CN110214794A - 加快种子萌发的调节剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供加快种子萌发的调节剂的制备方法，包括铜藻提取物的制备，该制备方法为：将新鲜铜藻气囊清洗并搅碎，加入提取溶剂，于30‑60℃、外加磁场作用下提取，再于25‑32℃真空浓缩，静置结晶，最后水相浓缩得到铜藻提取物；其中，提取溶剂为甲醇‑水‑香草酸‑谷胱甘肽按体积比15‑25:1:0.5:0.1‑0.2；本发明加快种子萌发的调节剂的有效成分包括50‑60%的铜藻提取物和1‑8%的香豆素类化合物；本发明调节剂通过影响植物种子幼胚中相关酶活性，进而调控植物体内赤霉素和脱落酸的含量及比值，促进种子萌发。

Description

加快种子萌发的调节剂的制备方法
技术领域
本发明属于促进植物生长领域，具体涉及加快种子萌发的调节剂的制备方法。
背景技术
海藻是生活在海洋中的植物，形状和大小很不相同。其中大型藻类根据它们的颜色不同，主要有红藻、绿藻和褐藻。比如红藻有紫菜、石花菜等；绿藻有浒苔、石莼等；褐藻有海带、羊栖菜等。海藻中有很多营养物质，有蛋白质、脂肪、糖，还有各种植物激素、矿物质和微量元素，它们不仅是人们喜欢的营养，也是植物们生长所需要的营养，可以让植物长的更高、促进发芽，结的果更大、更甜，而且有利于土壤的维护，更有利于人体的健康。我国研发海藻提取物肥料/农药有重要意义，一是中国海藻资源非常丰富，既有天然生长的大型藻类，又有人工养殖的海藻，原料取之不尽。二是中国是农业大国，作物品种丰富，地域广阔，有着非常大的市场潜力和应用前景。三是海藻中含有丰富的碳水化合物、含氮化合物、脂类化合物、酚类化合物和维生素以及无机成分等，具有潜在的突出的功能活性，其提取物属于纯天然的绿色的环保的植物生长调节剂。
近年来从动物及微生物的代谢产物中发现了一些新的香豆素类化合物，如发光真菌中的亮菌素类、海洋真菌Hansfordiasinuosae中的异香豆素以及中药僵蚕中的香豆素等。迄今为止，已从自然界中分离了1300余种香豆素类化合物。香豆素类化合物具有抗菌、抗病毒、抗凝血等生物活性，尤其是其抗菌活性已被研究证实。香豆霉素A、氯香豆霉素等香豆素类抗生素已在临床用于肺炎、败血症等疾病的治疗。然而，将香豆素类化合物用于促进植物种子萌发，鲜有研究报道，具有一定的开发和应用前景。
CN 108617698 A的中国发明专利，公开了一种促进种子萌发的铜藻提取物及其应用，该铜藻提取方法是将新鲜铜藻的气囊摘取后，清洗并搅碎，再加入甲醇水溶剂，在室温条件下提取后，25-35℃的低温条件下第一次真空浓缩至一定醇浓度，并静置结晶；剩下的溶液再第二次真空浓缩至一定醇浓度，并静置结晶；最后的水相浓缩得到铜藻提取物。
发明内容
本发明的目的在于提供加快种子萌发的调节剂，该调节剂通过影响植物种子幼胚中相关酶活性，进而调控植物体内赤霉素和脱落酸的含量及比值，促进种子萌发。
本发明的目的还在于提供加快种子萌发的调节剂的制备方法，利用磁化处理辅助提取铜藻，增加铜藻提取物中有效成分(尤其是赤霉素)的含量，提高了铜藻的利用价值，有助于实现农业增收增产。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
加快种子萌发的调节剂，其有效成分包括50-60％的铜藻提取物和1-8％的香豆素类化合物。
加快种子萌发的调节剂的制备方法，包括铜藻提取物的制备，该制备将铜藻气囊置于含香草酸和谷胱甘肽的甲醇溶剂中，利用磁化辅助作用进行提取。
作为优选，铜藻提取物的制备方法为：将新鲜铜藻气囊清洗并搅碎，加入提取溶剂，于30-60℃、外加磁场作用下提取，再于25-32℃真空浓缩，静置结晶，最后水相浓缩得到铜藻提取物。
作为优选，铜藻气囊与提取溶剂的体积比为1:2.5-6g/mL。
作为优选，提取溶剂为甲醇-水-香草酸-谷胱甘肽按体积比15-25:1:0.5:0.1-0.2混合。
作为优选，磁感应强度为0.05-1.0T；提取时间为0.5-1.5小时。
作为优选，真空浓缩至浓度为20-35％。
作为优选，香豆素类化合物为具有以下化学式，
其中，R1和R2各自独立地是卤素、羟基、羧基、经取代的或未经取代的C1-C3烷氧基；且R1和R2连同它们所连接的碳原子未形成碳环。
作为优选，香豆素类化合物的使用浓度为10-7～10-5mol/L。
作为优选，加快种子萌发的调节剂的使用方法是将种子浸泡于浓度为30-160μg/mL的调节剂中30min-1h，再种于土壤中。
作为优选，上述种子为被子、裸子或蕨类植物的种子。
本发明利用磁化处理辅助提取铜藻，原理如下：提取溶剂甲醇、水等抗磁性物质处于磁场中时，分子产生与外磁场方向相反的附加磁矩，分子因此获得附加能量，在加热的共同作用下，使抗磁性物质内部分子的内聚力减少，分子势垒降低，引起宏观物理性质发生相应变化，如表面张力的减小，黏度增大，扩散系数增加，溶解度增大等，进而加速了铜藻有效成分的提取及分离过程；提取溶剂中香草酸和谷胱甘肽作为激活剂，在磁化作用下，对铜藻提取物中有效成分产生选择增益效果，不仅体现在影响铜藻细胞中GA20-氧化酶、GA3β-羟化酶等基因的表达和翻译，提高基因转录水平，促进酶活性，从而优化各种生物活性GA的合成，提高铜藻提取物中赤霉素的提取含量；此外，能够降低岩藻黄素等在甲醇水溶剂中的溶解度，易于分离，提高铜藻提取物中赤霉素等有效成分的纯度和收率。
由于植物激素中GA(赤霉素)能够促进种子萌发，ABA(脱落酸)则抑制种子萌发；本发明通过调节植物体内这两种激素的生物合成以及分解代谢相关酶的生物活性，有意控制两者的比例，进而调控植物种子的萌发；本发明香豆素类化合物有利于促进种子的胚乳破裂以及胚根伸长，进而促进种子萌发；对植物体内ABA的含量没有显著影响，但是能提高种子幼胚中GA3氧化酶的活性，影响GA代谢及信号转导，进而影响GA与ABA比值，从而促进种子萌发。
本发明的有益效果为：
1)本发明加快种子萌发的调节剂，通过影响植物种子幼胚中相关酶活性，调控植物体内赤霉素和脱落酸的含量及比值，进而促进种子萌发；
2)本发明加快种子萌发的调节剂有效成分包括铜藻提取物，利用磁化处理辅助提取铜藻，增加铜藻提取物中有效成分(尤其是赤霉素)的含量，提高了铜藻的利用价值；提取用溶剂中香草酸和谷胱甘肽作为激活剂，在磁化作用下，对铜藻提取物中有效成分产生选择增益效果，不仅体现在影响铜藻细胞中GA20-氧化酶、GA3β-羟化酶等基因的表达和翻译，提高基因转录水平，促进酶活性，从而优化各种生物活性GA的合成，提高铜藻提取物中赤霉素的提取含量；此外，能够降低岩藻黄素等在甲醇水溶剂中的溶解度，易于分离，提高铜藻提取物中赤霉素等有效成分的纯度和收率。
本发明采用了上述技术方案提供范文，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
具体实施方式
本发明加快种子萌发的调节剂，其有效成分包括铜藻提取物和香豆素类化合物；其中，香豆素类化合物为具有以下化学式，
其中，R1和R2各自独立地是卤素、羟基、羧基、经取代的或未经取代的C1-C3烷氧基；且R1和R2连同它们所连接的碳原子未形成碳环。
选取铜藻提取物的原料方法如下：
对铜藻不同部位研磨后，用甲醇-水-香草酸-谷胱甘肽(15:1:0.5:0.1，v/v/v/v)进行提取，提取液对苹果种子进行萌发，每个组6颗种子，种子分别用不同部位的提取液浸泡30min后，放入一个萌发袋中。袋中继续加入铜藻提取物溶液，并以清水作为阴性对照组。结果发现气囊部位对苹果种子的萌发效果最好,第48h时就有2颗种子发芽，在60h时，发芽率达到5颗，都高于其它两个铜藻部位的提取物(表1)；因此，选用铜藻气囊作为提取的材料。
表1：铜藻不同部位提取物对种子发芽率的对比表
时间 清水 叶片 气囊 茎
48h 0/6 0/6 2/6 0/6
60h 2/6 2/6 5/6 3/6
72h 5/6 6/6 6/6 6/6
对铜藻提取方法的优选如下：
首先使用已报到的方法进行提取：
新鲜铜藻清洗并搅碎，再加入甲醇水溶剂，在室温条件下提取后，25-32℃的低温条件下真空浓缩得到铜藻提取物(表2中的提取物1)；
使用上述方法获得的提取物对气囊提取液对苹果种子进行萌发实验，结果发现上述方法提取的提取物中需要高浓度才有很好的效果；而且生根效果不好。
为了克服上述的问题，本发明对提取方法进行了优化。
本发明所建立的方法如下：
新鲜铜藻采集后，分离其中的气囊部分200g，利用清水清洗3遍后。利用搅碎机打碎至粒度为2-3mm，压榨脱水，加入甲醇:水:香草酸:谷胱甘肽＝15:1:0.5:0.1(体积比)的溶液800ml中，在50℃、外加磁场作用(磁感应强度为0.6T)下提取1小时，过滤；将浸提液在30℃真空浓缩至浓度为30％，静置待结晶完全，过滤去除岩藻黄素等物质，将溶液低温真空浓缩至20ml，干燥，低温储存(表2中的提取物2)。
对上述两种方法提取的铜藻提取物进行检测，步骤如下：
将两种方法的提取物分别用1mL含10mmol/L乙酸铵的甲醇-水-乙(90:10:0.05，v/v/v)复溶，将复溶液在4℃下10000r/min离心10min，取上清液经0.22μm有机滤膜过滤，上LC-MS分析。
色谱条件：分别采用Thermo Hypersil Gold C18色谱柱(100mm×2.1mm，3μm)为固定相；流动相为含10mmol/L乙酸铵的水溶液(A)-甲醇(B)，洗脱梯度为：在10min内流动相B从15％升到95％，保持1min后在1min内降到15％，保持3min；流速设置为0.3mL/min，柱温30℃，进样量10μL。
质谱条件：分别采用电喷雾电离源正、负离子电离模式，喷雾电压分别为3kV和2.5kV，鞘气流量20L/min，辅助气流量10L/min，离子传输管温度270℃，Q2碰撞室碰撞诱导解离电压1.5V，采用选择反应监测(SRM)扫描模式。
对提取物的测定结果表明提取物中含有吲哚乙酸、赤霉素、芸苔素内酯、玉米素、异戊烯腺嘌呤等物质。
表2：不同提取方法的提取物的含量检测表(ng/g，X±SD)
组分 提取物1 提取物2
异戊烯腺嘌呤 10.32±0.32 10.78±0.36
异戊烯腺苷 3.35±0.19 ND
反式玉米素核苷 3.33±0.01 0.61±0.05
玉米素 ND 3.77±0.03
吲哚乙酸 8.99±0.23 86.87±3.53
赤霉素 5.14±0.38 9.68±0.87
脱落酸 ND 3.56±0.51
芸苔素内酯 9.35±0.73 20.01±0.83
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
加快种子萌发的调节剂，包括50％的铜藻提取物、1％的香豆素类化合物和49％的草木灰溶液；
加快种子萌发的调节剂的制备方法：
其中，铜藻提取物的制备方法为：将新鲜铜藻气囊清洗并搅碎，加入提取溶剂，铜藻气囊与提取溶剂的体积比为1:2.5g/mL，于30℃、外加磁场作用(磁感应强度为0.05T)下提取1.5小时，再于25℃真空浓缩，静置结晶，最后水相浓缩得到铜藻提取物；提取溶剂为甲醇-水-香草酸-谷胱甘肽按体积比15:1:0.5:0.2；
香豆素类化合物为具有以下化学式，
其中，R1和R2均为羟基；该香豆素类化合物的使用浓度为10-7mol/L。
本发明利用磁化处理辅助提取铜藻，原理如下：提取溶剂甲醇、水等抗磁性物质处于磁场中时，分子产生与外磁场方向相反的附加磁矩，分子因此获得附加能量，在加热的共同作用下，使抗磁性物质内部分子的内聚力减少，分子势垒降低，引起宏观物理性质发生相应变化，如表面张力的减小，黏度增大，扩散系数增加，溶解度增大等，进而加速了铜藻有效成分的提取及分离过程；提取溶剂中香草酸和谷胱甘肽作为激活剂，在磁化作用下，对铜藻提取物中有效成分产生选择增益效果，不仅体现在影响铜藻细胞中GA20-氧化酶、GA3β-羟化酶等基因的表达和翻译，提高基因转录水平，促进酶活性，从而优化各种生物活性GA的合成，提高铜藻提取物中赤霉素的提取含量；此外，能够降低岩藻黄素等在甲醇水溶剂中的溶解度，易于分离，提高铜藻提取物中赤霉素等有效成分的纯度和收率。
由于植物激素中GA(赤霉素)能够促进种子萌发，ABA(脱落酸)则抑制种子萌发；本发明通过调节植物体内这两种激素的生物合成以及分解代谢相关酶的生物活性，有意控制两者的比例，进而调控植物种子的萌发；本发明香豆素类化合物有利于促进种子的胚乳破裂以及胚根伸长，进而促进种子萌发；对植物体内ABA的含量没有显著影响，但是能提高种子幼胚中GA3氧化酶的活性，影响GA代谢及信号转导，进而影响GA与ABA比值，从而促进种子萌发。
本发明加快种子萌发的调节剂的使用方法为：将种子浸泡于浓度为30μg/ml的调节剂中30min，再种于土壤中。
实施例2：
加快种子萌发的调节剂，包括56％的铜藻提取物、5％的香豆素类化合物和39％的草木灰溶液；
加快种子萌发的调节剂的制备方法：
其中，铜藻提取物的制备方法为：将新鲜铜藻气囊清洗并搅碎，加入提取溶剂，铜藻气囊与提取溶剂的体积比为1:5g/mL，于50℃、外加磁场作用(磁感应强度为0.6T)下提取1小时，再于30℃真空浓缩，静置结晶，最后水相浓缩得到铜藻提取物；提取溶剂为甲醇-水-香草酸-谷胱甘肽按体积比20:1:0.5:0.1；
香豆素类化合物为具有以下化学式，
其中，R1为甲氧基，R2为羧基；该香豆素类化合物的使用浓度为10-6mol/L。
本发明加快种子萌发的调节剂的使用方法为：将种子浸泡于浓度为80μg/ml的调节剂中30min，再种于土壤中。
对比例1：
本发明加快种子萌发的调节剂组分为：56％的铜藻提取物和44％的草木灰溶液，其余部分和实施例2完全一致。
对比例2：
本发明加快种子萌发的调节剂制备中，铜藻提取用溶剂中不含有香草酸和谷胱甘肽，其余部分和实施例2完全一致。
实施例3：
考察本发明加快种子萌发的调节剂对苹果种子发芽率的影响，结果如表3；选购苹果种子共60颗，每组20颗种子，种子分别用各自调节剂浸泡，放入一个萌发袋中。袋中继续加入各自浓度的调节剂，并以清水作为阴性对照组，以商品购买的普通液体肥作为阳性对照。
表3本发明加快种子萌发的调节剂对苹果种子发芽率的影响
由表3可知，本发明加快种子萌发的调节剂，能够显著促进种子萌发；该促进机理是通过影响植物种子幼胚中相关酶活性，进而调控植物体内赤霉素和脱落酸的含量及比值，促进种子萌发；该调节剂中有效成分铜藻提取物和香豆素类化合物，均能够促进植物体内赤霉素含量增加，因而具有协同增益效果；在铜藻提取过程中，在常规的甲醇水溶剂中添加香草酸和谷胱甘肽，有助于提高铜藻提取物中赤霉素的提取含量，同时纯化其纯度。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (10)

1.加快种子萌发的调节剂的制备方法，其特征在于：所述调节剂有效成分包括50-60％的铜藻提取物和1-8％的香豆素类化合物；所述铜藻提取物的制备通过将铜藻气囊置于含香草酸和谷胱甘肽的甲醇溶剂中，利用磁化辅助作用进行提取。
2.根据权利要求1所述的加快种子萌发的调节剂的制备方法，其特征在于：所述铜藻提取物的制备方法为：将新鲜铜藻气囊清洗并搅碎，加入提取溶剂，于30-60℃、外加磁场作用下提取，再于25-32℃真空浓缩，静置结晶，最后水相浓缩得到铜藻提取物。
3.根据权利要求2所述的加快种子萌发的调节剂的制备方法，其特征在于：所述铜藻气囊与提取溶剂的体积比为1:2.5-6g/mL。
4.根据权利要求2所述的加快种子萌发的调节剂的制备方法，其特征在于：所述提取溶剂为甲醇-水-香草酸-谷胱甘肽按体积比15-25:1:0.5:0.1-0.2。
5.根据权利要求2所述的加快种子萌发的调节剂的制备方法，其特征在于：所述磁感应强度为0.05-1.0T；提取时间为0.5-1.5小时。
6.根据权利要求1所述的加快种子萌发的调节剂的制备方法，其特征在于：所述香豆素类化合物为具有以下化学式，
其中，R1和R2各自独立地是卤素、羟基、羧基、经取代的或未经取代的C1-C3烷氧基；且R1和R2连同它们所连接的碳原子未形成碳环。
7.根据权利要求1所述的加快种子萌发的调节剂的制备方法，其特征在于：所述香豆素类化合物的使用浓度为10-7～10-5mol/L。
8.权利要求1所述的制备方法制得的调节剂在加快种子萌发中的应用。
9.权利要求1所述的制备方法制得的加快种子萌发的调节剂的使用方法，其特征在于：所述方法是将种子浸泡于浓度为30-160μg/ml的调节剂中30min-1h，再种于土壤中。
10.根据权利要求9所述的加快种子萌发的调节剂的使用方法，其特征在于：所述种子为被子、裸子或蕨类植物的种子。
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