CN111511198A - 具有增强的性状的经修饰的植物 - Google Patents

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Abstract

本公开提供具有增强的性状如增加的产量、提高的氮利用效率和增强的耐旱性或水利用效率的重组DNA构建体和经修饰的或转基因的植物。经修饰的或转基因的植物可包括大田作物以及此类经修饰的或转基因的植物的植物繁殖体、植物部分和子代。还提供了制备和使用此类经修饰的或转基因的植物的方法，以及从此类经修饰的或转基因的植物产生种子、使这种种子生长并选择具有增强的性状的子代植物的方法。还公开了具有改变的表型或性状的经修饰的或转基因的植物，所述改变的表型或性状可用于筛选和选择具有所需的增强的性状的转基因事件、编辑或突变。

Description

具有增强的性状的经修饰的植物
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年11月21日提交的美国临时申请号62/589,171的权益，所述申请以引用的方式整体并入本文。
序列表的并入
名称为“MONS454WO_ST25.txt”的序列表文件随本文提交并且以引用的方式整体并入本文，所述序列表文件是395千字节(在MS-WINDOWS中测量)并且于2018年11月20日创建。
技术领域
本文公开了重组DNA构建体，具有改变的表型、增强的性状、增加的产量、提高的氮利用效率和提高的水利用效率的植物；此类植物的繁殖体、子代和大田作物；以及生产和使用此类植物的方法。还公开了从此类植物产生种子、使这种种子生长和/或选择具有改变的表型、增强的性状、增加的产量、提高的氮利用效率和提高的水利用效率的子代植物的方法。
发明内容
在一个方面，本公开提供了重组DNA构建体，所述重组DNA构建体各自包含：(a)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:1-31组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:32-62和104-140组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；(c)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码mRNA分子，所述mRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:63-69组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列；或(d)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码蛋白质，所述蛋白质包含与选自由SEQ ID NO:70-76组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
本公开的重组DNA构建体可包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子，并且其中所述RNA分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:63-69组成的组的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸或与从所述内源性基因转录的mRNA序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％互补，所述内源性基因编码与选自由SEQ ID NO:70-76组成的组的氨基酸序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的蛋白质。根据一些实施方案，本公开的重组DNA构建体可包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子，其中所述RNA包含与选自由SEQ ID NO:84-90组成的组的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的多核苷酸序列。本公开的重组DNA构建体可包含选自由SEQ ID NO:77-83组成的组的多核苷酸序列。
所述重组DNA构建体可包含在植物细胞中具有功能性并与所述多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。还提供了包含这种重组DNA构建体的载体、质粒、植物、繁殖体和植物细胞。由所述重组DNA构建体编码的抑制RNA可选自由以下组成的组：双链RNA、反义RNA、miRNA和ta-siRNA。
包含重组DNA构建体的植物可以是大田作物植物，如玉米、大豆、棉花、芥花、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、藜麦以及甘蔗。与对照植物相比，包含重组DNA构建体的植物可具有改变的表型或增强的性状。所述增强的性状可能是，例如，与对照植物相比，减少的从种植到成熟的天数、增加的茎杆大小、增加的叶片数量、增加的营养阶段的植株高度生长速率、增加的穗大小、增加的每个植株的穗干重、增加的每个穗的籽粒数量、增加的每个籽粒的重量、增加的每个植株的籽粒数量、减少的穗空粒(ear void)、延长的籽粒灌浆期、降低的植株高度、增加的根分枝数量、增加的总根长、增加的产量、提高的氮利用效率以及提高的水利用效率。所述改变的表型可以是例如植株高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、施水量(water applied)、水含量和水利用效率。
根据另一个方面，本公开提供了用于在植物中改变表型、增强性状、增加产量、提高氮利用效率或提高水利用效率的方法，所述方法包括产生包含本公开的重组DNA构建体的转基因植物。产生转基因植物的步骤还可包括用所述重组DNA构建体转化植物细胞或组织，以及从包含所述重组DNA构建体的植物细胞或组织再生或发育成所述转基因植物。然后可将所述转基因植物与(a)自身；(b)来自同一株系的第二植物；(c)野生型植物；或(d)来自不同株系的第二植物杂交以产生一种或多种子代植物；并且植物可选自与对照植物相比具有增加的产量、提高的氮利用效率或提高的水利用效率或其他改变的表型或增强的性状的子代植物。还提供了通过这种方法产生的植物。
根据另一个方面，本公开提供了在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子包含插入序列，所述插入序列包含：(a)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:1-31组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:32-62和104-140组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；(c)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码mRNA分子，所述mRNA分子包含与选自由SEQID NO:63-69组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列；或(d)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码蛋白质，所述蛋白质包含与选自由SEQ ID NO:70-76组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
所述重组DNA分子的插入序列可包含在植物细胞中具有功能性并与所述多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。所述重组DNA分子还可包含在插入序列侧翼的至少一个同源臂，以指导插入序列整合到所需的基因组基因座中。还提供了包含所述插入序列的植物、繁殖体和植物细胞。根据一些实施方案，所述重组DNA分子还可包含表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或一种或多种指导RNA。
根据另一个方面，本公开提供了在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子包含用于调节内源性基因的表达的插入序列，其中所述内源性基因包含：(a)编码mRNA分子的多核苷酸序列，所述mRNA分子与选自由SEQ ID NO:1-31组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性；或(b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:32-62和104-140组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列。
所述插入序列可包含启动子、增强子、内含子或终止子区域，其可对应于内源性基因的启动子、增强子、内含子或终止子区域。还提供了包含所述插入序列的植物、繁殖体和植物细胞。所述重组DNA分子还可包含在所述插入序列侧翼的至少一个同源臂。根据一些实施方案，所述重组DNA分子还可包含表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或一种或多种指导RNA。
根据另一个方面，本公开提供了用于在植物中改变表型、增强性状、增加产量、提高氮利用效率或提高水利用效率的方法，所述方法包括：(a)通过以下修饰植物细胞的基因组：(i)鉴定所述植物的对应于选自本文的表1和表17中的基因列表的基因的内源性基因及它们的同源物，和(ii)经由定点整合修饰所述植物细胞中的内源性基因的序列以改变所述内源性基因的表达水平；和(b)从所述植物细胞再生或发育成植物。
根据另一方面，本公开提供了一种经修饰的玉米植物或植物部分，所述经修饰的玉米植物或植物部分包含至少一个细胞，所述至少一个细胞在内源性基因中具有通过诱变或基因组编辑技术引入的突变或编辑，相对于不具有所述突变或编辑的内源性基因的野生型等位基因，所述突变或编辑降低至少一个玉米细胞中的内源性基因的表达水平或活性，其中所述内源性基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因。相对于对照植物，所述经修饰的玉米植物可具有改变的表型或增强的性状。
根据另一方面，本公开提供了一种经修饰的大豆植物或植物部分，所述经修饰的大豆植物或植物部分包含至少一个细胞，所述至少一个细胞在内源性基因中具有通过诱变或基因组编辑技术引入的突变或编辑，相对于不具有所述突变或编辑的内源性基因的野生型等位基因，所述突变或编辑降低至少一个大豆细胞中的内源性基因的表达水平或活性，其中所述内源性基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。相对于对照植物，所述经修饰的大豆植物可具有改变的表型或增强的性状。
根据另一方面，本公开提供了一种包含指导RNA分子的组合物，其中所述指导RNA分子包含与在玉米植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，其中所述内源性靶基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因。根据一些方面，所述指导RNA分子可包含与SEQ ID NO:141、142、144或145的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。根据一些方面，所述内源性靶基因可包含与SEQ ID NO:63、64、66或67至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列，和/或其中所述内源性靶基因编码与SEQ ID NO:70、71、73或74至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的蛋白质。根据一些方面，所述组合物可包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与同源臂靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述同源臂靶DNA序列是玉米植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列，其中所述内源性靶基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因。
根据另一方面，本公开提供了一种包含指导RNA分子的组合物，其中所述指导RNA分子包含与在大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，其中所述内源性基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。根据一些方面，所述指导RNA分子可包含与SEQID NO:143、146或147的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。根据一些方面，所述内源性靶基因可包含与SEQ ID NO:65、68或69至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列，和/或其中所述内源性靶基因编码与SEQ ID NO:72、75或76至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的蛋白质。根据一些方面，所述组合物还可包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与同源臂靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述同源臂靶DNA序列是玉米植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列，其中所述内源性基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。
根据另一方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码非编码指导RNA分子的可转录DNA序列，其中所述指导RNA分子包含与在以下的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列：(i)玉米植物的内源性靶基因，其中所述内源性靶基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因；或(ii)大豆植物的内源性靶基因，其中所述内源性靶基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。根据一些方面，所述指导RNA分子可包含与SEQ ID NO:141、142、143、144、145、146或147的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。所述可转录DNA序列可以可操作地连接至植物可表达启动子。根据一些方面，所述内源性靶基因可包含与SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列，和/或其中所述内源性靶基因编码与SEQ ID NO:70、71、72、73、74、75、76或77至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的蛋白质。还提供了可包含所述重组DNA构建体的DNA分子、载体、细菌和宿主细胞。根据一些方面，提供了一种包含所述重组DNA构建体的组合物，所述组合物还可包含RNA指导的核酸内切酶。
根据另一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含第一DNA分子或载体和第二DNA分子或载体，其中所述第一DNA分子或载体包含编码指导RNA分子的重组DNA构建体，所述指导RNA分子与玉米或大豆植物的内源性靶基因处或附近的DNA靶位点互补，并且所述第二DNA分子或载体包含编码RNA指导的核酸内切酶的第二重组DNA构建体。根据一些方面，所述组合物还可包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与在玉米或大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列互补。
根据另一方面，本公开提供了一种工程化的位点特异性核酸酶，所述工程化的位点特异性核酸酶结合至玉米或大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并且在所述靶位点处引起双链断裂或切口。根据一些方面，所述位点特异性核酸酶可以是大范围核酸酶、归巢核酸内切酶、锌指核酸酶(ZFN)或转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。根据一些方面，所述内源性靶基因可以是玉米中的钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因，或大豆中的同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。根据一些方面，所述位点特异性核酸酶所结合的靶位点可与SEQ ID NO:141、142、143、144、145、146或147的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸或与其互补的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补。
根据另一方面，本公开提供了一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码位点特异性核酸酶的转基因，其中所述位点特异性核酸酶结合至玉米或大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并且在所述靶位点处引起双链断裂或切口，其中所述转基因可操作地连接至植物可表达启动子。根据一些方面，所述内源性靶基因可以是玉米中的钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因，或大豆中的同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。
根据另一方面，本公开提供了一种用于产生在内源性靶基因处或附近具有基因组编辑的玉米或大豆植物的方法，所述方法包括：(a)将位点特异性核酸酶或包含编码位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA分子引入所述玉米或大豆植物的外植体的至少一个细胞中，其中所述位点特异性核酸酶结合至所述内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并且在所述靶位点处引起双链断裂或切口，以及(b)从所述至少一个外植体细胞再生或发育成经编辑的玉米或大豆植物，所述至少一个外植体细胞包含在所述经编辑的玉米或大豆植物的内源性靶基因处或附近的基因组编辑。根据一些方面，所述方法还可包括(c)基于植物表型或性状或分子测定来选择所述经编辑的玉米或大豆植物。
具体实施方式
在所附的序列表中：
SEQ ID NO 1至31是可用于重组DNA构建体中以在植物中赋予增强的性状的核苷酸或DNA编码序列或链，各自表示蛋白质的编码序列。
SEQ ID NO 32至62是以相同顺序分别由SEQ ID NO 1至31的核苷酸或DNA序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO:63至69是核苷酸或DNA序列，各自表示抑制靶基因的编码序列。
SEQ ID NO 70至76是以相同顺序分别由SEQ ID NO 63至69的核苷酸或DNA序列编码的氨基酸序列。
SEQ ID NO 77至83是可用于重组DNA构建体中以在植物中赋予增强的性状或改变的表型的核苷酸或DNA序列，各自编码工程化的miRNA前体序列。
SEQ ID NO:84至90是以相同顺序分别由SEQ ID NO 77至83的核苷酸序列表示的工程化的miRNA前体的核苷酸或DNA靶向序列。
SEQ ID NO 91至94是水稻MIR基因的变体的核苷酸或DNA序列。
SEQ ID NO 95至103是可用于重组DNA构建体中以在植物中赋予增强的性状或改变的表型的核苷酸或DNA序列，各自表示具有特定类型的表达模式的启动子。
SEQ ID NO 104至140是分别与具有SEQ ID NO 32至62和70至76的氨基酸序列的蛋白质同源的蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO 141至147是也可被靶向以进行基因组编辑的在下表2中标识的用于抑制的玉米和大豆靶基因的基因组DNA序列。除了包含外显子和内含子序列的基因序列外，还包括上游序列和下游序列。
除非另外规定，否则本说明书文本中的核酸序列当从左向右阅读时是以5'至3'方向给出。本领域技术人员将会知道，给定DNA序列被理解为定义了除了用尿嘧啶(U)核苷酸置换DNA的胸腺嘧啶(T)核苷酸之外与DNA序列相同的对应RNA序列。因此，提供特定DNA序列被理解为定义了精确的RNA等同物。给定第一多核苷酸序列，无论是DNA还是RNA，还限定其精确补体的序列(其可以是DNA或RNA)，即通过形成沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对与第一多核苷酸完全杂交的第二多核苷酸。与靶基因或靶基因的片段“基本上相同”或“基本上互补”意指多核苷酸链(或双链多核苷酸的至少一条链)被设计来与靶基因或靶基因的片段或与靶基因或靶基因的片段的转录物杂交(通常在生理条件下诸如在活的植物或动物细胞中发现的那些)；本领域技术人员将理解，这种杂交不一定需要100％序列同一性或互补性。如本文所用，“可操作地连接”是指重组DNA构建体中的两个或更多个DNA片段缔合，以使得一个(例如，编码蛋白质的DNA)的表达或功能受另一个(例如，启动子)控制或影响。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，则第一核酸序列与第二核酸序列是“可操作地”相连的或“连接的”。例如，如果启动子提供DNA的转录或表达，则启动子序列与DNA是“可操作地连接的”。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的。
如本文所用，关于两个或更多个核苷酸或蛋白质序列的术语“同一性百分比”和“百分比相同”(包括任何数值百分比同一性)是通过以下方式计算的：(i)在比较窗口上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或蛋白质)，(ii)确定在两个序列中出现相同的核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白质)的位置的数目以产生匹配位置的数目，(iii)将所述匹配位置的数目除以所述比较窗中的位置总数，并且然后(iv)将此商乘以100％以产生同一性百分比。对于同一性百分比，如果两个或更多个多核苷酸或蛋白质序列的有序核苷酸或氨基酸的最大数目线性比对或匹配(即相同)并且在其比对中允许空位，则可对所述两个或更多个序列进行最佳比对。为了计算DNA序列与RNA序列之间的“同一性百分比”，RNA序列的尿嘧啶(U)被认为与DNA序列的胸腺嘧啶(T)相同。如果将比较窗口定义为两个或更多个序列之间的比对区域(即，不包括在所比较的序列之间不相同的所比对的多核苷酸序列的5’和3’端的核苷酸或所比对的蛋白质序列的N-末端和C-末端的氨基酸)，则“同一性百分比”也可称为“比对同一性百分比”。如果在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算“同一性百分比”，则通过将比对区域上的匹配位置的数目除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，出于本公开的目的，当对两个序列(查询和目标)进行最佳比对(在其比对中允许空位)时，查询序列的“同一性百分比”等于两个序列之间相同位置的数目除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的位置总数，然后乘以100％。
如本文所用，关于两个核苷酸序列的术语“互补性百分比”或“百分比互补”(包括任何数值互补性百分比)类似于同一性百分比的概念，但是指当查询序列和目标序列线性排列并且最佳碱基配对时查询序列中与目标序列的核苷酸最佳碱基配对或杂交的核苷酸的百分比。这种互补性百分比可以是在两条DNA链、两条RNA链或DNA链与RNA链之间。通过以下方式计算“互补性百分比”：(i)在比较窗口上以线性且完全延伸的排列(即，无折叠或二级结构)使两个核苷酸序列进行最佳碱基配对或杂交，(ii)确定在所述比较窗口上两个序列之间碱基配对的位置的数目以产生互补位置的数目；(iii)将所述互补位置的数目除以所述比较窗口中的位置总数，以及(iv)将此商乘以100％以产生两个序列的互补性百分比。可基于已知的核苷酸碱基配对，如G-C、A-T和A-U，通过氢键合来确定两个序列的最佳碱基配对。如果在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算“互补性百分比”，则通过将两个线性序列之间的互补位置的数目除以参考序列的总长度来确定互补性百分比。因此，出于本公开的目的，当两个序列(查询和目标)最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸但不具有折叠或二级结构)时，查询序列的“互补百分比”等于两个序列之间的碱基配对位置的数目除以查询序列在其长度上的位置总数(或除以查询序列在比较窗口上的位置数目)，然后乘以100％。
如本文所用，术语“表达”是指由植物、植物细胞或植物组织产生多核苷酸或蛋白质，其可产生改变的表型或增强的性状。表达也可指将来自基因的信息用于功能性基因产物的合成中的过程，所述功能性基因产物可包括但不限于可起到例如酶促、结构或调控功能的其他多核苷酸或蛋白质。具有调控功能的基因产物包括但不限于影响靶蛋白质的转录或翻译的发生或水平的元件。在一些情况下，表达产物是非编码功能性RNA。
表达的“调节”是指实现多核苷酸或蛋白质的过表达或抑制的过程。
如本文所用的术语“抑制”是指在基因的任何发展或瞬时阶段，与野生型或对照植物、细胞或组织中的表达相比，植物、植物细胞或植物组织中的靶多核苷酸或靶蛋白质的较低表达水平。如在抑制的上下文中使用的术语“靶蛋白质”是指被抑制的蛋白质；类似地，“靶mRNA”是指可被抑制或一旦表达就降解、从而导致它所编码的靶蛋白质的抑制的多核苷酸。如在抑制的上下文中使用的术语“靶基因”是指“靶蛋白质”和/或“靶mRNA”。在替代非限制性实施方案中，靶蛋白质和/或靶多核苷酸的抑制可直接或间接地产生增强的性状或改变的表型。在一个示例性实施方案中，靶蛋白质是可间接地增加或减少一种或多种其他蛋白质的表达的蛋白质，所述蛋白质的表达增加或减少分别与增强的性状或改变的表型相关。在另一个示例性实施方案中，靶蛋白质可结合至与改变的表型或增强的性状相关的一种或多种其他蛋白质，以增强或抑制其功能且由此间接地影响所述改变的表型或增强的性状。
可使用多种方法来施加抑制。非限制性实例包括：抑制途径中的内源性基因或基因的子集；抑制导致蛋白质活性降低的一种或多种突变；抑制抑制剂的产生；升高、降低或消除酶活性需要的底物水平，以产生新的蛋白质；活化通常沉默的基因；或累积在自然条件下通常不升高的产物。
相反，如本文所用的术语“过表达”是指在基因的任何发展或瞬时阶段，与野生型植物、细胞或组织中的表达相比，植物、植物细胞或植物组织中的多核苷酸或蛋白质的较高表达水平。过表达可在植物细胞中发生，所述植物细胞通常缺乏与本发明的多肽功能上等效或相同的多肽的表达。过表达也可在植物细胞中发生，在所述植物细胞中通常发生本发明的多肽或功能等效分子的内源性表达，但是这种正常表达处于较低水平。过表达因此导致植物、细胞或组织中所述多肽的大于正常产生或“过量产生”。
如本文在过表达的上下文中所使用的术语“靶蛋白质”是指过表达的蛋白质；“靶mRNA”是指编码并翻译以产生所述靶蛋白质的mRNA，所述靶蛋白质也可过表达。如在过表达的上下文中使用的术语“靶基因”是指“靶蛋白质”和/或“靶mRNA”。在替代实施方案中，靶蛋白质可直接或间接地实现增强的性状或改变的表型。在后一种情况下，它可这样做，例如，通过影响一种或多种其他蛋白质的表达、功能或可用的底物。在示例性实施方案中，靶蛋白质可结合至与改变的表型或增强的性状相关的一种或多种其他蛋白质，以增强或抑制其功能。
可使用多种方法来实现过表达。在一个实施方案中，可通过将编码一种或多种多核苷酸和/或多肽的DNA序列置于启动子的控制下来实现过表达，所述启动子的实例包括但不限于内源性启动子、异源启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子。在一个示例性的实施方案中，启动子是组成型启动子，例如花椰菜花叶病毒35S转录起始区。因此，取决于所使用的启动子，过表达可在整个植物中、在植物的特定组织中或在存在或不存在不同诱导剂(inducing agent)或诱导剂(inducible agent)如激素或环境信号的情况下发生。
基因抑制元件：基因抑制元件可以是任何适合长度的可转录DNA，并且对于重组DNA构建体意图抑制的每个靶基因，通常包括至少约19至约27个核苷酸(例如19、20、21、22、23或24个核苷酸)。在许多实施方案中，对于重组DNA构建体意图抑制的每个靶基因，基因抑制元件包括多于23个核苷酸(例如，多于约30、约50、约100、约200、约300、约500、约1000、约1500、约2000、约3000、约4000或约5000个核苷酸)。
可用于本发明的重组DNA构建体中的适合的基因抑制元件包括选自由以下组成的组的至少一种元件(并且在一些实施方案中，多种元件)：(a)包含与至少一种第一靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段的DNA；(b)包含与至少一种第一靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段的多个拷贝的DNA；(c)包含作为至少一种第一靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段的DNA；(d)包含作为至少一种第一靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段的多个拷贝的DNA；(e)转录成RNA以通过形成双链RNA来抑制至少一种第一靶基因并且包含与所述至少一个靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段和作为所述至少一种第一靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段的DNA；(f)转录成RNA以通过形成单个双链RNA来抑制至少一种第一靶基因并且包含与所述至少一个靶基因的至少一个区段反义的多个连续反义DNA区段和作为所述至少一种第一靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段的DNA；(g)转录成RNA以通过形成多条RNA双链来抑制至少一种第一靶基因并且包含与所述至少一个靶基因的至少一个区段反义的多个反义DNA区段和作为所述至少一种第一靶基因的至少一个区段的多个有义DNA区段的DNA，并且其中所述多个反义DNA区段和所述多个有义DNA区段以一系列反向重复序列排列；(h)包含源自miRNA、优选植物miRNA的核苷酸的DNA；(i)包含siRNA的核苷酸的DNA；(j)转录成能够与配体结合的RNA适体的DNA；以及(k)转录成能够结合至配体的RNA适体的DNA，以及转录成能够调控第一靶基因的表达的调控性RNA的DNA，其中所述调控取决于调控性RNA的构象，并且所述调控性RNA的构象受所述RNA适体的结合状态变构地影响。
这些基因抑制元件中的任一者(无论转录成单个双链RNA还是转录成多个双链RNA)都可被设计为抑制多于一种靶基因，包括例如靶基因的多于一种等位基因、来自单一物种的多种靶基因(或至少一种靶基因的多个区段)或来自不同物种的靶基因。
反义DNA区段：在一个实施方案中，与至少一种第一靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段包含与所述至少一种第一靶基因的至少一个区段反义或互补的DNA序列，并且可以包含多个反义DNA区段，即与所述至少一种第一靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段的多个拷贝。多个反义DNA区段可包含与至少一种第一靶基因的多个区段、或与至少一种第一靶基因的区段的多个拷贝、或与多种第一靶基因的区段、或与这些的任何组合反义或互补的DNA序列。多个反义DNA区段可融合到嵌合体中，例如，包含与一种或多种第一靶基因的多个区段反义并融合在一起的DNA序列。
与至少一种第一靶基因的至少一个区段反义或互补(即，可与其形成沃森-克里克碱基对)的反义DNA序列与所述至少一种第一靶基因的至少一个区段具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％互补性。在一个实施方案中，与至少一种第一靶基因的至少一个区段反义或互补的DNA序列与所述至少一种第一靶基因的至少一个区段具有介于约95％至约100％之间的互补性。在所述至少一个反义DNA区段包括多个反义DNA区段的情况下，互补性程度对于全部所述多个反义DNA区段可以是、但不必是相同的。
有义DNA区段：在另一个实施方案中，作为至少一种第一靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段包含对应于所述至少一种第一靶基因的至少一个区段的DNA序列(即，具有与其相同或基本上相同的序列)，并且可包含多个有义DNA区段，即对应于所述至少一种第一个靶基因的至少一个区段(即具有其核苷酸序列)的至少一个有义DNA区段的多个拷贝。多个有义DNA区段可包含作为或对应于至少一种第一靶基因的多个区段、或至少一种第一靶基因的区段的多个拷贝、或多种第一靶基因的区段、或这些的任何组合的DNA序列。多个有义DNA区段可融合到嵌合体中，即可包含对应于一种或多种第一靶基因的多个区段并融合在一起的DNA序列。
对应于所述靶基因的至少一个区段的有义DNA序列与所述靶基因的至少一个区段具有至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％序列同一性。在一个实施方案中，对应于所述靶基因的至少一个区段的DNA序列与所述靶基因的至少一个区段具有介于约95％至约100％之间的序列同一性。在所述至少一个有义DNA区段包括多个有义DNA区段的情况下，序列同一性程度对于全部所述多个有义DNA区段可以是、但不必是相同的。
多个拷贝：当基因抑制元件包含反义DNA序列的多个拷贝或有义DNA序列的多个拷贝时，这多个拷贝可以串联重复序列形式连续地排列。在一些实施方案中，可将这多个拷贝端对端连续地排列，即，呈直接连接的串联重复序列形式。在一些实施方案中，这多个拷贝可以间断的串联重复序列形式连续地排列，其中一个或多个间隔区DNA区段可位于多个拷贝中的一个或多个附近。串联重复序列(无论是直接连接的还是间断的或两者的组合)都可包含呈连续排列的单个反义DNA序列的多个拷贝或单个有义DNA序列的多个拷贝，或者可包含呈连续排列的多于一个反义DNA序列的多个拷贝或多于一个有义DNA序列的多个拷贝。
双链RNA：在基因抑制元件包含与至少一种靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段或作为所述至少一种靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA区段的那些实施方案中，从所述至少一个反义或至少一个有义DNA区段转录的RNA可通过RNA依赖性RNA聚合酶的作用变成双链。参见例如美国专利号5,283,184，所述专利以引用的方式并入本文。
在其他实施方案中，所述基因抑制元件可包含转录成RNA以通过形成双链RNA来抑制所述至少一种第一靶基因并且包含与所述至少一种靶基因的至少一个区段反义的至少一个反义DNA区段(如上文在标题“反义DNA区段”下所描述)和作为所述至少一种第一靶基因的至少一个区段的至少一个有义DNA片段(如上文在标题“有义DNA区段”下所描述)的DNA。这种基因抑制元件还可包含间隔区DNA区段。每一至少一个反义DNA片段与有义DNA区段的至少一部分互补，以允许通过所述至少一个反义DNA区段和所述至少一个有义DNA区段的分子内杂交形成双链RNA。反义DNA区段与有义DNA区段之间的这种互补性可以是、但不必须100％互补的；在一些实施方案中，这种互补性可优选是至少约80％、或至少约85％、或至少约90％、或至少约95％互补的。
双链RNA可呈单一dsRNA“茎”(有义链与反义链之间碱基配对的区域)的形式，或者可具有多个dsRNA“茎”。在一个实施方案中，基因抑制元件可包含转录成RNA以通过形成基本上单个双链RNA来抑制至少一种第一靶基因并且包含与所述至少一种第一靶基因的至少一个区段反义的多个连续反义DNA区段和作为所述至少一种第一靶基因的至少一个区段的多个连续有义DNA区段的DNA；所述多个连续反义区段和多个连续有义区段可形成单一双链RNA“茎”或呈连续排列的多个“茎”(有或无分隔所述多个“茎”的非碱基配对的间隔区DNA)。在另一个实施方案中，基因抑制元件包含转录成RNA以通过形成RNA的多个dsRNA“茎”来抑制至少一种第一靶基因并且包含与所述至少一种第一靶基因的至少一个区段反义的多个反义DNA区段和作为所述至少一种第一靶基因的至少一个区段的多个有义DNA区段的DNA，并且其中所述多个反义DNA区段和所述多个有义DNA区段呈一系列dsRNA“茎”(例如但不限于“反向重复序列”)排列。此类多个dsRNA“茎”可进一步连续或成簇排列以形成串联反向重复序列，或类似于“锤头”或“四叶苜蓿”形状的结构。这些基因抑制元件中的任一种都可还包含在dsRNA“茎”中发现的间隔区DNA片段(例如，作为多个反义或有义DNA区段之间的间隔区或作为碱基配对的反义DNA区段与有义DNA区段之间的间隔区)或在双链RNA“茎”之外的间隔区DNA(例如，作为分隔一对反向重复序列的环区)。在碱基配对的反义和有义DNA区段的长度不相等的情况下，较长的区段可充当间隔区。
miRNA：在另一实施方案中，基因抑制元件可包含DNA，所述DNA包含源自miRNA(微小RNA)的核苷酸，即对应于病毒或真核生物(包括植物和动物，尤其是无脊椎动物)天然的miRNA的DNA序列，或源自这种天然miRNA、但修饰为包含不与天然miRNA对应的核苷酸序列的DNA序列。尽管尚未报告真菌中的miRNA，但真菌miRNA(如果存在)也适用于本发明。一个实施方案包括基因抑制元件，所述基因抑制元件含有DNA，所述DNA包含源自病毒或植物miRNA的核苷酸。
在非限制性实例中，所述源自miRNA的核苷酸可包含DNA，所述DNA包含对应于天然miRNA的环区域的核苷酸和选自靶基因序列的核苷酸。在另一个非限制性实例中，所述源自miRNA的核苷酸可包含源自miRNA前体序列(如天然pri-miRNA或pre-miRNA序列)的DNA、或对应于天然miRNA的区域的核苷酸以及选自靶基因序列的核苷酸，以使得保留总体结构(例如，pre-miRNA的茎结构中错配的放置)，以允许pre-miRNA被加工成成熟miRNA。在又一个实施方案中，如Allen等人(2005)Cell,121:207-221所描述，基因抑制元件可包含DNA，所述DNA包含源自miRNA的核苷酸并且能够诱导或引导内源性转录物的同相裂解成反式作用siRNA。因此，包含源自miRNA的核苷酸的DNA可包含天然存在于miRNA或miRNA前体分子中的序列、合成序列或两者。
siRNA：在又一个实施方案中，基因抑制元件可包含DNA，所述DNA包含小干扰RNA(siRNA)的核苷酸。siRNA可以是一种或多种天然siRNA(如从非转基因真核生物或转基因真核生物分离的siRNA)，或者可以是预测具有siRNA活性的一个或多个DNA序列(如通过使用本领域中已知的预测工具，参见例如，Reynolds等人(2004)Nature Biotechnol.,22:326-330)。可将多个天然或预测的siRNA序列以嵌合siRNA序列形式连接来进行基因抑制。包含siRNA的核苷酸的这种DNA包含至少19个核苷酸，并且在一些实施方案中，包含至少20、至少21、至少22、至少23或至少24个核苷酸。在其他实施方案中，包含siRNA的核苷酸的DNA可基本上含有多于21个核苷酸，例如，多于约50、约100、约300、约500、约1000、约3000或约5000个核苷酸或更多。
工程化的miRNA和反式作用siRNA(ta-siRNA)可用于特异性增加的基因抑制。本发明提供了重组DNA构建体，所述重组DNA构建体各自包含被设计成抑制靶序列的可转录的工程化miRNA前体，其中所述可转录的工程化miRNA前体源自MIR基因(优选植物MIR序列)的折回结构。可基于MIR基因序列的全部或部分或其衍生物或变体序列设计工程化的前体miRNA，但用靶向并杂交至目标基因的靶mRNA的识别位点的不同序列置换MIR基因的靶向序列。例如，前体miRNA可源自SEQ ID NO:91-94之一，但是用靶向并杂交至由目标靶基因编码的mRNA的不同序列置换靶向序列。miRNA前体也可用于指导siRNA的同相产生(例如，异源序列被设计为在植物中的反式作用siRNA抑制机制中进行加工)。本发明还提供了一种用于抑制植物细胞中的靶序列的表达的方法，所述方法包括在植物细胞中转录包含被设计为抑制靶序列的可转录的工程化miRNA前体的重组DNA，其中所述可转录的工程化miRNA前体源自MIR基因(优选植物MIR序列)的折回结构，由此相对于在不存在所述重组DNA构建体的转录情况下靶序列的表达，抑制所述靶序列的表达。
由这些miRNA前体产生或预计由这些miRNA前体产生的成熟miRNA可经工程化以例如在通过miRNA进行的转录抑制中用于抑制靶基因，或以反式作用siRNA抑制机制指导siRNA的同相产生(参见Allen等人(2005)Cell,121:207-221；Vaucheret(2005)ScienceSTKE,2005:pe43；以及Yoshikawa等人(2005)Genes Dev.,19:2164-2175)。植物miRNA通常与其靶序列具有近乎完美的互补性(参见例如，Llave等人(2002)Science,297:2053-2056；Rhoades等人(2002)Cell,110:513-520；Jones-Rhoades和Bartel(2004)Mol.Cell,14:787-799)。因此，可通过用被靶向以进行抑制的序列的核苷酸置换成熟miRNA序列的核苷酸来将成熟miRNA工程化以充当可用于靶序列的基因抑制的序列；参见例如，由Parizotto等人(2004)Genes Dev.,18:2237-2242且尤其美国专利申请公布US2004/0053411A1、US2004/0268441A1、US2005/0144669和US2005/0037988公开的方法，所述文献全部以引用的方式并入本文。当将新的miRNA工程化以靶向特定序列时，一种策略是在靶序列中选择具有与天然miRNA序列尽可能相似的序列的区域。或者，可用靶序列的区域，优选满足据信对miRNA功能重要的结构和热力学标准的区域置换天然miRNA序列(参见例如，美国专利申请公布US2005/0037988)。优选地对序列进行工程化，以使得保留折回区域或pre-miRNA的茎结构中错配的数目和位置。因此，经工程化的miRNA或经工程化的miRNA前体可源自本文公开的任何成熟miRNA序列或其相应的miRNA前体(包括相应MIR基因的折回部分)。可在植物细胞或组织或完整植物中克隆并表达(瞬时或稳定)工程化的miRNA前体。
用于调节小型非编码RNA活性的重组DNA构建体的构建和描述公开于美国专利申请公布US 2009/0070898 A1、US2011/0296555 A1、US2011/0035839 A1中，所述专利申请全部以引用的方式整体并入本文。特别地，关于US2011/0035839 A1，参见例如，第122至135段中在标题“基因抑制元件”以及第188至190段中在标题“用于控制基因表达的工程化的异源miRNA下的部分。
重组DNA分子、构建体或载体可包含编码RNA或非编码RNA分子的可转录DNA或多核苷酸序列，其中所述RNA包含与由植物的内源性靶基因表达的mRNA分子的至少一个取代或部分至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列，其中所述可转录DNA序列可操作地连接至植物可表达启动子。所述RNA分子可靶向靶基因或转录物的成熟mRNA和/或内含子序列。根据许多实施方案，由靶向目标基因以进行抑制的重组DNA构建体编码的RNA可包含与SEQ ID NO:63-69中的任一个或编码SEQ ID NO:70-76中的任一个的内源性mRNA分子的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％互补的序列。根据一些实施方案，由靶向目标基因以进行抑制的重组DNA构建体编码的RNA可包含与SEQ ID NO:77-83中的任一个的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列。根据一些实施方案，由靶向目标基因以进行抑制的重组DNA构建体编码的RNA可包含SEQ ID NO:77-90中的任一个。
如本文所用，“植物”包括整株植物、经修饰的或转基因的植物、分生组织、枝器官/结构(例如，叶、茎和块茎)、根、花、花器官/结构(例如，苞片、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊、花药和胚珠)、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实(成熟子房)、植物组织(例如，维管组织、基本组织等)和细胞(例如，保卫细胞、卵细胞、花粉、叶肉细胞等)以及它们的子代。可在所公开的方法中使用的植物的类别通常与适于转化和育种技术的高等植物和低等植物的类别一样广泛，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物、木贼属植物、裸蕨植物、石松类、苔藓植物和多细胞藻类。
如本文所用，“经修饰的植物细胞”是指已经通过引入使用诱变或基因组编辑技术产生的突变或基因组编辑而进行修饰的植物细胞。如本文所用，“转基因植物细胞”是指用稳定整合的重组DNA转化的植物细胞，例如通过农杆菌介导的转化、使用包覆有重组DNA的微粒轰击或通过其他方式如定点整合。本公开的植物细胞可以是最初转化、编辑或突变的植物细胞，所述植物细胞以微生物或以子代植物细胞的形式存在，所述子代植物细胞再生为分化的组织，例如再生为具有稳定整合的重组DNA或引入的编辑或突变的经修饰的或转基因的植物，或源自经修饰的或转基因的植物或其子代植物的种子或花粉。如本文所用，“经修饰的植物”和“经修饰的植物部分”分别是指在这种植物或植物部分的至少一个细胞的基因组中具有使用诱变或基因组编辑技术产生的突变或基因组编辑的植物或植物部分。如本文所用，“转基因植物”和“转基因植物部分”分别是指在这种植物或植物部分的至少一个细胞的基因组中具有使用转化方法产生的稳定整合的重组DNA构建体或序列的植物或植物部分。
如本文所用，“对照植物”是指不含赋予增强的性状或改变的表型的本公开的重组DNA或编辑或突变的植物。对照植物用于鉴定并选择具有增强的性状或改变的表型的经修饰的或转基因的植物。适合的对照植物可以是用于产生经修饰的或转基因的植物的亲本株系的非转基因和未经修饰的植物，例如没有重组DNA或工程化的突变的野生型植物。适合的对照植物也可以是含有赋予其他性状的重组DNA、突变或修饰的经修饰的或转基因的植物，例如具有增强的除草剂耐受性的转基因植物。在一些情况下，适合的对照植物可以是不含重组DNA、突变或编辑的杂合或半合子修饰的或转基因的植物株系的子代，称为阴性分离子或阴性等基因系。
如本文所用，“繁殖体”包括减数分裂和有丝分裂的所有产物，包括但不限于植物、种子和能够繁殖新植物的植物部分。繁殖体包括整株植物、细胞、花粉、胚珠、花、胚、叶、根、茎、枝、分生组织、籽粒或种子或能够长成整株植物的任何植物部分。繁殖体还包括嫁接，其中将植物的一部分嫁接到不同植物(甚至是不同物种的植物)的另一部分，以产生活生物体。繁殖体还包括通过克隆或将减数分裂产物聚集在一起或使减数分裂产物聚集在一起以形成胚或受精卵(自然地或在人工干预下)而产生的所有植物和种子。
如本文所用，“子代”包括包含源自祖先植物的本公开的重组DNA、编辑或突变的任何植物、种子、植物细胞和/或可再生植物部分。对于转基因、编辑或突变，子代可以是纯合的或杂合的。子代可从由包含本公开的重组DNA、编辑或突变的经修饰的或转基因的植物产生的种子和/或从由用来自包含本公开的重组DNA、编辑或突变的经修饰的或转基因的植物的花粉或胚珠受精的植物产生的种子生长子代。
如本文所用，“性状”是植物或特定植物材料或细胞的生理、形态、生物化学或物理特征。在一些情况下，这种特征对于人眼是可见的，并且可机械地测量，如种子或植物大小、重量、形状、形式、长度、高度、生长速率和发育阶段，或者可通过生物化学技术进行测量，如检测种子或叶的蛋白质、淀粉、某些代谢物或油含量，或通过观察代谢或生理过程(例如通过测量对水分剥夺或特定盐或糖浓度的耐受性)或通过测量一种或多种基因的表达水平(例如，通过采用RNA印迹分析、RT-PCR、微阵列基因表达测定或报告基因表达系统)或通过农业观察，如高渗胁迫耐受性或产量。然而，可使用任何技术来测量转基因植物中任何选择的化合物或大分子的量、比较水平或差异。
如本文所用，“增强的性状”是指由于重组DNA在转基因植物中的稳定整合和表达产生的经修饰的或转基因的植物的特征。此类性状包括但不限于特征在于增强的植物形态、生理、生长和发育、产量、营养增强、抗病虫害或环境或化学耐受性的增强的农艺性状。在本公开的一些具体方面，增强的性状选自由以下组成的组：减少的从种植到成熟的天数、增加的茎杆大小、增加的叶片数量、增加的营养阶段的植株高度生长速率、增加的穗大小、增加的每个植株的穗干重、增加的每个穗的籽粒数量、增加的每个籽粒的重量、增加的每个植株的籽粒数量、减少的穗空粒、延长的籽粒灌浆期、降低的植株高度、增加的根分枝数量、增加的总根长、耐旱性、提高的水利用效率、耐寒性、提高的氮利用效率、增加的产量以及改变的表型，如表7-9和11-16中所示。在本公开的另一方面，性状是在非胁迫条件下增加的产量或在环境胁迫条件下增加的产量。胁迫条件可包括生物胁迫和非生物胁迫，例如，干旱、阴凉、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫侵染、线虫侵染、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、氮营养素利用率降低、磷营养素可用性降低和高植物密度。“产量”可受许多性质影响，所述性质包括但不限于植物高度、植物生物量、荚果数量、荚果在植物上的位置、节间数目、荚果破碎的发生率、籽粒大小、穗大小、穗尖灌浆、籽粒败育、结瘤和固氮的效率、养分同化的效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳同化、植物结构、抗倒伏性、种子发芽百分比、幼苗势以及幼年性状。产量还可受以下因素影响：发芽效率(包括在胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、花期和持续时间、穗数目、穗大小、穗重量、每个穗或荚果的种子数目、种子大小、种子的组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子灌浆的特征。
本文还使用的术语“性状修饰”涵盖相对于不包含本公开的重组DNA、编辑或突变的植物(例如野生型植物或阴性分离子)，通过在包含所述重组DNA、编辑或突变的植物中产生特征的可检测差异来改变天然存在的性状。在一些情况下，可定量地评价性状修饰。例如，与对照植物相比，性状修饰可导致观察到的性状特征或表型的增加或减少。已知修饰的性状中可存在自然变异。因此，与对照植物相比，所观察到的性状修饰导致植物中性状特征或表型的正态分布和量级的变化。
本公开涉及具有改善的经济上重要的特征、更具体地增加的产量的植物。更具体地，本公开涉及包含本公开的重组多核苷酸、编辑或突变的经修饰的或转基因的植物，其中与对照植物相比，所述植物具有增加的产量。与对照植物相比，本公开的许多植物表现出增加的产量或改善的产量性状成分。在一个实施方案中，本公开的经修饰的或转基因的植物表现出与产量有关的改善的性状，包括但不限于增加的氮利用效率、增加的氮胁迫耐受性、增加的水利用效率和增加的耐旱性，如下文所定义和讨论的。
产量可被定义为来自作物的具有经济价值的可测量产物。产量可在数量和/或质量范围内定义。产量可直接取决于若干因素，例如器官的数量和大小、植物结构(如分支的数量、植物生物量等)、花期和持续时间、籽粒灌浆期。根构型和发育、光合效率、养分吸收、胁迫耐受性、早期生长势、延迟的衰老和功能性保绿性表型可以是决定产量的重要因素。因此，优化上述因素可有助于增加作物产量。
本文中提及产量相关性状的增加也可被认为是指植物的一个或多个部分的生物量(重量)的增加，所述一个或多个部分可包括地上和/或地下(可收获)植物部分。特别地，此类可收获部分是种子，并且本公开的方法的执行产生相对于适合对照植物的种子产量，具有增加的产量且特别是增加的种子产量的植物。术语植物的“产量”可涉及所述植物的营养生物量(根和/或枝生物量)、繁殖器官和/或繁殖体(如种子)。
本公开的植物的增加产量可用许多方式(包括容重、每个植株的种子数目、种子重量、每单位面积的种子数目(例如，每英亩的种子，或种子重量)、蒲式耳/英亩、吨/英亩或公斤/公顷)度量。例如，玉米产量可测量为每单位生产面积的去壳玉米粒的产量，例如以蒲式耳/英亩或公吨/公顷为单位。还经常基于水分调整来报告产量，例如15.5％的水分。增加的产量可归因于关键生物化学化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用率提高，或者归因于对环境胁迫(如冷、热、干旱、盐、阴凉、高植物密度以及害虫或病原体侵袭)的反应改善。由于植物生长调控因子的改变的表达或细胞周期或光合作用途径的改变，本公开还可用于提供具有改善的生长和发育且最终增加的产量的植物。同样令人感兴趣的是产生相对于种子成分而言表现出增加的产量的植物，所述种子成分可以或可以不对应于总体植物产量的增加。
在一个实施方案中，“苜蓿产量”也可以饲料产量、收获时地上生物量的量来测量。导致生物量增加的主要因素包括营养生长、树枝、节和节间、叶面积和叶面积指数增加。
在另一个实施方案中，“芥化产量”也可以荚果数量、每个植株的荚果数、每个节的荚果数量、节间的数量、荚果破碎的发生率、每个角果的种子数、每个角果的种子重量、改善的种子、油或蛋白质组成来测量。
另外，“玉米(corn)或玉米(maize)产量”也可测量为每单位生产面积的去壳玉米粒的产量、每英亩的穗数、每个穗的籽粒行数和每行的籽粒数、每个穗的籽粒数或重量、每个籽粒的重量、穗数、穗重、新鲜或干燥的穗生物量(重量)。
在又一个实施方案中，“棉花产量”可测量为每个植株的棉铃数、棉铃的大小、纤维质量、以g/植物为单位的籽棉产量、以lb/英亩为单位的籽棉产量、以lb/英亩为单位的皮棉产量以及捆的数量。
“水稻产量”的具体实施方案还可包括每丘的穗数、每丘的籽粒和每穗的实粒数。
“大豆产量”的又一个实施方案还可包括每个植株的豆荚数、每英亩的豆荚数、每个植株的种子、每个豆荚的种子、每粒种子的重量、每个豆荚的重量、每个节的豆荚数、节数以及每个植株的节间数。
在又一个实施方案中，“甘蔗产量”可测量为茎产量(吨/英亩；kg/公顷)、总可回收糖(磅/吨)和糖产量(吨/英亩)。
在又一个实施方案中，“小麦产量”可包括：每单位面积的谷物、籽粒数量、籽粒重量、籽粒大小、每头的籽粒数、每头的种子数、每个植株的种子、每英亩的头数、每株有活力的分蘖的数量、种子的组成(例如碳水化合物、淀粉、油和蛋白质)和种子灌浆的特征。
上文针对许多核心作物定义了术语“产量”、“种子产量”。术语“增加的”、“改进的”、“增强的”是可互换的，并且在本文中定义。
在另一个实施方案中，本公开提供了一种用于产生具有改变的表型、增强的性状或增加的产量的植物的方法；所述方法的执行给予植物改变的表型、增强的性状或增加的产量。
“增加的产量”可表现为以下中的一种或多种：(i)植物的一个或多个部分，特别是植物的地上(可收获)部分的植物生物量(重量)增加、根生物量增加(根数增加，根厚度增加、根长增加)或任何其他可收获部分植物的生物量增加；或(ii)增加的早期生长势，在本文中定义为发芽后约三周改善的幼苗地上面积。“早期生长势”是指尤其是在植物生长早期期间的活跃、健康、充分平衡的生长，并且可以因提高的植物适应性所致，提高的植物适应性的原因是例如这些植物更好地适应它们的环境(例如优化能量资源的用途，营养摄入以及在枝与根之间的碳分配)。例如，玉米的早期生长势是玉米种子在播种后发芽和萌发的能力与玉米植株在萌发后生长和发育的能力的组合。具有早期生长势的植物还显示出增加的幼苗存活和更好的作物形成，这通常产生高度均匀的田地，其中大多数植物基本上同时达到发育的各个阶段，这通常产生增加的产量。因此，早期生长势可通过测量多种因素如籽粒重量(kernel weight)、萌发百分比、出苗百分比、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根和枝生物量、冠层大小以及颜色和许多其他因素等确定。
此外，增加的产量也可表现为(iii)增加的总种子产量，这可能归因于以下中的一种或多种：基于每个植株和/或基于单粒种子由于种子重量增加所致的种子生物量(种子重量)增加；每个植株的穗数量增加；豆荚数量增加；节数量增加；每个穗/植株的花(“小花”)数量增加；种子灌浆率增加；灌浆种子的数量增加；种子大小增加(长度，宽度，面积，周长)，这也会影响种子的组成；和/或种子体积增加，这也可影响种子的组成。在一个实施方案中，增加的产量可以是增加的种子产量，并且选自以下中的一种或多种：(i)增加的种子重量；(ii)增加的灌浆种子的数量；和(iii)增加的收获指数。
增加的产量也可(iv)导致构型改变，或者由于植物构型改变而发生。
增加的产量还可表现为(v)增加的收获指数，其表示为可收获部分(如种子)的产量与总生物量的比率
增加的产量还可表现为(vi)增加的籽粒重量，其是根据计数的灌浆种子的数量和它们的总重量而推断。籽粒重量增加可归因于种子大小和/或种子重量增加、胚大小增加、胚乳大小增加、糊粉层和/或盾片增加或相对于种子其他部位的增加导致籽粒重量增加。
增加的产量还可表现为(vii)增加的穗生物量，其是穗的重量，并且可基于每个穗、每个植株或每块地表示。
本公开还延伸至植物的可收获部分，如但不局限于种子、叶、果实、花、圆荚、荚果、角果、坚果、茎、根茎、块茎以及球茎。本公开此外涉及源自这种植物的可收获部分的产物，如干燥颗粒、粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
本公开提供了一种用于增加植物的“产量”或植物或植物部分的“广阔英亩产量”的方法，其被定义为每单位面积的可收获植物部分，例如种子或种子重量(每英亩、磅/英亩、蒲式耳/英亩、吨/英亩、吨/英亩或公斤/公顷)。
本公开还提供了一种通过产生包含本公开的多核酸序列的植物来改变植物的表型、增强性状或增加产量的方法，其中所述植物可与自身、来自同一植物株系的第二植物、野生型植物或来自不同植物株系的植物杂交以产生种子。所得植物的种子可从可育植物中收获，并且用于生长本公开的植物的子代。除了用重组DNA构建体直接转化植物之外，可通过将具有稳定整合的重组DNA构建体的第一植株与缺乏所述DNA的第二植株杂交来制备转基因植株。举例来说，可将重组DNA引入可经受转化以产生转基因植物的第一植物株系中，所述第一植物株系可与第二植物株系杂交以使重组DNA渗入第二植物株系中。
与对照植物相比，用重组DNA构建体转化并且具有本公开的多核苷酸的选择的转基因植物提供改变的表型、增强的性状或增加的产量。与重组DNA相关的遗传标记物的使用可促进对所需重组DNA纯合的转基因子代的产生。携带两种亲本性状的DNA的子代植物可与亲本株系回交多次(例如通常6至8代)以产生除另一转基因亲本株系的重组DNA之外，基因型大致上与一种再生原始转基因亲本株系相同的子代植物。术语“子代”表示通过本公开的方法制备的、含有如本文所述的重组多核苷酸的亲本植物的任何世代的子代。
如本文所用，“氮利用效率”是指导致植物产量、生物量、生长势和每施氮单位生长速率增加的过程。这些过程可包括植物对氮的吸收、同化、累积、信号传导、感测、再迁移以及对氮的利用。
如本文所用，“氮限制条件”是指提供对于充分或成功植物代谢、生长、繁殖成功和/或存活力所需的氮的少于最佳量的生长条件或环境。
如本文所用，“提高的氮胁迫耐受性”是指植物在经受少于最佳量的可用/施用氮时或在氮限制条件下正常生长、发育或出产，或更快或更好地生长、发育或出产的能力。
如本文所用，“提高的氮利用效率”是指植物在经受与在正常或标准条件下相同量的可用/施用氮时比正常情况更快或更好地生长、发育或出产的能力；当经受少于最佳量的可用/施用氮时或在氮限制条件下，植物正常生长、发育或出产或更快或更好地生长、发育或出产的能力。
提高的植物氮利用效率可在田间转化为在供应较少量氮的同时收获相似数量的产量，或者通过供应最佳/足够量的氮获得的增加的产量。提高的氮利用效率可改善植物的氮胁迫耐受性，并且还可改善作物品质和种子的生物化学成分，如蛋白质产量和油脂产量。术语“提高的氮利用效率”、“增强的氮利用效率”和“氮胁迫耐受性”在本公开中可互换使用来指代在氮限制条件下具有提高的生产力的植物。
如本文所用，“水利用效率”是指蒸腾的每单位水蒸气由叶片同化的二氧化碳的量。它是控制干旱环境下植物生产力的最重要的性状之一。“耐旱性”是指植物适应干旱(arid)或干旱(drought)条件的程度。植物对缺水的生理反应包括叶片萎蔫、叶片面积减少、叶片脱落以及通过将养分引导至植物的地下部分来刺激根生长。由于植物的资源无法支持根生长，因此植物在开花和种子发育(繁殖阶段)期间更容易受到干旱的影响。此外，脱落酸(ABA)(一种植物胁迫激素)诱导叶片气孔(参与气体交换的微观孔隙)的闭合，从而减少通过蒸腾作用造成的水流失并降低光合作用的速率。这些反应在短期内提高了植物的水利用效率。术语“提高的水利用效率”、“增强的水利用效率”和“提高的耐旱性”在本公开中可互换使用来指在水限制条件下具有提高的生产力的植物。
如本文所用，“提高的水利用效率”是指植物在经受与在正常或标准条件下相同量的可用/施用水时比正常情况更快或更好地生长、发育或出产的能力；当经受减少量的可用/施用水(水输入)时或在水胁迫或失水胁迫条件下，植物正常生长、发育或出产或更快或更好地生长、发育或出产的能力。
如本文所用，“提高的耐旱性”是指植物在经受减少量的可用/施用水和/或在急性或慢性干旱条件下正常生长、发育或出产，或比正常更快或更好地生长、发育或出产的能力；在经受减少量的可用/施加的水(水输入)时或在失水胁迫条件下或在急性或慢性干旱条件下，植物正常生长、发育或出产的能力。
如本文所用，“干旱胁迫”是指导致缺水并使植物经受胁迫和/或对植物组织的损害和/或不利地影响谷物/作物产量的干旱时期(急性或慢性/长期)；导致水不足和/或温度升高并使植物经受胁迫和/或对植物组织的损害和/或不利地影响谷物/作物产量的干燥时期(急性或慢性/长期)。
如本文所用，“缺水”是指提供少于最佳量的适当/成功的植物生长和发育所需的水的条件或环境。
如本文所用，“水胁迫”是指提供比植物/作物的充足/成功生长/发育所需的水不适当(更少/不足或更多/过量)量的水，从而使植物经受胁迫和/或对植物组织的损害和/或不利地影响谷物/作物产量的条件或环境。
如本文所用，“失水胁迫”是指提供比植物/作物的充足/成功生长/发育所需的水更少/不足量的水，从而使植物经受胁迫和/或对植物组织的损害和/或不利地影响谷物产量的条件或环境。
如本文所用，“多核苷酸”是包含多个聚合的核苷酸的核酸分子。多核苷酸可被称为核酸、寡核苷酸或其任何片段。在许多情况下，多核苷酸编码多肽(或蛋白质)或其结构域或片段。另外，多核苷酸可包含启动子、内含子、增强子区域、聚腺苷酸化位点、翻译起始位点、5’或3’非翻译区、报告基因、选择性标记物、可评分标记物等。多核苷酸可以是单链或双链DNA或RNA。多核苷酸任选地包含经修饰的碱基或经修饰的主链。多核苷酸可以是例如基因组DNA或RNA、转录物(如mRNA)、cDNA、PCR产物、克隆的DNA、合成DNA或RNA等。多核苷酸可与碳水化合物、脂质、蛋白质或其他材料组合以执行特定的活动，如转化或形成诸如肽核酸(PNA)的组合物。多核苷酸可包含呈有义或反义取向的序列。“寡核苷酸”基本上等同于术语扩增引物、引物、寡聚物、元件、靶标和探针，并且优选是单链的。
如本文所用，“重组多核苷酸”或“重组DNA”是不呈其天然状态的多核苷酸，例如，多核苷酸包含未在自然界中发现的一系列核苷酸(表示为核苷酸序列)，或在除自然存在的背景中的多核苷酸；例如，与通常在自然界中与之邻近的多核苷酸分离，或与通常不邻近于其的多核苷酸相邻(或邻接)。“重组多核苷酸”或“重组DNA”是指已在包含含有天然存在的DNA或cDNA或合成DNA的DNA的细胞外进行遗传工程化和构建的多核苷酸或DNA。例如，可将所讨论的多核苷酸克隆到载体中，或者以其他方式与一种或多种另外的核酸重组。
如本文所用，“多肽”包含多个连续的聚合的氨基酸残基，例如，至少约15个连续的聚合的氨基酸残基。在许多情况下，多肽包含一系列聚合的氨基酸残基，其是转录调控因子或其结构域或部分或片段。另外，所述多肽可包含：(i)定位结构域；(ii)活化结构域；(iii)阻抑结构域；(iv)低聚结构域；(v)蛋白质-蛋白质相互作用结构域；(vi)DNA结合结构域；等。所述多肽任选地包含经修饰的氨基酸残基、未由密码子编码的天然存在的氨基酸残基、非天然存在的氨基酸残基。
如本文所用，“蛋白质”是指一系列氨基酸、寡肽、肽、多肽或其部分，无论是天然存在的还是合成的。
如本文所用，“重组多肽”是通过重组多核苷酸的翻译产生的多肽。
“合成多肽”是通过使用本领域中已知的方法连续聚合分离的氨基酸残基而产生的多肽。
“分离的多肽”(无论是天然存在的还是重组的多肽)比野生型细胞中处于其天然状态的多肽在细胞中的富集程度更高，例如，超过5％富集、超过约10％富集、或超过约20％或超过约50％或更高富集，例如，可替代地表示：相对于100％下标准化的野生型，105％、110％、120％、150％或更高富集。这种富集不是野生型植物自然反应的结果。可替代地或另外地，例如通过各种蛋白质纯化方法中的任一种，将分离的多肽与通常与之缔合的其他细胞组分分离。
如本文所用，“功能片段”是指保留全长多肽的全部或部分分子、生理或生物化学功能的本文提供的多肽的一部分。功能片段通常含有在序列表中提供的多肽中鉴定的结构域，如Pfam结构域(参见下文)。
如本公开中使用的“重组DNA构建体”包含至少一个具有在植物细胞中可操作的启动子和本公开的多核苷酸的表达盒。DNA构建体可用作将重组DNA构建体递送至植物细胞中的手段，以实现重组分子稳定整合至植物细胞基因组中。在一个实施方案中，所述多核苷酸可编码蛋白质或蛋白质的变体或蛋白质的片段，所述蛋白质的片段在功能上被定义为在包括植物细胞、植物部分、外植体和整株植物的转基因宿主细胞中维持活性。在另一个实施方案中，多核苷酸可编码干扰调控表达的内源性类别的小RNA(包括但不限于taRNA、siRNA和miRNA)的功能的非编码RNA。重组DNA构建体使用本领域普通技术人员已知的方法组装，并且通常包含可操作地连接至DNA的启动子，其表达提供增强的农艺性状。
其他构建体组分可包括另外的调控元件，如用于增强转录的5’前导序列和内含子、3’非翻译区(如聚腺苷酸化信号和位点)以及用于转运或靶向或信号肽的DNA。
如本文所用，“同源物”或“同系物”是指执行相同生物学功能的一组蛋白质中的蛋白质，例如，属于相同Pfam蛋白质家族并在本公开的转基因植物中提供共同增强的性状的蛋白质。同源物由同源基因表达。关于同源基因，同源物包括直向同源物，例如，在不同物种中表达的通过物种形成从共同祖先基因进化并编码保留相同功能的蛋白质的基因；但不包括旁系同源物，即通过复制相关但进化为编码具有不同功能的蛋白质的基因。同源基因包括天然存在的等位基因和人工产生的变体。
遗传密码的简并性提供用不同的碱基取代基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基的可能性，而不会引起从所述基因产生的多肽的氨基酸序列改变。当进行最佳比对时，同源蛋白质或其相应的核苷酸序列在被鉴定为与在植物细胞中表达时赋予增强的性状或改变的表型相关的蛋白质或其相应核苷酸序列的全长上具有通常具有至少约60％的同一性，在一些情况下至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或甚至至少约99.5％的同一性。在本公开的一方面，同源蛋白质可从本文公开的序列构建的蛋白质和同源物的共有氨基酸序列具有至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约99.5％的同一性。
通过蛋白质序列的比较，例如人工或通过使用利用已知序列比较算法(如BLAST和FASTA)的基于计算机的工具，可从序列相似性推断出同源物。序列搜索和局部比对程序(例如BLAST)可用于针对各种生物体的蛋白质序列的数据库搜索基础生物体的查询蛋白质序列，以查找相似序列，并且汇总期望值(E值)可用于测量序列相似性的水平。因为对特定生物体而言，具有最低E值的蛋白质命中不一定是直系同源物，或是唯一的直系同源物，所以使用相互查询来筛选具有显著E值的命中序列以进行直系同源物鉴定。相互查询需要针对基础生物体的蛋白质序列的数据库搜索重大命中。当相互查询的最佳匹配是查询蛋白质本身或查询蛋白质的旁系同源物时，命中可被鉴定为直系同源物。通过相互查询过程，直系同源物与所有同源物中的旁系同源物进一步区别开来，从这允许推断基因的功能等效性。由在本发明的转基因植物中有用的DNA编码的同源物的另一方面是由于天然序列中一个或多个氨基酸的缺失或插入而与公开的蛋白质不同的那些蛋白质。
作为一种或多种已知的保守氨基酸取代的结果，其他功能性同源蛋白质的一个或多个氨基酸与本文公开的性状改善蛋白质的氨基酸不同，例如，缬氨酸是丙氨酸的保守替代物，并且苏氨酸是丝氨酸的保守替代物。用于天然序列内的氨基酸的保守性取代可选自所述天然存在的氨基酸所属的类别的其他成员。这些不同类别中的代表性氨基酸包括但不限于：(1)酸性(带负电荷)氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性(带正电荷的)氨基酸，如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；(3)中性极性氨基酸，如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；和(4)中性非极性(疏水性)氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。天然蛋白质或多肽中氨基酸的保守替代物可选自天然存在的氨基酸所属的组的其他成员。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。天然保守的氨基酸取代基是：缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。本公开的另一方面包括由于天然序列中的一个或多个氨基酸的缺失或插入而与所描述的蛋白质序列的一个或多个氨基酸不同的蛋白质。
通常，术语“变体”是指与参考(天然)多核苷酸或多肽相比，分别在其核苷酸或氨基酸序列上具有一些合成或天然产生的差异的分子。这些差异包括天然多核苷酸或氨基酸序列中此类改变的取代、插入、缺失或任何所需的组合。
关于多核苷酸变体，当前公开的多核苷酸与多核苷酸变体之间的差异是有限的，使得前者和后者的核苷酸序列总体上相似，并且在许多区域中相同。由于遗传密码的简并性，前者与后者核苷酸序列之间的差异可以是沉默的(例如，由多核苷酸编码的氨基酸是相同的，并且变体多核苷酸序列与目前公开的多核苷酸编码同一氨基酸序列)。变体核苷酸序列可编码不同的氨基酸序列，在这种情况下，相对于类似公开的多核苷酸序列，这种核苷酸差异将导致氨基酸取代、添加、缺失、插入、截短或融合。这些变异可产生编码共有至少一种功能特征的多肽的多核苷酸变体。遗传密码的简并性还指示许多不同的变体多核苷酸可编码相同和/或基本相似的多肽。
如本文所用，“基因”或“基因序列”是指基因、其互补序列及其5’和/或3’非翻译区(UTR)及其互补序列的部分或完整编码序列。基因也是遗传的功能单元，并且在物理上是沿着涉及产生多肽链的DNA(或RNA，在RNA病毒的情况下)分子的特定核苷酸区段或序列。后者可进行后续加工，如化学修饰或折叠以获得功能性蛋白质或多肽。举例来说，转录调控因子基因编码可转录调控因子多肽，其可起作用或需要加工以充当转录的起始子。
如本文使用，术语“启动子”通常是指参与识别和结合RNA聚合酶II和其他蛋白质(反式作用转录因子)以启始转录的DNA分子。启动子可最初从基因的基因组拷贝的5’未翻译区域(5’UTR)分离。或者，启动子可为合成产生的或操纵的DNA分子。启动子也可以是嵌合的，即通过两个或更多个异源DNA分子的融合产生的启动子。植物启动子包括获自植物、植物病毒、真菌和细菌如土壤杆菌属和根瘤菌属细菌的启动子DNA。
在植物的所有或大多数组织中启动转录的启动子被称为“组成型”启动子。在发育的某些时期或阶段启动转录的启动子被称为“发育”启动子。其表达在植物的某些组织中相对于其他植物组织得到增强的启动子被称为“组织增强”或“组织优选”的启动子。在植物的特定组织中表达、在其他植物组织中很少表达或不表达的启动子被称为“组织特异性”启动子。例如，“种子增强的”或“种子优选的”启动子相对于植物的其他组织在种子组织中驱动相关的转基因或可转录的核苷酸序列(即与所述启动子可操作地连接)的增强或更高的表达水平，而“种子特异性”启动子将驱动种子组织中相关转基因或可转录核苷酸序列(即与启动子可操作地连接)的表达，而在植物的其他组织中几乎没有表达。也可以此方式描述其他组织类型(如根、分生组织、叶等)的其他类型的组织特异性或组织优选的启动子。在植物的某一细胞类型(例如小孢子母细胞)中表达的启动子被称为“细胞类型特异性”启动子。“诱导型”启动子是响应于环境刺激(诸如寒冷、干旱或光照)或其他刺激(诸如伤害或化学应用)而起始转录的启动子。植物中许多生理和生物化学过程表现出约24小时周期的内源性节律。“昼夜启动子”是在昼夜节律振荡器的控制下表现出改变的表达谱的启动子。昼夜调控受制于环境输入(如光线和温度)以及昼夜节律钟的协调。
种子优选或种子特异性启动子的实例包括来自种子组织中表达的基因的启动子，如美国专利号5,420,034中公开的油菜籽蛋白、美国专利号6,433,252中公开的玉米L3油脂蛋白、由Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2):157-166公开的玉米蛋白Z27、由Belanger等人(1991)Genetics 129:863-872公开的球蛋白1、由Russell(1997)同上公开的谷蛋白1以及由Stacy等人(1996)Plant Mol Biol.31(6):1205-1216公开的抗氧化过氧化物氧还酶(Per1)。每个以上参考文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。例如，在国际申请号PCT/US 2017/057202中提供了分生组织优选的或分生组织特异性的启动子的实例，所述申请的内容和公开内容以引用的方式并入本文。
可在植物中使用的组成型启动子的许多实例是本领域已知的，如花椰菜花叶病毒(CaMV)35S和19S启动子(参见例如，美国专利号5,352,605)、增强的CaMV 35S启动子，如具有Omega区的CaMV 35S启动子(参见例如Holtorf,S.等人,Plant Molecular Biology,29:637-646(1995)或双重增强的CaMV启动子(参见例如，美国专利号5,322,938)、玄参花叶病毒(FMV)35S启动子(参见例如，美国专利号6,372,211)、紫茉莉花叶病毒(MMV)启动子(参见例如，美国专利号6,420,547)、花生褪绿条纹病毒启动子(参见例如，美国专利号5,850,019)、胭脂碱或章鱼碱启动子、泛素启动子，如大豆聚泛素启动子(参见例如，美国专利号7,393,948)、拟南芥S-腺苷甲硫氨酸合成酶启动子(参见例如，美国专利号8,809,628)等，或前述启动子的任何功能性部分，上述参考文献各自的内容和公开内容以引用的方式并入本文。
可在单子叶植物如谷物或玉米植物中使用的组成型启动子的例子包括例如，各种肌动蛋白基因启动子，如水稻肌动蛋白1启动子(参见例如，美国专利号5,641,876；还参见SEQ ID NO:75或SEQ ID NO:76)和水稻肌动蛋白2启动子(参见例如，美国专利号6,429,357；还参见例如SEQ ID NO:77或SEQ ID NO:78)、CaMV 35S或19S启动子(参见例如，美国专利号5,352,605；对于CaMV 35S还参见例如，SEQ ID NO:79)、玉米泛素启动子(参见例如，美国专利号5,510,474)、薏苡聚泛素启动子(参见例如，SEQ ID NO:80)、水稻或玉米Gos2启动子(参见例如，The Plant Journal,2(6):837-44 1992；对于水稻Gos2启动子，还参见例如SEQ ID NO:81)、FMV 35S启动子(参见例如，美国专利号6,372,211)、双重增强的CMV启动子(参见例如，美国专利号5,322,938)、MMV启动子(参见例如，美国专利号6,420,547；还参见，例如SEQ ID NO:82)、PCLSV启动子(参见例如，美国专利号5,850,019；还参见例如，SEQ IDNO:83)、Emu启动子(参见例如，Last等人,Theor.Appl.Genet.81:581(1991)；和Mcelroy等人,Mol.Gen.Genet.231:150(1991))，来自玉米、水稻或其他物种的微管蛋白启动子、胭脂碱合酶(nos)启动子、章鱼碱合酶(ocs)启动子、甘露碱合酶(mas)启动子或植物醇脱氢酶(例如，玉米Adh1)启动子、本领域已知或以后鉴定的在谷物或玉米植物中提供组成型表达的任何其他启动子(包括病毒启动子)、可用于单子叶植物或谷物植物中的本领域已知的任何其他组成型启动子以及任何上述启动子的任何功能序列部分或截短。每个以上参考文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。
如本文使用，术语“前导序列”是指从基因的基因组拷贝的未翻译5’区域(5’UTR)分离的DNA分子并且总体上定义为转录起始位点(TSS)与蛋白质编码序列起始位点之间的核苷酸区段。或者，前导序列可以是合成产生或操纵的DNA元件。前导序列可用作调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的5’调控元件。如本文所用，术语“内含子”是指可从基因的基因组拷贝中分离或鉴定的DNA分子，并且通常可被定义为在翻译之前的mRNA加工过程中剪接的区域。或者，内含子可以是合成产生或操纵的DNA元件。内含子可含有实现可操作地连接的基因的转录的增强子元件。内含子可用作调节可操作地连接的可转录多核苷酸分子的表达的调控元件。DNA构建体可包括内含子，并且内含子可以或可以不相对于可转录多核苷酸分子。
如本文所用，术语“增强子”或“增强子元件”是指顺式作用转录调控元件，也被称为顺式元件，其赋予总体表达模式的方面，但是通常不足以单独驱动可操作地连接的多核苷酸的转录。不同于启动子，增强子元件通常不包括转录起始位点(TSS)或TATA盒或等效序列。启动子可天然地包含一个或多个影响可操作地连接的多核苷酸的转录的增强子元件。分离的增强子元件还可融合至启动子以产生嵌合启动子顺式元件，其赋予基因表达的总体调节的方面。启动子或启动子片段可包含一个或多个实现可操作地连接的基因的转录的增强子元件。许多启动子增强子元件被认为结合DNA结合蛋白质且/或影响DNA布局，产生选择性允许或限制RNA聚合酶接近DNA模板或促进选择性开启转录启始位点处的双螺旋的局部构型。增强子元件可起作用来结合调控转录的转录因子。一些增强子元件结合多于一个转录因子，并且转录因子可以不同亲和力与多于一个增强子结构域相互作用。
本公开的表达盒可包含位于基因的5’或3’或基因内的“转运肽”或“靶向肽”或“信号肽”分子。这些术语通常是指当与目标蛋白质连接时将蛋白质引导至特定组织、细胞、亚细胞位置或细胞器的肽分子。实例包括但不限于叶绿体转运肽(CTP)、叶绿体靶向肽、线粒体靶向肽、核靶向信号、核输出信号、液泡靶向肽和液泡分选肽。对于使用叶绿体转运肽的描述，参见美国专利号5,188,642和美国专利号5,728,925。对于本公开中拟南芥属EPSPS基因的转运肽区域的描述，参见Klee,H.J.等人(MGG(1987)210:437-442。本公开的表达盒还可包含一个或多个内含子。本公开的表达盒可在盒的3’端附近包含DNA，所述DNA充当终止来自异源核酸的转录的信号并且指导所得mRNA的聚腺苷酸化。这些通常被称为“3’-非翻译区”或“3’-非编码序列”或“3’-UTR”。“3’非翻译序列”意指位于结构核苷酸序列下游的DNA序列并且包括编码聚腺苷酸化和其他能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列。聚腺苷酸化信号在植物中起到向mRNA前体3’端添加多聚腺苷酸核苷酸的功能。聚腺苷酸化序列可来源于天然基因、各种植物基因或T-DNA。聚腺苷酸化序列的一个实例是胭脂碱合酶3’序列(nos 3’；Fraley等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-4807,1983)。Ingelbrecht等人,Plant Cell 1:671-680,1989举例说明了不同3’非翻译序列的使用。
本公开的表达盒也可含有一种或多种基因，所述一种或多种基因编码选择性标记物并赋予对选择剂如抗生素或除草剂的抗性。许多选择性标记物基因是本领域已知的，并且可在本公开中使用：赋予对诸如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、壮观霉素(aadA)、美国专利公布2009/0138985A1和庆大霉素(aac3和aacC4)的抗生素的耐受性，或赋予对诸如草甘膦(例如，5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，美国专利号5,627,061；美国专利号5,633,435；美国专利号6,040,497；美国专利号5,094,945)、磺酰除草剂(例如，乙酰羟酸合酶或乙酰乳酸合酶，赋予对乙酰乳酸合酶抑制剂如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基氧基苯甲酸酯和邻苯二甲酰胺的耐受性(美国专利6,225,105；5,767,366；4,761,373；5,633,437；6,613,963；5,013,659；5,141,870；5,378,824；5,605,011))、双丙氨膦或膦丝菌素或衍生物(例如，膦丝菌素乙酰转移酶(bar)对草丁膦或草铵膦的耐受性)(美国专利5,646,024；5,561,236；5,276,268；5,637,489；5,273,894)；麦草畏(麦草畏单加氧酶，专利申请公布US2003/0115626A1)或稀禾定(修饰的乙酰辅酶A羧化酶，以赋予对环己二酮的耐受性)和芳氧基苯氧基丙酸酯(吡氟氯禾灵，美国专利号6,414,222)的除草剂的耐受性的选择性标记物基因。
本公开的转化载体可含有一个或多个“表达盒”，每个表达盒包含与目标多核苷酸序列可操作连接的天然或非天然植物启动子，所述目标多核苷酸序列与3’UTR序列和终止信号可操作地连接，用于在适当的宿主细胞中表达。它通常还包含正确翻译多核苷酸或转基因所需的序列。本文中使用的术语“转基因”是指人工并入宿主细胞基因组的多核苷酸分子。这种转基因可与宿主细胞异源。术语“转基因植物”是指包含这种转基因的植物。编码区通常编码目标蛋白质，但是也可编码目标功能性RNA(例如反义RNA，非翻译的RNA，以有义或反义方向)、miRNA、非编码RNA，或在抑制或过表达目标基因序列中使用的合成RNA。包含目标核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，这意味着它的至少一种组分相对于它的至少一种其它组分是异源的。如本文所用，术语“嵌合”是指由两个或两个以上遗传上不同的来源产生的DNA分子，例如来自一种基因或生物体的第一分子和来自另一种基因或生物体的第二分子。
本公开中的重组DNA构建体通常包含3’元件，所述3’元件通常含有聚腺苷酸化信号和位点。已知的3'元件包括例如美国专利号6,090,627中公开的来自诸如nos 3’、tml3’、tmr 3’、tms 3’、ocs 3’、tr7 3’的根癌土壤杆菌基因的元件；来自诸如小麦(普通小麦)热休克蛋白17(Hsp17 3’)、小麦泛素基因、小麦果糖-1,6-二磷酸酶基因、水稻谷蛋白基因、水稻乳酸脱氢酶基因和水稻β-微管蛋白基因的植物基因的3’元件，其全部公开于美国专利申请公布2002/0192813 A1中；以及豌豆(豌豆(Pisum sativum))二磷酸核酮糖羧化酶基因(rbs 3’)和来自宿主植物内的基因的3’元件。
转基因植物可包含本文公开的一种或多种多核苷酸的堆叠，从而导致产生多个多肽序列。可通过传统育种方法中的一种或两种或通过遗传工程化方法获得包含多核苷酸堆叠的转基因植物。这些方法包括但不限于使各自包含目标多核苷酸的单独转基因品系杂交，用第二基因转化包含本文公开的第一基因的转基因植物，以及将基因共转化到单个植物细胞中。基因的共转化可使用包含多种基因或在多个载体上分别携带的基因的单个转化载体来进行。
作为传统转化方法的替代，可将DNA序列(如转基因，表达盒等)经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本发明的重组DNA构建体和分子可包含供体模板序列，所述供体模板序列包含至少一种转基因、表达盒或其他DNA序列，以用于插入植物或植物细胞的基因组中。用于定点整合的这种供体模板还可包含侧接插入序列(即，待被插入植物基因组中的序列、转基因、盒等)的一个或两个同源臂。本公开的重组DNA构建体还可包含表达盒，所述表达盒编码位点特异性核酸酶和/或任何相关蛋白质以进行定点整合，或者位点特异性核酸酶和/或相关蛋白质可分开提供。表达核酸酶的盒可与供体模板存在于相同的分子或载体中(顺式)，或存在于单独的分子或载体中(反式)。
可潜在地选择植物的基因组内的任何位点或基因座以用于本文提供的转基因、构建体或可转录DNA序列的定点整合。用于定点整合的若干方法在本领域中是已知的，涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同的蛋白质(或蛋白质复合物和/或指导RNA)。简言之，如本领域中所理解的，在修复由核酸酶引入的DSB或切口的过程中，供体模板DNA可被整合到DSB或切口的位点处或附近的基因组中。供体模板中同源臂的存在可在修复过程中通过同源重组促进插入序列采用和靶向到植物基因组中，尽管插入事件也可通过非同源末端连接(NHEJ)发生。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点的序列。
如本文所用，术语“同源臂”是指与被转化的植物或植物细胞中的靶序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的多核苷酸序列。同源臂可包含至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少250个、至少500个或至少1000个核苷酸。
作为抑制的替代，靶基因可替代地是诱变或基因组编辑的靶标，从而导致靶基因的功能丧失。植物诱变技术(不包括基因组编辑)可包括化学诱变(即，用化学诱变剂处理，如叠氮化物、羟胺、亚硝酸、吖啶、核苷酸碱基类似物或烷基化剂，例如EMS(乙基磺酸乙酯)，MNU(N-甲基-N-亚硝基脲)等)、物理诱变(例如，γ射线、X射线、UV、离子束、其他形式的辐射等)以及插入诱变(例如，转座子或T-DNA插入)。植物或各个植物部分、植物组织或植物细胞可进行诱变。可再生经处理的植物以收集种子或产生子代植物，并且可将经处理的植物部分、植物组织或植物细胞发育或再生为植物或其他植物组织。用化学或物理诱变技术产生的突变可包括移码、错义或无义突变，从而导致目标基因的功能或表达丧失。可基于可观察的性状或表型(例如，本文所述的任何性状或表型)来筛选和选择已经进行了诱变或基因组编辑的植物。
一种诱变基因的方法称为“TILLING”(用于靶向基因组中的诱导局部损伤)，其中在植物细胞或组织中，优选在植物的种子、繁殖组织或种系中产生突变，例如，使用诱变剂(如EMS处理)。所得植物生长并自我受精，并且子代用于制备DNA样品。靶基因的核酸序列的PCR扩增和测序可用于鉴定突变的植物是否在靶基因中具有突变。然后可测试在靶基因中具有突变的植物的性状改变，如植物高度降低。或者，可测试诱变的植物的性状改变，如植物高度降低，且然后可使用PCR扩增和靶基因的核酸序列的测序来确定具有改变的性状的植物是否也在靶基因中具有突变。参见例如，Colbert等人,2001,Plant Physiol 126:480-484；和McCallum等人,2000,Nature Biotechnology 18:455-457。TILLING可用于鉴定改变基因表达或由基因编码的蛋白质的活性的突变，其可用于在植物的靶基因中引入和选择靶向突变。
还可通过在植物的基因组中引入双链断裂(DSB)或切口，通过基因组编辑技术将突变引入靶基因中。根据这种方法，可经由DSB或切口的不完全修复来将突变(如缺失、插入、倒位和/或取代)引入靶基因处或附近(例如，内)的所需靶位点处，以产生靶基因的敲除或敲低。即使不使用供体模板分子，也可通过靶向基因座的不完全修复来产生此类突变。靶基因的“敲除”可通过在靶基因的内源性基因座处或附近诱导DSB或切口以产生基因的非表达或从非功能蛋白质的靶基因表达来实现，而靶基因的“敲低”可通过在不影响靶基因的编码序列的位点处，以将消除其编码的蛋白质的功能和/或表达的方式在靶基因的内源性基因座处或附近诱导DSB或缺口来实现。例如，内源性基因座内的DSB或切口的位点可在靶基因的上游或5’区域(例如启动子和/或增强子序列)中，以影响或降低其表达水平。类似地，可用供体模板分子产生靶基因的靶向敲除或敲低突变，以经由修复DSB或切口在靶位点处或附近指导特定或所需的突变。供体模板分子可包含有或无插入序列并包含相对于DSB或切口位点处或附近的靶向基因组序列的一种或多种突变，如一个或多个缺失、插入、倒位和/或取代。例如，可通过缺失或反转基因的至少一部分或通过将移码或过早终止密码子引入基因的编码序列中来实现靶基因的靶向敲除突变。还可通过在两个靶位点处产生DSB或切口并引起由靶位点侧接的插入靶区域的缺失来引入靶基因的一部分的缺失。
本文提供的位点特异性核酸酶可选自由以下组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶、转座酶或它们的任何组合。参见例如，Khandagale,K.等人,“Genome editing for targeted improvement inplants,”Plant Biotechnol Rep 10:327-343(2016)；和Gaj,T.等人,“ZFN,TALEN andCRISPR/Cas-based methods for genome engineering,”Trends Biotechnol.31(7):397-405(2013)，所述文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。重组酶可以是附接至DNA识别基序的丝氨酸重组酶、附接至DNA识别基序的酪氨酸重组酶或本领域已知的其他重组酶。重组酶或转座酶可以是附接至DNA结合结构域的DNA转座酶或重组酶。附接至DNA识别基序的酪氨酸重组酶可选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。根据一些实施方案，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶被栓系至锌指DNA结合结构域。在另一个实施方案中，附接至本文提供的DNA识别基序的丝氨酸重组酶选自由以下组成的组：PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶。在另一个实施方案中，附接至本文提供的DNA结合结构域的DNA转座酶选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组。根据本公开的实施方案，RNA指导的核酸内切酶可选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cpf1、CasX、CasY以及它们的同源物或经修饰型式，Argonaute(Argonaute蛋白质的非限制性实例包括嗜热栖热菌Argonaute(TtAgo)、强烈火球菌Argonaute(PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌Argonaute(NgAgo)以及它们的同源物或经修饰型式。根据一些实施方案，RNA指导的核酸内切酶可以是Cas9或Cpf1酶。
对于RNA指导的核酸内切酶，还提供了指导RNA(gRNA)分子，以经由碱基配对或杂交将核酸内切酶引导至植物基因组中的靶位点，以在所述靶位点处或附近引起DSB或切口。可将gRNA作为gRNA分子或作为包含可转录DNA序列的重组DNA分子、构建体或载体转化或引入植物细胞或组织(可能与核酸酶或编码核酸酶的DNA分子、构建体或载体一起)，所述可转录DNA序列编码与植物可表达启动子可操作连接的指导RNA。如本领域中所理解的，“指导RNA”可包括例如CRISPR RNA(crRNA)、单链指导RNA(sgRNA)或可将核酸内切酶引导或导引至基因组中的特定靶位点的任何其他RNA分子。“单链指导RNA”(或“sgRNA”)是包含通过接头序列共价连接tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可表达为单一RNA转录物或分子。指导RNA包含与植物基因组内(如靶基因处或附近)的靶位点相同或互补的指导或靶向序列。与指导RNA的靶向序列互补的基因组靶位点序列的5’端紧邻并在其上游的基因组中可存在前间隔序列邻近基序(PAM)，即如本领域已知在基因组靶位点的有义(+)链的紧接下游(3’)(相对于指导RNA的靶向序列)。参见例如，Wu,X.等人,“Target specificity of the CRISPR-Cas9 system,”Quant Biol.2(2):59-70(2014)，所述文献的内容和公开内容以引用的方式并入本文。与靶位点相邻的有义(+)链上的基因组PAM序列(相对于指导RNA的靶向序列)可包含5’-NGG-3’。然而，指导RNA的相应序列(即，指导RNA的靶向序列的紧接下游(3’))通常可能与基因组PAM序列不互补。指导RNA通常可以是不编码蛋白质的非编码RNA分子。指导RNA的指导序列的长度可以是至少10个核苷酸，如长度为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸或17-25个核苷酸，或长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。指导序列可与靶基因处或附近(例如，内)的基因组靶位点处的DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25或更多个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补。
如上文所提及，用于基因组编辑的靶基因可以是本文提出进行抑制的任何基因，包括玉米或玉米中的以下基因：钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)、细胞分裂素脱氢酶4b或细胞分裂素氧化酶4b(Zm.CKX4b)或细胞分裂素脱氢酶10或细胞分裂素氧化酶10(Zm.CKX10)基因；以及大豆中的以下基因：同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。
为了在玉米中的钙调磷酸酶B样(CBL相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因处或附近(例如，内)用RNA指导的核酸内切酶进行基因组编辑，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:141的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如SEQ ID NO:141的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列。如本文所用，关于多核苷酸或蛋白质序列的术语“连续的”是指序列中没有缺失或空位。
对于通过基因组编辑进行玉米中钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因的敲低(并且可能是敲除)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向上游或下游序列，如玉米中钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因的启动子和/或增强子序列，或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列以使所述Zm.CIPK8基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变来影响或降低其表达水平。为了敲低(并且可能敲除)玉米中的Zm.CIPK8基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:141的核苷酸序列范围1-2000、SEQ ID NO:141的核苷酸序列范围2181-4340、4404-4568、4641-6821、6930-7016、7092-7168、7223-7640、7767-7892、7983-8462、8586-8732、8853-13119、13237-13340、13398-13488或13564-13756或SEQ ID NO:141的核苷酸序列范围13853-14852内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ IDNO:141的核苷酸序列范围1-2000、2181-4340、4404-4568、4641-6821、6930-7016、7092-7168、7223-7640、7767-7892、7983-8462、8586-8732、8853-13119、13237-13340、13398-13488、13564-13756或13853-14852内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
对于通过基因组编辑进行玉米中钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因的敲除(并且可能是敲低)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向玉米中的钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因的编码和/或内含子序列以潜在消除Zm.CIPK8基因和/或其编码的蛋白质的表达和/或活性。然而，在一些情况下，也可通过靶向Zm.CIPK8基因的上游和/或5’UTR序列，或靶向Zm.CIPK8基因的基因座处或附近的其他序列来实现Zm.CIPK8基因表达的敲除。因此，可通过在靶向Zm.CIPK8基因的位点或基因座处或附近靶向基因组序列来实现Zm.CIPK8基因表达的敲除，所述基因组序列包括上游或下游序列，如启动子和/或增强子序列，或Zm.CIPK8基因的内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，如上文针对Zm.CIPK8基因的敲低所描述。
为了敲除(并且可能敲低)玉米中的钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:141的核苷酸序列范围2001-13852或SEQ ID NO:141的核苷酸序列范围2001-2180、4341-4403、4569-4640、6822-6929、7017-7091、7169-7222、7641-7766、7893-7982、8463-8585、8733-8852、13120-13236、13341-13397、13489-13563或13757-13852内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:141的核苷酸序列范围2001-13852、2001-2180、4341-4403、4569-4640、6822-6929、7017-7091、7169-7222、7641-7766、7893-7982、8463-8585、8733-8852、13120-13236、13341-13397、13489-13563和/或13757-13852内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
若干位点特异性核酸酶(如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶和TALEN)不是RNA指导的，而是依靠它们的蛋白质结构来确定它们的用于引起DSB或缺口的靶位，或者将它们融合、拴系或附接至DNA结合蛋白结构域或基序上。位点特异性核酸酶(或融合/附接/拴系的DNA结合结构域)的蛋白质结构可使位点特异性核酸酶靶向靶位点(例如，靶基因的基因组基因座处或附近(例如，内)的靶位点)。根据一些实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可根据已知方法设计、工程化并构建来靶向并结合至玉米中钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因的基因组基因座处或附近的靶位点来在这种基因组基因座处产生DSB或切口，以经由修复DSB或切口敲除或敲低Zm.CIPK8基因的表达。例如，工程化的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计为靶向并结合至植物基因组内对应于SEQ IDNO:141中的序列或其互补序列的靶位点，以在Zm.CIPK8基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其然后可通过细胞修复机制导致在所述DSB或切口的位点处或附近产生序列的突变或插入，其可由供体分子或模板进一步指导。
为了在玉米中的山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因处或附近(例如，内)用RNA指导的核酸内切酶进行基因组编辑，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:142的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如SEQ IDNO:142的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列。
对于通过基因组编辑进行玉米中山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因的敲低(并且可能是敲除)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向上游或下游序列，如玉米中山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因的启动子和/或增强子序列，或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列以使所述Zm.SDH基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变来影响或降低其表达水平。为了敲低(并且可能敲除)玉米中的Zm.SDH基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:142的核苷酸序列范围1-2000、SEQ ID NO:142的核苷酸序列范围2125-3504或3573-3669或SEQID NO:142的核苷酸序列范围内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:142的核苷酸序列范围1-2000、2125-3504或3573-3669内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
对于通过基因组编辑进行玉米中山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因的敲除(并且可能是敲低)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向玉米中的山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因的编码和/或内含子序列以潜在消除Zm.SDH基因和/或其编码的蛋白质的表达和/或活性。然而，在一些情况下，也可通过靶向Zm.SDH基因的上游和/或5’UTR序列，或靶向Zm.SDH基因的基因座处或附近的其他序列来实现Zm.SDH基因表达的敲除。因此，可通过在靶向Zm.SDH基因的位点或基因座处或附近靶向基因组序列来实现Zm.SDH基因表达的敲除，所述基因组序列包括上游或下游序列，如启动子和/或增强子序列，或Zm.SDH基因的内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，如上文针对Zm.SDH基因的敲低所描述。
为了敲除(并且可能敲低)玉米中的山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:142的核苷酸序列范围2001-4578、SEQ ID NO:142的核苷酸序列范围2001-2124、3505-3572或3670-4578内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:142的核苷酸序列范围2001-4578、2001-2124、3505-3572或3670-4578内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
根据其他实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可根据已知方法设计、工程化并构建来靶向并结合至玉米中山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因的基因组基因座处或附近的靶位点来在这种基因组基因座处产生DSB或切口，以经由修复DSB或切口敲除或敲低Zm.SDH基因的表达。例如，工程化的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计为靶向并结合至植物基因组内对应于SEQ ID NO:142中的序列或其互补序列的靶位点，以在Zm.SDH基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其然后可通过细胞修复机制导致在所述DSB或切口的位点处或附近产生序列的突变或插入，其可由供体分子或模板进一步指导。
为了在玉米中的细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(Zm.CKX4b)基因处或附近(例如，内)用RNA指导的核酸内切酶进行基因组编辑，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ IDNO:144的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如SEQ ID NO:144的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列。
对于通过基因组编辑进行玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(Zm.CKX4b)基因的敲低(并且可能是敲除)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向上游或下游序列，如玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(Zm.CKX4b)基因的启动子和/或增强子序列，或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列以使所述Zm.CKX4b基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变来影响或降低其表达水平。为了敲低(并且可能敲除)玉米中的Zm.CKX4b基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:144的核苷酸序列范围1-2000、SEQ ID NO:144的核苷酸序列范围2608-2770、2899-3658、3923-4204或4477-5520或SEQ ID NO:144的核苷酸序列范围4855-5854内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:144的核苷酸序列范围1-2000、2608-2770、2899-3658、3923-4204、4477-5520或5855-6854内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
对于通过基因组编辑进行玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(Zm.CKX4b)基因的敲除(并且可能是敲低)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向玉米中的细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(Zm.CKX4b)基因的编码和/或内含子序列以潜在消除Zm.CKX4b基因和/或其编码的蛋白质的表达和/或活性。然而，在一些情况下，也可通过靶向Zm.CKX4b基因的上游和/或5’UTR序列，或靶向Zm.CKX4b基因的基因座处或附近的其他序列来实现Zm.CKX4b基因表达的敲除。因此，可通过在靶向Zm.CKX4b基因的位点或基因座处或附近靶向基因组序列来实现Zm.CKX4b基因表达的敲除，所述基因组序列包括上游或下游序列，如启动子和/或增强子序列，或Zm.CKX4b基因的内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，如上文针对Zm.CKX4b基因的敲低所描述。
为了敲除(并且可能敲低)玉米中的细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(Zm.CKX4b)基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:144的核苷酸序列范围2001-5854或SEQID NO:144的核苷酸序列范围2001-2607、2771-2898、3659-3922、4205-4476或5521-5854内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:144的核苷酸序列范围2001-5854、2001-2607、2771-2898、3659-3922、4205-4476或5521-5854内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
根据其他实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可根据已知方法设计、工程化并构建来靶向并结合至玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(Zm.CKX4b)基因的基因组基因座处或附近的靶位点来在这种基因组基因座处产生DSB或切口，以经由修复DSB或切口敲除或敲低Zm.CKX4b基因的表达。例如，工程化的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计为靶向并结合至植物基因组内对应于SEQ ID NO:144中的序列或其互补序列的靶位点，以在Zm.CKX4b基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其然后可通过细胞修复机制导致在所述DSB或切口的位点处或附近产生序列的突变或插入，其可由供体分子或模板进一步指导。
为了在玉米中的细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(Zm.CKX10)基因处或附近(例如，内)用RNA指导的核酸内切酶进行基因组编辑，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ IDNO:145的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如SEQ ID NO:145的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列。
对于通过基因组编辑进行玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(Zm.CKX10)基因的敲低(并且可能是敲除)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向上游或下游序列，如玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(Zm.CKX10)基因的启动子和/或增强子序列，或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列以使所述Zm.CKX10基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变来影响或降低其表达水平。为了敲低(并且可能敲除)玉米中的Zm.CKX10基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:145的核苷酸序列范围1-2000、SEQ ID NO:145的核苷酸序列范围2694-2778、3070-3742或4015-4453或SEQ ID NO:145的核苷酸序列范围4776-5775内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:145的核苷酸序列范围1-2000、2694-2778、3070-3742、4015-4453或4776-5775内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
对于通过基因组编辑进行玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(Zm.CKX10)基因的敲除(并且可能是敲低)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向玉米中的细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(Zm.CKX10)基因的编码和/或内含子序列以潜在消除Zm.CKX10基因和/或其编码的蛋白质的表达和/或活性。然而，在一些情况下，也可通过靶向Zm.CKX10基因的上游和/或5’UTR序列，或靶向Zm.CKX10基因的基因座处或附近的其他序列来实现Zm.CKX10基因表达的敲除。因此，可通过在靶向Zm.CKX10基因的位点或基因座处或附近靶向基因组序列来实现Zm.CKX10基因表达的敲除，所述基因组序列包括上游或下游序列，如启动子和/或增强子序列，或Zm.CKX10基因的内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，如上文针对Zm.CKX10基因的敲低所描述。
为了敲除(并且可能敲低)玉米中的细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(Zm.CKX10)基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:145的核苷酸序列范围2001-4775或SEQID NO:145的核苷酸序列范围2001-2693、2779-3069、3743-4014或4454-4775内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ IDNO:145的核苷酸序列范围2001-4775、2001-2693、2779-3069、3743-4014或4454-4775内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
根据其他实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可根据已知方法设计、工程化并构建来靶向并结合至玉米中细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(Zm.CKX10)基因的基因组基因座处或附近的靶位点来在这种基因组基因座处产生DSB或切口，以经由修复DSB或切口敲除或敲低Zm.CKX10基因的表达。例如，工程化的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计为靶向并结合至植物基因组内对应于SEQ ID NO:145中的序列或其互补序列的靶位点，以在Zm.CKX10基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其然后可通过细胞修复机制导致在所述DSB或切口的位点处或附近产生序列的突变或插入，其可由供体分子或模板进一步指导。
为了在大豆中的同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因处或附近(例如，内)用RNA指导的核酸内切酶进行基因组编辑，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:143的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如SEQ IDNO:143的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列。
对于通过基因组编辑进行大豆中同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因的敲低(并且可能是敲除)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向上游或下游序列，如大豆中同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因的启动子和/或增强子序列，或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列以使所述Gm.HB1基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变来影响或降低其表达水平。为了敲低(并且可能敲除)大豆中的Gm.HB1基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:143的核苷酸序列范围1-2000、SEQ ID NO:143的核苷酸序列范围2373-2584或SEQ ID NO:143的核苷酸序列范围2951-3950内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:143的核苷酸序列范围1-2000、2373-2584或2951-3950内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
对于通过基因组编辑进行大豆中同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因的敲除(并且可能是敲低)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向大豆中的同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因的编码和/或内含子序列以潜在消除Gm.HB1基因和/或其编码的蛋白质的表达和/或活性。然而，在一些情况下，也可通过靶向Gm.HB1基因的上游和/或5’UTR序列，或靶向Gm.HB1基因的基因座处或附近的其他序列来实现Gm.HB1基因表达的敲除。因此，可通过在靶向Gm.HB1基因的位点或基因座处或附近靶向基因组序列来实现Gm.HB1基因表达的敲除，所述基因组序列包括上游或下游序列，如启动子和/或增强子序列，或Gm.HB1基因的内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，如上文针对Gm.HB1基因的敲低所描述。
为了敲除(并且可能敲低)大豆中的同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:143的核苷酸序列范围2001-2950或SEQ ID NO:143的核苷酸序列范围2001-2372或2585-2950内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:143的核苷酸序列范围2001-2950、2001-2372或2585-2950内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
根据其他实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可根据已知方法设计、工程化并构建来靶向并结合至大豆中同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因的基因组基因座处或附近的靶位点来在这种基因组基因座处产生DSB或切口，以经由修复DSB或切口敲除或敲低Gm.HB1基因的表达。例如，工程化的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计为靶向并结合至植物基因组内对应于SEQ ID NO:143中的序列或其互补序列的靶位点，以在Gm.HB1基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其然后可通过细胞修复机制导致在所述DSB或切口的位点处或附近产生序列的突变或插入，其可由供体分子或模板进一步指导。
为了在大豆中的分枝1或BRC1(Gm.BRC1)基因处或附近(例如，内)用RNA指导的核酸内切酶进行基因组编辑，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:146的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如SEQ IDNO:146的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列。
对于通过基因组编辑进行大豆中BRC1(Gm.BRC1)基因的敲低(并且可能是敲除)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向上游或下游序列，如大豆中BRC1(Gm.BRC1)基因的启动子和/或增强子序列，或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列以使所述Gm.BRC1基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变来影响或降低其表达水平。为了敲低(并且可能敲除)大豆中的Gm.BRC1基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:146的核苷酸序列范围1-2000、SEQ ID NO:146的核苷酸序列范围3111-3731或SEQ ID NO:146的核苷酸序列范围3780-4779内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:146的核苷酸序列范围1-2000、3111-3731或3780-4779内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
对于通过基因组编辑进行大豆中BRC1(Gm.BRC1)基因的敲除(并且可能是敲低)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向大豆中的BRC1(Gm.BRC1)基因的编码和/或内含子序列以潜在消除Gm.BRC1基因和/或其编码的蛋白质的表达和/或活性。然而，在一些情况下，也可通过靶向Gm.BRC1基因的上游和/或5’UTR序列，或靶向Gm.BRC1基因的基因座处或附近的其他序列来实现Gm.BRC1基因表达的敲除。因此，可通过在靶向Gm.BRC1基因的位点或基因座处或附近靶向基因组序列来实现Gm.BRC1基因表达的敲除，所述基因组序列包括上游或下游序列，如启动子和/或增强子序列，或Gm.BRC1基因的内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，如上文针对Gm.BRC1基因的敲低所描述。
为了敲除(并且可能敲低)大豆中的BRC1(Gm.BRC1)基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:146的核苷酸序列范围2001-3779或SEQ ID NO:146的核苷酸序列范围2001-3110或3732-3779内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:146的核苷酸序列范围2001-3779、2001-3110或3732-3779内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
根据其他实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可根据已知方法设计、工程化并构建来靶向并结合至大豆中BRC1(Gm.BRC1)基因的基因组基因座处或附近的靶位点来在这种基因组基因座处产生DSB或切口，以经由修复DSB或切口敲除或敲低Gm.BRC1基因的表达。例如，工程化的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计为靶向并结合至植物基因组内对应于SEQ ID NO:146中的序列或其互补序列的靶位点，以在Gm.BRC1基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其然后可通过细胞修复机制导致在所述DSB或切口的位点处或附近产生序列的突变或插入，其可由供体分子或模板进一步指导。
为了在大豆中的多产c或FULc(Gm.FULc)基因处或附近(例如，内)用RNA指导的核酸内切酶进行基因组编辑，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:147的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如SEQ IDNO:147的12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列。
对于通过基因组编辑进行大豆中FULc(Gm.FULc)基因的敲低(并且可能是敲除)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向上游或下游序列，如大豆中FULc(Gm.FULc)基因的启动子和/或增强子序列，或内含子、5’UTR和/或3’UTR序列以使所述Gm.FULc基因的一个或多个启动子和/或调控序列突变来影响或降低其表达水平。为了敲低(并且可能敲除)大豆中的Gm.FULc基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:147的核苷酸序列范围1-2000、SEQ ID NO:147的核苷酸序列范围2186-11058、11135-11339、11405-12030、12131-12300、12343-12868、12908-13012、13153-13665或SEQ ID NO:147的核苷酸序列范围13766-14765内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:147的核苷酸序列范围1-2000、2186-11058、11135-11339、11405-12030、12131-12300、12343-12868、12908-13012、13153-13665或13766-14765内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
对于通过基因组编辑进行大豆中FULc(Gm.FULc)基因的敲除(并且可能是敲低)突变，可使RNA指导的核酸内切酶靶向大豆中的FULc(Gm.FULc)基因的编码和/或内含子序列以潜在消除Gm.FULc基因和/或其编码的蛋白质的表达和/或活性。然而，在一些情况下，也可通过靶向Gm.FULc基因的上游和/或5’UTR序列，或靶向Gm.FULc基因的基因座处或附近的其他序列来实现Gm.FULc基因表达的敲除。因此，可通过在靶向Gm.FULc基因的位点或基因座处或附近靶向基因组序列来实现Gm.FULc基因表达的敲除，所述基因组序列包括上游或下游序列，如启动子和/或增强子序列，或Gm.FULc基因的内含子、5’UTR和/或3’UTR序列，如上文针对Gm.FULc基因的敲低所描述。
为了敲除(并且可能敲低)大豆中的FULc(Gm.FULc)基因，可使用指导RNA，所述指导RNA包含与SEQ ID NO:147的核苷酸序列范围2001-13765或SEQ ID NO:147的核苷酸序列范围2001-2185、11059-11134、11340-11404、12031-12130、12301-12342、12869-12907、13013-13152或13666-13765内的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25个或更多个连续核苷酸或与其互补的序列(例如，SEQ ID NO:147的核苷酸序列范围2001-13765、2001-2185、11059-11134、11340-11404、12031-12130、12301-12342、12869-12907、13013-13152或13666-13765内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个连续核苷酸，或与其互补的序列)至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，但可能出现选择性剪接和不同的外显子/内含子边界。
根据其他实施方案，非RNA指导的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可根据已知方法设计、工程化并构建来靶向并结合至大豆中FULc(Gm.FULc)基因的基因组基因座处或附近的靶位点来在这种基因组基因座处产生DSB或切口，以经由修复DSB或切口敲除或敲低Gm.FULc基因的表达。例如，工程化的位点特异性核酸酶如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或TALEN可被设计为靶向并结合至植物基因组内对应于SEQ ID NO:147中的序列或其互补序列的靶位点，以在Gm.FULc基因的基因组基因座处产生DSB或切口，其然后可通过细胞修复机制导致在所述DSB或切口的位点处或附近产生序列的突变或插入，其可由供体分子或模板进一步指导。
根据一些实施方案，提供了重组DNA构建体和载体，所述重组DNA构建体和载体包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列，所述位点特异性核酸酶如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶，其中所述编码序列可操作地连接至植物可表达启动子。对于RNA指导的核酸内切酶，还提供了重组DNA构建体和载体，所述重组DNA构建体和载体包含编码指导RNA的多核苷酸序列，其中所述指导RNA包含与植物的基因组内(如靶基因处或附近)的靶位点具有一定百分比同一性或互补性的足够长度的指导序列。根据一些实施方案，可将编码位点特异性核酸酶或指导RNA的重组DNA构建体和载体的多核苷酸序列可操作地连接至植物可表达启动子，如诱导型启动子、组成型启动子、组织特异性启动子等。
在一方面，本公开提供了经修饰的玉米(玉米)或大豆植物或其植物部分，或经修饰的玉米或大豆植物组织或植物细胞，其包含靶基因的突变等位基因(即在所述靶基因处或附近(例如，内)的一种或多种突变和/或基因组编辑。所述经修饰的玉米(玉米)或大豆植物或其植物部分或经修饰的玉米或大豆植物组织或植物细胞对于所述靶基因的基因组基因座和/或所述靶基因的等位基因处或附近的突变和/或编辑可以是纯合的、杂合的、异等位基因的(或双等位基因的)。每个这样的突变或编辑可以是无义突变、错义突变、移码突变或剪接位点突变。在一方面，突变或编辑可位于靶基因的选自由以下组成的组的区域中：启动子、增强子、5’UTR、第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子、3’UTR或终止子。在一方面，靶基因(或靶基因的突变体或突变体等位基因)处或附近的突变可包含沉默突变，所述沉默突变不改变靶基因的所编码氨基酸序列，但是相对于靶基因的相应野生型等位基因可影响mRNA转录物表达、mRNA或蛋白质稳定性或蛋白质翻译效率，或以其他方式导致酶活性降低。在另一方面，靶基因(或靶基因的突变体或突变体等位基因)的突变可包含在TATA盒或影响基因转录的其他启动子元件处或周围的突变或编辑。在一方面，经修饰的玉米或大豆植物中的靶基因的突变或等位基因可以是隐性、显性或半显性突变或等位基因。
根据一些实施方案，重组DNA构建体或载体可包含第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列编码位点特异性核酸酶；和第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列编码可经由植物转化技术一起引入植物细胞中的指导RNA。或者，可提供两种重组DNA构建体或载体，包括可经由植物转化技术一起或依序引入植物细胞中的第一重组DNA构建体或载体和第二DNA构建体或载体，其中所述第一重组DNA构建体或载体包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列，并且所述第二重组DNA构建体或载体包含编码指导RNA的多核苷酸序列。根据一些实施方案，可经由植物转化技术将包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入植物细胞中，所述植物细胞已经包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用所述重组DNA构建体或载体转化)。或者，可经由植物转化技术将包含编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体引入植物细胞中，所述植物细胞已经包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用所述重组DNA构建体或载体转化)。根据其他实施方案，包含含有编码位点特异性核酸酶的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用所述重组DNA构建体或载体转化)的第一植物可与包含含有编码指导RNA的多核苷酸序列的重组DNA构建体或载体(或用所述重组DNA构建体或载体转化)的第二植物杂交。此类重组DNA构建体或载体可瞬时转化到植物细胞中或稳定地转化或整合到植物细胞的基因组中。
在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如但不限于，粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)将包含编码位点特异性核酸酶的多核苷酸和任选的一种或多种gRNA的载体提供或引入植物细胞中。在一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如但不限于，粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)将包含编码Cas9核酸酶的多核苷酸和任选的一种或多种gRNA的载体提供至植物细胞。在另一方面，通过本领域中已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)将包含编码Cpf1的多核苷酸和任选的一种或多种crRNA的载体提供至细胞。
在一方面，本文所述的靶向基因组编辑技术可包括使用重组酶。在一些实施方案中，附接(等)至DNA识别结构域或基序的酪氨酸重组酶可选自由以下组成的组：Cre重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在一方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶可栓系至锌指DNA结合结构域。Flp-FRT定点重组系统可来自面包酵母酿酒酵母中的2μ质粒。在这种系统中，Flp重组酶(翻转酶)可在翻转酶识别靶标(FRT)位点之间重组序列。FRT位点包含34个核苷酸。Flp可结合至FRT位点的“臂”(一个臂呈反向取向)，并且在插入核酸序列的任一端裂解FRT位点。在裂解后，Flp可在两个FRT位点之间重组核酸序列。Cre-lox是源自噬菌体P1的与Flp-FRT重组系统相似的定点重组系统。Cre-lox可用于使核酸序列反转、使核酸序列缺失或使核酸序列易位。在这种系统中，Cre重组酶可重组一对lox核酸序列。Lox位点包含34个核苷酸，其中前和后13个核苷酸(臂)为回文。在重组过程中，Cre重组酶蛋白结合至不同核酸上的两个lox位点，并且在所述lox位点处裂解。将裂解的核酸剪接在一起(相互易位)，并且重组完成。在另一方面，本文提供的lox位点是loxP、lox 2272、loxN、lox 511、lox 5171、lox71、lox66、M2、M3、M7或M11位点。
ZFN是由融合至裂解结构域(或裂解半结构域)的工程化锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白，其可源自限制性核酸内切酶(例如，FokI)。DNA结合结构域可以是规范的(C2H2)或非规范的(例如C3H或C4)。取决于靶位点，DNA结合结构域可包含一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个锌指)。DNA结合结构域中的多个锌指可被一个或多个接头序列隔开。ZFN可被设计为通过修饰锌指DNA结合结构域来裂解几乎任一段双链DNA。ZFN从由与DNA结合结构域融合的非特异性DNA裂解结构域(例如源自FokI核酸酶)组成的单体形成二聚体，所述DNA结合结构域包含经工程化以结合靶位点DNA序列的锌指阵列。ZFN的DNA结合结构域通常可包含3-4个(或更多个)锌指。相对于锌指α-螺旋开始的位置-1、+2，+3和+6处的氨基酸可改变并进行定制以适合特定靶标序列，所述氨基酸有助于与靶位点的位点特异性结合。其他氨基酸可形成共有珠粒，以产生具有不同序列特异性的ZFN。设计用于靶向和结合至特定靶序列的ZFN的方法和规则是本领域已知的。参见例如美国专利申请号2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062，所述专利的内容和公开内容以引用的方式并入本文。FokI核酸酶结构域可能需要二聚化来裂解DNA，并且因此需要两个带有C-末端区域的ZFN来结合裂解位点的相对DNA链(相隔5-7bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可切割靶位点。如本文所用，ZFN是广泛的并且包括可在没有另一ZFN帮助的情况下裂解双链DNA的单体ZFN。术语ZFN也可用来指一对ZFN中的一个或两个成员，所述ZFN被工程化为共同作用以在同一位点裂解DNA。
不受任何科学理论的限制，因为可使用多种方法之一重新工程化锌指结构域的DNA结合特异性，所以理论上可构建定制的ZFN，以靶向几乎任何靶序列(例如在植物基因组中的靶基因处或附近)。用于工程化锌指结构域的公开可用方法包括上下文依赖组装(CoDA)、寡聚体库工程化(OPEN)和模块式组装。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种ZFN。在另一方面，本文提供的ZFN能够产生靶向DSB或切口。在一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)将包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种ZFN的多核苷酸的载体提供至细胞。ZFN可作为ZFN蛋白、作为编码ZFN蛋白的多核苷酸和/或作为蛋白质与编码蛋白质的多核苷酸的组合引入。
通常在微生物中鉴定的大分子核酸酶如归巢核酸内切酶的LAGLIDADG家族是具有高活性和长识别序列(>14bp)、从而导致靶DNA的位点特异性消化的独特酶。天然存在的大范围核酸酶的工程化型式通常具有延伸的DNA识别序列(例如14至40bp)。根据一些实施方案，大范围核酸酶可包含选自由以下组成的组的支架或碱基酶：I-CreI、I-CeuI、I-MsoI、I-SceI、I-AniI和I-DmoI。大范围核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为大范围核酸酶的DNA识别和裂解功能交织在单个结构域中。诱变和高通量筛选的专门化方法已用于创建识别独特序列并具有改进的核酸酶活性的新型大范围核酸酶变体。因此，可选择或工程化大范围核酸酶以结合植物中的基因组靶序列，如在靶基因的基因组基因座处或附近。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种大范围核酸酶。在另一方面，本文提供的大范围核酸酶能够产生靶向DSB。在一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)将包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种大范围核酸酶的多核苷酸的载体提供至细胞。
TALEN是通过将转录活化因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域(例如FokI)融合而产生的人工限制性酶。当TALEN对的每个成员结合至靶位点侧翼的DNA位点时，FokI单体二聚化并在靶位点引起双链DNA断裂。除了野生型FokI裂解结构域外，还设计了具有突变的FokI裂解结构域的变体，以提高裂解特异性和裂解活性。FokI结构域起着二聚体的作用，从而对于靶基因组中具有适当取向和间距的位点需要两种具有独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI裂解结构域之间的氨基酸残基数目以及两个单独TALEN结合位点之间的碱基数目都是达到高水平活性的参数。
TALEN是通过将转录活化因子样效应物(TALE)DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。在一些方面，所述核酸酶选自由以下组成的组：PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051以及Pept071。当TALEN对的每个成员结合至靶位点侧翼的DNA位点时，FokI单体二聚化并在靶位点处引起双链DNA断裂。如本文所用，术语TALEN是广泛的并且包括可在没有另一TALEN帮助的情况下裂解双链DNA的单体TALEN。术语TALEN还指一对TALEN中的一个或两个成员，所述TALEN被工程化为共同作用以在同一位点裂解DNA。
转录活化因子样效应物(TALE)可被工程化为实际上结合任何DNA序列，如在植物中的靶基因的基因组基因座处或附近。TALE具有由33-34个氨基酸的13-28个重复单体组成的中心DNA结合结构域。除了位置12和13处的高变氨基酸残基外，每个单体的氨基酸都是高度保守的。这两个可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可识别连续DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化特定DNA结合结构域。
TALE结合结构域的氨基酸序列与DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。可使用诸如DNA Works的软件程序来设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等人,Nucleic Acids Research(2012)40:W117-122.；Cermak等人,Nucleic Acids Research(2011).39:e82；以及tale-nt.cac.cornell.edu/about。在一方面，本文提供的方法和/或组合物包含一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种TALEN。在另一方面，本文提供的TALEN能够产生靶向DSB。在一方面，通过本领域已知的转化方法(例如但不限于，病毒转染、粒子轰击、PEG介导的原生质体转染或土壤杆菌介导的转化)将包含编码一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种TALEN的多核苷酸的载体提供至细胞。参见例如美国专利申请号2011/0145940、2011/0301073和2013/0117869，所述专利的内容和公开内容以引用的方式并入本文。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许使用位点特异性核酸酶，如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶(例如CRISPR/Cas9系统)、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶对植物的基因组中的特定位置进行精确和/或靶向编辑的任何方法、方案或技术(即，所述编辑在很大程度上或完全非随机的)。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指产生内源性植物基因组核酸序列的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少1000、至少2500、至少5000、至少10,000或至少25,000个核苷酸的靶向突变、缺失、倒位或取代。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”还涵盖至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少10,000或至少25,000个核苷酸靶向插入或定点整合到植物的内源性基因组中。单数形式的“编辑(edit)”或“基因组编辑(genomic edit)”是指这样的靶向突变、缺失、倒位、取代或插入，而“编辑(edits)”或“基因组编辑(genomic edits)”是指两种或更多靶向突变、缺失、倒位、取代和/或插入，其中每种“编辑”都是经由靶向基因组编辑技术引入的。
对于不受RNA指导的位点特异性核酸酶，如锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶和/或转座酶，用于编辑的基因组靶标特异性取决于其蛋白质结构、特别是其DNA结合结构域。此类位点特异性核酸酶可被选择、设计或工程化为结合并切割在玉米(玉米)或大豆植物的基因组内的任何靶基因处或附近的所需靶位点。与用抑制构建体转化相似，用特定指导RNA或编码指导RNA的重组DNA分子、载体或构建体转化的玉米或大豆植物应优选为靶向基因组序列存在的物种或紧密相关的物种、品种、种质、品系等，以使得指导RNA能够识别并结合至所需的靶标切割位点。
包含或源自用本公开的重组DNA转化的植物细胞的转基因或经修饰的植物可用堆叠性状进一步增强，例如，具有由本文所公开的DNA的表达产生的增强的性状与除草剂抗性和/或抗虫性性状的组合的作物。例如，当前公开的基因或等位基因可与其他目标农艺学性状一起堆叠，如提供除草剂抗性的特征或昆虫抗性，如使用来自苏云金芽孢杆菌的基因来提供针对鳞翅目、鞘翅目、同翅目、半翅目和其他昆虫的，或改善的品质性状，如改善的营养价值。已经证明转基因植物对其展示耐受性并且可应用本公开的方法的除草剂包括但不限于草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲、溴苯腈、达草灭、2,4-D(2,4-二氯苯氧基)乙酸、芳氧基苯氧基丙酸酯、对羟基苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂(HPPD)和原卟啉原氧化酶抑制剂(PPO)除草剂。编码参与除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子在本领域中是已知的，并且包括但不限于编码公开于美国专利5,094,945、5,627,061、5,633,435和6,040,497中的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子，用于赋予草甘膦耐受性；编码公开于美国专利号5,463,175中的草甘膦氧化还原酶(GOX)和美国专利号申请公布2003/0083480A1中的草甘膦-N-乙酰基转移酶(GAT)的多核苷酸分子，也用于赋予草甘膦耐受性；编码美国专利申请公布2003/0135879 A1中公开的麦草畏单氧酶的多核苷酸分子，用于赋予麦草畏耐受性；编码美国专利号4,810,648中公开的溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子，用于赋予溴苯腈耐受性编码Misawa等人,(1993)Plant J.4:833-840和Misawa等人,(1994)Plant J.6:481-489中描述的八氢番茄红素去饱和酶的多核苷酸分子，用于赋予达草灭耐受性；编码Sathasiivan等人(1990)Nucl.Acids Res.18:2188-2193中描述的乙酰羟基酸合成酶(AHAS，又名ALS)的多核苷酸分子，用于赋予对磺酰脲类除草剂的耐受性；DeBlock,等人(1987)EMBO J.6:2513-2519中公开的称为bar基因的多核苷酸分子，用于赋予草铵膦和双丙氨膦耐受性；美国专利申请公布2003/010609 A1中公开的多核苷酸分子，用于赋予N-氨基甲基膦酸耐受性；美国专利号6,107,549中公开的多核苷酸分子，用于赋予吡啶类除草剂抗性；molecules and methods用于赋予对多种除草剂如草甘膦、阿特拉津、ALS抑制剂、异噁唑草酮和草铵膦除草剂的耐受性的分子和方法公开于美国专利号6,376,754和美国专利申请公布2002/0112260中。用于赋予昆虫/线虫/病毒抗性的分子和方法公开于美国专利5,250,515；5,880,275；6,506,599；5,986,175和美国专利申请公布2003/0150017 A1中。
植物细胞转化方法
用重组DNA转化植物细胞和/或将重组DNA引入植物细胞的染色体和质体中的许多方法是本领域已知的，可用于产生转基因或突变的植物细胞和植物的方法中。用于转化的两种有效方法是土壤杆菌介导的转化和微粒轰击介导的转化。微粒轰击方法例如在美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)；6,153,812(小麦)和6,365,807(水稻)中进行了说明。土壤杆菌介导的转化方法描述于例如美国专利5,159,135(棉花)；5,824,877(大豆)；5,463,174(芥花)；5,591,616(玉米)；5,846,797(棉花)；8,044,260(棉花)；6,384,301(大豆)；7,026,528(小麦)和6,329,571(水稻)；美国专利申请公布号2004/0087030 A1(棉花)和美国专利申请公布号2001/0042257 A1(甜菜)，所述专利全部以引用的方式整体并入本文。植物材料的转化在营养培养基(例如，允许细胞在体外生长的营养物的混合物)上的组织培养物中进行实践。接受者细胞靶标包括但不限于分生组织细胞、芽尖、下胚轴、愈伤组织、未成熟或成熟胚以及配子细胞，如小孢子、花粉、精子和卵细胞。愈伤组织可起始于包括但不限于不成熟或成熟胚、下胚轴、幼苗顶端分生组织、小孢子等的组织来源。使含有转基因核的细胞生长成转基因植物。
如上所述，用于转化植物细胞和植物细胞中的染色体的另一种方法是使用重组DNA供体模板通过定点整合的方法在基因组的预定位点插入DNA序列。定点整合可通过本领域已知的任何方法来实现，例如通过使用锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、TALE内切核酸酶、或RNA指导的内切核酸酶(例如Cas9或Cpf1)来实现。重组DNA构建体可通过同源重组(HR)或通过非同源末端连接(NHEJ)插入预定位点。除了在预定位点将重组DNA构建体插入植物染色体外，基因组编辑还可通过寡核苷酸定向诱变(ODM)(Oh和May，2001；美国专利号8,268,622)或通过引入使用位点特异性核酸酶的双链断裂(DSB)或切口、然后NHEJ或修复来实现。DSB或切口的修复可用于在DSB或切口的部位引入插入或缺失，并且这些突变可能导致引入移码、氨基酸取代和/或蛋白质翻译的早期终止密码子或基因的调控序列的改变。基因组编辑可在有或没有供体模板分子的情况下实现。
除了用重组DNA构建体直接转化或编辑植物材料外，还可通过使包含重组DNA编辑或突变的第一植物与缺乏所述重组DNA、编辑或突变的第二植物杂交来制备经修饰的或转基因的植物。例如，可将重组DNA编辑或突变引入到可经受转化的第一植物株系中，所述第一植物株系然后可与第二植物株系杂交以使所述重组DNA、编辑或突变渗入到第二植物株系中。具有提供增强的性状，例如增强的产量或其他产量构成性状的重组DNA、编辑或突变的经修饰的或转基因的植物可与具有赋予另一种性状(例如除草剂抗性或害虫抗性)的另一种重组DNA、编辑或突变的经修饰的或转基因的植物株系杂交以产生具有赋予两种性状的重组DNA序列、编辑或突变的子代植物。这些杂交的子代可分离，以使得一些植物将携带针对两种亲本性状的重组DNA、编辑或突变，并且一些植物将携带针对亲本性状之一的重组DNA、编辑或突变；并且可通过亲本性状中的一者或两者或与亲本性状中的一者或两者相关的标记物或所述重组DNA、编辑或突变来鉴定此类植物。例如，可通过分析或检测重组DNA、编辑或突变来进行标记物鉴定，或者在选择性标记物与重组DNA连接的情况下，可通过应用选择剂如与除草剂耐受性标记物一起使用的除草剂或通过选择增强的性状或使用任何分子技术来进行标记物鉴定。携带两种亲本性状的DNA的子代植物可与亲本株系之一回交多次(例如6至8代)以产生除另一经修饰的或转基因的亲本株系的重组DNA、编辑或突变之外，基因型大致上与原始转基因亲本株系相同的子代植物。
对于转化，通常在任一转化实验中都将DNA引入仅较小百分比的靶标植物细胞中。标记物基因用于提供用于鉴定通过接受重组DNA构建体并将所述构建体整合至它们的基因组中而被稳定转化的那些细胞的高效系统。优选的标记物基因提供赋予对如抗生素或除草剂的选择剂的抗性的选择性标记。本公开的植物可对其具有抗性的任何除草剂都是用于选择性标记物的试剂。使潜在转化细胞暴露于选择剂。在存活群体中，细胞是其中通常赋予抗性的基因被整合且在足以允许细胞存活的水平下表达的那些细胞。可进一步测试细胞以确认外源性DNA的稳定整合。通常使用的选择性标记物基因包括赋予对如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)、壮观霉素(aadA)和庆大霉素(aac3和aacC4)的抗生素的抗性或对如草铵膦(bar或pat)、麦草畏(DMO)和草甘膦(aroA或EPSPS)的除草剂的抗性的标记物基因。此类选择性标记物的实例在美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708；6,118,047和8,030,544中进行了说明。也可采用提供目视筛选转化体的能力的标记物，例如表达着色或荧光蛋白质(如荧光素酶或绿色荧光蛋白质(GFP))的基因或表达β-葡萄糖醛酸酶的基因或已知其各种显色底物的uidA基因(GUS)。
可在体外培养在暴露于选择剂时存活的植物细胞或在筛选测定中已计分为阳性的植物细胞以使发育或再生为小植株。可将从转化的植物细胞再生的发育中小植株转移至植物生长混合物中，并且例如在环境控制的室内以约85％相对湿度、600ppm CO2和25-250microEinsteins m-2s-1的光照经受耐寒锻炼，然后转移至温室或生长室进行成熟。取决于初始组织和植物种类，可在鉴定出转化体后约6周至10个月内再生植物。可使用本领域技术人员已知的常规植物育种方法对植物进行授粉以产生种子，例如转基因玉米和其他植物通常使用异花授粉和自花授粉。可测试再生转化植物或它的子代种子或植物的重组DNA表达且针对改变的表型或增强的农艺性状的存在加以选择。
经修饰的和转基因的植物和种子
使源自具有本公开的突变、编辑或转基因的经修饰的或转基因的植物细胞的经修饰的或转基因的植物生长，以产生与对照植物相比具有改变的表型或增强的性状的经修饰的或转基因的植物，并产生本公开的经修饰的或转基因的种子和单倍体花粉。具有增强的性状的此类植物是通过选择具有增强的性状的经修饰或转化的植物或子代种子来鉴定。为了效率，设计了一种选择方法来评价包含重组DNA的多种经修饰的或转基因的植物(事件)，例如2至20个或更多个转基因事件的多种植物。从本文提供的经修饰的或转基因的种子生长的经修饰的或转基因的植物表现出改善的有助于增加产量的农艺性状或提供增加的植物价值的其他性状，包括例如改善的种子质量。特别感兴趣的是具有提高的水利用效率或耐旱性、增强的高温或寒冷耐受性、增加的产量和提高的氮利用效率的植物。
表1提供作为重组DNA用于产生具有增强的性状的转基因植物的蛋白质编码基因的序列的列表。表1的要素通过参考以下进行描述：“NUC SEQ ID NO.”标识DNA序列；“PEPSEQ ID NO.”标识氨基酸序列；“基因ID”是指基因的标识符；并且“基因名称和描述”是基因的通用名称和功能描述。
表1.蛋白质编码基因的序列
Figure BDA0002545987400000761
Figure BDA0002545987400000771
Figure BDA0002545987400000781
表2提供作为重组DNA用于产生具有增强的性状的转基因植物的用于抑制靶蛋白编码基因的序列的列表。表2的要素通过参考以下进行描述：
“靶NUC SEQ ID NO.”标识抑制靶基因的核苷酸编码序列。
“靶PEP SEQ ID NO.”标识抑制靶基因的氨基酸序列。
作为抑制靶基因的标识符的“靶基因ID”。
“工程化的miRNA前体SEQ ID NO.”标识miRNA构建体的核苷酸序列。
“miRNA靶向序列SEQ ID NO.”标识miRNA靶向序列的核苷酸序列。
“靶基因名称和描述”是抑制靶基因的通用名称和功能描述。
表2.用于基因抑制的序列
Figure BDA0002545987400000782
Figure BDA0002545987400000791
作为抑制靶基因的替代方法，可替代使同一靶基因靶向诱变或基因组编辑，以产生降低或消除其表达和/或由靶基因编码的蛋白质活性的突变。以下表3提供玉米或大豆中的基因组DNA序列，涵盖表2中每种靶基因的基因组基因座。这些基因组序列可用于设计指导RNA或工程化位点特异性核酸酶，以靶向并在玉米或大豆植物的基因组中的靶点处在靶基因处或附近形成双链断裂或切口，这可进行修复(有或无供体模板)以在基因组靶位点处或附近产生突变(取代、缺失、倒位、插入等)，以减少或消除靶基因的表达和/或活性。
表3.用于基因组编辑的靶基因序列
Figure BDA0002545987400000792
Figure BDA0002545987400000801
表4提供作为重组DNA用于产生具有增强的性状的转基因植物的用于表达或抑制蛋白质编码基因的具有特定表达模式的构建体列表。表4的要素通过参考以下进行描述：
“构建体ID”通过与表达或抑制蛋白质编码基因的多核苷酸序列可操作地连接的启动子标识具有特定表达模式的构建体。
“基因ID”标识来自表1或表2的表达的或抑制的基因。
“特定表达模式”描述预期表达模式或启动子类型。
表4.用于基因表达和抑制的构建体
Figure BDA0002545987400000811
Figure BDA0002545987400000821
表5提供具有特定表达模式的启动子的多核苷酸序列的列表。为了表述特定表达模式，启动子的选择不限于表5中列出的那些。
表5.启动子序列和表达模式
核苷酸SEQ ID NO. 启动子表达模式
95 根优选的
96 种子优选的
97 胚乳优选的
98 分生组织优选的
99 叶维管束鞘优选的
100 地面上优选的
101 叶片叶肉优选的
102 叶片优选的
103 胚乳优选的
针对增强的性状选择并测试转基因植物
在各自用重组DNA从植物细胞发育或再生的转基因植物群体中，存活至产生种子和子代植物的可育转基因植物的许多植物将不表现出增强的农艺性状。从群体中进行选择对于鉴定具有增强的性状的一种或多种转基因植物可能是必要的。有力测试情况下的进一步评价对于理解性状的促成因素、支持性状发展决策和产生作用模式假设可能是重要的。可通过在多种测定中评价植物以检测增强的性状来从自本文所述转化的植物细胞发育、再生或衍生的植物群体中选择并测试具有增强的性状的转基因植物，所述增强的性状例如提高的水利用效率或耐旱性、增强的高温或寒冷耐受性、增加的产量或产量组成、合乎需要的结构、最佳生命周期、提高的氮利用效率、增强的种子组成(如增强的种子蛋白和增强的种子油)。
这些测定可采取多种形式，包括但不限于在温室或田间试验中直接筛选性状或通过筛选替代性状进行。此类分析可用于检测植物的化学组成、生物量、产量构成、生理性质、根构型、形态或生命周期的变化。可通过分析种子组成以及蛋白质、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉或生育酚的含量来检测化学组成(如籽粒的营养组成)的变化。化学组成的变化也可通过分析叶片中的含量(如叶绿素或类胡萝卜素含量)来检测。可在温室或田间种植的植物上评价生物量特征的变化，并且所述变化可包括植株高度、茎直径、根和枝干重、冠层大小；以及对于玉米植物，穗长度和直径。产量构成的变化可通过每单位面积籽粒的总数及其单重来测量。可通过评价对胁迫条件的反应来鉴定生理性质的变化，例如使用施加的胁迫条件(如缺水、缺氮、寒冷生长条件、病原体或昆虫侵袭或光照不足或植物密度增加)进行的测定。根构型的变化可通过根长度和分枝数来评价。可通过目测观察与朝向茂密、高大、浓密、窄叶、条纹叶、打结的性状、萎黄病、白化病、花青素产生或改变的雄穗、穗或根的变化相比看起来转化的植物似乎是正常植物的趋势来测量形态的变化。形态的变化也可通过基于形状参数的形态计量学分析，使用诸如穗直径、穗长、籽粒行数、节间长度、植株高度或茎体积的尺寸测量来进行测量。生命周期的变化可通过划分为发育阶段的宏观或微观形态变化来衡量，如到花粉散落的天数、到抽丝的天数、叶片延伸速率。其他选择和测试性质包括到花粉散落的天数、到抽丝的天数、叶片延伸速率、叶绿素含量、叶片温度、林分、幼苗活力、节间长度、植株高度、叶片数、叶片面积、分蘖、支柱根、保绿性或延迟的衰老、秸秆倒伏、根倒伏、植物健康、裸露/多产、嫩绿和害虫抗性。另外，可评价收获的籽粒的表型特征，包括穗上每行的籽粒数、穗上的籽粒行数、籽粒败育、籽粒重量、籽粒大小、籽粒密度和物理籽粒品质。
用于筛选所需性状的测定是本领域技术人员容易设计的。以下说明使用杂交玉米植物的玉米性状的筛选测定。所述测定可适于筛选杂种或近交的其他植物，如芥花、小麦、棉花和大豆。
可通过与对照植物相比在相同和足够量的氮供应下在田间筛选转基因植物来鉴定具有提高的氮利用效率的转基因玉米植物，其中与对照植物相比，此类植物提供更高的产量。还可通过与对照植物相比在减少量的氮供应下在田间筛选转基因植物来鉴定具有提高的氮利用效率的转基因玉米植物，其中与对照植物相比，此类植物提供相同或类似的产量。
可通过在多个位置使用转基因植物的子代进行筛选来鉴定具有增加的产量的转基因玉米植物，所述植物在最佳生产管理实践以及最大杂草和害虫控制或标准农艺实践(SAP)下生长数年。选择方法可在一个或多个种植季节(例如至少两个种植季节)的多个不同地理位置(例如最多16个或更多位置)中应用，以从统计学上将产量提高与自然环境影响区分开。
可通过在测定中筛选植物来鉴定具有提高的水利用效率或耐旱性的转基因玉米植物，在所述测定中将水截留一段时间以诱导胁迫，然后浇水以使植物恢复活力。例如，选择过程在11天的初始无胁迫生长期后的15天的总时间段内对植物施加3次干旱/再浇水周期。每个周期为5天，前四天不施加水，并且在周期的第5天用水淬灭。通过选择方法分析的主要表型可以是植物生长速率的变化，如通过植物干旱处理期间的高度和生物量所确定。
尽管本公开的植物细胞和方法可应用于任何植物细胞、植物、种子或花粉，例如任何水果、蔬菜、草、树或观赏植物，但是本公开的各个方面应用于玉米、大豆、棉花、芥花、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、藜麦和甘蔗植物。
实施例
实施例1.玉米转化
此实施例说明用于产生转基因玉米植物细胞、种子和植物的转化方法，所述转基因玉米植物细胞、种子和植物具有如表6-8所示的改变的表型以及如表10-15中所示的增强的性状、提高的水利用效率、提高的氮利用效率、增加的产量以及改变的性状和物候学。
对于土壤杆菌介导的玉米胚细胞的转化，收获来自玉米植株的穗，并通过将穗喷洒或浸泡在乙醇中进行表面灭菌，然后空气干燥。从经过表面消毒的穗的单个籽粒中分离出胚。在切除后，用含有带有目标基因盒和植物选择性标记物盒的质粒DNA的土壤杆菌细胞接种玉米胚，且然后与土壤杆菌一起共培养数天。将共培养的胚转移至各种选择和再生培养基，并在选择开始后的6至8周回收转化的R0植株，然后将其移植到盆栽土中。使再生的R0植株自交，并获得R1和随后的子代。
可重复上述过程，以从用具有表3中标识的构建体的重组DNA转化的细胞产生转基因玉米植株的多个事件。如表6-8和10-15所示，针对插入基因的存在和单拷贝以及各种改变或增强的性状和表型，如提高的水利用效率、增加的产量和提高的氮利用效率对转化的植物的子代转基因植株和种子进行筛选。从具有来自表3的特定重组DNA的转基因植物的多个事件的每组中，鉴定出显示出增加的产量、提高的水利用效率、提高的氮利用效率以及改变的表型和性状的事件。
实施例2.大豆转化
此实施例说明在产生具有改变的表型或增强的性状(如提高的水利用效率、耐旱性和增加的产量)的转基因大豆植物细胞、种子和植物中的植物转化，如表14所示。
对于土壤杆菌介导的转化，将大豆种子吸水过夜，并切下分生组织外植体。从种子吸水开始起不迟于14小时将大豆外植体与诱导的土壤杆菌细胞混合，所述土壤杆菌细胞包含具有目标基因盒和植物选择性标记物盒的质粒DNA，并使用超声处理进行伤害。在受伤后，将外植体置于共培养物中2-5天，然后将它们转移到选择培养基中，以进行转基因芽的选择和生长。在大约6-8周内收获抗性芽，并放入选择性生根培养基中2-3周。将产生根的芽转移到温室中并盆栽在土壤中。选择时仍保持健康但不产生根的芽转移至非选择性生根培养基中另外两周。在将它们转移至温室并盆栽到土壤中之前，测试来自产生根的不选择的任何芽的根测试植物选择性标记物的表达。
可重复上述过程，以从用具有表3中标识的构建体的重组DNA转化的细胞产生转基因大豆植株的多个事件。如表7-9和11-16所示，针对插入基因的存在和单拷贝，对转化的植物的子代转基因植株和种子进行筛选，以及针对各种改变或增强的表型和性状，对转化的植物的子代转基因植株和种子进行测试。
实施例3.自动温室中改变的表型的鉴定
此实施例说明在自动温室(AGH)中针对改变的表型筛选和鉴定转基因玉米植物。例如，在美国专利公布号2011/0135161中公开了用于植物的自动表型筛选的设备和方法，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在AGH的三个筛选中，在不同条件下(包括无胁迫、缺氮和失水胁迫条件)对玉米至进行了测试。在0-5天的萌发阶段，所有筛选都从无胁迫条件开始，然后在表6所示的筛选特定条件下使植物生长22天。
表6.玉米植物的三个AGH筛选的描述
Figure BDA0002545987400000871
缺水被定义为比无胁迫植物的VWC低的特定体积含水量(VWC)。例如，无胁迫的植物可维持在55％VWC，而缺水测定的VWC可能被定义在30％VWC左右。使用可见光和高光谱成像以及每天直接测量盆重和施加至单个植株的水和养分的量来收集数据。
缺氮被(部分)定义为氮的特定mM浓度，所述浓度低于无胁迫植物的氮浓度。例如，无胁迫的植物可保持在8mM氮，而在缺氮测定中施加的氮浓度可保持在2mM的浓度。
每个筛选测量最多十个参数。基于可见光彩色成像的测量值为：生物量、冠层面积和植株高度。生物量(Bmass)被定义为从多个角度获取的图像中估计的植物枝鲜重(g)。冠层面积(Cnop)被定义为自上而下图像(mm2)中看到的叶面积。植株高度(PlntH)是指从侧面图像(mm)得出的从花盆顶部到植物最高点的距离。花青素分数和面积、叶绿素分数和浓度以及水含量分数是基于高光谱成像的参数。花青素分数(AntS)是从顶向下的高光谱图像获得的叶冠层中花青素的估计值。花青素面积(AntA)是从侧视高光谱图像中获得的茎中花色苷的估计值。叶绿素分数(ClrpS)和叶绿素浓度(ClrpC)都是从自上而下的高光谱图像获得的叶冠层中叶绿素的度量值，其中叶绿素分数以相对单位度量，并且叶绿素浓度以百万分率(ppm)单位度量。含水量分数(WtrCt)是从自顶向下的高光谱图像获得的叶冠层中水的量度。水利用效率(WUE)源自每升添加的水中植物生物量的克数。施水量(WtrAp)是在实验过程中为保持稳定的土壤含水量添加到盆(无孔盆)中的水的直接量度。
建立这些生理筛选运行，以便将测试的转基因品系与对照品系进行比较。使用％Δ和某些p值截止值针对对照分析收集的数据。表7、8和9是包含所公开的重组DNA构建体的转基因玉米植物的总结，所述转基因玉米植物分别在无胁迫、缺氮和缺水条件下具有改变的表型。“构建体ID”是指如表4中定义的构建体标识符。
测试结果由三个数字表示：字母“p”之前的第一个数字表示在p<0.1时测试参数增加的事件数量；字母“n”前的第二个数字表示在p<0.1时测试参数减少的事件数量；字母“t”之前的第三个数字表示在特定筛选中针对给定参数测试的转基因事件的总数。与非转基因对照植物相比，测量了增加或减少。名称“-”表示尚未测试。例如，2p1n5t表示筛选了5个转基因植物事件，其中2个事件显示测量参数增加，并且1个显示测量参数减少。
表7.在AGH非胁迫筛选中具有改变的表型的转基因植物的总结
Figure BDA0002545987400000881
Figure BDA0002545987400000891
表8.在AGH缺氮筛选中具有改变的表型的转基因植物的总结
Figure BDA0002545987400000892
Figure BDA0002545987400000901
表9.在AGH缺水筛选中具有改变的表型的转基因植物的总结
Figure BDA0002545987400000902
Figure BDA0002545987400000911
实施例4.评价转基因植物的性状特征
进行性状测定以评价与非转基因对照相比，转基因植物的性状特征和表型变化。玉米和大豆植物在田间和温室条件下生长。在某些植物发育阶段，针对玉米的物候学、形态、生物量和产量构成研究测量了多达18个参数。对于根测定，使大豆植物在温室中在透明营养培养基中生长，以使根系统成像并进行分析。
玉米发育阶段由以下发育标准定义：
发育的叶片：叶片具有可见的叶领；
V阶段：玉米植物上已发育叶片的数量与所述植物的营养生长阶段相对应-即，V6阶段的玉米植物具有6片发育(完全展开)的叶片；
R1(抽丝)：定义为R1的植物必须具有一根或多根延伸到果壳叶外侧的丝。确定作物在R1或以后的繁殖阶段完全是基于初级穗的发育；
R3(乳)：根据温度和相对成熟度，通常在抽丝后18-22天发生。籽粒通常是黄色的，并且每个籽粒中的液体是乳白色的；
R6(生理成熟度)：通常在抽丝后55-65天发生(取决于温度和所观察的种质的相对成熟度)。此时，籽粒已达到最大干物质累积，并且籽粒水分为大约35％。
大豆发育阶段按以下标准定义：
充分发育的三叶叶片节点：当叶片在其紧接上方的节点处已经充分展开，因此每个小叶的两个边缘不再接触时，则认为所述叶片已完全发育。在主茎的末端节上，当小叶扁平且外观与植物上的老叶相似时，则认为叶片完全发育；
VC：子叶和具一小叶的叶片已充分扩展；
R1：开始开花–即在主茎的任何节上开一朵开放的花。
表10描述性状测定。性状RefID是每个性状测定的参考ID。性状测定名称是测定的描述性名称。所述说明提供测定所测量的内容以及进行测量的方式。阳性调用的方向指示测量数量的增加或减少是否对应于测定结果中的“阳性”调用。
表10.性状测定的描述
Figure BDA0002545987400000921
Figure BDA0002545987400000931
Figure BDA0002545987400000941
Figure BDA0002545987400000951
建立这些性状测定，以便将测试的转基因品系与对照品系进行比较。将收集的数据针对对照进行分析，并且如果p值为0.2或更小，则分配阳性。表11-14是包含所公开的重组DNA构建体的转基因植物分别针对玉米物候学和形态测定、玉米产量/性状成分测定、大豆物候学和形态测定、产量/性状成分测定以及玉米和大豆根测定的总结。
测试结果由三个数字表示：字母“p”之前的第一个数字表示具有“正”变化的事件的测试数量，如表10所定义；字母“n”之前的第二个数字表示具有“负”变化的事件的测试数量，其变化与表10中定义的“正”方向相反；字母“t”之前的第三个数字表示针对给定基因的特定测定的转基因事件的测试总数。与非转基因对照植物相比，测量了“正”或“负”变化。名称“-”表示尚未测试。例如，2p1n5t表示已测试了5个转基因植物事件，其中2个事件显示测量参数的“正”变化，并且1个事件显示测量参数的“负”变化。如表10所示，用其性状RefID表示所述测定。
表11.玉米物候学和形态特征性状测定的测定结果的总结
Figure BDA0002545987400000961
Figure BDA0002545987400000971
表12.玉米性状成分测定的结果的总结
Figure BDA0002545987400000972
Figure BDA0002545987400000981
表13.大豆物候学、形态计量学和性状成分测定的结果的总结
Figure BDA0002545987400000982
Figure BDA0002545987400000991
表14.玉米和大豆根测定的测定结果的总结
作物 构建体ID RBPN RTL RBNR2
玉米 TX6-04 - - 0p1n1t
玉米 TX6-22 0p0n4t 0p0n4t -
大豆 TX6-26 3p0n4t 3p0n4t 2p1n8t
大豆 TX6-29 2p0n4t 2p0n4t 0p3n8t
大豆 TX6-34T 2p0n4t 3p0n4t 1p0n8t
实施例5.在田间试验中针对提高的氮利用效率、提高的水利用效率和增加的产量对转基因植物的表型评价
进行了玉米田间试验，以鉴定在氮限制性条件下与非转基因对照相比可提高氮利用效率(NUE)、从而产生增加的产量表现的基因。对于表15所示的氮田间试验结果，将每个田间在氮限制性条件下种植(60磅/英亩)，并将玉米穗重或产量与非转基因对照植物进行比较。
进行了玉米田间试验，以鉴定在水限制性条件下与非转基因对照相比可提高水利用效率(WUE)、从而产生增加的产量表现的基因。表15中示出在有管理的水限制性条件下进行的水利用效率试验的结果，并将玉米穗重或产量与非转基因对照植物进行了比较。
进行了玉米和大豆田间试验，以鉴定可在标准农艺实践下提高大田产量(BAY)的基因。在表15中示出在标准农艺学实践下进行的大田产量试验的结果，并将玉米或大豆的产量与非转基因对照植物进行了比较。
表15提供产生与对照植物相比具有提高的氮利用效率(NUE)、提高的水利用效率(WUE)和/或提高的大田产量(BAY)的转基因植物的基因的列表。包括具有至少一个事件的构建体中的多核苷酸序列，所述至少一个事件在p<0.2处的多个位置显示出显著产量或穗重增加。除非在“特定表达模式”栏中另有说明，否则基因用组成型启动子表达。基于对基因功能的理解，或基于当用组成型启动子表达基因时观察到的缺乏显著产量增加的情况，选择特定表达模式的启动子而不是组成型启动子。表15的要素描述如下：“作物”是指试验作物，是玉米或大豆；“条件”是指田间试验的类型，对于标准农艺学(SAP)下的大田产量试验是BAY，对于水利用效率试验是WUE，并且对于氮利用效率试验是NUE。“构建体ID”是指表4中定义的构建体标识符；“基因ID”是指表1中定义的基因标识符；“产量结果”是指在构建体中具有至少一个事件的重组DNA，所述至少一个事件在各个位置的p<0.2处显示显著产量增加。第一个数字是指产量或穗重显著增加的事件的测试数量，而第二个数字是构建体中每种重组DNA的事件的测试总数。通常每个构建体测试4至8个不同的事件。
表15.针对提高的氮利用效率、提高的水利用效率和增加的产量的具有蛋白质编码基因的重组DNA
Figure BDA0002545987400001001
Figure BDA0002545987400001011
表16提供抑制靶基因和作为重组DNA提供的miRNA构建体元件的列表，所述重组DNA用于产生具有提高的氮利用效率、提高的水利用效率和增加的产量的转基因玉米或大豆植物。表16的要素通过参考以下进行描述：
“作物”是指试验作物，其是玉米或大豆；
“条件”是指田间试验的类型，BAY代表在标准农艺实践下的大田产量试验，WUE代表水利用效率试验，并且NUE代表氮利用效率试验；
“构建体ID”是指表4中定义的构建体标识符
“靶基因ID”是指表2中定义的抑制靶基因标识符；
“工程化的miRNA前体SEQ ID NO.”标识miRNA构建体的核苷酸序列。
“产量结果”是指具有至少一个事件的构建体中的重组DNA，所述至少一个事件在不同位置的p<0.2处显示显著产量增加。第一个数字是指产量或穗重显著增加的事件的数量，而第二个数字是针对构建体中每个序列测试的事件的总数。
表16.抑制靶向基因以获得提高的氮利用效率、提高的水利用效率和增加的产量的miRNA重组DNA构建体
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实施例6.同源物鉴定
此实施例说明在表1中标识的由DNA序列编码的蛋白质的同源物的鉴定，所述同源物用于提供具有增强的农艺性状的转基因种子和植物。从同源物蛋白质的序列中，可鉴定出相应的同源DNA序列，以制备具有增强的农艺性状的其他转基因种子和植物。
使用专有序列数据库和美国国家生物技术信息中心(NCBI)非冗余氨基酸数据库(nr.aa)，由已知蛋白质序列构建“全蛋白质数据库”。对于从其获得本文提供的多核苷酸序列的每个生物体，由所述生物体的已知蛋白序列构建“生物体蛋白质数据库”；它是基于生物体的NCBI分类学ID的全蛋白质数据库的子集。
使用表1中提供的氨基酸序列，使用NCBI“blastp”程序(E值截止值为1e-8)查询全蛋白质数据库。保留了多达1000种最高命中，并按生物体名称分隔。对于除查询序列以外的每个生物体，都会保留一个列表，以列出来自查询生物体本身的命中值，其E值比所述生物体的最佳命中更显著。所述列表包含本文提供的多核苷酸的可能重复的基因，并且被称为核心列表。保留了每个生物体的所有命中的另一个列表，按E值排序，并且称为命中列表。
使用表1中提供的多肽序列，使用NCBI“blastp”程序(E值截止值为1e-4)查询生物体蛋白质数据库。保留了多达1000个最高命中。基于这些命中构建了BLAST可搜索数据库，并且被称为“SubDB”。使用NCBI“blastp”程序(E值截止值为1e-8)用命中列表中的每个序列查询SubDB。将具有最佳E值的命中与相应生物体的核心列表进行比较。如果命中属于核心列表，则认为所述命中是可能的直系同源物，否则则认为它不是可能的直向同源物，并且在命中列表中没有针对同一生物体的序列的进一步搜索。在表17和18中报告了在表1中提供的多肽序列的95％的长度上具有至少95％的同一性的同源物。
表17提供同源物基因的列表，其要素描述如下：“PEP SEQ ID NO.”标识氨基酸序列。“同源物ID”是指字母数字标识符，其数字部分是NCBI Genbank GI号；并且“基因名称和描述”是基因的通用名称和功能描述。表18描述表1中的蛋白质编码基因、表2中的抑制靶基因及它们的同源物之间的对应关系，以及所述基因与它的同源物之间的蛋白质序列比对的水平。
表17.同源基因信息
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表18.基因和同源物的对应
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实施例7.使用抑制方法抑制靶基因的表达
此实施例说明用重组DNA构建体转化单子叶植物和双子叶植物，所述构建体可用于稳定整合到植物细胞核中的植物染色体中，以通过抑制靶基因的表达来提供具有增强的性状的转基因植物。
基于编码所述蛋白质的基因的核苷酸序列，构建了用于抑制转基因植物中的靶基因表达的多种重组DNA构建体，所述蛋白质具有选自由SEQ ID NO:70-76组成的组的氨基酸序列，其中将DNA构建体设计为表达(a)靶向用于抑制的基因的miRNA，(b)作为靶蛋白的信使RNA并具有导致下调靶蛋白的合成miRNA靶向序列的RNA，(c)形成dsRNA并且加工成影响靶蛋白的下调的siRNA的RNA，(d)形成反式作用siRNA的ssRNA，其导致产生实现靶蛋白的下调的siRNA。
使用实施例1和2的载体和方法，将各种类型的重组DNA构建体中的每一种用于玉米细胞的转化，以产生转基因玉米细胞的多个事件。将此类事件再生为转基因玉米植物，并且进行筛选以确认用于抑制靶蛋白的重组DNA的存在及其RNA的表达。还筛选了来自多个转基因事件的转基因植物群体，以鉴定表现出改变的表型或增强的性状的转基因植物。
实施例8.使用定点整合来引入转基因或调节植物中的内源性基因的表达。
如上所述，可将包含转基因、表达盒等的DNA序列，如表1、2和17中标识的基因的一个或多个编码序列或其同源物经由定点整合插入或整合到植物或植物细胞的基因组内的特定位点或基因座中。因此，本公开的重组DNA构建体和分子可包含供体模板，所述供体模板具有包含至少一种转基因、表达盒或其他DNA序列的插入序列，以用于插入植物或植物细胞的基因组中。用于定点整合的这种供体模板还可包含在插入序列侧翼的一个或两个同源臂，以促进插入序列在所需位点或基因座处的插入。可选择植物的基因组内的任何位点或基因座以用于插入序列的定点整合。用于定点整合的若干方法在本领域中是已知的，涉及切割基因组DNA以在所需的基因组位点或基因座处产生双链断裂(DSB)或切口的不同的蛋白质(或蛋白质复合物和/或指导RNA)。可使用的位点特异性核酸酶的实例包括锌指核酸酶、工程化的或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶和RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。对于使用RNA指导的位点特异性核酸酶(例如，Cas9或Cpf1)的方法，重组DNA构建体还将包含编码一个或多个指导RNA以将核酸酶引导至植物基因组内的所需位点的序列。本公开的重组DNA分子或构建体还可包含编码位点特异性核酸酶、指导RNA和/或任何相关蛋白质的表达盒，以进行所需的定点整合事件。
可选择与表1和17中标识的基因相对应的植物或植物细胞的内源基因组基因座或其同源物，以用于位点特异性插入重组DNA分子或能够调节相应内源性基因的表达的序列中。如上所述，重组DNA分子或序列用作供体模板，以用于将插入序列整合到植物基因组中。供体模板还可具有一个或两个同源臂，其侧接插入序列以促进靶向插入事件。尽管可经由定点整合将转基因、表达盒或其他DNA序列插入植物基因组的所需基因座或位点中，但也可使用供体模板来置换、插入或修饰内源性基因的5’非翻译区(UTR)、上游序列、启动子、增强子、内含子、3’UTR和/或终止子区域或其任何部分，以调节内源性基因的表达水平。用于修饰内源性基因的表达的另一种方法是通过内源性基因座的基因组编辑进行。例如，可进行靶向基因组编辑事件以破坏或废除内源性基因的转录阻遏物的调控结合位点，以增加或修饰内源性基因的表达。
对于基因组编辑或供体模板的插入序列的位点特异性整合，在选定的基因组基因座处进行双链断裂(DSB)或切口。可使用位点特异性核酸酶形成DSB或切口，所述核酸酶例如锌指核酸酶、工程化或天然大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶、或RNA指导的核酸内切酶(例如，Cas9或Cpf1)。在供体模板存在下，可通过在供体模板的同源臂与植物基因组之间进行同源重组来修复DSB或切口，从而导致插入序列的定点整合以在DSB或切口的位点处进行靶向基因组修饰或插入。为了使本文所示的基因或抑制元件在植物中引起或产生所需的表型或性状，可将包含与植物可表达启动子可操作地连接的基因或抑制元件的编码序列的表达构建体或转基因如上所述经由定点整合插入植物基因组内的所需或选定位置中。或者，可经由基因组编辑或定点整合来修饰相应内源性基因的序列，如在内源性基因的调控区内，以增加或改变内源性基因的表达水平，如通过添加启动子或内含子序列，或通过修饰或置换内源性基因的5’UTR序列、启动子、增强子、转录因子或阻遏物结合位点、内含子、3’UTR序列和/或终止子区域或其任何部分。
在用重组分子或构建体转化植物细胞后，针对供体模板插入序列的定点插入或基因组修饰筛选所得事件。然后可测试含有这些确认的编辑、事件或插入的植物的内源性基因的调节或抑制、整合的转基因的表达和/或产量性状或其他表型的修饰。
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Claims (86)

1.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：
a)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:1-31组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；
b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:32-62和104-140组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；
c)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码mRNA分子，所述mRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:63-69组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列；或
d)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码蛋白质，所述蛋白质包含与选自由SEQ ID NO:70-76组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸序列编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子，并且其中所述RNA分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:63-69组成的组的序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补。
3.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸序列编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子，并且其中所述RNA分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与编码蛋白质的mRNA序列的至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26或至少27个连续核苷酸至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％互补，所述蛋白质具有与选自由SEQ ID NO:70-76组成的组的序列至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述多核苷酸序列编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子，其中所述RNA分子包含与选自由SEQ ID NO:84-90组成的组的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％相同的多核苷酸序列。
5.如权利要求1所述的重组DNA构建体，所述重组DNA构建体还包含在植物细胞中具有功能性并与所述多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。
6.一种载体或质粒，所述载体或质粒包含如权利要求1所述的重组DNA构建体。
7.一种植物，所述植物包含如权利要求1所述的重组DNA构建体。
8.如权利要求7所述的植物，其中所述植物是大田作物。
9.如权利要求8所述的植物，其中所述大田作物植物选自由以下组成的组：玉米、大豆、棉花、芥花、水稻、大麦、燕麦、小麦、草皮草、苜蓿、甜菜、向日葵、藜麦以及甘蔗。
10.如权利要求7所述的植物，其中与对照植物相比，所述植物具有改变的表型或增强的性状。
11.如权利要求10所述的植物，其中所述增强的性状选自由以下组成的组：与对照植物相比，减少的从种植到成熟的天数、增加的茎杆大小、增加的叶片数量、增加的营养阶段的植株高度生长速率、增加的穗大小、增加的每个植株的穗干重、增加的每个穗的籽粒数量、增加的每个籽粒的重量、增加的每个植株的籽粒数量、减少的穗空粒、延长的籽粒灌浆期、降低的植株高度、增加的根分枝数量、增加的总根长、增加的产量、提高的氮利用效率以及提高的水利用效率。
12.如权利要求10所述的植物，其中所述改变的表型选自由以下组成的组：植株高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、施水量、水含量和水利用效率。
13.一种植物部分或繁殖体，所述植物部分或繁殖体包含如权利要求1所述的重组DNA构建体，其中所述植物部分或繁殖体选自由以下组成的组：细胞、花粉、胚珠、花、胚、叶、根、茎、枝、分生组织、籽粒以及种子。
14.一种用于在植物中改变表型、增强性状、增加产量、提高氮利用效率或提高水利用效率的方法，所述方法包括产生包含如权利要求1所述的重组DNA构建体的转基因植物。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述重组DNA构建体还包含在植物细胞中具有功能性并与所述重组DNA构建体的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述转基因植物通过以下来产生：用所述重组DNA构建体转化植物细胞或组织，以及从包含所述重组DNA构建体的所述植物细胞或组织再生或发育成所述转基因植物。
17.如权利要求14所述的方法，所述方法还包括：
通过将所述转基因植物与以下各项杂交来产生包含所述重组DNA构建体的子代植物：
(a)自身；
(b)来自同一株系的第二植物；
(c)野生型植物；或
(d)来自不同株系的第二植物，
以产生种子，使所述种子生长以产生子代植物；以及
选择与对照植物相比具有增加的产量、提高的氮利用效率或提高的水利用效率的子代植物。
18.如权利要求14所述的方法，其中所述转基因植物通过以下来产生：使用包含所述重组DNA构建体的供体模板将所述重组DNA构建体定点整合到植物细胞或组织的基因组中，以及从包含所述重组DNA构建体的所述植物细胞或组织再生或发育成所述转基因植物。
19.一种植物，所述植物通过如权利要求14所述的方法产生。
20.一种在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子包含插入序列，所述插入序列包含：
a)多核苷酸序列，所述多核苷酸序列与选自由SEQ ID NO:1-31组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；
b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含与选自由SEQ ID NO:32-62和104-140组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列；
c)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码mRNA分子，所述mRNA分子包含与选自由SEQ ID NO:63-69组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的多核苷酸序列；或
d)编码用于抑制内源性基因的表达的RNA分子的多核苷酸序列，其中所述内源性基因编码蛋白质，所述蛋白质包含与选自由SEQ ID NO:70-76组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
21.如权利要求20所述的重组DNA分子，其中所述插入序列还包含在植物细胞中具有功能性并与所述多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子。
22.如权利要求20所述的重组DNA分子，所述重组DNA分子还包含在所述插入序列侧翼的至少一个同源臂。
23.如权利要求20所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子还包含至少一个编码位点特异性核酸酶的盒，其中所述位点特异性核酸酶选自包括以下的组：锌指核酸酶、工程化或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶。
24.如权利要求20所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子还包含至少一个编码一种或多种指导RNA的盒。
25.一种在定点整合中用作供体模板的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子包含用于调节内源性基因的表达的插入序列，其中所述内源性基因包含：
a)编码mRNA分子的多核苷酸序列，所述mRNA分子与选自由SEQ ID NO:1-31组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性；或
b)编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽具有与选自由SEQ ID NO:32-62和104-140组成的组的序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。
26.如权利要求25所述的重组DNA构建体，其中所述插入序列包含启动子、增强子、内含子或终止子区域。
27.如权利要求25所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA分子还包含至少一个编码位点特异性核酸酶的盒，其中所述位点特异性核酸酶选自包括以下的组：锌指核酸酶、工程化或天然的大范围核酸酶、TALE-核酸内切酶或RNA指导的核酸内切酶。
28.如权利要求25所述的重组DNA构建体，其中所述重组DNA分子还包含至少一个编码一种或多种指导RNA的盒。
29.一种用于在植物中改变表型、增强性状、增加产量、提高氮利用效率或提高水利用效率的方法，所述方法包括：
a)通过以下修饰植物细胞的基因组：
i)鉴定所述植物的对应于选自表1和表17中的基因列表的基因的内源性基因及它们的同源物，以及
ii)经由定点整合修饰所述植物细胞中的内源性基因的序列以改变所述内源性基因的表达水平；以及
b)从所述植物细胞再生或发育成植物。
30.一种经修饰的玉米植物或植物部分，所述经修饰的玉米植物或植物部分包含至少一个细胞，所述至少一个细胞在内源性基因中具有通过诱变或基因组编辑技术引入的突变或编辑，相对于不具有所述突变或编辑的所述内源性基因的野生型等位基因，所述突变或编辑降低所述至少一个玉米细胞中的所述内源性基因的表达水平或活性，其中所述内源性基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因。
31.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物或植物部分，其中所述内源性基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因。
32.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物或植物部分，其中所述内源性基因是山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因。
33.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物或植物部分，其中所述内源性基因是细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因。
34.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物或植物部分，其中所述内源性基因是细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因。
35.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物，其中与对照植物相比，所述经修饰的玉米植物具有改变的表型，其中所述改变的表型选自由以下组成的组：改变的、增加的或降低的植株高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、施水量以及水含量。
36.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物，所述经修饰的玉米植物具有增强的性状，所述增强的性状选自由以下组成的组：与对照植物相比，更早或更晚成熟、增加的茎杆大小、增加的叶片数量、增加的营养阶段的植株高度生长速率、增加的穗大小、增加的每个植株的穗干重、增加的每个穗的籽粒数量、增加的每个籽粒的重量、增加的每个植株的籽粒数量、减少的穗空粒、延长的籽粒灌浆期、降低的植株高度、增加的根分枝数量、增加的总根长、增加的产量、提高的氮利用效率以及提高的水利用效率。
37.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物或植物部分，其中所述至少一个细胞在所述内源性基因中具有通过诱变技术引入的突变。
38.如权利要求30所述的经修饰的玉米植物或植物部分，其中所述至少一个细胞在所述内源性基因中具有通过基因组编辑技术引入的编辑。
39.如权利要求38所述的经修饰的玉米植物或植物部分，其中所述编辑使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶引入。
40.一种经修饰的大豆植物或植物部分，所述经修饰的大豆植物或植物部分包含至少一个细胞，所述至少一个细胞在内源性基因中具有通过诱变或基因组编辑技术引入的突变或编辑，相对于不具有所述突变或编辑的所述内源性基因的野生型等位基因，所述突变或编辑降低所述至少一个大豆细胞中的所述内源性基因的表达水平或活性，其中所述内源性基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。
41.如权利要求40所述的经修饰的大豆植物或植物部分，其中所述内源性基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因。
42.如权利要求40所述的经修饰的大豆植物或植物部分，其中所述内源性基因是分枝1(Gm.BRC1)基因。
43.如权利要求40所述的经修饰的大豆植物或植物部分，其中所述内源性基因是多产c(Gm.FULc)基因。
44.如权利要求40所述的经修饰的大豆植物，其中与对照植物相比，所述经修饰的大豆植物具有改变的表型，其中所述改变的表型选自由以下组成的组：改变的、增加的或降低的植株高度、生物量、冠层面积、花青素含量、叶绿素含量、施水量以及水含量。
45.如权利要求40所述的经修饰的大豆植物，所述经修饰的大豆植物具有增强的性状，所述增强的性状选自由以下组成的组：与对照植物相比，更早或更晚成熟、增加的叶片数量、增加的营养阶段的植株高度生长速率、增加的种子重量、增加的每个植株的种子数量、降低的植株高度、增加的根分枝数量、增加的总根长、增加的产量、提高的氮利用效率以及提高的水利用效率。
46.如权利要求40所述的经修饰的大豆植物或植物部分，其中所述至少一个细胞在所述内源性基因中具有通过诱变技术引入的突变。
47.如权利要求40所述的经修饰的大豆植物或植物部分，其中所述至少一个细胞在所述内源性基因中具有通过基因组编辑技术引入的编辑。
48.如权利要求47所述的经修饰的大豆植物或植物部分，其中所述编辑使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶、TALE核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶引入。
49.一种包含指导RNA分子的组合物，其中所述指导RNA分子包含与在玉米植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，其中所述内源性靶基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因。
50.如权利要求49所述的组合物，其中所述指导RNA分子包含与SEQ ID NO:141、142、144或145的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
51.如权利要求49所述的组合物，其中所述内源性靶基因包含与SEQ ID NO:63、64、66或67至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列，和/或其中所述内源性靶基因编码与SEQ ID NO:70、71、73或74至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的蛋白质。
52.如权利要求51所述的组合物，所述组合物还包含RNA指导的核酸内切酶。
53.如权利要求52所述的组合物，其中在所述指导RNA分子存在下，所述RNA指导的核酸内切酶在所述玉米植物的基因组中的靶DNA序列处或附近引起双链断裂或切口。
54.如权利要求53所述的组合物，所述组合物还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与同源臂靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述同源臂靶DNA序列是玉米植物的所述内源性靶基因的所述基因组基因座处或附近的基因组序列，其中所述内源性靶基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述至少一个同源序列或同源臂与SEQ ID NO:141、142、144或145的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补。
56.一种包含指导RNA分子的组合物，其中所述指导RNA分子包含与在大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补的指导序列，其中所述内源性基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。
57.如权利要求56所述的组合物，其中所述指导RNA分子包含与SEQ ID NO:143、146或147的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
58.如权利要求56所述的组合物，其中所述内源性靶基因包含与SEQ ID NO:65、68或69至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列，和/或其中所述内源性靶基因编码与SEQ ID NO:72、75或76至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的蛋白质。
59.如权利要求58所述的组合物，所述组合物还包含RNA指导的核酸内切酶。
60.如权利要求59所述的组合物，其中在所述指导RNA分子存在下，所述RNA指导的核酸内切酶在所述玉米植物的基因组中的靶DNA序列处或附近引起双链断裂或切口。
61.如权利要求60所述的组合物，所述组合物还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与同源臂靶DNA序列的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补，其中所述同源臂靶DNA序列是玉米植物的所述内源性靶基因的基因组基因座处或附近的基因组序列，其中所述内源性基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。
62.如权利要求61所述的组合物，其中所述至少一个同源序列或同源臂与SEQ ID NO:143、146或147的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补。
63.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码非编码指导RNA分子的可转录DNA序列，其中所述指导RNA分子包含与在以下的基因组基因座处或附近的靶DNA序列的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列：(i)玉米植物的内源性靶基因，其中所述内源性靶基因是钙调磷酸酶B样(CBL)相互作用蛋白激酶8(Zm.CIPK8)基因、山梨醇脱氢酶(Zm.SDH)基因、细胞分裂素脱氢酶/氧化酶4b(CKX4b)基因或细胞分裂素脱氢酶/氧化酶10(CKX10)基因；或(ii)大豆植物的内源性靶基因，其中所述内源性靶基因是同源盒转录因子1(Gm.HB1)基因、分枝1(Gm.BRC1)基因或多产c(Gm.FULc)基因。
64.如权利要求63所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子包含与SEQ ID NO:141、142、143、144、145、146或147的至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24或至少25个连续核苷酸或与其互补的序列至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％互补的指导序列。
65.如权利要求63所述的重组DNA构建体，其中所述可转录DNA序列可操作地连接至植物可表达启动子。
66.如权利要求63所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子是CRISPR RNA(crRNA)或单链指导RNA(sgRNA)。
67.如权利要求63所述的重组DNA构建体，其中所述指导RNA分子包含与所述玉米植物的基因组中存在的前间隔序列邻近基序(PAM)序列互补的序列，所述前间隔序列邻近基序序列与所述内源性靶基因的基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列紧邻。
68.如权利要求63所述的重组DNA构建体，其中所述内源性靶基因包含与SEQ ID NO:63、64、65、66、67、68或69至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的序列，和/或其中所述内源性靶基因编码与SEQ ID NO:70、71、72、73、74、75、76或77至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％相同的蛋白质。
69.一种DNA分子或载体，所述DNA分子或载体包含如权利要求63所述的重组DNA构建体。
70.一种细菌或宿主细胞，所述细菌或宿主细胞包含如权利要求63所述的重组DNA构建体。
71.一种玉米或大豆植物、植物部分或植物细胞，所述玉米或大豆植物、植物部分或植物细胞包含如权利要求63所述的重组DNA构建体。
72.一种组合物，所述组合物包含如权利要求63所述的重组DNA构建体，其中所述组合物还包含RNA指导的核酸内切酶。
73.一种组合物，所述组合物包含如权利要求63所述的重组DNA构建体，其中所述组合物还包含第二重组DNA构建体，所述第二重组DNA构建体包含编码RNA指导的核酸内切酶的第二可转录DNA序列。
74.如权利要求73所述的组合物，所述组合物包含DNA分子或载体，所述DNA分子或载体包含所述重组DNA构建体和所述第二重组DNA构建体。
75.一种组合物，所述组合物包含第一DNA分子或载体和第二DNA分子或载体，其中所述第一DNA分子或载体包含编码指导RNA分子的重组DNA构建体，所述指导RNA分子与玉米或大豆植物的内源性靶基因处或附近的DNA靶位点互补，并且所述第二DNA分子或载体包含编码RNA指导的核酸内切酶的第二重组DNA构建体。
76.如权利要求75所述的组合物，所述组合物还包含重组DNA供体模板，所述重组DNA供体模板包含至少一个同源序列或同源臂，其中所述至少一个同源序列或同源臂与在玉米或大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶DNA序列互补。
77.如权利要求76所述的重组DNA供体模板，其中所述至少一个同源序列包含相对于在所述内源性靶基因的基因组基因座处或附近的所述靶DNA序列的互补链的至少一种突变。
78.一种工程化的位点特异性核酸酶，所述工程化的位点特异性核酸酶结合至玉米或大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并且在所述靶位点处引起双链断裂或切口。
79.如权利要求78所述的工程化的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶或归巢核酸内切酶。
80.如权利要求78所述的工程化的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和裂解结构域的锌指核酸酶(ZFN)。
81.如权利要求78所述的工程化的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶是包含DNA结合结构域和裂解结构域的转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)。
82.如权利要求78所述的工程化的位点特异性核酸酶，其中所述位点特异性核酸酶所结合的所述靶位点与SEQ ID NO:141、142、143、144、145、146或147的至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少150、至少200、至少250、至少500、至少1000、至少2500或至少5000个连续核苷酸或与其互补的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％或100％相同或互补。
83.一种重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含编码位点特异性核酸酶的转基因，其中所述位点特异性核酸酶结合至玉米或大豆植物的内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并且在所述靶位点处引起双链断裂或切口，其中所述转基因可操作地连接至植物可表达启动子。
84.一种玉米或大豆植物、植物部分或植物细胞，所述玉米或大豆植物、植物部分或植物细胞包含如权利要求83所述的重组DNA构建体。
85.一种用于产生在内源性靶基因处或附近具有基因组编辑的玉米或大豆植物的方法，所述方法包括：
(a)将位点特异性核酸酶或包含编码位点特异性核酸酶的转基因的重组DNA分子引入所述玉米或大豆植物的外植体的至少一个细胞中，其中所述位点特异性核酸酶结合至所述内源性靶基因的基因组基因座处或附近的靶位点并且在所述靶位点处引起双链断裂或切口，以及
(b)从所述至少一个外植体细胞再生或发育成经编辑的玉米或大豆植物，所述至少一个外植体细胞包含在所述经编辑的玉米或大豆植物的所述内源性靶基因处或附近的基因组编辑。
86.如权利要求85所述的方法，所述方法还包括：
(c)基于植物表型或性状或分子测定来选择所述经编辑的玉米或大豆植物。
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