JP2001017176A

JP2001017176A - 病害抵抗性ポリペプチド、病害抵抗性遺伝子、植物に病害抵抗性を付与する方法、病害抵抗性を付与した形質転換植物、ヌクレオチドトリホスフェイト分解酵素

Info

Publication number: JP2001017176A
Application number: JP11189129A
Authority: JP
Inventors: Tomonori Shiraishi; 友紀白石; Itsuki Furusawa; 巖古澤
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 1999-07-02
Publication date: 2001-01-23

Abstract

(57)【要約】【課題】植物に対して病害抵抗性を付与する目的に有
用な、新たな遺伝子を得る。【解決手段】本発明により、エンドウ品種ミドリウス
イ（ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｍｉｄｏ
ｒｉｕｓｕｉ）由来の、植物細胞壁に存在するヌクレオ
チドトリホスフェイト分解酵素（ＮＴＰａｓｅ）、及び
当該酵素をコードする遺伝子であるＰｓＮＴＰａｓｅ−
１遺伝子及びＰｓＮＴＰａｓｅ−２遺伝子が与えられ
た。細胞壁ＮＴＰａｓｅは植物の防御系の情報伝達に深
く関与する酵素であると共に、病原菌のエリシター及び
サプレッサーと結合する事から、本発明の遺伝子を植物
に導入する事により、植物に病害抵抗性を付与する事が
可能である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、エンドウ品種ミド
リウスイ（ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｍ
ｉｄｏｒｉｕｓｕｉ）由来の、植物細胞壁ヌクレオチド
トリホスフェイト（ＮＴＰ）分解酵素、及び当該酵素を
コードする遺伝子である、ＰｓＮＴＰａｓｅ−１遺伝子
及びＰｓＮＴＰａｓｅ−２遺伝子に関する。更に、本発
明は当該遺伝子を植物に導入する事により植物に病害抵
抗性を付与する方法、及び病害抵抗性を付与した形質転
換植物に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、人口の爆発的な増加、地球の温暖
化、環境破壊等により、人類は食糧不足の危機にひんし
ている。人類の生存に必要不可欠な食糧の増産におい
て、農業技術の果たす役割は大きい。病害を防ぐ事によ
る食糧の増産技術に関して、これまでの農薬等の化学物
質に頼る方法から、実際に病原菌に感染する原因につい
て分子的レベルから解明しようとする、植物病理学的な
新たな方法へと移行しつつある。植物に病原菌抵抗性を
付与する目的で、抵抗性遺伝子を導入したトランスジェ
ニック植物の作成が行われている。キチナーゼやグルカ
ナーゼ等の、直接的な抗菌性が期待できる遺伝子を導入
する事により、病害耐性の付与が行われているが、その
効果は様々であり、必ずしも満足の行くものではない。
また、各種の病原体に対する抵抗性遺伝子がクローニン
グされているが、それらの生理学的な役割については、
まだ十分解明されていないのが現状であり、実用化には
至っていない。

【発明が解決しようとする課題】

【０００３】近年、植物の病原菌に対する抵抗性に関す
るメカニズムに関する、新たな知見が得られるようにな
ってきた。植物伝染病の８０％以上はカビ（糸状菌）に
よって引き起こされ、７％が細菌、７％がウイルス、残
りはウイロイドやファイトプラズマなどの難培養性微生
物、線虫や原虫などが原因である。糸状菌を例にとれ
ば、地球上には数十万種のカビが存在するが、この中で
植物を加害するものは約八千種である。しかし、例えば
イネの場合、加害するカビは約５０種であり、更に大き
な被害をもたらすものは１０指にも満たない。このよう
に、一つの植物種や品種は大多数の病原菌に対して抵抗
性ないし免疫性であり、一握りの病原菌のみが特定の植
物への感染に成功して、大きな被害をもたらす。このよ
うな病原菌感染の「宿主−寄生者の特異性」のメカニズ
ムを解明することにより、宿主特異性に関与する遺伝子
を提供する事が本発明の課題である。病原菌抵抗性に関
与する遺伝子が与えられる事により、植物に病害抵抗性
を付与する、新たな手段が与えられる。

【課題を解決するための手段】

【０００４】植物の抵抗性には、静的（構成的）抵抗性
と動的（誘導的）抵抗性がある事が知られている。静的
抵抗性とは、植物が本来備えている各種の性質による抵
抗性を示し、細胞壁の厚さや硬さ、潜在性抗菌物質など
が挙げられる。一方、動的抵抗性とは、植物が病原菌の
攻撃により新たに誘導される防御反応の事である。現在
知られている最も速い動的抵抗性はＯ₂ ^- やＨ₂ Ｏ₂ の
ような活性酸素種の生成に伴う、細胞壁糖蛋白質の不溶
化や感染阻害物質の生成であり、数分から１５分で生じ
る。その後、遺伝子の発現を伴った、ファイトアレキシ
ン（低分子抗菌性物質）の蓄積、感染特異的蛋白質（Ｐ
Ｒ蛋白質：グルカナーゼ、キチナーゼ等）の増加が認め
られる。この他にも、細胞壁のリグニン化、過敏感細胞
死、パピラの形成などが起こる。これら、動的抵抗性
は、植物側の病原菌認識機構によるものであり、そのメ
カニズムについて、植物の病原菌に対する抵抗性／感受
性の決定は、植物側の抵抗性遺伝子と病原菌の持つ非病
原性遺伝子の相互作用によるものだとする、遺伝子体遺
伝子説により明らかとなってきた。現在、いくつかの抵
抗性遺伝子がクローニングされており、これらの遺伝子
の翻訳産物の機能や構造を明らかにすると共に、病原体
認識から核への情報伝達に至るまでのメカニズムについ
ての解明が、現在行われている。

【０００５】このような動的抵抗性を誘導する因子が多
数の微生物から見出されており、エリシターと呼ばれて
いる。エリシターは、元々ファイトアレキシン生成の誘
導因子を指すものであったが、現在では植物防御応答を
誘導する物質に広く用いられている。エリシター活性
は、菌体成分である、グルカン、キチン、キトサン、ペ
プチド、糖ペプチドあるいは脂質等においても認められ
ている。また、病原菌は、エリシターによって誘導され
る抵抗反応を抑制もしくは遅延させる事によって感染す
る事ができる、という事が明らかとなってきた。このよ
うな物質はサプレッサーと呼ばれ、エリシターによって
誘導される抵抗反応を種特異的に阻害している。これま
での報告によれば、サプレッサーは糖やペプチドを含む
水溶性物質である。例えば、エンドウ褐紋病菌（Ｍｙｃ
ｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａｐｉｎｏｄｅｓ）の生産する
サプレッサーであるサプレッシンＡの構造はＧａｌＮＡ
ｃ−Ｏ−ＳＳＧであり、サプレッシンＢの構造はＧａｌ
−ＧａｌＮＡｃ−Ｏ−ＳＳＧＤＥＴである。

【０００６】ジャガイモと共に、エンドウにおいて情報
伝達系におけるサプレッサーの作用が検討されており、
発明者らはエンドウ褐紋病菌におけるサプレッサーの作
用メカニズムに注目した。エリシター処理エンドウにお
いて、ファイトアレキシンの蓄積は６時間以内に認めら
れ、生合成系の鍵となる酵素である酵素遺伝子の転写活
性化は１時間以内に認められる。しかし、サプレッサー
共存下ではこれらの応答は３〜６時間遅れる。このよう
に、サプレッサーの作用点は、遺伝子発現より上流にあ
る。情報伝達系につき種々探索した結果、蛋白質リン酸
化の系とポリホスホイノシチド（ＰＩ）代謝系が深く関
与していることが判った。

【０００７】近年、エンドウ褐紋病菌サプレッサーがア
デノシントリホスフェイト分解酵素（ＡＴＰａｓｅ）を
阻害する事が明らかとなってきた。サプレッサーによる
防御反応の種特異性を検討したところ、エンドウ褐紋病
菌のサプレッサーで処理された植物のうち、褐紋病菌の
宿主だけナシ黒班病菌が感染可能となる。ところが、褐
紋病菌サプレッサーはダイズ、インゲン、ササゲ、オオ
ムギから分離された細胞膜のＡＴＰａｓｅ活性も阻害
し、インビトロでの細胞膜ＡＴＰａｓｅに対する作用
に、厳密な特異性は認められなかった。一方、細胞化学
的にＡＴＰａｓｅ活性が調べられた結果、サプレッサー
の阻害作用は細胞レベルでは種特異的であり、供試作物
のうちエンドウ細胞の活性だけを阻害した。これらの、
種特異性の結果は、植物に特有で、最外層に位置する細
胞壁が、病源菌シグナルの受容や変換に深く関与する可
能性を示している。

【０００８】発明者らは、数種のマメ科植物から細胞壁
を調製し、エンドウ褐紋病菌が生産するエリシターとサ
プレッサーの、ＡＴＰａｓｅ活性に対する作用を調べた
ところ、（１）エリシターは細胞壁ＡＴＰａｓｅの活性
を非特異的に上昇させる事、（２）サプレッサーは宿主
非特異的にそれらの活性を阻害し、非宿主についてはエ
リシターと同様に上昇させる事を見出した。これらの結
果は、インビトロにおける感染、ＡＴＰａｓｅ活性、さ
らに防御応答に対するサプレッサーの作用と完全に一致
している。また、細胞壁画分中にはＮＡＤＨ依存性のＯ
₂ ^- 生成活性（ペルオキシダーゼ、ＰＯＸ）が存在し、
更に本Ｏ₂ ^- 生成活性はＡＴＰａｓｅと同様に病原菌シ
グナルによって制御されることから、細胞壁は病原菌シ
グナルの認識のみならず、その後の抵抗反応にも関与し
ているものと考えられる。即ち、細胞壁ＡＴＰａｓｅは
エリシター及びサプレッサーのレセプターとして作用し
ており、そのＡＴＰａｓｅを改変する事は、病原菌耐性
の付与において新たな手法を提供するものであり、細胞
壁ＡＴＰａｓｅの遺伝子を単離して遺伝子解析を行うこ
とにより、本発明はそのような手法を提供するものであ
る。

【発明の実施の形態】

【０００９】発明者らは病原菌シグナルに応答性を持つ
細胞壁画分ＡＴＰａｓｅの精製を試みた。エンドウの黄
化子苗から細胞壁画分を調製し、細胞壁の蛋白質を可溶
化して精製する事により、エリシター、サプレッサーに
応答性を持つＡＴＰａｓｅ複合体が精製された。そのア
ミノ酸配列を解析したところ、Ｎ末端１２アミノ酸配列
（ＥＥＩＳＸＹＡＶＶＦＤＡ）が明らかとなった。本発
明において、このアミノ酸配列の情報をもとにオリゴヌ
クレオチドを作成し、これをプライマーとしてエンドウ
から調製した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）から、リバース
トランスクリブターゼポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−Ｐ
ＣＲ）及び５’−ｒａｐｉｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎｏｆｃＤＮＡｅｎｄｓ（５’−ＲＡＣＥ）を
行うことにより、エリシター、サプレッサー結合蛋白質
遺伝子の単離を行った。その結果、配列表の配列番号３
に示す遺伝子、及び配列表の配列番号４に示す遺伝子を
単離し、それらの塩基配列を決定した。更に、得られた
遺伝子をを大腸菌により発現させて、組み換えＡＴＰａ
ｓｅを得た。発現した組み換え蛋白質の性質を検討した
ところ、ＡＴＰａｓｅ活性及びエリシター、サプレッサ
ー結合活性が認められた。

【００１０】本発明のエンドウ黄化子苗由来の、２つの
細胞壁ＡＴＰａｓｅ遺伝子の塩基配列は、配列表の配列
番号３に記載した塩基配列及び配列表の配列番号４に記
載した塩基配列により特定される。それらの遺伝子は、
エンドウ品種ミドリウスイ（Ｐｉｓｕｍｓａｔｉｖｕ
ｍＬ．ｃｖ．Ｍｉｄｏｒｉｕｓｕｉ）由来のヌクレオ
チドトリホスフェイト分解酵素（ＮＴＰａｓｅ）をコー
ドする遺伝子であるため、ＰｓＮＴＰａｓｅ−１遺伝子
及びＰｓＮＴＰａｓｅ−２遺伝子と名付けられた。本遺
伝子はＡＴＰａｓｅとして単離されたが、実施例で示す
様に、細胞壁ＡＴＰａｓｅはＡＴＰのみならず、ウリジ
ントリホスフェイト（ＵＴＰ）、シチジントリホスフェ
イト（ＣＴＰ）等の他のヌクレオチドトリホスフェイト
もまた基質として水解反応を触媒するため、その本質は
ＮＴＰａｓｅである。

【００１１】上述したように、ＰｓＮＴＰａｓｅはエリ
シター、サプレッサーの受容体として作用していると考
えられ、ＰｓＮＴＰａｓｅ−１遺伝子及びＰｓＮＴＰａ
ｓｅ−２遺伝子は、受容体の改変という、新たな病原菌
耐性の付与の手段を提供するものである。遺伝子組み換
え技術によれば、基本となるＤＮＡの特定の部位に、当
該ＤＮＡがコード化する物の基本的な特性を変化させる
ことなく、あるいはその特性を改善する様に、人為的に
変異を起こすことができる。本発明により提供される天
然の塩基配列を有する遺伝子、あるいは天然のものとは
異なる塩基配列を有する遺伝子に関しても、同様に人為
的に挿入、欠失、置換を行うことにより天然の遺伝子と
同等のあるいは改善された特性を有するものとすること
が可能であり、本発明はそのような変異遺伝子を含むも
のである。

【００１２】また、ＰｓＮＴＰａｓｅ−１遺伝子及びＰ
ｓＮＴＰａｓｅ−２遺伝子は同一のコーディング領域を
有し、当該コーディング領域の塩基配列は配列表の配列
番号２に記載した配列により特定される。その塩基配列
よりコードされる推定アミノ酸配列は、配列表の配列番
号１に記載した配列により、それぞれ特定される。多く
のアミノ酸については、それをコード化するＤＮＡの塩
基配列は複数存在する。本発明で明らかにされた細胞壁
ＡＴＰａｓｅのアミノ酸配列をコード化する遺伝子の場
合にも、そのＤＮＡの塩基配列として、天然の遺伝子の
塩基配列以外にも、多数の塩基配列が存在する可能性が
ある。しかし、本発明の遺伝子は、天然のＤＮＡ塩基配
列のみに限定されるものではなく、本発明により明らか
にされた細胞壁ＡＴＰａｓｅのアミノ酸配列をコード化
する、他のＤＮＡ塩基配列を含むものである。

【００１３】これまで述べてきた本発明の概念を、図１
及び図２に示す。非病原菌による接触が起こった場合、
エリシターにより細胞壁ＡＴＰａｓｅ（ＮＴＰａｓｅ）
が活性化し、それに引き続き（１）ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）の活性化による活性
酸素の産生（２）ビトロネクチン（ＶＲ）系を介してのポリホスホ
イニシチド（ＰＩ）代謝系の活性化による原形質膜ＡＴ
Ｐａｓｅの活性化（３）ビトロネクチン系及びアクチン系を介して、又は
ビトロネクチン系及びポリホスホイニシチド代謝産物で
あるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を介してのフィト
アレキシン等の防御物質の産生等の現象が起こり、結果として感染は拒絶される。しか
し、サプレッサーの存在下においては上述したメカニズ
ムは作用せず、従って活性酸素の産生、防御物質の産生
は行われない。

【００１４】本発明の遺伝子を植物に導入して形質転換
を行う方法、及び形質転換した植物もまた、本発明の範
囲内である。サプレッサーの認識が発病の成否及び種特
異性を担っていることを考えると、発明の細胞壁ＡＴＰ
ａｓｅ（ＮＴＰａｓｅ）遺伝子を改変あるいは破壊する
ことにより、本来羅病性を示す植物体を抵抗性にする事
ができる。本発明の遺伝子中のサプレッサー結合部位を
改変し、サプレッサーに感受性を失ったＰｓＮＴＰａｓ
ｅを、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、あ
るいはウイルスベクター法等の通常の形質転換方法によ
って、種々の植物を形質転換する事が可能である。ま
た、抵抗性植物のＮＴＰａｓｅを大量に異なる羅病性植
物内で発現させて、病害抵抗性にする事も可能である。
本発明の遺伝子は、種々の植物に導入する事が可能であ
り、導入可能な植物の例としてはエンドウの他、イネ、
トウモロコシ、アスパラガス、コムギ等の単子葉植物、
またシロイヌナズナ、タバコ、ニンジン、ダイズ、トマ
ト、ジャガイモ等の双子葉植物が挙げられる。以下に実
施例を挙げて、本発明を更に詳細に説明する。本発明
は、上述した例又は以下の実施例に限定されるものでは
なく、本発明の技術分野における通常の変更をする事が
できる。

【００１５】

【実施例】（サプレッサー、エリシター結合蛋白質の分
離精製）エンドウの黄化子苗の細胞壁から、０．５Ｍ
ＮａＣｌで可溶化した蛋白質より６０〜８０％飽和硫安
で沈殿する画分を回収し、３０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．６）に溶解し、分子量１万の限外濾過を行
い、内液を回収した。回収した蛋白質溶液をＡＴＰ結合
アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ）を詰めたカラムに供し、
５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）で洗浄した
後に０．５ＭＮａＣｌを含む同バッファーで洗浄する
事により、ＡＴＰ結合蛋白質を採取した。１００ｍＭ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
０）で平衡化したモノＱカラムに、得られたＡＴＰ結合
蛋白質をを供し、同バッファーで洗浄後、ＮａＣｌ１
００〜２５０ｍＭのリニアグラジエント（４０分）で溶
出した。モノＱカラムにより２回精製したところ、ほぼ
単一の蛋白質が得られた。精製の過程における活性の回
収率及び精製度を、表１に示す。

【００１６】

【表１】

【００１７】モノＱカラム溶出画分をネイティブポリア
クリルアミドゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ）
で分画し、Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥを行ったサンプルに
つき、銀染色（Ｓｉｌｖｅｒ）、ＡＴＰａｓｅ活性染
色、ペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）活性染色を行った（図
３）。銀染色については第一化薬の染色キットを使用し
た。ＡＴＰａｓｅ活性染色は、電気泳動終了後、３０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＭＥＳ（ｐＨ６．５）で１０分程度イン
キュベートし、終濃度３ｍＭＡＴＰ、３ｍＭＭｇＳＯ
₄ ０．１２％酢酸鉛を含む３０ｍＭＴｒｉｓ−ＭＥＳ
（ｐＨ６．５）中、２５℃で１時間インキュベートし、
その後０．１％Ｎａ₂ Ｓに浸す事により、バンドを検出
した。ＰＯＸの活性染色は、電気泳動終了後、３０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ（ｐＨ６．５）で１０分程度インキ
ュベートし、０．５ｍＭ過酸化水素、０．５ｍＭオルト
−ジアニシジンを含む３０ｍＭＴｒｉｓ−ＭＥＳ（ｐ
Ｈ６．５）中で２５℃でインキュベートする事により、
バンドを検出した。図３において検出されたバンドは、
精製蛋白質とＡＴＰａｓｅ、精製蛋白質とＰＯＸの会合
を示唆するものである。

【００１８】また、モノＱカラム溶出画分をドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ）で分画し、銀染色（Ｓｉｌｖｅｒ）、抗Ａ
ＴＰ抗体によるウエスタン解析（ＡＴＰａｓｅ）ＡＴＰ
結合蛋白質（ＡＢＰ）、、抗ホースラディッシュペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）抗体によるウエスタン解析（ＰＯ
Ｘ）を行った（図４）。ウエスタンブロッティングはＴ
ｒｉｓ−グリシンバッファーの系を用いてトランスファ
ーを行った後、ブロッキングを行い、酵素に対する特異
的な抗体を用いた通常のイムノブロッティングにより検
出を行った。ＡＴＰ結合蛋白質は、精製蛋白質に１ｍＭ
５’−パラフルオロスルホニルベンゾイルアデノシン
（ｐｆｌｕｏｒｏｓｕｌｆｏｎｙｌｂｅｎｚｏｙｌａｄ
ｅｎｏｓｉｎｅ：ＦＳＢＡ）（ＡＴＰバインディングプ
ロテインディテクションキット：ベーリンガー）を加
え、インキュベートした後に、電気泳動及びトランスフ
ァーした後、抗ＦＳＢＡ抗体、アルカリフォスファター
ゼ標識抗ウサギ二次抗体で処理して、発色試薬（ＢＣＩ
Ｐ／ＮＢＴ）でバンドを検出した。図４において６０ｋ
Ｄａ付近にバンドが認められ、やはり精製蛋白質とＡＴ
Ｐａｓｅ、精製蛋白質とＰＯＸの会合が示された。

【００１９】更に、モノＱカラムで精製して得られたＡ
ＴＰａｓｅに、エリシター及びサプレッサーが及ぼす影
響を検討した。エリシターは褐紋病菌由来の高分子糖蛋
白エリシター（図５）、合成エリシターは合成エリシタ
ーＮｏ．４（図６）、サプレッサーは、サプレッシンＡ
Ｂを含有する部分精製標品を用いた（図７）。モノＱカ
ラムで精製した蛋白質画分と、ビオチン化ラベル合成エ
リシターあるいはビオチン化サプレッサーを３０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＭＥＳ（ｐＨ６．５）中において混合後、２
５℃で５分間インキュベートし、ＵＶランプ（３６０ｎ
ｍ）を５分間照射し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。その後
ＰＶＤＦ膜にブロットし、アルカリホスファターゼ結合
アビジンで処理を行い、アルカリホスファターゼの基質
であるＣＤＰ−ｓｔａｒによる発光をＸ線フィルムで検
出した。尚、ビオチン化リガンド（エリシター、サプレ
ッサー）の調製は、基本的にレセプターバインディング
アナリシスキット（ベーリンガー）のプロトコールに従
って行った。イムノブロティングで検出したラベル化リ
ガンドの結合、及び非ラベル化エリシター、非ラベル化
サプレッサーによる結合の抑制を、図８に示す。

【００２０】その結果、１０μＭのビオチン化合成エリ
シターに由来するシグナルが６２．５ｋＤａの位置に認
められ、１ｍＭまたは５ｍＭの非ラベル化合成エリシタ
ーの存在下（図８Ａ）において、又は１０００ｐｐｍま
たは５０００ｐｐｍの褐紋病菌由来エリシターの存在下
（図８Ｂ）において、６２．５ｋＤａのシグナルは弱め
られた。ビオチン化サプレッサーに由来するシグナル
が、やはり６２．５ｋＤａの位置に認められ、１０００
ｐｐｍまたは３０００ｐｐｍの非ラベル化サプレッサー
の存在下において、６２．５ｋＤａのシグナルは弱めら
れた（図８Ｃ）。以上の結果は、モノＱカラム精製画分
の蛋白質が、エリシター及びサプレッサーと結合する性
質を有する事を示している。

【００２１】モノＱカラムで精製した蛋白質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した後、ポンソー
Ｓで染色した。上記のエリシター、サプレッサー結合蛋
白質に対応する染色バンドを確認して、切り抜いて洗浄
し、アプライドＡＢＩ４７６Ａプロテインシークエンサ
ーで、アミノ末端からアミノ酸配列を解析した。その結
果、アミノ末端１２アミノ酸配列であるＥＥＩＳＸＹＡ
ＶＶＦＤＡという塩基配列が明らかとなった

【００２２】（全ＲＮＡの調製）エンドウ黄化子苗よ
り、全ＲＮＡの抽出を行った（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ
及びＳａｃｃｈｉ、１９８７の変法）。暗所で静置した
播種後６〜７日のエンドウ黄化子苗１ｇを、液体窒素で
凍らせながら、乳鉢でよく粉砕した。グアニジンイソチ
オシアネート可溶化バッファー１０ｍｌを加えよく混合
し、ポリプロピレンチューブに移した。続いて水飽和酸
性フェノール１０ｍｌと、２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ
４．０）１ｍｌ、クロロホルム・イソアミルアルコール
（４９：１）４ｍｌを加え、ボルテックスした後に、氷
上に１５分間静置した。３５００ｒｐｍで４℃にて１０
分間遠心分離を行い、上層（水層）を別のポリプロピレ
ンチューブに移した。上層と等量のイソプロパノールを
加え、ー２０℃で１時間静置した。１００００ｒｐｍで
４℃にて１５分間遠心分離を行い、ＲＮＡのペレットを
得た。再度、グアニジンイソチオシアネート可溶化バッ
ファー（グアニジンイソチオシアネート４７．３ｇ、
３Ｍ酢酸ナトリウム０．８３３ｍｌ、Ｎ−ラウロイ
ルサルコシネートナトリウム０．５ｇ、β−メルカプ
トエタノール０．７６ｍｌ総量１００ｍｌ）１ｍｌ
に溶かし、０．５ｍｌずつ２本の１．５ｍｌ用マイクロ
チューブに分配した。上の操作と同じ手順で、酸性フェ
ノール抽出を行い、イソプロパノールでペレットを沈殿
後、７０％エタノール０．５ｍｌで洗浄し、ＲＮＡのペ
レットを得た。ペレットを１０〜１５分間風乾した。ジ
エチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水（０．０１
％のＤＥＰＣで処理した蒸留水を、３７℃で２時間静置
した後にオートクレーブしたもの）１００μｌに溶か
し、ＲＮＡ溶液とした。胚軸１ｇから約１００μｇのＲ
ＮＡが回収できた。

【００２３】（ＲＴ−ＰＣＲの逆転写反応）上述の過程
より得たエンドウ黄化子苗由来全ＲＮＡを鋳型として、
逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡについて、アミノ
酸配列の情報（ＹＡＶＶＦＤＡ）を基に合成した２種類
のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣ
Ｒを行った。５×ＲＴバッファー４μｌ、１０ｍＭｄ
ＮＴＰ２μｌ、リバーストランスクリプターゼ１μ
ｌ、ＲＮＡ分解酵素インヒビター１μｌ、全ＲＮＡ
１．５ｇ、にジエチルピロカルボネート処理水を添加し
て総量２０μｌにした反応液を、サーマルサイクラーで
４２℃で６０分間インキュベートする事により、逆転写
反応を行った。

【００２４】（ＲＴ−ＰＣＲのＰＣＲ反応）逆転写反応
で得られた１本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、スーパータク
プレミックスキットを用いてＰＣＲを行った。反応液は
１本鎖ｃＤＮＡ（１μｇ）１．５μｌ、オリゴｄＴプラ
イマー１μｌ、オリゴヌクレオチドプライマー１μ
ｌ、タクＤＮＡポリメラーゼ溶液より成る溶液であり、
当該反応液につきサーマルサイクラーでＰＣＲを行っ
た。ＰＣＲの条件は、９４℃で２分−５０℃で３０秒−
７２℃で３分を１サイクル、９４℃で３０秒−５０℃で
３０秒−７２℃で３分を３０サイクル、９４℃で３０秒
−５０℃で３０秒−７２℃で５分を１サイクル行った。
ＰＣＲによって得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電
気泳動し、増幅されたＤＮＡ断片の検出及びサイズ分画
を行った。使用したプライマーは、以下の通りである。
ＲＴ−ＰＣＲの産物について電気泳動を行ったところ、
約２．５ｋ塩基対、２．０ｋ塩基対、１．８ｋ塩基対の
３本のバンドが検出された。オリゴｄＴプライマー：GTC GAC TCT TGA(T)₂₅ オリゴヌクレオチドプライマーＰ３：TAY GCN GTN GTN TTY GAY GCN Ｐａ：TAY GCN GTN GTN TTY GAY GC

【００２５】（ＤＮＡフラグメントの回収）上記の３本
のバンドについて、結合剤であるガラスミルクをＤＮＡ
を結合させ、単離した後に回収をする方法であるジーン
クリーンキットを用いて、アガロースゲルからのＤＮＡ
抽出を行った。電気泳動後のアガロースゲルをエチジウ
ムブロマイド溶液中で染色し、ＵＶランプ上で検出され
た目的とするバンドを切り出して、１．５ｍｌポリプロ
ピレンチューブに移した。ゲルの１／２量のＴＥＢ修飾
剤と、４．５倍量のＮａＩを加えて、あらかじめ温めて
おいた恒温槽（５５℃）で完全に溶かした。ゲルの重さ
に相当する適当量のガラスミルクを加えて、シェーカー
で約５分間よく攪拌した。３０００ｒｐｍで５分間遠心
分離を行い、得られたペレット（ガラスミルク／ＤＮＡ
複合体）を洗浄した。洗浄後、ガラスミルクと同量の滅
菌水で溶解し、遠心分離をして、上清をＤＮＡ溶液とし
た。本操作により、約８０％のＤＮＡが回収できた。

【００２６】（ベクターへの導入及び形質転換）回収し
たＤＮＡを、トポＴＡクローニングキットを用いてＴＡ
ベクターへ導入し、コンピテントセルへの形質転換を行
った。回収したＤＮＡ溶液とＰＣＲ−トポベクターとを
混合し、室温でインキュベーションする事により、ライ
ゲーション反応を行った。キットに含まれているコンピ
ーテントセルに、０．５Ｍ β−メルカプトエタノール
２μｌを加えて混合した。氷上で３０分間インキュベ
ートした後、４２℃の恒温槽で３０秒間ヒートショック
し、すぐに氷上で２分間急冷した。室温に戻しておいた
ＳＯＣ培地（２％トリプトン、０．５％酵母抽出物、１
０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭ
ｇＣｌ₂ 、１０ｍＭＭｇＳＯ₄ 、１０ｍＭグルコー
ス）２５０μｌを加えて、３７℃で３０分間、水平下で
シェーカーでよく攪拌した。あらかじめ２０ｍｇ／ｍｌ
Ｘ−ｇａｌ４０μｌと１００ｍＭ４０μｌをプレ
ーティングしておいた、４０μｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＬＢ寒天培地（バクトトリプトン１０ｇ、酵母
抽出物５．０ｇ、ＮａＣｌ１０ｇを１Ｌに溶解し
て、ｐＨ７．０に調整）上に、５０〜１００μｌずつプ
レーティングした。３７℃で約一晩インキュベートし、
インサートが挿入されていると思われる数個〜数十個の
白コロニーを得た。

【００２７】上記の白コロニーを、５０μｌのＬｕｒｉ
ａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）液体培地を含むマイクロタ
イタープレート中に植菌し、３７℃で一晩培養した。こ
の培養液にＳＤＳ含有のローディングバッファーを加え
た後、直接電気泳動して、目的とする遺伝子が導入され
ているか、推測をした。サイズマーカーとして、インサ
ートを含まないＴＡベクターをロードした。電気泳動
後、導入されたｃＤＮＡの存在が確認されたコロニーに
ついて、プラスミドの精製を行った。

【００２８】（ｃＤＮＡを含むプラスミドの調製）プラ
スミドの精製は、以下のように行った。上記白コロニー
を採取し、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌ
のＬＢ液体培地に植菌し、３７℃で一晩震盪培養を行っ
た。培養液をチューブに移し、１２０００ｒｐｍで１分
間、４℃で遠心分離した後、上清を捨ててペレットを得
た。ペレットを１００μｌの溶液１（５０ｍＭグルコ
ース、２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．０、１０
ｍＭＥＤＴＡｐＨ８．０）でよく懸濁し、室温で５分
間静置した後、２００μｌの溶液２（０．２ＭＮａＯ
Ｈ、１％ＳＤＳ）を加え、氷中に５分間置いた。その
後、１５０μｌの溶液３（３Ｍ酢酸カリウム、１２％
酢酸）を加え、氷中に５分間置いた後、１２０００ｒ
ｐｍで５分間、４℃で遠心分離した後、上清を採取し
て、フェノール抽出及びエタノール沈殿を行い、得られ
たペレットを１００μｌの滅菌水に懸濁した。ＲＮＡ分
解酵素（１０ｍｇ／ｍｌＲＮＡ分解酵素Ａ、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．５、１５ｍＭＮａＣｌ
１００℃で１５分間加熱）を１μｌ加え、３７℃で２
時間反応させ、ＲＮＡを分解させた。その後、フェノー
ル抽出及びエタノール沈殿を行い、ＤＮＡを精製し、５
０μｌの滅菌水をペレットを懸濁した。分光光度計で、
精製したＤＮＡの濃度を測定し、精製されたプラスミド
の量を確認した。更に、以下に示す制限酵素処理、ＰＣ
Ｒ反応によって、インサートが導入されているかどうか
確認した。

【００２９】（ＴＡベクターの制限酵素処理）目的とす
る遺伝子を導入したＴＡベクターは、そのマルチクロー
ニングサイトの両側にＥｃｏＲＩサイトを含んでおり、
ＥｃｏＲＩ消化を行うことによって、インサートを切り
出し、電気泳動で確認した。即ち、反応液（ＥｃｏＲＩ
１μｌ、１０×バッファー１μｌ、２本鎖ＤＮＡ
（４〜６μｇ）３μｌ、滅菌水５μｌ）を、３７℃で
２ー３時間ないし一晩培養した後に、アガロースゲル電
気泳動を行い、インサートの確認を行った。

【００３０】（制限酵素処理産物のＰＣＲ）ＴＡベクタ
ー上の配列である、Ｍ１３リバースプライマーと、Ｍ１
３（−２０）フォワードプライマーで挟み込んで、ＰＣ
Ｒを行うことによって、目的とするＤＮＡ断片の増幅が
みられるかどうか確認した。反応液（Ｍ１３リバースプ
ライマー１μｌ、Ｍ１３フォワードプライマー１μ
ｌ、ｄｓＤＮＡ（１μｇ）１．５μｌ、ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ溶液４７μｌ）につき、サーマルサイク
ラーで以下に示すＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９
４℃で２分−５０℃で３０秒−７２℃で３分を１サイク
ル、９４℃で３０秒−５０℃で３０秒−７２℃で３分を
３０サイクル、９４℃で３０秒−５０℃で３０秒−７２
℃で５分を１サイクル行った。反応産物につき、アガロ
ースゲル電気泳動を行い、インサートの確認を行った。

【００３１】（シークエンス反応）制限酵素処理後、Ｐ
ＣＲによってインサートの確認のできたプラスミドＤＮ
Ａを鋳型としてＰＣＲを行い、ＡＢＩオートシークエン
サーによる解析を行った。シークエンサーによる解析
は、ＡＢＩＰＲＩＳＭ３１０の、デオキシローダミ
ンターミネーターキットのプロトコールを用いた。プラ
イマーには、センス側については、ＴＡベクター上の配
列であるＭ１３リバースプライマー、内部配列が明らか
となった上流から約４００塩基対、７００塩基対付近の
配列を基に合成したプライマー（Ｓ９、Ｐ９Ｓ）、又、
アンチセンス側についてはＴＡベクター上の配列である
Ｍ１３（−２０）フォワードプライマー、内部配列が明
らかとなった下流から約２００塩基対付近の配列を基に
合成したプライマー（Ｐ９ａ）を用いた。使用したプラ
イマーは、以下の通りである。（１）センス側のプライマーＭ１３ＲＰ：CAG GAA ACA GCT ATG AC Ｓ９：GAT GGA ACC CAA GAA GGT Ｐ９Ｓ：TCT CCT AAC CCT TGC CTT （２）アンチセンス側のプライマーＭ１３ＦＰ：G TAA AAC GAC GGC CAG Ｐ９ａ：GAG AAA GAA GGG AGG AAT GAG

【００３２】シークエンス解析を行った結果、ＲＴ−Ｐ
ＣＲの産物を電気泳動することによって得られた２．５
ｋ塩基対、２．０ｋ塩基対のバンドについては、それぞ
れリポキシゲナーゼ、多剤耐性蛋白質と相同性が認めら
れたが、いずれも１塩基の読み枠のずれを生じていた。
一方、約１．８ｋ塩基対のバンドについては、目的とす
る配列（ＹＡＶＶＦＤＡ）をふくんであり、かつエンド
ウの核ＮＴＰａｓｅと高い相同性が見られ、Ｋｒｌ．８
−９と名付けた。本クローン（Ｋｒｌ．８−９）につい
て詳細に解析を行ったところ、全長の塩基配列が明らか
となった。Ｋｒｌ．８−９は、ポリＡテールを含めて、
１５２１塩基対の塩基から構成されており、４１２アミ
ノ酸をコードする翻訳領域を有していた。また、エンド
ウの核ＮＴＰａｓｅとは、塩基レベルで９８％、アミノ
酸レベルでは９９％の相同性を示した。

【００３３】（ファーストストランドｃＤＮＡの合成）
５’側の配列を解読するために、５’−ＲＡＣＥを行う
事を考え、５’−ＲＡＣＥに使用するｃＤＮＡの合成を
試みた。即ち、エンドウ黄化子苗から抽出した全ＲＮＡ
を鋳型として、逆転写反応によって一本鎖ｃＤＮＡの合
成を行った。ＲＮＡサンプル１μｇ（１〜４μｌ）、ｃ
ＤＮＡ合成プライマー（１０μＭ）１μｌ、更に全量６
μｌになるように滅菌水を加え、サーマルサイクラーで
７０℃で２分間インキュベートした後に、氷上で２分間
急冷した。さらに、反応液（５×ファーストストランド
バッファー２μｌ、ｄＮＴＰミックス１μｌ、ＮＭ
ＬＢリバーストランスクリプターゼ１μｌ全量１０
μｌ）をサーマルサイクラーで、４２℃で１時間インキ
ュベーションし、ファーストストランドｃＤＮＡを得
た。尚、５×ファーストストランドバッファーの組成
は、２５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．３）、３０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ 、３７５ｍＭＫＣｌである。

【００３４】（セカンドストランドｃＤＮＡの合成）更
に、セカンドストランドｃＤＮＡの合成を行った。セカ
ンドストランドｃＤＮＡを合成する反応液（ファースト
ストランド反応液１０μｌ、５×セカンドストランド
バッファー１６μｌ、１０ｍＭｄＮＴＰ混合物
１．６μｌ、２０×セカンドストランド酵素カクテル
４μｌ、滅菌水４８．４μｌ、全量８０μｌ）を穏や
かに混合し、サーマルサイクラーで１６℃で３０分間イ
ンキュベートした。尚、５×セカンドストランドバッフ
ァーの組成は、５００ｍＭＫＣｌ、５０ｍＭ硫酸ア
ンモニウム、２５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．７５ｍＭ β
−ＮＡＤ、１００ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．
２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンである。２０×セカ
ンドストランド酵素カクテルの組成は、大腸菌ＤＮＡポ
リメラーゼ（６ユニット／μｌ）、大腸菌ＤＮＡリガー
ゼ（１．２ユニット／μｌ）、大腸菌ＲＮＡ分解酵素Ｈ
（０．２５ユニット／μｌ）である。０．２ＭＥＤＴ
Ａ４μｌを加え、２本鎖ｃＤＮＡの合成を終了させた。
フェノール：クロロフォルム：イソアミルアルコール
（２５：２４：１）１００μｌを加え攪拌した後に、１
４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上層を採取
した。さらに、クロロホルム：イソアミルアルコール
（２４：１）を１００μｌ加え、攪拌した後に１４００
０ｒｐｍで１０分間遠心分離を行い、上層を採取した。
上層の約半分量の４Ｍ酢酸アンモニウム、２．５倍量の
１００％エタノールを加え、十分ボルテックスした後
に、１４０００ｒｐｍで室温にて遠心分離を行い、セカ
ンドストランドｃＤＮＡのペレットを得た。８０％エタ
ノール３００μｌで洗浄し、得られたＤＮＡペレットを
約１０分間乾燥させた後に、滅菌水１０μｌに溶かし
た。

【００３５】（アダプターライゲーション）合成した２
本鎖ｃＤＮＡの半分量（５μｌ）を用いて、アダプター
の付加を行った。反応液（２本鎖ｃＤＮＡ５μｌ、１
０μＭマラソンｃＤＮＡアダプター２μｌ、５×Ｄ
ＮＡライゲーションバッファー２μｌ、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１μｌ、全量１０μｌ）をサーマルサイクラー
で１６℃にて一晩インキュベートした。尚、５×ＤＮＡ
ライゲーションバッファーの組成は、２５０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５０ｍＭＭｇＣｌ₂ 、
５ｍＭジチオスレイトール、２５％ポリエチレングリ
コール（分子量８０００）である。７０℃で５分間加熱
してライゲーション反応を終了させ、トライシン−ＥＤ
ＴＡバッファーを９０μｌ加えて１００μｌとした。本
ＤＮＡ溶液を、５’−ＲＡＣＥに用いた。

【００３６】前記クローン（Ｋｒｌ．８−９）の更に上
流の塩基配列を明らかにするために、アミノ酸配列の情
報（ＹＡＶＶＦＤＡ）に相当するＫｒｌ．８−９、エン
ドウの核ＮＴＰａｓｅの塩基配列を基にアンチセンスプ
ライマー（Ａ−Ｐ３、Ａ−ＮＴＰ）を作製し、５’−Ｒ
ＡＣＥを行った。前項の２本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、
上述のアンチセンスプライマー及びアダプタープライマ
ー（ＡＰＩ）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲと同様の手順でＰ
ＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＴＡベクターに導入
し、大腸菌に形質転換した後、シークエンス解析を行っ
た。使用したプライマーは、以下の通りである。Ａ−Ｐ３：GGC ATC GAA GAC TAC AGC ATA Ａ−ＮＴＰ：AGC ATC GAA TAC TAC AGC GTA ＡＰ１：CCA TCC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC

【００３７】５’−ＲＡＣＥを行った結果、Ａ−ＮＴＰ
プライマーでは２種のＤＮＡ断片、Ａ−Ｐ３プライマー
では１種のＤＮＡ断片の増幅が認められた。これらのＤ
ＮＡ断片に関して、４％アクリルアミドゲルを用いてサ
イズの解析を行ったところ、Ａ−Ｐ３プライマーで増幅
されるＤＮＡ断片は数十塩基対と非常に小さく、Ａ−Ｎ
ＴＰプライマーでは数十塩基対と、２５０塩基対付近に
更に２本のＤＮＡ断片の増幅が認められた。また、プラ
イマーのみのコントロール実験を行ったところ、数十塩
基対のＤＮＡ断片の増幅が認められた。以上の結果か
ら、Ａ−ＮＴＰプライマー、Ａ−Ｐ３プライマーで増幅
された共通の数十塩基対のＤＮＡは、プライマーのみで
増幅される非特異的なＤＮＡ断片であることが判った。
そこで、Ａ−ＮＴＰプライマーで増幅が見られた２本の
バンドについて、同様にシークエンス解析を行ったとこ
ろ、全塩基配列が明らかとなった。本クローンは、それ
ぞれ、１９１及び１７４塩基対の塩基から構成されてお
り、いずれもエンドウの核ＮＴＰａｓｅと高い相同性を
示した。また、両クローン間においては、５’側の非翻
訳領域の長さに違いが認められたものの、その他につい
てはほとんど同じであった。

【００３８】（ＮＴＰａｓｅホモログの全塩基配列の決
定）全長ｃＤＮＡを得るために、５’−ＲＡＣＥで明ら
かとなった５’側の配列を基に、２種類のプライマーを
作製し、ＲＴ−ＰＣＲを行った。使用したプライマー
は、以下の通りである。プライマー１：CTC TAA ATT GTT TAC CCT ACA プライマー２：CTG GAG CTA CCT AGT TTC TCT ２種類のプライマーのいずれを用いた場合においても、
ＲＴ−ＰＣＲによって増幅されるＤＮＡ断片として、約
１．７ｋｂのバンドが検出された。本クローンについて
も、全長の塩基配列の決定をした。後に示すように、得
られた遺伝子がコードする酵素はＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴ
Ｐ等の種々のヌクレオチドトリホスフェイトを基質とし
て分解する活性を有することから、プライマー１より得
た塩基配列をＰｓＮＴＰａｓｅ１（Ｐｉｓｕｍｓａｔ
ｉｖｕｍ由来ＮＴＰａｓｅ１）遺伝子と名付け、その配
列を配列表の配列番号３及び図９に示す。また、プライ
マー２より得た塩基配列をＰｓＮＴＰａｓｅ２（Ｐｉｓ
ｕｍｓａｔｉｖｕｍ由来ＮＴＰａｓｅ２）遺伝子と名
付け、その配列を配列表の配列番号４及び図１０に示
す。

【００３９】ＮＴＰａｓｅのホモログをコードする遺伝
子であるＰｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子、ＰｓＮＴＰａｓｅ
２遺伝子は、それぞれ１６９７、１６６７塩基から構成
されていた。両クローン間において翻訳領域には差が認
められなかったが、５’側と３’側の非翻訳領域の配列
及び長さの違いが認められた。両クローンにおいて共通
している翻訳領域は、４５５アミノ酸をコードしてい
た。ＰｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子とＰｓＮＴＰａｓｅ２遺
伝子において共通している、翻訳領域の塩基配列を配列
表の配列番号２に、推定アミノ酸配列を配列表の配列番
号１に、それぞれ示す。エンドウの核ＮＴＰａｓｅ（Ｎ
−ＮＴＰａｓｅ）との比較を行うと、アミノ酸レベルで
は９９％、塩基レベルでは９８％の相同性が認められた
が、３’側の非翻訳領域では複数の塩基が核ＮＴＰａｓ
ｅと異なっていた。この結果から、エンドウには複数の
ＮＴＰａｓｅ遺伝子が存在する可能性が示唆された。更
に、ＰｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子、ＰｓＮＴＰａｓｅ２遺
伝子に由来する推定アミノ酸配列をＰＲＯＳＩＴＥを用
いて解析すると、両クローンアミノ酸配列中には、複数
のリン酸化部位、２か所の糖鎖修飾部位、及びアミノ化
部位、脂質等の修飾を受けるミリスチル化部位、又、ジ
ャガイモのアピラーゼ（Ｓｔ−Ａｐｙｒａｓｅ）等でみ
られる共通保存配列（ａｐｙｒａｓｅｃｏｎｓｅｒｖ
ａｔｉｖｅｒｅｇｉｏｎ：ＡＣＲ１−４）を含んでい
た（図１１）。ＡＣＲの領域は、おそらくＡＴＰ、ＡＤ
Ｐ、ＮＴＰａｓｅの酵素活性に関連した保存配列である
と推定できる。また、生化学的に精製された蛋白質の分
子量は、約６０ｋＤａであるのに対し、得られたｃＤＮ
Ａのオープンリーディングフレームから予想される蛋白
質の分子量は約５０ｋＤａであった。この結果から、Ｐ
ｓＮＴＰａｓｅ１、ＰｓＮＴＰａｓｅ２は翻訳後に糖鎖
等の修飾を受けている可能性が示された。

【００４０】本発明の遺伝子の機能を確認するために、
ＰｓＮＴＰａｓｅ２遺伝子の、発現システムを構築し
た。即ち、ＰｓＮＴＰａｓｅ２遺伝子の翻訳領域の全長
を、大腸菌発現用ｐＥＴ−１６ｂベクターに挿入する事
を試みた。両端にＢａｍＨＩサイトを付加したプライマ
ーを調製し、定法どうりＰＣＲ反応（変性反応９４℃
［２分］で３０秒間、アニーリング５０℃で３０秒間、
伸長７２℃で３分間：３０サイクル）を行い、増幅ＤＮ
Ａ断片をＢａｍＨＩで３７℃で一晩消化した。消化した
サンプルを電気泳動した後、ＤＮＡ断片を消化した。センスプライマー：5-CGC GGA TCC GAC GGA GTT CCT TA
T TAA ACT-3 アンチセンスプライマー：5-CGC GGA TCC TTA AAC AAA
ATA CAT CAA TCG-3

【００４１】（ｐＥＴ−１６ｂベクターの調製）ｐＥＴ
−１６ｂベクターを挿入した大腸菌（ＤＨ５ａ）より調
製したｐＥＴ−１６ｂプラスミド（１０μｇ）をＢａｍ
ＨＩ消化（３７℃で３時間）、フェノール・クロロホル
ム・イソアミルアルコール（ＰＣＩ）処理、子牛小腸ア
ルカリホスファターゼ処理（３７℃で３０分、６５℃で
３０分）、更にＰＣＩ処理（２回）、子牛小腸アルカリ
ホスファターゼ処理を行った後、電気泳動によって切断
されたプラスミドのみを回収した。そのようにして調製
したベクター（１μｌ）、ＤＮＡ断片（９μｌ）、タカ
ラライゲーションキットｖｅｒ．２（１０μｌ）を混合
し、ブロックインキュベーター中で１６℃で３時間反応
し、ライゲーションを行った。このライゲーションサン
プルを、エタノール沈殿（７０％エタノール洗浄２
回）、滅菌水に懸濁後、コンピテントセル（大腸菌ＰＭ
１０９）にエレクトロポレーション法によって導入し
た。このセルをアンピシリンを添加したＬＢプレート上
で一晩静置したところ、４００個の形質転換コロニーが
得られた。

【００４２】（クローンの選抜）得られたクローンを、
アンピシリン含有ＬＢ液体培地（３０μｌ）を入れた９
６穴マイクロタイタープレート内で培養し（８時間〜一
晩）、菌体をローディングバッファーと混合し、０．８
％アガロースゲルにて電気泳動、インサートを含まない
プラスミドと比較して、移動度の低い擬陽性クローンを
選抜した。その結果、９６サンプル中１６サンプルの確
率で、擬陽性クローンが得られた。これら擬陽性クロー
ンの菌体を鋳型に、Ｔ７プロモーター＋Ｔ７ターミネー
ター、Ｔ７プロモーター＋ＮＴＰａｓｅＰｅｔ（ａ）プ
ライマーを用いてＰＣＲ反応（変性反応９４℃［５分、
１サイクル］で３０秒間、アニーリング５０℃で３０秒
間、伸長７２℃で３分間：３０サイクル）を行った後、
０．８％アガロースゲルにて電気泳動した。増幅ＤＮＡ
断片サイズ、及びインサートの方向性を確認した。その
結果、１２サンプル中２サンプルの確率で、陽性クロー
ンが得られた。

【００４３】これらの陽性クローンをアンピシリン含有
ＬＢ液体培地（２ｍｌ）で一晩培養し、定法によってプ
ラスミド調製を行った後、ＲＮＡ分解酵素処理（２時
間）後、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｎ
ｄｅＩ、ＸｈｏＩによって３時間消化した。０．８％ア
ガロースゲルにて電気泳動後、切り出されるＤＮＡ断片
のサイズからインサートのサイズ及び方向性を確認し
た。その結果、２サンプル中２サンプルの確率で、陽性
クローンが得られた。そのようにして得られた陽性クロ
ーンについて、Ｔ７プロモーター及びターミネータープ
ライマーを用いてシークエンス解析を行い、クローニン
グサイトの配列及びインサートの配列をチェックした。
その結果、２サンプル中２サンプルの確率で、陽性クロ
ーンが得られ、ＮＴＰａｓｅの翻訳領域を確認した。

【００４４】（蛋白質の発現誘導）上記の方法によりで
得られた陽性クローンより得たプラスミド（１μｇ）に
ついて、コンピテントセル（ＢＬ２１（ＤＥ３））に、
ヒートショック法によって形質転換し、アンピシリン含
有ＬＢプレート上で一晩静置した。その結果、約４００
個のコロニーが得られた。この様にして得られたコロニ
ーを５つピックアップし、アンピシリン含有ＬＢプレー
ト上で培養し、マスタープレートを作成した。同時にア
ンピシリン含有ＬＢ液体培地（２ｍｌ）で培養し、ＯＤ
６００が０．６程度になるまで培養し、培養液の一部
（２００μｌ）をエッペンドルフチューブ中で氷上で保
存した（誘導前サンプル）。残りの培養液にを最終濃度
１ｍＭになるように添加し、蛋白質の発現を誘導した。
３時間培養後、培養液の一部（２００μｌ）をエッペン
ドルフチューブに移し、氷上で５分静置後、誘導前サン
プルと同時に遠心分離（１００００ｒｐｍ、５分）後、
大腸菌懸濁バッファーに懸濁し、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにより分画する事により、融合蛋白質の発現を確認
した。

【００４５】（融合蛋白質の精製）融合蛋白質の発現が
認められたクローンについて、アンピシリン含有液体培
地（２ｍｌ）で一晩培養し、アンピシリン液体培地（１
００ｍｌ）のラージスケールで培養した。ＯＤ６００が
０．６程度になるまで培養し、培養液にを添加して（最
終濃度１ｍＭ）、蛋白質の発現を誘導した。大腸菌を遠
心分離によって回収し、５ｍｌのＢＥ−ＰＣＲで懸濁
し、１０分間震盪した後、遠心分離によって可溶性画分
（上清）、及び不溶性画分（沈殿）を得た。得られた可
溶性画分を、ニッケルカラム（クイックカラム）を用い
て精製した。ニッケルカラムを結合バッファーで洗浄
（１５ｍｌ：５ｍｌ／ｍｉｎ）後、溶出バッファー（１
０ｍｌ：自然落下）によって融合蛋白質の溶出を行う。
サンプルは１ｍｌ毎に分取し、蛋白質の存在する画分
（蛋白質量の定量）について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て精製度を確認した。その結果、融合蛋白質に由来す
る、５０ｋＤａのメジャーな蛋白質が確認された（図１
２）。

【００４６】（ビオチン化エリシター及びサプレッサー
との結合実験）融合蛋白質と、ビオチン化エリシター及
びビオチン化サプレッサーとの結合を検討した。精製し
た融合蛋白質と、ビオチン化合成エリシター（Ｎｏ．
４）あるいはビオチン化サプレッサー（サプレッシンＡ
Ｂを含有する部分精製標品）とを混合した後、２５℃で
５分間インキュベートし、ＵＶランプ（３６０ｎｍ）を
５分間照射し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。その後ＰＶＤ
Ｆ膜にブロットした後、ホースラディッシュパーオキシ
ダーゼ結合アビジンと反応させる事により、ビオチン化
エリシターと結合した蛋白質を、ホースラディッシュパ
ーオキシダーゼの発色試薬により検出した（図１３）。
使用したエリシターの濃度は２、１０、２０、４０μＭ
であり、又、使用したサプレッサーの濃度は１、１０、
２０、４０μｇ／ｍｌである。エリシターとの結合の結
果を結果を図１３左に、サプレッサーとの結合の結果を
図１３右に示す。図１３より、ビオチン化エリシター及
びビオチン化サプレッサーの濃度に依存したシグナル強
度の上昇が認められ、精製した融合蛋白質とエリシター
及びサプレッサーの結合が認められた。

【００４７】融合蛋白質とエリシター及びサプレッサー
の結合を確認するために、非ラベル化エリシター及び非
ラベル化サプレッサーを用いて拮抗実験を行った（図１
４）。即ち、２０μＭのビオチン化エリシターの存在下
における褐紋病菌エリシター（褐紋病菌由来の高分子糖
蛋白エリシター：非ラベル化エリシター）の影響を検討
したところ、非ラベル化エリシターの存在によりシグナ
ル強度が低下した（図１４左）。また、１０μｇ／ｍｌ
のビオチン化サプレッサーの存在下における褐紋病菌エ
リシター（非ラベル化エリシター）の影響を検討したと
ころ、非ラベル化エリシターの存在によりシグナル強度
が、やはり低下した（図１４右）。これらの結果は、精
製した融合蛋白質と、エリシター及びサプレッサーとの
結合を支持するものである。

【００４８】（融合蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性の測定）
融合蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性を検討した。尚、２μｇ
の蛋白質を用いて、定法（ＰｅｒｌｉｎａｎｄＳｐ
ａｎｓｗｉｃｋ法）により、アッセイを行った。３ｍＭ
の基質、３ｍＭのＭｇＳＯ₄ 、２μｇの蛋白質、３０ｍ
ＭＴｒｉｓ／ＭＥＳバッファー（ｐＨ６．５）より成る
２５μｌの反応液を調製し、２５℃で２０分間インキュ
ベートした後、０．４２％モリブデン酸アンモニウムと
１０％アスコルビン酸を５：１に混合した溶液５０μｌ
を加え、２５℃で５分間インキュベートした後、８２０
ｎｍの吸光度で活性を測定した。融合蛋白質の蛋白質量
と、ＡＴＰａｓｅ活性の関係とを検討したところ（図１
５）、蛋白質量に依存したＡＴＰａｓｅ活性が認められ
た。

【００４９】更に、融合蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性に及
ぼす、エリシター（褐紋病菌由来の高分子糖蛋白エリシ
ター）又はサプレッサー（サプレッシンＡＢを含有する
部分精製標品）の影響を検討した（図１６）。エリシタ
ー又はサプレッサーを添加しない場合（ＷＣ）のＡＴＰ
ａｓｅ活性と比較して、１００ｐｐｍのエリシター存在
下（Ｅ）においてＡＴＰａｓｅ活性は上昇したが、１０
０ｐｐｍのサプレッサー存在下（Ｓ）においてＡＴＰａ
ｓｅ活性はほぼ消失した。１００ｐｐｍのエリシターと
１００ｐｐｍのサプレッサーの共存下（Ｅ＋Ｓ）におい
ては、部分的なＡＴＰａｓｅ活性が認められた。更に、
エリシター濃度及びサプレッサー濃度を変えて検討を行
った（図１７）。０、１０、５０、１００、２００μｇ
／ｍｌのエリシター、又は０、１０、５０、１００、２
００μｇ／ｍｌのサプレッサーを用いて検討したとこ
ろ、ＡＴＰａｓｅ活性はエリシターの濃度に依存して活
性化され、１００μｇ／ｍｌのエリシターで最大に達し
た（図１７黒丸：Ｅ）。一方サプレッサーは濃度依存的
にＡＴＰａｓｅ活性を阻害し、２００μｇ／ｍｌのサプ
レッサーでは、ＡＴＰａｓｅ活性は１００％阻害された
（図１７白丸：Ｓ）。対象区として誘導前の大腸菌可溶
化画分のＡＴＰａｓｅ活性を調べたところ、１００μｇ
／ｍｌのエリシターで活性化されず、また、１００μｇ
／ｍｌのサプレッサーでも阻害されなかった。

【００５０】（融合蛋白質の酵素活性の諸性質）また、
３ｍＭのアデノシントリホスフェイト（ＡＴＰ）、シチ
ジントリホスフェイト（ＣＴＰ）、グアノシントリホス
フェイト（ＧＴＰ）、ウリジントリホスフェイト（ＵＴ
Ｐ）、パラニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）、ピロリ
ン酸（ＰＰｉ）を用いて基質特異性を検討した、その結
果、基質としての使用されやすさは、ＣＴＰ＞ＵＴＰ＞
ＡＴＰ＞ＧＴＰ＞ＰＰｉ＞ｐＮＰＰの順番であり（図１
８）、得られた酵素はＡＴＰａｓｅというより、より基
質の幅が広いＮＴＰａｓｅである事が示された。尚、ア
ミノ酸配列が類似するエンドウ核ＡＴＰａｓｅの基質特
異性は、ＡＴＰ＞ＵＴＰ＞ＣＴＰ＞ＧＴＰの順番であ
り、細胞膜ＡＴＰａｓｅと比較して基質特異性が異なっ
ている。

【００５１】融合蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性に及ぼす、
各種阻害剤の影響を検討した。１ｍＭのオルトバナジン
酸（ＶＯ４）、５０ｍＭの硝酸ナトリウム（ＮＯ３）、
１ｍＭのアジ化ナトリウム（Ｎ３）、５μｇ／ｍｌのク
エルセチン（Ｑｃ）の存在下における、２μｇの融合蛋
白質のＡＴＰａｓｅ活性を測定したところ、阻害剤の非
存在下（ＷＣ）と比較して、オルトバナジン酸により酵
素活性は強く阻害されたが、硝酸ナトリウム、アジ化ナ
トリウム、クエルセチンでは全く阻害されなかった（図
１９）。エンドウ核ＡＴＰａｓｅはクエルセチンにより
強く阻害されるが、バナジン酸によっては阻害されない
事、また、同じく配列が類似するジャガイモアピラーゼ
（Ｓｔ−ａｐｙｒａｓｅ）はアジ化ナトリウムによって
強く阻害される事、が知られているが、それらとの違い
が認められた。更に、３ｍＭのマグネシウムイオン（Ｍ
ｇ²⁺）、マンガンイオン（Ｍｎ²⁺）、カルシウムイオン
（Ｃａ²⁺）を用いて融合蛋白質の二価イオン要求性を検
討したところ、これら二価イオンの存在下で融合蛋白質
のＡＴＰａｓｅ活性は促進され、促進作用の強度は、マ
グネシウムイオン＞マンガンイオン＞カルシウムイオン
の順番であった（図２０）。

【００５２】

【発明の効果】本発明により、エンドウ由来の植物細胞
壁ＮＴＰａｓｅ、及び当該酵素をコードする遺伝子であ
るＰｓＮＴＰａｓｅ−１遺伝子及びＰｓＮＴＰａｓｅ−
２遺伝子が与えられた。細胞壁ＮＴＰａｓｅは植物の防
御系の情報伝達に深く関与する酵素であると共に、病原
菌のエリシター及びサプレッサーと結合する事から、本
発明の遺伝子を植物に導入する事により、植物に病害抵
抗性を付与する事が可能である。

【００５３】

【配列表】＜１１０＞出願人氏名：京都大学長＜１２０＞発明の名称：病害抵抗性ポリペプチド、病害抵抗性遺伝子、植物に病害抵抗性を付与する方法、病害抵抗性を付与した形質転換植物、ヌクレオチドトリホスフェイト分解酵素＜１６０＞配列の数：４＜２１０＞配列番号：１＜２１１＞配列の長さ：４５５＜２１２＞配列の型：アミノ酸＜２１３＞起源：ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｍｉｄｏｒｉｕｓｕｉ黄化子苗＜４００＞配列 MEFLIKLITF LLFSMPAITS SQYLGNNLLT SRKIFLKQEE ISSYAVVFDA GSTGSRIHVY 60 HFNQNLDLLH IGKGVEYYNK ITPGLSSYAN NPEQAAKSLI PLLEQAEDVV PDDLQPKTPV 120 RLGATAGLRL LNGDASEKIL QSVRDMLSNR STFNVQPDAV SIIDGTQEGS YLWVTVNYAL 180 GNLGKKYTKT VGVIDLGGGS VQMAYAVSKK TAKNAPKVAD GDDPYIKKVV LKGIPYDLYV 240 HSYLHFGREA SRAEILKLTP RSPNPCLLAG FNGIYTYSGR RFKATAYTSG ANFNKCKNTI 300 RKALKLNYPC PYQNCTFGGI WNGGGGNGQK NLFASSSFFY LPEDTGMVDA STPNFILRPV 360 DIETKAKEAC ALNFEDAKST YPFLDKKNVA SYVCMDLIYQ YVLLVDGFGL DPLQKITSGK 420 EIEYQDAIVE AAWPLGNAVE AISALPKFER LMYFV 455 ＜２１０＞配列番号：２＜２１１＞配列の長さ：１３６８＜２１２＞配列の型：核酸＜２１３＞起源：ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｍｉｄｏｒｉｕｓｕｉ黄化子苗＜４００＞配列 ATGGAGTTCC TTATTAAACT TATCACTTTT CTACTATTTT CTATGCCTGC AATCACTTCC 60 TCCCAATACT TAGGAAACAA CCTACTCACC AGTAGAAAGA TTTTCCTAAA ACAAGAGGAA 120 ATTTCCTCTT ACGCTGTAGT ATTCGATGCC GGTAGCACTG GTAGTCGCAT TCATGTTTAC 180 CATTTTAACC AGAACTTAGA CCTTCTTCAT ATTGGCAAAG GTGTCGAGTA TTATAATAAG 240 ATAACACCTG GTTTGAGTTC ATACGCTAAT AATCCAGAAC AGGCTGCAAA ATCTCTCATT 300 CCACTTTTAG AGCAAGCAGA AGATGTCGTC CCCGACGATC TTCAACCCAA GACACCCGTT 360 AGACTTGGGG CAACTGCCGG TTTAAGGCTT TTGAATGGAG ATGCTTCTGA AAAGATATTG 420 CAATCGGTAA GGGATATGCT GAGCAACAGA AGTACCTTCA ACGTTCAACC AGACGCAGTT 480 TCTATAATTG ATGGAACCCA AGAAGGTTCT TATCTATGGG TGACAGTTAA CTATGCATTG 540 GGAAATTTAG GGAAAAAGTA CACAAAAACA GTTGGAGTAA TAGATCTTGG AGGTGGATCA 600 GTTCAAATGG CGTATGCAGT ATCAAAGAAA ACTGCTAAAA ATGCTCCAAA AGTTGCAGAT 660 GGAGATGATC CATACATCAA GAAGGTTGTA CTCAAGGGAA TACCATATGA TCTTTATGTT 720 CACAGTTACT TACACTTTGG TAGAGAAGCA TCTCGAGCCG AGATTTTGAA GCTCACTCCT 780 CGTTCTCCTA ACCCTTGCCT TTTAGCTGGA TTTAATGGAA TCTATACATA TTCAGGGAGA 840 AGATTTAAGG CAACTGCTTA CACTTCTGGT GCAAACTTTA ATAAATGCAA AAACACAATT 900 CGTAAGGCTC TTAAGTTGAA CTATCCATGT CCATATCAGA ATTGCACTTT TGGTGGAATT 960 TGGAATGGTG GAGGAGGAAA TGGACAGAAA AACCTTTTTG CTTCTTCATC TTTCTTTTAC 1020 CTACCTGAAG ATACCGGTAT GGTTGATGCA AGCACACCTA ATTTCATACT TCGGCCGGTC 1080 GATATTGAGA CTAAAGCTAA AGAAGCTTGC GCGTTAAACT TCGAGGATGC GAAATCTACT 1140 TATCCATTTC TTGATAAGAA AAATGTAGCT TCATATGTAT GCATGGATCT TATATATCAG 1200 TATGTGTTAC TCGTTGATGG ATTTGGTCTT GATCCATTGC AAAAGATTAC ATCAGGGAAG 1260 GAAATTGAAT ACCAAGATGC TATTGTGGAA GCTGCATGGC CTCTAGGCAA TGCTGTAGAA 1320 GCCATATCAG CTTTACCTAA ATTTGAGCGA TTGATGTATT TTGTTTAA 1368 ＜２１０＞配列番号：３＜２１１＞配列の長さ：１６９７＜２１２＞配列の型：核酸＜２１３＞起源：ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｍｉｄｏｒｉｕｓｕｉ黄化子苗＜４００＞配列 CTCTAAATTG TTTACCCTAC ACAAATGGAG TTCCTTATTA AACTTATCAC TTTTCTACTA 60 TTTTCTATGC CTGCAATCAC TTCCTCCCAA TACTTAGGAA ACAACCTACT CACCAGTAGA 120 AAGATTTTCC TAAAACAAGA GGAAATTTCC TCTTACGCTG TAGTATTCGA TGCCGGTAGC 180 ACTGGTAGTC GCATTCATGT TTACCATTTT AACCAGAACT TAGACCTTCT TCATATTGGC 240 AAAGGTGTCG AGTATTATAA TAAGATAACA CCTGGTTTGA GTTCATACGC TAATAATCCA 300 GAACAGGCTG CAAAATCTCT CATTCCACTT TTAGAGCAAG CAGAAGATGT CGTCCCCGAC 360 GATCTTCAAC CCAAGACACC CGTTAGACTT GGGGCAACTG CCGGTTTAAG GCTTTTGAAT 420 GGAGATGCTT CTGAAAAGAT ATTGCAATCG GTAAGGGATA TGCTGAGCAA CAGAAGTACC 480 TTCAACGTTC AACCAGACGC AGTTTCTATA ATTGATGGAA CCCAAGAAGG TTCTTATCTA 540 TGGGTGACAG TTAACTATGC ATTGGGAAAT TTAGGGAAAA AGTACACAAA AACAGTTGGA 600 GTAATAGATC TTGGAGGTGG ATCAGTTCAA ATGGCGTATG CAGTATCAAA GAAAACTGCT 660 AAAAATGCTC CAAAAGTTGC AGATGGAGAT GATCCATACA TCAAGAAGGT TGTACTCAAG 720 GGAATACCAT ATGATCTTTA TGTTCACAGT TACTTACACT TTGGTAGAGA AGCATCTCGA 780 GCCGAGATTT TGAAGCTCAC TCCTCGTTCT CCTAACCCTT GCCTTTTAGC TGGATTTAAT 840 GGAATCTATA CATATTCAGG GAGAAGATTT AAGGCAACTG CTTACACTTC TGGTGCAAAC 900 TTTAATAAAT GCAAAAACAC AATTCGTAAG GCTCTTAAGT TGAACTATCC ATGTCCATAT 960 CAGAATTGCA CTTTTGGTGG AATTTGGAAT GGTGGAGGAG GAAATGGACA GAAAAACCTT 1020 TTTGCTTCTT CATCTTTCTT TTACCTACCT GAAGATACCG GTATGGTTGA TGCAAGCACA 1080 CCTAATTTCA TACTTCGGCC GGTCGATATT GAGACTAAAG CTAAAGAAGC TTGCGCGTTA 1140 AACTTCGAGG ATGCGAAATC TACTTATCCA TTTCTTGATA AGAAAAATGT AGCTTCATAT 1200 GTATGCATGG ATCTTATATA TCAGTATGTG TTACTCGTTG ATGGATTTGG TCTTGATCCA 1260 TTGCAAAAGA TTACATCAGG GAAGGAAATT GAATACCAAG ATGCTATTGT GGAAGCTGCA 1320 TGGCCTCTAG GCAATGCTGT AGAAGCCATA TCAGCTTTAC CTAAATTTGA GCGATTGATG 1380 TATTTTGTTT AAGTTTCTTA GATATAGTAA TAAGATCAAC TCATCAAATA AAAATTTCAG 1440 TTGACCCTAG TTTTTATAGG GAGAAGTTTT GCCTTCTCTC TATCTCATTC CTCCCTTCTT 1500 TCTCACCATC AAAGAAAGAT GATTTTTTGG TCTTTTTGAT CTGAAATCAT CTATCATCTA 1560 CATCTTTTTT TATTTTAATA ATGTTGAATT TGTGTTGTTT CTATCAATTT AAATTAATGA 1620 ATGTTTTTTT AGTAAAAAAA TAATATTTCA TCTGTTTCAT AATAATTGTC ATATTTAAAA 1680 ATAAAAAAAA AAAAAAA 1697 ＜２１０＞配列番号：４＜２１１＞配列の長さ：１６６７＜２１２＞配列の型：核酸＜２１３＞起源：ＰｉｓｕｍｓａｔｉｖｕｍＬ．ｃｖ．Ｍｉｄｏｒｉｕｓｕｉ黄化子苗＜４００＞配列 CTGGAGCTAC CTAGTTTCTC TAAATTGTTT ACCCTACACA AATGGAGTTC CTTATTAAAC 60 TTATCACTTT TCTACTATTT TCTATGCCTG CAATCACTTC CTCCCAATAC TTAGGAAACA 120 ACCTACTCAC CAGTAGAAAG ATTTTCCTAA AACAAGAGGA AATTTCCTCT TACGCTGTCG 180 TATTCGATGC TGGTAGCACT GGTAGTCGCA TTCATGTTTA CCATTTTAAC CAGAACTTAG 240 ACCTTCTTCA TATTGGCAAA GGTGTCGAGT ATTATAATAA GATAACACCT GGTTTGAGTT 300 CATACGCTAA TAATCCAGAA CAGGCTGCAA AATCTCTCAT TCCACTTTTA GAGCAAGCAG 360 AAGATGTCGT CCCCGACGAT CTTCAACCCA AGACACCCGT TAGACTTGGG GCAACTGCCG 420 GTTTAAGGCT TTTGAATGGA GATGCTTCTG AAAAGATATT GCAATCGGTA AGGGATATGC 480 TGAGCAACAG AAGTACCTTC AACGTTCAAC CAGACGCAGT TTCTATAATT GATGGAACCC 540 AAGAAGGTTC TTATCTATGG GTGACAGTTA ACTATGCATT GGGAAATTTA GGGAAAAAGT 600 ACACAAAAAC AGTTGGAGTA ATAGATCTTG GAGGTGGATC AGTTCAAATG GCGTATGCAG 660 TATCAAAGAA AACTGCTAAA AATGCTCCAA AAGTTGCAGA TGGAGATGAT CCATACATCA 720 AGAAGGTTGT ACTCAAGGGA ATACCATATG ATCTTTATGT TCACAGTTAC TTACACTTTG 780 GTAGAGAAGC ATCTCGAGCC GAGATTTTGA AGCTCACTCC TCGTTCTCCT AACCCTTGCC 840 TTTTAGCTGG ATTTAATGGA ATCTATACAT ATTCAGGCAG AAGATTTAAG GCAACTGCTT 900 ACACTTCTGG TGCAAACTTT AATAAATGCA AAAACACAAT TCGTAAGGCT CTTAAGTTGA 960 ACTATCCATG TCCATATCAG AATTGCACTT TTGGTGGAAT TTGGAATGGT GGAGGAGGAA 1020 ATGGACAGAA AAACCTTTTT GCTTCTTCAT CTTTCTTTTA CCTACCTGAA GATACCGGTA 1080 TGGTTGATGC AAGCACACCT AATTTCATAC TTCGGCCGGT CGATATTGAG ACTAAAGCTA 1140 AAGAAGCTTG CGCGTTAAAC TTCGAGGATG CGAAATCTAC TTATCCATTT CTTGATAAGA 1200 AAAATGTAGC TTCATATGTA TGCATGGATC TTATATATCA GTATGTGTTA CTCGTTGATG 1260 GATTTGGTCT TGATCCATTG CAAAAGATTA CATCAGGGAA GGAAATTGAA TACCAAGATG 1320 CTATTGTGGA AGCTGCATGG CCTCTAGGCA ATGCTGTAGA AGCCATATCA GCTTTACCTA 1380 AATTTGAGCG ATTGATGTAT TTTGTTTAAG TTTCTTAGAT ATAGTAATAA GATCAACTCA 1440 TCAAATAAAA ATTTCAGTTG ACCCTAGTTT TTAGAGGGAG AAGTTTTGCC TTCTCTCTAT 1500 CTCATTCCTC CCTTCTTTCT CACCATCAAA GAAAGATGAT TTTTTGGTCT TTTTGATCTG 1560 AAATCATCTA TCATCTACAT CTTTTTTTAT TTTAATAATG TTGAATTTGT GTTGTTTCTA 1620 TCAATTTAAA TTAATGAATG TTTTTTTAGT AAAAAAAAAA AAAAAAA 1667

【図面の簡単な説明】

【図１】非病原菌の接触で拒絶反応が誘導される場合
に、植物細胞で起こる情報伝達の機構を示した図であ
る。

【図２】病原菌の接触で感染が誘導される場合に、植
物細胞で起こる情報伝達の機構を示した図である。

【図３】エンドウ細胞壁より精製した細胞壁ＡＴＰａ
ｓｅをＮａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥで分離して、銀染色、Ａ
ＴＰａｓｅ活性染色、ペルオキシダーゼ活性染色を行っ
た結果を示す写真である。

【図４】エンドウ細胞壁より精製した細胞壁ＡＴＰａ
ｓｅをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離して、銀染色、抗ペルオ
キシダーゼ抗体を用いたイムノブロッティング、ＡＴＰ
ａｓｅの検出、抗ＡＴＰａｓｅ抗体を用いたイムノブロ
ッティングを行った結果を示す写真である。

【図５】褐紋病菌由来の高分子糖蛋白質エリシターの
化学構造を示す図である。

【図６】合成エリシターＮｏ．４の化学構造を示す図
である。

【図７】サプレッシンＡ及びサプレッシンＢの化学構
造を示す図である。

【図８】、エンドウ細胞壁より精製した細胞壁ＡＴＰａ
ｓｅと、ビオチン化アゴニスト（エリシター、サプレッ
サー）との結合を示す写真である。

【図９】ＰｓＮＴＰａｓｅ１遺伝子の塩基配列及び遺
伝子がコードする推定アミノ酸配列を示す図である。

【図１０】ＰｓＮＴＰａｓｅ２遺伝子の塩基配列及び
遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を示す図である。

【図１１】ＰｓＮＴＰａｓｅ１、ＰｓＮＴＰａｓｅ
２、核ＮＴＰａｓｅ及びジャガイモアピラーゼの推定ア
ミノ酸配列を比較した図である。

【図１２】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出を行った結果を
示す写真である。

【図１３】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質と、ビオチン化アゴニスト（エリシター、サプレ
ッサー）との結合を示す写真である。

【図１４】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質と、ビオチン化アゴニスト（エリシター、サプレ
ッサー）との結合の、非ラベル化アゴニストによる阻害
を示す写真である。

【図１５】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質の蛋白量と、ＡＴＰａｓｅ活性との関係を示すグ
ラフである。

【図１６】エリシター及びサプレッサーが及ぼす影響
を示すグラフである。

【図１７】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性に対して、エリシター及びサ
プレッサーが及ぼす影響の濃度依存性を示すグラフであ
る。

【図１８】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質の酵素活性の、基質依存性を示すグラフである。

【図１９】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性に対して、種々の阻害剤が及
ぼす影響を示すグラフである。

【図２０】ＰｓＮＴＰａｓｅ遺伝子より得られた融合
蛋白質のＡＴＰａｓｅ活性に対して、種々の二価イオン
が及ぼす影響を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続きＦターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB03 CD02 CD03 CD07 CD09 CD10 4B024 AA08 BA11 CA04 CA11 DA06 EA04 FA02 FA07 GA14 GA19 4B050 CC01 CC03 DD13 FF04E FF05E FF11E FF12E FF14E LL10 4H045 AA10 BA10 CA33 DA89 EA05 GA01 GA06 GA10 GA23 GA26 HA05 HA06

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】エンドウ黄化子苗に由来し、以下の
（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列からなることを
特徴とする、ポリペプチド。（ａ）配列表の配列番号１に示す、アミノ酸番号１−４
５５で示されるアミノ酸配列からなることを特徴とす
る、ポリペプチド。（ｂ）ヌクレオチドトリホスフェイト分解作用を有し、
（ａ）の一部が欠失、置換若しくは付加された、ポリペ
プチド。
【請求項２】請求項１記載のポリペプチドをコードす
る、遺伝子。
【請求項３】請求項１記載のポリペプチドをコード
し、配列表の配列番号２に示す、塩基番号１−１３６８
で示される塩基配列からなることを特徴とし、エンドウ
黄化子苗に由来する、遺伝子。
【請求項４】以下の（ｃ）または（ｄ）に示す塩基配
列からなることを特徴とし、エンドウ黄化子苗に由来す
る、遺伝子。（ｃ）配列表の配列番号３に示す、塩基番号１−１６９
７で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
子。（ｄ）請求項１記載のポリペプチドをコードし、（ｃ）
の一部が欠失、置換若しくは付加された、遺伝子。
【請求項５】以下の（ｅ）または（ｆ）に示す塩基配
列からなることを特徴とし、エンドウ黄化子苗に由来す
る、遺伝子。（ｅ）配列表の配列番号４に示す、塩基番号１−１６６
７で示される塩基配列からなることを特徴とする、遺伝
子。（ｆ）請求項１記載のポリペプチドをコードして、
（ｅ）の一部が欠失、置換若しくは付加された、遺伝
子。
【請求項６】請求項２ないし５のいずれか一つの請求
項記載の遺伝子を植物に導入することにより、植物に病
害抵抗性を付与する方法。
【請求項７】請求項２ないし５のいずれか一つの請求
項記載の遺伝子を植物に導入することにより、植物に病
害抵抗性を付与した、形質転換植物。
【請求項８】下記の性質を有する細胞壁ヌクレオチド
トリホスフェイト分解酵素：（１）ヌクレオチドトリホスフェイトを基質として、当
該基質を分解する反応を触媒し；（２）褐紋病菌のエリシター及びサプレッサーと結合活
性を有し；（３）分子量約５０ｋＤａのタンパク質であり；（４）オルトバナジン酸の存在下において酵素活性が抑
制されるが、クエルセチン、硝酸ナトリウム、アジ化ナ
トリウムの存在下において酵素活性が抑制されず；（５）マンガン、マグネシウム、カルシウムイオンの存
在下において酵素活性が促進される。