CN109068642B

CN109068642B - 含有三磷酸腺苷双磷酸酶基因组合的改良植物和用于制备具有三磷酸腺苷双磷酸酶组合的改良植物的方法

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Publication number: CN109068642B
Application number: CN201680077778.XA
Authority: CN
Inventors: S·J·劳克斯; G·B·克拉克
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2015-11-12
Filing date: 2016-11-11
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2036-11-11
Also published as: ZA201803063B; CN109068642A; EP4115734A1; CA3005234A1; EP3373730A4; CN114457096A; US20180320151A1; US20220106577A1; WO2017083728A2; EP3373730A2; BR112018009535A2; MX2018005935A; WO2017083728A3; AU2016353320A1; US11203745B2; MX2023009350A; AU2016353320B2

Abstract

本公开涉及含有三磷酸腺苷双磷酸酶基因的组合的修饰植物细胞、植物组织、小植物、植物部分、植物及其后代，所述三磷酸腺苷双磷酸酶基因的组合包括至少一个修饰的基因和/或至少一个额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。所述公开还涉及一种制备具有修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和/或额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的改良植物的方法。所述改良植物通常呈现出至少一个优于该植物由其衍生的植物系的改进特征。所述公开还涉及包含编码所公开的三磷酸腺苷双磷酸酶的核苷酸序列的重组DNA分子。

Description

含有三磷酸腺苷双磷酸酶基因组合的改良植物和用于制备具有三磷酸腺苷双磷酸酶组合的改良植物的方法

相关申请的交叉参考

本申请要求2015年11月12日提交的美国临时申请号62/254,558、2015年11月12日提交的美国临时申请号62/254,552、2015年11月12日提交的美国临时申请号62/654,543和2016年7月8日提交的美国临时申请号62/360,210的权益，将每篇的公开内容全部按引用并入本文中。

联邦资助研究的声明

不适用。

序列表按引用并入

本申请包括经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并全部按引用由此并入。生成于2016年11月11日的所述序列表命名为UTTA005WO_ST25.txt，并且大小为11.9千字节。

技术领域

本公开总体地涉及三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)基因、遗传修饰的植物和三磷酸腺苷双磷酸酶基因在植物中以在自然界中未发现的方式表达的领域。本公开还涉及用于设计和制备修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的方法，以及以在自然界中未发现的方式表达三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物。

背景技术

三磷酸腺苷双磷酸酶(核苷三磷酸二磷酸水解酶)是可以从NTP和NDP除去末端磷酸的酶，但不能从单磷酸核苷去除磷酸。它们在动物(Knowles，2011)和植物(Clark等，2014)的生理中起着多样的作用。表明某些三磷酸腺苷双磷酸酶可以调节植物生长的某些方面的早期研究由Thomas等(1999)和Wu等(2007)公布。这些研究狭隘地在特定模型中表明，某些三磷酸腺苷双磷酸酶的组成型表达可以促进营养生长，并且这些三磷酸腺苷双磷酸酶的抑制可以抑制生长。然而，这些研究只检验了生长在琼脂平板上的幼苗的根和嫩芽的营养生长，并且他们没有测试这些效应是否对之后的植物生长阶段和种子生产率具有任何影响。促进营养生长的因子常常对生殖生长具有很小的作用或没有作用，或者在一些情况中，甚至可能抑制生殖生长(Barker，2010)。此外，这些早期研究局限于三磷酸腺苷双磷酸酶表达对仅一种小的草本植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)的生长的作用。因此，这些早期研究不能预测三磷酸腺苷双磷酸酶的组成型表达是否对重要作物植物(如大豆)的种子生产率具有任何影响。

报道了三磷酸腺苷双磷酸酶增强的拟南芥幼苗的营养生长的相同幼苗研究还报告，某些三磷酸腺苷双磷酸酶的组成型表达可以增强这些幼苗的磷酸盐摄取(Thomas等，1999)。然而，这种增强仅在非常高的磷酸盐浓度(2mM)下才观察到，该浓度显著高于在大部分土壤或在商业肥料的溶液中发现的浓度(Smith等，2015)。因此，基于这个早期实验室结果，看起来三磷酸腺苷双磷酸酶的组成型表达对肥料使用前后的田间条件下的磷酸盐摄取具有很少的作用或没有作用，并且因此将具有很低的实用价值。

发明内容

在一个实施方式中，本公开涉及修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。本公开进一步涉及设计和制备修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的方法。在某些实施方式中，修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因是修饰的psNTP9、编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因或包含SEQ ID NO:4的DNA序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。在进一步的实施方式中，本公开提供了修饰三磷酸腺苷双磷酸酶以提高钙调蛋白结合的方法，包括将三磷酸腺苷双磷酸酶的氨基酸序列在螺旋轮图上作图，确定主要包含疏水性氨基酸残基的螺旋轮图的部分和主要包含碱性氨基酸残基的螺旋轮图的部分，并且用更疏水的氨基酸残基替代主要包含疏水性氨基酸残基的螺旋轮图部分中的至少第一非疏水性氨基酸残基或用更碱性的氨基酸残基替代主要包含碱性氨基酸残基的螺旋轮图部分中的至少第一非碱基氨基酸残基。

在另一个实施方式中，本公开涉及含有修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶的植物细胞、植物组织、小植物、植物部分、植物及其后代，以及制备这样的含有修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物细胞、植物组织、小植物、植物部分、植物及其后代的方法。在更多实施方式中，所述植物部分是细胞、种子、根、茎、叶、头状部分(head)、花或花粉。在再另一个实施方式中，所述修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶是修饰的psNTP9、编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因或包含SEQ ID NO:4的DNA序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。

本公开进一步涉及与衍生其的植物系相比，经修饰以含有和表达至少一个额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因(例如，通过染色体外表达或插入其基因组中)的植物部分、植物及其后代，以及制备这样的含有至少一个额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物部分、植物及其后代的方法，和制备这样的植物、植物部分或后代植物的方法。在某些实施方式中，所述额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因是天然存在的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。在其他实施方式中，所述额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因是外源三磷酸腺苷双磷酸酶基因或修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。在特别的实施方式中，所述额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因是豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因或拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶基因，或包含SEQ ID NO:3的DNA序列的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因或编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因。在各种实施方式中，所述改良的植物具有优于该植物由其衍生的植物系的提高的产量。

本公开进一步涉及与衍生其的植物系相比含有至少一个修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和至少一个额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的组合的植物细胞、植物组织、小植物、植物部分、植物及其后代，以及制备这样的含有至少一个修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和至少一个额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物细胞、植物组织、小植物、植物部分、植物及其后代的方法。在一些实施方式中，所述修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶是修饰的psNTP9、编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因或包含SEQ IDNO:4的DNA序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。在其他实施方式中，所述额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因是天然存在的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。在另一实施方式中，所述额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因是外源三磷酸腺苷双磷酸酶基因，例如，豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因或拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶基因、包含SEQ ID NO:3的DNA序列的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因或编码SEQ ID NO:1的氨基酸序列的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因。

根据本公开的每个实施方式的改良植物通常呈现出一个或多个优于其来源的植物系的改进，所述改进选自以下的至少一个：提高的产量、磷酸盐摄取、抗旱性、抗病性、抗真菌性、营养物吸收、水吸收、平均初生根长度、平均侧根数量、平均根毛密度和长度、豆科植物中根瘤的平均数量和大小、平均种荚大小、平均种子大小、平均种子重量、种子萌发、种子存活、平均长角果数量、平均长角果大小、平均叶长、平均叶面积或平均植物高度。当处于胁迫(包括干旱或渗透胁迫)下时，根据本公开的不同实施方式改良的植物在那些特征的一个或多个中呈现出优于其来源的植物系的更佳性能。

额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因可以是任何已知的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因可以源自任何已知的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。存在许多已知和公开的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。(参见，例如，Clark等，2014，相关部分按引用并入本文中)。在不同的植物中可以发现不同的三磷酸腺苷双磷酸酶基因，并且甚至在相同植物种内，可能存在多种已知的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。许多三磷酸腺苷双磷酸酶基因共有非常相似的DNA序列。源三磷酸腺苷双磷酸酶基因可以进行修饰以使得由修饰的基因编码的氨基酸序列与源三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码的氨基酸序列相同或不同。在某些实施方式中，修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码与源三磷酸腺苷双磷酸酶基因相同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码与源三磷酸腺苷双磷酸酶基因不同的氨基酸序列。在进一步的实施方式中，修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码相对于源三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码的氨基酸序列含有1、2、3或更多个氨基酸变化的氨基酸序列。以修饰以包含修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物通常呈现出一个或多个优于其来源的植物系的改进特征。在一些实施方式中，三磷酸腺苷双磷酸酶基因是豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因或拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶基因。

可以通过转化，如通过土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化，将额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因或修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因添加至植物的基因组。或者，可以通过常规的育种技术，例如，将一植物系与另一个含有额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和/或修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物系杂交，将额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因或修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因并入植物中。在进一步的实施方式中，可以将含有修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物系与含有额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物系杂交，从而获得含有修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的组合的植物。在另一个实施方式中，通过遗传工程化技术，例如，经由土壤杆菌转化，将修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和/或额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因转移至植物的基因组中。或者，三磷酸腺苷双磷酸酶或修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因可以是外源三磷酸腺苷双磷酸酶或修饰的基因。在另一个替换方案中，三磷酸腺苷双磷酸酶或修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因可以在染色体外表达。

本公开还提供了包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶和包含SEQ ID NO:4的核苷酸序列的修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。本公开的另一个方面是重组双链DNA分子，其按顺序包含：能够引起结构DNA序列在植物中表达的启动子；编码三磷酸腺苷双磷酸酶(例如，具有包含SEQ ID NO:2的序列的氨基酸序列的修饰三磷酸腺苷双磷酸酶基因)的三磷酸腺苷双磷酸酶基因结构DNA序列；和3’未翻译区，其在植物细胞起到导致多腺苷酸核苷酸链添加至RNA序列的3’端的作用。这样的DNA分子通常能够在植物细胞中表达包含如SEQ ID NO:2的氨基酸序列的三磷酸腺苷双磷酸酶。启动子可以是异源启动子。如本文中使用的，术语“异源的”是指源自不同来源并且因此在正常情况下在自然界中不相关联的两个或更多个项目之间的关系。例如，编码蛋白质的重组DNA分子相对于可操作地连接的启动子是异源的，如果这样的组合在正常情况下在自然界中不存在。此外，当特定的重组DNA分子在细胞、种子或生物体中不是天然地存在时，则该特定重组DNA分子相对于其插入到其中的特定细胞、种子或生物体是异源的。在一些实施方式中，所述蛋白质在其完全编码长度上与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多肽序列具有至少约85％序列同一性、至少约90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性。在某些实施方式中，所述启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)启动子。因此，本公开提供了重组DNA分子，其包含在植物细胞中功能性的异源启动子(可操作地连接于编码多肽的核酸序列)，所述多肽在其完全编码长度上与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的多肽序列具有至少90％序列同一性、至少95％序列同一性、至少96％序列同一性、至少97％序列同一性、至少98％序列同一性或至少99％序列同一性。在某些实施方式中，所述DNA分子包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的核酸序列。

本公开进一步涉及编码SEQ ID NO:2的氨基酸序列的修饰三磷酸腺苷双磷酸酶基因、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的植物细胞、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的植物组织、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的小植物、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的植物部分、包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的植物及含有和表达SEQ ID NO:2的氨基酸序列的其后代。本公开还涉及编码包含SEQ ID NO:2的序列的三磷酸腺苷双磷酸酶的分离的DNA分子。在可选的方面中，SEQ ID NO:2可以在染色体外表达。

本公开进一步涉及SEQ ID NO:4的DNA序列或基本上包含SEQ ID NO:4的序列的修饰三磷酸腺苷双磷酸酶基因。本公开进一步涉及包含含有SEQ ID NO:4的DNA序列的植物细胞、植物组织、小植物、植物部分、植物及其后代。在可选的方面中，SEQ ID NO:4可以在染色体外表达。

在某些实施方式中，根据本公开的植物细胞、植物组织、小植物、植物部分、植物及其后代呈现出一个或多个优于其来源的植物系的改进：提高的产量、磷酸盐摄取、抗旱性、抗病性、抗真菌性、营养物吸收、水吸收、平均初生根长度、平均侧根数量、种荚的平均数量、平均种荚大小、平均种子大小、平均种子重量、种子萌发、种子存活、平均长角果数量、平均长角果大小、平均叶长、平均叶面积或平均植物高度。当处于胁迫(包括干旱或渗透胁迫)下时，根据本公开的改良植物在那些特征的任一个中呈现出优于其来源的植物系的更佳性能。

根据本公开的任一实施方式的改良植物可以是单子叶植物或双子叶植物。在特定实施方式中，所述改良的植物是大豆、棉花(棉属(Gossypium sp.)，包括例如陆地棉(G.hirsutum))、加拿大油菜(canola)、马铃薯、水稻、小麦、甜菜或玉米(玉蜀黍)植物。

本公开还涉及设计对三磷酸腺苷双磷酸酶基因的修饰的方法，包括将三磷酸腺苷双磷酸酶基因的翻译序列在螺旋轮图上作图，鉴定显示出是钙调蛋白结合区的区域，选择至少一个核苷酸用于修饰，所述修饰将导致增强钙调蛋白结合区的结合特性的氨基酸修饰，制备修饰的基因，将修饰的基因插入植物组织中，其中所得到的植物呈现出至少一个优于其来源的植物系的改进。本公开还涉及通过该技术设计或修饰的修饰三磷酸腺苷双磷酸酶氨基酸序列和修饰三磷酸腺苷双磷酸酶核苷酸序列。

附图说明

为了更全面地了解本公开的特征和优势，现在将参照详述和附图进行说明。

图1是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS-PK)、拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶AtAPY1(AT-PK)和空载体对照(PK-EV)转化的棉花发根培养物的磷酸盐摄取的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’st-检验，P≤0.001；n≥6)。

图2是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS-PK)、拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶AtAPY1(AT-PK)和空载体对照(PK-EV)转化的大豆发根培养物的磷酸盐摄取的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’st-检验，P≤0.001；n≥10)。

图3是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的3周大的拟南芥幼苗(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)与Col-0野生型对照(Col-0)相比的初生根长度的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，P≤0.001；n≥4)。

图4是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的三个独立系的3周大的拟南芥幼苗(WS-OE-1、WS-OE-2和WS-OE-3)与野生型对照(WS)相比的初生根长度的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，**表示P≤0.005；*表示P≤0.05；n≥2)。

图5是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)在磷酸盐不存在的情况下生长的3周大的拟南芥幼苗与Col-0野生型对照(Col-0)相比的叶面积的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.07；n≥5)。

图6是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用psNTP9转化的三个独立系(WS-OE-1、WS-OE-2和WS-OE-3)在磷酸盐不存在的情况下生长的3周大的拟南芥幼苗与WS野生型对照(WS)相比的叶面积的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*表示P≤0.01；n≥2)。

图7是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的长角果(种荚)数量的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.02；n≥9)。

图8是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的长角果数量的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；**P≤0.005；n≥8)。

图9是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的平均种子重量的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.0001；**＝P≤0.000002；n≥8)。

图10是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的平均种子重量的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.000005；n≥8)。

图11是显示了在没有肥料下生长的成熟野生型(WT)、psNTP9转化的(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)和空载体对照(EV-1和EV-2)拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；n＝6)。

图12是显示了在半肥料中生长的成熟野生型(WT)、psNTP9转化的(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)和空载体对照(EV-1和EV-2)拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；**P≤0.005；n＝6)。

图13是显示了在全肥料情况下生长的成熟野生型(WT)、psNTP9转化的(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)和空载体对照(EV-1和EV-2)拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；**P≤0.005；n＝6)。

图14是显示了在没有肥料情况下生长的成熟野生型(WT)、psNTP9转化的(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)和空载体对照(EV-1和EV-2)拟南芥植物产生的平均种子重量(mg/植物)的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；**P≤0.0005；n＝6)。

图15是显示了在半肥料情况下生长的成熟野生型(WT)、psNTP9转化的(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)和空载体对照(EV-1和EV-2)拟南芥植物产生的平均种子重量(mg/植物)的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；**P≤0.0005；n＝6)。

图16是显示了在全肥料情况下生长的成熟野生型(WT)、psNTP9转化的(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)和空载体对照(EV-1和EV-2)拟南芥植物产生的平均种子重量(mg/植物)的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；**P≤0.0005；n＝6)。

图17是显示了用修饰的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的(psNTP9-DM2、psNTP9-DM4、psNTP9-DM9和psNTP9-DM11)、psNTP9转化的(OE-2和OE-3＝中等表达系)、Col-0-野生型(WT)和空载体(EV)对照转化的成熟拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05；n＝5)。

图18是显示了用修饰的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的(psNTP9-DM2、psNTP9-DM4、psNTP9-DM9和psNTP9-DM11)、psNTP9转化的(OE-2和OE-3＝中等表达系)、Col-0-野生型(WT)和空载体(EV)对照转化的成熟拟南芥植物产生的以克(gm)/植物计的平均种子重量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，**P≤0.01；***P≤0.001；n＝5)。

图19是显示了野生型植物和用psNTP9转化的两个大豆植物的种荚总数的分布的条形图。

图20是显示了用具有单突变(Mut-1)和双重突变(Dou Mut)的豌豆psNTP9转化的大豆发根培养物与用空载体对照(PK-EV)转化的大豆培养物相比的磷酸盐摄取的条形图。误差条表示标准误差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’st-检验，**＝P≤0.00001；*＝P≤0.01；n≥5)。

图21是显示了充分灌溉和干旱再灌溉(再灌溉后2天)的野生型(WT)、转基因(HE-1、HE-2、HE-3和ME-1)和空载体(EV-1)拟南芥植物的地上部分的平均鲜重的条形图。每个条表示三个生物学重复的平均值。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，**＝P≤0.05；**＝P≤0.005；***＝P≤0.0005；对于灌溉植物n>10；对于干旱再灌溉植物，n>20)。

图22是显示了Col-0野生型(WT)、空载体对照(EV)和表达psNTP9的转基因系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)拟南芥植物随着时间的水含量(％)的条形图。所述值表示三个生物学重复的平均值(n>9)。

图23是显示了包括Col-0野生型(WT)、空载体对照(EV)和表达psNTP9的转基因系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)的拟南芥植物的相对失水率(％)的条形图。各条表示三个生物学重复的平均值。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.0005；n>9)。针对每个时间段，从左至右的道分别对应于WT、HE-1、HE-2、HE-3、ME-1和EV-1。

图24是显示了包括Col-0野生型(WT)、空载体对照(EV)和表达psNTP9的转基因系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)的充分灌溉的植物和干旱再灌溉的拟南芥植物在51天后的地上部分鲜重的条形图。每个条表示三个生物学重复的平均值。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；**＝P≤0.005；***＝P≤0.0005；对于灌溉植物，n＝10；对于干旱再灌溉植物，n>8)。

图25是显示了在含有200mM甘露醇的1/2MS(渗透培养基)上生长10天后野生型(对照)和转基因(OE，ME)和空载体(EV)拟南芥种子的以厘米计的平均初生根长度的条形图。OE是指超表达转基因系HE-1、HE-2和HE-3。ME是指中等表达系ME-1、ME-2、ME-3和ME-4。EV是指空载体系EV-1和EV-2。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05，n＝5)。

图26是显示了在含有200mM甘露醇的1/2MS(渗透培养基)上生长10天后野生型(对照)和转基因(OE，ME)和空载体(EV)拟南芥种子观察到的平均侧根数的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05，n＝5)。

图27是显示了在含有200mM甘露醇的1/2MS(渗透培养基)上生长10天后野生型(WT)、转基因(HE-1、HE-2、HE-3、ME-1、ME-2、ME-3和ME-4)和空载体(EV-1和EV-2)拟南芥植物的根毛密度的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05，n＝5)。

图28是显示了在含有200mM甘露醇的1/2MS(渗透培养基)上生长10天后野生型(WT)、转基因(HE-1、HE-2、HE-3、ME-1、ME-2、ME-3和ME-4)和空载体(EV-1和EV-2)拟南芥植物观察到的以毫毛计的平均根毛长度的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*P≤0.05，n＝5)。

图29是显示用psNTP9转化的系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)、Col＝0野生型对照(WT)和空载体对照(EV)转化的拟南芥植物中的根毛密度(平均根毛数/mm)的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’st-检验，*＝P≤0.05；**＝P≤0.005；***＝P≤0.0005；n＝5)。

图30是显示用psNTP9转化的系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)、Col＝0野生型对照(WT)和空载体对照(EV)拟南芥植物中的根毛长度(mm)的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；**＝P≤0.005；***＝P≤0.0005；n＝5)。

图31是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种荚数/植物的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；n＝6)。

图32是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/植物的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；n＝6)。

图33是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的以克(g)/植物计的平均种子重量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；**＝P≤0.005；n＝6)。

图34是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/克的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.005；*＝P≤0.0005；n＝6)。

图35是显示了针对在温室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种荚数/植物的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；**＝P≤0.0005；n分别＝16、4、10和6)。

图36是显示了在温室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/植物的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；**＝P≤0.0005；n分别＝16、4、10和6)。

图37是显示了在温室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的以克(g)/植物计的平均种子重量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.0005；n分别＝16、4、10和6)。

图38是显示了在温室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/克的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.0005；n分别＝16、4、10和6)。

图39是显示了3个月大的Williams 82野生型对照大豆(WT)和psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的根生物量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.005；**＝P≤0.0005；n分别＝6、3、6和4)。

图40是显示了3个月大的Williams 82野生型对照大豆(WT)和psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的根瘤生物量的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；**＝P≤0.005；n分别＝5、3、5和4)。

图41是显示了3个月大的Williams 82野生型对照大豆(WT)和psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均根瘤数/植物的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.05；n分别＝8、6、8和7)。

图42是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS)、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆、玉米和加拿大油菜发根培养物的磷酸盐摄取(基于鲜重的Pi含量)的条形图。每个条表示三个生物学重复的平均值。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’st-检验，*＝P≤0.005；**＝P≤0.00005；对于大豆，n>4；对于玉米，n>8；对于加拿大油菜，n>6)。

图43是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆、玉米和加拿大油菜发根培养物的磷酸盐摄取(基于干重的Pi含量)的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.005；**＝P≤0.0005；***＝P≤0.0005；对于大豆，n>4；对于玉米，n>9；对于加拿大油菜，n>6)。

图44是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆培养物的生长速率(平均组织鲜重mg/培养物)的图。

图45是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS)、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆发根培养物的平均生长速率(g/周)的条形图。误差条表示标准偏差，而条上方的星号表示彼此在统计学上显著差异的平均值(Student’s t-检验，*＝P≤0.005；对于EV，n＝2；对于PS，n＝3；对于DM，n＝4)。

图46是显示了在1/2MS(营养培养基)上12小时、24小时、36小时和48小时后野生型(WT)、转基因(HE-1、HE-2、HE-3、ME-1和ME-2)和空载体(EV-1和EV-2)拟南芥植物的萌发反应(％)vs.时间(小时)的图。

图47是显示了在含有200mM甘露醇的1/2MS(渗透培养基)上1天、2天、3天、4天、5天、6天和7天后野生型(WT)、转基因(HE-1、HE-2、HE-3、ME-1和ME-2)和空载体(EV-1和EV-2)拟南芥植物的萌发反应(％)vs.时间(小时)的图。

图48A、图48B和图48C是来自豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶(图48A和图48B)和拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶(图48C)的序列的螺旋轮状排列。

具体实施方式

尽管以下详细讨论了本公开的各个实施方式的制备和使用，应当理解本公开提供了可以在各种特定背景中具体实施的许多可应用创新概念。本文中讨论的特定实施方式只是制备和使用本公开的特定方式的说明，并不是限制本公开的范围。

为了帮助理解本公开内容，以下定义了多种术语。本文中定义的术语具有本公开相关领域的普通技术人员通常理解的含义。术语如“一(a)”、“一个(an)”和“该(the)”不打算只是用来指单个实体，而是包括其具体实例可以用于说明的一般类别。本文中的术语用于描述本公开的特定实施方式，且其使用不限制本公开内容，除非是在权利要求中陈述的。

对于根据本公开的每个实施方式，所述改良植物可以是任何目标单子叶或双子叶植物，如，但不限于，具有商业或农业意义的植物，如农作物(尤其是用于人类食品或动物饲料的农作物)、产木材或纸浆的树木、蔬菜植物、水果植物和观赏植物。目标植物的非限制性实例包括谷物作物(如小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、小米、高粱、藜麦、苋属植物和荞麦)；饲料作物(如牧草和饲料双子叶植物，包括苜蓿、野豌豆、四叶草等)；油料种子作物(如棉花、红花、向日葵、大豆、加拿大油菜、油菜籽、亚麻、花生和油棕榈)；树坚果(如胡桃、腰果、榛子、美洲山核桃、杏仁等)；甘蔗、椰子、椰枣、橄榄、甜菜、茶和咖啡；产木材或纸浆的树木；蔬菜作物，如豆科植物(例如，豆类、豌豆、小扁豆、苜蓿、花生)、生菜、芦笋、洋蓟、芹菜、胡萝卜、萝卜、芸薹(例如，卷心菜、羽衣甘蓝、芥蓝和其他多叶芸薹、花椰菜、花菜、抱子甘蓝、芜青、甘蓝)、可食瓜类蔬菜(例如，黄瓜、甜瓜、西葫芦、窝瓜)、可食葱属植物(例如，洋葱、大蒜、韭葱、干葱、细葱)、可食用的茄科成员(例如，西红柿、茄子、马铃薯、辣椒、地樱桃)和可食的藜科成员(例如，甜菜(beet)、红甜菜(chard)、菠菜、藜麦、苋属植物)；水果作物，如苹果、梨、柑橘类(例如，橙子、酸橙、柠檬、葡萄柚等)、核果(例如，杏、桃、李、油桃)、香蕉、菠萝、葡萄、奇异果、番木瓜、鳄梨和浆果；以及观赏植物，包括观赏开花植物、观赏树木和灌木、观赏地被植物和观赏草类。用于本公开中的双子叶植物包括，但不限于，加拿大油菜、棉花、马铃薯、藜麦、苋属植物、荞麦、红花、大豆、甜菜和向日葵。用于本公开中的单子叶植物包括，但不限于，小麦、燕麦、大麦、玉米、黑麦、黑小麦、水稻、观赏草类和牧草、高粱、小米和甘蔗。

对于根据本公开的每个可应用实施方式，额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因可以是任何已知的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因可以源自任何已知的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。存在许多已知和公开的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。(参见，例如，Clark等，2014)。可以在不同的植物中发现不同的三磷酸腺苷双磷酸酶基因，并且甚至在相同的植物物种内，可能存在多个已知的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。许多三磷酸腺苷双磷酸酶基因共有非常相似的DNA序列。可以修饰源三磷酸腺苷双磷酸酶基因以使得由修饰的基因编码的氨基酸序列与源三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码的氨基酸序列相同或不同。在某些实施方式中，修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码与源三磷酸腺苷双磷酸酶基因相同的氨基酸序列。在另一个实施方式中，修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码与源三磷酸腺苷双磷酸酶基因不同的氨基酸序列。在再一个实施方式中，修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码相对于由源三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码的氨基酸序列含有1、2或3个氨基酸改变的氨基酸序列。此外，经修饰以含有修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物通常呈现出一个或多个优于其来源的植物系的特征。在各种不同的实施方式中，三磷酸腺苷双磷酸酶基因是豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因或拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶基因。

在本公开的某些实施方式中，根据本公开的改良植物和制备改良植物的方法通常具有优于其来源的植物系的提高产量的特征。在另一个实施方式中，根据本公开的各种不同实施方式的改良植物在一个或多个特征中呈现出优于其来源的植物系的改进，该特征包括提高的产量、磷酸盐摄取、抗旱性、抗病性、抗真菌性、营养物吸收、水吸收、平均初生根长度、平均侧根数量、平均种荚数量、平均种荚大小、平均种子大小、平均种子重量、种子萌发、种子存活、平均长角果数量、平均长角果大小、平均叶长、平均叶面积和平均植物高度。

在具有优于其来源的植物系的提高的产量、提高的磷酸盐摄取、提高的抗旱性、提高的抗病性、提高的抗真菌性、提高的营养物吸收、提高的水吸收、提高的初生根长度、提高的平均种荚数量、提高的平均种荚大小、提高的平均种子大小、提高的平均种子重量、提高的平均长角果数量、提高的平均长角果大小、提高的平均叶长、提高的平均叶面积、提高的平均植物高度的实施方式中，通常至少10％提高、至少20％提高、至少30％提高、至少50％提高、至少100％提高或甚至至少200％提高。在进一步的实施方式中，所述提高为约20-50％提高、50-100％提高或100-200％提高。

实施例

实施例1

对农作物进行的两个研究揭示了豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶(psNTP9)的组成型表达可以增强在正常或低于正常的肥料施用的条件下在土壤上生长的大豆和拟南芥的种子生产力。另外，这种增强的三磷酸腺苷双磷酸酶表达可以促进磷酸盐吸收至植物的根中，即使在低于2mM的磷酸盐浓度下，如通常在肥料中发现的那些浓度。最后，产生了修饰形式的psNTP9，其促进磷酸盐摄取(甚至高于野生型psNTP9)。

转化：使用之前所述的方法(Zhang等，2006，相关方法按引用并入本文中)，用psNTP9转化拟南芥WS和Col-0生态型。使用之前所述的方法(Cho等，2000；Kim，2013，相关方法按引用并入本文中)，用psNTP9和修饰形式的psNTP9转化大豆和棉花发根培养物。使用之前所述的方法(Paz等，2006；Luth等，2015，相关方法按引用并入本文中)，用psNTP9和修饰的psNTP9转化大豆(Glycine max(L.)Merr.)，基因型Williams 82植物。

将拟南芥生态型Col-0和WS的10至15个植物在4英寸盆中生长。将psNTP9基因克隆至Gateway克隆载体pH7WG2中，在35S CaMV启动子的控制下，并引入根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)菌株GV3101中。将根癌土壤杆菌原液在含有50mg/L庆大霉素和50mg/L壮观霉素的固化LB培养基上生长，并在28℃下孵育直至集落形成。用单个集落接种含有抗生素的液体LB培养基并在28℃下以250rpm振荡。将根癌土壤杆菌培养物离心，并在使用前将沉淀物重悬浮于渗透培养基(含有5％蔗糖和0.05％Silwet L-77，pH调节至5.7)中至最终OD₆₀₀＝0.80。通过蘸花法转化拟南芥植物，所述方法改进自Clough和Bent(1998)和Zhang等(2006)。将接种物加入烧杯中，将植物倒置入这一悬浮液中使得所有地上组织被浸没，并在3-5秒的温和搅动后取出植物。将植物覆盖并留在少光或黑暗地方过夜，并在第二天返回到温室。小心保持覆盖的植物避开直接日光。处理后大约12-24小时除去覆盖物，并使植物生长3-5周，直至长角果变成棕色和干燥，将来自每个盆的枝(bolt)保持在一起，并与邻近的盆隔开。收集用于推定转化体的种子、表面灭菌、冷处理3天并种植在潮霉素选择平板上，随后生长7-10天。转化体鉴定为在选择培养基中产生绿叶和良好形成的根的潮霉素抗性苗。通过移栽至土壤中，使转化体生长至成熟。

使用进行了少许修改的Paz等(2006)和Luth等(2015)描述的方法(相关方法按引用并入本文中)，用psNTP9和修饰的psNTP9转化大豆(G.max)基因型Williams 82植物。将psNTP9基因克隆至Gateway^TM克隆载体pB7WG2中，在35S CaMV启动子控制下，并随后引入根癌土壤杆菌(菌株EHA101)中。将EHA101/pB7WG2-psNTP9的根癌土壤杆菌原液在含有50mg/L卡那霉素和50mg/L壮观霉素的固化YEP培养基上生长，并在28℃下孵育直至集落形成。将阳性克隆在50mL含有抗生素的液体YEP培养基中生长，直至达到OD₆₂₀＝0.8-1.0。将根癌土壤杆菌培养物离心，并将沉淀物重悬浮于含有1/10强度Gamborg B-5培养基及200μM乙酰丁香酮的感染培养基中。使用氯气将大豆种子表面灭菌12小时。在用根癌土壤杆菌培养物感染前大约16小时，将无菌ddH₂O加入灭菌的种子中直至种子被2/3覆盖，并随后在24℃下在黑暗中孵育过夜。除去种皮，并然后沿着种脐核形成纵向切口以分开两个子叶节外植体。随后取出初生茎，并通过温和切割使子叶切受伤。用土壤杆菌悬浮液在室温下感染外植体20-30分钟。接种后，将一半种子转移至无菌纸巾上，使近轴侧向上，并且随后转移至含有1/10强度Gamborg B-5培养基及400mg/L半胱氨酸、154.2mg/L DTT和200μM乙酰丁香酮的共培养培养基(Co-Cultivation Medium)。将培养物在黑暗中在24℃下孵育5天。共培养5天后，将外植体在含有完全强度Gamborg B-5培养基及100mg/L

100mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素和8mg/L草铵膦的芽诱导培养基上培养。将培养基在24℃下，18:6光周期的150μM/m²/s下孵育14天。将培养物再转移至含有具有Gamborg维生素的完全强度的MS培养基及50mg/L天冬酰胺、100mg/L L-焦谷氨酸、0.1mg/L IAA、0.5mg/L GA₃、1mg/L ZR、100mg/L

100mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素和8mg/L草铵膦的芽伸长培养基中。8周后，当伸长的芽为至少3-4cm长时，切除接近芽垫(shoot pad)的芽并转移至含有具有Gamborg维生素的半强度MS培养基及1mg/L IBA和3mg/L草铵膦的生根培养基中。2-3周后，从生根培养基温和地取出具有健康外观的根的伸长的芽并移植至具有土壤混合物

的盆中。随后给小植物浇灌1/4强度20-20-20(N-P-K)液体植物肥料。小植物在24℃和16:8光周期下生长。通过施用草铵膦除草剂溶液来证实具有bar基因抗性的阳性T₀植物。将来自阳性T₀植物的八粒种子种植在土壤中并再次测试bar基因抗性。四个转基因大豆系中的三个在T₁后代中以3:1的分离比率稳定地遗传。

生长分析-拟南芥中的初生根长度和叶面积：将含有0.8％琼脂培养基的不含糖和不含磷酸盐(pH 5.7)的改良Murashige和Skoog(MS)用作生长培养基。使用的所有化学品均来自Sigma Aldrich。

将野生型拟南芥(生态型Columbia和Wassilewskija)和转基因的灭菌并成层(72小时)。将种子在生长室中22-24℃下生长于不含磷酸盐的改良MS培养基中。在连续光照130-150μM/m²/s下，将植物垂直生长3周。

使用ImageJ 1997软件(例如，Abramoff等，2004)分析了初生根长和叶面积。

使用不同量的肥料的拟南芥的生长分析：将灭菌并成层(72小时)的野生型拟南芥(生态型Columbia)和转基因种子生长于具有半肥料和全肥料的土壤中。使用含有75％

生物杀真菌剂(Biofungicide)和润湿剂及25％Profile^TM Field和Fairway^TM煅烧粘土(0.2-0.5cm颗粒)的土壤混合物。将14克(g)和28g

14-14-14(聚合物树脂包被的颗粒状缓释肥料，3-4个月)分别用作半肥料和全肥料。

将植物在22℃下，使用16小时光/8小时暗条件生长。5-6周后(一旦植物完全停止开花并且长角果仍然是绿色的时)，将来自单个植物的长角果数量计数。使植物再干燥3-4周，并从单个植物采收和收集种子，并测量种子重量。

使用不同量的肥料的拟南芥中的其他生长分析：将野生型种子(Col-0)、纯合的T3转基因种子(OE-4和OE-5是高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6是中等表达系)和空载体对照(EV-1和EV-2)种植于3:1

生物杀真菌剂与Profile^TM Field和Fairway^TM煅烧粘土(0.2-0.5cm颗粒)中，并使用

规律地灌溉以防止小虫子。观察植物的形态学特征，并且在种植7周后(在植物刚形成长角果时)对长角果数量计数。大约8-9周后，不再灌溉植物，并且使长角果在植物内干燥。从来自单个植物的长角果采收种子，并分开称重。对于全肥料：75％

生物杀真菌剂和润湿剂；25％Profile^TMField和Fairway^TM煅烧粘土(0.2-0.5cm颗粒)及

14-14-14:28ml/9L土壤混合物。对于半肥料：75％

生物杀真菌剂和润湿剂；25％Profile^TM Field和Fairway^TM煅烧粘土(0.2-0.5cm颗粒)及

14-14-14:14ml/10L土壤混合物。对于无肥料：75％

生物杀真菌剂和润湿剂；25％Profile^TM Field和Fairway^TM煅烧粘土(0.2-0.5cm颗粒)。

Classic(总氮(N)＝14％(8.2％氨氮；5.8％硝酸盐氮)；可用磷酸盐(P₂O₅)＝14％；可溶性钾碱(K₂O)＝14％)是缓释肥料并且在灌溉过程中没有添加额外的肥料。

磷酸盐含量测定：按照Ren等，2012中所述的分析了Pi含量。将新鲜发根组织称重，并用液氮冷冻和用提取缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，100mM NaCl，1mMβ-巯基乙醇和1mM

pH8.0)以1mg样品(鲜重)比10μL提取缓冲液的比率均质化。将总共100μL的均质化样品与900μL 1％冰醋酸混合，并在42℃下孵育30分钟。随后将溶液以10,500rpm离心5分钟，并将300μL上清液等份试样用于Pi测定中。将含有700μL分析溶液(0.35％正钼酸铵，0.86N H₂SO₄和1.4％抗坏血酸)和300μL样品的反应物在42℃下孵育30分钟。在A₈₂₀下测量Pi含量。

图1是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS-PK)、拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶AtAPY1(AT-PK)和空载体对照(PK-EV)之一转化的棉花发根培养物的磷酸盐摄取的条形图。与空载体对照(PK-EV)相比，在用psNTP9(PS-PK)或拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶AtAPY1(AT-PK)转化的棉花发根培养物中磷酸盐摄取统计学显著地提高。

图2是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS-PK)、拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶AtAPY1(AT-PK)或空载体对照(PK-EV)转化的大豆发根培养物的磷酸盐摄取的条形图。与用拟南芥三磷酸腺苷双磷酸酶AtAPY1(AT-PK)和空载体对照(PK-EV)转化的培养物相比，在用psNTP9(PS-PK)转化的大豆发根培养物中磷酸盐摄取统计学显著地提高。

图3是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的3周大的拟南芥幼苗(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)与Col-0野生型对照(Col-0)相比的初生根长度的条形图。与Col-0野生型对照(Col-0)相比，用psNTP9转化的3周大的拟南芥幼苗(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的初生根长度统计学显著地更长。

图4是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的三个独立系(WS-OE-1、WS-OE-2和WS-OE-3)的3周大的拟南芥幼苗与野生型对照(WS)相比的初生根长度的条形图。与WS野生型对照(WS)相比，用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的三个独立系(WS-OE-1、WS-OE-2和WS-OE-3)的3周大幼苗的初生根长度统计学显著地更长。

图5是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)在磷酸盐不存在的情况下生长的3周大的拟南芥幼苗与Col-0野生型对照(Col-0)相比的叶面积的条形图。在磷酸盐不存在的情况下生长时与Col-0野生型对照(Col-0)相比，用psNTP9转化的一个独立系(Col-0-OE-2)在磷酸盐不存在的情况下生长的3周大幼苗的叶面积统计学显著地更大。

图6是显示了在磷酸盐不存在的情况下生长时用psNTP9转化的三个独立系(WS-OE-1、WS-OE-2和WS-OE-3)在磷酸盐不存在的情况下生长的3周大拟南芥幼苗与WS野生型对照(WS)相比的叶面积的条形图。在磷酸盐不存在的情况下生长时与WS野生型对照(WS)相比，用psNTP9转化的一个独立系(WS OE-1)在磷酸盐不存在的情况下生长的3周大幼苗的叶面积统计学显著地更大。

图7是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的长角果(种荚)数量的条形图。在全肥料条件下生长时，与野生型对照植物(Col-0)相比，用psNTP9转化的两个系(Col-0-OE 1和Col-0OE2)中的成熟拟南芥植物产生的长角果数量统计学显著地更高。

图8是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的长角果数量的条形图。在半肥料条件下生长时，与野生型对照植物(Col-0)相比，用psNTP9转化的两个系(Col-0-OE 1和Col-0OE2)中成熟拟南芥植物产生的长角果数量统计学显著地更高。

图9是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的平均种子重量的条形图。在全肥料条件下生长时，与野生型对照植物(Col-0)相比，用psNTP9转化的两个系(Col-0-OE 1和Col-0OE2)中成熟拟南芥植物产生的平均种子重量统计学显著地更高。

图10是显示了用psNTP9转化的两个独立系(Col-0-OE-1和Col-0-OE-2)的成熟拟南芥植物与Col-0野生型对照(Col-0)相比产生的平均种子重量的条形图。在半肥料条件下生长时，与野生型对照植物(Col-0)相比，用psNTP9转化的两个系(Col-0-OE 1和Col-0OE2)中成熟拟南芥植物产生的平均种子重量统计学显著地更高。

图11是显示了在无肥料下生长的成熟拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。在没有肥料下生长时，与Col-0野生型对照(WT)和空载体(EV-1和EV-2)对照植物相比，在用psNTP9转化的系中(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)，成熟拟南芥植物产生的长角果数量统计学显著地更高。

图12是显示了在半肥料下生长的成熟拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。与Col-0野生型对照(WT)和空载体(EV-1和EV-2)对照植物相比，用psNTP9转化的系(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)中，在半肥料下生长时成熟拟南芥植物产生的长角果数量统计学显著地更高。

图13是显示了在全肥料下生长的成熟拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。与Col-0野生型对照(WT)和空载体(EV-1和EV-2)对照植物相比，用psNTP9转化的大多数系(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)中，在全肥料下生长时成熟拟南芥植物产生的长角果数量统计学显著地更高。

图14是显示了在没有肥料下生长的成熟拟南芥植物产生的平均种子重量(mg/植物)的条形图。与Col-0野生型对照(WT)和空载体(EV-1和EV-2)对照植物相比，用psNTP9转化的系(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)中，在没有肥料下生长时成熟拟南芥植物产生的种子重量统计学显著地更高。

图15是显示了在半肥料下生长的成熟拟南芥植物产生的平均种子重量(mg/植物)的条形图。与Col-0野生型对照(WT)和空载体(EV-1和EV-2)对照植物相比，用psNTP9转化的系(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)中，在半肥料下生长时成熟拟南芥植物产生的种子重量统计学显著地更高。

图16是显示了在全肥料下生长的成熟拟南芥植物产生的平均种子重量(mg/植物)的条形图。与Col-0野生型对照(WT)和空载体(EV-1和EV-2)对照植物相比，用psNTP9转化的系(OE-4和OE-5＝高表达系；OE-1、OE-2、OE-3和OE-6＝中等表达系)中，在全肥料下生长时成熟拟南芥植物产生的种子重量统计学显著地更高。

图17是显示了成熟拟南芥植物产生的长角果数量的条形图。与Col-0野生型(WT)、空载体(EV)对照和用psNTP9转化的转基因系(OE-2和OE-3＝中等表达系)植物相比，用修饰的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的转基因系(psNTP9-DM4、psNTP9-DM9和psNTP9-DM11)中，成熟拟南芥植物产生的长角果数量统计学显著地更高。

图18是显示了成熟拟南芥植物产生的以克(gm)/植物计的平均种子重量的条形图。与Col-0野生型(WT)、空载体(EV)对照和用psNTP9转化的转基因系(OE-2和OE-3＝中等表达系)植物相比，用修饰的豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9转化的转基因系(psNTP9-DM2、psNTP9-DM4、psNTP9-DM9和psNTP9-DM11)中，成熟拟南芥植物产生的平均种子重量/植物统计学显著地更高。

图19是显示了野生型植物和用psNTP9转化的两个大豆植物的种荚总数分布的条形图。与野生型对照植物相比，用psNTP9转化的两个大豆植物的种荚总数统计学显著地更高。基于种荚的均等分布，通过卡方检验确定统计学显著性。与来自三个野生型对照植物的种荚(1.6英寸、1.3英寸和1.3英寸)相比，来自用psNTP9转化的大豆植物的三个种荚的实际长度(2.3英寸、2.1英寸和2.1英寸)更大。

图20是显示了与用空载体对照转化的大豆培养物(PK-EV)相比，用具有单突变(Mut-1)和双重突变(Dou Mut)的豌豆psNTP9转化的大豆发根培养物的磷酸盐摄取的条形图。与空载体对照(PK-EV)相比，用具有单突变(Mut-1)的豌豆psNTP9转化和具有双重突变(Dou Mut)的豌豆psNTP9转化的大豆发根培养物中磷酸盐摄取统计学显著地提高。

从psNTP9产生的大豆(大豆转基因(对于psNTP9)系16C和系14A)比野生型大豆(Williams-82)产生的那些大得多。种子重量(种子/g)的比较也显示出从psNTP9产生的大豆(大豆转基因(对于psNTP9)系16C(4.52粒种子/克)和系14A(4.71粒种子/克))比野生型大豆(Williams-82；9.09粒种子/克(在Welch温室中生长)；6.01粒种子/克(来自Missouri)；和5.97粒种子/克(来自ISU))产生的那些大得多。Williams-82的标准种子数量为5.85粒种子/克。

来自psNTP9的转基因大豆植物(大豆转基因(对于psNTP9))比来自野生型大豆的对照(Williams-82)大得多并具有多得多的分枝、叶和种荚。

作为SEQ ID NO:1提供了psNTP9氨基酸序列，并且作为SEQ ID NO:2提供了修饰的psNTP9氨基酸序列。SEQ ID NO:1和2的比较显示出序列在两个氨基酸位置是不同的：氨基酸208在SEQ ID NO:1中是丝氨酸，而在SEQ ID NO:2中是亮氨酸，以及氨基酸216在SEQ IDNO:1中是脯氨酸，而在SEQ ID NO:2中是精氨酸。作为SEQ ID NO:3提供了psNTP9DNA序列，而作为SEQ ID NO:4提供了修饰的psNTP9DNA序列。SEQ ID NO:3和4的比较显示出序列在两个核苷酸位置是不同的：核苷酸623在SEQ ID NO:3中是胞嘧啶，而在SEQ ID NO:4中是胸腺嘧啶，以及核苷酸647在SEQ ID NO:3中是胞嘧啶，而在SEQ ID NO:4中是鸟嘌呤。

豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9的天然形式和修饰形式的异位表达在各种植物物种提高了植物生长和产量。本公开包括在不同营养物水平下提高的根生长和叶大小，以及提高的成熟植物的长角果数量和种子产量。本公开的一个方面是表达豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9或修饰形式的psNTP9的植物显示出提高的磷酸盐摄取。

与用空载体转化的对照相比，异位表达psNTP9的棉花和大豆发根培养物中磷酸盐摄取都提高，如通过每均等重量的组织的总无机磷酸盐含量测量的。与野生型对照相比，对于在异位表达psNTP9的系中的拟南芥Col-0和WS生态型，在磷酸盐肥料不存在的情况下生长的3周大幼苗中的初生根生长得更长。与野生型对照相比，对于在异位表达psNTP9的系中的拟南芥Col-0和WS生态型，在磷酸盐肥料不存在的情况下生长的3周大幼苗中的叶面积提高。与野生型对照相比，在半肥料和全肥料条件下生长的异位表达psNTP9的拟南芥(生态型Col-0)植物产生更多长角果。

与野生型对照相比，如通过在半肥料和全肥料条件下生长的异位表达psNTP9的拟南芥(生态型Col-1)植物产生的总种子重量判断的，存在更多种子。与野生型对照相比，在全肥料条件下生长的异位表达psNTP9的大豆植物产生更多的种荚。与野生型对照相比，在全肥料条件下生长的异位表达psNTP9的大豆植物产生更大的种荚。与用空载体转化的对照相比，异位表达修饰形式的psNTP9的大豆发根培养物中磷酸盐摄取提高，如通过每均等重量组织的总磷酸盐含量测量的。

实施例2

在另一个研究中，与野生型和空载体植物相比，豌豆三磷酸腺苷双磷酸基因psNTP9的表达赋予转基因拟南芥提高的抗旱性。

实验方案：将拟南芥的野生型(Col-0)和转基因种子灭菌并播种在1/2MS培养基上。转基因种子取自拟南芥产量分析中使用的相同系。所述系为：EV-1＝空载体对照系；Col-0＝野生型对照系；HE-1、HE-2、HE-3＝异位表达psNTP9的高表达系；ME-1＝异位表达psNTP9的中等表达系。

将种子在土壤中种植并生长以在10天后获得幼苗。对于干旱胁迫，将10天大的拟南芥植物接受干旱胁迫(不给水)条件21天。将充分灌溉的植物作为对照处理。将含有每个系5个植物的八个盆(40个植物)用于每个生物学重复中。在21天的干旱胁迫处理后将干旱处理的植物再灌溉。在之后再灌溉2天后记录干旱胁迫植物的存活率。通过计数绿色、健康植物的数量来计算存活率。将再灌溉2天后干旱胁迫处理植物的地上部分称重，并与对照植物(充分灌溉的植物)一起记录。为了测量水含量，分离土壤生长植物的地上部分并立即(0分钟)称重。此后，使植物在环境条件下(室温和室内湿度下)天然干燥。在所示时间点(15、30、45、60、120、180和240分钟)测量每个植物的鲜重。作为每个所示时间点的鲜重百分比来计算水含量。为了测量相对失水量，分离土壤生长的植物的地上部分并立即(0分钟)称重。此后，使植物在环境条件(室温和室内湿度)下天然干燥。在所示时间点(15、30、45、60、120、180和240分钟)测量每个植物的鲜重。将相对失水率表示为每个所示时间点的鲜重(FW)的百分变化(Cha等，2015；Shi等，2015)。

当暴露于干旱胁迫21天时，与野生型对照和空载体对照拟南芥植物相比，具有超表达的psNTP9的转基因拟南芥植物能够开花并且更大，更葱茏(具有更多分枝和叶)，并且产生更健康的长角果。转基因植物的存活率(HE-1 84.17％(101/120)；HE-2 87.5％(105/120)；HE-3 81.67％(98/120)；ME-1 85.83％(103/120))比野生型(37.5％(45/120))和空载体(32.5％(39/120))对照植物高得多。如在诱导干旱研究中证明的，异位表达psNTP9的转基因拟南芥植物与野生型和空载体对照拟南芥植物相比具有提高的耐旱性。

图21是显示了充分灌溉的和干旱再灌溉(再灌溉后2天)的拟南芥植物的地上部分的平均鲜重的条形图。在充分灌溉时和在再灌溉后2天干旱胁迫处理后，与Col-0野生型对照(WT)和空载体对照(EV)植物相比，用psNTP9转化的系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)的地上部分的鲜重统计学显著地更高。

图22是显示了Col-0野生型(WT)、空载体对照(EV)和表达psNTP9的转基因系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)拟南芥植物随着时间的水含量(％)的图。与WT和EV对照系相比，转基因系显示出更高的水含量。图23是显示出包括Col-0野生型(WT)、空载体对照(EV)和表达psNTP9的转基因系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)的拟南芥植物的相对失水率(％)的条形图。与野生型对照植物相比，转基因系显示出统计学显著地降低的失水。

在另一个干旱胁迫研究中，将4周大的拟南芥植物(野生型植物、Col-0和异位表达psNTP9的Col-0植物)接受干旱胁迫(不给水)条件21天。将充分灌溉的植物作为对照处理。使用每个系的三十五个植物。在21天干旱胁迫处理后，将干旱处理的植物再灌溉。再灌溉2天后记录干旱胁迫植物的存活率。通过计数绿色、健康植物的数量来计算存活率。将再灌溉2天后干旱胁迫处理植物的地上部分称重并与对照植物(充分灌溉的植物)一起记录(Cha等，2015；Shi等，2015)。

转基因植物的存活率(HE-1 74.28％(26/35)；HE-2 82.85％(29/35)；HE-368.57％(24/35)；ME-1 77.14％(27/35))比野生型(31.43(11/35))和空载体(22.85(8/35))对照植物高得多。图24是显示了充分灌溉的植物和干旱再灌溉拟南芥植物(51天后)的地上部分鲜重的条形图。在充分灌溉时以及在干旱胁迫处理后再灌溉2天时，与Col-0野生型对照(WT)和空载体对照(EV)植物相比，用psNTP9转化的系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)中的地上部分鲜重统计学显著地更高。

进行了另一个研究来分析转基因大豆植物在干旱条件下的行为。将野生型植物和来自异位表达psNTP9的每个转基因系(14A、16C和17B)的T3植物在生长室中(受控条件下)生长于2-L塑料盆中26天(V3阶段-营养阶段，三个三叶阶段)。在开始胁迫前，植物用水饱和，并且随后停止灌溉。通过停止灌溉8天(根据状况)，评价植物对缺水胁迫的耐受性。每天监控植物的萎蔫。在再灌溉3天后，评价水胁迫后的恢复。

8天干旱后野生型(Williams 82)大豆植物的表型分析显示出2/14的植物具有萎蔫现象，6/14的植物完全干燥和6/14的植物干燥/半干燥。8天干旱后表达psNTP9的Williams 82大豆转基因植物(14A系)的表型分析显示出5/16的植物具有萎蔫现象，2/16的植物完全干燥和9/16的植物干燥/半干燥。8天干旱后表达psNTP9的Williams 82大豆转基因植物(16C系)的表型分析显示出6/16的植物具有萎蔫现象，5/16的植物完全干燥和5/16的植物干燥/半干燥。8天干旱后表达psNTP9的Williams 82大豆转基因植物(17B系)的表型分析显示出3/13的植物具有萎蔫现象，2/13的植物完全干燥和8/13的植物干燥/半干燥。与野生型对照植物相比，14A、16C和17B系植物全部显示出提高的抗旱性。

8天干旱接着3天再灌溉后的野生型(Williams 82)大豆植物的存活率为50％。8天干旱接着3天再灌溉后的表达psNTP9的Williams 82大豆转基因植物(14A、17B和16C系)的存活率分别为93.75％、81.25％和84.61％，与野生型对照植物的50％形成对比。存活的转基因植物比存活的野生型对照植物更大且具有更多叶。

实施例3

在另一个研究中，证明了豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶基因(psNTP9)的表达赋予拟南芥植物提高的胁迫耐受性，如通过初生根和侧根的生长测定的。与1/2MS+200mM甘露醇(渗透培养基)中的对照和中等表达系相比，超表达psNTP9的拟南芥植物生长出更长的初生根，并具有更多侧根。

将拟南芥的野生型(WT)和转基因种子灭菌并播种在1/2MS上。转基因种子取自拟南芥产量分析中使用的相同系。所述系为：EV-1和EV-2＝空载体对照系；WT＝野生型对照系；OE-1、OE-2和OE-3＝超表达系(也称为HE-1、HE-2、HE-3＝高表达系)；ME-1、ME-2、ME-3和ME-4＝异位表达psNTP9的中等表达系。

在转移至生长室之前，将平板在4℃下保持3天。4天大的幼苗转移并垂直种植在补充了200mM甘露醇的1/2MS培养基(渗透培养基)上。处理10天后，观察样品的初生根长度、侧根数量、根毛密度和根毛长度。按照用显微镜(40×)观察的五个根的每个中的根毛数量来测定根毛密度。根毛从根尖5mm计数。针对五个根的每个测量了根毛长度。对于每个根，测量3个优势生长根毛的根毛长度(Ma等，2001)。

psNTP9系比野生型和空载体对照系生长出更长的初生根。图25是显示了在1/2MS+200mM甘露醇(渗透培养基)上生长10天后的WT和转基因种子的以厘米计的平均初生根长度的条形图。渗透培养基上HE-1的初生根比ME、WT和EV对照统计学显著地更长。

图26是显示了在1/2MS+200mM甘露醇(渗透培养基)上生长10天后对于WT和转基因种子观察的平均侧根数的条形图。在渗透培养基上HE系产生了比ME、WT和EV对照更高数量的侧根。

图27是显示了在1/2MS+200mM甘露醇(渗透培养基)上生长10天后WT和转基因种子的根毛密度(根毛数/mm²)的条形图。在渗透培养基上HE-1和ME-1系与WT和EV对照相比具有统计学显著提高的根毛密度。

图28是显示了在1/2MS+200mM甘露醇(渗透培养基)上生长10天后WT和转基因种子观察的以毫米计的根毛长度的条形图。在渗透培养基上的HE系与ME、WT和EV对照相比具有提高的根毛长度。

此外，与野生型对照相比，转基因系的根毛数量和长度提高。图29是显示了拟南芥植物的根毛密度(平均根毛数/mm)的条形图。与Col-0野生型对照(WT)和空载体对照(EV)植物相比，用psNTP9转化的系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)的根毛密度统计学显著地更高。图30是显示了拟南芥植物的根毛长度(mm)的条形图。与Col-0野生型对照(WT)和空载体对照(EV)植物相比，用psNTP9转化的系(HE＝高表达系；ME＝中等表达系)的根毛长度统计学显著地更长。

实施例4

还研究了大豆的产量数据、根构型和根瘤。对于产量数据，将大豆种子播种在土壤萌发混合物上并使其发芽。在2周萌发后，将植物移植至含有移栽混合物的5加仑盆中。每天给植物浇水。使植物生长直至完全成熟(R8阶段-繁殖阶段)。荚完全成熟后，使其在植物内干燥3-4周。采收荚并收集种子以分析每株植物的平均荚数、每株植物的平均种子数、每株植物的平均种子重量的数据，以及分析每克重量的种子数的数据。为了种子萌发，75％

MVP Seedling and Propagation；25％

Field和Fairway^TM煅烧粘土(0.2-0.5cm颗粒)和

14-14-14:28ml/10L土壤混合物。对于成熟大豆植物(移栽)，75％

生物杀真菌剂和润湿剂；25％

MVP和

14-14-14:28ml/10L土壤混合物。除了土壤混合物中的

每个月通过给5加仑盆的土壤表面添加大约10ml的

(通过喷撒在顶部)给植物施肥。

图31是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种荚数/植物的条形图。与野生型对照相比，转基因系14A和17B中的平均种荚数/植物统计学显著地更高。图32是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/植物的条形图。与野生型对照相比，转基因系17B的平均种子数/植物统计学显著地更高。

图33是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的以克(g)/植物计的平均种子重量的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中以克(g)/植物计的平均种子重量统计学显著地更高。图34是显示了在生长室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/克的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中的平均种子数/克在统计学上显著地更低。

图35是显示了在温室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种荚数/植物的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中平均种荚数/植物在统计学上显著地更高。图36是显示了在温室中生长的Williams82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/植物的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中平均种子数/植物在统计学上显著地更高。

图37是显示了在温室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的以克(g)/植物计的平均种子重量的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中的平均种子重量/植物在统计学上显著地更高。图38是显示了在温室中生长的Williams 82野生型对照大豆(WT)和T3psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均种子数/克的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中的平均种子数/克在统计学上显著地更低。

对于根构型和根瘤研究，将异位表达psNTP9的大豆的T3种子(14A、16C和17B)和WT种子用根瘤菌(Rhizobia)(GUARD-N接种物-Homesteader Hobbies)包被。使用商业上可购得的根瘤菌制备浆液，并种植在含有菌根的土壤中(Durst和Bosworth，1986；Park等，2010)。保护种子免受直接日光直至幼苗萌发(48-72小时)，并随后移动至温室。两周后，将小植物移栽至5加仑盆中。将植物在温室中生长三个月。三个月后，收集植物的根瘤以在WT和转基因植物之间进行比较。收集每个系的三至六株植物以研究根构型和根瘤形成。将根清洁并单独称重以分析和比较转基因和野生型大豆植物的生物量。相似地，收集根瘤并单独称重以分析和比较转基因和野生型大豆植物的生物量。

与Williams 82野生型对照大豆(WT)植物相比，3个月大的psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)的根构型发育范围大得多。图39是显示了3个月大的Williams 82野生型对照大豆(WT)和psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的根生物量的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中的根生物量在统计学上显著地更高。

与野生型对照相比，转基因系的根瘤的数量和大小也有提高。图40是显示了3个月大的Williams 82野生型对照大豆(WT)和psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的根瘤生物量的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中的根瘤生物量在统计学上显著地更高。图41是显示了3个月大的Williams 82野生型对照大豆(WT)和psNTP9转基因大豆(14A、17B和16C系)植物的平均根瘤数/植物的条形图。与野生型对照相比，所有转基因系中的平均根瘤数/植物在统计学上显著地更高。

实施例5

也在用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶(psNTP9)和豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶DM(双重突变)转化的大豆、加拿大油菜和玉米中进行了生长研究。将psNTP9、DM(双重突变)和空载体(仅载体)单独地插入二元载体pK7WG2中。随后将超表达载体和空载体对照分别转化至发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株ARQUA-1中，其进一步用于发根转化。将灭菌的种子在MS培养基上萌发。将大豆子叶、加拿大油菜的茎和叶以及玉米的茎的远轴侧损伤，并用转基因发根土壤杆菌菌株ARQUA-1的培养物感染。将受伤的子叶、茎和叶在补充了3％蔗糖、20mg/L卡那霉素、400mg/L

和0.8％琼脂的MS固体培养基上培养用于选择。将在选择培养基上存活的发根独立地在选择培养基上分培养。通过RT-PCR分析验证发根中相应基因的表达水平。将选择的发根在补充了3％蔗糖、20mg/L卡那霉素和400mg/L

的MS液体培养基上培养。

图42是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS)、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆、玉米和加拿大油菜发根培养物的磷酸盐摄取(基于鲜重的Pi含量)的条形图。与EV对照相比，所有三个PS发根培养系统中的磷酸盐摄取在统计学上显著地更高。与PS和EV对照相比，所有三个DM发根培养系统中的磷酸盐摄取在统计学上显著地更高。图43是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS)、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆、玉米和加拿大油菜发根培养物的磷酸盐摄取(基于干重的Pi含量)的条形图。与EV对照相比，所有三个PS发根培养系统中的磷酸盐摄取在统计学上显著地更高。与PS和EV对照相比，所有三个DM发根培养系统中的磷酸盐摄取在统计学上显著地更高。

还在大豆植物中进行了时程生长研究。将psNTP9、DM(双重突变)和空载体(仅载体)单独插入二元载体pK7WG2中。随后将超表达载体和空载体对照独立地转化至发根土壤杆菌菌株ARQUA-1中，其进一步用于发根转化。将灭菌的种子在MS培养基上萌发。将子叶的远轴侧损伤，并用转基因发根土壤杆菌菌株ARQUA-1的培养物感染。将受伤的子叶在补充了3％蔗糖、20mg/L卡那霉素、400mg/L

和0.8％琼脂的MS固体培养基上培养用于选择。将在选择培养基上存活的发根在选择培养基上单独分培养。通过RT-PCR分析验证发根中相应基因的表达水平。将选择的发根在补充了3％蔗糖、20mg/L卡那霉素和400mg/L

的MS液体培养物上培养。

将来自表达双重突变的四个不同系(DM-1、DM-2、DM-3和DM-4)和表达psNTP9的三个不同系(PS-1、PS-2和PS-3)以及只表达载体的两个不同系(EV-1和EV-2)的已知重量的发根组织单独接种至50ml含有30g/L蔗糖和400mg/L

的MS液体培养基中，并在轨道摇床中以大约80rpm和24℃下孵育。基本上按照Dunlop和Curtis(1991)以及Kajikawa等(2010)中所述的来测定根生长。简而言之，从液体培养物中无菌地取出根组织，并且通过无菌吸附滤纸将其表面上的液体培养基完全吸掉。将吸干净的组织在Eppendorf管中无菌地称重，并随后转移回液体培养基中。一周更换一次液体培养基。对于每个系，使用两个重复。

图44是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS)、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆培养物的生长速率(平均组织鲜重mg/培养物)的图。与空载体对照相比，所有转化的大豆系具有提高的生长速率。图45是显示了用豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(PS)、具有双重突变的修饰豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9(DM)和空载体对照(EV)转化的大豆发根培养物的平均生长速率(g/周)的条形图。与EV对照相比，PS和DM发根培养物的生长速率在统计学上显著地更高。

实施例6

将WT(Col-0)和异位表位psNTP9的纯合T3拟南芥转基因种子(HE-1、HE-2和HE-3，高表达系；ME-1和ME-2，中等表达系)以及空载体对照(EV-1和EV-2)表面灭菌，并播种在补充了0mM甘露醇(对照)或200mM甘露醇(渗透胁迫培养基)的1/2MS培养基上。将平板在4℃下保持3天，接着转移至生长室。监测WT和转基因植物的萌发状态，并且在这些培养基上每12小时评分，持续2天。当胚根已经出现1mm时，认为种子已经萌发。在每个研究中，每个系播种大约100粒种子，并且两个研究使用独立的种子批次进行(Tan等，2015)。

图46是显示了在1/2MS(营养培养基)上12小时、24小时、36小时和48小时后Col-0野生型(WT)、空载体对照(EV1和EV-2)、拟南芥植物中表达psNTP9的转基因高表达系(HE-1、HE-2和HE-3)和中等表达系(ME-1和ME-2)的萌发反应(％)vs.时间(小时)的图。在1/2MS培养基上与ME、WT和EV对照相比时，HE系的萌发(％)提高。图47是显示了在含有200mM甘露醇的1/2MS(渗透培养基)上12小时、24小时、36小时和48小时后Col-0野生型(WT)、空载体对照(EV1和EV-2)、拟南芥植物中表达psNTP9的转基因高表达系(HE-1、HE-2和HE-3)和中等表达系(ME-1和ME-2)的萌发反应(％)vs.时间(小时)的图。在含有200mM甘露醇的1/2MS培养基(渗透培养基)上与ME、WT和EV对照相比时，HE系的萌发(％)提高。

干旱是限制植物生长和影响全世界农业生产力的最重要环境限制之一。如在诱导干旱研究和拟南芥根研究中所证明的，异位表达psNTP9的转基因拟南芥植物与野生型植物相比具有更长的初生根、更多侧根和提高的耐旱性。异位表达psNTP的转基因拟南芥植物与野生型植物相比在暴露于渗透和干旱胁迫时还具有提高的种子萌发和幼苗存活。

豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9的天然形式和修饰形式的异位表达在多种植物物种(包括拟南芥)中改善了根构型和干旱胁迫耐受性。本公开包括提高的根生长和提高的抗旱性。

本公开的一个方面是表达豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9或psNTP9的修饰形式的植物，其显示出比WT对照提高的抗旱性、更长的初生根和更多侧根。本公开的另一个方面是表达豌豆三磷酸腺苷双磷酸酶psNTP9或psNTP9的修饰形式的植物，其与野生型植物相比在暴露于渗透和干旱胁迫时显示出提高的种子萌发和幼苗存活。

实施例7

使用螺旋轮设计修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因：用于预测蛋白质中的钙调蛋白结合结构域的一种方法称为螺旋轮。许多钙调蛋白结合结构域由蛋白质的一级氨基酸序列中的大约15个氨基酸组成，并且在将这个结构域的序列构建至螺旋轮中时，轮的一半由主要碱性的氨基酸构成，而另一半由主要疏水性的氨基酸构成。

本公开的一个方面包括将翻译的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的核苷酸序列作图于螺旋轮图上，鉴定显示为钙调蛋白结合区的区域，选择用于修饰的核苷酸以增强钙调蛋白结合区的结合特征，制备修饰的基因，将修饰基因插入植物组织中，其中所得到的植物呈现出优于天然存在的植物的改进。

根据之前的研究(O’Neil和Degrado，1990；Chapman等，1991)，许多表征的CaM结合蛋白的钙调蛋白(CaM)-结合区中的初级序列符合碱性两性α-螺旋模型(也称为螺旋轮模型)，而疏水性氨基酸簇集在螺旋的一侧上和碱性(带正电荷的)氨基酸簇集在相对侧上。图48A和图48B说明了psNTP9中与典型的CaM-结合结构域相似的两个序列，但其中只有一个被证明确实是CaM-结合结构域(图48A)，而另一个显示出不结合CaM(图48B；Heish等，2000)。确实结合CaM的序列(图48A)密切符合两性α-螺旋模型，而没有结合CaM的一个(图48B)与确实结合CaM的序列相比，在螺旋的一侧上疏水性较低，而在另一侧上碱性较低。发明人推断，使图48B的α-螺旋在一侧上更疏水而在另一侧上更碱性将使其更可能结合CaM。这可以通过用疏水性氨基酸(如F、I、L、M或Y)替代疏水侧上的S并用碱性氨基酸(如K或R)替代碱性氨基酸侧上的P(标准单字母氨基酸缩写)来进行。按照这些指引，通过直接氨基酸置换，例如，使用基因编辑技术，包括，但不限于，CRISPR、Talens、锌指或其他相似的基因编辑技术，可以使几乎适合两性α-螺旋模型的任何序列更可能地结合CaM。

例如，AtAPY1和AtAPY2具有87％相同的初级序列，而AtAPY1具有CaM结合结构域，AtAPY2没有(Steinebrunner等，2000)。不结合CaM的AtAPY2中的序列298至311仅在图43C中加下划线的两个位置处不同于结合CaM的AtAPY1中的平行区域(297-310)。通过将疏水侧(分割线的左侧)上的E变成疏水性氨基酸和碱性侧(分割线的右侧)上的D，AtAPY2中的这个序列可以转变成结合CaM的序列。

在本公开中，psNTP9中的非钙调蛋白结合序列(图48B)被修饰以使其更可能结合钙调蛋白，使得这种三磷酸腺苷双磷酸酶具有提高的与钙激活的钙调蛋白相互作用的能力，并且这种改变可能提高psNTP9在调节植物生长和发育中的活性。在psNTP9转录物的开放阅读框中进行两个单核苷酸改变。这些改变被翻译成氨基酸变化以使得图48B结构域中的序列更可能地结合钙调蛋白。第一个碱基对改变在翻译时用精氨酸残基(R)替代脯氨酸残基(P)，这使得螺旋轮的碱性半边的碱性更高。第二个碱基对改变在翻译时用亮氨酸(L)替代丝氨酸残基(S)，这使得螺旋轮的疏水性半边的疏水性更高。所得到的氨基酸和DNA序列分别显示于SEQ ID NO:2和4中。

设想本文中公开的任何实施方式可以关于本公开的任何方法、试剂盒、试剂或组合物来实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可以用于实现本公开的方法。

将认识到通过说明的方式而不是作为限制显示了本文中所述的特定实施方式。本公开的主要特征可以用于各种不同的实施方式中而没有脱离所述公开的范围。本领域技术人员将认识到或使用不超过常规的实验能够确定本文中所述的特定程序的多种等价体。这样的等价体被认为在本公开的范围内并且被权利要求涵盖。

说明书中提及的所有出版物和专利申请表示本公开所属领域的技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请按引用并入本文中，至如同每篇单独的出版物或专利申请特意并单独表示按引用并入的相同程度。

词语“一”或“一个”在权利要求和/或说明书中结合术语“包含”使用时可以表示“一个”，但也与“一个或多个”、“至少一个”和“一个或超过一个”的含义相一致。权利要求中的术语“或”的使用用来表示“和/或”，除非明确表示是指仅择一方式或可选方式是互相排斥的，尽管本公开内容支持仅择一方式和“和/或”的定义。在整个申请中，术语“约”用于表示包括针对用于测定数值的设备、方法的固有误差变化或研究对象中存在的变化的值。

如本说明书和权利要求中使用的，词语“包含(comprising)”(和包含的任何形式，如“包括(comprise)”和“含有(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，如“具备(have)”和“拥有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，如“包含(includes)”和“内含(include)”)或“含有(containing)”(和含有的任何形式，如“包含(contains)”和“含(contain)”)是包括性的或开放式的，并且不排除额外的、未描述的要素或方法步骤。在本文中提供的任一组合物和方法的实施方式中，“包含”可以由“基本上由……组成”或“由……组成”替代。如本文中使用的，短语“基本上由……组成”要求指定的整体或步骤以及不实质性地影响所要求保护的发明的特征或功能的那些整体或步骤。如本文中使用的，术语“组成”用于表示仅存在所述及的整体(例如，特点、要素、特征、特性、方法/过程步骤或限制)或整体的组(例如，(多个)特点、(多个)要素、(多个)特征、(多个)特性、(多个)方法/过程步骤或(多个)限制)。

如本文中使用的术语“或其组合”是指术语前所列项的所有排列和组合。例如，“A、B、C或其组合”用来包括A、B、C、AB、AC、BC或ABC中的至少一个，并且如果在特定内容中顺序是重要的，还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个实例，特意包括的是含有一个或多个项或术语的重复的组合，如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。本领域技术人员将理解，通常对任何组合的项或术语的数量没有限制，除非另外从上下文是明显的。

如本文中使用的，近似的词语，如，但不限于，“约”、“基本上”或“基本上地”是指如下状况：在这样修饰时，理解为不必定是绝对或完美的而认为是足够接近使得本领域普通技术人员能够确保所述状况存在。描述可以发生变化的程度将取决于可以进行多大程度的改变而仍然使本领域普通技术人员认为修饰部分仍然具有未修饰部分的所需特征和能力。通常，但受之前的讨论限制，本文中由近似词语(如“约”)修饰的数值可以从所述值改变至少±1、2、3、4、5、6、7、10、12或15％。

根据本公开，无需过度实验即可制得和实行本文中公开的和要求保护的所有组合物和/或方法。尽管已经根据优选的实施方式描述了本公开的组合物和方法，本领域技术人员将清楚可以对本文中所述的组合物和/或方法以及方法的步骤或步骤的顺序进行改变而没有脱离所述公开内容的概念、精神和范围。认为所有这样本领域技术人员显而易见的相似的替代和改变在由所附权利要求限定的所述公开的精神、范围和概念中。

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Claims

1.一种产生改良植物的方法，包括通过添加或工程化至少一个修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因来修饰所述植物的基因组,

其中所述修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因编码SEQ ID NO: 2的多肽序列或含有一个氨基酸残基置换的SEQ ID NO: 2的多肽序列。

2.权利要求1所述的方法，其中所述改良植物还包含至少一个额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。

3.权利要求1-2中任一项的方法，其中经由土壤杆菌（Agrobacterium）转化来添加所述修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因或所述额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因中的至少一个。

4.权利要求1-2中任一项的方法，其中经由土壤杆菌转化来添加所述修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因。

5.权利要求1的方法，其中通过将包含修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物和包含额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的植物杂交来产生所述改良植物。

6.权利要求1的方法，进一步限定为包括：

a）将包含所述至少一个修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因的改良植物或其后代置于干旱或渗透胁迫下；和

b）鉴定所述改良植物或后代植物中提高的农艺性状；

其中相对于该植物由其衍生的未改良同基因植物系，所述植物呈现出至少一个提高的农艺性状，所述未改良同基因植物系不包含所述修饰的三磷酸腺苷双磷酸酶基因和所述至少一个额外的三磷酸腺苷双磷酸酶基因，并且其中所述提高的农艺性状选自：提高的产量、磷酸盐摄取、抗旱性、抗病性、抗真菌性、营养物吸收、水吸收、平均初生根长度、平均侧根数量、平均种子荚数量、平均种子荚大小、平均种子大小、平均种子重量、种子存活、平均长角果数量、平均长角果大小、平均叶面积、平均叶长和平均植物高度。

7.权利要求1的方法，其中所述植物是大豆、棉花、加拿大油菜、马铃薯、水稻、小麦、甜菜或玉米植物。

8.一种包含SEQ ID NO: 2的多肽序列或含有一个氨基酸残基置换的SEQ ID NO: 2的多肽序列的修饰三磷酸腺苷双磷酸酶编码序列。

9.权利要求8的修饰三磷酸腺苷双磷酸酶编码序列，其中所述氨基酸残基置换是在所述多肽中存在的钙调蛋白结合结构域的主要疏水性或主要碱性部分中；其中所述疏水性部分中的置换是使用疏水性氨基酸残基置换，或其中所述碱性部分中的置换是使用碱性氨基酸残基置换。

10.一种包含SEQ ID NO: 4的核苷酸序列的修饰三磷酸腺苷双磷酸酶基因。

11.一种重组DNA分子，其包含可操作地连接于编码多肽的核酸序列的在植物细胞中功能性的异源启动子，所述核酸序列编码SEQ ID NO: 2的多肽序列或含有一个氨基酸残基置换的SEQ ID NO: 2的多肽序列。

12.权利要求11的DNA分子，其中所述核酸序列是SEQ ID NO: 4。