ES2895069T3 - Regulación de la expresión génica mediada por nucleasa - Google Patents

Abstract

Una célula genéticamente modificada que comprende deleciones y/o inserciones en una secuencia de potenciador BCL11a endógeno hechas por una nucleasa que comprende un dominio de escisión y un dominio de unión a ADN que se une a un sitio diana que comprende al menos 9 pares de bases de SEQ ID NO: 71 a 74.

Description

DESCRIPCIÓN

Regulación de la expresión génica mediada por nucleasa

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación está en el campo de la ingeniería del genoma, particularmente la modificación dirigida del genoma de una célula hematopoyética.

ANTECEDENTES

Cuando se considera que los esfuerzos de secuenciación del genoma han revelado que el genoma humano contiene entre 20.000 y 25.000 genes, pero menos de 2000 reguladores transcripciones, es evidente que deben interactuar varios factores para controlar la expresión génica en todas sus diversas manifestaciones temporales, de desarrollo y específicas de tejido. La expresión de genes está controlada por una mezcla altamente compleja de reguladores de la transcripción generales y específicos y la expresión también se puede controlar por elementos de ADN que actúan en cis. Estos elementos de ADN comprenden tanto elementos de ADN local, tales como el promotor central y sus sitios de unión al factor de transcripción asociados, así como elementos distales, tales como potenciadores, silenciadores, aislantes y regiones de control del locus (LCR) (véase Matson et al., (2006) Ann Rev Genoma Hum Genet 7: 29-50).

Los elementos potenciadores se identificaron por primera vez en el genoma vírico de SV40, y luego se encontraron en el locus de cadenas pesadas de la inmunoglobulina humana. Conocidos ahora por desempeñar funciones reguladoras en la expresión de muchos genes, parece que los potenciadores influyen principalmente en los patrones temporales y espaciales de la expresión génica. También se ha encontrado que los potenciadores funcionan de un modo que no es dependiente de la distancia desde el promotor central de un gen, y tampoco es dependiente de la orientación de secuencia específica con respecto al promotor. Los potenciadores se pueden localizar varios cientos de kilobases en la dirección 5' o en la dirección 3' de una región promotora central, donde se pueden localizar en una secuencia de intrón, o incluso más allá del extremo 3' de un gen.

Se han descrito diversos métodos y composiciones para la escisión dirigida de ADN genómico. Dichos acontecimientos de escisión dirigida se pueden usar, por ejemplo, para inducir la mutagénesis dirigida, inducir deleciones dirigidas de secuencias de ADN celular y facilitar la recombinación dirigida en un locus cromosómico predeterminado. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N28.623.618; 8.034.598; 8.586.526; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.067.317; 7.262.054; 7.888.121; 7.972.854; 7.914.796; 7.951.925; 8.110.379; 8.409.861; publicaciones de patente de EE. U U .20030232410;20050208489;20050026157;20060063231;20080159996;201000218264;20120017290; 20110265198; 20130137104; 20130122591; 20130177983 y 20130177960 y solicitud de EE. UU. N.214/278.903. Estos métodos implican frecuentemente el uso de sistemas de escisión manipulada para inducir una rotura bicatenaria (DSB) o un corte monocatenario en una secuencia de ADN diana de forma que la reparación de la rotura por un proceso propenso a error, tal como la unión de extremos no homólogos (NHEJ) o la reparación usando un molde de reparación (reparación dirigida por homología o HDR), pueda dar como resultado la inactivación de un gen o la inserción de una secuencia de interés (integración dirigida). Esta técnica también se puede usar para introducir cambios específicos del sitio en la secuencia del genoma mediante el uso de un oligonucleótido donante, que incluye la introducción de deleciones específicas de regiones genómicas, o de mutaciones puntuales específicas o alteraciones localizadas (también conocidas como corrección génica). La escisión puede ocurrir mediante el uso de nucleasas específicas, tales como nucleasas de dedos de cinc (ZFN) manipuladas, nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALEN), o el uso del sistema CRISPR/Cas con un ARNcr manipulado/ARNtracr ('ARn guía monocatenario') para guiar la escisión específica. Además, están desarrollándose nucleasas dirigidas basándose en el sistema Argonaute (por ejemplo, de T. thermophilus, conocido como 'TtAgo', véase Swarts et al., (2014) Nature 507(7491): 258-261), que también puede tener posibilidades de usos en la edición del genoma y genoterapia.

Los glóbulos rojos (RBC), o eritrocitos, son el principal componente celular de la sangre. En realidad, los RBC representan un cuarto de las células en un humano. Los RBC maduros carecen de núcleo y muchos otros orgánulos en los seres humanos, y están llenos de hemoglobina, una metaloproteína que funciona llevando el oxígeno a los tejidos, así como llevando el dióxido de carbono fuera de los tejidos y de vuelta a los pulmones para su eliminación. Esta proteína constituye aproximadamente el 97 % del peso seco de los RBC y aumenta la capacidad de la sangre de transportar el oxígeno en aproximadamente setenta veces. La hemoglobina es un heterotetrámero que comprende dos cadenas de globina de tipo alfa (a) y dos cadenas de globina de tipo beta (p) y 4 grupos hemo. En los adultos, el tetrámero a2p2 se denomina la hemoglobina A (HbA) o hemoglobina adulta. Normalmente, las cadenas de globina alfa y beta se sintetizan en una relación aproximada de 1:1 y esta relación parece ser crítica en términos de hemoglobina y estabilización de RBC. En un feto en desarrollo, se produce una forma diferente de hemoglobina, la hemoglobina fetal (HbF), que tiene una mayor afinidad de unión por el oxígeno que la hemoglobina A, de forma que el oxígeno se pueda suministrar al sistema del bebé por la corriente sanguínea de la madre. La hemoglobina fetal también contiene dos cadenas a de globina, pero en lugar de las cadenas p de globina adultas, tiene dos cadenas gamma (g) de globina fetal (es decir, la hemoglobina fetal es a2y2). A aproximadamente las 30 semanas de gestación, la síntesis de globina gamma en el feto empieza a disminuir, mientras que aumenta la producción de globina beta. A aproximadamente los 10 meses de edad, la hemoglobina del recién nacido es casi toda a2p2, aunque cierta HbF persiste en la adultez (aproximadamente el 1 -3 % de la hemoglobina total). La regulación del cambio de la producción de globina gamma a beta es bastante compleja, y principalmente implica la regulación por disminución de la transcripción de globina gamma con una regulación simultánea por incremento de la transcripción de globina beta.

Los defectos genéticos en las secuencias que codifican las cadenas de hemoglobina pueden ser responsables de varias enfermedades conocidas, como hemoglobinopatías, que incluyen anemia de células falciformes y talasemias. En la mayoría de los pacientes con hemoglobinopatías, los genes que codifican la globina gamma siguen estando presentes, pero la expresión es relativamente baja debido a la represión génica normal que ocurre alrededor del parto como se ha descrito anteriormente.

Se estima que 1 de cada 5000 personas en los EE. UU. tiene drepanocitosis (SCD), principalmente las personas de origen subsahariano. Parece haber un beneficio de los portadores heterocigóticos de la mutación de células falciformes para la protección contra la malaria, por lo que este rasgo puede haber sido positivamente seleccionado con el tiempo, de forma que se estima que en el África subsahariana un tercio de la población tiene el rasgo de célula falciforme. La drepanocitosis es provocada por una mutación en el gen de globina p como consecuencia de que la valina se sustituye por ácido glutámico en el aminoácido N.° 6 (un GAG a GTG al nivel de ADN), donde la hemoglobina resultante se denomina "hemoglobinas" o "HbS". En condiciones de menor oxígeno, un desplazamiento conformacional en la forma de desoxi de HbS expone un parche hidrófobo sobre la proteína entre las hélices E y F. Los restos hidrófobos de la valina en la posición 6 de la cadena beta en la hemoglobina son capaces de asociarse con el parche hidrófobo, causando que las moléculas de HbS se agreguen y formen precipitados fibrosos. Estos agregados provocan a su vez la anomalía o 'falciformación' de los RBC, lo que da como resultado una pérdida de flexibilidad de las células. Los RBC de falciformación ya no son capaces de estrujarse en los lechos capilares y pueden producir una crisis vaso-oclusiva en los pacientes con células falciformes. Además, los RBC falciformados son más frágiles que los RBC normales, y tienden hacia la hemólisis, conduciendo con el tiempo a anemia en el paciente.

El tratamiento y el abordaje de los pacientes con células falciformes es una propuesta para toda la vida que implica el tratamiento con antibióticos, el abordaje del dolor y transfusiones durante episodios agudos. Un enfoque es el uso de hidroxiurea, que ejerce sus efectos en parte aumentando la producción de globina gamma. Sin embargo, los efectos secundarios a largo plazo de la terapia crónica con hidroxiurea son todavía desconocidos y el tratamiento produce efectos secundarios no deseados y puede tener una eficacia variable de paciente a paciente. A pesar de un aumento en la eficacia de los tratamientos de células falciformes, la esperanza de vida de los pacientes sigue siendo solo de mediados a finales de los 50 años, y las morbilidades asociadas de la enfermedad tienen un profundo impacto sobre la calidad de vida del paciente.

Las talasemias también son enfermedades relacionadas con la hemoglobina e implican normalmente una expresión reducida de las cadenas de globina. Esto puede ocurrir mediante mutaciones en las regiones reguladoras de los genes o a partir de una mutación en una secuencia codificante de globina que produce una expresión reducida o niveles reducidos o proteína globina funcional. Las alfa-talasemias se asocian principalmente con personas de origen de África occidental y del sur de Asia, y pueden conferir resistencia palúdica. La beta-talasemia se asocia principalmente con personas de origen mediterráneo, normalmente de Grecia y las áreas costeras de Turquía e Italia. El tratamiento de las talasemias consiste normalmente en transfusiones de sangre y terapia de quelación del hierro. También se están usando trasplantes de médula ósea para el tratamiento de personas con talasemias intensas si se puede identificar un donante apropiado, pero este procedimiento puede tener riesgos significativos.

Un enfoque que se ha propuesto para el tratamiento de tanto la SCD como las beta talasemias es aumentar la expresión de la globina gamma con el objetivo de que la HbF sustituya funcionalmente a la hemoglobina adulta aberrante. Como se ha mencionado anteriormente, se cree que el tratamiento de pacientes con SCD con hidroxiurea es satisfactorio en parte debido a su efecto sobre el aumento de la expresión de globina gamma. El primer grupo de compuestos que se descubrió que afectaba la actividad de reactivación de la globina gamma fueron los fármacos citotóxicos. La capacidad de causar la síntesis de novo de la globina gamma por manipulación farmacológica se mostró primero usando 5-azacitidina en animales experimentales (DeSimone (1982) Proc Nat'l Acad Sci USA 79(14) :4428-31). Estudios posteriores confirmaron que la capacidad de la 5-azacitidina aumentaba la HbF en pacientes con ptalasemia y drepanocitosis (Ley, et al., (1982) N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475, y Ley, et al., (1983) Blood 62: 370-380). Además, se ha mostrado que los ácidos grasos de cadena corta (por ejemplo, butirato y derivados) en sistemas experimentales aumentan la HbF (Constantoulakis et al., (1988) Blood 72(6):1961 -1967). Por tanto, existe un segmento de la población humana con una afección conocida como 'persistencia hereditaria de la hemoglobina fetal' (HPFH) donde elevadas cantidades de HbF persisten en la adultez (10-40 % en heterocigotos de HPFH (véase Thein et al., (2009) Hum. Mol. Genet 18 (R2): R216-R223). Es una afección grave, pero en ausencia de cualquier anomalía de globina beta asociada, no se asociada a ninguna manifestación clínica significativa, incluso cuando el 100 % de la hemoglobina del individuo es HbF. Cuando los individuos que tienen una beta talasemia también tienen HPFH coincidente, la expresión de HbF puede reducir la intensidad de la enfermedad. Además, la intensidad del transcurso natural de la drepanocitosis puede variar significativamente de paciente a paciente, y esta variabilidad puede deberse, en parte, a que algunos individuos con una enfermedad más leve expresan niveles más altos de HbF.

Un enfoque para aumentar la expresión de HbF consiste en la identificación de genes cuyos productos desempeñan una función en la regulación de la expresión de la globina gamma. Dicho gen es BCL11A, identificado por primera vez debido a su función en el desarrollo de linfocitos. BCL11A codifica una proteína de dedos de cinc que se cree que participa en la regulación específica del estadio de desarrollo de la expresión de la globina gamma. BCL11A se expresa en células precursoras eritroides adultas y la regulación por disminución de su expresión conduce a un aumento en la expresión de la globina gamma. Además, parece que el corte y empalme de ARNm de BCL11A se regula por el comportamiento. En células embrionarias, parece que se expresan predominantemente las variantes de ARNm de BCL11A más cortas, conocidas como BCL11A-S y BCL11A-XS, mientras que, en células adultas, se expresan predominantemente variantes más largas de ARNm de BCL11A-L y BCL11A-XL. Véase, Sankaran et al., (2008) Science 322 p. 1839. Parece que la proteína BCL11A interactúa con el locus de globina beta para alterar su conformación y así su expresión en diferentes etapas del desarrollo. Se ha propuesto el uso de un ARN inhibidor dirigido al gen BCL11A (véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. 20110182867), pero esta tecnología tiene varios posibles inconvenientes, concretamente puede no lograrse la completa inactivación, la administración de dichos ARN puede ser problemática y los ARN deben estar presentes continuamente, lo que requiere múltiples tratamientos de por vida.

El direccionamiento de las secuencias del potenciador BCL11A puede proporcionar un mecanismo para aumentar la HbF. Por ejemplo, estudios de asociación de todo el genoma han identificado un conjunto de variaciones genéticas en BCL11A que se asocian a un aumento de los niveles de HbF. Estas variaciones son un conjunto de SNP encontrados en regiones no codificantes de BCL11A que funcionan como una región potenciadora específica de cada etapa, y restringida por el linaje. La investigación posterior reveló que este potenciador BCL11A es necesario en las células eritroides para la expresión de BCL11A, pero no es necesario para su expresión en linfocitos B (véase Bauer et al., (2013) Science 343:253-257). Se encontró la región potenciadora dentro del intrón 2 del gen BCL11A, y se identificaron tres áreas de hipersensibilidad a la DNAsa I (frecuentemente indicativas de un estado de la cromatina que se asocia con un potencial regulador) en el intrón 2. Estas tres áreas se identificaron como ''+62", ''+58" y ''+55" según la distancia en kilobases desde el sitio de inicio de la transcripción de BCL11 A. Estas regiones potenciadoras tienen una longitud aproximada de 350 (+55); 550 (+58); y 350 (+62) nucleótidos (Bauer 2013, arriba).

Así, sigue existiendo una necesidad de métodos y composiciones adicionales que puedan utilizar estos estudios de asociación de todo el genoma para la edición del genoma y la alteración de la expresión génica, por ejemplo, para tratar hemoglobinopatías, tales como la drepanocitosis y la beta talasemia.

SUMARIO

La presente invención se define en las reivindicaciones. En concreto, los métodos y las composiciones descritos se refieren a inactivar (por ejemplo, suprimir completa o parcialmente su expresión) un gen, por ejemplo, un gen que actúa de regulador de uno o más genes adicionales. En particular, la presente divulgación se refiere a métodos y composiciones para interferir con la función potenciadora en un gen BCL11A para disminuir o inactivar su actividad en linajes celulares específicos. Además, la divulgación se refiere a métodos y composiciones para interferir con las funciones del potenciador BCL11 A, en donde las secuencias potenciadoras no están situadas dentro del gen BCL11 A. La regulación por disminución resultante del gen BCL11A en estas circunstancias da a su vez como resultado una elevada expresión de globina gamma.

La invención proporciona una célula genéticamente modificada que comprende deleciones y/o inserciones en una secuencia potenciadora endógena de BCL11 a preparada por una nucleasa que comprende un dominio de escisión y un dominio de unión de ADN que se une a un sitio diana que comprende al menos 9 pares de bases de SEQ ID NO: 71 a 74.

La invención también proporciona una célula diferenciada modificada genéticamente heredada de la célula madre según la invención.

La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende la célula modificada genéticamente de la invención, y uso del fármaco.

La invención proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de una hemoglobinopatía.

La invención también proporciona una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de tratamiento o prevención de una hemoglobinopatía en un paciente en necesidad de un aumento en la expresión génica de la globina, comprendiendo el método administrar al paciente la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para aumentar la expresión génica de globina en el paciente.

En algunos aspectos, al menos una nucleasa (es decir, una nucleasa que se une a una secuencia del potenciador BCL11 A) se administra a una célula madre humana o célula precursora (HSC/PC) con el fin de manipular el genoma. En ciertos aspectos de la divulgación, la nucleasa reconoce una secuencia diana que comprende al menos 9 (por ^{ejemplo, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o incluso más) pares de bases contiguos de SEQ ID} nO:1, SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:3). Las secuencias diana se muestran en las Tablas 1,2, 3, 4 y 6. En ciertos aspectos de la divulgación, la nucleasa comprende una proteína de unión a ADN que comprende una proteína de dedos de cinc que comprende 4, 5 o 6 dominios de dedos de cinc que comprenden una región de hélice de reconocimiento, en donde las proteínas de dedo de cinc comprenden las regiones de hélice de reconocimiento en el orden mostrado en una única fila de la Tabla 3 o la Tabla 6. En otros aspectos de la divulgación, la nucleasa comprende una proteína TALE que comprende una pluralidad de unidades repetidas de TALE, comprendiendo cada unidad repetida una región de dirresiduo hipervariable (RVD), por ejemplo los RVD de las unidades repetidas de TALE se muestran en una única fila de la Tabla 1, la Tabla 2 o la Tabla 4. La(s) nucleasa(s) como se describen en el presente documento pueden comprender además un conector (por ejemplo, entre el dominio de unión a ADN y el dominio de escisión), por ejemplo, un conector como se muestra en las Figuras 14 y 17.

En algunas realizaciones, la nucleasa se administra como un péptido, mientras que en otras se administra como un ácido nucleico que codifica la al menos una nucleasa. En algunas realizaciones, se usa más de una nucleasa. En algunas realizaciones preferidas, el ácido nucleico que codifica la nucleasa es un ARNm, y en algunos casos, el ARNm está protegido. En algunos aspectos, el ARNm puede estar químicamente modificado (véase, por ejemplo, Kormann et al., (2011) Nature Biotechnology 29(2):154-157). En otros aspectos, el ARNm puede comprender una caperuza de ARCA (véanse las patentes de EE. UU. 7.074.596 y 8.153.773). En realizaciones adicionales, el ARNm puede comprender una mezcla de nucleótidos sin modificar y modificados (véase la publicación de patente de EE. UU. 2012­ 0195936). La nucleasa puede comprender una nucleasa de dedos de cinc (ZFN), una nucleasa TALE (TALEN) o un sistema de nucleasa de CRISPR/Cas o una combinación de los mismos. En una realización preferida, el ácido nucleico que codifica la(s) nucleasa(s) se administra a la HSC/PC por electroporación. En algunas realizaciones, la nucleasa se escinde en o cerca del sitio de unión del factor de transcripción. En algunos aspectos, el factor de transcripción es GATA-1.

En algunas realizaciones que comprenden un sistema de nucleasa que utiliza una guía de ácido nucleico (por ejemplo, CRISPR/Cas; TtAgo), la célula se puede poner en contacto con la guía de ácido nucleico al mismo tiempo que se pone en contacto con la nucleasa, antes del contacto con la nucleasa, o después del contacto con la nucleasa. La célula se puede poner en contacto donde la nucleasa se proporciona como un polipéptido, un ARNm o un vector (incluyendo un vector vírico) capaz de expresar el gen que codifica la nucleasa. El ácido nucleico guía se puede proporcionar como un oligonucleótido (para TtAgo) o ARN (CRISPR/Cas). Además, el ARN guía se puede proporcionar por un sistema de expresión para la expresión del ARN guía dentro de la célula. En algunos aspectos, se proporciona más de un ARN guía (véase Mandal et al. (2014) Cell Stem Cell 15:643). En algunas realizaciones, se proporcionan dos ARN guía, mientras que en otras se proporcionan más de dos (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de diez). En algunos aspectos, se usan ARN guía truncados para aumentar la especificidad (Fu et al. (2014) Nature Biotechnol 32(3): 279). Véase también la solicitud de patente de EE. UU. 14/278.903.

Se pueden usar nucleasas Cas mutadas específicas de un potenciador de BCL11A. En algunas realizaciones, estas nucleasas Cas mutantes son nucleasas Cas9, y tienen funcionalidad alterada. En algunas realizaciones, la proteína Cas9 está mutada en el dominio HNH, que hace que sea incapaz de escindir la cadena de ADN que es complementaria al ARN guía. En otras realizaciones, la Cas9 está mutada en el dominio Rvu, lo que hace que sea incapaz de escindir la cadena de ADN no complementaria. Estas mutaciones pueden dar como resultado la creación de nickasas Cas9. En algunas realizaciones, se usan dos nickasas Cas con dos ARN guía separados para dirigir un ADN, que da como resultado dos cortes monocatenarios en el ADN diana a una distancia determinada. En otras realizaciones, tanto los dominio de endonucleasa HNH como Rvu se alteran para dar una proteína Cas9 que es incapaz de escindir un ADN del potenciador BCl11A diana.

Se pueden usar truncaciones de la proteína Cas9. En una realización, la proteína Cas9 se trunca de forma que se eliminen uno o más de los dominios funcionales de Cas9. En una realización, la eliminación de parte o uno de los dominios de nucleasa convierte la nucleasa Cas en nickasa. En una realización, la Cas9 comprende solo el dominio responsable de la interacción con el ARNcr o ARNsg y el ADN diana.

Se pueden usar proteínas de fusión en donde la proteína Cas9, o truncación de la misma, se fusiona con un dominio funcional. En algunos aspectos, el dominio funcional es una activación o un dominio de represión. En otros aspectos, el dominio funcional es un dominio de nucleasa. En algunas realizaciones, el dominio de nucleasa es un dominio de endonucleasa Fokl (por ejemplo, Tsai (2014) Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2908). En algunas realizaciones, el dominio Fokl comprende mutaciones en el dominio de dimerización.

En otros aspectos, la invención se refiere a una célula o estirpe celular en la que se modifica una secuencia del potenciador de BCL11A endógeno, por ejemplo, en comparación con la secuencia no mutante de la célula. La célula o estirpes celulares pueden ser heterocigóticas u homocigóticas para la modificación. Las modificaciones comprenden inserciones, deleciones y/o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones preferidas, las inserciones, deleciones y/o combinaciones de las mismas producen la destrucción de un sitio de unión al factor de transcripción. La secuencia del potenciador BCL11A se modifica por una nucleasa (por ejemplo, ZFN, TALEN, sistema CRISPR/Cas, sistema Ttago, etc.). En ciertas realizaciones, el potenciador BCL11A se modifica en cualquier lugar entre el exón 2 y el exón 3. En otras realizaciones, el potenciador BCL11A se modifica en las regiones mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 (Figura 11). En ciertas realizaciones, la modificación es en o cerca del (de los) sitio(s) de unión y/o escisión de nucleasa(s), por ejemplo, dentro de 1-300 (o cualquier valor intermedio) pares de bases en la dirección 5' o en la dirección 3' del (de los) sitio(s) de escisión, más preferentemente dentro de 1 -100 pares de bases (o cualquier valor intermedio) de cualquier lado del (de los) sitio(s) de unión y/o escisión, incluso más preferentemente dentro de 1 a 50 pares de bases (o cualquier valor intermedio) en cualquier lado de (de los) sitio(s) de unión y/o escisión. La modificación puede ser en o cerca de la región ''+58" del potenciador BCL11A, por ejemplo, en o cerca de un sitio de unión a nucleasa mostrado en cualquiera de SEQ ID NO: 4 a 80 y 362. La modificación puede ser en o cerca de la región ''+55" del potenciador BCL11A, por ejemplo, en o cerca de un sitio de nucleasa mostrado en cualquiera de SEQ ID NO: 143 a 184 y 232-251. La modificación puede ocurrir en otras secuencias del potenciador BCL11A. Se puede modificar cualquier célula o estirpe celular, por ejemplo, una célula madre (célula madre hematopoyética). También se desvelan células parcialmente o completamente diferenciadas heredadas de las células madre modificadas, como se describe en el presente documento (por ejemplo, RBC o células precursoras de RBC). Cualquiera de las células o estirpes celulares desveladas en el presente documento puede mostrar una elevada expresión de la globina gamma. También se desvelan composiciones, tales como las composiciones farmacéuticas que comprenden las células genéticamente modificadas que se describen en el presente documento.

En otros aspectos, se puede administrar un ácido nucleico donante a una célula diana. El donante se puede administrar antes, después o junto con el ácido nucleico que codifica la(s) nucleasa(s). El ácido nucleico donante puede comprender una secuencia exógena (transgén) que se integra en el genoma de la célula, por ejemplo, un locus endógeno. En algunas realizaciones, el donante puede comprender un gen de longitud completa o fragmento del mismo flanqueado por regiones de homología con el sitio de escisión dirigido. En algunas realizaciones, el donante carece de regiones homólogas y se integra en un locus diana mediante un mecanismo independiente de homología (es decir, NHEJ). El donante puede comprender cualquier secuencia del ácido nucleico, por ejemplo un ácido nucleico que, cuando se usa como un sustrato para la reparación dirigida a homología de la rotura bicatenaria inducida por nucleasa, conduce a una deleción específica de donante que se genera en el locus cromosómico endógeno (por ejemplo, región del potenciador BCL11A) o, alternativamente (o además de), formas alélicas novedosas (por ejemplo, mutaciones puntuales que extirpan un sitio de unión a factor de transcripción) del locus endógeno a crear. En algunos aspectos, el ácido nucleico donante es un oligonucleótido en donde la integración conduce a un acontecimiento de corrección del gen, o una deleción dirigida.

En otros aspectos, la nucleasa y/o donante se suministra(n) por métodos de transferencia génica vírica y/o no vírica. En realizaciones preferidas, el donante se suministra a la célula por un virus adenoasociado (AAV). En algunos casos, el AAV comprende LTR que son de un serotipo heterólogo en comparación con el serotipo de la cápside.

En algunos aspectos, las composiciones de la invención usan una o más nucleasas (por ejemplo, ZFN y/o TALEN) dirigidas a regiones específicas en la región del potenciador BCL11A. En algunas realizaciones, el uno o más pares de secuencias se dirigen a nucleasas que producen la modificación de la región potenciadora por su deleción en su totalidad, mientras que en otras realizaciones se delecionan subsecciones del potenciador. En algunas realizaciones, la deleción comprende una o más de las regiones de hipersensibilidad de DNAsaI 55, 58 y/o 62 de la región potenciadora. En otras realizaciones, se deleciona un subconjunto (menos del todo) de las regiones hipersensibles. En algunas realizaciones, solo se deleciona la región 55, solo la 58 o solo la 62. En otras realizaciones, se delecionan dos de las regiones (por ejemplo, 55 y 58; 58 y 62; o 55 y 62).

En algunos aspectos, se hacen deleciones que comprenden regiones dentro de las regiones hipersensibles a DNAsaI del potenciador. Estas deleciones pueden comprender desde aproximadamente 1 nucleótido hasta aproximadamente 551 nucleótidos. Por lo tanto, las deleciones pueden comprender 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nucleótidos, o cualquier valor intermedio. En algunas realizaciones, las deleciones comprenden regiones de unión para uno o más factores de transcripción. En algunas realizaciones preferidas, las deleciones comprenden un sitio de unión a GATA-1, o el sitio de unión para GATA-1 en combinación con otros factores.

Algunos aspectos de la divulgación se refieren a proteínas de unión a ADN manipuladas (no naturales) que se unen a la(s) secuencia(s) del potenciador BCL11A, pero no las escinden. Por ejemplo, el dominio de la nucleasa Cas9 en un sistema CRISPR/Cas se puede manipular específicamente para perder actividad de escisión de ADN ("dCAS"), y se fusiona con un dominio funcional capaz de modular la expresión génica (véase Perez-Pimera (2013) Nat Method 10(10):973-976) para crear un CRISPR/dCas-TF. En algunos casos, los dominios de unión de ADN modificados bloquean la interacción de los factores de transcripción activos en la actividad de potenciador para que no se unan con sus secuencias del potenciador relacionadas.

Los dominios de unión a ADN se pueden fusionar con un dominio funcional, tal como la fusión de los dominios de unión a ADN con dominios capaces de regular la expresión de un gen. Las proteínas de fusión pueden comprender un dominio de unión a ADN fusionado con un dominio modulador de la expresión génica donde el modulador reprime la expresión génica.

En algunas realizaciones, las células HSC/PC se ponen en contacto con las nucleasas y/o proteínas de unión a ADN como se describe en el presente documento. En algunas realizaciones, las nucleasas y/o proteínas de unión a ADN se administran como ácidos nucleicos y en otras realizaciones se administran como proteínas. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos son ARNm que codifican las nucleasas y/o proteínas de unión a ADN, y en realizaciones adicionales se pueden proteger los ARNm. En algunas realizaciones, el ARNm se puede modificar químicamente, puede comprender una caperuza de ARCA y/o puede comprender una mezcla de nucleótidos sin modificar y modificados.

En algunos aspectos, las HSC/PC se ponen en contacto con las nucleasas y/o proteínas de unión a ADN como se describen en el presente documento ex vivo, después de la aféresis de HSC/PC de un sujeto, o purificación de la médula ósea recogida. Las nucleasas pueden provocar modificaciones dentro de las regiones del potenciador BCL11 A. Las HSC/PC que contienen las modificaciones de la región de potenciador BCL11A se pueden introducir de nuevo en el sujeto. En algunos casos, las HSC/PC que contiene las modificaciones de la región del potenciador BCL11A se expanden antes de la introducción. En otros aspectos, las HSC/PC genéticamente modificadas se administran al sujeto en un trasplante de médula ósea en donde las HSC/PC se injertan, diferencian y maduran in vivo. Las HSC/PC se pueden aislar del sujeto después de la movilización inducida por G-CSF y/o plerixafor, o las células se pueden aislar de médula ósea humana o cordones umbilicales humanos. En algunos aspectos, el sujeto se trata con un procedimiento mieloablativo suave antes de la introducción del injerto que comprende las HSC/PC modificadas, mientras que en otros aspectos, el sujeto se trata con un régimen de acondicionamiento mieloablativo vigoroso. En algunas realizaciones, las composiciones de la invención se usan para tratar o prevenir una hemoglobinopatía. En algunos aspectos, la hemoglobinopatía es una beta talasemia, mientras que en otros aspectos la hemoglobinopatía es la drepanocitosis.

En algunas realizaciones, las HSC/PC se ponen además en contacto con una molécula donante. En algunas realizaciones, la molécula donante se administra por un vector vírico. La molécula donante puede comprender una o más secuencias que codifican un polipéptido funcional (por ejemplo, un ADNc o fragmento el mismo), con o sin un promotor. Las secuencias adicionales (secuencias codificantes o no codificantes) se pueden incluir cuando se usa una molécula donante para la inactivación, que incluye, pero no se limita a, secuencias que codifican un péptido 2A, sitio SA, IRES, etc.

En un aspecto, los métodos y las composiciones comprenden métodos para poner en contacto las HSC/PC in vivo. Las nucleasas y/o proteínas de unión a ADN se administran a HSC/PC in situ por métodos conocidos en la técnica. Las nucleasas y/o proteínas de unión a ADN pueden comprender una partícula vírica que se administra al sujeto en necesidad, o las nucleasas y/o proteínas de unión a ADN pueden comprender una nanopartícula (por ejemplo, liposoma). Las partículas víricas y/o nanopartículas se pueden administrar al órgano (por ejemplo, médula ósea) en donde residen las HSC/PC.

En otro aspecto, en el presente documento se describen métodos de integración de un ácido nucleico donante en el genoma de una célula por mecanismos independientes de homología. Los métodos comprenden crear una rotura bicatenaria (DSB) en el genoma de una célula y escindir la molécula donante usando una nucleasa, de forma que el ácido nucleico donante se integre en el sitio de DSB. El ácido nucleico donante se puede integrar por métodos no dependientes de homología (por ejemplo, NHEJ). Como se observa anteriormente, tras la escisión in vivo, las secuencias de donante se pueden integrar de un modo dirigido en el genoma de una célula en la localización de un DSB. La secuencia donante puede incluir uno o más de los mismos sitios diana para una o más de las nucleasas usadas para crear el DSB. Así, la secuencia donante se puede escindir por una o más de las mismas nucleasas usadas para escindir el gen endógeno en el que se desea la integración. La secuencia donante puede incluir diferentes sitios diana de nucleasa de las nucleasas usadas para inducir la DSB. Las DSB en el genoma de la célula diana se pueden crear por cualquier mecanismo. La DSB se puede crear por una o más nucleasas de dedos de cinc (ZFN), proteínas de fusión que comprenden un dominio de unión de dedos de cinc, que se manipulan para unir una secuencia dentro de la región de interés, y un dominio de escisión o mitad de dominio de escisión. La DSB se puede crear por uno o más dominios de unión a ADN de TALE (naturales o no naturales) fusionados con un dominio de nucleasa (TALEN). La DSB se puede crear usando un sistema de nucleasa de CRISPR/Cas donde un único ARN guía manipulado o su equivalente funcional se usa para guiar la nucleasa a un sitio dirigido en un genoma.

En un aspecto, el donante puede codificar una proteína reguladora de interés (por ejemplo, TF de ZFP, TF de TALE o TF de CRISPR/Cas) que se une a y/o modula la expresión de un gen de interés. En una realización, las proteínas reguladoras se unen a una secuencia de ADN y previenen la unión de otros factores reguladores. En otra realización, la unión de la proteína reguladora puede modular (es decir, inducir o reprimir) la expresión de un ADN diana.

Se describe una célula HSC/PC transgénica y/o animal que incluye un transgén que codifica un gen humano. El animal transgénico puede comprender una inactivación en el locus endógeno correspondiente al transgén exógeno, por lo que se permite el desarrollo de un sistema in vivo donde la proteína humana puede ser estudiada en aislamiento. Dichos modelos transgénicos se pueden usar para fines de cribado para identificar moléculas pequeñas o biomoléculas grandes u otras entidades que puedan interactuar con o modificar la proteína humana de interés. En algunos aspectos de la divulgación, el transgén se integra en el locus seleccionado (por ejemplo, puerto seguro) en una célula madre (por ejemplo, una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida, una célula madre hematopoyética, etc.) o embrión animal obtenido por cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, y entonces el embrión se implanta de forma que nazca un animal vivo. El animal se cría entonces hasta la madurez sexual y se permite que tenga descendencia, en donde al menos algunos de los descendientes comprenden una secuencia de genes endógenos editada o el transgén integrado.

En el presente documento se describe un método de alteración de la expresión génica (por ejemplo, BCL11a y/o un gen de globina) en una célula, comprendiendo el método: introducir, en la célula, una o más nucleasas como se describe en el presente documento, en condiciones tales que la una o más proteínas se expresen y se altere la expresión del gen. Se puede alterar (por ejemplo, elevar) la expresión de un gen de globina (por ejemplo, globina gamma o globina beta). Cualquiera de los métodos descritos en el presente documento puede comprender además integrar una secuencia donante (por ejemplo, transgén o fragmento del mismo bajo el control de un promotor exógeno o endógeno) en el genoma de la célula, por ejemplo, integrando un donante en o cerca del sitio de escisión de nucleasa en el gen BCL11 a. La secuencia donante se introduce en la célula usando un vector vírico, como un oligonucleótido y/o en un plásmido. La célula en la que se altera la expresión génica puede ser, por ejemplo, una célula precursora de glóbulos rojos (RBC) y/o una célula madre hematopoyética (por ejemplo, célula CD34+).

En el presente documento se describe un método de producción de una célula genéticamente modificada que comprende una modificación genómica dentro de una secuencia del potenciador BCL11 a endógeno, comprendiendo el método las etapas de: a) poner en contacto una célula con un polinucleótido (por ejemplo, ADN o ARNm) que codifica una nucleasa de dedos de cinc que comprende 4, 5 o 6 dominios de dedos de cinc en los que cada uno de los dominios de dedos de cinc comprende una región de hélice de reconocimiento en el orden mostrado en una única fila de la Tabla 3 o la Tabla 6; b) someter la célula a condiciones que propicien la expresión de la proteína de dedos de cinc del polinucleótido; y c) modificar la secuencia del potenciador BCL11A endógeno con la proteína de dedos de cinc expresada adecuada para producir la célula genéticamente modificada. Las células se pueden estimular con al menos una citocina (por ejemplo, antes de la etapa (a)). El polinucleótido se puede poner en contacto con la célula usando cualquier método adecuado, que incluye, pero no se limita a, por transfección, usando un vector no vírico, usando un vector vírico, por medios químicos o por exposición a un campo eléctrico (por ejemplo, electroporación).

También se desvela un método de tratamiento de un paciente en necesidad de un aumento en la expresión del gen de globina, comprendiendo el método administrar al paciente la preparación farmacéutica como se describe en el presente documento en una cantidad suficiente para aumentar la expresión del gen de globina en el paciente. Se puede conoce que el paciente tiene, se puede sospechar que tiene, o puede estar en riesgo de desarrollar una talasemia o drepanocitosis.

También se desvela un kit, que comprende los ácidos nucleicos, proteínas y/o células de la invención. El kit puede comprender ácidos nucleicos que codifican las nucleasas (por ejemplo, moléculas de ARN o ZFN, TALEN o sistema CRISPR/Cas que codifica genes contenidos en un vector de expresión adecuado), o alícuotas de las proteínas nucleasa, moléculas donante, modificadores de pluripotencialidad adecuados, células, tampones y/o instrucciones (por ejemplo, para realizar los métodos desvelados en el presente documento) y similares.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 representa un diagrama de la región codificante de BCL11 A, que indica la posición de los intrones y de las regiones de potenciador. También se indican las derivaciones de los diferentes productos de corte y empalme (véase Liu et al. (2006) Molecular Cancer 5:18).

La Figura 2 representa la región genómica que codifica las diversas isoformas de Bcl11 a (navegador del genoma de la Universidad de California Santa Cruz, coordenadas enumeradas en el ensamblaje hg 19 del genoma humano), la región de potenciador en el intrón 2 de BCL11A (coordenadas enumeradas en el ensamblaje hg19 del genoma humano) y define las tres subregiones de la región de potenciador como se representa por sitios hipersensibles a la DNAsaI (listados en kb por distancia aproximada desde el sitio de inicio de la transcripción): 55, 58 y 62. Las localizaciones diana de nucleasa dentro de las tres subregiones se indican del siguiente modo: se diseñaron nucleasas para escindir el extremo izquierdo de cada subregión (los sitios 'L'), en el centro de cada uno (los sitios 'M') y en el extremo derecho (los sitios 'R'). La escisión del locus in vivo con un par de nucleasas da como resultado una deleción de la región intermedia en una fracción significativa de las células.

La Figura 3 representa los resultados de la escisión en la célula por los conjuntos de pares de TALEN (indicados en la tabla en el panel superior de la figura) en la región de potenciador BCL11A como se calibra por un ensayo basado en PCR para la deleción de diversas regiones del potenciador. Los pares de TALEN usados se diseñaron para crear deleciones en HSPC humanas ya fuera dentro de la región 55 ("55L-R"), dentro de la región 62 ("62L-R) o dentro de la región 58 ("58L-R", "58M-R"). El gel muestra productos de PCR producidos aislando ADN genómico de HSPC humanas transfectadas con construcciones de expresión que codifican las TALEN indicadas y amplificando la región que rodea la región diana. Estos datos demuestran la generación de deleciones (banda indicada por el símbolo A) en la región dirigida después de la escisión por los conjuntos de pares de Talen ^indicados.

La Figura 4 es un gráfico que muestra los resultados de un análisis de RT-qPCR en tiempo real ("Taqman®'') diseñados para detectar un cambio en la expresión de ARNm de globina gamma fetal después de la edición dirigida del potenciador BCL11 A. Después de la electroporación de células CD34 de voluntarios humanos sanos con ARNm que codifican las nucleasas diseñadas (véase la Fig 3), se generaron in vitro eritrocitos, después de lo cual se recogió el ARN total. Se determinaron los niveles relativos de ARNm de globina alfa y globina gamma para cada muestra en un análisis de RT-PCR Taqman®, y se representó la relación relativa de ARNm de globina gamma / ARNm de globina alfa. Por lo tanto, el aumento de la expresión de globina gamma en las muestras tratadas con nucleasa conduce a un aumento en la relación normalizada gamma/alfa en comparación con los controles. La figura muestra los resultados de tratar células CD34 con pares de TALEN individuales y para los conjuntos de pares TALEN descritos en las Figuras 2 y 3. El nivel de gamma/alfa es elevado para los conjuntos de pares 58L-R y 58M-R. Obsérvese que la relación en el control de transfección de GFP fue 3,4 en este experimento.

La Figura 5 es un gráfico que muestra los resultados de un análisis de RT-qPCR en tiempo real ("Taqman®") diseñado para detectar un cambio en la expresión de ARNm de globina gamma fetal después de la edición dirigida del potenciador BCL11A. Después de la electroporación de células CD34 de voluntarios humanos sanos con ARNm que codifican las nucleasas diseñadas (véase la Fig. 3), se generaron eritrocitos in vitro, después de lo cual se recogió el ARN total. Se determinaron los niveles relativos de ARNm de globina beta y globina gamma para cada muestra en un análisis de RT-PCR Taqman®, y se representó la relación relativa de ARNm de globina gamma/ARNm de globina beta. Los resultados demuestran que mientras que los pares de TALEN individuales específicos usados en estos experimentos no fueron capaces de inducir un cambio en la expresión de globina gamma, la creación de deleciones por el uso de conjuntos de pares causó un aumento en la expresión relativa de globina gamma, corregida por la expresión de globina beta del adulto en este caso. En particular, la deleción del ADN secuenciado englobado por la globina gamma elevada hipersensible a DNAsa I 55 o 58, mientras que dicha elevación después de una deleción de la secuencia englobada por el sitio hipersensible a DNAsa I 62 no se detectó en este experimento. Obsérvese que la relación en el control de transfección de GFP fue 0,5 en este experimento.

La Figura 6 muestra los resultados de un análisis Taqman® para niveles de globina fetal como se describe en la Figura 4. En este conjunto de experimentos, se midieron los niveles de ARNm de globina beta y globina gamma, y así los datos representados es la relación entre gamma y beta y en comparación con la misma relación entre gamma/beta en células tratadas de control. Se usó una serie de pares de TALEN individuales para "atravesar" la región 58 del potenciador BCL11A. A diferencia de los experimentos previos donde se requirió una deleción de 400-900 pares de bases para observar un aumento en la expresión de gamma, los resultados representados en este experimento demostraron un único sitio (indicado por una flecha) que cuando se escindió causó ese aumento relativo. Los resultados de los pares de deleción están incluidos en este gráfico para su comparación. Véase la Figura 7 para la localización de sitios de escisión de los pares de TALEN en la región de interés.

La Figura 7 muestra los resultados de un análisis Taqman® como se describe en la Figura 4 usando pares de ZFN dirigidos a la región potenciadora 58. Se caracterizaron y usaron los niveles de globina beta y globina gamma para expresar la relación entre globina gamma y beta en comparación con la misma relación en células tratadas de control. Los datos muestran que la alteración impulsada por ZFN de la misma región identificada en el cribado de TALEN (Figura 6 y véase la Figura 8 a continuación)) produjeron un aumento en la expresión de globina gamma. Obsérvese que la relación en el control de transfección de GFP fue 2,6 en este experimento.

La Figura 8 muestra una representación de los sitios de unión (SEQ ID NO: 264 y SEQ ID NO: 265) de la región 58 de las TALEN específicas de potenciador (102852 y 102853) y ZFN (45843 y 45844), cuyo uso en HSPC humanas aumenta la expresión relativa de globina gamma después de la eritropoyesis in vitro. La secuencia mostrada es la forma bicatenaria de la secuencia de ADN que engloba la región 58 del potenciador BCL11A (SEQ ID NO: 363), y el sistema de numeración se refiere al propio 58. También se indica en la figura la localización de una correspondencia con el sitio de unión del factor de transcripción de GATA-1 (secuencia de locus, gtGATAAag, sitio GATA-1 consenso - swGATAAvv). Además, se indican los sitios de escisión de los pares de TALEN usados al "atravesar" 58, donde los números corresponden a las muestras usadas en los conjuntos de datos presentados en la Figura 6.

La Figura 9 muestra los resultados de un análisis Taqman® como se describe en la Figura 4 donde se hicieron una serie de TALEN para dirigir la región 55 del potenciador BCL11A. En este conjunto de experimentos, se caracterizaron los niveles de globina beta y globina gamma, y así los datos representados es la relación de gamma con respecto a beta y en comparación con la misma relación en células tratadas de control (que, en este experimento, fue 0,8). Los datos confirman que las mutaciones generadas en posiciones específicas dentro de la región 55 pueden aumentar la expresión relativa de globina gamma (véanse las flechas).

La Figura 10 es una representación de los sitios de escisión de la región 55 de TALEN específicos de potenciador como se muestra en la Figura 9. La secuencia mostrada es la forma bicatenaria de la secuencia de ADN que engloba la región 55 del potenciador BCL11A (SEQ ID NO: 254). Los números que destacan regiones de nucleótidos cortas indican los sitios de escisión probablemente inducidos por las muestras de TALEN enumeradas en la Figura 10. También se indica en la Figura 10 dos correspondencias con el sitio de unión consenso para el factor de transcripción de GATA-1.

La Figuras 11A a 11C muestran la secuencia de ADN de los tres sitios hipersensibles a DNAsa I dentro de la secuencia del potenciador BCL11A. Debido a que su identificación se realizó sondando regiones de cromatina accesible en células (véase Bauer et al., (2013) arriba), no se conocen los límites exactos de las regiones y se muestran límites aproximados. La Figura 11A muestra la secuencia de la región 55 (SEQ ID NO: 1), la Figura 11B muestra la secuencia de la región 58 (SEQ ID NO: 2) y la Figura 11C muestra la secuencia de la región 62 (SEQ ID NO: 3).

Las Figuras 12A a 12C muestran que la escisión impulsada por ZFN en células más próximas al núcleo de GATA-1 consenso eleva los niveles de globina fetal hasta un grado incluso mayor que la escisión más próxima al extremo 3' del motivo. La Figura 12A muestra un diagrama que representa los sitios de unión de los pares de ZFN específicos de Bell 1A en relación con la secuencia consenso de GATA-1 (Figura 12A) y representa una secuencia de ADN dentro de la región 58 que comprende la secuencia consenso de GATA-1 (SEQ ID NO: 255). Las barras encima y debajo de la secuencia de ADN indican los sitios de unión de las ZFN. La Figura 12B muestra la expresión relativa de globina gamma y globina beta como se mide por la expresión de ARNm después de HSPC humanas con ARNm que codifica las ZFN indicadas (véase Figura 12A), seguido por eritropoyesis in vitro y medición de niveles de globina fetal (véase la Figura 4). La relación observada cuando un ARNm que expresa GFP se transfectó en las células CD34+ fue 0,97. La Figura 12C representa en forma de "quesitos" las formas alélicas del potenciador BCL11A (en concreto, la región escindida por las ZFN mostradas en la Figura 12A) encontrado en HSPC humanas después de la electroporación con las ZFN indicadas. Mientras que niveles comparables de cromátidas sin modificar (no mutantes) se observan en las dos muestras, la muestra tratadas con ZFN que corta más cerca al motivo de GATA-1 contiene un mayor número de cromátidas que elimina el GATA-1 consenso (por ejemplo, el alelo ''-15'', que representa una deleción de 15 pares de bases). Los datos muestran que la escisión por los dos pares de z Fn que están más próximos al centro de la secuencia consenso de GATA-1 (pares 46801/46880 y 46923/46999) está asociada con una expresión elevada de la globina gamma.

La Figura 13 muestra que la alteración del conector entre el dedo de cinc y el resto FokI en ZFN usados para la edición del genoma del potenciador BCL11A afecta los niveles de globina fetal después de la eritropoyesis in vitro, a pesar de niveles comparables de cromátidas alteradas. Las HSPC humanas se sometieron a electroforesis con las ZFN indicadas (el conector usado en cada monómero de ZFN se indica entre paréntesis), e inmediatamente antes y después de la diferenciación eritroide in vitro, se midió el % de alelos alterados (mostrado debajo de cada muestra en forma de "X/Y", con el primer número correspondiente al % de indeles no naturales después de la electroporación, y el segundo número muestra resultados después de 14 días de la diferenciación eritroide in vitro). Se recogió ARNm completo y se midieron los niveles de globina fetal (normalizados a globina alfa).

La Figura 14 representa las secuencias de aminoácidos y de ADN para cuatro conectores (L0 (SEQ ID NO: 256 y 257), L7a (SEQ ID NO: 258 y 259), L7c5 (SEQ ID NO: 260 y 261) y L8c5 (SEQ ID NO: 262 y 263) usados en los diseños de ZFP. Las secuencias con un subrayado sólido indican la región del extremo carboxi del dominio de unión a ADN de ZFP, mientras que las secuencias indicadas con el subrayado de guiones indican la región de extremo amino del dominio de nucleasa de FokI. Las secuencias en negrita indican las novedosas secuencias añadidas al conector estándar L0.

Las Figuras 15A y 15B representan el porcentaje de células de origen humano, y la modificación genética dirigida en el sitio diana de nucleasa en estas células humanas, respectivamente, encontrado en la sangre periférica de ratones después del trasplante de células CD34+ humanas editadas. La Figura 15A es un gráfico que representa el porcentaje de células humanas en la periferia de ratón después del trasplante de células CD34+ humanas que se habían editado con dos conjuntos diferentes de ZFN 4 semanas después del trasplante. La Figura 15B representa el nivel de indeles detectados en las células humanas. Cada símbolo representa datos obtenidos de un ratón individual.

Las Figuras 16A a 16D representan el porcentaje de indeles inducidos por las nucleasas en células humanas que se diferenciaron de las células CD34+ trasplantadas originales 16 semanas después del trasplante. La Figura 16A muestra el nivel de actividad de indeles en células pan-mieloides, identificadas por la presencia del marcador CD33. La Figura 16B muestra la actividad en linfocitos B CD19+. La Figura 16C muestra la actividad en glyA o células eritroides, mientras que la Figura 16D muestra la actividad en células madre. Cada símbolo representa datos obtenidos de un ratón individual.

La Figura 17 muestra una serie de secuencias conectoras (SEQ ID NO: 265-275). Estos conectores pueden servir para unir el dominio de unión a ADN de dedos de cinc con el dominio de nucleasa FokI.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

En el presente documento se desvelan composiciones y métodos de ingeniería genómica para la modulación de BCL11A y/o la expresión de globina gamma y para el tratamiento y/o la prevención de hemoglobinopatías. En particular, la deleción dirigida mediada por nucleasa (es decir, ZFN, TALEN o el sistema CRISPR/Cas o TtAgo) de sitios específicos en una región de potenciador BCL11A se logra eficientemente en HSC/PC y da como resultado un cambio en la expresión relativa de la globina gamma durante la posterior eritropoyesis. Esta modulación de BCL11A y expresión de la globina gamma es particularmente útil para el tratamiento de hemoglobinopatías (por ejemplo, beta talasemias, drepanocitosis) en donde existe una expresión insuficiente de globina beta o expresión de una forma mutada de globina beta. Usando las composiciones de la invención, se pueden vencer las complicaciones y las secuelas relacionadas con la enfermedad causada por la globina beta aberrante por alteración de la expresión de globina gamma en células precursoras de eritrocitos.

Generalidades

La práctica de los métodos, así como la preparación y el uso de las composiciones desveladas en el presente documento, emplean, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales en la biología molecular, la bioquímica, la estructura y el análisis de cromatina, la química computacional, el cultivo celular, el ADN recombinante y campos relacionados, según la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y tercera edición, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE An d FUNCTION, tercera edición, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; y METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definiciones

Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan indistintamente y se refieren a un polímero de desoxirribonucleótido o ribonucleótido, en conformación lineal o circular, y en o forma mono- o bicatenaria. A efectos de la presente divulgación, estos términos no se deben interpretar como limitantes con respecto a la longitud de un polímero. Los términos pueden englobar análogos conocidos de nucleótidos naturales, así como nucleótidos que se modifican en los restos de base, azúcar y/o fosfato (por ejemplo, esqueletos de fosforotioato). En general, un análogo de un nucleótido particular tiene la misma especificidad por apareamiento de bases; es decir, un análogo de A se apareará con base con T.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. El término también se aplica a polímeros de aminoácido en los que uno o más aminoácidos son análogos químicos o derivados modificados de aminoácidos correspondientes naturales.

"Unión" se refiere a una interacción no covalente específica de secuencia entre macromoléculas (por ejemplo, entre una proteína y un ácido nucleico). No todos los componentes de una interacción de unión necesitan ser específicos de secuencia (por ejemplo, contactos con restos de fosfato en un esqueleto de ADN), en tanto que la interacción en conjunto sea específica de secuencia. Dichas interacciones se caracterizan, en general, por una constante de disociación (K^d) de 10-6 M-1 o más baja. "Afinidad" se refiere a la intensidad de la unión: correlacionándose una elevada afinidad de unión con una menor K^d .

Una "proteína de unión" es una proteína que es capaz de unirse a otra molécula. Una proteína de unión puede unirse а, por ejemplo, una molécula de ADN (una proteína de unión a ADN), una molécula de ARN (una proteína de unión a ARN) y/o una molécula de proteína (una proteína de unión a proteína). En el caso de una proteína de unión a proteína, puede unirse a ella misma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) y/o puede unirse a una o más moléculas de una proteína o proteínas diferentes. Una proteína de unión puede tener más de un tipo de actividad de unión. Por ejemplo, las proteínas de dedos de cinc tienen actividad de unión a ADN, unión a ARN y unión a proteína.

Una "proteína de unión a ADN de dedos de cinc" (o dominio de unión) es una proteína, o un dominio dentro de una proteína más grande, que se une a ADN en un modo específico de secuencia mediante uno o más dedos de cinc, que son regiones de la secuencia de aminoácidos dentro del dominio de unión cuya estructura se estabiliza mediante la coordinación de un ion cinc. El término proteína de unión a ADN de dedos de cinc se abrevia frecuentemente como proteína de dedos de cinc o ZFP.

Un "dominio de unión a ADN de TALE" o "TALE" es un polipéptido que comprende uno o más dominios/unidades de repetición de TALE. Los dominios de repetición participan en la unión de TALE con su secuencia de ADN diana relacionada. Una única "unidad repetida" (también denominada una "repetición") tiene normalmente 33-35 aminoácidos de longitud y presenta al menos cierta homología de secuencias con otras secuencias de repetición de TALE dentro de una proteína TALE natural.

Los dominio de unión de dedos de cinc y de TALE pueden ser "manipulados" para unirse a una secuencia de nucleótidos predeterminada, por ejemplo, por ingeniería (alterando uno o más aminoácidos) de la región de hélice de reconocimiento de una proteína de dedos de cinc natural o TALE. Por lo tanto, las proteínas de unión a ADN manipuladas (dedos de cinc o TALE) son proteínas que no existen de forma natural. Los ejemplos no limitantes de métodos de manipulación de proteínas de unión a a Dn son el diseño y la selección. Una proteína de unión a ADN designada es una proteína que no ocurre en la naturaleza cuyo diseño/composición resulta principalmente de criterios racionales. Los criterios racionales para el diseño incluyen la aplicación de reglas de sustitución y algoritmos computerizados para procesar información en una base de datos que guarda información de diseños de ZFP y/o TALE y datos de unión existentes. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261 y 8.585.526; véanse también los documento de patente WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

Una proteína de dedos de cinc o TALE "seleccionada" es una proteína que no se encuentra en la naturaleza cuya producción resulta principalmente de un proceso empírico, tal como presentación en fagos, trampa de interacción o selección de híbridos. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; б. 200.759; 8.586.526; documentos de patente WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084.

"TtAgo" es una proteína Argonaute procariota que se cree que participa en el silenciamiento génico. TtAgo deriva de las bacterias Thermus thermophilus. Véanse, por ejemplo, Swarts et al., arriba, G. Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111,652). Un "sistema TtAgo" es todos los componentes requeridos que incluyen, por ejemplo, ADN guía para la escisión por una enzima TtAgo.

"Recombinación" se refiere a un proceso de intercambio de información genética entre dos polinucleótidos, que incluyen, pero no se limitan a, captura de donantes por unión de extremos no homólogos (NHEJ) y recombinación homóloga. A efectos de la presente divulgación, "recombinación homóloga (HR)" se refiere a la forma especializada de dicho intercambio que tiene lugar, por ejemplo, durante la reparación de roturas bicatenarias en células por mecanismos de reparación dirigidos por homología. Este proceso requiere homología de secuencias de nucleótidos, usa una molécula "donante" para reparar con molde una molécula "diana" (es decir, la que sufre la rotura bicatenaria), y se conoce de diversas formas como "conversión génica no cruzada" o "conversión génica de tramos cortos", debido a que conduce a la transferencia de información genética del donante a la diana. Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, dicha transferencia puede implicar la corrección de apareamientos erróneos del ADN de heterodúplex que se forma entre la diana rota y el donante, y/o la "hibridación de cadenas dependiente de síntesis", en la que el donante se usa para volver a sintetizar información genética que será parte de la diana, y/o procesos relacionados. Dicha HR especializada produce frecuentemente una alteración de la secuencia de la molécula diana de forma que parte o toda la secuencia del polinucleótido donante se incorpora en el polinucleótido diana.

En los métodos de la divulgación, una o más nucleasas dirigidas como se describe en el presente documento crean una rotura bicatenaria (DSB) en la secuencia diana (por ejemplo, cromatina celular) en un sitio predeterminado. La DSB puede producir deleciones y/o inserciones por reparación dirigida por homología o por mecanismos de reparación no dirigidos por homología. Las deleciones pueden incluir cualquier número de pares de bases. Similarmente, las inserciones pueden incluir cualquier número de pares de bases, que incluyen, por ejemplo, integración de un polinucleótido "donante", que opcionalmente tiene homología con la secuencia de nucleótidos en la región de la rotura. La secuencia donante puede estar físicamente integrada o, alternativamente, el polinucleótido donante se usa como molde para la reparación de la rotura por recombinación homóloga, dando como resultado la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos como en el donante en la cromatina celular. Así, se puede alterar una primera secuencia en la cromatina celular y, en ciertas realizaciones, se puede convertir en una secuencia presente en un polinucleótido donante. Así, se puede entender que el uso de los términos "sustituir" o "sustitución" representa la sustitución de una secuencia de nucleótidos por otra (es decir, la sustitución de una secuencia en el sentido de información), y no requiere necesariamente sustitución física o química de un polinucleótido por otro.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, se pueden usar pares adicionales de proteínas de dedos de cinc o TALEN para la escisión bicatenaria adicional de sitios diana adicionales dentro de la célula.

Se puede usar cualquiera de los métodos descritos en el presente documento para la inserción de un donante de cualquier tamaño y/o inactivación parcial o completa de una o más secuencias diana en una célula por integración dirigida de secuencia donante que altera la expresión del gen(es) de interés. También se desvelan estirpes celulares con genes parcialmente o completamente inactivados.

En cualquiera de los métodos descritos en el presente documento, la secuencia de nucleótidos exógenos (la "secuencia donante" o "transgén") puede contener secuencias que son homólogas, pero no idénticas, a las secuencias genómicas en la región de interés, lo que estimula así la recombinación homóloga para insertar una secuencia no idéntica en la región de interés. Así, en ciertas realizaciones, las porciones de la secuencia donante que son homólogas a las secuencias en la región de interés presentan entre aproximadamente el 80 y el 99 % (o cualquier número entero intermedio) de identidad de secuencia con la secuencia genómica que se sustituye. En otras realizaciones, la homología entre la secuencia donante y genómica es superior al 99 %, por ejemplo, si solo 1 nucleótido se diferencia como entre el donante y las secuencias genómicas de más de 100 pares de bases contiguos. En ciertos casos, una porción no homóloga de la secuencia donante puede contener secuencias no presentes en la región de interés, de forma que se introducen nuevas secuencias en la región de interés. En estos casos, la secuencia no homóloga está flanqueada, en general, por secuencias de 50-1.000 pares de bases (o cualquier valor entero intermedio) o cualquier número de pares de bases superior a 1.000, que son homólogos o idénticos a las secuencias en la región de interés. En otras realizaciones, la secuencia donante no es homóloga a la primera secuencia, y se inserta en el genoma por mecanismos de recombinación no homóloga.

"Escisión" se refiere a la rotura del esqueleto covalente de una molécula de ADN. La escisión se puede iniciar mediante una variedad de métodos que incluyen, pero no se limitan a, hidrólisis enzimática o química de un enlace fosfodiéster. Son posibles tanto la escisión monocatenaria como la escisión bicatenaria, y la escisión bicatenaria puede ocurrir como resultado de dos acontecimientos de escisión monocatenaria distintos. La escisión de ADN puede producir la producción de o extremos romos o extremos escalonados. En ciertas realizaciones, se usan polipéptidos de fusión para la escisión de ADN bicatenario dirigida.

Una "mitad de dominio de escisión" es una secuencia de polipéptidos que, junto con un segundo polipéptido (ya sea idéntico o diferente), forma un complejo que tiene actividad de escisión (preferentemente actividad de escisión bicatenaria). Los términos "primera y segunda mitades de dominio de escisión", "mitades de dominio de escisión y " y "mitades de dominio de escisión derecha e izquierda " se usan indistintamente para referirse a pares de mitades de dominio de escisión que dimerizan.

Una "mitad de dominio de escisión manipulada" es la mitad de dominio de escisión que ha sido modificada para formar heterodímeros obligados con otra mitad de dominio de escisión (por ejemplo, otra mitad de dominio de escisión manipulada). Véanse, por tanto, las publicaciones de patente de EE. Uu . N.° 2005/0064474, 20070218528, 20080131962 y 20110201055.

El término "secuencia" se refiere a una secuencia de nucleótidos de cualquier longitud, que puede ser ADN o ARN; puede ser linear, circular o ramificada, y puede ser o monocatenaria o bicatenaria. El término "secuencia donante" se refiere a una secuencia de nucleótidos que se inserta en un genoma. Una secuencia donante puede ser de cualquier longitud, por ejemplo, entre 2 y 100.000.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor entero intermedio o por encima), preferentemente entre aproximadamente 100 y 100.000 nucleótidos de longitud (o cualquier número entero intermedio), más preferentemente entre aproximadamente 2000 y 20.000 nucleótidos de longitud (o cualquier valor intermedio), e incluso más preferible entre aproximadamente 5 y 15 kb (o cualquier valor intermedio).

"Cromatina" es la estructura de nucleoproteína que comprende el genoma celular. La cromatina celular comprende ácido nucleico, principalmente ADN, y proteína, que incluye histonas y proteínas cromosómicas no de histona. La mayor parte de la cromatina celular eucariota existe en forma de nucleosomas, en donde un núcleo de nucleosoma comprende aproximadamente 150 pares de bases de ADN asociados a un octámero que comprende dos de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4; y el ADN de conector (de longitud variable dependiendo del organismo) se extiende entre núcleos del nucleosoma. Una molécula de histona H1 se asocia, en general, con el ADN conector. A efectos de la presente divulgación, el término "cromatina" indica que engloba todos los tipos de nucleoproteína celular, tanto procariota como eucariota. La cromatina celular incluye tanto cromatina cromosómica como episómica.

Un "cromosoma" es un complejo de cromatina que comprende todo o una porción del genoma de una célula. El genoma de una célula se caracteriza frecuentemente por su cariotipo, que es el conjunto de todos los cromosomas que comprenden el genoma de la célula. El genoma de una célula puede comprender uno o más cromosomas.

Un "episoma" es un ácido nucleico replicante, complejo de nucleoproteína u otra estructura que comprende un ácido nucleico que no es parte del cariotipo cromosómico de una célula. Los ejemplos de episomas incluyen plásmidos y ciertos genomas víricos.

Una "región accesible" es un sitio en la cromatina celular en la que un sitio diana presente en el ácido nucleico se pueden unir por una molécula exógena que reconoce el sitio diana. Sin desear quedar ligado a teoría particular alguna, se cree que una región accesible es una que no está encapsidada en una estructura nucleosómica. La estructura distinta de una región accesible se puede detectar frecuentemente por su sensibilidad a sondas químicas y enzimáticas, por ejemplo, nucleasas.

Un "sitio diana" o "secuencia diana" es una secuencia del ácido nucleico que define una porción de un ácido nucleico con la que se unirá una molécula de unión, proporcionado condiciones suficientes para que exista la unión.

Una molécula "exógena" es una molécula que no está normalmente presente en una célula, pero se puede introducir en una célula por uno o más métodos genéticos, bioquímicos u otros. La "presencia normal en la célula" se determina con respecto al estadio de desarrollo particular y a las condiciones medioambientales de la célula. Así, por ejemplo, una molécula que está presente solo durante el desarrollo embrionario de músculo es una molécula exógena con respecto a una célula de musculo adulto. Similarmente, una molécula inducida por choque térmico es una molécula exógena con respecto a una célula no de choque térmico. Una molécula exógena puede comprender, por ejemplo, una versión funcionante de una molécula endógena malfuncionante o una versión malfuncionante de una molécula endógena normalmente funcionante.

Una molécula exógena puede ser, entre otras cosas, una molécula pequeña, tal como se genera por un proceso de química combinatoria, o una macromolécula, tal como una proteína, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, glucoproteína, lipoproteína, polisacárido, cualquier derivado modificado de las moléculas anteriores, o cualquier complejo que comprenda una o más de las moléculas anteriores. Los ácidos nucleicos incluyen ADN y ARN, pueden ser mono- o bicatenarios; pueden ser lineales, ramificados o circulares; y pueden ser de cualquier longitud. Los ácidos nucleicos incluyen los capaces de formar dúplex, así como ácidos nucleicos formadores de tríplex. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 5.176.996 y 5.422.251. Las proteínas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de unión a ADN, factores de transcripción, factores de remodelación de cromatina, proteínas de unión a ADN metiladas, polimerasas, metilasas, desmetilasas, acetilasas, desacetilasas, cinasas, fosfatasas, integrasas, recombinasas, ligasas, topoisomerasas, girasas y helicasas.

Una molécula exógena puede ser del mismo tipo de molécula que una molécula endógena, por ejemplo, una proteína exógena o ácido nucleico. Por ejemplo, un ácido nucleico exógeno puede comprender un genoma vírico infectante, un plásmido o episoma introducido en una célula, o un cromosoma que normalmente no está presente en la célula. Los métodos de introducción de moléculas exógenas en las células son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, que incluyen lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión de células, bombardeo con partículas, co-precipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vector vírico. Una molécula exógena también pueden ser el mismo tipo de molécula que una molécula endógena, pero derivada de una especie diferente de la que deriva la célula. Por ejemplo, una secuencia del ácido nucleico humana se puede introducir en una estirpe celular derivada originalmente de un ratón o hámster. Los métodos para la introducción de moléculas exógenas en células vegetales son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, transformación de protoplastos, carburo de silicio (por ejemplo, WHISKERS™), transformación mediada por Agrobacterium, transferencia mediada por lípidos (es decir, liposomas, que incluyen lípidos neutros y catiónicos), electroporación, inyección directa, fusión de células, bombardeo con partículas (por ejemplo, usando una "pistola de genes"), coprecipitación con fosfato de calcio, transferencia mediada por DEAE-dextrano y transferencia mediada por vector vírico.

Por el contrario, una molécula "endógena" es una que normalmente está presente en una célula particular en un estadio de desarrollo particular en condiciones medioambientales particulares. Por ejemplo, un ácido nucleico endógeno puede comprender un cromosoma, el genoma de una mitocondria, cloroplasto u otro orgánulo, o un ácido nucleico episómico natural. Las moléculas endógenas adicionales pueden incluir proteínas, por ejemplo, factores de transcripción y enzimas.

Como se usa en el presente documento, el término "producto de un ácido nucleico exógeno" incluye tanto los productos de polinucleótido como de polipéptido, por ejemplo, productos de transcripción (polinucleótidos tales como ARN) y productos de traducción (polipéptidos).

Una molécula de "fusión" es una molécula en la que se unen dos o más moléculas de subunidad, preferentemente covalentemente. Las moléculas de subunidad pueden ser del mismo tipo de molécula química, o pueden ser de un tipo químico diferente de molécula. Los ejemplos del primer tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, proteínas de fusión (por ejemplo, una fusión entre un dominio de unión a ADN de ZFP o de TALE y uno o más dominios de activación) y ácidos nucleicos de fusión (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica la proteína de fusión descrita arriba). Los ejemplos del segundo tipo de molécula de fusión incluyen, pero no se limitan a, a fusión entre un ácido nucleico formador de tríplex y un polipéptido, y una fusión entre un ligando de unión al surco menor y un ácido nucleico.

La expresión de una proteína de fusión en una célula puede resultar de la administración de la proteína de fusión a la célula o de la administración de un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en donde el polinucleótido se transcribe, y el transcrito se traduce, para generar la proteína de fusión. El corte y empalme en trans, la escisión de polipéptidos y la ligación de polipéptidos también pueden participar en la expresión de una proteína en una célula. Los métodos para la administración de polinucleótidos y polipéptidos a células se presentan en cualquier parte en la presente divulgación.

Un "gen", a efectos de la presente divulgación, incluye una región de ADN que codifica un producto génico (véase abajo), así como todas las regiones de ADN que regulan la producción del producto génico, tanto si dichas secuencias reguladoras son adyacente, como si no a secuencias codificantes y/o transcritas. Por consiguiente, un gen incluye, pero no se limita necesariamente a, secuencias promotoras, terminadores, secuencias reguladoras de la traducción, tales como sitios de unión al ribosoma y sitios internos de entrada al ribosoma, potenciadores, silenciadores, aislantes, aisladores de la cromatina, orígenes de replicación, sitios de fijación de la matriz y regiones de control de locus.

"Expresión génica" se refiere a la conversión de la información, contenida en un gen, en un producto génico. Un producto génico puede ser el producto transcripcional directo de un gen (por ejemplo, ARNm, ARNt, ARNr, ARN antisentido, ribozima, ARN estructural o cualquier otro tipo de ARN) o una proteína producida por traducción de un ARNm. Los productos génicos también incluyen ARN que se modifican por procesos tales como encapuchado, poliadenilación, metilación y edición, y proteínas modificadas por, por ejemplo, metilación, acetilación, fosforilación, ubiquitinación, ADP-ribosilación, miristoilación y glucosilación.

"Modulación" de la expresión génica se refiere a un cambio en la actividad de un gen. La modulación de la expresión puede incluir, pero no se limita a, activación génica y represión génica. La edición del genoma (por ejemplo, escisión, alteración, inactivación, mutación aleatoria) se puede usar para modular la expresión. La inactivación génica se refiere a cualquier reducción en la expresión génica en comparación con una célula que no incluye una ZFP, TALE o sistema CRISPR/Cas como se describe en el presente documento. Así, la inactivación génica puede ser parcial o completa.

Un ARNm "protegido" es uno en el que el ARNm ha sido alterado en cierta manera para aumentar la estabilidad o traducción del ARNm. Los ejemplos de protecciones incluyen el uso de sustitución de hasta el 25 % de los restos de citodina y uridina con 2-tiouridina (s2U) y 5-metilcitidina (m5C). El ARNm resultante presenta menos inmunogenicidad y más estabilidad en comparación con su homólogo sin modificar (véase Karikó et al. ((2012), Molecular Therapy, Vol.

16, No. 11, páginas 1833 - 1844). Otros cambios incluyen la adición de una llamada caperuza ARCA, que aumenta la traduccionabilidad del ARNm producido in vitro (véase la patente de EE. UU. US7074596).

Una "región de interés" es cualquier región de cromatina celular, tal como, por ejemplo, un gen o una secuencia no codificante dentro de o adyacente a un gen, en la que se desea unir conveniente a una molécula exógena. La unión puede ser para los fines de escisión de ADN dirigida y/o recombinación dirigida. Una región de interés puede estar presente en, por ejemplo, un cromosoma, un episoma, un genoma organular (por ejemplo, mitocondrial, cloroplasto), o un genoma vírico infectante. Una región de interés puede estar dentro de la región codificante de un gen, dentro de regiones no codificantes transcritas, tales como, por ejemplo, secuencias conductoras, secuencias remolque o intrones, o dentro de regiones no transcritas, ya sea en la dirección 5' o en la dirección 3' de la región codificante. Una región de interés puede ser tan pequeña como un único par de nucleótidos, o de hasta 2.000 pares de nucleótidos de longitud, o cualquier valor entero de pares de nucleótidos.

Las células "eucariotas" incluyen, pero no se limitan a, células fúngicas (tales como levadura), células vegetales, células animales, células de mamífero y células humanas (por ejemplo, linfocitos T).

Los términos "enlace operativo" y "operativamente unido" (u "operablemente unido") se usan indistintamente con referencia a una yuxtaposición de dos o más componentes (tales como elementos de secuencia), en los que los componentes están dispuestos de forma que ambos componentes funcionen en condiciones normales y permitan la posibilidad de que al menos uno de los componentes pueda mediar en una función que es ejercida sobre al menos uno de los otros componentes. A modo de ilustración, una secuencia reguladora transcripcional, tal como un promotor, se une operativamente a una secuencia codificante si la secuencia reguladora transcripcional controla el nivel de transcripción de la secuencia codificante en respuesta a la presencia o ausencia de uno o más factores reguladores transcripcionales. Una secuencia reguladora transcripcional, en general, se une operativamente en cis con una secuencia codificante, pero no necesita ser directamente adyacente a ella. Por ejemplo, un potenciador es una secuencia reguladora transcripcional que está operativamente unida a una secuencia codificante, aún cuando no estén contiguos.

Con respecto a los polipéptidos de fusión, el término "operativamente unido" puede referirse al hecho de que cada uno de los componentes realiza la misma función en el enlace con el otro componente como si no estuvieran así unidos. Por ejemplo, con respecto a un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas está fusionado con un dominio de activación, el dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas y el dominio de activación están en un enlace operativo si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión de ADN de ZFP, TALE o Cas es capaz de unirse a su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de activación es capaz de regular por incremento la expresión génica. Cuando un polipéptido de fusión en el que un dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas se fusiona con un dominio de escisión, el dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas y el dominio de escisión están en enlace operativo si, en el polipéptido de fusión, la porción del dominio de unión a ADN de ZFP, TALE o Cas es capaz de unir su sitio diana y/o su sitio de unión, mientras que el dominio de escisión es capaz de escindir el ADN en la proximidad del sitio diana.

Un "fragmento funcional" de una proteína, polipéptido o ácido nucleico es una proteína, polipéptido o ácido nucleico cuya secuencia no es idéntica a la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa, pero retiene la misma función que la proteína, polipéptido o ácido nucleico de longitud completa. Un fragmento funcional puede poseer más, menos, o el mismo número de restos que la molécula nativa correspondiente, y/o puede contener una o más sustituciones de aminoácidos o de nucleótidos. Los métodos de determinación de la función de un ácido nucleico (por ejemplo, función codificante, capacidad de hibridarse con otro ácido nucleico) se conocen bien en la técnica. Similarmente, los métodos para determinar la función de proteína son bien conocidos. Por ejemplo, la función de unión a ADN de un polipéptido se puede determinar, por ejemplo, por unión a filtro, desplazamiento por movilidad electroforética, o ensayos de inmunoprecipitación. La escisión del ADN se puede ensayar por electroforesis en gel. Véase Ausubel et al., arriba. La capacidad de una proteína para interactuar con otra proteína se puede determinar, por ejemplo, por co-inmunoprecipitación, ensayos de dos híbridos o complementación, tanto genética como bioquímica. Véanse, por ejemplo, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; patente de EE. UU. N.° 5.585.245 y documento PCT WO 98/44350.

Un "vector" es capaz de transferir secuencias de genes a células diana. Normalmente, la "construcción de vector", el "vector de expresión" y el "vector de transferencia génica" significan cualquier construcción de ácidos nucleicos capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir las secuencias de genes a células diana. Así, el término incluye la clonación y la expresión vehículos, así como la integración de vectores.

Los términos "sujeto" y "paciente" se usan indistintamente y se refieren a mamíferos, tales como pacientes humanos y primates no humanos, así como a animales experimentales, tales como conejos, perros, gatos, ratas, ratones y otros animales. Por consiguiente, el término "sujeto" o "paciente", como se usa en el presente documento, significa cualquier paciente o sujeto mamífero al que se le pueden administrar las células madre de la invención. Los sujetos de la presente invención incluyen los que se han expuesto a una o más toxinas químicas, que incluyen, por ejemplo, una toxina nerviosa.

"Pluripotencialidad" se refiere a la capacidad relativa de cualquier célula para actuar en un modo similar a célula madre, es decir, el grado de toti-, pluri- u oligopotencia y autorrenovación expandida o indefinida que puede tener una célula madre particular.

Nucleasas

En el presente documento se describen composiciones, particularmente nucleasas, que son útiles para la escisión in vivo de una molécula donante que lleva un transgén y nucleasas para la escisión del genoma de una célula de forma que el transgén se integre en el genoma en un modo dirigido. En ciertas realizaciones, una o más de las nucleasas existen de forma natural. En otras realizaciones, una o más de las nucleasas no existen de forma natural, es decir, están manipuladas en el dominio de unión a ADN y/o dominio de escisión. Por ejemplo, se puede alterar el dominio de unión a ADN de una nucleasa natural para unirse a un sitio diana seleccionado (por ejemplo, una meganucleasa que se ha manipulado para unirse a un sitio diferente del sitio de unión relacionado). En otras realizaciones, la nucleasa comprende dominios de unión a ADN heterólogo y de escisión (por ejemplo, nucleasas de dedos de cinc; proteínas de unión a ADN de dominio efector de TAL; dominios de unión a ADN de meganucleasa con dominios de escisión heterólogos).

A. Dominios de unión a ADN

En ciertas realizaciones, la composición y los métodos descritos en el presente documento emplean un dominio de unión a ADN de meganucleasa (endonucleasa de asentamiento) para unirse a la molécula donante y/o unirse a la región de interés en el genoma de la célula. Las meganucleasas naturales reconocen sitios de escisión de 15-40 pares de bases y se agrupan comúnmente en cuatro familias: la familia LAGLIDADG, la familia GIY-YIG, la familia de la caja His-Cyst y la familia HNH. Las endonucleasas de asentamiento a modo de ejemplo incluyen I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-7evI, I-7evII y I-7evIII. Se conocen sus secuencias de reconocimiento. Véanse también la patente de EE. UU. N.° 5.420.032; la patente de EE. UU. N.° 6.833.252; Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs.

En ciertas realizaciones, los métodos y las composiciones descritas en el presente documento hacen uso de una nucleasa que comprende una endonucleasa de asentamiento manipulada (que no existen de forma natural) (meganucleasa). Se conocen secuencias de reconocimiento de las endonucleasas de asentamiento y las meganucleasas, tales como I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-^{7evI, I-7evII y I-7evIII. Véanse también la patente de EE. UU. N.° 5.420.032; la patente de} eE. Uu. ^{N.° 6.833.252;} Belfort et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 y el catálogo de New England Biolabs. Además, la especificidad de unión al ADN de las endonucleasas de asentamiento y las meganucleasas se puede manipular para que se unan a sitios diana no naturales. Véanse, por ejemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; publicación de patente de EE. UU. N.° 20070117128. Los dominios de unión a ADN de las endonucleasas de asentamiento y las meganucleasas se pueden alterar en el contexto de la nucleasa en conjunto (es decir, de forma que la nucleasa incluya el dominio de escisión relacionado) o se pueden fusionar con un dominio de escisión heterólogo.

En otras realizaciones, el dominio de unión a ADN de una o más de las nucleasas usadas en los métodos y las composiciones descritas en el presente documento comprende un dominio de unión a ADN efector de TAL natural o manipulado (que no existen de forma natural). Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.586.526. Se sabe que las bacterias patógenas de plantas del género Xanthomonas provocan muchas enfermedades en las plantas de cultivo importantes. La patogenicidad de Xanthomonas depende de un sistema de secreción de tipo III conservado (T3S) que inyecta más de 25 proteínas efectoras diferentes en la célula de la planta. Entre estas proteínas inyectadas están los efectos de tipo activador de la transcripción (TAL) que imitan los activadores transcripcionales de la planta y manipulan el transcriptoma de la planta (véase Kay et al., (2007) Science 318:648-651). Estas proteínas contienen un dominio de unión a ADN y un dominio de activación transcripcional. Uno de los efectores de TAL mejor caracterizados es AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (véase Bonas et al., (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 y el documento de patente WO2010079430). Los efectores de TAL contienen un dominio centralizado de repeticiones en tándem, conteniendo cada repetición aproximadamente 34 aminoácidos, que son clave para la especificidad de unión a ADN de estas proteínas. Además, contienen una secuencia de localización nuclear y un dominio de activación transcripcional ácido (para una revisión véase Schornack S, et al., (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Además, en las bacterias fitopatógenas Ralstonia solanacearum se han encontrado dos genes, designados brg11 y hpx17, que son homólogos para la familia AvrBs3 de Xanthomonas en la cepa de biovar 1 de R. solanacearum GMI1000 y en la cepa de biovar 4 RS1000 (véase Heuer et al., (2007) Appl and Envir Micro 73(13): 4379-4384). Estos genes son 98,9 % idénticos en secuencia de nucleótidos entre sí pero se diferencian por una deleción de 1.575 pares de bases en el dominio de repetición de hpx17. Sin embargo, ambos productos génicos tienen menos del 40 % de identidad de secuencia con proteínas de la familia AvrBs3 de Xanthomonas. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.586.526.

La especificidad de estos efectores de TAL depende de las secuencias encontradas en las repeticiones en tándem. La secuencia repetida comprende aproximadamente 102 pares de bases (pb) y las repeticiones son normalmente 91­ 100 % homólogas entre sí (Bonas et al., arriba). El polimorfismo de las repeticiones se sitúa normalmente en las posiciones 12 y 13 y parece ser una correspondencia uno a uno entre la identidad de los dirrestos hipervariables (RVD) en las posiciones 12 y 13 con la identidad de los nucleótidos contiguos en la secuencia diana del efector de TAL (véase Moscou y Bogdanove, (2009) Science 326:1501 y Boch et al., (2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, el código natural para el reconocimiento de ADN de estos efectores de TAL se ha determinado de forma que una secuencia de HD en las posiciones 12 y 13 conduzca a una unión a citosina (C), NG se une a T, NI a A, C, G o T, NN se une a A o G, e ING se une a T. Estas repeticiones de unión a ADN se han ensamblado en proteínas con las nuevas combinaciones y números de repeticiones, para hacer factores de transcripción artificiales que son capaces de interactuar con secuencias nuevas y activar la expresión de un gen indicador no endógeno en células vegetales (Boch et al., arriba). Las proteínas TAL manipuladas se han asociado a una mitad de dominio de escisión de FokI para dar una fusión de nucleasas efectoras de dominio de TAL (TALEN) que presenta actividad en un ensayo indicador de levadura (diana basada en plásmido). Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. N.° 8.586.526; Christian et al., ((2010)<Genetics epub 10.1534/genetics,110.120717). En ciertas realizaciones, el dominio de TALE comprende una caperuza de N y/o caperuza de C como se describe en la patente de EE. UU. N.° 8.586.526.

En ciertas realizaciones, el dominio de unión a ADN de una o más de las nucleasas usadas para la escisión in vivo y/o escisión dirigida del genoma de una célula comprende una proteína de dedos de cinc. Preferentemente, la proteína de dedos de cinc no existe de forma natural, ya que se manipula para unirse a un sitio diana de elección. Véase, por ejemplo, véase, por ejemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem.

70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; patentes de EE. UU. N.26.453.242; 6.534.261; 6.599.692; 6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054; 7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; y las publicaciones de patente de EE. UU. N.22005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

Un dominio de unión de dedos de cinc manipulado puede tener una novedosa especificidad de unión, en comparación con una proteína de dedos de cinc natural. Los métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y diversos tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos de dedos de cinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos triplete o cuadruplete está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de cinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. del mismo solicitante 6.453.242 y 6.534.261.

Los métodos de selección a modo de ejemplo, que incluyen presentación en fagos y sistemas de dos híbridos, se desvelan en las patentes de EE. UU. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como los documentos de patente WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, se ha descrito la mejora de la especificidad de unión por dominios de unión de dedos de cinc, por ejemplo, en el documento de patente del mismo solicitante WO 02/077227.

Además, como se desvela en estas y otras referencias, se pueden unir los dominios de dedos de cinc y/o las proteínas de dedos de cinc de múltiples dedos usando secuencias conectoras adecuadas, que incluyen, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos de longitud. Véanse, por tanto, las patentes de EE. UU. N° 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949 para secuencias conectoras a modo de ejemplo de 6 o más aminoácidos de longitud. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los dedos de cinc individuales de la proteína.

Los expertos en la técnica conocen la selección de sitios diana; ZFP y métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que los codifican) y se describen en detalle en las patentes de EE. UU. N° 6.140.081; 5.789.538; 6.453.242; 6.534.261; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; documentos de patente WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 y WO 03/016496.

Se puede usar casi cualquier conector (espaciador) entre el uno o más de los componentes del dominio de unión a ADN (por ejemplo, dedos de cinc), entre uno o más dominios de unión a ADN y/o entre el dominio de unión a ADN y el dominio funcional (por ejemplo, nucleasa). Los ejemplos no limitantes de secuencias conectoras adecuadas incluyen las patentes de EE. UU. N28.772.453; 7.888.121; 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949; la publicación de EE. UU. N.2 20090305419) y la publicación de EE. UU. N.° 14/471.782. Así, las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre los componentes de unión al ADN individuales y/o entre el dominio de unión a ADN y el dominio funcional de las composiciones descritas en el presente documento.

El locus de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas), que codifica componentes del sistema de ARN, y el locus cas (asociado a CRISPR), que codifica proteínas (Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1: e60) constituyen las secuencias génicas del sistema de CRISPR/nucleasa Cas. Los loci de CRISPR en los hospedadores microbianos contienen una combinación de genes asociados a CRISPR (Cas), así como elementos de ARN no codificantes capaces de programar la especificidad de la escisión de ácido nucleico mediada por CRISPR.

El CRISPR de tipo II es uno de los sistemas mejor caracterizados y lleva a cabo la rotura bicatenaria de ADN dirigido en cuatro etapas secuenciales. Primero, dos a Rn no codificantes, la matriz pre-ARNcr y el ARNtracr, se transcriben del locus de CRISPR. Segundo, se hibrida el ARNtracr con las regiones de repetición del pre-ARNcr y media en el procesamiento de pre-ARNcr en ARNcr maduros que contienen secuencias espaciadoras individuales. Tercero, el complejo maduro de ARNcr:ARNtracr dirige la Cas9 al ADN diana por el apareamiento de bases de Watson-Crick entre el espaciador en el ARNcr y el protoespaciador en el ADN diana a continuación del motivo adyacente de protoespaciador (PAM), un requisito adicional para el reconocimiento de dianas. Finalmente, la Cas9 media en la escisión de ADN diana para crear una rotura bicatenaria dentro del protoespaciador. La actividad del sistema CRISPR/Cas comprende tres etapas: (i) inserción de secuencias de ADN extrañas en la matriz de CRISPR para prevenir futuros ataques, en un proceso denominado 'adaptación', (ii) expresión de las proteínas relevantes, así como expresión y procesamiento de la matriz, seguido por (iii) interferencia mediada por ARN con el ácido nucleico extraño. Así, en la célula bacteriana, varias de las denominadas proteínas 'Cas' participan en la función natural del sistema de CRISPR/Cas y desempeñan funciones tales como la inserción del ADN extraño, etc.

En ciertas realizaciones, la proteína Cas puede ser un "derivado funcional" de una proteína Cas natural. Un "derivado funcional" de un polipéptido de secuencia nativa es un compuesto que tiene una propiedad biológica cualitativa en común con un polipéptido de secuencia nativa. Los "derivados funcionales" incluyen, pero no se limitan a, fragmentos de una secuencia nativa y derivados de un polipéptido de secuencia nativa y sus fragmentos, a condición de que tengan una actividad biológica en común con un polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Una actividad biológica contemplada en el presente documento es la capacidad del derivado funcional para hidrolizar un sustrato de ADN en fragmentos. El término "derivado" engloba tanto las variantes de la secuencia de aminoácidos de polipéptido, modificaciones covalentes, como sus fusiones. Los derivados adecuados de un polipéptido Cas o un fragmento del mismo incluyen, pero no se limitan a, mutantes, fusiones, modificaciones covalentes de la proteína Cas o un fragmento de la misma. La proteína Cas, que incluye la proteína Cas o un fragmento de la misma, así como derivados de la proteína Cas o un fragmento de la misma, se puede obtener de una célula o sintetizar químicamente o por una combinación de estos dos procedimientos. La célula puede ser una célula que produce naturalmente proteína Cas, o una célula que produce naturalmente proteína Cas y se manipula genéticamente para producir la proteína Cas endógena a un nivel más alto de expresión, o para producir una proteína Cas de un ácido nucleico exógenamente introducido, ácido nucleico que codifica una Cas que es la misma o diferente del Cas endógeno. En algún caso, la célula no produce naturalmente la proteína Cas y se manipula genéticamente para producir una proteína Cas.

En algunas realizaciones, el dominio de unión a ADN es parte de un sistema TtAgo (véase Swarts et al., arriba; Sheng et al., arriba). En eucariotas, el silenciamiento génico está mediado por la familia de proteínas Argonaute (Ago). En este paradigma, Ago se añade a ARN pequeños (19-31 nt). Este complejo de silenciamiento de proteína-ARN reconoce ARN diana por apareamiento de bases de Watson-Crick entre el ARN pequeño y la diana y escinde endonucleolíticamente el ARN diana (Vogel (2014) Science 344:972-973). A diferencia, las proteínas Ago procariotas se unen a fragmentos de ADN monocatenario pequeños y probablemente funcionan detectando y retirando ADN extraño (frecuentemente vírico) (Yuan et al., (2005) Mol. Cell 19, 405; Olovnikov, et al. (2013) Mol. Cell 51,594; Swarts et al., arriba). Las proteínas Ago procariotas a modo de ejemplo incluyen las de Aquifex aeolicus, Rhodobacter sphaeroides y Thermus thermophilus.

Una de las proteínas Ago procariotas mejor caracterizadas es la de T. thermophilus (TtAgo; Swarts et al. arriba). TtAgo se asocia con fragmentos de ADN monocatenario de 15 nt o 13-25 nt con grupos fosfato en 5'. Este "ADN guía" unido por TtAgo sirve para dirigir el complejo de proteína-ADN para la unión a una secuencia complementaria de ADN de Watson-Crick en una tercera molécula de ADN. Una vez la información de secuencia en estos ADN guía ha permitido la identificación del ADN diana, el complejo TtAgo-ADN guía escinde el ADN diana. Dicho mecanismo también está soportado por la estructura del complejo de TtAgo-ADN guía mientras está unido a su ADN diana (G. Sheng et al., arriba). Ago de Rhodobacter sphaeroides (RsAgo) tiene propiedades similares (Olivnikov et al. arriba).

Los ADN guía exógenos de secuencia de ADN arbitraria se pueden cargar en la proteína TtAgo (Swarts et al. arriba). Puesto que la especificidad de la escisión de TtAgo está dirigida por el ADN guía, un complejo TtAgo-ADN formado por un ADN guía exógeno especificado por el investigador dirigirá, por lo tanto, la escisión del ADN diana de TtAgo a un ADN diana complementario especificado por el investigador. De esta forma, se puede crear una rotura bicatenaria dirigida en el ADN. El uso del sistema TtAgo-ADN guía (o sistemas ortólogos de Ago-ADN guía de otros organismos) permite la escisión de ADN genómico dirigida dentro de las células. Dicha escisión puede ser o mono- o bicatenaria. Para la escisión de ADN genómico de mamífero, sería preferible usar una versión de codón de TtAgo optimizado para la expresión en células de mamífero. Además, podría ser preferible tratar células con un complejo de TtAgo-ADN formado in vitro donde la proteína TtAgo está fusionada con un péptido que penetra en la célula. Además, podría ser preferible usar una versión de la proteína TtAgo que ha sido alterada por mutagénesis para tener una actividad mejorada a 37 grados Celsius. La escisión de ADN mediada por Ago-ARN se podría usar para afectar un abanico de resultados que incluyen la inactivación génica, la adición de genes dirigidos, la corrección génica, la deleción de genes dirigidos usando técnicas convencionales en la técnica para la explotación de las roturas de ADN.

Por lo tanto, la nucleasa puede comprender un dominio de unión a ADN que se une específicamente a un sitio diana en cualquier gen en el que se desea insertar un donante (transgén).

B. Dominios de escisión

Cualquier dominio de escisión adecuado se puede unir operativamente a un dominio de unión a ADN para formar una nucleasa. Por ejemplo, se ha fusionado el dominio de unión a ADN de ZFP con el dominio de nucleasas para crear ZFN - una entidad funcional que es capaz de reconocer su diana de ácido nucleico prevista mediante su dominio de unión a ADN manipulado (ZFP) y provocar que el ADN se corte cerca del sitio de unión a ZFP por la actividad de nucleasa. Véase, por ejemplo, Kim et al. (1996) Proc Nat'l Acad Sci USA 93(3):1156-1160. Más recientemente, se han usado las ZFN para la modificación del genoma en una variedad de organismos. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y la publicación internacional WO 07/014275. Asimismo, se ha fusionado el dominio de unión a ADN de TALE con el dominio de nucleasas para crear TALEN. Véase, por ejemplo, la publicación de EE. UU. N.220110301073.

Como se observa anteriormente, el dominio de escisión puede ser heterólogo al dominio de unión a ADN, por ejemplo un dominio de unión a ADN de dedos de cinc y un dominio de escisión de una nucleasa o un dominio de unión a ADN de TALEN y un dominio de escisión, o dominio de unión a ADN de meganucleasa y dominio de escisión de una nucleasa diferente. Se pueden obtener dominios de escisión heterólogos a partir de cualquier endonucleasa o exonucleasa. Las endonucleasas a modo de ejemplo de las que puede derivar un dominio de escisión incluyen, pero no se limitan a, endonucleasas de restricción y endonucleasas de asentamiento. Véanse, por ejemplo, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; y Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Se conocen enzimas adicionales que escinden ADN (por ejemplo, S1 nucleasa; nucleasa de frijol mungo; DNAsa I pancreática; nucleasa microcócica; endonucleasa de levadura HO; véase también Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Se puede usar una o más de estas enzimas (o fragmentos funcionales de las mismas) como fuente de dominios de escisión y mitades de dominio de escisión.

Similarmente, la mitad de dominio de escisión se puede obtener de cualquier nucleasa o porción de la misma, como se expone anteriormente, que requiere dimerización para la actividad de escisión. En general, se requieren dos proteínas de fusión para la escisión si las proteínas de fusión comprenden mitades de dominio de escisión. Alternativamente, se puede usar una única proteína que comprende dos mitades de dominio de escisión. Las dos mitades de dominio de escisión pueden proceder de la misma endonucleasa (o fragmentos funcionales de la misma), o cada mitad de dominio de escisión puede proceder de una endonucleasa diferente (o fragmentos funcionales de la misma). Además, los sitios diana para las dos proteínas de fusión se disponen preferentemente, con respecto entre sí, tal que la unión de las dos proteínas de fusión a sus sitios diana respectivos ponga las mitades de dominio de escisión en una orientación espacial entre sí que permite que las mitades de dominio de escisión formen un dominio funcional de escisión, por ejemplo, por dimerización. Así, en ciertas realizaciones, los bordes próximos de los sitios diana están separados por 5-8 nucleótidos o por 15-18 nucleótidos. Sin embargo, cualquier número entero de nucleótidos o pares de nucleótidos puede interponerse entre dos sitios diana (por ejemplo, desde 2 hasta 50 pares de nucleótidos o más). En general, el sitio de escisión se encuentra entre los sitios diana.

Las endonucleasas de restricción (enzimas de restricción) están presentes en muchas especies y son capaces de unión específica de secuencia a ADN (en un sitio de reconocimiento), y la escisión de ADN en o cerca del sitio de unión. Ciertas enzimas de restricción (por ejemplo, tipo IIS) escinden ADN en sitios retirados del sitio de reconocimiento y tienen dominios de unión y de escisión separables. Por ejemplo, la enzima de tipo IIS FokI cataliza la escisión bicatenaria de ADN, en 9 nucleótidos desde su sitio de reconocimiento en una cadena y 13 nucleótidos de su sitio de reconocimiento en la otra. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. 5.356.802; 5.436.150 y 5.487.994; así como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31.978-31.982. Así, en una realización, las proteínas de fusión comprenden el dominio de escisión (o mitad de dominio de escisión) de al menos una enzima de restricción de tipo IIS y uno o más dominios de unión de dedos de cinc, que pueden o pueden no manipularse.

Una enzima de restricción de tipo IIS a modo de ejemplo, cuyo dominio de escisión es separable del dominio de unión, es FokI. Esta enzima particular es activa como un dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10.570­ 10.575. Por consiguiente, a efectos de la presente divulgación, la porción de la enzima FokI usada en las proteínas de fusión desveladas se considera mitad de dominio de escisión. Por lo tanto, para la escisión bicatenaria dirigida y/o sustitución dirigida de secuencias celulares usando fusiones de dedos de cinc-FokI, se pueden usar dos proteínas de fusión, comprendiendo cada una una mitad de dominio de escisión de FokI, para reconstituir un dominio de escisión catalíticamente activo. Alternativamente, también se puede usar una única molécula de polipéptido que contiene un dominio de unión de dedos de cinc y dos mitades de dominio de escisión de FokI. Los parámetros para la escisión dirigida y la alteración de secuencia dirigida usando fusiones de dedos de cinc-FokI se proporcionan en cualquier parte en la presente divulgación.

Un dominio de escisión o mitad de dominio de escisión puede ser cualquier porción de una proteína que retiene la actividad de escisión, o que retiene la capacidad de multimerizarse (por ejemplo, dimerizarse) para formar un dominio de escisión funcional.

Las enzimas de restricción de tipo IIS a modo de ejemplo se describen en la publicación internacional WO 07/014275. Las enzimas de restricción adicionales también contienen dominios de unión y de escisión separables, y estos se contemplan por la presente divulgación. Véase, por ejemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

En ciertas realizaciones, el dominio de escisión comprende una o más mitades de dominio de escisión manipuladas (también denominadas mutantes del dominio de dimerización) que minimizan o previenen la homodimerización, como se describe, por ejemplo, en Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 7.914.796; 8.034.598 y 8.623.618. Los restos de aminoácidos en las posiciones 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491,496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 y 538 de FokI son todas dianas para influir en la dimerización de las mitades de dominio de escisión de FokI.

Las mitades de dominio de escisión de Fok\ manipuladas a modo de ejemplo que forman heterodímeros estrictos incluyen un par en el que una primera mitad de dominio de escisión incluye mutaciones en los restos de aminoácidos en las posiciones 490 y 538 de Fok\ y una segunda mitad de dominio de escisión incluye mutaciones en los restos de aminoácidos 486 y 499.

Por lo tanto, en una realización, una mutación en 490 sustituye Glu (E) con Lys (K); la mutación en 538 sustituye Iso (I) con Lys (K); la mutación en 486 sustituye Gln (Q) con Glu (E); y la mutación en la posición 499 sustituye Iso (I) con Lys (K). En concreto, las mitades de dominio de escisión manipuladas descritas en el presente documento se prepararon mutando las posiciones 490 (E^-K) y 538 (I^-K) en una mitad de dominio de escisión para producir una mitad de dominio de escisión manipulada designada "E490K:I538K" y mutando las posiciones 486 (Q^-E) y 499 (I^L ) en otra mitad de dominio de escisión para producir una mitad de dominio de escisión manipulada designada "Q486E:I499L". Las mitades de dominio de escisión manipuladas descritas en el presente documento son mutantes de heterodímero estrictos en los que la escisión aberrante se minimiza o suprime. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. N.° 2008/0131962. En ciertas realizaciones, la mitad de dominio de escisión manipulada comprende mutaciones en las posiciones 486, 499 y 496 (numeradas con respecto a FokI natural), por ejemplo mutaciones que sustituyen el resto Gln (Q) natural en la posición 486 con un resto Glu (E), el resto Iso (I) natural en la posición 499 con un resto Leu (L) y el resto Asn (N) natural en la posición 496 con un resto Asp (D) o Glu (E) (también denominados los dominios "ELD" y "ELE", respectivamente). En otras realizaciones, la mitad de dominio de escisión manipulada comprende mutaciones en las posiciones 490, 538 y 537 (numeradas con respecto a FokI natural), por ejemplo mutaciones que sustituyen el resto Glu (E) natural en la posición 490 con un resto Lys (K), el resto Iso (I) natural en la posición 538 con un resto Lys (K), y el resto His (H) natural en la posición 537 con un resto Lys (K) o un resto Arg (R) (también denominados los dominios "KKK" y "KKR", respectivamente). En otras realizaciones, la mitad de dominio de escisión manipulada comprende mutaciones en las posiciones 490 y 537 (numerado con respecto a FokI natural), por ejemplo, mutaciones que sustituyen el resto Glu (E) natural en la posición 490 con un resto Lys (K) y el resto His (H) natural en la posición 537 con un resto Lys (K) o un resto Arg (R) (también denominados los dominios "KIK" y "KIR", respectivamente. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N° 7.914.796; 8.034.598 y 8.623.618. En otras realizaciones, la mitad de dominio de escisión manipulada comprende las mutaciones de "Sharkey" y/o "Sharkey" (véase Guo et al., (2010) J. Mol. Biol. 400(1):96-107).

Las mitades de dominio de escisión manipuladas descritas en el presente documento se pueden preparar usando cualquier método adecuado, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio de mitades de dominio de escisión naturales (FokI) como se describe en las publicaciones de patente de EE. UU. N.° 20050064474; 20080131962; y 20110201055.

Alternativamente, se pueden ensamblar nucleasas in vivo en el sitio diana de ácido nucleico usando la denominada tecnología de "enzima de división" (véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. N.° 20090068164). Los componentes de dichas enzimas de división se pueden expresar o en construcciones de expresión separadas, o se pueden unir en un marco de lectura abierto donde se separan los componentes individuales, por ejemplo, por un péptido 2A de autoescisión o secuencia IRES. Los componentes pueden ser dominios de unión a dedos de cinc individuales o dominios de un dominio de unión a ácido nucleico de meganucleasa.

Las nucleasas se pueden analizar en busca de su actividad antes de uso, por ejemplo, en un sistema cromosómico basado en levadura, como se describe en los documentos de patente WO 2009/042163 y 20090068164. Las construcciones de expresión de nucleasa se pueden diseñar fácilmente usando métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de Estados Unidos 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; y la publicación internacional WO 07/014275. La expresión de la nucleasa puede ser bajo el control de un promotor constitutivo o un promotor inducible, por ejemplo, el promotor de la galactocinasa que se activa (desreprime) en presencia de rafinosa y/o galactosa y se reprime en presencia de glucosa.

El sistema CRISPR/Cas relacionado con Cas9 comprende dos componentes no codificantes de ARN: ARNtracr y una matriz pre-ARNcr que contiene secuencias guía de nucleasa (espaciadores) intercaladas con repeticiones directas (DR) idénticas. Para usar un sistema CRISPR/Cas para realizar la manipulación del genoma, deben estar presentes ambas funciones de estos ARN (véase Cong et al., (2013) Sciencexpress 1/10.1126/science 1231143). En algunas realizaciones, los ARNtracr y pre-ARNcr se suministran por construcciones de expresión separadas o como ARN separados. En otras realizaciones, se construye un ARN quimérico donde un ARNcr maduro manipulado (que confiere especificidad por diana) se fusiona con un ARNtracr (que suministra la interacción con la Cas9) para crear un híbrido ARNcr-ARNtracr quimérico (también denominado un ARN guía único) (véase Jinek, arriba, y Cong, arriba).

Sitios diana

Como se describe en detalle anteriormente, se pueden manipular dominios de ADN para unirse a cualquier secuencia de elección. Un dominio de unión a ADN manipulado puede tener una novedosa especificidad de unión, en comparación con un dominio de unión a ADN natural. En ciertos aspectos de la divulgación, el dominio de unión a ADN se une a una secuencia dentro de una secuencia de potenciador BCL11A, por ejemplo, un sitio diana (normalmente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 o incluso más pares de bases) está entre el exón 2 y el exón 3 de BCL11A, que incluye el dominio de unión a ADN que se une a una secuencia dentro de un sitio hipersensible a DNAsaI en la secuencia de potenciador BCL11A (por ejemplo, 55, 58, 62; véase la Figura 11). Los métodos de manipulación incluyen, pero no se limitan a, diseño racional y diversos tipos de selección. El diseño racional incluye, por ejemplo, el uso de bases de datos que comprenden secuencias de nucleótidos triplete (o cuadruplete) y secuencias de aminoácidos de dedos de cinc individuales, en las que cada secuencia de nucleótidos triplete o cuadruplete está asociada con una o más secuencias de aminoácidos de dedos de cinc que se unen a la secuencia triplete o cuadruplete particular. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. del mismo solicitante 6.453.242 y 6.534.261. También se puede realizar el diseño racional de dominios efectores de TAL. Véase, por ejemplo, la publicación de EE. UU. N.° 20110301073.

Los métodos de selección a modo de ejemplo aplicables al dominio de unión a ADN, que incluyen presentación en fagos y sistemas de dos híbridos, se desvelan en las patentes de EE. UU. 5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466; 6.200.759; y 6.242.568; así como los documentos de patente WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 y GB 2.338.237. Además, se ha descrito la mejora de la especificidad de unión por dominios de unión de dedos de cinc, por ejemplo, en el documento de patente del mismo solicitante WO 02/077227.

La selección de sitios diana; nucleasas y métodos para el diseño y la construcción de proteínas de fusión (y polinucleótidos que las codifican) son conocidos por los expertos en la técnica y se describen con detalle en las publicaciones de solicitud de patente de EE. UU. N.° 20050064474 y 20060188987.

Además, como se desvela en estas y otras referencias, se pueden unir juntos el dominio de unión a ADN (por ejemplo, proteínas de dedos de cinc de múltiples dedos) y/o fusiones de dominio(s) de unión a ADN y dominio(s) funcional(es) usando cualquier secuencia conectora adecuada, que incluye, por ejemplo, conectores de 5 o más aminoácidos. Las patentes de EE. UU. N28.772.453; 7.888.121 (por ejemplo, conector "ZC"); 6.479.626; 6.903.185; y 7.153.949; publicación de EE. UU. N.° 20090305419) y solicitud de EE. UU. N.° 14/471.782. Las proteínas descritas en el presente documento pueden incluir cualquier combinación de conectores adecuados entre el dominio de unión a ADN individual de la proteína. Véase, por lo tanto, la patente de EE. UU. N.° 8.586.526.

Donantes

La presente divulgación se refiere a la integración dirigida mediada por nucleasa de una secuencia exógena en el genoma de una célula usando las moléculas de unión a la región de potenciador BCL11A descritas en el presente documento. Como se observa anteriormente, la inserción de una secuencia exógena (también denominada una "secuencia donante" o "donante" o "transgén"), por ejemplo, para la deleción de una región especificada y/o corrección de un gen mutante o para la elevada expresión de un gen natural. Será rápidamente evidente que la secuencia donante normalmente no es idéntica a la secuencia genómica donde se pone. Una secuencia donante puede contener una secuencia no homóloga flanqueada por dos regiones de homología para permitir la eficiente HDR en la localización de interés, o se puede integrar por mecanismos de reparación dirigida no por homología. Además, las secuencias donantes pueden comprender una molécula vectorial que contiene secuencias que no son homólogas a la región de interés en la cromatina celular. Una molécula donante puede contener varias regiones de homología discontinuas para la cromatina celular, y, por ejemplo, conducir a una deleción de una región de potenciador Bcl11a (o un fragmento de la misma) cuando se usa como un sustrato para la reparación de una DBS inducida por una de las nucleasas descritas aquí. Además, para la inserción dirigida de secuencias normalmente no presentes en una región de interés, dichas secuencias pueden estar presentes en una molécula donante de ácido nucleico y flanqueadas por regiones de homología con la secuencia en la región de interés.

Los polinucleótidos para la inserción también se pueden denominar polinucleótidos "exógenos", polinucleótidos o moléculas "donantes" o "transgenes." El polinucleótido donante puede ser ADN o ARN, monocatenario y/o bicatenario, y se puede introducir en una célula en forma lineal o circular. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de ^EE. Uu. ^{N.° 20100047805 y 20110207221. La(s) secuencia(s) donante(s) están preferentemente contenidas dentro} de un MC de ADN, que se puede introducir en la célula en forma circular o lineal. Si se introduce en forma lineal, los extremos de la secuencia donante se pueden proteger (por ejemplo, de la degradación exonucleolítica) por métodos conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, uno o más restos de didesoxinucleótidos se añaden a los extremos 3' de una molécula lineal y/o se unen oligonucleótidos auto-complementarios a uno o ambos extremos. Véanse, por ejemplo, Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963; Nehls et al. (1996) Science 272:886-889. Los métodos adicionales para proteger los polinucleótidos exógenos de la degradación incluyen, pero no se limitan a, adición de grupo(s) amino terminal(es) y el uso de enlaces internucleotídicos modificados, tales como, por ejemplo, fosforotioatos, fosforamidatos y restos de O-metilrribosa o desoxirribosa. Si se introducen en forma bicatenaria, el donante puede incluir uno o más sitios diana de nucleasa, por ejemplo, sitios diana de nucleasa que flanquean el transgén que se va a integrar en el genoma de la célula. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de EE. UU. N.220130326645.

Un polinucleótido se puede introducir en una célula como parte de una molécula vectorial que tiene secuencias adicionales, tales como, por ejemplo, orígenes de replicación, promotores y genes que codifican la resistencia a antibióticos. Además, se pueden introducir polinucleótidos donantes como ácido nucleico desnudo, como ácido nucleico complejado con un agente tal como un liposoma o poloxámero, o se pueden administrar por virus (por ejemplo, adenovirus, AAV, virus del herpes, retrovirus, lentivirus y lentivirus defectuosos en integrasa (IDLV)).

En ciertas realizaciones, el donante bicatenario incluye secuencias (por ejemplo, secuencias codificantes, también denominados transgenes) de más de 1 kb de longitud, por ejemplo, entre 2 y 200 kb, entre 2 y 10 kb (o cualquier valor intermedio). El donante bicatenario también incluye, por ejemplo, al menos un sitio diana de nucleasa. En ciertas realizaciones, el donante incluye al menos 2 sitios diana, por ejemplo, para un par de ZFN o TALEN. Normalmente, los sitios diana de nucleasa están fuera de las secuencias de transgenes, por ejemplo, 5' y/o 3' con respecto a las secuencias de transgenes, para la escisión del transgén. El (Los) sitio(s) de escisión de nucleasa pueden ser para cualquier nucleasa. En ciertas realizaciones, el (los) sitio(s) diana de nucleasa contenido(s) en el donante bicatenario son para la(s) misma(s) nucleasa(s) usada(s) para escindir la diana endógena en la que el donante escindido se integra por métodos independientes de homología.

El donante se inserta, en general, de manera que su expresión sea impulsada por el promotor endógeno en el sitio de integración, concretamente el promotor que impulsa la expresión del gen endógeno en el que el donante se inserta (por ejemplo, globina, AAVS1, etc.). Sin embargo, será evidente que el donante puede comprender un promotor y/o potenciador, por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor inducible o específico de tejido.

La molécula donante se puede insertar en un gen endógeno de forma que se exprese todo, algo o nada del gen endógeno. En otras realizaciones, el transgén (por ejemplo, con o sin secuencias codificantes de globina) se integra en cualquier locus endógeno, por ejemplo, un locus de puerto seguro. Véanse, por ejemplo, las publicaciones de patente de EE. UU. 20080299580; 20080159996 y 201000218264.

Además, aunque no se requiera para la expresión, las secuencias exógenas también pueden incluir secuencias reguladoras transcripcionales o traduccionales, por ejemplo, promotores, potenciadores, aisladores, sitios internos de entrada al ribosoma, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación.

Los transgenes llevados en las secuencias donantes descritas en el presente documento se pueden aislar de plásmidos, células u otras fuentes usando técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como PCR. Los donantes para su uso pueden incluir tipos variables de topología, que incluyen superenrrollados circulares, relajados circulares, lineales y similares. Alternativamente, se pueden sintetizar químicamente usando técnicas de síntesis de oligonucleótidos estándar. Además, los donantes se pueden metilar o carecer de metilación. Los donantes pueden estar en forma de cromosomas artificiales bacterianos o de levadura (BAC o YAC).

Los polinucleótidos donantes bicatenarios descritos en el presente documento pueden incluir una o más bases y/o esqueletos no naturales. En particular, la inserción de una molécula donante con citosinas metiladas se puede llevar a cabo usando los métodos descritos en el presente documento para lograr un estado de quiescencia transcripcional en una región de interés.

El polinucleótido (donante) exógeno puede comprender cualquier secuencia de interés (secuencia exógena). Las secuencias exógenas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, cualquier secuencia codificante de polipéptidos (por ejemplo, ADNc), secuencias promotoras, secuencias potenciadoras, marcas de epítopes, genes marcadores, sitios de reconocimiento de enzimas de escisión y diversos tipos de construcciones de expresión. Los genes marcadores incluyen, pero no se limitan a, secuencias que codifican proteínas que median en la resistencia a antibióticos (por ejemplo, resistencia a ampicilina, resistencia a neomicina, resistencia a G418, resistencia a puromicina), secuencias que codifican proteínas coloreadas o fluorescentes o luminiscentes (por ejemplo, proteína verde fluorescente, proteína verde fluorescente potenciada, proteína roja fluorescente, luciferasa) y proteínas que median en el potenciado crecimiento celular y/o la amplificación génica (por ejemplo, dihidrofolato reductasa). Las marcas de epítopes incluyen, por ejemplo, una o más copias de FLAG, His, myc, Tap, HA o cualquier secuencia detectable de aminoácidos.

En una realización preferida, la secuencia exógena (transgén) comprende un polinucleótido que codifica cualquier polipéptido cuya expresión en la célula se desea, que incluye, pero no se limita a, anticuerpos, antígenos, enzimas, receptores (superficie celular o nuclear), hormonas, linfocinas, citocinas, polipéptidos indicadores, factores de crecimiento y fragmentos funcionales de cualquiera de los anteriores. Las secuencias codificantes pueden ser, por ejemplo, ADNc.

Por ejemplo, la secuencia exógena puede comprender una secuencia que codifica un polipéptido que carece de o es no funcional en el sujeto que tiene una enfermedad genética, que incluye, pero no se limita a, cualquiera de las siguientes enfermedades genéticas: acondroplasia, acromatopsia, deficiencia de maltasa ácida, deficiencia de adenosina desaminasa (OMIM N.° 102700), adrenoleucodistrofia, síndrome de Aicardi, deficiencia de alfa-1 antitripsina, alfa-talasemia, síndrome de insensibilidad a andrógenos, síndrome de Apert, arritmogénica del ventrículo derecho, displasia, ataxia telangiectasia, síndrome de Barth, beta-talasemia, síndrome de Bean, enfermedad de Canavan, enfermedades granulomatosas crónicas (CGD), síndrome del maullido, fibrosis quística, enfermedad de Dercum, displasia ectodérmica, anemia de Fanconi, fibrodisplasia osificante progresiva, síndrome X frágil, galactosemia, enfermedad de Gaucher, gangliosidosis generalizada (por ejemplo, GM1), hemocromatosis, la mutación de la hemoglobina C en el 6° codón de la beta-globina (HbC), hemofilia, enfermedad de Huntington, síndrome de Hurler, hipofosfatasia, síndrome de Klinefleter, enfermedad de Krabbes, síndrome de Langer-Giedion, deficiencia de adhesión leucocitaria (LAD, OMIM N.° 116920), leucodistrofia, síndrome de QT largo, síndrome de Marfan, síndrome de Moebius, mucopolisacaridosis (MPS), síndrome onicorrotuliano, diabetes insípida nefrogénica, neurofibromatosis, enfermedad de Neimann-Pick, osteogénesis imperfecta, porfiria, síndrome de Prader-Willi, progeria, síndrome de Proteo, retinoblastoma, síndrome de Rett, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sanfilippo, inmunodeficiencia combinada grave (SCID), síndrome de Shwachman, drepanocitosis (anemia de células falciformes), síndrome de Smith-Magenis, síndrome de Stickler, enfermedad de Tay-Sachs, síndrome de trombocitopenia y aplasia radial (TAR), síndrome de Treacher Collins, trisomía, esclerosis tuberosa, síndrome de Turner, trastorno del ciclo de la urea, enfermedad de von Hippel-Landau, síndrome de Waardenburg, síndrome de Williams, enfermedad de Wilson, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome linfoproliferativo ligado al X (XLP, OMIM No. 308240).

Las enfermedades adicionales a modo de ejemplo que se pueden tratar por la integración dirigida incluyen inmunodeficiencias adquiridas, enfermedades de almacenamiento lisosómico (por ejemplo, enfermedad de Gaucher, GM1, enfermedad de Fabry y enfermedad de Tay-Sachs), mucopolisacaridosis (por ejemplo, enfermedad de Hunter, enfermedad de Hurler), hemoglobinopatías (por ejemplo, enfermedades de células falciformes, HbC, a-talasemia, ptalasemia) y hemofilias.

En ciertas realizaciones, las secuencias exógenas pueden comprender un gen marcador (descrito anteriormente), que permite la selección de células que se han sometido a integración dirigida, y una secuencia ligada que codifica una funcionalidad adicional. Los ejemplos no limitantes de genes marcadores incluyen GFP, marcador(es) de selección de fármacos y similares.

Las secuencias de genes adicionales que se pueden insertar pueden incluir, por ejemplo, genes naturales para sustituir secuencias mutadas. Por ejemplo, se puede insertar una secuencia de genes del factor IX natural en el genoma de una célula madre en la que la copia endógena del gen está mutada. La copia no mutante se puede insertar en el locus endógeno, o se puede dirigir alternativamente a un locus de puerto seguro.

La construcción de dichos casetes de expresión, siguiendo las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, utiliza metodologías bien conocidas en la técnica de la biología molecular (véase, por ejemplo, Ausubel o Maniatis). Antes del uso del casete de expresión para generar un animal transgénico, la sensibilidad del casete de expresión al inductor del estrés asociado a elementos de control seleccionados se puede probar introduciendo el casete de expresión en una estirpe celular adecuada (por ejemplo, células primarias, células transformadas o estirpes celulares inmortalizadas).

Además, aunque no se requiere para la expresión, las secuencias exógenas también pueden ser secuencias reguladoras de la transcripción o de la traducción, por ejemplo, promotores, potenciadores, aisladores, sitios internos de entrada al ribosoma, secuencias que codifican péptidos 2A y/o señales de poliadenilación. Además, los elementos de control de los genes de interés pueden estar unidos operativamente a genes indicadores para crear genes quiméricos (por ejemplo, casetes de expresión indicadores).

También se puede lograr la inserción dirigida de la secuencia del ácido nucleico no codificante. También se pueden usar secuencias que codifican ARN antisentio, iARN, ARNhp y microARN (miARN) para inserciones dirigidas.

En realizaciones adicionales, el ácido nucleico donante puede comprender secuencias no codificantes que son sitios diana específicos para diseños adicionales de nucleasa. Posteriormente, se pueden expresar nucleasas adicionales en células de forma que la molécula donante original se escinda y se modifique por inserción de otra molécula donante de interés. De esta forma, se pueden generar las integraciones reiterativas de moléculas donantes, lo que permite el apilamiento de rasgos en un locus de interés particular o en un locus de puerto seguro.

Adm inistración

Las nucleasas, los polinucleótidos que codifican estas nucleasas, los polinucleótidos donantes y las composiciones que comprenden las proteínas y/o los polinucleótidos descritos en el presente documento se pueden administrar in vivo o ex vivo por cualquier medio adecuado en cualquier tipo de célula.

Las células adecuadas incluyen células eucariotas (por ejemplo, animales) y procariotas y/o estirpes celulares. Los ejemplos no limitantes de dichas células o estirpes celulares generadas a partir de dichas células incluyen células COS, CHO (por ejemplo, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (por ejemplo, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) y perC6, así como células de insecto tales como Spodoptera frugiperda (Sf), o células fúngicas tales como Sacaromyces, Pichia y Schizosacaromyces. En ciertas realizaciones, la estirpe celular es una estirpe celular CHO, MDCK o HEK293. Las células adecuadas también incluyen células madre, tales como, a modo de ejemplo, células madre embrionarias, células madre pluripotentes inducidas, células madre hematopoyéticas, células madre neuronales y células madre mesenquimatosas.

Los métodos de administración de nucleasas como se describen en el presente documento se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. N2 6.453.242; 6.503.717; 6.534.261; 6.599.692; 6.607.882; 6.689.558; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824.

Las nucleasas y/o construcciones de donante como se describen en el presente documento también se pueden administrar usando vectores que contienen secuencias que codifican una o más de ZFN(s), TALEN(s) o sistemas CRIPSR/Cas. Se puede usar cualquier sistema de vector, que incluye, pero no se limita a, vectores plasmídicos, vectores retrovíricos, vectores lentivíricos, vectores de adenovirus, vectores de poxvirus; vectores de virus del herpes y vectores de virus adeno-asociado, etc. Véanse, por tanto, las patentes de EE. UU. N° 6.534.261; 6.607.882; 6.824.978; 6.933.113; 6.979.539; 7.013.219; y 7.163.824. Además, será evidente que cualquiera de estos vectores puede comprender una o más de las secuencias necesarias para el tratamiento. Así, cuando la una o más nucleasas y una construcción de donante se introducen en la célula, las nucleasas y/o el polinucleótido donante pueden ser transportados en el mismo vector o sobre vectores diferentes (MC(s) de ADN). Cuando se usan múltiples vectores, cada vector puede comprender una secuencia que codifica una o múltiples nucleasas y/o construcciones de donante. Se pueden usar métodos de transferencia génica vírica y no vírica convencionales para introducir ácidos nucleicos que codifican nucleasas y/o construcciones de donante en células (por ejemplo, células de mamífero) y tejidos diana. Los sistemas de administración no de vector vírico incluyen plásmidos de ADN o ARN, MC de ADN, ácido nucleico desnudo y ácido nucleico complejado con un vehículo de administración, tal como un liposoma o poloxámero. Los vectores no víricos adecuados incluyen vectores de nanotaxia, que incluyen vectores comercialmente disponibles de InCellArt (Francia). Los sistemas de administración de vectores víricos incluyen virus de ADN y de ARN, que tienen o genomas episómicos o integrados después de la administración a la célula. Para una revisión de la administración in vivo de proteínas de unión a ADN manipuladas y proteínas de fusión que comprenden estas proteínas de unión, véase, por ejemplo, Rebar (2004) Expert Opinion Invest. Drugs 13(7):829-839; Rossi et al. (2007) Nature Biotech.

25(12):1444-1454, así como referencias de administración génica general tales como Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31 -44 (1995); Haddada et al., en Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Los métodos de administración no vírica de ácidos nucleicos incluyen electroporación, lipofección, microinyección, biolística, virosomas, liposomas, inmunoliposomas, conjugados de policatión o lípido:ácido nucleico, ADN desnudo, viriones artificiales y captación mejorada de ADN por agentes. La sonoporación usando, por ejemplo, el sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) también se puede usar para la administración de ácidos nucleicos.

Los sistemas de administración de ácido nucleico adicionales a modo de ejemplo incluyen los proporcionados por Amaxa Biosystems (Cologne, Alemania), Maxcyte, Inc. (Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) y Copernicus Therapeutics Inc., (véase, por ejemplo, el documento de patente US6008336). La lipofección se describe en, por ejemplo, las patentes de EE. UU. N.° 5.049.386; 4.946.787; y 4.897.355 y los reactivos de lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam™ y Lipofectin™). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la eficiente lipofección por reconocimiento de receptores de polinucleótidos incluyen los de ^{Felgner, documentos de patente WO 91/17424,} Wo ^91/16024.

La preparación de complejos de lípido:ácido nucleico, que incluyen liposomas dirigidos tales como complejos de inmunolípidos, es bien conocida por un experto en la técnica (véase, por ejemplo, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res.

52:4817-4820 (1992); patentes de EE. UU. N.24.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 y 4.946.787).

Los métodos de administración adicionales incluyen el uso de encapsidación de los ácidos nucleicos a administrar en vehículos de administración EnGeneIC (EDV). Estos EDV se suministran en concreto a tejidos diana usando anticuerpos biespecíficos donde un brazo del anticuerpo tiene especificidad por el tejido diana y el otro tiene ^{especificidad por el EDV. El anticuerpo lleva los EDV a la superficie de la célula diana y entonces el} eDv ^{se introduce} en la célula por endocitosis. Una vez en la célula, se liberan los contenidos (véase MacDiarmid et al., (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

El uso de sistemas víricos basados en ARN o ADN para la administración de ácidos nucleicos que codifican ZFP, TALE y/o sistemas CRISPR/Cas modificados se aprovecha de procesos altamente evolucionados para el direccionamiento de un virus a células específicas en el cuerpo y el tráfico de la carga vírica al núcleo. Los vectores víricos se pueden administrar directamente a pacientes (in vivo) o se pueden usar para tratar células in vitro y las células modificadas se administran a pacientes (ex vivo). Los sistemas basados en virus convencionales para la administración de ZFP incluyen, pero no se limitan a, vectores retrovíricos, lentivíricos, adenovíricos, adeno-asociados, de la variolovacuna y virus del herpes simple para la transferencia génica. La integración en el genoma hospedador es posible con los métodos de transferencia génica de retrovirus, lentivirus y virus adeno-asociados, frecuentemente dando como resultado la expresión a largo plazo del transgén insertado. Además, se han observado eficiencias de alta transducción en muchos tipos diferentes de células y tejidos diana.

El tropismo de un retrovirus se puede alterar incorporando proteínas extrañas de la envoltura, que expanden la posible población diana de células diana. Los vectores lentivíricos son vectores retrovíricos que son capaces de transducir o infectar células no divisorias y normalmente producen alto títulos víricos. La selección de un sistema génico de transferencia retrovírica depende del tejido diana. Los vectores retrovíricos comprenden repeticiones terminales largas que actúan en cis con capacidad de encapsidación para hasta 6-10 kb de secuencia extraña. Las LTR mínimas que actúan en cis son suficientes para la replicación y la encapsidación de los vectores, que entonces se usan para integrar el gen terapéutico en la célula diana para proporcionar expresión transgénica permanente. Los vectores retrovíricos ampliamente usados incluyen los basados en el virus de la leucemia murina (MuLV), virus de la leucemia del gibón (GaLV), virus de la inmunodeficiencia simia (SIV), virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), y combinaciones de los mismos (véase, por ejemplo, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731 -2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol,63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol.

65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

En aplicaciones en las que se prefiere la expresión transitoria, se pueden usar sistemas adenovíricos. Los vectores adenovíricos son capaces de una eficiencia de transducción muy alta en muchos tipos de células y no requieren división celular. Con dichos vectores, se han obtenido alto título y altos niveles de expresión. Este vector se puede producir en grandes cantidades en un sistema relativamente simple. También se usan vectores de virus adenoasociado ("AAV") para transducir células con ácidos nucleicos diana, por ejemplo, en la producción in vitro de ácidos nucleicos y péptidos, y para los procedimientos de genoterapia in vivo y ex vivo (véase, por ejemplo, West et al., Virology 160:38-47 (1987); patente de EE. UU. N.° 4.797.368; documento de patente WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). La construcción de vectores AAV recombinantes se describe en varias publicaciones, que incluyen la patente de EE. UU. N° 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); y Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

Están actualmente disponibles al menos seis enfoques de vectores víricos para transferencia génica en ensayos clínicos, que utilizan enfoques que implican la complementación de vectores defectuosos con genes insertados en estirpes celulares auxiliares para generar el agente transductor.

pLASN y MFG-S son ejemplos de vectores retrovíricos que se han usado en ensayos clínicos (Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN fue el primer vector terapéutico usado en un ensayo de terapia génica (Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). Se han observado eficiencias de transducción del 50 % o mayores para vectores encapsidados MFG-S (Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

Los vectores de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) son un sistema de administración génica alternativo y prometedor basado en el virus de tipo 2 adeno-asociado de parvovirus defectuoso y no patógeno. Todos los vectores derivan de un plásmido que solo retiene las repeticiones terminales invertidas de 145 pb de AAV que flanquean el casete de expresión del transgén. La eficiente transferencia génica y la estable administración transgénica debido a la integración en los genomas de la célula transducida son características clave para este sistema de vector (Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)). También se pueden usar otros ^{serotipos de AAV, que incluyen} AaV1 ^{, AAV2, AAV3,} AaV4, ^{AAV5, AAV6, AAV7,} aAv8, ^{AAV9 y AAVrh.10 y cualquier} novedoso serotipo de AAV según la presente invención.

Los vectores adenovíricos recombinantes deficientes en la replicación (Ad) se pueden producir con alto título e infectan fácilmente varios tipos diferentes de células. La mayoría de los vectores adenovíricos se manipulan de forma que un transgén sustituya los genes Ad E1a, E1b y/o E3; posteriormente, el vector defectuoso en la replicación se propaga en células 293 humanas que suministran la función génica delecionada en trans. Los vectores Ad pueden transducir múltiples tipos de tejidos in vivo, que incluyen células diferenciadas no divisorias, tales como las encontradas en hígado, riñón y músculo. Los vectores Ad convencionales tienen una gran capacidad transportadora. Un ejemplo del uso de un vector Ad en un ensayo clínico implicó la terapia con polinucleótidos para inmunización antitumoral con inyección intramuscular (Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Los ejemplos adicionales del uso de vectores de adenovirus para la transferencia génica en ensayos clínicos incluyen Rosenecker et al., Infection 24:1 5­ 10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998).

Se usan células de encapsidación para formar partículas de virus que son capaces de infectar una célula hospedadora. Dichas células incluyen células 293, que encapsidan el adenovirus, y células ^2 o células PA317, que encapsidan el retrovirus. Los vectores víricos usados en la genoterapia se generan normalmente por una estirpe celular productora que encapsida un vector de ácido nucleico en una partícula vírica. Los vectores contienen normalmente las secuencias víricas mínimas requeridas para la encapsidación y posterior integración en un hospedador (si procede), siendo otras secuencias víricas sustituidas por un casete de expresión que codifica la proteína a expresar. Las funciones víricas ausentes se suministran en trans por la estirpe celular de encapsidación. Por ejemplo, los vectores AAV usados en genoterapia normalmente solo poseen secuencias de repeticiones terminales invertidas (ITR) del genoma AAV que se requieren para la encapsidación e integración en el genoma del hospedador. El ADN vírico se encapsida en una estirpe celular, que contiene un plásmido auxiliar que codifica los otros genes AAV, concretamente repy cap, pero que carece de secuencias ITR. La estirpe celular también se infecta con adenovirus como auxiliar. El virus auxiliar promueve la replicación del vector AAV y la expresión de genes AAV del plásmido auxiliar. El plásmido auxiliar no se encapsida en cantidades significativas debido a la ausencia de secuencias ITR. La contaminación con adenovirus se puede reducir, por ejemplo, con tratamiento con calor al que el adenovirus es más sensible que el AAV.

En muchas aplicaciones de genoterapia, se desea que el vector de terapia génica se administre con un alto grado de especificidad a un tipo de tejido particular. Por consiguiente, se puede modificar un vector vírico para tener especificidad por un tipo dado de célula que expresa un ligando, como una proteína de fusión con una proteína de la cubierta vírica sobre la superficie externa del virus. El ligando se elige de tal forma que tenga afinidad por un receptor que se sabe que está presente en el tipo de célula de interés. Por ejemplo, Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), informaron que el virus de la leucemia murina de Moloney se puede modificar para expresar heregulina humana fusionada con gp70, y el virus recombinante infecta ciertas células humanas de cáncer de mama que expresan un receptor humano de factor de crecimiento epidérmico. Este principio se puede extender a otros pares de virus-célula diana, en los que la célula diana expresa un receptor y el virus expresa una proteína de fusión que comprende un ligando para el receptor de superficie celular. Por ejemplo, el fago filamentoso se puede manipular para presentar fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, FAb o Fv) que tienen afinidad de unión específica por prácticamente cualquier receptor celular elegido. Aunque la descripción anterior se aplica principalmente a vectores víricos, se pueden aplicar los mismos principios a vectores no víricos. Dichos vectores se pueden manipular para contener secuencias de captación específicas que favorecen la captación por células diana específicas.

Los vectores de genoterapia se pueden administrar in vivo por administración a un paciente individual, normalmente por administración sistémica (por ejemplo, infusión intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subdérmica o intracraneal), o administración tópica, como se describe a continuación. Alternativamente, se pueden administrar vectores a células ex vivo, tales como células explantadas de un paciente individual (por ejemplo, linfocitos, aspirados de médula ósea, biopsia de tejido) o células madre de donantes hematopoyéticos universales, seguido por reimplantación de las células en un paciente, normalmente después de la selección de células que han incorporado el vector.

Los vectores (por ejemplo, retrovirus, adenovirus, liposomas, etc.) que contienen nucleasas y/o construcciones donantes también se pueden administrar directamente a un organismo para la transducción de células in vivo. Alternativamente, se puede administrar ADN desnudo. La administración es por cualquiera de las vías usadas normalmente para introducir una molécula en contacto definitivo con la sangre o células de tejido que incluyen, pero no se limitan a, inyección, infusión, administración tópica y electroporación. Los métodos adecuados de administración de dichos ácidos nucleicos están disponibles y son bien conocidos por los expertos en la técnica, y, aunque se puede usar más de una vía para administrar una composición particular, una vía particular puede proporcionar frecuentemente una reacción más inmediata y más eficaz que otra vía.

Los vectores adecuados para la introducción de polinucleótidos (por ejemplo, donantes que codifican nucleasa y/o bicatenarios) descritos en el presente documento incluyen vectores lentivíricos no integrantes (IDLV). Véase, por ejemplo, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol,72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222; publicación de patente de EE. UU. N.22009/0117617.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas disponibles, como se describe a continuación (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., 1989).

Será evidente que las secuencias codificantes de nucleasa y construcciones donantes se pueden administrar usando los mismos sistemas o diferentes. Por ejemplo, las nucleasas y los donantes pueden ser transportados por el mismo MC de ADN. Alternativamente, un polinucleótido donante puede ser transportado por un MC, mientras que la una o más nucleasas pueden ser transportadas por un plásmido estándar o vector AAV. Además, los diferentes vectores se pueden administrar por las mismas vías o diferentes (inyección intramuscular, inyección en la vena de la cola, otra inyección intravenosa, administración intraperitoneal y/o inyección intramuscular). Los vectores se pueden administrar simultáneamente o en cualquier orden secuencial.

Por lo tanto, la presente divulgación incluye el tratamiento in vivo o ex vivo de enfermedades y afecciones que son susceptibles a la inserción de transgenes que codifican una proteína terapéutica. Las composiciones se administran a un paciente humano en una cantidad eficaz para obtener la concentración deseada del polipéptido terapéutico en el suero o el órgano o células diana. La administración puede ser mediante cualquier medio en el que los polinucleótidos se administran a las células diana deseadas. Por ejemplo, se contemplan métodos tanto in vivo como ex vivo. La inyección intravenosa a la vena porta es un método preferido de administración. Otros modos de administración in vivo incluyen, por ejemplo, inyección directa en los lóbulos del hígado o el conducto biliar e inyección intravenosa distal al hígado, que incluye a través de la arteria hepática, inyección directa al parénquima del hígado, inyección por la arteria hepática y/o inyección retrógrada a través del árbol biliar. Los modos de administración ex vivo incluyen la transducción in vitro de hepatocitos resecados u otras células del hígado, seguido por infusión de los hepatocitos resecados transducidos de nuevo en la vasculatura portal, parénquima del hígado o árbol biliar del paciente humano, véase, por ejemplo, Grossman et al., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.

La cantidad eficaz de nucleasa(s) y donante a administrar variarán de paciente a paciente y según el polipéptido terapéutico de interés. Por consiguiente, las cantidades eficaces se determinan mejor por el médico que administra las composiciones y un experto habitual en la técnica pueden determinar fácilmente las dosis apropiadas. Después de dejar un tiempo suficiente para la integración y expresión (normalmente 4-15 días, por ejemplo), el análisis de los niveles en suero u otro tejido del polipéptido terapéutico y la comparación con el nivel inicial antes de la administración determinarán si la cantidad que se administra es demasiado baja, dentro del intervalo correcto o demasiado alta. Los regímenes adecuados para las administraciones iniciales y posteriores también son variables, pero están tipificados por una administración inicial, seguida por administraciones posteriores si fuera necesario. Las administraciones posteriores se pueden administrar en intervalos variables, que varían desde diariamente, pasando por anualmente, hasta cada varios años. Un experto en la técnica apreciará que puedan ser recomendadas técnicas inmunosupresoras apropiadas para evitar la inhibición o el bloqueo de la transducción por inmunosupresión de los vectores de administración, véase, por ejemplo, Vilquin et al., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401.

Las formulaciones para tanto las administraciones ex vivo como in vivo incluyen suspensiones en líquido o líquidos emulsionados. Los principios activos se mezclan frecuentemente con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatibles con el principio activo. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares, y combinaciones de los mismos. Además, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como humectantes o emulsionantes, agentes de tamponamiento del pH, estabilizantes u otros reactivos que potencian la eficacia de la composición farmacéutica.

Células

En el presente documento también se describen células y/o estirpes celulares en las que se modifica una secuencia endógena del potenciador BCL11A. La modificación puede ser, por ejemplo, en comparación con la secuencia no mutante de la célula. La célula o estirpes celulares pueden ser heterocigóticas u homocigóticas para la modificación. Las modificaciones a la secuencia de BCL11A pueden comprender inserciones, deleciones y/o combinaciones de las mismas.

Según la divulgación en el presente documento, la secuencia de potenciador BCL11A se puede modificar por una nucleasa (por ejemplo, ZFN, TALEN, sistema CRISPR/Cas, sistema Ttago, etc.), por ejemplo una nucleasa como se describe en el presente documento. El potenciador BCL11A se puede modificar en cualquier parte entre el exón 2 y el exón 3. El potenciador BCL11A se puede modificar en las regiones mostradas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 o SEQ ID NO: 3 (Figura 11). La modificación es preferentemente en o cerca del (de los) sitio(s) de unión y/o escisión de nucleasa(s), por ejemplo, dentro de 1-300 (o cualquier valor intermedio) pares de bases en la dirección 5' o en la dirección 3' del (de los) sitio(s) de escisión, más preferentemente dentro de 1-100 pares de bases (o cualquier valor intermedio) de cualquier lado del (de los) sitio(s) de unión y/o escisión, incluso más preferentemente dentro de 1 a 50 pares de bases (o cualquier valor intermedio) en cualquier lado del (de los) sitio(s) de unión y/o escisión. La modificación puede ser en o cerca de la región ''+58" del potenciador BCL11 A, por ejemplo, en o cerca de un sitio de unión a nucleasa mostrado en cualquiera de SEQ ID NO: 4 a 80 y 362. La modificación puede ser en o cerca de la región ''+55" del potenciador BCL11 A, por ejemplo, en o cerca de un sitio de nucleasa mostrado en cualquiera de SEQ ID NO: 143 a 184 y 232-251.

Se puede modificar cualquier célula o estirpe celular, por ejemplo, una célula madre, por ejemplo, una célula madre embrionaria, una célula madre pluripotente inducida, una célula madre hematopoyética, una célula madre neuronal y una célula madre mesenquimatosa. Otros ejemplos no limitantes de células como se describen en el presente documento incluyen linfocitos T (por ejemplo, CD4+, CD3+, CD8+, etc.); células dendríticas; linfocitos B. También se desvela un descendiente de una célula madre, que incluye una célula parcialmente o completamente diferenciada, (por ejemplo, una RBC o célula precursora de RBC). Los ejemplos no limitantes de otras estirpes celulares que incluyen una secuencia de BCL11A modificada incluyen COS, Ch O (por ejemplo, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (por ejemplo, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) y células perC6, así como células de insecto, tales como Spodoptera frugiperda (Sf), o células fúngicas tales como Sacaromyces, Pichia y Schizosacaromyces.

Las células como se describen en el presente documento son útiles en el tratamiento y/o la prevención de un trastorno, por ejemplo, por terapias ex vivo. Las células modificadas por nucleasa pueden ser expandidas y a continuación reintroducidas en el paciente usando técnicas convencionales. Véase, por ejemplo, Tebas et al., (2014) New Eng J Med 370(10):901. En el caso de células madre, después de la infusión en el sujeto, también ocurre la diferenciación in vivo de estos precursores en células que expresan el transgén funcional. También se desvelan composiciones farmacéuticas que comprenden las células como se describen en el presente documento. Además, las células se pueden crioconservar antes de la administración a un paciente.

Cualquiera de las células o estirpes celulares modificadas desveladas en el presente documento puede mostrar una elevada expresión de globina gamma. También se desvelan composiciones, tales como composiciones farmacéuticas que comprenden las células genéticamente modificadas como se describe en el presente documento.

Aplicaciones

Los métodos y las composiciones desvelados en el presente documento son para modificar la expresión de proteínas, o corregir una secuencia de genes aberrante que codifica una proteína expresada en una enfermedad genética, tal como una drepanocitosis o una talasemia. Por lo tanto, los métodos y las composiciones proporcionan el tratamiento y/o la prevención de dichas enfermedades genéticas. Se puede usar la edición del genoma, por ejemplo, de células madre, para corregir un gen aberrante, insertar un gen natural, o cambiar la expresión de un gen endógeno. A modo de ejemplo no limitante, un gen natural, por ejemplo, que codifica al menos una globina (por ejemplo, globina a y/o p), se puede insertar en una célula (por ejemplo, en una secuencia del potenciador BCL11 a endógeno usando una o más nucleasas como se describe en el presente documento) para proporcionar las proteínas de globina deficientes y/o ausentes en la célula y, por lo tanto, tratar una enfermedad genética, por ejemplo, una hemoglobinopatía, provocada por una defectuosa expresión de globina. Alternativamente o además, la edición genómica con o sin administración del donante apropiado puede corregir el gen endógeno defectuoso, por ejemplo, corregir la mutación puntual en hemoglobina a o p, para restaurar la expresión del gen y/o tratar una enfermedad genética, por ejemplo drepanocitosis y/o inactivación o alteración (expresión en exceso o represión) de cualquier gen regulador de globina directo o indirecto (por ejemplo, inactivación del gen regulador de globina y BCL11A o el regulador de BCL11A KLF1). En concreto, las composiciones de la invención se han usado en el tratamiento o la prevención de hemoglobinopatías.

Las nucleasas descritas en el presente documento se dirigen a la región de potenciador BCL11A, que se sabe que requiere la expresión de BCL11A y, por tanto, la regulación por disminución de la expresión de globina gamma. La modificación de esta región de potenciador puede producir eritrocitos con elevada expresión de globina gamma, y así puede ser útil para el tratamiento o la prevención de drepanocitosis o beta talasemia.

Los siguientes ejemplos se refieren a realizaciones a modo de ejemplo de la presente divulgación en las que la nucleasa comprende una nucleasa de dedos de cinc (ZFN) o TALEN.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Ensamblaje de nucleasas de dedos de cinc y nucleasas TALEN

Se ensamblaron ZFN contra el gen humano BCL11A y se probaron por ensayos de CEL1 como se describen en Miller et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25:778-785. Las TALEN se ensamblaron como se describe en Miller et al., (2011) Nature Biotechnology 29 (2): 143-151. Además, véanse las solicitudes de patente del mismo solicitante 14/013.236 y la patente de e E. UU. N.° 8.586.526. Las TALEN se ensamblaron con la arquitectura 63.

Ejemplo 2: Introducción de deleciones en las regiones 55, 58 y 62 del potenciador BCL11A

Para probar qué regiones de la región de potenciador BCL11A intrón 2 (Figura 1) se requirieron para la represión de globina gamma durante la eritropoyesis, se prepararon una serie de TALEN para dirigirse a secciones de estas regiones (Figura 2). Los pares de TALEN se muestran a continuación en la Tabla 1. Los nucleótidos en el sitio diana que se ponen en contacto por la nucleasa se indican en mayúsculas; los nucleótidos no contactados se indican en minúscula.

Se cultivaron células humanas K562 en DMEM complementado con 10 % de FBS y se transfectaron 200.00 0células con 800 ng de ADN de plásmido que codificaba las TALEN por Amaxa Nucleofector® siguiendo las instrucciones del fabricante. Se usó el ensayo Cel-I (Surveyor™, Transgenomics) como se describe en Perez et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26: 808-816 y Guschin et al. (2010) Methods Mol Biol. 649:247-56) para detectar modificaciones del gen diana inducidas por TALEN. En este ensayo, la amplificación por PCR del sitio diana fue seguida por la cuantificación de inserciones y/o deleciones (indeles) usando la enzima detectora de desapareamientos Cel-I (Yang et al. (2000) Biochemistry 39: 3533-3541) que proporcionó una estimación del límite inferior de frecuencia de DSB. Se usó la secuenciación profunda en la plataforma Illumina ("miSEQ") según las instrucciones del fabricante para medir la eficiencia de edición, así como la naturaleza de los alelos generados por edición. Para detectar deleciones después del tratamiento de las células con más de un par de nucleasa, se usó un ensayo basado en PCR en el que el ADN genómico en masa se amplifica con cebadores que flanquean la región que se va a delecionar, y se usa un gel para separar el producto de PCR derivado del alelo no mutante y el derivado del alelo portador de la deleción. Todos los diseños mostrados en la Tabla 1 estuvieron activos.

Tres días después de la transfección del vector de expresión TALEN en condiciones estándar (37 °C), se aisló ADN genómico de células K562 usando el kit DNeasy (Qiagen) o QuickExtract (Epicentre) y se sometió a amplificación por PCR.

Los resultados del ensayo Cel-I mostraron que las TALEN fueron capaces de inducir la escisión en sus sitios diana respectivos.

Para probar el efecto sobre la expresión relativa de globina gamma, los ARNm que codificaban los pares de TALEN se introdujeron en células CD34+ (obtenidas de voluntarios donantes sanos) por nucleofección de BTX según las instrucciones del fabricante. Las células se diferenciaron entonces en eritrocitos. Brevemente, se purificaron células CD34+ usando Ficoll-Paque (GE Healthcare) y microperlas CD34+ (MiltenyiBiotec) según las instrucciones del fabricante. Se cultivaron células CD34+ en MDM de Iscove con BIT 95000 (StemCell Technologies) en presencia de factores de crecimiento. Las células se diferenciaron hacia el linaje eritroide usando un modelo de cultivo líquido de 3 etapas. Durante los 6 primeros días (primera fase), las células CD34+ se expandieron con SCF (100 ng/mL), Flt3-L (100 ng/mL) e IL-3 (20 ng/mL). A continuación, las células expandidas se sensibilizaron y diferenciaron hacia el linaje eritroide (segunda fase) con Epo (2 U/ml) y SCF (50 ng/mL). Véase Giarratana et al. (2011) Blood 118(19) :5071 -9.

Para analizar la expresión relativa de globina gamma, se determinaron las relaciones de ARNm que codificaban globina gamma y globina beta después del tratamiento con TALEN 14 días después de la introducción de TALEN por análisis Taqman®. El análisis se hizo por análisis Taqman® habitual, siguiendo el protocolo y usando ensayos específicos de genes suministrados por el fabricante (Applied Biosystems) y los conjuntos de cebadores suministrados. Los niveles relativos de globina gamma se normalizaron por el nivel de expresión de globina alfa o beta donde la relación se comparó con la relación alfa/beta o gamma/beta en células sin tratar. Los resultados (Figuras 3, 4 y 5) mostraron que las deleciones de regiones dentro del sitio hipersensible a DNAsaI de BCL11A 58 y 55 produjeron un aumento en los niveles relativos de expresión de globina gamma en estos experimentos.

Ejemplo 3: TALEN "atraviesan" el s itio hipersensible a DNAsaI 58 en BCL11A

Para definir más el área requerida para la actividad de potenciador en la región 58, se preparó una serie de TALEN para crear una serie de DSB y deleciones a través de este tramo de ADN. Las TALEN usadas en este experimento se muestran a continuación en la Tabla 2.

Tabla 2: TALEN usadas en la caminata del potenciador 58

En esta tabla, 'Muestra' se refiere a las muestras mostradas en la Figura 6. Los resultados muestran que el par de TALEN 102853/102852 (indicado por la flecha en la figura) fue capaz de aumentar la expresión relativa de gamma. Además, grandes deleciones introducidas por algunos conjuntos de pares de las TALEN (Muestra 24: par desde la Muestra 22 par desde la Muestra 6; Muestra 25: par desde la Muestra 16 par desde la Muestra 6; Muestra 26: par desde la Muestra 22 par desde la Muestra 16) también fueron capaces de aumentar la expresión gamma relativa. Las TALEN se manipularon en este estudio para sondar en toda la región 58 (véase la Figura 8 que representa la secuencia potenciadora y los sitios de escisión de TALEN). Todos los diseños mostrados en la Tabla 2 fueron activos.

Ejemplo 4: ZFN dirigidas a la región 58 del potenciador de BCL11A

En paralelo con los pares de TALEN descritos en el Ejemplo 3, se prepararon pares de ZFN para elegir como diana la región 58. Las ZFN usadas se muestran a continuación en la Tabla 3. Las nucleasas se identifican por su número "SBS", un identificador numérico único para cada proteína.

Tabla 3: Pares de ZFN específicos para la región 58 del potenciador BCL11A

Se usaron estas ZFN para escindir la región 58 del potenciador BCL11A en células CD34 y se analizaron células transfectadas para la expresión gamma relativa después de la diferenciación de eritrocitos. Se identificó un par de ZFN, 45844/45843, que causó un aumento en la expresión gamma relativa en comparación con células tratadas con un control de transducción de GFP, o células tratadas con otras ZFN. La Figura 8 muestra que el sitio dirigido por este par de ZFN se solapa parcialmente con el dirigido por el par de TALEN más activo descrito en el Ejemplo 3. Una inspección más de cerca de la secuencia que se escinde revela que contiene un sitio consenso "GATA-1" (A/T GATA A/G), que se sabe que es una de las secuencias unidas por GATA1 y factores de transcripción relacionados. Véase, por ejemplo, Martin y Orkin (1990) Genes Dev 4:1886-1898; Fujiwara et al. (2009) Molecular Cell 36:667-681; Tijssen et al. (2011) Developmental Cell 20:597-609; May et al. (2013) Cell Stem Cell 13:1-15. Todos los diseños mostrados en la Tabla 3 fueron activos.

Se amplificó por PCR una región que comprendía el sitio de escisión, y después de la amplificación, el producto de PCR se secuenció por análisis de secuenciación de alto rendimiento MiSeq según instrucciones del fabricante (Ilumina) para tanto los pares de ZFN 45843/45844 como de TALEN 102852/102853. Los 5 genotipos más comunes se muestran a continuación en las Tablas 5a y 5b, muestran escisión en o cerca de los sitios diana de nucleasa y revela una pérdida mediada por nucleasa de la secuencia consenso de GATA-1 (en el recuadro) en ambos casos (la Tabla 5a muestra SEQ ID n O: 201-205 de arriba a abajo; la Tabla 5b muestra SEQ ID NO: 206-210 de arriba a abajo). El par de TALEN escinde ligeramente en la dirección 3' de la secuencia consenso, posiblemente dando como resultado una menor incidencia de la inactivación de esta secuencia.

Tabla 5a. Análisis de MiSeq de la región de deleción para el par de ZFN 45843/45844

Tabla 5b. Análisis de MiSeq de la región de deleción para el par de ZFN 102852/102853

Ejemplo 5: TALEN atraviesan el sitio hipersensible a DNAsaI de 55 en la región del potenciador BCL11A Para refinar aún más el área requerida para la actividad de potenciador en la región 55, se preparó una serie de pares de TALEN para crear una serie de mutaciones en el tramo de ADN. Los pares de TALEN preparados en este experimento se muestran a continuación en la Tabla 4.

Tabla 4: Pares de TALEN que reconocen la región 55 del potenciador BCL11A

Las TALEN se introdujeron en células CD34+ como se ha descrito anteriormente y las células fueron inducidas para diferenciarse en células eritroides como se ha descrito anteriormente. El análisis T aqman® se realizó como se describe y se identificaron varios sitios que causaron un aumento en la expresión gamma relativa (Figura 9). Los sitios de escisión se presentan en la Figura 10. Todos los diseños mostrados en la Tabla 4 fueron activos. Es interesante señalar que uno de los pares de TALEN que condujo a un aumento en ARNm de globinas gamma escinde en otra secuencia consenso de GATA-1 (sitio de escisión 17 en la Figura 10).

Ejemplo 6: ZFN dirigidas al sitio hipersensible a la DNAsal 55 en BCL11A

Similar al Ejemplo 4, se preparó un conjunto de ZFN para sondar la región hipersensible a DNAsa I 55. Las ZFN se muestran a continuación en la Tabla 6.

Tabla 6: ZFN específicas de la región de potenciador 55: diseños y dianas

Se probaron ZFN específicas de la región 55 para la actividad de escisión usando el ensayo de Cel-I y se encontró que eran activas en células K562. Todos los diseños mostrados en la Tabla 6 fueron activos y la modificación génica inducida por ZFN, descrita como % de NHEJ (unión de extremos no homólogos) encontrada en cada par se enumera a continuación en la Tabla 7.

Tabla 7: Actividad de escisión de la región 55 del potenciador BCL11A de ZFN específicas en células K562

Las células CD34+ se transfectaron con los pares de ZFN como se describe para el Ejemplo 4, y luego se diferenciaron en eritrocitos como antes. Las ZFN mostradas en 6 se unieron a y modificaron la región 55 del potenciador BCL11A. Ejemplo 7: Aumento de la actividad de pares de ZFN específicos de 58

Las ZFN que se dirigen a la región 58 se refinaron aún más desplazando las secuencias diana, alterando la identidad de los dedos y usando conectores alternos entre el dominio de unión a ADN de dedos de cinc y los dominios de escisión de Fok\.

Se prepararon pares de ZFN para seleccionar como diana una secuencia muy próxima al sitio de escisión del par de ZFN 45843/45844. Los pares se muestran a continuación en la Tabla 8, y la localización de sus sitios de unión se muestra en la Figura 12A.

Como se puede apreciar en la Figura 12, el sitio de unión de los nuevos pares se localiza un par de bases más cerca del centro de la secuencia consenso de GATA-1. Todos los pares fueron activos para la unión y escisión de sus dianas en el genoma como se calibraron por un cribado inicial en células K562. Los ARNm que codifican las ZFN se sometieron a electroporación en células CD34+ y a continuación las células se diferenciaron en el linaje eritroide como se describe en el Ejemplo 2. Para analizar la expresión relativa de globina gamma, se determinaron las relaciones de ARNm que codifican globina gamma y globina beta después del tratamiento con ZFN por análisis Taqman® 14 días después de la introducción de ZFN. Los resultados (Figura 12B) demostraron que los pares de ZFN que se dirigían a los sitios de unión desplazados tuvieron una mayor influencia sobre la expresión de globina gamma.

A continuación, las proteínas se prepararon con tipos de conectores alternos para probar el efecto sobre las proteínas BCL11A. Se prepararon conjuntos similares de ZFN que comprendían las mismas hélices en los mismos dedos, pero donde cada uno contuvo diferentes conectores entre el dominio de unión a ADN de ZFP y la nucleasa FokI. Por ejemplo, ZFN 46801,46786, 46816 y 46934 tienen el mismo dominio de unión a ADN de ZFP, pero se unen al dominio de nucleasa usando los conectores L7a, L0, L8c4 y L7c5, respectivamente. Similarmente, las ZFN 45844 y 47021 tienen el mismo dominio de unión a ADN, pero 45844 tiene el conector L7a, mientras que 47021 usa el conector L7c5. Además, 46880, 47923, 50679 y 50680 tienen los mismos dominios de unión a ADN, pero 46880 usa el conector L7a; 47923 tiene el conector L7c5; 50679 usa L0[-1] y 50680 tiene L0[-3]. Los conectores se muestran en la Figura 14 y la Figura 17.

Como se muestra en la Figura 13, las ZFN se probaron en diversos pares donde un conjunto de pares se dirigió al sitio de unión tipificado por el dirigido por el par 45843/45844, y luego un segundo conjunto tipificado por el dirigido por 46801/46880. Los pares probados se muestran a continuación en la Tabla 9 del siguiente modo junto con el porcentaje de escisión (NHEJ) como se mide por análisis de secuencias en o el día 0 (D0) o el día 14 (D14). Cada punto de datos es una media de tres duplicados.

Tabla 9: Efecto del conector sobre la actividad de escisión de ZFN

Se diseñaron pruebas adicionales para medir el número de ediciones que contenían indeles que destruyeron el sitio GATA en la diana. En la Tabla 10 se muestra a continuación las combinaciones de ZFN con diversos conectores y el efecto que los conectores tienen en el aumento del porcentaje de indeles en general y el aumento en indeles que producen la pérdida del sitio de unión a GATA.

Tabla 10: Actividad de conector a modo de ejemplo

Como se puede apreciar en la tabla anterior, el refino del par original, 46801 (L7a)/47923 (L0), cuya actividad se midió en este experimento que era del 19 % de la formación de indeles total, con 86 % de los indeles medidos que tienen un sitio de unión a GATA destruido, puede conducir a un aumento global en la actividad de escisión (indeles) y a un aumento global en el porcentaje de indeles que condujeron a una destrucción de GATA. Véase, por ejemplo, 46934(L7c5)/47923 (L0) donde se observó el 47,8 % de indeles totales y el 92 % de los indeles tenía un sitio de g At A destruido. Estos y otros conectores descritos (véase la Figura 17) se pueden incorporar en las ZFN para aumentar y/o refinar la actividad.

Así, se pueden usar conectores alternos con los pares de ZFN descritos en el presente documento para escindir Bcl11a y aumentar la hemoglobina gamma con respecto a la hemoglobina alfa.

Ejemplo 8: Adm inistración in v iv o

Las composiciones que incluyen células (por ejemplo, HSC y/o células precursoras de RBC), proteínas (por ejemplo, nucleasas) y/o polinucleótidos (por ejemplo, que codifican nucleasas) como se describe en el presente documento se administran a un sujeto, por ejemplo un sujeto con una hemoglobinopatía, esencialmente como se describe en las patentes de EE. UU. N° 7.837.668; 8.092.429; la publicación de patente de EE. UU. N.° 20060239966; las patentes de EE. UU. N° 6.180.613; 6.503.888 y/o las patentes de EE. UU. N° 6.998.118 y 7.101.540 para proporcionar terapia para un sujeto en necesidad de la misma.

Además, las células se estudian para su uso en la producción a gran escala de LT-HSC editado. Se estimularon previamente células CD34+ en masa con citocinas que comprendían Stemspan™ CC110, ligando Flt-3, SCF y TPO y todas las combinaciones de los mismos en concentraciones desde 10 ng/mL hasta 1000 ng/mL. La estimulación previa puede requerir tiempos de exposición de 24, hasta 48 y hasta 72 horas. Para la transfección de HSPC a escala clínica, se puede usar cualquier sistema de alta capacidad (por ejemplo, el sistema de transfección de flujo Maxcyte GT).

Para las terapias ex vivo, se someten células editadas (por ejemplo, HSC) a ensayos de formación de colonias en medio de metilcelulosa para confirmar la frecuencia de células pluripotentes y para verificar que las colonias poseen la edición genética deseada en las frecuencias esperadas. Los estudios de metilcelulosa se llevan a cabo usando métodos conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Keller et al., (1993) Mol Cell Bio 13(1) :473).

Para garantizar aún más la capacidad de injerto de las células editadas con BLC11 a (por ejemplo, HSC), las células se injertan en un modelo de ratón relevante y/o un modelo de primate no humano. El injerto en estos animales se hace según métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo Holt et al. (2010) Nat Biotech 28, 839-847, Ho et al.,

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una célula genéticamente modificada que comprende deleciones y/o inserciones en una secuencia de potenciador BCL11a endógeno hechas por una nucleasa que comprende un dominio de escisión y un dominio de unión a ADN que se une a un sitio diana que comprende al menos 9 pares de bases de SEQ ID NO: 71 a 74.

2. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 1, en donde la célula es una célula madre.

3. La célula genéticamente modificada de la reivindicación 2, en donde la célula madre es una célula madre hematopoyética, tal como una célula madre hematopoyética CD34+.

4. Una célula diferenciada genéticamente modificada heredada de la célula madre de la reivindicación 2 o la reivindicación 3.

5. La célula diferenciada genéticamente modificada de la reivindicación 4, en donde la célula es una célula de glóbulo rojo (RBC).

6. La célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el dominio de unión a ADN comprende una proteína de dedos de cinc (ZFP), una proteína de dominio efector TAL o un ARN guía único de un sistema CRISPR/Cas.

7. Una composición farmacéutica que comprende la célula genéticamente modificada de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento o la prevención de una hemoglobinopatía.

9. La composición farmacéutica de la reivindicación 7 para su uso en un método de tratamiento o prevención de una hemoglobinopatía en un paciente en necesidad de un aumento en la expresión génica de globina, comprendiendo el método administrar al paciente la composición farmacéutica en una cantidad suficiente para aumentar la expresión génica de globina en el paciente.

10. La composición farmacéutica para el uso según la reivindicación 9, en donde la expresión génica de globina es el nivel de ARNm de globina o la proteína globina producida.

11. La composición farmacéutica para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en donde la hemoglobinopatía es una talasemia o drepanocitosis, tal como p-talasemia.