ES2748430T3

ES2748430T3 - Endonucleasas de acoplamiento con enzimas de procesamiento de extremos que impulsan la interrupción génica de alta eficiencia

Info

Publication number: ES2748430T3
Application number: ES12751744T
Authority: ES
Inventors: Andrew Scharenberg; Michael Certo; Kamila Gwiazda
Original assignee: Seattle Childrens Hospital; Seattle Childrens Research Institute
Current assignee: Seattle Childrens Hospital; Seattle Childrens Research Institute
Priority date: 2011-02-28
Filing date: 2012-02-24
Publication date: 2020-03-16
Anticipated expiration: 2032-02-24
Also published as: EP2680877A2; US20170152503A1; US20210261946A1; US20170152504A1; US11873479B2; EP4062927A1; EP2680877A4; US10745688B2; US20170152505A1; US10745689B2; US20140227244A1; US20120276074A1; US10995332B2; CA2828303C; US20170152502A1; WO2012118717A3; EP3603662A1; US11008565B2; US20210254043A1; US20160312210A1

Abstract

Polinucleótido(s) para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación de una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería en una célula, en la que el(los) polinucleótido(s) codifica(n) una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, I-PanMI, IOnuI, 1-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos.

Description

DESCRIPCIÓN

Endonucleasas de acoplamiento con enzimas de procesamiento de extremos que impulsan la interrupción génica de alta eficiencia

Solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad para la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos No. 61/447,672, presentada el 28 de febrero de 2011.

Declaración con respecto a I y D patrocinado federalmente

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno en virtud de la Subvención No. T32 GM07270 otorgada por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de Estados Unidos y Subvenciones Nos. RL1CA133832, UL1DE019582, R01-HL075453, PL1-HL092557, RL1-HL092553, RL1-HL92554 y U19-AI96111 otorgadas por los Institutos Nacionales de Salud.

Campo

La presente divulgación se refiere a la biología molecular y celular. Algunas realizaciones se refieren a la ingeniería del genoma y la introducción de rupturas de ADN específicas de sitio dirigidas mediadas por endonucleasas para lograr la interrupción génica o la recombinación específica de sitio. Varias realizaciones se refieren a composiciones y métodos para la inactivación parcial o completa de un gen objetivo. Algunas realizaciones se refieren a la inactivación de un gen objetivo con propósitos terapéuticos y/o para producir estirpes celulares en las que se inactiva un gen objetivo.

Antecedentes

La interrupción génica dirigida tiene una amplia aplicabilidad para usos de investigación, terapéuticos, agrícolas e industriales. Una estrategia para producir la interrupción génica dirigida es a través de la generación de rupturas de ADN de cadena doble provocadas por endonucleasas específicas de sitio. Las endonucleasas se utilizan con mayor frecuencia para la interrupción génica dirigida en organismos que tradicionalmente han sido resistentes a métodos de direccionamiento genético más convencionales, tales como algas, plantas y modelos animales grandes, que incluyen humanos. Por ejemplo, actualmente se están realizando ensayos clínicos en humanos que implican nucleasas de dedos de zinc para el tratamiento y prevención de infección por VIH. Adicionalmente, la ingeniería de endonucleasas se está utilizando actualmente para intentar alterar genes que producen fenotipos indeseables en cultivos.

Las endonucleasas de asentamiento, también conocidas como meganucleasas, son endonucleasas específicas de secuencia que generan rupturas de cadena doble en el ADN genómico con un alto grado de especificidad debido a sus grandes sitios de división (por ejemplo, >14 pb). Si bien la especificidad de las endonucleasas de asentamiento para sus sitios objetivo permite un direccionamiento preciso de las rupturas de ADN inducidas, los sitios de división de endonucleasas de asentamiento son raros y la probabilidad de encontrar un sitio de división natural en un gen objetivo es baja.

Una clase de endonucleasas artificiales son las endonucleasas de dedo de zinc. Las endonucleasas de dedo de zinc combinan un dominio de división no específico, normalmente aquel de la endonucleasa FokI, con dominios de proteína de dedo de zinc que están diseñados para unirse a secuencias de ADN específicas. La estructura modular de las endonucleasas de dedo de zinc las convierte en una plataforma versátil para suministrar rupturas de cadena doble específicas de sitio al genoma. Una limitación de las endonucleasas de dedo de zinc es que la baja especificidad para un sitio objetivo o la presencia de múltiples sitios objetivo en un genoma pueden provocar eventos de división fuera del objetivo. A medida que la endonucleasa Fok1 se divide como un dímero, una estrategia para evitar eventos de división fuera del objetivo ha sido diseñar dominios de dedos de zinc que se unan en sitios adyacentes de 9 pares bases.

Otra clase de endonucleasas artificiales son las meganucleasas diseñadas por ingeniería. Las endonucleasas de asentamiento diseñadas por ingeniería se generan al modificar la especificidad de las endonucleasas de asentamiento existentes. En un enfoque, se introducen variaciones en la secuencia de aminoácidos de las endonucleasas de asentamiento de origen natural y luego las endonucleasas de asentamiento resultantes se criban para seleccionar proteínas funcionales que dividen un sitio de unión dirigido. En otro enfoque, las endonucleasas de asentamiento quiméricas se diseñan al combinar los sitios de reconocimiento de dos endonucleasas de asentamiento diferentes para crear un nuevo sitio de reconocimiento compuesto por un medio sitio de cada endonucleasa de asentamiento.

La mutagenicidad de las rupturas de ADN de cadena doble generadas por las endonucleasas naturales y artificiales depende de la precisión de la reparación del ADN. Las rupturas de cadena doble provocadas por las endonucleasas se reparan comúnmente a través de la unión de extremos no homólogos (NHEJ), que es la principal ruta de reparación de rupturas de cadena doble de ADN para muchos organismos. NHEJ se conoce como “no homólogo” porque los extremos de ruptura se ligan directamente sin la necesidad de una plantilla homóloga, en contraste con la recombinación homóloga, que utiliza una secuencia homóloga para guiar la reparación. La reparación imprecisa a través de esta ruta puede provocar mutaciones en el sitio de ruptura, tal como eliminaciones e inserciones de la base de ADN, así como translocaciones y fusión de telómeros. Cuando las mutaciones se realizan dentro de la secuencia de codificación de un gen, pueden hacer que el gen y su producto de proteína posterior no funcional, creen una interrupción génica dirigida o “inactivación” del gen.

La reparación de ruptura de ADN de cadena doble a través de la ruta de NHEJ a menudo no es mutagénica. La mayoría de las rupturas inducidas por endonucleasas reparadas por la ruta de NHEJ implican un religamiento preciso, lo que resulta en la restauración de la secuencia de a Dn original. Esto es especialmente cierto para los tipos de rupturas de ADN creadas por las plataformas de endonucleasas actuales disponibles para la especificidad de sitio diseñada por ingeniería, a saber, endonucleasas de asentamiento (meganucleasas) y nucleasas de dedos de zinc. Ambos tipos de enzimas dejan salientes de pares bases compatibles que no requieren procesamiento antes del nuevo ligamiento por la ruta de NHEJ. Cuando las salientes son compatibles, la NHEJ repara la ruptura con un alto grado de precisión. Por lo tanto, desde el punto de vista de la ingeniería del genoma, muchos de los eventos de división generados por las actuales plataformas de endonucleasa específicas de sitio son improductivos. La necesidad de soluciones adicionales a estos problemas es manifiesta.

Bennardo et al. (PLOS, 2009) utiliza las endonucleasas de corte raro I-SceI para estudiar las rutas de reparación de rupturas de cadena doble cromosómicas (DSB) mediante la reparación de DSB específicos del sitio generadas por endonucleasas de corte raro. Bennardo et al. modificó los DSB inducidos por I-SceI al coexpresar I-SceI con una exonucleasa 39 no procesiva, Trex2. Utilizando este enfoque, Bennardo et al. encuentra que la expresión de Trex2 provoca una reducción significativa en la frecuencia de las rutas de reparación que dan como resultado mutaciones de supresión sustanciales: EJ entre los extremos distales de dos DSB en tándem, hibridación de cadena sencilla y NHEJ alternativa. En contraste, la expresión de Trex2 no inhibe la reparación dirigida por homología.

Resumen

La invención se define en las reivindicaciones. La mutagénesis del ADN celular puede ocurrir cuando un evento de división del ADN es seguido por una unión final imprecisa durante la reparación del ADN. Como se divulga en el presente documento, una estrategia para aumentar la frecuencia de eventos de reparación de ADN imprecisos es al modificar las salientes compatibles generadas en las rupturas de ADN de cadena doble con una enzima de procesamiento de extremos. Los métodos y composiciones descritos en este documento son ampliamente aplicables y pueden involucrar a cualquier agente de interés que genere extremos romos o salientes compatibles al dividir el ADN de cadena doble, por ejemplo, nucleasas, radiación ionizante, tal como rayos X y rayos gamma, así como fármacos tales como bleomicina, cisplatino y mitomicina C. Varios ejemplos divulgados en el presente documento se refieren a métodos para acoplar la generación de rupturas de ADN de cadena doble a la modificación de salientes compatibles generados en el sitio de división con una enzima de procesamiento de extremos de ADN. Varios ejemplos divulgados en el presente documento se refieren a métodos para acoplar la generación de rupturas de ADN de cadena doble a la modificación de extremos romos generados en el sitio de división con una enzima de procesamiento de extremos. Algunos ejemplos divulgados en el presente documento se refieren a métodos para acoplar la generación de rupturas de ADN de cadena doble a la división de los enlaces de fosfodiéster expuestos en el sitio de ruptura de ADN por una exonucleasa. Algunos ejemplos divulgados en el presente documento se refieren a métodos para acoplar la generación de rupturas de ADN de cadena doble a la adición de bases de ADN a un extremo de ADN expuesto por una polimerasa no plantilla.

En aún otro aspecto, los métodos y composiciones descritos en el presente documento son ampliamente aplicables y pueden implicar cualquier agente de interés que genere rupturas en un polinucleótido. Varios ejemplos divulgados en el presente documento se refieren a métodos para acoplar la generación de rupturas de polinucleótidos a la modificación de extremos de polinucleótidos generados en el sitio de división con una enzima de procesamiento de extremos. En algunos ejemplos, el polinucleótido puede ser ADN de cadena doble, ADN de cadena sencilla, ARN de cadena, ARN de cadena sencilla, híbridos de ADN/^aRⁿde cadena doble y polinucleótidos sintéticos.

Varios ejemplos divulgados en este documento se refieren a una estrategia para aumentar la frecuencia de eventos de reparación de ADN imprecisos al modificar salientes compatibles generadas en las rupturas de ADN generadas por exonucleasa con una enzima de procesamiento de extremos de ADN. Varios ejemplos divulgados en este documento se refieren a métodos para acoplar la división específica de sitio de una secuencia de ADN dirigida a modificación de salientes compatibles generadas en el sitio de división con una enzima de procesamiento de extremos de ADN. Varios ejemplos divulgados en este documento se refieren a métodos para acoplar la división específica de sitio de una secuencia de ADN dirigida a modificación de extremos de ADN romos generados en el sitio de división con una enzima de procesamiento de extremos de ADN. Algunos ejemplos divulgados en este documento se refieren a métodos para acoplar la división específica de sitio de una secuencia de ADN dirigida por una endonucleasa para la división de los enlaces de fosfodiéster expuestos en el sitio de división de ADN por una exonucleasa. Algunos ejemplos divulgados en este documento se refieren a métodos para acoplar la división específica de sitio de una secuencia de ADN dirigida por una endonucleasa a la adición de bases de ADN a un extremo de ADN expuesto por una polimerasa no plantilla. Algunos ejemplos divulgados en este documento se refieren a métodos para acoplar la división específica de sitio de una secuencia de ADN dirigida por una endonucleasa para eliminación de un 5' fosfato en el sitio de división de ADN por una 5'-fosfatasa. Algunos ejemplos divulgados en este documento se refieren a métodos para acoplar la división específica de sitio de una secuencia de ADN dirigida por una endonucleasa para eliminación de un 3'fosfato en el sitio de división de ADN por una 3'fosfatasa. Adicionalmente se divulgan en este documento proteínas de fusión, que comprenden uno o más dominios de endonucleasa específicos de sitio unidos a uno o más dominios de procesamiento de extremos de ADN.

Ejemplos de endonucleasas incluyen endonucleasas de asentamiento (meganucleasas), nucleasas de dedos de zinc y nucleasas efectoras TAL. Las endonucleasas pueden comprender dominios de unión a ADN y división heterólogos (por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc; dominios de unión a ADN de endonucleasa de asentamiento con dominios de división heterólogos o fusiones de nucleasa del dominio efector TAL) o, alternativamente, el dominio de unión a ADN de una nucleasa de origen natural se puede alterar para unirse a un sitio objetivo seleccionado (por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento que se ha diseñado por ingeniería para unirse a un sitio diferente al sitio de unión afín a una fusión de nucleasa del dominio efector TAL).

Ejemplos de enzimas de procesamiento de extremos de ADN incluyen 5-3'exonucleasas, 3-5'exonucleasas, 5-3' exonucleasas alcalinas, 5' endonucleasas de tipo alerón, helicasas, fosfatasas, hidrolasas y polimerasas de ADN independientes de la plantilla. Las exonucleasas pueden comprender dominios de unión al ADN y procesamiento de extremos heterólogos (por ejemplo, un dedo de zinc y un dominio de exonucleasa).

Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas (enzimas que inciden en el ADN en un sitio objetivo interno específico) con una o más enzimas de procesamiento de extremos, con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos del polinucleótido producidos por división de polinucleótido mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más exonucleasas (enzimas que catalizan la eliminación de bases de polinucleótido a partir de un extremo de polinucleótido expuesto) con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos del polinucleótido producidos por división de polinucleótido mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más polimerasas no plantilla (enzimas que catalizan la adición de bases de ADN a un extremo de ADN expuesto) con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos de ADN producidos por división de ADN mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más fosfatasas que catalizan la eliminación de un 5' fosfato con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos del polinucleótido producidos por división de polinucleótido mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más fosfatasas que catalizan la eliminación de un 3' fosfato con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos del polinucleótido producidos por división de polinucleótido mediada por endonucleasa. En algunos ejemplos, una endonucleasa se acopla a una enzima de procesamiento de extremos.

Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas (enzimas que inciden en el ADN en un sitio objetivo interno específico) con una o más enzimas de procesamiento de extremos de ADN, con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos de ADN producidos por división de ADN mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más exonucleasas (enzimas que catalizan la eliminación de bases de ADN desde un extremo de ADN expuesto) con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos de ADN producidos por división de ADN mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más polimerasas no plantilla (enzimas que catalizan la adición de bases de ADN a un extremo de ADN expuesto) con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos de ADN producidos por división de ADN mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más fosfatasas que catalizan la eliminación de un 5' fosfato con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos de ADN producidos por división de ADN mediada por endonucleasa. Diversos ejemplos se refieren a la coexpresión de una o más endonucleasas con una o más fosfatasas que catalizan la eliminación de un 3' fosfato con el fin de lograr procesamiento mejorado de los extremos de ADN producidos por división de ADN mediada por endonucleasa. En algunos ejemplos, una endonucleasa se acopla a una enzima de procesamiento de extremos de ADN.

Un aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para mejorar la frecuencia de mutación asociada con división mediada por nucleasa de ADN celular en una región de interés (por ejemplo, se proporciona un método para interrupción dirigida de secuencias genómicas), el método comprende: (a) seleccionar una secuencia en la región de interés; (b) seleccionar una endonucleasa específica de sitio que divide la secuencia dentro de la región de interés; y (c) suministrar una o más proteínas de fusión a la célula, las proteínas de fusión comprenden uno o más dominios de endonucleasa específicos de sitio y uno o más dominios de procesamiento de extremos de ADN; en los que el dominio de endonucleasa divide el ADN en la región de interés. En algunas realizaciones, una proteína de fusión se puede suministrar a una célula al suministrar un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula. En algunos ejemplos el polinucleótido es ADN. En otras realizaciones, el polinucleótido es ARN. En algunos ejemplos, una proteína de fusión se puede expresar en una célula al suministrar un vector de ADN que codifica la proteína de fusión a una célula, en el que el vector de ADN se transcribe y el producto de transcripción de ARNm se traduce para generar la proteína de fusión. En algunas realizaciones, una proteína de fusión se puede expresar en una célula al suministrar una molécula de ARN que codifica la proteína de fusión a la célula en la que la molécula de ARN se traduce para generar la proteína de fusión. En algunos ejemplos, una proteína de fusión se puede suministrar directamente a la célula.

Otro aspecto divulgado en este documento se refiere a que se proporciona un método para mejorar la frecuencia de mutación asociada con división mediada por nucleasa de ADN celular en una región de interés (por ejemplo, un método para interrupción dirigida de secuencias genómicas), el método comprende: (a) seleccionar una secuencia en la región de interés; (b) seleccionar una o más endonucleasas específicas de sitio que dividen la secuencia dentro de la región de interés; y (c) coexpresar la una o más endonucleasas seleccionadas y una o más enzimas de procesamiento de extremos en la célula; en las que la endonucleasa divide el ADN en la región de interés y la enzima de procesamiento de extremos modifica los extremos de ADN expuestos por la endonucleasa. Las nucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se pueden expresar en una célula, por ejemplo, al suministrar las proteínas a la célula o al suministrar uno o más polinucleótidos que codifican las nucleasas a una célula. En algunos ejemplos, un polinucleótido único codifica una o más endonucleasas y una o más enzimas de procesamiento de extremos bajo el control de un promotor único. En algunos ejemplos, una o más endonucleasas y una o más enzimas de procesamiento de extremos se acoplan mediante uno o más motivos peptídicos de “omisión” de T2A. En algunos ejemplos, una o más endonucleasas y una o más enzimas de procesamiento de extremos se codifican mediante polinucleótidos separados. En algunos ejemplos, la expresión de la enzima de procesamiento de extremos de ADN precede aquella de la endonucleasa.

Aún otro aspecto divulgado en este documento se refiere a que se proporciona un método para mejorar la frecuencia de mutación asociada con división mediada por nucleasa de a Dn celular en múltiples regiones de interés (por ejemplo, un método para interrupción dirigida de múltiples secuencias genómicas), el método comprende: (a) seleccionar una primera secuencia en una primera región de interés; (b) seleccionar una primera endonucleasa específica de sitio que divide la primera secuencia dentro de la primera región de interés; (c) seleccionar una segunda secuencia en una segunda región de interés; (d) seleccionar una segunda nucleasa específica de sitio que divide la segunda secuencia dentro de la segunda región de interés y (c) coexpresar las endonucleasas seleccionadas y una o más enzimas de procesamiento de extremos en la célula; en las que la primera endonucleasa divide el ADN en la primera región de interés, la segunda endonucleasa divide el ADN en la segunda región de interés y la una o más enzimas de procesamiento de extremos modifican los extremos de ADN expuestos. Las nucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se pueden expresar en una célula, por ejemplo, al suministrar las proteínas a la célula o al suministrar uno o más polinucleótidos que codifican las nucleasas y enzimas de procesamiento de extremos a una célula. En algunos ejemplos, un polinucleótido único codifica tanto la primera como la segunda endonucleasas y la una o más enzima de procesamiento de extremos bajo el control de un promotor único. En algunos ejemplos, las endonucleasas y las enzimas de procesamiento de extremos se acoplan mediante uno o más motivos peptídicos de “omisión” de T2A. En algunos ejemplos, la primera y segunda regiones de interés están en el mismo gen. En otros ejemplos, la primera y segunda regiones de interés están en diferentes genes. En algunos ejemplos el método comprende adicionalmente la coexpresión de una tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, y/o décima endonucleasa en la célula.

Aún otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar, prevenir, o inhibir la infección por VIH o aliviar una afección asociada con VIH en un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una célula, un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende: (i) un dominio de unión a ADN de dedo de zinc que se diseña por ingeniería para unirse a un primer sitio objetivo en el gen CCR5; y (ii) un dominio de división; y (iii) un dominio de procesamiento de extremos bajo condiciones tales que el polipéptido se expresa en la célula, por lo cual el polipéptido se une al sitio objetivo y divide el gen CCR5 y el dominio de enzima de procesamiento de extremos modifica la endonucleasa sitio de división; y (b) introducir la célula en el sujeto. En ciertos ejemplos, la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula madre hematopoyética, una célula T, un macrófago, una célula dendrítica, y una célula que presenta antígeno.

Aún otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar o prevenir o inhibir la infección por VIH o aliviar una afección asociada con VIH en un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una célula, un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende: (i) un dominio de unión a ADN de dedo de zinc que se diseña por ingeniería para unirse a un primer sitio objetivo en el gen CCR5; y (ii) un dominio de división; y el segundo polipéptido comprende una enzima de procesamiento de extremos bajo condiciones tales que los polipéptidos se coexpresan en la célula, por lo cual el primer polipéptido se une al sitio objetivo y divide el gen CCR5 y la enzima de procesamiento de extremos modifica los extremos de ADN expuestos creados en la endonucleasa sitio de división; y (b) introducir la célula en el sujeto. En ciertos ejemplos, la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula madre hematopoyética, una célula T, un macrófago, una célula dendrítica y una célula que presenta antígeno.

Otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar o prevenir o inhibir la infección por VIH o aliviar una afección asociada con VIH en un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una célula, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido comprende: (i) un dominio endonucleasa de asentamiento que se diseña por ingeniería para unirse a un primer sitio objetivo en el gen CCR5; y (ii) un dominio de procesamiento de extremos bajo condiciones tales que el polipéptido se expresa en la célula, por lo cual el polipéptido se une al sitio objetivo y divide el gen CCR5 y modifica los extremos de ADN expuestos creados en el sitio de división; y (b) introducir la célula en el sujeto. En ciertas realizaciones, el ADN dominio de procesamiento de extremos comprende una exonucleasa.

Otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar o prevenir o inhibir la infección por VIH o aliviar una afección asociada con VIH en un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una célula, un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende una endonucleasa de asentamiento que se diseña por ingeniería para unirse a un sitio objetivo en el gen CCR5; y el segundo polipéptido comprende una enzima de procesamiento de extremos bajo condiciones tales que los polipéptidos se coexpresan en la célula, por lo cual el primer polipéptido se une al sitio objetivo y divide el gen CCR5 y la enzima de procesamiento de extremos modifica los extremos de ADN expuestos creados en la endonucleasa sitio de división; y (b) introducir la célula en el sujeto. En ciertos ejemplos, la enzima de procesamiento de extremos comprende una exonucleasa. En algunos ejemplos, la endonucleasa de asentamiento y la enzima de procesamiento de extremos se acoplan mediante uno o más motivos peptídicos de “omisión” de T2A.

Otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar o prevenir o inhibir la infección por VIH o aliviar una afección asociada con VIH en un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una célula, un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende: una endonucleasa de asentamiento que se diseña por ingeniería para unirse a un primer sitio objetivo en el gen CCR5; y (b) introducir, en la célula, un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido comprende: una enzima de procesamiento de extremos; bajo condiciones tales que los polipéptidos se expresan en la célula, por lo cual la endonucleasa de asentamiento se une al sitio objetivo y divide el gen CCR5 y la enzima de procesamiento de extremos modifica los extremos de ADN expuestos creados en la endonucleasa sitio de división; y (b) introducir la célula en el sujeto. En ciertos ejemplos, la enzima de procesamiento de extremos comprende una exonucleasa. En algunos ejemplos, la expresión de la enzima de procesamiento de extremos precede aquella de la endonucleasa.

Otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar o prevenir o inhibir síndrome de hiper IGE o aliviar una afección asociada con síndrome de hiper IGE un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una o más células, un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que el polipéptido comprende: (i) un dominio endonucleasa de asentamiento que se diseña por ingeniería para unirse a un primer sitio objetivo en el gen Stat3; y (ii) un dominio de procesamiento de extremos bajo condiciones tales que el polipéptido se expresa en la célula, por lo cual el polipéptido se une al sitio objetivo y divide el gen Stat3 y modifica los extremos de ADN expuestos creados en la endonucleasa sitio de división. En ciertos ejemplos, el dominio de enzima de procesamiento de extremos comprende una exonucleasa. Otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar o prevenir o inhibir síndrome de hiper IGE o aliviar una afección asociada con síndrome de hiper IGE un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una célula, un primer ácido nucleico que codifica un primer polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende: una endonucleasa de asentamiento que se diseña por ingeniería para unirse a un primer sitio objetivo en el gen Stat3; y (b) introducir, en la célula, un segundo ácido nucleico que codifica un segundo polipéptido, en el que el segundo polipéptido comprende: una enzima de procesamiento de extremos; bajo condiciones tales que los polipéptidos se expresan en la célula, por lo cual la endonucleasa de asentamiento se une al sitio objetivo y divide el gen Stat3 y la enzima de procesamiento de extremos modifica los extremos de ADN expuestos creados en la endonucleasa sitio de división. En ciertos ejemplos, la enzima de procesamiento de extremos comprende una exonucleasa. En algunos ejemplos, la expresión de la enzima de procesamiento de extremos precede aquella de la endonucleasa.

Aún otro aspecto divulgado en este documento se refiere a un método para tratar o prevenir o inhibir síndrome de hiper IGE o aliviar una afección asociada con síndrome de hiper IGE un sujeto, el método comprende: (a) introducir, en una célula, un ácido nucleico que codifica un primer polipéptido y un segundo polipéptido, en el que el primer polipéptido comprende una endonucleasa de asentamiento que se diseña por ingeniería para unirse a un primer sitio objetivo en el gen Stat3 y el segundo polipéptido comprende una enzima de procesamiento de extremos; bajo condiciones tales que los polipéptidos se coexpresan en la célula, por lo cual la endonucleasa de asentamiento se une al sitio objetivo y divide el gen Stat3 y la enzima de procesamiento de extremos modifica los extremos de ADN expuestos creados en la endonucleasa sitio de división. En ciertos ejemplos, la enzima de procesamiento de extremos comprende una exonucleasa. En algunos ejemplos, la endonucleasa de asentamiento y la enzima de procesamiento de extremos se acoplan mediante uno o más motivos peptídicos de “omisión” de T2A.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A muestra un esquema del sistema de Indicador de Luz de Tráfico (TLR) para medir la efectividad de la interrupción génica inducida por exonucleasa. Las células positivas a mCherry representan una proporción de las células totales que han experimentado interrupción génica. Las Figuras 1B-1H muestran representaciones esquemáticas de vectores de expresión para de suministro de endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN.

La Figura 2A muestra diagramas de flujo representativos de células HEK293 que albergan Indicador de luz de Tráfico transfectado con vectores de expresión que codifican SceD44A-IRES-BFP, SceD44A-T2A-Trex2-IRES-BFP, I-SceI-IRES-BFP, y I-SceI-T2A-Trex2- IRES-BFP. SceD44A corresponde a una forma mutante inactiva de I-SceI. La Figura 2B muestra la cuantificación de la interrupción génica en tres transfecciones independientes de los vectores indicados en la Figura 2A. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM), y valores p (con * que representa p<0.05, ** p<0.005, y *** p<0.0005) se calcularon utilizando la prueba t no pareada de dos colas de Student para comparar las muestras indicadas en esta y todas las figuras posteriores.

La Figura 3A muestra diagramas de flujo representativos de células HEK293 que albergan Indicador de luz de Tráfico transfectado con vectores de expresión que codifican I-SceI-IRES-BFP, I-SceI-T2A-Trex2-BFP, o I-SceI-G4S-Trex2-IRES BFP. La Figura 3B muestra una transferencia de Western anti-HA que demuestra expresiones iguales de endonucleasa, y estabilidad de las proteínas (HA-)I-SceI, (HA-)ISceI- T2A y (HA-)I-SceI-G4S-Trex2 de la Figura 3A. La Figura 3C es una transferencia de Western de licor que muestra el tamaño y estabilidad de la I-SceI etiquetado HA en los lisatos HEK293T indicados.

La Figura 4A muestra el análisis de ventana de células HEK293 que albergan Indicador de Luz de Tráfico transfectado con I-SceI-IRESBFP. La Figura 4B muestra un análisis de ventana de células HEK293 que albergan Indicador de Luz de Tráfico transfectado con vectores de expresión I-SceIT2A- Trex2-IRES-BFP.

La Figura 5A muestra una digestión de restricción I-SceI de amplicones que flanquean el sitio objetivo I-SceI de las células HEK293 que albergan indicador de luz de tráfico ordenado por los niveles de expresión de BFP seguidos por transfección con construcciones de expresión como se indica en la Figura 4A y la Figura 4B. La Figura 5B muestra la cuantificación de tres experimentos independientes como se describe en la Figura 5A.

La Figura 6 muestra los resultados de la secuenciación de ADN de amplicones que rodean el sitio objetivo I-SceI en células de Indicador de Luz de Tráfico HEK293 tratadas con I-SceI-IRES-BFP o I-SceI-T2A-Trex2-IRES-BFP.

La Figura 7 muestra una gráfica que puntúa las mutaciones observadas (las supresiones son negativas, las inserciones son positivas) en el sitio objetivo I-SceI luego de transfección de células de Indicador de Luz de Tráfico HEK293 con I-SceI-IRES-BFP o I-SceI-T2A-Trex2- IRES-BFP como se describe en la Figura 5.

La Figura 8A muestra un análisis de curso de tiempo cinético que demuestra la expresión transitoria de I-SceI-T2A-Trex2-IRES-BFP después de la transfección en células HEK293 que albergan Indicador de Luz de Tráfico. Las construcciones mostradas se dirigen a BFP mediante una secuencia IRES en dirección descendente de cualquiera de I-SceI o Trex2. La Figura 8B muestra una gráfica que cuantifica 3 experimentos de células HEK293T transfectadas con los vectores indicados en la Figura 8A, analizadas en los puntos de tiempo indicados. Cherry indica las tasas de interrupción génica observadas en células transfectadas.

La Figura 9A muestra una digestión de restricción I-SceI de amplicones de fibroblastos embrionarios murinos primarios que abarcan un sitio objetivo I-SceI 72 horas después de transducción con I-SceIIRES BFP o I-SceI-T2A-Trex2-IRES-BFP. La Figura 9B muestra una gráfica que cuantifica la interrupción del sitio de división en 2 experimentos independientes.

La Figura 9C muestra una digestión de restricción I-SceI de amplicones de linaje de médula ósea agotada que abarca un sitio objetivo I-SceI 72 horas después de transducción con I-SceI-IRES BFP o I-SceI-T2A-Trex2-IRES-BFP. La Figura 9D muestra la cuantificación de bandas de la Figura 9C.

La Figura 10 muestra una gráfica que cuantifica las tasas de interrupción génica de varias endonucleasas de asentamiento diferentes con y sin exonucleasa Trex2 según se mide por células HEK293 que albergan Indicadores de Luz de Tráfico con sitios objetivo respectivos para las endonucleasas de asentamiento indicadas.

La Figura 11A muestra diagramas de flujo representativos y sitios objetivos de células de Indicador de Luz de Tráfico HEK293 luego de transfección con una endonucleasa de asentamiento con y sin Trex2 y un nucleasa de dedo de zinc con y sin Trex2. La Figura 11B muestra una gráfica de un experimento independiente que examina la mutación de sitio de división para I-SceI y Nucleasa de dedo de zinc en la presencia y ausencia de Trex2. La Figura 11C muestra una gráfica de células de Indicador de Luz de Tráfico HEK293 luego de cotransfección de un HE con Trex2 o un TALEN con Trex2.

La Figura 12A muestra diagramas de flujo representativos de células HEK293 que albergan Indicadores de Luz de Tráfico con un sitio objetivo I-AniI luego de transfección con cualquiera de I-AniI-IRES-BFP, I-AniI-T2A-Trex2-IRES-BFP, I-AniIY2-IRES-BFP, I-AniIY2- T2A-Trex2-IRES-BFP. La Figura 12B muestra una gráfica que cuantifica 3 experimentos independientes como se realiza en la Figura 12A.

La Figura 13 muestra una gráfica que representa análisis del ciclo celular de fibroblastos embrionarios murinos transducidos con virus Simulado, I-SceIIRES- BFP, o I-SceI-T2A-Trex2-IRES-BFP.

La Figura 14 muestra una gráfica que representa el mantenimiento de la expresión de BFP en células transducidas con un lentivirus integrador que contiene I-SceID44A-IRES-BFP o I-SceID44A-T2A-Trex2-IRES-BFP.

La Figura 15A muestra una gráfica que mide la supervivencia de células madre hematopoyéticas CD34+ humanas cuando se transduce con ISceID44A- IRES-BFP o I-SceID44A-T2A-Trex2-IRES-BFP e inocula con Mitomicina C. La Figura 15B muestra una gráfica que mide la supervivencia de células madre hematopoyéticas CD34+ humanas cuando se transduce con I-SceID44A-IRES-BFP o ISceID44A- T2A-Trex2-IRES-BFP e inocula con camptotecina. La Figura 15C muestra una gráfica que mide la supervivencia de células madre hematopoyéticas CD34+ humanas cuando se transduce con I-SceID44A-IRES-BFP o I-SceID44A-T2A-Trex2- IRES-BFP e inocula con radiación ionizante.

La Figura 16A muestra una gráfica que mide la supervivencia de células de fibroblastos embrionarios murinos cuando se transduce con I-SceID44AIRES- BFP o I-SceID44A-T2A-Trex2-IRES-BFP e inocula con Mitomicina C. La Figura 16B muestra una gráfica que mide la supervivencia de células de fibroblastos embrionarios murinos cuando se transduce con I-SceID44A-IRES-BFP o I-SceID44A-T2ATrex2- IRES-BFP e inocula con camptotecina.

La Figura 17A muestra diagramas de flujo representativos de células de Indicador de Luz de Tráfico HEK293 luego de cotransfección de ISceI- IRES-BFP y un plásmido de expresión que codifica para la enzima de procesamiento de extremos indicada. La Figura 17B muestra una gráfica que cuantifica 3 experimentos independientes como se realiza en la Figura 17A.

La Figura 18A muestra diagramas de flujo representativos de a análisis de ventana de I-SceI-IRES-BFP cotransfectado con plásmido de expresión ARTEMIS como se indica en la Figura 17A. La Figura 18B muestra una gráfica que cuantifica análisis de ventana de diversas enzimas de procesamiento de extremos de 3 experimentos independientes como se indica en la Figura 18A.

La Figura 19A muestra una gráfica de células de Indicador de Luz de Tráfico HEK293 luego de cotransfección con un nucleasa de dedo de zinc y la enzima de procesamiento de extremos indicada plásmido de expresión. La Figura 19B muestra una gráfica de células de Indicador de Luz de Tráfico HEK293 luego de cotransfección con a TALEN y la enzima de procesamiento de extremos indicada plásmido de expresión.

La Figura 20 muestra una comparación de niveles de expresión y tasas de interrupción génica entre lentivirus integrador y lentivirus deficiente en integrasa de I-SceI con y sin acoplamiento de exonucleasa sobre células de indicador de Luz de Tráfico HEK293.

La Figura 21A muestra la imagen celular en vivo de células 72 horas después de transfección simulada o transfección con vectores de expresión que codifican I-SceI-IRES-BFP o I-SceI-T2A-Trex2-IRES-BFP. La Figura 21B muestra una gráfica que representa el mantenimiento de expresión de BFP en células transducidas con un lentivirus integrador que contiene solo BFP (sin Trex2) o Trex2-BFP.

Descripción detallada

Definiciones

En la descripción que sigue, se utilizan ampliamente varios términos. Las siguientes definiciones se proporcionan para facilitar la comprensión de las realizaciones presentes.

Como se utiliza en el presente documento, “un” o “una” pueden significar uno o más de uno.

Como se utiliza en el presente documento, el término “aproximadamente” indica que un valor incluye la variación inherente de error para el método que se emplea para determinar un valor, o la variación que existe entre los experimentos.

Como se utiliza en el presente documento, “ácido nucleico” o “molécula de ácido nucleico” se refiere a polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquier de ligadura, división, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas de monómeros que son nucleótidos naturales (como ADN y ARN), o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos de origen natural), o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en fracciones de azúcar y/o en fracciones de base de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, el reemplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares se pueden funcionalizar como éteres o ésteres. Más aún, toda la fracción de azúcar se puede reemplazar con estructuras similares estérica y electrónicamente, tales como azúcares aza y análogos de azúcar carbocíclico. Los ejemplos de modificaciones en una fracción base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar unidos por enlaces de fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Los análogos de los enlaces de fosfodiéster incluyen fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforanilidato, fosforamidato y similares. El término “molécula de ácido nucleico” también incluye los llamados “ácidos nucleicos peptídicos”, que comprenden bases de ácido nucleico modificadas o de origen natural unidas a una estructura principal de poliamida. Los ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla o de cadena doble.

El término “contig” denota una molécula de ácido nucleico que tiene un tramo contiguo de secuencia idéntica o complementaria a otra molécula de ácido nucleico. Se dice que las secuencias contiguas “se superponen” a un tramo dado de una molécula de ácido nucleico en su totalidad o a lo largo de un tramo parcial de la molécula de ácido nucleico.

El término “secuencia de nucleótidos degenerados” denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados en comparación con una molécula de ácido nucleico de referencia que codifica un polipéptido. Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácido (por ejemplo, los tripletes GAU y GAC cada uno codifica Asp). Se entenderá que, como resultado de la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican una proteína dada tal como una endonucleasa, enzima de procesamiento de extremos o proteína de fusión de endonucleasa/enzima de procesamiento de extremos de las presentes realizaciones.

El término “complementario a” significa que la secuencia complementaria es homóloga a toda o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos “CATTAG” corresponde a una secuencia de referencia “CATTAG” y es complementaria a una secuencia de referencia “GTAATC”.

El término “gen estructural” se refiere a una molécula de ácido nucleico que se transcribe en ARN mensajero (ARNm), que luego se traduce en una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico.

Una “molécula de ácido nucleico aislada” es una molécula de ácido nucleico que no está integrada en el ADN genómico de un organismo. Por ejemplo, una molécula de ADN que codifica un factor de crecimiento que se ha separado del ADN genómico de una célula es una molécula de ADN aislada. Otro ejemplo no limitante de una molécula de ácido nucleico aislada es una molécula de ácido nucleico sintetizada químicamente que no está integrada en el genoma de un organismo. Una molécula de ácido nucleico que se ha aislado de una especie particular es más pequeña que la molécula de ADN completa de un cromosoma de esa especie.

El “ADN complementario (ADNc)” es una molécula de ADN de cadena sencilla que se forma a partir de una plantilla de ARNm mediante la enzima transcriptasa inversa. Normalmente, se utiliza un cebador complementario a porciones de ARNm para el inicio de la transcripción inversa. Los expertos en la técnica también pueden utilizar el término “ADNc” para referirse a una molécula de ADN de cadena doble que consiste en dicha molécula de ADN de cadena sencilla y su cadena de ADN complementaria. El término “ADNc” también puede referirse a un clon de una molécula de ADNc sintetizada a partir de una plantilla de ARN.

Un “promotor” es una secuencia de nucleótidos que dirige la transcripción de un gen estructural. En algunas realizaciones, un promotor está ubicado en la región 5' no codificante de un gen, proximal al sitio de inicio de la transcripción de un gen estructural. Los elementos de secuencia dentro de los promotores que funcionan en el inicio de la transcripción a menudo se caracterizan por secuencias de nucleótidos de consenso. Estos elementos promotores incluyen sitios de unión a polimerasa de ARN, secuencias TATA, secuencias CAAT, elementos específicos de diferenciación (DSE; McGehee et al., Mol. Endocrinol 7: 551 (1993)), elementos de respuesta de AMP cíclico (CRE), elementos de respuesta en suero (SRE; Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1:41 (1990)), elementos de respuesta a glucocorticoides (GRE) y sitios de unión para otros factores de transcripción, tales como CRE/ATF (O'Reilly et al., J. Biol. Chem 267:19938 (1992)), AP2 (Ye y col., J. Biol. Chem 269:25728 (1994)), SP1, proteína de unión al elemento de respuesta AMPc (CREB; Loeken, Gene Expr. 3: 253 (1993)) y factores octaméricos (véase, en general, Watson et al., Eds., Molecular Biology of the Gene, 4a ed. (The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1987), y Lemaigre y Rousseau, Biochem. J. 303: 1 (1994)). Como se utiliza en el presente documento, un promotor puede ser constitutivamente activo, reprimible o inducible. Si un promotor es un promotor inducible, entonces la tasa de transcripción aumenta en respuesta a un agente inductor. Por el contrario, la tasa de transcripción no está regulada por un agente inductor si el promotor es un promotor constitutivo. También se conocen promotores representables.

Un “promotor de núcleo” contiene secuencias de nucleótidos esenciales para la función del promotor, que incluye la caja TATA y el inicio de la transcripción. Según esta definición, un promotor de núcleo puede o no tener actividad detectable en ausencia de secuencias específicas que pueden mejorar la actividad o conferir actividad específica de tejido.

Un “elemento regulador” es una secuencia de nucleótidos que modula la actividad de un promotor de núcleo. Por ejemplo, un elemento regulador puede contener una secuencia de nucleótidos que se une con factores celulares que permiten la transcripción exclusiva o preferencial en células, tejidos u orgánulos particulares. Estos tipos de elementos reguladores normalmente están asociados con genes que se expresan de una manera “específica a célula”, “específica a tejido” o “específica a orgánulo”.

Un “potenciador” es un tipo de elemento regulador que puede aumentar la eficiencia de la transcripción, independientemente de la distancia u orientación del potenciador en relación con el sitio de inicio de la transcripción. “ADN heterólogo” se refiere a una molécula de ADN, o una población de moléculas de ADN, que no existe naturalmente dentro de una célula anfitriona dada. Las moléculas de ADN heterólogas a una célula anfitriona particular pueden contener ADN derivado de la especie de célula anfitriona (por ejemplo, ADN endógeno) siempre que ese ADN anfitrión se combine con ADN no anfitrión (por ejemplo, ADN exógeno). Por ejemplo, una molécula de ADN que contiene un segmento de ADN no anfitrión que codifica un polipéptido unido operativamente a un segmento de ^aDⁿanfitrión que comprende un promotor de transcripción se considera una molécula de ADN heteróloga. Por el contrario, una molécula de ADN heteróloga puede comprender un gen endógeno unido operativamente con un promotor exógeno. Como otra ilustración, una molécula de a Dn que comprende un gen derivado de una célula de tipo silvestre se considera ADN heterólogo si esa molécula de ADN se introduce en una célula mutante que carece del gen de tipo silvestre.

Un “polipéptido” es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, producidos de forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos se denominan comúnmente “péptidos”. “

Una “proteína” es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos de carbohidratos. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos se pueden agregar a una proteína por la célula en la que se produce la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas se definen en el presente documento en términos de sus estructuras principales de aminoácidos; no obstante, los sustituyentes tales como los grupos de carbohidratos generalmente no se especifican, pero pueden estar presentes.

Un péptido o polipéptido codificado por una molécula de ADN no anfitrión es un péptido o polipéptido “heterólogo”. Un “elemento genético integrado” es un segmento de ADN que se ha incorporado en un cromosoma de una célula anfitriona después de que ese elemento se introduce en la célula a través de la manipulación humana. Dentro de las presentes realizaciones, los elementos genéticos integrados se derivan más comúnmente de plásmidos linealizados que se introducen en las células mediante electroporación u otras técnicas. Los elementos genéticos integrados se pasan de la célula anfitriona original a su progenie.

Un “vector de clonación” es una molécula de ácido nucleico, tal como un plásmido, cósmido, plastoma o bacteriófago que tiene la capacidad de replicarse de forma autónoma en una célula anfitriona. Los vectores de clonación normalmente contienen uno o un pequeño número de sitios de reconocimiento de endonucleasas de restricción que permiten la inserción de una molécula de ácido nucleico de manera determinable sin pérdida de una función biológica esencial del vector, así como secuencias de nucleótidos que codifican un gen marcador que es adecuado para uso en la identificación y selección de células transducidas con el vector de clonación. Los genes marcadores normalmente incluyen genes que proporcionan resistencia a la tetraciclina o resistencia a la ampicilina.

Un “vector de expresión” es una molécula de ácido nucleico que codifica un gen que se expresa en una célula anfitriona. Normalmente, un vector de expresión comprende un promotor de transcripción, un gen y un terminador de transcripción. La expresión génica generalmente se coloca bajo el control de un promotor, y se dice que dicho gen está “operativamente unido al” promotor. De manera similar, un elemento regulador y un promotor de núcleo están operativamente unidos si el elemento regulador modula la actividad del promotor de núcleo.

Como se utiliza en el presente documento, “transfección transitoria” se refiere a la introducción de ácido(s) nucleico(s) exógeno(s) en una célula anfitriona por un método que generalmente no da como resultado la integración del nucleico exógeno en el genoma de la célula anfitriona transfectada transitoriamente.

Por el término “célula anfitriona” se entiende una célula que contiene una o más nucleasas, por ejemplo endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y/o proteínas de fusión de enzimas de procesamiento de extremos/endonucleasa abarcadas por las presentes realizaciones o un vector que codifica mas mismas que admite la replicación, y/o transcripción o transcripción y traducción (expresión) de una o más nucleasas, por ejemplo endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y/o proteínas de fusión de enzimas de procesamiento de extremos/endonucleasa. Las células anfitrionas para uso en la presente invención pueden ser células procariotas o células eucariotas. Ejemplos de células anfitrionas procariotas incluyen, pero no se limitan a E. coli, bacterias fijadoras de nitrógeno, Staphylococcus aureus, Staphylococcus albus, lactobacillus acidophilus, Bacillus anthracis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, micoplasmas y cianobacterias. Los ejemplos de células anfitrionas eucariotas incluyen, pero no se limitan a, células de protozoos, hongos, algas, plantas, insectos, anfibios, aves y mamíferos.

Los “transformantes integradores” son células anfitrionas recombinantes, en las que el ADN heterólogo se ha integrado en el ADN genómico de las células.

Un “polipéptido aislado” es un polipéptido que está esencialmente libre de componentes celulares contaminantes, tales como carbohidratos, lípidos u otras impurezas proteicas asociadas con el polipéptido en la naturaleza. Normalmente, una preparación de polipéptido aislado contiene el polipéptido en una forma altamente purificada, por ejemplo, al menos aproximadamente 80% puro, al menos aproximadamente 90% puro, al menos aproximadamente 95% puro, mayor que 95% puro o mayor que 99% puro. Una forma de mostrar que una preparación de proteína particular contiene un polipéptido aislado es mediante la aparición de una sola banda después de la electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS) de la preparación de proteína y la tinción con azul brillante de Coomassie del gel. Sin embargo, el término “aislado” no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros, o alternativamente formas glucosiladas o derivadas.

Los términos “terminal amino” y “terminal carboxilo” se utilizan en el presente documento para denotar posiciones dentro de polipéptidos. Cuando el contexto lo permite, estos términos se utilizan con referencia a una secuencia o porción particular de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada en el terminal carboxilo a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido se encuentra próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo.

El término “expresión génica” se refiere a la biosíntesis de un producto génico. Por ejemplo, en el caso de un gen estructural, la expresión génica implica la transcripción del gen estructural en ARNm y la traducción de ARNm en uno o más polipéptidos.

El término “endonucleasa” se refiere a enzimas que dividen el enlace de fosfodiéster dentro de una cadena de polinucleótidos. El polinucleótido puede ser ADN de cadena doble (ADNcd), ADN de cadena sencilla (ADNcs), ARN, híbridos de cadena dobles de ADN y ARN, y ADN sintético (por ejemplo, que contiene bases distintas de A, C, G y T) Una endonucleasa puede cortar un polinucleótido simétricamente, dejando extremos “romos”, o en posiciones que no son directamente opuestas, creando salientes, que pueden denominarse “extremos adhesivos”. Los métodos y composiciones descritos en este documento pueden aplicarse de sitios de división generados por endonucleasas.

El término “endonucleasa de asentamiento” se refiere a DNasas de cadena doble que tienen sitios de reconocimiento asimétricos grandes (12-40 pares bases). Los sitios de reconocimiento de endonucleasa de asentamiento son extremadamente raros. Por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de 18 pares bases ocurrirá solo una vez en cada 7x1010 pares bases de secuencia aleatoria. Esto es equivalente a solo un sitio en 20 genomas del tamaño de mamíferos. Sin embargo, a diferencia de las endonucleasas de restricción estándar, las endonucleasas de asentamiento toleran cierta degeneración de secuencia dentro de su secuencia de reconocimiento. Como resultado, su especificidad de secuencia observada está normalmente en el rango de 10-12 pares bases. Aunque la especificidad de división de la mayoría de las endonucleasas de asentamiento no es absoluta con respecto a sus sitios de reconocimiento, los sitios son de longitud suficiente para que se pueda obtener un evento de división individual por genoma del tamaño de un mamífero al expresar una endonucleasa de asentamiento en una célula que contiene una copia única de Su sitio de reconocimiento. Los ejemplos de endonucleasas de asentamiento incluyen, pero no se limitan a, I-AniI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I- PanMI, I-SceII, I-Ppol, I-SceIII, I-Crel, I-Ltrl, I-Gpil, I-GZel, I-OnuI, I-HjeMI, I-TevI, I-TevII y I-TevIII. Sus secuencias de reconocimiento son conocidas. La especificidad de las endonucleasas y las meganucleasas dirigidas se pueden diseñar para unirse de sitios objetivo no naturales. Véase, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66. Los métodos y composiciones descritos en el presente documento pueden aplicarse de sitios de división generados por endonucleasas de asentamiento.

El término “nucleasa efectora TAL” (TALEN) se refiere a una nucleasa que comprende un dominio efector TAL fusionado a un dominio nucleasa. Se han descrito dominios de unión al ADN efector de TAL, aislados del patógeno vegetal Xanthomonas (véase Boch et al., (2009) Science 29 Oct. 2009 (10.1126/science.117881) y Moscou y Bogdanove, (2009) Science 29 oct. 2009 (10.1126/Science.l 178817)). Estos dominios de unión a A^dN se pueden diseñar por ingeniería para unirse a un objetivo deseado y fusionarse a un dominio de nucleasa, tal como el dominio de nucleasa de Fok1, para derivar una proteína de fusión de nucleasa de dominio efector TAL. Los métodos y composiciones descritos en este documento se pueden aplicar de sitios de división generados por nucleasas efectoras TAL.

El término “nucleasa de dedo de zinc” (ZFN) se refiere a enzimas de restricción artificiales generadas al fusionar un dominio de unión de ADN de dedo de zinc a un dominio de división de ADN. Los dominios de dedos de zinc se pueden diseñar por ingeniería para unirse al sitio objetivo deseado. En algunos ejemplos, el dominio de división comprende el dominio de división no específico de Fokl. En otros ejemplos, el dominio de división comprende la totalidad o una porción activa de otra nucleasa. En algunas realizaciones, el dominio de división puede comprender Trex2 o un fragmento activo del mismo. Los métodos y composiciones descritos en este documento se pueden aplicar de sitios de división generados por nucleasas de dedo de zinc.

El término “enzima de procesamiento de extremos” se refiere a una enzima que modifica los extremos expuestos de una cadena de polinucleótidos. El polinucleótido puede ser ADN de cadena doble (ADNcd), ADN de cadena sencilla (ADNcs), ARN, híbridos de cadena dobles de ADN y ARN y ADN sintético (por ejemplo, que contiene bases distintas de A, C, G y T) Una enzima de procesamiento de extremos puede modificar los extremos de la cadena de polinucleótidos expuestos al agregar uno o más nucleótidos, eliminar uno o más nucleótidos, eliminar o modificar un grupo fosfato y/o eliminar o modificar un grupo hidroxilo. Una enzima de procesamiento de extremos puede modificar los extremos en los sitios de corte de endonucleasa o en los extremos generados por otros medios químicos o mecánicos, tales como el corte (por ejemplo, al pasar a través de una aguja de calibre fino, calentamiento, sonicación, caída de microesferas y nebulización), radiación ionizante, radiación ultravioleta, radicales de oxígeno, hidrólisis química y agentes de quimioterapia.

El término “enzima de procesamiento de extremos de ADN” se refiere a una enzima que modifica los extremos expuestos del ADN. Una enzima de procesamiento de extremos de ADN puede modificar extremos romos o extremos escalonados (termina con salientes de 5' o 3'). Una enzima de procesamiento de extremos de ADN puede modificar ADN de cadena sencilla o de cadena doble. Una enzima de procesamiento de extremos de ADN puede modificar los extremos en los sitios de corte de endonucleasa o en los extremos generados por otros medios químicos o mecánicos, como el corte (por ejemplo, al pasar a través de agujas de calibre fino, calentamiento, sonicación, caída de microesferas y nebulización), radiación ionizante, radiación ultravioleta, radicales de oxígeno, hidrólisis química y agentes de quimioterapia. La enzima de procesamiento de extremos de ADN puede modificar los extremos de ADN expuestos al agregar uno o más nucleótidos, eliminar uno o más nucleótidos, eliminar o modificar un grupo fosfato y/o eliminar o modificar un grupo hidroxilo. Ejemplos no limitantes de tipos de enzimas de procesamiento de extremos de ADN incluyen 5-3' exonucleasas, 5-3' exonucleasas alcalinas, 3-5' exonucleasas, 5' endonucleasas de tipo alerón, helicasas, fosfatasas, hidrolasas y polimerasas de ADN independientes de la plantilla. Ejemplos de enzimas de procesamiento de extremos de ADN incluyen, pero no se limitan a, Trex2, Trex1, Trex1 sin dominio de transmembrana, Apollo, Artemis, DNA2, ExoI, ExoT, ExoIII, FenI, FanI, Mrell, Rad2, Rad9, TdT (desoxinucleotidilo terminal) transferasa), PNKP, RecE, RecJ, RecQ, exonucleasa Lambda, Sox, polimerasa de ADN de Vaccinia, exonucleasa I, exonucleasa III, exonucleasa VII, NDK1, NDK5, NDK7, NDK8, WRN, T7-exonucleasa de Gen 6, proteína de integración del virus de la mieloblastosis aviar (IN), Bloom, Fosfatasa Antártica, Fosfatasa alcalina, Polinucleótido de quinasa (PNK), Apel, Nucleasa de fríjol mungo, HexI, TTRAP (TDP2), Sgs1, Sae2, CtIP, Pol mu, Pol lambda, MUS81, EME1, EME2, SLX1, SLX4 y UL-12. Muchas enzimas de procesamiento de extremos de ADN están altamente conservadas a lo largo de la evolución y, por lo tanto, es probable que funcionen en varias especies diferentes. Adicionalmente, los homólogos de las enzimas de procesamiento de extremos de ADN pueden ser fácilmente identificables en organismos de interés biotecnológico, que incluyen plantas, animales y algas. En este documento se contemplan métodos para modificar las enzimas de procesamiento de extremos de ADN para optimizar la actividad o la procesividad.

El término “exonucleasa” se refiere a enzimas que dividen enlaces de fosfodiéster al final de una cadena de polinucleótidos mediante una reacción de hidrolización que rompe los enlaces de fosfodiéster en el extremo 3' o 5'. El polinucleótido puede ser ADN de cadena doble (ADNcd), ADN de cadena sencilla (ADNcs), ARN, híbridos de cadena dobles de ADN y ARN y ADN sintético (por ejemplo, que contiene bases distintas de A, C, G y T) El término “exonucleasa 5'” se refiere a exonucleasas que dividen el enlace de fosfodiéster en el extremo 5'. El término “exonucleasa 3'” se refiere a exonucleasas que dividen el enlace de fosfodiéster en el extremo 3'. Las exonucleasas pueden dividir los enlaces de fosfodiéster en el extremo de una cadena de polinucleótidos en los sitios de corte de endonucleasas o en los extremos generados por otros medios químicos o mecánicos, tales como el corte (por ejemplo, al pasar a través de una aguja de calibre fino, calentamiento, sonicación, caída de microesferas, y nebulización), radiación ionizante, radiación ultravioleta, radicales de oxígeno, hidrólisis química y agentes de quimioterapia. Las exonucleasas pueden dividir los enlaces de fosfodiéster en los extremos romos o extremos adhesivos. La exonucleasa I y la exonucleasa III de E. coli son dos exonucleasas 3' de uso común que tienen actividad de degradación de cadena sencilla exonucleolítica 3'. Otros ejemplos de 3'-exonucleasas incluyen nucleósidos difosfato quinasas (NDK), NDK1 (NM23-H1), NDK5, NDK7 y NDK8 (Yoon J-H, et al., Characterization of the 3' to 5' exonuclease activity found in human nucleoside diphosphate kinase 1 (NDK1) and several of its homologues. Biochemistry 2005:44(48):15774-15786.), WRN (Ahn, B., et al., Regulation of WRN helicase activity in human base excision repair. J. Biol. Chem. 2004, 279:53465-53474) y tres exonucleasa de reparación principal 3 (Trex2) (Mazur, D.J., Perrino, F.W., Excision of 3' termini by the Trex1 and TREX2 3'-->5' exonucleases. Characterization of the recombinant proteins. J. Biol. Chem. 2001, 276:17022-17029.). La exonucleasa VII de E. coli y el gen 6 de la exonucleasa T7 son dos 5'-3' exonucleasas de uso común que tienen un 5% de actividad de degradación de cadena sencilla exonucleolítica. La exonucleasa puede originarse a partir de procariotas, tales como las exonucleasas de E. coli, o eucariotas, como las exonucleasas de levadura, gusanos, murinos o humanos.

El término “división” se refiere a la ruptura de la estructura principal covalente de un polinucleótido. La división puede iniciarse mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, la hidrólisis enzimática o química de un enlace de fosfodiéster. Es posible la división de cadena sencilla y la división de cadena doble, y la división de cadena doble puede ocurrir como resultado de dos eventos distintos de división de cadena sencilla. La división híbrida de ADN, ARN o ADN/ARN de cadena dobles puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados.

Los términos “sitio objetivo” o “secuencia objetivo” se refieren a una secuencia de ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico al que se unirá una molécula de unión, siempre que existan condiciones suficientes para la unión. Por ejemplo, los sitios objetivo para varias endonucleasas de asentamiento se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1: Ejemplos de endonucleasas de asentamiento y sus sitios objetivo.

El término “proteína de fusión” indica que la proteína incluye componentes de polipéptidos derivados de más de una proteína o polipéptido parental. Normalmente, una proteína de fusión se expresa a partir de un gen de fusión en el que una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos de una proteína se adjunta en marco y, opcionalmente, se separa por un conector de una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de polipéptidos de una proteína diferente. El gen de fusión puede ser expresado por una célula anfitriona como una proteína única. Una proteína de fusión puede comprender al menos parte de un polipéptido fusionado con otro polipéptido. En algunos ejemplos, una proteína de fusión puede comprender al menos una parte de un polipéptido fusionado con al menos una parte del mismo polipéptido. Un ejemplo de una proteína de fusión es Trex2 monomorizado (al menos una parte de Trex2 fusionada con al menos una parte de Trex2).

El término “proteína de fusión de endonucleasa/enzima de procesamiento de extremos” o “proteína de fusión que tiene actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos” se refiere a una enzima, que tiene un dominio catalítico de endonucleasa y un dominio catalítico de procesamiento de extremos y exhibe actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos.

Un “dominio” de una proteína es cualquier porción de la proteína completa, hasta e incluyendo la proteína completa, pero normalmente comprende menos que la proteína completa. Un dominio puede, pero no necesita, plegarse independientemente del resto de la cadena de proteínas y/o estar correlacionado con una función o ubicación biológica, bioquímica o estructural particular (por ejemplo, un dominio de endonucleasa, un dominio de unión a polinucleótidos, tales como un dominio de unión a a Dn , o un dominio de procesamiento de extremos).

Las células “procariotas” carecen de una nucleasa verdadera. Los ejemplos de células procariotas son bacterias (por ejemplo, Cianobacterias, Lactobacillus acidophilus, bacterias fijadoras de nitrógeno, Helicobacter pylori, Bifidobacterium, Staphylococcus aureus, Bacillus anthrax, Clostridium tetani, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli) y arqueas (por ejemplo, Crenarchaeota, Euryarchaeota y Korarchaeota). Las células “eucariotas” incluyen, pero no se limitan a, células de algas, células fúngicas (tal como levadura), células vegetales, células animales, células de mamíferos y células humanas (por ejemplo, células T).

Las células “vegetales” incluyen, pero no se limitan a, células de plantas monocotiledóneas (monocotiledóneas) o dicotiledóneas (dicotiledóneas). Ejemplos no limitantes de monocotiledóneas incluyen plantas de cereales tales como maíz, arroz, cebada, avena, trigo, sorgo, centeno, caña de azúcar, piña, cebolla, plátano y coco. Ejemplos no limitativos de dicotiledóneas incluyen tabaco, tomate, girasol, algodón, remolacha azucarera, patata, lechuga, melón, soja, canola (colza) y alfalfa. Las células vegetales pueden ser de cualquier parte de la planta y/o de cualquier etapa del desarrollo de la planta.

Las “algas” son organismos predominantemente acuáticos que llevan a cabo la fotosíntesis que evoluciona con oxígeno, pero carecen de tejidos especializados que impulsan el agua y que impulsan alimentos. Las algas pueden ser unicelulares o multicelulares. Las algas pueden adaptarse para vivir en agua salada, agua dulce y en tierra. Los ejemplos de algas incluyen, pero no se limitan a, diatomeas, clorofita (por ejemplo, volvox, espirogira), euglenofita, dinoflagelata, crisofita, faenita (por ejemplo, fucus, algas marinas, sargazo) y rodofita (por ejemplo, lemanae).

El término “sujeto” como se utiliza en el presente documento incluye a todos los miembros del reino animal, que incluye los primates no humanos y humanos.

Descripción general

Varias realizaciones descritas en el presente documento se refieren a un método para mejorar la tasa de interrupciones génicas provocadas por la reparación imprecisa de rupturas de cadena doble de ADN. En algunas realizaciones, se proporcionan enzimas de procesamiento de extremos de ADN para mejorar la tasa de interrupción génica. Algunos aspectos de las realizaciones de la presente invención incluyen, sin limitación, tasas mejoradas de procesamiento mediado por enzimas de procesamiento de extremos de ADN de extremos de ADN en el sitio de una ruptura de cadena doble.

Las rupturas de cadena doble de ADN dirigidas introducidas por endonucleasas de división rara pueden aprovecharse para aplicaciones de interrupción génica en diversos tipos de células mediante el enganche de rutas de reparación de ADN de unión de extremos no homólogos. Sin embargo, las endonucleasas crean rupturas químicamente limpias que a menudo están sujetas a reparaciones precisas, lo que limita la eficiencia de la interrupción génica dirigida. Varios ejemplos descritos en el presente documento se refieren a un método para mejorar la tasa de interrupciones génicas dirigidas provocadas por la reparación imprecisa de rupturas de cadena doble de ADN específicas de sitio inducidas por endonucleasa. En algunos ejemplos, las endonucleasas específicas de sitio se acoplan con enzimas de procesamiento de extremos para mejorar la tasa de interrupción génica dirigida. El acoplamiento puede ser, por ejemplo, físico, espacial y/o temporal.

Algunos ejemplos incluyen, sin limitación, tasas mejoradas de procesamiento mediado por enzimas de procesamiento de extremos de extremos de ADN producidos por endonucleasa, que impulsan a una interrupción génica mejorada en el sitio objetivo genómico. Utilizando esta estrategia, las realizaciones descritas en el presente documento muestran tasas de interrupción inducidas por endonucleasa aumentadas en 25 veces. Ciertos ejemplos descritos en el presente documento pueden lograr la inactivación completa de un gen objetivo dentro de una población. Adicionalmente, esta tecnología tiene el potencial de aumentar dramáticamente la utilidad de las endonucleasas de división rara para aplicaciones de inactivación génica. Mejorar la tasa de mutación asociada con las endonucleasas facilita la ingeniería de endonucleasas, ya que se pueden utilizar enzimas con diferentes niveles de actividad. En algunos ejemplos, el acoplamiento del procesador de extremo endo se utiliza para modificar los extremos del ADN para la ingeniería del genoma inducida por endonucleasa. En algunos ejemplos, la expresión de exonucleasas capaces de una resección procesal del extremo 5' junto con la manipulación del entorno de reparación de ADN se puede utilizar para mejorar la selección de genes mediada por recombinación homóloga.

Para no estar limitado a ninguna teoría en particular, la resolución de una ruptura de ADN de cadena doble mediante uniones de extremos no homólogas (NHEJ) “propensas a errores” se puede aprovechar para crear interrupciones dirigidas e inactivaciones génicas, a medida que el proceso NHEJ puede resultar en inserciones y eliminaciones en el sitio de la ruptura. NHEJ está mediada por varias subrutas, cada una de las cuales tiene distintas consecuencias mutacionales. La ruta de NHEJ clásica (cNHEJ) requiere el complejo KU/DNA-PKcs/Lig4/XRCC4, y une de nuevo los extremos con un procesamiento mínimo. A medida que las rupturas de ADN creadas por las plataformas de endonucleasas de diseño (nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras TAL (TALEN) y endonucleasas de asentamiento (HE)) todas dejan rupturas de saliente compatibles químicamente limpias que no requieren procesamiento antes del ligamiento, son excelentes sustratos para la reparación precisa por la ruta cNHEJ. En ausencia o falla de la ruta clásica NHEJ de para resolver una ruptura, las rutas alternativas de NHEJ (altNHEJ) pueden sustituir: sin embargo, estas rutas son considerablemente más mutagénicas.

Para no estar limitado a ninguna teoría en particular, la modificación de las rupturas de cadena doble de ADN por las enzimas de procesamiento de extremos puede sesgar la reparación hacia una ruta altNHEJ. Adicionalmente, diferentes subconjuntos de enzimas de procesamiento de extremos pueden mejorar la interrupción por diferentes mecanismos. Por ejemplo, Trex2, una exonucleasa que hidroliza específicamente los enlaces de fosfodiéster que están expuestos en salientes 3', repara los sesgos en los sitios de ruptura hacia la supresión mutagénica. Por el contrario, se espera que la desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), una polimerasa no templativa, sesgue la reparación en los sitios de ruptura hacia las inserciones mutagénicas al promover la adición de bases de nucleótidos para alterar los extremos del ADN antes del ligamiento. De acuerdo con lo anterior, un experto en la técnica puede utilizar enzimas de procesamiento de extremos con diferentes actividades para proporcionar un resultado de ingeniería deseado. Adicionalmente, un experto en la técnica puede utilizar la sinergia entre diferentes enzimas de procesamiento de extremos para lograr tipos máximos o únicos de efectos de inactivación.

Varios ejemplos descritos en el presente documento combinan rupturas de ADN creadas por endonucleasas con enzimas de procesamiento de extremos es una forma sólida de mejorar las tasas de interrupción dirigida en una variedad de tipos y especies celulares, sin toxicidad asociada para el anfitrión. Este es un avance importante al menos porque: 1) Las rupturas de cadena doble (DSB) activan los puntos de control del ciclo celular para detener la división hasta que la ruptura se haya resuelto; En el caso de una “ruptura persistente” (un ciclo repetitivo de división y reparación precisa), las células pueden detenerse indefinidamente, lo que lleva a la apoptosis. 2) Las aplicaciones de ingeniería a menudo utilizan el suministro transitorio de una endonucleasa, proporcionando solo una ventana corta en la que la concentración de enzima es suficiente para lograr rupturas. 3) las rupturas persistentes pueden ser una fuente de translocaciones. El acoplamiento de las endonucleasas a las enzimas de procesamiento de extremos evita el establecimiento de una ruptura persistente y reduce la incidencia de reordenamientos cromosómicos graves, lo que mejora potencialmente la seguridad de la interrupción dirigida inducida por endonucleasa. 4) Se pueden lograr múltiples cambios en una sola ronda de mutagénesis, para uso, por ejemplo, en inactivaciones multialélicas y multiplexación, ya que los datos descritos en este documento sugieren que el acoplamiento de endonucleasas a enzimas de procesamiento de extremos mejora la tasa mutagénica de dos endonucleasas dadas 5 veces a sus respectivos objetivos, se puede lograr una mejora de 25 veces en la interrupción de ambos objetivos simultáneamente.

Se puede utilizar cualquier método adecuado para proporcionar endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos, y/o proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos en células anfitrionas. En algunos ejemplos uno o más polipéptidos que tienen actividad de endonucleasa y/o de procesamiento de extremos se pueden proporcionar directamente a las células. En algunos ejemplos, la expresión de endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y/o proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos en una célula anfitriona puede resultar del suministro de uno o más polinucleótidos que codifican una o más endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos, y/o proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos a la célula anfitriona. En algunas realizaciones, uno o más polinucleótidos es un vector de expresión de ADN. En algunas realizaciones, uno o más polinucleótidos es un vector de expresión de ARN. En algunas realizaciones, el transempalme, división de polipéptido y/o ligamiento de polipéptido se pueden implicar en la expresión de una o más proteínas en una célula. Los métodos para el suministro de polinucleótido y polipéptido a células son bien conocidos en la técnica.

Las composiciones y métodos descritos en el presente documento son útiles para generar interrupciones dirigidas de las secuencias de codificación de genes y, en algunas realizaciones, crear inactivaciones de genes. La división dirigida por las composiciones y métodos descritos en el presente documento también se puede utilizar para alterar secuencias no codificantes (por ejemplo, secuencias reguladoras tales como promotores, potenciadores, iniciadores, terminadores, sitios de empalme) para alterar los niveles de expresión de un producto génico. Dichos métodos se pueden utilizar, por ejemplo, para investigación biológica, para aplicaciones biotecnológicas tales como modificación de cultivos, con fines terapéuticos, genómica funcional y/o estudios de validación de objetivos.

Las mutaciones dirigidas que resultan de los métodos y composiciones descritos en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, mutaciones puntuales (por ejemplo, conversión de un solo par de bases en un par de bases diferente), sustituciones (por ejemplo, conversión de una pluralidad de pares bases a diferentes secuencia de longitud idéntica), inserciones de uno o más pares bases, supresiones de uno o más pares bases y cualquier combinación de las alteraciones de secuencia mencionadas anteriormente.

Algunos ejemplos se refieren a acoplar la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio con una o más enzimas de procesamiento de extremos. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se coexpresan en una célula. Si la expresión de las endonucleasas separadas y enzimas de procesamiento de extremos es por el suministro de polinucleótido, cada una de las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se pueden codificar por polinucleótidos separados, o por un polinucleótido único. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se codifican mediante un polinucleótido único y se expresan por un promotor único. En algunos ejemplos, una endonucleasa y enzimas de procesamiento de extremos se unen mediante una secuencia T2A que permite que dos proteínas separadas se produzcan a partir de una sola traducción. En algunas realizaciones, se puede utilizar una secuencia ligadora diferente. En otros ejemplos un polinucleótido único codifica las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos separadas por una Secuencia de Entrada de Ribosima Interna (IRES).

Diversos ejemplos se refieren a acoplar la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio seleccionadas del grupo que consiste de: endonucleasas de asentamiento (meganucleasas) (que incluyen endonucleasas de asentamiento diseñadas por ingeniería), nucleasas de dedos de zinc, y nucleasas efectoras TAL con una o más enzimas de procesamiento de extremos. Las endonucleasas pueden comprender dominios de unión a ADN y división heterólogos (por ejemplo, nucleasas de dedos de zinc; dominios de unión a ADN de endonucleasa de asentamiento con dominios de división heterólogos o fusiones de nucleasa del dominio efector TAL) o, alternativamente, el dominio de unión a ADN de una nucleasa de origen natural se puede alterar para unirse a un sitio objetivo seleccionado (por ejemplo, una endonucleasa de asentamiento que se ha diseñado por ingeniería para unirse a un sitio diferente al sitio de unión afín o una fusión de nucleasa de dominio efector TAL). En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se coexpresan en una célula.

Diversos ejemplos se refieren a acoplar la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio de asentamiento seleccionadas del grupo que consiste de: I-AniI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, IPpoI, I-SceIII, I-CreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII con una o más enzimas de procesamiento de extremos de ADN seleccionadas del grupo que consiste de: Trex2, Trex1, Trex1 sin dominio de transmembrana, Apollo, Artemis, ADN2, Exo1, ExoT, ExoIII, Fen1, Fan1, MreII, Rad2, Rad9, TdT (deoxinucleotidil transferasa terminal), PNKP, RecE, RecJ, RecQ, exonucleasa Lambda, Sox, polimerasa de ADN de Vaccinia, exonucleasa I, exonucleasa III, exonucleasa VII, NDK1, NDK5, NDK7, NDK8, WRN, T7-exonucleasa de Gen 6, proteína de integración del virus de mieloblastosis aviar (IN), Bloom, Fosfatasa Antártica, Fosfatasa Alcalina, Polinucleótido Quinasa (PNK), ApeI, Nucleasa de Fríjol Mungo, Hex1, TTRAP (TDP2), Sgs1, Sae2, CtIP, Pol mu, Pol lambda, MUS81, EME1, EME2, SLX1, SLX4 y UL-12. En algunos ejemplos, la endonucleasas de asentamiento y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunas realizaciones, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

Diversos ejemplos se refieren a acoplar la actividad de uno o más ZFN con una o más enzimas de procesamiento de extremos de ADN seleccionadas del grupo que consiste de: Trex2, Trex1, Trex1 sin dominio de transmembrana, Apollo, Artemis, ADN2, Exo1, ExoT, ExoIII, Fen1, Fan1, MreII, Rad2, Rad9, TdT (deoxinucleotidil transferasa terminal), PNKP, RecE, RecJ, RecQ, exonucleasa Lambda, Sox, polimerasa de ADN de Vaccinia, exonucleasa I, exonucleasa III, exonucleasa VII, NDK1, NDK5, NDK7, NDK8, WRN, T7-exonucleasa de Gen 6, proteína de integración del virus de mieloblastosis aviar (IN), Bloom, Fosfatasa Antártica, Fosfatasa Alcalina, Polinucleótido Quinasa (PNK), ApeI, Nucleasa de Fríjol Mungo, Hex1, TTRAP (TDP2), Sgs1, Sae2, CtIP, Pol mu, Pol lambda, MUS81, EME1, EME2, SLX1, SLX4 y UL-12. En algunos ejemplos, los ZFN y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, los ZFN y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, los ZFN y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

Diversos ejemplos se refieren a acoplar la actividad de uno o más TALEN con una o más enzimas de procesamiento de extremos de ADN seleccionadas del grupo que consiste de: Trex2, Trex1, Trex1 sin dominio de transmembrana, Apollo, Artemis, ADN2, Exo1, ExoT, ExoIII, Fen1, Fan1, MreII, Rad2, Rad9, TdT (deoxinucleotidil transferasa terminal), PNKP, RecE, RecJ, RecQ, exonucleasa Lambda, Sox, polimerasa de ADN de Vaccinia, exonucleasa I, exonucleasa III, exonucleasa VII, NDK1, NDK5, NDK7, NDK8, WRN, T7-exonucleasa de Gen 6, proteína de integración del virus de mieloblastosis aviar (IN), Bloom, Fosfatasa Antártica, Fosfatasa Alcalina, Polinucleótido Quinasa (PNK), ApeI, Nucleasa de Fríjol Mungo, Hex1, TTRAP (TDP2), Sgs1, Sae2, CtIP, Pol mu, Pol lambda, MUS81, EME1, EME2, SLX1, SLX4 y UL-12. En algunos ejemplos, los TALEN y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, los TALEN y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, los TALEN y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

En varios ejemplos, la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio de asentamiento seleccionadas del grupo que consiste de: I-AniI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, ICreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII se acopla con la actividad de una o más enzimas de procesamiento de extremos de a Dn seleccionadas del grupo que consiste de: Apollo, Artemis, ADN2, Exo1, Mre11, Rad2, RecE, exonucleasa Lambda, Sox, exonucleasa VII, T7-exonucleasa de Gen 6 y UL-12. En algunos ejemplos, la endonucleasas de asentamiento y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

En varios ejemplos, la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio de asentamiento seleccionadas del grupo que consiste de: I-AniI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, ICreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII se acopla con la actividad de una o más enzimas de procesamiento de extremos de ADN seleccionadas del grupo que consiste de: Sox y UL-12. En algunos ejemplos, la endonucleasas de asentamiento y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

En varios ejemplos, la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio de asentamiento seleccionadas del grupo que consiste de: I-AniI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, ICreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII se acopla con la actividad de una o más enzimas de procesamiento de extremos de ADN seleccionadas del grupo que consiste de: Trex2, polimerasa de ADN de Vaccinia, Mre11, exonucleasa I, exonucleasa III, NDK1, NDK5, n Dk7, NDK8, y WRN. En algunos ejemplos, la endonucleasas de asentamiento y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

En varios ejemplos, la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio de asentamiento seleccionadas del grupo que consiste de: I-AniI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, ICreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII se acopla con la actividad de Fen1. En algunas realizaciones, la endonucleasas de asentamiento y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

En varios ejemplos, la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio de asentamiento seleccionadas del grupo que consiste de: I-AniI, I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-PanII, I-PanMI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, ICreI, I-LtrI, I-GpiI, I-GZeI, I-OnuI, I-HjeMI, I-TevI, I-TevII, y I-TevIII se acopla con la actividad de TdT. En algunas realizaciones, la endonucleasas de asentamiento y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como una proteína de fusión. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se proporcionan como proteínas separadas. En algunos ejemplos, las endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos de ADN se coexpresan en una célula anfitriona.

Un aspecto de la presente invención proporciona polinucleótido(s) para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación de una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería en una célula, en los que el(los) polinucleótido(s) codifica(n) una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, I-PanMI, I-OnuI, I-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos. Otro aspecto de la presente invención proporciona polipéptidos para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación en una célula, en la que los polipéptidos comprenden una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, I-PanMI, I-OnuI, I-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos. Algunos ejemplos se refieren a acoplar la actividad de múltiples endonucleasas específica de sitio con la actividad de una o más enzimas de procesamiento de extremos. Las endonucleasas específica de sitio pueden dividir sitios objetivo dentro del mismo gen o en diferentes genes. En algunos ejemplos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 endonucleasas específica de sitio se pueden proporcionar a una célula junto con una o más enzimas de procesamiento de extremos. En algunos ejemplos, una combinación de endonucleasas de asentamiento, endonucleasas de dedo de zinc, y/o endonucleasas efectoras TAL se pueden proporcionar a una célula con una o más enzimas de procesamiento de extremos. En algunos ejemplos, la enzima de procesamiento de extremos es una exonucleasa. En algunos ejemplos, se puede proporcionar una 5' y una 3' exonucleasa. Si la expresión de las múltiples endonucleasas y una o más exonucleasas es mediante suministro de polinucleótido, cada una de de las endonucleasas y exonucleasas se pueden codificar por polinucleótidos separados, o por un polinucleótido único. En algunas realizaciones, las endonucleasas y exonucleasas se codifican mediante un polinucleótido único y se expresan por un promotor único. En algunas realizaciones, las endonucleasas y exonucleasas se unen mediante una secuencia T2A que permiten que las proteínas separadas se produzcan a partir de una sola traducción. En algunas realizaciones, se pueden utilizar secuencias ligadoras diferentes. En otras realizaciones, un polinucleótido único codifica las endonucleasas y exonucleasas separadas por IRESs.

Diversos ejemplos se refieren a una proteína de fusión heteróloga, que comprende un dominio de endonucleasa y un dominio de procesamiento de extremos o porciones del mismo. Diversos ejemplos se refieren a una construcción de fusión heteróloga, que codifica una proteína de fusión que tiene actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos. Los presentes ejemplos también se refieren a vectores y células anfitrionas que comprenden la construcción de fusión heteróloga, así como también métodos para producir una proteína de fusión que tiene actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos y composiciones de las mismas. En un ejemplo, el dominio de endonucleasa se acopla al dominio de procesamiento de extremos mediante medios recombinantes (por ejemplo, la proteína de fusión se genera mediante traducción de un ácido nucleico en el que un polinucleótido que codifica toda o una porción de una endonucleasa se une en marco con un polinucleótido que codifica toda o una porción de una enzima de procesamiento de extremos). En otros ejemplos, el dominio de endonucleasa y dominio de procesamiento de extremos de una proteína de fusión se puede ligar químicamente. Este ligamiento químico se puede llevar a cabo, por ejemplo, al utilizar moléculas ligadoras bifuncionales, tales como, BS3 (suberato de Bis[sulfosuccinimidilo]).

Algunos ejemplos se refieren a una proteína de fusión que comprende el dominio de endonucleasa y dominio de exonucleasa Trex2. En algunos ejemplos la proteína de fusión comprende al menos un fragmento o variante de una endonucleasa de asentamiento y al menos un fragmento o variante de una exonucleasa, por ejemplo, una 3' exonucleasa, que se asocian con otro mediante conjugación genética o química con otro. En varios ejemplos, la 3' exonucleasa es un monómero Trex2, dímero, o una variante del mismo. En otros ejemplos, la proteína de fusión comprende al menos un fragmento o variante de un dedo de zinc endonucleasa y al menos un fragmento o variante de una 5' exonucleasa, que se asocian con otra, mediante fusión genética o conjugación química con otro. La endonucleasa y exonucleasa, una vez parte de la proteína de fusión, se puede mencionar como una “porción”, “región”, “dominio” o “fracción” de la proteína de fusión de endo/exo-nucleasa.

En algunos ejemplos, una enzima de procesamiento de extremos (o fragmento o variante de la misma) se fusiona directamente a una endonucleasa (o fragmento o variante de la misma). La enzima de procesamiento de extremos (o fragmento o variante de la misma) se puede fusionar al terminal amino o el terminal carboxilo de la endonucleasa (o fragmento o variante de la misma).

Una proteína de fusión de endonucleasa/enzima de procesamiento de extremos puede incluir opcionalmente un péptido ligador entre la endonucleasa y los dominios de enzima de procesamiento de extremos para proporcionar una mayor separación física entre las fracciones y, por lo tanto, maximizar la accesibilidad de la porción de endonucleasa, por ejemplo, para unirse a su secuencia objetivo. El péptido ligador puede consistir en aminoácidos seleccionados para hacerlo más flexible o más rígido dependiendo de la función relevante. La secuencia ligadora se puede dividir por una proteasa o químicamente dividible para producir fracciones de endonucleasa y enzimas de procesamiento de extremos por separado. Los ejemplos de sitios de división enzimática en el ligador incluyen sitios para la división por una enzima proteolítica, tal como enteroquinasa, factor Xa, tripsina, colagenasa y trombina. En algunas realizaciones, la proteasa es una producida naturalmente por el anfitrión o se introduce de forma exógena. Alternativamente, el sitio de división en el ligador puede ser un sitio capaz de dividirse tras la exposición a un producto químico seleccionado, por ejemplo, bromuro de cianógeno, hidroxilamina o pH bajo. La secuencia ligadora opcional puede servir para un propósito diferente a la provisión de un sitio de división. La secuencia ligadora debería permitir el posicionamiento efectivo del resto de endonucleasa con respecto al resto de enzima de procesamiento de extremos para que el dominio de endonucleasa pueda reconocer y dividir su secuencia objetivo y el dominio de procesamiento de extremos pueda modificar los extremos de ADN expuestos en el sitio de división. El ligador también puede ser una secuencia de aminoácidos simple de una longitud suficiente para evitar cualquier obstáculo estérico entre el dominio de endonucleasa y el dominio de procesamiento de extremos. Adicionalmente, la secuencia ligadora puede proporcionar una modificación postraduccional que incluye, pero no se limita a, por ejemplo, sitios de fosforilación, sitios de biotinilación, sitios de sulfatación, sitios de Y-carboxilación y similares.

En algunos ejemplos, la secuencia ligadora comprende de aproximadamente 4 a 30 aminoácidos, más preferiblemente de aproximadamente 8 a 22 aminoácidos. Es decir, la secuencia ligadora puede ser cualquier número de aminoácidos desde aproximadamente 4 hasta 30, como al menos o igual a 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos. En algunos ejemplos, la secuencia ligadora es flexible para no contener el péptido biológicamente activo en una única conformación no deseada. El ligador puede estar compuesto predominantemente por aminoácidos con cadenas laterales pequeñas, tales como glicina, alanina y serina, para proporcionar flexibilidad. En algunos ejemplos, aproximadamente el 80 o 90 por ciento o más de la secuencia ligadora comprende residuos de glicina, alanina o serina, particularmente residuos de glicina y serina. En varias realizaciones, un péptido ligador G4S separa los dominios de procesamiento de extremos y endonucleasa de la proteína de fusión. En otras realizaciones, una secuencia ligadora T2A permite que se produzcan dos proteínas separadas a partir de una única traducción. Las secuencias enlazadoras adecuadas se pueden identificar fácilmente empíricamente. Adicionalmente, el tamaño adecuado y las secuencias de secuencias enlazadoras también se pueden determinar mediante técnicas convencionales de modelado por ordenador.

La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar del suministro de la proteína de fusión a la célula o del suministro de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en al que el polinucleótido se transcribe y el transcrito se traduce, para generar la proteína de fusión. El trasempalme, la división de polipéptidos y el ligamiento de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para el suministro de polinucleótidos y polipéptidos a las células son bien conocidos en la técnica.

Se puede construir una variedad de moléculas de ADN que codifican las endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión descritas anteriormente para proporcionar las proteínas o péptidos seleccionados a una célula. Las moléculas de ADN que codifican las endonucleasas, la enzima de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión se pueden modificar para contener diferentes codones para optimizar la expresión en una célula anfitriona seleccionada, como se conoce en la técnica.

Se puede construir una variedad de moléculas de ARN que codifican las endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión descritas anteriormente para proporcionar las proteínas o péptidos seleccionados a una célula. Las moléculas de ARN que codifican las endonucleasas, la enzima de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión se pueden modificar para contener diferentes codones para optimizar la expresión en una célula anfitriona seleccionada, como se conoce en la técnica.

Varios ejemplos se refieren a la prevención de la reparación precisa mediada por cNHEJ de rupturas de cadena doble inducidas por endonucleasa mediante la expresión simultánea de enzimas de procesamiento de extremos capaces de reconocer la estructura de ruptura posterior a la endonucleasa, lo que resulta en la modificación de los extremos del ADN antes del ligamiento, promoviendo un resultado de efecto mutagénico. Algunas realizaciones se refieren a las exonucleasas de expresión simultánea capaces de reconocer la estructura de ruptura posterior a la endonucleasa, lo que da como resultado el recorte de los extremos del ADN antes del ligamiento, promoviendo un resultado mutagénico. La expresión simultánea de una endonucleasa específica de sitio y una enzima de procesamiento de extremos mejora la eficiencia de la interrupción génica dirigida en hasta ~70 veces, esencialmente fijando un resultado mutagénico en el 100% de una población de células que contienen el sitio objetivo en menos de 72 horas.

En algunos ejemplos, se administran cantidades efectivas de endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos o una cantidad efectiva de una proteína de fusión a una célula, ya sea directamente en contacto con la célula con la proteína o proteínas o mediante la expresión transitoria de una construcción de expresión. En dichos ejemplos, la división celular reduce la concentración de las nucleasas a niveles subactivos dentro de unas pocas divisiones celulares.

Varios ejemplos se refieren a un método para conferir especificidad de sitio a una enzima de procesamiento de extremos de ADN mediante la unión física de un dominio de enzima de procesamiento de extremos a un dominio de unión a ADN específico de sitio. En algunos ejemplos, el dominio de enzima de procesamiento de extremos se une a un dominio de unión a ADN a través de un péptido ligador. La composición y estructura del péptido ligador no está especialmente limitada y, en algunos ejemplos, el ligador puede ser dividible química o enzimáticamente. El péptido ligador puede ser flexible o rígido y puede comprender desde aproximadamente 4 hasta 30 aminoácidos. En otros ejemplos, el dominio de enzima de procesamiento de extremos se fusiona químicamente a un dominio de unión a ADN. Sin desear estar limitado a una teoría particular, impartir especificidad de sitio a una enzima de procesamiento de extremos a través de la unión de la enzima de procesamiento de extremos a un dominio de unión de ADN específico del sitio disminuye la toxicidad asociada con la actividad indiscriminada de procesamiento de extremos, tal como la actividad de exonucleasa, y reduce la cantidad efectiva de enzima de procesamiento de extremos requerida para la modificación eficiente de la ruptura del ADN de cadena doble expuesta provocada por la actividad de endonucleasa en comparación con la enzima de procesamiento de extremos no unida. En algunos ejemplos, la enzima de procesamiento de extremos se une a una endonucleasa de asentamiento. En otros ejemplos, la enzima de procesamiento de extremos se une a la endonucleasa de dedo de zinc. En algunos ejemplos, un dominio de enzima de procesamiento de extremos se une a un dominio de unión a ADN de dedo de zinc que se une a una secuencia de ADN adyacente al sitio de división de una endonucleasa de asentamiento o endonucleasa de dedo de zinc.

Un aspecto de la presente invención proporciona polipéptidos para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación en una célula, en la que los polipéptidos comprenden una endonucleasa de asentamiento seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, I-PanMI, I-OnuI, I-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos. Varias realizaciones se refieren al acoplamiento de la actividad de una o más endonucleasas específicas de sitio con Trex2. Trex2 se puede proporcionar como un monómero o dímero. La enzima Trex2 hidroliza específicamente los enlaces de fosfodiéster que están expuestos en salientes 3'. Mientras que las endonucleasas de asentamiento generan salientes en 3' que son susceptibles a la actividad de exonucleasa Trex2, las nucleasas de dedos de zinc, que utilizan el dominio de división de Fok1, generan rupturas de ADN de cadena doble con salientes en 5'. Las endonucleasas de asentamiento y las nucleasas de dedo de zinc generan mutaciones en sus sitios de división a una tasa de referencia. La coexpresión de Trex2 con endonucleasas de asentamiento aumentó la tasa de mutación ~70 veces. La coexpresión de Trex2 con endonucleasas de dedo de zinc también se observó que afecta la tasa de mutación. Véanse las Figuras 11A y B. De acuerdo con lo anterior, varios ejemplos descritos en el presente documento se refieren a mejorar la tasa de mutación asociada a eventos de división dirigida a endonucleasa de dedo de zinc mediante el acoplamiento de endonucleasa de dedo de zinc a exonucleasas que cortan los salientes 5'. Algunos ejemplos se refieren al acoplamiento de 3' exonucleasas a endonucleasas de dedo de zinc en las que el dominio de nucleasa de la endonucleasa de dedo de zinc genera salientes 3'.

Algunos ejemplos se refieren a la coexpresión de una endonucleasa de asentamiento y la exonucleasa, Trex2, a través de un único promotor unido por una secuencia T2A que permite que se produzcan polipéptidos separados a partir de un único evento de traducción. De esta manera, la endonucleasa y la exonucleasa se proporcionan en una relación de 1 a 1. Se logran tasas de modificación más altas utilizando la expresión unida a T2A de la endonucleasa de asentamiento, I-SceI y Trex2 que la que se logra mediante la cotransducción de construcciones de expresión I-SceI y Trex2 separadas. En algunos ejemplos, se puede proporcionar una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de endonucleasa y uno o más dominios de Trex2.

En otro aspecto divulgado en este documento, se proporcionan métodos para coexpresar una enzima de procesamiento de extremos con una endonucleasa de dedo de zinc capaz de mutar el gen CCR-5 y/o inactivar la función CCR-5 en una célula o estirpe celular. En algunos ejemplos, se proporciona un método para mejorar la inactivación de un gen CCR-5 en una célula humana, el método comprende administrar a la célula cualquier endonucleasa específica de sitio que tenga un sitio objetivo en un CCR5 acoplado a una enzima de procesamiento de extremos. En algunos ejemplos, se proporciona un método para mejorar la inactivación de un gen CCR-5 en una célula humana, el método comprende administrar a la célula cualquier endonucleasa específica de sitio que tenga un sitio objetivo en un CCR5 acoplado a una exonucleasa capaz de dividir los enlaces de fosfodiéster creados en el sitio de división de endonucleasa. En algunos ejemplos, se proporciona un método para mejorar la inactivación de un gen CCR-5 en una célula humana, el método comprende administrar a la célula cualquier endonucleasa específica de sitio que tenga un sitio objetivo en un CCR5 y administrar simultáneamente una exonucleasa capaz de dividir los enlaces de fosfodiéster creados en el sitio de división de endonucleasa. Ejemplos de endonucleasas adecuadas se incluyen endonucleasas de asentamiento diseñadas por ingeniería y meganucleasas, que tienen secuencias de reconocimiento muy largas, algunas de las cuales probablemente estén presentes, sobre una base estadística, una vez en un genoma de tamaño humano. Cualquier dicha nucleasa que tenga un sitio objetivo único en un gen CCR5 se puede utilizar en lugar de, o además de, una nucleasa de dedo de zinc, junto con una exonucleasa para la división dirigida en un gen CCR5. Algunos ejemplos se refieren a la administración de una proteína de fusión que comprende una endonucleasa específica de sitio CCR5 y una exonucleasa capaz de dividir los enlaces de fosfodiéster creados en el sitio de división de endonucleasa.

Vectores de expresión

Las construcciones de expresión pueden diseñarse fácilmente utilizando métodos conocidos en la técnica. Los ejemplos de vectores de expresión de ácido nucleico incluyen, pero no se limitan a: virus recombinantes, lentivirus, adenovirus, plásmidos, cromosomas artificiales bacterianos, cromosomas artificiales de levadura, cromosomas artificiales humanos, ADN de minicírculo, episomas, ADNc, ARN y productos de PCR. En algunos ejemplos, los vectores de expresión de ácido nucleico codifican un péptido único (por ejemplo, una endonucleasa, una enzima de procesamiento de extremos o una proteína de fusión que tiene actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos). En algunos ejemplos, los vectores de expresión de ácido nucleico codifican una o más endonucleasas y una o más enzimas de procesamiento de extremos en un único casete de expresión policistrónico. En algunos ejemplos, una o más endonucleasas y una o más enzimas de procesamiento de extremos están ligadas entre sí mediante una secuencia de péptido 2A o una secuencia equivalente de “autodivisión”. En algunos ejemplos, un casete de expresión policistrónica puede incorporar una o más secuencias de sitio de entrada ribosómico interno (IRES) entre marcos de lectura abiertos. En algunos ejemplos, los vectores de expresión de ácido nucleico son vectores de expresión de ADN. En algunos ejemplos, los vectores de expresión de ácido nucleico son vectores de expresión de ARN.

Un vector de expresión de ácido nucleico puede comprender además uno o más marcadores de selección que facilitan la identificación o selección de células anfitrionas que han recibido y expresan la(s) endonucleasa(s), enzima(s) de procesamiento de extremos y/o proteína(s) de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos junto con el marcador de selección. Ejemplos de marcadores de selección incluyen, pero no se limitan a, genes que codifican proteínas fluorescentes, por ejemplo, EGFP, DS-Red, YFP y CFP; genes que codifican proteínas que confieren resistencia a un agente de selección, por ejemplo, el gen PuroR, el gen ZeoR, el gen HygroR, el gen neoR y el gen de resistencia a la blasticidina. En algunos casos, el marcador de selección comprende un indicador fluorescente y un marcador de selección.

Un vector de expresión de ADN puede comprender un promotor capaz de dirigir la expresión de una o más endonucleasa(s), enzima(s) de procesamiento de extremos y/o proteína(s) de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos. Los ejemplos de promotores incluyen, pero no se limitan a, elementos LTR retrovirales; promotores constitutivos tales como CMV, HSV1-TK, SV40, EF-1a, p-actina; promotores inducibles, tales como aquellos que contienen elementos de operador Tet; y promotores específicos de tejido. Los promotores bacterianos y eucarióticos adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); y Current Protocols in Molecular Biology (2010). Ejemplos no limitantes de promotores de plantas incluyen secuencias promotoras derivadas de ubiquitin-3 (ubi-3) de A. thaliana.

El ácido nucleico que codifica una o más endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y/o proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos se puede clonar en un vector para la transformación en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que codifican diferentes endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se clonan en el mismo vector. En dichos casos, los ácidos nucleicos que codifican diferentes endonucleasas y enzimas de procesamiento de extremos se pueden separar opcionalmente por secuencias T2A o IRES. Los vectores pueden ser vectores procariotas, por ejemplo, plásmidos o vectores lanzadera, vectores de insectos o vectores eucariotas, que incluyen los vectores de plantas descritos en este documento. La expresión de las nucleasas y las proteínas de fusión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducible.

La introducción de polipéptidos que tienen actividad de endonucleasa y/o procesamiento de extremos y/o polinucleótidos que codifican polipéptidos que tienen actividad de endonucleasa y/o procesamiento de extremos en las células anfitrionas puede utilizar cualquier método adecuado para el suministro de ácido nucleico o proteína como se describe en este documento o como se conocería un experto común en la técnica. Los polipéptidos y polinucleótidos descritos en este documento se pueden administrar en células cultivadas in vitro, así como in situ en tejidos y organismos completos. La introducción de los polipéptidos y polinucleótidos de las presentes realizaciones en una célula anfitriona puede realizarse química, biológica o mecánicamente. Esto puede incluir, pero no se limita a, electroporación, sonoporación, uso de una pistola de genes, lipotransfección, transfección con fosfato de calcio, uso de dendrímeros, microinyección, polibreno, fusión de protoplastos, el uso de vectores virales que incluyen vectores adenovirales, AAV y retrovirales, y ribozimas del grupo II.

Organismos

La presente invención es aplicable a cualquier organismo procariota o eucariota en el que se desee crear una mutación genética dirigida. Ejemplos de organismos eucariotas incluyen, pero no se limitan a, algas, plantas, animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, primates, cerdos, vacas, ovejas, conejos, etc.), peces e insectos. En algunos ejemplos, las células aisladas del organismo se pueden modificar genéticamente como se describe en el presente documento. En algunos ejemplos, las células modificadas pueden convertirse en organismos reproductivamente maduros. Se pueden utilizar células eucariotas (por ejemplo, células de algas, levaduras, plantas, hongos, piscinas, aves y mamíferos). También se pueden utilizar células de organismos que contienen una o más modificaciones genéticas adicionales.

Ejemplos de células de mamífero incluyen cualquier célula o estirpe celular del organismo de interés, por ejemplo, ovocitos, células somáticas, células K562, células CHO (ovario de hámster chino), células HEP-G2, células BaF-3, células Schneider, células COS (células de riñón de mono que expresan antígeno T SV40), células CV-1, células HuTu80, células NTERA2, células NB4, células HL-60 y células HeLa, células 293 y células de mieloma como SP2 o NSO. También se pueden utilizar mononucleocitos de sangre periférica (PBMC) o células T, al igual que las células madre embrionarias y adultas. Por ejemplo, las células madre que se pueden utilizar incluyen células madre embrionarias (ES), células madre pluripotentes inducidas (iPSC), células madre mesenquimales, células madre hematopoyéticas, células madre musculares, células madre de la piel y células madre neuronales.

Ejemplos de plantas objetivo y células vegetales incluyen, pero no se limitan a, plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, tales como cultivos que incluyen cultivos de granos (por ejemplo, trigo, maíz, arroz, mijo, cebada), cultivos de frutas (por ejemplo, tomate, manzana, pera, fresa, naranja), cultivos forrajeros (por ejemplo, alfalfa), cultivos de hortalizas de raíz (por ejemplo, zanahoria, papa, remolacha azucarera, ñame), cultivos de hortalizas de hoja (por ejemplo, lechuga, espinacas); plantas con flores (por ejemplo, petunia, rosa, crisantemo), árboles de coníferas y pinos (por ejemplo, abeto de pino, picea); plantas utilizadas en fitorremediación (por ejemplo, plantas de acumulación de metales pesados); cultivos oleaginosos (por ejemplo, girasol, colza) y plantas utilizadas con propósitos experimentales (por ejemplo, Arabidopsis). Por lo tanto, los métodos y composiciones descritos tienen uso en una amplia gama de plantas, que incluyen, pero no se limitan a, especies de los géneros Asparagus, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus, Capsicum, Cucurbita, Daucus, Erigeron, Glicina, Gossypium, Hordeum, Lactuca, Lolium, Lycopersicon, Malus, Manihot, Nicotiana, Orychophragmus, Oryza, Persea, Phaseolus, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Secale, Solanum, Sorghum, Triticum, Vitis, Vigna, y Zea. El término células vegetales incluye células vegetales aisladas, así como plantas enteras o porciones de plantas enteras como semillas, callos, hojas, raíces, etc. La presente divulgación también abarca semillas de las plantas descritas anteriormente. La presente divulgación abarca adicionalmente la progenie, los clones, las estirpes celulares o las células de las plantas descritas.

Generación de organismos modificados homocigóticamente

Las células en las que una o más endonucleasas se coexpresan con una o más enzimas de procesamiento de extremos y/o células en las que se expresan una o más proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos se analizan para detectar la presencia de mutaciones. En el sitio o sitios de división de endonucleasa. Dichas células modificadas pueden identificarse utilizando cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica, que incluye secuenciación, análisis por PCR, transferencia Southern y similares. En algunos ejemplos, se genera un amplicón que abarca el sitio objetivo de endonucleasa por PCR. Luego se expone el amplicón a la endonucleasa y se evalúa la capacidad de la endonucleasa para cortar el amplicón. La mutación del sitio objetivo se indica por la ausencia de productos de división generados por endonucleasa.

Posteriormente, las células que contienen el(los) sitio(s) objetivo(s) mutado(s) se cultivan o se tratan de tal manera que generan un organismo completo con el sitio objetivo mutado. Por ejemplo, los métodos tradicionales de inyección pro nuclear o inyección de ovocitos se pueden utilizar para generar animales con el sitio objetivo mutado. Del mismo modo, las células vegetales que contienen el sitio o sitios objetivo mutados pueden cultivarse para regenerar una planta completa que posee el genotipo mutante y, por lo tanto, el fenotipo deseado. La regeneración también se puede obtener a partir de callos de plantas, explantes, órganos, pólenes, embriones o partes de los mismos. Una vez que los organismos heterocigotos que contienen los sitios objetivos mutados alcanzan la madurez reproductiva, pueden cruzarse entre sí o, en algunos casos, las esporas pueden convertirse en haploides. De la progenie resultante de cruces, aproximadamente el 25% será homocigoto mutante/mutante en el locus objetivo.

Composiciones farmacéuticas y administración

Las endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos y los vectores de expresión que codifican endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos se pueden administrar directamente a un paciente para la división dirigida de una secuencia de ADN y para aplicaciones terapéuticas o profilácticas, por ejemplo, cáncer, isquemia, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, psoriasis, infección por VIH, anemia falciforme, enfermedad de Alzheimer, distrofia muscular, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades vasculares, fibrosis quística, apoplejía, síndrome hiper IGE, hemofilia y similares. En algunos ejemplos, las composiciones descritas en el presente documento (por ejemplo, endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos y vectores de expresión que codifican endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos) se pueden utilizar en métodos de tratamiento, prevención o inhibición de una enfermedad (por ejemplo, cáncer, isquemia, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, psoriasis, infección por VIH, anemia falciforme, enfermedad de Alzheimer, distrofia muscular, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad vascular, fibrosis quística, apoplejía, síndrome de hiper IGE, hemofilia) o mejorar una enfermedad o síntoma asociado con una enfermedad, como cáncer, isquemia, retinopatía diabética, degeneración macular, artritis reumatoide, psoriasis, infección por VIH, anemia falciforme, enfermedad de Alzheimer, distrofia muscular, enfermedades neurodegenerativas, enfermedad vascular, fibrosis quística, apoplejía, síndrome de hiper IGE Roma, hemofilia. En algunos ejemplos, las endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos y los vectores de expresión que codifican endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos se administran para tratar, prevenir o inhibir una enfermedad dominante autosómica, tal como acondroplasia, pseudoachondroplasia, displasias epifisarias múltiples, condrodisplasias, osteogénesis imperfecta, síndrome de Marfan, polidactilia, neuropatías sensoriales motoras hereditarias I y II (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth), distrofia miotónica y neurofibromatosis o mejorar una enfermedad o síntoma asociado con una enfermedad dominante autosómica, tal como acondroplasia, pseudoachondroplasia, displasias epifisarias múltiples, condrodisplasias, osteogénesis imperfecta, síndrome de Marfan, polidactilia, neuropatías sensoriales motoras hereditarias I y II (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth), distrofia miotónica y neurofibromatosis En algunos ejemplos, las endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos y los vectores de expresión que codifican endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos se administran para tratar, prevenir o inhibir una enfermedad provocada por la mala regulación de los genes. En algunos ejemplos, las endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos y los vectores de expresión que codifican endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos se administran para tratar, prevenir o inhibir un cáncer, tal como BCL-2, Bcl-XI y FLIP, o mejorar una enfermedad o síntoma asociado con un cáncer, tal como BCL-2, Bcl-XI y FLIP, por ejemplo, aumentando la tasa de mutación de los genes con actividad antiapoptótica. Un aspecto de la presente invención proporciona polinucleótido(s) para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación de una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería en una célula, en la que el(los) polinucleótido(s) codifica(n) una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, I-PanMI, I-OnuI, I-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos, en los que la endonucleasa es capaz de dividir un gen CCR-5 o un gen STAT-3, para uso como un medicamento. Otro aspecto de la presente invención proporciona polinucleótido(s) para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación de una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería en una célula, en la que el(los) polinucleótido(s) codifica(n) una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, IPanMI, I-OnuI, I-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos, en los que la endonucleasa es capaz de dividir un gen CCR-5 o un gen STAT-3, para uso en el tratamiento de VIH o síndrome de hiper IGE.

Los ejemplos de microorganismos que se pueden inhibir mediante el suministro de endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos incluyen bacterias patógenas, por ejemplo, clamidia, bacterias rickettsiales, micobacterias, estafilococos, estreptococos, neumococos, meningococos y conococos, clebsiella, proteus, serratia, pseudomonas, legionella, difteria, salmonella, bacilos, cólera, tétanos, botulismo, ántrax, peste, leptospirosis y bacterias de la enfermedad de Lyme; hongos infecciosos, por ejemplo, Aspergillus, especies de Candida; protozoos tales como esporozoos (por ejemplo, Plasmodia), rizopodos (por ejemplo, Entamoeba) y flagelados (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia, etc.); enfermedades virales, por ejemplo, hepatitis (A, B o C), virus del herpes (por ejemplo, VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV y EBV), VIH, ébola, adenovirus, virus de la gripe, flavivirus, echovirus, rinovirus, virus coxsackie, coronavirus, virus sincitial respiratorio, virus de las paperas, rotavirus, virus del sarampión, virus de la rubéola, parvovirus, virus vaccinia, virus HTLV, virus del dengue, virus del papiloma, poliovirus, virus de la rabia y virus de la encefalitis arboviral, etc. La administración de cantidades terapéuticamente efectivas se realiza por cualquiera de las rutas normalmente utilizadas para introducir endonucleasas de asentamiento o endonucleasas de dedo de zinc en contacto de extremo con el tejido que se va a tratar. Las endonucleasas, las enzimas de procesamiento de extremos y las proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y de procesamiento de extremos pueden ser para administración de cualquier manera adecuada, y en algunas realizaciones con vehículos farmacéuticamente aceptables. Los métodos adecuados para administrar tales proteínas o polinucleótidos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, aunque se puede utilizar más de una ruta para administrar una composición particular, una ruta particular a menudo puede proporcionar una reacción más inmediata y más efectiva que otra ruta

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. De acuerdo con lo anterior, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas que están disponibles (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences).

Las endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos o vectores que codifican endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos, solas o en combinación con otros componentes adecuados, pueden convertirse en formulaciones en aerosol (por ejemplo, pueden ser “nebulizadas”) para administrarse por inhalación. Las formulaciones en aerosol se pueden colocar en propulsores aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano, nitrógeno y similares.

Las formulaciones adecuadas para administración parenteral, tales como, por ejemplo, por rutas intravenosa, intramuscular, intradérmica y subcutánea, incluyen soluciones de inyección estériles isotónicas acuosas y no acuosas, que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes, estabilizadores y conservantes. Las composiciones divulgadas se pueden administrar, por ejemplo, por infusión intravenosa, por vía oral, tópica, intraperitoneal, intravesical o intratecal. Las formulaciones de compuestos pueden presentarse en recipientes sellados de dosis unitarias o multidosis, tales como ampollas y viales. Las soluciones y suspensiones de inyección se pueden preparar a partir de polvos, gránulos y tabletas estériles del tipo descrito anteriormente.

Kits

También se divulgan kits para realizar cualquiera de los métodos anteriores. Los kits normalmente contienen una o más endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y/o proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos o vectores de expresión que codifican endonucleasas, enzimas de procesamiento de extremos y/o proteínas de fusión que tienen actividad de endonucleasa y procesamiento de extremos como se describe en este documento. Los kits también pueden contener una construcción indicadora, tal como la construcción indicadora mCherry+ descrita en el presente documento, que contiene un sitio de clonación para la inserción del sitio objetivo para una endonucleasa de interés seleccionada. En algunos ejemplos, los kits pueden contener uno o más plásmidos de acuerdo con las SEQ ID NO: 110-145. Por ejemplo, los kits para cribar la mutagénesis producida por la endonucleasa acoplada y la actividad de procesamiento de extremos y/o las proteínas de fusión con actividad a un gen particular se proporcionan con una o más construcciones indicadoras que contienen el sitio o sitios objetivo deseados. De manera similar, los kits para enriquecer células para una población de células que tienen una modificación genómica mediada por endonucleasa pueden comprender una construcción indicadora que comprende un sitio objetivo presente en el genoma de las células y una o más endonucleasas específicas al sitio objetivo de interés y una o más enzimas de procesamiento de extremos seleccionadas y/o una o más proteínas de fusión específicas al sitio objetivo de interés. Los kits también pueden contener células, tampones para la transformación de células, medios de cultivo para células y/o tampones para realizar ensayos. Normalmente, los kits también contienen una etiqueta, que incluye cualquier material tales como instrucciones, empaque o folleto publicitario que se adjunta o acompaña a los demás componentes del kit.

Si bien la descripción escrita anterior permite a un experto en la técnica hacer y utilizar lo que se considera actualmente el mejor modo de hacerlo, aquellos expertos en la técnica entenderán y apreciarán la existencia de variaciones, combinaciones y equivalentes de la realización, método y ejemplo específicos.

Los siguientes Ejemplos se presentan con propósitos ilustrativos y no deben interpretarse como limitaciones.

Ejemplo 1

Coexpresión de la endonucleasa de asentamiento, I-SceI y Exonucleasa Trex2 aumenta la tasa a la que I-SceI induce mutaciones

Para determinar si el acoplamiento de una exonucleasa con una endonucleasa específica de sitio podría mejorar la eficiencia de la interrupción génica dirigida, evaluamos el efecto de Trex2 en la reparación mutagénica de los DSB generados por I-SceI. Para garantizar que Trex2 se coexprese con I-SceI, desarrollamos vectores de expresión que impulsan la expresión acoplada tanto de una endonucleasa como de una enzima de procesamiento de extremos a partir de un único promotor a través de un motivo peptídico “omisión” T2A. También incluimos la coexpresión de la proteína fluorescente mTagBFP por un sitio de entrada ribosomal interno (IRES) para rastrear la eficacia de la transfección. Para medir la tasa de interrupción dirigida inducida por nucleasas, se construyó una construcción indicadora mutNHEJ (Indicador de Luz de Tráfico (TLR)) al colocar el sitio objetivo I-SceI, SEQ ID NO: 1465'-AGTTACGCTAGGGATAACAG GGTAATATAG-3', frente a la proteína fluorescente mCherry ORF en el marco de lectura 3. Véase Figura 1A. Cuando un evento de división del ADN inducido por la endonucleasa da como resultado un cambio de marco en el marco de lectura 3, la proteína fluorescente mCherry se coloca en el marco y se traduce correctamente, dando como resultado células fluorescentes rojas que se pueden detectar fácilmente por citometría de flujo. Las estirpes celulares HEK que albergan el TLR se generaron al colocar placas 0.1x106 células HEK29324 horas antes de la transducción en una placa de 24 pozos. Las estirpes celulares indicadoras mutNHEJ (TLR) se hicieron al transducir células HEK293 a título limitante (~5%) con ~25 ng de un lentivirus integrador que contiene la construcción indicadora con polibreno de 4 ug/ml. Los medios se cambiaron 24 horas después de la transducción.

Los vectores de expresión que comprenden la endonucleasa de asentamiento, I-SceI, una proteína fluorescente (BFP) y opcionalmente Trex2 con un péptido ligador T2A o G4S se construyeron de acuerdo con los esquemas proporcionados en la Figura 1B-H.

0.1 x 10A6 células HEK293 que contienen un casete indicador de mutNHEJ (TLR) genómicamente integrado se colocaron en placas 24 horas antes de la transfección en una placa de 24 pozos. Las células HEK 293 se transfectaron con construcciones de expresión que comprenden el mutante I-SceI D44^asolo, el mutante I-SceI D44A acoplado a Trex2 a través de un ligador T2A, I-SceI solo o I-SceI acoplado a Trex2 a través de un ligador T2A utilizando reactivo de transfección Fugene de acuerdo con el protocolo de fabricación 72 horas después de la transducción de la estirpe celular con los vectores de expresión, las células se analizaron por citometría de flujo en un BD LSRII o BD FAC^sARIAII. El fluoróforo mCherry se excitó utilizando un láser de 561 nm y se adquirió con un filtro 610/20. El fluoróforo mTagBFP se excitó en un láser de 405 nm con un filtro 450/50. Los datos se analizaron utilizando el software FlowJo (FlowJo, Ashland OR).

La gráfica mostrada en la Figura 2 demuestra que la expresión de I-SceI indujo eventos de NHEJ mutagénico como se visualiza mediante la expresión de mCherry+ y que la tasa de eventos de NHEJ mutagénico (mCherry+) aumentó significativamente después de la coexpresión de I-SceI con la exonucleasa Trex2. Véase Figura 2. Si bien ni I-SceI D44A (catalíticamente inactivo) ni I-SceI D44A acoplado a Trex2 fueron capaces de inducir una interrupción génica medible, I-SceI acoplado a Trex2 a través del enlace T2A exhibió un aumento sustancial en las células positivas de mCherry en comparación con I-SceI solo. Véase Figura 2.

Después de la coexpresión de la endonucleasa I-SceI y la exonucleasa Trex2, se extrajo el ADN genómico de las células indicadoras HEK 293 utilizando el kit fácil de ADN de Qiagen. Los amplicones que abarcan el sitio objetivo I-SceI se generaron por PCR, se clonaron en un vector lanzadera y se sometieron a secuenciación de ADN del sitio objetivo ISceI. La secuencia demostró que esencialmente cada célula de la población contiene un sitio objetivo de I-Scel mutado, según lo predicho por la lectura del indicador. Véase Figura 6.

Las células HEK 293 se transdujeron con construcciones de expresión que comprenden el mutante I-SceI D44A solo, I-SceI solo o I-SceI acoplado a Trex2 a través de un ligador T2A. Después de la transducción de la estirpe celular con los vectores de expresión, las células se analizaron diariamente mediante inspección visual. Se tomaron imágenes de células vivas 72 horas después de la transducción con los vectores de expresión. Las células tratadas de cada manera parecían indistinguibles, y no existe una toxicidad manifiesta asociada con la coexpresión de Trex2. Véase Figura 21. Para evaluar la tasa de interrupción génica total, las células transfectadas I-SceI e I-SceI-T2A-Trex2 se clasificaron en función de los niveles de expresión de BFP variables. Las células HEK 293 que contienen un casete genómicamente integrado correspondiente al indicador de interrupción dirigido ilustrado en la Figura 1A (TLR) se transdujeron con construcciones de expresión que comprenden I-SceI-IRES-BFP (proteína fluorescente azul) o I-SceI-T2A-Trex2-IRES -BFP. La expresión de I-SceI-IRES-BFP y I-SceI-T2A-Trex2-IRES-BFP se midió en las células transducidas mediante un análisis de ventana de gráficos de citometría de flujo de actividad de BFP. Las células con niveles bajos, bajos a medios, medios y altos de expresión de BFP (que corresponden a diferentes niveles de expresión de endonucleasa I-SceI o expresión de exonucleasa I-SceI endonucleasa/Trex2) se ensayaron para detectar eventos NHEJ mutagénicos inducidos como se visualiza por expresión de mCherry+. Los datos demostraron que los bajos niveles de I-SceI solo resultaron en niveles de mutación más bajos, mientras que la expresión de I-SceI en combinación con Trex2 resulta en altas tasas de modificación incluso a bajos niveles de expresión de construcción I-SceI-T2A-Trex2-IRES- BFP. Véase Figura 4.

Después de que las células transfectadas I-SceI e I-SceI-T2A-Trex2 se clasificaron en función de los niveles variables de expresión de BFP, el área que flanquea el objetivo I-SceI se amplificó de cada una de las poblaciones mediante PCR. 100ng de cada producto de PCR se digirió in vitro con I-SceI recombinante (New England Biolabs) durante 6 horas a 37°C. El ADN se separó utilizando un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio para buscar una banda resistente, indicativa de un evento mutagénico en el locus que destruyó el sitio objetivo de I-SceI. Véase Figura 5A. El porcentaje de interrupción se calculó al cuantificar la intensidad de la banda utilizando el software Image J y dividir la intensidad de la banda no digerida por el total. A niveles bajos de expresión de endonucleasa, se observó un aumento de 25 veces en la interrupción génica total entre I-SceI e I-SceI acoplado a Trex2 (2.2 a 50.2% respectivamente), y casi el 100% de los objetivos se interrumpieron en las ventanas de análisis de expresión media y alta de I-SceI T2A Trex2 (90.3 y 97.1% respectivamente) Véase Figura 5B.

Estos experimentos indican que mientras I-SceI exhibe un aumento dependiente de la dosis en la interrupción génica, I-SceI acoplado a Trex2 se satura rápidamente. El análisis de secuencia del sitio objetivo I-SceI en células de alta expresión confirmó que el 100% de las células se modificaron en las células tratadas con I-SceI-T2A-Trex2. Véase Figura 6. La comparación de los espectros de mutación entre I-SceI solo y I-SceI.T2A.Trex2 mostró una tendencia hacia pequeños eventos de supresión en las células tratadas con exonucleasa. Véase Figuras 6 y 7. En un análisis cinético, si bien todas las construcciones exhibieron patrones de expresión similares, la expresión de Trex2 coincidió con la aparición de eventos de interrupción en puntos temporales anteriores. Véase Figura 8. En resumen, el acoplamiento de las endonucleasas a la expresión de Trex2 en un solo marco de lectura abierto dio como resultado una mejora de hasta 25 veces en la eficiencia de la interrupción génica dirigida en células de múltiples especies y en tipos de células primarias, y es capaz de impulsar tasas de inactivación selectiva a casi terminado dentro de las 72 horas.

Ejemplo 2

La exonucleasa Trex2 aumenta la tasa de mutación de una variedad de endonucleasas de asentamiento

Se evaluó la aplicabilidad de la interrupción potenciada por Trex2 a múltiples andamios de nucleasas diferentes. Casetes indicadores de interrupción dirigida (casetes indicadores mutNHEJ) con sitios de división objetivo para I-Ltr, I-Gpi, I-Gze, I-MpeMI, I-PanMI, I-Cre, I-Onul, I-HjeMI y I- AniI (Ver Tabla 1) se generaron al colocar el sitio objetivo de endonucleasa de interés ubicado frente a la proteína fluorescente ORF mCherry en el marco de lectura 3. Luego se generaron estirpes celulares indicadoras HEK293T que contenían casetes de indicador TLR I-Ltr, I-Gpi, I-Gze, I-MpeMI, I-PanMI, I-Cre, I-Onul, I-HjeMI e I-AniI TLR genómicamente integrados. Cada estirpe celular se transfectó con una construcción de expresión para su enzima respectiva con o sin cotransfección de una construcción de expresión que codifica Trex2, y se midieron las tasas de interrupción.

Se analizó por citometría de flujo el efecto de la coexpresión de Trex2 con cada una de las endonucleasas de asentamiento I-Ltr, TGpi, I-Gze, I-MpeMI, I-PanMI, I-Cre, I-OnuI, I-HjeMI e I-AniI. Para cada una de las diferentes endonucleasas de asentamiento probadas, las tasas de interrupción aumentaron cuando se acoplaron a Trex2, lo que demuestra que la exonucleasa Trex2 puede facilitar la interrupción génica por rupturas generadas por una variedad de diferentes endonucleasas de asentamiento, que dejan diferentes salientes de 3' 4 pb y poseen una cinética enzimática variable. Véase Figura 10. Estos datos demuestran que la expresión de Trex2 aumenta las tasas de mutagénesis asociadas con la división de ADN dirigida por una variedad de endonucleasas de asentamiento. Adicionalmente, la coexpresión de Trex2 con I-Gze aumentó la expresión de mCherry+ significativamente sobre los niveles de fondo observados con la expresión de I-Gze sola. Véase Figura 10.

Las endonucleasas de asentamiento en el panel que tienen una actividad muy baja se rescataron al acoplar a Trex2. Véase Figura 10. Esto sugiere que las endonucleasas de asentamiento que parecen inactivas pueden estar generando interrupciones a una tasa indetectable, y que la adición de Trex2 revela estas rupturas al catalizar el procesamiento de extremos antes del ligamiento de ruptura. Esto es consistente con la observación de que Trex2 puede aumentar las tasas de interrupción de una enzima de mayor actividad, como I-SceI, incluso a niveles de expresión muy bajos.

Para probar la capacidad de Trex2 de revelar rupturas provocadas por Endonucleasas de asentamiento que tienen una actividad muy baja, se analizó por citometría de flujo el efecto del acoplamiento de Trex2 en la tasa de interrupción génica de las Endonucleasas de asentamiento de I-AniI. WT I-AniI exhibe muy poca actividad en las células y la expresión de WT I-AniI solo no exhibe actividad de interrupción dirigida. Véase Figura 12. El acoplamiento de Trex2 a WT I-AniI aumenta su capacidad de interrupción génica a aquella de la variante altamente activa I-AniI, I-AniI Y2. Véase Figura 12. I-AniI Y2 fue sometido a varias rondas de evolución dirigida para mejorar su actividad. El acoplamiento de Trex2 a una forma inactiva de I-AniI, I-AniI E148D, no muestra un aumento en la expresión del indicador. Estos datos demuestran que la expresión de Trex2 aumenta las tasas de mutagénesis asociadas con la división de ADN dirigida por las endonucleasas de asentamiento subactivas.

Juntos, estos resultados muestran que Trex2 puede aumentar las tasas de interrupción para una variedad de endonucleasas de asentamiento y rescatar endonucleasas de baja actividad, reduciendo efectivamente la barra de ingeniería para enzimas diseñadas para producir interrupción génica en nuevos sitios objetivo.

Ejemplo 3

La coexpresión de exonucleasa trex2 afecta la tasa de mutación asociada con las interrupciones mediadas por la nucleasa del dedo de zinc FokI

Se generó una estirpe celular indicadora que alberga un sitio objetivo 5' ACC ATC TTC ttcaag GAC GAC GGC 3' (SEQ ID NO. 147) para una nucleasa de dedo de zinc correspondiente que contiene un dominio de nucleasa FokI. Los vectores de expresión que codifican la nucleasa de dedo de zinc se transdujeron en estirpes celulares indicadoras que albergan el casete indicador TLR-FokI con y sin Trex2. La coexpresión de Trex2 con la nucleasa de dedo de zinc da como resultado una tasa de mutación aumentada. Véase Figura 11B.

Ejemplo 4

La proteína de fusión I-SceI-G4s-Trex2 Endo/Exo-Nucleasa quimérica mejora la tasa de interrupción dirigida

Los vectores de expresión que comprenden HA-I-SceI-BFP, (HA-I-SceI)-T2A-Trex2-BFP o (HA-I-SceI)-G4S-Trex2-BFP se construyeron como se describe en el Ejemplo 1. El gen I-SceI utilizado para construir los vectores de expresión codificó adicionalmente una etiqueta de epítopo de HA N-terminal. El vector de expresión (HA-I-SceI)-T2A-(HA-Trex2-BFP) expresa HA-I-SceI y Trex2 en una relación de 1 a 1 de un solo promotor, pero la secuencia ligadora T2A permite dos proteínas separadas para ser producidas a partir de una sola traducción. El vector de expresión (HA-I-SceI)-G4S-(HA-Trex2)-BFP produce una proteína de fusión endo/exo-nucleasa en la que las proteínas HA-I-SceI y Trex2 se acoplan por un péptido ligador G4S. Los vectores de expresión HA-I-SceI-BFP, (HA-I-SceI)-T2A-Trex2-BFP y (HA-TSceI)-G4S-Trex2-BFP se transdujeron en células HEK293 que contienen un casete genómicamente integrado correspondiente al indicador de interrupción dirigido ilustrado en la Figura 1A.

Después de la transducción de la estirpe celular con los vectores de expresión, se analizó la expresión de mCherry+ en las células mediante citometría de flujo. La gráfica que se muestra en la Figura 3A demostró que las proteínas de fusión endo/exo I-SceI-G4S-Trex2 son activas y aumentan las tasas de interrupción específicas sobre el suministro de I-SceI solo. Véase Figura 3.

Sin embargo, Sce-G4S-Trex2, a pesar de la expresión estable de la proteína de fusión, fue inferior en la inducción de la interrupción génica en comparación con Sce-T2A-Trex2, posiblemente debido a un impedimento estérico. Véase Figura 3A.

Se realizó una transferencia Western anti-HA para evaluar la estabilidad de las proteínas HA-I-SceI, HA-I-SceI-T2A y (HA-I-SceI)-G4S-Trex2 en las células de expresión. Como se muestra en la Figura 3B y 3C, la proteína de fusión endoexo quimérica (HA-I-SceI)-G4S-Trex2 se expresó a los mismos niveles que I-SceI solo, o I-SceI que contiene un péptido etiqueta T2A residual.

Ejemplo 5

La coexpresión de la exonucleasa I-SceI y Trex2 aumenta la tasa de mutaciones inducidas por I-SceI en las células primarias

Para determinar si Trex2 aumentaría las tasas de interrupción génica en las células primarias, se aislaron fibroblastos embrómeos murinos primarios (MEF) de un ratón con un sitio I-SceI “conectado” al locus de la subunidad gamma del receptor de interleucina-2 (IL2RG) (Ratón “Sce-SCID”, datos no publicados, G.C., D.J.R., A.M.S). Los MEF se aislaron de embriones Sce-SCID a los 12-14 días de gestación. Brevemente, los embriones individuales se eliminaron del útero y se lavaron con PBS. Se retiraron tejidos de cabeza y rojo del embrión, y se trituró el tejido restante. El tejido se incubó con tripsina-EDTA durante 10 minutos a 37°C, seguido de centrifugación a 10.000xG durante 5 minutos. El sedimento se resuspendió en medio MEF y se sembró a 37°C. Las células MEF se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco sin glutamina suplementado con L-glutamina 2 mM, suero bovino fetal al 10% (FBS) y penicilina/estreptomicina al 1%.

1.0 x 105 células Sce-SCID MEF se sembraron en una placa de 24 pozos 24 horas antes de la transducción con I-SceI o I-SceI.T2A.Trex2 que expresan vectores lentivirales recombinantes (LV). Se utilizaron 05 |jg de ADN para cada vector de expresión, y se transfectaron utilizando Fugene6 o XtremeGene9 (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se pasaron 24 horas más tarde y se analizaron 72 horas después de la transducción. La interrupción génica total en el sitio objetivo de I-SceI se ensayó utilizando el ensayo de digestión descrito en el Ejemplo 1. Se observó un aumento de 6 veces en la interrupción en el locus de la cadena gamma común con I-SceI acoplado a Trex2 (I-SceI = 15.8, I-SceI.T2A.Trex2 = 88.7). Véanse las Figuras 9A y 9B. Adicionalmente, dado que IL2RG solo se expresa en un subconjunto de células hematopoyéticas diferenciadas, estos experimentos demuestran que Trex2 puede facilitar la interrupción de alta frecuencia en loci no expresados.

Ejemplo 6

Efecto de la sobreexpresión de exonucleasa en la reparación del daño del ADN endógeno

Para determinar si la sobreexpresión de exonucleasa altera la capacidad de las células para reparar otros tipos de daño endógeno del ADN, las células que expresan Trex2 se tratan con agentes inductores del daño del ADN modelo. Se sembraron 1.0 x106 Sce-SCID Me F en un plato de 10 cm 24 horas antes de la transducción. 500 pL de 10x LV (pCVL.SFFV.sceD44A.IRES.BFP o T2A.TREX2. IRES.BFP) se agregaron al cultivo con 4 pg/mL de polibreno. 24 horas después de la transducción, las células se pasaron a placas de 15 cm. 72 horas después de la transducción, se sembraron de 1.0x105 Sce-SCID MEF en una placa de 12 pozos con medio 1 mL y se trataron como se indica con agentes inductores de daño en el ADN: Mitomicina C (Sigma Aldrich, St. Louis), Camptotecina (Sigma Aldrich, St. Louis), o radiación ionizante. 48 horas después de la exposición, las células se incubaron en 0.5 jg/mL de PI como se indicó anteriormente y se analizaron por citometría de flujo. Para las células CD34+, 72 horas después de la transducción con Trex2 que expresa LV, se sembraron 2.0x105 CD34+ HSC en una placa de 96 pozos en 200 pL de medio, se agregaron agentes dañinos de ADN a los medios y las placas se analizaron como se indicó anteriormente. La sobreexpresión de Trex2 no tuvo ningún efecto adverso sobre el ciclo celular o la sensibilidad a los agentes que dañan el ADN modelo, lo que sugiere que las células mantienen una reparación del ADN de alta fidelidad en las lesiones que se producen independientemente de aquellas creadas por la endonucleasa. Véase Figuras 13-16.

Ejemplo 7

La coexpresión de I-SceI y las enzimas de procesamiento de extremos aumenta la tasa de mutaciones inducidas por I-SceI

Para determinar si los resultados de acoplar endonucleasas de asentamiento con Trex2 podrían extenderse a otras enzimas modificadoras de ADN, se generó una biblioteca de 13 enzimas candidatas que poseen una variedad de actividades de procesamiento de extremos bioquímico derivadas de especies de mamíferos, bacterias o virus. Véase Tabla 2. La biblioteca de enzimas de procesamiento de extremos de ADN se clonó en el vector pExodus con genes sintetizados por Genscript (Piscataway, NJ) como codón de ADNc optimizado para la expresión humana. Ver SEQ ID NO. 110-145.

La biblioteca de enzimas de procesamiento de extremos de ADN se cribó coexpresando cada enzima con la endonucleasa de asentamiento, I-SceI o la Nucleasa de dedo de zinc, VF2468, en las respectivas células HEK293T TLR. Véase Figuras 17-19. Cinco de las enzimas de procesamiento de extremos de ADN (Artemis, Tdt, Apollo, Rad2 y Exo1) aumentaron de manera sólida la eficiencia de interrupción génica de I-SceI. Véase Figura 17. Adicionalmente, la actividad de interrupción génica de estas cinco enzimas se analizó a tres niveles de expresión de I-SceI (cuantificada por la intensidad de fluorescencia media, MFI, del fluoróforo BFP). La coexpresión de estas enzimas con I-SceI aumentó la eficiencia mutagénica de I-SceI, incluso a niveles bajos de expresión de endonucleasa. Véase Figura 18. Por el contrario, aunque varias de las enzimas de procesamiento de extremos de ADN poseen actividad de exonucleasa 5', no se observó un efecto significativo de cualquier enzima en el aumento de la eficiencia de interrupción génica del ZFN VF2468. Véase Figura 19A.

Adicionalmente, la biblioteca de enzimas de procesamiento de extremos de ADN se seleccionó al coexpresar cada enzima con TALEN. Véase Figura 19B.

Tabla 2: Biblioteca de enzimas de procesamiento de extremos de ADN.

Ejemplo 8

Cribado de exonucleasa

Una biblioteca de expresión que contiene exonucleasas específicas 3' y 5' se criba al expresar las exonucleasas en células que contienen un indicador de interrupción dirigido que alberga un sitio objetivo de endonucleasa de asentamiento, por ejemplo, un sitio objetivo I-SceI. Las exonucleasas se coexpresan en las células indicadoras con una endonucleasa de asentamiento, por ejemplo, I-Sce-I, que genera salientes en 3' al dividir su sitio objetivo. A continuación, se identifican las exonucleasas que aumentan la tasa de interrupción, tal como se visualiza mediante la expresión de mCherry+, del sitio objetivo de endonucleasa de asentamiento sobre la expresión de la endonucleasa de asentamiento sola.

Una biblioteca de expresión que contiene exonucleasas específicas 3' y 5' se criba adicionalmente al expresar las exonucleasas en células que contienen un indicador de interrupción dirigido que alberga un sitio objetivo de endonucleasa de dedo de zinc. Las exonucleasas se coexpresan en las células indicadoras con una endonucleasa de dedo de zinc, que genera salientes en 5' al dividir su sitio objetivo con Fok1. Se identifican las exonucleasas que aumentan la tasa de interrupción, tal como se visualiza mediante la expresión de mCherry+, del sitio objetivo de endonucleasa de dedo de zinc sobre la expresión de la endonucleasa de dedo de zinc sola.

Ejemplo 9

Trex-Multiplex

El aumento de las tasas de interrupción para nucleasas individuales mediante el acoplamiento de la actividad de endonucleasa con la actividad de exonucleasa, permite múltiples cambios simultáneos a un genoma (multiplexación). Tres endonucleasas de asentamiento están diseñadas para inactivar tres genes diferentes (x, y y z). En ausencia de la coexpresión de exonucleasa, la eficiencia de producir una mutación disruptiva, inactivación, para cada gen individualmente es del 10%, lo que significa que la posibilidad de producir con éxito las tres mutaciones disruptivas en una sola célula con una sola ronda de expresión de endonucleasa es 1%. Una exonucleasa, por ejemplo, Trex2, se coexpresa con las tres endonucleasas de asentamiento para aumentar la tasa de mutagénesis inducida por las endonucleasas de asentamiento. Un aumento de 5 veces en la tasa de mutagénesis, al 50% para cada gen individual, mejora la posibilidad de interrumpir los tres en una sola célula, en una sola ronda al 12.5%, una diferencia de 125 veces. Ejemplo 10

Reducción de anomalías cromosómicas durante la interrupción dirigida mediada por endonucleasa

Las endonucleasas, tales como las endonucleasas de asentamiento, las nucleasas de dedo de zinc y las nucleasas efectoras de TAL, inducen anormalidades cromosómicas indiscriminadas, tales como las translocaciones. Para probar la capacidad de coexpresión de una exonucleasa que facilita la interrupción de un sitio objetivo de endonucleasa para disminuir la incidencia de anomalías cromosómicas indiscriminadas, se expresa una endonucleasa o una serie de endonucleasas en presencia y ausencia de Trex2. El análisis de cariotipo o el análisis de matriz GCH se realizan para determinar si se reduce la incidencia de anomalías genómicas inducidas por las endonucleasas.

Ejemplo 11

Impartir especificidad de sitio a exonucleasas

Una exonucleasa de interés, por ejemplo, Trex2, se fusiona directamente o se acopla a través de un péptido ligador a una endonucleasa o a un dominio de unión a ADN que se une específicamente a un sitio objetivo adyacente al sitio en el que se desea la actividad de exonucleasa.

Ejemplo 12

Método de tratamiento, prevención o inhibición de la infección por VIH en un paciente humano

Las células madre hematopoyéticas se aíslan de la médula ósea obtenida de un sujeto humano. Las células madre aisladas se ponen en contacto con una cantidad efectiva de una nucleasa de dedo de zinc (ZFN) que tiene sitios objetivo en el gen CCR-5 humano y se ponen en contacto simultáneamente con una exonucleasa 5'. Se permite que las células contactadas se recuperen en los medios durante 72 horas y luego se criban para detectar la interrupción dirigida del gen CCR-5. Las células que contienen una interrupción dirigida en CCR-5 luego se propagan bajo condiciones apropiadas. El sujeto recibe una inyección intravenosa diaria (i.v.) de aproximadamente 20 millones de células que contienen la interrupción dirigida en el gen CCR-5. Esta dosificación se puede ajustar con base en los resultados recibidos y el juicio del médico tratante. El protocolo se continúa preferiblemente durante al menos aproximadamente 1 o 2 semanas, preferiblemente al menos aproximadamente 1 o 2 meses, y se puede continuar sobre una base crónica. Ejemplo 13

Las células madre hematopoyéticas se aíslan de la médula ósea obtenida de un sujeto humano. Las células madre aisladas se ponen en contacto con una cantidad efectiva de una endonucleasa de asentamiento para dividir un sitio objetivo en el gen CCR-5 humano y se contactan simultáneamente con la exonucleasa Trex2. Se permite que las células contactadas se recuperen en los medios durante 72 horas y luego se criban para a interrupción dirigida del gen CCR-5. Las células que contienen una interrupción dirigida en CCR-5 luego se propagan bajo condiciones apropiadas. El sujeto recibe una inyección intravenosa diaria (i.v.) de aproximadamente 20 millones de células que contienen la interrupción dirigida en el gen CCR-5. Esta dosificación se puede ajustar con base en los resultados del tratamiento y el juicio del médico tratante. El protocolo se continúa preferiblemente durante al menos aproximadamente 1 o 2 semanas, preferiblemente al menos aproximadamente 1 o 2 meses, y se puede continuar sobre una base crónica.

Ejemplo 14

Claims

REIVINDICACIONES

1. Polinucleótido(s) para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación de una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería en una célula, en la que el(los) polinucleótido(s) codifica(n) una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, I-PanMI, I-OnuI, 1-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos.

2. El(los) polinucleótido(s) de la Reivindicación 1, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos se codifican mediante un polinucleótido único.

3. El(los) polinucleótido(s) de las Reivindicaciones 1 o 2, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos se unen mediante un dominio de ligador, tal como una secuencia ligadora T2A.

4. El(los) polinucleótido(s) de las Reivindicaciones 1o 2, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos se codifican mediante un polinucleótido único y se separan por un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).

5. El(los) polinucleótido(s) de la Reivindicación 1, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos cada uno se codifican por polinucleótidos separados.

6. El(los) polinucleótido(s) de cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería es capaz de dividir un gen CCR-5 o un gen STAT-3.

7. El(los) polinucleótido(s) de la Reivindicación 6 para uso en el tratamiento de VIH o síndrome de hiper IGE.

8. El(los) polinucleótido(s) de cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería o el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos comprende un dominio de dedo de zinc.

9. El(los) polinucleótido(s) de cualquiera de las reivindicaciones mencionadas anteriormente, en los que la célula se selecciona del grupo que consiste de una célula madre hematopoyética, una célula T, un macrófago, una célula dendrítica y una célula que presenta antígeno.

10. Polipéptidos para aumentar la actividad mutagénica o frecuencia de mutación en una célula, en los que el(los) polipéptido(s) comprenden una endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería seleccionada del grupo que consiste de: I-LtrI, I-GpiI, I-GzeI, I-MpeMI, I-PanMI, I-OnuI, 1-HjeMI, y I-AniI y un Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos.

11. Los polipéptidos de la Reivindicación 10, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos se codifican mediante un polinucleótido único.

12. Los polipéptidos de las Reivindicaciones 10 o 11, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos se unen mediante un dominio de ligador, tal como una secuencia ligadora T2A.

13. Los polipéptidos de las Reivindicaciones 10 o 11, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos se codifican mediante un polinucleótido único y se separan por un IRES.

14. Los polipéptidos de las Reivindicaciones 10 o 11, en los que la endonucleasa de asentamiento diseñada por ingeniería y el Trex2 o fragmento biológicamente activo de los mismos cada uno se codifican por polinucleótidos separados.

15. Los polipéptidos de la Reivindicación 10, en los que la endonucleasa es capaz de dividir un gen CCR-5 o un gen STAT-3.

16. Los polipéptidos de la Reivindicación 15 para uso en el tratamiento de VIH o síndrome de hiper IGE.

17. El(los) polinucleótido(s) de acuerdo con la reivindicación 6 o los polipéptidos de acuerdo con la reivindicación 15 para uso como un medicamento.