CN101442902A - 具有增强的农艺性状的转基因植物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了具有重组DNA用于表达蛋白质的转基因植物细胞，所述蛋白质对于赋予转基因农作物植物增强的农艺性状有用。本发明还提供包括转基因植物细胞的转基因植物和后代种子，其中植物根据具有增强的性状进行选择，所述性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。还公开了用于制备具有增强的性状的转基因种子和植物的方法。

Description

具有增强的农艺性状的转基因植物
与相关申请的交叉参考
本申请根据35USC§119(e)要求于2004年12月21日提交的美国临时申请序列号60/638,099和于2005年3月10日提交的美国临时申请序列号60/660,320的利益，所述2个临时申请引入本文作为参考。
序列表的引入
引入本文作为参考的序列表的2份拷贝(拷贝1和拷贝2)和序列表的计算机可读形式(CRF)全都在CD-ROMs上，它们各自包含名称为38-21(53720)B的文件，所述文件是33,897千字节(在MS-WINDOWS中测量)并于2005年12月13日创建。
计算机程序列表的引入
计算机程序列表文件夹hmmer-2.3.2和67pfamDir包含在光盘中，并整体引入本文作为参考。文件夹hmmer-2.3.2包含用于执行Pfam分析的HMMer软件的源代码和其他相关文件。文件夹67pfamDir包含67Pfam隐马尔可夫模型。2个文件夹于2005年12月13日在磁盘上创建，总大小为7.7兆字节(在MS-WINDOWS中测量)。
发明领域
本文公开的是植物遗传学与发育生物学领域的发明。更具体而言，本发明提供了具有用于在转基因植物中提供增强的性状的重组DNA的植物细胞，包括此类细胞的植物，来源于此类植物的种子和花粉，制备及使用此类细胞、植物、种子和花粉的方法。
发明背景
具有改良的农艺性状例如产量、环境应激耐受性、害虫抗性、除草剂耐受性、改良的种子组成等的转基因植物是农民和消费者都需要的。尽管植物育种中的大量努力已提供了所需性状的显著收益，但将特定DNA导入植物基因组的能力为产生具有改良和/或独特性状的植物提供了进一步的机会。只将重组DNA导入植物基因组不总是产生具有增强的农艺性状的转基因植物。需要从群体中选择个别转基因事件的方法以鉴别其特征为增强的农艺特性的那些转基因事件。
发明概述
本发明采用重组DNA用于表达对赋予转基因植物增强的农艺特性有用的蛋白质。本发明中的重组DNA在包括启动子的构建体中提供，所述启动子在植物细胞中起作用并且与DNA可操作地连接，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与如表28鉴别的Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值。在本发明更具体的实施方案中，在植物细胞中表达的蛋白质具有的氨基酸序列与共有氨基酸序列群中的共有氨基酸序列具有至少90％的同一性，所述共有氨基酸序列群由关于SEQ ID NO：84构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物，以及关于SEQ ID NO：166构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物组成。在本发明再更具体的实施方案中，植物细胞中表达的蛋白质是选自表1中鉴别的蛋白质群的蛋白质。
本发明的其他方面具体涉及包括本发明的重组DNA的转基因植物细胞、包括多个此类植物细胞的转基因植物、来自此类植物的后代转基因种子和转基因花粉。通过在群体中筛选转基因植物与不具有所述重组DNA的对照植物相比增强的性状，从转基因植物群体中选择此类植物细胞，所述转基因植物群体从用重组DNA转化的植物细胞再生并表达蛋白，其中所述增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。
在本发明的再一方面，植物细胞、植物、种子和花粉进一步包括表达蛋白质的DNA，所述蛋白质提供来自暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型所述植物细胞致死的水平应用。此类耐受性不仅在此类植物中作为有利性状特别有用，还在本发明方法的选择步骤中有用。在本发明的方面中此类除草剂的试剂是草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。
本发明的再其他方面提供对于重组DNA纯合的转基因植物，和来自玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麦或稻植物的本发明的转基因种子。在阿根廷用于实践本发明的各种方面的其他重要实施方案中，重组DNA在来源于玉米系的植物细胞中提供，所述玉米系是并维持对Mal de Rio Cuarto病毒或高粱柄锈菌(Puccina sorghi)真菌或两者的抵抗力。
本发明还提供了用于制备非天然的、转基因种子的方法，所述转基因种子可以用于生产一批具有增强的性状的转基因植物，所述增强的性状由稳定整合的重组DNA表达产生，所述重组DNA表达在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与表28鉴别的Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸比对超过Pfam聚集截止值。更具体而言，该方法包括(a)在植物群体中筛选增强的性状和重组DNA，其中在群体中的个体植物可以显示的性状水平低于、基本上等于或高于所述性状在不表达所述重组DNA的对照植物中显示的水平，(b)从群体中选出一种或多种植物，它们显示的性状水平大于所述性状在对照植物中显示的水平，(c)证实重组DNA稳定整合在所述选择的植物中，(d)分析所选植物的组织以确定生产的蛋白质具有由SEQ ID NO：1-83之一的序列中核苷酸编码的蛋白质的功能；和(e)收集来自所选植物的种子。在本发明的一个方面，群体中的植物进一步包括表达蛋白质的DNA，所述蛋白质提供针对暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型植物细胞致死的水平应用，并且选择通过用除草剂例如草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物处理群体来实现。在本发明的另一方面，通过鉴别具有增强的性状的植物来选择植物。该方法对于制备玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麦或稻种子特别有用。
本发明的另一方面提供了生产杂交玉米种子的方法，其包括从除草剂耐受性玉米植物中获得杂交玉米种子，所述玉米植物还具有稳定整合的重组DNA，所述重组DNA包括(a)在植物细胞中起作用并且(b)与DNA可操作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与表28鉴别的Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸比对超过Pfam聚集截止值。该方法进一步包括由所述杂交玉米种子生产玉米植物，其中由所述杂交玉米种子产生的植物的一部分对于所述重组DNA是纯合的，由所述杂交玉米种子产生的植物的一部分对于所述重组DNA是半合子的，并且由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分没有一种所述重组DNA；通过用除草剂处理选择对于所述重组DNA是纯合和半合子的玉米植物；收集来自除草剂处理存活的玉米植物的种子并种植所述种子以产生进一步的后代玉米植物；将选择和收集步骤重复至少一次以产生近交玉米系；并使近交玉米系与第二种玉米系杂交以生产杂交种子。
本发明的另一方面提供了选择包括本发明植物细胞的植物的方法，其通过使用免疫反应性抗体检测重组DNA表达的蛋白质在种子或植物组织中的存在来实现。本发明的再一方面提供防伪的研磨种子，其具有作为来源指示的本发明的植物细胞。
本发明的再其他方面涉及具有增强的水利用效率或增强的氮利用效率的转基因植物。例如，本发明提供无需灌溉水培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有本发明的植物细胞的种子，所述种子根据增强的水利用效率进行选择。可替代的方法包括在玉米农作物生产过程中应用减少的灌溉水，例如提供最高达300毫米的地下水。本发明还提供了无需添加氮肥料培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有本发明的植物细胞的种子，所述种子根据增强的氮利用效率进行选择。
发明详述
如本文所使用的，“植物细胞”指用稳定整合、非天然的重组DNA转化的植物细胞，例如通过土壤杆菌属(Agrobacterium)介导的转化或通过使用重组DNA包被的微粒轰击或其他方法。本发明的植物细胞可以是作为微生物或作为后代植物细胞存在的最初转化的植物细胞，或来源于后代转基因植物的种子或花粉，所述后代植物细胞再生为分化的组织，例如再生为具有稳定整合、非天然重组DNA的转基因植物。
如本文所使用的，“转基因植物”指其基因组已通过重组DNA的稳定整合而改变的植物。转基因植物包括由最初转化的植物细胞再生的植物，和来自转化植物的较后世代或杂交的后代转基因植物。
如本文所使用的，“重组DNA”指已基因工程改造并在细胞外构建的DNA，包括包含天然存在的DNA或cDNA的DNA或合成DNA。
如本文所使用的，“共有序列”指在同源蛋白质氨基酸序列比对的保守区域中的人工氨基酸序列，例如，如由同源蛋白质的氨基酸序列的CLUSTALW比对确定的。
如本文所使用的，“同源物”指执行相同生物学功能的蛋白质群中的蛋白质，例如属于相同Pfam蛋白质家族并在本发明的转基因植物中提供共同的增强的性状的蛋白质。同源物由同源基因表达。同源基因包括天然存在的等位基因和人工生成的变体。遗传密码的简并提供下列可能性：不导致基因产生的多肽氨基酸序列的改变而用不同碱基置换该基因的蛋白质编码序列的至少一个碱基。因此，在本发明中有用的多核苷酸可以具有从SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：83已根据遗传密码简并置换进行改变的任何碱基序列。同源物是在最佳比对时在全长蛋白质上具有至少60％同一性的蛋白质，更优选约70％或更高，更优选至少80％并且甚至更优选至少90％的同一性，所述全长蛋白质被鉴定为与在植物细胞中表达时赋予增强的性状相关联。同源物包括氨基酸序列与本文公开的蛋白质和同源物的共有氨基酸序列具有至少90％同一性的蛋白质。
通过氨基酸序列比较鉴别同源物，例如人工或通过使用基于计算机的工具，所述工具使用基于同源性的已知搜索算法，例如通常已知并称为BLAST、FASTA和Smith-Waterman的那些。局部序列比对程序例如BLAST，可以用于搜索序列数据库以找到相似序列，并且汇总的期望值(E值)用于测量序列碱基相似性。因为具有特定生物的最佳E值的蛋白质命中不必是直向同源物或唯一的直向同源物，所以在本发明中使用交互查询以过滤对于直向同源物鉴别具有显著E值的命中序列。交互查询需要搜索针对来自基础生物的氨基酸序列数据库的显著命中，它类似于查询蛋白质的序列。当交互查询的最佳命中是查询蛋白质自身或由物种形成后的重复基因编码的蛋白质时，命中的可能是直向同源物。本发明的进一步的方面包括功能性同源物蛋白质，作为保守氨基酸置换的结果它们在一个或多个氨基酸方面不同于公开的蛋白质的那些，例如在下列氨基酸中的置换：酸性(带负电荷的)氨基酸例如天冬氨酸和谷氨酸；碱性(带正电荷的)氨基酸例如精氨酸、组氨酸和赖氨酸；中性极性氨基酸例如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；中性非极性(疏水)氨基酸例如丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；具有脂族侧链的氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的氨基酸例如丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的氨基酸例如天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的氨基酸例如赖氨酸、精氨酸和组氨酸；具有含硫侧链的氨基酸例如半胱氨酸和甲硫氨酸；天然保守的氨基酸例如缬氨酸-亮氨酸、缬氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、天冬氨酸-谷氨酸、和天冬酰胺-谷氨酰胺。在本发明转基因植物中有用的DNA编码的同源物的进一步方面是作为在天然序列中一个或多个氨基酸缺失或插入的结果与公开的蛋白质不同的那些蛋白质。
如本文所使用的，“百分比同一性”指2个最佳比对的DNA或蛋白质区段在组分例如核苷酸序列或氨基酸序列比对窗口自始自终不变的程度。关于测试序列和参考序列的比对区段的“同一性分数”是通过比对窗口由2个比对区段序列共有的相同组分的数目除以参考区段中序列组分的总数目，所述总数目是完整的测试序列或完整的参考序列中的较小者。“百分比同一性”(“同一性％”)是同一性分数乘100。
如本文所使用的，“Pfam”指覆盖许多共同蛋白质家族的多重序列比对和隐马尔可夫模型的大集合，例如Pfam版本18.0(2005年8月)包含用于7973个蛋白质家族的比对和模型并且基于Swissprot 47.0和SP-TrEMBL 30.0蛋白质序列数据库。参见S.R.Eddy，“Profile HiddenMarkov Models”，Bioinformatics 14：755-763，1998。Pfam目前由PfamConsortium维持和更新。比对代表对蛋白质功能有牵连的某些进化保守结构。由Pfam比对建立的分布型(Profile)隐马尔可夫模型(分布型HMMs)对于自动识别属于现有蛋白质家族的新蛋白质有用，即使通过比对的同源性看起来低。一旦一种DNA鉴别为编码在转基因植物中表达时赋予增强的性状的蛋白质，就通过针对隐马尔可夫模型查询候选DNA编码的蛋白质氨基酸序列鉴别在相同蛋白质家族中的其他DNA编码蛋白质，所述模型使用HMMER软件表征Pfam结构域，其通用版本在附加的计算机列表中提供。满足特定Pfam比对的聚集截止值的候选蛋白质在蛋白质家族中，并且具有在构建用于本发明的植物细胞的重组DNA中有用的同源DNA。附加的计算机列表中还包括了伴随HMMER软件使用的隐马尔可夫模型数据库，用于鉴别在关于本发明的植物细胞中的重组DNA的共同Pfam中表达蛋白质的DNA。HMMER软件和Pfam数据库是版本18.0并用于鉴别对应于SEQID NO：84-SEQ ID NO：166氨基酸序列的蛋白质中的已知结构域。编码通过本文公开的Pfam分析得分高于表27中公开的聚集截止值的蛋白质的所有DNA都可以在本发明植物细胞的重组DNA中使用，例如用于选择具有增强的农艺性状的转基因植物。如下文更具体地公开的，在本发明中使用的相关Pfams是AAA、AP2、Aldo ket red、α淀粉酶、Aminotran 12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BRO1、CBFD NFYBHMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60 TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Di19、E2F TDP、FAD结合7、FA去饱和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase 2、Glyco hydrol、乙二醛酶、Gotl、HATPase c、HSF DNA-结合、HSP20、HisK A、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酶B、Metallophos、MtN3slv、NAF、NAM、NIF、Oxidored FMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶S10、肽酶S41、光敏色素、Peinase、Pkinase Tyr、吡哆醛deC、RIO1、RRM 1、RTC、RTC插入片段、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4，其数据库包括在附加的计算机列表中。
如本文所使用的“启动子”指用于起始转录的调节DNA。“植物启动子”是无论其起源是否是植物细胞都能够在植物细胞中起始转录的启动子，例如众所周知的是土壤杆菌属启动子在植物细胞中起作用。因此，植物启动子包括从植物、植物病毒和细菌例如土壤杆菌属和慢生根瘤菌属(Bradyrhizobium)细菌获得的启动子DNA。在发育控制下的启动子的实例包括优先起始在特定组织例如叶、根或种子中的转录的启动子。此类启动子称为“组织优选的”。只起始在特定组织中的转录的启动子称为“组织特异性的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官的特定细胞类型，例如根或叶中的血管细胞中的表达。“诱导型”或“阻抑型”启动子是在环境控制下的启动子。可以影响通过诱导型启动子的转录的环境条件的实例包括缺氧条件、或特定化学药品、或光的存在。组织特异性的、组织优选的、细胞类型特异性、和诱导型启动子构成“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数条件下有活性的启动子。
如本文所使用的，“可操作地连接”指在DNA构建体中结合2个或更多个DNA片段，从而使得一种例如编码蛋白质的DNA的功能受另一种例如启动子的控制。
如本文所使用的，“表达”指产生，例如当其同源DNA转录为mRNA，mRNA翻译成蛋白质时，蛋白质在植物细胞中表达。
如本文所使用的，“对照植物”指不包含重组DNA的植物，所述重组DNA表达赋予增强的性状的蛋白质。对照植物用于鉴别并选择具有增强的性状的转基因植物。适当的对照植物可以是用于产生转基因植物的亲本系的非转基因植物，即缺乏重组DNA。适当的对照植物在某些情况下是半合子转基因植物系的后代，它不包含重组DNA，称为阴性分离子。
如本文所使用的，“增强的性状”指转基因植物的特征，它包括但不限于，特征为增强的植物形态学、生理学、生长和发育、产量、营养增强、疾病或害虫抗性、或环境或化学药品耐受性的增强的农艺性状。在本发明的更具体的方面，增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。在本发明的重要方面，增强的性状是增强的产量，包括在非应激条件下增加的产量和在环境应激条件下增加的产量。应激条件可以包括例如干旱、阴凉、真菌病、病毒病、细菌病、昆虫侵扰、线虫侵扰、冷温度暴露、热暴露、渗透性应激、减少的氮营养物利用率、减少的磷营养物利用率和高植物密度。“产量”可以受许多性质影响，包括但不限于，植物高度、荚果数目、在植物上的结荚位置、节间数目、裂果(pod shatter)发生率、粒度、结瘤和固氮作用的效率、营养物同化作用的效率、针对生物和非生物应激的抗性、碳同化作用、植物结构、抗倒伏性、种子发芽百分数、幼苗活力、和幼年性状。产量还可受发芽效率(包括在应激条件下的发芽)、生长速率(包括在应激条件下的生长速率)、谷穗数目、每个谷穗的种子数目、种子大小、种子组成(淀粉、油、蛋白质)和种子充填的特征的影响。
本发明转基因植物增加的产量可以以多种方法测量，包括测试重量、每株植物的种子数目、种子重量、每单位面积的种子数目(即，每英亩的种子、或种子重量)、每英亩的蒲式耳、每英亩的公吨、每英亩的吨、每公顷的公斤。例如，玉蜀黍产量可以根据每单位生产面积生产的玉米粒测量，例如每英亩的蒲式耳或每公顷的公吨，通常在调整湿度的基础上报告，例如在15.5百分数湿度上。增加的产量还可由关键生物化学化合物的改善利用产生，所述化合物例如氮、亚磷和碳水化合物，或者由环境应激的改善应答产生，所述环境应激例如冷、热、干旱、盐、和害虫或病原体攻击。在本发明中使用的重组DNA还可用于提供具有改善的生长和发育以及最终增加的产量的植物，作为植物生长调节剂的修饰的表达、或细胞周期或光合作用途径的修饰的结果。有意义的还有产生转基因植物，它就种子组分而言证实了增强的产量，所述种子组分可以对应或可以不对应总体植物产量的增加。此类性质包括种子油、种子分子例如生育酚、蛋白质和淀粉、或油特别是油组分的增强，如可以通过种子组分比率的改变证明的。
本发明的核分子的子集包括公开的重组DNA的片段，其由至少15个、优选至少16或17、更优选至少18或19、并甚至更优选至少20个或更多个邻接核苷酸的寡核苷酸组成。此类寡核苷酸是具有选自SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：83的序列的较大分子的片段，并且可用作例如用于检测本发明多核苷酸的探针和引物。
在本发明的某些实施方案中，产生天然基因的显性失活突变体以达到所需作用。如本文所使用的，“显性失活突变体”指其基因产物不利地影响相同细胞中正常、野生型基因产物的突变基因，通常通过与其二聚化(组合)。在聚合分子例如胶原的情况下，显性失活突变体通常比导致不产生基因产物的突变(无效突变或无效等位基因)更有害。SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7被构建为分别编码缺失了K-框的agl11蛋白质和缺失了MAD框的MADs3蛋白质。类似于AGL11的MADS框蛋白质可以视为具有3个功能结构域。存在N末端DNA结合结构域(MADS框)、更远端的二聚化结构域(K-框)和C末端结构域，它通常涉及与其他蛋白质的相互作用。在植物中，MADS框和K-框之间的区域已显示在某些蛋白质中对于DNA结合是重要的并且通常称为I-框(Fan等人，1997)。考虑了几种不同类别的显性失活构建体。DNA结合结构域的缺失或灭活可以产生蛋白质，它能够与其天然全长配对物以及其他天然二聚化配对物二聚化。同样地，C末端结构域的去除可以允许与天然蛋白质及其天然二聚化配对物二聚化。在2种情况下，这些类型的构建体使得靶蛋白以及能够与K-框相互作用的任何其他蛋白质失去能力。
在本发明的其他实施方案中，构建组成型活性突变以达到所需作用。SEQ ID NO：3只编码来自依钙蛋白激酶(CDPK)的激酶结构域。CDPK1具有的结构域结构类似于其他依钙蛋白激酶，其中蛋白激酶结构域通过42个氨基酸的“间隔区”区域与4个EF手型结构域分开。认为依钙蛋白激酶由钙诱导的构象变化激活，所述构象变化导致自身抑制性结构域从蛋白激酶活性位点移开(Yokokura等人，1995)。因此组成型活性蛋白质可以通过只超表达蛋白质激酶结构域来制备。
DNA构建体使用本领域普通技术人员众所周知的方法进行装配，并且一般包括与DNA可操作地连接的启动子，其表达提供增强的农艺性状。其他构建体组分可以包括另外的调节元件，例如用于增强转录的5’前导序列(leasder)和内含子、3’非翻译区(例如多腺苷酸化信号和位点)、用于转运的DNA或信号肽。
在植物细胞中有活性的众多启动子已在文献中得到描述。这些包括在植物基因组中存在的启动子以及来自其他来源的启动子，包括在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)肿瘤诱导性质粒上携带的胭脂碱合酶(NOS)启动子和章鱼碱合酶(OCS)启动子、花椰菜花叶病毒启动子例如花椰菜花叶病毒。例如，参见美国专利号5,858,742和5,322,938，它公开了来源于花椰菜花叶病毒的组成型启动子的版本(CaMV35S)，美国专利5,641,876，它公开了稻肌动蛋白启动子，美国专利申请公开2002/0192813A1，它公开了在有效的植物表达载体设计中有用的5’、3’和内含子元件，美国专利申请序列号09/757,089，它公开了玉蜀黍叶绿体醛缩酶启动子，美国专利申请序列号08/706,946，它公开了稻谷蛋白启动子；美国专利申请序列号09/757,089，它公开了玉蜀黍醛缩酶(FDA)启动子，以及美国专利申请序列号60/310,370，它公开了玉蜀黍nicotianamine合酶启动子，所述专利全部引入本文作为参考。在植物细胞中起作用的这些以及众多其他启动子是本领域技术人员已知的并且可在本发明的重组多核苷酸中用于提供在转基因植物细胞中表达所需基因。
在本发明的某些方面，在植物种子组织中的充分表达是完成种子组成中的改良所需的。用于种子组成修饰的示例性启动子包括来自种子基因例如油菜籽蛋白(美国专利5,420,034)、玉米醇溶蛋白Z27和谷蛋白1(Russell等人(1997)Transgenic Res.6(2)：157-166)，和过氧化物氧还蛋白抗氧化剂(Perl)(Stacy等人(1996)Plant MolBiol.31(6)：1205-1216)、玉蜀黍L3油质蛋白(U.S.6,433,252)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129：863-872)的启动子。
在本发明的其他方面，在植物绿色组织中的优先表达是所需的。用于此类用途的目的启动子包括来自基因的那些，例如鼠耳芥fArabidopsis thaliana)核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)小亚基(Fischhoff等人(1992)Plant Mol Biol.20：81-93)、醛缩酶和丙酮酸正磷酸二激酶(PPDK)(Taniguchi等人(2000)Plant Cell Physiol.41(1)：42-48)。
此外，启动子可以被改变以包含多重“增强子序列”以帮助提高基因表达。此类增强子是本领域已知的。通过在此类构建体中包含增强子序列，可以增强所选蛋白质的表达。这些增强子通常在真核细胞中起作用的启动子的转录起始的5’发现，但通常可以插入编码序列的上游(5’)或下游(3’)。在某些情况下，这些5’增强元件是内含子。作为增强子特别有用的是稻肌动蛋白1(参见美国专利5,641,876)和稻肌动蛋白2基因的5’内含子、玉蜀黍乙醇脱氢酶基因内含子、玉蜀黍热休克蛋白70基因内含子(美国专利5,593,874)和玉蜀黍shrunken1基因。
在本发明的其他方面，需要在植物种子组织中的充分表达以完成种子组成的改良。用于种子组成修饰的示例性启动子包括来自种子基因的启动子，例如油菜籽蛋白(U.S.5,420,034)、玉蜀黍L3油质蛋白(U.S.6,433,252)、玉米醇溶蛋白Z27(Russell等人(1997)TransgenicRes.6(2)：157-166)、球蛋白1(Belanger等人(1991)Genetics129：863-872)、谷蛋白1(Russell(1997)同上)、和过氧化物氧还蛋白抗氧化剂(Perl)(Stacy等人(1996)Plant Mol Biol.31(6)：1205-1216)。
根据本发明制备的重组DNA构建体通常还将包括3’元件，它一般包含多腺苷酸化信号和位点。众所周知的3’元件包括来自根癌土壤杆菌基因的那些，例如引入本文作为参考的U.S.6,090,627中公开的nos 3’、tml 3’、tmr 3’、tms 3’、ocs 3’、tr73’；来自植物基因例如小麦(普通小麦(Triticum aesevitum))热休克蛋白17(Hsp173’)、小麦遍在蛋白基因、小麦果糖-1，6-二磷酸酶基因、稻谷蛋白基因稻乳酸脱氢酶基因和稻β微管蛋白基因的3’元件，所有这些都在引入本文作为参考的美国公开专利申请2002/0192813 A1中公开；和豌豆(Pisumsativum)核酮糖二磷酸羧化酶基因(rbs 3’)，和来自宿主植物中的基因的3’元件。
构建体和载体还可包括用于将基因靶靶向植物细胞器，特别是叶绿体、白色体或其他质体细胞器的转运肽。关于叶绿体转运肽使用的描述参见引入本文作为参考的美国专利5,188,642和美国专利号5,728,925。关于在本发明中有用的鼠耳芥EPSPS基因的转运肽区域的描述，参见Klee，H.J.等人(MGG(1987)210：437-442)。
包括或来源于用重组DNA转化的本发明植物细胞的转基因植物可以进一步用堆积性状增强，例如农作物植物具有的由本文公开的DNA表达产生的增强的性状，与除草剂和/或害虫抗性性状组合。例如，本发明的基因可以与其他农艺目的性状堆积，例如提供除草剂抗性或昆虫抗性的性状，例如使用来自苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringensis)的基因以提供针对鳞翅昆虫、鞘翅昆虫(coliopteran)、同翅昆虫、半翅昆虫(hemiopteran)和其他昆虫的抗性。其转基因植物耐受性已证实以及可以应用本发明方法的除草剂包括，但不限于，草甘膦、麦草畏、草铵膦、磺酰脲类、溴苯腈和达草灭除草剂。编码涉及除草剂耐受性的蛋白质的多核苷酸分子是本领域众所周知的，并且包括，但不限于，美国专利5,094,945；5,627,061；5,633,435和6,040,497中公开的、赋予草甘膦耐受性的编码5-烯醇式丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的多核苷酸分子；美国专利5,463,175中公开的编码草甘膦氧化还原酶(GOX)的多核苷酸分子，和美国专利申请公开2003/0083480A1中公开的、同样赋予草甘膦耐受性的草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)；美国专利申请公开2003/0135879A1中公开的、赋予麦草畏耐受性的麦草畏单加氧酶；美国专利4,810,648中公开的、赋予溴苯腈耐受性的编码溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子；Misawa等人，(1993)Plant J.4：833-840和Misawa等人，(1994)Plant J.6：481-489中描述的、关于达草灭耐受性的编码八氢番茄红素去饱和酶(crtl)的多核苷酸分子；Sathasiivan等人(1990)Nucl.AcidsRes.18：2188-2193中描述的、赋予对磺酰脲类除草剂耐受性的编码乙酰羟酸合酶(AHAS，aka ALS)的多核苷酸分子；DeBlock，等人(1987)EMBO J.6：2513-2519中公开的、赋予草铵膦和双丙氨酰膦耐受性的称为bar基因的多核苷酸分子；美国专利申请公开2003/010609 A1中公开的、赋予N氨基甲基膦酸耐受性的多核苷酸分子；美国专利6,107,549中公开的、赋予吡啶除草剂抗性的多核苷酸分子；赋予多重除草剂例如草甘膦、莠去津、ALS抑制剂、isoxoflutole和草铵膦除草剂耐受性的分子和方法公开于美国专利6,376,754和美国专利申请公开2002/0112260中，所有所述美国专利和专利申请公开都引入本文作为参考。赋予昆虫/线虫/病毒抗性的分子和方法公开于美国专利5,250,515；5,880,275；6,506,599；5,986,175和美国专利申请公开2003/0150017 A1中，所有所述专利引入本文作为参考。
在具体实施方案中，本发明人预期了与本文公开的蛋白质结合的单克隆或多克隆抗体的用途。制备和表征抗体的方法是本领域众所周知的(参见，例如Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，1988；引入本文作为参考)。产生单克隆抗体(mAbs)的方法一般根据与制备多克隆抗体的那些相同的路线开始。简言之，多克隆抗体通过用依照本发明的免疫原性组合物免疫动物并收集来自免疫动物的抗血清来制备。广泛范围的动物物种可以用于生产抗血清。一般地，用于生产抗血清的动物是兔、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠或山羊。因为兔的血量相对较大，所以兔是生产多克隆抗体的优选选择。
如本领域众所周知的，给定组合物在其免疫原性方面可以不同。因此通常必须加强宿主的免疫系统，如可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来完成。示例性和优选的载体是匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清清蛋白(BSA)。其他清蛋白例如卵清蛋白、小鼠血清清蛋白或兔血清清蛋白也可用作载体。使多肽与载体蛋白缀合的方法是本领域众所周知的并且包括使用戊二醛、间-马来酰亚胺苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳二亚胺和bis-biazotized联苯胺。
如本领域众所周知的，特定免疫原组合物的免疫原性可以通过使用称为佐剂的非特异性免疫应答刺激物增强。示例性和优选的佐剂包括完全弗氏佐剂(包含杀死的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的非特异性免疫应答刺激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
用于生产多克隆抗体的免疫原组合物的量依免疫原的性质以及用于免疫接种的动物而变。多种途径可以用于施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内)。多克隆抗体的生产可以通过免疫动物在免疫接种后各个点上的抽样血液来监控。还可以给予第二次加强注射。重复加强和滴定过程直至达到合适滴度。当获得所需免疫原性水平时，可以对免疫的动物抽血并分离且贮存血清，和/或动物可以用于生产mAbs。
通过使用众所周知的技术可以容易地制备mAbs，例如引入本文作为参考的美国专利号4,196,265中例示的那些。一般地，这项技术涉及用所选免疫原组合物，例如纯化或部分纯化的抗真菌蛋白、多肽或肽免疫合适的动物。免疫组合物以有效刺激抗体生产性细胞的方式施用。啮齿类动物例如小鼠和大鼠是优选的动物，然而，兔、羊或青蛙细胞的使用也是可能的。大鼠的使用可以提供一定的优点(Goding，1986，第60-61页)，但小鼠是优选的，BALB/c小鼠是最优选的，因为这是最常规使用的并且一般给出更高百分比的稳定融合物。
免疫接种后，选择具有生产抗体潜力的体细胞，特别是B淋巴细胞(B细胞)在mAb生产方案中使用。这些细胞从活组织检查的脾、扁桃体或淋巴结，或从外周血样品中获得。优选脾细胞和外周血细胞，前者是因为它们是成浆细胞分裂阶段中的抗体生产性细胞的丰富来源，并且后者是因为外周血易于获得。通常，一组动物将是已免疫的并且将取出具有最高抗体滴度的动物脾，并通过用注射器使脾匀浆来获得脾淋巴细胞。一般地，来自免疫的小鼠的脾包含大约5×107-2×108的淋巴细胞。
来自免疫的动物的抗体生产性B淋巴细胞随后与无限增殖骨髓瘤细胞的细胞融合，所述无限增殖骨髓瘤细胞一般是与被免疫的动物相同物种的。适合用于杂交瘤生产性融合操作的骨髓瘤细胞系优选是非抗体生产性的，具有高融合效率，并且具有致使它们不能在特定选择性培养基上生长的酶缺陷，所述选择性培养基只支持所需融合细胞(杂交瘤)生长。
众多骨髓瘤细胞中的任何一种都可使用，如本领域技术人员已知的(Goding，1986，第65-66页；Campbell，1984，第75-83页)。例如，当免疫的动物是小鼠时，人们可以使用P3-X63/Ag8、X63-Ag8.653、NS1/1.Ag41、Sp210-Ag14、FO、NSO/U、MPC-11、MPC11-X45-GTG1.7和S194/5XX0Bul；对于大鼠，人们可以使用R210.RCY3、Y3-Ag1.2.3、IR983F和4B210；并且U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2和UC729-6均在人细胞融合方面有用。
一种优选的鼠类骨髓瘤细胞是NS-1骨髓瘤细胞系(也称为P3-NS-1-Ag4-1)，它通过要求细胞系保藏号GM3573从NIGMS HumanGenetic Mutant Cell Repository容易获得。可以使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟嘌呤抗性小鼠鼠类骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。
用于产生抗体生产性脾或淋巴结细胞与骨髓瘤细胞的杂交体的方法通常包括使体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比率混合，尽管在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学或电)的存在下，比率可以分别为约20:1到约1:1。使用Spend病毒的融合方法(Kohler和Milstein，1975；1976)，以及使用聚乙二醇(PEG)，例如37％(v/v)PEG的那些(Gefter等人，1977)已得到描述。使用电诱导的融合方法也是适当的(Goding，1986，第71-74页)。
融合方法通常以低频率产生能存活的杂交体，约1×10-6-1×10-8。然而，这不造成问题，因为通过在选择性培养基中培养可以将能存活的、融合的杂交体与亲本、未融合的细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，它将通常继续无限地分裂)区分开。选择性培养基一般是包含阻断组织培养基中核苷酸从头合成的试剂。示例性和优选试剂是氨基蝶呤、氨甲蝶呤和重氮丝氨酸。氨基蝶呤和氨甲蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的从头合成，而重氮丝氨酸只阻断嘌呤合成。当使用氨基蝶呤或氨甲蝶呤时，培养基补加了次黄嘌呤和胸苷作为核苷酸来源(HAT培养基)。当使用重氮丝氨酸时，培养基补加了次黄嘌呤。
优选的选择性培养基是HAT。只有能够操作核苷酸补救途径的细胞能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞在补救途径的关键酶例如次黄嘌呤转磷酸核糖基酶(HPRT)上有缺陷，并且它们不能存活。B细胞可以操作这个途径，但它们在培养中具有有限的寿命并且一般在约2周内死亡。因此可以在选择性培养基中存活的唯一细胞是由骨髓瘤和B细胞形成的那些杂交体。
这种培养提供杂交瘤群体，从中可以选择特定的杂交瘤。一般地，杂交瘤的选择如下进行：通过在微量滴定板中单个克隆稀释培养细胞，随后测试个别克隆上清液(约2-3周后)的所需反应性。测定应该是灵敏、简单且快速的，例如放射免疫测定、酶免疫测定、细胞毒性测定、噬菌斑测定、免疫酶斑测定等。
选择的杂交瘤随后可以系列稀释并克隆到个别的抗体生产性细胞系中，其克隆可以随后无限地繁殖以提供mAbs。可以采用细胞系以2种基本方式生产mAb。杂交瘤的样品可以注射(通常注射到腹膜腔内)到组织相容性动物类型中，所述动物用于提供最初融合的体细胞和骨髓瘤细胞。注射的动物发展出分泌特定单克隆抗体的肿瘤，所述抗体由融合的细胞杂交体产生。随后可以抽取动物的体液，例如血清或腹水，以提供高浓度的mAbs。个别细胞系还可在体外培养，其中mAbs天然分泌到培养基中，从中它们可以容易地以高浓度获得。如果需要，通过任一方法产生的mAbs可以使用过滤、离心和各种色谱法例如HPLC或亲和色谱进一步纯化。
植物细胞转化方法
用重组DNA转化植物细胞的众多方法是本领域已知的并且可以在本发明中使用。用于植物转化的2种常用方法是土壤杆菌属介导的转化和微粒轰击。微粒轰击方法在美国专利5,015,580(大豆)；5,550,318(玉米)；5,538,880(玉米)；5,914,451(大豆)；6,160,208(玉米)；6,399,861(玉米)和6,153,812(小麦)中说明，并且土壤杆菌属介导的转化在美国专利5,159,135(棉花)；5,824,877(大豆)；5,591,616(玉米)；和6,384,301(大豆)中描述，所有专利都引入本文作为参考。对于基于根癌土壤杆菌的植物转化系统，在转化构建体上存在的另外元件将包括T-DNA左和右边界序列以促进重组多核苷酸整合到植物基因组中。
一般而言，在靶植物系的基因组中随机即在非特异性位置导入重组DNA是有用的。在特殊情况下，靶向重组DNA插入片段可以是有用的，以实现位点特异性整合，例如代替基因组中的现有基因，使用植物基因组中现有的启动子，或在已知对于基因表达有活性的预定位点插入重组多核苷酸。现有的已知对植入物起作用的几种位点特异性重组系统包括如美国专利4,959,317中公开的cre-lox，以及如美国专利5,527,695中公开的FLP-FRT，两个所述专利都引入本文作为参考。
本发明的转化方法优选在培养基上和控制环境中的组织培养中实践。“培养基”指众多营养物混合物，它们用于体外培养细胞，即在完整活生物之外。受体细胞靶包括，但不限于，分生组织细胞，愈伤组织，未成熟胚和配子细胞例如小孢子、花粉、精子和卵细胞。预期的是由其可以再生能育植物的任何细胞用作受体细胞。愈伤组织可以从组织来源开始，包括，但不限于，未成熟胚、幼苗顶端分生组织、小孢子等。能够作为愈伤组织增殖的细胞也是用于遗传转化的受体细胞。用于制备本发明转基因植物的实际转化方法和材料，例如各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚细胞的转化和后续能育的转基因植物的再生公开于美国专利6,194,636和6,232,526中，它们引入本文作为参考。
可以从能育的转基因植物收获转基因植物的种子并且可以用于培育本发明的转化植物的后代，包括用于选择具有增强的性状的植物的杂交植物系。除了用重组DNA直接转化植物外，通过使具有重组DNA的第一种植物与缺乏DNA的第二种植物杂交可以制备转基因植物。例如，重组DNA可以导入顺应转化以生产转基因植物的第一种植物系中，所述第一种植物系可以与第二种植物系杂交以使重组DNA基因渐渗到第二种植物系中。具有提供增强的性状例如增强的产量的重组DNA的转基因植物可以与具有赋予另一种性状例如除草剂抗性或害虫抗性的其他重组DNA的转基因植物系杂交，以生产具有赋予2种性状的重组DNA的后代植物。一般地，在关于组合性状的此类育种中，供给另外性状的转基因植物是雄性系，并且携带基础性状的转基因植物是雌性系。将分离这种杂交的后代，从而使得某些植物将携带关于2种亲本性状的DNA，并且某些将携带关于一种亲本性状的DNA；此类植物可以通过与亲本重组DNA结合的标记鉴别，例如通过分析重组DNA的标记鉴别，或在其中选择标记连接至重组体的情况下，通过应用选择试剂，例如与除草剂耐受性标记一起使用的除草剂，或通过选择增强的性状。携带2种亲本性状的DNA的后代植物可以与雌性亲本系多次回交，例如通常为6-8代，以产生具有与一种最初转基因亲本系基本上相同的基因型但具有另一种转基因亲本系的重组DNA的后代植物。
在转化实践中，在任何一个转化实验中DNA一般只导入小百分比的靶植物细胞。标记基因用于提供鉴别那些细胞的有效系统，所述细胞通过在其基因组中接受和整合转基因DNA构建体稳定转化。优选的标记基因提供选择标记，所述选择标记赋予针对选择试剂，例如抗生素或除草剂的抗性。本发明植物对其可以是抗性的任何除草剂是选择标记的有用试剂。潜在转化的细胞暴露于选择剂。在存活细胞群体中的将是其中抗性赋予基因一般以足够水平整合并表达以允许细胞存活的那些细胞。可以测试细胞以进一步证实外源DNA的稳定整合。通常使用的选择标记基因包括赋予对抗生素抗性的那些，所述抗生素例如卡那霉素和巴龙霉素(nptII)、潮霉素B(aph IV)和庆大霉素(aac 3和aacCA)，或针对除草剂例如草铵膦(bar或pat)和草甘膦(aroA或EPSPS)的抗性。此类选择的实例在美国专利5,550,318；5,633,435；5,780,708和6,118,047中说明，所有专利引入本文作为参考。提供视觉鉴别转化体的能力的选择标记也可以采用，例如表达有色或荧光蛋白质例如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)的基因，或表达β葡糖醛酸糖苷酶的基因或其各种显色底物是已知的uidA基因(GUS)。
暴露于选择剂存活的植物细胞或在筛选测定法中已评分为阳性的植物细胞，可以在再生培养基中培养并允许成熟为植物。由转化的植物细胞再生的发展中的小植物可以转移至植物生长混合物，并在转移至用于成熟的温室或生长室之前使其受冷而变得耐寒，例如在约85％相对湿度、600ppm CO2和25-250微爱因斯坦(microeinsteins)m-2s-1光的环境控制的室中。取决于最初组织，在鉴别出转化体后约6周-10个月再生出植物。可以使用本领域技术人员已知的常规植物育种方法给植物授粉并且产生种子，例如自花传粉通常对转基因玉米使用。可以测试再生的转化植物或其后代种子或植物的重组DNA表达并选择增强的农艺性状的存在。
转基因植物和种子
将来源于本发明植物细胞的转基因植物培育至产生与对照植物相比具有增强的性状的转基因植物，并产生本发明的转基因种子和单倍体花粉。通过在转化的植物或后代种子中选择增强的性状来鉴别具有增强的性状的此类植物。关于效率，设计选择方法以评估包括重组DNA的多重转基因植物(事件)，例如来自2-20个或更多转基因事件的多重植物。从本文提供的转基因种子培育的转基因植物证实有助于增加产量的改良的农艺性状，或提供增加的植物价值，包括例如改良的种子质量的其他性状。特别感兴趣的是具有增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油的植物。
表1提供了编码蛋白质的DNA(“基因”)列表，它用作生产具有增强的农艺性状的转基因植物的重组DNA，表1的元件通过参考下列来描述：
“PEP SEQ”鉴别SEQ ID NO：84-166的氨基酸序列。
“NUC SEQ”鉴别SEQ ID NO：1-83的DNA序列。
“基础载体”鉴别用于转化重组DNA的基础质粒。
“蛋白质名称”是由重组DNA编码的蛋白质的俗名。
“增强的性状”鉴别由蛋白质在转基因农作物植物中表达赋予的增强的性状。
“质粒ID”鉴别关于植物转化质粒的任意名称，包括用于在植物细胞中表达重组DNA的重组DNA。
表1
 
PEPSEQIDNO NUCSEQIDNO 基础载体 蛋白质名称 增强的性状 质粒ID
84 1 pMON65154 乳酰谷胱苷肽裂合酶 增强的种子蛋白质 pMON69462
85 2 pMON72472 rab7c 增强的耐寒性 pMON69456
86 3 pMON65154 CDPK激酶结构域 增强的水利用效率 pMON67754
 
87 4 pMON72472 SCOF-1 增强的水利用效率和增强的耐寒性       pMON72494
88 5 pMON72472 聚球蓝细菌属物种(Synechococcus sp.)PCC6301δ9去饱和酶 增加的产量、增强的耐寒性和增强的水利用效率                 pMON68399
89 6 pMON72472 鼠耳芥agl11 δ K-框 改善的耐寒性 pMON73765
90 7 pMON72472 稻MADS3 δ MADS-框-L37528          增强的耐寒性 pMON73829
91 8 pMON72472 玉米MADS框蛋白质110              增强的氮利用效率和增强的耐寒性       pMON73816
92 9 pMON72472 鼠耳芥同源结构域转录因子-            增强的耐寒性 pMON75305
93 10 pMON72472 鼠耳芥AP2结构域转录因子            增强的耐寒性 pMON75306
94 11 pMON72472 鼠耳芥GATA结构域转录因子         增强的耐寒性 pMON75309
95 12 pMON72472 鼠耳芥AT-钩状结构域转录因子-       增强的耐寒性 pMON75312
96 13 pMON72472 稻DET1-样-BAB16336   增强的氮利用效率和增强的耐寒性       pMON80270
97 14 pMON72472 大豆G482-样1 增强的水利用效率 pMON76342
98 15 pMON72472 鼠耳芥假设蛋白[NM_114802]    增强的耐寒性 pMON79174
99 16 pMON72472 玉米假设蛋白 增强的耐寒性 pMON79413
100 17 pMON72472 大豆Pra2-样蛋白质2 增强的氮利用效率 pMON75511
101 18 pMON72472 土壤杆菌属隐花色素-样蛋白质-AE008050   增强的耐寒性 pMON75515
102 19 pMON72472 稻SNF1-样蛋白质9[OsPK4]-AB011967  增强的氮利用效率、增强的水利用效率、增加的产量               pMON80542
103 20 pMON72472 玉米sNF1-样蛋白质3 增强的水利用效率和增强的氮利用效率   pMON78949
 
104 21 pMON72472 玉米SNF1-样蛋白质8 增强的耐寒性和增强的水利用效率       pMON78936
105 22 pMON72472 玉米Rubisco激活酶2 增加的产量、增强的耐寒性和增强的氮利用效率                 pMON75524
106 23 pMON72472 NLI相互作用同工型T1-               增强的耐寒性和增加的产量             pMON79163
107 24 pMON72472 玉蜀黍小突触小泡蛋白相关序列1-       增强的耐寒性条件和增加的产量         pMON75533
108 25 pMON72472 玉蜀黍镁转运蛋白mrs2-1-样1序列   增强的氮利用效率和增加的产量         pMON79709
109 26 pMON72472 类似于结瘤蛋白MtN3蛋白质的玉米蛋白质 增强的水利用效率 pMON79422
110 27 pMON72472 玉米乙二醛酶II同工酶                 增强的耐寒性 pMON79425
111 28 pMON72472 玉米RNA3-末端磷酸环化酶-样蛋白质 增强的耐寒性 pMON79718
112 29 pMON72472 稻Di19样序列 增强的耐寒性 pMON79447
113 30 pMON72472 大豆MAP激酶6样2序列            增强的耐寒性 pMON78232
114 31 pMON72472 Ralstonia metallidurans谷氨酸脱羧酶        增强的耐寒性和增强的氮利用效率       pMON75980
115 32 pMON72472 稻HSF5样序列 增强的水利用效率 pMON80489
116 33 pMON72472 大豆hsp17.4样1序列 增强的耐寒性和增强的水利用效率       pMON79697
117 34 pMON72472 玉米的推定吡咯烷酮羧肽酶             增强的水利用效率 pMON78237
118 35 pMON72472 鼠耳芥E2F 增强的耐寒性、增强的氮利用效率       pMON80461
119 36 pMON72472 鼠耳芥蛋白质磷酸酶1A                 增强的耐寒性 pMON78235
 
120 37 pMON72472 鼠耳芥CtpA 增强的耐寒性和增强的水利用效率       pMON80452
121 38 pMON74532 鼠耳芥CtpA 增加的产量
122 39 pMON72472 类似于鼠耳芥可能的微粒体信号肽酶的玉米蛋白质           增强的耐寒性 pMON80500
123 40 pMON72472 [稻(Oryza sativa)]的推定醛糖还原酶     增强的氮利用效率 pMON80850
124 41 pMON72472 玉蜀黍(Zea Mays)激酶II(类似于酵母IKS1和At MRK1)           增加的种子蛋白质 pMON78949
125 42 pMON72472 果糖-1-6-二磷酸酶 增加的产量 pMON81853
126 43 pMON72472 大豆G1928样1 增加的种子蛋白质 pMON83769
127 44 pMON74532 集胞蓝细菌属物种(Synechocystis sp.)6803 Hik 19         增加的产量 pMON78911
128 45 pMON72472 集胞蓝细菌属物种6803 Hik 19      增加的产量
129 46 pMON72472 鼠耳芥NAC结构域转录因子            增加的产量 pMON73787
130 47 pMON72472 酵母丙氨酸转氨酶1-AAB67593           增加的产量和增强的氮利用效率         pMON77895
131 48 pMON72472 大豆过氧化氢酶-样1 增加的产量 pMON79152
132 49 pMON72472 玉米ALG-2相互作用蛋白质        增加的产量 pMON80921
133 50 pMON72472 推定的丝氨酸羧肽酶 增加的产量 pMON75505
134 51 pMON72472 推定的锚蛋白样蛋白质-                增加的产量 pMON80925
135 52 pMON72472 推定的激酶样蛋白质- 增加的产量 pMON78942
136 53 pMON72472 推定的蛋白质- 增加的产量 pMON79164
137 54 pMON72472 酵母YPR45W/asn1-U40829           增加的产量 pMON79653
 
138 55 pMON72472 稻AtHSP17.6A样1序列 增加的产量 pMON81228
139 56 pMON72472 酵母YDL123w 增加的产量 pMON79430
140 57 pMON72472 稻12-oxophytodienoate还原酶样1序列 增加的产量 pMON79731
141 58 pMON72472 大豆MAP激酶6样3序列 增加的产量 pMON78229
142 59 pMON72472 鼠耳芥GAD1 增加的产量 pMON79696
143 60 pMON74532 鼠耳芥GAD1
144 61 pMON72472 大豆hsp17.4样4序列 增加的产量 pMON78240
145 62 pMON72472 玉蜀黍hsp60样4序列 增加的产量 pMON80283
146 63 pMON72472 大豆dsPTP1 增加的产量 pMON80866
147 64 pMON72472 酵母GLC3糖原分支酶 增加的产量 pMON80292
148 65 pMON72472 鼠耳芥未知蛋白质 增加的产量 pMON82223
149 66 pMON72472 β-D-葡糖苷酶 增加的产量 pMON83553
150 67 pMON72472 未知蛋白质1 增加的产量 pMON81857
151 68 pMON72472 醛氧化酶 增加的产量 pMON82218
152 69 pMON72472 玉米假设蛋白 在冷应激下改善的生长 pMON78227
153 70 pMON72472 玉米假设蛋白 在冷应激下改善的生长 pMON78904
154 71 pMON72472 鼠耳芥半胱氨酸蛋白酶抑制剂 增加的产量 pMON78920
155 72 pMON82053 鼠耳芥半胱氨酸蛋白酶抑剂 增加的产量 pMON92646
156 73 pMON72472 鼠耳芥假设蛋白 在冷应激下改善的生长 pMON78922
157 74 pMON72472 酵母SNF1-A26030 在低氮、干旱和/或冷应激下改善的生长 pMON78948
158 75 pMON72472 大豆SNF1-样蛋白质1 增加的产量 pMON79660
 
159 76 pMON72472 大豆SNF1-样蛋白质2 增强的氮利用效率、增强的水利用效率、增加的产量 pMON78931
160 77 pMON72472 大豆G1760 增加的产量和增强的水利用效率 pMON82645
160 77 大豆G1760 增加的产量 pMON74470
161 78 pMON72472 稻乙二醛酶II 增加的产量 pMON79665
162 79 pMON72472 玉米OsPK7-样 增强的氮利用效率、增强的水利用效率、增加的产量 pMON82629
163 80 pMON75432 含有鼠耳芥phyC内含子1的稻phyA 增加的产量 pMON81344
164 81 pMON82060 稻G975样1 在冷应激下改善的生长
165 82 玉米光敏色素A 增加的产量 pMON74916
166 83 鼠耳芥G1760 增加的产量 pMON73957
具有增强的农艺性状的转基因植物的选择方法
在用重组DNA转化的植物细胞再生的转基因植物群体中，比产生种子和后代植物的能育的转基因植物活得长的许多植物将不显示增强的农艺特性。从群体选择必需鉴别一种或多种转基因植物细胞，它们可以提供具有增强的性状的植物。具有增强的性状的转基因植物选自再生或来源于如本文所述转化的植物细胞的植物群体，这通过在多种测定中评估植物以检测增强的性状，例如增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。这些测定还可以采取多种形式，包括，但不限于，在温室或田间试验中直接筛选性状或通过筛选替代性状。此类分析可以涉及检测植物化学组成、生物量、生理性质、形态学中的改变。化学组成中例如谷粒的营养组成的改变可以通过分析种子组成和蛋白质含量、游离氨基酸、油、游离脂肪酸、淀粉或生育酚来检测。生物量特征中的改变可以对温室或田间生长植物进行，并且可以包括植物高度、茎直径、根和枝条干重；和，对于玉米植物，谷穗长度和直径。生理性质中的改变可以通过评估针对应激条件的应答来鉴定，例如使用施加的应激条件例如水分亏缺、缺氮、寒冷生长条件、病原体或昆虫攻击或光缺乏、或增加的植物密度的测定。形态学中的改变可以通过目视观察具有增强的农艺性状的转化植物看起来也是正常植物，与朝向丛状分枝、更高、更厚、更狭窄的叶、有条纹的叶、具节的性状、缺绿症、白化、花色素苷产生、或改变的雄花穗、谷穗或根的改变比较的趋势。其他选择性质包括花粉释放的天数、抽丝的天数、叶伸展速率、叶绿素含量、叶温度、直立、幼苗活力、节间长度、植物高度、叶数目、叶面积、分蘖、支柱根、保持绿色(stay green)、茎倒伏、根倒伏、植物健康状况、不育/多育、绿色植物突然折断(green snap)和害虫抗性。另外，可以评估收获的谷粒的表型特征，包括谷穗上每行的谷粒数目、谷穗上谷粒的行数、谷粒败育、谷粒重量、谷粒大小、谷粒密度和物理谷粒质量。尽管本发明的植物细胞和方法可以应用于任何植物细胞、植物、种子或花粉，例如任何果实、蔬菜、草、树或观赏植物，但本发明的各个方面优选应用于玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麦和稻植物。在许多情况下，本发明应用于对来自Mal de Rio Cuarto病毒或高粱柄锈菌真菌或两者的疾病有固有抗性的玉米植物。
包括下列实施例以证实本发明的方面，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可在公开的具体方面进行许多改变并且仍获得相同或相似结果。
实施例1.植物表达构建体
A.用于玉米转化的植物表达构建体
这个实施例说明了用于将重组DNA转化到植物细胞中的质粒的构建，所述植物细胞能够再生为本发明的转基因植物。在编码序列的起始和终止密码子处或附近设计用于PCR扩增重组DNA的蛋白质编码核苷酸的引物，以消除大部分5’和3’非翻译区。编码表1中鉴别的蛋白质的每种重组DNA在插入如表1中参考的基础载体之一的插入位点中之前通过PCR进行扩增。
使用GATEWAYTM Destination植物表达载体系统(从InvitrogenLife Technologies，Carlsbad，CA获得)建造基础植物转化载体pMON65154用于制备转化到玉米组织中的重组DNA。参考下表3中描述的元件和SEQ ID NO：10024，pMON65154包括选择标记表达盒和模板重组DNA表达盒。标记表达盒包括与编码新霉素磷酸转移酶II的基因(nptII)可操作地连接的CaMV 35S启动子，随后为根癌土壤杆菌胭脂碱合酶基因(nos)的3’区。模板重组DNA表达盒定位与标记表达盒尾部对尾部。模板重组DNA表达盒包括5’调节DNA，其包括稻肌动蛋白1启动子、外显子和内含子，随后为重组DNA的GATEWAYTM插入位点，随后为马铃薯蛋白酶抑制剂II(pinII)基因的3’区。一旦重组DNA已插入到插入位点中，质粒就对于植物转化有用，例如通过微粒轰击。
表3
Figure A200580048534D00311
构建类似的基础载体质粒pMON72472(SEQ ID NO：10025)在土壤杆菌属介导的植物转化方法中使用，所述载体质粒类似于pMON65154，只是除了(a)在模板重组DNA表达盒中的5’调节DNA是稻肌动蛋白启动子和稻肌动蛋白内含子，(b)加入来自土壤杆菌属的左和右T-DNA边界序列，右边界序列位于稻肌动蛋白1启动子的5’，并且左边界序列位于35S启动子的3’，和(c)加入DNA以促进质粒在大肠杆菌和根癌土壤杆菌中的复制。在T-DNA边界序列外加入质粒的DNA包括在土壤杆菌属中起作用的oriV广泛宿主范围的DNA复制起点，在大肠杆菌中起作用的pBR322复制起点，和在大肠杆菌和土壤杆菌属中用于选择的壮观霉素/链霉素抗性基因。
使用本领域已知的技术装配表4中举例说明的另一基础载体pMON82060(SEQ ID NO：10026)。
表4
Figure A200580048534D00321
Figure A200580048534D00331
B.用于大豆转化的植物表达载体
还制备了在大豆转化中使用的质粒。下表5中显示了示例性共同表达载体质粒pMON74532(SEQ ID NO：10027)的元件。
表5
Figure A200580048534D00341
使用本领域已知的技术装配表6中举例说明的另一基础载体pMON82053(SEQ ID NO：10028)。
表6
Figure A200580048534D00351
在插入位点插入载体之前通过PCR扩增重组DNA的蛋白质编码区段。在编码序列的起始和终止密码子处或附近设计用于PCR扩增的引物，以消除大部分5’和3’非翻译区。
实施例2.玉米转化
这个实施例说明了在生产本发明的转基因玉米植物细胞、植物、种子和花粉中有用的植物细胞转化方法，以及具有增强的性状的转基因玉米植物和种子的生产和鉴别，所述增强的性状即增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。通过将表1中鉴别的DNA克隆到鉴别的基础载体中制备质粒载体，以用于玉米植物细胞的玉米转化中以生产转基因玉米植物和后代植物、种子和花粉。
对于土壤杆菌属介导的玉米胚细胞转化，将容易转化的玉米植物系(命名为LH59)在温室中培育，并且当胚长度为1.5-2.0mm时收获谷穗。通过喷雾或将谷穗浸泡在80％乙醇中，随后风干来表面灭菌谷穗。从表面灭菌的谷穗上的个别谷粒分离出未成熟胚。在接种玉蜀黍细胞前，土壤杆菌属细胞在室温下生长过夜。未成熟的玉蜀黍胚细胞在切割后很快用土壤杆菌属接种，并在室温下与土壤杆菌属一起温育5-20分钟。未成熟胚植物细胞随后与土壤杆菌属在23℃在黑暗中共培养1-3天。将共培养的胚转移至选择培养基并培养大约2周，以允许胚发生愈伤组织发育。胚发生愈伤组织转移至包含100mg/L巴龙霉素的培养基中并在约2周的时间间隔进行传代培养。在选择开始后6-8周回收转化的植物细胞。
对于土壤杆菌属介导的玉蜀黍愈伤组织的转化，未成熟胚在切割后培养大约8-21天以允许愈伤组织发育。愈伤组织随后在室温下与土壤杆菌属悬浮液一起温育约30分钟，随后通过抽吸去除液体。愈伤组织和土壤杆菌属不加选择地共培养3-6天，随后通过对巴龙霉素选择大约6周，每两周一次转移至新鲜培养基，并且巴龙霉素抗性愈伤组织鉴别为在表达盒中包含重组DNA。
对于通过微粒轰击的转化，在轰击前3-4天分离并培养未成熟的玉蜀黍胚。在微粒轰击前，制备金颗粒悬浮液，在其上沉淀所需重组DNA表达盒。如美国专利5,550,318和6,399,861中所述，使用放电粒子加速基因递送装置将DNA导入玉蜀黍细胞中。在微粒轰击后，组织在黑暗中在27℃培养。用于制备本发明转基因植物的另外的转化方法和材料，例如，各种培养基和受体靶细胞、未成熟胚的转化和后续能育的转基因植物的再生公开于美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请序列号09/757,089中，其引入本文作为参考。
为了再生转基因玉米植物，由转化产生的转基因植物细胞的愈伤组织置于培养基上以起始小植物的枝条发育，所述小植物转移至盆栽土壤以在生长室中在26℃起始生长，随后为喷雾苗床，之后移植至5英寸罐中，在其中植物生长至成熟。再生的植物自体受精并收获种子以用于在一种或多种方法中选择种子、幼苗或后代第二代转基因植物(R2植物)或杂交体，例如通过与对照植物比较选择显示增强的性状的转基因植物。
转基因玉米植物细胞用来自表1中鉴别的每种基因的重组DNA转化。如实施例5中报告的，筛选后代转基因植物和转化的植物细胞的种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。
实施例3.大豆转化
这个实施例说明了在生产本发明的转基因大豆植物中有用的植物转化，以及具有下列特性的转基因大豆的转基因种子的生产和鉴别：增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。
对于土壤杆菌属介导的转化，大豆种子发芽过夜并切下分生组织外植体。分生组织和外植体置于创伤容器中。大豆外植体和诱导的土壤杆菌属细胞在种子发芽开始后不迟于14小时混合，并且使用超声处理进行创伤，所述土壤杆菌属细胞来自包含具有目的基因盒和植物选择标记盒的质粒DNA的菌株。创伤后，外植体置于共培养中2-5天，在这个点上它们转移至选择培养基6-8周，以允许选择和培育转基因枝条。大约6-8周收获性状阳性枝条并置于选择性生根培养基中2-3周。生根的枝条转移至温室并在土壤中进行盆载。对选择保持健康但不产生根的枝条转移至非选择性生根培养基另外2周。对来自中止选择产生根的任何枝条的根测试植物选择标记的表达，之后将它们转移至温室并土壤中进行盆载。另外，如引入本文作为参考的美国专利5,015,580中所述，DNA构建体可以通过粒子轰击转移至大豆细胞基因组中，并且细胞再生为能育的大豆植物。
用来自表1中鉴别的每种基因的重组DNA转化转基因大豆植物细胞。如实施例5中报告的，筛选后代转基因植物和转化的植物细胞种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。
实施例4.同源物鉴别
这个实施例说明了表1中鉴别的DNA编码的蛋白质同源物的鉴别，它用于提供具有增强的农艺性状的转基因种子和植物。从来自同源物的序列中，可以鉴别同源DNA序列以用于制备本发明的具有增强的农艺性状的另外的转基因种子和植物。
使用有所有权的序列数据库和国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)(NCBI)非冗余氨基酸数据库(nr.aa)构建已知蛋白质序列的“所有蛋白质数据库”。对于从中获得本文提供的多核苷酸序列的每种生物，构建生物的已知蛋白质序列的“生物蛋白质数据库”；它是基于生物的NCBI分类学ID的所有蛋白质数据库的子集。
使用NCBI“blastp”程序，E值截止值1e-8，使用本文提供的氨基酸序列如SEQ ID NO：84-SEQ ID NO：166查询所有蛋白质数据库。记录最高达1000的最高命中并通过生物名称分开。对于除查询序列的生物以外的每种生物，记录来自查询生物自身的命中列表，其具有比生物的最佳命中更显著的E值。列表包含本文提供的多核苷酸的可能的重复基因，并称为核心列表。另一列表记录来自每种生物的所有命中，通过E值分选，并称为命中列表。
使用NCBI“blastp”程序，E值截止值1e-4，使用本文提供的多肽序列如SEQ ID NO：84-SEQ ID NO：166查询生物蛋白质数据库。记录最高达1000的最高命中。基于这些命中构建BLAST可检索数据库，并称为“SubDB”。使用NCBI“blastp”程序，E值截止值1e-8，使用命中列表中的每种序列查询SubDB。具有最佳E值的命中与来自相应生物的核心列表比较。如果命中属于核心列表，则认为它是可能的直向同源物，否则就认为它不是可能的直向同源物，并且不在相同生物的命中列表中进一步检索序列。通过SEQ ID NO：167-SEQ ID NO：10023的氨基酸序列鉴别并报告来自大量不同生物的同源物。在表2中鉴别了SEQ ID NO：84-166的蛋白质以及SEQ ID NO：167-10023的同源物之间的这些关系。对于每种同源物的来源生物见序列表。
表2
   PEP SEQ ID NO：同源物 SEQ ID NOs
   84：4274  4007  7537 1472  2465 1788 1873 8538 2486 2101 2090
3705
       513  7264  6280 4902  2624 8820 1614 5907 8247 2717 4147
5559
       1631  7278  6566 6687  2116 9018 192  2002 5150 322  6314
6458
       6281  1285  7292 4226  4543 2496 9903 1478 554  5383 7751
2484
       4954  7695  5821 6271  3339 443  8542 1561 2321 5876 6877
3452
       2879  3497  2097 4257  7449 7281 3708 4513 2001 4425 9319
4133
       6686  2146  9698 1036  2026 1292 5566 181  6951 9794 2439
2621
       5202  878   8081 1392  1950 9999 4392 2121 7824 2367 5102
6717
       1541  9444  7051 529   4096  602 8266
  85： 1163  3954  9565 5913  8096 1310 3871 3019 2926 1456 2770
4461
       2570  5099  7946 3700  9665 1600 7270 7312 6531 9978 8803
8920
       4917  6067  6352 6902  2025 2516 4213 9446 8483 5404 2213
4311
       3724  9926  9599 3835   727 8396  190 3701 7478 706  4038
7149
       5413  1538  8094 9467  7385 7520 7275 3299 3658
86：   2511  2513  7067 7055  5647 9608 9399 4420 9867 4564 2527
7769
       2323   347  6509 2052  5258 4504 5363 3847  329 7133 1751
3243
       8135  4767  5558 2719  6177 6161 6180 1606 3066  514 7725
4747
       2868  3953  3995 9218  8245 1471 1050 4602 9788 5705 1043
87：   7338  2565  1372  619  8819 7803 7216 9263 8478 7286 2051
8010
       4629  2569  8521 7659  6081 6080 2727 1944 5731 7616 8198
8166
       6312  9586  2010 7801  4694 4265 3928 9925 1675 6099 5725
1040
       5933   270  4135 6356  8593 7015 3351 9045 5105 9655 3874
5951
       2184  7921  9476 3408  7095 1214 9077 3211 7050 7106 4788
3534
       3093  7715
88：   9004  8450  3918 3721   516 8506 8664 3458 6365 2464 1564
4322
       7760  3673  7547 2603  8146 1755 7919 4542  436 2278 4913
2453
       9651  2319  3659 678   4640 3600 4171 1156 1807 5765 6619
2992
       354   8233  2386 9454  9453 8837 1238 6971 7874 6538 8258
1371
       1609  3120  3437 8825  7158 5623 1313 7335 6137 3691 8239
415
       7580  5147  8818 6282  4612  543 6639 9686 7662 7683 7682
7664
       5278  5260  8016 2558  2566 2530 9515 5921 8962 3892 7174
6793
表2(续)
      6936   6938    8284  5225    9323   2932    4932    5328  6697  6602  5109
9625
      1876   7435    7758  1719    662    6913    4095    5563  4919  8188  6804
360
      9790   7742    7745  2584    8776   8004    862     6690  8757  5193  6618
9595
      225    4815    5192  1055    4061   4017    9781    9955  8231  1254  5944
4087
      8234   319     1180  4631    9258   6546    699     3498  866   588   189
4577
      1244   5332    3952  9818    2700   9827    6958    7167  3762  9259  3504
4434
      4968   3204    8580  1077    5275   9915    1474    9160  1653  2701  1637
5350
      5299   1843    4178  10018   7040   2894    2821    5624  680   9370  7560
4573
      2144   6813    6722  3689    6721   3373    8902    6656  8928  8462  1336
9106
      6956    220    3196   221    6118   4162    7171    9683  3870  4094  8343
8342
      213    904     6335  8822    2482   3806   1766     2692  9038   384  9008
9007
      3843   2040    7982  9001   9002    4781    606     4807  4852   5595 1509
1018
      8100   8751    6816  9347   8346
  89：9376   7987    7994  8028   8008    9732   7256     7258   6605  6606 7280
3139
       9607  7439    6711  9237   9236    6585   1956     1982   1979  7291 7290
1200
       8901  7293    7295  7315   7297    7279   6624     6601   6622  6584 6583
6387
       7341  9612    264   2843   1637    3217   3243     9476   3306  6206 600
6598
       6675  9922    4296  3753   4899    6243   4253     4128   8555  2069 9831
3105
       6073  6074    6075  7571   9157    3157   7568     8071   7565  5977 4467
7244
       1849  7820    7235  3250   6000    1058   6372     9381   7369  4775 4109
609
       9998  9373    6579  6559   6561     206   8729     1166   4317  1863 5710
381
       2162  4270    6680  6925    752    2268   4086      394    378  3059 6262
9338
       2659  8145    6646  9005   4294    6457   6451     8075   8093  3747 3558
7476
       7475  7317    1709  6558   3764    3280   6580     1845
   90：446   4338    4342  9732   4169    7256   7258     7260   6605  6606 7280
9607
       3131  3148    6585  4388   3940     177   7243     7291   7290  1200 1231
1207
       6265  7295    7293  7315   7297    7279   7792     7788   6624  6601 6622
6583
       6584  6891    7253  7277   7262    7272   7271     7324   7321  6598 6620
6600
       9922  7623    6675  9831   2069    3105   6073     6075   6074  7571 9157
7107
       7110  7108    7109  7244   1849    7235   3250      176    179  3357 1058
6798
表2(续)
     5204 9410 1816 5206 6794 1553 6056 6795 6372 9585 9587
7819
      383  510  175 2068 2865 2823  450 9643 1555 1636 3418
2608
      701 6147 6165 1470 6578 9307 4775 3206 4245 7525 8255
2331
     9277 9305 9278 9274 6559 6579 6561 8729 7851 2561 7850
2208
     1166 9701  670 6640 8134 5364 3904 6039 1320 6481 5993
3541
      207 8345 8326 4696 7508 1266 2160 2162 1270 3958 4250
6887
     3932 4270 5104 6680 8202 6925 1088 8251 1466 8249 9677
3579
     7756 2119 4273 1011  245 3713 9490 5245 4735 2153  854
4214
     5025 6660 5001 4086 4099 4077 7241 7237 3059 6262 2659
820
     6646 9005 4294 6457 6451 2869 2767 7746 1732 1738 1734
1740
     1617 6714 8105 7317 7318 1709 1731 6558 7716 7971 7968
1210
     1248  925 6580 1247 1273 1274 3369 2586 3664
 91：7402 7398 3583 3592 4729 6500 6496 2752  215 7280 3139
3136
     7439 7440 7424 9236 9237 3124 3128 3938  177 1956 1982
1979
     7291 7290 4868 6436 7355 7315 7297 7279  794 7341 7272
7262
      290  304  289  291  288 7324 7321 3947 6330 6661 6658
4296
     3753 8555 1943 8457 3157 7565 7568 7088 5977 4467 3998
3185
     3181 3152 3155 7534 7516 7244 1847 7442 7468 6000 8494
375
     1057 9773 6372 7369  957 2685 3508 3586 3087 8866 5749
1377
     2317  723 4586 2111 4703 4413 3687 8541 9052 1793 6037
2164
     2626 6824 5207 3238 7618 9974 9973 1815 1813  206 4540
2230
     6716 5597 2206 2232 2200 5599 1187 3435 9672 9040 9039
2881
     7223 2377 2292 7024 6395 4348 4880  744 8064 5301 8492
8447
     4312 4317 8472 1863 7956 6694 8324 7358  381 5710 3028
2182
     7020 3016  531 5699 9003 7798 7421 2299  787 1905 3641
1934
     1893 1889 7496 5036 7100 3584 3055 2018 2043 2042 7345
1084
     1086 8473 8350 4908 4934 8469 8477 8098 8215 6937 8496
4319
     8499 8500 1741 5722 1844 1930 2265 2272  605 4099 4086
5667
     7379 7378 6262 9338 4236 9976 9969 9972  819 9011 9012
4937
     4956 2236 6461 5469 8073 6550 3501 2047 2133 7747 6304
1321
表2(续)
      7230   5154   5153   7376   7373   7476   7490   6862   7512   7475   7562
7538
      7536   7559   212    200    2238   3159   8122   1753   435    442    2337
3280
      3274   8476   5502   6810   2934   4335   3380   8421   1125   1368
  92：4117   4611   3810   2575   6435   3730   689    8501   7519   5065   7840
1174
      8079   3550   8678   8411   9895   1790   4481   2401   2373   1224
  93：3314   5148   1284   2180   7766   9728   8528   6328   7621   9726   1134
7569
      7567   5040   7727   8537   7497   8041   1784   8956   8953   3029   5087
7642
      2764   1736   6023   8126   164    8296   4997   6279   3822   9989   6339
5750
      4196   2427   7030   8232   2440   5671   7115   6494   3608
  94：370    4530   5496   2209   8764   5878   2102   3133   4500
  95：7835   7905   4016   3657   6757   2948   2947   3710   3091   4869   8309
6256
      3302   1832   7091   9509   2972   4439   667    3396   7147
  96：7080   6259   8950   8331   6582   1510  8054     801   3389   4111   2614
4255
      5795   2476  10023   6565   3866   1300   6088   7775   6346   9576   8029
6701
      1803   4281    816   2806    396   2594   3089
  97：6736    292   4996   5983   8898   6886   8845   1312   9032   1586   9964
9971
      6476    455    357   6653   3756   4574   3311    920   3295   3443   9601
6906
      5214   5215   5216   5217   7960   7945   7009   8847   4936   6359   5296
6571
      2233   3288   8736   5420   4531   9662   4891   7545   7948   7980   2201
9853
      8153   4861   8591   1746   7233   8693   3252   8690    709   5069   9505
  98：9658   9420   3779   6609   3006   2471   3567   4983    434   3565  10008
8348
      5728   8033   8302   5426   8854   6705   4160   4243   9780   9744   8244
4469
      317     152    522   6171   3571   3894   8512   2442   9642   6255   3980
3725
  99：9060   9635   3511   3575   1890   1852   7041   4217   2648    156   2833
8456
      7232   8503   5709   8742   6107   9824   9121   1142    886   9105   8210
2910
 100：9526   1911   5622   9279   2726   1935   4608   7672   9536   4429    260
4235
       356   5588   4995   2426   5771   4203   1942   6086   3697   2322   9359
1534
      9550   1034   8012   7732   7017   1448
 101：4840   6812    777   7939   1059   6995   5721   4881   5741   9047    566
3050
      8123   2590   8060   4040   6354   2078   2081   3304   2079   3305   2734
1841
      9901   9621   1060   6385   3676   2300   1773   9674   4263   7267   9920
7962
      1042   6416   8813   2382   4599   5670   3931   4207   2985    400   5678
2687
      7693   5971   2534   4262   9246   1286   9506   3796   9450    271   6880
5182
表2(续)
      6830  3290  2631   572  3716  9890  9594  9073  7979  8835  7060
503
      4838  6333  2562  8179  3698  4825  8783  2604   673  2632  5822
3084
      9095  9913  3912  9850  7102  7121  4583  5132  3859  3618  4979
1024
      4655  9239  1027  3466  8177  1137  6704  1902  3898  6320  3990
8921
      9789  7780  1867   720  7797  8984  8792  6677  2787  6486  4974
7096
      6414  1120  4261  4688  9633  7118  1304  7906  4639  8137  6317
6512
      5194  7524  3719  8879  5892  6719 10015  2432  5524  5347  4620
7838
      2349  3742  3336  8156  4407   7519048   1574  8745  9064  5982
3677
      3335  8828  2296  6016  2954  2083  7531  750   6967  8907  4754
7306
      9325  8831  8687  6604  8124   953  5357  6150  4106  7305  448
7370
      2848  4299  6468  9430  4333  9395  6953  5311  6493  5514  1883
2876
      4693   645  4187  4174   955  2372  7506  9290  4134  4176  2986
9835
      4353  3004  4350  4916  2653  9517  5416  2953  2619  8038  8443
5903
      8092  4082  5327  1767  1761  1781  1763  9578  9787  3277  4719
7767
      4559  3285  7164  1444  6028  2320  6608  1684  1706  1687  1710
7111
      7099  5737  6814  6811   386  1976  9411  7973  2663  5521  9734
8257
      5695  2667  1484  5781  1479  2298  9281  9280  9689   502  6909
4165
       426  2941  8935  9201  1089  5055  7239   831  1203  9814  9688
385
      7326  6723  7768  5838  2982   242  2577  3232  9055  8305  5794
7974
      6114  3340  1764  5723  5940  5567  5093  9792  1635  7645  4958
6863
      2987  9330  3245  9438  4298   534  3316  5125  6755  4873  1065
6730
      6904  3603  5948  6903  9042  2384  3197  1325  9053  5820  971
3970
      7014  4645  2517  5757  7712  3115  3116  3113  6008  3494  9096
9270
      8942  5369  3727  5382  6563  7718  4888  3393  9383  834
 102：4624  1430  1961  1964  5156   999  3374  6267  4084  9627  4383
1556
      1098  783   6842  7112  7177  7189  4841  9547   456  3255  2850
8504
      1846  9224  7752  1367  8373  3039  6783  3653  4153  6429  9457
8323
      4252  6669  202   162   8940  1117   956  5660  7829  5669  4893
5253
      9367  6594  4400  6788
 103：4624  9456  5156  999   6267  3374  4084  5394  6413  7397  8169
6610
表2(续)
       9718 7876 4383 1098 1556  783 7112 3279 6197 9663 6252
7970
       7356 4596 1390 5051 5754 7566  980 5947 6353 2721 2365
3317
       2005 5483 8362 7498 6681 1616 4872 1367 6742 1167 8605
7077
       3202 8267 3674 8623 7344 6893  869 8068 1122 1124 3653
4153
       6429 9457 8101 8228 1091 8323 5427 3242 9678 7829 5669
6594
       4893  157 2141 2249  205 7148 4801 1348 5789  371 9957
3281
       2933 6102 9219 4400 7744
  104：4624 9456 5156  999 6267 4084 5394 6413 7397 8169 9718
6610
       7876 1098 4383 1556  783 5129 3279 6197 7970 4596 7356
1390
       5051 5754 7566 5947  980 6353 2721 2365 3317 7189 7177
456
       1367 6742 1167 3202 7077 8605 8623 8267 3368 7344 6893
3674
       6783 8068 9341 3935 4153 6429 9457 8101 3987 9140 3035
238
       8323 5427 3242 7829 5669 6594 4893  157 2141  205 2249
7148
       4801 4054 1348 5789 9493 8525  371 9957 3281 2933 6102
9219
       4400 6788 9027
  105：7812  882 3025 2739 5708 3306 1560 7612 5164 8369 4656
9015
       2778 2824 4488 9482 4490 7160 1576 8990 3445 9496 1081
8581
       8589 9860 6511  559 8419 7407 6212 6227 9129 4498 7269
8072
       9605 1531 7089 1967 8562 9391 1385 7893 1070 3042 8370
8206
       1811 5662 5196 4406 4389 5144 4681 4683 4661 7698 3800
6641
       7414 4547 9756 5711 5714 4033 4037 4039 4035  948
  106：9402 8595 2366 8382 1968 3420 6998 1544 1165 8998 1193
5810
       8051 1252 8171
  107：1291 7911 2740 6326 1417 8943 7052 3303 9661 5223 7511
5891
       5111 6321 4259 4424 4358 9191 2891 8424 8353 2521 6427
1960
        355 5300 5739 2460 3831 6920 9695 6754 4501 2964 4399
7640
       8431 7924 3977 1557 2027 3409 1651 8086 9083 8265 313
1774
       2339 1155 8549  234 6176 5862 3417 4736 6612 2434
  108：3765  171 1106  382 6195 8056 5268 5113  472 8844 4982
666
       8778 6706 7739 2918 9074 3017 4218 9363 9914 5967 7796
9712
       5449 5635 9520
  109：1826 2705 9393 2425 1213 7660 9089 9054 4327 3778  303
4458
表2(续)
      9486  6741  5431  6169  3381  1431   930  1853  2573  4821  8454
5435
      1573
 110：5969  7138  7828  3577   489  5529  6737  9681  6534  1722  8881
4557
      8810  4325  7209  9670  5063  2588  3570  2468  3921  9958  9301
5466
      3869  3523  1591  5729  9783  2404  7123 10012  1898  2921  1361
2199
      6079  4823  6562  3582  4198  2988  1673  9091  6045   745  7254
4887
       977   564  9761   790  3944   608  1196  5222   966  8036   326
1477
      2535  9234  1206  4824  2506  5853  1778  6765   919  8702  4812
5353
      1322  3733  5817  3053  4591  5238  4483   786   852  3201  1588
7489
      5700  2914  5503  2660  2500  2582  8351  2766  9436  4685  9940
4443
      8414  1785  1349   417  5680  3107  1447  4089  3425  2643  8291
7197
      5541  6047  4613  2239  7734  4497   881  7549  2390  7637  6418
5266
      5855  5325  7607  3119   859  3220  1382  4268   240  5654  3739
8059
      4397   806   301  2748  4529   838  9166   769  7471  8997  2099
1829
      3560  8685  3440  4648  6234   642  8422  3978  1239  3217   755
3790
      2682  1051  5269  8390   607   667  66647  1805  8971  7955   788
2675
       161  8217  9631  9610  2898   569  3240  6155  3722  2713  9746
5523
      6768  5103  4879  6805  6194  5775  7593  7966  1217  1068   592
5777
      2301  9364  7176  1747  7810
 111：1848  7581  8716  1381  3763  9600   464   830  1454  2697  1946
3371
      3331  5569  5388  8095  1812  8144  5798  9118  4416  2526  6791
6506
      2295  1757   521   807  6077  9190  8758  1157  2605  5928  4987
256
      8104  3453  5802  9866   374  6761
 112：3041  1135  1343  4097  5330  4575  1412  1253
 113：7726  7410  8023  8039  8037  3318  7855  3370  1661  7688  5627
4943
      8955  8914  4862  1500   344  3426  5227  3502   293  9110  3083
2887
      9766  1619  6856  2546  6874  6190  6923  5100  4621  9470  8754
9389
      6376  6441  4422  9154   345   457  6292   571  1061  3909  4751
2793
      5101  4673  4878  3491  6065  7011  7632  5390  4909  8328  5391
6022
      9063  1804  3189  3803   880  2123  2931  6650  7789  2392  3478
2204
      1188  1993  6419  5463  1704  1718  4102  6349  4776  8793  1919
7221
表2(续)
      1154  8756  3192  1603  8648  1347  1692  9684  3073  3212  8125
1563
      5012  2143  2731 10006  5240  4915  7389  1729  7639  6319   844
2263
      6343   891  3352   590  593    578   591  8035  6049  6731  7592
1145
      7686  9079  4699  5323  4303  1000   579   340  9696   539  7817
7814
       352  6724  1917  3594  8858  8853  8855  1866  2559  5673
 114：9538  6322  7202  4360  8216  2187  2190  2706  8864  7631  4191
753
      4188  3875  4002  8728  5819  8780  4946  5823  5429  9409  4797
1914
      9292  4470  1705  8384  2457  7603  5603  8655   376  7135  3249
3241
      5239　1064　1066　7518　6038　6924　3213　3207　5845　2936　6683
5372
　　 10011　9763  9153  4074  4666  7043  8312  4569  1296  3499  3846
5324
      5997  7365  3321  2810  4489  5162  9846  1282  8791  5848  5696
6367
      5854  3923  6828  9284  2736  6767  4015  4001  7119  7128  6819
6637
      6746  5893  8436  3198   954  9398  4215  6750  1094   429  6157
7446
      5377  6108  7283  2695   597  5092   227  5082   143   142  4345
4731
      5584  4024  1933  9022  1446  8586  6315  9886  8896  1441  3322
2485
      9887  1859  4473  4598  1725  1723  1711  1727  4684  1789  3375
2128
      1830  7859  7156  4538   461  5632  4722  4804   449  7646  4227
5060
      4568  5604  6193  2360  3728  5736  1183  4672  3037  932  7688
466
      1275  1707  2012  6397   463  3789  2075  6517  6083  2533  2036
726
      6533   899  8318  6219   508   312  5191  1874  4144   704   762
1810
      4409  6251  5115  4914   526  3447  1665  9116  2732  5462  7997
1995
      8681  1540  3384  9404  2304  4761  3200  9823  6221   354  5145
9265
      1685  8769  8873  8475  1862  5428  3807  1585  1457  9535  7023
7207
      8840  3150  7215  4107  3879  4554  1912  9215  1955  2217  4314
6198
      6851  7248  3714  1842  6726  3068  1234  1314  8417  5801  6952
7120
      2118   643  7187  7053  7671  9298  4633  4795  2872   634  6275
3390
      5246
 115：6527  5534  7630  1822  3812  8830  7349  8173  8230  6454   823
5742
      7635  2370  6734  3441  7401  1825  7723  1776  8502  4376  9849
8505
      9918  1246  5086  9880  5477  1168  6035   263  6347  7450  4783
8460
表2(续)
      3576  1626  1550  6648  3860  6467  9774  1264  5066  3347  9869
4031
      1128  9691  6162  7227  3529  3184  3182  6301  6712
 116：6340  2512  9223  8511  1411  9838  4614  2313  8017  3726  7853
4136
      7242  5908  4839  3629  2463  8002   685  2572  5679  9641  5049
6231
      3777  9346   570  2598  5766  4493  1856  3171   633  3079  3519
6914
      6119  4782   954  9944  6394  1818  3916  7353  2995  5902  2095
747
      9917  9933  4752  4734  4779   493  3829  5900  7925  2928  2157
1988
      7313  4921  4689  9543  1857  4528   407  9514  9214  3665  3506
2973
      3045  4875  6374  6390  4895  6392  6393  8200  4551  6433  5790
2532
      6707  8937  4894  7719  7722  6196  4546  7019  6334  5718  2693
8868
      8337  7624  8084  5368  1792  1809  5308  5291  3604  2470  4720
1363
      2244  6555  1691  5954  5228  5208  5224  3448  5362  9613  5230
7162
      8616  2935  5756  4391  4390  4378  9775  1461   914  4939  6668
2178
      4494  4491  4492  4447  4446  4398  4401  4423  3968  4462  6837
7793
      8451   922  9304  4070  7852  1526  1527  2223   387   246  1554
8977
      6547  3865  1386   684  8322   252   248   249  4690  2214  7084
6873
       328  9533  8682  4926  4698  7268  2344  9907  6963  6033  7577
297
      5424  3515  8897  9306  2854  9203  7342   949  6487  8468  2389
9019
      6360   377  9321  7871  1683  1290  4183  3397  3219  4855  4853
7564
      8066  2391  2364  2341  2308  2336  2359  2312  2355  2291  8674
8676
      2309  2334  2338  2293  6361 5880  4164  2896  8031  6630  5425
7499
      1442
 117：3877  5727  4241  1513  5672  903  2629  7240  1570  3522  6209
6399
      7453  4618  848  9822  1978  8047  7126  9241  3754  6401  6838
8863
      8632  7454  5580  8522  7895
 118：3495  5400  9889  6676  3537  2811  5961  7327  7081  3672  180
3487
       729  9474  1384  3951  5271   717  7942  6235  5455  4990  9372
1754
      1073  6133  7304  7521
 119：9634  7978  4066  4065  2009  5886  5171  8727  7846  9806  2815
4941
      1225  8445  4436  2407  3775  5616  4453  5778  6515  6090  4925
4646
      5370  6739  7765  4381  8172  1108  1839  7443   330  7806  7804
1251
表2(续)
      7085  1192  1195  8607  6203  9771   698  8705  5590  5598  5592
5596
      3601  9117  2765  3559   343  7898  8931  3693  3692  1611  1610
365
      5981  1171   764  5611  5444  5881  8797  7530  2017  8983  2997
2930
      6738  5270  1786  9245  3759  1888  4980  6122  5354  3372  9297
5120
 120：9228  4471  4904  8878  2071  9785   822  6100  8130  8957  6961
1787
      9828  6974  5058  6048  2058  1334  8704  4992   625  3328  4222
2494
      8453  5397  4969  4450  4318  2859  1370  1074   323  8974  4426
6663
      5231  4130  5715  6857  4963  5687  5392  8795  5871  8912  6299
1801
      2634  2636  1802  3896  9268  8278  3174  7026  7220  8074  8650
9102
      9287  7583  7097  8408  7371  7667   195  5536  2730  3535  2115
4088
      1078  5734  6232  6400  5785  9041  5946  5806   533  6762  5167
3509
      7720  6425  1775  5393  9808  2671  5316  1712  9504  4010  5818
4041
      4667  2542  3854  9371   235  4204  6216  4774  1599  2661  3975
8489
      1947  6860  3465  9213  3323  6144  9350  1311  6868  1029  5543
7654
      5689  9138  4901  3646  4370  5447  3568  9049   191  9432  7500
3216
      1937  1287  2215  3057  4331  2431  3662  2335  4680  9924  9464
9069
      2446  1136  9899  6634  3821  7491  5743  3818  5952  7694  5008
7044
       427  2844   993  3332  3542  9555  7509  2655  9733  5930  9935
2885
      3456  4859  5366  9953   703  1152  8430  4437  7699  8295  1423
695
      8683  1317  3715  6834   613  3411  1147  6674  3578  9109  2999
7881
      8241  6528  3430  2831  9772  7685  4897  7480   601  7250  9392
2656
      8567  4984  3736  9512  9647  5430  4593   748  6576  8827  3346
9892
      4300  3364  7086  6670  4459  7543  3063  3463  5232  5575  9624
1514
      1882  4732  5860  3475  5168  6684  6581  6437  8357   2423  4876
2589
      4866  4870  2803  6735  8307  4675  4142   798  2816   5545   867
2253
      5522  3595  2944  1158   840  7251  6225  8152  6818   7384  8440
8966
      5155  6030  7494  5408  8341  7914  7909  1602  8527  9112  2828
2829
      5360  4922  4427   459  9254  1278  7587 10010  5614  5712  6699
1041
      6085  1953  5422  1038  1533  8211  5116  4737  7492  9123  1237
3782
表2(续)
     5218  8775  8058  7078  9592  1095  9142   325   368  4520  6553
5378
     6134  8299  1309  2520  7542  9412  7800  6452  5355  3976  9725
7636
     7309   525  9834  4503  5283   870  5203
121：9228  4471  4904  8878  2071  9785   822  6100  8130  8957  6961
1787
     9828  6974  5058  6048  2058  1334  8704  4992   625  3328  4222
2494
     8453  5397  4969  4450  4318  2859  1370  1074   323  8974  4426
6663
     5231  4130  5715  6857  4963  5687  5392  8795  5871  8912  6299
1801
     2634  2636  1802  3896  9268  8278  3174  7026  7220  8074  8650
9102
     9287  7583  7097  8408  7371  7667   195  5536  2730  3535  2115
4088
     1078  5734  6232  6400  5785  9041  5946  5806   533  6762  5167
3509
     7720  6425  1775  5393  9808  2671  5316  1712  9504  4010  5818
4041
     4667  2542  3854  9371   235  4204  6216  4774  1599  2661  3975
8489
     1947  6860  3465  9213  3323  6144  9350  1311  6868  1029  5543
7654
     5689  9138  4901  3646  4370  5447  3568  9049   191  9432  7500
3216
     1937  1287  2215  3057  4331  2431  3662  2335  4680  9924  9464
9069
     2446  1136  9899  6634  3821  7491  5743  3818  5952  7694  5008
7044
     427   2844  993   3332  3542  9555  7509  2655  9733  5930  9935
2885
     3456  4859  5366  9953  703   1152  8430  4437  7699  8295  1423
695
     8683  1317  3715  6834  613   3411  1147  6674  3578  9109  2999
7881
     8241  6528  3430  2831  9772  7685  4897  7480  601   7250  9392
2656
     8567  4984  3736  9512  9647  5430  4593   748  6576  8827  3346
9892
     4300  3364  7086  6670  4459  7543  3063  3463  5232  5575  9624
1514
     1882  4732  5860  3475  5168  6684  6581  6437  8357  2423  4876
2589
     4866  4870  2803  6735  8307  4675  4142   798  2816  5545   867
2253
     5522  3595  2944  1158   840  7251  6225  8152  6818  7384  8440
8966
     5155  6030  7494  5408  8341  7914  7909  1602  8527  9112  2828
2829
     5360  4922  4427  459   9254  1278  7587  10010 5614  5712  6699
1041
     6085  1953  5422  1038  1533  8211  5116  4737  7492  9123  1237
3782
     5218  8775  8058  7078  9592  1095  9142  325   368   4520  6553
5378
表2(续)
      6134  8299  1309  2520  7542  9412  7800  6452  5355  3976  9725
7636
      7309    525 9834  4503  5283   870  5203
 122：5149  8274  1269  5690  5410  6173  3556  3468  4438  1208  5663
545
      7791    167 8526  3554  3890  5517  2633  5799  7332  3855
 123：6613  2955  6069  4371  9778  2358  6094  6089  6526  8516  5547
6071
      3313  6112  4034  2957  2978  5525  5509  5531  5528  5561  5607
5578
      5565  5581  5579  5526  5533  8275  9649  3706  6832  6350  5088
1150
      1439  5916  5281  2689  4704  6036  7641  3679  9051  6455  6836
861
      3525  9267   551  1047  9231  6871  6525  6523  3862  6179  7206
2549
      3992   178  3349  2003  9082  2354  3011  3013  6910  9731  555
1033
      8344  6990  7131  5177  8976  9092  1601  1598  1608  8048  8418
3451
      7002  4523  8340  5474  2917  7702  4505  7759  6992  6991  4145
9590
      9714  3423  9656  7573  3644   350  6892  6889   403   423  9597
10004
      8938  1952  9076  2084  3308   849  8160  1899  2114  8649  3702
4565
      6473  4071  5833  2038  3309  9303  3587  3472  9061  6685   194
646
      6121  5506  2376  9559  2417  3376  3360  1834  9759  2899  2901
6629
      5631  7670  8613  2962  9803  2743  2363  6848  9146  8108  8882
1697
      9779  3960  9830  4022  7740  4346  4615  3012  2583   803  5888
8151
      1450  8428  6588  5909  3963  6185  5814  1539   274  3076  10003
10005
      1221  1737  4288  6470  8686  2601  6469  5276  2937  6200  5380
172
      7523  9242  1590   266   973  7743  1032  9357  5552  9716  3259
6628
      3263  4120  3258  2581  3260  4555  5197  1295  7028  5131  9343
8641
      5953  2790  4533  3684  6756  8425  7620  9044  4484  4442  6589
7205
      2544  5999  5110  7690  3707  6257  8989  5519  4451  9747  4199
8386
      3597  3792  4276   797  2990  3048  5601   359  7576  1657  3740
8176
      9455   612   694  7192  9414  7194   254   581  2378  2380  1235
7600
      1272  3830  6792  5403  3464  3261  6428  8573  8600  9589  5505
5333
      2150  9945   536  8952  6290  8741  9349  7929  6110  6101  6554
6551
      7005  6556  2195  2194  9934  6053  5550  6091  6097  1294  4304
6796
      5401  3015  3974  9921  2789  8083  8082  6710  8905  7514   576
3319
表2(续)
      5564　4590　9666　 515　6745　5138　5139　2130　2645　6228　3562
8634
　　　9178　6536  4361  3337  9699  8491  7757  4905  3257  7611  6743
9014
　　　3439  6120  1783  1850  8136  4851   661   800  6654  2866  1759
7551
　　　2690  4141  6430   654   527  7495  5412  8061  2455  8022  4435
4155
　　　1201  7714  5423  7689  7485  7469  7473  7463  7348  5512   575
5548
　　　7021  6070  5585  9708  3749
 124：7858  8376  2905  7510  6066  7834   594  9979  7103  3214  2892
4020
 125：1965  1299  9851  8509  7263  1130  8178  2737  8180  3769  8759
9805
　　　1981  9059  8530  1473  9765  4269  4292  1925  7809  4290  9845
314
　　　7374  　231 4410  7211  4323  7033  6382  6485  4356  7873  9342
5560
　　　5071　3031  305   8559   247  1595  5021  4580  1249  8659  3872
6504
　　　5803  5906  8242  4525  8657  8070  598   5089   283  2903  2720
7170
　　　2274  8111  2729  7063  1409  2646  5774  5385  2760  5834  8876
7082
　　　3856  4842  5034  1645  7857  1744  9722  3900  2635  3326  6930
444
　　　5800  4668  3489  3366  3363  6548  1067  6568  3580  9755   462
1517
　　　3282  5254  7231  5879  5640  9730  8264  6866  8271  8219  8982
8518
　　　7330  5152  6006   362  6587  3857  8189  1021  4928  6146  7366
1017
　　　4985  6287   269  9285  8103  6140  8900  8461  8042  7513  1530
8908
　　　9187  7436  5320  7656  1494  1750  9428  8182  5863  1567  4944
9088
　　　4138  3394  3493  2812  5989  8558  2028  7289  1771  1452  9932
5027
　　　5309  2398  5097  8009   201  2519  8192  5965  8374  8356  6799
7965
　　　6539  3530  4701   563  8194  7382   410  5432  2428   265  5697
6229
　　　 331  2681  8269  4012  7866  7729  1913  2904  4157  3917
 126：5740   333  3685  6489  6369  4339  7931  3455   392  7908  5602
1268
　　　5664  6024  5557  2057  1003  8161  4098  8684  6875  9916  6781
936
　　　9710  7735  5417  7273   887  5812
 127：5856  1578  7377  3621  5827  3671  2110  9481  4233  1104  8163
9262
　　　4971  2839  3787  5613  3078  2259  8139  5793  3459  5929  2801
2151
　　　8722  3469  2286  3100  5637  6002  1085  7774  3391  1250  5804
1639
　　　 512   660  4885  7730  3038  9471  9992  8257  2829  937  2080
2108
　　　8747  7188  1529  5986  8046  6381  1331  2403   209  1777  8557
1506
表2(续)
　　　2579  8482  3343  2553   565  3342  3401  6464  5117  8449  3528
7042
　　　1092  4056  4605  3546  5074  4182  6213  3686  8439  7265  9894
2923
　　　4307  3005  7934   287  3138  6664  6013  4832  4468  3283  6236
9800
　　　7555  7668  2445  8349  8224  8032  6172  7963  7938  7860  7910
7940
　　　7907  7451  8523  7548  8917  4291  4210  5628  7633  8801  2658
5498
　　　6844  9034   992  6878   638  5185  3614  3001  2430  5371  2297
3099
　　　3329  2769  5307   818  5470  1002  3141  1414  9309  8679  8656
5433
　　　8459  4544  7977  2596  4036  6311  8615  7375  4284  7400  2159
1895
　　　6521  4711  1896  2666  9809  1537  3569  6829  6890  8347  5244
2023
　　　9596  210   8696  3632  3636  7413  7411  3341  5996  9252  6570
6106
　　　2550   827  9397  7998  5434  6501   421  6820  4792  8862  2587
1686
　　　5844  8143  2650  9719  2952  7764   7310 7350  4419  7343  4953
2281
　　　6922   998   732  4907  3656  3861   7773 1362  540   9872  4889
4717
　　　5358  4967  3442  9026  1186  1545   3768 3848  397   1733  7778
3230
　　　3231  2907  5201  4679  4662  2132   7944 9893  9351  9176  7697
4264
　　　4814  2142  7990  9856  9426  9361   4582 1406  2310  8164  8601
8738
　　　3162  3793  5143  9494  8400  2046   2045 4978  5677  7136  2474
5014
　　　5007  5017  5011  5639  3867  5691   5713 4168  4184  2860  1543
9881
　　　2070  8772  9552  6943  577   8594   2433 2435  6495  9544  4137
1833
　　　9946  6276  6143  6141  5825  6671   5735 8848  7146  7144  4623
5738
　　　184   9876  7225  9462  9460  9465   5910 2383  4800  5870  5869
273
　　　9875  9873  222   9840  4786  981    3797 1770  4201  7394  3143
9906
　　　1220  6221  4682  4697  6465  7159   6643 3631  3660  3640  3639
3638
　　　3635  3154  3650  3082  9499  1198   8043 8063  9598  7101  1871
1197
　　　4535  6057  7181  5995  6202  934    5123 5106  5576  5128  6688
6678
　　　4536  952   3461  5374  6774  99442  1230 6306  3483  5047  5450
4652
　　　9013  4964  7678  5914  3945  5931   5883 3330  584   7843  7842
7848
　　　7868  7847  4173  8628  8577  8303  8804  4589
 128：5856  1578  7377  3621  5827  3671  6513  2110  9481  4233  1104
　　　8163
　　　9262  4971  2839  3787  5613  3078  2259  8139  5793  3459  5929
2801
表2(续)
      2151  8722  3469  2286  3100  5637  6002  1085  7774  3391  1250
5804
      1639  512    660  4885  7730  3038  9471  9992  825   7282  9937
2080
      2108  8747  7188  1529  5986  8046  6381  1331  2403  209   1777
8557
      1506  2579  8482  3343  2553  565   3342  3401  3108  8272  3784
4267
      6464  5117  8449  3528  7042  1092  4056  4605  3546  5074  4182
6213
      3686  8439  7265  9894  2923  4307  3005  7934   287  3138  6664
6013
      4832  4468  3283  6236  9800  7555  7668  2445  8349  8224  8032
6172
      2670  7963  7938  7860  7910  7940  7907  7451  8523  7548  8917
4291
      4210  5628  7633  8801  2658  5498  6844  9034  992   6878  638
5185
      3614  3001  2430  5371  2297  3099  3329  2769  5307  8420  818
5470
      1002  3141  1414  9309  8679  8656  5433  8459  4544  7977  2596
4036
      6311  8615  7375  4284  7400  2159  1895  6521  4711  1896  2666
9809
      1537  3569  6829  6890  8347  5244  2023  9596   210  8696  3632
3636
      7413  7411  3341  5996  9252  6570  6106  2550  827   9397  7998
5434
      6501  421   6820  4792  8862  2587  1686  5844  8143  2650  9719
2952
      7764  7310  7350  4419  7343  4953  2281  6922  998    732  7563
4907
      3656  3861  7773  1362  540   9872  4889  4717  5358  4967  3442
9026
      1186  1545  3768  3848  397   1733  7778  3230  3231  2907  5201
4679
      4662  2132  7944  9893  9351  9176  7697  4264  4814  2142  7990
9856
      9426  9361  4582  1406  2310  8164  8601  8738  3162  3793  5143
9494
      8400  2046  2045  4978  5677  7136  2474  5014  5007  5017  5011
5639
      3867  5691  5713  4168  4184  2860  1543  9881  2070  8772  9552
6943
      577   8594  2433  2435  6495  9544  4137  1833  9946  6276  6143
6141
      251   5336  5825  6671  5735  8848  7146  7144  4623  5738   184
9876
      7225  9462  9460  9465  5910  2383  4800  5870  5869   273  9875
9873
      222   9840  4786  981   3797  1770  4201  7394  3143  9906  1220
6221
      4682  4697  6465  5600  7159  6643  3631  3660  3640  3639  3638
3635
      3154  3650  3082  9499  1198  8043  8063  9598  7101  1871  1197
4535
      6057  7181  5995  6202  934   5123  5106  5576  5128  4166  6688
6678
表2(续)
      4536  952  9386  3367  3461  5374  6774  9942  1230  6306  3483
5047
      5450  4652 9013  4964  7678  5924  3945  5931  5883  3330   584
7843
      7842  7848 7868  7847  4173  8628  8577  8303  8804  4589
 129：6283   2094 3062  2271  6254  9056  4151  3773  1819  5768  1674
7328
      5634   9770 3114  9282  6309  9704   845  5395  7738  5398  1796
5098
      1232  5972
 130：7784  5453 9584  6859  9085  5136  9525  2342  2327  2326  8227
3072
      6540  5884 9046  3774  9221  8368  4647  6152  6616  4140  5610
267
      1654  9864 3834  9194  5858  3771  2074  3054   970  1835  1677
7614
      6954  3403 6800  1641  7395  5591  3386  9950  8611   856  1858
1520
      473   8885 6011  9711  9825  9859  3111  5119  1429  1523  3561
1945
      9938  5482 3348  2385  6226  3194  3839  9243  3008  4170  6662
1892
      2971  766  6573   409  5075  4890  9646  5026  9188   942   940
7917
      938   7915 6978  1566  4359  5107  6149  1921  9205   558  2593
9767
      3663  3485 4395  5451  1327  3271   725   793  4006   236  9465
3590
      858   4660 8466  5760  453   2677  3069  3964  3914  4301  3064
3301
      7884  2946 9593  1301  1216  9620  2994  2405  3203  6375  2147
4373
      9796  8212 4251  5659  3187  9170  2662  2694 5304   4050  4069
4047
      6861  9115 2858  481   41i9  7615  7762 10016 6239    337   338
8599
      8597  929  927   924   363   7717   204  5991 3852   6318  1176
1179
      2056  2441 8533  628   2053  8174  5619  1515 5080  7386  6250
7883
      2826  5083 1164  9070  1162  1160  1438  1436 913   3235  596
3680
      4588  4570 6183  6184  8547  367   1416  380  1891  3924  5262
5013
     4687   5467 8364  7479  6919  5452  6845  2870 2993  3956  4175
1153
     7594   1878 2488  9668  3669  9251  5263  7422 8183  5174  6764
8181
      404   2913 6297   604   812  8190  9618  3480 3278  2591  5960
1324
      7168  7056 8115  5520  9207  8128   218  1127 3477  3670  3125
8175
      7877  1752 2733  1141  4208  4347   1178 1655 4864  9388  7195
1831
      7319  2809 9983  8576  8209  6211   5985 7193 7172  3476  6946
8553
      8127   336 9078  7210  7452  842    62967 259 8099   262  7208
5730
表2(续)
       3224   5151   9273   3752  2509  4744  9275  8065  3772  8089  1647
761
       393    9365   3811   2436  2699  9248  2055  5846  4705  4287  1594
2863
       4479   6327   416    3939  1110  8556  8259  1688  3628  1083  9741
6541
       4025   4046   4026   815   2691  8354  2970  2976  8363  5782  6532
6520
       7608   3545   6249  10017  8969  170   7412  2402  1726  2886  6760
2893
       8941   8926   1099   8899  5043  8842  9093  9097  9094  3237  997
5732
       6302   4820   483    599   3492  485   9120  4799  5221  6286  3496
9084
       5010   8262   3704   5443  4626  583   9310  4048  8575  3981  3979
7967
       9931   8221    203    193   9874  470  4105  864   6260  2222   791
2909
       2949   8495    479   5872   216   3623 3236  9418  3607  4308  7455
3010
       9192   1583   9348   5873   796   9882 8903  2724  9328  3934  3514
7540
       6894   8289  10013   8967   7832  9868 5251  8336  6242  6691  6785
2443
       1097   7889   7093   6508   4232  2438 2247  9065  6246  6168  6186
621
       1149   9707   2641   3609   2735  7025 420   1824  7038  9975  5137
8767
       7252   6126   3695   478    4249  9959 6269  8608  5706  951   3884
316
       6858   4028   4644   7046   1823  1357 6802  7127  9616  4121  3047
7634
       1870   302    4118   2842   652   6907 9815  9812  3365  9764  4844
4849
       4847   4846   2929   6567   8044  7445 2818  8838  8841  7861  8986
5665
       8545   9143   6751   6789   9944
  131：5504   7201   9080   4524   6201  3840 4320  2523  2135  7287  7299
9617
       6355   4519   632    4321   7887  8869 366   8507  2280  8201  3170
697
       696    7153   6491   8338   8389  8397 8381  8377  8380  8358  8393
8391
       8394   8313   8352   8415   8317  8334 8333  8361  8314  8315  8332
8335
       8375   5831   5829   7224   1326  8514  946  7226  2939  327   649
1493
       3809   4297   4080   2845   1795  5346 6667   309  1854  1140  7837
2545
       7199   1133   1129   1151   1115  1146 1985  1959  1957  1983  3307
8045
       3741   3761   3758   6087   9379  4826 6544  675   538   8707  5857
9832
       8154   8796   1629   5286   8321  7217 824   2711  9035  9036  3030
975
       7674   6483   7661   8936   1875  5973 4043  1380  1475  4930  2958
7261
       1499   3014   1118   4597   9776  4045 9394  1075  5052  3239  6900
4517
表2(续)
       7736  1105  9534  2745  1713  8191  6041  1894  9169  2207  9058
9057
       7606  9010  6901  6139  8120  7458  1100  8906  6027  419   4516
1121
       1840  5685  742   3398  4315  7584  5975  7854  6034  580   672
3555
       7613  5650  1836  8040  3428  8666  2077  1708  437   4402  3169
7183
       6217  6054  7882  665   3473  2638  2784  674   8719  5127  7087
5042
       9757  8027  395   2919  511   6695  7456  560   3549  8964  286
3470
       9697  8561  2708  6753  9472  2611  7750  7001  342   3233  3234
5990
       4867  5918  321   9956  2156  5769  6864  320   6627  7213  7184
9216
       544   4092  5302  6529  1682  1907  4691  5608  1063  7337  2808
9500
       1975  9163  2361  4923  6408  6445  7405  1974  5389  9491  3969
6957
       8378  3026  3751  5198  8427  8438  8584  8587  5030  5340  9031
5970
       3246  5935  5841  7679  391   4480  451   4813  6214  3457  8155
8236
       9366  710   8960  3718  4721  7862  3936  8627  1552  3825  1633
6948
       4863  7763  8131  5038  335   6404  1109  253   5375  991   1827
1503
       2479  2503  6313  4724  4816  6673  9553  2085  9222  9687  2686
3888
       5409  2127  5964  9572  681   3989  6809  9602  5922  9591  2756
2758
       6689  8560  1663  5987  4502  5912  8708  8737  8713  1575  6507
4057
       2862  469   1869  7285  8781  7390  1437  3602  9071  9713  2412
2922
       1209  5744  5692  1026  9522  5688  3097  9739  9900  7071  7359
7822
       4049  8760   349  690   2499  2502  2505  2498  1337  2791  5897
5606
       4991  3385   3598 9168  5609  9723  9452  5114  1422  542   9513
1289
       3327  6439   1584 8412  4773  1330  5478  8055  9066  3902  8510
1970
       3043  422    425  4014  7799  6230  2105  6258  6010  9413  8660
2628
       6270  6876   4757 1582  1581  5586  9313  2411  3471  2774  9575
4886
       4883  4884   1215 785   4052  9911  8024  9256  3819  2592  4122
4055
       2104  8273   8711 3776  4609  5894  5414  5418  5415  5642   996
5943
       6109  4051   4053 8715  8689  8709  8717  8692  8688  5287  2817
9609
       7733  9086   6128 4075  7772  6277  6273  4787  3051  8442  8712
4124
       2000  4725   1483 9000  9477  2674   278  7578  3218  1900  1350
6241
表2(续)
       1920  6638  5305  6621  9702  4686  7782  6159  7362  5339  1623
8116
       1283  7783  3123  3850  5188  8534  6749  6062  7680  4280  6471
5968
       5335  9529  7785  6059  4403  9104  1212  9615  6740  3591  2050
2501
       802   9315  8981  1486  9161  2203  821   6989  8360  5767  501
5220
       5243  5219  1306  2318  1308  15669 3903  7296  1023  5411  7922
10000
       8193  5033  7826  8112  1031  480   9434  8638  2548  6644  6659
926
       1281  3863  6885  5018  4324  8240  5645  1451  1428  9255  5020
4604
       4477  2089  4986  5016  4449  4981  4472  4466  7926  3449  7930
5796
       7352  8479  4487  8945  8107  3619  1039  5716  943   5762  4636
6158
       553   6272  3897  8815  1257  974   2294  2276  804   846   2807
7643
       2248  9745  506   6040  557   2227  6288  6293  4240  257   8598
6115
       7125  4527  7301  5367  5048  2504  3901  5615  6160  7427  9645
  132：7833  5889  3007  8109  5915  2022  6345  3652  3805  4242  6959
5248
       6384  1580  8887  6294  1739  9842  6700  3666  2480  3620  7472
9016
       9795   276  1758  5135  1256  3574  7061  4918  7154  1916  2076
9159
       3416   4625 1865  1670  9896  6240  8603  8205  6782  8883   877
7470
       7190
  133：3767   1936 390   6879  5949  8320  4341  1797  9923  5720  7626
5638
       8294   5250 5783  4649  3513  3058   519  7034  4635  7649  7684
4411
       7300   4860 7598  9786  3415  4337  4344  7610  3729  4393  7627
1303
       9821   5057 520   6928  3675  494   8993  2837  7701  2841  8011
6082
       6341   495  7302  7878  8508  7303  9857  4723  3748  5707  6773
7432
       918    3886 8446  2456  7372  1768  3467  6125  5805  4521  2163
2258
       9581   4275 4278  4277  6407  5172  4628  2564  4139  2574
  134：9820   3178 3325  9629  4845  7949  7988  6657  1236  4592  310
4063
       1123   2925 2783  7441  3361  4193  7477  4906  2980  4000
  135：4310   4445 1549  1551  3520  6747  1048  9936  8536  4394  3173
8330
       2117   6095 9293  4238  4200  4617  3566  9898  2444
  136：7669   3429 8564  5459  5927  2547  8365  5562  7856
  137：7203   1791 7073  4234  972   3070  439   9332  8118  4541  3482
648
       537    5289 5540  490   702   664   1008  6187  7074  6233  6163
4384
       8150   5035 1644  4408  6682  3350  8610  3596  230   3531  3948
898
表2(续)
       219  1056  4256  8367  3221  4110  4671  5460  2049  9396  2900
2969
       9748 389   9212  1864  5652  2316  3193  8423  7844  243   7890
1403
       2437 6939  332   5108  1139  3836  4791  3688  3868  5811  9804
1305
       7891 2082  8288  5255  7561  8519  5295  7387  5694  5274  9863
6912
       8622 3682  5241  8843  9768  4465  5859  1838  5905  1199  524
2161
       2578 9604  1383  9340  2346  616   1159  7597  8811  4810  945
968
       5461 5898  1202  5573  8859  3581  6206  6103  4456  3135  1772
2420
       1542 9260  6174  562   1605  1656  6955  6926  6358  441   9249
2800
       8387 3191  334   2847  6264  872   687   8724  8761  549   567
582
       507  5130  8455  3399  4068  2609  6331  5656  4441  2510  2332
3481
       4081 9524  6696  6218  4369  4945  4309  4977  405   6983  6870
7927
       4526 2262  7867  4653  2920  5839  2357  3696  2951  3527  3462
1263
       1881 5247  9669  6111  9269  6592  4622  5763  8052  4584  5303
9133
       9742 1799  5298  5348  2353  408   6603  1498  4948  1468  6569
4552
       4474 6215  9167  8635  3889  3190  6852  6001  2924  6593  1769
9650
       8304 5072  3090  6124  6966  6156  5792  7585  9548  4237  4190
6153
       7245 9753  4877  3298  3746  1328  6557  8823  8653  2152    353
424
       5626 9311  7214  4534  4537  8243  2229  1536  1559  3540    3539
2772
       294  1511  1204  9644  1227  1332  6205  8680  6524  9632    2875
1173
       7336 9927  8110  3755  9682  7367  8630  2454  3973  5134    3040
8782
       8372 199   1015  2599  6284  2131  9652  9977  4718  2747    2315
1977
       4229 5568  2490  4404  3624  3794  1205  6459  5436  5438    3000
2998
       223  1445  2176  3648  3647  614   9919  3503  1333  4230    285
6261
       2409 4607  8222  3883  8049  9508  7003  3315  8218  5212    1954
7696
       7141 6117  3021  5587  3606  7591  1054  3882  9819  548     2096
4432
       2507 2406  4146  3563  603   7104  9676  3832  5518  4567    1994
7175
       3096 6776  7786  6338  186   8520  5752  630   8740  5658    5674
2763
       8877 5701  6518  1260  8398  8918  7622  8077  2861  9735    8643
5686
       6827 5648  4664  950   1885  9164   668   528   656  6068     9043
8808
表2(续)
       4152  8817  4150  5780  5776  9902  5830  5073  324  5617  5625
7408
       5329  6642  318   7647  4115
 138： 8968  2512  9223  8511  3726  6931  2463  9346  570  2598  2374
2120
       6914  6119  944   6394  1818  7353  9429  747   3887 9917  9933
4752
       2216  1923  9626  493   2928  3665  4875  4912  6403 6405  6433
8937
       4874  9507  1293  1302  4892  6196  7019  2623  2620 9448  9929
3532
       198   7447  1262  9816  2942  214   5895  8132  6833 2470  6044
1360
       3864  3354  5078  3712  3622  2243  7841  7704  7058 8513  4248
5756
       1329  1650  915   3098  4511  4507  6837  7793  8451 8617  4070
7852
       4387  2840  9705  7098  9546  9283  7821  9334  1355 8515  4515
3849
       1103  4638  7596  1101  6492  7805  4585  2129  3813 3165  6012
2459
       4855  3219  4853  7564  4163  2896  6630
 139： 3997  2703  1918  5761  6918  6142  9908  5187  2508
 140： 9075  587   5843  3210  5471  8034  8884  3547  8432 5657  433
3460
       5473  789   471   3122  7813  7075  3837  3743  8256 348   3077
5593
       5832  987   3146  9721  5493  5966  5508  2938  8924 7628  2462
6274
        719 8951   9226  7284  2916  4116  8624  4496  2668 9288  1814
5032
        893 5334   3572  6043  1404  6379  5861  9837  8946 1512  2796
2246
       1405 9622   7329  4715  1148  4231  4695  5190  4903 7517  1440
3444
       9782 8850   2260  9801  3324  6632  2884  9126  3044 2991  3786
8888
       7132 3383   9017  8248  1660  7652  3827  8250  7599 5788  2798
8406
       3056 2529   8973  1049  1082  6220  6984  9090  4858 8488  484
6596
       1558 7383   8535  6808  9568  6266   168   406  1425 5748  6969
6702
       9912 3294   9324  3291  6801  9081  1476  5724  8405 372   4330
5141
       3067 7461   6014  3410  4643  4606  2961  6780  414  3074  4632
6130
       1316 1319   2004  3438  2134  9758  1126  3244  3215 7234  722
1394
       2679 7238   7007  4659  1903  7605  5015  9769  9693 6982  2630
6050
       1465 244    4085  1276  4159  5963  9264  2927  6093 8298  3359
8697
       8399 1481   4594  5950  5882  5282  6872  2524  9738 9706  6151
4349
       498  4669   9149  5901  9185  7875   169   183  6175 4512  8771
174
       6208 768    8720  1460  770   4495  4692   724   901 6744  6651
7901
表2(续)
     1649  7047  5090  8755  5784  5815  9826  5681  1076  7590  1185
7406
     3024  8988  7169  4476  2458  561   241   259   1191  7004  1219
6720
     5056  7916  5849  2343  2984  6652  2915  261   4127  1948  6310
8213
     7655  6289  6015  5992  713   737   9023  1906  3484  3994  4180
6042
     4627  4179  6063  1342  4478  1760  735   7308  1211  211   2016
3413
     2761  8403  9671  3223  2610  6373  2912  3345  6189  373   3613
430
     7399  7985  4778  509   3557  3379  5229  629   3927  7993  8030
7991
     505   9441  8091  635   8392  3382  9291  9299  2607  712   4192
7064
     4220  5454  5175  8836  7428  1630  2531  4634  7795  3052  1659
532
     8922  6060  8806  1643  1046  6432  530   5257  6181  5009  1144
173
     2348  7322  7083  9654  255   2956  7522  9545  9523  3395  3709
236
     4405   187  4154  2983  3573  5555  9760  7294  9331  2109  2167
1280
     4396  1044  3149  4750  4896  2106  3020  6679  6549  7288  8013
9862
     3450  1045  6386  9884  896   7380  3022  5932  492   3526  9847
7879
     5847  2718  9458  4283  4104  5361  8282  6752  1668  9638  7885
3930
     863   7550  4244  5787  2543  2906  4959  4952  418   4994  6927
5582
     4076  9962  2092  8524  3145  4431  2557  5249  8225  6443  9667
4131
     2416  8413  3643  4181  7952  9690  5499  2154  2155  2177  2061
8834
     2175  2749  523   1716  8963  3110  3009  5753  4947  9619  3694
7995
     9473  9431  1492  7403  4539  623   9195  2989  8057  1634  5530
3661
     4674  8260  6635  4058  3824  6199  5809  3436  2191  9530  9501
1972
     2813  6148  8444  1808  6021  7831  5292  3950  6999  6997  5133
6170
     5636  3521  2788  9752  9527  1910  6847  7134  4013  1102  4506
7666
     3334  5267  2644  3985   651  5046  4819  6263  9628  3518  3516
2113
     2098  7129  3412  3092  5544  6537  4415   841  1037   836  6545
9865
     9685  1632  9736  9510  6775  6136  3176   721  5911  3424  7246
5062
     3402  7541  4475  7969  8925   307  8929  8910  8913  8915  5176
440
      399  4558  1132  5824  8138  5406  8078   847  4706  2943  2722
9939
     8129  6474  9988  9994  6797  4455  4457  4454  1607   916   9574
5091
表2(续)
      9573  9416  6129  2974  9630  9904  8114  1131  1742  7897  5186
5618
      2362  2379   468  7173  6703  2170  9387  9362  9562  1646  5807
3814
      9186  6763  6268  2429   902  5140  4247   885  2652  6247  3161
3723
      6096  7818  6599  2688  7827  1622  6633  8485  6498  4882  5163
5076
      4563  5733  9810
141： 7726  7410  8023  8039  8037  6113  3318  7855  3370  7688  1661
4943
      5627  8955  8914  4862  1500  344   3426  5227  3502  293   9110
3083
      2887  9766  6856  1619  2546  6874  6190  5100  6923  4621  9470
8754
      9389  6441  6376  4422  9154   345    457 6292   571  1061  3909
4751
      2793  5101  4673  4878  8732  3491  6065  7011  7632  5390  8328
6022
       880  2123  2931  4044  6650  7789  2392  3478  2204  1188  4440
1993
      6419  5463  1704  1718  4102  6349   398  4776  8793  1919  7221
8756
      1154  3192  1603  8648  2048  1692  1347  3073  9684  3212  8125
1563
      5012  2143  2731 10006  5240  4915  7389  1729  7639  6319   844
2263
      6343   891  3352   590  593   578    591  8035  6049  6731  7592
1145
      7686  9079  4699  5323  4303  1000   579   340  9696   539  7817
7814
       352  6724  1917  8987  3594  8858  8853  8855  1866  2559  5673
7130
 142：9538  6322  8216  2187  2190  2706  2702  8864  7631  5819  4946
5429
      1914  9292  4470  1705  2457  8384  7603  8655   376  1064  7518
5845
      2936  6683  9763  9153  7043  3846  5324  5162  4489  5848  6367
5696
      5854  2736  9284  6767  4015  4001  7119  7128  6819  6746  6637
8436
      3198  7283  2695   597  5092  4684  1789  8417  7187  643  7053
7671
      4633  4795  6275  3390  5246  4731
 143：9538   6322  7202   114  8216  2187  2190  2706  2702  8864  7631
      4188
      753   4191  8728  4002  3875  5819  8780  4946  5429  1914  9292
4470
      1705  2457  8384  7603  8655   376  7135  1064  1066  7518  6038
6924
      5845  3207  2936  6683  10011 9763  9153  7043  4569  1296  3846
5324
      5997  3321  5162  4489  9846  1282  8791  5848  6367 5696   5854
6828
      2736  9284  6767  4015  4001  7119  7128  6819  6746  6637  8436
3198
      9398  1094  7283  2695   597  5092   227  5082  4684  1789  3375
6456
表2(续)
      8602  2128  5736  1183    4672  6560   688   466  3789  2075  6517
726
      6083  2036  2533  4914     762  5115   4409  6251   704  1810  526
1665
      7997  2732  5462  7207    8475  8840   7215  1585  1862  3807  5428
1234
      8417  5801  6952  7120    7187   643   7053  7671  9298  4633  4795
6275
      3390  5246  4731
 144：7151  6340  8968  2512    9223  8511   6831  1411  8429  640   9838
8939
      4614  2313  8017  7853    3726  4136   7242  5908  4839  3629  5553
2463
      8002  685   2572  5679    5651  9641   5049  2397  6231  3777  9346
570
      2598  5766  4493  4464    1856  3171   4078  2374   633   615  3079
3519
      6914  6119  4782  8753    9483  1625   9549   944  6394  1818  7353
491
      9429  2995 10019  8167    5902  2890    636   9917 9933  4734  4779
493
      6410  3829  1821  2762    5900  7925   2780   627 6949  2928  9995
2157
      1988  7313  4921   9729   2461  4689   9543  3358 1857  4528 9514
9214
      3665  3506  2973   4875   3045  6374   6390  4895 6393  6392 8200
4665
      3446  4551  1111   6433   5790  2532   6707  8937 4894  7719 7722
7644
      6196  4546  7019   6334   4112  2693   5718  8868 8337  7105 8401
3479
      9883  5297  5826   5195   1694  1052   7624  8084 5368  1792 1809
5308
      5291  3604  6611   2470   4720  1363   1360  1366 2541  2540 2244
7448
      7845  5208  5228   5224   5362  5230   3448  7779 7781  9870 7776
4248
      2935  5756  4391   4378   9775  4390   1461  914  4939  6837 7793
8451
      9304  9302   922    718   4070  7852   1527  1526 8977  246   684
3865
      6547  1386   387   2223   1554  8322    252   249   248  2214 7084
4690
      328   6873  7325   2968   9025  8682   9533  6729 9375  1072 6897
4926
      7268  2344  6963   9907   4698  7342   949   5424 6033  1290 7577
297
      3515  8897  9306   2854   9019  6360   6487  2389 9203  7871 9321
377
      1683  8468  3397   4855   3219  4853   7825  8066 2391  2312 2364
2341
      2308  2336  2359   2355   2291  2309   8676  2334 8674  2338 2293
6361
      5880  4164  2896   6929   5179  4595   8031  1887 6630  5425 7499
1442
      7539  5770
 145：585   3920   765    759   2616  8355   4161  2637 7094  9183 4433
9037
表2(续)
      5612  7711   708  9981  1449    535   369 3735  3293  3266  3269
8463
      8467  8543   8464 3289  3286   3297  3287 3262  5702  5683  5698
7139
      1676  9405   9107 8749   779   4302  6597 6771  5571  7748  6790
5122
      8975  8959   6766 8978  8958   9114  7307 6807  8875  5118  8980
6787
      7247  6769   6530 5704  6823   5121  6786 8954   873  8636  3808
3804
      2021  8654   3510 3490  6003    413  2715 3140   589  7741  3717
7864
      4809  1615   1297 3474  2657   8486  1090 4379  3610  1681  7276
3538
      9250  5439   9541 6420  6446   6448  6453 1779  2759  4209  8839
5759
      6316  5079   9067 7346   965   5537  4924  932  4239  5440  4550
4553
      9891   728   6411 3757  1365    749  8359 4212  5384  5887  5885
7619
      5344  8695   4266 8762   895   5170  9300 4177  3407  3406  1658
4158
      39965 386    9435 3353  2967   7334  1571 9189  1662  9905  784
8069
      1679  4032   8480 1420  8470   2469  6970 3941 10007  1233  7595
1223
      3392  9479   5643 4657  5675   2843  6552 8891  733   1929  6409
4271
      1806  8106    906 5484  7989   1861  5345 3310  2776  6368  2838
8416
      5284  3760   9836 7972  7638   6223   760 8339   639   626  4576
7072
      6595  3817   5644 3801   500   8184  9664  182  3226  3544  2678
5693
      8861  428    9165 4156  8484   9539  275  279   280    730   736
739
      741   758    763  767   778    781   3505 5684  3264  2966  7474
1093
      7069  8585   5272 2654  2683   624   5465 5356  7266  5797  3536
1828
      547   1597   8870 6843 10022   8087  8540 2613  3377  9407  1980
4818
      5874  7036   1298 1335  2836   7790  3404 1182  3845  3785  8290
3075
      7048  6182   3791 4149  2282   6718  5538  679  9878  2857  8645
5464
      7964  1621   5456  477   476    475  2742 8088  8670  6713  9308
3421
      5326  5668   4641 9333  1369   1749  6883 4532   961  7152  6032
5703
      8658   774   9119 7953  3512   9537  3823 4365  8395  1780   488
2388
      3356  6398   7648 3878  3906   7124  7182 5189   746  2122   644
8448
      9888  8140   6672  217  4167   8812  6029 3543  4023  7409  8142
2473
      5200   772    546  1868 7354   6135  3651 9257  8149  1604  9928
3589
表2(续)
      1820  6020  4900  8814   963  2723  5479  5280  7755  1762   775
7059
       776  5842  6839  3690  6921  8787  4186  8301  3732  1119  1114
1715
      7142  7143   714  3780  9326  6442  5485  1407  6888  4871  3002
6383
      1161  7161  7157  7065  3783  8739  2979  4246  2649  3844  2647
2325
      2642   743   740   734   731   738  6590  6591  4561  8433  7535
8157
       346   499  9813   773  7165   780  8640  2945  2556   438  7219
7179
      4482  2856  2709  3962  5211  3292  3296  3300  3802  8102  9987
995
      4700  1720  8404  5786  3433  8639   454  7777  1004  1491  1490
5199
      969   982   2555  3984  1007   990  5359  9982   306  8565  8574
8570
      8551  7460  6248  8548  868   8546  8994  6342  6224  6145  6748
1028
      8067  7339  7140  1005  2536  2771  1006  7381  6324  4286  1013
985
       983   986   988  1012  1014  5904  6917  9390  8571  3799  9941
1435
      1184  1700  7836  6450  6415  3826  460   4702  1613  989   3627
7006
      3820  2775  2019  6031  3109  9844  1190  8286  2676  7249  8053
8050
      8021  5583  1288  9211  1388  9566  9567  8578  1194  5183  5441
5476
      9139  1941  7180  2347  7137  7145  3046  3434  2250   659  4654
5998
      4123  2044  7609  3431  4126  7018  9353  2424  8631   5621  716
3265
      1927  4113  5029  2741  3179  1255  1258  1259  4029   1699 1680
4579
      1701  4581  1678  4578  6472  5994  5755  5840  9542    620  967
8297
      8661  2254  2618  3734   388  1999  6815  6462  3737   3738 5682
 146：7116  5816  2975  2710  7572  5242  8569
 147：9980  8517  5865  3276  1782  5877  3378  2835  6460   7031 637
7150
      5976  5053  8379  6853  5054  6835  2396  2400 10014   8794 2777
3049
      3065  4260  1323  1393  3229  4514   518  6979  2478   4572 7815
8710
      8714  2447  1880  1877  9531  6131  2371  9692  4518   7212 7070
8383
      2539   447  4509  2757  8254  4486  1886  8886   647   3605 1340
4340
      4352  2450  9960  9961  9984  5974  3654  2277  3683   4258 7625
7629
      7807  1667  5942  4108  4951  7663  4817  9558  1497   9335 1922
2552
       315  5475  1702  8621  1181  4759  6019   412  3885   6535 9659
8860
      1138  3205  3227  3507  7092  2746  7090  8214  8238   1170 7996
1169
表2(续)
      2580  4143    700  2066  5653  6377  9985  8119  8133  3999  8846
9385
      1080  9220   7323  8985   611  9087  4272  4289  9437  9871  7731
1640
      6396  5112   6732   308  6772  2651  6072  6882  6884  6840  1243
4194
      8085  6138   5719  7574  9528  7823  6291  5169  6865  3858  9839
7673
      5764  8979   3419  9556  4316  5574  9235  7604  6645  7218  7992
923
      7314  7316   5655  2602  2600  1222  1226  9024  1998  8625  2107
9020
      9749  9033   9750  9030  8706  8220  3106  3838  2032  5349  4566
6025
      4658  4677   9841  8773  6626  8774  5666  5661  5458  6693  3788
5620
      5178  6017   6018  2528  2525  226   888   799   2054  4027  4030
9848
      4545  1071   5285  6911  1565  1568  3943  4377  5487  2125  9897
6666
      9709   771   7870  5851  3208  8090   810  1624  8292  9433  3388
3387
       467  2381   5050  1693  5019  1695  1698  1001  2950  1016  7419
4009
      8816   941   3750  7912  5077  196   2275  5837  5836   311  7444
4898
      9271  7544   7546  7570  4976  3166  5924  4603  3955  2015  1997
4708
      8402  7880   3273   905  7113  6305  683   8306  839    272  8308
7888
      4510  9798   2895  2832  2996  9727  6188   250   228   9569 6665
2669
      3905  3967   3983  7320  7999  8000  6004   5158  6444  5159 2911
2908
      4616  5890   9068  2210  3841  8458  3611    517  3630  3617 3634
9484
      3248  2410   9577  3637  3616  3612  296    6502   232  3745 6421
7737
      1535  1728   4293  6636  4642  2481  295    8618  7665  5500 6092
6417
      9793  1756   1107  8880  7849  4355  2551   6728  6727  6725 5717
1618
      6869  1735   2189  8582   431  6104  2137   4753   300  7068 4364
5925
      7582  5337   8409  3270  7438  2020  5293   6300  6132  6898 6348
6344
      6915  6364   6988  6944  6962  6402  6389   6896  6935  6431 6895
7039
      6164  6960   6933  7037  6424  6363  7012   2698  7035  7054 7062
2625
      8662  8725   2242  8550  2240  2235  8721   2622  2306  8620 8694
8718
      2211  2185   2181  1669  2328  2288  8665   8698  8544  8691 2186
2307
      2302  6323   2283  2261  8612  2269  2329   8588  8614  2303 8572
8592
      2273  8668   2375  8563  8619  8566  2266   7707  7198  2415 8663
7016
表2(续)
      7651  8590  7653  2413  2352  8644  7010  2981  6940  7029  6908
6370
      6303  2330  2408  2350  6406  6964  6758  8583  6307  6899  7586
6942
      5539  5516  5556  5542  5472  5535  8947  5497  7057  6987  7008
7617
      7553  7032  6985  541   6058  6084  8637  6965  9469  7236  6698
1730
      9006  3880  5551  1508  6825  595   3061  3766  1241  4738  3338
9162
      2738  2754  2792  2755  8261  9240  8014  3333  3160  2615  6154
7902
      1851  1638  6482  5095  2179  4637  7811  7808  9636  7191  7650
2537
      5006
 148：9807  9021  3422  2554  9217  1648  8121  7920  3711  4189  445
8186
      9777  5773  5629  8481  7331  9861  358   5468  2202  5988  3247
6055
      4619   474  4670
 149：5381  9028  2279   884  4610  8904  4254  5875  6779  4755  8911
5791
      5808  8596  5957  6105  7423  9570  6777  3703  6770  9316  9694
6778
      1800  3633  2725  1518  2728  8293   197  7515  6222   817  5934
3432
      4228   497  9852  9532  9797  2585  9286  4549  2707  6026  7816
7886
      9885  8531  7941  6505  5939  8407  7918  9261  5926  4508  5980
2753
      4600  6329  4072   482  3320  1189  6715  6733  4651  4185  6207
4328
      4305  7347  7753  3966  7961  4768  6708  6614  809   8319  8165
1612
      4463  2522  6308  9784  3982  7865  1315  9193  4380  5448  9717
1962
      2714  2820  3593  6916  5746  1143  6972  8371  5751  5306  1696
6855
      1022  2422  8196  6854  1087  7228  4448  5899  2617  2888  8141
229
      2851  1359  6649  7079  9751  9877  8961  8311  6617  556   1951
3744
      1307  9445  6692  2039  188   4412  6543  2640  4522  1318  8539
8579
      5589  6447  3908  5896  6572  9171  7178  9244  1271  9817  9266
7196
      7122  7937  2744  9623  3164  1855  3222  5747  3731  8388  631
1245
      4663  3199  8554  9111  2314  2031  6332  1664  1672  8062  9272
4562
      1229  1443  850   5294  1908  2034  3937  1627  9459  2172  3699
2324
      2220  9564  1596  6052  7728  3284  4062  4060  4351  3833  3795
5442
      5446  8168  9551  2627  9679  6542  2567  8609  9122  6380  7657
3272
      8965  4079  5096  9540  5633  4911  5173  3094  1532  1748  2145
6278
表2(续)
      3256  4148  7431  3922  3919  5419  5331  5059  1467  921  7229
4285
      2140  2571  573    994  3993  6950  1469  3500  2877  5376 7404
6849
      8018  5094  1374  4042  4962  1459  1463  4601  9948  610  4064
379
      2475  2960  6166  8246  7298  5379  9417  7830  9137  5938 5923
4827
      5937  4780  9811  7357  5234  8731  7904  258   4100  7487 233
1079
      8789  8798  607   2673  2477  9419  3588  2672  6167  6245 7975
5342
      5322  1030  9660   917  2188  3645  2878  3625  6803   653 4021
2136
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5941
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 150：6947  9930 8552  4707   600  458   9423  3655  2834  5726 3667
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1010
      1924  6440  9247  7839  4961  6973  7163  7602  4129  574  3851
6285
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 151：2606  2063  2060  496   39461 0020  7076  2024  5495  6475 9700
 152：9658  9420  3779  6609  3006  2471  3567  4983  98    979  3486
5549
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8854
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 153：9658  9420  3779  6609  3006  2471  3567  4983  3486    98   979
5549
      434   35651 0008  8348  5728  8302  8033  6705  8244  9642 6255
 154：9424  4676  2340  5445  8252  8604  8158  6499  3027  1765 10009
2963
      4716  5352  5351  5277  6850  7155  4678  8208  8329  6993 2100
9833
      2421  9791  7936  7900  9072  9799  4367  6826  6514  4091 4090
2751
      4093  3033  9312  9554  6607  4421  1703  4418  1817  7022 4357
4059
      9296  9910  3071  2940  1860  7771  402   2073  9498   928 1909
9653
      9497  2696  8498  3036  2414  4777  3899  6192  9909  3770 4485
2467
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2418
      6981  7274  5184  5081  1671  9295  3599  1020  4224  5554 5572
5570
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 155：9424  4676  2340  5445  8252  8604  8158  6499  3027  1765 6510
3427
      10009 2963  4716  5352  5351  5277  6850  7155  4678  8208 8329
6993
      2100  9833  6994  9657  6996  9854  3668  8199  5365  7802 9029
2421
      9791  7936  7900  9072  9799  4367  6826  6514  4091  4090 2751
4093
表2(续)
      3033  9312  9554  6607  4421  1703  4418  1817  7022  4357  4059
9296
      9910  3071  2940  1860  2684  782   9276  7425  9991  2492  1884
2794
      8529  5265  8007  7771   402  3842  2073  9498  928   1909  9653
9497
      2696  8498  3036  2414  4777  3899  6192  9909  3770  4485  2467
2419
      9451  2712  837   8434  2138  6351  9108  4836  5481  2124  2418
6981
      7274  5184  5081  1714  3228  2139  6846  7947  2977  5641  1671
9295
      3599  1020  4224  5554  5572  5570  6391  3961
 156：9060  9635  3511  1890  1852  7041  8456  8503  5709  7232  9824
9121
      1142  9105  3524   886    99  2910  9802  8893  9050  6116  8210
2648
 157：4624  1430  1961  1964  9456  5156  5394  7397  8169  7589  3279
4306
      7970  5051  6353  5373  7529  7189  7177  9720  9724  9737  8325
9743
      8310  9762  5483  4841  9547   456  7027  4073  865   3681  4125
2487
      9754  9715  5852  7311  8287  9858  4556  4386  5237  4843  8283
6968
      3988  5146  2030  3167 10021  7754   401  6336  1019  9986  7351
9843
      1519  5919  6463  2568 4326   3251  7257   411  8280  2612  4172
677
      5236  6337  6941  1939 1846   3268  5264  2126  2850  1413  2595
4865
      5338  8606  8629  3585 9954   2395  3255  1592  8504  2091  3454
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      2103  6516  7601  9113 5955   8362  7498    6681 8435   682 1616
4872
      3003  3881  9673  5402 10002  9368  1367    5310 4499  5630 4811
486
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8373
      5779  5405  8890  3368 7467   1794  5605    3202 7077  3414  8605
8267
      8441  6977  6210  3177 3674   9141  1069    1345 8623  3926  7892
5387
       663  1904   869  6784 3039   6783  5341    9603 7943  1496  1495
8633
      7703  6564  8195  4295  754   7579  7687    9829 1122  3935  9341
8268
      4211  3564  2805  8263  792   1124   756    2716 7333  7222  2014
2356
      3127  3653  7950  4153 8867   6429  9457    6434 8734  6905  2165
4571
      2072  6064  4650  5252 3798   3915  1666    7185 7706  3720   883
3254
      4920  8452  5962  7186 1091   8162  8228     843 9140  2345  3987
7200
      2814  6078  9492  3816 4354   6881  7705    1724 2597   102  4828
238
       552  5676  1642  4417 5646   3678  6325    4282 2664  3035  9503
7204
表2(续)
      6422  6586  1652  3175  8323  2399  2394  5427  4430  6378  8097
2704
      4444  9173  9557  8568  6575  1240  268   5166  550   2093  5835
8235
      3242  9062  7503  1242  6669  202   4252  3942  1837  5772  7013
3949
      2387  1872  4132   239  6362  3853  5399  5290   361  1690  6817
1339
      1096  1489   224   351  1620  7863  9449  6123  8366  6051  2183
1721
      9238  2680  3626  3344  1116  2750  6932  7588  7744   103  3267
5492
       104  9588  6655  8671  8426  5594  1218  7709  9637  2882  3986
162
      8940  7045  1364  3112  2088  6478  9289  3965  1117  5979  9329
2311
       956  6806  9680  5660  8285  1398  5343  6127  7466  4784  3032
5850
      5920  9197  3649  8744  8970  8852  1984  5669  7829  6594  8237
1348
      5789   371  9957  3281  2933  6102  9219  4400  6788  4414
 158：2959  3815  4004  3362  3533  6295  3034  6178  1228  1025  5085
 159：4624  1430  1961  1964  9456  5156  999   3374  6267  1053  4084
9627
      5394  6413  7397  8169  9718  6610  7876  4383  1098  1556  783
6842
      7112  9675  3279  6197  9663  4306  7970  4596  7356  1390  5051
7566
      5754  6353  2721  2365  7177  7189  4841  9547  3255  2850  8504
1846
      9224  7752  6742  3039  8268  3564  4153  6429  9457   102  4828
7200
      4354  6881  8323  5427  6669  4252   162  8940  1117  5660   956
7829
      5669  6594  4893  5253  9367  5124  9369  5546   157  2141   205
2249
      7148  8237  1348  5789  9493   371  9957  3281  2933  6102  9219
4400
      6788  9027  8373
 160：7398  4338  6484  6449  9732  6500  6496  6480  6477  4169  7260
6605
      6606  7280  8487  9607  7439  9236  9237  3131  6585   177  7291
7290
      4868  7293  7295  7297  7315  7279  8159  6601  6624  6622  6584
6583
      6388  6387  7341  6891  7253  7321  7324  3947  4452  6330  6620
6598
      6600  3753  4899  6243  9355  3157  7108  7107  5977  4467  3998
3181
      3185  3152  3155  7534  1849  7442  7235  3250  8494   176  3357
7369
      8673  9585  9587  8866  6046  9103  4775  9951  9949  9943  9947
6579
      6559  6561  6574  1261  8729  1166  9701  8492  8447  8472  4317
1863
      7956  8326  3400  1267  4696  7761  1266  1270  5036  7100  6366
6519
      6371  3055  3488  6680  1088  8473  8469  3126  8098  5813  8496
4319
表2(续)
      8499  8500  1717  1741  4313  9009   854  6660  5001  4099  4086
4077
      7241  8185  3059  3060  8187  2158   8207 5667  8147  7379  6262
9338
      8145   820  6646  9005  2236  5469   8075 8093  3501  7746  1321
6007
      3747  1915  5153  7373  3558  7476    212   200  2238  1617  6714
8105
      7317  7318  6558  7716  3764  7971   7968 3275  6580  8476  3023
 161：7166  6423  5969  7138  7828  3577   489  5529  6737  9681  6534
1722
      8881  8779  4557  8810  4325  7209   9670 5063  2588  3570  2468
3921
      9958  9301  5466  911   3869  3523   1591 9783  2404  237   7123
6479
      10012 1898  2921  1361   341  8532   2199 6079  2205  4823  6562
3582
      4198  5437  2988  1673  7066  5126   9091 6045  745   4216  7254
5161
      4887   977  5407   564  9761   790   1009 3944  8437   608  1196
5222
      966   8036  1477  2535  9234  4824   5288 2506  5853  2880  1778
3225
      6765  919   4375  8702  3209  4812   1562 833   5353  1322  3733
5817
      6945  3053  7049  900   4591  5238   5868 4483  786   3201  1588
7489
      5700  2914  5503  2660  2500  6191   2902 2582  8948  8351  185
2766
      6841  9436  9478  4685  9940  658    4443 1344  8414  1785  1349
8856
      417   5680  984   3107  1447  4089   3425 2643  3781  3118  4548
7197
      5541  6047  4613  7933  2239  7734   4497 9378  4202  881   8999
7549
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806
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1805
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7397
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6197
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9457
表2(续)
      102  4828  7200  6881  4354  8323  4252  6669    202  7829  5669
5253
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371
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 163：3151 8646  4019  4005   282   299  4018  4831   2576 4850   3134
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2065
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1926
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2006
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1485
表2(续)
      6986  3088  1522  1338  1356  1353  1427  1426  1487  1525  1351
1399
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      4955  4957  4960  4988  4989  4993  4998  4999  5022  5023  5024
5028
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8849
表2(续)
      8872  8889  8874  8927  8932  8930  8895  8909  4770  7681  7691
5226
      5213  5157  5160  1375  1400  1458  1462  1482  2037  2041  9172
5321
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      7430  9401  9403  2007  2062  2059  2064  4857  8675  8677  4940
4965
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2035
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9726
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1736
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 165：3151  1577  8646  4019  4005   282   299  4018  4831  2576  4850
3134
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2251
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2802
      2873  2849  2786  2819  2795  2799  2148  2198  2192  2168  2225
2218
      2197  2867  2864  2825  2196  2193  2171  2169  2830  2219  2173
2166
      2853  2827  2889  2871  2874  8471  8474  8465  5165  5181  5180
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1963
      1992  2006  1932  1938  5044  933   939   7558  4219   808   908
811
表2(续)
       813   7526  7481   828  4221   826   814   931   829   910   851
832
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4728
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1464
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5022
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8701
      2393    2368  3117 4739  4972  4763  4766  4772  4806  2241  2289
2305
      2270    2264  2267 2284  2212  2237  6357  4975  4756  9294  8327
5259
      5256    5867  4794 8493  8497  3144  3142  1113  7676  7658  7675
3548
      3551    4329  8490 9196  9198  4848  9152  9155  9145  9144  9135
9136
      9204    8385  2226 2228  2231  2234  3552  3553  7721  9640  2515
2518
      277     3910  3018 6615  3355  6975  6980  6976  7713  7000  3517
4790
      4802    4830  3405 2451  4011  4833  5828  4712  4805  4771  4746
5318
      4713    4793  4835 5319  5317  4742  4764  1421  1424  9606  6625
1969
      1971    1434  8672 8669  3130  2013  2029  9516  8726  8730  9336
9339
      9337    6631  4829 6934  1743  5745  1958  7869  6426  1986  1987
7340
表2(续)
　　　5037　4785　4789　 912　3876　3873　3891　3102　8807　8626　8642
3132
　　　4854  9232  9233　9202　9132  1418  1419  9199  9200  9184  1628
1172
　　　1175  1177  9360　4765  9855   163  5084  6821  5061   671   657
669
　　 　655  5314  5067  8113  8117   298  1989  1991  4796  4808  6244
6488
　　　6490  6503  4743  3312  6822  4067  5279  9156  9158  5205  3147
3168
　　　4856  3156  1548  1798  1546   208  8944  8933  8949  8276  8279
8281
　　　8203  6005  8253  8992  8995  8996  8972  8991  9519  8197  5917
5978
　　　8223  5984  5936  8316  5956  5958  8226  8229  8300  9098  9099
9560
　　　9563  9580  9579  9582  9583  8919  7418  7794  1587  1579  7692
5273
　　　1593  5261  4710  4279  1547  3895  3893  3907  3081  4195  5210
4758
　　　4197  4727  8832  8916  8851  8857  8894  8892  8871  8865  8849
8872
　　　8889  8874  8927  8932  8930  8895  8909  4770  1062  7681  7691
5213
　　　5226  5157  5160  1375  1400  1458  1462  1482  2037  2041  9172
5321
　　　1396  1415  4714  4741  4966  4970  5000  5002  4745  5003  4760
4762
　　　5005  4769  4798  5064   7114  1379  1352  1341  1453  3929  3925
3080
　　　8750  7430  9401  9403   2007  2059  2062  2064  4857  8675  8677
4940
　　　4965  4973  5004  5039   5041  5045   705   707   691   693   692
2033
　　　2035  4740  4709  4749   4748  4803  5312  5313  5315  1745  8270
 166：7398  6484  6449  4729   6500  6496  6480  6477  4169  7256  7258
2351
　　　6605  6606  7280  9607   7439  9571  9415  6711  9236  9237  6585
177
　　　1949  7291  7290  4868   6438  6265  7293  7295  7297  7315  7279
7792
　　　7788  8159  6601  6622  6624  6584  6583  6388  7341  7253  7277
7321
　　　7324  3947  6620  6598  6600  4296  3753  4899  6243  4253  4128
9355
　　　8071  7568  7534  7244  7442  7468  7820  7235  3250  8494   176
6372
　　　7369  4428  8866  4775  7525  8255  5421  9967  6579  6559  6561
2768
　　　1166  9701  4083  9703  8447  4312  8472  4317  1863  7956  3400
757
　　　3642  5036  7100  3055  3488  6680  4587  8473  8469  3126  8477
8098
　　　5813  9879  2965  9740  5142  8499  4319  8500  1717  8410  2883
1410
　　　 641   854  6660  5001  4099  4086  7241  4077  7237  8777  3059
8185
　　　5491  3060  5667  7379  6262  9338  4236  6646  2236  8075  8093
8076
表2(续)
      2767   7746   7749   1321   6007   7724   7373   7376   3558   7476   1732
1734
      1740   1738   212    200    6714   7317   7318   1689   1709   6558   7716
3764
      435    7971   7968   6580   8476   5457   1346
实施例5.具有增强的农艺性状的转基因植物的选择
这个实施例说明了通过筛选衍生的植物和种子的增强的性状鉴别本发明的植物细胞。具有表1中鉴别的重组DNA的转基因玉米种子和植物通过用DNA转化的植物细胞制备，所述DNA稳定整合到玉米细胞的基因组中。使用测量方法选择转基因种子、小植物和后代植物。转基因玉米植物细胞用来自表1中鉴别的每种基因的重组DNA转化。与对照植物比较筛选转化的植物细胞的后代转基因植物和种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。
A.强的氮利用效率的选择
可以在高通量氮(N)选择方法中测试转基因玉米植物(作为杂交体测试)的生理效率的氮利用效率(NUE)性状。使用统计学模型比较收集的数据与来自野生型对照的测量结果，以确定改变是否归因于转基因。使用SAS软件分析原始数据。本文显示的结果是转基因植物相对于野生型对照的比较。
(1)用于设置NUF方案的培养基制备
使用的种植培养基是：Metro Mix 200(厂商：Hummert)Cat.#10-0325，Scotts Micro Max Nutrients(厂商：Hummert)Cat.# 07-6330，OS 41/3″ x 37/8″(厂商：Hummert)Cat.# 16-1415，OS盘(厂商：Hummert)Cat.# 16-1515，Hoagland氏大量营养物溶液，Plastic 5″桩(厂商：Hummert)黄色Cat.# 49-1569，白色Cat.# 49-1505，具有说明材料的编号的标签包含在罐中。用Metro Mix 200装填500个罐至边缘，重量为～140g/罐。通过使用平衡器均一地装填罐。向每个罐中加入0.4g Micro Max营养物。用刮铲搅拌成分至3英寸深，同时防止材料损失。
(2)在温室中设置NUF选择
(a)种子发芽-使用逆向渗透的纯化水给每个罐轻微地浇水2次。安排第一次浇水紧在种植之前发生；并且第二次浇水在种子已种植到罐中之后。种植每次入组的10粒种子(每罐1粒种子)以选择8个健康状态均一的幼苗。种植另外的野生型对照用作边界行。可替代地，种植每次入组的15粒种子(每罐1粒种子)以选择12个健康状态均一的幼苗(这个较大的种植数目用于第二次或证实种植)。将罐在Conviron生长室中的12个架子的每一个上放置7天。这样做是为了允许更均一的发芽和早期的幼苗生长。随后的生长室设定为25℃/日和22℃/夜，14小时光照和10小时黑暗，湿度～80％，以及光强度～350μmol/m2/s(在罐的水平上)。经由类似于温室工作台的毛细管垫子在每天3次10分钟的持续时间内进行浇水。
(b)幼苗转移-7天后，分别选择第一次或证实途径运行的最佳的8或12个幼苗，并转移至温室工作台。使用毛细管垫子上印刷的间隔图案使罐相隔8英寸(中心与中心)并置于工作台上。Vattex垫子产生384位网格，其中所有列、行组合随机化。另外的对照罐沿着实验区组外放置以减少边界作用。
允许植物在低N运行下生长28天或在高N运行下生长23天。大量营养物以大量营养物溶液(参见下文的组合物)的形式分配，所述溶液包含精确量的添加的N(对于限制性N选择为2mM NH4NO3并且对于高N选择运行为20mM NH4NO3)。每个罐分别在高N和低N运行种植后8和10天时开始隔日人工分配100m1营养物溶液，一周3次。在营养物应用的当天，跳过05:00和13:00时的2次20分钟浇水。每第3次运行应当更换Vatter垫子以避免N积聚和根物质的累积。表7显示对于低或高氮选择的营养物溶液中营养物的量。
表7
Figure A200580048534D00781
注：用HCl或KOH将pH调整至5.6
(c)收获测量结果和数据收集-植物在低N运行下生长28天和植物在高N运行下生长23天后，进行下列测量(括号中为phenocodes)：通过Sartorius电子天平测量的总枝条新鲜质量(g)(SFM)，通过Minolta SPAD计测量的V6叶叶绿素(相对单位)(LC)，通过Li-Cor叶面积计测量的V6叶面积(cm2)(LA)，通过Sartorius电子天平测量的V6叶新鲜质量(g)(LFM)，以及通过Sartorius电子天平测量的V6叶干质量(g)(LDM)。通过SAS软件分析原始数据。显示的结果是转基因植物相对于野生型对照的比较。
为了进行叶读取，从V6叶上切下样品。因为玉米叶的叶绿素计阅读受到叶的部分和叶在取样的植物上的位置影响，所以SPAD计阅读在植物的第6片叶上进行。每片叶进行3次测量，其中第一次阅读取自在叶尖和环之间一半距离，以及从叶缘到中脉的一半的点，而2次向叶尖获取。测量限制在叶总长度的1/2-3/4(从底部)的区域，它们之间的间隔大约相等。从SPAD机器获取3次测量结果的平均值。
记录切下的V6叶的叶新鲜质量，将叶置于纸袋中。包含叶的纸袋随后置于强制空气烘箱中在80℃进行3天。3天后，从烘箱中取出纸袋并进行叶干质量测量。
由收集的数据进行2次衍生测量：(1)叶叶绿素面积(LCA)，这是V6相对叶绿素含量与其叶面积(相对单位)的乘积。叶叶绿素面积＝叶叶绿素×叶面积。这个参数给出了叶绿素在整个叶面积上的展开的指示；(2)比叶面积(LSA)计算为V6叶面积与其干质量的比(cm2/g干质量)，这个参数还识别为NUE的测量。数据显示于表8中。
Figure A200580048534D00801
Figure A200580048534D00811
Figure A200580048534D00821
Figure A200580048534D00831
Figure A200580048534D00841
氮使用田间效率测定
水平I.将本发明提供的转基因植物种植在田间而不应用任何氮源。转基因植物和对照植物通过基因型和构建体分群，其中对照随机安排在基因型区组中。每种类型的转基因植物通过3次重复并横过5个位置进行测试。通过收集来自0-24″和24-48″土壤层的30个样品土壤核心在4月初的预先种植中分析田间的氮水平。分析土壤样品的硝酸盐-氮、磷(P)、钾(K)、有机物质和pH以提供基线值。基于土壤测试建议应用P、K和微量营养物。
水平II.将本发明提供的转基因植物种植在应用3种氮(N)肥料水平的田间，即低水平(0N)、中等水平(80磅/英亩(1b/ac))和高水平(180磅/英亩)。液体28％或32％UAN(尿素，铵态氮)用作N源并通过散播吊杆应用，且合并在与预期的农作物行相同的方向具有后翻滚篮(rear ro1ling basket)的田地中耕机。尽管对于0N处理没有应用N，但土壤仍应当以与处理的区域相同的方式扰动。转基因植物和对照植物通过基因型和构建体分群，其中对照随机安排在基因型区组中。每种类型的转基因植物通过3次重复并横过4个位置进行测试。通过收集来自0-24″和24-48″土壤层的30个样品土壤核心在4月初的预先种植中分析田间的氮水平。分析土壤样品的硝酸盐-氮、磷(P)、钾(K)、有机物质和pH以提供基线值。基于土壤测试建议应用P、K和微量营养物。
B.对于增加的产量的选择
本发明的多种转基因植物与对照植物比较显示出改善的产量。改善的产量可以由增强的种子库潜力(sink potential)，即胚乳细胞或谷粒的数目和大小和/或增强的库强(sink strength)，即淀粉生物合成的速率引起。库潜力可以在谷粒发展过程的非常早期确定，因为胚乳细胞数目和大小在授粉后最初几天内测定。
在过去几十年中玉米产量的许多增加由种植密度的增加产生。在那个时期，玉米产量以2.1蒲式耳/英亩/年的速率增加，而种植密度已以250株植物/英亩/年的速率增加。现代杂交玉米的特征是这些变种以高密度种植的能力。许多研究已显示高于目前的种植密度应当导致更多生物量产生，但目前的种质在这些更高的密度上执行得不好。在高密度种植中增加产量的一个方法是增加收获指数(HI)，这是与总生物量比较分配给谷粒的生物量的比例。
增强的所得转基因玉米事件的有效产量选择使用在多个位置的转基因事件的杂交后代，其中植物在最佳生产管理实践和最大害虫控制下生长。对于改善的产量有用的靶是，与来自对照植物种子培育的植物产生的产量比较，产量增加5％-10％。选择方法可以在多个和不同的地理位置中应用，例如最高达16或更多个位置，经过一个或多个种植季节，例如至少2个种植季节，以统计学区分产量改进与天然环境作用。在标准地块中种植多重转基因植物、阳性和阴性对照植物、以及授粉者植物，例如2排地块，20英尺长5英尺宽，排间距为30英寸，并且行之间有3英尺小径。转基因事件可以通过重组DNA构建体分群，群随机置于田间。当使用雄性不育转基因事件时，每2块地块种植高质量玉米系的授粉者地块以允许自由传粉。有用的种植密度是约30,000株植物/英亩。高种植密度大于30,000株植物/英亩，优选约40,000株植物/英亩，更优选约42,000株植物/英亩，最优选约45,000株植物/英亩。关于产量改善的替代指示包括源容量(生物量)、源输出(蔗糖和光合作用)、库组分(谷粒大小、谷穗大小、种子中的淀粉)、发育(光应答、高度、密度耐受性)、成熟度、早期开花性状和对高密度种植的生理学应答，例如45,000株植物/英亩，例如如表10和11中说明的。
表10
 
时间选择 评价 描述 评论
V2-3 早期直立 可以在发芽后和取出任何植物前的任何时候获取。
花粉释放 GDU至50％释放 GDU至50％植物释放50％雄花穗。
抽丝 GDU至50％抽丝 GDU至50％植物显示丝。
成熟度 植物高度 从土壤表面到旗叶附着的高度(英寸)。 每地块10株植物-产量团队帮助
成熟度 谷穗高度 从土壤表面到第一个谷穗附着节的高度。 每地块10株植物-产量团队帮助
成熟度 谷穗上方的叶 视觉得分；竖直、大小、翻转
成熟度 雄花穗大小 视觉得分+/-对WT
收获前 最终直立 收获前的最后直立计数，分蘖除外
收获前 茎倒伏 第一个耳穗附着下方的茎折断的数目。倾斜的分蘖除外
收获前 根倒伏 与垂线倾斜>45°角的茎的数目。
收获前 保持绿色 生理成熟后并且当基因型中的差异明显时：等级1(90-100％的组织绿色)-9(0-19％的组织绿色)。
收获 谷粒产量 谷粒产量/地块(壳重量)
表11
 
时间选择 评价 描述
V8-V12 叶绿素
V12-VT 谷穗叶面积
V15-15DAP Ch1荧光
V15-15DAP CER
15-25DAP 碳水化合物 蔗糖、淀粉
收获前 第一个节间的直径
收获前 底部第三个节间的直径
收获前 谷穗节间的直径
成熟 谷穗性状 直径、长度、谷粒数目、谷粒重量
电子传递速率(ETR)和CO2交换速率(CER)：使用Li6400LCF(Licor，Lincoln，NE)在约V9-R1阶段测量ETR和CER。叶叶绿素荧光是监控来源活性的快速方法并且报告与在各种条件下的CO2同化作用高度关联(Photosyn Research，37：89-102)。用光化性光1500(具有10％的蓝光)微摩尔m-2s-1，28℃，CO2水平450ppm测量最年幼的完全伸展的叶或耳穗叶上方的2片叶。在每个事件中测量10株植物。对于每株植物进行2次阅读。
手提式叶绿素计SPAD-502(Minolta-日本)用于测量在活转基因植物和野生型配对物上的总叶绿素水平。分析来自每株植物的3个三小叶，并且每个三小叶分析3次。随后将9个数据点平均以获得叶绿素水平。每种基因型分析的植物数目为5-8。
Figure A200580048534D00901
Figure A200580048534D00911
当选择产量改善时，有用的统计学测量方法包括3个组分，即模拟对于每个位置分开的测试田间的空间自相关，调整对于每个位置的空间依赖性的重组DNA事件的性状，和进行交叉位置分析。模拟空间自相关的第一个步骤是估计半变异函数(semivariogram)的协方差参数。假定球形协方差模型以模拟空间自相关。由于试验的大小和性质，空间自相关可能可以改变。因此，连同球形协方差结构一起也假定各向异性。下列方程式组描述了各向异性球形协方差模型的统计学形式。
C ( h ; &theta; ) = vI ( h = 0 ) + &sigma; 2 ( 1 - 3 2 h + 1 2 h 3 ) I ( h < 1 ) ,
其中I(●)是指示物函数， h = x &CenterDot; 2 + y &CenterDot; 2 , 且
x &CenterDot; = [ cos ( &rho;&pi; / 180 ) ( x 1 - x 2 ) - sin ( &rho;&pi; / 180 ) ( y 1 - y 2 ) ] / &omega; x
y &CenterDot; = [ sin ( &rho;&pi; / 180 ) ( x 1 - x 2 ) + cos ( &rho;&pi; / 180 ) ( y 1 - y 2 ) ] / &omega; y
其中s1＝(x1，y1)是一个位置的空间坐标并且s2＝(x2，y2)是第二个位置的空间坐标。共有5个相等协方差各向异性椭圆的协方差参数，θ＝(v，σ2，ρ，ωn，ωj)，其中是v是块金效应，σ2是偏基台值，ρ是由北顺时针方向旋转的度数，ωn是对于短轴的定标参数并且ωj是对于长轴的定标参数。限定空间趋势的5个协方差参数随后将通过使用来自大量重复授粉者地块的数据经由限制的最大似然方法估计。在多位置田间试验中，对于每个位置分开模拟空间趋势。
在获得模型的方差参数后，产生方差-协方差结构用于要分析的数据集。这个方差-协方差结构包含调整空间依赖性的产量数据所需的空间信息。在这种情况下，最佳代表本研究的处理和实验设计的嵌套模型连同方差-协方差结构一起使用以调整产量数据。在这个过程中，还可模拟并估计苗圃或种子批次作用，以关于由种子批次差异引起的任何产量相等调整产量。来自不同位置的空间调整的数据产生后，组合并分析所有调整的数据，其中假定位置作为复制。在这次分析中，组合位置内和位置间的方差以估计来自转基因植物和对照植物的产量标准误。相对平均数比较用于指示统计学显著的产量改善。
表14
Figure A200580048534D00931
表15
Figure A200580048534D00941
表15续
 
SEQIDNO 构建体 事件 转基因平均值 对照平均值 百分比差异   P值
116 PMON79697 ZM_M53938 171.6 176.1 -2.6 0.171
116 PMON79697 ZM_M53939 180.2 176.1 2.3 0.236
116 PMON79697 ZM_M54371 1750 176.1 -0.6 0.733
116 PMON79697 ZM_M54372 185.1 176.1 5.1 0.009
116 PMON79697 ZM_M54374 181.2 1761 2.8 0.127
144 PMON78240 ZM_M53464 184.1 176.1 4.5 0.015
144 PMON78240 ZM_M53465 175.2 176.1 -0.5 0.785
144 PMON78240 ZM_M53470 174.4 176.1 -1.0 0.811
144 PMON78240 ZM_M53471 166.7 176.1 -5.4 0.005
144 PMON78240 ZM_M53478 173.6 176.1 1.4 0.456
144 PMON78240 ZM_M53673 175.8 176.1 0.2 0.917
144 PMON78240 ZM_M53674 172.5 176.1 -2.1 0.269
144 PMON78240 ZM_M53684 179.4 176.1 1.8 0.342
122 PMON80500 ZM_M56549 173.4 176.1 -1.6 0.408
122 PMON80500 ZM_M56560 173.4 176.1 -1.6 0.394
122 PMON80500 ZM_M56565 175.4 176.1 -0.4 0.811
122 PMON80500 ZM_M56567 177.9 176.1 1.0 0.599
122 PMON80500 ZM_M56568 185.9 176.1 5.6 0.003
122 PMON80500 ZM_M58003 169.4 176.1 -3.8 0.047
145 PMON80283 ZM_M58140 174.6 176.1 -0.9 0.641
145 PMON80283 ZM_M58141 179.7 176.1 2.0 0.294
145 PMON80283 ZM_M58143 183.8 176.1 4.4 0.024
146 PMON80866 ZM_M58256 177.6 176.1 0.8 0.651
146 PMON80866 ZM_M59441 183.3 176.1 4.1 0.028
146 PMON80866 ZM_M60646 174.8 176.1 -0.7 0.692
147 PMON80292 ZM_M57487 180.8 176.1 2.6 0.159
147 PMON80292 ZM_M58571 184.2 176.1 4.6 0.021
147 PMON80292 ZM_M59578 177.5 176.1 0.8 0.717
142 PMON79696 ZM_M53849 177.6 179.1 -1.2 0.431
142 PMON79696 ZM_M53849 190.3 179.1 5.8 0.0003
142 PMON79696 ZM_M53849 178.5 179.1 -0.7 0.0635
150 PMON81857 ZM_M67504 178.8 178.1 1.5 0.415
150 PMON81857 ZM_M70000 182.7 176.1 3.7 0.047
150 PMON81857 ZM_M71064 172.1 176.1 -2.3 0.229
150 PMON81857 ZM_M71065 184.6 176.1 4.8 0.011
150 PMON81857 ZM_M72550 174.3 176.1 -1.0 0.589
149 PMON83553 ZM_M71131 150.7 176.1 -14.5 0.000
149 PMON83553 ZM_M71140 187.4 176.1 6.4 0.001
149 PMON83553 ZM_M71156 150.3 176.1 -14.7 0.000
149 PMON83553 ZM_M71161 172.7 176.1 -1.9 0.298
150 PMON81857 ZM_M67504 178.8 176.1 1.5 0.415
150 PMONB1857 ZM_M70000 182.7 176.1 3.7 0.047
150 PMON81857 ZM_M71064 172.1 1761 -2.3 0.229
150 PMON81857 ZM_M71065 184.8 176.1 4.8 0.011
150 PMON81857 ZM_M72550 174.3 176.1 -1.0 0.589
151 PMON82212 ZM_M67581 171.1 176.1 -2.8 0.126
51 PMON82212 ZM_M67583 186.1 176.1 5.6 0.002
51 PMON82212 ZM_M69111 173.2 176.1 -1.7 0.368
表15续
 
PEP SEQ1D NO 构建体 事件 转基因平均值 对照平均值 百分比差异 P值
108 PMON79709 ZM_M51983 184.3 176.1 4.7 0.037
108 PMON79709 ZM_M51985 180.1 176.1 2.3 0.231
108 PMON79709 ZM_M52052 185.6 176.1 5.3 0.013
PMON79709 7M_M52710 175.5 176.1 -0.4 0.862
108 PMON79709 ZM_M62720 175.2 176. -0.6 0.765
129 PMON73787 ZM_M55059 162.6 176.1 -7.7 0.000
129 PMON73787 ZM_M61950 186.4 176.1 5.8 0.002
129 PMON73767 ZM_M61953 164.7 176.1 -6.5 0.001
129 PMON73787 ZM_M61958 1659 176.1 -5.8 0.003
129 PMON73787 ZM_M61965 1343 176.1 -23.8 0.000
129 PMON73787 ZM_M61966 172.6 176.1 -2.0 0.280
135 PMON78942 ZM_M66312 1762 176.1 0.0 0.997
135 PMON78942 ZM_M66316 173.1 1761 -1.7 0.362
135 PMON78942 ZM_M66318 164.1 176.1 -6.9 0.000
135 PMON78942 ZM_M66331 183.3 176.1 4.1 0.029
C.对干增强的水利用效率(WUE)的选择
在这个实施例中描述的是用于温室选择转基因玉米植物与野生型玉米植物(作为近交系或杂交体测试)的水利用效率的高通量方法。这个选择方法在最初11天无应激生长时间段后，经过总共15天的时间段对植物施加3次干旱/再浇水循环。每次循环由5天组成，在最初的4天不应用水并且在循环的第5天应用水淬火。如在植物干旱处理过程中通过高度和生物量测定的，通过选择方法分析的最初表现型是植物生长速率的改变。还测量了干旱后枝条组织的水合状态。在3个时间点上测量植物高度。第一次紧在植物为11天龄时干旱开始前进行，这是枝条初始高度(SIH)。还在种植后第18天贯穿干旱/再浇水方案中途测量植物高度，以产生枝条干旱中期高度(SMH)。在种植后第26天最终干旱循环完成后，收获植物的枝条部分并测量最终高度，这是枝条枯萎高度(SWH)并且还测量了枝条枯萎生物量(SWM)。将枝条在40℃在黑暗中置于水中。3天后，将枝条称重以产生枝条膨胀重量(STM)。在烘箱中干燥4天后，将枝条称重得到枝条干生物量(SDM)。枝条平均高度(SAH)是经过3次高度测量的平均植物高度。已知情形时，上文描述的程序对于每个步骤可以调整+/-～1天。
为了校正植物间的轻微差异，由SIH和SWH获得大小校正的生长值。这是相对生长速率(RGR)。对于每个枝条使用式[RGR％＝(SWH-SIH)/((SWH+SIH)/2)*100]计算相对生长速率(RGR)。相对含水量(RWC)是植物在收获时有多少水(％)的测量结果。对于每个枝条使用式[RWC％＝(SWM-SDM)/(STM-SDM)*100]计算含水量(RWC)。这个年龄的充分浇水的玉米植物为约98％RWC。
通过根据上述标准方法的选择方法选择本发明提供的转基因植物，并且这些转基因植物的性能显示于下表16中。
表16
Figure A200580048534D00971
在Satanta，IL和Dixon CA使用中等干旱条件在田间测试用pMON67754转化的转基因植物，所述pMON67754包括如SEQ ID NO：3中列出的重组DNA。与对照植物比较，在中等干旱应激下叶上的SPAD读数显示转基因植物中的叶绿素水平显著增加。2个事件显示叶绿素水平的SPAD读数显著增加，从而表明干旱耐受性的改善。在重复的田间试验中，6个测试的事件中的2个事件(ZM_M16396和ZM_M16401)显示2个不同位置中显著(p<0.1)改善的叶SPAD读数，从而表明干旱耐受性的改善。
D.在冷应激下生长的选择
(1)冷发芽测定-对于本测定使用3组种子。第一组由阳性转基因事件(F1杂交)组成，其中本发明的基因在种子中表达。第二个种子组是非转基因的、野生型阴性对照，由与转基因事件相同的基因型制备而成。第三组由2个耐寒性和1个冷敏感性玉米商业对照系组成。所有种子都用杀真菌剂“克菌丹”(
Figure A200580048534D0098162535QIETU
80DF Fungicide，Arvesta Corporation，San Francisco，CA，USA)处理。通过将其充分混合并在实验前干燥杀真菌剂，对每45g玉米种子应用0.43mL克菌丹。
玉米谷粒胚侧向下置于发芽盘(54 x 36cm)的个别单元(8.9 x 8.9cm)中的吸墨纸上。来自一个事件的10粒种子置于发芽盘的一个单元中。每个盘可以容纳21个转基因事件和3份重复的野生型(LH244SDms+LH59)，这在完全区组设计中随机化。对于每个事件，有5次重复(5个盘)。将盘置于Convrion生长室(Conviron ModelPGV36，Contro1led Environments，Winnipeg，加拿大)内在9.7℃下24天(无光)。将250毫升去离子水加入每个发芽盘。发芽计数在实验开始日后的第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第17天、第19天、第21天和第24天进行。如果出现的胚根大小为1cm，那么种子视为发芽的。从发芽计数计算发芽指数。
发芽指数根据下式计算：
发芽指数＝(∑([T+1-ni]*[Pi-Pi-l]))/T
其中T为其中进行发芽测定的总天数。n定义种植后的天数。“i”表明已计数发芽的次数，包括当天。P是在任何给定等级中发芽种子的百分比。计算转基因事件和野生型对照之间的统计学差异。统计学分析后，显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.1的事件将进行第二次冷选择。第二次冷筛选以第一次选择相同的方式进行，只将重复数目增至10。进行来自第二次选择数据的统计学分析以鉴别显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.05的事件。
表17
Figure A200580048534D00991
Figure A200580048534D01011
(2)冷休克测定-对于冷休克测定的实验组织与上文冷发芽测定描述的相同，除了对于冷休克测定种子在盆栽培养基中生长外。
所需数目的2.5″正方形塑料罐置于浅苗床(flat)上(n＝32，4x8)。罐装满Metro Mix 200土壤较少的培养基，其包含19:6:12肥料(6磅/立方码)(Metro Mix，罐和浅苗床从Hummert International，Earth City，MO获得)。种植种子后，将罐置于设定为23℃，相对湿度65％，12小时日和夜光周期(300uE/m2-分钟)的生长室中。种植的种子每隔一日通过地下灌溉浇水20分钟，并且对于生长中的玉米幼苗浅苗床每隔一天在生长室中旋转。
在种植后第10天，转基因阳性和野生型阴性(WT)植物以交替的模式置于浅苗床中。在生长黑暗时间段期间的第10天通过使用PAM-2000手提式荧光计根据制造商的说明(Walz，德国)测量植物的叶绿素荧光。叶绿素测量后，收集来自每个事件的叶样品以用于证实本发明基因的表达。对于表达分析，随机收获来自每次选择的6个V1叶尖。浅苗床移至设定为5℃的生长室。所有其他条件例如湿度、日/夜周期和光强度在生长室中保持不变。在移至冷温度后浅苗床每天进行地下灌溉。在第4天测量叶绿素荧光。在冷休克处理6天后将植物转移至正常生长条件并允许其在接下来的3天恢复。在这个恢复时间段期间，在第1天和第3天测量V3叶的长度。在恢复2天后，通过估计绿色V2叶的百分数视觉测定V2叶损害。
在休克前和冷休克过程中V3叶生长、V2叶坏死和荧光的统计学差异可以用于估计冷休克对玉米植物的损害。
(3)早期幼苗生长测定-对于本实验使用3组种子。第一组由阳性转基因事件(F1杂交)组成，其中本发明的基因在种子中表达。第二个种子组是非转基因的、野生型阴性对照，由与转基因事件相同的基因型制备而成。第三个种子组由2个耐寒性和2个冷敏感性玉米商业对照系组成。所有种子用杀真菌剂“克菌丹”(3a，4，7，a-四氢-2-[(三氯甲基)硫代]-1H-异吲哚-1，3(2H)-二酮，Drex Chemical Co.Memphis，TN)处理。通过将其充分混合并在实验前干燥杀真菌剂，对每45g玉米种子应用克菌丹(0.43mL)。
种子在发芽纸中生长以用于早期幼苗生长测定。对于测试中的每次入组使用3张12″ x 18″发芽纸(Anchor Paper #SD7606)(每个转基因事件重复3次)。纸在0.5％ KNO3和0.1％ Thyram的溶液中湿润。
对于每张纸，在沿着纸长度均匀隔开的线上放置15粒种子。将15粒种子定位在纸上，从而使得胚根(radical)将向下生长，例如与纸的边缘更长的距离。湿纸从短末端之一开始卷起来。纸均匀且足够紧地卷起以使种子维持在一定位置。纸卷用2个大纸夹固定在一定位置，一个纸夹在顶端并且一个在底部。在适当容器中的随机化的完全区组设计中纸卷在生长室于23℃温育3天。室设定为65％的湿度，没有光周期。对于冷应激处理，纸卷随后在生长室中于12℃温育12天。室设定为65％的湿度，没有光周期。
冷处理后，将发芽纸打开并丢弃不发芽的种子。通过自动化成像程序测量每个种子的胚根和胚芽鞘的长度，所述程序自动收集并处理图像。成像程序自动测量每一个单独幼苗的枝条长度、根长度和整个幼苗长度并随后计算每个纸卷的平均数。
统计学分析后，显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.1的事件将进行第二次冷选择。第二次冷筛选以与第一次选择相同的方式进行，只将重复数目增至5。进行来自第二次选择数据的统计学分析以鉴别显示相对于野生型对照统计学显著性为p水平小于0.05的事件。
Figure A200580048534D01041
Figure A200580048534D01051
Figure A200580048534D01061
Figure A200580048534D01071
4.冷田间效力试验
这个实施例阐述了冷田间效力试验以鉴别基因构建体，在常规耕种和模拟的无耕种环境中在早春田间种植条件下所述构建体给予发芽时增强的冷活力和早期幼苗生长。在当地农民开始种植玉米前大约2周将种子种植到地里，从而使得对农作物施加显著的冷应激，命名为冷处理。种子还在当地最佳种植条件下种植，从而使得农作物只有很少或没有暴露于冷条件，命名为正常处理。冷田间效力试验在5个地点进行，包括Glyndon MN、Mason MI、Monmouth IL、Dayton IA、Mystic CT。在每个地点，种子在冷和正常条件下种植，每个处理重复3次，每行20个谷粒，并且每地块单行。种子种植到土壤中1.5-2英寸深，以避免多泥条件。在每个地点安置2个温度监视器以每天监控空气和土壤温度。
种子突出(emergence)定义为生长中的枝条刺破土壤表面时的时刻。从最早的地块开始突出那天开始每天计数每地块中突出的幼苗数目直至突出发生没有显著变化。此外，对于每个种植日期，还记录所有地块中突出为0时的最迟日期。还在玉米植物平均高度达到10英寸前的V3-V4阶段评价幼苗活力，其中1＝极佳的早期生长，5＝平均生长和9＝生长差。使用SAS软件对于每个地点中或跨越所有地点的数据计算50％突出的天数、最大百分比突出和幼苗活力。
下列表列出了基于上文说明的方法收集并分析的数据。跨越所有地点分析的数据只包括来自Glyndon MN、Mason MI和Mystic CT的那些。
Figure A200580048534D01091
Figure A200580048534D01101
E.具有增加的蛋白质和/或油水平的转基因植物种子的筛选
这个实施例阐述了使用Infratec 1200系列谷粒分析仪鉴别在种子组成中具有改善的植物种子的高通量选择，所述谷粒分析仪是近红外透射率分光计，用于测定大批种子样品的组成。近红外分析是无破坏性、高通量的方法，它可以分析单一样品扫描中的多重性状。目的分析物的NIR校准用于预测未知样品的值。使用复合化学计量软件包获得样品的NIR光谱并与校准值比较，所述软件包提供预测值以及关于样品在校准中拟合得如何好的信息。
Foss North America具有转运模块的Infratec Model 1221、1225或1227与比色杯，条目# 1000-4033，Foss North America一起使用，或对于小样品与小单元比色杯，由Leon Girard Co.修改的Foss标准比色杯，一起使用。维持在对照单元比色杯中各种组成的玉米和大豆对照样品由Leon Girard Co.供应。NIT收集软件由Maximum Consulting Inc.Software提供。通过软件自动进行计算。种子样品在具有来自消费者的条形码标签的包装或容器中收到。在收到时将种子倾倒入比色杯中并进行分析。
表20
 
一般样品： 全谷粒玉米和大豆种子
运行方法的分析时间： 每个样品少于0.75分钟
每次运行经过的总时间： 每个样品1.5分钟
一般和最小样品大小： 玉米一般为：50cc；最小值30cc大豆一般为：50cc；最小值5cc
一般分析范围： 通过特别校准部分测定。玉米-湿度5-15％，油5-20％，蛋白质5-30％，淀粉50-75％，和密度1.0-1.3％。大豆-湿度5-15％，油15-25％和蛋白质35-50％。
Figure A200580048534D01121
表22
Figure A200580048534D01131
实施例6
这个实施例说明了转基因植物细胞的制备，所述细胞包含表达玉蜀黍光敏色素A蛋白(PHYA)的重组DNA(SEQ ID NO：82)。编码玉米PHYA蛋白质的全长cDNA从玉米中克隆。cDNA克隆包含3396bp核苷酸，其编码分子量为125.2kD的1131个氨基酸PHYA蛋白质。基于cDNA序列，设计引物以从玉蜀黍近交LH 172基因组文库中克隆图1中说明的基因组DNA。将重组DNA插入如SEQ ID NO：10030中列出的pMON74916转化载体中，所述重组DNA包括与编码玉米PHYA蛋白质的基因组DNA可操作地连接的稻肌动蛋白启动子，随后为Hsp17终止子。使用pMON74916用表达PHA的重组DNA转化玉米植物细胞，并将其用于再生转基因植物群体。由约100个转化的植物细胞事件再生转基因植物；选择来自90个事件具有各种表达水平的植物用于授粉以生产R1和F1种子；并且选择来自31个事件的植物用于增强的性状的筛选。
种子发芽和幼苗发育
选择5个事件连同其他转基因材料一起分析在黑暗条件下对种子发芽和幼苗发育的表型作用。每个野生型和转基因玉蜀黍事件的12粒近交种子在湿润且卷起的发芽纸中在完全黑暗的生长室中发芽10天。测量每个幼苗的中胚轴、胚芽鞘和根的长度。与非转基因对照比较，鉴别显示中胚轴和展开的胚芽鞘极大延长生长的转基因玉蜀黍幼苗，所述生长由表达PHYA蛋白质的重组DNA赋予。
密度研究
转基因植物以3个密度在田间生长：高密度为42,000株植物/英亩；中等密度为35,000株植物/英亩；和低密度为28,000株植物/英亩。选择来自表达PHYA的3个植物细胞事件的植物用于研究针对不同密度的生理学和产量应答。来自密度试验YI130的生理学数据概括于下文显示的表23中。在高种植密度下事件ZM_S83483显示植物高度、谷穗高度和节间长度显著减少并且叶绿素含量具有显著增加。
表23
谷粒性状分析
如表24中所示，事件ZM_S83444、ZM_S83446、ZM_S83473、ZM_S83480、ZM_S83483和ZM_S83907显示单谷粒重量显著增加。事件ZM_S83452显示单谷粒重量和总谷粒重量显著增加。筛选数据显示具有稳定整合、非天然、表达光敏色素A蛋白的重组DNA的植物细胞可以再生为与对照植物比较显示增加的产量的植物。
表24
实施例7
这个实施例说明了转基因植物细胞的制备，其包含表达大豆MADS框转录因子蛋白质的重组DNA(SEQ ID NO：77)，并鉴别为G1760。
编码大豆MADS框转录因子的DNA从大豆文库中克隆，并插入重组DNA构建体中，所述构建体包括与编码转录因子的DNA可操作地连接的CaMV 35S启动子，随后为终止子。重组DNA构建体插入转化载体质粒中，以产生如SEQ ID NO：10029中所列出的质粒pMON74470，它用于土壤杆菌属介导的大豆植物细胞转化。
使用MON74470用表达MADS框转录因子的重组DNA转化大豆植物细胞并用于再生转基因植物群体。将转基因大豆植物再生并选择用于筛选增强的性状。
转基因大豆植物显示具有高度扩大的萼片和缠绕茎的花。主茎显示减少的侧出分枝和增加的总状花序形成。与对照植物比较，在短白昼(10小时)和长白昼(14小时)条件下，开花时间减少约2-4天。当置于非诱导的20小时光时，转基因植物还开花5周；野生型对照植物在此类条件下不开花。在转基因植物中花和荚果的脱离极大地减少，从而导致每株植物的荚果数目增加。野生型对照植物产生100个荚果左右，特定的转基因植物产生至少125个荚果/植物，并且由一个转基因事件的植物细胞再生的植物产生大于200个荚果/植物。成熟期也有所延迟，从来自单一拷贝事件A29204的植物显示的1周到来自多拷贝事件A28877的植物显示的1个月。来自事件A29204的转基因植物上超过95％的荚果在一个时间段内成熟；但来自事件A28877的转基因植物上只有50％的荚果在相同时间段内成熟。来自转基因植物的种子小于来自对照植物的种子，并且在数目上大于来自对照植物的种子，例如约多1800粒种子/磅。转基因植物还显示具有增强的水利用效率。
在测试大豆的干旱耐受性时，将4.5″罐用Metromix 200制备并将罐调整至相同重量。罐用水饱和。R2或R3纯合种子置于罐的土壤中，每个事件15个罐，每个构建体3-6个事件。植物在600μEM-2S-1的光强度；温度：28℃；相对湿度(RH)：60％下生长。使用基因检查条(Trait RUR Lateral Flow 50测试，来自Strategic Diagnostics，Inc.)对选择的植物进行关于CP4基因存在的基因检查。丢弃不需要的阴性植物。当植物达到V1阶段时，通过彻底灌溉用水饱和罐。拍摄在水饱和罐中的植物的照片。排出过量的水并停止进一步的浇水直至对于良好浇水的对照和干旱处理的植物分别为50％的罐含水量和10％的持水量(通过每3-5天测量土壤湿度或罐重量监控含水量)。在大约10％的饱和水重量时，植物开始显示萎蔫表型的起始。每1-2天继续限制浇水以将罐含水量维持在50或10％。接下来的14天测定干旱伤害表型(参见测量结果表)。在干旱处理开始后14天的每一天进行植物的拍照和生理学测定。这些包括，但不限于，植物高度、叶相对含水量、叶水势、叶绿素含量和叶绿素荧光。在14天后罐用营养物溶液饱和并重新开始规律浇水时间表。
表25
 
测量结果 方案
农艺学测量结果 突出，早季节活力，高度(cm)
视觉干旱得分 分数为1-4：1.健康植物，与对照植物没有差异；2.看见萎蔫，叶变得萎蔫；3.植物萎蔫，仍为绿色并可恢复；4.严重萎蔫，萎黄病并且不可恢复
如表25中描述对转基因大豆植物进行的干旱测定法测量结果显示，来自事件GM 29204的转基因植物细胞的转基因大豆植物呈现增强的水利用效率。
与150粒种子/植物的平均数比较，从来自41个转基因植物细胞事件中的一个转基因植物细胞事件(28877)再生的R0植物产生大数目的荚果/节和种子/植物-531R1种子/植物，即产量增加。
实施例6.共有序列
这个实施例说明了对于DNA编码的蛋白质和同源物的共有氨基酸序列的鉴别，所述DNA用于制备本发明的具有增强的农艺性状的转基因种子和植物。
选择ClustalW程序用于SEQ ID NO：136的氨基酸序列及其9个同源物，以及SEQ ID NO：151及其11个同源物的多重序列比对。显著影响序列比对的3个主要因素是(1)蛋白质权重矩阵；(2)缺口开放罚分；(3)缺口延伸罚分。对于ClustalW程序可用的蛋白质权重矩阵包括Blosum、Pam和Gonnet系列。广泛地测试具有缺口开放罚分和缺口延伸罚分的那些参数。在测试结果的基础上，对于多重序列比对选择Blosum权重矩阵、缺口开放罚分10和缺口延伸罚分1。图2显示SEQ ID NO：136、其同源物和结尾的共有序列(SEQ ID NO：10031)的序列。图3显示SEQ ID NO：151、其同源物和结尾的共有序列(SEQ ID NO：10032)的序列。关于共有序列的符号是(1)大写字母为多重序列比对输出的所有位置中100％的同一性；(2)小写字母为>＝70％的同一性；符号；(3)“X”指示<70％的同一性；(4)破折号“-”指缺口在>＝70％的序列中。
共有氨基酸序列可以用于鉴别对应本发明完全范围的DNA，所述DNA在提供转基因植物例如具有增强的农艺性状的玉米和大豆植物中有用，所述增强的农艺性状例如改善的氮利用效率、增加的产量、改善的水利用效率和/或在冷应激下改善的生长，这是由于编码的氨基酸序列等同于共有氨基酸序列的蛋白质的DNA在植物中的表达。
实施例7.通过Pfam分析鉴别氨基酸结构域
使用附加的计算机列表中的HMMER软件，针对多重序列比对的目前Pfam集合和隐马尔可夫模型分析Pfam蛋白质家族中显示与增强的性状结合的表达蛋白质的氨基酸序列。表26中显示了SEQ IDNO：84-166的蛋白质的Pfam蛋白质家族。附加的计算机列表中还有关于鉴别的专利家族的隐马尔可夫模型数据库，其允许鉴别其他同源蛋白质及其同源编码DNA，以使得本领域普通技术人员能够充分外延本发明。通过单个Pfam结构域鉴别特定蛋白质，并且通过多个Pfam结构域鉴别其他的蛋白质。例如，具有SEQ ID NO：91的氨基酸的蛋白质的特征为2个Pfam结构域，即SRF-TF和K-框；并且具有SEQ IDNO：165的氨基酸的蛋白质的特征为6个Pfam结构域，即GAF、光敏色素、PAS、重复的PAS、HisKA和HATPase。
表26
 
NUC SEQ ID PEP SEQ ID Pfam结构域名称 开始 终止 得分 E值
3 86 Pkinase 79 337 343 4.30E-100
5 88 FA_去饱和酶 99 319 206.2 6.60E-59
2 85 Ras 10 178 297.9 1.60E-86
1 84 乙二醛酶 27 171 130.1 5.40E-36
8 91 SRF-TF 9 59 121.4 2.30E-33
8 91 K-框 75 176 151.7 1.70E-42
7 90 K-框 4 104 145.6 1.20E-40
83 166 SRF-TF 9 59 99.2 1.10E-26
83 166 K-框 75 172 92.4 1.20E-24
82 165 GAF 219 404 105.6 1.30E-28
82 165 光敏色素 415 595 407.6 1.60E-119
82 165 PAS 622 738 88.9 1.40E-23
82 165 PAS 753 878 101.1 2.80E-27
82 165 HisKA 898 957 27.6 4.00E-05
82 165 HATPase c 1012 1124 66.9 5.80E-17
9 92 同源异型框 97 158 68 2.80E-17
10 93 AP2 5 68 127.5 3.30E-35
11 94 GATA 196 231 71.3 2.70E-18
12 95 AT钩 57 69 7.4 1.1
12 95 DUF296 84 208 183.6 4.30E-52
24 107 小突触小泡蛋白 128 215 137.6 2.90E-38
31 114 吡哆醛_deC 28 381 194.6 2.10E-55
36 119 Metallophos 63 258 161 2.80E-45
21 104 Pkinase 12 267 346 5.40E-101
21 104 Pkinase Tyr 12 265 88.5 1.80E-23
21 104 NAF 310 369 98.6 1.60E-26
26 109 MtN3 slv 9 98 96.7 6.10E-26
26 109 MtN3 slv 132 218 116.8 5.70E-32
27 110 内酰胺酶_B 94 252 125.1 1.80E-34
33 116 HSP20 53 157 159.9 5.80E-45
 
28 111 RTC 3 353 275.2 1.10E-79
28 111 RTC_插入片段 184 300 120.8 3.40E-33
37 120 PDZ 200 284 37.6 3.80E-08
37 120 肽酶_S41 320 483 244.5 1.90E-70
35 118 E2F TDP 167 232 131 2.90E-36
41 124 Pkinase 63 341 199.5 7.00E-57
41 124 Pkinase Tyr 63 341 243 5.60E-70
43 126 zf-C2H2 72 94 25.6 0.00016
43 126 zf-C2H2 149 171 20.5 0.0054
4 87 zf-C2H2 85 107 22.1 0.0018
17 100 PRA1 10 161 181.8 1.50E-51
22 105 AAA 154 352 85 2.10E-22
14 97 CBFD NFYB HMF 31 96 134.4 2.80E-37
34 117 肽酶_C15 11 219 -72.2 3.50E-07
20 103 Pkinase 13 267 345.5 7.80E-101
20 103 Pkinase Tyr 13 265 75.2 1.80E-19
20 103 NAF 312 371 104.7 2.50E-28
32 115 HSF_DNA-结合 49 225 212.2 1.00E-60
19 102 Pkinase 37 291 353.9 2.30E-103
19 102 RIO1 50 208 -88.1 0.0038
19 102 NAF 375 432 101.8 1.80E-27
40 123 Aldo ket red 7 284 448.1 1.00E-131
42 125 FBPase 13 337 691.6 5.30E-205
6 89 SRF-TF 9 59 119.7 7.20E-33
18 101 DNA_光解酶 6 173 163.3 5.70E-46
18 101 FAD_结合_7 205 476 425.8 5.50E-125
30 113 Pkinase 41 327 326.6 3.80E-95
23 106 NIF 95 291 90.6 4.10E-24
15 98 Gotl 30 130 237 3.60E-68
16 99 RRM1 21 89 67.1 5.00E-17
29 112 Di19 13 206 365.4 8.00E-107
25 108 CorA 90 467 408.2 1.00E-119
39 122 SPC25 12 190 252.3 9.00E-73
44 127 应答_reg 18 139 151.1 2.60E-42
44 127 .HisKA 320 385 101.5 2.30E-27
44 127 HATPase c 432 565 138.4 1.70E-38
44 127 应答_reg 740 862 128 2.40E-35
44 127 Hpt 922 1013 63.4 6.60E-16
45 128 应答_reg 18 139 151.1 2.60E-42
45 128 HisKA 320 385 101.5 2.30E-27
45 128 HATPase c 432 565 138.4 1.70E-38
45 128 应答_reg 740 862 128 2.40E-35
 
45 128 Hpt 922 1013 63.4 6.60E-16
46 129 NAM 9 135 313.7 2.90E-91
47 130 Aminotran 1_2 183 576 55.7 1.40E-13
48 131 过氧化氢酶 18 401 960.1 7.80E-286
49 132 BRO1 10 172 177.8 2.40E-50
69 152 Gotl 30 130 211.8 1.40E-60
70 153 Gotl 30 130 174.9 1.80E-49
71 154 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 36 124 87.6 3.40E-23
72 155 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 36 124 87.6 3.40E-23
73 156 RRM1 22 87 32.4 1.40E-06
74 157 Pkinase_Tyr 55 304 86.2 9.10E-23
74 157 Pkinase 55 306 362 8.40E-106
75 158 SPX 1 167 88.9 1.30E-23
75 158 zf-C3HC4 238 286 17 0.0024
76 159 Pkinase Tyr 19 271 70.8 4.00E-18
76 159 Pkinase 19 273 359.7 4.10E-105
76 159 NAF 324 381 105.6 1.30E-28
77 160 SRF-TF 9 59 100.8 3.60E-27
77 160 K-框 73 173 95.3 1.60E-25
50 133 肽酶_S10 1 227 -42.7 6.00E-11
51 134 Ank 44 76 47.3 4.70E-11
51 134 Ank 77 109 33.5 6.40E-07
51 134 Ank 111 144 15.7 0.14
51 134 Ank 185 217 39.7 9.00E-09
51 134 Ank 228 260 30.7 4.50E-06
52 135 Pkinase_Tyr 51 341 158.7 1.40E-44
52 135 Pkinase 63 341 104.4 3.00E-28
54 137 GATase 2 2 162 11.8 6.10E-12
54 137 Asn_合酶 211 479 334.3 1.80E-97
55 138 HSP20 56 164 168-2 1.90E-47
78 161 内酰胺酶_B 93 251 129 1.20E-35
56 139 UPF0057 11 62 102.9 8.40E-28
57 140 Oxidored_FMN 6 341 302.1 9.10E-88
58 141 Pkirnase 39 325 309.2 6.40E-90
59 142 吡哆醛_deC 33 381 546 3.40E-161
60 143 吡哆醛_deC 33 381 546 3.40E-161
61 144 HSP20 57 160 178.8 1.20E-50
38 121 PDZ 200 284 37.6 3.80E-08
38 121 肽酶_S41 320 483 244.5 1.90E-70
62 145 Cpn60 TCP1 59 562 578.6 5.40E-171
63 146 DSPc 50 188 142.9 7.70E-40
64 147 异淀粉酶_N 61 149 94.9 2.10E-25
64 147 α淀粉酶 209 589 -36.4 1.30E-07
 
79 162 Pkinase 45 299 360.3 2.80E-105
79 162 NAF 384 441 105.2 1.70E-28
65 148 DUF1685 38 146 184.5 2.40E-52
80 163 GAF 219 404 108.4 1.90E-29
80 163 光敏色素 415 595 409.1 5.70E-120
80 163 PAS 622 737 96.6 6.50E-26
80 163 PAS 752 877 107.4 3.80E-29
80 163 HisKA 897 956 26.7 7.10E-05
80 163 HATPase c 1011 1123 64.4 3.30E-16
66 149 Glyco_hydro_1 74 558 1024.9 0
67 150 ArfGap 17 133 174.4 2.50E-49
81 164 AP2 6 69 132 1.50E-36
表27
 
pfam结构域名称 登记号 聚集截止值 结构域描述
AAA PF00004.17 10 与各种细胞活性相关的ATPase家族(AAA)
AP2 PF00847.9 0 AP2结构域
Aldo ket red PF00248.10 -97 醛/酮还原酶家族
α淀粉酶 PF00128.11 -93 α淀粉酶，催化结构域
Aminotran 1_2 PF00155.9 -57.5 I和II类转氨酶
Ank PF00023.17 21.6 锚蛋白重复序列
ArfGap PF01412.8 -17 对于Arf推定的GTP酶激活蛋白质
Asn_合酶 PF00733.10 -52.8 天冬酰胺合酶
BRO1 PF03097.6 25 BR01样结构域
CBFD NFYB HMF PF00808.12 18.4 组蛋白样转录因子(CBF/NF-Y)和archaeal组蛋白
过氧化氢酶 PF00199.8 -229 过氧化氢酶
CorA PF01544.8 -61.3 CorA样Mg2+转运蛋白
Cpn60TCP1 PF00118.13 -223.4 TCP-1/cpn60陪伴蛋白家族
半胱氨酸蛋白酶抑制剂 PF00031.10 17.5 半胱氨酸蛋白酶抑制剂结构域
DNA_光解酶 PF00875.7 -10 DNA光解酶
DSPc PF00782.9 -21.8 双重特异性磷酸酶，催化结构域
DUF1685 PF07939.1 25 未知功能的蛋白质(DUF1685)
DUF296 PF03479.4 -11 未知功能的结构域(DUF296)
Di19 PF05605.2 25 干旱诱导的19蛋白质(Di19)
E2F_TDP PF02319.9 17 E2F/TDP家族翼状螺旋DNA结合结构域
FAD_结合_7 PF03441.3 25 DNA光解酶的FAD结合结构域
FA_去饱和酶 PF00487.13 -46 脂肪酸去饱和酶
FBPase PF00316.9 -170.3 果糖-1，6-二磷酸酶
GAF PF01590.14 23 GAF结构域
GATA PF00320.15 28.5 GATA锌指
 
GATase_2 PF00310.10 -106.2 II类谷氨酰胺转氨酶
Glyco_hydro_1 PF00232.8 -301.8 糖基水解酶家族1
乙二醛酶 PF00903.14 12.1 乙二醛酶/博来霉素抗性蛋白质/加双氧酶超家族
Gotl PF04178.2 25 Gotl样家族
HATPase_c PF02518.13 22.4 组氨酸激酶，DNA促旋酶B，和HSP90样ATPase
HSF_DNA结合 PF00447.7 -70 HSF类型DNA结合
HSP20 PF00011.9 13 HSP20/α晶体蛋白家族
HisKA PF00512.13 10.2 His激酶A(磷受体(phosphoacceptor))结构域
同源异型框 PF00046.17 -4.1 同源异型框结构域
Hpt PF01627.11 25 Hpt结构域
异淀粉酶N PF02922.7 -6.5 异淀粉酶N末端结构域
K-框 PF01486.7 0 K-框区域
内酰胺酶_B PF00753.15 22.3 金属β内酰胺酶超家族
Metallophos PF00149.16 22 钙依赖磷酸酶样磷酸酯酶
MtN3_slv PF03083.5 -0.8 MtN3/唾液家族
NAF PF03822.4 25 NAF结构域
NAM PF02365.5 -19 无顶端分生组织(NAM)蛋白质
NIF PF03031.7 -81 NLI相互作用因子样磷酸酶
Oxidored_FMN PF00724.8 -147.7 NADH：黄素氧化还原酶/NADH氧化酶家族
PAS PF00989.12 20 PAS折叠
PDZ PF00595.11 12.1 PDA结构域(还称为DHR或GLGF)
PRA1 PF03208.8 25 PRA1家族蛋白质
肽酶_C15 PF01470.7 -100 焦谷氨酰肽酶
肽酶_S10 PF00450.11 -198 丝氨酸羧肽酶
肽酶_S41 PF03572.7 -25.8 肽酶家族s41
光敏色素 PF00360.9 11 光敏色素区域
Pkinase PF00069.14 -70.8 蛋白质激酶结构域
Pkinase_Tyr PF07714.4 65 蛋白质酪氨酸激酶
吡哆醛_deC PF00282.8 -158.6 吡哆醛依赖性脱羧酶保守结构域
RIO1 PF01163.11 -89.1 RI01家族
RRM_1 PF00076.10 15.2 RNA识别基序(也称为RRM、RBD或RNP结构域)
RTC PF01137.11 -36.9 RNA3′末端磷酸环化酶
RTC_插入片段 PF05189.3 25 RNA3′末端磷酸环化酶(RTC)，插入结构域
Ras PF00071.11 18 Ras家族
应答_reg PF00072.11 -14.4 应答调节物接受结构域
SPC25 PF06703.1 25 微粒体信号肽酶25kDa亚基(sPC25)
SPX PF03105.9 -20 SPX结构域
SRF-TF PF00319.8 11 SPF类型转录因子(DNA结合和二聚化结构域)
小突触小泡蛋白 PF00957.9 25 小突触小泡蛋白
UPF0057 PF01679.7 25 未表征的蛋白质家族UPF0057
 
zf-C2H2    PF00096.14   19           锌指，C2H2类型              
zf-C3HC4   PF00097.12   16.9       锌指，C3HC4类型(RINC指)  
实施例8.具有增强的农艺性状的转基因植物的选择
这个实施例说明了通过选择来源于本发明转基因植物细胞的转基因种子和植物的制备和鉴别，其中通过筛选由蛋白质表达赋予的增强的农艺性状来鉴别植物和种子，所述蛋白质选自实施例4中鉴别的同源蛋白质，SEQ ID NO：121、128、152-160、162和164。用重组DNA转化玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、小麦和稻的转基因植物细胞，以表达实施例4中鉴别的每种同源物。由转化的植物细胞再生植物并将其用于生产后代植物和种子，筛选所述后代植物和种子的增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。通过同源蛋白质的表达鉴别显示赋予的增强的性状的植物。

Claims (22)

1.一种具有稳定整合的重组DNA的植物细胞，其包括在植物细胞中起作用并且与来自植物、细菌或酵母的DNA可操作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值，所述蛋白质结构域家族由AAA、AP2、Aldo ket red、α淀粉酶、Aminotran 1 2、Ank、ArfGap、Asn合酶、BRO1、CBFD NFYB HMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60 TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Di19、E2F TDP、FAD结合7、FA去饱和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase 2、Glyco hydro1、乙二醛酶、Got1、HATPase c、HSFDNA-结合、HSP20、HisKA、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酶B、Metallophos、MtN3 slv、NAF、NAM、NIF、Oxidored FMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶S10、肽酶S41、光敏色素、Peinase、Pkinase Tyr、吡哆醛deC、RIO1、RRM 1、RTC、RTC插入片段、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4组成；其中关于所述蛋白质结构域家族的Pfam聚集截止值在表28中说明；其中通过筛选由所述群体中的植物细胞再生并表达所述蛋白质的植物与不具有所述重组DNA的对照植物相比增强的性状，从具有所述重组DNA的植物细胞群体选择所述植物细胞；并且其中所述增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油。
2.权利要求1的植物细胞，其中所述蛋白质具有的氨基酸序列与共有氨基酸序列群中的共有氨基酸序列具有至少90％的同一性，所述共有氨基酸序列群由关于SEQ ID NO：84构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物，以及关于SEQ ID NO：166构建的共有氨基酸序列和表2中列举的其同源物组成。
3.权利要求1的植物细胞，其中所述蛋白质选自表1中鉴别的蛋白质群。
4.权利要求1的植物细胞，其进一步包括表达蛋白质的DNA，所述蛋白质提供来自暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型所述植物细胞致死的水平应用。
5.权利要求4的植物细胞，其中所述此类除草剂的试剂是草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。
6.一种转基因植物，其包括许多权利要求1的植物细胞。
7.权利要求6的转基因植物，其对于所述重组DNA是纯合的。
8.一种转基因种子，其包括许多权利要求1的植物细胞。
9.权利要求8的转基因种子，其来自玉米、大豆、棉花、低芥酸菜子、苜蓿、小麦或稻植物。
10.权利要求9的非天然、转基因玉米种子，其中所述种子可以产生对来自Mal de Rio Cuarto病毒或高粱柄锈菌真菌或两者的疾病有抵抗力的玉米植物。
11.一种转基因花粉粒，其包括权利要求1的植物细胞的单倍体衍生物。
12.一种用于制备非天然、转基因种子的方法，所述种子可以用于生产一批具有增强的性状的转基因植物，所述增强的性状由稳定整合的重组DNA表达产生，所述重组DNA包括(a)在植物细胞中起作用并且(b)与来自植物、细菌或酵母的DNA可操作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值，所述蛋白质结构域家族由AAA、AP2、Aldo ket red、α淀粉酶、Aminotran12、Ank、ArfGap、Asn合酶、BRO1、CBFD NFYB HMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60 TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Di19、E2F TDP、FAD结合7、FA去饱和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase 2、Glyco hydro1、乙二醛酶、Got1、HATPase c、HSFDNA-结合、HSP20、HisKA、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酶B、Metallophos、MtN3 slv、NAF、NAM、NIF、Oxidored FMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶S10、肽酶S41、光敏色素、Peinase、Pkinase Tyr、吡哆醛deC、RIO1、RRM 1、RTC、RTC插入片段、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4组成；其中关于所述蛋白质结构域家族的Pfam聚集截止值在表28中说明；并且其中所述增强的性状选自增强的水利用效率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用效率、增强的种子蛋白质和增强的种子油，用于制备所述种子的所述方法包括：
(a)在植物群体中筛选所述增强的性状和所述重组DNA，其中在所述群体中的个体植物可以显示的所述性状水平低于、基本上等于或高于所述性状在不表达所述重组DNA的对照植物中显示的水平，
(b)从所述群体中选择一种或多种植物，它们显示的性状水平大于所述性状在对照植物中显示的水平，
(c)证实所述重组DNA稳定整合在所述选择的植物中，
(d)分析所选植物的组织以确定生产的蛋白质具有由SEQ ID NO：1-83之一序列中的核苷酸编码的蛋白质的功能；和
(e)收集来自所选植物的种子。
13.权利要求12的方法，其中所述群体的植物进一步包括表达蛋白质的DNA，所述蛋白质提供针对暴露于除草剂的耐受性，所述除草剂以对野生型植物细胞致死的水平应用，并且其中所述选择通过用所述除草剂处理所述群体来实现。
14.权利要求13的方法，其中所述除草剂包括草甘膦、麦草畏或草铵膦化合物。
15.权利要求12的方法，其中所述选择通过鉴别具有所述增强的性状的植物来实现。
16.权利要求12的方法，其中所述种子是玉米、大豆、棉花、苜蓿、小麦或稻种子。
17.一种生产杂交玉米种子的方法，其包括：
(a)从除草剂耐受性玉米植物获得杂交玉米种子，所述玉米植物还具有稳定整合的重组DNA，所述重组DNA包括(a)在植物细胞中起作用并且(b)与DNA可操作地连接的启动子，所述DNA编码在序列中具有至少一个氨基酸结构域的蛋白质，所述氨基酸结构域对于与Pfam名称组中由Pfam名称鉴别的蛋白质结构域家族的氨基酸序列比对超过Pfam聚集截止值，所述蛋白质结构域家族由AAA、AP2、Aldo ket red、α淀粉酶、Aminotran 1 2、Ank、ArfGap、Asn合酶、BRO1、CBFD NFYB HMF、过氧化氢酶、CorA、Cpn60 TCP1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、DNA光解酶、DSPc、DUF1685、DUF296、Di19、E2F TDP、FAD结合7、FA去饱和酶、FBPase、GAF、GATA、GATase 2、Glycohydro1、乙二醛酶、Got1、HATPase c、HSF DNA-结合、HSP20、HisKA、同源异型框、Hpt、异淀粉酶N、K-框、内酰胺酶B、Metallophos、MtN3 slv、NAF、NAM、NIF、Oxidored FMN、PAS、PDZ、PRA1、肽酶C15、肽酶S10、肽酶S41、光敏色素、Peinase、Pkinase Tyr、吡哆醛deC、RIO1、RRM 1、RTC、RTC插入片段、Ras、应答reg、SPC25、SPX、SRF-TF、小突触小泡蛋白、UPF0057、zf-C2H2、和zf-C3HC4组成；其中关于所述蛋白质结构域家族的Pfam聚集截止值在表28中说明；
(b)由所述杂交玉米种子生产玉米植物，其中由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分对于所述重组DNA是纯合的，由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分对于所述重组DNA是半合子的，并且由所述杂交玉米种子产生的所述植物的一部分没有一种所述重组DNA；
(c)通过用除草剂处理选择对于所述重组DNA是纯合和半合子的玉米植物；
(d)收集来自除草剂处理存活的玉米植物的种子并种植所述种子以产生进一步的后代玉米植物；
(e)将步骤(c)和(d)重复至少一次以产生近交玉米系；
(f)使所述近交玉米系与第二种玉米系杂交以生产杂交种子。
18.选择包括权利要求1的细胞的植物的方法，其中使用免疫反应性抗体检测所述蛋白质在种子或植物组织中的存在。
19.防伪的研磨种子，其具有作为来源指示的权利要求1的植物细胞。
20.一种无需灌溉水培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有权利要求1的植物细胞的种子，所述种子根据增强的水利用效率进行选择。
21.权利要求20的方法，其包括在所述农作物生产过程中提供最高达300毫米的地下水。
22.一种无需添加氮肥料培育玉米、棉花或大豆农作物的方法，其包括种植具有权利要求1的植物细胞的种子，所述种子根据增强的氮利用效率进行选择。
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