TWI767251B - 含有外源誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）與內源誘導因子之植物活力劑及其使用 - Google Patents

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Abstract

控制／強化植物的生理學過程，改善農作物的活力、產量、品質及收穫後之保存性。 將植物活力劑應用於植物，該植物活力劑之特徵為包含外源誘導因子及內源誘導因子。

Description

含有外源誘導因子（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）與內源誘導因子之植物活力劑及其使用
本發明係關於含有外源誘導因子與內源誘導因子之植物活力劑，及使用該植物活力劑之植物的栽培／生產方法。
植物會因日照時間、氣溫及降雨量等非生物性壓力，以及病害蟲等生物性壓力而收穫量減少。特定而言，為了使農業作物的收穫量增加，迄今為止，已使用各種肥料及農藥。肥料為植物的生長所需之營養源，但不具有緩和壓力之機能。農藥係直接驅除寄生於植物中之病害蟲，排除生物性壓力，但在使用農藥之情況，儘管安全性經充分確認，但過量攝取所引發之對人體或環境之影響卻令人擔心，特定而言，藉由化學合成法所製造之農藥等藥劑亦有一旦進行散佈便長期殘存於土壤中等之疑慮，若可能的話，期望藉由其他方法賦予對於生物壓力之耐性。由此，近年來，除了此等以外，作為對人體、對環境皆安全的物質，生物刺激素(biostimulant)的利用亦受到矚目。
「生物刺激素」亦稱為「生物刺激劑」或「植物活力劑」等，其係指含有任意的物質群／微生物，在施用於植物體或其根系之情況，藉由刺激在自然狀態的作物體內亦會發生之一連串過程，而使養分吸收提升，或提高施肥效率，可賦予壓力耐性，使品質提升之物，其對病害蟲不會顯示出直接的作用，因此，並未被分類成任何殺蟲／殺菌劑。即，其係指屬於存在於自然界中之成分(包含微生物)，雖然並非植物激素或營養分，但即便是極少量亦會刺激植物的活力，促進生長發育之物質。一般認為藉由將生物刺激素施用於植物，便會提高植物的養分吸收及養分利用率，促進生長發育，農作物的產量及品質變得良好。在農業用生物刺激素中，包含為了控制／強化作物的生理學過程而施用於植物或土壤之化合物、物質及其他製品等多種多樣的製劑。生物刺激素係通過與營養素不同的路徑而作用於植物生理，以便改善作物的活力、產量、品質及收穫後之保存性。 如此，藉由生物刺激素，便可在不會產生以往的農藥或肥料所引發之問題之情形下，刺激植物原本所具有之能力而促進其成長。
作為與此種生物刺激素相關者，迄今為止，已報導將幾丁寡糖(chitin oligosaccharide)及具有抗菌活性之幾丁聚糖(chitosan)等進行組合而得之植物活力劑(專利文獻1)；在食用醋中摻合寡醣類及植物萃取成分而得之植物活力劑(專利文獻2)；包含纖維素之植物成長促進劑(專利文獻3)；包含六呋喃糖衍生物之植物生長調節劑(專利文獻4)；使用經低分子化之幾丁質(chitin)或幾丁聚糖來提高植物的耐病性之方法(專利文獻5)；以及包含幾丁質及／或幾丁聚糖等之肥料(專利文獻6)。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開平9-143013號公報 [專利文獻2]日本專利特開2001-64112號公報 [專利文獻3]日本專利特開2002-114610號公報 [專利文獻4]日本專利特開2013-151438號公報 [專利文獻5]日本專利特開2015-48436號公報 [專利文獻6]日本專利特開2017-95352號公報 [專利文獻7]國際公開第2017／104687號
[發明欲解決之課題]
本發明欲解決之課題係在於控制／強化植物的生理學過程，改善農作物的活力、產量、品質及收穫後之保存性。 [解決課題之手段]
本案發明者等人為了解決上述課題而致力檢討，反覆實驗之結果，發現外源誘導因子及內源誘導因子之組合會促進植物的成長且使植物的誘導因子活性增大之令人驚訝的見解，遂完成本發明。
本發明係如下。 [1] 一種植物活力劑，其特徵為包含外源誘導因子及內源誘導因子。 [2] 如1所記載之植物活力劑，其中，前述外源誘導因子為幾丁寡糖，前述內源誘導因子為選自纖維寡糖及木寡糖之至少1種寡醣。 [3] 如1或2所記載之植物活力劑，其中，前述植物活力劑中之前述外源誘導因子及前述內源誘導因子之合計含量為0.05～10質量%。 [4] 如1～3中任一項所記載之植物活力劑，其中，前述植物活力劑中之前述外源誘導因子相對於前述內源誘導因子之質量比為0.2～5。 [5] 如1～4中任一項所記載之植物活力劑，其包含木寡糖作為前述內源誘導因子。 [6] 如5所記載之植物活力劑，其包含纖維寡糖及木寡糖兩者作為前述內源誘導因子。 [7] 如6所記載之植物活力劑，其中，前述植物活力劑中之前述纖維寡糖相對於前述木寡糖之質量比為0.2～5。 [8] 如1～7中任一項所記載之植物活力劑，其進一步包含展開劑。 [9] 一種植物栽培方法，其包含將1～8中任一項所記載之植物活力劑應用於植物。 [10] 如9所記載之方法，其包含將前述植物活力劑以前述外源誘導因子及前述內源誘導因子之合計含量成為0.1～500質量ppm之濃度應用於植物。 [11] 如9或10所記載之方法，其中，前述植物活力劑對植物之應用係藉由葉面散佈來施行。 [12] 一種相較於未應用1～8中任一項所記載之植物活力劑之情況而言，具有增大的誘導因子活性之植物或其一部分之生產方法，其包含藉由9～11中任一項所記載之方法來栽培植物。 [13] 如12所記載之方法，其中，前述誘導因子活性係藉由測定植物中之聚葡萄糖酶產生量來決定。 [14] 一種肥料組成物，其含有1～8中任一項所記載之植物活力劑。 [發明效果]
根據本發明，能夠在不會產生以往的農藥或肥料所引發之對人體或環境之影響之類的問題之情形下，控制／強化植物的生理學過程，改善農作物的活力、產量、品質及收穫後之保存性。
在本發明之第一態樣中，係提供一種植物活力劑，其特徵為包含外源誘導因子及內源誘導因子。 本發明涉及之「植物活力劑」不僅包含具有與植物的生長發育有關之溫度、光、水及鹽等非生物性壓力的緩和作用者，亦包含具有病害蟲等生物性壓力的緩和作用者。
誘導因子為於高等植物的組織或培養細胞誘導出生體防禦反應之物質的總稱，其在植物的免疫機制中誘導出病害抵抗性。植物係以存在於葉面等之受體來感知誘導因子，啟動病原抵抗反應。藉此，對各種病原菌起到分泌各種化合物之生體防禦作用(免疫)。一般認為若誘導因子作用於植物，則會誘導出植物防禦素(phytoalexin)或感染特異性蛋白質的合成／蓄積、活性氧生成、活性氮生成、過敏感反應性細胞死亡、基因表現變化等防禦反應，藉由此等反應，植物從病原菌中保護自身，提高耐病性。 植物防禦素為藉由誘導因子的作用而在植物體內合成、蓄積之抗菌性化合物，按植物種，所生產之抗菌性化合物有所不同。作為代表性植物防禦素，可列舉類黃酮、類萜(terpenoid)、脂肪酸衍生物等。活性氧擁有殺死病原微生物之作用，再者，活性氧及活性氮係單獨或協調地作為啟動各式各樣的防禦反應之訊息而產生機能。此種誘導因子效果所引發之病害抵抗性係針對於廣泛的病害使抵抗性增強等，因而在農業利用上受到期待。
在本案說明書中，所謂「外源誘導因子」，係意味源自植物以外之生物之物質，例如源自真菌、昆蟲、甲殼類之成分的誘導因子，在具有誘導因子效果之前提下，並無特別限制，典型地為幾丁質、幾丁聚糖及該等之寡醣、源自於昆蟲之多種多樣的生體分子等。 本發明涉及之植物活力劑較佳係包含幾丁寡糖作為外源誘導因子。
幾丁寡糖包含一部分經去乙醯基化之幾丁聚寡糖(chitosan oligosaccharide)且為數個N-乙醯基葡萄糖胺連結而得之寡醣類，一般而言，其係藉由將源自甲殼類等之幾丁質進行水解等而獲得，亦稱為寡-N-乙醯基葡萄糖胺。 即，幾丁寡糖係藉由將依常法自蟹、蝦等甲殼類的殼等所調製出之幾丁質化學性或酵素性地進行部分水解而獲得。作為幾丁寡糖，較佳係使用選自N-乙醯基幾丁二糖、N-乙醯基幾丁三糖、N-乙醯基幾丁四糖、N-乙醯基幾丁五糖、N-乙醯基幾丁六糖、N-乙醯基幾丁七糖、N-乙醯基幾丁八糖等之一種或複數種之混合物。在此等之中，特定而言，N-乙醯基幾丁五糖、N-乙醯基幾丁六糖、N-乙醯基幾丁七糖係誘導因子效果較高。
本發明中所使用之幾丁寡糖特佳係具有下述化學結構。
Figure 02_image001
另外，亦包含式中之乙醯基(COCH3 )一部分脫落而成為NH2 者。此種去乙醯基化的比例較佳為幾丁寡糖整體的30%以下，更佳為20%以下，再佳為15%以下。
在本案說明書中，所謂「內源誘導因子」，係意味源自植物之物質的誘導因子，在具有誘導因子效果之前提下，並無特別限制，典型地為產自植物之纖維素、木聚糖(xylan)及該等之寡醣等。 本發明涉及之植物活力劑較佳係包含選自纖維寡糖及木寡糖之至少1種寡醣作為內源誘導因子。
纖維寡糖為複數個葡萄糖藉由β-糖苷鍵進行聚合而得之低聚醣類，近年來被發現保濕性、抑制發黏、賦予清爽味、減低澱粉老化、抑制蛋白變性等機能性，被期待利用於醫藥、化妝品、食品、飼料領域。特定而言，葡萄糖的聚合度為3以上之纖維寡糖在增大上述機能性、賦予新的機能性之方面被寄予更大的期待。目前在工業上所利用之纖維寡糖係藉由酵素反應所製造，主成分為葡萄糖及二聚體的纖維二糖，幾乎不含有三聚體的纖維三糖以上之寡聚物。然而，近年來，已由申請人等人報導在使用碳觸媒之植物性生質的水解反應中，藉由控制升溫速度、冷卻速度、反應溫度、反應時間來使其進行水熱反應而製造含有葡萄糖的聚合度為3～6之寡聚物之纖維寡糖之方法(專利文獻7)。 在藉由纖維素的水解反應來獲得纖維寡糖之情況，作為纖維素原料，較佳係使用Avicel(Merck公司製)等結晶性微粉纖維素或棉短絨紙漿。
本發明中所使用之纖維寡糖特佳係具有下述化學結構。
Figure 02_image003
木寡糖為數個木糖藉由β-糖苷鍵進行聚合而得之低聚醣類，一般而言，其係藉由屬於半纖維素的主成分之木聚糖的水解而獲得，主要以食品用途之形式進行販售。
本發明中所使用之木寡糖特佳係具有下述化學結構。
Figure 02_image005
本發明涉及之植物活力劑可以粉狀、顆粒狀、液狀等任何形態進行製品化，一般而言，較佳係製成易於散佈之液狀。本發明涉及之植物活力劑可以使外源誘導因子及內源誘導因子以高濃度溶解於水等溶媒中而得之原液之形式進行供給。在一實施態樣中，植物活力劑原液中之前述外源誘導因子及前述內源誘導因子之合計含量較適當為0.05～10質量%，更適當為0.1～8質量%，再適當為0.5～6質量%。在另一實施態樣中，植物活力劑原液中之前述外源誘導因子及前述內源誘導因子之合計含量較適當為1～15質量%，更適當為3～12質量%，再適當為5～10質量%。
在一實施態樣中，本發明涉及之植物活力劑中之前述外源誘導因子相對於前述內源誘導因子之質量比(即，外源誘導因子含量／內源誘導因子含量)較適當為0.2～5，更適當為0.3～3，再適當為0.5～1.5。在另一實施態樣中，前述外源誘導因子相對於前述內源誘導因子之質量比較適當為0.1～4，更適當為0.2～2，再適當為0.3～1。
本發明涉及之植物活力劑更適當係包含木寡糖作為內源誘導因子，最適當係包含纖維寡糖及木寡糖兩者。在一實施態樣中，本發明涉及之植物活力劑中之前述纖維寡糖相對於前述木寡糖之質量比(即，纖維寡糖含量／木寡糖含量)較適當為0.2～5，更適當為0.3～3，再適當為0.5～1.5。在另一實施態樣中，前述纖維寡糖相對於前述木寡糖之質量比較適當為0.1～4，更適當為0.2～2，再適當為0.3～1。
在植物活力劑包含幾丁寡糖作為外源誘導因子且包含纖維寡糖及木寡糖兩者作為內源誘導因子之情況，各寡醣相對於幾丁寡糖及纖維寡糖及木寡糖之合計含量之比例較佳為幾丁寡糖10～50質量%且纖維寡糖10～50質量%且木寡糖10～60質量%。各寡醣的比例更佳為幾丁寡糖20～40質量%且纖維寡糖20～40質量%且木寡糖20～55質量%。
本發明涉及之植物活力劑亦可進一步包含屬於活性成分之外源誘導因子及內源誘導因子以外之其他成分，例如防腐劑、展開劑、沉澱防止劑、增黏劑、賦形劑。作為防腐劑，可列舉山梨酸鉀、對羥基安息香酸酯、安息香、去氫醋酸鈉、檜木醇(hinokitiol)、苯氧基乙醇、聚胺基丙基雙胍、聚離胺酸等。展開劑為以界面活性劑作為主成分之黏稠的液體，在可使用作為植物活力劑之展開劑之前提下，並無特別限制，可列舉例如聚氧乙烯壬基苯基醚、山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯己糖醇酐脂肪酸酯等。作為沉澱防止劑，可列舉多磷酸或多磷酸之鹽類，或多羧酸型高分子界面活性劑等。作為增黏劑，可列舉羧基甲基纖維素(CMC)、聚丙烯醯胺、澱粉等水溶性高分子，或廢糖蜜、酒精發酵濃縮廢液、胺基酸發酵濃縮廢液等。作為賦形劑，可列舉乳糖或澱粉等。
在本發明之第二態樣中，係提供一種植物栽培方法，其包含將本發明涉及之植物活力劑應用於植物。
本發明涉及之植物活力劑所應用之對象植物並無特別限制，典型地為農作物，可列舉菊科、茄科、十字花科、禾本科、豆科、薔薇科、葫蘆科、旋花科、藜科、百合科、繖形科、錦葵科、薑科、蓮科等植物。 具體而言，可列舉大白菜、捲心菜、青花菜、花椰菜類、小松菜、日本蕪菁、白蘿蔔、蕪菁等十字花科植物，馬鈴薯、蕃茄、茄子、青椒、辣椒、燈籠椒、煙草等茄科植物，茼蒿、萵苣、散葉萵苣、牛蒡、蜂斗菜等菊科植物，西瓜、甜瓜、南瓜、小黃瓜、苦瓜、絲瓜、葫蘆等葫蘆科植物，菠菜、莙薘菜、瑞士甜菜、鈉沙蓬、甜菜等藜科植物，胡蘿蔔、西芹、香芹、鴨兒芹等繖形科植物，大豆(毛豆)、紅豆、菜豆、蠶豆、蜿豆、四棱豆、花生等豆科植物，蕃薯、空心菜等旋花科植物，韭菜、蔥類、洋蔥、大蒜、蘆筍等百合科植物，草莓、蘋果、梨、枇杷等薔薇科植物，秋葵、棉等錦葵科植物，薑等薑科植物，蓮等蓮科植物，玉米、米、大麥、小麥、甘蔗等禾本科植物等。 在該等之中，較佳為捲心菜、小松菜等十字花科植物，蕃茄、茄子等茄科植物，萵苣、散葉萵苣等菊科植物，草莓、蘋果等薔薇科植物，其中，更佳為小松菜、蕃茄。
本發明涉及之植物活力劑一般而言係在其原液中加入水等並稀釋成所期望的濃度(例如稀釋成1000倍)來使用，植物活力劑中之外源誘導因子及內源誘導因子之合計含量較適當係在成為0.1～500質量ppm之濃度下應用於植物。植物活力劑中之外源誘導因子及內源誘導因子之合計含量更適當係在成為0.5～200質量ppm，再適當為1～100質量ppm之濃度下應用於植物。
植物活力劑對植物之應用可藉由該業界所慣用之方法來施行，散佈方法亦無特別限定，例如可為直接散佈於植物的葉、莖等之方法、散佈於栽培植物之培養基或土壤中之方法、摻合至肥料等中並散佈於培養基或土壤中之方法等中之任何者。另外，在摻合至肥料中之情況，作為肥料，係含有氮、磷酸、鉀之化學肥料、油渣、魚渣、骨粉、海藻粉末、胺基酸、醣類、維生素類等有機質肥料等，其種類並無限定。作為散佈方法，特定而言，藉由葉面散佈來施行就有效地表現出誘導因子活性之方面而言係較佳。葉面散佈可藉由該業界所慣用之手法，例如動力噴霧器、肩掛式噴霧器、撒播機、噴灑器、有人或無人直昇機、煙霧器、手持噴灑器等來施行。
在將植物活力劑摻合至肥料中來進行散佈之情況，相對於肥料組成物中之固形分100質量%而言，前述外源誘導因子的含量較佳為5～30質量%，更佳為8～20質量%。相對於肥料組成物中之固形分100質量%而言，前述內源誘導因子的含量較佳為15～60質量%，更佳為25～50質量%。肥料組成物係除了前述外源誘導因子及前述內源誘導因子以外，較佳係尚含有選自氮、磷酸、鉀之至少1種營養素，更佳係尚含有氮、磷酸及鉀共3種營養素全部。在液狀肥料之情況，肥料組成物較佳係含有水70～99質量%，更佳係含有水75～99質量%，較佳係在散佈前將此原液稀釋100倍至1000倍來使用。
藉由以此種方法來栽培植物，相較於未應用植物活力劑之情況而言，能夠生產具有誘導因子活性之植物或其一部分(例如根、莖、葉、花、果實、種子、組織、細胞等)，進而可改善農作物的活力、產量、品質及收穫後之保存性。
如上述，誘導因子效果就病害抵抗性之一項指標而言實屬重要，本發明者等人此次發現可藉由屬於誘導因子效果之一項訊息(signal)之聚葡萄糖酶產生量，通過測定其酵素活性來評估誘導因子活性。藉由採取栽培中植物的葉的一部分並分析其聚葡萄糖酶活性，便能夠進行同一個體的經時性評估。
將誘導因子活性之評估方法中之順序的概要示於下： (i)施行植物的取樣及前處理；(ii)以BSA作為蛋白質標準來製作檢量曲線(利用經由色素結合法之波長(600nm)的吸光度)；(iii)測定(i)中所調製而得之檢體的蛋白質濃度；(iV)測定(i)中所調製而得之檢體的聚葡萄糖酶活性。具體而言，透過若因聚葡萄糖酶使可溶性低分子分解物發生游離就會顯色之B-HS試劑，以波長590nm的吸光度值之形式評估其活性；(v)算出每蛋白質單位之聚葡萄糖酶活性。 針對此種誘導因子活性之評估方法的具體順序，係以下述實施例詳細地進行說明。
藉由以下實施例來更具體地說明本發明，但本發明並不限定於此。 [實施例]
[1.寡醣的準備] (1)幾丁寡糖 將幾丁質(富士軟片和光純藥股份有限公司製，精製幾丁質)10g分散於包含磷酸1.2g之水30mL中後，將經減壓乾燥之粉末連同直徑5mm的氧化鋁球100g裝入容量250mL的氧化鋁坩堝中，固定於行星式球磨機(Fritsch公司製，PULVERISETTE6)並以500rpm連續處理6小時而取得反應物。另外，針對溫度，係於室溫開始，剪切放熱所引發之溫度上升係任其自然發展。 繼而，使用5B濾紙並藉由吸濾器(nutsche filter)對將反應物懸浮於水中並以氫氧化鈣進行中和而得之漿料液施行過濾，將所回收之濾液進行凍結乾燥而取得幾丁寡糖粉末。
(2)纖維寡糖 在以下實施例1～7及比較例9、10、15中，係使用藉由「製造方法1」所製造而得之纖維寡糖，在實施例9、10、12、14、16、17中，係使用藉由「製造方法2」所製造而得之纖維寡糖。 (製造方法1：自結晶性微粉纖維素取得) 將Avicel(Merck公司製結晶性微粉纖維素)10g及活性碳BA50(味之素Fine Techno(股)製)1.5g連同直徑1.5cm的氧化鋁球2000g裝入容量3600mL的陶瓷罐磨機中，固定於桌上型罐磨機旋轉台(日陶科學(股)製，桌上型罐磨機型式ANZ-51S)，以60rpm處理48小時而取得反應原料。另外，針對溫度，係於室溫開始，剪切放熱所引發之溫度上升係任其自然發展。 繼而，將反應原料0.374g及水40mL裝入高壓反應器(內容積100mL，Omlabo Tec(股)製高壓釜，哈氏合金(hastelloy)C22製)中後，一面以600rpm進行攪拌一面以10～30℃／分鐘(平均升溫速度11.3℃／分鐘)加熱至反應溫度至230℃後，立即停止加熱，將反應器以10～30℃／分鐘(平均降溫速度16.7℃／分鐘)進行風冷並冷卻而製作反應液。 繼而，將藉由離心分離裝置回收反應液而得之上清液進行凍結乾燥而取得纖維寡糖粉末。
(製造方法2：自棉短絨紙漿取得) 將棉短絨紙漿(東工KOSEN股份有限公司，纖維素含有率97%)271g(含水率1.8%，乾燥質量266g)使用食物攪合器(型號：HBF500S，Hamilton Beach公司製)與85質量%磷酸(富士軟片和光純藥股份有限公司製特級試劑)38g進行混合，而取得反應原料309g(含水率3.4%，磷酸含有率10.4%)。 繼而，將反應原料309g與φ3／4英吋碳鋼球13kg一起投入至振動磨機(裝置名：MB-1型，中央化工機股份有限公司製，罐尺寸5L)中並在全振幅8mm，振動數16.2Hz，夾套流通水溫度75℃之條件下，施行經由乾式粉碎之水解反應24小時後，回收反應粉體。 將此反應粉體10g及離子交換水90g裝入200L燒杯中，並使用磁力攪拌器於25℃施行攪拌1小時，獲得纖維素水解物之萃取液。 繼而，在萃取物中加入40質量%氫氧化鈣水溶液1.3g，自使用磁力攪拌器於25℃施行攪拌1小時所調製而得之中和液中藉由離心分離裝置回收上清液後，進行凍結乾燥而取得纖維寡糖粉末。
(3)木寡糖 在以下實施例1～8及比較例11、12、16中，係使用下述「市售品」的木寡糖，在實施例9～15、17、18中，係使用藉由「製造方法」所製造而得之木寡糖。
(製造方法：自玉米芯粉末取得) 將解纖維枝頂孢霉(Acremonium Cellulolyticus)TN株(FERM P-18508)在已裝入液體培養基(Avicel 50g／L、KH2 O4 24g／L、硫酸銨5g／L、酒石酸鉀1／2H2 O 4.7g／L、尿素4g／L、Tween80 1g／L、MgSO4 ・7H2 O 1.2g／L、ZnSO4 ・7H2 O 10mg／L、MnSO4 ・5H2 O 10mg／L、CuSO4 ・5H2 O 10mg／L)100mL之500mL燒瓶中於30℃振盪培養6日，將玉米芯粉末5g懸浮於所獲得之培養液之離心分離上清液50mL中，將於50℃以72Hr進行攪拌反應所獲得之反應液之離心分離上清液進行凍結乾燥而取得木寡糖原末。 (市售品) 使用物產Food Science股份有限公司製，木寡糖95P。
[2.褶邊萵苣的可食部收穫量及根乾燥重量的測定] (1)植物活力劑的調製 將[1.寡醣的準備]中所準備之各寡醣以成為下述表中之實施例1、9-11中之植物活力劑濃度(質量ppm)的1000倍之方式，以各自的組成比率進行攪拌器攪拌並溶解於水中後，以0.45μm過濾器進行除菌，將所得之物作為植物活力劑原液。
(2)栽培試驗 在試驗區中，在為了水耕栽培實施用所準備之養液150L中添加各條件之植物活力劑原液150g，使其進行分散(稀釋1000倍)並於溫度20～22℃開始進行各120株的栽培。栽培係實施合計60日，開始進行植物活力劑原液150g的追加後每1週施行合計5次，測定褶邊萵苣的可食部收穫量及根乾燥重量，與未應用植物活力劑之情況(比較例1)進行比較。 另外，可食部收穫量的測定係藉由切下根的部分並將上部依原樣作為可食部分進行測定而施行，根乾燥重量的測定係藉由使所切下之根的部分以恆溫乾燥機於50℃乾燥12小時之後再測定重量而施行。
Figure 02_image007
[3.蕃茄的可食部收穫量及糖度的測定] (1)植物活力劑的調製 將[1.寡醣的準備]中所準備之各寡醣以成為下述表中之比較例3-6及實施例2-3、12-13中之植物活力劑濃度(質量ppm)的1000倍之方式，以各自的組成比率進行攪拌器攪拌並溶解於水中後，以0.45μm過濾器進行除菌，將所得之物作為植物活力劑原液。將此原液以水稀釋成1000倍，並使用於以下栽培試驗。
(2)栽培試驗 在田地種植前日，對於進行盆栽育苗之中玉蕃茄的苗的葉，使植物活力劑液充分散佈於葉面及盆栽的土壤。 蕃茄的田地栽培係在塑料棚內，使用合計334m2 的田地，每間隔50cm各種植40苗／區中玉蕃茄並施行在化成肥料使用下之慣用農法。 經調製成各條件之植物活力劑濃度之水溶液係每次準備1.5kg／區，栽種後2週後起，以1次／2週的比例施行使用澆水器之葉面散佈及對根源附近的土壤部之澆水操作2個月，施行合計5次後，測定可食部收穫量及糖度，與未應用植物活力劑之情況(比較例2)進行比較。 另外，可食部收穫量的測定係藉由僅切取蕃茄果實部分作為可食部並依原樣測定重量而施行，糖度的測定係藉由榨取蕃茄果實的果汁並使用糖度計進行測定而施行。
Figure 02_image009
[4.蕃茄的植物乾燥重量的測定] (1)植物活力劑的調製 將[1.寡醣的準備]中所準備之各寡醣以成為下述表中之比較例8-12及實施例4-5、14-15中之植物活力劑濃度(質量ppm)的1000倍之方式，以各自的組成比率進行攪拌器攪拌並溶解於水中後，以0.45μm過濾器進行除菌，將所得之物作為植物活力劑原液。將此原液以水稀釋成1000倍，並使用於以下栽培試驗。
(2)栽培試驗 將蕃茄的種子浸漬於蒸餾水中6小時後去掉角質層，其次，將其在通風的場所乾燥30分鐘。其次，在經鋪設複數張吸收紙之培養皿中各放10個種子後，每個培養皿裝滿各條件之植物活力劑液並浸漬6小時。然後，自各培養皿中選出大小統一的3個種子，按條件進行缽植並栽培11日。已發芽之種子係測定植物乾燥重量，與未應用植物活力劑之情況(比較例7)進行比較。植物乾燥重量係切下根的部分並使剩餘的上部依原樣以恆溫乾燥機於50℃乾燥12小時之後再測定重量。
Figure 02_image011
[5.小松菜的誘導因子活性的評估] (1)植物活力劑的調製 將[1.寡醣的準備]中所準備之各寡醣以成為下述表中之比較例14-16及實施例6中之植物活力劑濃度(質量ppm)的1000倍之方式，以各自的組成比率進行攪拌器攪拌並溶解於水中後，以0.45μm過濾器進行除菌，將所得之物作為植物活力劑原液。將此原液以水稀釋成1000倍，並使用於以下栽培試驗。
(2)MS培養基的調製 在小松菜的育成中，係使用Murashige-Skoog(MS)瓊脂培養基。將所調製而得之植物活力劑以成為各比較例及實施例中所示之終濃度之方式添加至MS培養基中，然後，於121℃以20分鐘施行高壓釜滅菌。
(3)播種及生長發育方法 在無塵操作台上，將經高壓蒸氣滅菌之MS培養基移至種植箱，充分降溫後，播下小松菜(Wakami，Sakata Seed)的種各10粒。然後，使其於明亮處在22℃，24小時，長日條件下生長發育6日。
(4)蛋白質萃取 調製以下組成的蛋白質萃取用緩衝液。
Figure 02_image013
在BioMasher(Nippi股份有限公司)附屬的1.5ml管中添加上述所製作而得之蛋白質萃取用緩衝液300μl，於其中放入以剪刀剪成4×4mm左右來進行取樣而得之葉(植物體)。針對各樣品施行此操作5次。接著，以手轉動攪拌棒，將植物體進行破碎，直至肉眼可見的固形分大致消失之程度。在15,000×g，10分鐘，4℃之條件下進行離心分離，將水層回收至新的1.5ml管中，調製萃取液。
(5)蛋白質濃度的調整 將純度既知的牛血清白蛋白(BSA)2mg／ml進行階段稀釋(1／2、1／4、1／8、1／16、1／32、1／64稀釋)而製作標準品。使用所製作而得之標準品，取在600nm之吸光度(Abs600)之平均值，製作檢量曲線(n=3)。將考馬斯亮藍(Coomassie brilliant blue，CBB)液300μl分注於96孔盤中，添加上述所調製而得之萃取液6μl。測定Abs600。空白係使用MilliQ。將萃取液的吸光度套用至藉由經階段稀釋之BSA 2mg／ml所製作而得之檢量曲線，求出蛋白質濃度。 另外，在萃取液的Abs600測定值超出檢量曲線之情況，係以超純水(MilliQ)適宜稀釋並進行再測定而求出蛋白質濃度。 使用所求出之值，以萃取液的濃度成為一定之方式施行稀釋，用於以下聚葡萄糖酶活性測定。
(6)聚葡萄糖酶活性的測定 在1.5ml管中，將使B-HS試劑(Megazyme公司)1錠懸浮於MilliQ 10ml中而得之B-HS基質溶液100μl、0.2M磷酸緩衝液(pH6.0)50μl及上述所調製而得之稀釋液或超純水(空白)50μl進行混合，調製各比較例及實施例之樣品。每15分鐘充分搖動樣品，同時在30℃的水浴中施行酵素反應1小時30分鐘。加入反應停止液0.2N NaOH 100μl(合計300μl)來停止反應。在15,000rpm，5分鐘之條件下進行離心分離，將上清液200μl分注於96孔盤中，為了評估聚葡萄糖酶活性，測定在590nm之吸光度(Abs590)，與未應用植物活力劑之情況(比較例13)進行比較。
Figure 02_image015
[6.棉花的誘導因子活性的評估] (1)植物活力劑的調製 將[1.寡醣的準備]中所準備之各寡醣以成為下述表中之實施例7-8、16-18中之植物活力劑濃度(質量ppm)的1000倍之方式，以各自的組成比率進行攪拌器攪拌並溶解於水中後，以0.45μm過濾器進行除菌，將所得之物作為植物活力劑原液。將此原液以水稀釋成1000倍，並使用於以下栽培試驗。
(2)播種及生長發育方法 以已裝入培土(有機蔬菜的土：廣田商店)及肥料(新多木有機入液肥3號：多木化學股份有限公司)之花盆(640×220×180mm)來施行棉花的栽培試驗。首先，施行中國產棉花的播種，在發芽後自上部以噴灑器散佈上述所調製而得之植物活力劑50ml並使其生長發育。關於肥料，係將在施行植物活力劑的散佈之前日稀釋200倍而得者對約1.5L的花盆進行追肥。
(3)聚葡萄糖酶活性的測定 藉由與上述[5.小松菜的誘導因子活性試驗]同樣的手法，測定棉花的聚葡萄糖酶活性，與未應用植物活力劑之情況(比較例17)進行比較。
Figure 02_image017

Claims (15)

  1. 一種植物活力劑，其特徵為包含外源誘導因子及內源誘導因子，前述外源誘導因子為幾丁質、幾丁聚糖或該等之寡醣、或者源自於昆蟲之生體分子，前述內源誘導因子為產自植物之纖維素、木聚糖(xylan)或該等之寡醣。
  2. 如請求項1之植物活力劑，其中，前述外源誘導因子為幾丁寡糖，前述內源誘導因子為選自纖維寡糖及木寡糖之至少1種寡醣。
  3. 如請求項1或2之植物活力劑，其中，前述植物活力劑中之前述外源誘導因子及前述內源誘導因子之合計含量為0.05~10質量%。
  4. 如請求項1或2之植物活力劑，其中，前述植物活力劑中之前述外源誘導因子相對於前述內源誘導因子之質量比為0.2~5。
  5. 如請求項1或2之植物活力劑，其包含木寡糖作為前述內源誘導因子。
  6. 如請求項5之植物活力劑，其包含纖維寡糖及木寡糖兩者作為前述內源誘導因子。
  7. 如請求項6之植物活力劑，其中，前述植物活力劑中之前述纖維寡糖相對於前述木寡糖之質量比為0.2~5。
  8. 如請求項1或2之植物活力劑，其進一步包含展開劑。
  9. 一種植物活力劑，其特徵為包含外源誘導因子及內源誘導因子，前述外源誘導因子為幾丁質、幾丁聚糖或該等之寡醣、或者源自於昆蟲之生體分子，前述內源誘導因子為產自植物之纖維素、木聚糖(xylan)或該等之寡醣，並且藉由聚葡萄糖酶活性評估前述外源誘導因子與前述內源誘導因子之誘導因子活性時，外源誘導因子之聚葡萄糖酶活性與內源誘導因子之聚葡萄糖酶活性的比，滿足(內源誘導因子之聚葡萄糖酶活性)/(外源誘導因子之聚葡萄糖酶活性)≧29/62。
  10. 一種包含將請求項1至9中任一項之植物活力劑應用於植物之方法。
  11. 如請求項10之方法，其包含將前述植物活力劑以前述外源誘導因子及前述內源誘導因子之合計含量成為0.1~500質量ppm之濃度應用於植物。
  12. 如請求項10或11之方法，其中，前述植物活力劑對植物之應用係藉由葉面散佈來施行。
  13. 一種生產方法，其係相較於未應用請求項1至9中任一項之植物活力劑之情況而言，具有增大的誘導因子活性之植物或其一部分之生產方法，其包含藉由請求項10或11之方法來栽培植物。
  14. 如請求項13之方法，其中，前述誘導因子活性係藉由測定植物中之聚葡萄糖酶產生量來決定。
  15. 一種肥料組成物，其含有請求項1至9中 任一項之植物活力劑。
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