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を含むETR核酸のことである。前駆体E TR核酸は、天然に発生するETR核酸ならびにその他の修正されたETR核酸を含む。 Arabidopsis ETR核酸内の残基31でアラニンをコードするコドンといった１つのコドンにおいて単数又は複数のヌクレオチドを置換するため、部位特異的突然変異誘発、カセット突然変異誘発などといった標準的な技術により修正することのできる前駆体核酸として、Arabidopsis thalianaからの天然に発生するETR核酸を使用することができる。このようなインビトロコドン修正は、その他の天然に発生するアミノ酸残基のいずれか１つをコードするコドンの位置31での生成を結果としてもたらすことができる。このような修正は、結果として、修正されたET R核酸をもたらす。例えば、ネバーライプ突然変異体の中に見られる表現型の原因である突然変異は、例中に開示されている。ここで記述されている通り、単一点突然変異は、TE TRタンパク質内で残基36に通常存在するプロリンをロイシンに変える。この単一突然変異は、野生型植物上で優性エチレン不感応性表現型を付与するのに充分である。この修正されたETR核酸でのトマト及びその他の植物の形質転換は、このような形質転換された植物細胞上で優性エチレン不感応性表現型を付与するものと予想される。代替的には、前駆体核酸は、野生型ETR核酸のヌクレオチドのうちの単数又は複数のものがすでに修正されているものであってよい。かくして、例えば、Arab idopsis thaliana ETR核酸はコドン31で修正されて、例えばバリンといったアラニン以外のアミノ酸をコードするコドンでのこのコドンの置換を含む修正された核酸を形成することができる。この修正されたETR核酸は同様に、第２の修正を導入するための前駆体核酸としても作用しうる。例えば、トレオニンの置換をコードするべくAla-102をコードするコドンを修正することができ、この場合、このように形成された修正済み核酸は、残基31及び102での２つの異なるアミノ酸の置換をコードする。 ETR核酸内の欠失も同様に考慮されている。例えば、推定上の膜内外又は細胞内ドメインをコードする部分を欠失させるべくETR核酸を修正することができる。このように形成された修正済みETR核酸は、植物細胞内で発現されたとき、植物組織内での有効なエチレンレベルを変調させるべく直接的又は間接的にエチレンを結合することが潜在的に可能であるETRタンパク質のアミノ末端部分のみを産生する。さらに、修正済みのETR核酸は、エチレンに対する応答の変性を特徴とする優性又は劣性表現型をもつ突然変異体植物から同定、分離され得る。このような突然変異体植物は、自然発生することもできるし、或いは、周知の化学的又は放射線突然変異誘発技術とそれに続くこのような植物の後代におけるエチレン応答の決定によって誘発させることもできる。自然発生するこのような突然変異体植物の例には、トマトのネバーライプ突然変異体やカーネーションのエチレン不感応性突然変異体が含まれる。かくして、野生型ETR核酸の組換え型修正又は突然変異体植物種からの修正されたETR対立遺伝子の同定及び分離により、修正されたE TR核酸を得ることができる。修正済みETR核酸が、前駆体ETRタンパク質内の単数又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失をコードすることが好ましい。宿主植物細胞内での修正済み核酸の発現時点で、かくして産生された修正済みETRタンパク質は、少なくとも宿主細胞のエチレンに対する応答を変調させることができる。このような表現型の生成と関連して、修正され野生型植物内に再導入された時点で形質転換された植物によるエチレン応答を減少させる結果となる、Arabidopsis thalianaからのETR核酸の中の数多くのコドンが同定された。これらのコドンは、Arabidopsis thalianaのETRタンパク質内で、アミノ酸残基Ala-31，Ile-62，Cys-65及びTyr-102をコードする。これらの特定の修正済みアミノ酸残基の各々及びETR遺伝子は、Arabidopsis thalianaからの野生型ETR遺伝子及びArabidopsis thalianaからの４つの異なる変種（etr1-1 ，etr1-2，etr1-3及びetr1-4）からの化学的に修正された対立遺伝子（その各々が、エチレンに対する不感応性を含む優性表現型を示した）をクローニングし、ヌクレオチド配列と演繹されたアミノ酸配列を比較することにより同定された。しかしながら本発明は、例で記述されているようなArabidopsis thalianaからの修正済みETR核酸に制限されるわけではない。むしろ、本発明には、エチレン感応性を変調させるその他の直ちに同定可能な修正済みETR核酸が含まれている。優性エチレン不感応性を示す上述の４つの変種はArabidopsis thalianaの実生の化学的修正により生成され、外因性エチレンを付加してこのような修正済み実生からの植物の発育を観察することにより同定された。外因性エチレンの付加を伴って又は伴わずに類似のアプローチを使用して、当業者は、同様に変調したエチレン応答をもつあらゆる選択された植物種のその他の変異体を容易に生成することができる。このとき、本書で開示されている野生型又は修正済みETR核酸配列に基づくETRプローブを用いて、修正済みの選択された植物種の適切なゲノミックスはcDNAライブラリをプローブ探査することによってその他の修正済みETR 核酸を分離することができる。このとき、このように新たに生成された修正済みETR核酸のヌクレオチド及び／又はコードされたアミノ酸の配列を、好ましくは、選択された植物種からの野生型ETR核酸と比較して、ETR核酸内に修正がある場合、そのどれが観察された表現型の原因であるかを決定する。選択された植物種の野生型配列が利用可能でない場合には、同定されてきたArabidopsis thalianaについて本書で開示された野生型又は修正済みのETR配列又はその他のETR配列を比較目的で使用することができる。この要領で、エチレン不感応性表現型を付与することのできるETRタンパク質に対するその他の修正を同定することができる。このような修正には、Ar abidopsis thaliana ETRタンパク質内のAla-31，Ile-62，Cys-65及びAla-102と等価の残基において置換されうるここで開示したもの以外のアミノ酸の同定、及び望ましい表現型を産生するべく単数又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失によって修正され得るその他のアミノ酸残基の同定が含まれる。代替的には、単数又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失をコードするように、クローニングされた前駆体ETR核酸を系統的に修正し、植物のエチレン応答に対するこの修正の効果を見極めるためテストすることができる。かかる修正は、好ましくは、ETRタンパク質のアミノ末端部分をコードするETR核酸の部分の中で行なわれる。しかしながら、シグナルトランスダクションを変調させるためのカルボキシ末端又は推定上の膜内外ドメインに対する修正も同様に考慮される。（例えば、想定されている自己リン酸化部位であるヒスナジンキナーゼドメインの保存されたヒスチジン又は想定上のリン酸化部位である応答調節因子の保存されたアスパラギン酸塩の修正）、エチレンとの直接的又は間接的相互作用に関与する特定のアミノ酸残基を同定するために使用できる１つの方法は、グリシン又はアラニンといった走査用アミノ酸をコードするコドンでETR核酸のコドンを逐次的に置換し（例えば1990年５月３日に公示されたPCT公報WO90/04 788号を参照のこと）それに続いてこのように形成された修正済み核酸の各々を１つの植物へと形質転換させてエチレン応答に対するかかる逐次的置換の効果を確認することから成る。その他のアプローチには、クローニングされたETR核酸の無作為修正又は予め定められターゲティングされた修正（例えば1992年４月30 日に公示されたPCT公報WO92/07090号を参照のこと）及びそれに続く植物細胞の形質転換及び変化したエチレン応答をもつ後代の同定が含まれる。望ましい表現型を有するこれらの植物からのETR核酸は、観察された表現型の原因である修正を確認又は同定するべく分離され配列決定される。エチレン応答を変更すべく修正されうるETRタンパク質内で特異的に同底されたものと等価のアミノ酸残基を、その他の植物種からのETRタンパク質内で容易に同定することも可能である。例えば、Arabidopsis thalianaからのETRタンパク質内で同定されたものと等価のアミノ酸残基を、その他のETRタンパク質の中で容易に同定することが可能である。前駆体ETRタンパク質内のアミノ酸残基は、それが、一次又は三次構造のいずれかでの位置についてArabidopsis ETRタンパク質の特定された残基と相同である場合に、Arabidopsis thalianaのETRタンパク質内の特定の残基と等価である。一次構造を通して相同性を立証するためには、前駆体ETRタンパク質の一次アミノ酸配列を、Arabidopsis thalianaからのETRタンパク質の一次配列とのアラインメントにより直接比較する。かかるアラインメントは好ましくはアミノ末端ドメインのものであり、アミノ酸配列の相同性を最大限にするべく、２つの配列の間のような単数又は複数のアミノ酸残基の潜在的な挿入又は欠失が考慮に入れられることになる。ETRタンパク質配列の多重度とArabidopsis thalianaのものを比較することにより、このような配列の中で保存された残基を同定することができ、この保存は好ましくは一次アミノ酸配列のさらなる比較のために維持される。かかる配列のアラインメントに基づき、当業者は、Arabidopsis thaliana E TRタンパク質中のAla-31，Ile-62，Cys-65，Ala-102及びその他の残基と等価のものであるその他のETRタンパク質中のアミノ酸残基を容易に同定することができる。かかる等価の残基は、望ましいエチレン応答性表現型を付与するその他の修正済みETRタンパク質のものと類似の修正のために選定される。かかる修正済みETRタンパク質は好ましくは、等価のアミノ酸残基における対応する置換、挿入及び／又は欠失をコードするべく前駆体ETR核酸を修正することによって作られる。一次配列レベルでの相同性に加えて、三次構造レベルでの相同性に基づいて等価の残基を同定することができる。このレベルでの等価性の決定には一般に、Ar abidopsisからのETRタンパク質又は修正されたETRタンパク質についての３次元結晶構造（又は規定の等価残基をもつもう１つのETRタンパク質の結晶構造）及び、選択されたETRタンパク質の結晶構造が必要とされる。三次構造レベルでの等価残基というのは、ArabidopsisからのETRタンパク質と比較して、選択された ETRタンパク質の特定のアミノ酸残基の主鎖原子のうちの２つ以上のものの原子座標がアラインメントの後0.13nm、好ましくは0.10nm以内にあるような残基として定義づけられる。アラインメントは、問題のETRタンパク質の非水素タンパク質原子の原子座標の最大の重複を与えるよう最良のモデルが配向され位置づけされた後に達成される。 ETR核酸はエチレンに対する応答性をもつ高等植物のいずれからでも誘導されうる。特に適した植物としては、トマト、バナナ、キウイーフルーツ、アボカドメロン、マンゴ、パパイヤ、リンゴ、桃及びその他のクリマクテリック果実植物がある。ETR核酸を分離することのできる非クリマクテリック種としては、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー、ブルーベリー、レタス、キャベツ、カリフラワー、玉ネギ、ブロッコリ、芽キャベツ、綿、canola、ブドウ、大豆及び脂肪種子ナタネがある。さらに、双子葉植物（Magnoliopsida及びDicotyl edoneaeクラス）及び単子葉植物（Liliopsida）を含む被子植物を含んで成るMag noliophyta門の中の顕花植物から、ETR核酸を分離することもできる。A.M．John son．The Century Co.，NY，1931による「顕花植物の体系的分類」に従った特に好ましい被子植物目には、Rosales，Cucurbitales，Rubiales，Campanulatae，C ontortae，Tubiflorae，Plantaginales，Ericales，Primulales，Ebenales，Dia pensiales，Primulales，Plumbaginales，Opuntiales，Parietales，Myritiflor ae，Umbelliflorae，Geraniales，Sapindales，Rhamnales，Malvales，Pandales ，Rhoendales，Sarraceniales，Ramales，Centrospermae，Santalales，Euphorb iales，Capparales，Aristolochiales，Julianiales，Juglandales，Fagales，U rticales，Myricales，Polygonales，Batidales，Balanopsidales，Proteales， Salicales，Leitneriales，Garryales，Verticillatae及びPiperalesが含まれる。特に好ましい植物としては、ゆり、カーネーション、キク、ペチュニア、バラ、ジェラニウム、すみれ、グラジオラス、ラン、ライラック、野生リンゴ、モミジバフウ、カエデ、ポインセチア、ニセアカシア、トネリコ、シナノキがある。本書の教示に従って修正又は分離することのできるETR核酸のための供給源を提供することに加えて、上述の植物は、単数又は複数の組織タイプの形質転換された植物の中でエチレン耐性表現型を示すキメリック又はトランスジェニック植物を産生するための修正された核酸の受容体として用いることができる。修正済みETR核酸は、ひとたびクローニングされた時点で、植物細胞を形質転換するためのベクターを構築するために使用され得る。かかるベクターの構築は、植物及び原核生物といった適当なクローニング宿主の両方において操作及び選択を行なうことのできるシャトルベクターの使用によって容易になる。従ってこのようなシャトルベクターには、植物細胞中での選択のための抗生物質耐性遺伝子（例えばカナマイシン耐性）及び細菌宿主内での選択のための抗生物質耐性遺伝子（例えばアクチノマイシン耐性）が含まれると考えられる。かかるシャトルベクターは同様に、使用される原核生物宿主に適切な複製の起源及び好ましくは少なくとも１つの唯一の制限部位又は、ベクター構築を容易にするべく唯一の制限部位を含むポリリンカーをも内含する。かかるシャトルベクターの例としては、pMON530（Rogers et al.（1988）酵素学の方法153：253-277）及びpCGN1547（ McBride et al（1990）植物分子生物学14：269-276）が含まれる。本発明を実施するための最良の様式を構成する好ましい実施形態においては、形質転換された植物の組織の少なくとも一部分の中でETR又は修正済みETRの核酸の発現を駆動するために１つのプロモータが使用される。ETR核酸の発現は、好ましくは、内因性ETRのRNA写しの翻訳の減少により、エチレン応答を変調させるためアンチセンス配向で行なわれる。修正済みETR核酸の発現の結果として、エチレン不感応性を付与することのできる修正済みETRタンパク質の産生がもたらされる。このようなプロモータは、植物、植物病原菌又は植物ウイルスから得ることができる。構成性プロモータとしては、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV35S及びCaMV19S）の35Ｓ及び19Ｓプロモータ、Figwortモザイクウイルス（FMV35S）からの全長写しプロモータ（1 992年７月23日に公示されたPCT公報WO92/12249を参照のこと）及び、ノパリンシンターゼ（NOS）、マンノピンシンターゼ（MOS）又はオクトピンシンターゼ（OC S）といったAgrobacterium（アグロバクテリウム）遺伝子と結びつけられたプロモータがある。その他の構成性プロモータとしては、α−１及びβ−１チューブリンプロモータ（Silflow et al.（1987）Devel．Genet．８：435-460）、ヒストンプロモータ（Chanbet（1987）Devl．Genet．８：461-473）及びETR核酸の転写を調節するプロモータがある。いくつかの実施形態においては、ETR及び修正済みETR核酸の発現を制御するために、組織及び／又は時間特異的プロモータを使用することができる。果実特異的プロモータの例としては、トマトからのＥ８，Ｅ４，E17及びＪ49プロモータ（Lincoln et al.（1988）Mol．Gen．Genet．212：71-75）及び米国特許第4,943 ,674号、5175095号及び5177,307号の中で記述されているようなトマトからの2A1 1，Ｚ130及びＺ70プロモータがある。さらに、米国特許第5,177,011号に記述されているような植物EF-1αプロモータを利用して、急速に分裂する組織における優先的発現を得ることができる。花特異的プロモータの例としては、リーフィープロモータ、及び無弁花、雌花及び無配偶子遺伝子からのプロモータがある。形質転換された植物の葉の中での発現をターゲティングするためのプロモータ系は、光の無いところでssRuBlSCOの発現を抑制するssRuBlSCO遺伝子の一部分に連結されたCaMV35Sプロモータを含むキメラプロモータである。さらに、花粉特異的プロモータも使用することができる。かかるプロモータは当業者にとっては周知のものであり、容易に入手可能である。かかるプロモータの一例として、Zn13（Hamilton et al.（1 992）Plant Mol．Biol．18：211-218）がある。このプロモータはトウモロコシ（Monocot）からクローニングされたものであるが、タバコの中で使用すると、強い花粉特異的プロモータとして機能する。 ETR核酸の条件付き発現のために使用することのできる誘発可能なプロモータの例としては、PHsl熱ショックタンパク質遺伝子（タカハシet al.（1989）Mol ．Gen．Genet．219：365-372）といった熱ショックタンパク質遺伝子からのもの及び、３つのクロロフィルａ／ｂ集光性タンパク質プロモータ（Leut us ler et al.（1986）Nucl．Acids．Res．14：4051〜4064）及びプリーフェレドキシンプロモータ（Vorst et al.（1990）Plant Mol．Biol．14：491-499）を含む光誘発性プロモータがある。本発明のさらにもう１つの実施形態においては、植物細胞を形質転換するために使用されるベクターは、植物細胞内で内因性プロモータ内へのETR核酸の挿入をターゲティングするように構築される。内因性プロモータへの修正済みETR核酸の組込みをターゲティングするのに使用されうる１つのタイプのベクターには、哺乳動物のES細胞内の予め定められた内因性遺伝子座への外因性DNAのターゲティングについて記述するMonsour，et al．Nature 336：348〜352（1988）により記述されたものと類似の正−負選択ベクターが含まれる。植物細胞内で機能的な正及び負の選択標識を用いた類似の構成体は、内因性植物プロモータ及びそれをとり囲む配列の同定に基づいて容易に設計することができる。このようなアプローチが使用される場合、野生型遺伝子型への復帰の確率を最小限におさえるため、置換型ベクターを使用することが好ましい。本発明のベクターは、ベクターの中に含まれるプロモータ配列又は植物細胞ゲノムの中でターゲティングされているプロモータ配列が、ETR又は修正済みETR核酸をコードする核酸に作動的にリンケージされるように設計されている。ETR核酸の正のストランドが使用される場合、「作動時にリンケージされた」という語は、RNAポリメラーゼがプロモータ配列からのETR核酸の転写を開始させることができるような形でプロモータ配列がETR核酸のコーディング配列との関係において位置づけされていることを意味する。このような実施形態においては、ETRタンパク質へと翻訳されうる機能的RNA写しを産生するべく、適切なリポソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、及びポリアデニル化配列を提供することも好まれる。ETR核酸のアンチセンス配向が使用される場合、必要なのは、ETRアンチセンスストランドを転写するべくプロモータが作動的にリンケージされていることだけである。かくして、かかる実施形態では、形質転換された植物細胞の中に含まれている修正済みETR核酸又は内因性E TR遺伝子からのmRNA又はその他のRNA写しとハイブリッド形成することのできるR NA写しを提供するために、転写開始及び終結配列のみが必要とされる。プロモータに加えて、インビボでのETR核酸の発現を容易にするため、エンハンサーといったその他の発現調節配列をベクターに加えることもできる。ベクターがひとたび構築されたならば、植物の形質転換は本発明に従い、植物分子生物学の当業者にとって既知のさまざまな形質転換方法のうち基本的にいずれを用いてでも実施することができる。このような方法は、一般に、Methods an d Engymology、第153巻、（「組換え型DNA部分Ｄ」）、1987，Wa及びGrossman， Academic Press eds．において記述されている。ここで使用する「形質転換」という語は、外因性核酸の導入による植物細胞の遺伝子型の変化を意味する。植物細胞の形質転換のための特定の方法には、マイクロピペットの使用による植物細胞内への核酸の直接的マイクロインジェクションが含まれている。代替的には、ポリエチレングリコールを用いることにより、核酸を植物細胞内にトランスファすることもできる（Paszkowski et al.，EMBO．J．３：2717-272 2（1984））。その他の形質転換方法には、原形質体の電気穿孔法（Fromm，et a l．Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．82：5824（1985）；植物特異的ウイルス例えばカリフラワーモザイクウイルスでの感染（Hohnet eｔal.「植物腫瘍の分子生物学」、Academic Press，New York（1982），p549〜560）又はAgrobacterium tumefaciens（アグロバクテリウム・ツメファシエンス）といった植物特異的細菌からの形質転換配列、例えば、agrobacterium tumefaciensでの感染の時点で植物細胞に伝送されたTiプラスミドの使用（Horsch et al．Science233：496〜4 98（1984）；Fraley et al．Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．80：4803（1983））が含まれる。代替的には、植物細胞の高速弾動貫入によって小さいビーズ又は粒子の表面上又はマトリクス内に含まれている核酸を導入することによって、植物細胞を形質転換することもできる（Klein et al．Nature 329：70-73（1987））。植物細胞内にベクターが導入された後、植物の再分化に先立って、成功した形質転換についての選択が標準的に行なわれる。かかる形質転換選択は必ず必要ではないものの、野生型背景を減少させることにより望ましい表現型をもつ再分化された植物の選択を容易にする。かかる選択は、便利にも、形質転換ベクター内に取り込まれうる抗生物質耐性及び／又は除草剤耐性遺伝子に基づいている。実際には、培養された細胞又は組織から全ての植物を再分化させることができる。ここで使用する「再分化」という語は、１つの植物細胞、１群の植物細胞又は植物部分から１つの植物全体を成長させることを意味する。植物再分化のための方法は、当業者にとって周知のものである。例えば、培養された原形質体からの再分化については、Evans et al.「原形質体の分離及び培養」、Handbook of Plant Cell Cultures（植物細胞培養便覧）１：124〜 176（MacMillan Publishing Co.，New York（1983）；M.R．Davey、「植物原形質体の培養及び細分化における最近の発達」、Protoplasts（1983）Leeture Pro ceedings（講義議事録）、p12〜29（Birkhauser，Basil 1983）：及びH．Bindin g「植物の再分化」、Plant Protoplasts（植物原形質体）p21〜731 CRC Press， Bocaraton 1985）、によって記述されている。形質転換が器官部分のものである場合、再分化は、植物カルス、外植体、器官又は部分からのものでありうる。再分化のためのこのような方法も当業者にとって既知のものである。例えば、Meth ods in Enzymolog、前出；Methods in Enzymology、第18巻；及びKlee et al．A nnual Review of Plant Physiology（植物生理学年報）38：467〜486を参照のこと。本発明のベクターを用いてペチュニアを形質転換し再分化するための好ましい１つの方法は、Horsch，R.B．et al.（1985）Science 227：1229〜1231によって記述されている。本発明のベクターで綿花を形質転換しそれから植物を再分化させるための好ましい方法は、Trolinder et al.（1987）Plant Cell Reports（植物細胞報告書）６：231-234によって記述されている。トマト植物細胞は、好ましくは、Mc Cormick et al.，Plant Cell Reports ５：81-84（1986）内に記述されているような方法によりAgrobacterium菌株を利用して形質転換される。特に７〜８日目の実生から子葉が得られる。種子は30％の Clorox漂白剤の中で20分間表面殺菌されDavis発芽培地上のPlantconsボックス内で発芽させられる。Davis発芽培地は、4.3ｇ／ｌのMS塩、20ｇ／ｌのスクロース及び10mls ／ｌのNitshビタミン、pH 5.8で構成されている。Nitshビタミン溶液は100mg／ｌのミオイノシトール、５mg／ｌのニコチン酸、0.5mg／ｌのピリドキシンHCl、 0.5mg／ｌのチアミンHCｌ、0.05mg／ｌの葉酸、0.05mg／ｌのビオチン、２mg／ｌのグリシンから成る。80アインシュタインm²-s^-1の強度の白色冷光下で、25℃ 湿度40％にて成長チャンバの中で７〜８日間、種子を発芽させる。光周期は、明 16時間、暗８時間である。ひとたび発芽が起こると、矩形の外植体を作るべく、＃15のフェザーブレードを用いて、頂端分裂組織及び胚軸を切断することにより子葉を外植する。発芽しつつある子葉の短い端部でのこれらのカットは、感染のための表面積を増大させる。脱水を防ぐため、外植体を無菌のDavis再分化液の中に入れる。Davis再分化培地は１×MS塩、３％スクロース、１×Nitshビタミン、2.0mg／ｌゼアチン、pH 5.8で構成されている。この溶液は0.8％のノーブル寒天でオートクレーブに付されたものである。いかなる抗生物質も含まない培地から成る「フィーダープレート」上で子葉を予備栽培する。この培地は4.3ｇ／ｌのMS塩、30ｇ／ｌのスクロース、0.1ｇ／ｌのミオーイノシトール、0.2ｇ／ｌのKH₂PO₄、1.45mls／ｌのチアミンHCl 0.9mg ／ml溶液、0.2mlsのキネチン0.5mg／ml溶液及びO.1mlの2.4D 0.2mg／ml溶液から成る。この溶液をKOHを用いてpH 6.0に調整する。1.5〜2.0mlsのタバコ懸濁細胞（TXD's）と2C005K培地の中に浸された無菌Whitmanフィルターをこれらのプレートの上に置く。2C005Kの培地は、4.3ｇ／ｌのGibco MS塩混合物、１mlのＢ５ビタミン（1000×ストック）、30ｇ／ｌのスクロース、２mg／mlストックからの２ mls／ｌのPCPA、及び0.5mg／mlのストックからの10μｌ／ｌのキネチンから成る。連続明光周期で40〜50アインシュタインm²s^-1の光強度を用いて、白色冷光下25 ℃で成長チャンバ内にて、１日子葉を培養した。次に、子葉に、修正済み又は野生型のETR核酸を含むAgrobacteriumの対数増殖期の溶液を接種する。Agrobacteriumの濃度は、約５×10⁸細胞／mlである。数分間子葉を細菌溶液の中に浸し、次に無菌Whatmanフィルターディスク上で余分な溶液を除去するため吸い取り、その後もとのフィーダープレートに戻し、ここで２日間同時培養させる。２日後、子葉を、２mg／ｌのゼアチンリボシド、500μ ｇ／mlのカルベニシリン及び100μｇ／mlのカナマイシンと共にDavis再分化培地を含む選択プレートへと移す。２−３週間後、カルス及び／又は菌条が形成した子葉を、カルベニシリン及びカナマイシンを同じレベルで含む新鮮なDavis再分化プレートに移す。この時点で形質転換体について実験を評点する。規則的に３週の間隔でカルス組織を継代培養し、発育する菌条のつぼみが再分化し続けるように異常な構造があればそれをトリミングする。菌条は３〜４カ月以内で発育する。菌条が発育すると、これをカルス組織からきれいに切除し、発根選択プレート上に植付けする。これらのプレートには、50μｇ／mlのカナマイシン及び500μ ｇ／mlのカルベニシリンを含む0.5×MSOが含まれている。これらの菌条は２週間以内で選択培地上で根を形成する。２週間後にいかなる根も現われなかった場合、菌条をトリミングし選択培地上に再度植付けする。22℃の温度でパーシバル中で菌条培養をインキュベートする。根のついた菌条を、次に、根の長さが約２cm になった時点で鉢植えする。温室へ移す前に、２〜３週間明18時間暗６時間の光周期で21℃で成長チャンバー内にて植物を硬化させる。温室では、日中26℃夜間 21℃の温度で植物を成長させる。光周期は明13日、暗11日であり、植物を成熟させる。植物がひとたび再分化されたならば、エチレン応答表現型の変化に基づいて単数又は複数の植物を選択する。例えば、修正済みETR核酸がその未変性プロモータと共に使用される場合、選択は、かかる植物からの実生の「３重応答」のうちの１つのいずれかにおける変化に基づくものでありうる。Guzman et al.（1990 ）The Plant Cell（植物細胞）２：523。代替的に、又は構成性プロモータが使用される場合、その他のさまざまなエチレン応答を検定し、野生型植物と比較することができる。かかるその他のエチレン応答としては、（主としてトマトに見られる）上偏成長、epsision、器官脱離、花弁老化及び果実成熟がある。エチレン応答の明白な変化に加えて、酵素といった特定のタンパク質のレベルの標準的な増減についての応答時間を決定するためエチレンに対する露呈が後に続くさまざまな酵素レベルの測定を行なうことができる。特定の植物がエチレンに対する減少した応答を有するか否かを決定するために使用することのできるさまざまなエチレン応答の例は、「植物生物学におけるエチレン」第２版内の第７章、エチレン作用のメカニズム、F.B.Abels，P.W.Morgan及びM.E.Salveit，Jr.，eds．Sa n Diego Academic Press，Ins.（1992）の中で記述されている。組織及び／又は時間特異的プロモータ又は誘発可能なプロモータが使用される場合、エチレン応答の変調の決定は、適切な時に又必要とあらば誘発性プロモータを活化／不活化するための適切な条件下で、行なわれる。各々のケースにおいて、好ましくはエチレン応答は、野生型植物からの同じエチレン応答に比較される。以下に記すのは、果実中のエチレン応答を変調するための特に好ましい実施形態である。しかしながら、このような実施形態は、栄養組織及び花におけるエチレン応答を変調させるために容易に修正することができるものである。１つのアプローチでは、エチレン応答を減少させるため、中庸な強度の構成性プロモータに作動的にリンケージされた修正済みETR核酸が使用される。こうして果実の成熟のための時間が延長される結果となる。代替的な一実施態様においては、修正済みETR核酸の発現を開始させる条件を維持して果実の成熟を妨げることができるように、調節可能な（誘発可能な）プロモータに作動的にリンケージされた修正済みETR核酸が使用される。次に、成熟を得るべく修正済みETR核酸の発現を停止させる条件を維持することができる。例えば、高い（現場）温度では活性であるものの冷凍中といった低温では活性でない熱誘発性プロモータを使用することができる。もう１つの例では、早期成熟を防ぐため２，４−Ｄといった市販のオーキシン類似体又は市販のジベレリン類似体で形質転換された植物を処理できるように、オーキシン又はジベルリン誘発されるプロモータが利用される。代替的には、果実の成熟を妨げるため、修正済みETR核酸に対して強い構成性プロモータを作動的にリンケージさせることができる。場合によって果実の成熟を可能にするため、植物は、誘発性プロモータに作動的にリンケージされた野生型ETR核酸でも形質転換される。野生型ETR核酸の発現は、誘発可能なプロモータが応答する適切な条件に植物をさらすことによって、増大する。野生型ETR核酸発現が増大した時点で、果実の成熟が起こるよう、修正ETR核酸の発現の効果が減少する。エチレン不感応性を付与するべく植物を形質転換させる上で使用するのに望ましい特定の構成体には、プロリンをロイシンに変換するべく残基36に対応する修正を含んでいるその他のあらゆる突然変異体Arabidopsis ETRゲノミック又はcDN Aクローンに作動的にリンケージされたCMV35Sプロモータが含まれる。このような構成体は、それによって形質転換されそれを発現する細胞及び植物に対して優性エチレン不感応性表現型を付加するものと予想されている。さらに、好ましい構成体は、ArabidopsisからのETR遺伝子の中で同定されたもののいずれかと類似の突然変異、ならびにトマトETR遺伝子内に見られるNr突然変異を含むように工学処理されたトマトTETR cDNAの発現を駆動するべくFMVプロモータを作動的にリンケージする--を含んでいる。このような構成体は、それによって形質転換されそれを発現する細胞及び植物に対する優性エチレン不感応性表現型を付与することが予想されている。その他の好ましい構成体には、TETR及びETR1を含むETRアンチセンスcDNAに対しFMVプロモータをリンケージする作動体（operable）が含まれている。このような構成体は、それによって形質転換されそれを発現する細胞及び植物に対して優性エチレン不感応性表現型を付与することが予想されている。本発明は、有用な表現型を得るため、広範な植物において実践することができる。例えば、花壇又は綿作物（Hall，et al.（1957）Physid Plant 10：306-317 ）及び切花になった（Halevy，et al.（1981）Hort.Rev．３：59-143）又はなっていない観賞花（カーネーション、バラなど）において発生するような成長中又は輸送又は貯蔵中の花の老化及び落花を遅延させるか又妨げるために、本発明を使用することができる。さらに、本発明は、キュウリ（Jackson，et al.（1972 ）Can.J.Bot．50：1465-1471）、野菜及びその他の作物（Heck et al.（1962）T exas Agric.Expt.Sta Misc，PubliMP 613：1-13）及び観賞植物（例えばヒイラギリース）（Curtis et al.（1952）Proc.Am.Soc.Hort.Sci．560：104〜108）における葉及び果実の老化及び脱離を遅延させるか又は妨げるために実施することもできる。その他の用途としては、例えばサツマイモ（Kitinoja（1978）「園芸におけるエチレン応答の操作」、Reid，ed.，Acta.Hort.第201巻、377-42）、ニンジン（Coxonet al.（1973）Phyto Chem.Istry．12：1881〜1885）、アメリカボウフラ（Shattuck et al.（1988）Hort.Sci．23：912）及びアブラナ属におけるエチレンにより誘発される苦味フェノール化合物（イソクマリン）の減少又は予防が含まれる。その他の用途としては、オート麦やcanolaにおいて発生するような生殖組織に対する選択的損傷（Reid et al.（1985）、「植物発育におけるエチレン」中、Roberts，Tucker，eds.（ロンドン），Butterworths，p277-286）、リンゴやすいかといった貯蔵農産物において発生するような風味、堅実さ及び／又はテクスチュアの喪失（Risse et al,（1982）Hort.Sci．17：946-948）、先の巻いたレタスにおいてエチレンにより誘発されるあづき色のしみ（収穫後の障害）を予防して、例えば観賞用アナナスにおける花の形成を遅らせることによって（Mekers et al,（9183），Acta Hortic 137：217-223）植物のサイズを増大し、雄花の産生を促進させる（Jaiswal et al.（1985）Proc.Indian Acad.Sci. （Plantg Sci，95：453-459）こと、が含まれる。さらにColletotrichum lagena riumに感染したキュウリにおける損傷及び老化を防止することといった疾病の発生を遅らせるため、及び例えば大麦、カンキツ属、アメリカトガサクラ実生、グレープフルーツ、プラム、バラ、カーネーション、イチゴ、タバコ、トマト、小麦、スイカ及び観賞植物のように、疾病発生の増加をエチレンがひき起こしている植物における疾病を減少させるために、エチレン応答の減少を利用することもできる。さらに、環境内に見られるエチレンの効果及び間接的には植物組織内のエチレンの生合成を結果としてもたらすさまざまな環境的ストレスの効果を減少させるのに、本発明を用いることができる。例えば、エチレンは火災、自動車排気ガス及び工業のため、局所的大気内に生物学的に有害なレベルで存在する。例えば、前出の「植物生物学におけるエチレン」の中の第８章、環境内のエチレンを参照のこと。さらに、本発明は、洪水、濁水、酸素欠乏、外傷（圧迫及び打撃傷を含む）、冷え、病原体侵入（ウイルス、細菌、真菌、昆虫、線虫など）、化学的露出（例えばオゾン塩及び重金属イオン）及び放射線といった環境的ストレスに応答して合成されるエチレンの効果を最小限におさえるために使用できる。以下の説明は、例示として記すものであり、本発明の範囲に対する制限とみなされるべきものではない。さらに、ここに記されている参考文献は全て、明示的に参考として内含される。例１ ETR1遺伝子のクローニング etr1-１植物を、それぞれ劣性の可視的標識ap１及びclv2を支持する２つの系統と交雑させる。Ｆ₁後代を自家受粉させた。Ｆ₂において表現型を評点した。（ Kosambiマッピング関数（D.D.Kosambi（1944）Ann.Eugen．12：172）を用いて）組換え百分率をセンチモルガン単位で決定した。ETR1遺伝子座は可視的遺伝子標識ap１及びclv2の間の染色体１の下部部分にマッピングした（AP１から6.5＋／ −1.0cM及びCLV2から2.8＋／−1.1cM）。 etr1-1を検定系統W100（生態型Landsberg（Koornneef et al.,（1987）Arabid opsis Inf.Serv．23：46）に交雑させ、Ｐ₁植物を自家受粉させた。Chang，et a l.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．85：6856に記述されている通り56のＦ₂ 植物内で、ETR1遺伝子座へのRFLP標識のリンケージを分析した。この染色体１の領域内にあるRFLP標識のうち１つの標識1bAt315は、112の染色体のうちのetr1-1 突然変異体表現型と完全に同時分離した。従って、1bAt315クローンはETR1遺伝子領域内の染色体歩行を開始させるためのプローブとして使用された。さまざまなゲノミックDNAコスミドライブラリを利用した。１つのライブラリは、1bAt315に対してハイブリッド形成した２つの酵母人工染色体（YACs EG4E4及びEG2G11（Grill et al.（1991）Mol.Gen.Genet．226：484）のサブクローンを内含していた。YACをサブクローニングするため、EG4E4又はEG2G11を宿す酵母細胞からの全DNAを、Sau3AIで部分的に消化させ、コスミドベクターpCIT30 （Ma et al.（1992）Gene，117：161）内にクローニングさせた。標準クローニング及びスクリーニング方法を使用した（Sambrook et al、分子クローニング：実験室マニュアル（Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY ，1989））。etr1-1突然変異体からのライブラリを、同様にpCIT30内で構築した。野生型ライブラリは、以前に構築された（Yanofsky et al,（1990）Nature 34 6：35）。これらのライブラリに対する制限分析及び逐次的ハイブリダイゼーションにより、約230kbの距離にまたがる重複するコスミド（contig）を得た。図８参照のこと。 ETR1遺伝子は、微細構造RFLPマッピングを用いて、約47kbの下位領域に位置決定された。微細構造地図を作成するため、ap１及びclv2を支持する２つの系統（両方共生態型Landsberg）とetr1-1突然変異体（生態型Columbia）の間の上述の交雑のＦ₂自己後代からの表現型に基づいて減数分裂組換え体を分離した。両方の遺伝子座で野生型であるか又は両方の遺伝子座で突然変異体であった植物としてＦ₂後代の中で、組換え体を同定した。ETR1を、暗所で成長した実生内で評点した。（Bleecker et al.（1988）Science 241：1086）。ETR1とAP１の間で74個の組換え体が、又ETR1とCLV2の間で25個の組換え体が得られた。RFLPプローブとして染色体歩行からのDNAフラグメントを用いて、組換え破断点をマッピングした。分離された組換え体の数から見て、各々の交雑について、破断点間の計算上の平均距離はおよそ20kbであった。230kgのcontigより上で、見い出された破断点の実際の密度はCLV2上の計算上の密度と一貫したものであった（約120kb内で５つの破断点）。ETR1遺伝子をフランキングする最も近い破断点は、約47kbのDNAセグメントを構成していた。この47kbの領域から誘導された写しを探究するため、DNAフラグメントを用いてcDNAライブラリをスクリーニングした。１つのcDNAクローンをλＣ４と呼称し、これを図８に示されている4.25kbのEcoRＩフラグメント１で検出した。λＣ４は潜在的にETR1遺伝子を表わしていたため、このクローンをさらに特徴づけした。例２ ETR遺伝子の特徴づけ Sequenase Version 2.0（United States Biochemical Co.，Cleveland，Ohio ）及び長さ17ヌクレオチドの合成オリゴヌクレオチドプライマを用いて、λC4 c DNA及び対応するゲノミックDNA（図２）のヌクレオチド配列（配列番号１）を決定した。全配列が決定されるまで、配列を拡張させるべく既存のETR1配列からプライマ配列を選んだ。クローニングベクターにアニールしたプライマを用いて、初期配列を得た。鋳型は、２本鎖プラスミドであった。推定された転写開始部位より上流225bpとポリアデニル化部位の下流90bpを含むゲノミックDNAの両方のストランドを配列決定した。λＣ４は１本鎖上で配列決定された。 λＣ４は、18塩基のpoly Aテイルを含め長さ1812塩基対であった。DNA配列及びRNAブロット（以下で記述）から、λＣ４に５′末端の約1000の塩基対が欠如していることが確認された。より長いcDNAを得るため、λＣ４の内部の配列特異的プライマを用いて、実生poly A⁺RNAから最初のストランドcDNAを合成した（Ribo Clone cDN A合成システム、Promega，Madison Wisconsin）。次にさまざまなプライマ対を用いて、PCRによりcDNAを増幅した（Saiki，R.K．et al.（1985）Science，230 ：1350）：cDNA及びゲノミックDNA配列から演繹されるように異なるエキソンにアニールするため３′PCRプライマが選択され、ゲノミックDNA配列のさまざまな５′部分にアニールするため５′PCRプライマが選択された。５′末端で６つの異なるプライマが使用された。cDNAを増幅した最も遠い上流プライマは、Q（5′ AGTAAGAACGAAGAAGAAGTG）（配列番号26）であった。下流で12塩基だけシフトさせられた重複プライマも同様にcDNAを増幅した。98塩基対だけさらに上流にあった５′末端プライマを用いてcDNAを増幅することはできなかった。PCR制御のためにゲノミックDNA鋳型を使用した。最長のcDNAは、プライマＱの５′末端まで拡張するものとみなされた。以下のとおりにSequenase Version 2.0で直接、増幅cDNAを配列決定した：すなわち、まず、エタノール沈降によりPCR反応を濃縮させた後、増幅産物を0.8％のLMPアガロースゲル内で電気泳動により分離した。 DNAフラグメントを切除し、10μｌの切除済みゲル（70℃で溶融したもの）、１m lの10mMプライマ及び1.2mlの５％Nonidet P-40の混合物を２分間90℃で加熱して DNAを変性させた。次に、配列決定反応に着手する前に、混合物を37℃まで冷却した。 2786塩基対（poly Aテイルを含まず）であった最長cDNAは、RNAブロットからの2800塩基という見積り上のサイズと一致しており、全長に近いものと推定された。潜在的なTATAボックス（5′ATAATAATAA）が、ゲノミック配列内で５′末端から上流33bpのところに存在する。cDNA配列とゲノミックDNA配列の比較に基づくと、遺伝子は、５′の未翻訳リーダー内にあるもの１つを含む６つのイントロンを有する。エキソンは、738アミノ酸の単一の読取り枠を含んでいる。図３を参照のこと。この遺伝子が実際ETR1であるという決定は、野生型対立遺伝子及び４つの突然変異体対立遺伝子のヌクレオチド配列を比較することによって立証された。各々の突然変異体対立遺伝子について、ベクターラムダZAPII（Stratagene La Jolla ，California）内で１つのEcoRＩサイズ選択ライブラリを構築した。野生型フラグメントでのハイブリダイゼーションにより4.25kbのEcoRＩフラグメントのクローンを分離した。これらのクローンを、供給業者（Stratagene）に従ってインビボ切除により、プラスミド（pBluescriptベクター）へと変換させた。各々の突然変異体対立遺伝子について１本鎖上で２つの独立したクローンを配列決定した。５′末端（4.25kbのEcoRＩフラグメント上に含まれていない535bp）をPCRにより増幅し、前述の通り直接配列決定した。コドンの差異は以下のとおりであった：etr1-1内でコドン65 TGT〜TAG（図６Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ）、etr1-2内でコドン1 02 GCG〜ACG（図７Ａ，Ｂ，Ｃ、及びＤ）、etr1-3内でコドン31 GCG〜GTG（図４Ａ，Ｂ，Ｃ及びＤ）、etr1-4内でコドン62ATC〜TTC（図５Ａ，Ｂ，Ｃ、及びＤ）。４つの突然変異は全て、演繹されたタンパク質配列のアミノ末端領域内でクラスター化している。標準RNA電気泳動（ホルムアルデヒド）ゲルブロットの中でETR1メッセージを検査した。検査した全ての植物部分つまり葉、根、茎、花及び実生の中に、2.8k bのETR1写しが存在していた（データ示さず）。さらに、野生型及び突然変異体対立遺伝子のETR1写しの間には、全く差異が観察されなかった（データ示さず）。エチレンでの処理は、暗所で成長した野生型実生内のETR1 mRNAの量を検出可能なほど変えなかった（データ図示せず）。通常の緊縮性（すなわち５×SSPE（0.9ＭのNaCl、50mMのNaH₂PO₄、40mMのNaOH 、4.5mMのEDTAN、pH 7.4）内で65℃で一晩、そして30分間65℃での0.1×SSPE内での最も緊縮性の高い洗浄を伴う）でETR1遺伝子をArabidopsisゲノミックDNAブロットにハイブリッド形成させた時点で、ETR1遺伝子座の予想されたフラグメントのみが観察された（データ示さず）。しかしながら、減少した緊縮性（すなわち、50℃で５×SSPEでのハイブリダイゼーションと50℃で５×SSPE内の洗浄）では、数多くのフラグメントが検出され、このことは、類似の遺伝子の系統群がAr abidopsis内に存在することを示唆している。 ETR1の予想されたアミノ末端配列（残基１−316）は、Gen Bankデータベース（バージョン77.0）内の配列と全く類似性をもたない。しかしながら、カルボキシ末端部分は、シグナルトランスダクションの原核２成分系のセンサー及び応答調節因子の両方の保存されたドメインときわめて高い類似性をもつ。細菌内では、センサーのヒスチジンタンパク質キナーゼドメインは、緩やかに保存された間隔どりで特定の順序で配置された５つの配列モチーフによって特徴づけられる（ Parkinson（1992）Annu.Rev.Genet．26：71）。演繹されたETR1配列は、細菌タンパク質内で見られるものと同じ相対的順序及び間隔どりをもつ５つのモチーフ全てを含む（図９Ａ）。演繹された配列は、Escherichia coli BarA（ナガサワe t al（1992）Mol.Microbiol．６：3011）及びPseudomonas syringae LemA（Harb ak et al.（1992）J.Bact．174：3011）に最も類似している：ヒスチジンキナーゼドメイン（残基336から566までの241のアミノ酸）全体にわたり、それぞれBar A及びLemAと43％及び41％のアミノ酸同一性が存在する。BarAは、E.coli浸透センサータンパク質EnvZ（ナガサワ、前出）内での欠失を相補するその能力に基づいてクローニングされたが、その機能についてはまだ知られていない。LemAは、インゲンマメ植物上のP.syringaeの病原性にとって必要なものである（Hrabak、前出）。この推定上のETR1ドメインにきわめて類似した配列をもつその他の細菌タンパク質は、アブラナ科植物内での病原性についての宿主認識に関与している可能性のある Xanthomonas Campestris Rpfc（35％の同一性）（Tang et al（1991）Mol.Gen.G enet，226：409）、きょう膜合成の調節に関与しているE.coli RcsC（34％の同一性）（Stout et al.（1990）J.Bacterial．172：659）及び嫌気性酵素の抑制の原因であるE.coli ArcB（25％の同一性）（Luchi et al.（1990）Mol.Microbi ol．４：715）である。推定上のヒスチジンキナーゼドメインに隣接して、演繹されたETR1列は細菌性応答調節因子の構造的特徴と保存された残基を示す。応答調節因子の構造的特徴は、５つのα−せんにとり囲まれた５つの平行なβ−ストランドから成る、Salm onella typhimurium及びE.coli内のCheY（化学定性についての応答調節因子）の既知の３次元構造に基づいている（Stock et al.（1989）Nature 337：745；Vol z et al.（1991），J.Biol.Chem．266：15511）。細菌応答調節因子の配列は、C heYの疎水性コアと相容性ある残基に基づいてこの構造と整列させられた。（Sto ck et al.（1989）Microbiological Rev．53：450）。演繹されたETR1配列も同様に整列させることができる（データ示さず）。４つの特異的位置において、応答調節因子は、保存度の極めて高い残基つまり３つのアスパラギン酸塩とリシンを含んでいる（Parkinson et al.（1992）Annu.Rev.Genet．26：71；Stock et a l.，前出）；３つのアスパラギン酸塩、保存されたリシンの側鎖が中に突出する酸性ポケットを形成し（Stock et al.（1989）Nature 337：745；Volz et al.（ 1991）J.Biol.Chem．266：15511）、３番目のアスパラギン酸塩は、ホスホヒスチジンからのリン酸塩の受け器である（Stock et al（1989）、前出）。第２のアスパラギン酸塩に対するグルタミン酸塩の保存的置換を除いて、これらの保存されたアミノ酸は、演繹されたETR1配列内で同じ位置に発見される（図９Ｂ）。このドメイン（ETR1内の残基609〜729までの121のアミノ酸の伸張）内の演繹された配列は、ヒトにおける病原性について毒力関連遺伝子を制御するBordetella paraper tussis BvgS（29％の同一性、60％の類似性）、E.coliRcsC（29％の同一性、64 ％の類似性）、P.syringae LemA（26％の同一性、57％の類似性）、X.campestri s RpfC（25％の同一性）及びE.coli BarA（20％の同一性）の配列に最も類似している。配列がETR1に類似している細菌タンパク質は全て、ヒスチジンキナーゼドメイン及び応答調節因子ドメインの両方を含むという点でETR1に構造的にも類似している。これらの特長は共通のものであるが、検知機能は明らかに散逸している。潜在的に膜にまたがるドメイン（残基295〜313）が、水治療法分析に基づいて演繹されたETR1配列内に存在しているものの（Kyte et al.（1982），J.Mol.Bio l．157：105）、明らかなシグナル配列が全く存在しないことからETR1が実際に膜内外タンパク質であるか否かは不明瞭である。同様に、Ｎ−リンケージしたグリュシル化部位は全く存在しない。演繹されたETR1配列が類似している細菌タンパク質は全て、アミノ末端ドメインにフランキングする２つの潜在的に膜にまたがるドメインを有しているが、いくつかの細菌性センサー（応答調節因子が欠如しているもの）はこれを有していない。例３ etr1突然変異体遺伝子が野生型植物に対してエチレン不感応性を付与する Agrobacteriumで媒介される形質転換を用いて、etr1-1突然変異体遺伝子を安定した形で導入したとき、野生型Arabidopsis植物に対して優性エチレン不感応性が付与された。遺伝子は、7.3kbのゲノミックDNAフラグメント上に支持されていた（転写開始部位の上流に約2.7kb、ポリアデニル化部位の下流に約１kbを含んでいた図８中のフラグメント１及び２）。これはCalgene，Inc. ，Davis，Californiaから得られた２成分形質転換ベクターpCGN1547内へとクローニングされた。ベクターは又、植物中のカナマイシン耐性のための選択可能な標識をも支持していた。 etr1-1構成体についてはetr1-1突然変異を含む4.25kbのEcoRＩプラスミドクローンは部分的EcoRＩ消化によって線形化され、コスミドクローンtheta8（歩行におけるYAC EG4E4のサブクローン）からゲル精製されたアガロースであった3.1kb のEcoRＩフラグメントと連結させられた。適正な相対的配向で２つのEcoRＩフラグメントを含む、結果として得られたプラスミドは、ポリリンカー部位Asp718で線形化され、クレノウ酵素を用いて末端が充てんされ、BamHＩリンカーは平滑末端に連結された。最終的に、ポリリンカー部位BamHＩにおいてプラスミドから7. 3kbのインサートが除去され、２成分形質転換ベクターpCGN1547のBamHＩ部位内に連結された（McBride，K.E．et al.（1990）植物分子生物学14：269）。対照構成体については、EcoRＩの部分的に消化されたコスミドtheta8から、野生型7. 3kbフラグメントをアガロースゲル精製し、pBluescriptのEcoRＩ部位内にサブクローニングさせた。次に、ポリリンカーのBamHＩ及びKpnＩ部位を用いてフラグメントを除去し、BamHＩ及びKpnＩで消化されたpCGN1547内へとこれを連結させた。突然変異体及び野生型構成体はAgrobacterium（Holsters et al（1978）Mol .Gen.Genet．163：181）菌株ASE（Monsanto）（Rogers et al.（1988）Meth.Enz ymol．153：253）へと形質転換された。Arabidopsis生態型Noss enは、固体培地上ではなくむしろ液体中で培養された根組織を用いて形質転換された（Valvekens，D．et al.（1988）Natl.Proc.Acad.Sci．U.S.A．85：5536）。ETR1遺伝子の１つの突然変異体コピーを有する３倍体植物が、生態型Columbia と同じ三重応答表現型をもつ生態型Bensheim中の４倍体野生型とetr1-1同型接合体（２倍体）の間の交雑の後代として得られた。３倍体野生型植物は同様に、４倍体に２倍体野生型を交雑させることによっても得られた。エチレン（Bleecker et al、前出）又は0.5mMのACCのいずれかで処理された暗所で成長した実生において、エチレン感応性を検定した。ACC処理のために、植物をムラシゲ及びSkoog の基礎塩混合物（MS，Sigma）、pH5.7、0.5mMのACC（Sigma）、１％のBacto-aga r（Difco）上で発芽、成長させた。MS pH5.7μｇ／mlカナマイシン、１％ Bacto -agar上で成長させた一週間目の実生内での根の伸長の程度によって、カナマイシン耐性を測定した。 10本のカナマイシン耐性植物を産生した。10本のうち８本は、エチレンに対する暗所成長実生の応答によって評価される通りエチレン不感応性の自家後代を示した。各々の系統において、エチレン不感応性はカナマイシン耐性と同時分離した。対照として、６つのカナマイシン耐性植物を提供した野生型の対応する7.3k bのゲノミックDNAフラグメントを用いて、形質転換を行なった。これらの系統は、野生型とは異なるものとは思えないエチレン感応性自家後代のみを発生させた。 etr1-1形質転換体は、異なるレベルのエチレン不感応性を表示した。かくして、野生型遺伝子は突然変異体表現型を減衰させることができ、etr1-1突然変異は、形質転換された植物において充分に優性なものではない。10のカナマイシン耐性系統のうち６つは、完全に優性なエチレン不感応性を与え、このことは突然変異体遺伝子の多数のコピーの存在を表わしている。その他２つの系統は、部分的優性を表わし、２つの系統は野生型であると思われた。エチレン不感応性の減少は、推定上、位置効果（例えばＤＮＡメチル化）又は場合によってはトランスファされたDNA の切形によってひき起こされうる低い発現レベルによるものであった。例４非相同プロモータを含むベクター構成体この例は、野生型及び突然変異体ETR1核酸の発現を制御するための非相同プロモータを含む植物形質転換ベクターの構築について記述している。カリフラワーモザイクウイルス35Ｓタンパク質プロモータ（Guilley et al.（ 1982）Cell 30：763〜773）Odell，et al.（1985）Nature 313：810〜812及びSa nders et al.（1987）Nucl.Acids Res．15：1543〜1558）及びノパリンシンターゼ（NOS）遺伝子の３′末端をpCGN1547ベクターへとクローニングしてpCGN18を作った。約1.6kbのHindIII−BamHＩフラグメント上の35Ｓのプロモータを、pCGN 1547の唯一のHindIII−BamHＩ部位内にクローニングした。１kbのBamHＩ−KpnＩ NOSフラグメントをpCGN1547の唯一のBamHＩ−KpnＩ部位内へクローニングした。 BamHＩリンカーを用いて上述のpCGN18ベクターの唯一のBamHＩ部位内に、野生型及び突然変異体の両方のETR1-1遺伝子の4.25kbのEcoRＩフラグメントを個別にクローニングした。この4.25kbのEcoRＩゲノミックフラグメントは、ポリアデニル化部位の下流に約１kbのゲノミックDNAと５つのイントロンを含む完全なコーディング配列を内含している。これは、図５で3.1EcoRＩフラグメント２の上にあるETR1プロモータを内含していない。これらのベクターは、例３に記述されているように根の外植体を形質転換するために用いられた。突然変異体ETR1-1遺伝子を含むカナマイシン耐性植物が得られ、これは、例３に見られるものに類似したエチレン不感応性を示した。野生型ETR1遺伝子で形質転換した対照植物は、エチレン感応性自家後代のみを産生した。例５アンチセンスETR1を利用するベクター構成体標準的なAgrobacterium根形質転換手順を用いて導入されたETR1アンチセンス核酸の発現によって、野生型Arabidopsisに対してエチレン不感応性が付与された。Valvekens et al.（1988）Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A．85：5536。アンチセンス核酸は1.9kbのETR1 cDNAフラグメントで構成されていた。図３Ａ，３Ｂ，３Ｃ及び３Ｄ内でヌクレオチド220のMscＩ制限部位からヌクレオチド2176の第１のSmaＩ部位まで拡がっていたこのフラグメントの発現は、逆の配向でCaMV35Sプロモータによって駆動された。アンチセンス核酸を構築するため、1.9kbのMscＩ −SmaＩ DNAフラグメントの末端に、BamHＩリンカーを連結させ、このようにして形成されたフラグメントを、pCGN18形質転換ベクターのBamHＩ部位内に連結させた。Jack et al.（1994），Cell 76：703、構成体を上述のとおりAgrobacteri um菌株ASEへと形質転換させた。この形質転換実験から誘導された実生を、前述のとおりエチレンに対する感応性についてテストした。アンチセンス構成体を含む実生はエチレン不感応性のものであった。例６ Arabidopsis内の第２のETR核酸、QITRの同定 Arabidopsis thalianaからのゲノミックDNAをSau3Aで部分的に消化し、Promeg a社（Madison，Wisconsin）から得たλGEM11（半部位アーム）内へクローニングした。λGEM11でのクローニングの前にゲノミック消化物を部分的末端充てんに付し、メーカーの提案に従って培地上で平板固定した。かくしてクローニングされたライブラリを、図３Ｂ，３Ｃ及び３Ｄに記されている通りヌクレオチド993〜2308まで拡がる³²Ｐで標識付けされたcDNA XbaＩフラグメントを用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーション条件は50℃及び５×SSPEであった。50℃0.2×SSPEで洗浄を行なった。いくつかの積極的にハイブリッド形成するクローンを同定し、再度平板固定し、再度スクリーニングした。積極的にハイブリッド形成するクローンをSacＩ（これはクローニングファージのアーム内及びインサート内で分割する）で消化させた。そこから得た多数のフラグメントを、配列決定のため細菌プラスミド内にサブクローニングした。ゲノミックDNA配列（配列番号：45）と演繹されたアミノ酸配列（配列番号：46 及び48）が共に図12に記されている。このETR核酸及びアミノ酸配列は、それぞれQITR核酸又はアミノ酸配列と呼ばれる。QITR cDNA配列（配列番号：47）及びQ ITRアミノ酸配列（配列番号：46及び48）は、図13に示されている。 ETR1 Arabidopsis核酸及びアミノ酸配列（図２及び図３参照）と比較すると、 QITRタンパク質は、ETRIタンパク質のアミノ末端部分に対し比較的高いレベルの相同性をもつアミノ末端部分、及びETR1内の同じ配列に対し中位のレベルの相同性をもつヒスチジンキナーゼ部分を含んでいると思われる。ETR1内に見出される応答調節領域は、QITRタンパク質の中には存在しない。全体的核酸相同性は約69 ％である。アミノ末端部分（すなわち残基１〜316の間）に関しては、相同性は、アミノ酸配列については約71％同一であり、核酸配列については72％同一である。例７エチレン不感応性を付与するためのQITR核酸の修正 ETR1突然変異についてのものすなわち位置62のイソロイシンのフェニルアラニンでの置換と類似していた５kbのQITRゲノミッククローンの中でアミノ酸置換を行なった。図３Ａと図５Ａを残基62で比較されたい。図12及び図13でさらに記すとおり、QITRタンパク質内の残基62も、ETRIタンパク質中と同様イソロイシンである。オリゴヌクレオチドで誘導されたインビトロ突然変異誘発を用いて、QITR核酸に対してアミノ酸置換を行なった。Kunkel et al.（1987）Methods in Engymolo gy 154：367〜382。この特定の突然変異と結びつけて、Bio-Rad Laboratoreis， Hereules，CaliforniaからのMuta-geneキットを使用した。使用したオリゴヌクレオチドの配列は５′CGA GCC TTT TTC ATT CTCであった。コドンATC内のＴとヌクレオチドＡの置換により、演繹されたタンパク質配列内で残基62のアミノ酸Il eはPheに変わった。第１のHindIII部位から第２のKpnＩ部位までの約５kbにまたがるQITR核酸は、出発コドンから上流に約2.4kbのヌクレオチドを含んでいた。この５kbのフラグメントを、pCGN1547形質転換ベクター（前出）内に連結させた。次にこの構成体を、前出のものに記述されている通りにAgrobacterium菌株ASEへと、そしてその後Arabidopsisへと形質転換させた。この形質転換実験から誘導された実生を、前述の通りエチレンに対する感応性についてテストした。残基62に修正を含むQITR核酸を含む実生は、エチレン不感応性であった。例８ Arabidopsis ETR核酸Ｑ８の同定 ArabidopsisからのETR1核酸との直接的配列比較によって、ETR核酸Ｑ８（配列番号：41及び43）を同定した。Arabidopsis thalia naの染色体３上での染色体歩行と結びつけてArabidopsis Q8核酸を同定した。簡単に言うと、重複するYACクローンを生成し、これをその後でプラスミド内にサブクローニングした。制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、このようなプラスミド中のゲノミックインサートを解放させ、これをArabidopsis の花組織からのcDNAライブラリに対しハイブリッド形成させた。図14に記されている通り演繹されたアミノ酸配列（配列番号：42及び44）と共にゲノミック配列全体（配列番号：41）を産生するように、積極的にハイブリッド形成するインサートを配列決定した。cDNA配列（配列番号：43）及び演繹されたアミノ酸配列（配列番号：42及び44）は図15に記されている。Ｑ８核酸とETR1核酸の間のような全体的な核酸相同性は約69％である。残基１から316まで拡がるアミノ末端部分に関しては、全体的アミノ酸配列相同性は約7 2％であり、一方この配列をコードする核酸は、Ｑ８及びETR1核酸の間のように約71％の配列相同性をもつ。例９ TETR cDNAの分離 PCRプライマー「５′BamHＩ」（CCCGGATCCATAGTGTAAAAAATTCATAATGG）及び「３′BamHＩB」（CCGGATCCGTTGAAGACTTCCATCTTCTAACC）を用いてArabidopsis ETR 1遺伝子のPCR増幅により生成された1.3kbのPCRフラグメントの無作為プライマー標識付けを行なうことによって、³²Ｐ標識付けされたハイブリダイゼーションプローブを調製した。 Stratagene，La Jolla，CAからのラムダZAPIIベクターのEcoRＩ部位内でクローニングされた赤いトマトの果実mRNAのcDNAライブラリをスクリーニングするため、このプローブを使用した。このプローブに対しハイブリッド形成した20の陽性一次プラークを同定し（65℃２×SSCの洗浄条件）、これらの上で二次スクリーンを行なって純粋プラークを得た。その後結果として得られた組換え型ファージでインビボ切除を行ない、19の独立したプラスミドクローンを得た。 ETR1プローブに対してハイブリッド形成した最大のフラグメントを含むプラスミドクローンからの相補的DNAを配列決定し、最も長いトマトのcDNAのヌクレオチド配列及び予想されたアミノ酸配列（TETR14，TXTRとも呼ばれる）をETR1及び QITR配列に比較した。TETR14のヌクレオチド配列は、コードされたペプチドがET R1ペプチドよりもQITRペプチドの方により類似していることを予想していた。この結論は、TETR14及びQITRの両方の中に応答調節ドメイン（ETR1内に存在するもの）が存在していないという事実に基づくものであった。その他のcDNAクローンのいくつかの配列（又は部分的配列）を決定し、これが同じ遺伝子に対応することがわかった。例10 TETR14遺伝子発現の分析正常なトマト又は突然変異体のトマト（成熟阻害（rin）、非成熟（nor）又はネバーライプ（Nr））の発育中の果実からのmRNAを用いて、ノーザン分析法を実施した。使用した発育中の果実の段階は、緑熟果、ブレーカ、ブレーカプラス７日、及びエチレンで処理した緑熟果であった。TETR14遺伝子プローブにハイブリッド形成したメッセンジャRNAは、緑熟段階では存在しなかったが、ブレーカ、ブレーカプラス７日及びエチレン処理緑熟果には存在していた。従って、ETR14 mRNAの蓄積がエチレンによって調節されるという結論が下された。３つの成熟している突然変異体全ての中でTETR14 mRNAの蓄積が減衰しており、このことは、mRNAの蓄積がエチレンにより調節されるという発見事実をさらに裏づけている。例11 ピアソン及びネバーライプDNAからのTETR14遺伝子の分析 TETR14遺伝子のＮ末端領域を特異的に増幅するPCRプライマが得られた。増幅された部分は、図16Ａ及び16Ｂ内でMet1とIle214の間にあった。プライマは、（ CCGGATCCATGGAATCCTGTGATTGCATTG）とTETR4A（GATAATAGGAAGATTAATTGGC）であった。PCR条件（Perkin-Elmer Cetus）：１μｇのトマトゲノミックDNAN、40ピコモルの各プライマ、94℃で１分間、45℃で２分間、72℃で２分間、35サイクル。ピアソン及びNrのDNAの２つの独立した増幅反応の結果得られたこれらのプライマで得られたPCR産物を、アガロースゲルで精製し、Ｔ／Ａベクター（Invitroge n）内にサブクローニングさせるか又はBamHＩ及びXhoＩで消化させBamHＩ及びSa lＩで線形化されたBluescript KS内にサブクローニングさせた。結果として得られたプラスミドから一本鎖鋳型DNAを調製し配列決定した。ピアソンDNAからのPC R産物の配列は、TETR14クローンの配列と同じであった。配列分析は、Nr DNA（T ETR14-Nr）のPCRの結果としてもたらされたPCRフラグメントがピアソンDNAから得られたものと同一でなかったということを明らかにした。TETR14遺伝子の位置 395のシトシンヌクレオチドは、Nr DNAから増幅された遺伝子中のチミンである。TETR14-Nr内のこのヌクレオチド置換は、予測されたペプチドのアミノ酸位置3 6のプロリンをロイシンに変える。全体的核酸及びアミノ酸の配列それぞれについては、図22及び配列番号49及び50を参照のこと。TETR14のこのPro-36はETR1ペプチドのPro-36及びQITRペプチドのPro-36に対応する。この結果は、トマトTETR 14遺伝子中の突然変異が優性エチレン不感応性を付与することを表わしている。従って、TETR14遺伝子及びその他のトマトETR1相同体内のその他の変化が、結果としてトマトにおけるエチレン不感応性をもたらすことになるという予想を行なうことが可能である。本発明の好ましい実施形態について記述してきたが、開示された実施形態に対してさまざまな修正を加えることができ、かつかかる修正が本発明の範囲内に入るものとされていることは、当業者の目には明らかであろう。全ての参考文献は、本書に参考として明示的に組み込まれている。配列の列挙（１）一般情報：（ｉ）出願者：Meyerowitz，Elliott M． Chang，Caren Bleecker，Anthony B．（ii）発明の名称：エチレンに対する修正された応答をもつ植物（iii）配列の数：50 （iv）通信先：（Ａ）住所：Richard F.Trecartin （Ｂ）通り：3400 Embarcadero Center，Suite 3400 （Ｃ）町：San Francisco （Ｄ）州：California （Ｅ）国：USA （Ｆ）郵便番号：94111 （ｖ）コンピューター読取りフォーム：（Ａ）メディアムタイプ：Floppy disk （Ｂ）コンピューター：IBM PC compatible （Ｃ）操作システム：PC-DOS/MS-DOS （Ｄ）ソフトウェアー：Patentln Release＃1.0，Version ＃1.25 （vi）出願データ：（Ａ）出願番号： PCT／US94／（Ｂ）出願日：01-JUL-1994 （Ｃ）分類：（vii）従来の出願データ：（Ａ）出願番号： US 08／086,555 （Ｂ）出願日：01-JUL-1993 （Ｃ）分類：（viii）アトーニイ／エージェント情報：（Ａ）名称：Trecartin，Richard F．（Ｂ）登録番号：31,801 （Ｃ）参照／ドケット番号：FP57515-lRFT （ix）テレコミュニケーション情報：（Ａ）電話：（415）781-1989 （Ｂ）ファクシミリ：（415）398-3249 （２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：3879個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：DNA（ゲノム）（xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2787個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：188..2401 （xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 738個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2787個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：188..2401 （xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 738個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2787個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：188..2401 （xi）配列：配列番号６：（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 738個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号７：（２）配列番号８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2787個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：188..2401 （xi）配列：配列番号８：（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 738個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号９：（２）配列番号10についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2787個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA （ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：188..2401 （xi）配列：配列番号10：（２）配列番号11についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 738個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号11：（２）配列番号12についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 155個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号12：（２）配列番号13についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 155個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号13：（２）配列番号14についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 155個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：ペプチド（xi）配列：配列番号14：（２）配列番号15についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ： 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者チャン，カレンアメリカ合衆国，カリフォルニア 91107, パサデナ，サウスルーズベルトアベニュ 95，アパートメントナンバー３ (72)発明者ブリーカー，アンソニービー. アメリカ合衆国，ウィスコンシン 53711, マディソン，カウンシルクレスト 4022

Claims

【特許請求の範囲】１．植物ETR核酸を含んで成る単離された核酸。２．前駆体ETR核酸の１又は複数のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を含む変性された植物ETR核酸を含んで成る単離された核酸。３．前記変性されたETR核酸が、前記前駆体ETR核酸によりコードされる前駆体 ETRタンパク質と比較して、１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失を含む変性されたETRタンパク質をコードする請求の範囲第２項記載の核酸。４．前記変性されたETRタンパク質が異なったアミノ酸による前記前駆体ETRタンパク質における少なくとも１つの選択されたアミノ酸残基の置換を含んで成り、そして前記前駆体ETRタンパク質における前記選択されたアミノ酸残基が、アラビドプシスサリアナからのETRタンパク質におけるAla-31，Ile-62，Cys-65 及びAla-102から成る群から選択されたアミノ酸残基に相当する請求の範囲第３項記載の核酸。５．変性された植物ETR核酸に操作可能的に結合されるプロモータを含んで成る組換え核酸。６．前記変性されたETR核酸が前駆体ETR核酸の１又は複数のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を含み、そして前記プロモータが前記前駆体ETR核酸と異種であり、そして植物細胞において前記変性されたETR核酸の発現を引き起こすことができる請求の範囲第５項記載の組換え核酸。７．前記プロモータが組織特異的又は一過性−特異的プロモータを含んで成る請求の範囲第６項記載の組換え核酸。８．前記プロモータが誘発できる請求の範囲第６項記載の組換え核酸。９．請求の範囲第６項記載の組換え核酸により形質転換された植物細胞。 10．請求の範囲第９項記載の植物細胞を含んで成る植物。 11．変性されたETR核酸により形質転換された少なくとも１種の植物細胞を含んで成り、そして前記形質転換された植物細胞を含まない対応する野生型植物に比較して、エチレンに対する前記少なくとも１種の形質転換された植物細胞の応答の低下により特徴づけられる表現型を有する植物。 12．前記変性されたETR核酸が、前記前駆体ETR核酸によりコードされる前駆体 ETRタンパク質に比較して、前記変性されたETR核酸によりコードされる変性されたETRタンパク質における１又は複数のアミノ酸残基の置換、挿入又は欠失をもたらす前駆体ETR核酸における１又は複数のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を含んで成る請求の範囲第11項記載の植物。 13．前記前駆体ETR核酸における変性が、異なったアミノ酸による前記前駆体E TRタンパク質における１又は複数の選択されたアミノ酸残基の置換をもたらす１又は複数のヌクレオチドの置換を包含し、そして前記選択されたアミノ酸残基が、アラビドプシスサリアナからのETRタンパク質におけるAla-31，Ile-62，Cys -65及びAla-102から成る群から選択されたアミノ酸残基に相当する請求の範囲第 12項記載の植物。 14．組織−特異的プロモータが前記変性されたETR核酸に操作可能的に結合されている請求の範囲第12項記載の植物。 15．前記植物が果実−結実性であり、そして前記プロモータが果実−特異的プロモータである請求の範囲第14項記載の植物。 16．前記表現型が果実成熟の速度の低下により特徴づけられる請求の範囲第15項記載の植物。 17．請求の範囲第16項記載の植物からの果実。 18．トマトを包含する請求の範囲第17項記載の果実。 19．少なくとも１種の形質転換された細胞及び前記形質転換された植物細胞を含まない植物に比較して、エチレンに対する少なくとも１種の形質転換された植物細胞の応答の低下により特徴づけられる表現型を有する植物を製造するための方法であって：ａ）変性されたETR核酸により少なくとも１種の植物細胞を形質転換し；ｂ）このようにして形質転換された１又は複数の植物細胞から植物を再生し；そしてｃ）前記表現型を有する少なくとも１種の植物を選択する段階を含んで成る方法。 20．前記変性されたETR核酸が組織−特異的プロモータに操作可能的に結合される請求の範囲第19項記載の方法。