TW201839136A - 治療血色素異常症之組合物及方法 - Google Patents

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克里斯頓 史密特
珍妮佛 斯尼德
蘇珊Ｃ 史蒂芬森
毅 楊
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瑞士商諾華公司
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Abstract

本發明係關於用於治療血色素異常症之基因體編輯系統、試劑及方法。

Description

治療血色素異常症之組合物及方法
CRISPR (成叢規律間隔短回文重複序列)在細菌中演變為防禦病毒攻擊之適應性免疫系統。在暴露於病毒後，短病毒DNA片段被整合至細菌基因體之CRISPR基因座中。自CRISPR基因座之包括病毒序列之一部分轉錄RNA。含有與病毒基因體互補之序列之RNA介導Cas9蛋白質靶向病毒基因體中之序列。Cas9蛋白裂解，且由此使病毒靶標沉默。 近年來，CRISPR/Cas系統已適用於真核細胞中之基因體編輯。引入位點特異性單(SSB)或雙鏈斷裂(DSB)使得經由例如非同源末端連接(NHEJ)或同源性定向修復(HDR)而靶標序列更改。
在不受理論限制之情況下，本發明部分基於以下發現：CRISPR系統(例如，例如如本文中所描述之Cas9 CRISPR系統)可用於調節例如如本文中所描述之非缺失性HPFH區處之細胞(例如造血幹細胞及祖細胞(HSPC))，增加例如經修飾細胞之子代(例如紅血球子代)中胎兒血色素(HbF)表現及/或降低β血球蛋白(例如具有致病突變之β血球蛋白基因)之表現；及經修飾細胞(例如經修飾HSPC)可用於治療血色素異常症，例如鐮狀細胞疾病及β地中海型貧血。在一個態樣中，本文中出人意料地展示，向細胞(例如HSPC)中引入例如如本文中所描述之基因編輯系統(例如，CRISPR系統)，無已知HPFH突變或缺失映射至之基因體之靶區域產生經修飾HSPC (例如包含一或多個例如如本文中所描述之插入缺失的HSPC)，該等經修飾HSPC能夠有效地移植至生物體中，在所移植生物體中長期存留，且分化為包括具有胎兒血色素表現增加的紅血球。另外，此等經修飾HSPC能夠例如在(例如如本文中所描述之)幹細胞擴增劑存在下在維持幹性時使其擴增及增殖條件下離體培養。當將基因編輯系統(例如，例如如本文中所描述之CRISPR系統)引入至衍生自鐮狀細胞疾病患者之HPSC中時，相對於未經修飾的細胞群，經修飾細胞及其子代(例如紅血球系子代)出人意料地展示不僅胎兒血色素上調，且亦展示鐮狀β血球蛋白顯著降低及鐮狀細胞之數目顯著降低以及正常紅血球之數目增加。 因此，在一態樣中，本發明提供CRISPR系統(例如Cas CRISPR系統，例如Cas9 CRISPR系統，例如化膿性鏈球菌(S . pyogenes ) Cas9 CRISPR系統)，其包含一或多個(例如一個)如本文中所描述之gRNA分子。在此類系統中及在本文中所描述之方法及細胞中可使用本文中所描述之gRNA分子中之任一者。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括tracr及crRNA，其中該crRNA包括靶向域，該靶向域： a)與非缺失性HFPH區(例如人類非缺失性HPFH區)之靶標序列互補； b)與-鏈hg38之Chr11:5,249,833至Chr11:5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； c)與-鏈hg38之Chr11:5,254,738至Chr11:5,255,164處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； d)與-鏈hg38之Chr11:5,250,094-5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； e)與-鏈hg38之Chr11:5,255,022-5,255,164處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； f)與-鏈hg38之Chr11: 5,249,833-5,249,927處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； g)與-鏈hg38之Chr11: 5,254,738-5,254,851處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； h)與-鏈hg38之Chr11:5,250,139-5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補；或 i)其組合。 在實施例中，靶向域包括，例如由SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 72中之任一者組成。在實施例中，靶向域包括，例如由以下中之任一者組成：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 67。在實施例中，靶向域包括，例如由以下中之任一者組成：a) SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 51或SEQ ID NO: 67；或b) SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12或SEQ ID NO: 54。在實施例中，gRNA分子包括靶向域，該靶向域包括，例如由SEQ ID NO: 8組成。在實施例中，gRNA分子包括靶向域，該靶向域包括，例如由SEQ ID NO: 67組成。在實施例中，gRNA分子包括靶向域，該靶向域包括(例如由其組成)以上序列中之任一者之片段。 在前述態樣及實施例中之任一者中，gRNA分子可進一步具有本文中所描述之區及/或特性。在實施例中，gRNA分子包括前述靶向域中之任一者之片段。在實施例中，靶向域包括，例如由所引述靶向域序列中之任一者之17、18、19或20個連續核酸組成。在實施例中，所引述靶向域序列中之任一者之17、18、19或20個連續核酸為位於所引述靶向域序列之3'端處的17、18、19或20個連續核酸。在其他實施例中，所引述靶向域序列中之任一者之17、18、19或20個連續核酸為位於所引述靶向域序列之5'端處的17、18、19或20個連續核酸。在其他實施例中，所引述靶向域序列中之任一者之17、18、19或20個連續核酸不包括所引述靶向域序列之5'或3'核酸。在實施例中，靶向域由所引述靶向域序列組成。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，crRNA之一部分與tracr之一部分雜交，形成包括SEQ ID NO: 182或183之旗桿。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，旗桿進一步包括位於旗桿之crRNA部分3'之第一旗桿延長，其中該第一旗桿延長包括SEQ ID NO: 184。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，旗桿進一步包括位於旗桿之crRNA部分3'之第二旗桿延長及第一旗桿延長(若存在)，其中該第二旗桿延長包括SEQ ID NO: 185。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，tracr包括SEQ ID NO: 224或SEQ ID NO: 225。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，tracr包括SEQ ID NO: 232，視情況在3'端進一步包括另外1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，crRNA自5'至3'包括[靶向域]-：a) SEQ ID NO: 182；b) SEQ ID NO: 183；c) SEQ ID NO: 199；d) SEQ ID NO: 200；e) SEQ ID NO: 201；f) SEQ ID NO: 202；或g) SEQ ID NO:226。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，tracr自5'至3'包括：a) SEQ ID NO: 187；b) SEQ ID NO: 188；c) SEQ ID NO: 203；d) SEQ ID NO: 204；e) SEQ ID NO: 224；f) SEQ ID NO: 225；g) SEQ ID NO: 232；h) SEQ ID NO: 227；i) SEQ ID NO: 228；j) SEQ ID NO: 229；k)以上a)至j)中之任一者，其在3'端進一步包括至少1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸；l)以上a)至k)中之任一者，其在3'端進一步包括至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸；或m)以上a)至l)中之任一者，其在5'端(例如在5'末端)進一步包括至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，靶向域及tracr位於獨立核酸分子上。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，靶向域及tracr位於獨立核酸分子上，且包括靶向域之核酸分子包括SEQ ID NO: 201，視情況位於緊接著靶向域之3'，且包括tracr之核酸分子包括，例如由SEQ ID NO: 224組成。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，旗桿之crRNA部分包括SEQ ID NO: 201或SEQ ID NO: 202。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，tracr包括SEQ ID NO: 187或188及視情況位於SEQ ID NO: 187或188之5'之第一tracr延長(若存在第一旗桿延長)，該第一tracr延長包括SEQ ID NO: 189。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，靶向域及tracr位於單一核酸分子上，例如其中tracr位於靶向域之3'。在一態樣中，gRNA分子包括位於靶向域之3'及tracr之5'的環。在實施例中，環包括SEQ ID NO: 186。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，gRNA分子自5'至3'包括[靶向域]-：(a) SEQ ID NO: 195；(b) SEQ ID NO: 196；(c) SEQ ID NO: 197；(d) SEQ ID NO: 198；(e) SEQ ID NO: 231；或(f)以上(a)至(e)中之任一者，其在3'端進一步包括1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，靶向域及tracr位於單一核酸分子上，且其中該核酸分子包括，例如由該靶向域及視情況緊接著位於該靶向域之3'之SEQ ID NO: 231組成。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，該等包括gRNA分子之核酸分子中之一個，或視情況多於一個包括： a)該一或多個核酸分子之3'端處之一或多個(例如三個)硫代磷酸酯修飾； b)該一或多個核酸分子之5'端處之一或多個(例如三個)硫代磷酸酯修飾； c)該一或多個核酸分子之3'端處之一或多個(例如三個)2'-O-甲基修飾； d)該一或多個核酸分子之5'端處之一或多個(例如三個)2'-O-甲基修飾； e)該一或多個核酸分子之第4末端、第3末端及第2末端3'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾； f)該一或多個核酸分子之第4末端、第3末端及第2末端5'殘基之中之每一者處之2' O-甲基修飾；或 f)其任何組合。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 74； (b) SEQ ID NO: 75；或 (c) SEQ ID NO: 76。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 77組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 77組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 78組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 78組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 79； (b) SEQ ID NO: 80；或 (c) SEQ ID NO: 81。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 82組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 82組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 83組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 83組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 84； (b) SEQ ID NO: 85；或 (c) SEQ ID NO: 86。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 87組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 87組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 88組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 88組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 89； (b) SEQ ID NO: 90；或 (c) SEQ ID NO: 91。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 92組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 92組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 93組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 93組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 94； (b) SEQ ID NO: 95；或 (c) SEQ ID NO: 96。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 97組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 97組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 98組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 98組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 99； (b) SEQ ID NO: 100；或 (c) SEQ ID NO: 101。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 102組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 102組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 103組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 103組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 104； (b) SEQ ID NO: 105；或 (c) SEQ ID NO:106。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 107組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 107組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 108組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 108組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 109； (b) SEQ ID NO: 110；或 (c) SEQ ID NO: 111。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 112組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 112組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 113組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 113組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 114； (b) SEQ ID NO: 115；或 (c) SEQ ID NO:116。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 117組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 117組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 118組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 118組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 119； (b) SEQ ID NO: 120；或 (c) SEQ ID NO: 121。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 122組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 122組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 123組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 123組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 124； (b) SEQ ID NO: 125；或 (c) SEQ ID NO:126。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 127組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 127組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 128組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 128組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 129； (b) SEQ ID NO: 130；或 (c) SEQ ID NO: 131。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 132組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 132組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 133組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 133組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 134； (b) SEQ ID NO: 135；或 (c) SEQ ID NO:136。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 137組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 137組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 138組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 138組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 139； (b) SEQ ID NO: 140；或 (c) SEQ ID NO: 141。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 142組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 142組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 143組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 143組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 144； (b) SEQ ID NO: 145；或 (c) SEQ ID NO:146。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 147組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 147組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 148組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 148組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 149； (b) SEQ ID NO: 150；或 (c) SEQ ID NO: 151。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 152組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 152組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 153組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 153組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 154； (b) SEQ ID NO: 155；或 (c) SEQ ID NO:156。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 157組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 157組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 158組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 158組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 159； (b) SEQ ID NO: 160；或 (c) SEQ ID NO: 161。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 162組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 162組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 163組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 163組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 164； (b) SEQ ID NO: 165；或 (c) SEQ ID NO:166。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 167組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 167組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 168組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 168組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 169； (b) SEQ ID NO: 170；或 (c) SEQ ID NO: 171。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 172組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 172組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 173組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 173組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 174； (b) SEQ ID NO: 175；或 (c) SEQ ID NO:176。 在一態樣中，本發明提供一種gRNA分子，其包括，例如由以下序列組成： (a) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 177組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 177組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 178組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包括，例如由SEQ ID NO: 178組成；及tracr，其包括，例如由SEQ ID NO: 73組成。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，本發明提供一種gRNA分子，其中： a)當將包括gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，在與gRNA分子之靶向域互補之靶標序列處或附近形成插入缺失；及/或 b)當將包括gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，產生包括序列之缺失，例如包括同HBG1啟動子區中之gRNA靶向域互補(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之gRNA靶向域互補(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列。在實施例中，插入缺失並不包括非缺失性HPFH或轉錄因子結合位點之核苷酸。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，本發明提供一種gRNA分子，其中當將包括gRNA分子之系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞群體中時，在與群體之以下百分比的細胞中的gRNA分子的靶向域互補的靶標序列處或附近形成插入缺失：至少約15%、例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約30%、例如至少約40%、例如至少約50%、例如至少約55%、例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約75%。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，插入缺失包括HBG1啟動子區之至少一個核苷酸或HBG2啟動子區之至少一個核苷酸。在實施例中，群體之至少約15%之細胞包括以下：插入缺失，其包括HBG1啟動子區之至少一個核苷酸；及插入缺失，其包括HBG2啟動子區之至少一個核苷酸。在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，群體之包括含HBG1啟動子區之至少一個核苷酸之插入缺失之細胞的百分比與群體之包括含HBG2啟動子區之至少一個核苷酸之插入缺失之細胞的百分比相差至少約5%，例如至少約10%、例如至少約20%、例如至少約30%。在實施例中，如藉由下一代定序(NGS)來量測插入缺失。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，本發明提供一種gRNA分子，其中當將包括gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，胎兒血色素之表現在該細胞或其子代，例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代中增加。在實施例中，當將包括gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞群體中時，相對於未引入gRNA分子之細胞群體或其子代群體(例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代)中之F細胞之百分比，該群體或其子代(例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代)群體中之F細胞之百分比增加至少約15%，例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約25%、例如至少約30%、例如至少約35%、例如至少約40%。在實施例中，該細胞或其子代(例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代)產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，本發明提供一種gRNA分子，其中當將包括gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，在該細胞中不形成脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部(例如在基因，例如基因之編碼區內)不形成脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測。 在一態樣中，包括在前述態樣及實施例中之任一者中，本發明提供一種gRNA分子，其中當將包括gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞群體中時，在細胞群體之以下百分比之細胞中未偵測到脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部(例如在基因，例如基因之編碼區內)無脫靶插入缺失：多於約5%、例如多於約1%、例如多於約0.1%、例如多於約0.01%，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測。 在一態樣中，包括前述態樣及實施例中之任一者，細胞為(或細胞群體包括)哺乳動物、靈長類或人類細胞，例如為人類細胞，例如細胞為(或細胞群體包括)HSPC，例如HSPC為CD34+，例如HSPC為CD34+CD90+。在實施例中，細胞對於待投與該細胞之患者而言為自體的。在其他實施例中，細胞對於待投與該細胞之患者而言為同種異體的。 在一態樣中，本文中所描述之gRNA分子、基因體編輯系統(例如CRISPR系統)及/或方法係關於例如如本文中所描述之包括或產生以下特性中之一或多者的細胞： (a)本文中所描述之細胞群體之至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之細胞在與本文中所描述之gRNA分子的靶向域互補的基因體DNA序列處或附近包含插入缺失，視情況其中插入缺失選自表2-7中列舉的插入缺失，視情況其中群體中無細胞包含位於-鏈(hg38)之 5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失； (b)本文中所描述之細胞(例如細胞群體)能夠分化為紅血球系譜系之分化細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞例如相對於未更改細胞(例如細胞群體)呈現增加含量的胎兒血色素； (c)本文中所描述之細胞群體能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)； (d)本文中所描述之細胞(例如細胞群體)能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞(例如分化細胞群體)產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞； (e)在本文中所描述之細胞中不形成脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部(例如在基因，例如基因之編碼區內)不形成脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測； (f)在本文中所描述之細胞群體之多於約5%、例如多於約1%、例如多於約0.1%、例如多於約0.01%之細胞中未偵測到脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部(例如在基因，例如基因之編碼區內)無脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測； (g)本文中所描述之細胞或其子代在將其移植至之患者中於移植多於16週、多於20週或多於24週後為可偵測的，例如在骨髓中可偵測或在末梢血液中可偵測，視情況如藉由偵測與如技術方案1至22中任一項之gRNA分子之靶向域互補的基因體DNA序列處或附近的插入缺失來偵測，視情況其中插入缺失選自表2-7中列舉的插入缺失，視情況其中插入缺失為大型缺失插入缺失(deletion indel)； (h)本文中所描述之細胞群體能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體包括降低百分比的鐮狀細胞(例如低至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%百分比的鐮狀細胞)；及/或 (i)本文中所描述之細胞或細胞群體能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體包括產生降低含量(例如低至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%含量)的鐮狀血色素(HbS)的細胞。 在一態樣中，本發明提供一種組合物，其包括： 1)本文中所描述之(例如前述gRNA態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子(包括第一gRNA分子)，及例如本文中所描述之Cas9分子； 2)本文中所描述之(例如前述gRNA態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子(包括第一gRNA分子)，及編碼例如本文中所描述之Cas9分子之核酸； 3)編碼本文中所描述之(例如前述gRNA態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子(包括第一gRNA分子)及例如本文中所描述之Cas9分子的核酸； 4)編碼本文中所描述之(例如前述gRNA態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子(包括第一gRNA分子)的核酸，及編碼例如本文中所描述之Cas9分子的核酸；或 5)以上1)至4)中之任一者，及模板核酸；或 6)以上1)至4)中之任一者，及包括編碼模板核酸之序列之核酸。 在一態樣中，本發明提供一種組合物，其包括本文中所描述之(例如前述gRNA態樣及實施例中之任一者之)第一gRNA分子，進一步包括例如本文中所描述之Cas9分子，例如其中Cas9分子為活性或非活性化膿性鏈球菌Cas9，例如其中Cas9分子包括SEQ ID NO: 205。在態樣中，Cas9分子包括，例如由以下組成：(a) SEQ ID NO: 233、(b) SEQ ID NO: 234、(c) SEQ ID NO: 235、(d) SEQ ID NO: 236、(e) SEQ ID NO: 237、(f) SEQ ID NO: 238、(g) SEQ ID NO: 239、(h) SEQ ID NO: 240、(i) SEQ ID NO: 241、(j) SEQ ID NO: 242、(k) SEQ ID NO: 243或(l) SEQ ID NO: 244。 在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，第一gRNA分子及Cas9分子以核糖核酸蛋白複合物(RNP)存在。 在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，本發明提供一種組合物，其進一步包括：第二gRNA分子；第二gRNA分子及第三gRNA分子；或第二gRNA分子，視情況第三gRNA分子及視情況第四gRNA分子，其中第二gRNA分子、視情況存在之第三gRNA分子及視情況存在之第四gRNA分子為本文中所描述之gRNA分子，例如為前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之gRNA分子，且其中組合物之各gRNA分子與不同靶標序列互補。在實施例中，第一gRNA分子、第二gRNA分子、視情況存在之第三gRNA分子及視情況存在之第四gRNA分子中之兩個或更多個與同一基因或區內之靶標序列互補。在實施例中，第一gRNA分子、第二gRNA分子、視情況存在之第三gRNA分子及視情況存在之第四gRNA分子與相隔以下長度的靶標序列互補：不大於6000個核苷酸、不大於5000個核苷酸、不大於500、不大於400個核苷酸、不大於300、不大於200個核苷酸、不大於100個核苷酸、不大於90個核苷酸、不大於80個核苷酸、不大於70個核苷酸、不大於60個核苷酸、不大於50個核苷酸、不大於40個核苷酸、不大於30個核苷酸、不大於20個核苷酸或不大於10個核苷酸。在實施例中，第一gRNA分子、第二gRNA分子、視情況存在之第三gRNA分子及視情況存在之第四gRNA分子中之兩個或更多個包括：至少一個gRNA分子，其包括與HBG1啟動子區靶標序列靶標序列互補的靶向域；及至少一個gRNA分子，其包括與HBG2啟動子區之靶標序列互補的靶向域。在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，組合物包括(例如由其組成)第一gRNA分子及第二gRNA分子，其中第一gRNA分子及第二gRNA分子：(a)經獨立選擇，且靶向例如本文中所描述之非缺失性HPFH區，且與不同靶標序列互補；(b)獨立地選自表1之gRNA分子，且與不同靶標序列互補；c)獨立地選自表2之gRNA分子，且與不同靶標序列互補；或(d)獨立地選自表3a之gRNA分子，且與不同靶標序列互補；(e)獨立地選自表3b之gRNA分子，且與不同靶標序列互補；或(f)獨立地選自前述態樣及實施例中之任一者之gRNA分子，且與不同靶標序列互補。 在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，組合物包括第一gRNA分子及第二gRNA分子，其中： a)第一gRNA分子與包括以下內之至少1個核苷酸(例如包括20個連續核苷酸)的靶標序列互補： i) Chr11:5,249,833至Chr11:5,250,237 (hg38)； ii) Chr11:5,250,094-5,250,237 (hg38)； iii) Chr11: 5,249,833-5,249,927 (hg38)；或 iv) Chr11:5,250,139-5,250,237 (hg38)； b)第二gRNA分子與包括以下內之至少1個核苷酸(例如包含20個連續核苷酸)的靶標序列互補： i) Chr11:5,254,738至Chr11:5,255,164 (hg38)； ii) Chr11:5,255,022-5,255,164 (hg38)；或 iii) Chr11: 5,254,738-5,254,851 (hg38)。 在一態樣中，相對於組合物之gRNA分子組分，組合物由第一gRNA分子及第二gRNA分子組成。 在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，該等gRNA分子中之每一者呈與例如本文中所描述之Cas9分子的核糖核酸蛋白複合物(RNP)。 在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，組合物包括模板核酸，其中模板核酸包括對應於第一gRNA分子之靶標序列處或附近之核苷酸的核苷酸。在實施例中，模板核酸包括編碼以下之核酸：(a)人類β血球蛋白或其片段，例如包括突變G16D、E22A及T87Q中之一或多者的人類β血球蛋白；或(b)人類γ血球蛋白或其片段。 在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，組合物調配於適合於電穿孔之介質中。 在一態樣中，包括在前述組合物態樣及實施例中之任一者中，該組合物之該等gRNA分子中之每一者呈與本文中所描述之Cas9分子的RNP，且其中該RNP中之每一者在小於約10 μM之濃度下，例如小於約3 μM、例如小於約1 μM、例如小於約0.5 μM、例如小於約0.3 μM、例如小於約0.1 μM。在實施例中，RNP在約1 μM之濃度下。在實施例中，RNP在約2 μM之濃度下。在實施例中，該濃度為RNP於組合物中之濃度，該組合物包含例如如本文中所描述之細胞，視情況其中包含細胞及RNP之組合物適合於電穿孔。 在一態樣中，本發明提供一種核酸序列，其編碼本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子。在實施例中，核酸包括可操作地連接於編碼一或多個gRNA分子之序列之啟動子，例如啟動子為由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III識別之啟動子，或例如啟動子為U6啟動子或HI啟動子。 在一態樣中，包括在前述核酸態樣及實施例中之任一者中，核酸進一步編碼Cas9分子，例如，包括，例如由以下中之任一者組成的Cas9分子：SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 243或SEQ ID NO: 244。在實施例中，該核酸包括可操作地連接於編碼Cas9分子之序列之啟動子，例如EF-1啟動子、CMV IE基因啟動子、EF-1α啟動子、泛素C啟動子或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。 在一態樣中，本發明提供一種載體，其包括前述核酸態樣及實施例中之任一者之核酸。在實施例中，載體選自由以下組成的群組：慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、單純疱疹病毒(HSV)載體、質體、小環、奈米質體及RNA載體。 在一態樣中，本發明提供一種在細胞內之靶標序列處或附近更改該細胞(例如細胞群體) (例如更改核酸之結構(例如序列))的方法，包括使該細胞(例如細胞群體)與以下接觸(例如向其中引入)： 1)本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子，及例如本文中所描述之Cas9分子； 2)本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子，及編碼例如本文中所描述之Cas9分子之核酸； 3)編碼本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子及例如本文中所描述之Cas9分子的核酸； 4)編碼本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之)一或多個gRNA分子的核酸，及編碼例如本文中所描述之Cas9分子的核酸； 5)以上1)至4)中之任一者，及模板核酸； 6)以上1)至4)中之任一者，及包括編碼模板核酸之序列之核酸； 7)本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物；或 8)本文中所描述之載體，例如前述載體態樣及實施例中之任一者之載體。 在一態樣中，包括在前述方法態樣及實施例中之任一者中，gRNA分子或編碼gRNA分子之核酸，及Cas9分子或編碼Cas9分子之核酸，調配於單一組合物中。在另一態樣中，gRNA分子或編碼gRNA分子之核酸，及Cas9分子或編碼Cas9分子之核酸，調配於多於一個組合物中。在一態樣中，同時或依序遞送該多於一個組合物。 在本文所描述之方法之一態樣中，包括在前述方法態樣及實施例中之任一者中，細胞為動物細胞，例如細胞為哺乳動物、靈長類或人類細胞，例如細胞為造血幹細胞或祖細胞(HSPC) (例如HSPC群體)，例如細胞為CD34+細胞，例如細胞為CD34+CD90+細胞。在本文所描述之方法之實施例中，細胞位於包括已增濃CD34+細胞之細胞群體的組合物中。在本文所描述之方法之實施例中，細胞(例如細胞群體)已自骨髓、移動的末梢血液或臍帶血分離。在本文所描述之方法之實施例中，細胞對於待投與該細胞之患者而言為自體或同種異體的，例如自體的。 在本文所描述之方法之一態樣中，包括在前述方法態樣及實施例中之任一者中，a)更改在與一或多個gRNA分子之靶向域互補的基因體DNA序列處或附近產生插入缺失；或b)更改產生包括序列之缺失，例如同HBG1啟動子區中之一或多個gRNA分子之靶向域互補(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之一或多個gRNA分子之靶向域(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)互補的序列之間的實質上所有序列。在方法之態樣中，插入缺失為小於約40個核苷酸之插入或缺失，例如小於30個核苷酸、例如小於20個核苷酸、例如小於10個核苷酸，例如為單核苷酸缺失。 在本文所描述之方法之一態樣中，包括在前述方法態樣及實施例中之任一者中，該方法產生細胞群體，其中至少約15%、例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約30%、例如至少約40%、例如至少約50%、例如至少約55%、例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約75%之該群體已更改，例如包括插入缺失。 在本文所描述之方法之一態樣中，包括在前述方法態樣及實施例中之任一者中，更改產生能夠分化為紅血球系譜系之分化細胞(例如紅血球)的細胞(例如細胞群體)，且其中該分化細胞例如相對於未更改細胞(例如細胞群體)呈現增加含量的胎兒血色素。 在本文所描述之方法之一態樣中，包括在前述方法態樣及實施例中之任一者中，更改產生能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)的細胞群體，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)。 在本文所描述之方法之一態樣中，包括在前述方法態樣及實施例中之任一者中，更改產生能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)的細胞，且其中該分化細胞產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。 在一態樣中，本發明提供一種細胞，其藉由本文中所描述之方法(例如前述方法態樣及實施例中之任一者之方法)更改。 在一態樣中，本發明提供一種細胞，其可藉由本文中所描述之方法(例如前述方法態樣及實施例中之任一者之方法)獲得。 在一態樣中，本發明提供一種細胞，其包括本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣或實施例中之任一者之)第一gRNA分子或本文中所描述之(例如前述組合物態樣或實施例中之任一者之)組合物、本文中所描述之(例如前述核酸態樣或實施例中之任一者之)核酸或本文中所描述之(例如前述載體態樣或實施例中之任一者之)載體。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，細胞進一步包括例如本文中所描述之Cas9分子，例如包括以下中之任一者的Cas9分子：SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 243或SEQ ID NO: 244。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，細胞包括、已包括或將包括本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣或實施例中之任一者之)第二gRNA分子、或編碼該gRNA分子之核酸，其中第一gRNA分子及第二gRNA分子包括不同的靶向域。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，相對於尚未經修飾以包括gRNA分子之相同細胞類型之細胞或其子代，在該細胞或其子代(例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代)中胎兒血色素的表現增加。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，細胞能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞例如相對於尚未經修飾以包括gRNA分子之相同類型之細胞，呈現增加含量的胎兒血色素。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，分化細胞(例如紅血球系譜系之細胞，例如紅血球)例如相對於尚未經修飾以包括gRNA分子之相同類型之分化細胞，產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，細胞已與幹細胞擴增劑接觸，例如離體接觸，例如選自以下之幹細胞擴增劑：a) (1r,4r)-N1 -(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺；b) 4-(3-哌啶-1-基丙胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯；c) 4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-異丙基-9H-嘌呤-6-基胺基)乙基)苯酚；d) (S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇；或e)其組合(例如(1r,4r)-N1 -(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，細胞包括：a)與本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣或實施例中之任一者之)gRNA分子之靶向域互補的基因體DNA序列處或附近的插入缺失；或b)包括序列的缺失，例如同HBG1啟動子區中之本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣或實施例中之任一者之) gRNA分子之靶向域互補(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之本文中所描述之(例如前述gRNA分子態樣或實施例中之任一者之)gRNA分子之靶向域互補(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列。在一態樣中，插入缺失為小於約40個核苷酸之插入或缺失，例如小於30個核苷酸、例如小於20個核苷酸、例如小於10個核苷酸，例如插入缺失為單核苷酸缺失。 在本文中所描述之細胞之一態樣中，包括在前述細胞態樣及實施例中之任一者中，細胞為動物細胞，例如細胞為哺乳動物、靈長類或人類細胞。在一態樣中，細胞為造血幹細胞或祖細胞(HSPC) (例如HSPC群體)，例如細胞為CD34+細胞，例如細胞為CD34+CD90+細胞。在實施例中，細胞(例如細胞群體)已自骨髓、移動的末梢血液或臍帶血分離。在實施例中，細胞對於待投與該細胞之患者而言為自體的。在實施例中，細胞對於待投與該細胞之患者而言為同種異體的。 在一態樣中，本發明提供一種本文中所描述之細胞群體，例如包括本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞的細胞群體。在態樣中，本發明提供一種細胞群體，其中該群體之至少約50%，例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約80%、例如至少約90% (例如至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%)之細胞為本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者的細胞。在態樣中，細胞群體(例如細胞群體之細胞)能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於未經修飾的相同類型細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約17%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)。在態樣中，分化細胞群體之F細胞產生平均至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。 在一態樣中，包括在前述細胞群體態樣及實施例中之任一者中，本發明提供細胞群體，其包括：1)至少1e6個CD34+細胞/公斤待向其投與細胞之患者體重；2)至少2e6個CD34+細胞/公斤待向其投與細胞之患者體重；3)至少3e6個CD34+細胞/公斤待向其投與細胞之患者體重；4)至少4e6個CD34+細胞/公斤待向其投與細胞之患者體重；；或5) 2e6至10e6個CD34+細胞/公斤待向其投與細胞之患者體重。在實施例中，群體之至少約40%，例如至少約50% (例如至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%)之細胞為CD34+細胞。在實施例中，群體之至少約5%，例如至少約10%、例如至少約15%、例如至少約20%、例如至少約30%之細胞為CD34+CD90+細胞。在實施例中，細胞群體衍生自臍帶血、末梢血液(例如移動的末梢血液)或骨髓，例如衍生自骨髓。在實施例中，細胞群體包括，例如由哺乳動物細胞，例如人類細胞組成。在實施例中，細胞群體對於待將其投與至之患者而言為自體的。在其他實施例中，細胞群體對於待將其投與至之患者而言為同種異體的。 在一態樣中，本發明提供一種組合物，其包括本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞、或本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體。在一態樣中，組合物包括醫藥學上可接受之介質，例如適合於低溫保存之醫藥學上可接受之介質。 在一態樣中，本發明提供一種治療血色素異常症之方法，其包括向患者投與本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體；或本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物。 在一態樣中，本發明提供一種增加哺乳動物中之胎兒血色素表現之方法，其包括向患者投與本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體；或本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物。在態樣中，血色素異常症為β-地中海型貧血。在態樣中，血色素異常症為鐮狀細胞疾病。 在一態樣中，本發明提供一種製備細胞(例如細胞群體)之方法，其包括： (a)提供細胞(例如細胞群體) (例如HSPC (例如HSPC群體))； (b)在包括幹細胞擴增劑之細胞培養基中離體培養該細胞(例如該細胞群體)；以及 (c)向該細胞中引入例如本文中所描述之第一gRNA分子，例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之第一gRNA分子；編碼第一gRNA分子之核酸分子；本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物；或本文中所描述之載體，例如前述態樣及實施例中之任一者之載體。在方法之態樣中，在該引入步驟(c)之後，該細胞(例如細胞群體)能夠分化為分化細胞(例如分化細胞群體)，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球系譜系之細胞群體)，例如紅血球(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞(例如分化細胞群體)例如相對於尚未經受步驟(c)之相同細胞產生增加的胎兒血色素。在方法之態樣中，幹細胞擴增劑為：a) (1r,4r)-N1-(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺；b) 4-(3-哌啶-1-基丙胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯；c) 4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-異丙基-9H-嘌呤-6-基胺基)乙基)苯酚；d) (S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇；或e)其組合(例如(1r,4r)-N1-(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在態樣中，細胞培養基包括血小板生成素(Tpo)、Flt3配體(Flt-3L)及人類幹細胞因子(SCF)。在態樣中，細胞培養基進一步包括人類介白素-6 (IL-6)。在態樣中，細胞培養基包括各自在介於約10 ng/mL至約1000 ng/mL範圍內之濃度下之血小板生成素(Tpo)、Flt3配體(Flt-3L)及人類幹細胞因子(SCF)，例如各自在約50 ng/mL之濃度下，例如各自在50 ng/mL之濃度下。在態樣中，細胞培養基包括在介於約10 ng/mL至約1000 ng/mL範圍內之濃度下之人類介白素-6 (IL-6)，例如在約50 ng/mL之濃度下，例如在50 ng/mL之濃度下。在態樣中，細胞培養基包括在介於約1 nM至約1 mM範圍內之濃度下之幹細胞擴增劑，例如在介於約1 μM至約100 nM範圍內之濃度下，例如在介於約500 nM至約750 nM範圍內之濃度下。在態樣中，細胞培養基包括在約500 nM之濃度下之幹細胞擴增劑，例如在500 nM之濃度下。在態樣中，細胞培養基包括在約750 nM之濃度下之幹細胞擴增劑，例如在750 nM之濃度下。 在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，培養步驟(b)包括在引入步驟(c)前之培養時間，例如在引入步驟(c)前之培養時間為至少12小時，例如持續約1天至約12天之時間，例如持續約1天至約6天之時間，例如持續約1天至約3天之時間，例如持續約1天至約2天之時間，例如持續約2天之時間。在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，培養步驟(b)包括在引入步驟(c)後的培養時間，例如在引入步驟(c)後的培養時間為至少12小時，例如持續約1天至約12天的時間，例如持續約1天至約6天的時間，例如持續約2天至約4天的時間，例如持續約2天的時間，或持續約3天的時間，或持續約4天的時間。在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，細胞群體例如相對於不根據步驟(b)培養之細胞擴增至少4倍，例如至少5倍、例如至少10倍。 在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，引入步驟(c)包括電穿孔。在態樣中，電穿孔包括1至5個脈衝，例如1個脈衝，且其中各脈衝在700伏至2000伏介於範圍內之脈衝電壓下且具有介於10 ms至100 ms範圍內之脈衝持續時間。在態樣中，電穿孔包括，例如由1個脈衝組成。在態樣中，脈衝(或多於一個脈衝)電壓介於1500至1900伏範圍內，例如為1700伏。在態樣中，一個脈衝或多於一個脈衝之脈衝持續時間介於10 ms至40 ms範圍內，例如為20 ms。 在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，步驟(a)中提供之細胞(例如細胞群體)為人類細胞(例如人類細胞群體)。在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，步驟(a)中提供之細胞(例如細胞群體)係自骨髓、末梢血液(例如移動的末梢血液)或臍帶血分離。在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，步驟(a)中提供之細胞(例如細胞群體)係自骨髓分離，例如係自患有血色素異常症的患者的骨髓分離。 在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，步驟(a)中提供之細胞群體中的CD34+細胞經增濃。 在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，在引入步驟(c)之後，將細胞(例如細胞群體)低溫保存。 在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，在引入步驟(c)之後，細胞(例如細胞群體)包括：a)與第一gRNA分子的靶向域互補的基因體DNA序列處或附近的插入缺失；或b)包括序列的缺失，例如同HBG1啟動子區中的第一gRNA分子的靶向域互補(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中的第一gRNA分子的靶向域互補(例如與gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列。 在製備細胞(例如細胞群體)之方法之態樣中，包括在前述方法之態樣及實施例中之任一者中，在引入步驟(c)之後，該細胞群體之至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之細胞包括與第一gRNA分子的靶向域互補的基因體DNA序列處或附近的插入缺失。 在一態樣中，本發明提供一種細胞(例如細胞群體)，其可藉由本文中所描述之(例如前述製備細胞之方法態樣及實施例中之任一者中所描述)製備細胞(例如細胞群體)之方法獲得。 在一態樣中，本發明提供一種治療人類患者之血色素異常症之方法，其包括向人類患者投與組合物，該組合物包括本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；或本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體。在態樣中，血色素異常症為β-地中海型貧血。在態樣中，血色素異常症為鐮狀細胞疾病。 在一態樣中，本發明提供一種增加人類患者中之胎兒血色素表現之方法，其包括向該人類患者投與組合物，該組合物包括本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；或本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體。在態樣中，人類患者患有β-地中海型貧血。在態樣中，人類患者患有鐮狀細胞疾病。 在治療血色素異常症之方法或增加胎兒血色素表現之方法之態樣中，向人類患者投與組合物，該組合物包括至少約1e6個細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重，例如至少約1e6個CD34+細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重。在治療血色素異常症之方法或增加胎兒血色素表現之方法之態樣中，向人類患者投與組合物，該組合物包括至少約2e6個細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重，例如至少約2e6個CD34+細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重。在治療血色素異常症之方法或增加胎兒血色素表現之方法之態樣中，向人類患者投與組合物，該組合物包括約2e6個細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重，例如約2e6個CD34+細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重。在治療血色素異常症之方法或增加胎兒血色素表現之方法之態樣中，向人類患者投與組合物，該組合物包括至少約3e6個細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重，例如至少約3e6個CD34+細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重。在治療血色素異常症之方法或增加胎兒血色素表現之方法之態樣中，向人類患者投與組合物，該組合物包括約3e6個細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重，例如約3e6個CD34+細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重。在治療血色素異常症之方法或增加胎兒血色素表現之方法之態樣中，向人類患者投與組合物，該組合物包括約2e6至約10e6個細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重，例如約2e6至約10e6個CD34+細胞(例如如本文中所描述之細胞)/公斤人類患者體重。 在一態樣中，本發明提供：一種本文中所描述之gRNA分子，例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之gRNA分子；一種本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物；一種本文中所描述之核酸，例如前述核酸態樣及實施例中之任一者之核酸；一種本文中所描述之載體，例如前述載體態樣及實施例中之任一者之載體；一種本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；或一種本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體，其用作藥物。 在一態樣中，本發明提供：一種本文中所描述之gRNA分子，例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之gRNA分子；一種本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物；一種本文中所描述之核酸，例如前述核酸態樣及實施例中之任一者之核酸；一種本文中所描述之載體，例如前述載體態樣及實施例中之任一者之載體；一種本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；或一種本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體，其用於製造藥物。 在一態樣中，本發明提供：一種本文中所描述之gRNA分子，例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之gRNA分子；一種本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物；一種本文中所描述之核酸，例如前述核酸態樣及實施例中之任一者之核酸；一種本文中所描述之載體，例如前述載體態樣及實施例中之任一者之載體；一種本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；或一種本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體，其用於治療疾病。 在一態樣中，本發明提供：一種本文中所描述之gRNA分子，例如前述gRNA分子態樣及實施例中之任一者之gRNA分子；一種本文中所描述之組合物，例如前述組合物態樣及實施例中之任一者之組合物；一種本文中所描述之核酸，例如前述核酸態樣及實施例中之任一者之核酸；一種本文中所描述之載體，例如前述載體態樣及實施例中之任一者之載體；一種本文中所描述之細胞，例如前述細胞態樣及實施例中之任一者之細胞；或一種本文中所描述之細胞群體，例如前述細胞群體態樣及實施例中之任一者之細胞群體，其用於治療疾病，其中疾病為血色素異常症，例如β-地中海型貧血或鐮狀細胞疾病。
相關申請案之交叉參考本申請案主張2017年2月6日申請之美國臨時專利申請案第62/455,464號之優先權，其內容以全文引用的方式併入本文中。 序列表 本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用的方式併入本文中。該ASCII複本於2018年1月30日建立，名為PAT057603-WO-PCT_SL.txt且大小為258,837個位元組。 定義 術語「CRISPR系統」、「Cas系統」或「CRISPR/Cas系統」係指一組分子，其包含RNA引導的核酸酶或其他效應分子及gRNA分子，該gRNA分子一起為必需的且足以藉由RNA引導的核酸酶或其他效應分子引導及影響靶標序列處之核酸的修飾。在一個實施例中，CRISPR系統包含gRNA及Cas蛋白質，例如Cas9蛋白。包含Cas9或經修飾Cas9分子之此類系統在本文中稱為「Cas9系統」或「CRISPR/Cas9系統」。在一個實例中，gRNA分子及Cas分子可為複合的，以形成核糖核酸蛋白(RNP)複合物。 術語「引導RNA」、「引導RNA分子」、「gRNA分子」或「gRNA」可互換地使用，且係指一組核酸分子，其促進RNA引導的核酸酶或其他效應分子(通常與gRNA分子呈複合形式)針對靶標序列之特異性導引。在一些實施例中，該導引經由將gRNA之一部分雜交至DNA (例如經由gRNA靶向域)及藉由將gRNA分子之一部分結合至RNA引導的核酸酶或其他效應分子(例如至少經由gRNA tracr)來實現。在實施例中，gRNA分子由單個連續多核苷酸分子組成，其在本文中稱為「單一引導RNA」或「sgRNA」及其類似者。在其他實施例中，gRNA分子由複數個，通常兩個本身能夠通常經由雜交而結合之多核苷酸分子組成，其在本文中稱為「雙引導RNA」或「dgRNA」及其類似者。gRNA分子在下文更詳細地描述，但一般包括靶向域及tracr。在實施例中，靶向域及tracr位於單一多核苷酸上。在其他實施例中，靶向域及tracr位於獨立多核苷酸上。 如結合gRNA使用之術語「靶向域」為gRNA分子之識別靶標序列(例如細胞之核酸內(例如基因內)之靶標序列)，例如與靶標序列互補的部分。 如結合gRNA使用之術語「crRNA」為gRNA分子之包含靶向域及與tracr相互作用形成旗桿區之區的部分。 術語「靶標序列」係指與gRNA靶向域互補，例如完全互補之核酸序列。在實施例中，靶標序列位於基因體DNA上。在一實施例中，靶標序列與由具有核酸酶或其他效應活性之蛋白質識別之前間隔子相鄰基元(PAM)序列(例如由Cas9識別之PAM序列)相鄰(在同一鏈上或在DNA之互補鏈上)。在實施例中，靶標序列為影響血球蛋白基因之表現，例如影響β血球蛋白或胎兒血色素(HbF)之表現的基因或基因座內的靶標序列。在實施例中，靶標序列為例如在HBG1及/或HBG2啟動子區內之非缺失性HPFH區內之靶標序列。 如本文結合gRNA分子使用，術語「旗桿」係指gRNA之其中crRNA及tracr彼此結合或彼此雜交之部分。 如本文結合gRNA分子使用，術語「tracr」係指gRNA之結合至核酸酶或其他效應分子之部分。在實施例中，tracr包含特異性結合至Cas9之核酸序列。在實施例中，tracr包含形成旗桿之部分之核酸序列。 術語「Cas9」或「Cas9分子」係指來自造成DNA裂解之細菌II型CRISPR/Cas系統之酶。Cas9亦包括野生型蛋白以及其功能性及非功能性突變。在實施例中，Cas9為化膿性鏈球菌之Cas9。 如結合核酸所使用，術語「互補」係指鹼基之配對，A與T或U，及G與C。術語互補係指完全互補，亦即在整個參考序列中形成A與T或U配對及G與C配對的核酸分子；以及至少80%、85%、90%、95%、99%互補的分子。 如結合同源性定向修復或同源重組所使用，「模板核酸」係指待藉由CRISPR系統供體序列插入在修飾位點處以用於在剪切位點處基因修復(插入)的核酸。 如本文中所使用之術語「插入缺失」係指相對於參考核酸，包含一或多個核苷酸插入、一或多個核苷酸缺失或核苷酸插入與缺失之組合的核酸，其在暴露於包含gRNA分子之組合物(例如CRISPR系統)後產生。插入缺失可藉由在暴露於包含gRNA分子之組合物後定序核酸，例如藉由NGS來測定。關於插入缺失之位點，若插入缺失包含在參考位點之約10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸內之至少一個插入或缺失，或與該參考位點之部分或所有重疊(例如包含與同gRNA分子(例如本文中所描述之gRNA分子)之靶向域互補之位點之10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸重疊或在其內的至少一個插入或缺失)，則插入缺失稱為在參考位點(例如與gRNA分子之靶向域互補之位點)「處或附近」。在實施例中，插入缺失為大型缺失，其例如包含多於約1 kb、多於約2kb、多於約3kb、多於約4 kb、多於約5 kb、多於約6kb或多於約10 kb核酸。在實施例中，大型缺失之5'端、3'端或5'及3'端兩者位於本文中所描述之gRNA分子之靶標序列處或附近。在實施例中，大型缺失包含位於例如本文中所描述之位於HBG1啟動子區內之gRNA分子之靶標序列與例如本文中所描述之位於HBG2啟動子區內之gRNA分子之靶標序列之間的約4.9 kb DNA。 如本文中所使用之術語「插入缺失圖案」係指在暴露於包含gRNA分子之組合物後產生之一組插入缺失。在一實施例中，根據出現頻率，插入缺失圖案由頂部三個插入缺失組成。在一實施例中，根據出現頻率，插入缺失圖案由頂部五個插入缺失組成。在一實施例中，插入缺失圖案由以相對於所有定序讀段大於約1%頻率存在之插入缺失組成。在一實施例中，插入缺失圖案由以相對於所有定序讀段大於約5%頻率存在之插入缺失組成。在一實施例中，插入缺失圖案由以相對於插入缺失定序讀段(亦即，不由未經修飾之參考核酸序列組成之彼等讀段)之總數大於約10%頻率存在的插入缺失組成。在一實施例中，插入缺失圖案包括頂部五個最頻繁地觀測到之插入缺失之任何3個。插入缺失圖案可例如藉由本文中所描述之方法來測定，例如藉由定序暴露於gRNA分子之細胞群體之細胞。 本文中所使用之術語「脫靶插入缺失」係指除gRNA分子之靶向域之靶標序列以外之位點處或附近的插入缺失。此類位點可包含例如相對於gRNA之靶向域之序列1、2、3、4、5或更多個錯配核苷酸。在例示性實施例中，使用電腦預測之脫靶位點之靶向定序或藉由此項技術中已知之插入方法來偵測此類位點。關於本文中所描述之gRNA，脫靶插入缺失之實例為在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部之序列處形成之插入缺失。在例示性實施例中，脫靶插入缺失在基因之序列，例如在基因之編碼序列內中形成。 術語「一(a及an)」係指一個或多於一個(亦即至少一個)物品之語法對象。藉助於實例，「一元件(an element)」意謂一個元件或多於一個元件。 當涉及諸如量、暫態持續時間及其類似物之可量測值時，術語「約」意欲包涵相較於指定值±20%，或在一些情況下±10%，或在一些情況下±5%，或在一些情況下±1%，或在一些情況下±0.1%之變化，因為此類變化適合於進行所揭示之方法。 術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可涉及抗體產生或特異免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術者將理解，任何大分子，包括幾乎所有蛋白質或肽，可用作抗原。此外抗原可衍生自重組或基因體DNA。熟習此項技術者將理解，當在本文中使用彼術語時，包含編碼引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因此編碼「抗原」。此外，熟習此項技術者將理解，抗原不必僅藉由基因之全長核苷酸序列編碼。顯而易見，本發明包括(但不限於)多於一個基因之部分核苷酸序列之用途且此等核苷酸序列以各種組合排列以編碼引發所需免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者將理解，抗原根本無需藉由「基因」編碼。顯而易見，抗原可合成或可衍生自生物樣本或可為除多肽以外之大分子。此類生物樣本可包括(但不限於)組織樣本、細胞或具有其他生物組分之體液。 術語「自體」係指衍生自稍後將其再引入之同一個體的任何材料。 術語「同種異體」係指衍生自與引入材料之個體相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座處之基因不相同時，兩個或更多個個體稱為彼此同種異體。在一些態樣中，來自相同物種之個體的同種異體材料在基因上可足夠不同從而以抗原方式相互作用。 術語「異種」係指衍生自不同物種之動物的移植物。 本文中所使用之術語「衍生自」指示第一與第二分子之間的關係。其一般指第一分子與第二分子之間的結構相似性，且不涵蓋或包括對衍生自第二分子之第一分子的過程或來源限制。 術語「編碼」係指諸如基因、cDNA或mRNA之多核苷酸中之核苷酸之特異性序列在生物過程中用作合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性，該等聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列(例如rRNA、tRNA及mRNA)或已確定之胺基酸序列及由其獲得之生物特性。因此，若對應於基因之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因、cDNA或RNA編碼蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼鏈與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼鏈兩者均可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。 除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。片語編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列亦可包括內含子，其達到編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些形式中含有內含子之程度。 術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用，且係指如本文所描述能有效實現特定生物結果之化合物、調配物、材料或組合物之量。 術語「內源性」係指來自或在生物體、細胞、組織或系統內部產生之任何材料。 術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生之任何材料。 術語「表現」係指由啟動子驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。 術語「轉移載體」係指包含經分離核酸且可用於將經分離核酸遞送至細胞內部之物質組合物。許多載體為此項技術中已知，包括(但不限於)線性多核苷酸、與離子性或兩親媒性化合物相關之多核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。 術語「表現載體」係指包含重組性多核苷酸之載體，該重組性多核苷酸包含與待表現之核苷酸序列可操作地連接之表現控制序列。表現載體包含足夠順式作用元件用於表現；用於表現之其他元件可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之所有，包括併入重組性多核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或含於脂質體中)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。 術語「同源」或「一致性」係指在兩個聚合分子之間，例如在諸如兩個DNA分子或兩個RNA分子之兩個核酸分子之間，或在兩個多肽分子之間的次單位序列一致性。當兩個分子中之一次單位位置由相同單體次單位佔據時，例如當兩個DNA分子中每一者中之一位置均由腺嘌呤佔據時，則其在彼位置處為同源或一致的。兩個序列之間的同源性為匹配或同源位置數目之直接函數；例如若兩個序列中之位置有一半(例如，長度為十個次單位之聚合物中之五個位置)同源，則該兩個序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩個序列為90%同源。 術語「經分離」意謂自天然狀態更改或移除。舉例而言，天然存在於活的動物中之核酸或肽並非的「經分離」的，但自其天然狀態之共存物質部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離」的。經分離之核酸或蛋白質可以實質上純化形式存在，或可存在於諸如宿主細胞之非天然環境中。 術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調節序列與異源核酸序列之間的功能連接，其引起異源核酸序列之表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列處於官能性關係時，第一核酸序列與第二核酸序列可操作地連接。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接於編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且例如若接合兩個蛋白質編碼區時必要，則在同一閱讀框架中。 術語「非經腸」投與免疫性組合物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射、瘤內或輸注技術。 術語「核酸」或「多核苷酸」指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其單鏈或雙鏈形式之聚合物。除非明確限制，否則該術語包涵含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等已知類似物具有與參考核酸類似的結合特性且以與天然存在之核苷酸類似的方式代謝。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地包涵其經保守修飾之變體(例如，簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個(或所有)所選擇之密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列來達成(Batzer等人, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)；Ohtsuka等人, J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985)；及Rossolini等人, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。 術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且係指由藉由肽鍵共價連接之胺基酸殘基組成之化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸，且對可包含蛋白質或肽之序列之最大胺基酸數目無限制。多肽包括包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或更多個胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱為例如肽、寡肽及寡聚物)及長鏈(其在此項技術中一般稱為蛋白質，其存在多種類型)。「多肽」除其他之外包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽或其組合。 術語「啟動子」係指由細胞合成機制或引入之合成機制識別，起始多核苷酸序列之特異性轉錄所需之DNA序列。 術語「啟動子/調節序列」係指表現可操作地連接於啟動子/調節序列之基因產物所必需的核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下，此序列亦可包括增強子序列及表現基因產物所需的其他調節元件。啟動子/調節序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物的序列。 術語「組成性」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，在細胞之大多數或所有生理學條件下引起基因產物在細胞中產生之核苷酸序列。 術語「誘導性」啟動子係指當與編碼或指定基因產物之多核苷酸可操作地連接時，僅當細胞中存在對應於啟動子之誘導劑時才引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。 術語「組織特異性」啟動子係指當與編碼或指定基因之多核苷酸可操作地連接時，僅當細胞為對應於啟動子之組織類型的細胞時才引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。 如本文所使用，結合信使核糖核酸(mRNA)，5'端帽(亦稱為RNA端帽、RNA 7-甲基鳥苷端帽或RNA m7G端帽)為已在開始轉錄之後不久添加至真核信使RNA之「前端」或5'端之經修飾的鳥嘌呤核苷酸。5'端帽由連接至第一轉錄核苷酸之端基組成。其存在對於核糖體識別及保護免於RNase至關重要。端帽添加與轉錄偶合，且以共轉錄方式進行，使得各自彼此影響。在開始轉錄後不久，所合成之mRNA之5'端由與RNA聚合酶相關之端帽合成複合物結合。此酶促複合物催化mRNA加帽所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應形式進行。加帽部分可經修飾以調節mRNA之功能性，諸如其轉譯穩定性或效率。 如本文中所使用，「活體外轉錄RNA」係指已活體外合成之RNA，較佳mRNA。一般而言，活體外轉錄之RNA自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄之RNA的模板。 如本文中所使用，「poly(A)」為藉由聚腺苷酸化連接至mRNA的一連串腺苷。在短暫表現構築體之較佳實施例中，polyA為50至5000 (SEQ ID NO: 190)，較佳地大於64，更佳大於100，最佳大於300或400。poly(A)序列可經化學修飾或酶修飾以調節mRNA功能，諸如轉譯之位置、穩定性或效率。 如本文中所使用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷部分或其經修飾之變體與信使RNA分子共價連接。在真核生物中，大多數信使RNA (mRNA)分子在3'端經聚腺苷酸化。3' poly(A)尾為經酶(聚腺苷酸化聚合酶)之作用添加至前mRNA之腺嘌呤核苷酸長序列(通常幾百)。在高級真核生物中，poly(A)尾添加至含有特異性序列(聚腺苷酸化信號)之轉錄物上。poly(A)尾及其結合之蛋白質幫助保護mRNA免於被核酸外切酶分解。聚腺苷酸化對於轉錄終止、mRNA自細胞核輸出及轉譯亦為重要的。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生，但另外亦可稍後在細胞質中發生。轉錄已終止後，mRNA鏈經由與RNA聚合酶相關之核酸內切酶複合物的作用裂解。裂解位點通常表徵為在裂解位點附近存在鹼基序列AAUAAA。mRNA已裂解後，腺苷殘基添加至裂解位點之游離3'端。 如本文中所使用，「短暫」係指表現非整合轉殖基因持續幾小時、幾天或幾週之時段，其中若整合至基因體中或含於宿主細胞中之穩定質體複製子內時，則表現時間段小於基因表現時間段。 如本文中所使用，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指由於投與一或多個療法(例如一或多個治療劑，諸如gRNA分子、CRISPR系統或本發明之經修飾細胞)而減輕或改善病症(例如血色素異常症)之進展、嚴重程度及/或持續時間，或改善病症(例如血色素異常症)之一或多個症狀(較佳地，一或多個可辨別的症狀)。在特定實施例中，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指改善血色素異常症之不可由患者辨別的至少一個可量測物理參數。在其他實施例中，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指在物理上藉由例如穩定可辨別症狀、在生理上藉由例如穩定物理參數或兩者來抑制病症之進展。在其他實施例中，術語「治療(treat/treatment/treating)」係指減輕或穩定血色素異常症(例如鐮狀細胞疾病或β-地中海型貧血)之症狀。 術語「信號轉導路徑」係指在將信號自細胞之一個部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關係。短語「細胞表面受體」包括能夠跨越細胞膜接收信號及傳輸信號之分子及分子複合物。 術語「個體」意欲包括可引發免疫反應之活的生物體(例如，哺乳動物、人類)。 術語「實質上純化」細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上純化細胞亦指已與在其天然存在之狀態下通常與其結合之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上純化細胞群體係指同源細胞群體。在其他情況下，此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然結合之細胞分離的細胞。在一些態樣中，在活體外培養細胞。在其他態樣中，不在活體外培養細胞。 如本文所使用，術語「療法」意謂治療。藉由減輕、抑止、緩解或根除疾病病況來獲得治療效果。 如本文所使用，術語「防治」意謂疾病或疾病病況之預防性治療或保護性治療。 術語「轉染」或「轉形」或「轉導」係指將外源性核酸及/或蛋白質轉移至或引入至宿主細胞中的一種方法。經「轉染」或「轉形」或「轉導」細胞為已用外源核酸及/或蛋白質轉染、轉形或轉導的細胞。該細胞包括初級個體細胞及其後代。 術語「特異性結合」係指識別且與樣本中存在之結合配偶體(例如蛋白質或核酸)結合之分子，但該分子並不實質上識別或結合樣本中之其他分子。 術語「生物等效」係指產生等效於由參考劑量或參考量之參考化合物產生之效果的效果所需的除參考化合物以外的藥劑的量。 如本文所使用，「難治性」係指對治療不起反應之疾病，例如血色素異常症。在實施例中，難治性血色素異常症在治療開始前或在治療開始時可對治療具有抗性。在其他實施例中，難治性血色素異常症可在治療期間變得具有抗性。難治性血色素異常症亦稱為耐藥性血色素異常症。 如本文所使用，「復發性」係指疾病(例如血色素異常症)或疾病(諸如血色素異常症)之體徵及症狀在改善一段時間後，例如在療法(例如血色素異常症療法)之先前治療後恢復。 範圍：在本發明通篇中，本發明之各種態樣可以範圍形式呈現。應理解，範圍形式中之描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明範疇的固定限制。因此，範圍之描述應視為已特定揭示所有可能的子範圍以及該範圍內之個別數值。舉例而言，對諸如1至6之範圍之描述應視為已特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等子範圍以及該範圍內之個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95%-99%一致性之範圍包括95%、96%、97%、98%或99%之一致性，且包括子範圍，諸如96%-99%、96%-98%、96%-97%、97%-99%、97%-98%及98%-99%之一致性。不管範圍之寬度如何，此均適用。 術語「BCL11a」係指B細胞淋巴瘤/白血病11A，一種RNA聚合酶II核心啟動子近端區序列特異性DNA結合蛋白及與所有內含子及外顯子一起編碼該蛋白質之基因。此基因編碼C2H2型鋅指蛋白。已發現BCL11A在抑止胎兒血色素產生中起作用。BCL11a亦稱為B細胞CLL/淋巴瘤11A (鋅指蛋白)、CTIP1、EVI9、親嗜性病毒整合位點9蛋白同源物、COUP-TF相互作用蛋白1、鋅指蛋白856、KIAA1809、BCL-11A、ZNF856、EVI-9及B細胞CLL/淋巴瘤11A。該術語包涵BLC11a之所有同功異型物及剪接變體。編碼BCL11a之人類基因被映射至染色體位置2p16.1 (藉由Ensembl)。人類與鼠類胺基酸及核酸序列可在公用資料庫，諸如GenBank、UniProt及Swiss-Prot，中找到，且人類BCL11a之基因體序列可在GenBank中之NC_000002.12處找到。BCL11a基因係指此基因體位置，包括所有內含子及外顯子。存在多種已知之BCL11a同型。 編碼人類BCL11a之同功異型物1之mRNA序列可在NM_022893處找到。 人類BCL11a之同功異型物1之肽序列為： SEQ ID NO: 245 (標識符Q9H165-1；以及NM_022893.3；以及寄存號ADL14508.1)。 其他BCL11a蛋白同功異型物之序列在以下提供： 同功異型物2：Q9H165-2 同功異型物3：Q9H165-3 同功異型物4：Q9H165-4 同功異型物5： Q9H165-5 同功異型物6：Q9H165-6 如本文中所使用，人類BCL11a蛋白亦包涵在其全長內與BCL11a同功異型物1-6具有至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%之蛋白質，其中此類蛋白質仍具有BCL11a之至少一個功能。 如本文所使用，術語「血球蛋白基因座」係指人類染色體11之包含胚胎(ε)、胎兒(G(γ)及A(γ))、成年血球蛋白基因(γ及β)、基因座對照區及DNA酶I超敏反應位點之基因的區。 如結合核酸所使用，術語「互補」係指鹼基之配對，A與T或U，及G與C。術語互補係指完全互補，亦即在整個參考序列中形成A與T或U配對及G與C配對的核酸分子；以及至少80%、85%、90%、95%、99%互補的分子。 術語「非缺失性HPFH」係指不包含產生胎兒血色素之遺傳持續且特徵在於成年紅血球中之胎兒血色素增加之一或多個核苷酸的插入或缺失的突變。在例示性實施例中，非缺失性HPFH為在Nathan and Oski's Hematology and Oncology of Infancy and Childhood, 第8版, 2015, Orkin SH, Fisher DE, Look T, Lux SE, Ginsburg D, Nathan DG編, Elsevier Saunders中描述之突變，其全部內容以引用之方式併入本文中，例如表21-5處描述之非缺失性HPFH突變。術語「非缺失性HPFH區」係指包含非缺失性HPFH或在其附近之基因體位點。在例示性實施例中，非缺失性HPFH區為：HBG1啟動子區(-鏈hg38之Chr11:5,249,833至Chr11:5,250,237)之核酸序列、HBG2啟動子區(-鏈hg38之Chr11:5,254,738至Chr11:5,255,164)之核酸序列或其組合。在例示性實施例中，非缺失性HPFH區包括在Nathan and Oski's Hematology and Oncology of Infancy and Childhood, 第8版, 2015, Orkin SH, Fisher DE, Look T, Lux SE, Ginsburg D, Nathan DG編, Elsevier Saunders (例如表21-5中所描述)中描述之非缺失性HPFH中之一或多者。在例示性實施例中，非缺失性HPFH區為：-鏈hg38之chr11:5,250,094-5,250,237處之核酸序列；或-鏈hg38之chr11:5,255,022-5,255,164處之核酸序列；或-鏈hg38之chr11: 5,249,833-5,249,927處之核酸序列；或-鏈hg38之chr11: 5,254,738-5,254,851處之核酸序列；或-鏈hg38之chr11:5,250,139-5,250,237處之核酸序列；或其組合。 如本文中所使用之術語「BCL11a增強子」係指影響，例如增強BCL11a之表現或功能之核酸序列。參見例如Bauer等人, Science, 第342卷, 2013, 第253-257頁。BCL11a增強子可例如僅在某些細胞類型(例如紅血球系譜系之細胞)中為可操作的。BCL11a增強子之一個實施例為BCL11a基因之外顯子2與外顯子3之間的核酸序列(例如在以下位置處或對應於其之核酸：如hg38中記錄之+55：Chr2:60497676-60498941；+58：Chr2:60494251-60495546；+62：Chr2:60490409-60491734)。在一實施例中，BCL11a增強子為BCL11a基因之外顯子2與外顯子3之間的核酸序列之+62區。在一實施例中，BCL11a增強子為BCL11a基因之外顯子2與外顯子3之間的核酸序列之+58區。在一實施例中，BCL11a增強子為BCL11a基因之外顯子2與外顯子3之間的核酸序列之+55區。 術語「造血幹細胞及祖細胞」或「HSPC」可互換地使用，且係指包含造血幹細胞(「HSC」)及造血祖細胞(「HPC」)兩者之細胞群體。此類細胞例如表徵為CD34+。在例示性實施例中，自骨髓分離HSPC。在其他例示性具體實例中，自末梢血液分離HSPC。在其他例示性具體實例中，自臍帶血分離HSPC。在一實施例中，HSPC表徵為CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-。在實施例中，HSPC表徵為CD34+/CD90+/CD49f+細胞。在實施例中，HSPC表徵為CD34+細胞。在實施例中，HSPC表徵為CD34+/CD90+細胞。在實施例中，HSPC表徵為CD34+/CD90+/CD45RA-細胞。 如本文所使用，「幹細胞擴增劑」係指使細胞(例如HSPC、HSC及/或HPC)相對於不存在該藥劑之相同細胞類型以更快速率增殖(例如數目增加)的化合物。在一個例示性態樣中，幹細胞擴增劑為芳基烴受體路徑之抑制劑。幹細胞擴增劑之其他實例提供於下。在實施例中，離體實現增殖(例如數目增加)。 「移植(Engraftment/engraft)」係指將細胞或組織(例如HSPC群體)併入至接受者(例如哺乳動物或人類個體)之身體中。在一個實例中，移植包括所移植細胞在接受者體內之生長、擴增及/或分化。在一實例中，HSPC之移植包括該等HSPC在接受者之身體內分化為紅血球系細胞及生長。 如本文所使用，術語「造血祖細胞(HPC)」係指原始造血細胞，其視造血層級內之位置而定具有自我更新及多譜系分化(例如骨髓、淋巴)、單譜系分化(例如骨髓或淋巴)或細胞類型受限的分化(例如紅血球系祖細胞)之潛力的有限能力(Doulatov等人, Cell Stem Cell 2012)。 如本文所使用，「造血幹細胞(HSC)」係指未成熟的血細胞，其具有自我更新及分化為更成熟血細胞的能力，該等血球包含粒細胞(例如前骨髓細胞、嗜中性球、嗜酸性球、嗜鹼性球)、紅血球(例如網狀紅血球、紅血球)、凝血細胞(例如巨核細胞母細胞、血小板產生巨核細胞、血小板)及單核球(例如單核球、巨噬細胞)。HSC在整個說明書中互換地描述為幹細胞。此項技術中已知，此類細胞可能或可能不包括CD34+細胞。CD34+細胞為表現CD34細胞表面標記之未成熟的細胞。認為CD34+細胞包括具有上文所定義之幹細胞特性之細胞亞群。此項技術中熟知，HSC為可產生原始祖細胞(例如多能祖細胞)及/或限於特異性造血譜系之祖細胞(例如淋巴祖細胞)的多能細胞。限於特異性造血譜系之幹細胞可為T細胞譜系、B細胞譜系、樹突狀細胞譜系、蘭格漢氏細胞(Langerhans cell)譜系及/或淋巴組織特異性巨噬細胞細胞譜系。另外，HSC亦係指長期HSC (LT-HSC)及短期HSC (ST-HSC)。ST-HSC比LT-HSC具有更高的活性及更高的增殖性。然而，LT-HSC具有無限的自我更新(亦即，其貫穿成年期存活)，而ST-HSC具有有限的自我更新(亦即，其僅存活有限時間段)。此等HSC中之任一者可在本文所描述之方法中之任一者中使用。視情況，ST-HSC為適用的，因為其為高度增殖的且因此HSC及其子代之數目快速增加。造血幹細胞視情況獲自血液製品。血液製品包括獲自含有造血源之細胞之身體或身體器官的製品。此類來源包括未分級的骨髓、臍帶、末梢血液(例如移動的末梢血液，例如與移動藥劑移動，該等移動藥劑諸如G-CSF或Plerixafor® (AMD3100)，或G-CSF與Plerixafor® (AMD3100)之組合)、肝、胸腺、淋巴及脾。可以熟習此項技術者已知之方式對所有前述粗物質或未分級的血液製品之具有造血幹細胞特徵之細胞進行增濃。在一實施例中，HSC表徵為CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-。在實施例中，HSC表徵為CD34+/CD90+/CD49f+細胞。在實施例中，HSC表徵為CD34+細胞。在實施例中，HSC表徵為CD34+/CD90+細胞。在實施例中，HSC表徵為CD34+/CD90+/CD45RA-細胞。 在細胞之上下文中，「擴增(Expansion/Expand)」係指特徵細胞類型或可能相同或可能不相同之來自初始細胞群之細胞類型的數目增加。用於擴增之原始細胞可能與由擴增產生之細胞不相同。 「細胞群體」係指自生物來源分離且衍生自多於一個細胞之真核哺乳動物，較佳地人類細胞，該等生物來源例如血液製品或組織。 當「增濃的」用於細胞群體之上下文中時，係指基於一或多個標記(例如CD34+)之存在而選擇之細胞群體。 術語「CD34+細胞」係指在其表面表現CD34標記之細胞。CD34+細胞可使用例如流式細胞測量術及螢光標記之抗CD34抗體來偵測及計數。 「CD34+細胞增濃」意謂，細胞群體已基於CD34標記之存在而選擇。因此，選擇方法後之CD34+細胞於細胞群體中之百分比高於基於CD34標記選擇步驟前之初始細胞群體中之CD34+細胞的百分比。舉例而言，CD34+細胞可表示CD34+細胞增濃之細胞群體中之至少50%、60%、70%、80%或至少90%之細胞。 術語「F細胞(F cell/F-cell)」係指含有及/或產生(例如表現)胎兒血色素之細胞，通常紅血球(例如紅血球)。舉例而言，F細胞為含有或產生可偵測含量之胎兒血色素之細胞。舉例而言，F細胞為含有或產生至少5皮克胎兒血色素之細胞。在另一實例中，F細胞為含有或產生至少6皮克胎兒血色素之細胞。在另一實例中，F細胞為含有或產生至少7皮克胎兒血色素之細胞。在另一實例中，F細胞為含有或產生至少8皮克胎兒血色素之細胞。在另一實例中，F細胞為含有或產生至少9皮克胎兒血色素之細胞。在另一實例中，F細胞為含有或產生至少10皮克胎兒血色素之細胞。胎兒血色素之含量可使用本文中所描述之分析法或藉由此項技術中已知之其他方法來量測，例如使用抗胎兒血色素偵測試劑之流式細胞測量術、高效液相層析、質譜分析或酶聯免疫吸附分析。 除非另外陳述，否則所有基因體或染色體座標均根據hg38。 本文中所描述之gRNA分子、組合物及方法係關於真核細胞中使用CRISPR/Cas9系統編輯之基因體。特定言之，本文中所描述之gRNA分子、組合物及方法係關於調節血球蛋白含量，且適用於例如調整血球蛋白基因及蛋白質之表現及產生。gRNA分子、組合物及方法可適用於治療血色素異常症。I . gRNA 分子 gRNA分子可具有多個域，如下文更充分地描述，然而gRNA分子通常包含至少一crRNA域(包含靶向域)及一tracr。本發明之用作CRISPR系統之組分之gRNA分子適用於修飾靶位點處或附近之DNA (例如修飾序列)。此類修飾包括引起例如包含靶位點之基因之功能性產物之表現降低或消除的缺失及/或插入。此等用途及其他用途在下文更充分地描述。 在一實施例中，單分子的或sgRNA包含，較佳地自5'至3'：crRNA (其含有與靶標序列互補之靶向域及形成旗桿之部分之區(亦即，crRNA旗桿區))；環；以及tracr (其含有與crRNA旗桿區互補之域及另外結合核酸酶或其他效應分子(例如Cas分子，例如Cas9分子)之域)，且可採用以下形式(自5'至3')： [靶向域]-[crRNA旗桿區]-[視情況存在之第一旗桿延長]-[環]-[視情況存在之第一tracr延長]-[tracr旗桿區]-[tracr核酸酶結合域]。 在實施例中，tracr核酸酶結合域結合至Cas蛋白質，例如Cas9蛋白。 在一實施例中，雙分子的或dgRNA包含兩個多核苷酸；第一個，較佳地自5'至3'：crRNA (其含有與靶標序列互補之靶向域及形成旗桿之部分之區)；以及第二個，較佳地自5'至3'：tracr (其含有與crRNA旗桿區互補之域及另外結合核酸酶或其他效應分子(例如Cas分子，例如Cas9分子)之域，且可採用以下形式(自5'至3')： 多核苷酸1 (crRNA)：[靶向域]-[crRNA旗桿區]-[視情況存在之第一旗桿延長]-[視情況存在之第二旗桿延長] 多核苷酸2 (tracr)：[視情況存在之第一tracr延長]-[tracr旗桿區]-[tracr核酸酶結合域] 在實施例中，tracr核酸酶結合域結合至Cas蛋白質，例如Cas9蛋白。 在一些態樣中，靶向域包含以下或由以下組成：本文中所描述之靶向域序列，例如表1中描述之靶向域；或靶向域，其包含以下或由以下組成之：表1中描述之靶向域序列之17、18、19或20個(較佳地20)連續核苷酸。 在一些態樣中，旗桿，例如crRNA旗桿區，自5'至3'包含：GUUUUAGAGCUA (SEQ ID NO: 182)。 在一些態樣中，旗桿，例如crRNA旗桿區，自5'至3'包含：GUUUAAGAGCUA (SEQ ID NO: 183)。 在一些態樣中，環自5'至3'包含：GAAA (SEQ ID NO: 186)。 在一些態樣中，tracr自5'至3'包含：UAGCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 187)且較佳地在包含SEQ ID NO 182之gRNA分子中使用。 在一些態樣中，tracr自5'至3'包含：UAGCAAGUUUAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 188)且較佳地在包含SEQ ID NO 183之gRNA分子中使用。 在一些態樣中，gRNA亦可在3'端包含額外U核酸。舉例而言，gRNA可在3'端包含額外1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個U核酸(SEQ ID NO: 249)。在一實施例中，gRNA在3'端包含額外4個U核酸。在dgRNA之情況下，dgRNA之多核苷酸中之一或多者(例如包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸)在3'端可包含額外U核酸。舉例而言，在dgRNA之情況下，dgRNA之多核苷酸中之一或多者(例如包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸)可在3'端包含額外1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個U核酸(SEQ ID NO: 249)。在一實施例中，在dgRNA之情況下，dgRNA之多核苷酸中之一或多者(例如包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸)可在3'端包含額外4個U核酸。在dgRNA之一實施例中，僅包含tracr之多核苷酸包含額外U核酸，例如4個U核酸。在dgRNA之一實施例中，僅包含靶向域之多核苷酸包含額外U核酸。在dgRNA之一實施例中，包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸兩者均包含額外U核酸，例如4個U核酸。 在一些態樣中，gRNA亦可在3'端包含額外A核酸。舉例而言，gRNA可在3'端包含額外1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個A核酸(SEQ ID NO: 250)。在一實施例中，gRNA在3'端包含額外4個A核酸。在dgRNA之情況下，dgRNA之多核苷酸中之一或多者(例如包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸)可在3'端包含額外A核酸。舉例而言，在dgRNA之情況下，dgRNA之多核苷酸中之一或多者(例如包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸)可在3'端包含額外1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個A核酸(SEQ ID NO: 250)。在一實施例中，在dgRNA之情況下，dgRNA之多核苷酸中之一或多者(例如包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸)在3'端包含額外4個A核酸。在dgRNA之一實施例中，僅包含tracr之多核苷酸包含額外A核酸，例如4個A核酸。在dgRNA之一實施例中，僅包含靶向域之多核苷酸包含額外A核酸。在dgRNA之一實施例中，包含靶向域之多核苷酸及包含tracr之多核苷酸兩者均包含額外U核酸，例如4個A核酸。 在實施例中，gRNA分子之多核苷酸中之一或多者可在5'端包含端帽。 在一實施例中，單分子的或sgRNA包含，較佳地自5'至3'：crRNA (其含有與靶標序列互補之靶向域)；crRNA旗桿區；第一旗桿延長；環；第一tracr延長(其含有與第一旗桿延長之至少一部分互補之域)；以及tracr (其含有與crRNA旗桿區互補之域，及另外結合Cas9分子之域)。在一些態樣中，靶向域包含本文中所描述之靶向域序列，例如表1中描述之靶向域、或包含或由表1中描述之靶向域序列之17、18、19或20 (較佳地20)個連續核苷酸組成的靶向域，例如表1中描述之靶向域序列之3' 17、18、19或20 (較佳地20)個連續核苷酸。 在包含第一旗桿延長及/或第一tracr延長之態樣中，旗桿、環及tracr序列可如上文所描述。一般而言，可採用任何第一旗桿延長及第一tracr延長，其限制條件為其為互補的。在實施例中，第一旗桿延長及第一tracr延長由3、4、5、6、7、8、9、10或更多個互補核苷酸組成。 在一些態樣中，第一旗桿延長自5'至3'包含：UGCUG (SEQ ID NO: 184)。在一些態樣中，第一旗桿延長由SEQ ID NO: 184組成。 在一些態樣中，第一tracr延長自5'至3'包含：CAGCA (SEQ ID NO: 189)。在一些態樣中，第一tracr延長由SEQ ID NO: 189組成。 在一實施例中，dgRNA包含兩個核酸分子。在一些態樣中，dgRNA包含第一核酸，其較佳地自5'至3'含有，與靶標序列互補之靶向域、crRNA旗桿區、視情況存在之第一旗桿延長以及視情況存在之第二旗桿延長；以及第二核酸(其在本文中可稱為tracr)；且包含結合Cas分子(例如Cas9分子)的至少一域，該域較佳地自5'至3'包含視情況存在之第一tracr延長以及tracr (其含有與crRNA旗桿區互補之域，及另外結合Cas (例如Cas9)分子之域)。第二核酸可在3'端(例如3'至tracr)另外包含額外U核酸。舉例而言，tracr在3'端(例如3'至tracr)可包含額外1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個U核酸(SEQ ID NO: 249)。第二核酸可在3'端(例如3'至tracr)另外或者包含額外A核酸。舉例而言，tracr可在3'端(例如3'至tracr)包含額外1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個A核酸(SEQ ID NO: 250)。在一些態樣中，靶向域包含本文中所描述之靶向域序列，例如表1中描述之靶向域，或包含或由表1中描述之靶向域序列之17、18、19或20 (較佳地20)個連續核苷酸組成的靶向域。 在涉及dgRNA之態樣中，crRNA旗桿區、視情況存在之第一旗桿延長、視情況存在之第一tracr延長及tracr序列可如上文所描述。 在一些態樣中，視情況存在之第二旗桿延長自5'至3'包含：UUUUG (SEQ ID NO: 185)。 在實施例中，gRNA分子(及在dgRNA分子之情況下，包含靶向域之多核苷酸及/或包含tracr之多核苷酸)之3' 1、2、3、4或5個核苷酸、5' 1、2、3、4或5核苷酸、或3'及5' 1、2、3、4或5個核苷酸兩者為經修飾核酸，如下文章節XIII中更充分地描述。 下文簡要論述該等域： 1) 靶向域： 可在例如Fu Y等人. NAT BIOTECHNOL 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808)及Sternberg SH等人. NATURE 2014 (doi: 10.1038/naturel3011)中找到靶向域選擇之指導。 靶向域包含與靶標核酸上之靶標序列互補之核苷酸序列，例如至少80、85、90、95或99%互補，例如完全互補。靶向域為RNA分子之一部分，且因此將包含鹼基尿嘧啶(U)，而編碼gRNA分子之任何DNA將包含鹼基胸腺嘧啶(T)。雖然不希望受理論束縛，但咸信，靶向域與靶標序列之互補引起gRNA分子/Cas9分子複合物與靶標核酸之相互作用的特異性。應理解，在靶向域及靶標序列對中，靶向域中之尿嘧啶鹼基將與靶標序列中之腺嘌呤鹼基配對。 在一實施例中，靶向域之長度為5至50個，例如10至40個、例如10至30個、例如15至30個、例如15至25個核苷酸。在一實施例中，靶向域之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25個核苷酸。在一實施例中，靶向域之長度為16個核苷酸。在一實施例中，靶向域之長度為17個核苷酸。在一實施例中，靶向域之長度為18個核苷酸。在一實施例中，靶向域之長度為19個核苷酸。在一實施例中，靶向域之長度為20個核苷酸。在實施例中，前述16、17、18、19或20個核苷酸包含來自表1中描述之靶向域之5' 16、17、18、19或20個核苷酸。在實施例中，前述16、17、18、19或20個核苷酸包含來自表1中描述之靶向域之3' 16、17、18、19或20個核苷酸。 在不受理論束縛之情況下，咸信，位於靶向域3'端處之靶向域之8、9、10、11或12個核酸對於靶向靶標序列為重要的，且可因此稱為靶向域之「核心」區。在一實施例中，核心域與靶標序列完全互補。 與靶向域互補之靶標核酸鏈在本文中稱為靶標序列。在一些態樣中，靶標序列位於染色體上，例如為基因內之靶標。在一些態樣中，靶標序列位於基因之外顯子內。在一些態樣中，靶標序列位於基因之內含子內。在一些態樣中，靶標序列包含相關基因之調節元件之結合位點，或與其鄰近(例如在10、20、30、40、50、100、200、300、400、500或1000個核酸內)，該結合位點例如啟動子或轉錄因子結合位點。該域之一些或所有核苷酸可具有修飾，例如見於本文中章節XIII中之修飾。 2) crRNA旗桿區： 旗桿含有來自crRNA及tracr兩者之部分。crRNA旗桿區與tracr之一部分互補，且在一實施例中與tracr之一部分具有足夠的互補以在至少一些生理學條件(例如正常生理學條件)下形成雙螺旋區。在一實施例中，crRNA旗桿區之長度為5至30個核苷酸。在一實施例中，crRNA旗桿區之長度為5至25個核苷酸。crRNA旗桿區可與來自細菌CRISPR陣列之重複序列之天然存在之部分共用同源性，或衍生自其。在一實施例中，其與本文中揭示之crRNA旗桿區(例如化膿性鏈球菌或嗜熱鏈球菌(S. thermophilus) crRNA旗桿區)具有至少50%同源性。 在一實施例中，旗桿，例如crRNA旗桿區包含SEQ ID NO: 182。在一實施例中，旗桿，例如crRNA旗桿區包含與SEQ ID NO: 182具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%同源性之序列。在一實施例中，旗桿，例如crRNA旗桿區包含SEQ ID NO: 182之至少5、6、7、8、9、10或11個核苷酸。在一實施例中，旗桿，例如crRNA旗桿區包含SEQ ID NO: 183。在一實施例中，旗桿包含與SEQ ID NO: 183具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%或99%同源性之序列。在一實施例中，旗桿，例如crRNA旗桿區包含SEQ ID NO: 183之至少5、6、7、8、9、10或11個核苷酸。 該域之一些或所有核苷酸可具有修飾，例如本文中章節XIII中描述之修飾。 3)第一旗桿延長 當使用包含第一tracr延長之tracr時，crRNA可包含第一旗桿延長。一般而言，可採用任何第一旗桿延長及第一tracr延長，其限制條件為其為互補的。在實施例中，第一旗桿延長及第一tracr延長由3、4、5、6、7、8、9、10或更多個互補核苷酸組成。 第一旗桿延長可包含與第一tracr延長之核苷酸互補，例如80%、85%、90%、95%或99%，例如完全互補的核苷酸。在一些態樣中，與第一tracr延長之互補核苷酸雜交之第一旗桿延伸核苷酸為連續的。在一些態樣中，與第一tracr延長之互補核苷酸雜交之第一旗桿延伸核苷酸為非連續的，例如包含藉由不與第一tracr延長之核苷酸鹼基配對之核苷酸隔開的兩個或更多個雜交區。在一些態樣中，第一旗桿延長包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些態樣中，第一旗桿延長自5'至3'包含：UGCUG (SEQ ID NO: 184)。在一些態樣中，第一旗桿延長由SEQ ID NO: 184組成。在一些態樣中，第一旗桿延長包含與SEQ ID NO: 184具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性之核酸。 第一tracr延長之一些或所有核苷酸可具有修飾，例如見於本文中章節XIII中之修飾。 4)環 環用於將sgRNA之crRNA旗桿區(或視情況存在之第一旗桿延長(若存在))與tracr (或視情況存在之第一tracr延長(若存在))連接。環可將crRNA旗桿區與tracr以共價或非共價方式連接。在一實施例中，連接為共價的。在一實施例中，環以共價方式將crRNA旗桿區及tracr偶合。在一實施例中，環以共價方式將第一旗桿延長及第一tracr延長偶合。在一實施例中，環為插入於crRNA旗桿區與tracr之與crRNA旗桿區雜交之域之間的共價鍵，或包含該共價鍵。通常，環包含一或多個，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。 在dgRNA分子中，兩個分子可藉助於crRNA之至少一部分(例如crRNA旗桿區)與tracr之至少一部分(例如tracr之與crRNA旗桿區互補之域)之間的雜交來結合。 廣泛多種環適用於sgRNA。環可由共價鍵組成，或長度短至一個或若干核苷酸，例如1、2、3、4或5個核苷酸。在一實施例中，環之長度為2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25或更多個核苷酸。在一實施例中，環之長度為2至50、2至40、2至30、2至20、2至10或2至5個核苷酸。在一實施例中，環與天然存在之序列共享同源性，或衍生自其。在一實施例中，環與本文中揭示之環具有至少50%同源性。在一實施例中，環包含SEQ ID NO: 186。 該域之一些或所有核苷酸可具有修飾，例如本文中章節XIII中描述之修飾。 5)第二旗桿延長 在一實施例中，dgRNA可包含crRNA旗桿區或第一旗桿延長(若存在)之3'的額外序列，其在本文中稱為第二旗桿延長。在一實施例中，第二旗桿延長之長度為2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5或2-4個核苷酸。在一實施例中，第二旗桿延長之長度為2、3、4、5、6、7、8、9或10個或更多個核苷酸。在一實施例中，第二旗桿延長包含SEQ ID NO: 185。 6) Tracr： tracr為核酸酶(例如Cas9)結合所需之核酸序列。在不受理論束縛之情況下，咸信，各Cas9物種與特定tracr序列結合。在sgRNA及dgRNA系統兩者中使用Tracr序列。在一實施例中，tracr包含來自或衍生自化膿性鏈球菌tracr之序列。在一些態樣中，tracr具有與crRNA之旗桿部分雜交，例如與crRNA旗桿區具有足夠的互補以在至少一些生理學條件下形成雙螺旋區的部分(有時在本文中稱為tracr旗桿區或與crRNA旗桿區互補之tracr域)。在實施例中，tracr之與crRNA旗桿區雜交之域包含與crRNA旗桿區之互補核苷酸雜交之至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。在一些態樣中，與crRNA旗桿區之互補核苷酸雜交之tracr核苷酸為連續的。在一些態樣中，與crRNA旗桿區之互補核苷酸雜交之tracr核苷酸為非連續的，例如包含藉由不與crRNA旗桿區之核苷酸鹼基配對之核苷酸隔開的兩個或更多個雜交區。在一些態樣中，tracr之與crRNA旗桿區雜交之部分自5'至3'包含：UAGCAAGUUAAAA (SEQ ID NO: 191)。在一些態樣中，tracr之與crRNA旗桿區雜交之部分自5'至3'包含：UAGCAAGUUUAAA (SEQ ID NO: 192)。在實施例中，與crRNA旗桿區雜交之序列位於另外結合核酸酶(例如Cas分子，例如Cas9分子)之tracr序列之5'的tracr上。 tracr進一步包含另外結合至核酸酶(例如Cas分子，例如Cas9分子)之域。在不受理論束縛之情況下，咸信，來自不同物種之Cas9結合至不同tracr序列。在一些態樣中，tracr包含結合至化膿性鏈球菌Cas9分子之序列。在一些態樣中，tracr包含結合至本文中揭示之Cas9分子之序列。在一些態樣中，另外結合Cas9分子之域自5'至3'包含：UAAGGCUAGUCCGUUAUCAA CUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 193)。在一些態樣中，另外結合Cas9分子之域自5'至3'包含：UAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 194)。 在一些實施例中，tracr包含SEQ ID NO: 187。在一些實施例中，tracr包含SEQ ID NO: 188。 tracr之之一些或所有核苷酸可具有修飾，例如見於本文中章節XIII中之修飾。在實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，在gRNA之5'端、3'端或5'及3'端兩者包含反向無鹼基殘基。在實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，包含多核苷酸之5'端處殘基之間的一或多個硫代磷酸酯鍵，例如前兩個5'殘基之間的、前三個5'殘基中之每一者之間的、前四個5'殘基中之每一者之間的或前五個5'殘基中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵。在實施例中，gRNA或gRNA組分可替代地或另外包含多核苷酸之3'端處之殘基之間的一或多個硫代磷酸酯，例如前兩個3'殘基之間的、前三個3'殘基中之每一者之間的、前四個3'殘基中之每一者之間的或前五個3'殘基中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵。在一實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，包含前四個5'殘基(例如包含，例如由5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵及前四個3'殘基(例如包含，例如由3'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵。在一實施例中，上文所描述之硫代磷酸酯修飾中之任一者與多核苷酸之5'端、3'端或5'及3'端兩者處之反向無鹼基殘基組合。在此類實施例中，反向無鹼基核苷酸可藉由磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵連接至5'及/或3'核苷酸。在實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，包含包括2' O-甲基修飾之一或多個核苷酸。在實施例中，5'殘基之前1、2、3或更多中之每一者包含2' O-甲基修飾。在實施例中，3'殘基之前1、2、3或更多中之每一者包含2' O-甲基修飾。在實施例中，之第4末端、第3末端及第2末端3'殘基包含2' O-甲基修飾。在實施例中，5'殘基之前1、2、3或更多中之每一者包含2' O-甲基修飾，及3'殘基之前1、2、3或更多中之每一者包含2' O-甲基修飾。在一實施例中，5'殘基之前3中之每一者包含2' O-甲基修飾，及3'殘基之前3中之每一者包含2' O-甲基修飾。在實施例中，5'殘基之前3中之每一者包含2' O-甲基修飾，及第4末端、第3末端及第2末端3'殘基包含2' O-甲基修飾。在實施例中，例如如上文所描述之2' O-甲基修飾中之任一者可與例如如上文所描述之一或多個硫代磷酸酯修飾及/或例如如上文所描述之一或多個反向無鹼基修飾組合。在一實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，包含，例如由前四個5'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前四個3'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前三個5'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾及前三個3'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾組成。在一實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，包含，例如由前四個5'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前四個3'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前三個5'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾及第4末端、第3末端與第2末端3'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾組成。 在一實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，包含，例如由前四個5'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前四個3'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前三個5'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾、前三個3'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾及5'及3'端中之每一者處之額外反向無鹼基殘基組成。 在一實施例中，gRNA (例如sgRNA、或dgRNA之tracr及/或crRNA)，例如上文所描述之gRNA或gRNA組分中之任一者，包含，例如由前四個5'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前四個3'殘基(例如，包含，例如由多核苷酸之5'端處之三個硫代磷酸酯鍵組成)中之每一者之間的硫代磷酸酯鍵、前三個5'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾第4末端、第3末端及第2末端3'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾以及5'及3'端中之每一者處之額外反向無鹼基殘基組成。 在一實施例中，gRNA為dgRNA，且包含以下，例如由以下組成： crRNA： mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU (SEQ ID NO: 251)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基；以及 tracr： AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (SEQ ID NO: 224) (視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)。 在一實施例中，gRNA為dgRNA，且包含以下，例如由以下組成： crRNA： mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAU*mG*mC*mU (SEQ ID NO: 251)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基；以及 tracr： mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 246)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基。 在一實施例中，gRNA為dgRNA，且包含以下，例如由以下組成： crRNA： mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG (SEQ ID NO: 252)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基；以及 tracr： AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (SEQ ID NO: 224) (視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)。 在一實施例中，gRNA為dgRNA，且包含以下，例如由以下組成： crRNA： mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUU*mU*mU*mG (SEQ ID NO: 252)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基；以及 tracr： mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 246)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，及*指示硫代磷酸酯鍵(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)。 在一實施例中，gRNA為dgRNA，且包含以下，例如由以下組成： crRNA： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 253)，其中N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基；以及 tracr： mA*mA*mC*AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 246)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，及*指示硫代磷酸酯鍵(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)。 在一實施例中，gRNA為sgRNA，且包含以下，例如由以下組成： NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 254)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基。 在一實施例中，gRNA為sgRNA，且包含以下，例如由以下組成： mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 255)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基。 在一實施例中，gRNA為sgRNA，且包含以下，例如由以下組成： mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U (SEQ ID NO: 256)，其中m指示具有2'O-甲基修飾之鹼基，*指示硫代磷酸酯鍵，及N's指示例如如本文中所描述之靶向域(視情況在5'及/或3'末端具有反向無鹼基殘基)之殘基。 7)第一Tracr延長 其中gRNA包含第一旗桿延長，tracr可包含第一tracr延長。第一tracr延長可包含與第一旗桿延長之核苷酸互補，例如80%、85%、90%、95%或99%，例如完全互補之核苷酸。在一些態樣中，與第一旗桿延長之互補核苷酸雜交之第一tracr延伸核苷酸為連續的。在一些態樣中，與第一旗桿延長之互補核苷酸雜交之第一tracr延伸核苷酸為非連續的，例如包含藉由不與第一旗桿延長之核苷酸鹼基配對之核苷酸隔開的兩個或更多個雜交區。在一些態樣中，第一tracr延長包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些態樣中，第一tracr延長包含SEQ ID NO: 189。在一些態樣中，第一tracr延長包含與SEQ ID NO: 189具有至少80%、85%、90%、95%或99%同源性之核酸。 第一tracr延長之一些或所有核苷酸可具有修飾，例如見於本文中章節XIII中之修飾。 在一些實施例中，sgRNA自5'至3'，位於靶向域之3'，可包含： a) ； b) ； c) ； d) ； e)以上a)至d)中之任一者，其在3'端進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸； f)以上a)至d)中之任一者，其在3'端進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸；或 g)以上a)至f)中之任一者，其在5'端(例如在5'末端，例如靶向域之5')進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸。在實施例中，以上a)至g)中之任一者直接位於靶向域之3'。 在一實施例中，本發明之sgRNA自5'至3'包含以下，例如由以下組成：[靶向域]-GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 231)。 在一實施例中，本發明之sgRNA自5'至3'包含以下，例如由以下組成：[靶向域]-GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAAG UUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 227)。 在一些實施例中，dgRNA可包含： crRNA，其自5'至3'，較佳地直接位於靶向域之3'，包含： a)； b)； c)； d)； e)； f)；或 g)； 及tracr，其自5'至3'包含： a) ； b) ； c) ； d) ； e) ； f) ； g) h) ； i) ； j) ； k)以上a)至j)中之任一者，其在3'端進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸； l)以上a)至j)中之任一者，其在3'端進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸；或 m)以上a)至l)中之任一者，其在5'端(例如在5'末端)進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸。 在一實施例中，例如，若使用U6啟動子用於轉錄，則以上k)之序列包含3'序列UUUUUU。在一實施例中，例如若使用HI啟動子用於轉錄，則以上k)之序列包含3'序列UUUU。在一實施例中，例如視所使用之pol-III啟動子之終止信號而定，以上k)之序列包含可變數目之3' U's。在一實施例中，若使用T7啟動子，則以上k)之序列包含衍生自DNA模板之可變3'序列。在一實施例中，例如若使用活體外轉錄以產生RNA分子，則以上k)之序列包含衍生自DNA模板之可變3'序列。在一實施例中，例如若使用pol-II啟動子以驅動轉錄，則以上k)之序列包含衍生自DNA模板之可變3'序列。 在一實施例中，crRNA包含以下，例如由以下組成：靶向域，及位於靶向域之3' (例如直接位於靶向域之3')之序列，該序列包含，例如由SEQ ID NO: 201組成；及tracr包含以下，例如由以下組成：AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (SEQ ID NO: 224)。 在一實施例中，crRNA包含以下，例如由以下組成：靶向域，及位於靶向域之3' (例如直接位於靶向域之3')之序列，該序列包含，例如由SEQ ID NO: 202組成；及tracr包含以下，例如由以下組成：AACAGCAUAGCAAGUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU (SEQ ID NO: 225)。 在一實施例中，crRNA包含以下，例如由以下組成：靶向域，及位於靶向域之3' (例如直接位於靶向域之3')之序列，該序列包含，例如由GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO: 226)組成；及tracr包含以下，例如由以下組成：GUUUAAGAGCUAUGCUGGAAACAGCAUAGCAA GUUUAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 227)。 在一實施例中，crRNA包含以下，例如由以下組成：靶向域，及位於靶向域之3' (例如直接位於靶向域之3')之序列，該序列包含，例如由GUUUUAGAGCUAUGCU (SEQ ID NO: 226)組成；及tracr包含以下，例如由以下組成：AGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (SEQ ID NO: 228)。 在一實施例中，crRNA包含以下，例如由以下組成：靶向域，及位於靶向域之3' (例如直接位於靶向域之3')之序列，該序列包含，例如由GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 201)組成；及tracr包含以下，例如由以下組成：GUUGGAACCAUUCAAAACAGCAUAGC AAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU (SEQ ID NO: 229)。II . 針對於非缺失性 HPFH 區之 gRNA 靶向域 下表中所提供的為針對於非缺失性HPFH區之靶向域，其用於本發明之gRNA分子及用於本發明之各種態樣，例如用於更改血球蛋白基因(例如胎兒血色素基因或血色素β基因)之表現。 表1：針對於非缺失性HPFH區之gRNA靶向域。SEQ ID NO:係指gRNA靶向域序列。 下文表2展示當包括於gRNA分子中時根據實例中描述之方法，在7天引起胎兒血色素(例如在由經修飾HSPC分化之紅血球系細胞中)增加至少17%的彼等靶向域。包含此等靶向域中之任一者之gRNA分子在本文中統稱為2階gRNA分子。 表2，2階gRNA分子之靶向域 下文表3a及表3b展示當包括於gRNA分子中時根據實例中描述之方法，在7天引起胎兒血色素(例如在由經修飾HSPC分化之紅血球系細胞中)之最高增加的彼等靶向域。包含此等靶向域之gRNA分子在本文中統稱為1階(例如1a階或1b階) gRNA分子。 表3a，1a階gRNA分子之靶向域 表3b，1b階gRNA分子之靶向域 III . 用於設計 gRNA 之 方法 本文中描述用於設計gRNA之方法，包括用於選擇、設計及驗證靶標序列之方法。本文亦提供例示性靶向域。可將本文中所論述之靶向域併入至本文中所描述之gRNA中。 用於選擇及驗證靶標序列之方法以及脫靶分析描述於例如以下中：Mali等人, 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826；Hsu等人, 2013 NAT BIOTECHNOL, 31 (9): 827-32；Fu 等人, 2014 NAT BIOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PM ID: 24463574；Heigwer等人, 2014 NAT METHODS ll (2): 122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216；Bae等人, 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24463181；Xiao A等人, 2014 BIOINFORMATICS PubMed PMID: 24389662。 舉例而言，可使用軟體工具以最佳化使用者靶標序列內之gRNA之選擇，例如以使跨越基因體之總脫靶活性降至最低。脫靶活性可以不為裂解。對於各種可能的gRNA選擇，例如使用化膿性鏈球菌Cas9，工具可鑑別跨越基因體含有至多某一數目(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)之錯配鹼基對的所有脫靶序列(例如前述NAG PAM或NGG PAM)。可例如使用實驗導出之稱重流程來預測各脫靶序列處之裂解效率。接著，根據gRNA總預測脫靶裂解，對各種可能的gRNA進行分級；等級最高的gRNA表示可能具有最大靶向及最小脫靶裂解的彼等。其他功能亦可包括於工具中，例如用於CRISPR構築之自動化試劑設計、用於靶向量測儀分析之引子設計及用於偵測之引子設計及經由下一代定序而定量脫靶裂解。可藉由此項技術中已知之方法或如本文中所描述之方法來評價候選gRNA分子。 儘管可使用軟體演算法產生潛在gRNA分子之初始清單，但剪切效率及特異性將不一定反映預測值，且gRNA分子通常需要在特定細胞株，例如初級人類細胞株、例如人類HSPC、例如人類CD34+細胞中篩選，以測定例如剪切效率、插入缺失形成、剪切特異性及所需表型之變化。此等特性可藉由本文所描述之方法來分析。 在本發明之態樣中，包含GCR-0001 (SEQ ID NO:1，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0001 #1 ： sgRNA GCR-0001 #2 ： sgRNA GCR-0001 #3 ： dgRNA GCR-0001 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0001 #2 ： tracr： dgRNA GCR-0001 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0006 (SEQ ID NO: 6，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0006 #1 ： sgRNA GCR-0006 #2 ： sgRNA GCR-0006 #3 ： dgRNA GCR-0006 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0006 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0006 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0008 (SEQ ID NO: 8，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0008 #1 ： sgRNA GCR-0008 #2 ： sgRNA GCR-0008 #3 ： dgRNA GCR-0008 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0008 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0008 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0009 (SEQ ID NO: 9，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0009 #1 ： sgRNA GCR-0009 #2 ： sgRNA GCR-0009 #3 ： dgRNA GCR-0009 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0009 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0009 #3 ： crRNA： tracr：在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0010 (SEQ ID NO: 10，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0010 #1 ： sgRNA GCR-0010 #2 ： sgRNA GCR-0010 #3 ： dgRNA GCR-0010 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0010 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0010 #3 ： crRNA： tracr：在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0011 (SEQ ID NO: 11，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0011 #1 ： sgRNA GCR-0011 #2 ： sgRNA GCR-0011 #3 ： dgRNA GCR-0011 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0011 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0011 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0012 (SEQ ID NO: 12，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0012 #1 ： sgRNA GCR-0012 #2 ： sgRNA GCR-0012 #3 ： dgRNA GCR-0012 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0012 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0012 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0028 (SEQ ID NO: 28，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0028 #1 ： sgRNA GCR-0028 #2 ： sgRNA GCR-0028 #3 ： dgRNA GCR-0028 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0028 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0028 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0034 (SEQ ID NO: 34，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0034 #1 ： sgRNA GCR-0034 #2 ： sgRNA GCR-0034 #3 ： dgRNA GCR-0034 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0034 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0034 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0045 (SEQ ID NO: 45，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0045 #1 ： sgRNA GCR-0045 #2 ： sgRNA GCR-0045 #3 ： dgRNA GCR-0045 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0045 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0045 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0046 (SEQ ID NO: 46，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0046 #1 ： sgRNA GCR-0046 #2 ： sgRNA GCR-0046 #3 ： dgRNA GCR-0046 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0046 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0046 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0047 (SEQ ID NO: 47，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0047 #1 ： sgRNA GCR-0047 #2 ： sgRNA GCR-0047 #3 ： dgRNA GCR-0047 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0047 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0047 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0048 (SEQ ID NO: 48，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0048 #1 ： sgRNA GCR-0048 #2 ： sgRNA GCR-0048 #3 ： dgRNA GCR-0048 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0048 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0048 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0050 (SEQ ID NO: 50，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0050 #1 ： sgRNA GCR-0050 #2 ： sgRNA GCR-0050 #3 ： dgRNA GCR-0050 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0050 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0050 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0051 (SEQ ID NO: 51，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0051 #1 ： sgRNA GCR-0051 #2 ： sgRNA GCR-0051 #3 ： dgRNA GCR-0051 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0051 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0051 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0053 (SEQ ID NO: 53，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0053 #1 ： sgRNA GCR-0053 #2 ： sgRNA GCR-0053 #3 ： dgRNA GCR-0053 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0053 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0053 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0054 (SEQ ID NO: 54，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0054 #1 ： sgRNA GCR-0054 #2 ： sgRNA GCR-0054 #3 ： dgRNA GCR-0054 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0054 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0054 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0058 (SEQ ID NO: 58，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0058 #1 ： sgRNA GCR-0058 #2 ： sgRNA GCR-0058 #3 ： dgRNA GCR-0058 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0058 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0058 #3 ： crRNA： tracr：在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0062 (SEQ ID NO: 62，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0062 #1 ： sgRNA GCR-0062 #2 ： sgRNA GCR-0062 #3 ： dgRNA GCR-0062 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0062 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0062 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0063 (SEQ ID NO: 63，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0063 #1 ： sgRNA GCR-0063 #2 ： sgRNA GCR-0063 #3 ： dgRNA GCR-0063 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0063 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0063 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。 在本發明之態樣中，包含GCR-0067 (SEQ ID NO: 67，未經修飾序列其下加底線)之靶向域之gRNA，例如下文所描述之gRNA分子中之一者，適用於本發明之CRISPR系統、方法、細胞及其他態樣以及實施例中，包括適用於涉及例如本文中所描述之多於一個gRNA分子的態樣中：sgRNA GCR-0067 #1 ： sgRNA GCR-0067 #2 ： sgRNA GCR-0067 #3 ： dgRNA GCR-0067 #1 ： crRNA：tracr： dgRNA GCR-0067 #2 ： crRNA： tracr： dgRNA GCR-0067 #3 ： crRNA： tracr： 。 在上文所描述之gRNA分子中之每一者中，「*」指示相鄰核苷酸之間的硫代磷酸酯鍵，及「mN」(其中N=A、G、C或U)指示經2'-OMe修飾之核苷酸。在實施例中，本文中所描述之(例如上文所描述之) gRNA分子中之任一者與例如如本文中所描述之Cas9分子複合，形成核糖核酸蛋白複合物(RNP)。此類RNP尤其適用於本發明之(例如本文中所描述之)方法、細胞及其他態樣以及實施例中。IV. Cas 分子 Cas9 分子 在較佳實施例中，Cas分子為Cas9分子。各種物種之Cas9分子可用於本文中所描述之方法及組合物中。雖然化膿性鏈球菌Cas9分子為本文中許多所揭示內容之主題，但亦可使用本文中列舉之其他物種之Cas9蛋白質之Cas9分子、衍生自或基於其之Cas9分子。換言之，可在本文中所描述之系統、方法及組合物中使用其他Cas9分子，例如嗜熱鏈球菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)及/或奈瑟氏腦膜炎菌(Neisseria meningitidis) Cas9分子。其他Cas9物種包括：西瓜嗜酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、產琥珀酸放線桿菌(Actinobacillus succinogenes)、豬放線桿菌(Actinobacillus suis)、放線菌(Actinomyces sp.)、脫氮嗜脂環菌(cycliphilus denitrificans)、少食胞菌(Aminomonas paucivorans)、蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)、史氏芽孢桿菌(Bacillus smithii)、蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)、擬桿菌(Bacteroides sp.)、瑪麗娜胚小梨形菌(Blastopirellula marina)、短根瘤菌(Bradyrhiz' obium sp.)、側孢短小芽孢桿菌(Brevibacillus latemsporus)、大腸彎曲桿菌(Campylobacter coli)、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、彎曲桿菌(Campylobacter lad)、暫定普尼側螺旋菌(Candidatus Puniceispirillum)、解纖維素梭菌(Clostridiu cellulolyticum)、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、擁擠棒狀桿菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)、馬氏棒狀桿菌(Corynebacterium matruchotii)、絲貝玫瑰桿菌(Dinoroseobacter sliibae)、細長真桿菌(Eubacterium dolichum)、γ變形桿菌(gamma proteobacterium)、重氮營養葡糖酸醋桿菌(Gluconacetobacler diazotrophicus)、副流感嗜血桿菌(Haemophilus parainfluenzae)、生痰嗜血桿菌(Haemophilus sputorum)、加拿大螺旋桿菌(Helicobacter canadensis)、同性戀螺旋桿菌(Helicobacter cinaedi)、鼬鼠螺旋桿菌(Helicobacter mustelae)、營養泥桿菌(Ilyobacler polytropus)、金格桿菌(Kingella kingae)、捲曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、伊氏李斯特菌(Listeria ivanovii)、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、李斯特氏菌(Listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌(Methylocystis sp.)、甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯動彎桿菌(Mobiluncus mulieris)、桿狀奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、淺黃奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、奈瑟氏菌(Neisseria sp.)、瓦茨瓦爾西奈瑟氏菌(Neisseria wadsworthii)、亞硝酸菌(Nitrosomonas sp.)、食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida)、琥珀酸考拉桿菌(Phascolarctobacterium succinatutens)、丁香羅爾斯頓菌(Ralstonia syzygii)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小紅卵菌(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘脂單胞菌(Sphingomonas sp.)、威尼亞芽孢乳桿菌(Sporolactobacillus vineae)、路鄧葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、鏈球菌(Streptococcus sp.)、罕見小球菌(Subdoligranulum sp.)、運動黃水枝菌(Tislrella mobilis)、螺旋體(Treponema sp.)或愛勝蚓蟲腎桿菌(Verminephrobacter eiseniae)。 如本文中所使用之術語Cas9分子係指可與gRNA分子(例如tracr之域之序列)相互作用，且結合gRNA分子之情況下定位(例如靶向或歸屬)至包含靶標序列及PAM序列之位點的分子。 在一實施例中，Cas9分子能夠裂解靶標核酸分子，其在本文中可稱為活性Cas9分子。在一實施例中，活性Cas9分子包含以下活性中之一或多者：切口酶活性，亦即裂解核酸分子之單鏈(例如非互補鏈或互補鏈)的能力；雙鏈核酸酶活性，亦即裂解雙鏈核酸之兩條鏈且產生雙鏈斷裂(在一實施例中，其為兩個切口酶活性之存在)的能力；核酸內切酶活性；核酸外切酶活性；以及解螺旋酶活性，亦即使雙鏈核酸之螺旋結構展開的能力。 在一實施例中，酶活性Cas9分子使兩條DNA鏈裂解，且產生雙鏈斷裂。在一實施例中，Cas9分子僅裂解一條鏈，例如與gRNA雜交之鏈或與同gRNA雜交之鏈互補的鏈。在一實施例中，活性Cas9分子包含與HNH類域相關之裂解活性。在一實施例中，活性Cas9分子包含與N端RuvC類域相關之裂解活性。在一實施例中，活性Cas9分子包含與HNH類域相關之裂解活性，及與N端RuvC類域相關之裂解活性。在一實施例中，活性Cas9分子包含活性或裂解勝任HNH類域，及非活性或裂解非勝任N端RuvC類域。在一實施例中，活性Cas9分子包含非活性或裂解非勝任HNH類域，及活性或裂解勝任N端RuvC類域。 在一實施例中，活性Cas9分子與靶標核酸相互作用及裂解靶標核酸之能力為PAM序列依賴性的。PAM序列為靶標核酸中之序列。在一實施例中，靶標核酸之裂解發生在PAM序列之上游。來自不同細菌物種之活性Cas9分子可識別不同序列基元(例如PAM序列)。在一實施例中，化膿性鏈球菌之活性Cas9分子識別序列基元NGG，且導引彼序列上游1至10 (例如3至5)個鹼基對之靶標核酸序列的裂解。參見例如Mali等人SCIENCE 2013; 339(6121): 823-826。在一實施例中，嗜熱鏈球菌之活性Cas9分子識別序列基元NGGNG及NNAG AAW (W = A或T)，且導引此等序列上游1至10 (例如3至5)個鹼基對之核心靶標核酸序列的裂解。參見例如Horvath等人, SCIENCE 2010; 327(5962): 167-170，及Deveau等人, J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390-1400。在一實施例中，變異鏈球菌(S. mulans)之活性Cas9分子識別序列基元NGG或NAAR (R為A或G)，且導引此序列上游1至10 (例如3至5)個鹼基對之核心靶標核酸序列的裂解。參見例如Deveau等人, J BACTERIOL 2008; 190(4): 1 390-1400。 在一實施例中，金黃色葡萄球菌之活性Cas9分子識別序列基元NNGRR (R = A或G)，且導引彼序列上游1至10 (例如3至5)個鹼基對之靶標核酸序列的裂解。參見例如Ran F.等人, NATURE, 第520卷, 2015, 第186-191頁。在一實施例中，奈瑟氏腦膜炎菌之活性Cas9分子識別序列基元NNNNGATT，且導引彼序列上游1至10 (例如3至5)個鹼基對之靶標核酸序列的裂解。參見例如Hou等人, PNAS EARLY EDITION 2013, 1-6。可例如使用Jinek等人, SCIENCE 2012, 337:816中描述之轉形分析來測定Cas9分子識別PAM序列之能力。 一些Cas9分子具有與gRNA分子相互作用，及結合gRNA分子之情況下，歸屬(例如靶向或定位)至核心靶向域的能力，但不能裂解靶標核酸或不能以有效速率裂解。不具有或不具有實質性裂解活性之Cas9分子在本文中可稱為非活性Cas9 (酶促非活性Cas9)、無作用Cas9或dCas9分子。舉例而言，非活性Cas9分子可缺乏裂解活性，或實質上具有較低，例如小於參考Cas9分子之20、10、5、1或0.1%裂解活性，如藉由本文中所描述之分析法所量測。 例示性天然存在之Cas9分子描述於Chylinski等人, RNA Biology 2013; 10:5, 727-737中。此類Cas9分子包括以下之Cas9分子：集群1細菌族、集群2細菌族、集群3細菌族、集群4細菌族、集群5細菌族、集群6細菌族、集群7細菌族、集群8細菌族、集群9細菌族、集群10細菌族、集群11細菌族、集群12細菌族、集群13細菌族、集群14細菌族、集群15細菌族、集群16細菌族、集群17細菌族、集群18細菌族、集群19細菌族、集群20細菌族、集群21細菌族、集群22細菌族、集群23細菌族、集群24細菌族、集群25細菌族、集群26細菌族、集群27細菌族、集群28細菌族、集群29細菌族、集群30細菌族、集群31細菌族、集群32細菌族、集群33細菌族、集群34細菌族、集群35細菌族、集群36細菌族、集群37細菌族、集群38細菌族、集群39細菌族、集群40細菌族、集群41細菌族、集群42細菌族、集群43細菌族、集群44細菌族、集群45細菌族、集群46細菌族、集群47細菌族、集群48細菌族、集群49細菌族、集群50細菌族、集群51細菌族、集群52細菌族、集群53細菌族、集群54細菌族、集群55細菌族、集群56細菌族、集群57細菌族、集群58細菌族、集群59細菌族、集群60細菌族、集群61細菌族、集群62細菌族、集群63細菌族、集群64細菌族、集群65細菌族、集群66細菌族、集群67細菌族、集群68細菌族、集群69細菌族、集群70細菌族、集群71細菌族、集群72細菌族、集群73細菌族、集群74細菌族、集群75細菌族、集群76細菌族、集群77細菌族或集群78細菌族。 例示性天然存在之Cas9分子包括集群1細菌族之Cas9分子。實例包括以下之Cas9分子：化膿性鏈球菌(例如菌株SF370、MGAS 10270、MGAS 10750、MGAS2096、MGAS315、MGAS5005、MGAS6180、MGAS9429、NZ131及SSI-1)、嗜熱鏈球菌(例如菌株LMD-9)、假豕鏈球菌(例如菌株SPIN 20026)、變異鏈球菌(例如菌株UA 159、NN2025)、獼猴鏈球菌(例如菌株NCTC1 1558)、牛型鏈球菌(S. gallolylicus) (例如菌株UCN34、ATCC BAA-2069)、馬鏈球菌(S. equines) (例如菌株ATCC 9812、MGCS 124)、停乳鏈球菌(S. dysdalactiae) (例如菌株GGS 124)、牛鏈球菌(S. bovis) (例如菌株ATCC 700338)、卡金蘇鏈球菌(S. cmginosus) (例如菌株F021 1)、無乳鏈球菌* (S. agalactia) (例如菌株NEM316、A909)、單核球增多性李氏菌(Listeria monocytogenes) (例如菌株F6854)、無害李氏菌(Listeria innocua) (例如菌株Clip l 1262)、意大利腸球菌(EtUerococcus italicus) (例如菌株DSM 15952)或屎腸球菌(例如菌株1,231,408)。其他例示性Cas9分子為奈瑟氏腦膜炎菌(Hou等人. PNAS Early Edition 2013, 1-6)之Cas9分子及金黃色葡萄球菌Cas9分子。 在一實施例中，Cas9分子(例如活性Cas9分子或非活性Cas9分子)：包含與其具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性之胺基酸序列；當與其相比時，相差不大於1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%或40%之胺基酸殘基；與其相差至少1、2、5、10或20個胺基酸但不大於100、80、70、60、50、40或30個胺基酸；或與其一致；本文中所描述之任何Cas9分子序列或天然存在之Cas9分子序列，例如來自本文中列舉或Chylinski等人, RNA Biology 2013, 10:5, Ί2Ί-Τ,1 Hou等人. PNAS Early Edition 2013, 1-6中描述之物種的Cas9分子。 在一實施例中，Cas9分子：包含與其具有60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源性之胺基酸序列；當與其相比時，相差不大於1%、2%、5%、10%、15%、20%、30%或40%之胺基酸殘基；與其相差至少1、2、5、10或20個胺基酸但不大於100、80、70、60、50、40或30個胺基酸；或與其一致；化膿性鏈球菌Cas9： (SEQ ID NO: 205) 在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO:205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括一或多個突變為帶正電胺基酸(例如離胺酸、精胺酸或組胺酸)的突變，該等突變在該位置引入不帶電或非極性胺基酸(例如丙胺酸)。在實施例中，突變為突變成Cas9之核苷酸溝槽中之一或多個帶正電胺基酸。在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO:205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括在SEQ ID NO: 205之855位置處之突變，例如在SEQ ID NO: 205之855位置處突變為不帶電胺基酸(例如丙胺酸)。在實施例中，Cas9分子具有僅在SEQ ID NO: 205之855位置處之突變，相對於，SEQ ID NO: 205，例如突變為不帶電胺基酸(例如丙胺酸)。在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO: 205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括在SEQ ID NO: 205之位置810處之突變、位置1003處之突變及/或位置1060處之突變，例如在SEQ ID NO: 205之位置810、位置1003及/或位置1060處突變為丙胺酸。在實施例中，Cas9分子具有僅在SEQ ID NO: 205之位置810、位置1003及位置1060處之突變，相對於SEQ ID NO: 205，例如其中各自突變為不帶電胺基酸(例如丙胺酸)。在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO: 205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括在SEQ ID NO: 205之位置848處之突變、位置1003處之突變及/或位置1060處之突變，例如在SEQ ID NO: 205之位置848、位置1003及/或位置1060處突變為丙胺酸。在實施例中，Cas9分子具有僅在SEQ ID NO: 205之位置848、位置1003及位置1060處之突變，相對於SEQ ID NO: 205，例如其中各自突變為不帶電胺基酸(例如丙胺酸)。在實施例中，Cas9分子為如以下中所描述之Cas9分子，Slaymaker等人,Science Express , 2015年12月1日，可在Science DOI: 10.1126/science.aad5227線上獲得。 在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO: 205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括一或多個突變。在實施例中，Cas9變體包含在SEQ ID NO: 205之位置80處之突變，例如包括SEQ ID NO: 205之在位置80處之白胺酸(亦即，包含，例如由具有C80L突變之SEQ ID NO: 205組成)。在實施例中，Cas9變體包含在SEQ ID NO: 205之位置574處之突變，例如包括SEQ ID NO: 205之在位置574處之麩胺酸(亦即，包含，例如由具有C574E突變之SEQ ID NO: 205組成)。在實施例中，Cas9變體包含在SEQ ID NO: 205之位置80處之突變及位置574處之突變，例如包括SEQ ID NO: 205之位置80處之白胺酸及SEQ ID NO: 205之位置574處之麩胺酸(亦即，包含，例如由具有C80L突變及C574E突變之SEQ ID NO: 205組成)。在不受理論束縛之情況下，咸信，此類突變改良Cas9分子之溶液特性。 在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO: 205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括一或多個突變。在實施例中，Cas9變體包含在SEQ ID NO: 205之位置147處之突變，例如包括SEQ ID NO: 205之在位置147處之酪胺酸(亦即，包含，例如由具有D147Y突變之SEQ ID NO: 205組成)。在實施例中，Cas9變體包含在SEQ ID NO: 205之位置411處之突變，例如包括SEQ ID NO: 205之在位置411處之蘇胺酸(亦即，包含，例如由具有P411T突變之SEQ ID NO: 205組成)。在實施例中，Cas9變體包含在SEQ ID NO: 205之位置147處之突變及位置411處之突變，例如包括SEQ ID NO: 205之位置147處之酪胺酸及SEQ ID NO: 205之位置411處之蘇胺酸(亦即，包含，例如由具有D147Y突變及P411T突變之SEQ ID NO: 205組成)。在不受理論束縛之情況下，咸信，此類突變改良Cas9分子例如在酵母菌中之靶向效率。 在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO: 205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括一或多個突變。在實施例中，Cas9變體包含在SEQ ID NO: 205之位置1135處之突變，例如包括SEQ ID NO: 205之在位置1135處之麩胺酸(亦即，包含，例如由具有D1135E突變之SEQ ID NO: 205組成)。在不受理論束縛之情況下，咸信，此類突變改良Cas9分子針對NGG PAM序列與NAG PAM序列之選擇性。 在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO: 205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括在某些位置引入不帶電或非極性胺基酸(例如丙胺酸)的一或多個突變。在實施例中，Cas9分子為SEQ ID NO: 205之化膿性鏈球菌Cas9變體，其包括在SEQ ID NO: 205之位置497處之突變、位置661處之突變、位置695處之突變及/或位置處926之突變，例如在SEQ ID NO: 205之位置497、位置661、位置695及/或位置926處突變為丙胺酸。在實施例中，Cas9分子具有僅在SEQ ID NO: 205之位置497、位置661、位置695及位置926處之突變，相對於SEQ ID NO: 205，例如其中各自突變為不帶電胺基酸(例如丙胺酸)。在不受理論束縛之情況下，咸信，此類突變降低脫靶位點處之Cas9分子之剪切。 應理解，Cas9分子之本文中所描述之突變可進行組合，且可與融合或本文中所描述之其他修飾及本文中所描述之分析中測試之Cas9分子中的任一者組合。 各種Cas分子類型可用於實踐本文中揭示之發明。在一些實施例中，使用II型Cas系統之Cas分子。在其他實施例中，使用其他Cas系統之Cas分子。舉例而言，可使用I型或III型Cas分子。例示性Cas分子(及Cas系統)例如描述於Haft等人, PLoS COMPUTATIONAL BIOLOGY 2005, 1(6): e60及Makarova等人, NATURE REVIEW MICROBIOLOGY 201 1 , 9:467-477中，兩個參考之內容均以全文引用之方式併入本文中。 在一實施例中，Cas9分子包含以下活性中之一或多者：切口酶活性；雙鏈裂解活性(例如核酸內切酶及/或核酸外切酶活性)；解螺旋酶活性；或與gRNA分子一起定位至靶標核酸之能力。經更改 Cas9 分子 天然存在之Cas9分子擁有多種特性，其包括：切口酶活性；核酸酶活性(例如核酸內切酶及/或核酸外切酶活性)；解螺旋酶活性；與gRNA分子功能結合之能力；以及靶向(或定位至)核酸上之位點之能力(例如PAM識別及特異性)。在一實施例中，Cas9分子可包括所有此等特性或此等特性之子組。在典型實施例中，Cas9分子具有與gRNA分子相互作用，及在結合gRNA分子之情況下定位至核酸中之位點的能力。在Cas9分子中，其他活性，例如PAM特異性、裂解活性或解螺旋酶活性可更廣泛地變化。 具有所需特性之Cas9分子可以多種方式來製備，例如藉由更改親本(例如天然存在之Cas9分子)以提供具有所需特性之經更改Cas9分子。舉例而言，可引入相對於親本Cas9分子之一或多個突變或差異。此類突變及差異包含：取代(例如保守取代或非必需胺基酸之取代)；插入；或缺失。在一實施例中，Cas9分子可包含相對於參考Cas9分子之一或多個突變或差異，例如至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50個突變但小於200、100或80個突變。 在一實施例中，一或多個突變對於Cas9活性，例如本文中所描述之Cas9活性不具有實質性效果。在一實施例中，一或多個突變對於Cas9活性，例如本文中所描述之Cas9活性具有實質性效果。在一實施例中，例示性包含PAM特異性、裂解活性及解螺旋酶活性中之一或多者。突變可例如在以下中存在：一或多個RuvC類域，例如N端RuvC類域；HNH類域；RuvC類域及HNH類域外部之區。在一些實施例中，突變在N端RuvC類域中存在。在一些實施例中，突變在HNH類域中存在。在一些實施例中，突變在N端RuvC類域及HNH類域兩者中均存在。 無論特定序列(例如取代)是否可影響一或多個活性，諸如靶向活性、裂解活性等，可例如藉由評估突變是否為保守的或藉由章節ΠΙ中所描述之方法來對其進行評價或預測。在一實施例中，如在Cas9分子之上下文中所用之「非必需」胺基酸殘基為可自野生型Cas9分子序列(例如天然存在之Cas9分子，例如活性Cas9分子)更改而不消除或更佳地實質上不更改Cas9活性(例如裂解活性)，但改變「必需」胺基酸殘基產生實質性活性(例如裂解活性)缺失。具有經更改 PAM 識別或不具有 PAM 識別之 Cas9 分子 天然存在之Cas9分子可識別特異性PAM序列，例如上文針對化膿性鏈球菌、嗜熱鏈球菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌及奈瑟氏腦膜炎菌所描述之PAM識別序列。 在一實施例中，Cas9分子具有與天然存在之Cas9分子相同的PAM特異性。在其他實施例中，Cas9分子具有不與天然存在之Cas9分子相關之PAM特異性、或不與其具有最接近序列同源性之天然存在之Cas9分子相關的PAM特異性。舉例而言，天然存在之Cas9分子可進行更改，例如更改PAM識別，例如更改Cas9分子識別之PAM序列以降低脫靶位點及/或改良特異性；或消除PAM識別要求。在一實施例中，Cas9分子可進行更改，例如增加PAM識別序列之長度及/或改良Cas9特異性至高水準一致性，以降低脫靶位點及增加特異性。在一實施例中，PAM識別序列之長度至少為4、5、6、7、8、9、10或15個胺基酸長度。可使用定向進化來產生識別不同PAM序列及/或具有降低的脫靶活性之Cas9分子。可用於定向進化Cas9分子之例示性方法及系統描述於例如Esvelt等人, Nature 2011, 472(7344): 499-503中。可例如藉由本文中所描述之方法來評價候選Cas9分子。非裂解及裂解經修飾之 Cas9 分子 在一實施例中，Cas9分子包含不同於天然存在之Cas9分子，例如不同於具有最接近同源性之天然存在之Cas9分子的裂解特性。舉例而言，Cas9分子與天然存在之Cas9分子，例如化膿性鏈球菌之Cas9分子之不同之處可如下：例如相比於天然存在之Cas9分子(例如化膿性鏈球菌之Cas9分子)，其調節(例如減少或增加)雙鏈斷裂之裂解(核酸內切酶及/或核酸外切酶活性)的能力；例如相比於天然存在之Cas9分子(例如化膿性鏈球菌之Cas9分子)，其調節(例如減少或增加)核酸之單鏈(例如核酸分子之非互補鏈或核酸分子之互補鏈)裂解(切口酶活性)的能力；或裂解核酸分子(例如雙鏈或單鏈核酸分子)的能力，其可經消除。裂解活性經修飾之 Cas9 分子 在一實施例中，活性Cas9分子包含以下活性中之一或多者：與N端RuvC類域相關之裂解活性；與HNH類域相關之裂解活性；與HNH域相關之裂解活性及與N端RuvC類域相關之裂解活性。 在一實施例中，Cas9分子為例如僅裂解DNA之單鏈之Cas9切口酶。在一實施例中，Cas9切口酶包括在SEQ ID NO: 205之位置10處之突變及/或位置840處之突變，例如包含針對SEQ ID NO: 205之D10A及/或H840A突變。非裂解非活性 Cas9 分子 在一實施例中，經更改Cas9分子為非活性Cas9分子，其並不裂解核酸分子(雙鏈或單鏈核酸分子)或以顯著較低效率裂解核酸分子，例如小於20、10、5、1或0.1%之參考Cas9分子之裂解活性，例如如藉由本文中所描述之分析法所量測。參考Cas9分子可為天然存在之未經修飾Cas9分子，例如天然存在之Cas9分子，諸如以下細菌之Cas9分子：化膿性鏈球菌、嗜熱鏈球菌、金黃色葡萄球菌或奈瑟氏腦膜炎菌。在一實施例中，參考Cas9分子為具有最接近序列一致性或同源性之天然存在之Cas9分子。在一實施例中，非活性Cas9分子不具有與N端RuvC類域相關之實質性裂解活性及與HNH類域相關之實質性裂解活性。 在一實施例中，Cas9分子為dCas9。Tsai等人. (2014), Nat. Biotech. 32:569-577。 可將催化非活性Cas9分子與轉錄抑制子融合。非活性Cas9融合蛋白與gRNA複合，且定位至由gRNA之靶向域指定的DNA序列，但不同於活性Cas9，其將不裂解靶標DNA。效應子結構域(諸如轉錄抑制域)與非活性Cas9之融合使得能夠對由gRNA指定之任何DNA位點補充效應子。Cas9融合蛋白對於基因啟動子區之位點特異性靶向可阻斷或影響聚合酶結合至啟動子區，例如Cas9與轉錄因子(例如轉錄活化子)融合及/或轉錄增強子結合至核酸，以增加或抑制轉錄活化。或者，Cas9與轉錄抑制子融合對於基因啟動子區之位點特異性靶向可用於降低轉錄活化。 可與非活性Cas9分子融合之轉錄抑制子或轉錄抑制子域可包括ruppel相關聯盒(KRAB或SKD)、Mad mSIN3相互作用域(SID)或ERF抑制子域(ERD)。 在另一實施例中，可將非活性Cas9分子與修飾染色體之蛋白質融合。舉例而言，非活性Cas9分子可與以下蛋白質融合：異染色體蛋白1 (HPl)、組蛋白離胺酸甲基轉移酶(例如SUV39H 1、SUV39H2、G9A、ESET/SETDB l、Pr-SET7/8、SUV4-20H 1、RIZ1)、組蛋白離胺酸去甲基化酶(例如LSD1/BHC1 10、SpLsdl/Sw、l/Safl 10、Su(var)3-3、JMJD2A/JHDM3A、JMJD2B、JMJD2C/GASC1、JMJD2D、Rph l、JARID 1 A/RBP2、JARI DIB/PLU-I、JAR1D 1C/SMCX、JARID1 D/SMCY、Lid、Jhn2、Jmj2)、組蛋白離胺酸脫乙醯基酶(例如HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、Rpd3、Hos l、Cir6、HDAC4、HDAC5、HDAC7、HDAC9、Hdal、Cir3、SIRT 1、SIRT2、Sir2、Hst l、Hst2、Hst3、Hst4、HDAC 1 1)及DNA甲基化酶(DNMT1、DNMT2a/DMNT3b、MET1)。非活性Cas9-染色體修飾分子融合蛋白可用於更改染色體狀態至降低表現靶基因。 可將異源序列(例如轉錄抑制子域)與非活性Cas9蛋白之N端或C端融合。在一替代實施例中，可將異源序列(例如轉錄抑制子域)與非活性Cas9蛋白之內部部分(亦即，除N端或C端以外之部分)融合。 可例如藉由章節ΠΙ中之本文所描述之方法來評價Cas9分子/gRNA分子複合物結合至靶標核酸及裂解靶標核酸之能力。亦可藉由此項技術中熟知之方法來評價Cas9分子(例如單獨活性Cas9或非活性Cas9，或與gRNA分子呈複合物)之活性，該等方法包括基因表現分析及基於染色體分析，例如染色體免疫沈澱(ChiP)及活體內染色體分析(CiA)。其他 Cas9 分子融合 在實施例中，Cas9分子(例如化膿性鏈球菌之Cas9)可另外包含一或多個賦予額外活性之胺基酸序列。 在一些態樣中，Cas9分子可包含一或多個細胞核定位序列(NLS)，諸如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多NLS。在一些實施例中，Cas9分子包含胺基端處或附近之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多NLS，羧基端處或附近之至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多NLS，或此等之組合(例如胺基端處之一或多個NLS及羧基端處之一或多個NLS)。當存在多於一個NLS時，每一NLS可獨立於其他NLS進行選擇，以使得單個NLS可存在於多於一個複本中及/或與一或多個複本中存在之一或多個其他NLS組合。在一些實施例中，當NLS沿多肽鏈距N端或C端之最接近胺基酸在約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或更多個胺基酸內時，認為NLS在N端或C端附近。通常，NLS由暴露於蛋白質表面上之帶正電離胺酸或精胺酸之一或多個短序列組成，但其他類型之NLS為已知的。NLS之非限制性實例包括含或衍生自以下之NLS序列：SV40病毒大型T-抗原之NLS，其具有胺基酸序列PKKKRKV (SEQ ID NO: 206)；來自核質蛋白之NLS (例如具有序列KRPAATKKAGQ AKKKK (SEQ ID NO: 207)之核質蛋白二分體NLS)；c-myc NLS，其具有胺基酸序列PAAKRVKLD (SEQ ID NO: 208)或RQRRNELKRSP (SEQ ID NO: 209)；hRNPA1 M9 NLS，其具有序列NQSSNFGPMKGGNFGG RSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY (SEQ ID NO: 210)；來自內輸蛋白α之IBB域之序列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQ ILKRRNV (SEQ ID NO: 211)；肌瘤T蛋白之序列VSRKRPRP (SEQ ID NO: 212)及PPKKARED (SEQ ID NO: 213)；人類p53之序列PQPKKKPL (SEQ ID NO: 214)；小鼠c-ab1 IV之序列SALIKKKKKMAP (SEQ ID NO: 215)；流感病毒NS1之序列DRLRR (SEQ ID NO: 216)及PKQKKRK (SEQ ID NO: 217)；D型肝炎病毒抗原之序列RKLKKKIKKL (SEQ ID NO: 218)；小鼠Mx1蛋白之序列REKKKFLKRR (SEQ ID NO: 219)；人類聚(ADP-核糖)聚合酶之序列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK (SEQ ID NO: 220)；以及甾類激素受體(人類)糖皮質激素之序列RKCLQAGMNLEARKTKK (SEQ ID NO: 221)。其他合適NLS序列為此項技術中已知的(例如Sorokin, Biochemistry (Moscow) (2007) 72:13, 1439-1457；Lange J Biol Chem. (2007) 282:8, 5101-5)。 在一實施例中，Cas9分子(例如化膿性鏈球菌Cas9分子)包含例如位於Cas9分子N端之SV40的NLS序列。在一實施例中，Cas9分子(例如化膿性鏈球菌Cas9分子)包含位於Cas9分子N端之SV40的NLS序列及位於Cas9分子C端之SV40的NLS序列。在一實施例中，Cas9分子(例如化膿性鏈球菌Cas9分子)包含位於Cas9分子N端之SV40的NLS序列及位於Cas9分子C端之核質蛋白的NLS序列。在前述實施例中之任一者中，分子可例如在N端或C端另外包含標籤，例如His標籤，例如His(6)標籤(SEQ ID NO: 247)或His(8)標籤(SEQ ID NO: 248)。 在一些態樣中，Cas9分子可包含允許Cas9分子特異性地識別例如標籤之一或多個胺基酸序列。在一個實施例中，標籤為組胺酸標籤，例如包含至少3、4、5、6、7、8、9、10或更多個組胺酸胺基酸之組胺酸標籤。在實施例中，組胺酸標籤為His6標籤(六個組胺酸) (SEQ ID NO: 247)。在其他實施例中，組胺酸標籤為His8標籤(八個組胺酸) (SEQ ID NO: 248)。在實施例中，組胺酸標籤可藉由連接子與Cas9分子之一或多個其他部分隔開。在實施例中，連接子為GGS。此類融合之實例為Cas9分子iProt106520。 在一些態樣中，Cas9分子可包含由蛋白酶識別之一或多個胺基酸序列(例如包含蛋白酶裂解位點)。在實施例中，裂解位點為菸草蝕刻病毒(TEV)裂解位點，例如包含序列ENLYFQG (SEQ ID NO: 230)。在一些態樣中，蛋白酶裂解位點(例如TEV裂解位點)位於標籤(例如His標籤、例如His6 (SEQ ID NO: 247)，或His8標籤(SEQ ID NO: 248))與Cas9分子之其餘部分之間。在不受理論束縛之情況下，咸信，此類引入將允許使用標籤以用於例如純化Cas9分子，且接著後續裂解，因此標籤並不干擾Cas9分子功能。 在實施例中，Cas9分子(例如如本文中所描述之Cas9分子)包含N端NLS及C端NLS (例如自N端至C端包含NLS-Cas9-NLS)，例如其中各NLS為SV40 NLS (PKKKRKV (SEQ ID NO: 206))。在實施例中，Cas9分子(例如如本文中所描述之Cas9分子)包含N端NLS、C端NLS及C端His6標籤(SEQ ID NO: 247) (例如自N端至C端包含NLS-Cas9-NLS-His標籤)，例如其中各NLS為SV40 NLS (PKKKRKV (SEQ ID NO: 206))。在實施例中，Cas9分子(例如如本文中所描述之Cas9分子)包含N端His標籤(例如His6標籤(SEQ ID NO: 247))、N端NLS及C端NLS (例如自N端至C端包含His標籤-NLS-Cas9-NLS)，例如其中各NLS為SV40 NLS (PKKKRKV (SEQ ID NO: 206))。在實施例中，Cas9分子(例如如本文中所描述之Cas9分子)包含N端NLS及C端His標籤(例如His6標籤(SEQ ID NO: 247)) (例如自N端至C端包含His標籤-Cas9-NLS)，例如其中NLS為SV40 NLS (PKKKRKV (SEQ ID NO: 206))。在實施例中，Cas9分子(例如如本文中所描述之Cas9分子)包含N端NLS及C端His標籤(例如His6標籤(SEQ ID NO: 247)) (例如自N端至C端包含NLS-Cas9-His標籤)，例如其中NLS為SV40 NLS (PKKKRKV (SEQ ID NO: 206))。在實施例中，Cas9分子(例如如本文中所描述之Cas9分子)包含N端His標籤(例如His8標籤(SEQ ID NO: 248))、N端裂解域(例如菸草蝕刻病毒(TEV)裂解域(例如包含序列ENLYFQG (SEQ ID NO: 230)))、N端NLS (例如SV40 NLS；SEQ ID NO: 206)及C端NLS (例如SV40 NLS；SEQ ID NO: 206) (例如自N端至C端包含His標籤-TEV-NLS-Cas9-NLS)。在前述實施例中之任一者中，Cas9具有SEQ ID NO: 205之序列。或者，在前述實施例中之任一者中，Cas9具有例如如本文中所描述之SEQ ID NO: 205之Cas9變體之序列。在前述實施例中之任一者中，Cas9分子包含His標籤與分子之另一部分之間的連接子，例如GGS連接子。上文所描述之例示性Cas9分子之胺基酸序列提供於下。「iProt」標識符匹配圖60中之彼等。 iProt105026 (亦稱為iProt106154、iProt106331、iProt106545及PID426303，視蛋白質之製備而定) (SEQ ID NO: 233)： iProt106518 (SEQ ID NO: 234)：iProt106519 (SEQ ID NO: 235)：iProt106520 (SEQ ID NO: 236)：iProt106521 (SEQ ID NO: 237)：iProt106522 (SEQ ID NO: 238)： iProt106658 (SEQ ID NO: 239)：iProt106745 (SEQ ID NO: 240)： iProt106746 (SEQ ID NO: 241)：iProt106747 (SEQ ID NO: 242)：iProt106884 (SEQ ID NO: 243)：iProt 20109496 (SEQ ID NO: 244) 編碼 Cas9 分子之核酸 本文提供編碼Cas9分子(例如活性Cas9分子或非活性Cas9分子)之核酸。 編碼Cas9分子之例示性核酸描述於以下中：Cong等人, SCIENCE 2013, 399(6121):819-823；Wang等人, CELL 2013, 153(4):910-918；Mali 等人, SCIENCE 2013, 399(6121):823-826；Jinek等人, SCIENCE 2012, 337(6096):816-821。 在一實施例中，編碼Cas9分子之核酸可為合成的核酸序列。舉例而言，合成的核酸分子可經化學修飾，例如如章節XIII中所描述。在一實施例中，Cas9 mRNA具有以下特性中之一或多者，例如所有：其為加帽，聚腺苷酸化，經5-甲基胞啶及/或假尿苷取代的。 另外或替代地，合成的核酸序列可為密碼子最佳化的，例如至少一個非常見密碼子或不常見密碼子已經常見密碼子置換。舉例而言，合成的核酸可引導最佳化信使mRNA之合成，例如例如本文中所描述之針對哺乳動物表現系統中之表現最佳化。 下文提供編碼化膿性鏈球菌之Cas9分子之例示性密碼子最佳化核酸序列。 (SEQ ID NO: 222) 下文提供編碼包括SEQ ID NO: 244之Cas9分子之例示性密碼子最佳化核酸序列： 若將以上Cas9序列與肽或多肽在C端融合(例如非活性Cas9與轉錄抑制子在C端融合)，則應理解，將移除終止密碼子。 本文亦提供用於製造Cas9分子(例如本文中所描述之Cas9分子)之核酸、載體及細胞。可使用熟習此項技術者已知之技術來實現多肽分子之重組製造。本文中描述用於重組製造多肽分子(諸如，例如如本文中所描述之Cas9分子)之分子及方法。如結合使用，「重組」分子及製造包括藉由重組方式製備、表現、產生或分離之所有多肽(例如，例如如本文中所描述之Cas9分子)，諸如：分離自針對編碼所關注分子之核酸轉殖基因或轉殖染色體之動物(例如小鼠)的多肽；由此製備的融合瘤；分離自經轉形以表現該分子之宿主細胞(例如分離自轉染瘤)的分子；分離自重組體、組合文庫的分子；及藉由任何其他方式而製備、表現、創建或分離的分子，該等方式涉及將編碼該分子(或其部分)之基因之全部或一部分剪接至其他DNA序列。重組製造可來自宿主細胞，例如包含編碼本文中所描述之分子(例如Cas9分子，例如本文中所描述之Cas9分子)之核酸的宿主細胞。 本文提供編碼例如如本文中所描述之分子(例如Cas9分子及/或gRNA分子)之核酸分子。特異性地提供核酸分子，其包含編碼以下之序列：編碼SEQ ID NO: 233至SEQ ID NO: 244中之任一者之序列，或編碼SEQ ID NO: 233至SEQ ID NO: 244中之任一者之片段，或編碼包含與SEQ ID NO: 233至SEQ ID NO: 244中之任一者具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同源性之多肽。 本文提供例如如本文中所描述之載體，其包含上文所描述之核酸分子中之任一者。在實施例中，該等核酸分子可操作地連接於啟動子，例如在引入載體之宿主細胞中可操作的啟動子。 本文提供宿主細胞，其包含本文中所描述之一或多個核酸分子及/或載體。在實施例中，宿主細胞為原核宿主細胞。在實施例中，宿主細胞為真核宿主細胞。在實施例中，宿主細胞為酵母菌或大腸桿菌(e. coli)細胞。在實施例中，宿主細胞為哺乳動物細胞，例如人類細胞。此類宿主細胞可用於製造本文中所描述之重組分子，例如，例如如本文中所描述之Cas9或gRNA分子。VI . 候選分子之功能分析 可藉由此項技術已知之方法或如本文中所描述之方法來評價候選Cas9分子、候選gRNA分子、候選Cas9分子/gRNA分子複合物。舉例而言，用於評估Cas9分子之核酸內切酶活性之例示性方法例如描述於Jinek等人, SCIENCE 2012; 337(6096):816-821中。VII. 模板核酸 ( 用於引入核酸 ) 如本文所使用，術語「模板核酸」或「供體模板」係指待在已藉由本發明之CRISPR系統修飾(例如裂解)之靶標序列處或附近插入的核酸。在一實施例中，靶標序列處或附近之核酸序列經修飾以通常在裂解位點處或附近具有模板核酸之一些或所有序列。在一實施例中，模板核酸為單鏈的。在一替代實施例中，模板核酸為雙鏈的。在一實施例中，模板核酸為DNA，例如雙鏈DNA。在一替代實施例中，模板核酸為單鏈DNA。 在實施例中，模板核酸包含編碼血球蛋白(例如β血球蛋白)之序列，例如包含β血球蛋白基因。在一實施例中，由核酸編碼之β血球蛋白包含一或多個突變，例如抗鐮狀化突變。在一實施例中，由核酸編碼之β血球蛋白包含突變T87Q。在一實施例中，由核酸編碼之β血球蛋白包含突變G16D。在一實施例中，由核酸編碼之β血球蛋白包含突變E22A。在一實施例中，β血球蛋白基因包含突變G16D、E22A及T87Q。在實施例中，模板核酸進一步包含一或多個調節元件，例如啟動子(例如人類β血球蛋白啟動子)、3'增強子及/或血球蛋白基因座控制區(例如一或多個DNAseI超敏反應位點(例如人類血球蛋白基因座之HS2、HS3及/或HS4))之至少一部分。 在其他實施例中，模板核酸包含編碼γ血球蛋白之序列，例如包含γ血球蛋白基因。在實施例中，模板核酸包含編碼γ血球蛋白之多於一個複本之序列，例如包含兩個或更多個(例如兩個)γ血球蛋白基因序列。在實施例中，模板核酸進一步包含一或多個調節元件，例如啟動子及/或增強子。 在一實施例中，模板核酸藉由加入同源性定向修復事件中來更改靶標位置之結構。在一實施例中，模板核酸更改靶標位置之序列。在一實施例中，模板核酸使得將經修飾或非天然存在之鹼基併入至靶標核酸中。 可使用本文中所論述之方法中之一者來校正本文中所描述之基因或路徑中之突變。在一實施例中，藉由同源性定向修復(HDR)使用模板核酸來校正本文中所描述之基因或路徑中之突變。在一實施例中，藉由同源重組(HR)使用模板核酸來校正本文中所描述之基因或路徑中之突變。在一實施例中，藉由非同源末端接合(NHEJ)修復使用模板核酸來校正本文中所描述之基因或路徑中之突變。在其他實施例中，可將編碼所關注之分子之核酸插入在藉由本發明之CRISPR系統修飾的位點處或附近。在實施例中，模板核酸包含調節元件，例如一或多個啟動子及/或增強子，其可操作地連接於編碼所關注之(例如如本文中所描述之)分子之核酸序列。 HDR或HR修復及模板核酸 如本文中所描述，核酸酶誘導之同源性定向修復(HDR)或同源重組(HR)可用於更改靶標序列及校正(例如修復或編輯)基因體中之突變。雖然不希望受理論束縛，但咸信，靶標序列之更改藉由基於供體模板或模板核酸之修復而發生。舉例而言，供體模板或模板核酸提供靶標序列之更改。預期，質體供體或直鏈雙鏈模板可用作同源重組之模板。進一步預期，單鏈供體模板可用作用於藉由靶標序列與供體模板之間的同源性定向修復之替代方法(例如單鏈退火)更改靶標序列的模板。靶標序列之供體模板實現之更改可視藉由Cas9分子之裂解而定。藉由Cas9之裂解可包含雙鏈斷裂、一個單鏈斷裂或兩個單鏈斷裂。 在一實施例中，可藉由單個雙鏈斷裂或兩個單鏈斷裂來校正突變。在一實施例中，可藉由提供模板及CRISPR/Cas9系統來校正突變，該CRISPR/Cas9系統建立(1)一個雙鏈斷裂，(2)兩個單鏈斷裂，(3)兩個雙鏈斷裂，其中一斷裂在靶標序列之各側上發生，(4)一個雙鏈斷裂及兩個單鏈斷裂，其中雙鏈斷裂及兩個單鏈斷裂在靶標序列之各側上發生，(5)四個單鏈斷裂，其中一對單鏈斷裂在靶標序列之各側上發生，或(6)一個單鏈斷裂。 雙鏈斷裂介導的校正 在一實施例中，藉由具有與HNH類域相關之裂解活性及與RuvC類域(例如N端RuvC類域)相關之裂解活性的Cas9分子(例如野生型Cas9)來實現雙鏈裂解。此類實施例僅需要單一gRNA。 單鏈斷裂介導的校正 在其他實施例中，藉由具有切口酶活性，例如與HNH類域相關之裂解活性或與N端RuvC類域相關之裂解活性之Cas9分子來實現兩個單鏈斷裂或鏈裂。此類實施例需要兩個gRNA，一個用於置放各單鏈斷裂。在一實施例中，具有切口酶活性之Cas9分子裂解與gRNA雜交之鏈，但不裂解同與gRNA雜交之鏈互補之鏈。在一實施例中，具有切口酶活性之Cas9分子並不裂解與gRNA雜交之鏈，而是裂解同與gRNA雜交之鏈互補之鏈。 在一實施例中，切口酶具有HNH活性，例如具有RuvC活性之Cas9分子不活化在D10處具有突變(例如D10A突變)之(例如) Cas9分子。D10A不活化RuvC；因此，Cas9切口酶具有(僅)HNH活性，且將在與gRNA雜交之鏈(例如互補鏈，其並不在其上具有NGG PAM)上剪切。在其他實施例中，具有H840 (例如H840A)突變之Cas9分子可用作切口酶。H840A不活化HNH；因此，Cas9切口酶具有(僅) RuvC活性，且在非互補鏈(例如具有NGG PAM且其序列與gRNA一致之鏈)上剪切。 在切口酶及兩個gRNA用於置放兩個單鏈鏈裂之一實施例中，一個鏈裂係在靶標核酸之+鏈上，及一個鏈裂係在靶標核酸之-鏈上。PAM面向外部。可選擇gRNA，使得gRNA由約0-50、0-100或0-200個核苷酸隔開。在一實施例中，與兩個gRNA之靶向域互補之靶標序列之間不存在重疊。在一實施例中，gRNA不重疊，且由多達50、100或200個核苷酸隔開。在一實施例中，使用兩個gRNA可例如藉由降低脫靶結合而增加特異性(Ran等人, CELL 2013)。 在一實施例中，單一鏈裂可用於誘導HDR。本文中預期，單一鏈裂可用於增加既定裂解位點處之HDR、HR或NHEJ比率。 相對於靶標位置雙鏈斷裂或單鏈斷裂之置放 鏈中之一者中之雙鏈斷裂或單鏈斷裂應充分接近於靶標位置使得校正發生。在一實施例中，距離不大於50、100、200、300、350或400個核苷酸。雖然不希望受理論束縛，但咸信，斷裂應充分接近於靶標位置，使得斷裂係在末端切除期間經受核酸外切酶介導的移除的區內。若靶標位置與斷裂之間的距離過大，則突變可能不包括於末端切除中，且因此可能不能進行校正，由於供體序列可僅用於校正末端切除區內之序列。 在出於誘導HDR-或HR-介導的校正之目的gRNA (單分子(或嵌合)或模組gRNA)及Cas9核酸酶誘導雙鏈斷裂之一實施例中，裂解位點距靶標位置在0-200 bp (例如0至175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100 bp)之間。在一實施例中，裂解位點距靶標位置在0-100 bp (例如0至75、0至50、0至25、25至100、25至75、25至50、50至100、50至75或75至100 bp)之間。 在兩個gRNA (獨立地，與Cas9切口酶複合之單分子(或嵌合)或模組gRNA出於誘導HDR介導的校正之目的而誘導兩個單鏈斷裂)之一實施例中，距靶標位置較近的鏈裂在0-200 bp (例如0至175、0至150、0至125、0至100、0至75、0至50、0至25、25至200、25至175、25至150、25至125、25至100、25至75、25至50、50至200、50至175、50至150、50至125、50至100、50至75、75至200、75至175、75至150、75至125、75至100 bp)之間，且兩個鏈裂理想地應彼此在25-55 bp (例如25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、30至55、30至50、30至45、30至40、30至35、35至55、35至50、35至45、35至40、40至55、40至50、40至45 bp)內且彼此距離不大於100 bp (例如彼此距離不大於90、80、70、60、50、40、30、20、10或5 bp)。在一實施例中，裂解位點距靶標位置在0-100 bp (例如0至75、0至50、0至25、25至100、25至75、25至50、50至100、50至75或75至100 bp)之間。 在一個實施例中，兩個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成將雙鏈斷裂置放於靶標位置之兩側上。在一替代實施例中，三個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成將雙鏈斷裂(亦即，一個gRNA與Cas9核酸酶複合)及兩個單鏈斷裂或成對單鏈斷裂(亦即，兩個gRNA與Cas9切口酶複合)置放於靶標位置之任一側上(例如第一gRNA用於靶向靶標位置上游(亦即，5')，及第二gRNA用於靶向靶標位置下游(亦即，3'))。在另一實施例中，四個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成在靶標位置之任一側上產生兩對單鏈斷裂(亦即，兩對兩個gRNA Cas9切口酶複合) (例如第一gRNA用於靶向靶標位置上游(亦即，5')，及第二gRNA用於靶向靶標位置下游(亦即，3'))。雙鏈斷裂或配對中之兩個單鏈鏈裂之更近者理想地應在靶標位置之0-500 bp內(例如距靶標位置不大於450、400、350、300、250、200、150、l00、50或25 bp)。當使用切口酶時，配對中之兩個鏈裂彼此距離25-55 bp內(例如在以下之間：25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50 、45至50、35至45或40至45 bp)且彼此距離不大於100 bp (例如不大於90、80、70、60、50、40、30、20或10 bp)。 在一個實施例中，兩個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成將雙鏈斷裂置放於靶標位置之兩側上。在一替代實施例中，三個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成將雙鏈斷裂(亦即，一個gRNA與Cas9核酸酶複合)及兩個單鏈斷裂或成對單鏈斷裂(亦即，兩個gRNA與Cas9切口酶複合)置放於插入位點之兩個靶標序列上(例如第一gRNA用於靶向靶標序列上游(亦即，5')，及第二gRNA用於靶向靶標序列下游(亦即，3'))。在另一實施例中，四個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成在插入位點之任一側上產生兩對單鏈斷裂(亦即，兩對兩個gRNA與Cas9切口酶複合) (例如第一gRNA用於靶向本文中所描述之靶標序列上游(亦即，5')，及第二gRNA用於靶向本文中所描述之靶標序列下游(亦即，3'))。雙鏈斷裂或配對中之兩個單鏈鏈裂之更近者理想地應在靶標位置之0-500 bp內(例如距靶標位置不大於450、400、350、300、250、200、150、100、50或25 bp)。當使用切口酶時，配對中之兩個鏈裂距離彼此在25-55 bp內(例如在以下之間：25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45或40至45 bp)且距離彼此不大於100 bp (例如不大於90、80、70、60、50、40、30、20或10 bp)。 同源性臂之長度 同源性臂應至少延伸遠至末端切除可發生之區，例如以允許經切除之單鏈突出端找到供體模板內之互補區。總長度可能受諸如質體大小或病毒封裝限制之參數限制。在一實施例中，同源性臂並不延伸至重複元件中，例如ALU重複序列、LINE重複序列。模板可具有兩個相同或不同長度之同源性臂。 例示性同源性臂長度包括至少25、50、100、250、500、750或1000個核苷酸。 如本文中所使用，靶標位置係指靶標核酸(例如染色體)上之藉由Cas9分子依賴性方法修飾的位點。舉例而言，靶標位置可為經Cas9分子裂解修飾之靶標核酸及模板核酸定向修飾，例如靶標位置之校正。在一實施例中，靶標位置可為向其中添加一或多個核苷酸之靶標核酸上之兩個核苷酸(例如相鄰核苷酸)之間的位點。靶標位置可包含藉由模板核酸更改(例如校正)之一或多個核苷酸。在一實施例中，靶標位置在靶標序列(例如結合gRNA之序列)內。在一實施例中，靶標位置在靶標序列(例如gRNA結合之序列)上游或下游。 通常，模板序列經受斷裂介導的或催化的與靶標序列之重組。在一實施例中，模板核酸包括對應於靶標序列上之藉由Cas9介導的裂解事件裂解的位點的序列。在一實施例中，模板核酸包括對應於以下兩者之序列：靶標序列上之在第一Cas9介導的事件中裂解的第一位點，及靶標序列上之在第二Cas9介導的事件中裂解的第二位點。 在一實施例中，模板核酸可包括在轉譯序列之編碼序列中產生更改之序列，例如在蛋白質產物中產生一個胺基酸取代另一個胺基酸的一者，例如將突變型對偶基因轉形至野生型對偶基因中，將野生型對偶基因轉形至突變型對偶基因中，及/或引入終止密碼子、插入胺基酸殘基、缺失胺基酸殘基或無意義突變。 在其他實施例中，模板核酸可包括在非編碼序列中產生更改之序列，例如外顯子、或5'或3'非轉譯或非轉錄區中之更改。此類更改包括控制元件(例如啟動子、增強子)中之更改及順式作用或反式作用控制元件中之更改。 模板核酸可包括當整合時產生以下之序列： 降低正控制元件之活性； 增加正控制元件之活性； 降低負控制元件之活性； 增加負控制元件之活性； 降低基因之表現； 增加基因之表現； 增加對病症或疾病之抗性； 增加對病毒進入之抗性； 校正突變或更改非所需胺基酸殘基； 賦予、增加、消除或降低基因產物之生物特性，例如增加酶之酶活性，或增加基因產物與另一分子相互作用之能力。 模板核酸可包括產生以下之序列： 靶標序列之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多個核苷酸之序列之改變。 在一實施例中，模板核酸之長度為20+/- 10、30+/- 10、40+/- 10、50+/- 10、60+/- 10、70+/- 10、80+/- 10、90+/- 10、100+/- 10、110+/- 10、120+/- 10、130+/- 10、140+/- 10、150+/- 10、160+/- 10、170+/- 10、180+/- 10、190+/- 10、200+/- 10、210+/-10、220+/- 10、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、800-900、900-1000、1000-2000、2000-3000或多於3000個核苷酸。 模板核酸包含以下組分： [5'同源性臂]-[插入序列]-[3'同源性臂]。 同源性臂提供重組至染色體中，其可用置換序列置換非所需元件，例如突變或標誌。在一實施例中，同源性臂側接最遠端裂解位點。 在一實施例中，5'同源性臂之3'端為緊接於置換序列之5'端之位置。在一實施例中，5'同源性臂可自置換序列之5'端之5'延伸至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000個核苷酸。 在一實施例中，3'同源性臂之5'端為緊接於置換序列之3'端之位置。在一實施例中，3'同源性臂可自置換序列之3'端之3'延伸至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、180、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500或2000個核苷酸。 本文中預期，可縮短一個或兩個同源性臂，以避免包括某些序列重複元件，例如Alu重複序列、LINE元件。舉例而言，可縮短5'同源性臂以避免序列重複元件。在其他實施例中，可縮短3'同源性臂以避免序列重複元件。在一些實施例中，可縮短5'及3'同源性臂兩者以避免包括某些序列重複元件。 本文中預期，可設計用於校正突變之模板核酸，以用作單鏈寡核苷酸(ssODN)。當使用ssODN時，5'及3'同源性臂之長度範圍可至多約200個鹼基對(bp)，例如長度為至少25、50、75、100、125、150、175或200 bp。亦考慮較長同源性臂用於ssODN，由於不斷進行寡核苷酸合成中之改良。 用於基因靶向之NHEJ方法 如本文中所描述，核酸酶誘導的非同源末端接合(NHEJ)可用於靶基因特異性剔除。核酸酶誘導的NHEJ亦可用於移除(例如缺失)相關基因中之序列。 雖然不希望受理論束縛，但咸信，在一實施例中，與本文所描述之方法相關之基因體更改依賴於核酸酶誘導的NHEJ及NHEJ修復路徑之易錯性質。NHEJ藉由將兩個末端接合在一起而修復DNA中之雙鏈斷裂；然而一般而言，僅當兩個相容末端極佳地接合時(確切地，當其由雙鏈斷裂形成時)，才恢復初始序列。在重新接合末端之前，雙鏈斷裂之DNA末端常常已經受酶處理，其引起在一或兩個鏈處添加或移除核苷酸。此使得DNA序列中NHEJ修復位點處之插入及/或缺失(插入缺失)突變的存在。三分之二之此等突變可更改閱讀框架，且因此產生非功能性蛋白質。另外，維持閱讀框架但插入或缺失大量序列之突變可破壞蛋白質之功能性。此為基因座依賴性，由於蛋白質之關鍵功能性域中之突變可能比非關鍵性區中之突變耐受更低。 由NHEJ產生之插入缺失突變在自然界中為不可預測的；然而，在既定斷裂位點處，某些插入缺失序列為有利的且在群體中過度表現。缺失之長度可廣泛地變化；最常在1-50 bp範圍中，但其可容易地達至大於100-200 bp。插入傾向於為較短的，且通常包括緊接在斷裂位點周圍之序列的短複製。然而，有可能獲得大型插入，且在此等情況下，插入序列通常來自基因體之其他區或來自細胞中存在之質體DNA。 因為NHEJ為一種突變方法，所以其亦可用於缺失小序列基元，只要不需要產生特異性最終序列即可。若雙鏈斷裂靶向短靶標序列附近，則由NHEJ修復引起之缺失突變通常跨越且因此移除非所需核苷酸。對於較大DNA片段之缺失，引入兩個雙鏈斷裂(一個在序列之各側上)可在末端之間產生NHEJ，同時移除整個插入序列。兩個此等方法均可用於缺失特異性DNA序列；然而，NHEJ之易錯性質仍可在修復位點處產生插入缺失突變。 雙鏈裂解Cas9分子及單鏈(或切口酶) Cas9分子兩者均可用於本文中所描述之方法及組合物中以產生NHEJ介導的插入缺失。靶向基因(例如編碼區，例如相關基因之早期編碼區)之NHEJ介導的插入缺失可用於基因剔除(亦即，消除表現)相關基因。舉例而言，相關基因之早期編碼區包括緊隨轉錄起始位點在編碼序列之第一外顯子內、或在轉錄起始位點之500 bp (例如小於500、450、400、350、300、250、200、150、100或50 bp)內的序列。 雙鏈或單鏈斷裂相對於靶標位置之置放 在出於誘導NHEJ介導的插入缺失之目的gRNA及Cas9核酸酶產生雙鏈斷裂之一實施例中，gRNA (例如單分子(或嵌合)或模組gRNA分子)經組態成將一個雙鏈斷裂置放在非常接近於靶標位置之核苷酸。在一實施例中，裂解位點距靶標位置在0-500 bp之間(例如距靶標位置小於500、400、300、200、100、50、40、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 bp)。 在出於誘導NHEJ介導的插入缺失之目的與Cas9切口酶複合之兩個gRNA誘導兩個單鏈斷裂之一實施例中，兩個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成置放兩個單鏈斷裂以提供NHEJ修復靶標位置之核苷酸。在一實施例中，gRNA經組態成在不同鏈之相同位置處或在彼此之若干核苷酸內置放剪切，從而基本上模擬雙鏈斷裂。在一實施例中，較近鏈裂距靶標位置在0-30 bp之間(例如距靶標位置小於30、25、20、1 、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1 bp)，且兩個鏈裂距離彼此在25-55 bp內(例如在以下之間：25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45或40至45 bp)且距離彼此不大於100 bp (例如不大於90、80、70、60、50、40、30、20或10 bp)。在一實施例中，gRNA經組態成將單鏈斷裂置放在靶標位置核苷酸之任一側上。 雙鏈裂解Cas9分子及單鏈(或切口酶)Cas9分子兩者均可用於本文中所描述之方法及組合物中以在靶標位置之兩側產生斷裂。可在靶標位置之兩側上產生雙鏈或成對單鏈斷裂，以移除兩個剪切之間的核酸序列(例如使兩個斷裂之間的區缺失)。在一個實施例中，兩個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成將雙鏈斷裂置放在靶標位置之兩側上(例如第一gRNA用於靶向本文中所描述之基因或路徑中之突變上游(亦即，5')，及第二gRNA用於靶向本文中所描述之基因或路徑中之突變下游(亦即，3'))。在一替代實施例中，三個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成將雙鏈斷裂(亦即，一個gRNA與Cas9核酸酶複合)及兩個單鏈斷裂或成對單鏈斷裂(亦即，兩個gRNA與Cas9切口酶複合)置放在靶標位置之任一側上(例如第一gRNA用於靶向本文中所描述之基因或路徑中之突變上游(亦即，5')，及第二gRNA用於靶向本文中所描述之基因或路徑中之突變下游(亦即，3'))。在另一實施例中，四個gRNA (例如獨立地，單分子(或嵌合)或模組gRNA)經組態成在靶標位置之任一側上產生兩對單鏈斷裂(亦即，兩對兩個gRNA與Cas9切口酶複合) (例如第一gRNA用於靶向本文中所描述之基因或路徑中之突變上游(亦即，5')，及第二gRNA用於靶向本文中所描述之基因或路徑中之突變下游(亦即，3'))。雙鏈斷裂或配對中之兩個單鏈鏈裂之更近者理想地應在靶標位置之0-500 bp內(例如距靶標位置不大於450、400、350、300、250、200、150、100、50或25 bp)。當使用切口酶時，配對中之兩個鏈裂距離彼此在25-55 bp內(例如在以下之間：25至50、25至45、25至40、25至35、25至30、50至55、45至55、40至55、35至55、30至55、30至50、35至50、40至50、45至50、35至45或40至45 bp)且距離彼此不大於100 bp (例如不大於90、80、70、60、50、40、30、20或10 bp)。 在其他實施例中，可藉由微小同源性末端接合(MMEJ)介導模板核酸之插入。參見例如Saksuma等人「MMEJ-assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems.」Nature Protocols 11 , 118-133 (2016) doi:10.1038/nprot.2015.140 2015年12月17日線上公開，其內容以全文引用之方式併入。VIII. 包含多於一個 gRNA 分子之系統 雖然不意欲受理論束縛，但本文中已出人意料地展示，靶向連續核酸上之位置緊密接近之兩個靶標序列(例如藉由各自在其個別靶標序列處或附近誘導單鏈或雙鏈斷裂之兩個gRNA分子/Cas9分子複合物)誘導位於兩個靶標序列之間的核酸序列(或至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%之該核酸序列)刪除(例如缺失)。在一些態樣中，本發明提供兩個或更多個gRNA分子之使用，該兩個或更多個gRNA分子包含靶向連續核酸(例如染色體，例如基因或基因座，包括其內含子、外顯子及調節元件)上之緊密接近之靶標序列的靶向域。該使用可例如藉由將兩個或更多個gRNA分子以及一或多個Cas9分子(或編碼該兩個或更多個gRNA分子及/或該一或多個Cas9分子之核酸)引入至細胞中。 在一些態樣中，兩個或更多個gRNA分子之靶標序列在連續核酸上相隔以下距離定位：至少5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000或15,000個核苷酸，但在連續核酸上相隔不大於25,000個核苷酸。在實施例中，靶標序列相隔約4000與約6000個核苷酸之間定位。在一實施例中，靶標序列相隔約4000個核苷酸定位。在一實施例中，靶標序列相隔約5000個核苷酸定位。在一實施例中，靶標序列相隔約6000個核苷酸定位。 在一些態樣中，複數個gRNA分子各自靶向相同基因或基因座內之序列。在一例示性態樣中，兩個或更多個gRNA分子之靶標序列位於HBG1啟動子區中。在一例示性態樣中，兩個或更多個gRNA分子之靶標序列位於HBG2啟動子區中。在另一態樣中，複數個gRNA分子各自靶向2個或更多個不同基因或基因座內之序列。在一例示性態樣中，gRNA分子中之一或多者之靶標序列位於HBG1啟動子區中，及其他gRNA分子中之一或多者之靶標序列位於HBG2啟動子區中。 在一些態樣中，本發明提供組合物及細胞，其包含複數個(例如2個或更多個，例如2個)本發明之gRNA分子，其中該複數個gRNA分子靶向相隔以下距離的序列：小於15,000、小於14,000、小於13,000、小於12,000、小於11,000、小於10,000、小於9,000、小於8,000、小於7,000、小於6,000、小於5,000、小於4,000、小於3,000、小於2,000、小於1,000、小於900、小於800、小於700、小於600、小於500、小於400、小於300、小於200、小於100、小於90、小於80、小於70、小於60、小於50、小於40或小於30個核苷酸。在一實施例中，靶標序列在雙螺旋核酸之相同鏈上。在一實施例中，靶標序列在雙螺旋核酸之不同鏈上。 在一個實施例中，本發明提供一種用於切除(例如刪除)在雙螺旋核酸之相同或不同鏈上位於安置於相隔以下長度之兩個gRNA結合位點之間的核酸的方法：小於25,000、小於20,000、小於15,000、小於14,000、小於13,000、小於12,000、小於11,000、小於10,000、小於9,000、小於8,000、小於7,000、小於6,000、小於5,000、小於4,000、小於3,000、小於2,000、小於1,000、小於900、小於800、小於700、小於600、小於500、小於400、小於300、小於200、小於100、小於90、小於80、小於70、小於60、小於50、小於40或小於30個核苷酸。在一實施例中，該方法提供使以下百分比之位於與各gRNA結合位點相關之PAM位點之間的核苷酸缺失：多於50%、多於60%、多於70%、多於80%、多於85%、多於86%、多於87%、多於88%、多於89%、多於90%、多於91%、多於92%、多於93%、多於94%、多於95%、多於96%、多於97%、多於98%、多於99%或100%。在實施例中，缺失進一步包含在與各gRNA結合位點相關之PAM位點中之一或多者內的一或多個核苷酸。在實施例中，缺失亦包含在與各gRNA結合位點相關之PAM位點之間的區之外部的一或多個核苷酸。 在一個態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向側接基因調節元件(例如啟動子結合位點、增強子區或抑制子區)之靶標序列之靶向域，使得插入序列(插入序列之一部分)之刪除引起相關基因上調或下調。在其他實施例中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向側接基因之序列之靶向域，使得插入序列(或其部分)之刪除引起相關基因之缺失。 在一實施例中，兩個或更多個gRNA分子各自包括靶向域，該靶向域包含以下，例如由以下組成：表1之靶向域序列，例如表2或例如表3a或表3b之靶向域序列。在實施例中，兩個或更多個gRNA分子各自包括靶向域，該靶向域包含以下，例如由以下組成：gRNA分子靶向域，該靶向域使得由HSPC分化(例如在編輯後第7天)之紅血球群體中之F細胞之數目上調至少15%，該等HSPC藉由本文所描述之方法藉由該gRNA離體編輯。在態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向域，該等靶向域與相同基因或區(例如HBG1啟動子區或HBG2啟動子區)中之序列互補。在態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向域，該等靶向域與不同基因或區之序列(例如HBG1啟動子區中之序列及HBG2啟動子區中之序列)互補。 在一個態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向側接基因調節元件(例如啟動子結合位點、增強子區或抑制子區)之靶標序列之靶向域，使得插入序列(插入序列之一部分)之刪除引起相關基因上調或下調。在另一態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向側接基因之靶標序列之靶向域，使得插入序列(或插入序列之一部分)之刪除引起相關基因之缺失。藉助於實例，兩個或更多個gRNA分子包含靶向側接HBG1基因(例如一個gRNA分子靶向HBG1啟動子區中之靶標序列，及第二gRNA分子靶向HBG2啟動子區中之靶標序列)之靶標序列之靶向域，使得切除HBG1基因。 在一實施例中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向域，該等靶向域包含以下，例如由以下組成：選自表1之靶向域。 在態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向域，該等靶向域包含以下，例如由以下組成：以上表2中列舉之靶向域序列。在態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向域，該等靶向域包含以下，例如由以下組成：以上表3a中列舉之gRNA之靶向域序列。在態樣中，兩個或更多個gRNA分子包含靶向域，該等靶向域包含以下，例如由以下組成：以上表3b中列舉之靶向域序列。 包含靶向非缺失性HPFH區(例如HBG1及/或HBG2啟動子區)內之序列之靶向域之gRNA分子可另外與以下一起使用：gRNA分子，其包含與例如BCL11a增強子區(例如+55、+58或+62 BCL11a增強子區)內之靶標序列互補之靶向域；及/或gRNA分子，其包含與缺失型HPFH基因座之靶標序列互補之靶向域。此類缺失型HPFH基因座為此項技術中已知的，例如描述於Sankaran VG等人. NEJM (2011) 365:807-814 (其以全文引用之方式併入本文中)中之彼等。IX. gRNA 之特性 本文中進一步出人意料地展示，單一gRNA分子可具有多於一個基因座(例如具有高序列同源性之基因座)中之靶標序列，及當此類基因座存在於相同染色體上例如在小於約15,000個核苷酸、小於約14,000個核苷酸、小於約13,000個核苷酸、小於約12,000個核苷酸、小於約11,000個核苷酸、小於約10,000個核苷酸、小於約9,000個核苷酸、小於約8,000個核苷酸、小於約7,000個核苷酸、小於約6,000個核苷酸、小於約5,000個核苷酸、小於約4,000個核苷酸或小於約3,000核苷酸(例如相隔約4,000至約6,000個核苷酸)內時，此類gRNA分子可引起插入序列(或其部分)之刪除，從而引起有益效果，例如由(如本文中所描述之)經修飾HSPC分化之紅血球系細胞中的胎兒血色素上調。因此，在一態樣中，本發明提供gRNA分子，其在兩個基因座(例如相同染色體上之基因座)處具有靶標序列，例如其在HBG1啟動子區處及在HBG2啟動子區(例如如表1中所描述)處具有靶標序列。在不受理論束縛之情況下，咸信，此類gRNA可引起基因體在多於一個位置處(例如在兩個區中之每一者中之靶標序列處)之剪切，及後續修復可引起插入核酸序列缺失。同樣，在不受理論束縛之情況下，該插入序列之缺失對於一或多個蛋白質之表現或功能可能具有所需效果。 進一步出人意料地展示，gRNA分子，其包含與僅一個基因或區中之序列互補之靶向域(例如其與HBG1啟動子區(但不與HBG2啟動子區)中之靶標序列互補，或其與HBG2啟動子區(但不與HBG1啟動子區)中之靶標序列互補)，可引起由(如本文中所描述之)經修飾HSPC分化之紅血球系細胞中的胎兒血色素顯著上調。在態樣中，本發明因此提供gRNA分子，其包含靶向域，該靶向域與例如HBG1或HBG2啟動子區(如表1中所描述)內之單一非缺失性HPFH區中之靶標序列互補，但在任何其他基因或區中並不具有完全(例如100%)互補靶標序列匹配。 本文中進一步出人意料地展示，gRNA分子及包含該等gRNA分子之CRISPR系統在使用相同細胞類型、遞送方法及crRNA/tracr組分之多個實驗中產生類似或相同插入缺失圖案。在不受理論束縛之情況下，咸信，一些插入缺失圖案可比其他的更有利。舉例而言，主要包括引起「框移突變」(例如1或2個鹼基對插入或缺失，或其中n/3不為整數(其中n=插入或缺失中之核苷酸之數目)之任何插入或缺失)之插入及/或缺失的插入缺失，在降低或消除功能蛋白的表現中可能為有益的。同樣，主要包括「大型缺失」(多於10、11、12、13、14、15、20、25或30個核苷酸之缺失，例如多於1 kb、多於2 kb、多於3kb、多於5kb或多於10 kb，例如包含位於(例如如本文中所描述之) gRNA之第一與第二結合位點之間的序列)的插入缺失，在例如移除關鍵調節序列(諸如啟動子結合位點)或更改基因座之結構或功能中亦可為有益的，該等基因座對於功能蛋白之表現可能具有類似地效果。雖然出人意料地發現由既定gRNA/CRISPR系統誘導之插入缺失圖案始終再現既定細胞類型、如本文中所描述之gRNA及CRISPR系統，但不是任何單一插入缺失結構將不可避免地在引入gRNA/CRISPR系統後於既定細胞中製造。 因此，本發明提供gRNA分子，其產生有益插入缺失圖案或結構，例如其具有主要由大型缺失組成之插入缺失圖案或結構。可藉由評定由所測試細胞(例如HEK293細胞)或所關注之細胞(例如HSPC細胞)中之候選gRNA分子所產生的插入缺失圖案或結構，藉由如本文中所描述的NGS來選擇此類gRNA分子。如實例中所展示，已發現gRNA分子(當將其引入至所需細胞群體中時)產生包含大量在gRNA之靶標序列處或附近具有大型缺失之細胞的細胞群體。在一些情況下，大型缺失插入缺失形成之速率高達75%、80%、85%、90%或更多。因此，本發明提供細胞群體，其包含至少約40%之細胞(例如至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%)，該等細胞在本文中所描述之gRNA分子之靶位點處或附近具有(例如如本文中所描述之)大型缺失。本發明亦提供細胞群體，其包含至少約50%之細胞(例如至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%)，該等細胞在本文中所描述之gRNA分子之靶位點處或附近具有(例如如本文中所描述之)大型缺失。 因此，本發明提供選擇用於本發明之治療方法中之gRNA分子之方法，其包含：1)向所關注之靶標提供複數個gRNA分子，2)評定藉由使用該等gRNA分子而產生之插入缺失圖案或結構，3)選擇形成主要由框移突變、大型缺失或其組合組成之插入缺失圖案或結構的gRNA分子，及4)在本發明之方法中使用該等所選擇gRNA。 因此，本發明提供選擇用於本發明之治療方法中之gRNA分子之方法，其包含：1)向所關注之靶標中提供複數個gRNA分子，例如其在多於一個位置處具有靶標序列，2)評定藉由使用該等gRNA分子產生之插入缺失圖案或結構，3)選擇例如在暴露於該等gRNA分子之細胞群體之至少約25%或更多之細胞中形成包含位於兩個靶標序列之間核酸序列的序列的刪除的gRNA分子，及4)在本發明之方法中使用該經選擇gRNA分子。 本發明進一步提供更改細胞之方法及經更改細胞，其中總是在彼細胞類型中用既定gRNA/CRISPR系統製造特定插入缺失圖案。可使用實例之方法及例如實例中揭示之方法來測定插入缺失圖案，該等插入缺失圖案包括在本文中所描述之gRNA/CRISPR系統之情況下觀測到之頂部5個最頻繁存在的插入缺失。如實例中所展示，產生細胞群體，其中大量細胞包含頂部5個插入缺失中之一者，例如頂部5個插入缺失中之一者在群體之多於30%、多於40%、多於50%、多於60%或更多之細胞中存在的細胞群體。因此，本發明提供細胞，例如(如本文中所描述之) HSPC，其包含在既定gRNA/CRISPR系統之情況下觀測到之頂部5個插入缺失中的任一者的插入缺失。此外，本發明提供細胞群體，例如(如本文中所描述之) HSPC，當藉由例如NGS評定時，其包含高百分比之細胞，該等細胞包含本文中針對既定gRNA/CRISPR系統所描述之頂部5個插入缺失中之一者。當結合插入缺失圖案分析使用時，「高百分比」係指群體之至少約50% (例如至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%)之細胞，該等細胞包含本文中針對既定gRNA/CRISPR系統所描述之頂部5個插入缺失中之一者。在其他實施例中，細胞群體包含至少約25% (例如約25%至約60%、例如約25%至約50%、例如約25%至約40%、例如約25%至約35%)之細胞，該等細胞具有本文中針對既定gRNA/CRISPR系統所描述之頂部5個插入缺失中之一者。 亦已發現，某些gRNA分子不在靶細胞類型之基因體內之脫靶序列(例如HBG1及/或HBG2啟動子區外部之脫靶序列)處產生插入缺失，或在脫靶位點(例如HBG1及/或HBG2啟動子區外部之脫靶序列)處以極低頻率(相對於在靶位點處產生之插入缺失頻率) (例如群體內＜5%之細胞)產生插入缺失。因此，本發明提供gRNA分子及CRISPR系統，其在靶細胞類型中不呈現脫靶插入缺失形成，或其產生小於5%之脫靶插入缺失形成頻率，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區外部之任何脫靶位點處以小於5%之頻率產生插入缺失。在實施例中，本發明提供gRNA分子及CRISPR系統，其在靶細胞類型中不呈現任何脫靶插入缺失形成。因此，本發明進一步提供一種細胞，例如(例如如本文中所描述之)細胞群體、例如HSPC，其在本文中所描述之gRNA分子之靶位點處或附近包含插入缺失(例如框移插入缺失，或由(例如如本文中所描述之)既定gRNA/CRISPR系統產生之頂部5個插入缺失中之任一者)，但在gRNA分子之任何脫靶位點處不包含插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區外部之任何脫靶位點處的插入缺失。在其他實施例中，本發明進一步提供一種細胞群體，例如(例如如本文中所描述之) HSPC，其包含至少20%，例如至少30%、例如至少40%、例如至少50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少75%之細胞，該等細胞在本文中所描述之gRNA分子之靶位點處或附近具有插入缺失(例如框移插入缺失，或由(例如如本文中所描述之)既定gRNA/CRISPR系統產生之頂部5個插入缺失中之任一者)；但包含小於5%，例如小於4%、小於3%、小於2%或小於1%之細胞，該等細胞在gRNA分子之任何脫靶位點處包含插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區外部之任何脫靶位點處的插入缺失。在其他實施例中，本發明進一步提供一種細胞群體，例如(例如如本文中所描述之) HSPC，其包含至少20%，例如至少30%、例如至少40%、例如至少50%、例如至少60%、例如至少70%、例如至少75%、例如至少80%、例如至少90%、例如至少95%之細胞，該等細胞在HBG1及/或HBG2啟動子區內(例如在與gRNA之靶標序列具有至少90%同源性之序列處或附近)具有插入缺失；但其包含小於5%，例如小於4%、小於3%、小於2%或小於1%之細胞，該等細胞在HBG1及/或HBG2啟動子區外部之任何脫靶位點處或附近包含插入缺失。在實施例中，在基因之序列內(例如在基因之編碼序列內)形成脫靶插入缺失。在實施例中，在(例如如本文中所描述之)所關注之細胞中之基因之序列內(例如在基因之編碼序列內)不形成脫靶插入缺失。X. 遞送 / 構築體 可以各種形式遞送、調配或投與組分，例如Cas9分子或gRNA分子或兩者。作為一非限制性實例，可將gRNA分子及Cas9分子調配(於一或多個組合物中)，直接遞送或向需要基因體編輯事件之細胞中投與。或者，可調配(在一或多個組合物中)、遞送或投與編碼一或多種組分(例如Cas9分子或gRNA分子或兩者)之核酸。在一個態樣中，將gRNA分子提供為編碼gRNA分子之DNA，且將Cas9分子提供為編碼Cas9分子之DNA。在一個實施例中，在獨立核酸分子上編碼gRNA分子及Cas9分子。在一個實施例中，在相同核酸分子上編碼gRNA分子及Cas9分子。在一個態樣中，將gRNA分子提供為RNA，且將Cas9分子提供為編碼Cas9分子之DNA。在一個實施例中，gRNA分子具備例如如本文中所描述之一或多個修飾。在一個態樣中，將gRNA分子提供為RNA，且將Cas9分子提供為編碼Cas9分子mRNA。在一個態樣中，將gRNA分子提供為RNA，且將Cas9分子提供為蛋白質。在一個實施例中，將gRNA及Cas9分子提供為核糖核酸蛋白複合物(RNP)。在一個態樣中，將gRNA分子提供為編碼gRNA分子之DNA，且將Cas9分子提供為蛋白質。 可藉由例如(例如如此項技術中已知之)電穿孔或呈現可透過核酸及/或多肽分子之細胞膜之其他方法來實現遞送，例如遞送RNP (例如至如本文中所描述之HSPC細胞中)。在實施例中，藉由電穿孔使用4D核轉染(Lonza)，例如使用4D核轉染(Lonza)上之方案CM-137來遞送CRISPR系統，例如如本文中所描述之RNP。在實施例中，藉由電穿孔使用約800伏至約2000伏之電壓來遞送CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)，例如約1000伏至約1800伏、例如約1200伏至約1800伏、例如約1400伏至約1800伏、例如約1600伏至約1800伏、例如約1700伏，例如1700伏之電壓。在實施例中，脈衝寬度/長度約為10 ms至約50 ms，例如約10 ms至約40 ms、例如約10 ms至約30 ms、例如約15 ms至約25 ms、例如約20 ms、例如20 ms。在實施例中，使用1、2、3、4、5或更多個(例如2個、例如1個)脈衝。在一實施例中，藉由電穿孔使用約1700伏(例如1700伏)之電壓、約20 ms (例如20 ms)之脈衝寬度，使用單一(1)脈衝來遞送CRISPR系統，例如如本文中所描述之RNP。在實施例中，使用氖電穿孔器實現電穿孔。用於呈現可穿透膜之其他技術為此項技術中已知的，且包括例如細胞擠壓(例如如WO2015/023982及WO2013/059343中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中)、奈米針(例如如Chiappini等人, Nat. Mat., 14; 532-39或US2014/0295558中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中)及奈米吸管(例如如Xie, ACS Nano, 7(5); 4351-58中所描述，其內容以全文引用之方式併入本文中)。 當遞送在DNA中編碼之組分時，DNA將通常包括控制區(例如包含啟動子)以實現表現。Cas9分子序列之適用啟動子包括CMV、EF-lα、MSCV、PGK、CAG控制啟動子。gRNA之適用啟動子包括H1、EF-lα及U6啟動子。可選擇具有類似或不同強度之啟動子以調節組分之表現。編碼Cas9分子之序列可包含細胞核定位信號(NLS)，例如SV40 NLS。在一實施例中，Cas9分子或gRNA分子之啟動子可獨立地為誘導性、組織特異性或細胞特異性的。 基於DNA之Cas9分子及/或gRNA分子的遞送 可藉由此項技術中已知之方法或如本文中所描述之方法，將編碼Cas9分子及/或gRNA分子之DNA向個體投與或遞送至細胞中。舉例而言，可例如藉由載體(例如病毒或非病毒載體)、基於非載體之方法(例如使用裸DNA或DNA複合物)或其組合來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA的DNA。 在一些實施例中，藉由載體(例如病毒載體/病毒、質體、小環或奈米質體)來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA之DNA。 載體可包含編碼Cas9分子及/或gRNA分子之序列。載體亦可包含編碼信號肽(例如用於細胞核定位、核仁定位、粒線體定位)的序列，該序列例如與Cas9分子序列融合。舉例而言，載體可包含與編碼Cas9分子之序列融合之一或多個細胞核定位序列(例如來自SV40)。 一或多個調節/控制元件，例如啟動子、增強子、內含子、聚腺苷酸化信號、Kozak共有序列、內部核糖體進入位點(IRES)、2A序列及剪接受體或供體，可包括於載體中。在一些實施例中，啟動子由RNA聚合酶II識別(例如CMV啟動子)。在其他實施例中，啟動子由RNA聚合酶III識別(例如U6啟動子)。在一些實施例中，啟動子為調節啟動子(例如誘導性啟動子)。在其他實施例中，啟動子為組成性啟動子。在一些實施例中，啟動子為組織特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子為病毒啟動子。在其他實施例中，啟動子為非病毒啟動子。 在一些實施例中，載體或遞送媒介物為小環。在一些實施例中，載體或遞送媒介物為奈米質體。 在一些實施例中，載體或遞送媒介物為病毒載體(例如用於產生重組病毒)。在一些實施例中，病毒為DNA病毒(例如dsDNA或ssDNA病毒)。在其他實施例中，病毒為RNA病毒(例如ssRNA病毒)。 例示性病毒載體/病毒包括例如反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒(AAV)、痘瘡病毒、痘病毒及單純疱疹病毒。病毒載體技術為此項技術中所熟知且描述於例如Sambrook等人, 2012, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第1-4卷, Cold Spring Harbor Press, NY)及其他病毒學與分子生物學手冊中。 在一些實施例中，病毒感染分裂細胞。在其他實施例中，病毒感染非分裂細胞。在一些實施例中，病毒感染分裂及非分裂細胞兩者。在一些實施例中，病毒可整合至宿主基因體中。在一些實施例中，病毒經工程改造以在例如人類中具有降低的抗擾性。在一些實施例中，病毒為複製勝任的。在其他實施例中，病毒為複製缺陷的，例如其具有對於用其他基因置換或缺失之其他病毒粒子複製及/或封裝回合必需的基因的一或多個編碼區。在一些實施例中，病毒使的短暫表現Cas9分子及/或gRNA分子。在其他實施例中，病毒使得持久，例如至少1週、2週、1個月、2個月、3個月、6個月、9個月、1年、2年或永久表現Cas9分子及/或gRNA分子。病毒之封裝能力可例如在至少約4 kb至至少約30 kb變化，例如至少約5 kb、10 kb、15 kb、20 kb、25 kb、30 kb、35 kb、40 kb、45 kb或50 kb。 在一些實施例中，藉由重組反轉錄病毒來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA之DNA。在一些實施例中，反轉錄病毒(例如Moloney鼠類白血病病毒)包含例如允許整合至宿主基因體中之逆轉錄酶。在一些實施例中，反轉錄病毒為複製勝任的。在其他實施例中，反轉錄病毒為複製缺陷的，例如其具有針對用其他基因置換或缺失之其他病毒粒子複製及封裝回合所必需的基因的一或多個編碼區。 在一些實施例中，藉由重組慢病毒來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA之DNA。舉例而言，慢病毒為複製缺陷的，例如不包含病毒複製所需之一或多個基因。 在一些實施例中，藉由重組腺病毒來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA之DNA。在一些實施例中，腺病毒經工程改造以在人類中具有降低的抗擾性。 在一些實施例中，藉由重組AAV來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA之DNA。在一些實施例中，AAV可將其基因體併入至宿主細胞(例如如本文中所描述之靶細胞)之基因體中。在一些實施例中，AAV為自互補腺相關病毒(scAAV)，例如封裝一起退火形成雙鏈DNA之兩條鏈的scAAV。可用於所揭示之方法中之AAV血清型包括例如AAVl、AAV2、經修飾AAV2 (例如在Y444F、Y500F、Y730F及/或S662V處之修飾)、AAV3、經修飾AAV3 (例如在Y705F、Y731F及/或T492V處之修飾)、AAV4、AAV5、AAV6、經修飾AAV6 (例如在S663V及/或T492V處之修飾)、AAV8。AAV8.2、AAV9、AAV rh 10及假型化AAV，諸如AAV2/8、AAV2/5及AAV2/6，亦可用於所揭示之方法中。 在一些實施例中，藉由雜合病毒(例如本文中所描述之病毒中之一或多者之雜合體)來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA之DNA。 封裝細胞用於形成能夠感染宿主或靶細胞之病毒粒子。此類細胞包括可封裝腺病毒之293細胞及可封裝反轉錄病毒之ψ2細胞或PA317細胞。通常由將核酸載體封裝至病毒粒子中之生產細胞株來產生用於基因療法中之病毒載體。載體通常含有封裝及後續整合至宿主或靶細胞(若適用)中所需之極少病毒序列，其中其他病毒序列由編碼待表現之蛋白質之表現盒置換。舉例而言，用於基因療法中之AAV載體通常僅擁有來自需要封裝及在宿主或靶細胞中基因表現之AAV基因體的反向末端重複(ITR)序列。該丟失的病毒功能藉由封裝細胞株以反式供應。此後，將病毒DNA封裝在細胞株中，該細胞株含有編碼其他AAV基因之輔助質體(即rep及端帽)，但缺乏ITR序列。亦用作為輔助之腺病毒感染細胞株。輔助病毒促進AAV載體之複製及來自輔助質體之AAV基因之表現。不以大量封裝輔助質體，此係由於缺乏ITR序列。可藉由例如腺病毒比AAV更敏感之熱處理來減少伴隨腺病毒之污染物。 在一實施例中，病毒載體具有細胞類型及/或組織類型識別之能力。舉例而言，病毒載體可用不同/替代性病毒包封醣蛋白來假型化；用細胞類型特異性受體進行工程改造(例如將病毒包封糖蛋白併入靶向配體(諸如肽配體、單鏈抗體、生長因子)之基因修飾)；及/或經工程改造，以具有具備雙特異性之分子橋，其中一端識別病毒醣蛋白且另一端識別靶細胞表面之部分(例如配體-受體、單株抗體、抗生素蛋白-生物素及化學結合)。 在一實施例中，病毒載體達成細胞類型特異性表現。舉例而言，可構築組織特異性的啟動子以限制轉殖基因(Cas 9及gRNA)僅在靶細胞中表現。載體之特異性亦可藉由微小RNA依賴性控制轉殖基因表現來調節。在一實施例中，病毒載體之病毒載體與靶細胞膜之融合的效率增加。舉例而言，可併入諸如融合勝任血球凝集素(HA)之融合蛋白，以增加病毒攝取至細胞中。在一實施例中，病毒載體具有細胞核定位之能力。舉例而言，可對需要分解細胞壁(在細胞分裂期間)且因此將不感染非分裂細胞之病毒進行更改，以在病毒之基質蛋白中併入細胞核定位肽，從而使得能夠轉導非增殖性細胞。 在一些實施例中，藉由基於非載體之方法(例如使用裸DNA或DNA複合物)來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA之DNA。舉例而言，可例如藉由經有機地修飾之二氧化矽或矽酸鹽(Ormosil)、電穿孔、基因槍、聲致穿孔、磁轉染、脂質介導的轉染、樹枝狀分子、無機奈米粒子、磷酸鈣或其組合來遞送DNA。 在一些實施例中，藉由基於載體載體與基於非載體之方法之組合來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA的DNA。舉例而言，病毒體包含與不活化病毒(例如HIV或流感病毒)組合之脂質體，其可比單獨病毒或脂質體方法例如在呼吸性上皮細胞中引起更有效的基因轉移。 在一實施例中，遞送媒介物為非病毒載體。在一實施例中，非病毒載體為(例如連接至奈米粒子之表面之有效負載)無機奈米粒子。例示性無機奈米粒子包括例如磁性奈米粒子(例如Fe lvln02 )或二氧化矽。奈米粒子之外表面可與帶正電聚合物(例如聚乙烯亞胺、聚離胺酸、聚絲胺酸)結合，該帶正電聚合物允許連接(例如結合或陷入)有效負載。在一實施例中，非病毒載體為有機奈米粒子(例如陷入奈米粒子內部之有效負載)。例示性有機奈米粒子包括：例如，SNALP脂質體，其含有塗佈有聚乙二醇(PEG)及魚精蛋白之陽離子脂質以及中性輔助脂質；及核酸複合物，其塗佈有脂質包衣。 用於轉移CRISPR系統或核酸之例示性脂質及/或聚合物，例如編碼CRISPR系統或其組分之載體，包括例如描述於WO2011/076807、WO2014/136086、WO2005/060697、WO2014/140211、WO2012/031046、WO2013/103467、WO2013/006825、WO2012/006378、WO2015/095340及WO2015/095346中之彼等，前述中之每一者之內容以全文引用之方式併入本文中。在一實施例中，媒介物具有靶向修飾以增加奈米粒子及脂質體之靶細胞更新，例如細胞特異性抗原、單株抗體、單鏈抗體、適體、聚合物、糖及細胞穿透肽。在一實施例中，媒介物使用促融及核內體不穩定的肽/聚合物。在一實施例中，媒介物進行酸觸發的構形改變(例如以加速負荷之核內體流失)。在一實施例中，使用刺激可裂解的聚合物例如以用於在細胞腔室中釋放。舉例而言，可使用在還原細胞環境中裂解的基於二硫化物之陽離子聚合物。 在一實施例中，遞送媒介物為生物非病毒遞送媒介物。在一實施例中，媒介物為減毒細菌(例如天然地或人工工程改造為侵襲性的但減毒的以預防發病機制及表現轉殖基因(例如單核球增多性李氏菌、某些沙門氏菌(Salmonella)菌株、龍根雙叉桿菌(Bifidobacterium longum)及經修飾大腸桿菌)、具有營養及組織特異性趨向性以靶向特異性組織的細菌、具有經修飾表面蛋白質以更改靶標組織特異性的細菌)。在一實施例中，媒介物為經基因修飾之噬菌體(例如工程改造噬菌體，其具有大型封裝能力、低免疫原性，含有哺乳動物質體維持序列及具有併入的靶向配體)。在一實施例中，媒介物為哺乳動物病毒樣粒子。舉例而言，可產生經修飾病毒粒子(例如藉由純化「空」粒子隨後將病毒與所需負荷離體組裝)。媒介物亦可經工程改造以併入靶向配體以更改靶標組織特異性。在一實施例中，媒介物為生物脂質體。舉例而言，生物脂質體為基於磷脂之衍生自人類細胞(例如紅血球影，其為分解成衍生自個體之球形結構的紅血球)的粒子(例如組織靶向可藉由各種組織或細胞特異性配體之連接來達成)；或衍生自分泌性外來體個體(亦即，患者)之內吞起源(例如其可由各種細胞類型產生，且可因此由細胞吸收而無需靶向配體)的膜結合奈米媒介物(30-100 nm)。 在一實施例中，遞送除Cas系統之組分(例如本文中所描述之Cas9分子組分及/或gRNA分子組分)以外之一或多個核酸分子(例如DNA分子)。在一實施例中，在遞送Cas系統之組分中之一或多者同時，遞送核酸分子。在一實施例中，在遞送Cas9系統之組分中之一或多者之前或之後(例如小於約30分鐘、1小時、2小時、3小時、6小時、9小時、12小時、1天、2天、3天、1週、2週或4週)，遞送核酸分子。在一實施例中，藉由不同於遞送Cas9系統之組分中之一或多者(例如Cas9分子組分及/或gRNA分子組分)之方式來遞送核酸分子。可藉由本文中所描述之遞送方法中之任一者來遞送核酸分子。舉例而言，可藉由病毒載體(例如整合缺陷型慢病毒)來遞送核酸分子，且可藉由電穿孔來遞送Cas9分子組分及/或gRNA分子組分，例如使得可減小由核酸(例如DNA)產生的毒性。在一實施例中，核酸分子編碼治療蛋白質，例如本文中所描述之蛋白質。在一實施例中，核酸分子編碼RNA分子，例如本文中所描述之RNA分子。 編碼Cas9分子之RNA之遞送 可藉由此項技術中已知之方法或如本文中所描述之方法，將編碼Cas9分子(例如活性Cas9分子、非活性Cas9分子或非活性Cas9融合蛋白)之RNA及/或gRNA分子遞送至細胞中，例如本文中所描述之靶細胞。舉例而言，可例如藉由顯微注射、電穿孔、脂質介導的轉染、肽介導的遞送或其組合來遞送編碼Cas9及/或編碼gRNA的RNA。 作為蛋白質之Cas9分子之遞送 可藉由此項技術中已知之方法或如本文中所描述之方法，將Cas9分子(例如活性Cas9分子、非活性Cas9分子或非活性Cas9融合蛋白)遞送至細胞中。舉例而言，可例如藉由顯微注射、電穿孔、脂質介導的轉染、肽介導的遞送、細胞擠壓或研磨(例如藉由奈米針)或其組合來遞送Cas9蛋白分子。遞送可伴有編碼gRNA之DNA或伴有gRNA，例如藉由將gRNA及Cas9蛋白預複合在核糖核酸蛋白複合物(RNP)中。 在一態樣中，例如如本文中所描述之Cas9分子作為蛋白質遞送，且gRNA分子作為一或多個RNA(例如作為如本文中所描述之dgRNA或sgRNA)遞送。在實施例中，在遞送至細胞之前，例如如本文中所描述，將Cas9蛋白與gRNA分子複合呈核糖核酸蛋白複合物(「RNP」)。在實施例中，可藉由任何此項技術中已知之方法(例如電穿孔)，例如本文中所描述將RNP遞送至細胞中。如本文中所描述且在不受理論束縛之情況下，可能較佳的是，使用gRNA分子及Cas9分子，此在例如本文中所描述之靶細胞中在靶標序列處產生高%的編輯(例如＞85%、＞90%、＞95%、＞98%或＞99%)。同樣，在不受理論束縛之情況下，遞送降低的濃度或低濃度之包含在靶細胞中在靶標序列處產生高%編輯之gRNA分子的RNP (包括在低RNP濃度下)可能為有益的，因為其可降低脫靶編輯事件之頻率及數目。在一個態樣中，其中使用低或降低濃度之RNP，以下例示性過程可用於產生具有dgRNA分子之RNP： 1. 提供在高濃度(例如高於遞送至細胞之最終RNP濃度)下之含Cas9分子及tracr之溶液，且使兩個組分平衡； 2. 提供crRNA分子，且使組分平衡(從而形成高濃度之RNP溶液)； 3. 稀釋RNP溶液至所需濃度； 4. 例如藉由電穿孔將在該所需濃度下之該RNP遞送至靶細胞。 可藉由省略以上步驟2，且在步驟1中提供在高濃度下之含Cas9分子及sgRNA分子之溶液，並使組分平衡，來修改以上過程以與sgRNA分子一起使用。在實施例中，在溶液中以1:2比率(Cas9:gRNA) 例如1:2莫耳比之Cas9:gRNA分子，來提供Cas9分子及各gRNA組分。當使用dgRNA分子時，比率，例如莫耳比率為1:2:2 (Cas9:tracr:crRNA)。在實施例中，在20 μM或更高之濃度，例如約20 μM至約50 μM之濃度下形成RNP。在實施例中，在10 μM或更高之濃度，例如約10 μM至約30 μM之濃度下形成RNP。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至10 μM或更低之最終濃度(例如約0.01 μM至約10 μM之濃度)以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至3 μM或更低之最終濃度(例如約0.01 μM至約3 μM之濃度)以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至1 μM或更低之最終濃度(例如約0.01 μM至約1 μM之濃度)以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至0.3 μM或更低之最終濃度(例如約0.01 μM至約0.3 μM之濃度)以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約3 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約2 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約1 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約0.3 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約0.1 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約0.05 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約0.03 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP在包含(例如本文中所描述之)靶細胞之溶液中稀釋至約0.01 μM之最終濃度以用於遞送至該靶細胞。在實施例中，將RNP調配在適合於電穿孔之介質中。在實施例中，藉由電穿孔，例如使用本文中所描述之電穿孔條件，將RNP遞送至細胞，例如(例如如本文中所描述之) HSPC細胞。 在態樣中，藉由機械地擾動細胞，例如藉由使該等細胞穿過壓縮細胞之微孔或通道，將基因編輯系統(例如CRISPR系統)之組分及/或編碼該基因編輯系統(例如CRISPR系統)之一或多種組分之核酸引入至細胞中。可在包含基因編輯系統(例如CRISPR系統)之組分及/或編碼例如如本文中所描述之基因編輯系統(例如CRISPR系統)之一或多種組分之核酸的溶液中實現此類擾動。在實施例中，使用例如實例及PCT專利申請案PCT/US17/54110 (以全文引用的方式併入本文中)中之(例如如本文中所描述之) TRIAMF系統來實現擾動。 組分之二模態或差異遞送 獨立遞送Cas系統之組分，例如Cas9分子組分及gRNA分子組分，且更特定言之藉由不同模式遞送組分，可例如藉由改良組織特異性及安全性而增強效能。 在一實施例中，藉由不同模式、或如在本文中有時稱為差異模式來遞送Cas9分子及gRNA分子。如本文中所使用，不同模式或差異模式係指對於主題組分分子(例如Cas9分子、gRNA分子或模板核酸)賦予不同藥效動力學或藥物代謝動力學特性的遞送模式。舉例而言，遞送模式可例如在所選擇腔室、組織或器官中產生不同組織分佈、不同半衰期或不同時間分佈。 一些遞送模式，例如藉由在細胞中或在細胞之子代中例如藉由自發複製或插入至細胞核酸中而存留之核酸載體的遞送產生更持久性之組分之表現及存在。XI. 治療方法 本文中所描述之Cas9系統，例如一或多個gRNA分子及一或多個Cas9分子，適用於治療哺乳動物(例如人類)之疾病。術語「治療(treat/treated/treating/treatment)」包括向細胞中投與cas9系統(例如一或多個gRNA分子及一或多個cas9分子)，以預防或延緩疾病之症狀、併發症或生物化學標誌之發作，緩解症狀或遏制或抑制疾病、病況或病症之進一步發展。治療亦可包括投與一或多個細胞(例如其群體) (例如HSPC)，該等細胞已藉由引入本發明之gRNA分子(或多於一個gRNA分子)、或藉由引入如本文中所描述之CRISPR系統、或藉由製備本文中所描述之該等細胞之方法中之任一者而修飾，以預防或延緩疾病之症狀、併發症或生物化學標誌發作，緩解症狀或遏制或抑制疾病、病況或病症之進一步發展。治療可為防治性(以預防或延緩疾病發作或預防其臨床或亞臨床症狀顯現)或治療性抑止或緩解在疾病顯現後之症狀。治療可藉由本文中所描述之治療量測來量測。因此，本發明之「治療」方法亦包括向個體投與藉由引入cas9系統(例如一或多個gRNA分子及一或多個Cas9分子)引入至細胞中而更改之該等細胞，以治癒、降低疾病或病況之嚴重程度、或改善疾病或病況之一或多個症狀，以延長個體超出預期不存在此類治療之情況下的健康或存活。舉例而言，「治療」包括緩解個體之疾病症狀至少5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多。 包含含本文中(例如表1中)所描述之靶向域之gRNA分子之Cas9系統及(例如如本文中所描述之)方法以及細胞適用於治療血色素異常症。血色素異常症 血色素異常症包涵遺傳起源之多種貧血，在遺傳起源中紅血球(RBC)之產生減少及/或破壞(溶血)增加。此等亦包括產生製造具有伴隨減弱的維持氧濃度能力的異常血色素的遺傳缺陷。一些此類病症涉及未能產生足夠量之正常β-血球蛋白，而其他的涉及完全未能產生正常β-血球蛋白。此等病症與β-血球蛋白相關，其一般稱為β-血色素異常症。舉例而言，β-地中海型貧血由β-血球蛋白基因之表現中之部分或完全缺陷導致HbA缺陷或HbA不存在而造成。鐮狀細胞貧血由β-血球蛋白結構基因中之點突變導致製造異常(鐮狀)血色素(HbS)而造成。HbS易於聚合，尤其在脫氧條件下。HbS RBC比正常RBC更脆弱，且更容易經受溶血，從而導致最終貧血。 在一實施例中，例如藉由同源重組，使用本文中所描述之Cas9分子及gRNA分子(例如CRISPR系統)來校正α血球蛋白或β血球蛋白中之遺傳缺陷。 在一實施例中，藉由同源重組，使用本文中所描述之CRISPR系統及方法，將編碼α血球蛋白或β血球蛋白之野生型(例如非突變的)複本之基因插入至細胞基因體中例如安全位點處，例如AAVS1安全含有位點處。 在一實施例中，使用本文中所描述之Cas9分子及gRNA分子靶向血色素異常症相關基因。例示性靶標包括例如與控制γ血球蛋白基因相關之基因。在一實施例中，靶標為非缺失性HPFH區。 胎兒血色素(以及血色素F或HbF或α2γ2)為兩個成年α-血球蛋白多肽與兩個胎兒β樣γ血球蛋白多肽之四聚體。HbF為在子宮中最後七個月發育期間之人類胎兒及在直至大致6月齡之新生兒中的主要氧輸送蛋白。功能上，胎兒血色素與成年血色素最大的不同在於：其比成年形式能夠以更高的親和力結合氧，從而使得發育中的胎兒較佳的自母親之血流獲得氧。 在新生兒中，大致產後6個月，胎兒血色素幾乎完全由成年血色素置換。在成年中，可在藥理學上再活化胎兒血色素製造，此適用於治療諸如血色素異常症之疾病。舉例而言，在患有血色素異常症之某些患者中，較高γ血球蛋白表現量可部分地補償缺陷或減弱的β血球蛋白基因製造，此可改善此等疾病之臨床嚴重程度。HbF含量或F細胞(含有紅血球之HbF)數目增加可改善血色素異常症(例如重型β-地中海型貧血及鐮狀細胞貧血)之疾病嚴重程度。 如出人意料地發現，HbF含量或F細胞計數增加可與細胞中之一或多個非缺失性HPFH區處之插入缺失形成相關，該等細胞為例如HSPC及/或由HSPC (例如藉由本文中所描述之一或多個gRNA分子修飾之HSPC)分化的細胞。在一實施例中，細胞為造血幹細胞或祖細胞。 鐮狀細胞疾病 鐮狀細胞疾病為一組影響血色素之病症。患有此病症之人具有非典型血色素分子(血色素S)，該等非典型血色素分子可使紅血球變形為鐮狀或新月狀。此病症之特性特徵包括低數目之紅血球(貧血)、重複感染及定期疼痛發作。 HBB基因中之突變造成鐮狀細胞疾病。HBB基因提供製備β血球蛋白之指示。由HBB基因中之不同突變造成各種β血球蛋白型式。一個特定HBB基因突變產生異常的β血球蛋白型式，其稱為血色素S (HbS)。HBB基因中之其他突變產生其他異常的β血球蛋白型式，諸如血色素C (HbC)及血色素E (HbE)。HBB基因突變亦可引起罕見的低含量之β血球蛋白，亦即β地中海型貧血。 在患有鐮狀細胞疾病之人中，血色素中之β血球蛋白次單位中之至少一個經血色素S置換。在鐮狀細胞疾病常見形成之鐮狀細胞貧血中，血色素S置換血色素中之兩個β血球蛋白次單位。在其他鐮狀細胞疾病類型中，血色素中之僅一個β血球蛋白次單位經血色素S置換。其他β血球蛋白次單位經不同的異常變體(諸如血色素C)置換。舉例而言，患有鐮狀血色素C (HbSC)疾病之人具有帶有血色素S及血色素C而非β血球蛋白的血色素分子。若產生血色素S及β地中海型貧血之突變一起發生，則個體患有血色素S-β地中海型貧血(HbSBetaThal)疾病。 β地中海型貧血 β地中海型貧血為減少血色素之產生的血液病症。在患有β地中海型貧血之人中，低血色素含量造成身體之許多部分中缺乏氧。患病個體亦具有紅血球不足(貧血)，該紅血球不足可造成皮膚蒼白、虛弱、疲乏及更嚴重併發症。患有β地中海型貧血之人發展異常血凝塊的風險增加。 視症狀嚴重程度而定，β地中海型貧血分為兩個類型：重度地中海型貧血(亦稱為庫利氏貧血(Cooley's anemia))及中度地中海型貧血。在兩個類型中，重度地中海型貧血為更嚴重的。 HBB基因中之突變造成β地中海型貧血。HBB基因提供製備β血球蛋白之指示。HBB基因中之一些突變防止產生任何β血球蛋白。不存在β血球蛋白被稱作零β (B°)地中海型貧血。其他HBB基因突變允許產生一些β血球蛋白但呈降低的量，亦即正β (B+ )地中海型貧血。患有兩個類型之人已診斷患有重度地中海型貧血及中度地中海型貧血。 在一實施例中，靶向第一基因或基因座之Cas9分子/gRNA分子複合物用於治療表徵為第二基因(例如第二基因中之突變)的病症。藉助於實例，例如藉由編輯或有效負載遞送而靶向第一基因可補償或抑制例如來自突變的第二基因的進一步破壞(第二基因之影響)。在一實施例中，個體攜帶之第一基因之對偶基因不造成病症。舉例而言，如本文中所展示，誘導在非缺失性HPFH區(例如HBG1及/或HBG2啟動子區)處形成插入缺失之gRNA分子可在由(如本文中所描述之)經修飾HSPC分化之紅血球系細胞中引起胎兒血色素上調，且在不受理論束縛之情況下，此類胎兒血色素上調補償及校正含有鐮狀突變之HBB基因。 在一個態樣中，本發明係關於治療需要增加胎兒血色素(HbF)之哺乳動物，例如人類。 在一個態樣中，本發明係關於治療已診斷患有血色素異常症或處發展血色素異常症風險下之哺乳動物，例如人類。 在一個態樣中，血色素異常症為β-血色素異常症。在一個態樣中，血色素異常症為鐮狀細胞疾病。在一個態樣中，血色素異常症為β地中海型貧血。治療血色素異常症之方法 在另一態樣中，本發明提供式治療方法：在態樣中，本發明之gRNA分子、CRISPR系統及/或細胞用於治療有需要之患者。在態樣中，患者為哺乳動物，例如人類。在態樣中，患者患有血色素異常症。在實施例中，患者患有鐮狀細胞疾病。在實施例中，患者患有β地中海型貧血。 在一個態樣中，治療方法包含向哺乳動物(例如人類)投與：一或多個gRNA分子，例如包含表1中描述之靶向域之一或多個gRNA分子；及本文中所描述之一或多個cas9分子。 在一個態樣中，治療方法包含向哺乳動物投與細胞群體，其中細胞群體為來自哺乳動物(例如人類)之細胞群體，該細胞群體已投與：一或多個gRNA分子，例如包含表1中描述之靶向域之一或多個gRNA分子；及本文中所描述之一或多個cas9分子，例如如本文中所描述之CRISPR系統。在一個實施例中，在活體內實現向細胞中投與一或多個gRNA分子或CRISPR系統。在一個實施例中，離體實現向細胞中投與一或多個gRNA分子或CRISPR系統。 在一個態樣中，治療方法包含向哺乳動物(例如人類)投與有效量之細胞群體，細胞群體包含含或一次性含一或多個gRNA分子(例如包含表1中描述之靶向域之一或多個gRNA分子)及本文中所描述之一或多個cas9分子的細胞或該等細胞之子代。在一個實施例中，細胞對於哺乳動物為同種異體。在一個實施例中，細胞對於哺乳動物為自體的。在一個實施例中，自哺乳動物收集細胞，離體操縱，且將其返回至哺乳動物中。 在態樣中，包含或一次性包含一或多個gRNA分子(例如包含表1中描述之靶向域之一或多個gRNA分子)及本文中所描述之一或多個cas9分子之細胞或該等細胞的子代包含幹細胞或祖細胞。在一個態樣中，幹細胞為造血幹細胞。在一個態樣中，祖細胞為造血祖細胞。在一個態樣中，細胞包含造血幹細胞及造血祖細胞兩者，例如HSPC。在一個態樣中，細胞包含CD34+細胞，例如由其組成。在一個態樣中，細胞實質上不含CD34-細胞。在一個態樣中，細胞包含CD34+/CD90+幹細胞，例如由其組成。在一個態樣中，細胞包含CD34+/CD90-細胞，例如由其組成。在一態樣中，細胞為包含上文所描述或本文中所描述之細胞類型中之一或多者的群體。 在一個實施例中，本發明提供一種用於治療有需要之哺乳動物(例如人類)之血色素異常症(例如鐮狀細胞疾病或β-地中海型貧血)之方法、或一種用於增加胎兒血色素表現之方法，該方法包含： a)提供(例如收集或分離)來自哺乳動物之HSPC (例如CD34+細胞)群體； b)視情況在有效量之包含至少一個幹細胞擴增劑之組合物存在下，離體(例如在細胞培養基中)提供該等細胞，由此該HSPC (例如CD34+細胞)群體擴增至比未處理群體更高的程度； c)使HSPC (例如CD34+細胞)群體與有效量之以下物質接觸：組合物，其包含含本文中所描述之靶向域(例如表1中描述之靶向域)之至少一個gRNA分子、或編碼該gRNA分子之核酸；及至少一個例如本文中所描述之cas9分子、或編碼該cas9分子之核酸，例如一或多個如本文中所描述之RNP，該等RNP例如具有本文中所描述之CRISPR系統； d)在群體之至少一部分細胞(例如群體之HSPC (例如CD34+細胞)之至少一部分)中產生至少一個修飾，由此例如當HSPC分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)時，例如相對於不根據步驟c)接觸之細胞，胎兒血色素表現增加；以及 f)將包含該等經修飾HSPC (例如CD34+細胞)之細胞群體返回至哺乳動物。 在一態樣中，HSPC對於將其返回至之哺乳動物為同種異體的。在一態樣中，HSPC對於將其返回至之哺乳動物為自體的。在態樣中，自骨髓分離HSPC。在態樣中，自末梢血液(例如移動的末梢血液)分離HSPC。在態樣中，自已投與G-CSF之個體分離移動的末梢血液。在態樣中，自已投與除G-CSF以外之移動藥劑(例如Plerixafor® (AMD3100))之個體分離移動的末梢血液。在其他態樣中，自已組合投與G-CSF及Plerixafor® (AMD3100)之個體分離移動的末梢血液。在態樣中，自臍帶血分離HSPC。在實施例中，細胞衍生自血色素異常症患者，例如患有鐮狀細胞疾病之患者或患有地中海型貧血(例如β-地中海型貧血)之患者。 在該方法之其他實施例中，在提供例如來自上文所描述之來源之HSPC (例如CD34+細胞)群體之後，方法進一步包含，增濃細胞群體之HSPC (例如CD34+細胞)的步驟。在該方法之實施例中，在該增濃之後，細胞(例如HSPC)群體實質上不含CD34-細胞。 在實施例中，返回至哺乳動物之細胞群體包括至少70%活細胞。在實施例中，返回至哺乳動物之細胞群體包括至少75%活細胞。在實施例中，返回至哺乳動物之細胞群體包括至少80%活細胞。在實施例中，返回至哺乳動物之細胞群體包括至少85%活細胞。在實施例中，返回至哺乳動物之細胞群體包括至少90%活細胞。在實施例中，返回至哺乳動物之細胞群體包括至少95%活細胞。在實施例中，返回至哺乳動物之細胞群體包括至少99%活細胞。例如如此項技術中已知的，可藉由對細胞群體之代表性部分進行細胞存活力標記染色來測定存活力。 在另一實施例中，本發明提供一種用於治療有需要之哺乳動物(例如人類)之血色素異常症(例如鐮狀細胞疾病或β-地中海型貧血)之方法、或用於增加胎兒血色素表現之方法，該方法包含以下步驟： a)提供(例如收集或分離例如來自哺乳動物骨髓之哺乳動物之HSPC (例如CD34+細胞)群體； b)自步驟a)之細胞群體分離CD34+細胞； c)在有效量之包含至少一個幹細胞擴增劑之組合物存在下，離體提供該等CD34+細胞，且例如在細胞培養基中培養該等細胞，由此該CD34+細胞群體擴增至比未處理群體更高的程度，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.5至約0.75微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇； d)向群體CD34+細胞之細胞中引入有效量之以下物質：組合物，其包含例如如本文中所描述之Cas9分子；及例如如本文中所描述之gRNA分子，例如視情況其中Cas9分子及gRNA分子呈例如如本文中描述之RNP形式，且視情況其中該引入係藉由將該RNP (例如如本文中描述之)電穿孔至該等細胞中； e)在群體之至少一部分細胞(例如群體之HSPC (例如CD34+細胞)之至少一部分)中產生至少一個基因修飾，由此在與在步驟d)中引入的gRNA之靶向域中互補的基因體位點處或附近產生例如如本文中所描述的插入缺失； f)視情況，在該引入之後，在有效量之包含至少一個幹細胞擴增劑之組合物存在下，另外例如在細胞培養基中培養該等細胞，使得該等細胞擴增至少2倍，例如至少4倍、例如至少5倍，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.5至約0.75微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇； g)低溫保存該等細胞；以及 h)將細胞返回至哺乳動物，其中 返回至哺乳動物之細胞包含以下之細胞：1)維持分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)之能力；2)當分化為紅血球時，例如相對於未藉由步驟e)之gRNA修飾的細胞，產生增加含量的胎兒血色素，例如產生至少6皮克胎兒血色素/細胞。 在一態樣中，HSPC對於將其返回至之哺乳動物為同種異體的。在一態樣中，HSPC對於將其返回至之哺乳動物為自體的。在態樣中，自骨髓分離HSPC。在態樣中，自末梢血液(例如移動的末梢血液)分離HSPC。在態樣中，自已投與G-CSF之個體分離移動的末梢血液。在態樣中，自已投與除G-CSF以外之移動藥劑(例如Plerixafor® (AMD3100))之個體分離移動的末梢血液。在其他態樣中，自已組合投與G-CSF及Plerixafor® (AMD3100)之個體分離移動的末梢血液。在態樣中，自臍帶血分離HSPC。在實施例中，細胞衍生自血色素異常症患者，例如患有鐮狀細胞疾病之患者或患有地中海型貧血(例如β-地中海型貧血)之患者。 在以上方法之實施例中，引述步驟b)產生實質上不含CD34-細胞之細胞群體。 在該方法之其他實施例中，在提供例如來自上文所描述之來源之HSPC (例如CD34+細胞)群體之後，方法進一步包含對細胞群體之HSPC (例如CD34+細胞)增濃。 在此等方法之另一實施例中，在再引入至哺乳動物中之前，將具有分化增加的胎兒血色素表現之能力的經修飾HSPC (例如CD34+幹細胞)群體進行低溫保存及儲存。在實施例中，將低溫保存的HSPC群體解凍，且接著再引入至哺乳動物中，該等HSPC具有分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)之能力及/或當分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)時產生增加含量之胎兒血色素。在此等方法之另一實施例中，方法包含移除或降低哺乳動物中之內源性造血祖細胞或幹細胞的化療及/或放療。在此等方法之另一實施例中，方法不包含移除或降低哺乳動物中之內源性造血祖細胞或幹細胞之化療及/或放療的步驟。在此等方法之另一實施例中，方法包含部分地降低(例如部分地淋巴細胞耗盡)哺乳動物中之內源性造血祖細胞或幹細胞之化療及/或放療。在實施例中，在將經修飾HSPC再引入至哺乳動物中之前，用完全淋巴細胞耗盡劑量之硫酸布他卡因處理患者。在實施例中，在將經修飾HSPC再引入至哺乳動物中之前，用部分淋巴細胞耗盡劑量之硫酸布他卡因處理患者。 在實施例中，使細胞與RNP接觸，該RNP包含與對於(例如如本文中所描述之)非缺失性HPFH區之gRNA (例如其包含表1中列舉之靶向域)複合之(例如如本文中所描述之) Cas9分子。在實施例中，幹細胞擴增劑為化合物1。在實施例中，幹細胞擴增劑為化合物2。在實施例中，幹細胞擴增劑為化合物3。在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，且在2-0.1微莫耳，例如1-0.25微莫耳、例如0.75-0.5微莫耳之濃度下存在。在實施例中，幹細胞擴增劑為描述於WO2010/059401中之分子(例如描述於WO2010/059401之實例1中之分子)。 在實施例中，在使細胞與例如本文中所描述之CRISPR系統接觸之步驟之前，離體培養細胞(例如，例如如本文中所描述之HSPC)約1小時至約15天之時間，例如約12小時至約12天之時間、例如約12小時至4天之時間、例如約1天至約4天之時間、例如約1天至約2天之時間、例如約1天之時間或約2天之時間。在實施例中，在該接觸步驟之前之該培養係在包含例如本文中所描述之幹細胞擴增劑之組合物(例如細胞培養基)中，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.25 μM至約1 μM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.75-0.5微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，在使細胞與例如本文中所描述之CRISPR系統接觸之步驟之後，例如在包含例如本文中所描述之幹細胞擴增劑之細胞培養基中離體培養細胞不大於約1天之時間，例如不大於約18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小時，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.25 μM至約1 μM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.75-0.5微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在其他實施例中，在使細胞與例如本文中所描述之CRISPR系統接觸之步驟後，在細胞培養基中離體培養細胞約1小時至約15天之時間，例如約12小時至約10天之時間、例如約1天至約10天之時間、例如約1天至約5天之時間、例如約1天至約4天之時間、例如約2天至約4天之時間、例如約2天、約3天或約4天之時間，該細胞培養基例如包含例如本文中所描述之幹細胞擴增劑，例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.25 μM至約1 μM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇、例如在約0.75-0.5微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，離體培養(例如在該接觸步驟之前培養及/或在該接觸步驟之後培養)細胞約1小時至約20天之時間，例如約6-12天之時間、例如約6、約7、約8、約9、約10、約11或約12天之時間。 在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少約1百萬個細胞(例如至少約1百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少約2百萬個細胞(例如至少約2百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少約3百萬個細胞(例如至少約3百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少約4百萬個細胞(例如至少約4百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少約5百萬個細胞(例如至少約5百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少約6百萬個細胞(例如至少約6百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少1百萬個細胞(例如至少1百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少2百萬個細胞(例如至少2百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少3百萬個細胞(例如至少3百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少4百萬個細胞(例如至少4百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少5百萬個細胞(例如至少5百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少6百萬個細胞(例如至少6百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含約1百萬個細胞(例如約1百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含約2百萬個細胞(例如約2百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含約3百萬個細胞(例如約3百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含約4百萬個細胞(例如約4百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含約5百萬個細胞(例如約5百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含約6百萬個細胞(例如約6百萬個CD34+細胞)/公斤。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含約2 × 106 個細胞(例如約2 × 106 個CD34+細胞)/公斤患者體重。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含至少2 × 106 個細胞(例如約2 × 106 個CD34+細胞)/公斤患者體重。在實施例中，包含返回至哺乳動物之經修飾HSPC之細胞群體包含2 × 106 個細胞(例如約2 × 106 個CD34+細胞)/公斤患者體重與10 × 106 個細胞(例如約2 × 106 個CD34+細胞)/公斤患者體重之間的。在實施例中，細胞包含輸注至患者中之經修飾細胞。在實施例中，在將包含經修飾HSPC之細胞輸注至患者中之前，患者用淋巴細胞耗盡療法處理，例如用白消安處理，例如用完全淋巴細胞耗盡之白消安方案處理，或例如用降低強度之白消安淋巴細胞耗盡方案處理。 在實施例中，上文所描述之方法中之任一者使得患者之至少80%之其循環CD34+細胞在與方法中使用之gRNA分子之靶向域互補的基因體位點處或附近包含插入缺失，例如如在細胞再引入至哺乳動物中後至少15天，例如至少20、至少30、至少40、至少50或至少60天所量測。在不受理論束縛之情況下，本文中出人意料地發現，當將例如如本文中所描述之基因編輯系統(例如CRISPR系統，例如包含靶向HBG1及/或HBG2區之gRNA分子之CRISPR系統)引入至HSPC中時所觀測到之插入缺失及插入缺失圖案(包括大型缺失)，及將彼等細胞移植至生物體中，某些gRNA在生物體中產生包含仍可在經編輯細胞群體及其子代中偵測的插入缺失及插入缺失圖案(包括大型插入缺失)，且存留多於8週、12週、16週或20週。在不受理論束縛之情況下，包含在可偵測細胞群體內在引入至生物體(例如患者)中後存留例如長於16週或長於20週之插入缺失圖案或特定插入缺失(包括大型缺失)的細胞群體，可能對於產生比在引入至失去一或多個插入缺失(包括大型缺失)的生物體或患者中後的細胞(或其子代)更長期的(例如本文中所描述之)疾病或病況(例如血色素異常症、例如鐮狀細胞疾病或地中海型貧血)改善為有益的。在實施例中，持續插入缺失或插入缺失圖案與(例如該等細胞之紅血球系子代中之)胎兒血色素上調相關。因此，在實施例中，本發明提供例如如本文中所描述之細胞群體(例如HSPC)，該等細胞包含一或多個插入缺失(包括大型缺失)，該等插入缺失在引入至生物體(例如患者)中後存留(例如仍在例如血液及/或骨髓中之細胞群體或其子代中可偵測)多於8週、多於12週、多於16週或多於20週。 在實施例中，上文所描述之方法中之任一者使得患者之至少20%之其骨髓CD34+細胞在與方法中使用之gRNA分子之靶向域互補的基因體位點處或附近包含插入缺失，例如如在細胞再引入至哺乳動物中後至少15天，例如至少20、至少30、至少40、至少50或至少60天所量測。 在實施例中，再引入至哺乳動物中之HSPC能夠在活體內分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)，且該等分化細胞呈現增加的胎兒血色素含量，例如產生至少6皮克胎兒血色素/細胞，例如至少7皮克胎兒血色素/細胞、至少8皮克胎兒血色素/細胞、至少9皮克胎兒血色素/細胞、至少10皮克胎兒血色素/細胞，例如在約9與約10皮克胎兒血色素/細胞之間，例如使得血色素異常症得到治療。 應理解，當細胞表徵為具有增加的胎兒血色素時，包括呈現增加的胎兒血色素之細胞之子代(例如分化子代)的實施例。舉例而言，在本文所描述之方法中，經更改或經修飾CD34+細胞(或細胞群體)可不表現增加的胎兒血色素，但當分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)時，細胞表現增加的胎兒血色素，例如相對於在類似條件下未經修飾或未更改細胞增加的胎兒血色素。XII. 培養方法及製造細胞之方法 本發明提供培養經本文中所描述之gRNA分子修飾或待修飾之細胞的方法，該等細胞為例如HSPC，例如造血幹細胞，例如CD34+細胞。DNA 修復路徑抑制劑 在不受理論束縛之情況下，咸信，由既定gRNA分子在特定靶標序列處產生之插入缺失之圖案為細胞內之活性DNA修復機制(例如非同源末端接合、微小同源性介導的末端接合等)中的每一者的產物。在不受理論束縛之情況下，咸信，可藉由使待編輯細胞與並不產生所需插入缺失之DNA修復路徑之抑制劑接觸來選擇尤其有利的插入缺失，或對該尤其有利的插入缺失進行增濃。因此，本發明之gRNA分子、CRISPR系統、方法及其他態樣可與此類抑制劑組合進行。此類抑制劑之實例包括描述於例如WO2014/130955中之彼等，其內容以全文引用之方式併入本文中。在實施例中，抑制劑為DNAPKc抑制劑，例如NU7441。幹細胞擴增劑 在一個態樣中，本發明係關於用一或多個藥劑培養細胞，例如HSPC，例如經本文中所描述之gRNA分子修飾或待修飾之CD34+細胞，該一或多個藥劑相對於未用藥劑處理之細胞產生增加的擴增比率、增加的擴增含量或增加的移植物。此類藥劑在本文中稱為幹細胞擴增劑。 在一態樣中，相對於未用藥劑處理之細胞產生增加的擴增比率或增加的擴增含量之一或多個藥劑(例如幹細胞擴增劑)，包含呈芳基烴受體(AHR)路徑之抑制劑的藥劑。在態樣中，幹細胞擴增劑為揭示於WO2013/110198中之化合物或揭示於WO2010/059401中之化合物，其內容以全文引用之方式併入。 在一個態樣中，相對於未用藥劑處理之細胞產生增加的擴增比率或增加的擴增含量之一或多個藥劑為例如如揭示於WO2013/110198中之嘧啶并[4,5-b]吲哚衍生物，其內容以全文引用之方式併入本文中。在一個實施例中，藥劑為化合物1 ((1r,4r)-N1 -(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺)：化合物 1 在另一態樣中，藥劑為化合物2 (4-(3-哌啶-1-基丙胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯)：化合物 2 ： 在另一態樣中，相對於未用藥劑處理之細胞產生增加的擴增比率或增加的擴增含量之一或多個藥劑為揭示於WO2010/059401中之藥劑，其內容以全文引用之方式併入本文中。 在一個實施例中，幹細胞擴增劑為化合物3：4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-異丙基-9H-嘌呤-6-基胺基)乙基)苯酚，亦即為來自WO2010/059401之實例1之化合物，其具有以下結構：化合物 3 ： 在另一態樣中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇((S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，亦即為根據WO2010/059401之化合物157S)，其具有以下結構：( S )- 2 -( 6 -( 2 -( lH - 吲哚 - 3 - 基 ) 乙胺基 )- 2 -( 5 - 氟吡啶 - 3 - 基 )- 9H - 嘌呤 - 9 - 基 ) 丙 - l - 醇 ： 在實施例中，在將CRISPR系統(例如本發明之gRNA分子及/或Cas9分子)引入至HSPC之前，使該等HSPC之群體與幹細胞擴增劑接觸，該幹細胞擴增劑例如化合物1、化合物2、化合物3、(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇或其組合(例如化合物1與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。在實施例中，在將CRISPR系統(例如本發明之gRNA分子及/或Cas9分子)引入HSPC至之後，使該等HSPC之群體與幹細胞擴增劑接觸，該幹細胞擴增劑例如化合物1、化合物2、化合物3、(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇或其組合(例如化合物1與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。在實施例中，在將CRISPR系統(本發明之例如gRNA分子及/或Cas9分子)引入至HSPC之前及之後，均使該等HSPC之群體與幹細胞擴增劑接觸，該幹細胞擴增劑例如化合物1、化合物2、化合物3、(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇或其組合(例如化合物1與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。 在實施例中，幹細胞擴增劑以相對於相同介質但不存在幹細胞擴增劑中之HSPC增加HSPC之擴增含量的有效量存在。在實施例中，幹細胞擴增劑以介於約0.01至約10 μM (例如約0.1 μM至約1 μM)範圍內之濃度存在。在實施例中，幹細胞擴增劑在細胞培養基中以以下之濃度存在：約1 μM、約950 nM、約900 nM、約850 nM、約800 nM、約750 nM、約700nM、約650 nM、約600 nM、約550 nM、約500 nM、約450 nM、約400 nM、約350 nM、約300 nM、約250 nM、約200 nM、約150 nM、約100 nM、約50 nM、約25 nM或約10 nM。在實施例中，幹細胞擴增劑以介於約500 nM至約750 nM範圍內之濃度存在。 在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，其在細胞培養基中以介於約0.01至約10微莫耳(μM)範圍內之濃度存在。在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，其在細胞培養基中以介於約0.1至約1微莫耳(μM)範圍內之濃度存在。在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，其在細胞培養基中以約0.75微莫耳(μM)之濃度存在。在實施例中，幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，其在細胞培養基中以約0.5微莫耳(μM)之濃度存在。在前述中之任一者之實施例中，細胞培養基另外包含化合物1。 在實施例中，幹細胞擴增劑為化合物1與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之混合物。 在實施例中，使本發明細胞與足夠產生2至10,000倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子接觸且接觸足夠時間，例如2-1000倍CD34+細胞擴增、例如2-100倍CD34+細胞擴增、例如20-200倍CD34+細胞擴增。如本文中所描述，與一或多個幹細胞擴增劑之接觸可在使細胞與例如如本文中所描述之CRISPR系統接觸之前、在使細胞與例如如本文中所描述之CRISPR系統接觸之後或其組合。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少2倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子(例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇)接觸且接觸足夠時間，該等CD34+細胞例如在與引入至該細胞中之CRISPR/Cas9系統之gRNA之靶向域互補的靶位點處或附近包含插入缺失的CD34+細胞。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少4倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子(例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇)接觸且接觸足夠時間，該等CD34+細胞例如在與引入至該細胞中之CRISPR/Cas9系統之gRNA之靶向域互補的靶位點處或附近包含插入缺失的CD34+細胞。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少5倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子(例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇)接觸且接觸足夠時間，該等CD34+細胞例如在與引入至該細胞中之CRISPR/Cas9系統之gRNA之靶向域互補的靶位點處或附近包含插入缺失的CD34+細胞。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少10倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子接觸且接觸足夠時間。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少20倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子接觸且接觸足夠時間。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少30倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子接觸且接觸足夠時間。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少40倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子接觸且接觸足夠時間。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少50倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子接觸且接觸足夠時間。在一實施例中，使細胞與足夠產生至少60倍CD34+細胞擴增之量的一或多個幹細胞擴增劑分子接觸且接觸足夠時間。在實施例中，使細胞與一或多個幹細胞擴增劑接觸約1-60天之時間，例如約1-50天、例如約1-40天、例如約1-30天、例如1-20天、例如約1-10天、例如約7天、例如約1-5天、例如約2-5天、例如約2-4天、例如約2天或例如約4天。 在實施例中，在使細胞與例如本文中所描述之CRISPR系統接觸之步驟之前，離體培養例如如本文中所描述之細胞(例如HSPC)約1小時至約10天之時間，例如約12小時至約5天之時間、例如約12小時至4天之時間、例如約1天至約4天之時間、例如約1天至約2天之時間、例如約1天之時間或約2天之時間。在實施例中，在該接觸步驟之前之該培養係在包含例如本文中所描述之幹細胞擴增劑之組合物(例如細胞培養基)中，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.25 μM至約1 μM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.75-0.5微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，在使細胞與例如本文中所描述之CRISPR系統接觸之步驟之後，例如在包含例如本文中所描述之幹細胞擴增劑之細胞培養基中離體培養細胞不大於約1天之時間，例如不大於約18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1小時，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.25 μM至約1 μM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.75-0.5微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在其他實施例中，在使細胞與例如本文中所描述之CRISPR系統接觸之步驟之後，在例如包含例如本文中所描述之幹細胞擴增劑之細胞培養基中，離體培養細胞約1小時至約14天之時間，例如約12小時至約10天之時間、例如約1天至約10天之時間、例如約1天至約5天之時間、例如約1天至約4天之時間、例如約2天至約4天之時間、例如約2天、約3天或約4天之時間，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.25 μM至約1 μM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在約0.75-0.5微莫耳濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。 在實施例中，細胞培養基為化學限定成分的介質。在實施例中，細胞培養基可另外含有例如StemSpan SFEM (StemCell Technologies；目錄號09650)。在實施例中，細胞培養基可替代地或另外含有例如HSC Brew、GMP (Miltenyi)。在實施例中，細胞培養基不含血清。在實施例中，介質可補充有血小板生成素(TPO)、人類Flt3配體(Flt-3L)、人類幹細胞因子(SCF)、人類介白素-6、L-麩醯胺酸及/或青黴素/鏈黴素。在實施例中，介質補充有血小板生成素(TPO)、人類Flt3配體(Flt-3L)、人類幹細胞因子(SCF)、人類介白素-6及L-麩醯胺酸。在其他實施例中，介質補充有血小板生成素(TPO)、人類Flt3配體(Flt-3L)、人類幹細胞因子(SCF)及人類介白素-6。在其他實施例中，介質補充有血小板生成素(TPO)、人類Flt3配體(Flt-3L)及人類幹細胞因子(SCF)，但不補充有人類介白素-6。在其他實施例中，介質補充有人類Flt3配體(Flt-3L)、人類幹細胞因子(SCF)，但不補充有人類血小板生成素(TPO)或人類介白素-6。當存在於介質中時，血小板生成素(TPO)、人類Flt3配體(Flt-3L)、人類幹細胞因子(SCF)、人類介白素-6及/或L-麩醯胺酸各自以介於約1 ng/mL至約1000 ng/mL範圍內之濃度存在，例如介於約10 ng/mL至約500 ng/mL範圍內之濃度，例如介於約10 ng/mL至約100 ng/mL範圍內之濃度，例如介於約25 ng/mL至約75 ng/mL範圍內之濃度，例如約50 ng/mL之濃度。在實施例中，所補充組分中之每一者在相同濃度下。在其他實施例中，所補充組分中之每一者在不同濃度下。在一實施例中，介質包含StemSpan SFEM (StemCell Technologies；目錄號09650)、50 ng/mL之血小板生成素(Tpo)、50 ng/mL之人類Flt3配體(Flt-3L)、50 ng/mL之人類幹細胞因子(SCF)及50 ng/mL之人類介白素-6 (IL-6)。在一實施例中，介質包含StemSpan SFEM (StemCell技術；目錄號09650)、50 ng/mL之血小板生成素(Tpo)、50 ng/mL之人類Flt3配體(Flt-3L)及50 ng/mL之人類幹細胞因子(SCF)，且不包含IL-6。在實施例中，介質進一步包含幹細胞擴增劑，例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在0.75 µM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，介質進一步包含幹細胞擴增劑，例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇，例如在0.5 µM濃度下之(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，介質進一步包含1% L-麩醯胺酸及2%青黴素/鏈黴素。在實施例中，細胞培養基不含血清。XII. 組合療法 本發明涵蓋與一或多個其他治療性模式及/或藥劑組合之本文中所描述之gRNA分子或經本文中所描述之gRNA分子修飾之細胞(例如造血幹細胞，例如CD34+細胞)的用途。因此，除使用gRNA分子或經本文中所描述之gRNA分子修飾之細胞以外，吾人亦可向個體投與用於治療血色素異常症的一或多個「標準」療法。 用於治療血色素異常症之一或多個額外療法可包括例如額外幹細胞移植，例如造血幹細胞移植。幹細胞移植可為同種異體或自體的。 用於治療血色素異常症之一或多個額外療法可包括例如輸血及/或鐵螯合(例如移除)療法。已知鐵螯合藥劑包括例如去鐵胺及地拉羅司(deferasirox)。 用於治療血色素異常症之一或多個額外療法可包括例如葉酸補充物或羥基脲(例如5-羥基脲)。用於治療血色素異常症之一或多個額外療法可為羥基脲。在實施例中，可以例如10-35 mg/kg/天(例如10-20 mg/kg/天)之劑量投與羥基脲。在實施例中，以10 mg/kg/天之劑量投與羥基脲。在實施例中，以20 mg/kg/天之劑量投與羥基脲。在實施例中，在投與例如如本文中所描述之細胞(或細胞群體) (例如本發明之CD34+細胞(或細胞群體))之前及/或之後，投與羥基脲。 一或多種額外治療劑可包括例如抗p-選擇蛋白抗體，例如SelG1 (Selexys)。P-選擇蛋白抗體描述於例如PCT公開案WO1993/021956、PCT公開案WO1995/034324、PCT公開案WO2005/100402、PCT公開案WO2008/069999、美國專利申請公開案US2011/0293617、美國專利第5800815號、美國專利第6667036號、美國專利第8945565號、美國專利第8377440號及美國專利第9068001號中，其各者之內容以其全文併入本文中。 一或多個額外藥劑可包括例如上調胎兒血色素之小分子。此類分子之實例包括TN1 (例如如Nam, T.等人, ChemMedChem 2011, 6, 777 - 780, DOI: 10.1002/cmdc.201000505中所描述，其以引用的方式併入本文中)。 一或多個額外療法亦可包括輻射或此項技術中已知之其他骨髓切除療法。此類療法之實例為硫酸布他卡因。此類額外療法可在將本發明細胞引入至個體中之前進行。在本文中所描述之治療方法(例如包括投與藉由本文所描述之方法修飾(例如經本文中所描述之CRISPR系統修飾)之細胞(例如HSPC)例如以增加HbF製造的治療方法)之一實施例中，該方法並不包括骨髓切除步驟。在實施例中，方法包括部分地骨髓切除步驟。 本文中所描述之療法(例如包含投與HSPC群體，例如使用本文中所描述之CRISPR系統而經修飾之HSPC)亦可與另一種治療劑組合。在一實施例中，額外治療劑為HDAC抑制劑，例如帕比諾他(panobinostat)。在一實施例中，額外治療劑為描述於PCT公開案第WO2014/150256號中之化合物，例如描述於WO2014/150256之表1中之化合物，例如GBT440。HDAC抑制劑之其他實例包括例如辛二醯苯胺氧肟酸(SAHA)。一或多個額外藥劑可包括例如DNA甲基化抑制劑。已展示此類藥劑增加BCL11a活性降低之細胞中之HbF誘導(例如Jian Xu等人, Science 334, 993 (2011); DOI: 0.1126/science.1211053，其以引用的方式併入本文中)。其他HDAC抑制劑包括此項技術中已知之任何HDAC抑制劑，例如曲古黴素A (trichostatin A)、HC毒素、DACI-2、FK228、DACI-14、脫毒黴素、DACI-16、突巴辛(tubacin)、NK57、MAZ1536、NK125、斯克太德(Scriptaid)、吡咯沙敏(Pyroxamide)、MS-275、ITF−2357、MCG-D0103、CRA−024781、CI−994及LBH589 (參見例如Bradner JE等人,PNAS , 2010 (卷107:28), 12617-12622，其以全文引用的方式併入本文中)。 可將本文中所描述之gRNA分子或經本文中所描述之gRNA分子修飾之細胞(例如造血幹細胞，例如CD34+細胞)及共治療劑或協同療法在同一調配物中投與或分別地投與。在獨立投與之情況下，可在投與共治療劑或協同療法之前、之後或同時投與本文中所描述之gRNA分子或經本文中所描述之gRNA分子修飾的細胞。一個藥劑可以介於數分鐘至數週範圍內之間隔先於或後於其他藥劑投與。在兩個或更多個不同種類之治療劑分別地施用於個體之實施例中，吾人應一般確保一顯著時間段不在各遞送時間之間終止，使得此等不同種類之藥劑應仍能夠發揮對於靶標組織或細胞的有利組合效果。XIII. 經修飾核苷、核苷酸及核酸 經修飾核苷及經修飾核苷酸可在核酸，例如特定言之gRNA中存在，且亦可以其他形式存在，例如mRNA、RNAi或siRNA。如本文中所描述，「核苷」定義為含有五碳糖分子(戊糖或核糖)或其衍生物，及有機鹼嘌呤或嘧啶或其衍生物的化合物。如本文中所描述，「核苷酸」定義為進一步包含磷酸酯基之核苷。 經修飾核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者： (i)磷酸二酯主鏈連接中之非連接磷酸酯氧中之一或兩者及/或連接磷酸酯氧中之一或多者的更改，例如置換； (ii)核糖組分(例如核糖上之2'羥基)之更改，例如置換； (iii)磷酸酯部分經「去磷」連接子成批置換； (iv)包括具有非典型核鹼基之天然存在之核鹼基之修飾或置換； (v)核糖-磷酸酯主鏈之置換或修飾； (vi)寡核苷酸之3'端或5'端之修飾，例如末端磷酸酯基之移除、修飾或置換，或部分、端帽或連接子之結合；以及 (vii)糖之修飾或置換。 上文所列之修飾可進行組合以提供可具有兩個、三個、四個或更多修飾之經修飾核苷及核苷酸。舉例而言，經修飾核苷或核苷酸可具有經修飾糖及經修飾核鹼基。在一實施例中，gRNA之每一鹼基為經修飾的，例如所有鹼基均具有經修飾磷酸酯基，例如所有均為硫代磷酸酯基。在一實施例中，單分子或模組gRNA分子之所有或實質上所有磷酸酯基均經硫代磷酸酯基置換。在實施例中，gRNA之五個3'末端鹼基中之一或多者及/或五個5'末端鹼基中之一或多者經硫代磷酸酯基修飾。 在一實施例中，可將經修飾核苷酸(例如具有如本文中所描述之修飾之核苷酸)併入至核酸中，例如「經修飾核酸」。在一些實施例中，經修飾核酸包含一個、兩個三個或更多個經修飾核苷酸。在一些實施例中，經修飾核酸中之至少5% (例如至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%)之位置為經修飾核苷酸。 未經修飾核酸可易於由例如細胞核酸酶降解。舉例而言，核酸酶可水解核酸磷酸二酯鍵。因此，在一個態樣中，本文中所描述之經修飾核酸可含有一或多個經修飾核苷或核苷酸，例如以引入對核酸酶之穩定性。 在一些實施例中，本文中所描述之經修飾核苷、經修飾核苷酸及經修飾核酸可在活體內及離體兩者引入至細胞群體中時呈現降低的先天性免疫反應。術語「先天性免疫反應」包括對於外源性核酸之細胞反應，該等外源性核酸包括涉及誘導細胞介素表現及釋放之一般病毒或細菌起源之單鏈核酸，特定言之干擾素及細胞死亡。在一些實施例中，本文中所描述之經修飾核苷、經修飾核苷酸及經修飾核酸可破壞主要溝槽相互作用搭配物與核酸之結合。在一些實施例中，本文中所描述之經修飾核苷、經修飾核苷酸及經修飾核酸可在活體內及離體兩者引入至細胞群體中時呈現降低的先天性免疫反應，以及破壞主要溝槽相互作用搭配物與核酸的結合。 化學基團之定義 如本文中所使用，「烷基」意謂係指為直鏈或分支鏈之飽和烴基。實例烷基包括甲基(Me)、乙基Et)、丙基(例如正丙基及異丙基)、丁基(例如正丁基、異丁基、第三丁基)、戊基(例如正戊基、異戊基、新戊基)及其類似者。烷基可含有1至約20、2至約20、1至約12、1至約8、1至約6、1至約4或1至約3個碳原子。 如本文中所使用，「芳基」係指單環或多環(例如具有2、3或4個稠合環)芳香烴，諸如苯基、萘基、蒽基、菲基、茚滿基、茚基及其類似者。在一些實施例中，芳香基具有6至約20個碳原子。 如本文中所使用，「烯基」係指含有至少一個雙鍵之脂族基。如本文中所使用，「炔基」係指含有2-12個碳原子且表徵具有一或多個參鍵之直鏈或分支鏈烴鏈。炔基之實例包括(但不限於)乙炔基、丙炔基及3-己炔基。 如本文中所使用，「芳烷基(arylalkyl/aralkyl)」係指烷基氫原子由芳基置換之烷基部分。芳烷基包括其中多於一個氫原子已經芳香基置換之基團。「芳烷基(arylalkyl/aralkyl)」之實例包括苯甲基、2-苯乙基、3-苯丙基、9-茀基、二苯甲基及三苯甲基。 如本文中所使用，「環烷基」係指具有3至12個碳之環狀、雙環、三環或多環非芳香族烴基。環烷基部分之實例實例包括(但不限於)環丙基、環戊基及環己基。 如本文中所使用，「雜環基」係指雜環系統之單價基團。代表性雜環基包括(但不限於)四氫呋喃基、四氫噻吩基、吡咯啶基、吡咯啶酮基、哌啶基、吡咯啉基、哌嗪基、二氧雜環己烷基、二氧戊環基、二氮呯基、噁氮呯基、噻環氮己三烯基及嗎啉基。 如本文中所使用，「雜芳基」係指雜芳環系統之單價基團。雜芳基部分之實例包括(但不限於)咪唑基、噁唑基、噻唑基、三唑基、吡咯基、呋喃基、吲哚基、苯硫基吡唑基、吡啶基、吡嗪基、噠嗪基、嘧啶基、吲哚嗪基、嘌呤基、㖠啶基、喹啉基及喋啶基。 磷酸酯主鏈修飾 磷酸酯基 在一些實施例中，經修飾核苷酸之磷酸酯基可藉由用不同取代基置換氧中之一或多者來修飾。此外，經修飾核苷酸(例如存在於經修飾核酸中之經修飾核苷酸)可包括用如本文中所描述之經修飾磷酸酯成批置換未經修飾之磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之修飾可包括產生不帶電連接子或具有不對稱電荷分佈之帶電荷連接子的更改。 經修飾磷酸酯基之實例包括硫代磷酸酯基、硒代磷酸酯基、硼烷磷酸酯基、硼烷磷酸酯基、氫膦酸酯基、胺基磷酸酯基、烷基或芳基膦酸酯基及磷酸三酯基。在一些實施例中，磷酸酯主鏈部分中之非橋接磷酸酯氧原子中之一者可經以下基團中之任一者置換：硫(S)、硒(Se)、BR3 (其中R可為例如氫、烷基或芳基)、C (例如烷基、芳基及其類似者)、H、NR2 (其中R可為例如氫、烷基或芳基)或OR (其中R可為例如烷基或芳基)。未經修飾磷酸酯基中之磷原子為非對掌性的。然而，用以上原子或原子之基團中之一者對非橋接氧中之一者的置換可呈現磷原子對掌性；換言之，以此方式修飾之磷酸酯基中之磷原子為立體對稱中心。立體對稱磷原子可擁有「R」組態(本文中Rp)或「S」組態(本文中Sp)。 二硫代磷酸酯之兩個非橋接氧均經硫置換。二硫代磷酸酯中之磷中心為非對掌性的，其杜絕形成寡核糖核苷酸非對映異構體。在一些實施例中，對於一個或兩個非橋接氧之修飾亦可包括用獨立地選自以下之基團置換非橋接氧：S、Se、B、C、H、N及OR (R可為例如烷基或芳基)。 磷酸酯連接子亦可藉由用氮(橋接胺基磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)置換橋接氧(亦即連接磷酸酯與核苷之氧)來加以修飾。置換可發生在任一連接氧或兩個連接氧處。 磷酸酯基之置換 磷酸酯基可經不含磷之連接體置換。在一些實施例中，帶電磷酸酯基可經中性部分置換。 可置換磷酸酯基之部分之實例可包括(但不限於)例如甲基膦酸酯、羥胺基、矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、氧化乙烯連接子、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基肼、亞甲基二甲基肼及亞甲氧基甲基亞胺基。 核糖磷酸酯主鏈之置換 亦可構築可模擬核酸之骨架，其中磷酸酯連接子及核糖由核酸酶抗性核苷或核苷酸代替物置換。在一些實施例中，核鹼基可由替代物主鏈繫留。實例可包括(但不限於)嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷代替物。 糖修飾 經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括對於糖基之一或多個修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經多個不同「氧基」或「脫氧」取代基修飾或置換。在一些實施例中，對於2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，由於羥基可能不再去質子化以形成2'-醇鹽離子。2'-醇鹽可藉由對連接子磷原子之分子內親核攻擊來催化降解。 「氧基」-2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2 CH2 O)n CH2CH2 OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20 (例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)之整數。在一些實施例中，「氧基」-2'羥基修飾可包括「鎖閉」核酸(LNA)，其中2'羥基可例如藉由Ci - 6 伸烷基或Cj - 6 伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中例示性橋可包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋；O-胺基(其中胺基可為例如NH2 ；烷胺基、二烷胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)及胺基烷氧基O(CH2 )n - 胺基(其中胺基可為例如NH2 ；烷胺基、二烷胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)。在一些實施例中，「氧基」-2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE)、(OCH2 CH2 OCH3 ，例如PEG衍生物)。 「脫氧」修飾可包括氫(亦即，例如在部分ds RNA之突出端部分處之去氧核糖)；鹵基(例如溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為例如NH2 ；烷胺基、二烷胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH2 CH2 NH)n CH2CH2 -胺基(其中胺基可為例如如本文中所描述之胺基)；-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖);氰基；氫硫基；烷基-硫-烷基；硫代烷氧基；以及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經例如如本文中所描述之胺基取代。 糖基亦可含有擁有與核糖中之對應碳之立體化學組態相比相反的立體化學組態的一或多個碳。因此，經修飾核酸可包括含有例如作為糖之阿拉伯糖的核苷酸。核苷酸「單體」可在糖上之Γ位置處具有α連接，例如α核苷。經修飾核酸亦可包括「無鹼基」糖，其在C-處缺乏核鹼基。此等無鹼基糖亦可在組成糖原子中之一或多者處進一步經修飾。經修飾核酸亦可包括呈L形式之一或多個糖，例如L-核苷。 一般而言，RNA包括糖基核糖，其為具有氧之5員環。例示性經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括(但不限於)核糖中之氧之置換(例如用硫(S)、硒(Se)或伸烷基，諸如亞甲基或乙烯)；添加雙鍵(例如以用環戊烯基或環己烯基置換核糖)；核糖之環收縮(例如以形成環丁烷或氧雜環丁烷之4-員環)；核糖之環擴張(例如以形成具有額外碳或雜原子之6員環或7員環，諸如無水己糖醇、阿卓糖醇、甘露醇、環己烷基、環己烯基及亦具有胺基磷酸酯主鏈之嗎啉基)。在一些實施例中，經修飾核苷酸可包括多環形式(例如三環；以及「未鎖閉」形式，諸如乙二醇核酸(GNA) (例如R-GNA或S-GNA，其中核糖由連接至磷酸二酯鍵之乙二醇單位置換)、蘇糖核酸(TNA，其中核糖經-L-蘇糖呋喃糖基-(3'-→2')置換)。 核鹼基上之修飾 本文中所描述之經修飾核苷及經修飾核苷酸(其可併入至經修飾核酸中)可包括經修飾核鹼基。核鹼基之實例包括(但不限於)腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。此等核鹼基可經修飾或完全置換以提供可併入至經修飾核酸中之經修飾核苷及經修飾核苷酸。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如鹼基之天然存在及合成的衍生物。 尿嘧啶 在一些實施例中，經修飾核鹼基為經修飾尿嘧啶。具有經修飾尿嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括(不限於)假尿苷(ψ)、吡啶-4-酮核苷、5-氮雜-尿苷、6-氮雜-尿苷、2-硫-5-氮雜-尿苷、2-硫-尿苷(s2U)、4-硫-尿苷(s4U)、4-硫-假尿苷、2-硫-假尿苷、5-羥基-尿苷(ho5 U)、5-胺基烯丙基-尿苷、5-鹵基-尿苷(例如5-碘-尿苷或5-溴-尿苷)、3-甲基-尿苷(m3 U)、5-甲氧基-尿苷(mo5 U)、尿苷5-氧基乙酸(cmo5 U)、尿苷5-氧基乙酸甲酯(mcmo5 U)、5-羧甲基-尿苷(cm5 U)、1-羧甲基-假尿苷、5-羧基羥甲基-尿苷(chm5 U)、5-羧基羥甲基-尿苷甲酯(mchm5 U)、5-甲氧基羰基甲基-尿苷(mcm5 U)、5-甲氧基羰基甲基-2-硫-尿苷(mcm5 s2U)、5-胺基甲基-2-硫-尿苷(nm5 s2U)、5-甲胺基甲基-尿苷(mnm5 U)、5-甲胺基甲基-2-硫-尿苷(mnm5 s2U)、5-甲胺基甲基-2-硒-尿苷(mnm5 se2 U)、5-胺甲醯基甲基-尿苷(ncm5 U)、5-羧甲基胺基甲基-尿苷(cmnm5 U)、5-羧甲基胺基甲基-2-硫-尿苷(cmnm5 s2U)、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-尿苷(xcm5 U)、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫-尿苷(Trn5 s2U)、l-牛磺酸甲基-4-硫-假尿苷、5-甲基-尿苷(m5 U，亦即具有核鹼基脫氧胸腺嘧啶)、1-甲基-假尿苷(m1 ψ)、5-甲基-2-硫-尿苷(m5 s2U)、1-甲基-4-硫-假尿苷(m1 s4ψ)、4-硫-l-甲基-假尿苷、3-甲基-假尿苷(m3 ψ)、2-硫-l-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷(D)、二氫假尿苷、5,6-二氫尿苷、5-甲基-二氫尿苷(m5 D)、2-硫-二氫尿苷、2-硫-二氫假尿苷、2-甲氧基-尿苷、2-甲氧基-4-硫-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫-假尿苷、Nl-甲基-假尿苷、3-(3-胺基-3-羧丙基)尿苷(acp3 U)、l-甲基-3-(3-胺基-3-羧丙基-假尿苷-5-(異戊烯基胺基甲基)尿苷(inm5 U)、5-(異戊烯基胺甲基)-2-硫-尿苷(inm5 s2U)、2-硫-尿苷、2'-O-甲基-尿苷(Urn)、5,2'-O-二甲基-尿苷(m5 Um)、2'-O-甲基-假尿苷(ψm)、2-硫-2'-O-甲基-尿苷(s2Um)、5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基-尿苷(mcm5 Um)、5-胺甲醯基甲基-2'-O-甲基-尿苷(ncm5 Um)、5-羧甲基胺基甲基-2'-O-甲基-尿苷(cmnm5 Um)、3,2'-O-二甲基-尿苷(m3 Um)、5-(異戊烯基胺基甲基)-2'-O-甲基-尿苷(inm5 Um)、l-硫-尿苷、脫氧胸苷、2'-F-氮雜-尿苷、2'-F-尿苷、2'-OH-氮雜-尿苷、5-(2-甲氧羰基乙烯基)尿苷、5-[3-(l-E-丙烯基胺基)尿苷、吡唑并[3,4-d]嘧啶、黃嘌呤及次黃嘌呤。 胞嘧啶 在一些實施例中，經修飾核鹼基為經修飾胞嘧啶。具有經修飾胞嘧啶之例示性核鹼基及核苷包括(不限於)5-氮雜-胞嘧啶核苷、6-氮雜-胞嘧啶核苷、假異胞苷、3-甲基-胞嘧啶核苷(m3 C)、N4-乙醯基-胞嘧啶核苷(act)、5-甲醯基-胞嘧啶核苷(f5 C)、N4-甲基-胞嘧啶核苷(m4 C)、5-甲基-胞嘧啶核苷(m5 C)、5-鹵基-胞嘧啶核苷(例如5-碘-胞嘧啶核苷)、5-羥甲基-胞嘧啶核苷(hm5 C)、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞嘧啶核苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫-胞嘧啶核苷(s2C)、2-硫-5-甲基-胞嘧啶核苷、4-硫-假異胞苷、4-硫-1-甲基-假異胞苷、4-硫-l-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-l-去氮-假異胞苷、澤布拉恩(zebularine)、5-氮雜-澤布拉恩、5-甲基-澤布拉恩、5-氮雜-2-硫-澤布拉恩、2-硫-澤布拉恩、2-甲氧基-胞嘧啶核苷、2-甲氧基-5-甲基-胞嘧啶核苷、4-甲氧基-假異胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷、賴西啶(k2 C)、2-硫-胞嘧啶核苷、2'-O-甲基-胞嘧啶核苷(Cm)、5,2'-O-二甲基-胞嘧啶核苷(m5 Cm)、N4-乙醯基-2'-O-甲基-胞嘧啶核苷(ac4 Cm)、N4,2'-O-二甲基-胞嘧啶核苷(m4 Cm)、5-甲醯基-2'-O-甲基-胞嘧啶核苷(f5 Cm)、N4,N4,2'-O-三甲基-胞嘧啶核苷(m4 2 Cm)、1-硫-胞嘧啶核苷、2'-F-氮雜-胞嘧啶核苷、2'-F-胞嘧啶核苷及2'-OH-氮雜-胞嘧啶核苷。 腺嘌呤 在一些實施例中，經修飾核鹼基為經修飾腺嘌呤。具有經修飾腺嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括(不限於)2-胺基-嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、2-胺基-6-鹵基-嘌呤(例如2-胺基-6-氯-嘌呤)、6-鹵基-嘌呤(例如6-氯-嘌呤)、2-胺基-6-甲基-嘌呤、8-疊氮基腺苷、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基-嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基-嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基-腺苷(m1 A)、2-甲基-腺嘌呤(m2 A)、N6-甲基-腺苷(m6 A)、2-甲硫基-N6-甲基-腺苷(ms2m6 A)、N6-異戊烯基-腺苷(i6 A)、2-甲硫基-N6-異戊烯基-腺苷(ms2 i6 A)、N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(io6 A)、2-甲硫基-N6-(順-羥基異戊烯基)腺苷(ms2io6 A)、N6-甘胺醯基胺基甲醯基-腺苷(g6 A)、N6-蘇胺醯基胺基甲醯基-腺苷(t6 A)、N6-甲基-N6-蘇胺醯基胺基甲醯基-腺苷(m6 t6 A)、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺基甲醯基-腺苷(ms2 g6 A)、N6,N6-二甲基-腺苷(m6 2 A)、N6-羥基正纈胺醯基胺基甲醯基-腺苷(hn6 A)、2-甲硫基-N6-羥基正纈胺醯基胺基甲醯基-腺苷(ms2hn6 A)、N6-乙醯基-腺苷(ac6 A)、7-甲基-腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、2-硫-腺苷、2'-O-甲基-腺苷(Am)、N6 ,2'-O-腺苷(m5 Am)、N6 -甲基-2'-去氧腺苷、N6,N6,2'-O-三甲基-腺苷(m6 2 Am)、l,2'-O-二甲基-腺苷(m1 Am)、2'-O-核糖基-腺苷(磷酸酯) (Ar(p))、2-胺基-N6-甲基-嘌呤、1-硫-腺苷、8-疊氮基-腺苷、2'-F-氮雜-腺苷、2'-F-腺苷、2'-OH-氮雜-腺苷及N6-(19-胺基-五氧雜十九烷基)-腺苷。 鳥嘌呤 在一些實施例中，經修飾核鹼基為經修飾鳥嘌呤。具有經修飾鳥嘌呤之例示性核鹼基及核苷包括(不限於)肌苷(I)、1-甲基-肌苷(m 'l)、懷俄苷(imG)、甲基懷俄苷(mimG)、4-去甲基-懷俄苷(imG-14)、異懷俄苷(imG2)、懷俄丁苷(yW)、過氧基懷俄丁苷(o2 yW)、羥基懷俄丁苷(OHyW)、未經修飾之羥基懷俄丁苷(OHyW*)、7-去氮-鳥苷、Q核苷(Q)、環氧Q核苷(oQ)、半乳糖苷-Q核苷(galQ)、甘露糖基-Q核苷(manQ)、7-氰基-7-去氮-鳥苷(preQ0 )、7-胺甲基-7-去氮-鳥苷(preQi)、古嘌苷(G+ )、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫-鳥苷、6-硫-7-去氮-鳥苷、6-硫-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷(m7 G)、6-硫-7-甲基-鳥苷、7-甲基-肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基-鳥苷(m1 G)、N2-甲基-鳥苷(m2 G)、N2,N2-二甲基-鳥苷(m2 2 G)、N2,7-二甲基-鳥苷(m2 ,7G)、N2,N2,7-二甲基-鳥苷(m2 ,2,7G)、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫-鳥苷、N2,N2-二甲基-6-硫-鳥苷、2-硫-鳥苷、2'-O-甲基-鳥苷(Gm)、N2-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m¾m)、N2,N2-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2 2 Gm)、l-甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m1 Gm)、N2,7-二甲基-2'-O-甲基-鳥苷(m2 ,7Gm)、2'-O-甲基-肌苷(Im)、l,2'-O-二甲基-肌苷(m1 lm)、O6 -苯基-2'-去氧肌苷、2'-O-核糖基-鳥苷(磷酸酯) (Gr(p))、1-硫-鳥苷、O6 -甲基-鳥苷、O6 -甲基-2'-脫氧鳥苷、2'-F-氮雜-鳥苷及2'-F-鳥苷。 經修飾gRNA 在一些實施例中，經修飾核酸可為經修飾gRNA。在一些實施例中，gRNA可在3'端處經修飾。在此實施例中，gRNA可在3'端U核糖處經修飾。舉例而言，U核糖之兩個末端羥基可經氧化為醛基且伴隨核糖環打開，得到經修飾核苷，其中U可為未經修飾或經修飾之尿苷。 在另一實施例中，3'末端U可經2' 3'環狀磷酸酯修飾，其中U可為未經修飾或經修飾之尿苷。在一些實施例中，例如藉由併入本文中所描述之經修飾核苷酸中之一或多者，gRNA分子可含有可為穩定不易降解之3'核苷酸。在此實施例中，例如尿苷可經經修飾尿苷(例如5-(2-胺基)丙基尿苷及5-溴尿苷)或經本文中所描述之經修飾尿苷中之任一者置換；腺苷及鳥苷可經經修飾腺苷及鳥苷(例如在8位處具有修飾，例如8-溴鳥苷)或本文中所描述之經修飾腺苷或鳥苷中之任一者置換。在一些實施例中，可將去氮核苷酸，例如7-去氮-腺苷，併入至gRNA中。在一些實施例中，可將O-及N-烷基化核苷酸，例如N6-甲基腺苷併入至gRNA中。在一些實施例中，可併入糖經修飾之核糖核苷酸，例如其中2'OH-由選自以下之基團置換：H、-OR、-R (其中R可為例如甲基、烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、鹵基、-SH、-SR (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、胺基(其中胺基可為例如NH2 ；烷胺基、二烷胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)，或氰基(-CN)。在一些實施例中，磷酸酯主鏈可如本文中所描述經例如硫代磷酸酯基修飾。在一些實施例中，gRNA之突出端區中之核苷酸可各自獨立地為經修飾或未經修飾之核苷酸，其包括(但不限於) 2'經糖修飾，諸如2-F 2'-O-甲基、胸苷(T)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基尿苷(Teo)、2'-O-甲氧基乙基腺苷(Aeo)、2'-O-甲氧基乙基-5-甲基胞啶(m5Ceo)及其任何組合。 在一實施例中，RNA分子(例如gRNA分子)之單鏈突出端中之一或多個或所有核苷酸為去氧核苷酸。醫藥組合物 本發明之醫藥組合物可包含與一或多個醫藥學上或生理學上可接受載劑、稀釋劑或賦形劑組合之本文中所描述之gRNA分子(例如複數個如本文中所描述之gRNA分子)或細胞(例如細胞群體，例如造血幹細胞群體，例如CD34+細胞群體)，該等細胞包含經一或多個本文中所描述之gRNA分子修飾之一或多個細胞。此類組合物可包含緩衝液，諸如中性緩衝鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。在一個態樣中，本發明之組合物調配用於靜脈內投與。 本發明之醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。儘管可藉由臨床試驗來判定適當劑量，但投與數量及頻率將由諸如以下之因素決定：患者之條件，及患者之疾病的類型及嚴重程度。 在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含雜質，例如存在無可偵測含量之雜質，該雜質例如選自由以下組成的群組：內毒素、黴漿菌、小鼠抗體、合併的人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、非所需CRISPR系統組分、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌為選自由以下組成的群組的至少一者：糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、奈瑟氏腦膜炎菌、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。 可以任何適宜方式進行主題組合物之投與，包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝取、輸注、植入或移植。可動脈內、皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內向患者投與本文所描述之組合物。在一個態樣中，藉由皮內或皮下注射向患者投與本發明之組合物。在一個態樣中，藉由i.v.注射投與本發明之細胞組合物。 以上待向患者投與的治療之劑量將隨所治療之精確病況性質及治療接受者而變化。可根據此項技術中接受之實踐對用於人類投與之劑量按比例調整。細胞 本發明亦係關於包含本發明之gRNA分子之細胞或編碼該等gRNA分子之核酸。 在一態樣中，細胞為藉由本文中所描述之方法製備之細胞。 在實施例中，細胞為造血幹細胞(例如造血幹細胞及祖細胞；HSPC)，例如CD34+幹細胞。在實施例中，細胞為CD34+/CD90+幹細胞。在實施例中，細胞為CD34+/CD90-幹細胞。在實施例中，細胞為人類造血幹細胞。在實施例中，細胞為自體的。在實施例中，細胞為同種異體的。 在實施例中，細胞衍生自骨髓，例如自體骨髓。在實施例中，細胞衍生自末梢血液，例如移動的末梢血液，例如自體移動的末梢血液。在採用移動的末梢血液之實施例中，自已投與移動藥劑之患者分離細胞。在實施例中，移動藥劑為G-CSF。在實施例中，移動藥劑為Plerixafor® (AMD3100)。在實施例中，移動藥劑包含G-CSF與Plerixafor® (AMD3100)之組合。在實施例中，細胞衍生自臍帶血，例如同種異體的臍帶血。在實施例中，細胞衍生自血色素異常症患者，例如患有鐮狀細胞疾病之患者或患有地中海型貧血(例如β-地中海型貧血)之患者。 在實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在實施例中，細胞為人類細胞。在實施例中，細胞衍生自血色素異常症患者，例如患有鐮狀細胞疾病之患者或患有地中海型貧血(例如β-地中海型貧血)之患者。 在一態樣中，本發明提供一種細胞，其在與例如如本文中所描述之一或多個gRNA分子互補之核酸序列處或附近(例如在20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸內)包含修飾或更改(例如插入缺失)，該一或多個gRNA分子例如作為如本文中所描述之CRISPR系統之部分而引入至該等細胞中。在實施例中，細胞為CD34+細胞。在實施例中，經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)保持分化為多譜系之細胞的能力，例如保持分化為紅血球系譜系之細胞的能力。在實施例中，經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)已在培養基中，例如在包含幹細胞擴增劑之培養基中進行或能夠進行至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10或更多倍增，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)在培養基中，例如在包含例如如本文中所描述之幹細胞擴增劑分子之培養基中已進行或能夠進行至少5 (例如約5)的倍增，該幹細胞擴增劑分子例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)呈現相對於類似未經修飾或未更改細胞而胎兒血色素含量(例如表現量及/或蛋白質含量)增加(例如胎兒血紅素蛋白含量至少增加20%)，及/或能夠分化為該等細胞，例如分化為紅血球系譜系之細胞，例如分化為紅血球。在實施例中，經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)呈現相對於類似未經修飾或未更改細胞而胎兒血色素含量(例如表現量及/或蛋白質含量)增加，例如產生至少6皮克、例如至少7皮克、至少8皮克、至少9皮克或至少10皮克胎兒血色素，及/或能夠分化為該等細胞，例如分化為紅血球系譜系之細胞，例如分化為紅血球。在實施例中，經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)呈現相對於類似未經修飾或未更改細胞而胎兒血色素含量(例如表現量及/或蛋白質含量)增加，例如產生約6至約12、約6至約7、約7至約8、約8至約9、約9至約10、約10至約11或約11至約12皮克胎兒血色素，及/或能夠分化為該等細胞，例如分化為紅血球系譜系之細胞，例如分化為紅血球。 在一態樣中，本發明提供一種細胞群體，其包含在與例如如本文中所描述之一或多個gRNA分子互補之核酸序列處或附近(例如在20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸內)具有修飾或更改(例如插入缺失)的細胞，該一或多個gRNA分子例如作為如本文中所描述之CRISPR系統之部分而引入至該等細胞中。在實施例中，該群體之至少50%，例如至少60%、至少70%、至少80%或至少90%之細胞例如在引入本發明之gRNA及/或CRISPR系統後兩天時具有例如如本文中所描述之修飾或更改(例如具有至少一個修飾或更改)，例如如藉由NGS所量測。在實施例中，該群體之至少90%，例如至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之細胞例如在引入本發明之gRNA及/或CRISPR系統後兩天時具有例如如本文中所描述之修飾或更改(例如具有至少一個修飾或更改)，例如如藉由NGS所量測。在實施例中，細胞群體包含CD34+細胞，例如包含至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約98%之CD34+細胞。在實施例中，包含經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)之細胞群體維持產生(例如分化為)多譜系之細胞之能力，例如保持產生(例如分化為)紅血球系譜系之細胞之能力。在實施例中，細胞群體(例如CD34+細胞群體)在培養基中，例如在包含幹細胞擴增劑之培養基中已進行或能夠進行至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或至少10或更多群體倍增，該幹細胞擴增劑例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，細胞群體(例如CD34+細胞群體)在培養基中，例如在包含例如如本文中所描述之幹細胞擴增劑分子之培養基中已進行或能夠進行至少5，例如約5群體倍增，該幹細胞擴增劑分子例如(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，包含經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)之細胞群體呈現相對於類似未經修飾或未更改細胞而胎兒血色素含量(例如表現量及/或蛋白質含量)增加，及/或能夠分化為該細胞群體，例如分化為紅血球系譜系細胞群體，例如分化為紅血球群體。在實施例中，包含經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)之細胞群體呈現相對於類似未經修飾或未更改細胞而胎兒血色素含量(例如表現量及/或蛋白質含量)增加，例如包含產生至少6皮克、例如至少7皮克、至少8皮克、至少9皮克或至少10皮克胎兒血色素/細胞的細胞，及/或能夠分化為該細胞群體，例如分化為紅血球系譜系細胞群體，例如分化為紅血球群體。在實施例中，包含經更改或經修飾細胞(例如CD34+細胞)之細胞群體呈現相對於類似未經修飾或未更改細胞而胎兒血色素含量(例如表現量及/或蛋白質含量)增加，例如包含產生約6至約12、約6至約7、約7至約8、約8至約9、約9至約10、約10至約11或約11至約12皮克胎兒血色素/細胞的細胞，及/或能夠分化為該細胞群體，例如分化為紅血球系譜系細胞群體，例如分化為紅血球群體。 在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e3個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e4個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e5個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e6個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e7個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e8個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e9個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e10個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e11個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e12個細胞。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e13個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約2e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約3e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約4e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約5e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約6e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約7e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約8e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約9e6個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約2e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約3e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約4e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約5e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約6e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約7e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約8e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約9e7個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e8個細胞/公斤待將其投與至之患者體重。在前述實施例中之任一者中，細胞群體可包含至少約50% (例如至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或至少約99%) HSPC，例如CD34+細胞。在前述實施例中之任一者中，細胞群體可包含約60% HSPC，例如CD34+細胞。在一實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約3e7個細胞且包含約2e7個HSPC，例如CD34+細胞。如在本申請案中所使用，科學記數法[數字]e[數字]以其一般含義給出。因此，例如2e6等效於2 × 106 或2,000,000。 在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1.5e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約2e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約3e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約4e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約5e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約6e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約7e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約8e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約9e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約2e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約3e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約4e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約5e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約6e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約7e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約8e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約9e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約1e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約2e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約3e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約4e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含至少約5e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。 在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約1e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約1.5e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約2e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約3e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約4e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約5e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約6e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約7e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約8e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約9e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約1e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約2e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約3e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約4e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約5e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約6e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約7e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約8e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約9e7個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約1e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約2e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約3e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約4e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約5e8個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。 在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含約2e6至約10e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。在實施例中，例如如本文中所描述之細胞群體包含2e6至10e6個HSPC (例如CD34+細胞)/公斤待將其投與至之患者體重。 本發明之細胞可包含本發明之gRNA分子或編碼該gRNA分子之核酸，及本發明之Cas9分子或編碼該Cas9分子之核酸。在一實施例中，本發明之細胞可包含核糖核酸蛋白(RNP)複合物，其包含本發明之gRNA分子及本發明之Cas9分子。 本發明之細胞較佳地經修飾，以例如藉由本文中所描述之方法，例如藉由電穿孔或藉由TRIAMF，離體包含本發明之gRNA分子(如專利申請案PCT/US2017/54110中所描述，其以全文引用的方式併入本文中)。 本發明之細胞包括一或多個基因之表現已藉由引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統而經更改(例如降低或抑制)的細胞。舉例而言，本發明之細胞可相對於未經修飾細胞具有降低含量的β血球蛋白(例如包含鐮狀化突變之血色素β)表現。作為另一實例，本發明之細胞可相對於未經修飾細胞具有增加含量的胎兒血色素表現。替代地或另外，本發明之細胞可產生(例如分化為)另一細胞類型(例如紅血球)，該細胞類型相對於由未經修飾細胞分化之細胞具有增加含量的胎兒血色素表現。在實施例中，胎兒血色素含量之增加為至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%。替代地或另外，本發明之細胞可產生(例如分化為)另一細胞類型(例如紅血球)，該細胞類型相對於由未經修飾細胞分化之細胞具有降低含量的β血球蛋白(例如包含鐮狀化突變之血色素β，在本文中亦稱為鐮狀β血球蛋白)表現。在實施例中，鐮狀β血球蛋白含量之降低為至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%。 本發明之細胞包括一或多個基因之表現已藉由引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統而經更改(例如降低或抑制)的細胞。舉例而言，本發明之細胞可相對於未經修飾細胞具有降低含量的血色素β (例如突變的或野生型血色素β)表現。在另一態樣中，本發明提供衍生自(例如分化自)已引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統之細胞的細胞。在此等態樣中，已引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統之細胞可不呈現降低的血紅素β (例如突變的或野生型血色素β)含量，但衍生自(例如分化自)該等細胞的細胞呈現降低的血紅素β (例如突變的或野生型血色素β)含量。在實施例中，在活體內(例如在患者中，例如在血色素異常症患者中，例如在患有鐮狀細胞疾病或地中海型貧血(例如β地中海型貧血)的患者中)實現衍生(例如分化)。在實施例中，已引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統之細胞為CD34+細胞，且自其衍生(例如分化)之細胞為紅血球系譜系的細胞，例如紅血球。 本發明之細胞包括一或多個基因之表現已藉由引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統而經更改(例如增加或促進)的細胞。舉例而言，本發明之細胞可相對於未經修飾細胞具有增加含量的胎兒血色素表現。在另一態樣中，本發明提供衍生自(例如分化自)已引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統之細胞的細胞。在此等態樣中，已引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統之細胞可不呈現增加含量的胎兒血色素，但衍生自(例如分化自)該等細胞的細胞呈現增加含量胎兒血色素。在實施例中，在活體內(例如在患者中，例如在血色素異常症患者中，例如在患有鐮狀細胞疾病或地中海型貧血(例如β地中海型貧血)的患者中)實現衍生(例如分化)。在實施例中，已引入包含本發明之gRNA之CRISPR系統之細胞為CD34+細胞，且自其衍生(例如分化)之細胞為紅血球系譜系的細胞，例如紅血球。 在另一態樣中，本發明係關於細胞，其包括在與引入至該等細胞中之一或多個gRNA分子(例如gRNA分子之靶標序列)互補核酸序列處(例如在內)或附近(例如在20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸內)的插入缺失。在實施例中，插入缺失為框移插入缺失。在實施例中，細胞包括大型缺失，例如1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb或更長之缺失。在實施例中，大型缺失包含位於引入至細胞中之一或多個gRNA分子之兩個結合位點之間的核酸。在實施例中，缺失包含以下，例如由以下組成：位於本文中所描述之gRNA之靶標序列(其位於HBG1啟動子區中)與本文中所描述之gRNA之靶標序列(其位於HBG2啟動子區中)之間的約4900個核苷酸。在實施例中，插入缺失(例如缺失)不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸。 在一態樣中，本發明係關於一種(例如如本文中所描述之)細胞群體，例如HSPC群體，其包含在與例如如本文中所描述之一或多個gRNA分子互補之核酸序列處或附近(例如在20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸內)包括插入缺失的細胞，該一或多個gRNA分子例如如本文中所描述而引入至該等細胞中。在實施例中，插入缺失為框移插入缺失。在實施例中，細胞群體包括包含大型缺失細胞，該大型缺失例如1 kb、2 kb、3 kb、4 kb、5 kb、6 kb或更長缺失缺失。在實施例中，大型缺失包含位於引入至細胞中之一或多個gRNA分子之兩個結合位點之間的核酸。在實施例中，缺失包含以下，例如由以下組成：位於本文中所描述之gRNA之靶標序列(其位於HBG1啟動子區中)與本文中所描述之gRNA之靶標序列(其位於HBG2啟動子區中)之間的約4900個核苷酸。在實施例中，該群體中之小於1%、0.5%、0.1%或0.001%之細胞(例如該群體中無細胞)包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失。在實施例中，該群體中之20%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，該群體中之30%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，該群體中之40%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，該群體中之50%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，該群體中之60%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，該群體中之70%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，該群體中之80%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，該群體中之90%-100%之細胞包括該大型缺失、一個插入缺失或多個插入缺失。在實施例中，細胞群體保持例如在個體(例如人類)中分化為多細胞類型之能力，例如保持分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)之能力。在實施例中，經編輯細胞(例如HSPC細胞，例如CD34+細胞，例如CD34+細胞之任何亞群，例如如本文中所描述)維持例如在細胞培養基中(及/或進行)增殖之能力，例如在細胞培養基中，例如在本文中所描述之細胞培養基(例如包含一或多個幹細胞擴增劑(例如化合物4)之細胞培養基)中，例如在1、2、3、4、5、6、7或更多天之後(例如在約1或約2天之後)，增殖至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多。在實施例中，經編輯及分化細胞(例如紅血球)維持增殖之能力，例如在例如如實例中所描述之紅血球系分化培養基(EDM)中在7天之後增殖至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍或更多，及/或例如在例如如實例中所描述之紅血球系分化培養基(EDM)中或在個體(例如哺乳動物，例如人類)中在21天之後增殖至少30倍、至少35倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍、至少55倍、至少60倍、至少65倍、至少70倍、至少75倍、至少80倍、至少85倍、至少90倍、至少95倍、至少100倍、至少110倍、至少120倍、至少130倍、至少140倍、至少150倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍、至少1000倍、至少1100倍、至少1200倍、至少1300倍、至少1400倍、至少1500倍或更多。 在一實施例中，本發明提供一種細胞(例如CD34+細胞)群體，該群體中之至少90%，例如至少95%、例如至少98%之細胞包含例如如本文中所描述之大型缺失或一或多個插入缺失。在不受理論束縛之情況下，咸信，將如本文中所描述之gRNA分子或CRISPR系統引入至細胞群體中在該群體中產生插入缺失及/或大型缺失之圖案，且因此包含插入缺失及/或大型缺失之群體之各細胞可不呈現相同的插入缺失及/或大型缺失。在實施例中，插入缺失及/或大型缺失包含在與本文中所描述之gRNA分子之靶向域互補之位點處或附近的一或多個核酸；其中該等細胞維持分化為紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)之能力；及/或其中由細胞群體分化之該等細胞相對於由類似未經修飾細胞群體分化之細胞具有增加含量的胎兒血色素(例如群體具有更高%的F細胞)。在實施例中，細胞群體例如在包含一或多個幹細胞擴增劑之介質中已離體進行至少2倍擴增，該介質例如包含(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。在實施例中，細胞群體例如在包含一或多個幹細胞擴增劑之介質中已離體進行至少5倍擴增，該介質例如包含(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。 在實施例中，插入缺失小於約50個核苷酸，例如小於約45、小於約40、小於約35、小於約30或小於約25個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約25個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約20個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約15個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約10個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約9個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約9個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約7個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約6個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約5個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約4個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約3個核苷酸。在實施例中，插入缺失小於約2個核苷酸。在前述實施例中之任一者中，插入缺失為至少1個核苷酸。在實施例中，插入缺失為1個核苷酸。在實施例中，大型缺失包含約1 kb DNA。在實施例中，大型缺失包含約2 kb DNA。在實施例中，大型缺失包含約3 kb DNA。在實施例中，大型缺失包含約4 kb DNA。在實施例中，大型缺失包含約5 kb DNA。在實施例中，大型缺失包含約6 kb DNA。在實施例中，大型缺失包含例如位於HBG1啟動子區中之靶標序列與HBG2啟動子區中之靶標序列之間的約4.9 kb DNA。 在實施例中，(例如如本文中所描述之)細胞群體包含插入缺失及/或大型缺失之圖案，該等插入缺失及/或大型缺失包含與包含本文中所描述之gRNA分子之CRISPR系統相關而最頻繁偵測到之插入缺失中的任何1、2、3、4、5或6個，例如該等插入缺失及/或大型缺失包含表7-2中描述的插入缺失及大型缺失中的1、2、3、4、5或6個(例如包含在HBG1靶標序列處或附近偵測到之插入缺失及大型缺失中的1、2、3、4、5或6個，及/或包含在HBG2靶標序列處或附近偵測到之插入缺失及大型缺失中的1、2、3、4、5或6個)。在實施例中，藉由本文中所描述之方法，例如藉由NGS或qPCR來偵測插入缺失及/或大型缺失。 在一態樣中，(例如如本文中所描述之)細胞或細胞群體不在脫靶位點處包含插入缺失或大型缺失，例如如藉由本文中所描述之方法所偵測。 在實施例中，本文中所描述之細胞或細胞群體(例如衍生自鐮狀細胞疾病患者)之子代(例如分化子代，例如紅血球系(例如紅血球)子代)比未經修飾細胞產生更低含量之鐮狀β血球蛋白及/或更高含量之γ血球蛋白。在實施例中，本文中所描述之細胞或細胞群體(例如衍生自鐮狀細胞疾病患者)之子代(例如分化子代，例如紅血球系(例如紅血球)子代)比未經修飾細胞產生更低含量之鐮狀β血球蛋白及更高含量之γ血球蛋白。在實施例中，以比未經修飾細胞低至少約20%、至少約30%、至少約40%或至少約50%之含量製造鐮狀β血球蛋白。在實施例中，以比未經修飾細胞高至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%或至少約70%之含量製造γ血球蛋白。 在一態樣中，本發明提供一種例如如本文中所描述之經修飾HSPC或由該等HSPC分化(例如離體或在患者中分化)之紅血球系細胞之群體，其中至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%之細胞為F細胞。在實施例中，細胞群體比未將例如如本文中所描述之一或多個gRNA分子引入至該等細胞中之類似細胞群體含有更高百分比的F細胞(或能夠例如在活體內分化為含有更高百分比的F細胞的紅血球群體)。在實施例中，相對於未將例如如本文中所描述之一或多個gRNA分子引入至該等細胞中之類似細胞群體，該細胞群體之F細胞具有至少20%增加，例如至少21%增加、至少22%增加、至少23%增加、至少24%增加、至少25%增加、至少26%增加、至少27%增加、至少28%增加、或至少29%增加(或能夠例如在活體內分化為具有以下增加之紅血球群體)。在實施例中，相對於未將例如如本文中所描述之一或多個gRNA分子引入至該等細胞中之類似細胞群體，細胞群體之F細胞具有至少30%增加、例如至少35%增加、至少40%增加、至少45%增加、至少50%增加、至少55%增加、至少60%增加、至少65%增加、至少70%增加、至少75%增加、至少80%增加、至少85%增加、至少90%增加或至少95%增加(或能夠例如在活體內分化為具有以下增加之紅血球群體)。在實施例中，相對於未將例如如本文中所描述之一或多個gRNA分子引入至該等細胞中之類似細胞群體，細胞群體之F細胞具有10%-90%、20%-80%、20%-70%、20%-60%、20%-50%、20%-40%、20%-30%、25%-80%、25%-70%、25%-60%、25%-50%、25%-40%、25%-35%、25%-30%、30%-80%、30%-70%、30%-60%、30%-50%、30%-40%或30%-35%增加(或能夠例如在活體內分化為具有以下增加之紅血球群體)。在實施例中，例如如藉由本文中所描述之方法產生之細胞群體包含足夠數目的細胞及/或足夠的F細胞%增加，以當例如以治療有效量引入至有需要患者中時治療該患者之例如如本文中所描述之血色素異常症，例如鐮狀細胞疾病及/或β地中海型貧血。在實施例中，如在例如如本文中所描述之紅血球系分化分析中量測F細胞之增加。 在實施例中，包括在本文中所描述之實施例及態樣中之任一者中，本發明係關於一種細胞，例如細胞群體，其例如如藉由本文中所描述之gRNA、方法及/或CRISPR系統中之任一者修飾，其包含產生至少6皮克胎兒血色素/細胞之F細胞。在實施例中，F細胞產生至少7皮克胎兒血色素/細胞。在實施例中，F細胞產生至少8皮克胎兒血色素/細胞。在實施例中，F細胞產生至少9皮克胎兒血色素/細胞。在實施例中，F細胞產生至少10皮克胎兒血色素/細胞。在實施例中，F細胞產生平均在6.0與7.0皮克之間、在7.0與8.0之間、在8.0與9.0之間、在9.0與10.0之間、在10.0與11.0之間或在11.0與12.0皮克之間的胎兒血色素/細胞。 在實施例中，例如如本文中所描述之細胞或細胞群體(例如其包含插入缺失，例如表7-2中描述之大型缺失或插入缺失) (或其子代)，在引入其之個體之細胞中為可偵測的，例如其保持可藉由偵測插入缺失例如使用本文中所描述之方法來偵測。在實施例中，細胞或細胞群體(或其子代)在引入其之個體中，在將該細胞或細胞群體引入至該個體中後至少10週、至少14週、至少16週、至少18週、至少20週、至少30週、至少40週、至少50週或更長時間為可偵測的。 在實施例中，一或多個插入缺失(例如表7-2中描述之大型缺失或插入缺失)在已引入本文中所描述之細胞或細胞群體之個體之細胞(例如骨髓及/或末梢血液之細胞，例如CD34+細胞)中為可偵測的，例如其保持可藉由本文中所描述之方法(例如NGS)來偵測。在實施例中，一或多個插入缺失在已引入本文中所描述之細胞或細胞群體之個體之細胞(例如骨髓及/或末梢血液之細胞，例如CD34+細胞)中，在將本文中所描述之細胞或細胞群體引入至該個體中之後至少10週、至少14週、至少16週、至少18週、至少20週、至少30週、至少40週、至少50週或更長時間為可偵測的。在實施例中，例如當相對於移植前量測或在移植後2週時或在移植後8週時所量測之偵測含量(例如包含一或多個插入缺失之細胞之百分比)而在移植後20週時所量測時，該一或多個插入缺失之偵測含量並不隨著時間推移而降低，或降低小於5%、小於10%、小於15%、小於20%、小於30%、小於40%或小於50% (例如相對於移植前偵測之插入缺失含量，或相對於在移植後2週時或在移植後8週時偵測之含量)。 在實施例中，包括在前述實施例中之任一者中，本發明之細胞及/或細胞群體包括不包含編碼Cas9分子之核酸之細胞，例如由該等細胞組成。治療方法 遞送時序 在一實施例中，遞送除Cas系統之組分(例如本文中所描述之Cas9分子組分及/或gRNA分子組分)以外之一或多個核酸分子(例如DNA分子)。在一實施例中，在遞送Cas系統之組分中之一或多者同時，遞送核酸分子。在一實施例中，在遞送Cas系統之組分中之一或多者之前或在之後(例如小於約30分鐘、1小時、2小時、3小時、6小時、9小時、12小時、1天、2天、3天、1週、2週或4週)，遞送核酸分子。在一實施例中，藉由不同於遞送Cas系統之組分(例如Cas9分子組分及/或分子組分)中之一或多者之方式來遞送核酸分子。可藉由本文中所描述之遞送方法中之任一者來遞送核酸分子。舉例而言，可藉由病毒載體(例如整合缺陷型慢病毒)來遞送核酸分子，且可藉由電穿孔來遞送Cas9分子組分及/或gRNA分子組分，例如使得可減小由核酸(例如DNA)產生的毒性。在一實施例中，核酸分子編碼治療蛋白質，例如本文中所描述之蛋白質。在一實施例中，核酸分子編碼RNA分子，例如本文中所描述之RNA分子。 組分之二模態或差異遞送 獨立遞送Cas系統之組分，例如Cas9分子組分及gRNA分子組分，且更特定言之藉由不同模式遞送組分，可例如藉由改良組織特異性及安全性而增強效能。在一實施例中，藉由不同模式、或如在本文中有時稱為差異模式來遞送Cas9分子及gRNA分子。如本文中所使用，不同或差異模式係指對於主題組分分子(例如Cas9分子、gRNA分子、模板核酸或有效負載)賦予不同藥效動力學或藥物代謝動力學特性的遞送模式。舉例而言，遞送模式可例如在所選擇腔室、組織或器官中產生不同組織分佈、不同半衰期或不同時間分佈。 一些遞送模式，例如藉由在細胞中或在細胞之子代中例如藉由自發複製或插入至細胞核酸中而存留之核酸載體的遞送產生更持久性之組分之表現及存在。實例包括病毒遞送，例如腺相關病毒或慢病毒遞送。 藉助於實例，可藉由不同於關於在身體中、或在特定腔室、組織或器官中所遞送組分之所得半衰期或持久性的模式來遞送組分，例如Cas9分子及gRNA分子。在一實施例中，可藉由此類模式來遞送gRNA分子。可藉由使得其較短持久性或較低暴露於身體或特定腔室或組織或器官的模式來遞送Cas9分子組分。 更一般而言，在一實施例中，第一遞送模式用於遞送第一組分，且第二遞送模式用於遞送第二組分。第一遞送模式賦予第一藥效動力學或藥物代謝動力學特性。第一藥效動力學特性可為例如身體、腔室、組織或器官中之組分或編碼該組分之核酸的分佈、持久性或暴露。第二遞送模式賦予第二藥效動力學或藥物代謝動力學特性。第二藥效動力學特性可為例如身體、腔室、組織或器官中之組分或編碼該組分之核酸的分佈、持久性或暴露。 在一實施例中，第一藥效動力學或藥物代謝動力學特性(例如分佈、持久性或暴露)比第二藥效動力學或藥物代謝動力學特性更受限制。 在一實施例中，選擇第一遞送模式以最佳化(例如使其降至最低)藥效動力學或藥物代謝動力學特性，例如分佈、持久性或暴露。 在一實施例中，選擇第一遞送模式以最佳化(例如使其達到最大)藥效動力學或藥物代謝動力學特性，例如分佈、持久性或暴露。 在一實施例中，第一遞送模式包含使用相對持久性元件，例如核酸，例如質體或病毒載體，例如AAV或慢病毒。由於此類載體具相對持久性，自其轉錄之產物應具相對持久性。 在一實施例中，第二遞送模式包含相對短暫元件，例如RNA或蛋白質。 在一實施例中，第一組分包含gRNA，且遞送模式為相對持久性的，例如gRNA由質體或病毒載體(例如AAV慢病毒慢病毒)轉錄。此等基因之轉錄應具有極小生理學結果，因為該等基因不編碼蛋白質產物，且gRNA為不能能在分離中起作用。以短暫方式遞送例如作為mRNA或作為蛋白質之第二組分Cas9分子，從而確保完全Cas9分子/gRNA分子複合物僅存在且起作用短的時間。 此外，可以不同分子形式或與彼此互補之不同遞送載體一起來遞送組分以增強安全性及組織特異性。 使用差異遞送模式可增強效能、安全性及效果。舉例而言，可減小偶發性脫靶修飾之可能性。藉由較短持久性模式遞送免疫原性組分(例如Cas9分子)可降低免疫原性，由於來自自細菌衍生之Cas酶之肽在細胞表面上藉由MHC分子顯示。兩部分遞送系統可減輕此等缺點。 差異遞送模式可用於將組分遞送至不同的但重疊的靶區域。在靶區域之重疊外部，形成活性複合物降至最低。因此，在一實施例中，藉由產生第一空間(例如組織)分佈之第一遞送模式來遞送第一組分，例如gRNA分子。藉由產生第二空間(例如組織)分佈之第二遞送模式來遞送第二組分，例如Cas9分子。在一實施例中，第一模式包含選自脂質體、奈米粒子之第一元件，例如聚合奈米粒子及核酸，例如病毒載體。第二模式包含選自該群組之第二元件。在一實施例中，第一遞送模式包含第一靶向元件，例如細胞特異性受體或抗體，且第二遞送模式並不包括該元件。在一實施例中，第二遞送模式包含第二靶向元件，例如第二細胞特異性受體或第二抗體。 當以病毒遞送載體、脂質體或聚合奈米粒子遞送Cas9分子時，當可能需要僅靶向單一組織時，存在用於遞送至多個組織及治療性活性的潛力。兩部分遞送系統可解決此難題且增強組織特異性。若將gRNA分子及Cas9分子封裝在具有不同但重疊的組織向性的隔開的遞送媒介物中，則完全功能性複合物僅在兩個載體靶向之組織中形成。 可藉由此項技術中已知之方法或如本文中所描述之方法來評價候選Cas分子(例如Cas9分子)、候選gRNA分子、候選Cas9分子/gRNA分子複合物及候選CRISPR系統。舉例而言，用於評估Cas9分子之核酸內切酶活性之例示性方法例如描述於Jinek等人, SCIENCE 2012; 337(6096):816-821中。 額外態樣描述於下文所列舉之實施例中。 實施例： 1.一種gRNA分子，其包含tracr及crRNA，其中該crRNA包含靶向域，該靶向域： a)與非缺失性HFPH區(例如人類非缺失性HPFH區)之靶標序列互補； b)與-鏈hg38之Chr11:5,249,833至Chr11:5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； c)與-鏈hg38之Chr11:5,254,738至Chr11:5,255,164處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； d)與-鏈hg38之Chr11:5,250,094-5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； e)與-鏈hg38之Chr11:5,255,022-5,255,164處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； f)與-鏈hg38之Chr11: 5,249,833-5,249,927處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； g)與-鏈hg38之Chr11: 5,254,738-5,254,851處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； h)與-鏈hg38之Chr11:5,250,139-5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補；或 i)其組合。 2.如實施例1之gRNA分子，其中該靶向域包含，例如由SEQ ID NO: 1 toSEQ ID NO: 72中之任一者或其片段組成。 3.如實施例2之gRNA分子，其中該靶向域包含，例如由以下中之任一者組成：SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63、SEQ ID NO: 67，或其片段。 4.如實施例2之gRNA分子，其中該靶向域包含以下中之任一者，例如由以下中之任一者組成： a) SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 67，或其片段；或 b) SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 54，或其片段。 5.如實施例2至4中任一項之gRNA分子，其中該靶向域包含以下，例如由以下組成：所引述靶向域序列中之任一者之17、18、19或20個連續核酸。 6.如實施例5之gRNA分子，其中所引述靶向域序列中之任一者之該等17、18、19或20個連續核酸為位於所引述靶向域序列之3'端處之17、18、19或20個連續核酸。 7.如實施例5之gRNA分子，其中所引述靶向域序列中之任一者之該等17、18、19或20個連續核酸為位於所引述靶向域序列之5'端處之17、18、19或20個連續核酸。 8.如實施例5之gRNA分子，其中所引述靶向域序列中之任一者之該等17、18、19或20個連續核酸不包含所引述靶向域序列之5'或3'核酸。 9.如實施例2至8中任一項之gRNA分子，其中該靶向域由所引述靶向域序列組成。 10.如先前實施例中任一項之gRNA分子，其中該crRNA之一部分與該tracr之一部分雜交，形成包含SEQ ID NO: 182或183之旗桿。 11.如實施例10之gRNA分子，其中該旗桿進一步包含位於該旗桿之該crRNA部分3'之第一旗桿延長，其中該第一旗桿延長包含SEQ ID NO: 184。 12.如實施例10或11之gRNA分子，其中該旗桿進一步包含位於該旗桿之該crRNA部分3'之第二旗桿延長及該第一旗桿延長(若存在)，其中該第二旗桿延長包含SEQ ID NO: 185。 13.如實施例1至12中任一項之gRNA分子，其中該tracr包含SEQ ID NO: 224或SEQ ID NO: 225。 14.如實施例1至13中任一項之gRNA分子，其中該tracr包含SEQ ID NO: 232，視情況在3'端進一步包含另外1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸。 15.如實施例1至14中任一項之gRNA分子，其中該crRNA自5'至3'包含[靶向域]-： a) SEQ ID NO: 182； b) SEQ ID NO: 183； c) SEQ ID NO: 199； d) SEQ ID NO: 200； e) SEQ ID NO: 201； f) SEQ ID NO: 202；或 g) SEQ ID NO: 226。 16.如實施例1至9或15中任一項之gRNA分子，其中該tracr自5'至3'包含： a) SEQ ID NO: 187； b) SEQ ID NO: 188； c) SEQ ID NO: 203； d) SEQ ID NO: 204； e) SEQ ID NO: 224； f) SEQ ID NO: 225； g) SEQ ID NO: 232； h) SEQ ID NO: 227； i) (SEQ ID NO: 228； j) SEQ ID NO: 229； k)以上a)至j)中之任一者，其在3'端進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸； l)以上a)至k)中之任一者，其在3'端進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸；或 m)以上a)至l)中之任一者，其在5'端(例如在5'末端)進一步包含至少1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸，例如1、2、3、4、5、6或7個腺嘌呤(A)核苷酸。 17.如實施例1至9中任一項之gRNA分子，其中該靶向域及該tracr位於獨立核酸分子上，且其中包含該靶向域之該核酸分子包含SEQ ID NO: 201，其視情況緊接著位於靶向域之3'，且包含該tracr之該核酸分子包含SEQ ID NO: 224，例如由其組成。 18.如實施例13至14中任一項之gRNA分子，其中該旗桿之該crRNA部分包含SEQ ID NO: 201或SEQ ID NO: 202。 19.如實施例1至12中任一項之gRNA分子，其中該tracr包含SEQ ID NO: 187或188及視情況位於SEQ ID NO: 187或188之5'之第一tracr延長(若第一旗桿延長存在)，該第一tracr延長包含SEQ ID NO: 189。 20.如實施例1至19中任一項之gRNA分子，其中該靶向域及該tracr位於獨立核酸分子上。 21.如實施例1至19中任一項之gRNA分子，其中該靶向域及該tracr位於單一核酸分子上，且其中該tracr位於靶向域之3'。 22.如實施例21之gRNA分子，其進一步包含位於該靶向域之3'且該tracr之5'的環。 23.如實施例22之gRNA分子，其中該環包含SEQ ID NO: 186。 24.如實施例1至9中任一項之gRNA分子，其自5'至3'包含[靶向域]-： (a) SEQ ID NO: 195； (b) SEQ ID NO: 196； (c) SEQ ID NO: 197； (d) SEQ ID NO: 198； (e) SEQ ID NO: 231；或 (f)以上(a)至(e)中之任一者，其在3'端進一步包含1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸。 25.如實施例1至9或21至24中任一項之gRNA分子，其中該靶向域及該tracr位於單一核酸分子上，且其中該核酸分子包含以下，例如由以下組成：該靶向域及視情況緊接著位於該靶向域之3'之SEQ ID NO: 231。 26.如實施例1至25中任一項之gRNA分子，其中包含該gRNA分子之該等核酸分子中之一個或視情況多於一個包含： a)該一或多個核酸分子之3'端處之一或多個(例如三個)硫代磷酸酯修飾； b)該一或多個核酸分子之5'端處之一或多個(例如三個)硫代磷酸酯修飾； c)該一或多個核酸分子之3'端處之一或多個(例如三個)2'-O-甲基修飾； d)該一或多個核酸分子之5'端處之一或多個(例如三個)2'-O-甲基修飾； e)該一或多個核酸分子之第4末端、第3末端及第2末端3'殘基中之每一者處之2' O-甲基修飾； f)該一或多個核酸分子之第4末端、第3末端及第2末端5'殘基之中之每一者處之2' O-甲基修飾；或 f)其任何組合。 27.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 74； (b) SEQ ID NO: 75；或 (c) SEQ ID NO: 76。 28.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 77組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 77組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 78組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 78組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 29.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 79； (b) SEQ ID NO: 80；或 (c) SEQ ID NO: 81。 30.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 82組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 82組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 83組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 83組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 31.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 84； (b) SEQ ID NO: 85；或 (c) SEQ ID NO: 86。 32.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 87組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 87組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 88組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 88組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 33.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 89； (b) SEQ ID NO: 90；或 (c) SEQ ID NO: 91。 34.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 92組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 92組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 93組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 93組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 35.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 94； (b) SEQ ID NO: 95；或 (c) SEQ ID NO: 96。 36.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 97組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 97組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 98組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 98組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 37.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 99； (b) SEQ ID NO: 100；或 (c) SEQ ID NO: 101。 38.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 102組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 102組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 103組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 103組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 39.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 104； (b) SEQ ID NO: 105；或 (c) SEQ ID NO:106。 40.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 107組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 107組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 108組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 108組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 41.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 109； (b) SEQ ID NO: 110；或 (c) SEQ ID NO: 111。 42.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 112組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 112組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 113組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 113組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 43.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 114； (b) SEQ ID NO: 115；或 (c) SEQ ID NO:116。 44.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 117組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 117組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 118組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 118組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 45.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 119； (b) SEQ ID NO: 120；或 (c) SEQ ID NO: 121。 46.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 122組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 122組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 123組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 123組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 47.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 124； (b) SEQ ID NO: 125；或 (c) SEQ ID NO:126。 48.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 127組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 127組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 128組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 128組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 49.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 129； (b) SEQ ID NO: 130；或 (c) SEQ ID NO: 131。 50.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 132組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 132組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 133組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 133組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 51.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 134； (b) SEQ ID NO: 135；或 (c) SEQ ID NO:136。 52.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 137組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 137組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 138組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 138組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 53.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 139； (b) SEQ ID NO: 140；或 (c) SEQ ID NO: 141。 54.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 142組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 142組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 143組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 143組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 55.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 144； (b) SEQ ID NO: 145；或 (c) SEQ ID NO:146。 56.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 147組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 147組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 148組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 148組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 57.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 149； (b) SEQ ID NO: 150；或 (c) SEQ ID NO: 151。 58.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 152組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 152組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 153組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 153組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 59.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 154； (b) SEQ ID NO: 155；或 (c) SEQ ID NO:156。 60.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 157組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 157組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 158組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 158組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 61.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 159； (b) SEQ ID NO: 160；或 (c) SEQ ID NO: 161。 62.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 162組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 162組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 163組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 163組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 63.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 164； (b) SEQ ID NO: 165；或 (c) SEQ ID NO:166。 64.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 167組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 167組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 168組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 168組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 65.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 169； (b) SEQ ID NO: 170；或 (c) SEQ ID NO: 171。 66.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 172組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 172組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 173組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 173組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 67.如實施例1之gRNA分子，其包含以下之序列，例如由以下之序列組成： (a) SEQ ID NO: 174； (b) SEQ ID NO: 175；或 (c) SEQ ID NO:176。 68.如實施例1之gRNA分子，其包含以下，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 177組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 177組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 178組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 178組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。 69.如實施例1至68中任一項之gRNA分子，其中 a)當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，在與該gRNA分子之該靶向域互補之該靶標序列處或附近形成插入缺失；及/或 b)當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，產生包含序列之缺失，例如其包含同HBG1啟動子區中之gRNA靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)之序列與同HBG2啟動子區中之gRNA靶向域互補(例如至少與該gRNA靶向域90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)之序列之間的實質上所有序列。 70.如實施例69之gRNA分子，其中該插入缺失不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸，視情況其中該插入缺失不包含非缺失性HPFH或轉錄因子結合位點之核苷酸。 71.如實施例1至70中任一項之gRNA分子，其中當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞群體中時，在該群體之以下百分比之該等細胞中，與該gRNA分子的該靶向域互補的靶標序列處或附近形成插入缺失：至少約15%，例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約30%、例如至少約40%、例如至少約50%、例如至少約55%、例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約75%、例如至少約80%、例如至少約85%、例如至少約90%、例如至少約95%。 72.如實施例69至71中任一項之gRNA分子，其中該插入缺失包含HBG1啟動子區之至少一個核苷酸或HBG2啟動子區之至少一個核苷酸。 73.如實施例71至72中任一項之gRNA分子，其中該群體之至少約15%之細胞包含：插入缺失，其包含HBG1啟動子區之至少一個核苷酸；及插入缺失，其包含HBG2啟動子區之至少一個核苷酸。 74.如實施例71至73之gRNA分子，其中該群體中之包含含HBG1啟動子區一至少一個核苷酸之插入缺失之細胞的百分比，與該群體中之包含含HBG2啟動子區一至少一個核苷酸之插入缺失之細胞的百分比，相差至少約5%，例如至少約10%、例如至少約20%、例如至少約30%。 75.如實施例69至74中任一項之gRNA分子，其中該插入缺失如藉由下一代定序(NGS)所量測。 76.如實施例1至75中任一項之gRNA分子，其中當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，胎兒血色素之表現在該細胞或其子代，例如其紅血球系子代、例如其紅血球子代中增加。 77.如實施例76之gRNA分子，其中當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，該群體或其子代(例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代)群體中之F細胞的百分比，相對於未將該gRNA分子引入之細胞群體或其子代(例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代)群體中之F細胞的百分比，增加至少約15%，例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約25%、例如至少約30%、例如至少約35%、例如至少約40%。 78.如實施例76中任一項之gRNA分子，其中該細胞或其子代，例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代，產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。 79.如實施例1至78中任一項之gRNA分子，其中當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，在該細胞中不形成脫靶插入缺失，例如在該HBG1及/或該HBG2啟動子區域外部不形成脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測。 80.如實施例1至78中任一項之gRNA分子，其中當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞群體中時，在該細胞群體之多於約5%，例如多於約1%、例如多於約0.1%、例如多於約0.01%之細胞中未偵測到脫靶插入缺失，例如在該HBG1及/或HBG2啟動子區域外部無脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測。 81.如實施例69至80中任一項之gRNA分子，其中該細胞為(或細胞群體包含)哺乳動物、靈長類或人類細胞，例如為人類細胞。 82.如實施例81之gRNA分子，其中該細胞為(或細胞群體包含) HSPC。 83.如實施例82之gRNA分子，其中該HSPC為CD34+。 84.如實施例83之gRNA分子，其中該HSPC為CD34+CD90+。 85.如實施例69至84中任一項之gRNA分子，其中該細胞對於待投與該細胞之患者為自體的。 86.如實施例69至84中任一項之gRNA分子，其中該細胞對於待投與該細胞之患者為同種異體的。 87.一種組合物，其包含： 1)一或多個如實施例1至86中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)及Cas9分子； 2)一或多個如實施例1至86中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)及編碼Cas9分子核酸； 3)編碼一或多個如實施例1至86中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)之核酸及Cas9分子； 4)編碼一或多個如實施例1至86中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)之核酸及編碼Cas9分子之核酸；或 5)以上1)至4)中之任一者，及模板核酸；或 6)以上1)至4)中之任一者，及包含編碼模板核酸之序列之核酸。 88.一種組合物，其包含如實施例1至86中任一項之第一gRNA分子，視情況進一步包含Cas9分子。 89.如實施例87或88之組合物，其中該Cas9分子為活性或非活性化膿性鏈球菌Cas9。 90.如實施例87至89之組合物，其中該Cas9分子包含SEQ ID NO: 205。 91.如實施例87至89之組合物，其中該Cas9分子包含以下，例如由以下組成： (a) SEQ ID NO: 233； (b) SEQ ID NO: 234； (c) SEQ ID NO: 235； (d) SEQ ID NO: 236； (e) SEQ ID NO: 237； (f) SEQ ID NO: 238； (g) SEQ ID NO: 239； (h) SEQ ID NO: 240； (i) SEQ ID NO: 241； (j) SEQ ID NO: 242； (k) SEQ ID NO: 243；或 (l) SEQ ID NO: 244。 92.如實施例88至91中任一項之組合物，其中該第一gRNA分子及Cas9分子以核糖核酸蛋白複合物(RNP)存在。 93.如實施例87至92中任一項之組合物，其進一步包含第二gRNA分子；第二gRNA分子及第三gRNA分子；或第二gRNA分子、視情況第三gRNA分子及視情況第四gRNA分子，其中該第二gRNA分子、該視情況存在之第三gRNA分子及該視情況存在之第四gRNA分子為如實施例1至68中任一項之gRNA分子，且其中該組合物之各gRNA分子與不同靶標序列互補。 94.如實施例93之組合物，其中該第一gRNA分子、該第二gRNA分子、該視情況存在之第三gRNA分子及該視情況存在之第四gRNA分子中之兩個或更多個與相同基因或區內之靶標序列互補。 95.如實施例93或94之組合物，其中該第一gRNA分子、該第二gRNA分子、該視情況存在之第三gRNA分子及該視情況存在之第四gRNA分子與相隔以下長度的靶標序列互補：不大於6000個核苷酸、不大於5000個核苷酸、不大於500、不大於400個核苷酸、不大於300、不大於200個核苷酸、不大於100個核苷酸、不大於90個核苷酸、不大於80個核苷酸、不大於70個核苷酸、不大於60個核苷酸、不大於50個核苷酸、不大於40個核苷酸、不大於30個核苷酸、不大於20個核苷酸或不大於10個核苷酸。 96.如實施例93之組合物，其中該第一gRNA分子、該第二gRNA分子、該視情況存在之第三gRNA分子及該視情況存在之第四gRNA分子中之兩個或更多個包含：至少一個gRNA分子，其包含與HBG1啟動子區之靶標序列互補的靶向域；及至少一個gRNA分子，其包含與HBG2啟動子區之靶標序列互補的靶向域。 97.如實施例94至95中任一項之組合物，其包含第一gRNA分子及第二gRNA分子，其中該第一gRNA分子及第二gRNA分子： (a)獨立地選自如實施例1之gRNA分子，且與不同靶標序列互補； (b)獨立地選自如實施例2之gRNA分子，且與不同靶標序列互補； c)獨立地選自如實施例3之gRNA分子，且與不同靶標序列互補；或 (d)獨立地選自如實施例4之gRNA分子，且與不同靶標序列互補；或 (e)獨立地選自如實施例27至68中任一項之gRNA分子，且與不同靶標序列互補。 98.如實施例94至96中任一項之組合物，其包含第一gRNA分子及第二gRNA分子，其中： a)該第一gRNA分子與包含以下內之至少1個核苷酸(例如包含20個連續核苷酸)之靶標序列互補： i) Chr11:5,249,833至Chr11:5,250,237 (hg38)； ii) Chr11:5,250,094-5,250,237 ( hg38)； iii) Chr11: 5,249,833-5,249,927 (hg38)；或 iv) Chr11:5,250,139-5,250,237 (hg38)； b)該第二gRNA分子與包含以下內之至少1個核苷酸(例如包含20個連續核苷酸)之靶標序列互補： i) Chr11:5,254,738至Chr11:5,255,164 (hg38)； ii) Chr11:5,255,022-5,255,164 (hg38)；或 iii) Chr11: 5,254,738-5,254,851 (hg38)。 99.如實施例87至98中任一項之組合物，其中關於該組合物之該gRNA分子組分，該組合物由第一gRNA分子及第二gRNA分子組成。 100.如實施例87至99中任一項之組合物，其中該等gRNA分子中之每一者呈與本文中所描述之Cas9分子，例如如實施例90或91中任一項之Cas9分子，之核糖核酸蛋白複合物(RNP)。 101.如實施例87至100中任一項之組合物，其包含模板核酸，其中該模板核酸包含對應於在該第一gRNA分子之該靶標序列處或附近之核苷酸的核苷酸。 102.如實施例101中任一項之組合物，其中該模板核酸包含編碼以下之核酸： (a)人類β血球蛋白或其片段，例如包含突變G16D、E22A及T87Q中之一或多者人類β血球蛋白；或 (b)人類γ血球蛋白，或其片段。 103.如實施例87至102中任一項之組合物，其調配於適合於電穿孔之介質中。 104.如實施例87至103中任一項之組合物，其中該等gRNA分子中之每一者處於具有本文中所描述之Cas9分子之RNP中，且其中該RNP中之每一者在小於約10 μM濃度下、例如小於約3 μM、例如小於約1 μM、例如小於約0.5 μM、例如小於約0.3 μM、例如小於約0.1 μM，視情況其中該RNP之濃度約為2 μM或約為1 μM，視情況其中該組合物進一步包含細胞群體，該等細胞為例如HSPC。 105.一種核酸序列，其編碼一或多個如實施例1至68中任一項之gRNA分子。 106.如實施例105之核酸序列，其中該核酸包含可操作地連接於編碼該一或多個gRNA分子之序列的啟動子。 107.如實施例106之核酸序列，其中該啟動子為由RNA聚合酶II或RNA聚合酶III識別啟動子。 108.如實施例107之核酸序列，其中該啟動子為U6啟動子或HI啟動子。 109.如如實施例105至108中任一項之核酸序列，其中該核酸進一步編碼Cas9分子。 110.如實施例109之核酸序列，其中該Cas9分子包含以下中之任一者：SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 243或SEQ ID NO: 244。 111.如實施例109至110中任一項之核酸序列，其中該核酸包含可操作地連接於編碼Cas9分子之序列的啟動子。 112.如實施例111之核酸序列，其中該啟動子為EF-1啟動子、CMV IE基因啟動子、EF-1α啟動子、泛素C啟動子或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。 113.一種載體，其包含如實施例105至112中任一項之核酸。 114.如實施例113之載體，其中該載體選自由以下組成的群組：慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、單純疱疹病毒(HSV)載體、質體、小環、奈米質體及RNA載體。 115.一種在細胞內之靶標序列處或附近更改該細胞(例如細胞群體) (例如更改核酸之結構(例如序列))之方法，其包含使該細胞(例如細胞群體)與以下接觸(例如向其中引入)： 1)一或多個如實施例1至68中任一項之gRNA分子及Cas9分子； 2)一或多個如實施例1至68中任一項之gRNA分子及編碼Cas9分子之核酸； 3)編碼一或多個如實施例1至68中任一項之gRNA分子之核酸及Cas9分子； 4)編碼一或多個如實施例1至68中任一項之gRNA分子之核酸及編碼Cas9分子之核酸； 5)以上1)至4)中之任一者，及模板核酸； 6)以上1)至4)中之任一者，及包含編碼模板核酸之序列之核酸； 7)如實施例87至104中任一項之組合物；或 8)如實施例113至114中任一項之載體。 116.如實施例115之方法，其中該gRNA分子或編碼該gRNA分子之核酸，及該Cas9分子或編碼該Cas9分子之核酸，調配於單一組合物中。 117.如實施例115之方法，其中該gRNA分子或編碼該gRNA分子之核酸，及該Cas9分子或編碼該Cas9分子之核酸，調配於多於一個組合物中。 118.如實施例117之方法，其中該多於一個組合物同時或依序遞送。 119.如實施例115至118中任一項之方法，其中該細胞為動物細胞。 120.如實施例115至118中任一項之方法，其中該細胞為哺乳動物、靈長類或人類細胞。 121.如實施例120之方法，其中該細胞為造血幹細胞或祖細胞(HSPC) (例如HSPC群體)。 122.如實施例115至121中任一項之方法，其中該細胞為CD34+細胞。 123.如實施例115至122中任一項之方法，其中該細胞為CD34+CD90+細胞。 124.如實施例115至123中任一項之方法，其中該細胞位於包含已增濃CD34+細胞之細胞群體的組合物中。 125.如實施例115至124中任一項之方法，其中該細胞(例如細胞群體)已自骨髓、移動的末梢血液或臍帶血分離。 126.如實施例115至125中任一項之方法，其中該細胞對於待投與該細胞之患者為自體或同種異體的，視情況其中該患者為血色素異常症患者，視情況其中該患者患有鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，視情況β地中海型貧血。 127.如實施例115至126中任一項之方法，其中： a)該更改在與該一或多個gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近產生插入缺失；及/或 b)該更改產生包含序列之缺失，例如同HBG1啟動子區中之一或多個gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之一或多個gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列，視情況其中該缺失不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸。 128.如實施例127之方法，其中該插入缺失為小於約40個核苷酸，例如小於30個核苷酸、例如小於20個核苷酸、例如小於10個核苷酸的插入或缺失。 129.如實施例128之方法，其中該插入缺失為單核苷酸缺失。 130.如實施例127至129中任一項之方法，其中該方法產生細胞群體，其中該群體中之至少約15%、例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約30%、例如至少約40%、例如至少約50%、例如至少約55%、例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約75%、例如至少約80%、例如至少約85%、例如至少約90%、例如至少約95%已經更改，例如包含插入缺失，視情況其中該插入缺失選自表2-7中列舉之插入缺失，視情況其中該群體之細胞不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失。 131.如實施例115至130中任一項之方法，其中該更改產生能夠分化為紅血球系譜系之分化細胞(例如紅血球)的細胞(例如細胞群體)，且其中該分化細胞例如相對於未更改細胞(例如細胞群體)呈現增加含量的胎兒血色素。 132.如實施例115至131中任一項之方法，其中該更改產生能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系之細胞群體(例如紅血球群體)的細胞群體，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)。 133.如實施例115至131中任一項之方法，其中該更改產生能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)的細胞，且其中該分化細胞產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。 134.一種細胞，其藉由如實施例115至133中任一項之方法更改，或一種細胞，其可藉由如實施例115至133中任一項之方法獲得。 135.一種細胞，其包含表7-2中描述之插入缺失，視情況其中該細胞不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失。 136.一種細胞，其包含如實施例1至68中任一項之第一gRNA分子、或如實施例87至104中任一項之組合物、如實施例105至112中任一項之核酸或如實施例113至114中任一項之載體。 137.如實施例136之細胞，其包含Cas9分子。 138.如實施例137之細胞，其中該Cas9分子包含以下中之任一者：SEQ ID NO: 205、SEQ ID NO: 233、SEQ ID NO: 234、SEQ ID NO: 235、SEQ ID NO: 236、SEQ ID NO: 237、SEQ ID NO: 238、SEQ ID NO: 239、SEQ ID NO: 240、SEQ ID NO: 241、SEQ ID NO: 242、SEQ ID NO: 243或SEQ ID NO: 244。 139.如實施例134至138中任一項之細胞，其中該細胞包含，已包含或將包含如實施例1至68中任一項之第二gRNA分子、或編碼如實施例1至68中任一項之第二gRNA分子之核酸，其中該第一gRNA分子及第二gRNA分子包含不同的靶向域。 140.如實施例134至139中任一項之細胞，其中相對於尚未經修飾以包含gRNA分子之相同細胞類型之細胞或其子代，胎兒血色素之表現在該細胞或其子代(例如其紅血球系子代，例如其紅血球子代)中增加。 141.如實施例134至139中任一項之細胞，其中該細胞能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞例如相對於尚未經修飾以包含gRNA分子之相同類型之細胞呈現增加含量的胎兒血色素。 142.如實施例140至141中任一項之細胞，其中該分化細胞(例如紅血球系譜系之細胞，例如紅血球)例如相對於尚未經修飾以包含gRNA分子之相同類型之分化細胞，產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素。 143.如實施例134至142中任一項之細胞，其已與幹細胞擴增劑接觸。 144.如實施例143之細胞，其中該幹細胞擴增劑為： a)(1r,4r)-N1 -(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺； b) 4-(3-哌啶-1-基丙胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯； c)4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-異丙基-9H-嘌呤-6-基胺基)乙基)苯酚； d)(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇；或 e)其組合(例如(1r,4r)-N1 -(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。 145.如實施例144之細胞，其中該幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。 146.一種細胞，例如如實施例134至145中任一項之細胞，其包含： a)在與如實施例1至68中任一項之gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近的插入缺失；及/或 b)包含序列之缺失，例如同HBG1啟動子區中之如實施例1至68中任一項之gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之如實施例1至68中任一項之gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列，視情況其中該缺失不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸。 147.如實施例146之細胞，其中該插入缺失為小於約40個核苷酸，例如小於30個核苷酸、例如小於20個核苷酸、例如小於10個核苷酸的插入或缺失。 148.如實施例146至147中任一項之細胞，其中該插入缺失為單核苷酸缺失。 149.如實施例134至148中任一項之細胞，其中該細胞為動物細胞。 150.如實施例149之細胞，其中該細胞為哺乳動物、靈長類或人類細胞。 151.如實施例134至150中任一項之細胞，其中該細胞為造血幹細胞或祖細胞(HSPC) (例如HSPC群體)。 152.如實施例134至151中任一項之細胞，其中該細胞為CD34+細胞。 153.如實施例152之細胞，其中該細胞為CD34+CD90+細胞。 154.如實施例134至153中任一項之細胞，其中該細胞(例如細胞群體)已自骨髓、移動的末梢血液或臍帶血分離。 155.如實施例134至154中任一項之細胞，其中該細胞對於待投與該細胞之患者為自體的，視情況其中該患者為血色素異常症患者，視情況其中該患者患有鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，視情況β地中海型貧血。 156.如實施例134至154中任一項之細胞，其中該細胞對於待投與該細胞之患者為同種異體。 157.一種細胞群體，其包含如實施例134至156中任一項之細胞。 158.如實施例157之細胞群體，其中該群體之至少約50%，例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約80%、例如至少約90% (例如至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%)之該等細胞為如實施例134至156中任一項之細胞。 159.如實施例157至158中任一項之細胞群體，其中該細胞群體能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於相同類型未經修飾細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約17%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)。 160.如實施例159之細胞群體，其中該分化細胞群體之該等F細胞產生平均至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。 161.如實施例157至160中任一項之細胞群體其包含： 1)至少1e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重； 2)至少2e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重； 3)至少3e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重； 4)至少4e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重；或 5) 2e6至10e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重。 162.如實施例157至161中任一項之細胞群體，其中該群體之至少約40%，例如至少約50% (例如至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%)之細胞為CD34+細胞。 163.如實施例162之細胞群體，其中該群體之至少約10%，例如至少約15%、例如至少約20%、例如至少約30%之細胞為CD34+CD90+細胞。 164.如實施例157至163中任一項之細胞群體，其中該細胞群體衍生自臍帶血、末梢血液(例如移動的末梢血液)或骨髓，例如衍生自骨髓。 165.如實施例157至164中任一項之細胞群體，其中該細胞群體包含，例如由哺乳動物細胞，例如人類細胞組成，視情況其中該細胞群體獲自患有血色素異常症的患者，該血色素異常症為例如鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，例如β-地中海型貧血。 166.如實施例157至165中任一項之細胞群體，其中該細胞群體(i)對於待投與其之患者為自體的，或(ii)對於待投與其之患者為同種異體的。 167.例如如實施例157至165中任一項之細胞群體(例如CD34+細胞)，其包含如表7-2中所描述之插入缺失圖案，視情況其中表7-2中描述之插入缺失圖案之插入缺失在該群體之至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%之細胞中為可偵測的。 168.一種組合物，其包含如實施例134至156中任一項之細胞、或如實施例157至167中任一項之細胞群體。 169.如實施例168之組合物，其包含醫藥學上可接受之介質，例如適合於低溫保存之醫藥學上可接受之介質。 170.一種治療血色素異常症之方法，其包含向患者投與如實施例134至156中任一項之細胞、如實施例157至167中任一項之細胞群體或如實施例168至169中任一項之組合物。 171.一種增加哺乳動物中之胎兒血色素表現之方法，其包含向患者投與如實施例134至156中任一項之細胞、如實施例157至167中任一項之細胞群體或如實施例168至169中任一項之組合物。 172.如實施例170之方法，其中該血色素異常症為β-地中海型貧血或鐮狀細胞疾病。 173.一種製備細胞(例如細胞群體)之方法，其包含： (a)提供細胞(例如細胞群體) (例如HSPC (例如HSPC群體))； (b)在包含幹細胞擴增劑之細胞培養基中離體培養該細胞(例如該細胞群體)；以及 (c)向該細胞中引入如實施例1至86中任一項之第一gRNA分子、編碼如實施例1至86中任一項之第一gRNA分子之核酸分子、如實施例87至104或168至169中任一項之組合物、如實施例105至112中任一項之核酸或如實施例113至114中任一項之載體。 174.如實施例173之方法，其中在該引入步驟(c)之後，該細胞(例如細胞群體)能夠分化為分化細胞(例如分化細胞群體)，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球系譜系細胞群體)，例如紅血球(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞(例如分化細胞群體)例如相對於尚未經受步驟(c)之相同細胞產生增加的胎兒血色素。 175.如實施例173至174中任一項之方法，其中該幹細胞擴增劑為： a)(1r,4r)-N1-(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺； b) 4-(3-哌啶-1-基丙胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯； c)4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-異丙基-9H-嘌呤-6-基胺基)乙基)苯酚； d)(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇；或 e)其組合(例如(1r,4r)-N1-(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。 176.如實施例175之方法，其中該幹細胞擴增劑為(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇。 177.如實施例173至176中任一項之方法，其中該細胞培養基包含血小板生成素(Tpo)、Flt3配體(Flt-3L)及人類幹細胞因子(SCF)。 178.如實施例177之方法，其中該細胞培養基進一步包含人類介白素-6 (IL-6)。 179.如實施例177至178之方法，其中該細胞培養基包含各自在介於約10 ng/mL至約1000 ng/mL範圍內之濃度下之血小板生成素(Tpo)、Flt3配體(Flt-3L)及人類幹細胞因子(SCF)。 180.如實施例179之方法，其中該細胞培養基包含各自在約50 ng/mL濃度下，例如在50 ng/mL濃度下之血小板生成素(Tpo)、Flt3配體(Flt-3L)及人類幹細胞因子(SCF)。 181.如實施例178至180中任一項之方法，其中該細胞培養基包含在介於約10 ng/mL至約1000 ng/mL範圍內之濃度下之人類介白素-6 (IL-6)。 182.如實施例181之方法，其中該細胞培養基包含在約50 ng/mL濃度下，例如在50 ng/mL濃度下之人類介白素-6 (IL-6)。 183.如實施例173至182中任一項之方法，其中該細胞培養基包含在介於約1 nM至約1 mM範圍內之濃度下之幹細胞擴增劑。 184.如實施例183之方法，其中該細胞培養基包含在介於約1 μM至約100 nM範圍內之濃度下之幹細胞擴增劑。 185.如實施例184之方法，其中該細胞培養基包含在介於約500 nM至約750 nM範圍內之濃度下之幹細胞擴增劑。 186.如實施例185之方法，其中該細胞培養基包含在約500 nM濃度下，例如在500 nM濃度下之幹細胞擴增劑。 187.如實施例186之方法，其中該細胞培養基包含在約750 nM濃度下，例如在750 nM濃度下之幹細胞擴增劑。 188.如實施例173至187中任一項之方法，其中該培養步驟(b)包含在該引入步驟(c)之前之培養時間。 189.如實施例188之方法，其中在該引入步驟(c)之前之該培養時間為至少12小時，例如為約1天至約12天之時間，例如為約1天至約6天之時間，例如為約1天至約3天之時間，例如為約1天至約2天之時間，例如為約2天之時間或約1天之時間。 190.如實施例173至189中任一項之方法，其中該培養步驟(b)包含在該引入步驟(c)之後之培養時間。 191.如實施例190之方法，其中在該引入步驟(c)之後之該培養時間為至少12小時，例如為約1天至約12天之時間，例如為約1天至約6天之時間，例如為約2天至約4天之時間，例如為約2天之時間或為約3天之時間或為約4天之時間。 192.如實施例173至191中任一項之方法，其中該細胞群體例如相對於未根據步驟(b)培養之細胞擴增至少4倍，例如至少5倍、例如至少10倍。 193.如實施例173至192中任一項之方法，其中該引入步驟(c)包含電穿孔。 194.如實施例193之方法，其中該電穿孔包含1至5個脈衝，例如1個脈衝，且其中各脈衝在介於700伏至2000伏範圍內之脈衝電壓下且具有介於10 ms至100 ms範圍內之脈衝持續時間。 195.如實施例194之方法，其中該電穿孔包含1個脈衝。 196.如實施例194至195中任一項之方法，其中該脈衝電壓介於1500至1900伏範圍內，例如為1700伏。 197.如實施例194至196中任一項之方法，其中該脈衝持續時間介於10 ms至40 ms範圍內，例如為20 ms。 198.如實施例173至197中任一項之方法，其中步驟(a)中提供之細胞(例如細胞群體)為人類細胞(例如人類細胞群體)。 199.如實施例198之方法，其中步驟(a)中提供之細胞(例如細胞群體)係自骨髓、末梢血液(例如移動的末梢血液)或臍帶血分離。 200.如實施例199之方法，其中 (i)步驟(a)中提供之細胞(例如細胞群體)係自骨髓分離，例如自患有血色素異常症之患者之骨髓分離，視情況其中該血色素異常症為鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，視情況其中該地中海型貧血為β地中海型貧血；或 (ii)步驟(a)中提供之細胞(例如細胞群體)係自末梢血液分離，例如自患有血色素異常症之患者之末梢血液分離，視情況其中該血色素異常症為鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，視情況其中該地中海型貧血為β地中海型貧血；視情況其中該末梢血液為移動的末梢血液，視情況其中該移動的末梢血液為使用普樂沙福(Plerixafor)、G-CSF或其組合來移動。 201.如實施例173至200中任一項之方法，其中步驟(a)中提供之該細胞群體之CD34+細胞經增濃。 202.如實施例173至201中任一項之方法，其中在該引入步驟(c)之後，低溫保存該細胞(例如細胞群體)。 203.如實施例173至202中任一項之方法，其中在該引入步驟(c)之後，該細胞(例如細胞群體)包含： a)在與該第一gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近的插入缺失；及/或 b)包含序列之缺失，例如同HBG1啟動子區中之第一gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之第一gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列，視情況其中該插入缺失，例如缺失，不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸。 204.如實施例173至203中任一項之方法，其中在該引入步驟(c)之後，該細胞群體中之至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之細胞在與該第一gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近包含插入缺失，視情況其中該群體中無細胞包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失。 205.一種細胞(例如細胞群體)，其可藉由如實施例173至204中任一項之方法獲得。 206.一種治療血色素異常症之方法，其包含向人類患者投與組合物，組合物包含如實施例134至156中任一項之細胞、如實施例157至167中任一項之細胞群體或如實施例205之細胞(例如細胞群體)。 207.一種增加人類患者中之胎兒血色素表現之方法，其包含向該人類患者投與組合物，該組合物包含如實施例134至156中任一項之細胞、如實施例157至167中任一項之細胞群體或如實施例205之細胞(例如細胞群體)。 208.如實施例206之方法，其中該血色素異常症為β-地中海型貧血或鐮狀細胞疾病。 209.如實施例206至208中任一項之方法，其中向該人類患者投與組合物，該組合物包含至少約1e6個如實施例205之細胞/公斤該人類患者體重，例如至少約1e6個如實施例205之CD34+細胞/公斤該人類患者體重。 210.如實施例209之方法，其中向該人類患者投與組合物，該組合物包含至少約2e6個如實施例205之細胞/公斤該人類患者體重，例如至少約2e6個如實施例205之CD34+細胞/公斤該人類患者體重。 211.如實施例209之方法，其中向該人類患者投與組合物，該組合物包含約2e6至約10e6個如實施例205之細胞/公斤該人類患者體重，例如至少約2e6至約10e6個如實施例205之CD34+細胞/公斤該人類患者體重。 212.如實施例1至86中任一項之gRNA分子、如實施例87至114或168至169中任一項之組合物、如實施例105至112中任一項之核酸、如實施例113至114中任一項之載體、如實施例134至156或205中任一項之細胞或如實施例157至167中任一項之細胞群體，其用作藥物。 213.如實施例1至86中任一項之gRNA分子、如實施例87至114或168至169中任一項之組合物、如實施例105至112中任一項之核酸、如實施例113至114中任一項之載體、如實施例134至156或205中任一項之細胞或如實施例157至167中任一項之細胞群體，其用於製造藥物。 214.如實施例1至86中任一項之gRNA分子、如實施例87至114或168至169中任一項之組合物、如實施例105至112中任一項之核酸、如實施例113至114中任一項之載體、如實施例134至156或205中任一項之細胞或如實施例157至167中任一項之細胞群體，其用於治療疾病。 215.如實施例1至86中任一項之gRNA分子、如實施例87至114或168至169中任一項之組合物、如實施例105至112中任一項之核酸、如實施例113至114中任一項之載體、如實施例134至156或205中任一項之細胞或如實施例157至167中任一項之細胞群體，其用於治療疾病，其中該疾病為血色素異常症。 216.如實施例1至86中任一項之gRNA分子、如實施例87至114或168至169中任一項之組合物、如實施例105至112中任一項之核酸、如實施例113至114中任一項之載體、如實施例134至156或205中任一項之細胞或如實施例157至167中任一項之細胞群體，其用於治療疾病，其中該血色素異常症為β-地中海型貧血或鐮狀細胞疾病。實例 實例1，例示性一般方法引導選擇及設計 使用人類參考基因組及所關注區基因體(例如基因、基因之外顯子、非編碼調節區等)限定之使用者來電腦進行初始引導選擇，以用於鑑別該所關注區中之PAM。對於各經鑑別之PAM，進行分析且報導統計資料。進一步選擇gRNA分子，且基於用於測定效率及效果之例如如本文中所描述之多種方法來分級排序。此實例提供可用於分析本文中所描述之本發明之CRISPR系統、gRNA及其他態樣之步驟的實驗詳情。在該實例中提到在特定實驗中採用之對此等一般步驟的任何修改。 在實例中，在以下實驗中，使用sgRNA分子或dgRNA分子。除非另外指示，否則當使用dgRNA分子時，gRNA包括以下： crRNA：[靶向域]-[SEQ ID NO: 201] tracr (trRNA)：SEQ ID NO: 224 除非另外指示，否則在採用sgRNA分子之實驗中，使用以下序列： [靶向域]-[SEQ ID NO: 195]-UUUU用於靶向裂解效率及插入缺失形成之下一代定序 ( NGS ) 及分析 為了測定基因體中之目標部位處之編輯(例如裂解)效率，使用深度定序來鑑別藉由非同源末端接合之插入及缺失的存在。 總之，圍繞靶位點設計PCR引子，且在經編輯及未經編輯樣本中對所關注之基因體區域進行PCR擴增。將所得擴增子轉化成Illumina定序文庫，且進行定序。將定序讀段與人類基因體參考進行比對，且與變體進行比對，稱為允許吾人測定序列變體及其在所關注之目標區處之頻率的分析。資料經受各種品質過濾器，且排除已知變體或僅在未經編輯樣本中鑑別之變體。編輯百分比定義為在所關注之靶向位點處發生之所有插入或缺失事件(亦即，靶向位點處之插入及缺失讀段)相對於靶向位點處之總讀段(野生型及突變讀段)數的百分比。NGS分析方法之詳細描述描述於實例2.1中。RNP 產生 向Cas9蛋白添加crRNA及trRNA使得形成活性Cas9核糖核蛋白複合物(RNP)，該活性Cas9核糖核蛋白複合物介導與由crRNA指定之目標區結合及所靶向基因體DNA之特異性裂解。藉由將trRNA及crRNA負載至Cas9中來形成此複合物，此被認為造成Cas9之構形改變，從而允許其結合dsDNA及裂解dsDNA。 使crRNA及trRNA分別地在95℃下變性2分鐘，且使其降至室溫。向5× CCE緩衝液(20 mM HEPES，100 mM KCL，5 mM MgCl2 ，1 mM DTT，5%甘油)中添加Cas9蛋白(10 mg/ml)，接著向其中添加trRNA及各種crRNA(在獨立反應中)且在37℃下培育10分鐘，從而形成活性RNP複合物。藉由電穿孔及其他方法將複合物遞送至廣泛多種細胞中，包括HEK-293及CD34+造血細胞。將 RNP 遞送至 CD34 + HSC 將Cas9 RNP遞送至CD34+ HSC中。 將CD34+ HSC解凍，且在添加有IL12、SCF、TPO、Flt3L及青黴素/鏈黴素(Pen/Strep)之StemSpan SFEM (StemCell Technologies)介質中培養(在~500,000個細胞/毫升下)隔夜。對於每各RNP遞送反應，等分大致90,000個細胞且集結。接著，將細胞再懸浮於60 μl P3核轉染緩衝液(Lonza)中，隨後向其中添加活性RNP。接著對HSC進行電穿孔(例如使用Lonza核轉染上之程式CA-137進行核轉染)重複三次(20 μL/電穿孔)。緊隨電穿孔，向培養至少24小時之HSC中添加StemSpan SFEM介質(具有IL12、SCF、TPO、Flt3L及Pen/Strep)。接著，收集HSC，且使其經受T7E1、NGS及/或表面標記表現分析。HSC 功能性分析 可使用諸如流式細胞測量術或活體外群落形成分析之已知技術來分析CD34+ HSC之幹細胞表型。藉助於實例，藉由活體外群落形成分析(CFC)使用Methocult H4034最佳試劑盒(StemCell Technologies)使用製造商方案來分析細胞。簡言之，向1-1.25 ml methocult中添加呈＜=100 μl體積之500-2000個CD34+細胞。將混合物劇烈地渦動4-5秒以充分混合，接著在室溫下靜置至少5分鐘。使用注射器，將1-1.25 ml之MethoCult + 細胞轉移至35 mm皿或6孔盤之孔中。在12-14天之後按照製造商方案評定群落數目及形態。活體內異種移植 HSC在功能上藉由其自我更新及多譜系分化之能力來定義。此功能性僅可在活體內評定。用於測定人類HSC功能之黃金標準為經由異種移植至NOD-SCID γ小鼠(NSG)中，該小鼠經由一系列突變而嚴重免疫功能不全且因此可充當人類細胞之接受者。將編輯後之HSC移植至NSG小鼠中以驗證所誘導編輯並不影響HSC功能。定期末梢血液分析用於評定人類嵌合及譜系發育，且20週後之二級移植用於確定功能性HSC之存在，如在此等實例中更充分地描述。實例 2 . 1 使用CRISPR-Cas9在造血幹細胞及祖細胞(HSPC)中之非缺失型HPFH區編輯，以用於解除成年紅血球系細胞中之胎兒血球蛋白表現之抑制方法： 人類CD34+ 細胞培養。使用免疫選擇(Miltenyi)根據製造商說明書自來自成年供體之G-CSF移動的末梢血液(AllCells)分離人類CD34+細胞，且使用StemSpan SFEM (StemCell Technologies；目錄號09650)使其擴增4至6天，該StemSpan SFEM補充有各自50 ng/mL下之血小板生成素(Tpo，Life Technologies，目錄號PHC9514)、Flt3配體(Flt-3L，Life Technologies，目錄號PHC9413)、人類幹細胞因子(SCF，Life Technologies，目錄號PHC2113)及人類介白素-6 (IL-6，Life Technologies，目錄號PHC0063)以及1×抗生素/抗黴菌素(Gibco，目錄號10378-016)與500 nM 化合物4。在此實例(包括其子實例)中，在方案指示對細胞進行「擴增」時，使用此介質。在此實例(包括其子實例)中，此介質亦稱為「幹細胞擴增介質」或「擴增介質」。 組裝Cas9與引導RNA核糖核蛋白(RNP)複合物，製備HSPC，且將RNP電穿孔至HSPC中。緊接著在電穿孔之前製備Cas9-引導RNA核糖核蛋白複合物(RNP)。為了使用雙引導RNA (dgRNA)形成RNP，使6 µg各crRNA (4.5 µL)及tracr (2.52 µL)首先在獨立管中在95℃下變性2 min，且接著冷卻至室溫。對於Cas9蛋白之製備，使12 µg Cas9蛋白(2 µL)與1 µL 10 × CCE緩衝液(20 mM HEPES，100 mM KCL，5 mM MgCl2 ，5%甘油及新鮮添加之1 mM DTT)混合。首先使Tracr與Cas9製劑混合，且在37℃下培育5 min。接著，向Tracr/CAS9複合物中添加crRNA，且在37℃下培育5 min。對於無/對照條件，向Tracr/CAS9複合物中添加媒介物而不是crRNA。藉由離心採集HSPC，且以2.8 × 106 /mL之細胞密度再懸浮於與隨附Lonza電穿孔試劑盒(目錄號V4XP-3032 Lonza Amaxa P3初級細胞4-D核轉染X試劑盒)的P3緩衝液+補充物中。藉由向上及向下吸液而使RNP與40 µL細胞混合，且在RT下培育2 min。對於各複製，將21 µL RNP/細胞混合物轉移至Lonza Amaxa P3初級細胞4-D核轉染X試劑盒中。利用Lonza轉染系統(4D-核轉染X單元)使用方案CM-137進行電穿孔。重複進行兩次21 µL電穿孔。 活體外紅血球生成及含有HbF之紅血球系細胞之FACS分析。在電穿孔之後，緊接著將細胞轉移至250 µL預溫熱紅血球系分化培養基(EDM)中，該紅血球系分化培養基由以下組成：IMDM (GE Life Sciences，目錄號SH30228.01)、330 µg/mL人類全運鐵蛋白(Invitria，目錄號777TRF029)、10 µg/mL重組人類胰島素(Gibco，目錄號A1138211)、2 IU/mL肝素(Sigma，部分#H3393)、5%人類AB血清(Sigma，目錄號H4522)、2.5 U/mL人類紅血球生成素(Peprotech，#100-064)及1×抗生素/抗黴菌素(Gibco，目錄號10378-016)。在初始培養時間直至第7天期間，對EDM進一步補充1.38 µM氫皮質酮(Sigma H8672)、100 ng/mL人類SCF (Life Technologies，目錄號PHC2113)及5 ng/mL人類IL-3 (Peprotech #10779-598)以製備EDM-I。在4天之後，在新鮮介質中稀釋細胞培養物。在上文所描述之培養條件下保持培養物總共7天，此時藉由胞內HbF表現染色來分析一半細胞。簡言之，用PBS洗滌細胞一次，再懸浮於LIVE/DEAD®可固定紫色死亡的細胞染色(ThermoFisher L34963；1:1000於PBS中)中，且培育30 min。接著洗滌細胞，用抗CD71-BV711 (Fisher Scientific Company Llc. BD 563767)及抗CD235a-APC (BD 551336)抗體之1/50稀釋液染色30 min。接著洗滌細胞，隨後用固定緩衝液(Biolegend，目錄號420801)固定，且用1×胞內染色滲透洗滌緩衝液(Biolegend，目錄號421002)根據製造商說明書進行滲透。接著使細胞與抗HbF-PE抗體(Life Technologies，部分#MHFH04)於50 µL 1×胞內染色滲透洗滌緩衝液中之1/40稀釋液一起在室溫下培育20 min。用0.2 mL 1×胞內染色滲透洗滌緩衝液洗滌細胞兩次，且再懸浮於染色緩衝液中，且在LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)上分析HbF表現。使用Flowjo分析結果，且資料呈現為活CD71陽性紅血球系細胞群體中之HbF陽性細胞(F細胞)%。 自殘餘第7天，將所培養80,000個細胞/條件轉移至EDM-II培養介質中以進行進一步分化直至第11天為止。EDM-II由僅補充有100 ng/mL SCF之EDM-I組成。在第11天，對細胞進行計數，且將200,000個細胞/條件轉移至不具有其他補充物之EDM中。在第14天，類似於第7天但自染色排除表面標記以防止細胞聚集，對細胞進行染色以用於分析HbF表現。 基因體DNA製備及下一代定序(NGS)。由在電穿孔後7天時之經編輯及未經編輯HSPC使用快速提取DNA提取溶液(Epicentre，目錄號QE09050)製備基因體DNA。為了測定編輯效率及插入與缺失(插入缺失)之圖案，使用引子側接靶位點產生PCR產物，其接著經受如文獻中所描述之下一代定序(NGS)。未經編輯樣本(僅用由Cas9與Tracr組成之RNP電穿孔)中之對應序列之編輯百分比通常小於1%但從不超過3%。 NGS文庫製備及擴增子之定序。使用1.8x Agencourt AmpureXP珠粒(Beckman Coulter)根據製造商建議來純化PCR擴增子。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析(Life Technologies)根據製造商建議來定量擴增子。使用Nextera DNA文庫製備型試劑盒(Illumina)根據具有以下改變之製造商建議來產生Illumina定序文庫。在最終5 μl體積中使用5 ng經純化PCR產物、0.15 μl Nextera標籤酶及先前由Wang等人(PMID：24071908；其以引用之方式併入本文中)所描述之標籤化緩衝液來進行標籤化。接著，以最終50 μl體積使用0.2 mM dNTP (Life Technologies)之最終濃度、0.2 μM Illumina指標PCR引子(Integrated DNA Technologies)、1× Phusion DNA聚合酶緩衝液(New England Biolabs)及1 U之Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs)來對經標籤化擴增子進行PCR擴增。所使用之PCR循環條件如下：72℃下3 min；98℃下2 min；及98℃下10 sec，63℃下30 sec及72℃下3 min，15個循環。接著使用1.0x Agencourt AmpureXP珠粒(Beckman Coulter)根據製造商建議來純化定序文庫。使用Quant-iT PicoGreen dsDNA分析(Life Technologies)根據製造商建議來定量定序文庫，且等莫耳合併以用於定序。用MiSeq定序器上之150個鹼基配對末端讀段根據製造商建議(Illumina)來對定序文庫進行定序。每擴增子產生最小1000倍定序覆蓋。NGS定序資料QC及變體分析。使用預設參數，Illumina MiSeq分析軟體(MiSeq reporter，版本2.6.2，Illumina)用於產生擴增子特異性FASTQ定序資料檔案(Cock等人, Nucleic Acids Res. 2010, 38(6):1767-71, PMID：20015970)。接著，經由由一系列使用標準Perl指令碼包裝而接合在一起之公共領域套裝軟體組成之內部研發的變體分析管線來處理FASTQ檔案。所使用之工作流程分成五個階段。階段1，PCR引子及靶向與脫靶序列QC：對於靶向位點及脫靶位點兩者，使用BLAST檢索(版本2.2.29+，Altschul等人, J Mol Biol., 1990, 215(3):403-10, PMID: 2231712)，將20個核苷酸gRNA靶向域序列+PAM序列及靶向特異性PCR引子序列(左側及右側不具有額外Illumina序列)與人類基因體參考序列(建構GRCh38)進行比對。標記具有多個基因體位置之靶向位點及脫靶位點。 階段2，定序器檔案解壓：使用gzip指令碼(版本1.3.12)，將Illumina定序器產生之FASTQ.GZ檔案解壓至FASTQ檔案，且計算每檔案之讀段數目。進一步分析排除不具有讀段之檔案。 階段3，序列讀段比對及品質修整：使用BWA-MEM aligner (版本0.7.4-r385，Li及Durbin, Bioinformatics, 2009, 25(14):1754-60, PMID: 19451168)，使用『硬限幅』以修整Illumina序列及低品質鹼基讀段之3'末端，將FASTQ檔案中之定序讀段與人類基因體參考序列(建構GRCh38)進行比對。使用SAMtools指令碼(版本0.1.19-44428cd，Li等人, Bioinformatics, 2009 25(16):2078-9, PMID: 19505943)，將所得呈BAM檔案格式之經比對讀段(Li等人, Bioinformatics, 2009 25(16):2078-9, PMID: 19505943)轉化成FASTQ檔案。接著，使用BWA-MEM aligner，此次不具有『硬限幅』，將FASTQ檔案與人類基因體參考序列(建構GRCh38)進行再次比對。 階段4，變體(SNP及插入缺失)分析：使用VarDict變體caller (版本1.0 ，由開發者修改之『Cas9感知』，ZhongWu Lai，Lai等人, Nucleic Acids Res., 2016, 44(11):e108, PMID: 27060149)來處理經比對讀段之BAM檔案，其中對偶基因頻率偵測極限設置為＞=0.0001以鑑別變體(SNP及插入缺失)。Cas9感知VarDict呼叫者(Cas9 aware VarDict caller)係基於公共領域封裝但能夠移動不明確的變體呼叫，由於朝向位於PAM序列5'之3個鹼基之gRNA靶向域序列中之潛在Cas9核酸酶剪切位點的變體事件的比對區中的重複序列而產生。SAMtools指令碼用於計算讀段覆蓋/樣本擴增子，以測定靶向位點及脫靶位點是否以＞1000倍序列覆蓋而覆蓋。標記具有＜1000倍序列覆蓋之位點。 階段5，dbSNP過濾及經處理/未處理差異分析：對所鑑別變體過濾dbSNP (建構142，Shery等人, Nucleic Acids Res. 2001, 29(1):308-11, PMID: 11125122)中發現之已知變體(SNP及插入缺失)。對經處理樣本中之變體進行進一步過濾以排除：1)未經編輯對照樣本中之所鑑別變體；2)具有2:1之VarDict鏈偏差之變體(其中對支撐參考序列之正向及反向讀段計數進行平衡，但不對非參考變體呼叫進行平衡)；3)位於潛在Cas9剪切位點之任一側＞5 bp的變體；4)單核苷酸變體。 結果：吾人在此處已展示以下之出人意料結果，HBG1或HBG2啟動子區域內之特異性序列(例如藉由在彼等序列處或附近產生之插入缺失)之靶向破壞減輕γ血球蛋白表現之抑制，從而允許製造含有提高的HbF蛋白質之紅血球(表現胎兒血色素之細胞在本文中有時稱為「F細胞」。HbF提高防止紅血球在脫氧條件下鐮狀化，且對於患有β-地中海型貧血及SCD兩者之患者為治療性/治癒性的。此處，將用來自SCD患者之經編輯HSC之離體基因體的自體造血幹細胞移植(HSCT)亦與幹細胞擴增增強技術組合，例如，例如如WO2010/059401 (其內容以全文引用之方式併入)中所描述之芳基烴受體(AHR)抑制劑，例如化合物4，以改良離體擴增且增加所遞送之經基因修飾HSC的劑量。 對於經由可程式化核酸酶Cas9編輯之有效基因體，將引導RNA (gRNA)及Cas9蛋白成功遞送至靶細胞及組織中為必需的。此處，吾人展示，藉由電穿孔遞送預複合gRNA/Cas9核糖核蛋白(RNP)複合物，幾乎緊接地在遞送之後產生有效及特異性的基因體編輯，且在細胞中降解，從而降低脫靶效果。相比之下，使用用於遞送Cas9之質體及病毒載體系統使得可加重與系統相關之脫靶效果之酶的表現延長。另外，將RNP遞送至靶細胞中不需要額外工具，此將極大地有利於在臨床中出於治療性目的而編輯之基因體的轉譯。 自大腸桿菌純化重組化膿性鏈球菌Cas9蛋白(SEQ ID NO: 236)，且將其與合成的由crRNA及tracr組成之雙gRNA (dgRNA)複合，產生核糖核蛋白(RNP)複合物。研究中使用之gRNA靶向域之清單及序列展示於表1中。大部分gRNA序列在HBG1及HBG2啟動子區域兩者中具有完美的靶標或僅具有1或2個錯配。此情形係由於HBG基因在人類β血球蛋白基因座內之複製。經由如以下材料及方法所描述之電穿孔，將RNP複合物電穿孔至CD34+ HSPC中。在遞送RNP複合物之前，對細胞進行擴增。在不受理論束縛之情況下，活性分裂細胞可便於攝取由電穿孔遞送之RNP複合物。 表4.目前研究中使用之靶向HBG1及HBG2啟動子區之gRNA之清單。所有gRNA分子均以上文所描述之dgRNA形式重複測試兩次。 使用與螢光染料結合之抗體，藉由流式細胞測量術來分析經基因體編輯及未經編輯HSPC之胎兒血球蛋白及紅血球系細胞表面標記運鐵蛋白受體(CD71)的表現量。對活細胞進行鑑別且藉由排除活死紫(Live Dead Violet)進行閘控。基因體編輯不會不利地影響紅血球系分化，如培養細胞展示CD71+細胞之百分比與類似於來經編輯細胞之紅血球母細胞一致。相比於在電穿孔後第7天之模擬電穿孔細胞(16.9%)，將此等gRNA RNP遞送至HSPC產生增加百分比的含有HbF之子代紅血球系細胞(高達62.75%) (表4)。在第14天之額外HbF誘導含量評估確認對於最佳效能的dgRNA序列之高誘導含量(表4)，但相比於第7天，對照中偵測到之背景HbF含量更高。亦平行觀測藉由包括靶向BCL11A之外顯子2之g8之靶向域的dgRNA對HbF陽性細胞的誘導，且對於HBG1或HBG2區的若干gRNA比g8產生更高的F細胞含量%。來自在電穿孔後第7天分離之HBG1及HBG2啟動子區之基因體DNA之PCR產物亦經受下一代定序(NGS)，以測定細胞群體中之經編輯對偶基因的百分比。在許多用含有Cas9、具有既定靶向域之crRNA及Tracr之RNP電穿孔之細胞培養物中觀測到HBG1及HBG2啟動子區處之高基因體編輯百分比(表4，圖1)，但在不具有所遞送靶向域(僅含有Cas9及Tracr之RNP)之對照細胞中未觀測到。特定言之，在第7天產生比模擬轉染對照背景高17% HbF+細胞之dgRNA處理在HBG1或HBG2靶標基因座上具有5.92%至77.84%範圍的經編輯對偶基因(表4、圖2及圖3)。對於HBG1或HBG2啟動子區域具有選擇性特異性之一些引導物展示在具有特異性之基因座處較佳的編輯(例如GCR-0001、GCR-0011及GCR-0012更有效地編輯HBG1，且GCR-0034、GCR-0046、GCR-0051、GCR-0052、GCR-0054及GCR-0058更有效地編輯HBG2)。此相關性中一個顯著且出人意料的例外為GCR-0008，其儘管對HBG1基因座之靶標序列具有特異性，但有效地編輯HBG1及HBG2基因座兩者以及產生高HbF誘導。GCR-0008與HBG2基因座中之靶標序列具有單一錯配，表明在此位點處發生有效脫靶編輯。所測試72個gRNA中之一些之靶標序列定位至重疊與遺傳胎兒血色素持久性(HPFH)表現相關之若干標註之人類突變或附近的區，以及定位至HBG1及HBG2兩者的近端啟動子區域中的轉錄因子的已知結合位點(圖4及圖5)。出人意料地，最佳效能的gRNA集群靶向HBG1及HBG2基因中起作用之此等已知啟動子區域外部的序列(例如分別地定位至chr11:5,250,094-5,250,237，hg38及chr11:5,255,022-5,255,164，hg38 (圖4及圖5))。此等gRNA包括GCR-0001、GCR-0006、GCR-0008、GCR-0009、GCR-0010、GCR-0011、GCR-0012、GCR-0034、GCR-0046、GCR-0048、GCR-0051、GCR-0054、GCR-0058及GCR-0067。另一良好效能gRNA (GCR-0028)靶向HBG1及HBG2兩者之不與非缺失型HPFH突變相關之近端啟動子區域中之轉錄因子結合位點(TATA盒) (分別地chr11: 5,249,833-5,249,927，hg38 及chr11: 5,254,738-5,254,851，hg38 (圖4及圖5))。實例 2 . 2 ：使用具有sgRNA形式之CRISPR-Cas9在所選擇位點處之評估，用於解除成年紅血球系細胞中之胎兒血球蛋白表現之抑制的HSPC中的γ血球蛋白啟動子區編輯方法： 方法如實例2.1中的，其中具有以下修改。 人類CD34+ 細胞培養。人類CD34+細胞衍生自成年健康供體骨髓(Lonza目錄號2M-101D)。將細胞解凍，接著擴增6天。 組裝Cas9與引導RNA核糖核蛋白(RNP)複合物，製備HSPC，且將RNP電穿孔至HSPC中。為了使用單一引導RNA (sgRNA)形成RNP，使12 µg各sgRNA、12 µg Cas9蛋白及1 µL 10 × CCE緩衝液(20 mM HEPES、100 mM KCL、5 mM MgCl2 、5%甘油及新鮮添加之1 mM DTT)在10 μl總體積中合併，接著在37℃下培育5 min。對於無/對照條件，添加媒介物而不是sgRNA。P3緩衝液+補充物中之細胞密度為3.9 × 106 /mL。 活體外紅血球生成及含有HbF之紅血球系細胞之FACS分析。在第11天，將細胞轉移至不具有其他補充物之EDM中。在第14天及第18天，使細胞集結，且再懸浮於不具有其他補充物之新鮮EDM中。獲取等分試樣細胞以用於分析在第14天及第21天之HbF表現。類似於第7天，對細胞進行染色，但自染色排除表面標記以防止細胞聚集，且抗HbF抗體以1:20稀釋使用。 基因體DNA製備及下一代定序(NGS)。使用快速提取DNA提取溶液(Epicentre，目錄號QE09050)，由在電穿孔後3天之經編輯及未經編輯HSPC來製備基因體DNA。下文所描述之NGS分析展示在用單獨Cas9電穿孔之對照樣本中無顯著編輯。 如實例2.1中所描述進行NGS文庫製備及擴增子之定序。如實例2.1中所描述進行NGS定序資料QC及變體分析。 結果：吾人在此處已展示，靶向破壞HBG1或HBG2啟動子區域內之導致產生F細胞之特異性序列亦可藉由利用sgRNA形式之gRNA來實現。 表5.目前研究中使用之靶向HBG1及HBG2啟動子區中選擇gRNA之清單。所有gRNA分子以上文所描述之sgRNA形式重複測試兩次。 用由重組化膿性鏈球菌Cas9蛋白(SEQ ID NO: 236)及sgRNA形式之所指示gRNA形成之RNP複合物電穿孔成年骨髓衍生之HSPC。使用與螢光染料結合之抗體，藉由流式細胞測量術來分析所得經基因體編輯及未經編輯HSPC之胎兒血球蛋白及紅血球系細胞表面標記運鐵蛋白受體(CD71)的表現量。對活細胞進行鑑別且藉由排除活死紫(Live Dead Violet)進行閘控。相比於在電穿孔後第7天之模擬電穿孔細胞(39.0%)，將此等gRNA RNP遞送至HSPC產生增加百分比的含有HbF之子代紅血球系細胞(高達74.6%) (表5)。在第14天及第21天之額外HbF誘導含量評估確認對於最佳效能的sgRNA序列之高誘導含量(表5)。來自在電穿孔後第3天分離之HBG1及HBG2啟動子區之基因體DNA之PCR產物亦經受下一代定序(NGS)，以測定細胞群體中之經編輯對偶基因的百分比。在許多用含有Cas9及具有既定靶向域之sgRNA之RNP電穿孔之細胞培養物中觀測到HBG1及HBG2啟動子區處之高基因體編輯百分比(排除大型缺失) (表5)，但在不具有所遞送sgRNA (僅Cas9)之對照細胞中未觀測到。 此研究中包括選擇在實例2.1中在第7天HbF+紅血球系細胞增加＞17%之靶向位點。該實驗設計以兩個顯著方式不同於實例2.1中先前所描述之設計：gRNA形式(sgRNA而不是dgRNA)，及HSPC來源(不同供體及骨髓衍生的，而不是移動的末梢血液衍生的)。在不受理論束縛之情況下，研究之間的未經編輯細胞培養物中之HbF+細胞之基線百分比之差異可能由HSPC來源之間的固有差異引起。儘管存在此等差異，除GCR-47之外之所有靶向位點仍與在第7天之HbF+紅血球系細胞增加＞17%相關(圖7)。對於GCR-0067，此增加維持至第21天(圖7)。另外，在GCR-0008、GCR-0048、GCR-0051、GCR-0053、GCR-0063及GCR-0067中觀測到HBG1、HBG2或兩者處之＞25%之插入缺失形成(表5)。如同dgRNA形式(表4)，呈sgRNA形式之GCR-0008與在靶向HBG1位點及脫靶HBG2位點兩者處之有效編輯相關(表5)。未測定此研究中之GCR-0047中之較低HbF+細胞誘導是否與降低的編輯相關。值得注意的是，第7天及第14天之＞17%之HbF+細胞誘導與在HBG1及HBG2基因中起作用之已知啟動子區域外部之靶向序列相關(例如分別地定位至chr11:5,250,094-5,250,237，hg38及chr11:5,255,022-5,255,164，hg38 (圖4及圖5))，具體言之GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051、GCR-0054及GCR-0067 (圖7)。在此等中，GCR-0008、GCR-0048及GCR-0067在第21天之HbF+細胞亦增加＞10%，且在HBG1、HBG2或兩者處之插入缺失＞25%(表5及圖7)。實例 2 . 3 ：使用具有sgRNA形式之CRISPR-Cas9之編輯圖案之額外分析，用於解除成年紅血球系細胞中之胎兒血球蛋白表現之抑制的HSPC中的γ血球蛋白啟動子區編輯 方法： 方法如實例2.1中的，其中具有以下修改。 人類CD34+ 細胞培養。人類CD34+細胞衍生自來自成年健康供體(Lonza目錄號2M-101D及Hemacare目錄號BM34-C)之骨髓。將細胞解凍，接著擴增6天。 組裝Cas9與引導RNA核糖核蛋白(RNP)複合物，製備HSPC，且將RNP電穿孔至HSPC中。為了使用單一引導RNA (sgRNA)形成RNP，使12 µg各sgRNA、12 µg Cas9蛋白及1 µL 10 × CCE緩衝液(20 mM HEPES、100 mM KCL、5 mM MgCl2 、5%甘油及新鮮添加之1 mM DTT)在10 μl總體積中合併，接著在37℃下培育5 min。對於無/對照條件，添加媒介物而不是sgRNA。P3緩衝液+補充物中之細胞密度為3.9 × 106 /mL。 活體外紅血球生成及含有HbF之紅血球系細胞之FACS分析。在第11天，將細胞轉移至不具有其他補充物之EDM中。在第14天及第18天，使細胞集結，且再懸浮於不具有其他補充物之新鮮EDM中。獲取等分試樣細胞以用於分析在第14天及第21天之HbF表現。類似於第7天，對細胞進行染色，但自染色排除表面標記以防止細胞聚集，且抗HbF抗體以1:20稀釋使用。 基因體DNA製備及下一代定序(NGS)。使用快速提取DNA提取溶液(Epicentre，目錄號QE09050)，由在電穿孔後3天之經編輯及未經編輯HSPC來製備基因體DNA。下文所描述之NGS分析展示在用單獨Cas9電穿孔之對照樣本中無顯著編輯。 如實例2.1中所描述進行NGS文庫製備及擴增子之定序。如實例2.1中所描述進行NGS定序資料QC及變體分析。 用於偵測倒位及大型缺失之非定量PCR。以下引子組用於擴增HBG1及HBG2之區中之gDNA。P1：正向引子5'-TGCTGAGATGAAACAGGCGT-3' (SEQ ID NO: 257)、反向引子5'-TTAGGCATCCACAAGGGCTG-3' (SEQ ID NO:258)、HBG1與HBG2靶向/脫靶位點之間的缺失之預期~2.8 kb產物、HBG1與HBG2靶向/脫靶位點之間的倒位之預期~7.7 kb產物、無大型缺失或倒位(單獨地，未經編輯的或HBG1及/或HBG2靶向/脫靶位點處之較小插入缺失)之預期~7.7 kb產物。P2：正向引子5'-GCTCTACAAATGGAACCCAACC-3' (SEQ ID NO: 259)、反向引子5'-CTGCTCTGATCTCTAACACCTCA-3' (SEQ ID NO: 260)、HBG1與HBG2靶向/脫靶位點之間的缺失之預期無產物、HBG1與HBG2靶向/脫靶位點之間的倒位之預期無產物、無大型缺失或倒位(單獨地，未經編輯的或HBG1及/或HBG2靶向/脫靶位點處之較小插入缺失)之預期~3.8 kb產物。P3：正向引子5'-GAAGATACAGCTTGCCTCCGA-3' (SEQ ID NO: 261)、反向引子5'-TTGCTGAGATGAAACAGGCGT-3' (SEQ ID NO: 262)、HBG1與HBG2靶向/脫靶位點之間的缺失之預期無產物、HBG1與HBG2靶向/脫靶位點之間的倒位之預期~1.75 kb產物、無大型缺失或倒位(單獨地，未經編輯的或HBG1及/或HBG2靶向/脫靶位點處之較小插入缺失)之預期無產物。在瓊脂糖凝膠上連同含有0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、8及10 kb條帶之參考階梯來觀測PCR產物(L；New England Biolabs，目錄號N3232L)。選擇產物如所指示經分離，且經受如實例2.1中所描述之NGS。 大型缺失之定量。藉由數位液滴PCR (ddPCR)以複本數測定之非競爭性分析形式根據製造商建議，來定量HBG1及HBG2啟動子處之靶向位點之間的大型缺失。簡言之，將gDNA與探針之ddPCR超混合液(無dUTP) (BioRad，目錄號1863024)、HindIII-HF限制酶(NEB，目錄號R3104S)及各引子探針混合物組合，將其轉移至與探針之液滴產生油(BioRad，目錄號1863005)及用QX200液滴產生器(BioRad)產生之液滴一起之DG8柱。液滴在具有96深孔反應模組之C1000觸控熱循環器(BioRad)上經受PCR，隨後用QX200液滴讀取器(BioRad)偵測。藉由用QuantaSoft軟體(BioRad)之分析來測定每μl之複本。常規引子探針組(Life Technologies，目錄號APZW76R，PN4331348，正向引子：ACGGATAAGTAGATATTGAGGTAAGC (SEQ ID NO: 263)，反向引子：GTCTCTTTCAGTTAGCAGTGG (SEQ ID NO: 264)，FAM TaqMan探針：ACTGCGCTGAAACTGTGGCTTTATAG (SEQ ID NO: 265))用於擴增HBG1-HBG2基因間區內之gDNA。TaqMan複本數參考分析人類RNA酶P (Thermo Fisher，目錄號4403326)用作參考擴增子。HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl複本係在製造商報導的線性範圍內。百分比缺失報導為100%乘以1減去HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl之複本比率。未經編輯對照樣本具有2.4%之計算百分比缺失，其可反映分析中之背景。 結果：吾人在此處已展示，靶向破壞HBG1及HBG2啟動子區域內之導致產生F細胞之特異性序列與HBG1或HBG2靶向或脫靶位點處之插入缺失以及插入區之缺失與倒位兩者相關。擴增子之NGS分析確定此觀測。 表6.目前研究中用於編輯來自第一獨立供體之細胞之靶向HBG1及HBG2啟動子區的選擇gRNA的清單。所有gRNA分子以上文所描述之sgRNA形式重複測試兩次。 表7.目前研究中用於編輯來自第二獨立供體之細胞之靶向HBG1及HBG2啟動子區的選擇gRNA的清單。所有gRNA分子以上文所描述之sgRNA形式重複測試兩次。 用由重組化膿性鏈球菌Cas9蛋白 (SEQ ID NO: 236)與sgRNA形式之所指示gRNA形成之RNP複合物電穿孔來自2個獨立供體之成年骨髓衍生的HSPC。所評價sgRNA具有在HBG1及HBG2基因中起作用之已知啟動子區域外部之靶向序列(例如分別地，定位至chr11:5,250,094-5,250,237，hg38及chr11:5,255,022-5,255,164，hg38 (圖4及圖5))。使用與螢光染料結合之抗體，藉由流式細胞測量術來分析所得經基因體編輯及未經編輯HSPC之胎兒血球蛋白及紅血球系細胞表面標記運鐵蛋白受體(CD71)的表現量。對活細胞進行鑑別且藉由排除活死紫(Live Dead Violet)進行閘控。相比於在電穿孔後第7、14及21天之模擬電穿孔細胞，將此等gRNA RNP遞送至HSPC產生增加百分比的含有HbF的子代紅血球系細胞(表6及表7)。所有所包括的靶向位點與在所有時間點處第7、14及21天之來自兩個供體之HbF+紅血球系細胞增加＞17%相關(圖8)。來自在電穿孔後第3天分離之HBG1及HBG2啟動子區之基因體DNA之PCR產物亦經受下一代定序(NGS)，以測定細胞群體中之經編輯對偶基因的百分比。在來自用含有Cas9及具有靶向域GCR-0008、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067之sgRNA之RNP電穿孔的兩個供體的細胞培養物中觀測到HBG1及HBG2啟動子區兩者處之高基因體編輯百分比(53%至92%插入缺失) (表6及表7)，但在不具有所遞送sgRNA (僅Cas9)之對照細胞中未觀測到。靶向域GCR-0010與來自兩個供體之細胞培養物中之HBG1及HBG2啟動子區兩者處之降低的但相當大的編輯百分比(17%至28%插入缺失)相關；而GCR-0001與兩個供體中之相比於HBG2 (1%及1%)對HBG1 (59%及62%)處的有效及選擇性編輯相關(表6及表7)。 GCR-0048及GCR-0067靶向域在HBG1及HBG2兩者處存在，且其他靶向域在HBG1 (GCR-0001、GCR-0008及GCR-0010)或HBG2 (GCR-0051)處存在，其中在其他啟動子處具有潛在錯配脫靶位點。在HBG1及HBG2靶向/脫靶位點兩者處同時裂解具有產生插入4.9 kb基因體序列之缺失及/或倒位的潛力；本文中有時亦稱為『4.9 kb』或『HBG1-HBG2』或『大型』倒位或缺失。因此，一組三個不同PCR反應用於偵測具有此區之缺失或倒位之基因組的存在。設計P2反應，使得不具有HBG1-HBG2缺失或倒位之基因體序列將用所得3.8 kb產物進行擴增，而將不對具有HBG1-HBG2缺失或倒位之序列進行擴增。在所有樣本中偵測到大致此大小之條帶(圖9)，與各個別HBG1或HBG2靶向位點(表6及表7)處之較小插入缺失之偵測一致。設計P3反應，使得HBG1-HBG2反向的基因體序列將用所得1.7 kb產物進行擴增，而將不對不具有此倒位或具有/不具有HBG1-HBG2缺失之序列進行擴增。在用含有Cas9及具有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔的培養物中偵測到大致此大小之條帶，但在未經編輯對照培養物中為不可偵測的(圖9)。最終，P1反應設計成跨越HBG1及HBG2靶向區兩者，使得不具有HBG1-HBG2缺失之序列以及具有HBG1-HBG2區反向的彼等的擴增將均產生7.7 kb產物，而含有HBG1-HBG2缺失之序列之擴增將產生2.8 kb產物。實際上，未經編輯對照樣本具有在大致8 kb處之突出的上部條帶及在大致2.8 kb處之暗淡的潛在非特異性條帶。相比之下，用含有Cas9及具有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔的培養物具有在大致2.8 kb處之突出的條帶及在大致8 kb處之暗淡的條帶(圖9)。對來自用星號指示之各條帶之DNA進行分離，且使其經受下一代定序以確認其與所預測序列(具有或不具有HBG1-HBG2倒位或缺失，如所描述)之擴增的一致性。 對於跨越HBG1及HBG2編輯位點之區之進一步序列表徵，研發第四長程PCR條件(P4)以擴增包涵gRNA GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067之HBG1及HBG2編輯位點的6192 bp區。經基因體編輯之樣本之擴增產生兩個擴增子大小(1.2 kb及6.2 kb)，而未經編輯樣本僅產生一個擴增子大小(6.2 kb)。6.2 kb及1.2 kb擴增子之序列分析展示，1.2 kb擴增子為HBG1與HBG2剪切位點之間的4.9 kb缺失之結果，而6.2 kb擴增子由HBG1及HBG2編輯位點處之野生型及各種插入缺失對偶基因組成。定序分析亦展示低含量之HBG1與HBG2剪切位點之間的倒位，其中兩個位點之間切除的序列已在相反方向上再併入至基因體中。此分析不為定量的，但倒位可能為極其罕見的，此係由於其僅在小百分比(＜1%)之跨越HBG1及HBG2剪切位點之定序讀段中偵測到。 總合此等結果表明，除HBG1或HBG2靶向/脫靶位點處之插入缺失以外，用含有Cas9及具有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔的培養物含有具有插入HBG1-HBG2區之缺失或倒位的經編輯對偶基因。因此，編輯後之既定對偶基因可為HBG1-HBG1倒位、HBG1-HBG2缺失、位於HBG1位點之插入缺失、位於HBG2位點之插入缺失、或位於HBG1位點之插入缺失以及位於不具有插入區之修飾之HBG2位點的插入缺失。藉由用gRNA GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067編輯而產生之最常見靶向編輯修復圖案變體展示於表7-2中。所展示變體為HBG1及HBG2基因座處產生之局部插入缺失及由刪除HBG1與HBG2剪切位點之間的序列引起的大型4.9 kb缺失。使用如實例2.1中所描述之PCR及NGS分析對局部插入缺失進行定性。進行定量ddPCR分析以測定具有插入HBG1至HBG2區之大型4.9 kb缺失之對偶基因的頻率(圖10)。簡言之，HBG1啟動子上游之區(在5.2 kb正向引子與圖10中展示之反向引子之間)的複本數係根據如方法中所描述之RPPH1基因座處之複本數而定義。局部較小插入缺失之對偶基因頻率不與總插入缺失頻率相關，此係因為用於NGS之HBG1或HBG2位點之擴增將不在含有4.9 kb倒位或缺失之對偶基因中發生。舉例而言，對於gRNA GCR-0001，4.9 kb缺失之頻率為35.2%，其中剩下64.8% (100%-35.2%，忽略倒位)為野生型及較小局部插入缺失之混合物。因此，9%單一鹼基對A鹼基缺失將為總插入缺失頻率之5.8%，亦即64.8%之9%。表7-2中展示之對偶基因頻率在各實驗之間的略微變化，且不應視為絕對值。 表7-2.藉由用gRNA GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067編輯來自第一供體之細胞而產生的頂部靶向編輯修復圖案(對於任何gRNA分子，在本文中亦統稱為「插入缺失圖案」)變體。展示變體大小、變體類型(Ins=插入，Del=缺失)、參考對偶基因、變體對偶基因、相對於染色體11參考基因組建構hg38之變體起始及終止位置及對偶基因頻率。用gRNA GCR-0001編輯之HBG2基因座展示無顯著局部插入缺失，但基於qPCR結果，其確實產生4.9 kb缺失。*具有錯配之HBG1/2靶位點。 在用含有具有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔細胞之後，觀測到γ血球蛋白基因座處之高的總體編輯頻率，包括HBG1與HBG2啟動子靶向位點之間的大型4.9 kb缺失之高頻率。在紅血球系分化後產生增加的F細胞之細胞中鑑別出所展示之靶向編輯圖案，如所描述。在實施例中，本文中所描述之任何gRNA分子之插入缺失圖案包括HBG1基因座處偵測到之最頻繁的1、2、3、4、5或6個插入缺失。在實施例中，本文中所描述之任何gRNA分子之插入缺失圖案包括HBG2基因座處偵測到之最頻繁的1、2、3、4、5或6個插入缺失。在實施例中，本文中所描述之任何gRNA分子之插入缺失圖案包括HBG1基因座處偵測到之最頻繁的1、2、3、4、5或6個插入缺失，及HBG2基因座處偵測到之最頻繁的1、2、3、4、5或6個插入缺失，例如如表7-2中所描述(但不重複計數大致4.9 kb缺失)。實例 2 . 4 ：γ血球蛋白啟動子區編輯後之經分離HSPC亞群之例示性編輯圖案 方法： 方法如實例2.1中的，其中具有以下修改。 人類CD34+ 細胞培養。使用免疫選擇(Miltenyi)根據製造商說明書，自來自成年供體G-CSF移動的末梢血液(Hemacare，目錄號M001F-GCSF-3)分離人類CD34+細胞，且在用RNP複合物電穿孔之前擴增2天。 組裝Cas9與引導RNA核糖核蛋白(RNP)複合物，製備HSPC，且將RNP電穿孔至HSPC中。為了使用單一引導RNA (sgRNA)形成RNP，使12 µg各sgRNA、12 µg Cas9蛋白及1 µL 10 × CCE緩衝液(20 mM HEPES、100 mM KCL、5 mM MgCl2 、5%甘油及新鮮添加之1 mM DTT)在10 μl總體積中合併，接著在37℃下培育5 min。P3緩衝液+補充物中之細胞密度為1.3 × 108 /mL。使用GCR-0067進行七個重複電穿孔，且在電穿孔後合併細胞。對於無/對照條件，將細胞直接自P3緩衝液轉移至未電穿孔或未添加Cas9之擴增介質中。在用RNP複合物電穿孔後，在流式細胞測量術細胞分選之前，使細胞另外擴增3天。 流式細胞測量術細胞分選，以用於分析造血幹細胞及祖細胞亞群中之編輯效率。收集電穿孔後第3天之經編輯細胞培養物，且與抗CD34 (BD Biosciences，目錄號348057)、抗CD38 (BD Biosciences，目錄號560677)、抗CD90 (BD Biosciences，目錄號559869)、抗CD45RA (BD Biosciences，目錄號563963)、抗CD49f (BD Biosciences，目錄號562598)一起在FACS染色緩衝液中培育，該FACS染色緩衝液由補充有2% FBS (Omega Scientific，目錄號FB-11)及2mM EDTA (Corning，目錄號46-034 -CL)之HBSS (GE Life Sciences，目錄號SH30588.01)組成。用FACS染色緩衝液洗滌細胞，且藉由添加DAPI (4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)來測定細胞存活力。在FACS Aria細胞分選儀(BD Biosciences)上進行多色FACS分析。藉由閘控組使用對照染色之細胞培養物來測定陰性與陽性細胞群體之間的區別，在該等對照染色之細胞培養物中，各抗體單獨地經同型及螢光結合匹配的非特異性對照抗體(BD Biosciences，目錄號550854、554680、563437、557872及562602)置換。藉由分選後純度檢查來確認所分選細胞之純度。 基因體DNA製備及下一代定序(NGS)。由電穿孔後第3天之未經編輯HSPC及經編輯HSPC之分選亞群，使用DNeasy血液及組織試劑盒(Qiagen，目錄號69504)來製備基因體DNA。下文所描述之NGS分析展示在對照未經編輯樣本中無顯著編輯。 如實例2.1中所描述進行NGS文庫製備及擴增子之定序。如實例2.1中所描述進行NGS定序資料QC及變體分析。 大型缺失之定量。藉由數位液滴PCR (ddPCR)以複本數測定之非競爭性分析形式根據製造商建議，來定量HBG1及HBG2啟動子處之靶向位點之間的大型缺失。簡言之，將gDNA與探針之ddPCR超混合液(無dUTP) (BioRad，目錄號1863024)、HindIII-HF限制酶(NEB，目錄號R3104S)及各引子探針混合物組合，將其轉移至與探針之液滴產生油(BioRad，目錄號1863005)及用QX200液滴產生器(BioRad)產生之液滴一起之DG8柱。液滴在具有96深孔反應模組之C1000觸控熱循環器(BioRad)上經受PCR，隨後用QX200液滴讀取器(BioRad)偵測。藉由用QuantaSoft軟體(BioRad)之分析來測定每μl之複本。常規引子探針組(Life Technologies，目錄號APZW76R、PN4331348，正向引子：ACGGATAAGTAGATATTGAGG TAAGC (SEQ ID NO: 270)，反向引子：GTCTCTTTCAGTTAGCAGTGG (SEQ ID NO: 271)，FAM TaqMan探針：ACTGCGCTGAAACTGTGG CTTTATAG (SEQ ID NO: 272))用於擴增HBG1-HBG2基因間區內之gDNA。TaqMan複本數參考分析人類RNA酶P (Thermo Fisher，目錄號4403326)用作參考擴增子。HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl複本係在製造商報導的線性範圍內。百分比缺失報導為100%乘以1減去HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl之複本比率。未經編輯對照樣本具有至多13%之計算百分比缺失，其可反映分析中之背景。 結果： 在不受理論束縛之情況下，認為CD34+ HSPC群體含有移植、自我更新及細胞命運之各種潛能的細胞，其中在具有共用特性之細胞中進一步增濃額外標記，包括移植長期造血幹細胞(Notta,Science , 2011年7月8日;333(6039):218-21. doi: 10.1126/science.1201219；Huntsman,Blood . 2015年9月24日;126(13):1631-3. doi: 10.1182/blood-2015-07-660670；各自以全文引用之方式併入本文中)。在不受理論束縛之情況下，此類亞群可在經基因編輯之細胞移植物中具有特定的治療效益，此係由於其可在移植後不同時間復原造血系統。因此，使細胞經受流式細胞測量術以表徵HSPC亞群中之編輯效率。分離五個細胞群，第一CD34+細胞，隨後使用所展示策略進行針對CD34+CD45RA-CD38+、CD34+CD45RA-CD38-CD90-CD49f+、CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49f+及CD34+CD45RA- CD38-CD90-CD49f-細胞的4方向分選(圖11)。藉由單獨地定序HBG1及HBG2靶位點局部區，以及藉由偵測插入HBG1-HBG2區之缺失，分析此等所分選群體中之每一者的編輯。在亞群中，HBG1-HBG2缺失(亦即，刪除)頻率始終較高，其介於69至81百分比範圍內(圖12)。分別在HBG1及HBG2啟動子處之局部擴增及NGS用於測定各位點處之編輯% (小插入缺失)。將不在分析中對具有由靶向兩個啟動子處引起之倒位或缺失的對偶基因進行擴增。在不具有HBG1-HBG2缺失或倒位之對偶基因中，在亞群中之編輯類似地較高，其HBG1之編輯介於53至73百分比範圍內且HBG2之編輯介於75至91百分比範圍內。藉由將HBG1-HBG2缺失之基因體之百分比與具有HBG2處之編輯之非HBG1-HBG2缺失之基因體之百分比組合來評估最小總編輯(最小總編輯=缺失%+未缺失%[100減去缺失%，忽略倒位]乘以HBG2處編輯的%)。不包括HBG1處之局部小插入缺失，此係因為吾人不能測定何種比例之HBG1處之編輯%為具有僅位於HBG1之插入缺失的對偶基因及何種比例為具有HBG1及HBG2兩者處之共存在插入缺失的對偶基因。評估亞群中之最小總編輯為介於92至97百分比範圍內。在亞群中，位於HBG1及HBG2靶位點之插入缺失之編輯圖案亦為類似的，其中最頻繁地觀測到之編輯圖案在亞群中普遍。對於所有亞群及各位點HBG1或HBG2，頂部三個插入缺失圖案包括6 bp缺失、5 bp缺失及1 bp缺失(圖13A (HBG1基因座)；圖13B (HBG2基因座))。總之，總HSPC與子級分(包括所定義之CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49f+長期造血幹細胞)之間的一致編輯頻率及圖案，支持本文中描述之用於HSPC移植之基因編輯方法之效用。實例 2 . 5 ：γ血球蛋白啟動子區編輯後之HSPC之群落形成能力 方法： 方法如實例2.1中的，其中具有以下修改。 人類CD34+ 細胞培養。人類CD34+細胞衍生自來自成年健康供體(Lonza目錄號2M-101D)之骨髓。在用RNP複合物電穿孔之前，使細胞解凍，接著擴增2天。 組裝Cas9與引導RNA核糖核蛋白(RNP)複合物，製備HSPC，且將RNP電穿孔至HSPC中。為了使用單一引導RNA (sgRNA)形成RNP，使12 µg各sgRNA、12 µg Cas9蛋白及1 µL 10 × CCE緩衝液(20 mM HEPES、100 mM KCL、5 mM MgCl2 、5%甘油及新鮮添加之1 mM DTT)在10 μl總體積中合併，接著在37℃下培育5 min。P3緩衝液+補充物中之細胞密度為6.64 × 106 /mL。用來自兩個獨立供體中之每一者之細胞進行兩個電穿孔重複。對於無/對照條件，添加媒介物而不是sgRNA。在用RNP複合物電穿孔後，將細胞返回至擴增介質。 基因體DNA製備及下一代定序(NGS)。由電穿孔後第3天之未經編輯HSPC及經編輯HSPC之分選亞群，使用DNeasy血液及組織試劑盒(Qiagen，目錄號69504)來製備基因體DNA。下文所描述之NGS分析展示在用單獨Cas9電穿孔之對照樣本中無顯著編輯。 如實例2.1中所描述進行NGS文庫製備及擴增子之定序。如實例2.1中所描述進行NGS定序資料QC及變體分析。 大型缺失之定量。藉由數位液滴PCR (ddPCR)以複本數測定之非競爭性分析形式根據製造商建議，來定量HBG1及HBG2啟動子處之靶向位點之間的大型缺失。簡言之，將gDNA與探針之ddPCR超混合液(無dUTP) (BioRad，目錄號1863024)、HindIII-HF限制酶(NEB，目錄號R3104S)及各引子探針混合物組合，將其轉移至與探針之液滴產生油(BioRad，目錄號1863005)及用QX200液滴產生器(BioRad)產生之液滴一起之DG8柱。液滴在具有96深孔反應模組之C1000觸控熱循環器(BioRad)上經受PCR，隨後用QX200液滴讀取器(BioRad)偵測。藉由用QuantaSoft軟體(BioRad)之分析來測定每μl之複本。常規引子探針組(Life Technologies，目錄號APZW76R、PN4331348，正向引子：ACGGATAAGTAGATATTGAGG TAAGC (SEQ ID NO: 273)，反向引子：GTCTCTTTCAGTTAGCAGTGG (SEQ ID NO: 274)，FAM TaqMan探針：ACTGCGCTGAAACTGTGG CTTTATAG (SEQ ID NO: 275))用於擴增HBG1-HBG2基因間區內之gDNA。TaqMan複本數參考分析人類RNA酶P (Thermo Fisher，目錄號4403326)用作參考擴增子。HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl複本係在製造商報導的線性範圍內。百分比缺失報導為100%乘以1減去HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl之複本比率。未經編輯對照樣本具有至多9%之計算百分比缺失，其可反映分析中之背景。 群落形成單位細胞分析。在RNP遞送後兩天，使用TruCount管(BD Biosciences，目錄號340334)根據製造商建議，藉由流式細胞測量術在LSRFortessa (BD Biosciences)上計數活細胞。使用DAPI (4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)辨別活細胞。使用FlowJo軟體(Tree Star)進行分析。對於群落形成單位(CFU)分析，向MethoCult H4034最佳(Stemcell Technologies)甲基纖維素介質(StemCell Technologies)中添加細胞及1×抗生素/抗黴菌素(Gibco，目錄號10378-016)，且將1 mL一式三份塗鋪在SmartDish盤(StemCell Technologies)中。在含濕氣培育箱中在37℃下培育培養皿。在塗鋪後第14天使用StemVision (Stemcell Technologies)使培養物成像。使用群落標記軟體(Stemcell Technologies)對群落手動進行記分。將群落數目/孔(三個孔之平均值)除以Methocult之每ml塗鋪之細胞數目(範圍在226至318)且乘以1000，獲得CFU頻率/1000個細胞。 結果： 吾人在此處已展示，在靶向破壞HBG1及HBG2啟動子區域內之與產生F細胞相關之特異性序列後，HSPC在群落形成分析中起作用。使用群落形成單位分析，評價經基因體編輯及未經編輯HSPC之祖細胞組合物及分化潛能。對群落進行計數，且分類為衍生自紅血球系祖細胞(CFU-紅血球系[CFU-E]及爆裂形成單位-紅血球系[BFU-E])、粒細胞及/或巨噬細胞祖細胞(CFU-粒細胞、巨噬細胞[CFU-GM]；CFU-粒細胞[CFU-G]；以及CFU-巨噬細胞[CFU-M]或多潛能祖細胞(CFU-粒細胞、紅血球、巨噬細胞、巨核細胞[CFU-GEMM])。 表8.目前研究中用於編輯來自第一獨立供體之細胞之靶向HBG1及HBG2啟動子區之選擇gRNA的清單。 表9.目前研究中用於編輯來自第二獨立供體之細胞之靶向HBG1及HBG2啟動子區之選擇gRNA的清單。 用具有所指示gRNA之RNP電穿孔之兩個供體具有有效編輯、位於HBG1及HBG2啟動子靶向/脫靶位點之插入缺失以及插入區之缺失兩者(表8及表9)。經編輯培養物與總群落形成能力之下降相關(表8及表9)，可能指示經歷編輯之細胞之適合度減少。不管總群落數目之減少，在至少一個供體中觀測到所有紅血球系、粒細胞/巨噬細胞及多能群落(表8及表9)。此外，未經編輯與經編輯樣本之間的群落類型之比例存在極小差異(圖14)，指示此等靶向位點處編輯之細胞培養物確實不具有偏斜的分化能力。實例 2 . 6 ：γ血球蛋白啟動子區編輯後之活體外HSPC之細胞增殖 方法： 方法如實例2.1中的，其中具有以下修改。 人類CD34+ 細胞培養。人類CD34+細胞衍生自來自成年健康供體(Lonza目錄號2M-101D及Hemacare目錄號BM34-C)之骨髓。在用RNP複合物電穿孔之前，使細胞解凍，接著擴增2天。 組裝Cas9與引導RNA核糖核蛋白(RNP)複合物，製備HSPC，且將RNP電穿孔至HSPC中。為了使用單一引導RNA (sgRNA)形成RNP，使12 µg各sgRNA、12 µg Cas9蛋白及1 µL 10 × CCE緩衝液(20 mM HEPES、100 mM KCL、5 mM MgCl2 、5%甘油及新鮮添加之1 mM DTT)在10 μl總體積中合併，接著在37℃下培育5 min。P3緩衝液+補充物中之細胞密度為1 × 107 至2.5 × 107 /mL。用來自三個獨立供體中之每一者之細胞進行一個電穿孔重複。對於無/對照條件，添加媒介物而不是sgRNA。在用RNP複合物電穿孔後，將細胞返回至擴增介質。 基因體DNA製備及下一代定序(NGS)。使用快速提取DNA提取溶液(Epicentre，目錄號QE09050)或DNeasy血液及組織試劑盒(Qiagen，目錄號69504)，由在電穿孔後3天之經編輯及未經編輯HSPC來製備基因體DNA。下文所描述之NGS分析展示在用單獨Cas9電穿孔之對照樣本中無顯著編輯。 如實例2.1中所描述進行NGS文庫製備及擴增子之定序。如實例2.1中所描述進行NGS定序資料QC及變體分析。 細胞增殖及表型。在RNP遞送後兩天，使用TruCount管(BD Biosciences，目錄號340334)根據製造商建議，藉由流式細胞測量術在LSRFortessa (BD Biosciences)上計數活細胞。使用DAPI (4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)辨別活細胞，且藉由含抗CD34 (BD Biosciences，目錄號348057；BD Biosciences，目錄號340666；或eBioscience，目錄號25-0349-425)及抗CD90 (BD Biosciences，目錄號559869)之包含物之FACS染色緩衝液來測定CD34+及CD34+CD90+細胞含量，該FACS染色緩衝液由以下組成：補充有2% FBS (Omega Scientific，目錄號FB-11)及2mM EDTA (Corning，目錄號46-034-CL)之HBSS (GE Life Sciences，目錄號SH30588.01)。使用FlowJo軟體(Tree Star)進行分析。接著以2.0 × 104 或1.0 × 105 個活細胞/ml將細胞接種至擴增介質中，且培養7天。對於以1.0 × 105 /ml接種之培養物，在培養期間添加新鮮介質以稀釋3或4倍。在7天培養後，再次如上計數細胞。在7天培養後，在用以下抗體組染色後，另外分析細胞之表面標記表現。組1：對以下具有特異性之抗體：CD38 (FITC結合物，BD Biosciences #340926，純系HB7)、CD133抗原決定基1 (PE結合物，Miltenyi #130-080-801，純系AC133)、CD34 (PerCP結合物，BD Biosciences #340666，純系8G12)、CD90 (APC結合物，BD Biosciences #559869，純系5E10)、CD45RA (Pe-Cy7結合物，eBioscience #25-0458-42，純系HI100)。組2：對以下具有特異性之抗體：CD34 (PerCP結合物，BD Biosciences #340666，純系8G12)、CD33 (PE-Cy7結合物，BD Biosciences #333946，純系P67.6)、CD14 (APC-H7結合物，BD Biosciences #560270，純系MφP9)、CD15 (PE結合物，Biolegend #301905，純系HI98)。組3：對以下具有特異性之抗體：CD34 (PerCP結合物，BD Biosciences #340666，純系8G12)、CD41a (APC-H7結合物，BD Biosciences #561422，純系HIP8)、CD71 (FITC結合物，BD Biosciences #555536，純系M-A712)、CD19 (PE結合物，BD Biosciences #340720，純系SJ25C1)、CD56 (APC結合物，Biolegend #318310，純系HCD56)。對應同型對照抗體組用於染色平行培養物。藉由DAPI (4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚)染色來辨別活細胞。在LSRFortessa流式細胞儀(BD Biosciences)上分析所染色樣本之細胞表面蛋白質表現。使用Flowjo來分析結果，且資料呈現為DAPI陰性活細胞群體%。 結果： 吾人在此處已展示，在HBG1及HBG2啟動子區域內之與產生F細胞相關之特異性序列之靶向破壞後，HSPC可與典型細胞組合物一起在活體外擴增。評價經基因體編輯及未經編輯HSPC在促進HSPC擴增之培養條件的增殖能力及細胞組合物。用含有GCR-0067之RNP電穿孔之重複獨立供體具有有效編輯(表9-2)。 表9-2.使用所指示gRNA，來自三個獨立供體之細胞中之HBG1或HBG2啟動子區之經編輯擴增子百分比。 經編輯培養物與總增殖能力之下降相關，可能指示經歷編輯之細胞之適合度輕度減少，儘管在三個獨立細胞供體內此確實未達到顯著性(圖15)。在造血幹細胞增濃之CD34+CD90+群體內觀測到與總CD34+群體內類似的降低，指示此群體無差異地影響(圖15)。在此等培養條件下，預期HSPC及分化子代均存在，因此，進一步分析細胞組合物之更全面細胞表面標記組之表現。此等細胞群之區別例示於圖16中。在跨越三個獨立細胞供體之經基因體編輯及未經編輯培養物之間，細胞組合物為類似的，其中藉由不配對t-測試，在既定群體中不具有顯著差異(圖17)。CD33+群體之大誤差條由經基因體編輯及未經編輯培養物兩者中之具有可忽略CD33+細胞的單一供體產生(圖17)。實例 3 ： Cas9 變體之評估 CD34+造血幹細胞中之評估 吾人藉由量測基因剔除β-2-微球蛋白(B2M)基因於初級人類造血幹細胞(HSC)中之其效率來評價14個經純化化膿性鏈球菌Cas9 (SPyCas9)蛋白。將此等蛋白質分成3組：第一組由具有改良選擇性之SPyCas9變體組成(Slaymaker等人. 2015, Science 351: 84 (e1.0, e1.1 and 及K855A)；Kleinstiver等人. 2016, Nature 529: 490 (HF))。第二組由以下組成：野生型SPyCas9，其具有不同數目及/或位置之SV40細胞核定位信號(NLS)，及具有或不具有可裂解TEV位點之6x組胺酸(His6) (SEQ ID NO:247)或8x組胺酸(His8)標籤(SEQ ID NO: 248)；及具有兩個半胱胺酸取代(C80L、C574E)之SPyCas9蛋白，已報導其使Cas9穩定以用於結構性研究(Nishimasu等人. 2014, Cell 156:935)。第三組由由不同過程產生之相同重組SPyCas9組成(圖6)。藉由FACS及下一代定序(NGS)來測定B2M基因剔除。 方法 材料 1. 氖電穿孔儀器(Invitrogen，MPK5000) 2. 氖電穿孔試劑盒(Invitrogen，MPK1025) 3. crRNA (與B2M基因中之序列互補之GGCCACGGAGCGAGACAUCU (SEQ ID NO: 276)之靶向域序列，其與SEQ ID NO: 201融合) 4. tracrRNA (SEQ ID NO: 224) 5. Cas9儲存緩衝液：20 mM Tris-Cl，pH 8.0，200mM KCL，10mM MgCl2 6. 骨髓衍生之CD34+ HSC (Lonza，2M-101C) 7. 細胞培養基(Stemcell Technologies，具有StemSpam CC-100之StemSpam SFEM II) 8. FACS洗滌緩衝液：含2% FCS之PBS 9. FACS阻斷緩衝液：每mL PBS，添加0.5 μg小鼠IgG、150 μg Fc阻斷、20 μL FCS 10. Chelex懸浮液：含10% Chelex 100 (bioRad，目錄號142-1253)之H2 O 11. 抗B2M抗體：Biolegend，目錄號316304 過程 根據Lonza之建議，解凍細胞且使其生長，每2-3天添加介質。在第5天，以200 × g使細胞集結15 min，用PBS洗滌一次，用來自氖試劑盒之T-緩衝液以2 × 104 個/μL再懸浮細胞，置放於冰上。用Cas9儲存緩衝液將Cas9蛋白稀釋至5 mg/ml。用H2 O復原crRNA及tracrRNA至100 μM。藉由將0.8 μL各CAS9蛋白、crRNA及tracrRNA 與0.6 uL Cas9儲存緩衝液混合，在室溫下培育10 min，來製備核糖核蛋白(RNP)複合物。使7 μL HSC與RNP複合物混合兩分鐘，且將整個10 μL轉移至氖移液管尖端中，在1700 v、20 ms及1個脈衝下電穿孔。緊接著在電穿孔後，將細胞轉移至含有在37℃、5% CO2 下預校準之1 ml介質之24孔盤的孔中。電穿孔後72小時收集細胞以用於FACS及NGS分析。 FACS：自24孔盤之各孔取出250 μL細胞至96孔U形底盤之孔，且使細胞集結。用2% FCS (胎牛血清)-PBS洗滌一次。向細胞中添加50 μL FACS阻斷緩衝液，且在冰上培育10分鐘，添加1 μL FITC標記之B2M抗體且培育30分鐘。用150 μL FACS洗滌緩衝液洗滌一次，隨後用200 μL FACS洗滌緩衝液再洗滌一次。將細胞再懸浮於200 μL FACS緩衝液FACS分析中。 NGS樣本製備：自24孔盤之各孔將250 μL細胞懸浮液轉移至1.5 ml Eppendorf管，添加1 mL PBS，且使細胞集結。添加100 μL Chelex懸浮液，在99℃下培育8分鐘且漩渦10秒，隨後在99℃下培育8分鐘，漩渦10秒。藉由在10,000 × g下離心3分鐘使樹脂向下集結，且上清液溶解物用於PCR。取4 μL溶解物，且使用鈦試劑盒(Clonetech，目錄號639208)且根據製造商指令用b2m引子(b2mg67F：CAGACAGCAAACTCACCCAGT (SEQ ID NO: 277)；b2mg67R：CTGACGCTTATCGACGCCCT (SEQ ID NO: 278))進行PCR反應。使用以下PCR條件：98℃下5分鐘，1個循環；95℃下15秒，62℃下15秒及72℃下1分鐘，30個循環；以及最終72℃下3分鐘，1個循環。使用PCR產物以用於NGS。 如實例2.1中所描述進行NGS文庫製備及擴增子之定序。如實例2.1中所描述進行NGS定序資料QC及變體分析。 統計：藉由FACS之B2M KO細胞的百分比及藉由NGS之插入缺失的百分比用於評價CAS9裂解效率。將實驗設計成具有Cas9，作為固定效果。將各實驗嵌套在供體內，作為嵌套隨機效果。因此，混合線性模型應用於分析FACS及NGS資料。 結果 為了標準化實驗及供體變異，吾人圖示各蛋白質對於iProt105026之相對活性，該iProt105026為在蛋白質之C端具有側接野生型SPyCas9及His6標籤(SEQ ID NO: 247)之兩個SV40 NLS (圖6)的初始設計。統計分析展示，與參考Cas9蛋白相比，iProt105026、iProt106331、iProt106518、iProt106520及iProt106521在HSC中之基因剔除B2M中無顯著差異，而所測試之其他變體(PID426303、iProt106519、iProt106522、iProt106545、iProt106658、iProt106745、iProt106746、iProt106747、iProt106884)高度顯著地不同於HSC中之基因剔除B2M中之參考iProt105026。吾人發現，將His6標籤(SEQ ID NO: 247)自C端移動至N端(iProt106520)並不影響蛋白質之活性(圖6)。僅當將NLS置放於蛋白質之C端時，一個NLS足以維持活性(iProt106521相對於iProt106522，圖6)。自過程1純化之蛋白質比自過程2及3純化之彼等蛋白質具有一致更高的基因剔除效率(iProt106331相對於iProt106545及PID426303，圖6)。一般而言，具有報導改良選擇性之SPyCas9變體不如野生型SPyCas9一樣活性(iProt106745、iProt106746及iProt106747，圖6)。有趣的是，iProt106884並不剪切靶向位點。此與Kleinstiver等人之此變體未能剪切哺乳動物細胞中之至多20%之合理靶向位點的報導一致(Kleinstiver等人. 2016, Nature 529: 490)。最終，具有兩個半胱胺酸取代之Cas9變體(iProt106518)維持高水準之酶活性(圖6)。實例 4 . 藉由毛細電泳質譜分析，在基因編輯後，血色素次單位之定量改變 在基因編輯HSC後，除藉由流式細胞測量術捕獲胎兒血色素產生以外，亦藉由毛細電泳質譜分析(CE-MS)來量測紅血球系細胞中之個別血色素次單位的改變。衍生自鐮狀細胞患者之末梢血液之CD34+細胞在Cas9蛋白(具有兩個NLS及一個His標籤，iProt106331)存在及無引導RNA存在下進行模擬編輯，或在Cas9蛋白及引導RNA sg0067兩者存在下進行基因編輯，且在如先前所描述之培養基中分化為紅血球系譜系。在紅血球系分化之第14天，用識別胎兒血色素(HbF)之FITC結合抗體對來自各條件之相同數目細胞進行染色，且使細胞經受流式細胞測量術以定量基因編輯後的HbF誘導。流式細胞測量術報導HbF+細胞上調30%-50% (表10)。平行地，收集每條件下變化量之紅血球系細胞(6、12、66及99百萬)，且使其經受CE-MS以定量α-血球蛋白、正常β血球蛋白(HbB)、鐮狀β血球蛋白(HbS)及胎兒γ血球蛋白(HbF)次單位，且用輸入細胞之量來標準化資料。CE-MS能夠偵測呈少至600個細胞/μL濃度的所有血球蛋白次單位。結果展示，經編輯鐮狀細胞患者樣本之γ血球蛋白增加~40%，且同時鐮狀β血球蛋白降低50% (圖18)。 表10.處理之描述及經受血球蛋白次單位之CE-MS定量之樣本細胞量。亦藉由流式細胞測量術使用與螢光團結合之抗HbF抗體來量測此等樣本之胎兒血色素表現。 實例 5 . 經 基因編輯之造血幹細胞 ( HSC ) 能夠長期移植且支持多譜系復原 為了評價經基因編輯之HSC之幹細胞功能，將經編輯人類HSC移植至免疫功能不全小鼠中，以檢查長期造血再生。在第0天將骨髓衍生之500000個CD34+細胞解凍，在第3天用模擬RNP複合物(單獨Cas9及無gRNA)或用Cas9與包含CR001128之靶向域之sgRNA(本文中有時在sg1128處提及) (AUCAGAGGCCAAACCCUUCC GUUUUAGAGCUAG AAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 181)，其包含AUCAGAGGCCAAACCCUUCC (SEQ ID NO: 180)之靶向域序列)形成之RNP複合物電穿孔。隨後將細胞維持在實例2.1中描述之相同濃度及介質中，且在培養之6天，將來自各處理之所有細胞移植至2個灰色以亞致死劑量輻射的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ (NSG)小鼠中(圖19)。吾人觀測到在移植後在16週之接受者之骨髓中大致30%-40%人類細胞移植物。此外，此移植含量與模擬處理對照相當，表明基因編輯並不減損HSC之長期移植能力(圖20)。經基因編輯、移植的HSC在移植後4、8、12、16週保持正常骨髓、B淋巴及T淋巴細胞再生(圖21)。此資料證明，經基因編輯之HSC能夠長期移植且支持包括直至移植後16週之正常多譜系復原。實例 6 . 經基因編輯、長期移植的 HSC 能夠保持胎兒血色素 ( HbF ) 產生 在獨立研究中，吾人評價相比於來自BCL11A基因之紅血球系特異性增強子區之gRNA(sg-G1128)，用來自γ血球蛋白啟動子區gRNA (表11中之sg-G0008、sg-G0051、sg-G0010、sg-G0048、sg-G0067)進行基因編輯之HSC的幹細胞功能。將用此等gRNA編輯之人類HSC移植至免疫功能不全NSG小鼠中，以檢查造血再生(圖22)。 表11.移植研究種使用之引導RNA，其設計成靶向γ血球蛋白啟動子區。 實驗步驟 CD34 + 解凍及培養 將骨髓CD34+細胞進行解凍及培養。自液氮移出各小瓶1百萬個骨髓CD34+細胞，用70%乙醇噴霧，且在37℃水浴中快速解凍直至保持小冰集結粒為止。小瓶用70%乙醇噴霧，且擦拭。使用5 ml吸管，將小瓶該內含物轉移至50 ml falcon管中。用1 ml預溫熱IMDM、10% FBS沖洗冷凍小瓶一次，且逐滴添加至50 ml falcon管中；在2 min內向細胞中緩慢添加25 ml預溫熱IMDM、10% FBS，平緩地渦旋為混合物。在下300g旋轉細胞10 min。在StemSpan SFEM + 100 ng/ml SCF/IL6/Flt3L/TPO + 500 nM 化合物4 + 1× Pen/Strep中在0.2-0.5 × 10e6個細胞/毫升下培養28000000個CD34+細胞。RNP 電穿孔 解凍後四十八小時，用以下對細胞進行電穿孔：1) 僅Cas9；或2) 含有sg1128 (如上文所描述)或表11中之sgRNA之一者的Cas9 RNP複合物。簡言之，使用產生具有10 μM Cas9及20 μM sgRNA之RNP混合物之1:2莫耳比的Cas9蛋白:sgRNA來製備RNP。向含1百萬CD34+細胞之20 μl P3緩衝液中添加5μl 10 μM RNP。將22 μl電穿孔混合物轉移至96孔電穿孔盤之一個孔中，且使用Lonza Amaxa 96孔梭或Lonza核轉染系統、程式CA-137來電穿孔。緊接在電穿孔後，向經電穿孔之樣本中添加80 μl培養基(StemSpan SFEM + 100 ng/ml SCF/IL6/Flt3L/TPO + 500 nM 化合物4 + 1× Pen/Strep)。 電穿孔後二十四小時，每小鼠移植500K起始細胞等效物。30,000-100,000個細胞用於紅血球系分化，以評定編輯後之HbF誘導。使殘餘細胞置於培養物中另外24 h (電穿孔後總共48 h)以用於NGS分析編輯頻率。移植 在用200 Rad移植前4-24 h，使用RadSource X射線輻射器來輻射十隻NSG小鼠/條件，或2個灰色使用Cesium138 輻射器。經由尾靜脈注射，每小鼠移植500000個起始細胞等效物。在移植之後，將小鼠置放於抗生素方案上4-8週。根據研究所之動物護理步驟且根據經批准IACUC方案來處理小鼠。在4、8、12、16及20週，經由尾靜脈缺口，採集末梢血液以用於移植及譜系分析。在8-9週及20週，採集骨髓以用於分析(如先前方案(例如實例2.1)中所描述之流式細胞測量術，Taqman qPCR及NGS)以及用於分選用於如先前方案中所描述的紅血球系分化的hCD45+CD34+細胞。在20週，進行hCD45+CD34+細胞分選及紅血球系分化。 圖22展示，相比於來自BCL11A基因之紅血球系特異性增強子區之gRNA(sg-G1128，亦稱為sg1128)，評價用來自γ血球蛋白啟動子區之sgRNA (sg-G0008、sg-G0051、sg-G0010、sg-G0048、sg-G0067)編輯之HSC的幹細胞功能的移植研究的示意圖。在第0天解凍500000個人類CD34+細胞，用模擬RNP複合物(單獨Cas9及無gRNA)或用Cas9 (NLS-Cas9-NLS-His6 (揭示為SEQ ID NO: 247之「His6」))及第3天之各種gRNA形成的RNP複合物進行電穿孔。在第6天，收集來自各條件之所有細胞，且移植至2個Gy以亞致死劑量輻射之NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ (NSG)小鼠中(圖22)。在移植後4、8、12、16及20週對小鼠進行抽血。在移植後8及20週，亦收集來自動物之骨髓細胞以檢查骨髓中之人類細胞移植。結果 編輯 HSC 能夠在 NSG 小鼠中長期移植且支持多譜系分化 結果展示，來自γ血球蛋白啟動子區之sgRNA在移植後8週達成平均20%-40%之骨髓移植，其與sg-G1128相當。儘管來自早期時間點之移植可由短生命期造血祖細胞貢獻，但較長時間點(20週)處之移植為藉由長期HSC之復原的證據。所測試sgRNA展示移植後20週5%-22%骨髓移植(圖23A至圖23F及圖24A及圖24B)。值得注意的是，吾人僅注射~500,000模擬或經基因體編輯之CD34+細胞至各小鼠中以達成此類移植水準。此移植水準與移植1百萬個經基因體編輯之CD34+細胞之其他研究相當，指示本發明之細胞之高效移植。另外，當將所有經基因編輯之組與經模擬編輯之對照時，吾人觀測移植後4、8、12、16、20週之骨髓、B淋巴及T淋巴細胞的正常恢復(圖23A至圖23F及圖25)。此等資料證明，藉由靶向具有並不定位至任何已知HPFH之gRNA之γ血球蛋白啟動子區，基因體編輯策略並不影響長期HSC之移植能力，其亦不更改當移植至新宿主中時其多譜系復原功能。相比之下，吾人可藉由注入相比於其他報導策略少50%之細胞來達成穩固移植。總之，藉由此等sgRNA編輯之HSC能夠在造血幹細胞生態棲位中具有穩固多譜系復原的長期移植，以維持長期血細胞生成。在移植前及移植後維持高編輯效率 吾人藉由如實驗步驟中所描述之NGS來檢查所測試sgRNA之編輯效率。在基因編輯三天後，100,000個經基因編輯之人類CD34+細胞以及經模擬編輯之CD34+細胞經受NGS分析。將剩餘細胞移植至如先前所描述之NSG接受者中。在移植後8週及20週，收集來自經移植NSG小鼠之骨髓細胞，且使100,000個所分選人類CD45+細胞經受NGS以量測編輯效率。結果展示，sgRNA sg-G1128、sg-G0048及sg-G0067達成80%-90%編輯，而sg-G0010表明~45%編輯(圖26)。當將移植前與移植後8或20週之編輯效率進行比較時，結果展示，造血幹細胞及祖細胞群體中之經編輯事件在移植期間中長期維持。此資料表明經移植個體中之經編輯細胞之持久性。吾人甚至觀測到移植後20週sg-G1128之編輯效率稍微增加，意味著藉由骨髓微環境選擇經編輯細胞或經編輯細胞在移植後具有存活優勢。 在另一獨立移植重複中，NGS分析揭露用所測試gRNA達成之編輯範圍，其中sg-G1128在電穿孔兩天後產生大於90%之編輯(圖8A)。亦在移植後9及20週分離之人類CD34+細胞中偵測編輯(圖27B及圖27C)。基因編輯、長期移植之 HSC 保持胎兒血色素產生增加 NSG小鼠不支持紅血球系發育，慈禧由於小鼠缺乏正確人類細胞介素以使得能夠紅血球系成熟。然而，可自小鼠骨髓收集所移植人類HSC，將其置放於紅血球系分化培養基(如此等實例中之其他地方所描述)中以誘導紅血球系分化。資料展示，相比於經模擬編輯及移植之HSC，經基因編輯、移植20週之HSC能夠產生更高含量的HbF (圖28)。實例 7 . 脫靶 插入缺失圖案分析 潛在 gRNA 脫靶基因座之電腦鑑別 HGB1/HBG2區gRNA GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067子組之潛在脫靶基因座如下鑑別。對於各gRNA，使用BFAST序列比對器(版本0.6.4f，Homer等人, PLoS One, 2009, 4(11), e7767, PMID: 19907642)，使用允許至多5個核苷酸錯配之標準參數，將20個核苷酸gRNA靶向域序列與人類基因體參考序列(建構GRCh38)進行比對。過濾所鑑別基因座以僅含有與Cas9典型5'-NGG-3' PAM序列(亦即，5'-脫靶基因座-PAM-3') 5'相鄰的位點。使用BEDTools指令碼(版本2.11.2，Quinlan及Hall, Bioinformatics, 2010 26(6):841-2, PMID: 20110278)，針對RefSeq基因註解，對具有5個核苷酸錯配之位點進行進一步過濾(Pruitt等人, Nucleic Acids Res., 2014 42(Database issue):D756-63, PMID: 24259432)，以僅含有標註為外顯子的基因座。針對HGB1/HBG2區gRNA鑑別之潛在脫靶基因座之計數展示於表12中。表 12 .展示針對HBG1/HBG2區gRNA GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067鑑別之電腦脫靶基因座之計數，該等gRNA在RefSeq外顯子內具有0、1、2、3及4個核苷酸錯配及5個核苷酸錯配。*gRNA GCR-0048及GCR-0067具有兩個完美匹配靶向位點/HBG基因座。+ 包括一或兩個錯配同源HBG1或HBG2靶向位點。 CD34 + HSPC 中之脫靶分析 基因體 DNA 提取 使用快速DNA小規模純化試劑盒(Zymo Research)按照製造商建議，自3天經RNP編輯及未經編輯骨髓衍生之CD34+HSPC分離基因體DNA。用於潛在脫靶位點之靶向擴增之 PCR 引子設計 使用Primer3 (版本2.3.6，Untergasser等人, Nucleic Acids Res., 2012 40(15):e115, PMID: 22730293)，使用針對大致160-300個鹼基對(其中gRNA靶向域序列位於擴增子中心中)長度之擴增子大小範圍之預設參數，來設計針對HBG1/HBG2區gRNA (GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067)鑑別之靶向具有0-3個錯配之潛在脫靶基因座(及靶向基因座)的PCR擴增子。藉由BLAST檢索(版本2.2.19，Altschul等人, J Mol Biol., 1990, 215(3):403-10, PMID: 2231712)相對於人類基因體參考序列(建構GRCh38)之序列，來檢驗所得PCR引子配對及擴增子序列之唯一性。棄去產生多於一個擴增子序列之引子配對，且進行重新設計。表13展示所設計之成功PCR引子配對之計數。Illumina 定序文庫製備、定量及定序 使用Quant-iT PicoGreen dsDNA試劑盒(Thermo Fisher，目錄號P7581)使用製造商建議，來定量來自經RNP編輯(2個重複/gRNA)及未經編輯(2個重複/gRNA) HSPC的基因體DNA。針對各樣本，使用兩個依序PCR反應產生靶向個別脫靶基因座(及靶向基因座)之Illumina定序文庫。第一PCR使用帶通用Illumina定序相容序列之尾之靶標特異性PCR引子(以上經設計)來擴增靶標基因座。第二PCR向第一PCR擴增子中添加額外Illumina定序相容序列，包括樣本條碼，以使得能夠在定序期間多工化。以10 µL最終體積進行PCR 1，其中各反應含有大致6.5 ng gDNA (等效於大致1000個細胞)、在0.25 µM最終濃度下之PCR 1引子對(Integrated DNA Technologies)及1×最終濃度之Q5熱起始基本混合物(New England BioLabs，目錄號102500-140)。PCR 1左側引子帶5'尾(亦即，5'-尾-靶標特異性左側引子-3')，該等左側引子具有序列5'-TCGTCGGCAGCGT CAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 279)；且右側引子為帶5'尾的(亦即，5'-尾-靶標特異性右側引子-3')，其中該等右側引子具有序列5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO: 280)。在熱循環儀上使用以下循環條件進行PCR 1：98℃下1 min，1個循環；98℃下10 sec，63℃下20 sec及72℃下30 sec，25個循環；72℃下2 min，1個循環。接著使用不含核酸酶之水(Ambion，目錄號AM9932)以1/100稀釋PCR 1，且用作至PCR 2中之輸入。以10 µL最終體積進行PCR 2，其中各反應含有2 µL經稀釋PCR 1產物，在0.5 µM最終濃度下之PCR 2引子對(Integrated DNA Technologies)及1×最終濃度之Q5熱起始基本混合物(New England BioLabs，目錄號102500-140)。所使用之PCR 2左側引子序列為5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNN NNNNTCGTCGGCAGCGTC-3' (SEQ ID NO: 281)，且所使用之PCR 2右側引子序列為5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNN GTCTCGTGGGCTCGG-3' (SEQ ID NO: 282)，其中NNNNNNNN表示用於作為標準Illumina定序方法之部分之樣本多工的8個核苷酸條碼序列。在熱循環儀上使用以下循環條件進行PCR 2：72℃下3 min，1個循環；98℃下2 min，1個循環；98℃下10 sec，63℃下30 sec及72℃下2 min，15個循環。使用Agencourt AMPure XP珠粒(Beckman Coulter，目錄號A63882)按照製造商建議，清潔PCR 2擴增子、現在的可用Illumina定序文庫。接著，使用標準qPCR定量方法使用Power SYBR綠色PCR主混合物(Life Technologies，目錄號4367660)及對Illumina定序文庫末端具有特異性之引子(正向引子序列5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3' (SEQ ID NO: 283)及反向引子序列5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA-3' (SEQ ID NO: 284))，來對經清潔的Illumina定序文庫進行定量。接著等莫耳合併伊路米那定序文庫，且使用MiSeq試劑試劑盒v3 (Illumina，目錄號MS-102-3003)按照製造商建議，使其在具有300個鹼基配對末端讀段之MiSeq儀器(Illumina，目錄號SY-410-1003)上經受Illumina定序。對於各複製中之各基因座，產生最小1000倍之序列覆蓋。分別地進行經編輯及未經編輯樣本之PCR、清潔、合併及定序，以避免交叉樣本或自其產生之PCR擴增子之間的雜質之任何可能。NGS 定序資料 QC 及變體分析 方法如同實例2.1中的，其具有以下修改。對於分析之階段5，考慮具有＞2%之經組合插入缺失頻率(在大於約10-20個細胞中編輯)之位點，且使用整合基因體檢視器(IGV版本2.3，Robinson等人, Nat Biotechnol. 2011, 9(1):24-6, PMID: 21221095)在讀段比對層級下進一步檢查潛在活性編輯位點，該整合基因體檢視器允許對相對於基因體參考序列之讀段比對的目視檢查。 大型缺失之定量。 藉由數位液滴PCR (ddPCR)以複本數測定之非競爭性分析形式根據製造商建議，來定量HBG1及HBG2啟動子處之靶向位點之間的大型缺失。簡言之，將gDNA與探針之ddPCR超混合液(無dUTP) (BioRad，目錄號1863024)、HindIII-HF限制酶(NEB，目錄號R3104S)及各引子探針混合物組合，將其轉移至與探針之液滴產生油(BioRad，目錄號1863005)及用QX200液滴產生器(BioRad)產生之液滴一起之DG8柱。液滴在具有96深孔反應模組之C1000觸控熱循環器(BioRad)上經受PCR，隨後用QX200液滴讀取器(BioRad)偵測。藉由用QuantaSoft軟體(BioRad)之分析來測定每μl之複本。常規引子探針組(Life Technologies，目錄號APZW76R、PN4331348，正向引子：ACGGATAAGTAGATATTGAGGTAAGC (SEQ ID NO: 285)，反向引子：GTCTCTTTCAGTTAGCAGTGG (SEQ ID NO: 286)，FAM TaqMan探針：ACTGCGCTGAAACTGTGGCTTTATAG (SEQ ID NO: 287))用於擴增HBG1-HBG2基因間區內之gDNA。TaqMan複本數參考分析人類RNA酶P (Thermo Fisher，目錄號4403326)用作參考擴增子。HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl複本係在製造商報導的線性範圍內。百分比缺失報導為100%乘以1減去HBG1-HBG2及RNA酶P擴增子之每μl之複本比率。未經編輯對照樣本具有至多2%之計算百分比缺失，其可反映分析中之背景。HBG1 / HBG2 區電腦脫靶分析結果 表13展示成功表徵的脫靶位點之數目。未表徵的位點失敗於PCR引子設計或PCR擴增，且仍進行評價。gRNA GCR - 0001 ：HBG1靶向位點展示具有大致58%之平均插入缺失頻率之穩固局部編輯，而相對於gRNA靶向域序列(5'-AGTCCTGGTATCt TCTATGg -PAM-3'，PAM = TGG (SEQ ID NO: 288))具有兩個錯配(此處及下文，以小寫字母展示)同源HBG2靶位點展示最小的局部編輯。然而，4.9 kb缺失之ddPCR分析展示，其以大致34%之頻率發生。其他分析鑑別在兩者重複中具有大致26%之平均插入缺失頻率的一個陽性脫靶位點。該位點相對於gRNA靶向域序列(5'-At TCCca GTATCCTCTATGA-PAM-3'，PAM = TGG (SEQ ID NO: 289))具有3個錯配 ，且位於Y染色體上鹼基對位置21,470,475-21,470,497處之基因間序列中。此脫靶位點處之編輯是否對於基因表現或細胞存活力具有任何有害效果上不明確。需要進一步分析。gRNA GCR - 0008 ：HBG1靶向位點展示具有大致88%之平均插入缺失頻率之穩固局部編輯。相對於gRNA靶向域序列(5'-GGAGAAGa AAACTAGCTAAA-PAM-3'，PAM = GGG (SEQ ID NO:290))具有一個錯配 之同源HBG2靶位點展示具有大致85%之平均插入缺失頻率的穩固局部編輯。4.9 kb缺失之ddPCR分析展示其以大致50%之頻率發生。無其他位點展示編輯。gRNA GCR - 0010 ：HBG1靶向位點展示具有大致32%之平均插入缺失頻率之穩固局部編輯。相對於gRNA靶向域序列(5'-GGGAGAAGa AAACTAGCTAA-PAM-3'，PAM = AGG (SEQ ID NO: 291))具有一個錯配 之同源HBG2靶位點展示具有大致27%之平均插入缺失頻率的穩固局部編輯。4.9kb缺失之ddPCR分析展示其以大致33%之頻率發生。無其他位點展示編輯。gRNA GCR - 0048 ：HBG1及HBG2靶向位點展示具有針對兩個位點之大致86%之平均插入缺失頻率的穩固局部編輯。4.9 kb缺失之ddPCR分析展示其以大致45%之頻率發生。無其他位點展示編輯。gRNA GCR - 0051 ：HBG2靶向位點展示具有大致88%之平均插入缺失頻率之穩固局部編輯。相對於gRNA靶向域序列(5'-GGAGAAGg AAACTAGCTAAA-PAM-3'，PAM = GGG (SEQ ID NO:292))具有一個錯配 之同源HBG1靶位點展示具有大致59%之平均插入缺失頻率的穩固局部編輯。4.9 kb缺失之ddPCR分析展示其以大致40%之頻率發生。無其他位點展示編輯。gRNA GCR - 0067 ：HBG1及HBG2靶向位點展示分別地具有大致74%及78%之平均插入缺失頻率之穩固局部編輯。4.9 kb缺失之ddPCR分析展示其以大致62%之頻率發生。無其他位點展示編輯。 上文所描述之局部插入缺失頻率不係相對於總插入缺失頻率，且不考慮大型4.9 kb缺失之頻率。表 13 .展示針對HBG1/HBG2區gRNA GCR-0001、GCR-0008、GCR-0010、GCR-0048、GCR-0051及GCR-0067鑑別之0-3個電腦錯配脫靶位點的計數、在經基因體編輯之HSPC中成功表徵之位點的計數及展示編輯之位點的計數。 無偏性脫靶分析 使用基於寡核苷酸插入之分析(參見例如Tsai等人,Nature Biotechnology . 33 , 187-197; 2015)來測定藉由靶向HBG1及/或HBG2之Cas9而裂解的潛在脫靶基因體位點。在此等實驗中，用gRNA (15 nM crRNA:tracr)及插入寡核苷酸(10 nM)使用Lipofectamine® RNAiMAX來轉染表現Cas9GFP之HEK293細胞(HEK-293_Cas9GFP)。分析依賴於併入至基因體中之雙鏈斷裂中之寡核苷酸之鑑別，該等斷裂可能或可能不由藉由Cas9之裂解產生。 在一個實驗中，在HEK-293_Cas9GFP細胞中篩選靶向HBG1及/或HBG2之gRNA (雙引導RNA，其包含圖29中之所指示靶向域)，且結果繪製於圖29中。在一獨立實驗中，相同方法用於在HEK-293_Cas9GFP細胞中篩選靶向HBG1及/或HBG2之一些相同的以及額外gRNA (包括雙引導及單引導RNA，其包含圖30中之所指示靶向域)，且結果繪製於圖30中。具有圖30中所描繪之資料之實驗使用具有經平衡G/C含量之替代性插入寡核苷酸，及與人類基因體之降至最低的互補性，以及相比於Tsai等人methods, which improved sensitivity and diminished false positives中所公開的PCR步驟的其他修改。在兩個實驗中，分析偵測所預期靶標序列及一或多個潛在脫靶位點處之高效編輯。 儘管基因體中之除靶向位點以外之位點處之插入寡核苷酸之偵測鑑別Cas9的潛在脫靶效果，但潛在脫靶位點的定向深度測序可用於判定潛在位點是否為藉由Cas9裂解之善意脫靶位點。為了這個目的，進行一實驗，其中用先前兩個實驗中使用之gRNA (以25 nM crRNA:tracr)但無插入寡核苷酸來類似地轉染HEK-293_Cas9GFP細胞。圖29及圖30中所描繪之所鑑別潛在脫靶位點中之每一者之擴增子深度測序用於鑑別插入缺失(指示Cas9裂解事件)是否在HEK-293_Cas9GFP細胞株中之潛在脫靶位點處存在。此實驗之結果證明，藉由寡核苷酸插入分析鑑別之大部分潛在脫靶位點在轉染gRNA後不具有可偵測的插入缺失，下表14如所提供之若干個例外。值得注意的是，此等實驗中用於偵測潛在脫靶所使用之HEK-293_Cas9GFP細胞組成性過度表現Cas9，相比於各種所關注之細胞類型(例如CD34+ HSC)中之短暫遞送模態(例如RNP遞送)，可能導致更高數目之潛在脫靶「命中」。 表14.HEK-293_Cas9GFP細胞株中驗證之脫靶位點 使用本文所描述之方法，在經sgRNA/Cas9編輯之CD34+ HSPC中檢查潛在脫靶位點，且展示在CD34+細胞類型中無編輯。實例 8 實驗步驟 在與先前實例6中所描述相同的條件下，將自健康供體之移動的末梢血液(mPB)收集之CD34+細胞進行培養且進行基因編輯。使用與先前段落中所描述相同的方法來表徵細胞之其生物功能。衍生自移動的末梢血液之 CD34 + 細胞在編輯後維持其 CD34 + 細胞計數、擴增能力及存活力 移植至患者中之CD34+細胞數目與成功骨髓移植直接相關。因此，使用臨床上可接受之方法ISHAGE，吾人計數在基因編輯後10天時間內之CD34+細胞之百分比。結果展示，當相比於模擬經編輯對照時，用sg1128以及sg0067之編輯均不影響CD34+細胞計數(圖31)。對於吾人之細胞過程之總持續時間，其中在電穿孔後將細胞僅在培養基中維持3天，CD34+細胞之百分比維持在大致90%下。(圖31A)。基因編輯亦不影響電穿孔後CD34+細胞擴增之能力(圖31B)及範圍為在70%與90%之間的其存活力(圖31C)。吾人觀測到，在電穿孔後第3天~2倍細胞擴增，在電穿孔後第7天~10倍擴增，及在電穿孔後第10天15-25倍擴增(圖31B)。衍生自健康個體之移動的末梢血液之 CD34 + 細胞證明相比於骨髓細胞來源或來自鐮狀細胞疾病患者之 CD34 + 細胞的類似編輯效率 Sg1128證明衍生自健康供體之mPB之CD34+細胞中之約70%-75%編輯效率，而sg0067展示＞95%之總編輯效率(包括大型5 kb缺失及小插入缺失) (圖32)。來自此等sgRNA之編輯效率在來自不同來源之細胞中類似，該等細胞包括來自健康供體之骨髓衍生的CD34+細胞或來自鐮狀細胞疾病患者之末梢血液衍生的CD34+細胞(參見其他實例)。值得注意的是，各sgRNA之編輯效率及編輯圖案兩者在所測試之所有供體中高度一致。BCL11A 之 CRISPR 阻斷基因表現或 γ 血球蛋白基因叢之突變增加 γ 血球蛋白轉錄及 F - 細胞產生 藉由sg1128之BCL11A之阻斷基因表現或藉由sg0067之γ血球蛋白基因叢處之潛在BCL11A結合位點的突變，兩者均顯著地增強γ血球蛋白轉錄物(圖33)，導致相比於經模擬編輯對照，F-細胞產生上調15%-20% (圖34)。總之，sg1128及sg0067可高效編輯CD34+細胞，且產生高度一致的編輯圖案。經編輯細胞在吾人之6天細胞處理步驟之末端維持大致90%CD34+細胞計數。細胞之擴增能力及存活力不由基因編輯步驟減弱。經編輯CD34+細胞，當分化為紅血球時，表現顯著高含量之γ血球蛋白轉錄物，轉變為增加數目之F細胞製造。此改良血色素表現，且F細胞數目可解救鐮狀細胞疾病之血液學特徵。實例 9 ： 衍生自鐮狀細胞疾病患者之經基因編輯之 HSPC 之活體內移植及表徵 實驗步驟 在與先前實例8中所描述相同的條件下，將來自鐮狀細胞疾病患者之CD34+細胞進行培養且進行基因編輯。使用先前實例中所描述相同的方法，表徵細胞之其生物功能。衍生自鐮狀細胞疾病個體之 CD34 + 細胞在編輯後維持其 CD34 + 免疫表型及存活力 維持其原始細胞狀態之造血幹細胞及祖細胞(HSPC)應表現CD34。此為與可移植造血幹細胞相關之在移植後的最重要臨床標記中的一者，且移植之成功與所移植CD34+細胞之數目直接相關。因此，吾人使用臨床上可接受之方法ISHAGE計數在編輯後獲自鐮狀個體之末梢血液的CD34+細胞數目。結果展示，當相比於經模擬編輯對照時，用sg1128以及sg0067之編輯均不影響CD34+細胞計數(圖35A及圖35B)。CD34+細胞之百分比在編輯後第3天維持在~80%(圖35B)。基因編輯亦不影響患者衍生之CD34+細胞擴增之能力(圖35C)，且其電穿孔(在D0電穿孔)後存活力在10天時間內所量測之所有時間點處高於75%(圖35D)。相比於來自健康供體之 CD34 + 細胞 ， 衍生自鐮狀細胞疾病個體之 CD34 + 細胞證明類似的編輯效率 Sg1128證明在衍生自鐮狀細胞患者之CD34+細胞中約65%編輯效率，而sg0067展示在患者樣本中80%-95%編輯效率(圖36)。編輯效率之含量類似於使用來自健康供體之骨髓或移動的末梢血液衍生之CD34+細胞所獲得的彼等。如藉由NGS (如實例2.1中所描述)所量測之各引導RNA之編輯圖案在不同患者中亦高度一致。基因編輯並不損害衍生自鐮狀細胞疾病個體之 CD34 + 細胞之活體外多譜系分化能力 經基因編輯之造血幹細胞及祖細胞完全能夠分化為紅血球系、顆粒球性、單核球性及巨核細胞譜系，如藉由群落形成單位分析所量測(圖37)。BCL11A 之 CRISPR 阻斷基因表現或 γ 血球蛋白基因叢之突變增加 γ 血球蛋白轉錄、 F - 細胞產生及胎兒血色素表現 藉由sg1128之BCL11A之阻斷基因表現或藉由sg0067在γ血球蛋白叢處產生插入缺失/缺失，顯著地增強的γ血球蛋白轉錄物(圖38)且增加F細胞之數目，如藉由流式細胞測量術所量測(圖39)。另外，F細胞之胎兒血色素表現強度亦在每細胞基礎上進行改良，如藉由流式細胞測量術所量測(圖40)。對患者衍生之 CD34 + 細胞進行基因編輯使得鐮狀細胞計數顯著降低且增加正常細胞數目 最終，為了理解基因編輯是否可解救鐮狀細胞形態，吾人對鐮狀細胞疾病患者衍生之CD34+細胞進行CRISPR編輯，使此等細胞分化為紅血球，且使此等細胞經受低氧腔室4天，以誘導鐮狀細胞形態。用抗HbF-FITC抗體對細胞進行共染色，固定在腔室內，且經受成像流式細胞測量術，以捕獲一個單一影像/細胞。單一細胞成像流式細胞測量術可基於細胞長度及呈高通量方式之HbF表現，而相對於正常細胞區分鐮狀細胞(來自各患者之40,000單一細胞影像用於資料分析)。結果展示，用sg1128或sg0067進行之基因編輯能夠降低鐮狀細胞計數大致40% (圖41A)且同時增加正常細胞計數1.2倍(圖41B)。降低鐮狀細胞計數及同時增加正常紅血球計數之複合效果當轉變至臨床時將極大地有益於患者。 總之，sg1128及sg0067可高效編輯來自鐮狀細胞疾病患者之CD34+細胞，且產生高度一致的編輯圖案。當將經編輯細胞與經模擬編輯對照組時進行比較，藉由基因編輯步驟不減弱CD34+細胞之百分比、細胞擴增能力及細胞之存活力。經編輯CD34+細胞，當分化為紅血球時，表現顯著高含量之γ血球蛋白轉錄物。此轉變為增加數目之F細胞以及增強的HbF表現/細胞。在吾人之單一細胞成像流式細胞測量術分析中反映高HbF表現之F細胞數目之增加及鐮狀紅血球數目之減少。當相比於經模擬編輯對照時，吾人在經基因編輯組中觀測到鐮狀細胞降低50%，且在經編輯組中同時高HbF表現之正常紅血球增加1.2倍。當轉變至臨床時，在基因編輯後降低鐮狀細胞數目與同時增加高HbF表現之正常紅血球之此複合效果應顯著地有益於患者。總之，此等資料支持CRISPR/Cas介導的基因體編輯作為治療β血球蛋白病之細胞療法手段的發展。 任何序列表與說明書中所引述之任何序列之間若存在不符，則說明書中所引述之序列應認為為正確序列。除非另外指示，否則所有基因體位置均係根據hg38。 以引用之方式併入 本文中所提及之所有公開案、專利及專利申請案均以全文引用的方式併入本文中，其引用的程度如各個別公開案、專利或專利申請案經特定及單獨地指示以引用的方式併入一般。在有衝突的情況下，以本申請案(包括本文中之任何定義)為準。 等效物 熟習此項技術者將認識到或能夠僅使用常規實驗即可確定本文所描述之本發明之具體實施例的許多等效物。雖然已參考特定態樣揭示本發明，但顯而易見熟習此項技術者可在不背離本發明之真實精神及範疇的情況下設計本發明之其他態樣及變化。所附申請專利範圍意欲理解為包括所有此類態樣及等效變化。
圖 1 ： 在編輯後7天之HbF誘導。對於所測試之各gRNA靶標序列，基於模擬轉染，具有經誘導HbF表現、經背景含量校正之細胞之百分比展示為具有指示標準差之誤差條的平均值。針對BCL11A之外顯子2之gRNA G8用作陽性對照。17%處之點線指示分析所選擇之臨限水準。各種灰色著色，如圖例中所指示，係關於相對於HBG1或HBG2靶標基因座中之編輯程度的HbF誘導程度。圖 2 ：HBG1靶標基因座處之編輯效率。對於所測試之各gRNA，藉由NGS偵測之插入缺失之百分比展示為具有指示標準差之誤差條的平均值。針對BCL11A之外顯子2之gRNA G8用作陽性對照。未獲得NGS資料之兩個引導物由箭頭指示。圖 3 ：HBG2靶標基因座處之編輯效率。對於所測試之各gRNA，藉由NGS偵測之插入缺失之百分比展示為具有指示標準差之誤差條的平均值。針對BCL11A之外顯子2之gRNA G8用作陽性對照。未獲得NGS資料之十六個引導物由箭頭指示。圖 4 ：高效能gRNA靶標序列(例如在第7天＞17% HbF上調)之位置之綜覽，該等靶標序列已知HBG1啟動子區域中之非缺失型HPFH多態性及轉錄因子結合位點。該圖按出現之次序分別揭示SEQ ID 293-312。圖 5 ：高效能gRNA靶標序列(例如在第7天＞17% HbF上調)之位置之綜覽，該等靶標序列已知HBG2啟動子區域中之非缺失型HPFH多態性及轉錄因子結合位點。該圖按出現之次序分別揭示SEQ ID 313-332。圖 6 ： CD34+ HSPC中之所靶向B2M基因座處之藉由不同Cas9變體的編輯效率，如藉由NGS及流式細胞測量術所評價。NLS = SV40 NLS；His6 (SEQ ID NO: 247)或His8 (SEQ ID NO: 248)分別係指6個(SEQ ID NO: 247)或8個(SEQ ID NO: 248)組胺酸殘基；TEV =菸草蝕刻病毒裂解位點；Cas9 =野生型化膿性鏈球菌Cas9，突變或變體如所指示。圖 7 ： 在於HSPC用含有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔後之紅血球系分化後之第7 (黑色條)、14 (淺灰色條)或21 (暗灰色條)天藉由流式細胞測量術的HbF陽性細胞的偵測及定量。已減去針對在各時間點未用sgRNA處理之對照培養物的百分比HbF+細胞。指示平均值+標準差(技術性重複n=2)。圖 8 ： 在於HSPC用含有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔後之紅血球系分化後之第7 (空心黑色條)、14 (空心淺灰色條)或21 (空心暗灰色條)天藉由流式細胞測量術的HbF陽性細胞的偵測及定量。已減去針對在各時間點未用sgRNA處理之對照培養物的百分比HbF+細胞。展示兩個獨立細胞供體之平均值(條)，以及各供體(圓形=第一供體、三角形=第二供體)之值。圖 9 . 自來自用含有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔後之細胞或未用sgRNA處理之對照細胞的所指示反應P1、P2或P3 (如實例中所描述)之PCR產物的觀測。預期產物如下：P1，野生型/小插入缺失對偶基因或4.9 kb倒位對偶基因為7.7 kb、4.9 kb缺失對偶基因為2.8 kb。P2，野生型/小插入缺失對偶基因為3.8 kb，4.9 kb缺失或4.9 kb倒位對偶基因為無產物。P3，4.9 kb倒位對偶基因為1.8 kb，野生型/小插入缺失對偶基因或4.9 kb缺失對偶基因為無產物。L = DNA參考階梯。* = 自此帶分離且經受下一代定序的DNA。圖 10 ： 指示定量4.9 kb缺失之數位液滴PCR分析之引子及探針結合位點之基因體位置的示意圖。引子(5.2 kb Fwd及5.2 kb Rev)及探針(FAM探針)結合至HBG2之下游及HBG1之上游的基因間位點。探針具有HBG2之上游之第二結合位點，但該區不與引子結合。指示靶向域位於HBG1及HBG2啟動子中之區域。若插入兩個靶向域區之序列缺失，則HBG1與HBG2之間的引子/探針結合位點將丟失。圖 11 ： 用含有GCR-0067靶向域之sgRNA之RNP電穿孔後之細胞樣本的HSPC亞群的分選流程。展示靶向所指示細胞表面標記之免疫染色後之細胞螢光的點狀圖。如所展示來分選以下群體：P5 = CMP (CD34+CD45RA-CD38+)、P9 = MPP (CD34+CD45RA-CD38-CD90-CD49f-)、P10 = ST-HSC (CD34+CD45RA-CD38-CD90-CD49f+)、P11 = LT-HSC (CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49f+)。亦分選總CD34+細胞(未展示)。圖 12 ： 用含有GCR-0067靶向域之sgRNA之RNP電穿孔後之所分選HSPC亞群的編輯百分比。HBG1插入缺失及HBG2插入缺失分別指示小插入之百分比及由HBG1或HBG2啟動子區靶向域處或附近之PCR擴增之下一代定序鑑別的缺失(應注意，具有先前所描述之4.9 kb缺失或倒位的等位基因不擴增)。HBG1-HBG2缺失指示具有4.9 kb缺失之等位基因之百分比，如藉由實例中描述之數位液滴PCR分析所測定。總編輯為一近似值，其藉由HBG1-HBG2缺失的百分比加上不具有HBG1-HBG2缺失之百分比，乘以HBG2插入缺失百分比來計算。圖 13 ： 圖13A展示在引入包含GCR-0067之靶向域之sgRNA之後，在所陳述細胞類型中之HBG1基因座處觀測到的所有插入缺失的總和。排列插入缺失，其中最頻繁觀測到的插入缺失在各條之頂部。此分析中未定量的為包含HBG1與HBG2基因座之間的大型4.9kb缺失的細胞級分。最普遍插入缺失中之每一者之條內之數字指示與野生型基因體序列相差之核苷酸數目(-指示缺失；+指示插入)。圖13B展示在引入包含GCR-0067之靶向域之sgRNA之後，在所陳述細胞類型中之HBG2基因座處觀測到的所有插入缺失的總和。排列插入缺失，其中最頻繁觀測到的插入缺失在各條之頂部。此分析中未定量的為包含HBG1與HBG2基因座之間的大型4.9kb缺失的細胞級分。最普遍插入缺失中之每一者之條內之數字指示與野生型基因體序列相差之核苷酸數目(-指示缺失；+指示插入)。CMP = CD34+CD45RA-CD38+細胞；MPP = CD34+CD45RA-CD38-CD90-CD49f-細胞；ST-HSC = CD34+CD45RA-CD38-CD90-CD49f+細胞；以及LT-HSC = CD34+CD45RA-CD38-CD90+CD49f+細胞。圖 14 ： 用含有所指示靶向域之sgRNA之RNP電穿孔後之對應於所指示次型CFU-GEMM (暗灰色條)、CFU-G/M/GM (中等灰色條)或BFU-E/CFU-E (淺灰色條)的群落或未用sgRNA處理的對照培養物的百分比。指示平均值+/-標準差(獨立供體n=2)。圖 15 ： 在用含有GCR-0067靶向域之sgRNA之RNP電穿孔後，如所指示之總有核細胞(TNC)、CD34陽性細胞(CD34+)及CD34與CD90雙陽性細胞(CD34+CD90+)或未用sgRNA處理之對照培養物於包含化合物4的介質中的倍數增殖。指示平均值+/-標準差(獨立供體n=2)。展示三個獨立細胞供體之平均值(條)，以及各供體(正方形=供體A、三角形=供體B、圓形=供體C)之值。藉由不配對t-測試(GraphPad Prism)，經編輯培養物與對照培養物之間的差異不顯著(ns)。圖 16 ： 藉由流式細胞測量術之細胞群體之代表性閘控。展示靶向指示細胞表面標記或同型對照(同型)之免疫染色後之細胞螢光的點狀圖。用粗體框指示之閘控用於量化所指示群體之百分比，且設定成排除同型對照標記的細胞。僅活細胞預閘控為DAPI陰性，且在細胞正向分散及側向分散內，展示閘控且該等閘控衍生自僅用Cas9電穿孔之供體C。圖 17 ： 在用含有GCR-0067靶向域之sgRNA之RNP電穿孔(黑色條)後或未用sgRNA處理之對照培養物(灰色條)之具有所指示細胞細胞表面表型的細胞的百分比，如藉由流式細胞測量術所評定。在包含化合物4之介質中RNP電穿孔後2天，使細胞擴增，且藉由流式細胞測量術評定，如圖16中所描述。指示平均值+標準差(獨立供體n=3)。對於既定群體，藉由不配對t-測試(GraphPad Prism)，經編輯細胞與未經編輯之間不存在顯著差異。圖 18A .衍生自用Cas9及無sgRNA模擬編輯之鐮狀細胞疾病患者(SCD1)之模擬編輯HSC中之血球蛋白次單位的CE-MS定量。在細胞分化為紅血球系譜系之後，細胞展示正常含量之α血球蛋白、由於鐮狀純合性所致之無正常β血球蛋白、高含量之鐮狀β血球蛋白次單位及低含量之胎兒γ血球蛋白。圖 18B .衍生自鐮狀細胞患者(SCD1)之基因體編輯的HSPC中之血球蛋白次單位的CE-MS定量。在編輯HSC之後，衍生自樣本患者之紅血球系細胞展現胎兒γ血球蛋白上調40%及同時鐮狀β血球蛋白次單位下調50%。圖 19 . 研究基因編輯的細胞之移植之示意性方案。用Cas9及包含CR001128 (sg1128)之靶向域之sgRNA基因編輯的HSC的移植。用gRNA模擬編輯或用sg1128基因編輯500000個人類CD34+細胞，隨後將該等細胞注射至2 Gy輻射的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl /SzJ (NSG)接受者中。在4、8、12、16週對小鼠進行抽血，在移植後16週收集骨髓細胞。圖 20 . 使用實驗方案在移植後16週進行之骨髓復原展示於圖19中。圖 21 . 使用實驗方案，骨髓、B及T淋巴細胞於末梢血液及骨髓中在多個時間點之復原展示於圖19中。N=5/組，資料展示min至max，4個獨立實驗。圖 22 .評價相比於來自BCL11A基因之紅血球系特異性增強子區(sg-G1128；亦被稱作sg1128)，用來自γ血球蛋白啟動子區之sgRNA (sg-G0008、sg-G0051、sg-G0010、sg-G0048、sg-G0067)編輯之HSC的幹細胞功能的移植研究的示意圖。將細胞置於電穿孔後24小時之培養物中。電穿孔之前及之後兩者之培養條件為StemSpan SFEM+IL6，SCF，TPO，Flt3L；750 nM 化合物4。圖 23 ： NSG小鼠中之20週內之人類移植及譜系分析。圖 23A ) 18週內之末梢血液嵌合；圖 23B ) 18週時之末梢血液中之譜系分佈。骨髓分析：圖 23C ) 9週時之人類細胞之骨髓分析；圖 23D ) 9週時之骨髓中之人類CD45+移植及人類細胞之譜系分佈；圖 23E ) 移植後20週時之骨髓中之人類CD45+移植；圖 23F ) 20週時骨髓中之移植細胞的譜系分佈。圖 24A .相比於用BCL11A基因之紅血球系特異性增強子區之sgRNA (sg1128)，用與γ血球蛋白啟動子區具有同源性之sgRNA (sg-G0008、sg-G0051、sg-G0010、sg-G0048、sg-G0067)編輯的HSC的移植效率。展示移植後8週時之NSG小鼠中之人類細胞移植。N=10/組，3個獨立實驗。曲線展示合併的資料。圖 24B .相比於用BCL11A基因之紅血球系特異性增強子區之sgRNA (sg1128)，用與γ血球蛋白啟動子區具有同源性之sgRNA (sg-G0008、sg-G0051、sg-G0010、sg-G0048、sg-G0067)編輯的HSC的移植效率。展示移植後20週時之NSG小鼠中之人類細胞移植。N=10/組，3個獨立實驗。曲線展示合併的資料。圖 25 .基因編輯之CD34+細胞移植的NSG小鼠的多譜系復原。N=10/組，資料來自一個代表性實驗。圖 26 . 在移植前後維持高編輯效率。「Xpt前」：編輯後但移植前之人類CD34+細胞中之個別sgRNA之編輯效率及插入缺失圖案，如藉由NGS所量測。「Xpt後8週」：骨髓移植後8週之小鼠中之人類CD34+細胞中之編輯效率及插入缺失圖案，如藉由NGS所量測。「Xpt後20週」：骨髓移植後20週之小鼠中之人類CD34+細胞中之編輯效率及插入缺失圖案，如藉由NGS所量測。每組重複進行三次電穿孔，資料來自一個代表性實驗。如關於本圖中所使用的，「插入缺失」係指小於200個核苷酸之所有插入缺失；「大型缺失」係指針對各gRNA之預測HBG1與HBG2結合位點之間的序列缺失。圖 27 . 用 RNP編輯後之CD34+細胞之NGS分析。sgRNA靶向特異性區指示於x軸上。圖27A：RNP電穿孔後第2天之CD34+細胞之NGS分析。圖27B：移植後9週時之來自移植有經編輯骨髓CD34+細胞之NSG小鼠之完全骨髓的NGS分析。圖27C：移植後20週時之來自移植有經編輯骨髓CD34+細胞之NSG小鼠之完全骨髓的NGS分析。插入插入缺失以黑色指示，缺失插入缺失(排除包含刪除針對gRNA sg-G51、sg-G48及sg-G67中之每一者之結合HBG1與HBG2靶標序列之間的區的大型缺失)以灰色指示。總編輯%由條之高度表示。N=10，資料以來自一個獨立實驗之平均值±SEM呈現。圖 28 . 基因編輯、長期移植的人類HSC在紅血球系細胞分化後能夠產生增加含量之HbF。自8週或20週移植的NSG小鼠之骨髓分選50000個人類CD34+細胞。將分選細胞接種至紅血球系分化培養基中14-21天。分析培養物中之成熟紅血球之HbF表現，且計數藉由流式細胞測量術之HbF+細胞之數目。模擬對照表示用Cas9不用gRNA編輯之CD34+細胞，且以與基因編輯的對照組相同的方式將其移植至NSG小鼠中。N=10/組，3個獨立實驗。圖 29 . 使用dsDNA寡核苷酸插入方法評定Cas9過度表現之HEK-293細胞中之HBG1及/或HBG2引導RNA的脫靶活性。指示所偵測之靶向位點(空心圓)及潛在脫靶位點(實心圓)；y軸指示偵測之頻率。以dgRNA形式測試所有gRNA，其中靶向域由CRxxxxxx標識符指示。圖 30 . 使用dsDNA寡核苷酸插入方法評定Cas9過度表現之HEK-293細胞中之HBG1及/或HBG2引導RNA的脫靶活性。指示所偵測之靶向位點(空心圓)及潛在脫靶位點(實心圓)；y軸指示偵測之頻率。以以下形式中之任一者測試gRNA：dgRNA形式，其中靶向域由CRxxxxx標識符指示；或以sgRNA形式，其中靶向域由Gxxxxxx標識符指示。圖 31A . 基因編輯後衍生自健康個體之移動的末梢血液的細胞的CD34+細胞計數。在第0天將細胞解凍，在第3天電穿孔前培養3天。藉由ISHAGE，電穿孔後10天內之CD34+細胞數目之計數。兩個獨立實驗重複進行兩次。總N=5。圖以平均值±SEM展示來自1個實驗之資料。圖 31B . 衍生自基因編輯後之健康個體之移動的末梢血液的細胞的CD34+細胞擴增。在第0天將細胞解凍，在第3天電穿孔前培養3天。在編輯後第3、7及10天之總單核細胞之擴增。兩個獨立實驗重複進行兩次。總N=5。圖以平均值±SEM展示來自1個實驗之資料。圖 31C . 衍生自基因編輯後之健康個體之移動的末梢血液的細胞的CD34+細胞存活力。在第0天將細胞解凍，在第3天電穿孔前培養3天。在編輯後相同時間點之單核細胞之存活力。兩個獨立實驗重複進行兩次。總N=5。圖以平均值±SEM展示來自1個實驗之資料。圖 32A . 自健康個體之末梢血液移動之CD34+細胞中之sg1128及sg0067的編輯效率。所展示為在使用sg1128 (靶向ESH之BCL11A +58區)及sg0067 (靶向HbG-1及HbG-2基因叢)編輯後由NGS捕獲之插入缺失的百分比。此曲線亦指示sg1128之總編輯效率，由於僅小插入缺失為由此sgRNA產生的。多於五個獨立實驗重複進行兩次或重複進行三次，n=2-3/實驗。圖 32B . 自健康個體之末梢血液移動之CD34+細胞中之sg1128及sg0067的編輯效率。在使用sg0067 (靶向HbG-1及HbG-2基因叢)編輯後由NGS捕獲之插入缺失的百分比。所展示為sg0067之總編輯效率及編輯圖案。sg0067之編輯圖案由5kb大型缺失(由黑色條指示)及較小插入缺失(由灰色條指示)組成。多於五個獨立實驗重複進行兩次或重複進行三次，n=2-3/實驗。圖 33 . 在BCL11A之CRISPR阻斷基因表現或在HBG1/2區中形成插入缺失/缺失後，γ血球蛋白轉錄物於來自患者樣本之紅血球系細胞中的倍數變化。衍生自健康供體之移動的末梢血液之CD34+細胞由CRISPR編輯，且在活體外分化為紅血球系譜系，如先前步驟中所描述。在紅血球系分化之第11天，自培養物收集細胞，且使其經受qPCR以量測標準化至GAPDH之γ血球蛋白及β血球蛋白轉錄物。實驗獨立地進行兩次，各自重複進行兩次，n=2-3/實驗。資料展示來自一個研究之合併供體之平均值±SEM。圖 34 . 在基因編輯後來自健康個體之HbF+細胞之計數。衍生自健康供體之移動的末梢血液之CD34+細胞由CRISPR編輯，且在活體外分化為紅血球系譜系，如先前步驟中所描述。在紅血球系分化之第10天，用抗HbF-FITC抗體對細胞進行染色以藉由流式細胞測量術計數HbF+細胞。實驗獨立地進行兩次，各自重複進行兩次，n=2-3/實驗。資料展示來自一個研究之平均值±SD。圖 35A . 在基因編輯後衍生自鐮狀細胞疾病個體之末梢血液之CD34+細胞的擴增及存活力。在電穿孔之前，將細胞培養6-10天。D0係指電穿孔之日。所展示為在電穿孔後10天內藉由ISHAGE之CD34+細胞的絕對計數。N=4，資料展示平均值±SEM。4個獨立實驗重複進行兩次。自各時間點之左側至右側，各條為模擬、sg1128、sg0067。圖 35B . 在基因編輯後衍生自鐮狀細胞疾病個體之末梢血液之CD34+細胞的擴增及存活力。在電穿孔之前，將細胞培養6-10天。D0係指電穿孔之日。所展示為在電穿孔後10天內藉由ISHAGE之CD34+細胞的百分比。N=4，資料展示平均值±SEM。4個獨立實驗重複進行兩次。自各時間點之左側至右側，各條為模擬、sg1128、sg0067。圖 35C . 在基因編輯後衍生自鐮狀細胞疾病個體之末梢血液之CD34+細胞的擴增及存活力。在電穿孔之前，將細胞培養6-10天。D0係指電穿孔之日。所展示為在編輯後第3、7及10天之總單核細胞之擴增。N=4，資料展示平均值±SEM。4個獨立實驗重複進行兩次。自各時間點之左側至右側，各條為模擬、sg1128、sg0067。圖 35D . 在基因編輯後衍生自鐮狀細胞疾病個體之末梢血液之CD34+細胞的擴增及存活力。在電穿孔之前，將細胞培養6-10天。D0係指電穿孔之日。所展示為編輯後第3、7及10天之單核細胞之存活力。N=4，資料展示平均值±SEM。4個獨立實驗重複進行兩次。自各時間點之左側至右側，各條為模擬、sg1128、sg0067。圖 36 . 來自鐮狀細胞疾病患者樣本之CD34+細胞中之sg1128及sg0067之編輯效率。sg0067之編輯圖案由大型缺失(灰色)及小插入缺失(黑色)之總和指示。資料展示四個獨立編輯實驗之平均值±SEM，該等實驗用來自四個不同鐮狀細胞疾病患者(SCD1-4)之CD34+細胞重複進行兩次。圖 37 . HSPC之活體外多譜系分化能力，如藉由群落形成單位分析所量測。BFU-E = 母細胞形成單位，紅血球系；CFU-GM = 群落形成單位，粒細胞、單核球；CFU-GEMM = 群落形成單位，粒細胞、紅血球系、單核球、巨核細胞。曲線展示來自三個不同鐮狀細胞疾病患者(SCD1-3)之CD34+細胞之三個獨立實驗。實驗重複進行三次。資料表示平均值±SEM。圖 38 . 在BCL11A之CRISPR阻斷基因表現或γ血球蛋白基因叢處形成插入缺失/缺失後來自患者樣本之紅血球系細胞中之γ血球蛋白轉錄物的倍數變化。衍生自3個鐮狀細胞疾病患者(SCD1-3)之CD34+細胞由CRISPR編輯，且活體外分化為紅血球系譜系，如實例中所描述。在紅血球系分化之第11天，自培養物收集細胞，且使其經受qPCR以量測標準化至GAPDH之γ血球蛋白及β血球蛋白轉錄物。實驗重複進行兩次。資料展示合併供體之平均值±SEM。圖 39 . 在基因編輯後鐮狀細胞疾病患者樣本中之HbF+細胞之計數。衍生自3個鐮狀細胞疾病患者(SCD1-3)之CD34+細胞由CRISPR編輯，且活體外分化為紅血球系譜系，如實例中所描述。在紅血球系分化之第11、14及21天，用抗HbF-FITC抗體對細胞進行染色以藉由流式細胞測量術計數HbF+細胞。實驗重複進行兩次。資料展示平均值±SEM。在第11天所展示為來自SCD1-3之結果；在第14天所展示為來自SCD-1及SCD-2之結果；在第21天所展示為來自SCD-2及SCD-3之結果。圖 40 . 藉由流式細胞測量術，基因編輯的鐮狀細胞疾病患者樣本中之胎兒血色素表現的量測。衍生自3個鐮狀細胞疾病患者(SCD1-3)之CD34+細胞由CRISPR編輯，且活體外分化為紅血球系譜系，如實例中所描述。在紅血球系分化之第11、14及21天，用抗HbF-FITC抗體對細胞進行染色以藉由流式細胞測量術量測各細胞之HbF表現強度。實驗重複進行兩次。資料展示平均值±SEM。MFI=平均螢光強度。在第11天所展示為來自SCD1-3之結果；在第14天所展示為來自SCD-1及SCD-2之結果；在第21天所展示為來自SCD-2及SCD-3之結果。圖 41 . 在CRISPR編輯患者樣本後鐮狀細胞與正常細胞之數目的計數。衍生自3個鐮狀細胞疾病患者(SCD1-3)之CD34+細胞由CRISPR編輯，且在活體外分化為紅血球系譜系，如先前步驟中所描述。在紅血球系分化之第21天，使細胞經受%低氧腔室4天，固定，且隨後進行單一細胞成像流式細胞測量術。圖41A (左圖)展示基因編輯的患者樣本中之鐮狀細胞之數目之變化，如藉由單一細胞成像所計數。圖41B (右圖)展示患者樣本中之基因編輯後之正常細胞之數目之變化，如藉由單一細胞成像所計數。進行三個獨立實驗，其中各實驗重複兩次。自各患者計數40000個單一細胞影像。曲線展示來自合併資料之平均值±SEM。

Claims (92)

  1. 一種gRNA分子，其包含tracr及crRNA，其中該crRNA包含靶向域，該靶向域： a)與-鏈hg38之Chr11:5,250,094-5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； b)與-鏈hg38之Chr11:5,255,022-5,255,164處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； c)與非缺失性HFPH區(例如人類非缺失性HPFH區)之靶標序列互補； d)與-鏈hg38之Chr11:5,249,833至Chr11:5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； e)與-鏈hg38之Chr11:5,254,738至Chr11:5,255,164處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； f)與-鏈hg38之Chr11: 5,249,833-5,249,927處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； g)與-鏈hg38之Chr11: 5,254,738-5,254,851處之基因體核酸序列內之靶標序列互補； h)與-鏈hg38之Chr11:5,250,139-5,250,237處之基因體核酸序列內之靶標序列互補；或 i)其組合。
  2. 如請求項1之gRNA分子，其中該靶向域包含，例如由SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO: 72中之任一者或其片段組成。
  3. 如請求項2之gRNA分子，其中該靶向域包含，例如由以下中之任一者組成：SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 50、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 62、SEQ ID NO: 63或其片段。
  4. 如請求項2之gRNA分子，其中該靶向域包含，例如由以下中之任一者組成 a)SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 48、SEQ ID NO: 51，或其片段；或 b)SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 54，或其片段。
  5. 如請求項2至4中任一項之gRNA分子，其中該靶向域包含，例如由該等所引述靶向域序列中之任一者之17、18、19或20個連續核酸組成。
  6. 如請求項5之gRNA分子，其中該等所引述靶向域序列中之任一者之該等17、18、19或20個連續核酸為位於所引述靶向域序列之3'端處之17、18、19或20個連續核酸。
  7. 如請求項5之gRNA分子，其中該等所引述靶向域序列中之任一者之該等17、18、19或20個連續核酸為位於所引述靶向域序列之5'端處之17、18、19或20個連續核酸。
  8. 如請求項5之gRNA分子，其中該等所引述靶向域序列中之任一者之該等17、18、19或20個連續核酸不包含所引述靶向域序列之5'或3'核酸。
  9. 如請求項2至4中任一項之gRNA分子，其中該靶向域由所引述靶向域序列組成。
  10. 如請求項1至4中任一項之gRNA分子，其中該靶向域包含，例如由SEQ ID NO: 67組成。
  11. 如請求項1至4中任一項之gRNA分子，其中該gRNA分子為雙引導RNA分子。
  12. 如請求項1至4中任一項之gRNA分子，其中該gRNA分子為單引導RNA分子。
  13. 如請求項12之gRNA分子，其包含： (a) SEQ ID NO: 195； (b) SEQ ID NO: 231；或 (c)以上(a)或(b)中之任一者，其在3'端進一步包含1、2、3、4、5、6或7個尿嘧啶(U)核苷酸；其中(a)至(c)中之任一者之序列位於該靶向域之3'，視情況緊接著3'處。
  14. 如請求項1之gRNA分子，其包含，例如由以下序列組成： (a) SEQ ID NO: 174； (b) SEQ ID NO: 175；或 (c) SEQ ID NO: 176。
  15. 如請求項1之gRNA分子，其包含，例如由以下組成： (a) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 177組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成； (b) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 177組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成； (c) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 178組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 224組成；或 (d) crRNA，其包含，例如由SEQ ID NO: 178組成；及tracr，其包含，例如由SEQ ID NO: 73組成。
  16. 如請求項1至4、14及15中任一項之gRNA分子，其中 a)當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，在與該gRNA分子之該靶向域互補之該靶標序列處或附近形成插入缺失；及/或 b)當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞中時，產生包含序列之缺失，例如其包含同HBG1啟動子區中之gRNA靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)之序列與同HBG2啟動子區中之gRNA靶向域互補(例如至少與該gRNA靶向域90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)之序列之間的實質上所有序列。
  17. 如請求項16之gRNA分子，其中該插入缺失不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸，視情況其中該插入缺失不包含非缺失性HPFH或轉錄因子結合位點之核苷酸。
  18. 如請求項1至4、14及15中任一項之gRNA分子，其中當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞群體中時，在該群體之以下百分比之該等細胞中，與該gRNA分子的該靶向域互補的靶標序列處或附近形成插入缺失：至少約15%，例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約30%、例如至少約40%、例如至少約50%、例如至少約55%、例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約75%。
  19. 如請求項1至4、14及15中任一項之gRNA分子，其中當將包含該gRNA分子之CRISPR系統(例如如本文中所描述之RNP)引入至細胞(例如細胞群體)中時： (a)在該細胞或其子代，例如其紅血球系子代、例如其紅血球子代中胎兒血色素之表現增加，視情況其中相對於不將該gRNA分子引入的細胞群體或其子代群體，例如其紅血球系子代、例如其紅血球子代中的胎兒血色素的表現量，胎兒血色素的該表現增加至少約15%，例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約25%、例如至少約30%、例如至少約35%、例如至少約40%； (b)該細胞或細胞群體或其子代，例如其紅血球系子代、例如其紅血球子代產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞； (c)在該細胞中不形成脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部不形成脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測；及/或 (d)在該細胞群體之多於約5%，例如多於約1%、例如多於約0.1%、例如多於約0.01%之該等細胞中未偵測到脫靶插入缺失，例如HBG1及/或HBG2啟動子區域外部無脫靶插入缺失，例如如藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測。
  20. 如請求項16至19中任一項之gRNA分子，其中該細胞為(或細胞群體包含)哺乳動物、靈長類或人類細胞，例如為人類細胞，視情況其中該細胞獲自患有血色素異常症之患者，該血色素異常症為例如鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，例如β-地中海型貧血。
  21. 如請求項20之gRNA分子，其中該細胞為(或細胞群體包含)HSPC，視情況CD34+ HSPC，視情況CD34+CD90+ HSPC。
  22. 如請求項16至21中任一項之gRNA分子，其中該細胞對於待投與該細胞之患者而言為自體或同種異體的。
  23. 一種組合物，其包含： 1)一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)及Cas9分子； 2)一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)及編碼Cas9分子之核酸； 3)編碼一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)之核酸及Cas9分子； 4)編碼一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子(包括第一gRNA分子)的核酸及編碼Cas9分子的核酸；或 5)以上1)至4)中之任一者，及模板核酸；或 6)以上1)至4)中之任一者，及包含編碼模板核酸之序列之核酸。
  24. 一種組合物，其包含如請求項1至22中任一項之第一gRNA分子，其進一步包含Cas9分子，視情況其中該Cas9分子為活性或非活性化膿性鏈球菌(s . pyogenes ) Cas9，視情況其中該Cas9分子包含SEQ ID NO: 205或與其具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同源性之序列。
  25. 如請求項23或24之組合物，其中該Cas9分子包含，例如由以下組成： (a) SEQ ID NO: 233； (b) SEQ ID NO: 234； (c) SEQ ID NO: 235； (d) SEQ ID NO: 236； (e) SEQ ID NO: 237； (f) SEQ ID NO: 238； (g) SEQ ID NO: 239； (h) SEQ ID NO: 240； (i) SEQ ID NO: 241； (j) SEQ ID NO: 242； (k) SEQ ID NO: 243；或 (l) SEQ ID NO: 244。
  26. 如請求項23或24之組合物，其中該第一gRNA分子及該Cas9分子以核糖核酸蛋白複合物(RNP)存在。
  27. 如請求項23或24之組合物，其調配於適合於電穿孔之介質中。
  28. 如請求項23或24之組合物，其中該等gRNA分子中之每一者處於具有本文中所描述之Cas9分子之RNP中，且其中該RNP中之每一者在小於約10 μM濃度下、例如小於約3 μM、例如小於約1 μM、例如小於約0.5 μM、例如小於約0.3 μM、例如小於約0.1 μM，視情況其中該RNP之濃度約為2 μM或約為1 μM，視情況其中該組合物進一步包含細胞群體，該等細胞為例如HSPC。
  29. 一種核酸序列，其編碼一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子。
  30. 一種載體，其包含如請求項29之核酸序列，視情況其中該載體選自由以下組成的群組：慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒(AAV)載體、單純疱疹病毒(HSV)載體、質體、小環、奈米質體及RNA載體。
  31. 一種在細胞內之靶標序列處或附近更改該細胞(例如細胞群體) (例如更改核酸之結構(例如序列))之方法，其包含使該細胞(例如細胞群體)與以下接觸(例如向其中引入)： 1)一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子及Cas9分子； 2)一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子及編碼Cas9分子之核酸； 3)編碼一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子的核酸及Cas9分子； 4)編碼一或多個如請求項1至22中任一項之gRNA分子的核酸及編碼Cas9分子的核酸； 5)以上1)至4)中之任一者，及模板核酸； 6)以上1)至4)中之任一者，及包含編碼模板核酸之序列之核酸； 7)如請求項23至28中任一項之組合物；或 8)如請求項30之載體。
  32. 如請求項31之方法，其中該細胞為動物細胞，例如哺乳動物、靈長類或人類細胞，例如為人類細胞；視情況其中該細胞獲自患有血色素異常症之患者，該血色素異常症為例如鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，例如β-地中海型貧血。
  33. 如請求項31至32中任一項之方法，其中該細胞為HSPC，視情況CD34+ HSPC，視情況CD34+CD90+ HSPC。
  34. 如請求項31至32中任一項之方法，其中該細胞位於包含已增濃CD34+細胞之細胞群體的組合物中。
  35. 如請求項31至32中任一項之方法，其中該細胞(例如細胞群體)已自骨髓、末梢血液(例如移動的末梢血液)或臍帶血分離。
  36. 如請求項31至32中任一項之方法，其中該細胞對於待投與該細胞之患者而言為自體或同種異體的。
  37. 如請求項31至32中任一項之方法，其中： a)該更改在與該一或多個gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近產生插入缺失；及/或 b)該更改產生包含序列之缺失，例如同HBG1啟動子區中之一或多個gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之一或多個gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列，視情況其中該缺失不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸。
  38. 如請求項31至32中任一項之方法，其中： (a)該方法產生細胞群體，其中至少約15%，例如至少約17%、例如至少約20%、例如至少約30%、例如至少約40%、例如至少約50%、例如至少約55%、例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約75%之該群體已更改，例如包含插入缺失，視情況其中該插入缺失選自表2-7中列舉之插入缺失，視情況其中該群體之該等細胞不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失； (b)該更改產生能夠分化為紅血球系譜系之分化細胞(例如紅血球)的細胞(例如細胞群體)，且其中該分化細胞例如相對於未更改細胞(例如細胞群體)呈現增加含量的胎兒血色素； (c)該更改產生能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)的細胞群體，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)；及/或 (d)該更改產生能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)的細胞(例如細胞群體)，且其中該分化細胞產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。
  39. 一種細胞，其藉由如請求項31至38中任一項之方法更改；或一種細胞，其可藉由如請求項31至38中任一項之方法獲得。
  40. 一種細胞，其包含表7-2中描述之插入缺失，視情況其中該細胞不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失。
  41. 一種細胞，其包含如請求項1至22中任一項之第一gRNA分子、或如請求項23至28中任一項之組合物、如請求項29之核酸序列或如請求項30之載體。
  42. 如請求項39至41中任一項之細胞，其中該細胞能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞例如相對於尚未經修飾以包含gRNA分子之相同類型之細胞呈現增加含量的胎兒血色素，視情況其中該分化細胞(例如紅血球系譜系之細胞，例如紅血球)例如相對於尚未經修飾以包含gRNA分子之相同類型之分化細胞產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素。
  43. 如請求項39至41中任一項之細胞，其已與幹細胞擴增劑接觸。
  44. 如請求項43之細胞，其中該幹細胞擴增劑為： a) (1r,4r)-N1 -(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺； b) 4-(3-哌啶-1-基丙胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯； c)4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-異丙基-9H-嘌呤-6-基胺基)乙基)苯酚； d)(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇；或 e)其組合(例如(1r,4r)-N1 -(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。
  45. 一種細胞，例如如請求項39至41中任一項之細胞，其包含： a)在與如請求項1至22中任一項之gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近的插入缺失；及/或 b)包含序列之缺失，例如同HBG1啟動子區中之如請求項1至22中任一項之gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之如請求項1至22中任一項之gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列，視情況其中該缺失不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸。
  46. 如請求項39至41中任一項之細胞，其中該細胞為動物細胞，例如哺乳動物、靈長類或人類細胞，例如為人類細胞；視情況其中該細胞獲自患有血色素異常症之患者，該血色素異常症為例如鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，例如β-地中海型貧血。
  47. 如請求項39至41中任一項之細胞，其中該細胞為HSPC，視情況CD34+ HSPC，視情況CD34+CD90+ HSPC。
  48. 如請求項39至41中任一項之細胞，其中該細胞(例如細胞群體)已自骨髓、末梢血液(例如移動的末梢血液)或臍帶血分離。
  49. 如請求項39至41中任一項之細胞，其中該細胞對於待投與該細胞之患者而言為自體或同種異體的。
  50. 一種細胞群體，其包含如請求項39至49中任一項之細胞，視情況其中至少約50%，例如至少約60%、例如至少約70%、例如至少約80%、例如至少約90% (例如至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%)之該群體之該等細胞為如請求項39至49中任一項之細胞。
  51. 如請求項50之細胞群體，其中該細胞群體能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於未經修飾的相同類型細胞的群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約17%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)；視情況其中該分化細胞群體的該等F細胞產生平均至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞。
  52. 如請求項50至51中任一項之細胞群體，其包含： 1)至少1e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重； 2)至少2e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重； 3)至少3e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重； 4)至少4e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重；或 5) 2e6至10e6個CD34+細胞/公斤待投與該等細胞之患者體重。
  53. 如請求項50至51中任一項之細胞群體，其中至少約40%，例如至少約50% (例如至少約60%、至少約70%、至少約80%或至少約90%)之該群體之該等細胞為CD34+細胞，視情況其中至少約10%，例如至少約15%、例如至少約20%、例如至少約30%之該群體之該等細胞為CD34+CD90+細胞。
  54. 如請求項50至51中任一項之細胞群體，其中該細胞群體衍生自臍帶血、末梢血液(例如移動的末梢血液)或骨髓，例如衍生自骨髓。
  55. 如請求項50至51中任一項之細胞群體，其中該細胞群體包含，例如由哺乳動物細胞組成，例如人類細胞；視情況其中該細胞群體獲自患有血色素異常症之患者，該血色素異常症為例如鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，例如β-地中海型貧血。
  56. 如請求項50至51中任一項之細胞群體，其中該細胞群體(i)對於待投與其之患者而言為自體的，或(ii)對於待投與其之患者而言為同種異體的。
  57. 例如如請求項50至51中任一項之細胞群體(例如CD34+細胞)，其包含如表7-2中所描述之插入缺失圖案，視情況其中表7-2中描述之插入缺失圖案之插入缺失在至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%的該群體的該等細胞中為可偵測的。
  58. 一種組合物，其包含如請求項39至57中任一項之細胞或細胞群體，其視情況包含醫藥學上可接受之介質，例如適合於低溫保存之醫藥學上可接受之介質。
  59. 一種如請求項39至57中任一項之細胞或細胞群體、或如請求項58之組合物的用途，其用於製造用於治療血色素異常症的藥物。
  60. 一種如請求項39至57中任一項之細胞或細胞群體、或如請求項58之組合物的用途，其用於製造用於增加哺乳動物中的胎兒血色素表現的藥物。
  61. 如請求項60之用途，其中該血色素異常症為β-地中海型貧血或鐮狀細胞疾病。
  62. 一種製備細胞(例如細胞群體)之方法，其包含： (a)提供細胞(例如細胞群體) (例如HSPC (例如HSPC群體))； (b)在包含幹細胞擴增劑之細胞培養基中離體培養該細胞(例如該細胞群體)；以及 (c)向該細胞中引入如請求項1至22中任一項之第一gRNA分子、編碼如請求項1至22中任一項之第一gRNA分子的核酸分子、如請求項23至28中任一項之組合物、如請求項29之核酸序列或如請求項30之載體。
  63. 如請求項62之方法，其中在該引入步驟(c)之後，該細胞(例如細胞群體)能夠分化為分化細胞(例如分化細胞群體)，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球系譜系細胞群體)，例如紅血球(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞(例如分化細胞群體)例如相對於尚未經受步驟(c)的相同細胞產生增加的胎兒血色素。
  64. 如請求項62至63中任一項之方法，其中該幹細胞擴增劑為： a) (1r,4r)-N1-(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺； b) 4-(3-哌啶-1-基丙胺基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-7-甲酸甲酯； c)4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-異丙基-9H-嘌呤-6-基胺基)乙基)苯酚； d)(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇；或 e)其組合(例如(1r,4r)-N1-(2-苯甲基-7-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-9H-嘧啶并[4,5-b]吲哚-4-基)環己烷-1,4-二胺與(S)-2-(6-(2-(lH-吲哚-3-基)乙胺基)-2-(5-氟吡啶-3-基)-9H-嘌呤-9-基)丙-l-醇之組合)。
  65. 如請求項62至63中任一項之方法，其中該細胞培養基包含血小板生成素(Tpo)、Flt3配體(Flt-3L)及人類幹細胞因子(SCF)，視情況其中該細胞培養基進一步包含人類介白素-6 (IL-6)；視情況其中該細胞培養基包含血小板生成素(Tpo)、Flt3配體(Flt-3L)、人類幹細胞因子(SCF)及人類IL-6(若存在)，各自在介於約10 ng/mL至約1000 ng/mL範圍內之濃度下，視情況各自在約50 ng/mL濃度下，例如在50 ng/mL濃度下。
  66. 如請求項62至63中任一項之方法，其中該細胞培養基包含在介於約1 nM至約1 mM範圍內之濃度下的幹細胞擴增劑，視情況在介於約1 μM至約100 nM範圍內之濃度下，視情況在介於約500 nM至約750 nM範圍內之濃度下，視情況在約500 nM之濃度下，例如在500 nM之濃度下或在約750 nM之濃度下，例如在750 nM之濃度下。
  67. 如請求項62至63中任一項之方法，其中該培養步驟(b)包含在該引入步驟(c)之前的培養時間，視情況其中該引入步驟(c)之前的培養時間至少為12小時，例如為約1天至約12天的時間，例如為約1天至約6天的時間，例如為約1天至約3天的時間，例如為約1天至約2天的時間，例如為約2天的時間。
  68. 如請求項62至63中任一項之方法，其中該培養步驟(b)包含在該引入步驟(c)後之培養時間，視情況其中在該引入步驟(c)後之培養時間至少為12小時，例如為約1天至約12天之時間，例如為約1天至約6天之時間，例如為約2天至約4天之時間，例如為約2天之時間，或為約3天之時間或為約4天之時間。
  69. 如請求項62至63中任一項之方法，其中該細胞群體離體擴增至少3倍，例如至少4倍、例如至少5倍、例如至少10倍。
  70. 如請求項62至63中任一項之方法，其中該引入步驟(c)包含電穿孔。
  71. 如請求項62至63中任一項之方法，其中步驟(a)中提供之該細胞(例如細胞群體)為人類細胞(例如人類細胞群體)。
  72. 如請求項71之方法，其中步驟(a)中提供之該細胞(例如細胞群體)係自骨髓、末梢血液(例如移動的末梢血液)或臍帶血分離。
  73. 如請求項72之方法，其中 (i)步驟(a)中提供之該細胞(例如細胞群體)係自骨髓分離，例如自患有血色素異常症之患者之骨髓分離，視情況其中該血色素異常症為鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，視情況其中該地中海型貧血為β地中海型貧血；或 (ii)步驟(a)中提供之該細胞(例如細胞群體)係自末梢血液分離，例如自患有血色素異常症之患者之末梢血液分離，視情況其中該血色素異常症為鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，視情況其中該地中海型貧血為β地中海型貧血；視情況其中該末梢血液為移動的末梢血液，視情況其中該移動的末梢血液為使用普樂沙福(Plerixafor)、G-CSF或其組合而移動的。
  74. 如請求項62至63中任一項之方法，其中步驟(a)中提供之該細胞群體的CD34+細胞經增濃。
  75. 如請求項62至63中任一項之方法，其中在該引入步驟(c)之後，將細胞(例如細胞群體)低溫保存。
  76. 如請求項62至63中任一項之方法，其中在該引入步驟(c)之後，該細胞(例如細胞群體)包含： a)在與該第一gRNA分子之該靶向域互補之基因體DNA序列處或附近的插入缺失；及/或 b)包含序列之缺失，例如同HBG1啟動子區中之第一gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列與同HBG2啟動子區中之第一gRNA分子之靶向域互補(例如與該gRNA靶向域至少90%互補，例如完全與該gRNA靶向域互補)的序列之間的實質上所有序列，視情況其中該插入缺失，例如缺失，不包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸。
  77. 如請求項62至63中任一項之方法，其中： (a)在該引入步驟(c)之後，該細胞群體之至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之該等細胞在與該第一gRNA分子之該靶向域互補之基因體DNA序列處或附近包含插入缺失，視情況其中該插入缺失選自表2-7中列舉之插入缺失，視情況其中該群體中無細胞包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失； (b)在該引入步驟(c)之後，該細胞(例如細胞群體)能夠分化為紅血球系譜系之分化細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞例如相對於未更改細胞(例如細胞群體)呈現增加含量的胎兒血色素； (c)在該引入步驟(c)之後，該細胞群體能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如高至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%百分比的F細胞)； (d)在該引入步驟(c)之後，該細胞(例如細胞群體)能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞(例如分化細胞群體)產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞； (e)在該引入步驟(c)之後，在該細胞中不形成脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部不形成脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測；及/或 (f)在該引入步驟(c)之後，在該細胞群體之多於約5%、例如多於約1%、例如多於約0.1%、例如多於約0.01%之該等細胞中未偵測到脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部無脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測。
  78. 一種細胞(例如細胞群體)，其可藉由如請求項62至77中任一項之方法獲得。
  79. 一種細胞，例如更改細胞，例如如請求項78之細胞，其中： (a)該細胞群體之至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%之該等細胞在與如請求項1至22中任一項之gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近包含插入缺失，視情況其中該插入缺失選自表2-7中列舉之插入缺失，視情況其中該群體中無細胞包含位於-鏈(hg38)之5,250,092與5,249,833之間的核苷酸的缺失； (b)該細胞(例如細胞群體)能夠分化為紅血球系譜系之分化細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞例如相對於未更改細胞(例如細胞群體)呈現增加含量的胎兒血色素； (c)該細胞群體能夠分化為分化細胞群體，例如紅血球系譜系細胞群體(例如紅血球群體)，且其中該分化細胞群體例如相對於未更改細胞群體具有增加百分比的F細胞(例如百分比高至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%或至少約40%的F細胞)； (d)該細胞(例如細胞群體)能夠分化為分化細胞，例如紅血球系譜系之細胞(例如紅血球)，且其中該分化細胞(例如分化細胞群體)產生至少約6皮克(例如至少約7皮克、至少約8皮克、至少約9皮克、至少約10皮克、或約8至約9皮克、或約9至約10皮克)胎兒血色素/細胞； (e)在該細胞中不形成脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部不形成脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測； (f)在該細胞群體之多於約5%、例如多於約1%、例如多於約0.1%、例如多於約0.01%之該等細胞中未偵測到脫靶插入缺失，例如在HBG1及/或HBG2啟動子區域外部無脫靶插入缺失，例如如可藉由下一代定序及/或核苷酸插入分析偵測；及/或 (g)該細胞或其子代在將其移植至之患者中在移植後多於16週、多於20週或多於24週時為可偵測的，視情況如藉由偵測與如請求項1至22中任一項之gRNA分子之靶向域互補之基因體DNA序列處或附近的插入缺失而偵測，視情況其中該插入缺失選自表2-7中列舉的插入缺失。
  80. 如請求項78至79中任一項之細胞，其中該細胞為動物細胞，例如哺乳動物、靈長類或人類細胞，例如為人類細胞；視情況其中該細胞獲自患有血色素異常症之患者，該血色素異常症為例如鐮狀細胞疾病或地中海型貧血，例如β-地中海型貧血。
  81. 如請求項78至79中任一項之細胞，其中該細胞為HSPC，視情況CD34+ HSPC，視情況CD34+CD90+ HSPC。
  82. 如請求項78至79中任一項之細胞，其中該細胞(例如細胞群體)已自骨髓、末梢血液(例如移動的末梢血液)或臍帶血分離。
  83. 如請求項78或79之細胞，其中該細胞對於待投與該細胞之患者而言為自體或同種異體的。
  84. 一種包含如請求項39至57及78至83中任一項之細胞或細胞群體之組合物的用途，其用於製造用於治療血色素異常症的藥物。
  85. 一種包含如請求項39至57及78至83中任一項之細胞或細胞群體之組合物的用途，其用於製造用於增加人類患者中的胎兒血色素表現的藥物。
  86. 如請求項84之用途，其中該血色素異常症為β-地中海型貧血或鐮狀細胞疾病。
  87. 如請求項84至86中任一項之用途，其中向該人類患者投與包含至少約2e6個如請求項39至57或78至83中之任一項之細胞/公斤該人類患者體重，例如至少約2e6個如請求項39至57或78至83中之任一項之CD34+細胞/公斤該人類患者體重的組合物。
  88. 如請求項84至86中任一項之用途，其中該細胞或細胞群體或其子代在該人類患者中在投與後多於16週、多於20週或多於24週時為可偵測的，視情況如藉由偵測與如請求項1至22中任一項之gRNA分子之靶向域互補的基因體DNA序列處或附近的插入缺失而偵測，視情況其中該插入缺失選自表2-7中列舉的插入缺失；視情況其中參考細胞群體(例如CD34+細胞)中在投與後多於16週、多於20週或多於24週時的該插入缺失的偵測含量相對於該細胞群體恰好在投與之前的該插入缺失的偵測含量，降低不大於50%、不大於40%、不大於30%、不大於20%、不大於10%、不大於5%或不大於1%。
  89. 如請求項1至4、14及15中任一項之gRNA分子，如請求項23至24及58中任一項之組合物，如請求項29之核酸，如請求項30之載體，如請求項39至41、50、51、78及79中任一項之細胞或細胞群體，其用作藥物。
  90. 如請求項1至4、14及15中任一項之gRNA分子，如請求項23至24及58中任一項之組合物，如請求項29之核酸，如請求項30之載體，如請求項39至41、50、51、78及79中任一項之細胞或細胞群體，其用於製造藥物。
  91. 如請求項1至4、14及15中任一項之gRNA分子，如請求項23至24及58中任一項之組合物，如請求項29之核酸，如請求項30之載體，如請求項39至41、50、51、78及79中任一項之細胞或細胞群體，其用於治療疾病。
  92. 如請求項1至4、14及15中任一項之gRNA分子，如請求項23至24及58中任一項之組合物，如請求項29之核酸，如請求項30之載體，如請求項39至41、50、51、78及79中任一項之細胞或細胞群體，其用於治療疾病，其中該疾病為血色素異常症，視情況其中該血色素異常症為鐮狀細胞疾病或地中海型貧血(例如β-地中海型貧血)。
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