ES2796087T3

ES2796087T3 - Métodos y composiciones para el tratamiento de beta talasemia

Info

Publication number: ES2796087T3
Application number: ES15742584T
Authority: ES
Inventors: Pei-Qi Liu; Andreas Reik; Lei Zhang
Original assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Current assignee: Sangamo Therapeutics Inc
Priority date: 2014-02-03
Filing date: 2015-02-02
Publication date: 2020-11-25
Anticipated expiration: 2035-02-02
Also published as: WO2015117081A3; HRP20201038T1; HUE051232T2; RS60514B1; EP3102673B1; DK3102673T3; US10072066B2; EP3102673A4; PT3102673T; LT3102673T; PL3102673T3; US20150218253A1; EP3102673A2; WO2015117081A2; SI3102673T1

Abstract

Una célula madre hematopoyética CD34+ modificada genéticamente, que comprende: un par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par: (i) una primera nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana como se muestra en SEQ ID NO: 5, comprendiendo la primera ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11); F2: QSGTRKT (SEQ ID NO: 12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO: 13); F4: DSANRIK (SEC ID Nº: 14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11); y F6: QSGNLHV (SEQ ID NO: 15); y (ii) una segunda nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana como se muestra en SEQ ID NO: 4, comprendiendo la segunda ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: AMQTLRV (SEQ ID NO: 16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO: 7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO: 8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO: 9); y F5: TSSDRKK (SEQ ID NO: 17) o VYEGLKK (SEQ ID NO: 18); y una secuencia donante que comprende una secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21, en donde la secuencia donante se inserta en un gen de hemoglobina beta humana (Hbb) aberrante endógena después de la escisión fijada como objetivo por el par de nucleasas con dedos de zinc, corrigiendo con ello la secuencia del gen Hbb, y en donde el gen Hbb aberrante comprende una secuencia intermedia 1, mutación número 1 mutación (IVS1-1).

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y composiciones para el tratamiento de beta talasemia

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación se encuentra en el campo de la ingeniería del genoma de células madre hematopoyéticas, especialmente para el tratamiento de una hemoglobinopatía, tal como beta talasemia.

ANTECEDENTES

La terapia génica tiene un enorme potencial para una nueva era en la medicina humana. Estas metodologías permitirán el tratamiento de afecciones que hasta ahora no han sido abordables por la práctica médica estándar. Un área que es especialmente prometedora es la capacidad de modificar genéticamente una célula para hacer que esa célula exprese un producto que no se había producido previamente en esa célula, por ejemplo debido a una mutación que inactiva el gen específico en su genoma. Ejemplos de usos de esta tecnología incluyen la corrección fijada como objetivo de una mutación que provoca la enfermedad, la inserción de un gen que codifica una nueva proteína terapéutica, la inserción de una secuencia codificante que codifica una proteína que falta en la célula o en el individuo, la inserción de un gen de tipo salvaje en una célula que contiene una secuencia del gen mutada y la inserción de una secuencia que codifica un ácido nucleico estructural, tal como un microARN o ARNip.

Los transgenes pueden administrarse a una célula de una diversidad de maneras, de modo que el transgén se integre en el propio genoma de la célula y se mantenga allí. En los últimos años se ha desarrollado una estrategia para la integración transgénica que utiliza la escisión con nucleasas específicas para el sitio para la inserción fijada como objetivo en un locus genómico elegido (véase, p. ej., la Patente de EE.UU. de propiedad conjunta 7.888.121). Nucleasas específicas para genes fijados como objetivo se pueden utilizar de modo que la construcción del transigen se inserte por reparación dirigida por homología (HDR) o por captura final durante procesos impulsados por unión de extremos no homólogos (NHEJ). Los loci fijados como objetivo incluyen loci de "puerto seguro", por ejemplo, un gen CCR5, un gen CXCR4, un gen PPP1R12C (también conocido como AAVS1), un gen de albúmina o un gen Rosa. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. N27.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; 8.586.526; Publicaciones de Patentes de EE.UU. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960). La integración mediada por nucleasas ofrece la posibilidad de una expresión transgénica mejorada, una seguridad incrementada y la durabilidad de la expresión, en comparación con los enfoques de integración clásicos que se basan en la integración aleatoria del transgén, ya que permite un posicionamiento exacto del transgén para un riesgo mínimo de silenciamiento génico o activación de oncogenes cercanos. Las nucleasas incluyen nucleasas con dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), endonucleasas mega o de asentamiento, sistemas de nucleasas, tales como CRISPR/Cas que utilizan un ARN guía para determinar la especificidad y fusiones entre nucleasas, tales como mega-TAL.

La integración fijada como objetivo mediada por nucleasa también puede utilizarse para la corrección génica fijada como objetivo de un locus endógeno. La corrección génica puede producirse después de la escisión de la nucleasa como se indicó anteriormente, insertando un transgén de interés en el locus endógeno mutante. Alternativamente, un gen mutante puede corregirse integrando una porción de la secuencia de tipo salvaje o manipulada para reemplazar (corregir) la porción mutante del locus del gen. Para la corrección génica, al igual que con la integración fijada como objetivo de cualquier secuencia exógena, se utilizan nucleasas específicas para la secuencia (p. ej., ZFN, TALEN, CRlSPR/Cas, meganucleasas o megaTAL) para introducir un DSB en el gen endógeno de interés y un donante, que típicamente comprende brazos de homología con el gen endógeno (mutante), se integra de tal manera que el gen endógeno (mutante) es alterado por el donante. Este enfoque puede utilizarse para corregir mutaciones dentro de una secuencia de genes endógena y/o para insertar secuencias manipuladas para un propósito deseado.

Los glóbulos rojos (RBC), o eritrocitos, son el componente celular principal de la sangre. De hecho, los RBC representan una cuarta parte de las células en un ser humano. Los RBC maduros carecen de un núcleo y de muchos otros orgánulos en los seres humanos, y están llenos de hemoglobina, una metaloproteína que se encuentra en los RBC que funciona para transportar oxígeno a los tejidos, así como para extraer dióxido de carbono de los tejidos y de nuevo a los pulmones para su separación. La proteína constituye aproximadamente el 97% del peso seco de los RBC y aumenta la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre en aproximadamente setenta veces. La hemoglobina es un heterotetrámero que comprende dos cadenas de globina de tipo a y dos cadenas de globina de tipo p y 4 grupos hemo. En adultos, el tetrámero a2p2 se conoce como Hemoglobina A (HbA) o hemoglobina adulta. Típicamente, las cadenas de globina alfa y beta se sintetizan en una relación aproximada de 1:1 y esta relación parece ser crítica en términos de hemoglobina y estabilización de los RBC. De hecho, en algunos casos en los que un tipo de gen de globina se expresa de forma inadecuada (véase más adelante), la reducción de la expresión (p. ej., utilizando un ARNip específico) del otro tipo de globina, la restauración de esta relación 1:1 alivia algunos aspectos del fenotipo celular mutante (véase Voon et al (2008) Haematologica 93(8):1288). En un feto en desarrollo se produce una forma diferente de hemoglobina, la hemoglobina fetal (HbF), que tiene una mayor afinidad de unión por el oxígeno que la hemoglobina A, de modo que el oxígeno puede ser entregado al sistema del bebé a través del torrente sanguíneo de la madre. La hemoglobina fetal también contiene dos cadenas de globina a, pero en lugar de las cadenas de globina p de los adultos, tiene dos cadenas de globina y fetal (es decir, la hemoglobina fetal es a2Y2). Aproximadamente a las 30 semanas de gestación, la síntesis de globina y en el feto comienza a disminuir, al tiempo que aumenta la producción de globina p. Aproximadamente a los 10 meses de edad después del nacimiento, la hemoglobina del recién nacido es casi toda a2p2, aunque algo de la HbF persiste hasta la edad adulta (aproximadamente 1 -3% de la hemoglobina total). La regulación del cambio de la producción de y a p es bastante compleja, y principalmente implica una regulación a la baja de la expresión de globina y con una regulación al alza simultánea de la expresión de globina p.

Defectos genéticos en las secuencias que codifican las cadenas de hemoglobina pueden ser los responsables de un cierto número de enfermedades conocidas como hemoglobinopatías, incluyendo anemia de células falciformes y talasemias. En la mayoría de los pacientes con hemoglobinopatías, los genes que codifican la globina y permanecen intactos, pero la expresión de globina y es relativamente baja debido a la represión génica normal que se produce alrededor del parto tal como se describió arriba.

Las talasemias también son enfermedades relacionadas con la hemoglobina y típicamente implican una producción reducida de cadenas de globina. Esto puede ocurrir a través de mutaciones en las regiones reguladoras de los genes o de una mutación en una secuencia de codificación de globina que resulta en una producción reducida. Las alfa talasemias están asociadas con personas de África Occidental y ascendencia del Sur de Asia, y pueden conferir resistencia a la malaria. La beta talasemia está asociada con personas de ascendencia mediterránea, típicamente de Grecia y las zonas costeras de Turquía e Italia. El tratamiento de las talasemias implica habitualmente transfusiones de sangre y terapia de quelación de hierro. Los trasplantes de médula ósea también se están utilizando para el tratamiento de personas con talasemias graves si se puede identificar un donante apropiado, pero este procedimiento puede tener riesgos significativos. Las beta talasemias se dividen generalmente en tres grupos: i) rasgo talasémico o talasemia menor, en que los pacientes son portadores de un alelo de la enfermedad de talasemia o tienen síntomas muy leves que pueden resultar en una anemia leve. ii) Pacientes con talasemia intermedia, en que la falta de beta globina es lo suficientemente grande como para provocar una anemia moderadamente severa y problemas de salud significativos, incluyendo deformaciones de los huesos y agrandamiento del bazo. Sin embargo, existe un amplio intervalo en la gravedad clínica de esta afección, y el límite entre la talasemia intermedia y la forma más severa, la talasemia mayor, puede ser confuso. El factor decisivo parece ser la cantidad de transfusiones de sangre requeridas por el paciente. iii) Talasemia mayor o anemia de Cooley. Esta es la forma más severa de beta talasemia en la cual la falta completa de beta globina provoca una anemia potencialmente mortal que requiere transfusiones de sangre regulares y atención médica extensa y continua. Estas transfusiones de sangre extensas y de por vida conducen a una sobrecarga de hierro que debe tratarse con terapia de quelación para prevenir la muerte prematura por insuficiencia orgánica.

Para talasemias beta, a finales de 1980 se estimó que aproximadamente 54 mutaciones en el gen de beta globina englobaban todos los genes de globina beta enfermos conocidos; desde entonces, el número ha aumentado a más de 200. Las mutaciones se dividen en mutaciones que dan como resultado la proteína globina beta no funcional, incluidas mutaciones sin sentido y mutaciones de desplazamiento de marco; mutaciones de procesamiento de ARN, que incluyen cambios en las uniones de corte y empalme y cambios en las secuencias de consenso de corte y empalme, así como cambios en las secuencias intrónicas y exónicas internas que resultan en un corte y empalme aberrante; mutantes transcripcionales; mutantes de escisión de poliA y ARN; mutantes del sitio caperuza; y mutantes inestables de ARNm. Estas mutaciones dan como resultado una pérdida completa de ARNm de globina beta en la célula (también denominada "p-0") o un nivel reducido de la expresión y acumulación de ARNm (al que se alude como "p "). (véase, p. ej., Kazazian y Boehm (1988) Bloodvol 71 N° 4: 1107). Los pacientes con las formas p más leves de beta talasemia pueden tener esperanzas de vida relativamente normales, pero aquellos con las formas p-0 severas pueden morir antes de la edad de 30 años si no se tratan, y si los niveles de hierro no se controlan, también pueden tener una esperanza de vida más corta si se administran transfusiones frecuentes Es de destacar que algunas mutaciones específicas son más comunes que otras; en particular, en algunas partes de Europa y Oriente Medio, una mutación conocida como "IVS1-1" (que significa "secuencia intermedia 1, mutación número 1") representa aproximadamente el 20% de todas las mutaciones mayores de b-talasemia. En esta mutación, el dinucleótido "GT" al comienzo del intrón 1 del gen de beta-globina humana se cambia a un "AT", interrumpiendo con ello una señal clave (conocida como el "motivo del donante de corte y empalme") esencial para una separación precisa y eficiente del intrón 1 del pre-ARNm de globina beta. Como resultado, se observa una reducción significativa en la proteína globina beta durante la eritropoyesis, lo que resulta en una b-talasemia mayor dependiente de transfusiones.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de métodos y composiciones adicionales que puedan ser utilizados para la edición del genoma, para corregir un gen aberrante o alterar la expresión de otros, por ejemplo, para tratar beta talasemias.

SUMARIO

La invención proporciona una célula madre hematopoyética CD34+ modificada genéticamente que comprende: un par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par: (i) una primera nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO: 5, comprendiendo la primera ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); y F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); y (ii) una segunda nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO:4, comprendiendo la segunda ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); y F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) o VYEGLKK (SEQ ID NO:18); y una secuencia donante que comprende una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO:19 o SEQ ID NO:21, en donde la secuencia donante se inserta en un gen endógeno aberrante de betahemoglobina humana (Hbb) después de la escisión fijada como objetivo por el par de nucleasas con dedos de zinc, corrigiendo con ello la secuencia del gen Hbb, y en donde el gen Hbb aberrante comprende una secuencia intermedia 1, mutación número 1 (IVS1-1).

La invención también proporciona una célula genéticamente modificada que desciende de una célula de la invención, en donde la célula comprende: un par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par: (i) una primera nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO:5, comprendiendo la primera ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); F2: QSGTRKT (SeQ ID NO:12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); y F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); y (ii) una segunda nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO:4, comprendiendo la segunda ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); y F5: TSSDRKK (SeQ ID NO:17) o VYEGLKK (SEQ ID NO:18); y una secuencia donante que comprende una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO:19 o SeQ ID NO:21.

La invención proporciona, además, una célula diferenciada genéticamente modificada que desciende de una célula de la invención, tal como un glóbulo rojo (RBC), en donde la célula comprende: un par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par: (i) una primera nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO:5, comprendiendo la primera ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: LRHHLTR (SEQ ID N°:11); F2: QSGTRKT (SEQ ID NO:12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO: 14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); y f6: QSGNLHV (SeQ ID NO:15); y (ii) una segunda nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO:4, comprendiendo la segunda ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); y F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) o VYEGLKK (SEQ ID NO:18); y una secuencia donante que comprende una secuencia tal como se muestra en SEQ ID NO:19 o SEQ ID NO:21.

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una célula genéticamente modificada de la invención.

La invención también proporciona una célula genéticamente modificada de la invención para su uso en el tratamiento de una beta-talasemia.

La invención proporciona, además, una composición que comprende un par de nucleasas con dedos de zinc, o un polinucleótido que codifica el par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par: (i) una primera nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO:5, comprendiendo la primera ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); F2: QSGTRKT (SeQ ID NO:12); F3: RSDNLST (SEQ ID NO:13); F4: DSANRIK (SEQ ID NO:14); F5: LRHHLTR (SEQ ID NO:11); y F6: QSGNLHV (SEQ ID NO:15); y (ii) una segunda nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana tal como se muestra en SEQ ID NO:4, comprendiendo la segunda ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento: F1: AMQTLRV (SEQ ID NO:16); F2: DRSHLAR (SEQ ID NO:7); F3: RSDNLSE (SEQ ID NO:8); F4: ASKTRKN (SEQ ID NO:9); y F5: TSSDRKK (SEQ ID NO:17) o VYEGLKK (SEQ ID NO:18).

La invención proporciona un método in vitro para alterar la expresión de Hbb en una célula, comprendiendo el método: introducir, en la célula, uno o más polinucleótidos de acuerdo con la invención, en condiciones tales que se expresen una o más proteínas y se aumente la expresión del gen Hbb.

La invención también proporciona una composición farmacéutica de la invención para uso en un método de tratar un paciente con p-talasemia, comprendiendo el método administrar al paciente la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para aumentar la expresión del gen Hbb en el paciente.

En esta memoria se describen métodos y composiciones para alterar la expresión de y/o para corregir uno o más genes que codifican proteínas implicadas en una enfermedad genética (p. ej., producir proteínas que carecen de, son deficientes o aberrantes en la enfermedad y/o proteínas que regulan estas proteínas) tales como hemoglobinopatías (p. ej., beta talasemias). La alteración de genes de este tipo puede dar como resultado el tratamiento de estas enfermedades genéticas (p. ej., beta talasemias). En particular, la edición del genoma se utiliza para corregir un gen aberrante, insertar un gen de tipo salvaje o cambiar la expresión de un gen endógeno. A modo de ejemplo no limitativo, un gen mutado que codifica globina p puede corregirse en una célula para producir una proteína de globina p de tipo salvaje en la célula para tratar una hemoglobinopatía provocada por el gen defectuoso de globina p. Un enfoque implica, además, el uso de la modificación de una célula madre (p. ej., célula madre hematopoyética o precursor de RBC), células madre que pueden utilizarse para injertarse en un paciente, para el tratamiento de una hemoglobinopatía.

En un aspecto, se describe en esta memoria una proteína nucleasa o sistema (p. ej., ZFN, TALEN, megaendonucleasa o de asentamiento, mega-TAL o un sistema CRISPR/Cas) que se une al sitio diana en una región de interés (p. ej., un gen de globina p) en un genoma, en donde la nucleasa comprende uno o más dominios manipulados. La ZFP puede ser una nucleasa con dedos de zinc (ZFN) que escinde una región genómica diana de interés, en donde la ZFN comprende uno o más dominios de unión de dedos de zinc manipulados y un dominio de escisión o semidominio de escisión de nucleasa. La nucleasa puede ser una nucleasa TALE (TALEN) que escinde una región genómica diana de interés, en donde la TALEN comprende uno o más dominios de unión al ADN de TALE manipulados y un dominio de escisión o semi-dominio de escisión de nucleasa. La nucleasa puede ser un sistema CRISPR/Cas en donde la especificidad del CRISPR/Cas está determinada por un ARNm de guía única manipulado. Los dominios de escisión y los semi-dominios de escisión pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de diversas endonucleasas de restricción y/o endonucleasas de asentamiento. En una realización, los semi-dominios de escisión se derivan de una endonucleasa de restricción de Tipo IIS (p. ej., Fok I). El dominio de unión al ADN (p. ej., el dedo de zinc o el dominio de unión al ADN de TALE) puede reconocer un sitio diana en un gen de globina beta. El dominio con dedos de zinc puede comprender 5 o 6 dominios con dedos de zinc y reconoce un sitio diana en un gen globina.

En otro aspecto, en esta memoria se describe un sistema CRISPR/Cas que se une al sitio diana en una región de interés (p. ej., un gen altamente expresado, un gen asociado a la enfermedad o un gen seguro) en un genoma, en donde el sistema CRISPR/Cas comprende una nucleasa CRIPSR/Cas y un ARNcr/ARNtracr manipulado (o ARN guía único). El sistema CRISPR/Cas puede reconocer un sitio diana en un gen de puerto altamente expresado, asociado a la enfermedad o seguro. En determinados aspectos, el sistema CRISPR/Cas reconoce una diana en un gen de globina beta.

Las ZFN, TALEN y/o el sistema CRISPR/Cas tal como se describen en esta memoria pueden unirse a y/o escindir la región de interés en una región codificante o no codificante dentro o adyacente al gen, tal como, por ejemplo, una secuencia conductora, secuencia de avance o intrón, o dentro de una región no transcrita, ya sea aguas arriba o aguas abajo de la región codificante. Las ZFN, TALEN y/o el sistema CRISPR/Cas pueden unirse y/o escindir un gen globina. Las ZFN, TALEN y/o el sistema CRISPR/Cas pueden unirse y/o escindir un gen seguro, por ejemplo un gen CCR5, un gen CXCR4, un gen PPP1R12C (también conocido como AAVS1), un gen albúmina, un gen HPRT o un gen Rosa. Véanse, p. ej., las patentes de EE.UU. N27.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; 8.586.526; Publicaciones de Patentes de EE.UU. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960. Además, para ayudar en la selección, se puede utilizar el locus HPRT (véase la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20130122591). En otro aspecto, en esta memoria se describen composiciones que comprenden una o más de las nucleasas con dedos de zinc y/o TALE o sistema CRISPR/Cas tal como se describe en esta memoria. Las ZFN, TALEN y/o el sistema CRISPR/Cas pueden unirse a y escindir un gen p o globina. En otro aspecto, en esta memoria se describen composiciones que comprenden una o más de las nucleasas con dedos de zinc, TALE o Cas tal como se describe en esta memoria.

En otro aspecto, en esta memoria se describe un polinucleótido que codifica una o más ZFN, TALEN y/o sistema CRISPR/Cas tal como se describe en esta memoria. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ARNm. En algunos aspectos, el ARNm puede modificarse químicamente (véase, p. ej., Kormann et al., (2011) Nature Biotechnology 29(2): 154-157). En otros aspectos, el ARNm puede comprender una caperuza ARCA (véanse las patentes de EE.UU.

7.074.596 y 8.153.773). En realizaciones adicionales, el ARNm puede comprender una mezcla de nucleótidos no modificados y modificados (véase la Publicación de Patente de EE.UU. 20120195936).

En otro aspecto, en esta memoria se describe un vector de expresión de ZFN, TALEN y/o sistema CRISPR/Cas que comprende un polinucleótido que codifica uno o más ZFN, TALEN y/o sistema CRISPR/Cas descritos en esta memoria, unido operativamente a un promotor. En una realización, el vector de expresión es un vector viral.

En un aspecto, en esta memoria se describe una ZFN, TALEN y/o proteína del sistema CRISPR/Cas que se utiliza para escindir un ADN diana.

En otro aspecto, en esta memoria se describe una célula o línea celular modificada genéticamente, por ejemplo, en comparación con la secuencia de tipo salvaje de la célula o línea celular. En determinados aspectos, la célula comprende precursores de RBC modificados genéticamente (células madre hematopoyéticas conocidas como "HSC"). La célula o las líneas celulares pueden ser heterocigotas u homocigotas para la modificación. Las modificaciones pueden comprender inserciones, deleciones y/o combinaciones de las mismas. Las HSC pueden modificarse con una nucleasa manipulada y un ácido nucleico donante de manera que se inserte y se exprese un gen de tipo salvaje (p. ej., gen globina) y/o se corrija un gen aberrante endógeno. La modificación (p . ej., Inserción) puede estar en o cerca de los sitios de unión y/o escisión de nucleasa(s), por ejemplo, dentro de 1 -300 (o cualquier valor entre ellos) pares de bases aguas arriba o aguas abajo del o de los sitios de escisión, más preferiblemente dentro de 1 -100 pares de bases (o cualquier valor entre ellos) de cualquier lado de los sitios de unión y/o escisión, incluso más preferiblemente dentro de 1 a 50 pares de bases (o cualquier valor entre ellos) a cualquier lado de los sitios de unión y/o escisión. En algunos casos, la secuencia del gen de tipo salvaje para la inserción codifica una globina p de tipo salvaje. En otros casos, el gen aberrante endógeno es el gen de la globina p, por ejemplo, una o más modificaciones genómicas que corrigen al menos una mutación en un gen de la beta-hemoglobina humana aberrante endógena (Hbb). En algunos aspectos, la modificación del gen de la globina beta permite un corte y empalme adecuado de los ARN transcritos. En algunos casos, la región para la corrección comprende las mutaciones IVS 1-1, 1-5, 1 -6, 1-110. La región de globina beta que se corrige comprende la mutación IVS 1-1. La región para la corrección puede comprender mutaciones IVS 2-1,2-745 o 2-654. Células parcial o completamente diferenciadas descendientes de las células madre modificadas tal como se describe en esta memoria se describen también (p. ej., RBC o células precursoras de RBC). También se describen en esta memoria composiciones, tales como composiciones farmacéuticas, que comprenden las células genéticamente modificadas tal como se describe en esta memoria.

En otro aspecto, en esta memoria se describe un método para corregir o insertar una secuencia en un gen endógeno (p. ej., un gen globina beta) en una célula (p. ej., célula madre), comprendiendo el método escindir el gen endógeno utilizando una o más nucleasas y corrigiendo o insertando una secuencia en el sitio de escisión. En determinados aspectos, una secuencia genómica en cualquier gen diana se reemplaza, por ejemplo utilizando un par de ZFN o TALEN, o un sistema CRIPSR/Cas (o un vector que codifica dichas ZFN, TALEN y/o sistema CRIPSR/Cas) tal como se describe en esta memoria y una secuencia "donante" (en algunos casos también conocida como "transgén") que se inserta en el gen después de la escisión fijada como objetivo con la ZFN, TALEN y/o el sistema CRIPSR/Cas. La secuencia donante puede estar presente en el vector ZFN o TALEN, presente en un vector separado (p. ej., vector Ad, AAV o LV) o, alternativamente, puede introducirse en la célula utilizando un mecanismo de suministro de ácidos nucleicos diferente. Una inserción de este tipo de una secuencia de nucleótidos donante en el locus diana (p. ej., el gen globina, otro gen seguro, etc.) da como resultado la expresión del transgen bajo el control de elementos de control genético del locus diana (p. ej., de globina). El transgen puede codificar un ARN no codificante (p. ej., un ARNhc).

En otros aspectos, los precursores de RBC modificados genéticamente (células madre hematopoyéticas conocidas como "HSC") se dan en un trasplante de médula ósea y los RBC se diferencian y maduran in vivo. En algunas realizaciones, las HSC se aíslan después de la movilización inducida por G-CSF y, en otras, las células se aíslan de la médula ósea humana o los cordones umbilicales. En algunas realizaciones, las HSC modificadas se administran al paciente después de un preacondicionamiento mieloablativo leve. En otros aspectos, las HSC se administran después de la mieloablación completa, de modo que después del injerto, el 100% de las células hematopoyéticas se derivan de las HSC modificadas. En aún otro aspecto, se describen en esta memoria líneas celulares y/o modelos (sistemas) de animales transgénicos. La célula y/o el animal transgénico pueden incluir un transgen que codifica un gen humano. En algunos casos, el animal transgénico comprende una inactivación en el locus endógeno correspondiente al transgen exógeno (p. ej., el gen globina de ratón es inactivado y el gen globina humano se inserta en un ratón), permitiendo con ello el desarrollo de un sistema in vivo, en que la proteína humana se puede estudiar de forma aislada. Modelos transgénicos de este tipo pueden utilizarse con fines de rastreo para identificar moléculas pequeñas o biomoléculas grandes u otras entidades que pueden interactuar con o modificar la proteína humana de interés. En algunos aspectos de la divulgación, el transgen se integra en el locus seleccionado (p. ej., globina o puerto seguro) en una célula madre (p. ej., una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida, una célula madre hematopoyética, etc.) o el embrión animal obtenido por cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, y luego el embrión se implanta de manera que nazca un animal vivo. Luego, el animal es criado hasta la madurez sexual y se le permite producir descendencia, en donde al menos algo de la descendencia comprende la secuencia del gen endógeno editado o el transgen integrado.

En todavía un aspecto adicional, en esta memoria se describe un método para la integración específica para el sitio de una secuencia de ácido nucleico en un locus endógeno o la corrección de un gen endógeno en un locus deseado (p. ej., gen globina) de un cromosoma, por ejemplo en el cromosoma de un embrión. En determinados aspectos de la divulgación, el método comprende: (a) inyectar un embrión con (i) al menos un vector de ADN, en donde el vector de ADN comprende una secuencia aguas arriba y una secuencia aguas abajo que flanquean la secuencia de ácido nucleico a integrar, y (ii) al menos una molécula de ARN que codifica una nucleasa con dedos de zinc, TALE o Cas9. En el caso de utilizar una proteína Cas9, también se introduce un ARN(sg) de guía única diseñado. La nucleasa o el sistema de nucleasas reconoce el sitio diana en el lugar diana (p. ej., globina o locus seguro), y luego (b) se cultiva el embrión para permitir la expresión de la nucleasa con dedos de zinc o TALE y/o el sistema CRISPR/Cas, en donde una ruptura de la doble cadena se introduce en la diana mediante la nucleasa con dedos de zinc, luego se repara la TALEN o el sistema CRISPR/Cas, mediante recombinación homóloga con el vector de ADN, con el fin de integrar la secuencia de ácido nucleico en el cromosoma.

En cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, el polinucleótido que codifica la o las nucleasas con dedos de zinc, TALEN y/o el sistema CRIPSR/Cas puede comprender ADN, ARN o combinaciones de los mismos. El polinucleótido puede comprender un plásmido. El polinucleótido que codifica la nucleasa puede comprender ARNm.

También se describe un kit que comprende las ZFP, TALEN y/o el sistema CRIPSR/Cas descritos en esta memoria. El kit puede comprender ácidos nucleicos que codifican las ZFP, TALEN o el sistema CRISPR/Cas, (p. ej., las moléculas de ARN o ZFP, TALEN o Cas9 que codifican genes contenidos en un vector de expresión adecuado) y ARNsg manipulado si es necesario, o partes alícuotas de la proteínas nucleasa, moléculas donantes, líneas celulares huéspedes adecuadas, instrucciones para realizar los métodos de la invención, y similares.

Por lo tanto, la divulgación incluye, pero no se limita a, una célula modificada genéticamente que comprende una modificación genómica. En un aspecto, la modificación genómica corrige al menos una mutación en un gen endógeno aberrante de beta-hemoglobina humana (Hbb). En otro aspecto, la modificación genómica se selecciona del grupo que consiste en inserciones, deleciones y combinaciones de las mismas. En un aspecto relacionado, la célula modificada genéticamente está hecha por una nucleasa que incluye una o más de las nucleasas descritas en esta memoria (p. ej., ZFN (p. ej., tal como se describe en las dos últimas filas de la Tabla 1), TALEN, etc.), nucleasa que puede introducirse en forma de ácido nucleico y/o proteína. En determinados aspectos, la mutación está en una secuencia intermedia 1, mutación número 1 (IVS1 -1), una mutación IVS1 -5, una mutación IVS1 -6, una mutación IVS1 -110, una mutación IVS2-1, una mutación IVS2-745 o una mutación IVS2-654. La modificación genómica puede corregir una mutación puntual. En la célula modificada genéticamente arriba descrita, la modificación genómica puede estar dentro de una o más de las secuencias mostradas en SEQ ID NO:3, por ejemplo, una modificación genómica dentro de SEQ ID NO:3 interrumpe un motivo de donante de corte y empalme. El dinucleótido GT al comienzo del intrón 1 del gen globina beta humana puede cambiarse a un AT. La modificación genómica puede corregir una mutación que altera el sitio donante de corte y empalme para el procesamiento de ARNm del gen Hbb aberrante que conduce a la beta-talasemia. La modificación genómica puede estar en o cerca de cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID N° 4 o 5. La modificación genómica puede comprender la inserción de la secuencia donante que comprende un nuevo sitio de escisión de la enzima de restricción con respecto al gen Hbb endógeno. En determinados aspectos, la secuencia donante tiene una longitud de entre 2 kb y 200 kb, por ejemplo, una secuencia donante seleccionada de cualquiera de SEQ ID NO 20 y 22 y el nuevo sitio de escisión de la enzima de restricción es un sitio Xba I. La secuencia donante puede comprender un transgen de cualquier longitud.

Cualquiera de las células genéticamente modificadas tal como se describe en esta memoria puede ser, por ejemplo, una célula madre tal como una célula madre hematopoyética (p. ej., CD34+). Además, en esta memoria se describe una célula diferenciada, genéticamente modificada, que desciende de cualquiera de las células madre genéticamente modificadas tal como se describe en esta memoria, que incluye, por ejemplo, un glóbulo rojo (RBC).

También se describe una composición farmacéutica que comprende una de más de las células genéticamente modificadas tal como se describe en esta memoria.

Además, también se describe una proteína con dedos de zinc que comprende 4, 5 o 6 dominios de dedos de zinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, comprendiendo cada uno de los dominios de dedos de zinc las regiones de hélice de reconocimiento en el orden mostrado en las dos últimas filas de la Tabla 1. En determinados aspectos, se describe una proteína de fusión que comprende una proteína con dedos de zinc y un semi-dominio de escisión de tipo salvaje o manipulado. También se describen polinucleótidos que codifican cualquiera de las ZFP y/o proteínas de fusión descritas en esta memoria. En esta memoria se describen células aisladas (p. ej., glóbulos rojos (RBC) o células precursoras (p. ej., células madre hematopoyéticas CD4+) que comprenden una o más ZFP, proteínas de fusión y/o polinucleótidos descritos en esta memoria. También se describen kits que comprenden un polinucleótido, una proteína y/o célula tal como se describe en esta memoria.

También se describe un método de alterar la expresión de Hbb en una célula, comprendiendo el método: introducir en la célula, uno o más polinucleótidos tal como se describen en esta memoria, en condiciones tales que la una o más proteínas se expresan y la expresión del gen Hbb está alterada (p. ej., incrementada). Los métodos pueden comprender, además, integrar una secuencia donante en el genoma de la célula, por ejemplo utilizando un vector viral, tal como un oligonucleótido y/o en un plásmido. La secuencia donante puede comprender un transgen y la expresión del transgen puede estar bajo el control de un promotor endógeno o exógeno. El donante puede comprender un oligonucleótido que corrige una mutación que altera el sitio del donante de corte y empalme para el procesamiento de ARNm del gen Hbb. La célula puede ser una célula precursora de glóbulos rojos (RBC) y/o una célula madre hematopoyética. En determinados aspectos, los métodos comprenden producir una célula genéticamente modificada que comprende una modificación genómica dentro de un gen Hbb endógeno, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto una célula con un polinucleótido que codifica una proteína de fusión que comprende una nucleasa con dedos de zinc que comprende 4, 5 o 6 dominios de dedos de zinc, comprendiendo cada uno de los dominios de dedos de zinc una región de hélice de reconocimiento y, además, en donde las regiones de hélice de reconocimiento están en el orden mostrado en una de las dos últimas filas de la Tabla 1; b) someter a la célula a condiciones propicias para expresar la proteína de fusión del polinucleótido; y c) modificar el gen Hbb endógeno con la proteína de fusión expresada suficiente para producir la célula genéticamente modificada. En cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, los métodos pueden comprender, además, estimular las células con al menos una citoquina. El polinucleótido puede suministrarse dentro de la célula, por ejemplo, utilizando al menos uno de un sistema de suministro no viral, un sistema de suministro viral y/o un vehículo de suministro. Los métodos pueden implicar someter las células a un campo eléctrico.

También se describe un método de tratamiento de un paciente con p-talasemia, comprendiendo el método administrar al paciente la preparación farmacéutica tal como se describe en esta memoria (p. ej., una composición farmacéutica describe una o más proteínas, polinucleótidos y/o células tal como se describe en esta memoria) en una cantidad suficiente para aumentar la expresión del gen Hbb en el paciente.

Estos y otros aspectos serán fácilmente evidentes para el experto en la materia a la vista de la divulgación en su conjunto.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una ilustración de la estructura del gen globina beta humana, adaptada de Kazazian y Boehm (1998) ibid. En la parte superior está la ilustración del gen globina beta, en donde las áreas sombreadas indican los exones, y las áreas claras representan los intrones, así como las regiones 5' y 3' no codificantes. También se representan varios de los tipos conocidos de mutaciones de globina beta asociadas con las talasemias, en que un marcador de globo en blanco indica mutaciones que efectúan el corte y empalme, los globos en negro indican mutaciones transcripcionales, los cuadrados en blanco indican la mutación del sitio de la caperuza, la flecha hacia abajo indica mutaciones de escisión del ARN, las flechas en negro hacia arriba indican mutaciones de desplazamiento de marco, las flechas en blanco hacia arriba indican mutaciones sin sentido, un bloque con un asterisco indica mutaciones que aumentan la inestabilidad de ARNm y los rectángulos en blanco indican mutaciones de deleción observadas. El panel inferior de la Figura 1 (SEQ ID NO:1) representa la ubicación de la mutación IVS 1-1 y la secuencia de tipo salvaje correspondiente a esta secuencia. También se muestran las ubicaciones de unión para que dos ZFN se escindan en o cerca de la mutación IVS 1-1, y la mutación puntual responsable de la mutación IVS 1-1 se indica mediante un corchete abierto.

Las Figuras 2A y 2B representan la actividad del par 43545/43544 de ZFN. La Figura 2A es un gel que muestra la actividad de escisión del par ZFN en células CD34+ humanas utilizando el Ensayo Cel I Surveyor, mientras que la Figura 2B es un gráfico que representa la escisión en la secuencia de tipo salvaje ("wt") o en la secuencia mutante IVS1.1 tal como se midió por el ensayo de reasociación de cadena sencilla de luciferasa dual (véase la patente de EE.UU. 8586526). Los experimentos mostrados en la Figura 2B son duplicados. Los experimentos de control se realizaron con células transducidas con un plásmido informador de GFP ("GFP") o células transfectadas simuladas ("negativas"). Los datos indican que ambos alelos son escindidos por el par ZFN.

Las Figuras 3A y 3B representan esquemas para introducir una mutación IVS 1-1 en un gen globina beta de tipo salvaje. La Figura 3A representa las etapas de la modificación del gen, en que la secuencia de tipo salvaje en el gen globina beta endógeno se reemplaza por la mutación IVS 1-1. El donante es un oligonucleótido de cadena sencilla que comprende la mutación IVS 1-1 (que representa la mutación puntual A), así como un sitio de restricción XbaI ("oligonucleótido ss") y el sitio de escisión de ZFN. El gen endógeno escindido (que representa el tipo G salvaje) se muestra debajo del nucleótido donante, y el gen endógeno "gen corregido", que ahora comprende tanto la mutación IVS 1-1 como el sitio de restricción Xbal, se muestra en la parte inferior. La Figura 3B (SEQ ID NO:2) es un primer plano del donante de oligonucleótidos ss, que muestra la secuencia alrededor del sitio de escisión de ZFN, así como los nucleótidos introducidos entre paréntesis.

La Figura 4 representa los resultados de la introducción de la mutación IVS 1-1 descrita en la Figura 3 en el gen globina beta de tipo salvaje en células CD34+ normales. Se muestra un gel que representa los resultados de la escisión de la enzima de restricción XbaI introducida (RFLP). La escisión enzimática indica que las células CD34+ se "corrigieron" con un donante de oligonucleótidos ss que comprende la secuencia de tipo salvaje ("wt") o de globina beta IVS 1-1 y un sitio de restricción XbaI. También se muestran debajo del gel los resultados de la secuenciación de alto rendimiento de productos de PCR que comprenden esta región en las células tratadas. Se indica la cantidad de integración dirigida del donante en las muestras que reciben el donante ("% TI"), y la cantidad de actividad ZFN ("% indeles") en las muestras.

La Figura 5 representa la secuencia genómica (SEQ ID NO:3) alrededor de la mutación IVS 1-1 (Adaptado de Lapoumeroulie et al., (1987) Nucleic Acids Research, 15(20):8195). En la figura se indican sitios de corte y empalme crípticos que se utilizan cuando el sitio de corte y empalme normal se ve interrumpido por la mutación G-> A IVS1 -1.

Las Figuras 6A y 6B representan resultados después de la corrección génica en células CD34+ derivadas del paciente. Células CD34+ derivadas del paciente con beta talasemia ("p13" mostradas en la Figura 6B), junto con las células CD34+ de tipo salvaje ('WT' mostradas en la Figura 6A) fueron tratadas con un oligonucleótido para corregir la mutación IVS 1-1 en tipo salvaje. Las células fueron tratadas con cualquiera de los pares de ZFN solo, con ZFN más el gen con oligo donante que corrige el gen (“WT oligo") o con oligo de donante y GFP solo. En la mayoría de los casos, el oligo donante también comprendía un sitio de restricción XbaI único ("XbaI"). Los geles representan la escisión por XbaI del ADN genómico aislado de las células tratadas y demuestran la inserción del oligonucleótido donante. Las designaciones de las pistas son las siguientes: la pista 1 muestra resultados utilizando ZFN 43545/43544; la pista 2 muestra resultados utilizando ZFN 43545/45946; la pista 3 muestra resultados utilizando ZFN 43545/45952; la pista 4 muestra resultados utilizando ZFN 43545/43544 y WT oligo XbaI; la pista 5 muestra resultados utilizando ZFN 43545/45946 y WT oligo XbaI; la pista 6 muestra resultados utilizando ZFN 43545/45952 y WT oligo XbaI; la pista 7 muestra resultados utilizando GFP y WT oligo XbaI; la pista 8 muestra resultados utilizando ZFN 43545/43544 y WT Oligo (solo p13); y la pista 9 muestra resultados de células no transfectadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En esta memoria se describen métodos y composiciones para estudiar y tratar una enfermedad genética tal como una hemoglobinopatía. Se describe la edición genómica de una célula diana de modo que exista un cambio favorable en la producción de uno o más genes globina, lo que a su vez da como resultado el tratamiento de hemoglobinopatías, tales como una talasemia, en un sujeto que lo necesite. Los cambios favorables en la producción de globina incluyen, pero no se limitan a la corrección de una secuencia aberrante del gen globina p. Adicionalmente, el suministro de células madre hematopoyéticas alteradas en un trasplante alterado para expresar un producto proteico deseado puede ser igualmente beneficioso en el tratamiento de hemoglobinopatías, tales como una talasemia. También se describen líneas celulares y animales con producción alterada de globina.

Por lo tanto, los métodos y las composiciones descritos en esta memoria pueden utilizarse para alterar la producción de uno o más genes globina (p. ej., p) en una célula (p. e j, una célula precursora eritroide). Estas alteraciones y los métodos y las composiciones pueden utilizarse para editar un gen endógeno o insertar un gen en una ubicación deseada en el genoma de una célula (p. ej., en una HSC). Las células precursoras pueden derivarse de sujetos necesitados, modificadas ex vivo y luego son devueltas al sujeto en un injerto de médula ósea.

Generalidades

La puesta en práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones descritas en esta memoria emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, estructura y análisis de cromatina, química computacional, cultivo celular, ADN recombinante y campos relacionados como están dentro de la habilidad de la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Nueva York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATiN STRUCTURE AND FUNCTION, Tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman y A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS iN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definiciones

La expresión "ácido nucleico" y los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, en conformación lineal o circular, y en forma de cadena sencilla o de doble cadena. Para los fines de la presente divulgación, esta expresión y estos términos no deben interpretarse como limitativos con respecto a la longitud de un polímero. La expresión y los términos pueden abarcar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que están modificados en los restos base, azúcar y/o fosfato (p. ej., cadenas principales de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad de apareamiento de bases; es decir, un análogo de A se apareará con T.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan indistintamente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácidos, en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de los correspondientes aminoácidos naturales.

"Unión" se refiere a una secuencia específica, la interacción no covalente entre macromoléculas (p. ej., entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión tienen que ser específicos para la secuencia (p. ej., los contactos con los residuos fosfato en una cadena principal de ADN), siempre que la interacción como un conjunto sea específica para la secuencia. Interacciones de este tipo se caracterizan generalmente por una constante de disociación (Kd) de 10-6 M-1 o inferior. "Afinidad" se refiere a la fuerza de unión: estando el incremento de la afinidad de unión correlacionado con una Kd menor.

Una "proteína de unión" es una proteína que es capaz de unirse de forma no covalente a otra molécula. Una proteína de unión puede unirse, por ejemplo, a una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteínas). En el caso de una proteína de unión a proteínas, puede unirse a sí misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas de dedos de zinc tienen actividad de unión al ADN, unión al ARN y unión a proteínas.

Una "proteína de unión a ADN de dedos de zinc" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une al ADN de una manera específica para la secuencia a través de uno o más dedos de zinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión, cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion zinc. La expresión proteína de unión a ADN de dedos de zinc se abrevia a menudo como proteína de dedos de zinc o ZFP.

Un "dominio de unión a ADN de TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición TALE. Los dominios repetidos están implicados en la unión del TALE a su secuencia de ADN diana relacionada. Una sola "unidad de repetición" (a la que también se alude como "repetición") tiene típicamente una longitud de 33-35 aminoácidos y exhibe al menos alguna homología de secuencia con otras secuencias de repetición TALE dentro de una proteína TALE que se produce de forma natural. Véase, p. ej., la Publicación de Patente de los EE.UU. N220110301073.

Los dominios de unión de dedos de zinc y TALE se pueden "manipular" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo mediante manipulación (alterando uno o más aminoácidos) de la región de hélice de reconocimiento de una proteína de dedos de zinc o TALE que se produce de forma natural. Por lo tanto, las proteínas de unión al ADN manipuladas (dedos de zinc o TALE) son proteínas que no se producen de forma natural. Ejemplos no limitantes de métodos para manipular proteínas de unión al ADN son el diseño y la selección. Una proteína de unión al ADN diseñada es una proteína que no se produce en la naturaleza, cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computarizados para procesar información en una base de datos que almacena información de diseños ZFP y/o TALE existentes y datos de unión. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 6.140.081; 6.453.242; y 6.534.261; véanse también los documentos WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496 y la Publicación de EE.UU. N220110301073.

Una proteína de dedos de zinc o TALE "seleccionada" es una proteína que no se encuentra en la naturaleza, cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico tal como la presentación de fagos, la trampa de interacción o la selección de híbridos. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. N° 8.586.526; 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; y 6.200.759.

"TtAgo" es una proteína Argonauta procariota que se cree que participa en el silenciamiento de genes. TtAgo se deriva de la bacteria Thermus thermophilus. Véase, p. ej., Swarts et al., ibid, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652). Un "sistema TtAgo" son todos los componentes requeridos, incluyendo, por ejemplo, los ADN guía para la escisión por una enzima TtAgo.

"Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos. Para los fines de esta divulgación, "recombinación homóloga" (HR) se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas de doble cadena en las células a través de mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere homología de secuencia de nucleótidos, utiliza una molécula "donante" para reparar el molde de una molécula "diana" (es decir, la que experimentó la ruptura de doble cadena), y se conoce de diversas maneras como "conversión génica no cruzada" o "conversión génica del tracto corto", ya que conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin desear estar ligado a teoría particular alguna, dicha transferencia puede implicar una corrección del emparejamiento erróneo del ADN heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o la "reasociación de la cadena dependiente de la síntesis", en que el donante se utiliza para volver a sintetizar información genética que se convertirá en parte de la diana y/o procesos relacionados. Una HR especializada de este tipo da como resultado, a menudo, una alteración de la secuencia de la molécula diana, de tal manera que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora al polinucleótido diana.

En los métodos de la divulgación, una o más nucleasas fijadas como objetivo tal como se describe en esta memoria crean una rotura de doble cadena en la secuencia diana (p. e j, cromatina celular) en un sitio predeterminado, y puede introducirse en la célula un polinucleótido "donante", que tiene homología con la secuencia de nucleótidos en la región de la ruptura. Se ha demostrado que la presencia de la ruptura de doble cadena facilita la integración de la secuencia donante. La secuencia donante puede estar físicamente integrada o, alternativamente, el polinucleótido donante se utiliza como molde para reparar la ruptura mediante recombinación homóloga, lo que da como resultado la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos como en el donante en la cromatina celular. Por lo tanto, una primera secuencia en la cromatina celular puede alterarse y, en ciertos casos, puede convertirse en una secuencia presente en un polinucleótido donante. Por lo tanto, el uso de los términos "reemplazar" o "reemplazo" puede entenderse que representa el reemplazo de una secuencia de nucleótidos por otra (es decir, el reemplazo de una secuencia en el sentido informativo), y no necesariamente requiere el reemplazo físico o químico de un polinucleótido por otro.

En cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, pares adicionales de proteínas dedos de zinc o TALEN se puede utilizar para la escisión de la doble cadena adicional de sitios diana adicionales dentro de la célula. Además, un sistema CRISPR/Cas puede emplearse de manera similar para inducir roturas adicionales de la doble cadena.

En determinados métodos de recombinación y/o reemplazo y/o alteración fijado como objetivo de una secuencia en una región de interés en la cromatina celular, una secuencia cromosómica se altera por recombinación homóloga con una secuencia de nucleótidos "donante" exógena. Dicha recombinación homóloga es estimulada por la presencia de una ruptura de la doble cadena en la cromatina celular, si están presentes secuencias homólogas a la región de la ruptura.

En cualquiera de los métodos descritos en esta memoria, la secuencia de nucleótidos exógena (la "secuencia donadora" o "transgén") pueden contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas, a las secuencias genómicas en la región de interés, estimulando con ello la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. Por lo tanto, las porciones de la secuencia donante que son homólogas a las secuencias en la región de interés pueden exhibir entre aproximadamente el 80 y el 99% (o cualquier número entero entremedias) de identidad de secuencia con la secuencia genómica que se reemplaza. La homología entre la secuencia donante y la genómica puede ser superior al 99%, por ejemplo, si solo 1 nucleótido difiere entre el donante y las secuencias genómicas de más de 100 pares de bases contiguas. En determinados casos, una porción no homóloga de la secuencia donante puede contener secuencias que no están presentes en la región de interés, de modo que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga está flanqueada generalmente por secuencias de 50-1.000 pares de bases (o cualquier valor entero entremedias) o cualquier número de pares de bases mayor que 1.000, que son homólogas o idénticas a las secuencias en la región de interés. En otros casos, la secuencia donante no es homóloga a la primera secuencia, y se inserta en el genoma mediante mecanismos de recombinación no homóloga.

Cualquiera de los métodos descritos en esta memoria puede utilizarse para la inactivación parcial o completa de una o más secuencias diana en una célula mediante la integración fijada como objetivo de la secuencia del donante que interrumpe la expresión del gen o genes de interés. También se describen líneas celulares con genes parcial o completamente inactivados.

Además, los métodos de integración fijada como objetivo tal como se describe en esta memoria también se pueden utilizar para integrar una o más secuencias exógenas. La secuencia de ácido nucleico exógena puede comprender, por ejemplo, uno o más genes o moléculas de ADNc, o cualquier tipo de secuencia codificante o no codificante, así como uno o más elementos de control (p. ej., promotores). Además, la secuencia de ácido nucleico exógena puede producir una o más moléculas de ARN (p. ej., ARN de horquilla pequeña (ARNhc), ARN inhibidores (ARNi), microARN (miARN), etc.).

"Escisión" se refiere a la ruptura de la cadena principal covalente de una molécula de ADN. La escisión puede iniciarse mediante una diversidad de métodos que incluyen, pero no se limitan a la hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Es posible la escisión de la cadena sencilla y la escisión de la doble cadena, y la escisión de la doble cadena puede ocurrir como resultado de dos eventos distintos de escisión de la cadena sencilla. La escisión del ADN puede dar como resultado la producción de extremos romos o extremos escalonados. Los polipéptidos de fusión se utilizan para la escisión de ADN de doble cadena fijado como objetivo.

Un "semi-dominio de escisión" es una secuencia de polipéptidos que, en conjunción con un segundo polipéptido (idéntico o diferente) forma un complejo que tiene actividad de escisión (preferiblemente actividad de escisión de la doble cadena). Las expresiones "primer y segundo semi-dominios de escisión" y "semi-dominios de escisión y -" y "semi-dominios de escisión derecho e izquierdo" se utilizan indistintamente para referirse a pares de semi-dominios de escisión que se dimerizan.

Un "semi-dominio de escisión manipulado" es un semi-dominio de escisión que ha sido modificado con el fin de formar heterodímeros obligados con otro semi-dominio de escisión (p. ej.., otro semi-dominio de escisión manipulado). Véanse también las patentes de EE.UU. N27.888.121; 7.914.796; 8.034.598 y 8.823.618.

El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser lineal, circular o ramificada y puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. La expresión "secuencia donante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede tener cualquier longitud, por ejemplo entre 2 y 10.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero entremedias o por encima), preferiblemente entre aproximadamente 100 y 1.000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero entremedias), más preferiblemente entre aproximadamente 200 y 500 nucleótidos de longitud.

Un "gen asociado a la enfermedad" es uno que es defectuoso de alguna manera en una enfermedad monogénica. Ejemplos no limitantes de enfermedades monogénicas incluyen inmunodeficiencia severa combinada, fibrosis quística, enfermedades de almacenamiento lisosomal (p. ej.. de Gaucher, Hurler, Hunter, Fabry, Neimann-Pick, Tay-Sach, etc.), anemia de células falciformes y talasemia.

"Cromatina" es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN y proteínas, incluidas las proteínas cromosómicas histonas y no histonas. La mayoría de la cromatina celular eucariota existe en forma de nucleosomas, en donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociadas con un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN enlazador (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre núcleos de nucleosomas. Una molécula de histona H1 se asocia generalmente con el ADN enlazador. Para los fines de la presente divulgación, el término "cromatina" pretende abarcar todos los tipos de nucleoproteína celular, tanto procariotas como eucariotas. La cromatina celular incluye cromatina tanto cromosómica como episomal.

Un "cromosoma", es un complejo de cromatina que comprende la totalidad o una porción del genoma de una célula. El genoma de una célula se caracteriza a menudo por su cariotipo, que es la colección de todos los cromosomas que comprenden el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.

Un "episoma" es un ácido nucleico replicante, complejo de nucleoproteína u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no es parte del cariotipo cromosómico de una célula. Ejemplos de episomas incluyen plásmidos y determinados genomas virales.

Un "sitio diana" o una "secuencia diana" es una secuencia de ácidos nucleicos que define una parte de un ácido nucleico a la cual se unirá una molécula de unión, siempre que las condiciones sean suficientes para que exista la unión.

Una molécula "exógena" es una molécula que normalmente no está presente en una célula, pero que puede ser introducida en una célula por uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. La "presencia normal en la célula" se determina con respecto a la fase de desarrollo particular y las condiciones del entorno de la célula. Así, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario de la musculatura es una molécula exógena con respecto a una célula muscular adulta. De manera similar, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula no sometida a choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcional de una molécula endógena que funciona mal o una versión que funciona mal de una molécula endógena que funciona normalmente.

Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña tal como se genera por un proceso de química combinatoria, o una macromolécula tal como una proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, glicoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser de cadena sencilla o de doble cadena; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden ser de cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los que son capaces de formar dúplex, así como los ácidos nucleicos que forman triplex. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N° 5.176.996 y 5.422.251. Proteínas incluyen, pero no se limitan a proteínas de unión al ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de la cromatina, proteínas de unión al ADN metiladas, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, quinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

Una molécula exógena puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, p. e j, una proteína o ácido nucleico exógeno. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma viral infectante, un plásmido o episoma introducido en una célula o un cromosoma que normalmente no está presente en la célula. Métodos para la introducción de moléculas exógenas en células son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, la transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, incluyendo lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión celular, bombardeo de partículas, co-precipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vectores virales. Una molécula exógena también puede ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, pero derivada de una especie diferente de la que se deriva la célula. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico humano puede introducirse en una línea celular originalmente derivada de un ratón o hámster.

Por el contrario, una molécula "endógena" es una que está normalmente presente en una célula particular en una fase de desarrollo particular bajo condiciones del entorno particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otra organela, o un ácido nucleico episomal que se produce de forma natural. Moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.

Una molécula de "fusión" es una molécula en la que dos o más moléculas subunidades están enlazadas, preferentemente de forma covalente. Las moléculas de la subunidad pueden ser del mismo tipo químico de molécula, o pueden ser diferentes tipos químicos de moléculas. Ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN de ZFP o TALE y uno o más dominios de activación) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descrita arriba). Ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a una fusión entre un ácido nucleico formador de triplex y un polipéptido, y una fusión entre un aglutinante de surco menor y un ácido nucleico.

La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar del suministro de la proteína de fusión a la célula o del suministro de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en donde el polinucleótido se transcribe y el transcrito se traduce, para generar la proteína de fusión. El corte y empalme trans, la escisión de polipéptidos y el ligamiento de polipéptidos también pueden estar implicados en la expresión de una proteína en una célula. Métodos para el suministro de polinucleótidos y polipéptidos a las células se presentan en otra parte de esta divulgación.

Un "gen", para los propósitos de la presente divulgación, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase más abajo), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, ya estén o no las secuencias reguladoras adyacentes a las secuencias codificantes y/o transcritas. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción, tales como sitios de unión a ribosomas y sitios de entrada al ribosoma interno, potenciadores, silenciadores, aisladores, elementos límite, orígenes de replicación, sitios de unión a la matriz y regiones de control de locus. Un gen "aberrante" es un gen que difiere en la secuencia de nucleótidos del gen de tipo salvaje, incluido un gen que incluye una o más mutaciones (p. ej., mutaciones puntuales, inserciones y/o deleciones) en comparación con la secuencia de tipo salvaje. Hbb de tipo salvaje se describe, por ejemplo, en GenBank N° de Acceso NG_000007 (véase, también, Efstratiadis et al. (1980) Cell21 (3):653-668). El producto codificado por un gen aberrante puede exhibir la misma o diferente función (p. ej., función incrementada, función disminuida, sin función) en comparación con el producto génico de tipo salvaje. Genes Hbb aberrantes ilustrativos se describen en esta memoria y en Kazazian y Boehm (1988) Blood vol 71 N° 4: 1107.

"Expresión génica" se refiere a la conversión de la información contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (p. ej., ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por traducción de un ARNm. Productos génicos también incluyen ARN que se modifican mediante procesos tales como recubrimiento, poliadenilación, metilación y edición, y las proteínas modificadas, por ejemplo, por metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ribosilación de ADP, miristilación y glicosilación.

“Modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a activación de genes y represión de genes. La edición del genoma (p. ej., escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) puede utilizarse para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica en comparación con una célula que no incluye una ZFP o TALEN tal como se describe en esta memoria. Por lo tanto, la inactivación génica puede ser parcial o completa.

Una "región de interés" es cualquier región de la cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro de o adyacente a un gen, en la que es deseable unir una molécula exógena. La unión puede ser para fines de la escisión de ADN fijada como objetivo y/o recombinación fijada como objetivo. Una región de interés puede estar presente en un cromosoma, un episoma, un genoma de la organela (p. ej., mitocondrial, cloroplasto) o un genoma viral infectante, por ejemplo. Una región de interés puede estar dentro de la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas, tales como, por ejemplo, secuencias conductoras, secuencias remolque o intrones, o dentro de regiones no transcritas, ya sea aguas arriba o aguas abajo de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un solo par de nucleótidos o hasta 2.000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor entero de pares de nucleótidos.

Células "eucariotas" incluyen, pero no se limitan a células de hongos (tales como levaduras), células vegetales, células animales, células de mamíferos y células humanas (p. ej., células T).

"Glóbulos rojos " (RBC), o eritrocitos, son células derivadas de células madre hematopoyéticas diferenciadas terminalmente. Carecen de una nucleasa y la mayoría de las organelas celulares. Los RBC contienen hemoglobina para transportar oxígeno desde los pulmones a los tejidos periféricos. De hecho, el 33% de un RBC individual es hemoglobina. También transportan el CO2 producido por las células durante el metabolismo fuera de los tejidos y de vuelta a los pulmones para liberarlo durante la exhalación. Los RBC se producen en la médula ósea en respuesta a la hipoxia sanguínea que está mediada por la liberación de eritropoyetina (EPO) por el riñón. La EPO provoca un aumento en el número de proeritroblastos y acorta el tiempo requerido para la maduración completa de los RBC. Después de aproximadamente 120 días, dado que los RBC no contienen un núcleo ni cualquier otra capacidad regenerativa, las células son separadas de la circulación por las actividades fagocíticas de los macrófagos en el hígado, el bazo y los ganglios linfáticos (~ 90%) o por hemólisis en el plasma (~ 10%). Después de la inmersión de los macrófagos, los componentes químicos de los RBC se descomponen en las vacuolas de los macrófagos debido a la acción de las enzimas lisosómicas.

"Tejidos secretores" son aquellos tejidos en un animal que secretan productos fuera de la célula individual en un lumen de algún tipo que se derivan típicamente del epitelio. Ejemplos de tejidos secretores que se localizan en el tracto gastrointestinal incluyen las células que recubren el intestino, el páncreas y la vesícula biliar. Otros tejidos secretores incluyen el hígado, tejidos asociados con los ojos y las membranas mucosas, tales como las glándulas salivales, las glándulas mamarias, la próstata, la glándula pituitaria y otros miembros del sistema endocrino. Adicionalmente, los tejidos secretores incluyen células individuales de un tipo de tejido que son capaces de secretar.

Las expresiones "enlace operativo" y "enlazado operativamente" (o "unido operativamente") se utilizan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en que los componentes están dispuestos de tal manera que ambos componentes funcionan normalmente y permitirán la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar en una función que se ejerce sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora de la transcripción, tal como un promotor, está enlazada operativamente a una secuencia codificante si la secuencia reguladora de la transcripción controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores de la transcripción. Una secuencia reguladora de la transcripción está generalmente enlazada operativamente en cis con una secuencia codificante, pero no necesita estar directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora de la transcripción que está enlazada operativamente a una secuencia codificante, aunque no sean contiguas.

Con respecto a los polipéptidos de fusión, la expresión "enlazado operativamente" puede referirse al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función en vinculación con el otro componente como lo haría si no estuviera así vinculado. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas se fusiona a un dominio de activación, el dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas y el dominio de activación están en enlace operativo si, en el polipéptido de fusión, la porción de dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de activación es capaz de regular al alza la expresión génica. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de ZFP o TALE se fusiona con un dominio de escisión, el dominio de unión a ADN de ZFP o TALE y el dominio de escisión están en enlace operativo si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión al ADN de ZFP o TALE es capaz de unir su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión es capaz de escindir el ADN en la vecindad del sitio diana.

Un "fragmento funcional" de una proteína, un polipéptido o un ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, el polipéptido o el ácido nucleico de longitud completa, pero conserva la misma función que la proteína, el polipéptido o el ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos o el mismo número de residuos que la molécula nativa correspondiente, y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o nucleótidos. Métodos para determinar la función de un ácido nucleico (p. ej., la función codificante, la capacidad de hibridarse a otro ácido nucleico) son bien conocidos en la técnica. De manera similar, métodos para determinar la función de la proteína son bien conocidos. Por ejemplo, la función de unión al ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, mediante la unión del filtro, el cambio de movilidad electroforética o los ensayos de inmunoprecipitación. La escisión del ADN se puede analizar mediante electroforesis en gel. Véase Ausubel etal., supra. La capacidad de una proteína de interactuar con otra proteína puede determinarse, por ejemplo, mediante co-inmunoprecipitación, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genética como bioquímica. Véase, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; patente de EE.UU. N° 5.585.245 y documento PCT WO 98/44350.

Un "vector" es capaz de transferir secuencias génicas a células diana. Típicamente, "construcción de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia de genes" significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias génicas a células diana. Por lo tanto, la expresión incluye vehículos de clonación y expresión, así como vectores integradores.

Un "gen informador" o "secuencia informadora" se refieren a cualquier secuencia que produce un producto de proteína que se mide fácilmente, de preferencia aunque no necesariamente en un ensayo de rutina. Genes informadores adecuados incluyen, pero no se limitan a secuencias que codifican proteínas que median en la resistencia a antibióticos (p. ej., resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (p. ej., proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde potenciada, proteína fluorescente roja, luciferasa), y proteínas que median en el crecimiento celular potenciado y/o en la amplificación de genes (p. ej., dihidrofolato reductasa). Etiquetas de epítopos incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable. "Etiquetas de expresión" incluyen secuencias que codifican informadores que pueden estar operativamente enlazados a una secuencia génica deseada con el fin de controlar la expresión del gen de interés.

Los términos "sujeto" y "paciente" se utilizan indistintamente y se refieren a mamíferos tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como animales experimentales, tales como conejos, perros, gatos, ratas, ratones y otros animales. Por consiguiente, el término "sujeto" o "paciente", tal como se utiliza en esta memoria, significa cualquier paciente o sujeto mamífero al que se pueden administrar RBC (o células madre) alterados de la invención. Sujetos de la presente invención incluyen aquellos que han sido expuestos a una o más toxinas químicas, incluyendo, por ejemplo, una toxina nerviosa.

Nucleasas

En esta memoria se describen composiciones, particularmente nucleasas, que son útiles para fijar como objetivo un gen para su uso con hemoglobinopatías. La nucleasa puede producirse de forma natural o no natural (es decir, manipulada en el dominio de unión a ADN y/o el dominio de escisión de ADN). Se puede utilizar cualquier dominio de unión a ADN en las nucleasas descritas en esta memoria. Por ejemplo, el dominio de unión a ADN de una nucleasa que se produce de forma natural puede alterarse para unirse a un sitio diana seleccionado (p. ej., una meganucleasa que ha sido manipulada para unirse a un sitio diferente al sitio de unión relacionado). En otros aspectos, la nucleasa comprende dominios heterólogos de unión a ADN y escisión de ADN (p. ej., nucleasas de dedos de zinc; nucleasas efectoras de TAL; dominios de unión a ADN de meganucleasa con dominios de escisión heterólogos), o una nucleasa genérico guiada por un ARN guía específico (p. ej., un CRPISR/Cas).

A. Dominios de unión a ADN

En determinados aspectos, la nucleasa es una meganucleasa (endonucleasa de asentamiento). Meganucleasas que se producen de forma natural reconocen los sitios de escisión de 15-40 pares de bases y se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de cajas His-Cyst y la familia HNH. Endonucleasas de asentamiento ilustrativas incluyen I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I CreI, I-Tev\, I-TevII e I-TevIII. Sus secuencias de reconocimiento son conocidas. Véase también la Patente de EE.UU. N25.420.032; Patente de EE.UU. N26.833.252; Belfort et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs.

En determinados aspectos, la nucleasa comprende una endonucleasa de asentamiento (meganucleasa) (que se produce de forma no natural). Las secuencias de reconocimiento de endonucleasas de asentamiento y meganucleasas, tales como I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceN, I-PpoI, I-SceNI, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII. Véase también la Patente de EE.UU. N° 5.420.032; Patente de EE.UU. N° 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs. Además, la especificidad de unión al ADN de endonucleasas y meganucleasas de asentamiento puede manipularse para unirse a sitios diana no naturales. Véase, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicación de Patente de EE.UU. N° 20070117128. Los dominios de unión al ADN de las endonucleasas y las meganucleasas de asentamiento pueden alterarse en el contexto de la nucleasa como un todo (es decir, de manera que la nucleasa incluye el dominio de escisión relacionado) o pueden fusionarse a un dominio de escisión heterólogo.

En otros aspectos, el dominio de unión a ADN comprende un dominio de unión a ADN efector de TAL que se produce de forma natural o manipulado (que no se produce de forma natural). Véase, p. ej., la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20110301073. Se sabe que las bacterias fitopatógenas del género Xanthomonas provocan muchas enfermedades en plantas de cultivo importantes. La patogenicidad de Xanthomonas depende de un sistema conservado de secreción de tipo III (T3S) que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula vegetal. Entre estas proteínas inyectadas se encuentran efectores de tipo activadores de la transcripción (TALE) que imitan a los activadores transcripcionales de la planta y manipulan el transcriptoma de la planta (véase Kay et al (2007) Science 318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión a ADN y un dominio de activación transcripcional. Uno de los TALE mejor caracterizados es AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (véase Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218:127-136 y el documento WO2010079430). Los TALE contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, conteniendo cada una de las repeticiones aproximadamente 34 aminoácidos, que son clave para la especificidad de unión al ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación transcripcional de carácter ácido (para una revisión, véase Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3):256-272). Además, en la bacteria fitopatógena Ralstonia solanacearum se han encontrado dos genes, designados brg11 y hpx17, que son homólogos a la familia AvrBs3 de Xanthomonas en la cepa R. solanacearum biovar 1 GMI1000 y en la cepa biovar 4 RS1000 (Véase Heuer et al (2007) Appl and Envir Micro 73(13):4379-4384). Estos genes son 98,9% idénticos en la secuencia de nucleótidos entre sí, pero difieren por una deleción de 1.575 pares de bases en el dominio repetido de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos del 40% de identidad de secuencia con las proteínas de la familia AvrBs3 de Xanthomonas.

Por lo tanto, en algunos aspectos, el dominio de unión a ADN que se une a un sitio diana en un locus diana (p. ej., globina o puerto seguro) es un dominio manipulado de un efector TAL similar a los derivados de los patógenos vegetales Xanthomonas (Véase Boch et al, (2009) Science 326:1509-1512 y Moscou y Bogdanove, (2009) Science 326:1501) y Ralstonia (véase Heuer et al (2007) Applied and Environmental Microbiology 73(13): 4379-4384); Patentes de EE.UU. N28.420.782 y 8.440.431 y Publicación de Patente de EE.UU. N220110301073.

En determinados aspectos, el dominio de unión a ADN comprende una proteína con dedos de zinc (p. ej., una proteína con dedos de zinc que se une a un sitio diana en un gen globina o seguro). Preferiblemente, la proteína con dedos de zinc no se produce de forma natural, ya que está manipulada para unirse al sitio diana de elección. Véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Patentes de EE.UU. N26.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y las Publicaciones de Patente de EE.UU. N22005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

Un dominio de unión a dedos de zinc o TALE manipulado puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con una proteína con dedos de zinc que se produce de forma natural. Métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a diseño racional y diversos tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos de triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos de dedos de zinc individuales, en las que cada una de las secuencias de nucleótido triplete o cuadruplete se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de zinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. de propiedad conjunta 6.453.242 y 6.534.261.

Métodos de selección ilustrativos, incluyendo presentación en fagos y sistemas de dos híbridos, se describen en las Patentes de EE.UU. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como en los documentos WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, la mejora de la especificidad de unión para dominios de unión de dedos de zinc se ha descrito, por ejemplo, en el documento WO 02/077227 de propiedad conjunta.

Además, tal como se describe en estas y otras referencias, dominios de ADN (p. ej., proteínas con dedos de zinc multidedos o dominios TALE) pueden enlazarse entre sí utilizando cualquier secuencia de enlazador adecuada, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse, también, las Patentes de EE.UU. N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias de enlazadores ilustrativas de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas de unión al ADN descritas en esta memoria pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína. Además, la mejora de la especificidad de unión para dominios de unión de dedos de zinc se ha descrito, por ejemplo, en el documento WO 02/077227 de propiedad conjunta.

La selección de sitios diana; dominios de unión a ADN y métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y los polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en detalle en las Patentes de EE.UU. N2 8.586.526; 7.888.121; 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759.

Además, tal como se describe en estas y otras referencias, los dominios de unión a ADN (p. ej., proteínas con dedos de zinc multi-dedos) pueden enlazarse entre sí utilizando cualesquiera secuencias de enlazadores adecuadas, incluyendo, por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse, también, las Patentes de EE.UU. N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias de enlazadores ilustrativas de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en esta memoria pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dedos de zinc individuales de la proteína.

En determinados aspectos, la nucleasa comprende un sistema CRISPR/Cas. El locus CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente espaciadas), que codifica los componentes de ARN del sistema, y el locus cas (asociado a CRISPR), que codifica las proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60) constituyen las secuencias de genes del sistema de nucleasa CRISPR/Cas. Loci CRISPR en huéspedes microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión de ácidos nucleicos mediada por CRISPR.

CRISPR de tipo II es uno de los sistemas más bien caracterizados y lleva a cabo la rotura de la doble cadena de ADN fijada como objetivo en cuatro etapas secuenciales. Primero, dos a Rn no codificantes, la matriz pre-ARNcr y ARNtracr, se transcriben del locus CRISPR. En segundo lugar, el ARNtracr se hibrida con las regiones repetidas del pre-ARNcr y media en el procesamiento del pre-ARNcr en ARNcr maduros que contienen secuencias de espaciador individuales. En tercer lugar, el complejo maduro ARNcr: ARNtracr dirige Cas9 al ADN diana a través del apareamiento de bases de Watson-Crick entre el espaciador en el ARNcr y el proto-espaciador en el ADN diana junto al motivo adyacente al proto-espaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento de la diana. Finalmente, Cas9 media en la escisión del ADN diana para crear una ruptura de la doble cadena dentro del proto-espaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas comprende tres etapas: (i) inserción de secuencias de ADN extraño en la matriz CRISPR para prevenir futuros ataques, en un proceso denominado 'adaptación', (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido de (iii) interferencia mediada por ARN con el ácido nucleico extraño. Por lo tanto, en la célula bacteriana, varias de las denominadas proteínas 'Cas' están implicadas con la función natural del sistema CRISPR/Cas y cumplen papeles en funciones tales como la inserción del ADN extraño, etc.

En determinados aspectos, la proteína Cas puede ser un "derivado funcional" de una proteína Cas que se produce de forma natural. Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. "Derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, siempre que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Una actividad biológica contemplada en esta memoria es la capacidad del derivado funcional de hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término "derivado" abarca variantes de secuencia de aminoácidos del polipéptido, modificaciones covalentes y fusiones de los mismos. Derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero no se limitan a mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de la proteína Cas o un fragmento del mismo. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como los derivados de la proteína Cas o un fragmento de la misma, pueden obtenerse de una célula o pueden sintetizarse químicamente o mediante una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce de forma natural proteína Cas, o una célula que produce de forma natural proteína Cas y está genéticamente manipulada para producir la proteína Cas endógena a un nivel de expresión más alto o para producir una proteína Cas a partir de un ácido nucleico introducido de forma exógena, ácido nucleico que codifica una Cas que es la misma o diferente de la Cas endógena. En algunos casos, la célula no produce de forma natural proteína Cas y está genéticamente manipulada para producir una proteína Cas.

Sistemas ilustrativos de nucleasa CRISPR/Cas fijados como objetivo a la protección segura y otros genes se describen, por ejemplo, en la Solicitud de EE.UU. N° 14/278.903.

En algunos aspectos, el dominio de unión a ADN es parte de un sistema TtAgo (véase Swarts et a l , ibid; Sheng et al, ibid). En eucariotas, el silenciamiento génico está mediado por la familia de proteínas Argonautas (Ago). En este paradigma, Ago está unida a ARN pequeños (19-31 nt). Este complejo de silenciamiento de proteína-ARN reconoce ARN diana a través del apareamiento de bases de Watson-Crick entre el ARN pequeño y la diana y escinde por endonucleosis el ARN diana (Vogel (2014) Science 344:972-973). En contraste, las proteínas Ago procarióticas se unen a pequeños fragmentos de ADN de cadena sencilla y probablemente funcionen para detectar y separar ADN extraño (a menudo viral) (Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51,594; Swarts et al., Ibid.). Proteínas Ago procariotas ilustrativas incluyen las de Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides y Thermus thermophilus.

Una de las proteínas Ago procariotas más bien caracterizadas es la de T. thermophilus (TtAgo; Swarts et al ibid.). TtAgo se asocia con fragmentos de ADN de cadena sencilla de 15 nt o 13-25 nt con grupos fosfato 5'. Este "ADN guía" unido por TtAgo sirve para dirigir el complejo proteína-ADN para que se una a una secuencia de ADN complementaria de Watson-Crick en una molécula de ADN de un tercero. Una vez que la información de la secuencia en estos ADN guía ha permitido la identificación del ADN diana, el complejo de TtAgo-ADN guía escinde el ADN diana. Un mecanismo de este tipo también está respaldado por la estructura del complejo de TtAgo-ADN guía mientras está unido a su ADN diana (G. Sheng et al., Ibid). Ago de Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) tiene propiedades similares (Olivnikov et al. Ibid).

ADN guía exógenos de la secuencia de ADN arbitraria pueden ser cargados en la proteína TtAgo (Swarts et al. Ibid.). Dado que la especificidad de la escisión de TtAgo está dirigida por el ADN guía, un complejo TtAgo-ADN formado con un ADN guía exógeno, especificado por el investigador dirigirá, por lo tanto, la escisión del ADN diana de TtAgo a un ADN diana complementario especificado por el investigador. De esta manera, se puede crear una ruptura de la doble cadena fijada como objetivo en el ADN. El uso del sistema de TtAgo-ADN guía (o sistemas de Ago-ADN guía ortólogos de otros organismos) permite la escisión fijada como objetivo del ADN genómico dentro de las células. Una escisión de este tipo puede ser de cadena sencilla o de doble cadena. Para la escisión de ADN genómico de mamífero, sería preferible utilizar una versión del codón TtAgo optimizada para la expresión en células de mamífero. Además, podría ser preferible tratar las células con un complejo TtAgo-ADN formado in vitro, en que la proteína TtAgo se fusiona a un péptido que penetra en las células. Además, podría ser preferible utilizar una versión de la proteína TtAgo que ha sido alterada por mutagénesis para tener una actividad mejorada a 37 grados centígrados. La escisión de ADN mediada por ARN de Ago podría utilizarse para afectar a una panopolía de resultados que incluyen la inactivación de genes, la adición de genes fijados como objetivo, la corrección de genes, la deleción de genes fijados como objetivo utilizando técnicas estándares en la técnica para la explotación de roturas de ADN.

Por lo tanto, la nucleasa puede comprender cualquier dominio de unión a ADN que se una específicamente a un sitio diana en cualquier gen.

B. Dominios de escisión

Cualquier dominio de escisión adecuado puede ser enlazado operativamente a cualquier dominio de unión a ADN (p. ej., ZFP, TALE, ARN guía, etc.) para formar una nucleasa o sistema de nucleasa. Por ejemplo, ZFP, TALE, meganucleasa, ARN y otros dominios de unión a ADN se han fusionado con dominios de nucleasa para crear nucleasas - una entidad funcional que es capaz de reconocer su diana de ácido nucleico pretendida a través de su dominio de unión de ADN manipulado y hacer que el ADN se corte en o cerca del sitio de unión a través de la actividad de nucleasa. Nucleasas manipuladas incluyen nucleasas con dedos de zinc ("ZFN"), TALEN, sistemas de nucleasa CRISPR/Cas y endonucleasas de asentamiento que están diseñadas para unirse específicamente a sitios de ADN diana tienen la capacidad de regular la expresión génica de genes endógenos y son útiles en la manipulación del genoma y terapia génica, incluyendo la inactivación de receptores del VIH, tales como CCR5 y CXCR4. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. N2 8.586.526; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.067.317; 7.262.054; 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; Publicaciones de Patente de EE.UU.

20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060063231; 20080159996; 201000218264; 20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960 y la Solicitud de EE.UU. N2 14/278.903, cuyas divulgaciones son

Tal como se señaló anteriormente, el dominio de escisión puede ser heterólogo al dominio de unión a ADN, por ejemplo un dominio de unión a ADN de dedos de zinc y un dominio de escisión de una nucleasa o un dominio de unión a ADN de TALEN y un dominio de escisión, o dominio de unión a ADN de meganucleasa y dominio de escisión de una nucleasa diferente. Los dominios de escisión heterólogos se pueden obtener de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Ejemplos de endonucleasas de las que se puede derivar un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y endonucleasas de asentamiento. Véase, por ejemplo, Catálogo 2002-2003, New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Se conocen enzimas adicionales que escinden el ADN (p. ej., Nucleasa S1; nucleasa de habas mungo; DNasa I pancreática; nucleasa micrococócica; endonucleasa HO de levadura; véase también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) pueden utilizarse como fuente de dominios de escisión y semi-dominios de escisión.

De manera similar, un semi-dominio de escisión puede derivarse de cualquier nucleasa o porción de la misma, tal como se establece arriba, que requiere dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden semi-dominios de escisión. Alternativamente, se puede utilizar una única proteína que comprende dos semi-dominios de escisión. Los dos semidominios de escisión pueden derivarse de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada uno de los semi-dominios de escisión puede derivarse de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión están dispuestos preferiblemente uno con respecto a otro, de modo que la unión de las dos proteínas de fusión a sus respectivos sitios diana coloca los semi-dominios de escisión en una orientación espacial entre sí que permite que los semi-dominios de escisión formen un dominio de escisión funcional, p. e j, dimerizando. Por lo tanto, en determinados casos, los bordes cercanos a los sitios diana están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede interponerse entre dos sitios diana (p. ej., de 2 a 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios diana.

Endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unirse a ADN de forma específica para la secuencia (en un sitio de reconocimiento) y escindir el ADN en o cerca del sitio de unión. Determinadas enzimas de restricción (p. ej., Tipo IIS) escinden el ADN en sitios retirados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y escisión separables. Por ejemplo, la enzima Fok I tipo IIS cataliza la escisión de ADN de doble cadena, a 9 nucleótidos desde su sitio de reconocimiento en una cadena y 13 nucleótidos desde su sitio de reconocimiento en la otra. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279 ; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem.

269:31.978-31.982. Por lo tanto, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o semi-dominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión con dedos de zinc, que pueden o no estar manipulados.

Una enzima de restricción de tipo IIS ilustrativa, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es Fok I. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10.570-10.575. Por consiguiente, para los fines de la presente divulgación, la porción de la enzima Fok I utilizada en las proteínas de fusión descritas se considera un semi-dominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión de la doble cadena fijada como objetivo y/o el reemplazo fijado como objetivo de secuencias celulares utilizando fusiones de dedos de zinc-Fok I, se pueden utilizar dos proteínas de fusión, comprendiendo cada una de un semi-dominio de escisión Fok I, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se puede utilizar una molécula de polipéptido única que contiene un dominio de unión a ADN y dos semi-dominios de escisión Fok I.

Un dominio de escisión o semi-dominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que conserva la actividad de escisión, o que conserva la capacidad de multimerizar (p. ej., dimerizan) para formar un dominio de escisión funcional.

Enzimas de restricción de tipo IIS ilustrativas se describen en la Publicación Internacional WO 07/014275. Enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y escisión separables, y estos se contemplan en la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Fies. 31:418-420.

En determinadas realizaciones, el dominio de escisión comprende uno o más semi-dominios de escisión manipulados (a los que también se alude como mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o evitan la homodimerización tal como se describe, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N° 7.888.121; 7.914.796; 8.034.598 y 8.823.618. Residuos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 y 538 de Fok I son todos dianas para influir en la dimerización de los semi-dominios de escisión Fok I.

Semi-dominios de escisión modificados manipulados ilustrativos de Fok I que forman heterodímeros obligados incluyen un par en el que un primer semi-dominio de escisión incluye mutaciones en los residuos de aminoácidos en las posiciones 490 y 538 de Fok I y un segundo semi-dominio de escisión incluye mutaciones en los residuos de aminoácidos 486 y 499.

Por lo tanto, en una realización, una mutación en 490 reemplaza Glu (E) por Lys (K); la mutación en 538 reemplaza Iso (I) por Lys (K); la mutación en 486 reemplazó Gln (Q) por Glu (E); y la mutación en la posición 499 reemplaza Iso (I) por Lys (K). Específicamente, los semi-dominios de escisión manipulados descritos en esta memoria se prepararon mutando las posiciones 490 (E ^ K) y 538 (I ^ K) en un semi-dominio de escisión para producir un semi-dominio de escisión manipulado designado "E490K:I538K" y por las posiciones mutantes 486 (Q ^ E) y 499 (I ^ L) en otro semidominio de escisión para producir un semi-dominio de escisión diseñado como "Q486E:I499L". Los semi-dominios de escisión manipulados descritos en esta memoria son mutantes heterodímeros obligados en los que la escisión aberrante se minimiza o se elimina. Véase, p. ej., la Patente de EE.UU. N° 7.914.796.

En determinadas realizaciones, el semi-dominio de escisión manipulado comprende mutaciones en las posiciones 486, 499 y 496 (numeradas en relación con Fokl de tipo salvaje), por ejemplo mutaciones que reemplazan el residuo de Gln (Q) de tipo salvaje en la posición 486 por semi-dominios de escisión por un residuo de Glu (E), el residuo de Iso (I) de tipo salvaje en la posición 499 por un residuo de Leu (L) y el residuo de Asn (N) de tipo salvaje en la posición 496 por un residuo de Asp (D) o Glu (E) (a los que también se alude como dominios "ELD" y "ELE", respectivamente). En otras realizaciones, el semi-dominio de escisión manipulado comprende mutaciones en las posiciones 490, 538 y 537 (numeradas con relación a FokI de tipo salvaje), por ejemplo, mutaciones que reemplazan el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 por un residuo de Lys (K ), el residuo de Iso (I) de tipo salvaje en la posición 538 por un residuo de Lys (K) y el residuo de His (H) de tipo salvaje en la posición 537 por un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (a los que también se alude como dominios "KKK" y "KKR", respectivamente). En otras realizaciones, el semi-dominio de escisión manipulado comprende mutaciones en las posiciones 490 y 537 (numeradas con relación a FokI de tipo salvaje), por ejemplo mutaciones que reemplazan el residuo de Glu (E) de tipo salvaje en la posición 490 por un residuo Lys (K) y el residuo His (H) de tipo salvaje en la posición 537 por un residuo de Lys (K) o un residuo de Arg (R) (a los que también se alude como dominios "KIK" y "KIR", respectivamente). (Véase la Patente de EE.UU. N° 8.623.618). Los semi-dominios de escisión manipulados descritos en esta memoria se pueden preparar utilizando cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio de semi-dominios de escisión de tipo salvaje (Fok I) tal como se describe en las Patentes de EE.UU. 7.888.121; 7.914.796; 8.034.598 y 8.823.618.

Alternativamente, las nucleasas pueden ensamblarse in vivo en el sitio diana del ácido nucleico utilizando la denominada tecnología de "enzima dividida" (véase, p. ej., la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20090068164). Componentes de este tipo de enzimas divididas se pueden expresar en construcciones de expresión separadas, o se pueden enlazar en un marco de lectura abierto en donde los componentes individuales están separados, por ejemplo, por un péptido 2A auto-escindible o una secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión con dedos de zinc individuales o dominios de un dominio de unión de ácido nucleico de meganucleasa.

Las nucleasas pueden rastrearse en cuanto a la actividad antes de su uso, por ejemplo en un sistema cromosómico basado en levaduras tal como se describe en los documentos WO 2009/042163 y 20090068164. Construcciones de expresión de nucleasa pueden manipularse fácilmente utilizando métodos conocidos en la técnica. Véanse, p. ej., las Publicaciones de Patente de EE.UU. 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y la Publicación Internacional WO 07/014275. La expresión de la nucleasa puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducible, por ejemplo, el promotor de galactoquinasa que se activa (des reprime) en presencia de rafinosa y/o galactosa y se reprime en presencia de glucosa.

Sitios Diana

Como se describió en detalle arriba, los dominios de unión a ADN se pueden manipular para unirse a cualquier secuencia de elección en un locus, por ejemplo, un gen globina o seguro. Un dominio de unión a ADN manipulado puede tener una nueva especificidad de unión, en comparación con un dominio de unión a ADN que se produce de forma natural. Métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a diseño racional y diversos tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, utilizar bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos tripletes (o cuadrupletes) y secuencias de aminoácidos individuales (p. ej., dedos de zinc), en que cada una de las secuencias de nucleótidos tripletes o cuadrupletes se asocia con una o más secuencias de aminoácidos de dominio de unión a ADN que se une a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 6.453.242 y 6.534.261 de propiedad conjunta. También se puede realizar el diseño racional de dominios efectores TAL. Véase, p. ej., la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20110301073.

Métodos de selección ilustrativos aplicables a dominios de unión a ADN, que incluyen la presentación de fagos y sistemas de dos híbridos, se describen en las Patentes de EE.UU. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como los documentos WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237.

Selección de sitios diana; nucleasas y métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen en detalle en las Publicaciones de Solicitud de Patente de EE.UU. N° 20050064474 y 20060188987.

Además, tal como se describe en estas y otras referencias, los dominios de unión a ADN (p. ej., proteínas con dedos de zinc multi-dedos) pueden enlazarse entre sí utilizando cualesquiera secuencias de enlazadores adecuadas, incluyendo por ejemplo, enlazadores de 5 o más aminoácidos. Véanse, p. ej., las Patentes de EE.UU. N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias de enlazadores ilustrativas de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en esta memoria pueden incluir cualquier combinación de enlazadores adecuados entre los dominios individuales de unión a ADN de la proteína. Véase, también, la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20110287512.

Donantes

Tal como se señaló arriba, la inserción de una secuencia exógena (también denominada una "secuencia donante" o "donante" o "transgén"), por ejemplo para la corrección de un gen mutante o para la expresión incrementada de un gen de tipo salvaje. Resultará evidente que la secuencia donante no es típicamente idéntica a la secuencia genómica en donde se coloca. Una secuencia donante puede contener una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología para permitir una HDR eficiente en la ubicación de interés. Adicionalmente, las secuencias donantes pueden comprender una molécula de vector que contiene secuencias que no son homólogas a la región de interés en la cromatina celular. Una molécula donante puede contener varias regiones discontinuas de homología con la cromatina celular. Por ejemplo, para la inserción fijada como objetivo de secuencias que normalmente no están presentes en una región de interés, dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula de ácido nucleico donante y pueden estar flanqueadas por regiones de homología para secuenciar en la región de interés.

En esta memoria se describen métodos de inserción fijada como objetivo de cualquier polinucleótido para su inserción en una ubicación elegida. A los polinucleótidos para inserción también se les puede aludir como polinucleótidos "exógenos", polinucleótidos o moléculas "donantes" o "transgenes". El polinucleótido donante puede ser ADN o ARN, de cadena sencilla y/o de doble cadena y puede introducirse en una célula en forma lineal o circular. Véanse, p. ej., las Publicaciones de Patente de EE.UU: N220100047805, 20110281361, 20110207221 y la Solicitud de EE.UU. N2 13/889.162. La o las secuencias del donante pueden estar contenidas dentro de un ADN MC, que puede introducirse en la célula en forma circular o lineal. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia donante pueden protegerse (p. ej., de la degradación exonucleolítica) por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se añaden uno o más residuos de didesoxinucleótidos al extremo 3' de una molécula lineal y/u oligonucleótidos auto-complementarios se ligan a uno o ambos extremos. Véase, por ejemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Métodos adicionales para proteger polinucleótidos exógenos frente a la degradación incluyen, pero no se limitan a, la adición de grupo o grupos amino terminales y al uso de enlaces internucleotídicos modificados, tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y residuos de O-metil ribosa o desoxirribosa. Si se introduce en forma de doble cadena, el donante puede incluir uno o más sitios diana de nucleasa, por ejemplo, sitios diana de nucleasa que flanquean el transgen a ser integrado en el genoma de la célula. Véase, p. ej., la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20130326645.

Se puede introducir un polinucleótido en una célula como parte de una molécula de vector que tiene secuencias adicionales, tales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican resistencia a antibióticos. Además, los polinucleótidos donantes pueden introducirse como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente tal como un liposoma o poloxámero, o pueden suministrarse mediante virus (p. ej., adenovirus, AAV, virus herpes, retrovirus, lentivirus y lentivirus defectuosos en integrasa (IDLV)). Vectores no virales adecuados incluyen vectores de nanotaxis, incluidos los vectores comercialmente disponibles de InCellArt (Francia).

El donante de doble cadena puede incluir secuencias (p. ej., secuencias codificantes, a las que también se alude como transgenes) mayores que 1 kb de longitud, por ejemplo entre 2 y 200 kb, entre 2 y 10 kb (o cualquier valor intermedio). El donante de doble cadena también incluye al menos un sitio diana de nucleasa, por ejemplo. El donante puede incluir al menos 1 sitio diana, por ejemplo, para uso con un CRISPR/Cas, o 2 sitios diana, por ejemplo para un par de ZFN o TALEN. Típicamente, los sitios diana de nucleasa están fuera de las secuencias transgénicas, por ejemplo, 5' y/o 3' respecto a las secuencias transgénicas, para la escisión del transgen. El sitio o los sitios de escisión de nucleasa pueden ser para cualquier o cualesquiera nucleasas. El o los sitios diana de nucleasa contenidos en el donante de doble cadena pueden ser para la o las mismas nucleasas utilizadas para escindir la diana endógena en el que se integra el donante escindido mediante métodos independientes de la homología.

El donante se inserta generalmente de modo que su expresión es impulsada por el promotor endógeno en el sitio de integración, es decir, el promotor que impulsa la expresión del gen endógeno en el que se inserta el donante (p. ej., globina, AAVS1, etc.). Sin embargo, resultará evidente que el donante puede comprender un promotor y/o potenciador, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible o específico para el tejido.

La molécula donante puede insertarse en un gen endógeno de modo que se exprese todo, parte o nada del gen endógeno. Por ejemplo, un transgen tal como se describe en esta memoria puede insertarse en un locus de globina de manera que algunas o ninguna de las secuencias de globina endógenas se expresen, por ejemplo, como una fusión con el transgen. En otros aspectos, el transgen (p. ej., con o sin secuencias codificantes de globina) se integra en cualquier locus endógeno, por ejemplo, un locus seguro. Véanse, p. ej., las publicaciones de patente de EE.UU.

20080299580;20080159996 y 201000218264.

Cuando secuencias adicionales (p. ej., secuencias de globina, endógenas o parte del transgen) se expresan con el transgen, las secuencias adicionales (p. ej., globina) pueden ser secuencias de longitud completa (tipo salvaje o mutante) o secuencias parciales. Preferiblemente, las secuencias adicionales son funcionales. Ejemplos no limitantes de la función de estas secuencias adicionales de longitud completa o parcial, por ejemplo secuencias que codifican globina, incluyen el aumento de la semivida en suero del polipéptido expresado por el transgen (p. ej., gen terapéutico) y/o actuando como un soporte.

Además, aunque no se requiere para la expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras de la transcripción o la traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aisladores, sitios de entrada al ribosoma interno, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación.

Los transgenes transportados en las secuencias donantes descritas en esta memoria pueden aislarse de plásmidos, células u otras fuentes utilizando técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como PCR. Donantes para su uso pueden incluir diversos tipos de topología, incluyendo los superenrollados circulares, los relajados circulares, los lineales y similares. Alternativamente, pueden sintetizarse químicamente utilizando técnicas de síntesis de oligonucleótidos estándares. Además, los donantes pueden estar metilados o carecen de metilación. Los donantes pueden estar en forma de cromosomas bacterianos o de levadura artificial (BAC o YAC).

Los polinucleótidos donantes de doble cadena descritos en esta memoria pueden incluir una o más bases y/o cadenas principales no naturales. En particular, la inserción de una molécula donante con citosinas metiladas se puede llevar a cabo utilizando los métodos descritos en esta memoria para lograr un estado de inactividad transcripcional en una región de interés.

El polinucleótido (donante) exógeno puede comprender cualquier secuencia de interés (secuencia exógena). Secuencias exógenas ilustrativas incluyen, pero no se limitan a cualquier secuencia codificante de polipéptidos (p. ej., ADNc), secuencias de promotor, secuencias de potenciador, etiquetas de epítopo, genes marcadores, sitios de reconocimiento de enzimas de escisión y diversos tipos de construcciones de expresión. Los genes marcadores incluyen, pero no se limitan a secuencias que codifican proteínas que median en la resistencia a antibióticos (p. ej., resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (p. ej., proteína fluorescente verde, proteína fluorescente verde potenciada, proteína fluorescente roja, luciferasa) y proteínas que median en el crecimiento celular mejorado y/o la amplificación génica (p. ej., dihidrofolato reductasa). Etiquetas de epítopo incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia de aminoácidos detectable.

En un aspecto preferido, la secuencia exógena (transgén) comprende un polinucleótido que codifica cualquier polipéptido, cuya expresión en la célula se desea, que incluye, pero no se limita a anticuerpos, antígenos, enzimas, receptores (superficie celular o nuclear), hormonas, linfoquinas, citoquinas, polipéptidos informadores, factores de crecimiento y fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores. Las secuencias codificantes pueden ser, por ejemplo, ADNc.

En determinados aspectos, las secuencias exógenas pueden comprender un gen marcador (arriba descrito), que permite la selección de células que han sufrido una integración dirigida, y una secuencia enlazada que codifica una funcionalidad adicional. Ejemplos no limitantes de genes marcadores incluyen GFP, marcador o marcadores de selección de fármacos y similares.

Secuencias de genes adicionales que pueden insertarse pueden incluir, por ejemplo, genes de tipo salvaje para reemplazar secuencias mutadas. Por ejemplo, una secuencia del gen beta globina de tipo salvaje puede insertarse en el genoma de una célula madre en la que la copia endógena del gen está mutada. La copia de tipo salvaje puede insertarse en el locus endógeno, o puede fijar alternativamente como objetivo un locus seguro.

La construcción de casetes de expresión de este tipo, siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, utiliza metodologías bien conocidas en la técnica de la biología molecular (véase, por ejemplo, Ausubel o Maniatis). Antes de usar el casete de expresión para generar un animal transgénico, la capacidad de respuesta del casete de expresión al inductor de estrés asociado con elementos de control seleccionados se puede testar introduciendo el casete de expresión en una línea celular adecuada (p. ej., células primarias, células transformadas o líneas celulares inmortalizadas).

Además, aunque no se requiere para la expresión, las secuencias exógenas también pueden ser secuencias reguladoras de la transcripción o la traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aisladores, sitios de entrada al ribosoma interno, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación. Además, los elementos de control de los genes de interés pueden estar operativamente enlazados a genes informadores para crear genes quiméricos (p. ej., casetes de expresión informadores).

También se puede lograr la inserción fijada como objetivo de una secuencia de ácido nucleico no codificante. Secuencias que codifican ARN antisentido, ARNi, ARNhc y microARN (miARN) también pueden utilizarse para inserciones fijadas como objetivo.

El ácido nucleico donante puede comprender secuencias no codificantes que son sitios diana específicos para diseños de nucleasa adicionales. Posteriormente, se pueden expresar nucleasas adicionales en células de modo que la molécula donante original se escinda y modifique mediante la inserción de otra molécula donante de interés. De esta manera, se pueden generar integraciones reiterativas de moléculas donantes que permitan el apilamiento de rasgos en un lugar de interés particular o en un locus seguro.

Suministro

Las nucleasas, los polinucleótidos que codifican estas nucleasas, los polinucleótidos donantes y las composiciones que comprenden las proteínas y/o los polinucleótidos descritos en esta memoria pueden suministrarse in vivo o ex vivo por cualquier medio adecuado.

Métodos de suministrar nucleasas tal como se describen en esta memoria se describen, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N26.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.

Construcciones de nucleasas y/o donantes tal como se describen en esta memoria también pueden suministrarse utilizando vectores que contienen secuencias que codifican uno o más de las proteínas con dedos de zinc o TALEN. Se puede utilizar cualquier sistema de vectores que incluye, pero no se limita a vectores plasmídicos, vectores retrovirales, vectores lentivirales, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores del virus herpes y vectores de virus adeno-asociados, etc. Véase, también, las Patentes de Ee .UU. N° 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824. Además, resultará evidente que cualquiera de estos vectores puede comprender una o más de las secuencias necesarias para el tratamiento. Por lo tanto, cuando una o más nucleasas y una construcción donante se introducen en la célula, las nucleasas y/o el polinucleótido donante pueden transportarse en el mismo vector o en diferentes vectores. Cuando se utilizan múltiples vectores, cada uno de los vectores puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples nucleasas y/o construcciones donantes.

Métodos de transferencia génica virales y no virales convencionales pueden utilizarse para introducir ácidos nucleicos que codifican nucleasas y construcciones donantes en células (p. ej., células de mamíferos) y tejidos diana. Los sistemas de suministro de vectores no virales incluyen plásmidos de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de suministro, tal como un liposoma o un poloxámero. Los sistemas de suministro de vectores virales incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episomales o integrados después del suministro a la célula. Para una revisión de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51 (1 ):31 -44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Bohm (eds.) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Métodos de suministro no viral de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, policatión o conjugados de lípidos:ácidos nucleicos, ADN desnudo, viriones artificiales y captación de ADN potenciada por el agente. La sonoporación utilizando, p. ej., el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) también se puede utilizar para la suministro de ácidos nucleicos.

Sistemas de suministro de ácidos nucleicos adicionales ilustrativos incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Colonia, Alemania), MaxCyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc., (véase, por ejemplo, el documento US6008336). La lipofección se describe, p. ej., en las Patentes de EE.UU. N° 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355, y reactivos de lipofección se venden comercialmente (p. ej., Transfectam™ y Lipofectin™). Lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente de reconocimiento de receptor de polinucleótidos incluyen los de Felgner, documentos WO 91/17424, WO 91/16024.

La preparación de complejos de lípidos:ácidos nucleicos, incluyendo liposomas fijados como objetivo, tales como complejos de inmunolípidos, es bien conocida para un experto en la técnica (véase, p. ej., Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cáncer Res. 52:4817-4820 (1992); Patentes de EE.UU. N° 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871,4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).

Métodos de suministro adicionales incluyen el uso de empaquetar los ácidos nucleicos a ser suministrados en vehículos de suministro (EDV) EnGeneIC. Estos EDV se suministran específicamente a los tejidos diana utilizando anticuerpos biespecíficos en donde un brazo del anticuerpo tiene especificidad para el tejido diana y el otro tiene especificidad para el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula diana y luego el EDV es llevado a la célula por endocitosis. Una vez en la célula, se liberan los contenidos (véase MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27 (7):643).

El uso de sistemas virales de ARN o ADN para el suministro de ácidos nucleicos que codifican ZFPs manipuladas se aprovechan de los procesos altamente evolucionados para fijar como objetivo un virus a células específicas en el cuerpo y el tráfico de la carga útil viral al núcleo. Los vectores virales pueden administrarse directamente a los sujetos (in vivo) o pueden utilizarse para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a los sujetos (ex vivo). Sistemas convencionales virales para el suministro de ZFP incluyen, pero no se limitan a vectores retrovirales, lentivirus, adenovirales, adeno-asociados, vaccinia y herpes simplex para la transferencia génica. La integración en el genoma del huésped es posible con los métodos de transferencia génica de retrovirus, lentivirus y virus adenoasociados, lo que a menudo resulta en la expresión a largo plazo del transgen insertado. Adicionalmente, se han observado altas eficiencias de transducción en muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.

El tropismo de un retrovirus puede alterarse incorporando proteínas con envoltura extrañas, expandiendo la población diana potencial de células diana. Los vectores lentivirales son vectores retrovirales que son capaces de transducir o infectar células que no se dividen y que típicamente producen altos títulos virales. La selección de un sistema de transferencia génica retroviral depende del tejido diana. Los vectores retrovirales están compuestos por repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de empaquetamiento de hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas que actúan en cis son suficientes para la replicación y el empaquetamiento de los vectores, que luego se utilizan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar una expresión transgénica permanente. Vectores retrovirales ampliamente utilizados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), el virus de inmunodeficiencia en simios (SIV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y sus combinaciones (véase, p. ej., Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et a l, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et a l, J. Virol. 65:2220-2224 (1991); documento PCT/US94/05700).

En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, se pueden utilizar sistemas adenovirales. Los vectores adenovirales son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con vectores de este tipo se han obtenido un alto título y altos niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. Los vectores de virus adeno-asociados ("AAV") también se utilizan para transducir células con ácidos nucleicos diana, p. ej., en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para procedimientos de terapia génica in vivo y ex vivo (véase, p. ej., West et al., Virology 160:38-47 (1987); Patente de EE.UU. N° 4.797.368; documento WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores de AAV recombinantes se describe en un cierto número de publicaciones, incluyendo la Pat. de EE.UU. N° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol.

5:3251-3260 (1985); Tratschin, et a l., Mol. Cell. Biol.4:2072-2081 (1984); Hermonat y Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984) y Samulski et a l, J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

Actualmente, al menos seis enfoques de vectores virales están disponibles para la transferencia de genes en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos por genes insertados en líneas celulares auxiliares para generar el agente transductor.

pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovirales que se han utilizado en ensayos clínicos (Dunbar et a l, Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et a l, Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et a l, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico utilizado en un ensayo de terapia génica. (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción de 50% o mayores para los vectores empaquetados de MFG-S. (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther.

1:111-2 (1997).

Vectores de virus adeno-asociados recombinantes (rAAV) son prometedores sistemas de suministro de genes alternativos basados en el virus tipo 2 adeno-asociado defectuoso y no patógeno de parvovirus. Todos los vectores se derivan de un plásmido que conserva solo las repeticiones terminales invertidas del par de bases 145 de AAV que flanquean el casete de expresión transgénica. La transferencia eficiente de genes y el suministro estable de transgenes debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave para este sistema de vectores. (Wagner et al., Lancet351:91171702-3 (1998), Kearns etal., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). Otros serotipos de AAV, incluidos AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 y AAVrh10, y todas sus variantes, también pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención.

Vectores adenovirales (Ad) recombinantes deficientes en la replicación pueden producirse en un título alto e infectar fácilmente un cierto número de tipos de células diferentes. La mayoría de los vectores de adenovirus están manipulados de tal manera que un transgén reemplaza a los genes Ad E1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector defectuoso en la replicación se propaga en células 293 humanas que suministran la función del gen eliminado en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, incluidas las células diferenciadas y no divisorias, tales como las que se encuentran en el hígado, los riñones y los músculos. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad de carga. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicaba la terapia con polinucleótidos para la inmunización anti-tumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther.

7:1083-9 (1998)). Ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia de genes en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:71083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et a l, Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

Células de empaquetamiento se utilizan para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula huésped. Células de este tipo incluyen células 293, que empaquetan adenovirus, y células ^2 o células PA317, que empaquetan retrovirus. Los vectores virales utilizados en la terapia génica son generados habitualmente por una línea celular productora que empaqueta un vector de ácido nucleico en una partícula viral. Los vectores contienen típicamente las secuencias virales mínimas requeridas para el empaquetamiento y la posterior integración en un huésped (si es aplicable), siendo reemplazadas otras secuencias virales por un casete de expresión que codifica la proteína a expresar. Las funciones virales que faltan son suministradas en trans por la línea celular de empaquetamiento. Por ejemplo, los vectores de AAV utilizados en terapia génica solo poseen típicamente secuencias de repetición terminal invertida (ITR) del genoma de AAV que se requieren para el empaquetamiento y la integración en el genoma del huésped. El ADN viral está empaquetado en una línea celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes de AAV, a saber, rep y cap, pero que carece de secuencias ITR. La línea celular también está infectada con adenovirus como un auxiliar. El virus auxiliar fomenta la replicación del vector de AAV y la expresión de genes AAV a partir del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no está empaquetado en cantidades significativas debido a la ausencia de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir, p. ej., mediante un tratamiento térmico al que el adenovirus es más sensible que el AAV.

En muchas aplicaciones de terapia génica, es deseable que el vector de terapia génica sea suministrado con un alto grado de especificidad a un tipo de tejido particular. Por consiguiente, un vector viral puede modificarse para tener especificidad para un tipo de célula dado al expresar un ligando como una proteína de fusión con una proteína de cubierta viral en la superficie externa del virus. El ligando se elige para tener afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Han et a l, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995) informó que el virus de la leucemia murina de Moloney puede modificarse para expresar heregulina humana fusionada a gp70, y el virus recombinante infecta determinadas células de cáncer de mama humano que expresan el receptor del factor de crecimiento epidérmico humano. Este principio puede extenderse a otros pares de células diana del virus, en las que la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de la superficie celular. Por ejemplo, el fago filamentoso puede manipularse para mostrar fragmentos de anticuerpos (p. ej., FAB o Fv) que tienen afinidad de unión específica para virtualmente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a los vectores virales, los mismos principios se pueden aplicar a vectores no virales. Estos vectores pueden manipularse para que contengan secuencias de captación específicas que favorecen la captación por parte de células diana específicas.

Vectores de terapia génica pueden administrarse in vivo mediante la administración a un sujeto individual, típicamente por administración sistémica (p. ej., infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica o intracraneal) o aplicación tópica, tal como se describe más adelante. Alternativamente, los vectores pueden suministrarse a las células ex vivo, tales como las células explantadas de un paciente individual (p. ej., linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre hematopoyéticas de donantes universales, seguido de reimplantación de las células en un paciente, habitualmente después de la selección de células que han incorporado el vector.

Vectores (p. ej., retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen nucleasas y/o construcciones donantes también se pueden administrar directamente a un organismo para la transducción de células in vivo. Alternativamente, se puede administrar ADN desnudo. La administración se realiza por cualquiera de las vías que normalmente se utilizan para introducir una molécula en contacto final con células de la sangre o de tejidos, incluyendo, pero no limitadas a inyección, infusión, aplicación tópica y electroporación. Métodos adecuados para administrar ácidos nucleicos de este tipo están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, aunque se puede utilizar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular puede proporcionar a menudo una reacción más inmediata y más efectiva que otra va.'

Vectores adecuados para la introducción de polinucleótidos descritos en esta memoria incluyen vectores de lentivirus no integrantes (IDLV). Véase, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Viro¡.72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol.72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; Publicación de Patente de EE.UU. N° 20090117617.

Vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular utilizado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, tal como se describe a continuación (véase, p. e j, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).

Resultará evidente que las secuencias que codifican la nucleasa y las construcciones donantes pueden administrarse utilizando el mismo sistema o sistemas diferentes. Por ejemplo, un polinucleótido donante puede ser transportado por un plásmido, mientras que la una o más nucleasas pueden ser transportadas por un vector de AAV. Además, los diferentes vectores pueden administrarse por la misma o diferentes vías (inyección intramuscular, inyección en la vena de la cola, otra inyección intravenosa, administración intraperitoneal y/o inyección intramuscular. Los vectores pueden suministrarse simultáneamente o en cualquier orden secuencial.

Por lo tanto, la presente divulgación incluye el tratamiento in vivo o ex vivo de enfermedades y afecciones que son susceptibles de inserción de un transgén que codifica una proteína terapéutica, por ejemplo el tratamiento de hemoglobinopatías vía la integración mediada por nucleasas de un gen que codifica una proteína globina. Las composiciones se administran a un paciente humano en una cantidad efectiva para obtener la concentración deseada del polipéptido terapéutico en el suero o el órgano o células diana. La administración puede ser por cualquier medio en el que los polinucleótidos se suministran a las células diana fijadas como objetivo. Por ejemplo, se contemplan métodos tanto in vivo como ex vivo. La inyección intravenosa en la vena porta es un método de administración preferido. Otros modos de administración in vivo incluyen, por ejemplo, la inyección directa en los lóbulos del hígado o el conducto biliar e inyección intravenosa distal al hígado, incluyendo a través de la arteria hepática, inyección directa en el parénquima hepático, inyección a través de la arteria hepática y/o inyección retrógrada a través del árbol biliar. Modos de administración ex vivo incluyen la transducción in vitro de hepatocitos reseccionados u otras células del hígado, seguido de la infusión de los hepatocitos reseccionados y transducidos nuevamente en la vasculatura portal, el parénquima hepático o el árbol biliar del paciente humano, véase, p. ej., Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.

La cantidad eficaz de nucleasa(s) y donantes a ser administrada variará de un paciente a otro y de acuerdo con el polipéptido terapéutico de interés. Por consiguiente, el médico que administra las composiciones determina mejor las cantidades efectivas y un experto en la técnica puede determinar fácilmente las dosis apropiadas. Después de permitir suficiente tiempo para la integración y la expresión (típicamente 4-15 días, por ejemplo), el análisis del suero u otros niveles de tejido del polipéptido terapéutico y la comparación con el nivel inicial antes de la administración determinarán si la cantidad que se administra es demasiado baja, dentro del intervalo correcto, o demasiado alta. Regímenes adecuados para las administraciones iniciales y posteriores también son variables, pero están tipificados por una administración inicial seguida de administraciones posteriores si es necesario. Las administraciones posteriores se pueden administrar a intervalos variables, que varían desde diaria a anualmente a cada varios años. Un experto en la técnica apreciará que se pueden recomendar técnicas inmunosupresoras apropiadas para evitar la inhibición o el bloqueo de la transducción por inmunosupresión de los vectores de suministro, véase, p. ej., Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther. 6:1391-1401.

Formulaciones para administraciones tanto ex vivo como in vivo incluyen suspensiones en líquidos o emulsionadas. Los ingredientes activos se mezclan a menudo con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores de pH, agentes estabilizadores u otros reactivos que potencian la efectividad de la composición farmacéutica.

Células

También se describen en esta memoria células y/o líneas celulares en las que se modifica una secuencia endógena de beta-hemoglobina humana (Hbb). La modificación puede ser, por ejemplo, en comparación con la secuencia de tipo salvaje de la célula, que puede ser una célula de un sujeto con talasemia. La célula o las líneas celulares pueden ser heterocigotas u homocigotas para la modificación. Las modificaciones pueden comprender inserciones, deleciones y/o combinaciones de las mismas.

El gen Hbb puede ser modificado por una nucleasa (p. e j, ZFN, TALEN, sistema CRISPR/Cas, sistema Ttago, etc.), por ejemplo una nucleasa tal como se describe en esta memoria. En determinados aspectos, la modificación genómica es una secuencia intermedia 1, mutación número 1 (IVS1-1 o IVS.1), mutación IVS1-5, IVS1-6, IVS1-110, IVS2-1, IVS2-745 o IVS2-654, por ejemplo, una modificación que corrige una secuencia mutante IVS.1 como se ve en sujetos con una talasemia tal como la beta-talasemia. La modificación genómica puede estar dentro de una o más de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 3, por ejemplo, que interrumpe un motivo donante de corte y empalme (p. ej., la modificación de un dinucleótido "GT" al principio del intrón 1 del gen beta-globina humano se modifica en un "AT"). La modificación genómica puede corregir una mutación que altera el sitio donante de corte y empalme para el procesamiento de ARNm del gen Hbb y conduce a la beta-talasemia.

La modificación es preferiblemente en o cerca del o de los sitios de unión y/o de escisión de la o las nucleasas, por ejemplo, dentro de 1 -300 (o cualquier valor entremedias) pares de bases aguas arriba o aguas abajo del o de los sitios de escisión, más preferiblemente dentro de 1-100 pares de bases (o cualquier valor entremedias) de cualquier lado del o de los sitios de unión y/o escisión, incluso más preferiblemente dentro de 1 a 50 pares de bases (o cualquier valor entremedias) a cada lado del o de los sitios de unión y/o escisión. En determinados aspectos, la modificación es en o cerca de cualquier secuencia diana mostrada en SEQ ID NO: 3, 4 o 5.

Cualquier célula o línea celular puede modificarse, por ejemplo, una célula madre, por ejemplo una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida, una célula madre hematopoyética, una célula madre neuronal y una célula madre mesenquimatosa. Otros ejemplos no limitantes de células tal como se describe en esta memoria incluyen células T (p. e j, CD4+, CD3+, CD8+, etc.); células dendríticas; células B. También se describe un descendiente de una célula madre, que incluye una célula parcial o totalmente diferenciada (p. ej., una célula de RBC o precursora de RBC). Ejemplos no limitantes de otras líneas celulares que incluyen una secuencia BCL11A modificada incluyen COS, CHO (p. e j, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (p. e j, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), y células perC6, así como células de insecto tales como Spodopterafugiperda (Sf), o células fúngicas, tales como Saccharomyces, Pichia y Schizosaccharomyces.

Las células tal como se describen en esta memoria son útiles para tratar y/o prevenir un trastorno, por ejemplo, por terapias ex vivo. Las células modificadas con nucleasa pueden expandirse y luego reintroducirse en el paciente utilizando técnicas estándares. Véase, p. ej., Tebas et a l(2014) NewEng J Med370(10):901. En el caso de las células madre, después de la infusión en el sujeto, también se produce la diferenciación in vivo de estos precursores en células que expresan el transgén funcional. También se describen en esta memoria composiciones farmacéuticas que comprenden las células tal como se describe en esta memoria. Además, las células pueden crioconservarse antes de la administración a un paciente.

Cualquiera de las células o líneas celulares modificadas descritas en esta memoria puede mostrar una expresión incrementada de un tipo salvaje o insertado. También se describen composiciones, tales como composiciones farmacéuticas que comprenden las células genéticamente modificadas tal como se describe en esta memoria.

Aplicaciones

Los métodos y las composiciones descritos en esta memoria son para modificar la expresión de proteínas, o la corrección de una secuencia de gen aberrante en una enfermedad genética, tal como una talasemia. Por lo tanto, los métodos y las composiciones proporcionan el tratamiento y/o la prevención de enfermedades genéticas de este tipo. La edición del genoma, por ejemplo de células madre, se utiliza para corregir un gen aberrante, insertar un gen de tipo salvaje o cambiar la expresión de un gen endógeno. A modo de ejemplo no limitativo, un gen de tipo salvaje, p. ej., que codifica al menos una globina (p. ej., globina p), puede insertarse en una célula para proporcionar las proteínas globina deficientes y/o carentes en la célula y, con ello, tratar una enfermedad genética, p. ej., una hemoglobinopatía. Alternativamente o además, la edición genómica con o sin administración del donante apropiado, puede corregir el gen endógeno defectuoso, p. ej., corrigiendo la mutación puntual en la hemoglobina p, para restaurar la expresión del gen y/o tratar una enfermedad genética, p. ej., beta-talasemia.

Los siguientes Ejemplos se refieren a realizaciones ilustrativas de la presente divulgación en las que la nucleasa comprende una nucleasa con dedos de zinc (ZFN). Se apreciará que esto es solo para fines de ejemplificación y que se pueden utilizar otras nucleasas, por ejemplo TALEN, endonucleasas de asentamiento (meganucleasas) con dominios de unión a ADN manipulados y/o fusiones de endonucleasas de asentamiento manipuladas y que se producen de forma natural (meganucleasas) y dominios de unión a ADN y dominios de escisión heterólogos (p. ej., Mega-TAL) y/o un sistema CRISPR/Cas que comprende un ARN guía único manipulado.

Ejemplos

Ejemplo 1: Diseño, construcción y caracterización general de las nucleasas de proteína con dedos de zinc (ZFN) Se diseñaron proteínas con dedos de zinc y se incorporaron en plásmidos, vectores de AAV o adenovirales esencialmente como se describe en Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651, Perez et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):808-816, y tal como se describe en la Patente de EE.UU. N° 6.534.261. Para ZFN y TALEN específicos para el locus de globina beta humana, véase, también, la Patente de EE.UU. N° 7.888.121 de propiedad conjunta.

Ejemplo 2: Actividad de ZFN específica para globina beta

Se hicieron pares de ZFN que fijan como objetivo al locus de globina beta humana en o cerca de la mutación IVS1 -1 tal como se describe arriba. Véase, también, la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20140093913. Las secuencias de aminoácidos de las regiones de hélice de reconocimiento de cada uno de los dedos de las ZFN indicadas se muestran a continuación en la Tabla 1 junto con todos los sitios diana (sitios diana de ADN indicados en letras mayúsculas; nucleótidos no contactados indicados en minúsculas). La ubicación del sitio diana también se muestra en la Figura 1. Todas las ZFP se testaron para determinar la especificidad de unión a su secuencia diana.

Tabla 1: Nucleasas con dedos de zinc

El ensayo Cel-I (Surveyor™, Transgenomics) tal como se describe en Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 y Guschin et al. (2010) Methods Mol Biol. 649:247-56) se utilizó para detectar modificaciones inducidas por ZFN del gen diana en K562 o HSC. En este ensayo, la amplificación por PCR del sitio diana fue seguida por la cuantificación de inserciones y/o deleciones ("indeles") utilizando la enzima de detección de emparejamientos erróneos Cel-I (Yang et al. (2000) Biochemistry 39: 3533-3541) que proporcionó una estimación de límite inferior de frecuencia DSB. Tres días después de la transfección del vector de expresión de ZFN en condiciones estándar (37°C) o utilizando un choque hipotérmico (30°C, véase la publicación de patente de EE.UU. Publicación de Patente de EE.UU. N° 20110041195 de propiedad conjunta), se aisló ADN genómico de células K562 utilizando el kit DNeasy (Qiagen).

Los resultados (Figura 2A) del ensayo Cel-I demostraron que las ZFN fueron capaces de inducir la escisión en sus respectivos sitios diana. Además, se testó la actividad de las ZFN utilizando el Ensayo de reasociación de cadena sencilla de luciferasa dual (DLSSA). Este sistema se utilizó para cuantificar la actividad de ZFN en células transfectadas transitoriamente y se basa en el sistema de ensayo Dual-Luciferase Reporter® de Promega. El sistema secuencial mide dos enzimas informadoras individuales, Luciferasas de Luciérnaga y Renilla, dentro de un solo tubo (pocillo). Tanto los informadores Luciferasa de Luciérnaga como Luciferasa de Renilla son re-manipulados y las condiciones del ensayo están optimizadas. La construcción del informador de Luciferasa de Luciérnaga contiene dos copias incompletas de las regiones de codificación de Luciérnaga que están separadas por sitios de unión a ADN para las ZFN. En este estudio, la copia 5' se deriva de aproximadamente dos tercios de la parte N-terminal del gen Luciérnaga y la copia 3' se deriva de aproximadamente dos tercios de la parte C-terminal del gen Luciérnaga. Las dos copias incompletas contienen unos brazos de homología de aproximadamente 600 pb. Los fragmentos separados de Luciérnaga no tienen actividad luciferasa. Una ruptura de la doble cadena de ADN provocada por el par ZFN estimulará la recombinación entre repeticiones flanqueantes por la vía de reasociación de cadena sencilla y luego restablecerá la función Luciferasa de Luciérnaga. El plásmido co-transfectado Luciferasa de Renilla proporciona un control interno. La actividad luminiscente de cada uno de los informadores se lee en un luminómetro. La normalización de la actividad del informador experimental (Luciérnaga) a la actividad del control interno (Renilla) minimiza la variabilidad experimental provocada por las diferencias en la viabilidad celular y/o la eficiencia de la transfección. El valor normalizado se utiliza para determinar la actividad de un par de ZFN o TALEN dado.

Los resultados (Figura 2B) demuestran que el par 43545/43544 es capaz de escindir tanto la secuencia de globina de tipo beta salvaje como la secuencia IVS 1-1 mutante.

Ejemplo 3: Edición del locus de globina beta IVS 1 -1

El par de ZFN 43545/43544 de específico para el gen de la globina beta humana (HBB) se utilizó para introducir un ADN donante en el locus de globina beta como sigue. Se diseñó un oligo donante para la captura en el gen HBB escindido después del tratamiento con ZFN. El oligo contenía un sitio de restricción XbaI tal que después de la inserción del oligo, se introdujo un nuevo sitio de restricción en el intrón del gen HBB (IVS1) justo detrás del sitio de reconocimiento de ZFN que podría visualizarse posteriormente mediante digestión de restricción de un producto de PCR que contiene la región de unión de ZFN (véase la Figura 3).

Los diversos oligos fueron suministrados a las células CD34+ como moléculas de cadena sencilla y se muestran a continuación:

Hbb oliao WT:

5 ^'

AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAG

GCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAAC

TGGGCATGTGGAGACAGA (SEQ ID N O : 19 )

Hbb oliao G A:

5 '

AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAG

GCCCTGGGCAGATTGGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAAC

TGGGCATGTGGAGACAGA (SEQ ID N O :20 )

Hbb oliao WT XbaI:

5 ^'

AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAG

GCCCTGGGCAGGTTGGTATCTAGAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAA

ACTGGGCATGTGGAGACAGA (SEQ ID N O :21 )

Hbb oliao G A XbaI:

5 ^'

AAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCAAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAG

GCCCTGGGCAGATTGGTATCTAGAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAA

ACTGGGCATGTGGAGACAGA (SEQ ID N O : 22 )

Para la transducción de CD34+ se utilizó un dispositivo BTX ECM830 con una cubeta de separación de 2 mm. Los ARNm de las células se prepararon utilizando un kit mMessageMachine T7 Ultra (n° AM1345, Ambion). Se cultivaron células CD34+ humanas en medio x-vivo10 (Lonza) con 1xCC110 (Tecnología de células madre) en placas no tratadas con cultivo de tejidos. Las células se contaron y se recogieron por centrifugación a 1200 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron 1-2 veces con PBS a temperatura ambiente. Se utilizaron 200,000 células para cada una de las transfecciones y se resuspendieron en 100 gL de solución BTexpress. Se añadieron 2-4 pg de ARNm por transfección y la mezcla se transfirió a la cubeta. Inmediatamente después de la transferencia, la mezcla se sometió a electroporación a 250 V durante 5 ms. Los medios precalentados se añadieron a la cubeta y el medio más las células se transfirieron a placas tratadas con cultivo sin tejido de 48 pocillos y luego se incubaron a 37°C. La edición de genes se midió mediante secuenciación de ADN de alto rendimiento de amplicones de PCR del gen HBB. Se analizó el porcentaje de modificación génica por unión final no homóloga ("NHEJ", provocada por la curación de una ruptura de la doble cadena en el ADN después de la escisión inducida por ZFN) o la integración fijada como objetivo del oligo después de la escisión por ZFN ("corrección génica").

Tal como se muestra en la Figura 4, el donante de oligo globina p se insertó en el locus apropiado, como se verifica por la presencia del nuevo sitio de restricción presente en el ADN del donante. Además, se realizó un análisis de la secuencia para verificar el porcentaje de alelos que comprende una integración fijada como objetivo y/o indeles (inserciones y/o deleciones) introducidas por NHEJ propensa a errores después de la escisión de ZFN. Se extrajo el ADN genómico (utilizando el micro kit de ADN Qiagen QlAamp®) y se analizó la actividad de ZFN como sigue. Brevemente, la región que comprende el sitio de escisión se amplificó por PCR mediante métodos estándares, y después de la amplificación, el producto de PCR se secuenció a través de un análisis de secuenciación de alto rendimiento MiSeq de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Illumina®).

Para cuantificar el porcentaje de alelos editados, la región genómica de interés se amplificó por PCR utilizando cebadores que añaden las secuencias del adaptador de secuenciación Illumina® estándar. Se realizó un segundo grupo de 13 rondas de PCR para añadir secuencias de código de barras y adaptador puente a ambos extremos. La secuenciación se realizó en un Illumina® MiSeq de acuerdo con los protocolos del fabricante para la secuenciación de amplicones. El MiSeq genera lecturas de extremos emparejados, que se fusionan y se recortan mediante un software de alineamiento estándar. Las lecturas fueron desmultiplexadas por muestra a través de pares de secuencias de códigos de barras utilizando scripts personalizados. Las secuencias de Amplicon se alinearon globalmente a una secuencia de referencia mediante una implementación del algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, Saul B.; y Wunsch, Christian D. (1970). Jour Mol Bio 48 (3): 443-53). Los huecos o las inserciones en el alineamiento se contaron como % de eventos NHEJ y se compararon con una secuencia de muestra de control no tratada para determinar las tasas de fondo específicas de la secuencia.

Para el cálculo de la integración fijada como objetivo, las secuencias de Amplicon se alinearon globalmente a una secuencia de referencia a través de una implementación biopython del algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman, Saul B.; y Wunsch, Christian D., ibid). Los cambios de secuencia generados a través de tratamientos experimentales se buscaron, contaron y compararon con los recuentos en las muestras de control. Los polimorfismos de característica única (SNP) conocidos pueden enmascararse durante este proceso y excluirse de recuentos adicionales (p. e /, SFP de deleción de 1 pb cerca del sitio diana de ZFN). El porcentaje de unión final no homóloga (% NHEJ) (al que también se alude como indeles) se calculó determinando el porcentaje de secuencias que contienen inserciones y/o deleciones. Las muestras tratadas solo con el vector GFP se utilizaron para evaluar la PCR y la frecuencia de fondo de las inserciones y deleciones basadas en el error de secuenciación. Se observaron frecuencias de fondo de menos del 1%.

Los resultados demuestran que en presencia del donante de oligo y el par ZFN, aproximadamente el 12-14% de las células mostraron un evento de integración. Además, el análisis de la presencia de indeles demostró que cuando estaban presentes ZFN, se detectaron indeles en el 42-70% de los alelos. Véase también la Figura 4.

Para diferenciar las células transgénicas CD34+ en RBC maduros se utilizaron métodos conocidos en la técnica. Agrupaciones de células CD34+ modificadas por ZFN se indujeron a diferenciarse tal como se describe en Giarratana et al. (2011) Blood 118(19):5071-9.

En el día 14 de diferenciación de eritrocitos, se aisló el ARN total y se analizó el corte y empalme del gen de globina beta mediante RT-PCR estándar y análisis de secuencia tal como se describió arriba. Los resultados (véase la Tabla 2) demuestran que la escisión por las ZFN solas es capaz de introducir indeles que interfieren con el corte y empalme adecuado, y este efecto también se ve en presencia del donante de oligo IVS 1-1, en donde se produce un porcentaje de corte y empalme. a través de nuevos sitios de corte empalme crípticos (véase la Figura 5). Sin embargo, cuando se utiliza el donante de oligo WT, el corte y empalme se restaura parcialmente a los niveles observados cuando no se utilizan ZFN. Además, la presencia del sitio XbaI introducido en el donante de oligo no parece afectar el corte y empalme.

Tabla 2: Productos de empalme en eritrocitos tratados

Ejemplo 4: Corrección génica basada en oligo de la mutación IVS1 -1 en células CD34+ de talasemia.

Células CD34+ derivadas de pacientes con talasemia se trataron luego para corregir la mutación IVS 1-1. Este paciente, "p13", es un paciente p°p° con la mutación IVS1-1 en un alelo y una mutación sin sentido (TGG -> TAG) en el otro alelo en el codón 15. Células CD34+ se aislaron y se trataron con las nucleasas y oligos donantes tal como se describe en el Ejemplo 3. Además, se realizó un análisis de secuenciación de alto rendimiento para observar la modificación provocada por las nucleasas y oligos. El ADN genómico se aisló de las muestras y demostró que había una alta tasa de escisión con la enzima de restricción XbaI debido a la integración fijada como objetivo del oligo donante (véase la Figura 6).

El análisis de la secuencia se muestra a continuación en la Tabla 3. El primer conjunto de datos es para las células CD34 WT en donde ambos alelos de globina beta tienen secuencia de tipo salvaje, mientras que el segundo grupo de datos es para las células de pacientes p13 de beta talasemia.

Tabla 3: Resultados después de la corrección génica en células CD34+

Los datos demuestran la actividad de las nucleasas en el sitio IVS1-1 en ambas poblaciones celulares, medido por la actividad de los indeles en las muestras de ZFN solas. En presencia de los donantes que comprenden el sitio XbaI, existe una cantidad notable de detección de RFLP, lo que indica la integración del oligo donante. En las células p13, el uso del oligo donante WT que incluye el sitio XbaI provoca la aparición de XbaI RFLP en ambos alelos. También existe un aumento en la secuencia "G" WT en el sitio IVS1-1 en el alelo IVS1-1 (por ejemplo, con el par de ZFN 43545/43544, se detectó un valor de secuencia WT del 34,6% en comparación con el 10,7% en las células no transfectadas.

Células CD34+ derivadas del paciente que han sido modificadas con ZFN se indujeron a diferenciarse en colonias utilizando el medio de metilcelulosa Methocult de Stemcell Technologies de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La diferenciación se analizó mediante el ensayo de tipos de colonias que surgen de la diferenciación inducida por Methocult: unidades formadoras de colonias, eritroides ("CFU-E"); unidades formadoras de estallido, eritroides ("BFU-E"); unidades formadoras de colonias, granulocitos/macrófagos ("CFU-GM") y unidades formadoras de colonias; granulocitos/eritrocitos/monocitos/macrófagos ("CFU-GEMM"). Las colonias de BFU-E se recogieron y analizaron para determinar el genotipo y el corte y empalme de globina beta utilizando el análisis MiSeq. El 20% de todos los clones tienen la mutación IVS1.1 corregida al tipo salvaje "G", y el corte y empalme de globina beta se restableció a la normalidad. Los datos también confirmaron que la adición del sitio de restricción XbaI en el intrón IVS1 no tiene efecto adverso alguno sobre el corte y empalme de globina beta.

Tomados en conjunto, estos datos demuestran la corrección genética con éxito de una mutación (la mutación IVS1-1) en el gen globina beta en células CD34+ derivadas del paciente con beta talasemia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una célula madre hematopoyética CD34+ modificada genéticamente, que comprende:

un par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par:

(i) una primera nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana como se muestra en SEQ ID NO: 5, comprendiendo la primera ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO: 12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO: 13);

F4: DSANRIK (SEC ID N2: 14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11); y

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO: 15); y

(ii) una segunda nucleasa con dedos de zinc que se une a un sitio diana como se muestra en SEQ ID NO: 4, comprendiendo la segunda ZFN las siguientes regiones de hélice de reconocimiento:

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO: 16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO: 7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO: 8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO: 9); y

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO: 17) o VYEGLKK (SEQ ID NO: 18);

y una secuencia donante que comprende una secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21, en donde la secuencia donante se inserta en un gen de hemoglobina beta humana (Hbb) aberrante endógena después de la escisión fijada como objetivo por el par de nucleasas con dedos de zinc, corrigiendo con ello la secuencia del gen Hbb, y en donde el gen Hbb aberrante comprende una secuencia intermedia 1, mutación número 1 mutación (IVS1-1).

2. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 1, en donde la secuencia donante corrige una mutación puntual.

3. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 2, en donde el gen Hbb aberrante comprende una modificación genómica dentro de una o más de las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 3.

4. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 3, en donde la modificación genómica dentro de SEQ ID NO: 3 interrumpe un motivo donante de corte y empalme, tal como cambiar el dinucleótido GT al comienzo del intrón 1 del gen de globina beta humana a un dinucleótido AT.

5. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 2, en donde se corrige una mutación que altera el sitio donante de corte y empalme para el procesamiento de ARNm del gen Hbb aberrante que conduce a la beta-talasemia.

6. La célula modificada genéticamente de la reivindicación 2, en donde el gen Hbb aberrante comprende una modificación genómica en o cerca de cualquiera de las secuencias mostradas como SEQ ID NO. 4 o 5.

7. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 6, en donde la secuencia donante comprende un nuevo sitio de escisión de enzima de restricción con respecto al gen Hbb endógeno.

8. Una célula modificada genéticamente que desciende de la célula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la célula comprende:

un par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO: 12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO: 13);

F4: DSANRIK (SEC ID N2: 14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11); y

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO: 15); y

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO: 16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO: 7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO: 8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO: 9); y

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO: 17) o VYEGLKK (SEQ ID NO: 18);

y una secuencia donante que comprende una secuencia como se muestra en SEQ ID NO: 19 o SEQ ID NO: 21.

9. Una célula diferenciada genéticamente modificada que desciende de la célula de cualquiera de las reivindicaciones 1 -7, tal como un glóbulo rojo (RBC), en donde la célula comprende:

un par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO: 12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO: 13);

F4: DSANRIK (SEC ID N2: 14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11); y

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO: 15); y

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO: 16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO: 7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO: 8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO: 9); y

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO: 17) o VYEGLKK (SEQ ID NO: 18);

10. Una composición farmacéutica que comprende la célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

11. La célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para uso en el tratamiento de una beta-talasemia.

12. Una composición que comprende un par de nucleasas con dedos de zinc, o un polinucleótido que codifica el par de nucleasas con dedos de zinc, comprendiendo el par:

F1: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11);

F2: QSGTRKT (SEQ ID NO: 12);

F3: RSDNLST (SEQ ID NO: 13);

F4: DSANRIK (SEC ID N2: 14);

F5: LRHHLTR (SEQ ID NO: 11); y

F6: QSGNLHV (SEQ ID NO: 15); y

F1: AMQTLRV (SEQ ID NO: 16);

F2: DRSHLAR (SEQ ID NO: 7);

F3: RSDNLSE (SEQ ID NO: 8);

F4: ASKTRKN (SEQ ID NO: 9); y

F5: TSSDRKK (SEQ ID NO: 17) o VYEGLKK (SEQ ID NO: 18).

13. Un método in vitro para alterar la expresión de Hbb en una célula, comprendiendo el método: introducir en la célula uno o más polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 12, en condiciones tales que se expresen una o más proteínas y se incrementa la expresión del gen Hbb.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 10 para uso en un método para tratar a un paciente con ptalasemia, comprendiendo el método administrar al paciente la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para aumentar la expresión del gen Hbb en el paciente.