KR20160097327A - 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법 - Google Patents

유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20160097327A
KR20160097327A KR1020167018582A KR20167018582A KR20160097327A KR 20160097327 A KR20160097327 A KR 20160097327A KR 1020167018582 A KR1020167018582 A KR 1020167018582A KR 20167018582 A KR20167018582 A KR 20167018582A KR 20160097327 A KR20160097327 A KR 20160097327A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
crispr
inductive
sequence
cas9
cas system
Prior art date
Application number
KR1020167018582A
Other languages
English (en)
Inventor
펑 장
베른트 체체
Original Assignee
더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드, 매사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 filed Critical 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드
Publication of KR20160097327A publication Critical patent/KR20160097327A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/095—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear export signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3519—Fusion with another nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2522/00—Reaction characterised by the use of non-enzymatic proteins
    • C12Q2522/10—Nucleic acid binding proteins
    • C12Q2522/101—Single or double stranded nucleic acid binding proteins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 표적 유전자 서열 및 관련 유전자 산물의 발현을 변경시키기 위한 시스템, 방법 및 조성물을 제공한다. CRISPR-Cas 시스템의 Cas 단백질에 대한 구조적 정보, CRISPR 복합체의 변형된 성분의 생성에서의 이러한 정보의 용도, CRISPR 복합체의 하나 이상의 성분 또는 변형된 성분을 인코딩하는 벡터 및 벡터 시스템의 용도, 및 그러한 벡터 및 성분의 설계 및 이용 방법이 제공된다. 또한, 진핵 세포에서의 CRISPR 복합체 형성의 유도 방법 및 CRISPR-Cas 시스템의 사용 방법이 제공된다. 특히, 본 발명은 최적화된 모듈형 CRISPR-Cas 효소 시스템의 조작을 이해한다.

Description

유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ＣＡＳ 효소의 발현의 변경을 위한 ＣＲＩＳＰＲ-ＣＡＳ 시스템 및 방법{CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS, STRUCTURAL INFORMATION AND INDUCIBLE MODULAR CAS ENZYMES}
관련 출원 및 참조에 의한 포함
본 출원은 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,267호, 2014년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/939,228호에 대하여 주장되는 우선권으로부터 우선권을 주장한다.
전술한 출원, 및 상기 출원에 또는 상기 출원의 절차 중에 인용된 모든 문헌("출원 인용 문헌") 및 상기 출원 인용 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌, 및 본원에서 인용되거나 참조된 모든 문헌("본원 인용 문헌") 및 본원 인용 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌은, 본원에 언급되거나 본원에 참고로 포함된 임의의 문헌에 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침서, 설명서, 제품 명세서 및 제품 시이트(sheet)와 함께, 본원에 참고로 포함되어 있으며, 그리고 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 모든 참조된 문헌은 마치 각각의 개별 문헌을 참고로 포함하는 것으로 특정적으로 그리고 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 참고로 포함된다.
본 발명은 일반적으로 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; CRISPR) 및 그의 성분과 관련된 벡터 시스템을 사용할 수 있는 게놈 변동(genomic perturbation) 또는 유전자-편집(gene-editing)과 같이 서열 표적화를 수반하는 유전자 발현의 조절을 위해 사용되는 시스템, 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 최적화된 모듈형 CRISPR-Cas 효소 시스템의 조작을 이해한다.
연방 정부가 후원하는 연구에 대한 성명
본 발명은 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 지급된 NIH 파이오니어 어워드(Pioneer Award) DP1MH100706 하에 정부 지원으로 수행되었다. 정부는 본 발명에 소정의 권리를 갖는다.
게놈 시퀀싱(sequencing) 기술 및 분석 방법의 최근의 진전에 의해, 다양한 생물학적 기능 및 질병(disease)과 관련된 유전적 요인을 분류하고 발견하는 능력이 상당히 촉진되었다. 개별 유전 요소의 선택적 변동을 가능하게 함으로써 원인이 되는 유전 변이의 체계적인 역의 조작을 가능하게 할 뿐 아니라, 합성 생물학, 생명공학 및 의학 응용을 진전시키기 위하여, 정밀한 게놈 표적화 기술이 필요하다. 게놈-편집 기술, 예를 들어, 디자이너 징크 핑거, 전사 활성화제-유사 이펙터(effector)(TALE) 또는 귀소 메가뉴클레아제(homing meganuclease)가 표적화된 게놈 변동을 생성하는데 이용 가능하지만, 가격이 알맞고, 설립하기 용이하며, 확대 가능하고, 진핵 게놈 내의 다수의 위치를 표적화하는데 부합되는 새로운 게놈 조작 기술이 필요하다.
발명의 요약
다수의 응용에서 대안의 강력한 서열 표적화 시스템 및 기술이 시급하게 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 다루며, 관련 이점을 제공한다. CRISPR/Cas 또는 CRISPR-Cas 시스템(두 용어 모두는 본 출원에서 상호교환 가능하게 사용된다)은 특정 서열을 표적화하기 위해 맞춤형 단백질의 생성을 필요로 하지 않고, 오히려, 단일의 Cas 효소가 짧은 RNA 분자에 의해 프로그램화되어, 특정 DNA 표적을 인식할 수 있으며, 다시 말하면, Cas 효소는 상기 짧은 RNA 분자를 사용하여 특정 DNA 표적에 동원될 수 있다. 게놈 시퀀싱(sequencing) 기술 및 분석 방법의 레퍼토리에 CRISPR-Cas 시스템을 부가하면, 상기 방법을 상당히 단순화시킬 수 있으며, 다양한 생물학적 기능 및 질병과 관련된 유전적 요인을 분류하고 발견하는 능력을 촉진시킬 수 있다. 유해 영향 없이 게놈 편집을 위해 효율적으로 CRISPR-Cas 시스템을 사용하기 위하여, 청구된 발명의 양태인 이들 게놈 조작 도구의 조작 및 최적화의 양태를 이해하는 것이 중요하다.
일 양태에서, 본 발명은
유도성 이량체의 제1 절반에 부착된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물 및
유도성 이량체의 제2 절반에 부착된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며,
제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결되며,
제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 이출(export) 신호에 작동 가능하게 연결되고,
유도물질 에너지원과의 접촉은 유도성 이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키며,
유도성 이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키는 것은 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 작용성 CRISPR-Cas 시스템을 구성하게 하고,
CRISPR-Cas 시스템은 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하며,
작용성 CRISPR-Cas 시스템은 표적 서열에 결합하고, 임의로, 게놈 유전자좌를 편집하여, 유전자 발현을 변경시킨다.
본 발명의 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 유도성 이량체는 유도성 이종이량체이거나, 그를 포함하거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어진다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 유도성 이종이량체의 제1 절반 또는 제1 부분 또는 제1 단편은 FKBP, 임의로 FKBP12이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 본질적으로 그로 이루어진다. 본 발명의 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 유도성 이종이량체의 제2 절반 또는 제2 부분 또는 제2 단편은 FRB이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 본질적으로 그로 이루어진다. 본 발명의 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 제1 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열은 N' 말단 Cas9 부분 - FRB - NES이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 본질적으로 그로 이루어진다. 본 발명의 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 제1 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열은 NES - N' 말단 Cas9 부분 - FRB - NES이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 본질적으로 그로 이루어진다. 본 발명의 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열은 C' 말단 Cas9 부분 - FKBP - NLS이거나, 그를 포함하거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어진다. 일 양태에서, 본 발명은 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열이 NLS - C' 말단 Cas9 부분 - FKBP - NLS이거나, 그를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 본질적으로 그로 이루어지는 것을 제공한다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, Cas9 부분을 유도성 이량체의 절반 또는 부분 또는 단편으로부터 분리하는 링커가 존재할 수 있다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 유도물질 에너지원은 라파마이신이거나, 그를 포함하거나, 본질적으로 그로 이루어지거나, 그로 이루어진다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 유도성 이량체는 유도성 동종이량체이다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, CRISPR 효소는 Cas9, 예를 들어, SpCas9 또는 SaCas9이다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, Cas9는 SpCas9에 따라 또는 그를 참조하여 하기의 분할점 중 어느 하나에서 2개의 부분으로 분할된다: 202A/203S 사이의 분할 위치; 255F/256D 사이의 분할 위치; 310E/311I 사이의 분할 위치; 534R/535K 사이의 분할 위치; 572E/573C 사이의 분할 위치; 713S/714G 사이의 분할 위치; 1003L/1004E 사이의 분할 위치; 1054G/1055E 사이의 분할 위치; 1114N/1115S 사이의 분할 위치; 1152K/1153S 사이의 분할 위치; 1245K/1246G 사이의 분할 위치; 또는 1098 및 1099 사이의 분할 위치. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 하나 이상의 작용성 도메인은 Cas9 효소의 하나의 또는 둘 모두의 부분과 회합되며, 예를 들어, 작용성 도메인은 임의로 전사 활성화제, 전사 억제제 또는 뉴클레아제, 예를 들어, Fok1 뉴클레아제를 포함한다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, 작용성 CRISPR-Cas 시스템은 표적 서열에 결합하며, 효소는 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 CRISPR 효소와 비교하여, 임의로 적어도 97% 또는 100% 감소된 뉴클레아제 활성(또는 3% 이하 및 유리하게는 0% 뉴클레아제 활성)을 갖는 deadCas9이다. 일 양태에서, 유도성 CRISPR-Cas 시스템에서, deadCas9(CRISPR 효소)는 2개 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서, SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그(ortholog)에 따른 D10, E762, H840, N854, N863 또는 D986, 또는 SaCas9 단백질에 따른 N580 중 2개 이상이 돌연변이되거나, 또는 CRISPR 효소는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 예를 들어, 적어도 H840이 돌연변이된다. 본 발명은 추가로 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이해하며, 본 발명의 일 양태는 그를 제공한다.
CRISPR 효소의 돌연변이에 관하여, 효소가 SpCas9가 아닌 경우, 돌연변이는 SpCas9의 위치 10, 762, 840, 854, 863 및/또는 986에 상응하는 임의의 또는 모든 잔기에서 이루어질 수 있다(예를 들어, 표준 서열 비교 툴에 의해 확인될 수 있음). 특히, 임의의 또는 모든 하기의 돌연변이: D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A가 SpCas9에서 바람직하며; 대체 아미노산 중 임의의 것에 대한 보존적 치환도 또한 예상된다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 임의의 또는 각각의 또는 모든 구현예에 관하여, CRISPR 효소가 적어도 하나 이상의, 또는 적어도 2개 이상의 돌연변이를 포함하며, 적어도 하나 이상의 돌연변이 또는 적어도 2개 이상의 돌연변이가 SpCas9 단백질에 따른 D10, E762, H840, N854, N863 또는 D986, 예를 들어, SpCas9에 따른 D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A, 또는 SaCas9에 따른 N580, 예를 들어, SaCas9에 따른 N580A, 또는 오솔로그의 Cas9에서 Sp 또는 Sa로의 임의의 상응하는 돌연변이(들)에 대한 것이거나, CRISPR 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 적어도 Sp Cas9에 따른 H840 또는 N863A, 또는 Sa Cas9에 따른 N580A가 돌연변이되고; 예를 들어, CRISPR 효소가 SpCas9 단백질에 따른 H840A, 또는 D10A 및 H840A, 또는 D10A 및 N863A, 또는 오솔로그의 Cas9에서 Sp 단백질 또는 Sa 단백질로의 임의의 상응하는 돌연변이(들)를 포함하는 것이 제공된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바에 따른, 유도성 이량체의 제1 절반 또는 부분 또는 단편에 부착되고, 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물의 전달을 위한 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 유도성 이량체의 제2 절반 또는 부분 또는 단편에 부착되고, 하나 이상의 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 전달을 위한 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 본원에 논의된 바와 같은, 유도성 이량체의 제1 절반 또는 부분 또는 단편에 부착되고, 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물; 및 본원에 논의된 바와 같은, 유도성 이량체의 제2 절반 또는 부분 또는 단편에 부착되고, 하나 이상의 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물 둘 모두의 전달을 위한 벡터를 제공한다.
일 양태에서, 벡터는 단일의 플라스미드 또는 발현 카세트일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 벡터 중 임의의 것으로 형질전환되거나, 또는 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 진핵 숙주 세포 또는 세포주를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 벡터 중 임의의 것으로 형질전환되거나, 또는 본원에 논의된 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 트랜스제닉 유기체 또는 그의 자손을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 구성적으로 발현하는 모델 유기체를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은
유도성 이종이량체의 제1 절반에 부착된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물, 및
유도성 이종이량체의 제2 절반에 부착된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며,
제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결되고,
제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결되며,
유도물질 에너지원과의 접촉은 유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키고,
유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키는 것은 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 작용성 CRISPR-Cas 시스템을 구성하게 하며,
CRISPR-Cas 시스템은 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하고,
작용성 CRISPR-Cas 시스템은 게놈 유전자좌를 편집하여, 유전자 발현을 변경시킨다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 논의된 벡터 중 임의의 것으로 대상체를 형질전환시키고, 유도물질 에너지원을 대상체에게 투여함으로써 유전자 편집을 유도하는 것을 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 제공한다. 본 발명은 의약, 예를 들어, 대상체를 치료하기 위한 또는 대상체의 그러한 치료 방법을 위한 그러한 의약의 제조에서의 그러한 폴리뉴클레오티드 또는 벡터의 용도를 이해한다. 일 양태에서, 상기 방법에서, 예를 들어, 수복 주형을 포함하는 벡터에 의해 전달되는 수복 주형도 또한 제공된다.
또한, 본 발명은 대상체를 본원에 논의된 폴리뉴클레오티드 또는 본원에 논의된 벡터 중 임의의 것으로 형질전환시킴으로써 전사 활성화 또는 억제를 유도하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 제공하며, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 촉매적 비활성 CRISPR 효소 및 본원에 논의된 바와 같은 하나 이상의 회합된 작용성 도메인을 인코딩하거나 포함하며; 상기 방법은 유도물질 에너지원을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, 본 발명은 특히 동종이량체 및 이종이량체, dead Cas9 또는 예를 들어, 돌연변이를 통하여 본질적으로 뉴클레아제 활성을 갖지 않는 Cas9로서, 하나 이상의 NLS 및/또는 하나 이상의 NES가 존재하는 시스템 또는 복합체; 분할형 Cas9에 연결된 작용성 도메인(들); 치료 방법을 포함하는 방법 및 용도를 이해한다.
본원에서 CRISPR 효소, Cas 또는 Cas 단백질이 참조되는 경우, 이것이 본 발명의 분할형 Cas9를 포함하는 것이 이해될 것이다. 일 양태에서, 본 발명은 유전자 산물의 발현의 변경 또는 변형 방법을 제공한다. 상기 방법은 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 함유하고 이를 발현하는 세포 내로 Cas 단백질 및 DNA 분자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 도입하는 단계로서, 그에 의해, 가이드 RNA가 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 표적으로 하며, Cas 단백질이 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 절단하고, 그에 의해, 유전자 산물의 발현이 변경되며; Cas 단백질 및 가이드 RNA가 함께 천연 발생하지 않는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명은 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 이해한다. 본 발명은 추가로 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas 단백질을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이며, 더욱 바람직한 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 유전자 산물의 발현은 감소된다.
일 양태에서, 본 발명은 Cas 단백질, 및 세포 내의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 그에 의해, 가이드 RNA가 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 표적으로 하고, Cas 단백질이 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 절단하며, 그에 의해, 유전자 산물의 발현은 변경되고; Cas 단백질 및 가이드 RNA는 천연적으로 함께 발생하지 않으며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 본 발명은 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 이해한다. 본 발명의 일 구현예에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR-Cas 단백질이며, 바람직한 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이고; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 본 발명은 추가로 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas 단백질을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이며, 더욱 바람직한 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 유전자 산물의 발현은 감소된다.
다른 양태에서, 본 발명은 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 표적으로 하는 CRISPR-Cas 시스템 가이드 RNA에 작동 가능하게 연결된 제1 조절 요소 및 Cas 단백질에 작동 가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 하나 이상의 벡터를 포함하는 조작된, 비-천연 발생 벡터 시스템을 제공하며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일하거나 상이한 벡터에 위치할 수 있다. 가이드 RNA는 세포 내의 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 표적으로 하며, Cas 단백질은 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자를 절단하고, 그에 의해, 유전자 산물의 발현이 변경되며; Cas 단백질 및 가이드 RNA는 함께 천연 발생하지 않는다. 본 발명은 tracr 서열에 융합된 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 이해한다. 본 발명의 일 구현예에서, Cas 단백질은 II형 CRISPR-Cas 단백질이며, 바람직한 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이고; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 본 발명은 추가로 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된 Cas 단백질을 이해한다. 바람직한 구현예에서, 진핵 세포는 포유류 세포이며, 더욱 바람직한 구현예에서, 포유류 세포는 인간 세포이다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 유전자 산물의 발현이 감소된다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 벡터를 포함하는 벡터 시스템을 제공한다. 일부 구현예에서, 시스템은 (a) tracr 메이트(mate) 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동 가능하게 연결된 제1 조절 요소로서, 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하는 제1 조절 요소; 및 (b) 핵 국소화 서열을 포함하는 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하며; 성분 (a) 및 (b)는 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 위치하며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소의 조절하에 tracr 메이트 서열의 하류의 tracr 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 가이드 서열을 더 포함하며, 2개 이상의 가이드 서열의 각각은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 상이한 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 제3 조절 요소, 예를 들어, 중합효소 III 프로모터의 조절하에 tracr 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 최적으로 정렬되는 경우, tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 나타낸다. 최적의 정렬의 결정은 해당 분야의 숙련자의 이해 범위 내에 있다. 예를 들어, 공개적이며 상업적으로 이용 가능한 정렬 알고리즘 및 프로그램, 예를 들어, 비제한적으로 ClustalW, matlab의 Smith-Waterman, Bowtie, Geneious, Biopython 및 SeqMan이 존재한다.
일부 구현예에서, CRISPR 복합체는 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양으로 상기 CRISPR 복합체의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함한다. 이론에 구속되지 않으면서, 핵 국소화 서열은 진핵생물에서 CRISPR 복합체 활성에 필요하지 않지만, 이러한 서열을 포함하여, 특히 핵 내의 핵산 분자를 표적화하는 것에 관하여 시스템의 활성을 증진시키는 것으로 여겨진다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9 효소이다. 일부 구현예에서, Cas9 효소는 스트렙토코커스 뉴모니애(S. pneumoniae), 스트렙토코커스 피오게네스(S. pyogenes) 또는 스트렙토코커스 써모필러스(S. thermophilus) Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, 제1 조절 요소는 중합효소 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 조절 요소는 중합효소 II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 뉴클레오티드 또는 10 내지 30개 또는 15 내지 25개 또는 15 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일반적으로, 그리고 본 명세서에서, 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 단일-가닥, 이중-가닥 또는 부분 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하거나, 자유 말단을 포함하지 않는(예를 들어, 환형) 핵산 분자; DNA, RNA 또는 둘 모두를 포함하는 핵산 분자; 및 해당 분야에 알려져 있는 다른 종류의 폴리뉴클레오티드를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 하나의 유형의 벡터는 "플라스미드"이며, 이는 추가의 DNA 세그먼트가 예를 들어, 표준 분자 클로닝 기술에 의해 삽입될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서, 바이러스-유래 DNA 또는 RNA 서열은 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)로의 패키징을 위해 벡터에 존재한다. 또한, 바이러스 벡터는 숙주 세포로의 트랜스펙션(transfection)을 위해 바이러스가 지니는 폴리뉴클레오티드도 포함한다. 특정 벡터(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다. 기타 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포로의 도입시에 숙주 세포의 게놈으로 통합되며, 그에 의해, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 게다가, 특정 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다. 재조합 DNA 기술에 유용한 통상적인 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태로 존재한다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서의 핵산의 발현에 적절한 형태의 본 발명의 핵산을 포함할 수 있으며, 이는 재조합 발현 벡터가, 발현을 위해 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있는, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템 내에서, 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입되는 경우 숙주 세포 내에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결된 것을 의미하는 의도이다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(internal ribosomal entry site; IRES) 및 기타 발현 조절 요소(예를 들어, 전사 종결 신호, 예를 들어, 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하는 의도이다. 그러한 조절 요소는 예를 들어, 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 기술되어 있다. 조절 요소는 많은 유형의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 조절 요소 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 조절 요소(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)를 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 요망되는 관심 조직, 예를 들어, 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 기관(예를 들어, 간, 췌장) 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 유도할 수 있다. 또한, 조절 요소는 시간-의존적 방식으로, 예를 들어, 세포-주기 의존적 또는 발생 단계-의존적 방식으로 발현을 유도할 수 있으며, 이는 또한 조직 또는 세포-유형에 특이적이거나 그렇지 않을 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol I 프로모터) 또는 그들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예에는 U6 및 H1 프로모터가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. pol II 프로모터의 예에는 레트로바이러스 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서가 존재), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(임의로 CMV 인핸서가 존재)[예를 들어, 문헌(Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)) 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터 및 EF1α 프로모터가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 또한, 용어 "조절 요소"에는 인핸서 요소, 예를 들어, WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR 내의 R-U5' 세그먼트(문헌[Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988]); SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2와 3 사이의 인트론 서열(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981])이 포함된다. 발현 벡터의 설계가 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음이 해당 분야의 숙련자에 의해 인식될 것이다. 벡터를 숙주 세포로 도입하여, 그에 의해, 전사물, 본원에 기술된 바와 같은 핵산에 의해 인코딩된 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 그의 돌연변이체 형태, 그의 융합 단백질 등)를 생성할 수 있다.
유리한 벡터는 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스를 포함하며, 또한, 그러한 벡터의 유형은 특정 세포 유형을 표적화하기 위해 선택될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 (a) tracr 메이트 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동 가능하게 연결된 제1 조절 요소로서, 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하는 제1 조절 요소; 및/또는 (b) 핵 국소화 서열을 포함하는 상기 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하는 진핵 숙주 세포를 제공한다. 일부 구현예에서, 숙주 세포는 성분 (a) 및 (b)를 포함하며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a), 성분 (b) 또는 성분 (a) 및 (b)는 숙주 진핵 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소의 조절하에 tracr 메이트 서열의 하류의 tracr 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 가이드 서열을 더 포함하며, 2개 이상의 가이드 서열의 각각은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 상이한 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 진핵 숙주 세포는 상기 tracr 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 조절 요소, 예를 들어, 중합효소 III 프로모터를 더 포함한다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 최적으로 정렬되는 경우 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 나타낸다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 가닥 절단 활성이 결여된다. 일부 구현예에서, 제1 조절 요소는 중합효소 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 조절 요소는 중합효소 II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 뉴클레오티드 또는 10 내지 30개 또는 15 내지 25개 또는 15 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다. 일 양태에서, 본 발명은 기술된 구현예 중 임의의 것에 따른 진핵 숙주 세포를 포함하는 비-인간 진핵 유기체; 바람직하게는 다세포 진핵 유기체를 제공한다. 다른 양태에서, 본 발명은 기술된 구현예 중 임의의 것에 따른 진핵 숙주 세포를 포함하는 진핵 유기체; 바람직하게는 다세포 진핵 유기체를 제공한다. 이들 양태의 일부 구현예에서 유기체는 동물; 예를 들어, 포유류일 수 있다. 또한, 유기체는 절지동물, 예를 들어, 곤충일 수 있다. 또한, 유기체는 식물일 수도 있다. 추가로, 유기체는 진균일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 성분 중 하나 이상을 포함하는 키트를 제공한다. 일부 구현예에서, 키트는 벡터 시스템 및 키트 사용 지침서를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 (a) tracr 메이트 서열, 및 tracr 메이트 서열의 상류에 하나 이상의 가이드 서열을 삽입하기 위한 하나 이상의 삽입 부위에 작동 가능하게 연결된 제1 조절 요소로서, 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하고, CRISPR 복합체는 (1) 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하는 제1 조절 요소; 및/또는 (b) 핵 국소화 서열을 포함하는 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 제2 조절 요소를 포함하며, 유리하게는 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 시스템의 동일한 또는 상이한 벡터에 위치한 성분 (a) 및 (b)를 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소의 조절하에 tracr 메이트 서열의 하류의 tracr 서열을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 성분 (a)는 제1 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 2개 이상의 가이드 서열을 더 포함하며, 2개 이상의 가이드 서열의 각각은 발현되는 경우, 진핵 세포 내의 상이한 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 시스템은 tracr 서열에 작동 가능하게 연결된 제3 조절 요소, 예를 들어, 중합효소 III 프로모터를 더 포함한다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 최적으로 정렬되는 경우 tracr 메이트 서열의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성을 나타낸다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양의 상기 CRISPR 효소의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 II형 CRISPR 시스템 효소이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9 효소이다. 일부 구현예에서, Cas9 효소는 스트렙토코커스 뉴모니애, 스트렙토코커스 피오게네스 또는 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9이며, 이들 유기체로부터 유래된 돌연변이된 Cas9를 포함할 수 있다. 효소는 Cas9 상동체 또는 오솔로그일 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 진핵 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 DNA 가닥 절단 활성이 결여된다. 일부 구현예에서, 제1 조절 요소는 중합효소 III 프로모터이다. 일부 구현예에서, 제2 조절 요소는 중합효소 II 프로모터이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25개 뉴클레오티드 또는 10 내지 30개 또는 15 내지 25개 또는 15 내지 20개 뉴클레오티드 길이이다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 표적 폴리뉴클레오티드의 변경 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하게 하여, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 초래하여, 그에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 변경시키는 단계를 포함하며, 여기서, CRISPR 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하며, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되며, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화된다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 상기 CRISPR 효소에 의한, 표적 서열의 위치에서의 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 포함하며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 표적 유전자의 전사의 감소를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 외인성 주형 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합에 의해 상기 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 수복하는 단계를 더 포함하며, 상기 수복은 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터 발현되는 단백질의 하나 이상의 아미노산 변화를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 상기 진핵 세포로 전달하는 단계를 더 포함하며, 하나 이상의 벡터는 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 대상체 내의 진핵 세포로 전달된다. 일부 구현예에서, 상기 변경은 세포 배양물 중의 상기 진핵 세포에서 발생한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 변경 전에 상기 진핵 세포를 대상체로부터 분리하는 단계를 더 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 진핵 세포 및/또는 그로부터 유래된 세포를 상기 대상체로 복귀시키는 단계를 더 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 발현의 변경 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합하게 하여, 상기 결합이 상기 폴리뉴클레오티드의 증가되거나 감소된 발현을 야기하도록 하는 단계를 포함하며; 여기서, CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되고, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화되며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 상기 진핵 세포로 전달하는 단계를 더 포함하며, 여기서, 하나 이상의 벡터는 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도한다.
일 양태에서, 본 발명은 돌연변이된 질병 유전자를 포함하는 모델 진핵 세포의 생성 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 유전자는 질병을 갖거나 질병이 발생할 위험의 증가와 관련된 임의의 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 벡터를 진핵 세포로 도입하는 단계로서, 하나 이상의 벡터는 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도하는 단계; 및 (b) CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합하게 하여, 상기 질병 유전자 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 야기하여, 그에 의해 돌연변이된 질병 유전자를 포함하는 모델 진핵 세포를 생성하는 단계로서, CRISPR 복합체가 (1) 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열, 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화되는 CRISPR 효소를 포함하는 단계를 포함하며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 상기 CRISPR 효소에 의한, 표적 서열의 위치에서의 1개 또는 2개의 가닥의 절단을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단은 표적 유전자의 전사의 감소를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 외인성 주형 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합에 의해 상기 절단된 표적 폴리뉴클레오티드를 수복하는 단계를 더 포함하며, 상기 수복은 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환을 포함하는 돌연변이를 야기한다. 일부 구현예에서, 상기 돌연변이는 표적 서열을 포함하는 유전자로부터의 단백질 발현에서 하나 이상의 아미노산 변화를 야기한다.
일 양태에서, 본 발명은 질병 유전자와 관련된 세포 신호전달 사건을 조절하는 생물학적 활성 작용제의 개발 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 질병 유전자는 질병을 갖거나 질병이 발생할 위험의 증가와 관련된 임의의 유전자이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 (a) 시험 화합물을 기술된 구현예 중 임의의 것의 모델 세포와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 질병 유전자의 상기 돌연변이와 관련된 세포 신호전달 사건의 감소 또는 증가를 나타내는 판독치의 변화를 검출하여, 그에 의해 상기 질병 유전자와 관련된 상기 세포 신호전달 사건을 조절하는 상기 생물학적 활성 작용제를 개발하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 tracr 메이트 서열의 상류에 가이드 서열을 포함하는 재조합 폴리뉴클레오티드를 제공하며, 가이드 서열은 발현되는 경우, 진핵 세포에 존재하는 상응하는 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 진핵 세포에 존재하는 바이러스 서열이다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 원암유전자(proto-oncogene) 또는 암유전자이다.
일 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 돌연변이를 하나 이상의 세포(들) 내의 유전자에 도입함에 의한 하나 이상의 세포(들)의 선택 방법을 제공하며, 상기 방법은 하나 이상의 벡터를 세포(들)로 도입하는 단계로서, 하나 이상의 벡터가 CRISPR 효소, tracr 메이트 서열에 연결된 가이드 서열, tracr 서열 및 편집 주형 중 하나 이상의 발현을 유도하고; 편집 주형이 CRISPR 효소 절단을 없애는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단계; 편집 주형과 선택될 세포(들) 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 상동성 재조합을 가능하게 하는 단계; CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되게 하여, 상기 유전자 내의 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 초래하는 단계로서, CRISPR 복합체는 (1) 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열 및 (2) tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열과 복합체화되는 CRISPR 효소를 포함하고, 표적 폴리뉴클레오티드로의 CRISPR 복합체의 결합이 세포사를 유도하여, 그에 의해 하나 이상의 돌연변이가 도입된 하나 이상의 세포(들)가 선택되게 하는 단계를 포함하며; 이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다. 바람직한 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9이다. 본 발명의 다른 바람직한 구현예에서, 선택되는 세포는 진핵 세포일 수 있다. 본 발명의 양태는 선택 마커 또는 반대-선택 시스템을 포함할 수 있는 2-단계 과정을 필요로 하지 않고 특정 세포의 선택을 가능하게 한다.
본원에 어구 "이것은 본 발명의 분할형 Cas9를 포함한다" 또는 유사 표현이 존재하며; 이것은 본원의 구현예에서 하나의 또는 상기 CRISPR 효소 또는 Cas9가 본원에 논의된 바와 같은 분할형 Cas9일 수 있음을 나타내는 것이다.
"결합 부위" 또는 "활성 부위"는 결합에 연루되는 화합물, 예를 들어, 핵산 분자에 결합할 수 있는 결합 공동 또는 영역 내의 부위(예를 들어, 원자, 아미노산 잔기의 작용기 또는 복수의 그러한 원자 및/또는 기)를 포함하거나 본질적으로 그로 이루어진다.
본원에 언급된 물질에서 CRISPR 효소 결정의 구조 정보는 sgRNA(또는 키메라 RNA) 및 표적 DNA와의 CRISPR 효소(예를 들어, Cas9) 상호작용의 조사를 가능하게 하여, CRISPR 효소의 모듈형 또는 다중-부분 성분을 조작 또는 변경 또는 생성하여, 새로운 작용성에 이르게 하거나 또는 전체 CRISPR-Cas 시스템의 작용성을 최적화시킨다. 또한, 모듈형 또는 다중-부분 CRISPR 효소는 추가로 최적화될 수 있는 유도성 CRISPR-Cas 시스템의 생성을 가능하게 한다. 유도성 CRISPR-Cas 시스템의 양태는 2013년 7월 21일에 출원되고, 2014년 1월 30일에 PCT 공개 WO2014018423A2호로 공개된, 발명의 명칭이 "INDUCIBLE DNA BINDING PROTEINS AND GENOME PERTURBATION TOOLS AND APPLICATIONS THEREOF"인 PCT 출원 PCT/US2013/051418호에 기재된 바와 같으며, 그의 내용은 그들 전문이 참조로 본원에 포함된다.
일 양태에서, 본 발명은 유도성 이종이량체의 제1 절반에 부착된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물 및 유도성 이종이량체의 제2 절반에 부착된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 포함하며, 제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결되며, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결되고, 유도물질 에너지원과의 접촉이 유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키며, 유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키는 것은 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 작용성 CRISPR-Cas 시스템을 구성하게 하고, CRISPR-Cas 시스템은 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하며, 작용성 CRISPR-Cas 시스템은 게놈 유전자좌를 편집하여, 유전자 발현을 변경시킨다. 본 발명의 일 구현예에서, 유도성 이종이량체의 제1 절반은 FKBP12이고, 유도성 이종이량체의 제2 절반은 FRB이다. 본 발명의 다른 구현예에서, 유도물질 에너지원은 라파마이신이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, CRISPR 효소는 Cas9, 예를 들어, Sp Cas9이다.
따라서, 임의의 이전에 공지된 제품, 제품의 제조방법 또는 제품의 사용 방법을 본 발명 내에 포함하지 않는 것이 본 발명의 목적이므로 출원인은 권리를 보존하며 이로써 임의의 이전에 공지된 산물, 공정 또는 방법에 대한 권리 포기를 드러낸다. 본 발명은 USPTO(35 U.S.C. §112, 제1항) 또는 EPO(EPC의 83조)의 기재된 설명 및 실시가능요건을 충족하지 않는 임의의 제품, 공정 또는 제품의 제조 또는 제품의 사용 방법을 본 발명의 범위 내에 포함하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 추가로 언급되므로 출원인은 권리를 보존하고 이로써 임의의 이전에 기재된 제품, 제품의 제조 방법 또는 제품의 사용 방법에 대한 권리 포기를 드러낸다.
본 개시내용 및 청구범위 및/또는 단락에서, "함유한다", "함유된", "함유하는" 등과 같은 용어가 미국 특허법에 귀속되는 의미를 가질 수 있고; 예를 들어, 그들은 "포함한다", "포함된", "포함하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어진다"와 같은 용어가 미국 특허법에 귀속되는 의미를 갖고, 예를 들어, 그들은 명백하게 열거되지 않는 요소를 허용하지만, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 새로운 특징에 영향을 미치는 요소를 배제함이 주목된다. 53(c)조 EPC 및 28(b) 및 (c)항 EPC에 따르는 것이 본 발명의 실시에서 유리할 수 있다. 본원에서 어느 것도 가망성으로 해석되지 않는다.
이들 및 다른 구현예가 개시되거나 하기의 상세한 설명으로부터 명백하고 그에 의해 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부된 청구범위에 개시되어 있다. 본 발명의 원리가 이용된 예시적인 구현예를 설명하는 하기의 상세한 설명을 참조함으로써 본 발명의 특징 및 이점을 더욱 잘 이해할 것이며, 첨부된 도면은 다음과 같다:
도 1a 내지 도 1d는 SpCas9-FRBP12 및 SpCas9-FRB 융합 단백질의 생성을 보여준다. (a) SpCas9가 분할되고 FKBP12(C-말단 단편) 또는 FRB(N-말단)에 융합될 11개의 위치(청색 삼각형)를 도시한 카툰. (b) FKBP12 및 FRP의 구조. 융합 부위는 황색 원으로 표시되어 있다. (c) 위치 #12로부터 생성된 SpCas9 융합 단백질의 대표적인 예시. (d) 11개의 FKBP12/FRB 융합의 정확한 위치를 요약한 표. 융합면 열의 처음의 수는 FKBP12가 상응하는 SpCas9 단편에 융합될 아미노산을 말한다. 두번째 수는 FRB가 상응하는 SpCas9 단편에 융합될 아미노산을 말한다.
도 2a 및 도 2b는 (A) PX330 및 pTB005 플라스미드에 대한 카툰을 보여준다. SpCas9-FKBP fu15 및 SpCas9-FRB fu15의 생성을 위한 대표적인 프라이머 결합 부위가 나타나 있다. (B) 최종 SpCas9-FKPB fu15 플라스미드 및 중간체 SpCas9-FRP fu15 플라스미드의 카툰. 최종 버전의 SpCas9-FRB 작제물은 N-말단에 NES를 갖는다.
도 3a 내지 도 3c는 NLS, 15개 아미노산 링커 및 20 bp 깁슨(Gibson) 상동성 측부에 대한 서열이 혼입된 PCR 프라이머의 표를 보여준다.
도 4a 내지 도 4c는 생성된 NLS 부재의 FRB-Cas9 융합 조각이 혼입된 프라이머의 표를 보여준다.
도 5a 내지 도 5c는 라파마이신 처리가 SpCas9-FRB/FKBP12 융합 단백질의 어셈블리를 유도하고, EMX1 유전자좌에서 삽입결실 형성을 야기하는 것을 보여준다. (a) SpCas9 융합 조각의 카툰. FPB 조각은 N-말단에 핵 이출 서열(NES)을 함유한다. FKBP 조각은 핵 국소화 서열(NLS)이 측부 배치된다. (b) 라파마이신 유도된 분할형 Cas9(상측) 및 비유도된 분할형 Cas9(하측)에 의해 매개되는 삽입결실 형성을 보여주는 대표적인 서베이어(SURVEYOR) 겔. (c) 유도된(청색) 대 비유도된(주황색) 분할형 Cas9에 의해 매개되는 삽입결실 형성의 정량화.
도 6a 내지 도 6g는 유도성 분할형-Cas9의 생성 및 최적화를 보여준다. (a) Cas9의 리본 표현. 삼각형은 분할형-4(녹색) 및 분할형-5(적색)에 대한 분할 위치를 나타낸다. (b) 유도성 분할형 Cas9 융합의 다이어그램. 인간 코돈-최적화된 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 N- 및 C-말단 조각은 각각 FRB 및 FKBP 이량체화 도메인에 융합된다. (c 및 d) 분할형 Cas9 시스템을 최적화시키기 위한 전략. 라파마이신의 부재하에(c), Cas9(N)-FRB-NES 조각은 인간 PTK2 유래의 NES의 첨가로 인하여 세포질 내에 격립된다. Cas9(C)-FKBP 조각은 2개의 NLS를 함유하며, 핵 내로 능동 수송된다. 라파마이신의 존재하에(d), Cas9(N)-FRB-NES는 Cas9(C)-FKBP에 결합한다. 생성된 리어셈블된 Cas9의 NLS는 핵 이입 후에 표적화된 유전자좌로의 결합을 매개한다. (e) 라파마이신과 함께(좌측) 및 그것 없이(우측) 인간 EMX1 유전자좌에서의 분할형-4 및 -5 매개의 삽입결실에 대한 대표적인 서베이어 검정. 화살표는 예상되는 서베이어 단편을 나타낸다. Nd = 검출되지 않음. (f) U6 프로모터-유도 sgRNA, EFS 프로모터-유도 분할형 Cas9 조각 및 퓨로마이신 내성 유전자(puro)를 함유하는 렌티바이러스 분할형 Cas9 플라스미드의 개략도. 2A 자가-절단 펩티드(P2A)는 분할형 Cas9 조각 및 puro 둘 모두를 분리한다. (g) EMX1 유전자좌 및 4개의 주석이 있는 OT에서의 딥 시퀀싱(deep sequencing)에 의해 측정되는 삽입결실 빈도. 삽입결실을 형질도입 4주(야생형-Cas9; n=2 생물학적 반복검증) 또는 6주(분할형 Cas9; n=3 생물학적 반복검증) 후에 측정하였다(****p<0.0001). 라파마이신 처리를 12일 지속하였다. 모든 패널에서 평균 ± 표준오차.
도 7a 내지 도 7c는 분할형 dCas9-VP64 융합체를 사용한 유도성 전사 활성화를 보여준다. (a) 전사 활성화를 위해 사용되는 dCas9(N)-FRB-2xNES 및 dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64 융합체의 개략도. 각각의 조각은 주석이 있는 점 돌연변이(D10A 또는 N863A)를 지니며, 이는 라파마이신-유도 어셈블리 시에 dead Cas9를 재구성한다. VP64 전사 활성화 도메인은 dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64 조각의 C-말단에 융합된다. (b) 분할형-4(Split) 및 유전자마다 4개의 sgRNA가 트랜스펙션된 HEK293FT 세포에서 qPCR에 의해 측정된 ASCL1, MYOD1 및 IL1RN 유전자 발현. 발현을 전장 dead Cas9-VP64(전장)에 비하여(n=3 기술적 반복검증) 라파마이신과 함께 또는 그것 없이 세포에서 측정하였다(n=4 생물학적 반복검증). 트랜스펙션되지 않은 세포를 기준선으로 사용하였다. (c) 라파마이신 처리 후 2, 6, 12, 24 및 72시간에 qPCR에 의해 측정되는 HEK293FT에서의 ASCL1 발현 및 N2A 세포에서의 Neurog2 발현(각 시점에 대하여 n=3 생물학적 반복검증). 세포를 라파마이신으로 계속 처리하거나(남색 원), 2시간 동안만 처리하거나(하늘색 사각형) 또는 처리하지 않았다(주황색 삼각형). 트랜스펙션되지 않은 세포를 기준선으로 사용하였다. 모든 패널에서 평균 ± 표준오차.
도 8a 내지 도 8g는 Cas9가 분할될 수 있으며, Cas9-FRB/FKBP 융합 단백질이 라파마이신-유도성 리어셈블리를 나타내는 것을 보여준다. (a) 적색 및 녹색 화살표로 표시된 11개의 분할 위치와 함께 Cas9 일차 구조의 개략도. 적색 화살표는 루프 영역 내의 분할을 나타내며; 녹색 화살표는 비구조화 영역 내의 분할을 나타낸다. N-말단 내의 말단 아미노산(aa)의 위치. Cas9 분할은 분할 번호 하에 표시된다. BH=브리지 나선(bridge helix), PI=PAM 상호작용 도메인. (b) 유도성 분할형 Cas9 전략의 다이어그램. 인간 코돈-최적화 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 N- 및 C-말단 조각은 각각 FRB 및 FKBP 이량체화 도메인에 융합된다. FRB 및 FKBP의 라파마이신-유도 이량체화가 작용성 전장 Cas9 뉴클레아제의 리어셈블리를 야기할 때까지 Cas9-FRB/FKBP 조각은 분리되고, 비활성이다. (c) 라파마이신 유도가 있는(상측) 및 그것이 없는(하측), 모든 11개의 Cas9 분할형에 대한 인간 EMX1 유전자좌에서의 분할형 Cas9-매개의 삽입결실에 대한 대표적인 서베이어 검정. 화살표는 예상되는 서베이어 단편을 나타낸다. (d) (c)의 정량화. 오차 막대는 2개의 개별 생물학적 반복검증의 5개의 기술적 반복검정으로부터의 SEM을 반영한다. (e) 이량체화 도메인이 결여된 N- 및 C-말단 Cas9 조각의 자동-어셈블리에 대하여 시험하기 위한 전략의 다이어그램. (f) 인간 EMX1 유전자좌에서의 자동-어셈블리 분할형-4 내지 -6 및 -11 매개의 삽입결실에 대한 대표적인 서베이어 검정. (g) (f)의 정량화. 오차 막대는 수행되는 2개의 생물학적 반복검정의 3개의 기술적 반복검증으로부터의 표준오차를 반영한다.
도 9a 및 도 9b는 분할형 Cas9를 포함하는 단일의 벡터 작제물을 보여준다(a). 분할형 Cas9는 라파마이신의 존재하에 야생형과 유사한 삽입결실 형성을 보였으나, 라파마이신의 부재하에 야생형보다 현저히 더 낮은 삽입결실 형성을 보였다(b).
본원의 도면은 오직 예시의 목적만을 위한 것이며, 본질적으로 축척으로 도시되지 않는다.
상세한 설명
본 발명의 실시에 유용한 모든 것, 양 및 제형에 관한 것을 포함하여, 방법, 재료, 전달 비히클, 벡터, 입자, AAV 및 그의 제조 및 이용을 포함하는, CRISPR-Cas 시스템, 그의 성분, 및 그러한 성분의 전달에 대한 일반적 정보에 관하여, 다음에 대하여 참조가 이루어진다: 미국 특허 제8,697,359호, 제8,771,945호, 제8,795,965호, 제8,865,406호, 제8,871,445호, 제8,889,356호, 제8,889,418호 및 제8,895,308호; 미국 특허 공개 US 2014-0310830호(미국 출원 제14/105,031호), US 2014-0287938 A1호(미국 출원 제14/213,991호), US 2014-0273234 A1호(미국 출원 제14/293,674호), US2014-0273232 A1호(미국 출원 제14/290,575호), US 2014-0273231호(미국 출원 제14/259,420호), US 2014-0256046 A1호(미국 출원 제14/226,274호), US 2014-0248702 A1호(미국 출원 제14/258,458호), US 2014-0242700 A1호(미국 출원 제14/222,930호), US 2014-0242699 A1호(미국 출원 제14/183,512호), US 2014-0242664 A1호(미국 출원 제14/104,990호), US 2014-0234972 A1호(미국 출원 제14/183,471호), US 2014-0227787 A1호(미국 출원 제14/256,912호), US 2014-0189896 A1호(미국 출원 제14/105,035호), US 2014-0186958호(미국 출원 제14/105,017호), US 2014-0186919 A1호(미국 출원 제14/104,977호), US 2014-0186843 A1호(미국 출원 제14/104,900호), US 2014-0179770 A1호(미국 출원 제14/104,837호) 및 US 2014-0179006 A1호(미국 출원 제14/183,486호), US 2014-0170753호(미국 출원 제14/183,429호); 유럽 특허 출원 EP 2 771 468호(EP13818570.7호), EP 2 764 103호(EP13824232.6호) 및 EP 2 784 162호(EP14170383.5호); 및 PCT 특허 공개 WO 2014/093661호(PCT/US2013/074743호), WO 2014/093694호(PCT/US2013/074790호), WO 2014/093595호(PCT/US2013/074611호), WO 2014/093718호(PCT/US2013/074825호), WO 2014/093709호(PCT/US2013/074812호), WO 2014/093622호(PCT/US2013/074667호), WO 2014/093635호(PCT/US2013/074691호), WO 2014/093655호(PCT/US2013/074736호), WO 2014/093712호(PCT/US2013/074819호), WO2014/093701호(PCT/US2013/074800호) 및 WO2014/018423호(PCT/US2013/051418호). 또한, 각각 2013년 1월 30일; 2013년 3월 15일; 2013년 3월 28일; 2013년 4월 20일; 2013년 5월 6일 및 2013년 5월 28일에 출원된 미국 가출원 제61/758,468호; 제61/802,174호; 제61/806,375호; 제61/814,263호; 제61/819,803호 및 제61/828,130호에 대하여 참조가 이루어진다. 또한, 2013년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/836,123호에 대하여 참조가 이루어진다. 또한, 각각 2013년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/835,931호, 제61/835,936호, 제61/836,127호, 제61/836,101호, 제61/836,080호 및 제61/835,973호에 대하여 참조가 이루어진다. 추가로, 2013년 8월 5일에 출원된 미국 가출원 제61/862,468호 및 제61/862,355호; 2013년 8월 28일에 출원된 제61/871,301호; 2013년 9월 25일에 출원된 제61/960,777호 및 2013년 10월 28일에 출원된 제61/961,980호에 대하여 참조가 이루어진다. 각각 2014년 6월 10일, 6/10/14에 출원된 PCT 특허 출원 PCT/US2014/041803호, PCT/US2014/041800호, PCT/US2014/041809호, PCT/US2014/041804호 및 PCT/US2014/041806호; 2014년 6월 11일에 출원된 PCT/US2014/041808호; 및 2014년 10월 28일에 출원된 PCT/US2014/62558호 및 각각 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,150호, 제61/915,301호, 제61/915,267호 및 제61/915,260호; 2013년 1월 29일 및 2013년 2월 25일에 출원된 제61/757,972호 및 제61/768,959호; 2013년 6월 17일에 출원된 제61/835,936호, 제61/836,127호, 제61/836,101호, 제61/836,080호, 제61/835,973호 및 제61/835,931호; 둘 모두 2014년 6월 11일에 출원된 제62/010,888호 및 제62/010,879호; 각각 2014년 6월 10일에 출원된 제62/010,329호 및 제62/010,441호; 및 각각 2014년 2월 12일에 출원된 제62/939,256호 및 제61/939,242호; 2014년 4월 15일에 출원된 제61/980,012호; 2014년 8월 17일에 출원된 제62/038,358호; 각각 2014년 9월 25일에 출원된 제62/054,490호, 제62/055,484호, 제62/055,460호 및 제62/055,487호; 및 2014년 10월 27일에 출원된 제62/069,243호에 대하여 추가로 참조가 이루어진다. 또한, 2014년 9월 25일에 출원된 미국 가출원 제62/055,484호, 제62/055,460호 및 제62/055,487호; 2014년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 제61/980,012호; 및 2014년 2월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/939,242호에 대하여 참조가 이루어진다. 특히 미국에 지정된 PCT 출원, 2014년 6월 10일에 출원된 출원 PCT/US14/41806호에 대하여 참조가 이루어진다. 2014년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/930,214호에 대하여 참조가 이루어진다. 각각 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,251호; 제61/915,260호 및 제61/915,267호에 대하여 참조가 이루어진다. 2014년 4월 15일에 출원된 미국 가출원 USSN 61/980,012호에 대하여 참조가 이루어진다. 특히 미국에 지정된 PCT 출원, 2014년 6월 10일에 출원된 출원 PCT/US14/41806호에 대하여 참조가 이루어진다. 2014년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/930,214호에 대하여 참조가 이루어진다. 각각 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,251호; 제61/915,260호 및 제61/915,267호에 대하여 참조가 이루어진다. 2014년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/930,214호에 대하여 참조가 이루어진다. 각각 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,251호; 제61/915,260호 및 제61/915,267호에 대하여 참조가 이루어진다. 2014년 1월 22일에 출원된 미국 가출원 제61/930,214호에 대하여 참조가 이루어진다. 각각 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,251호; 제61/915,260호 및 제61/915,267호에 대하여 참조가 이루어진다. 각각 2012년 12월 12일, 2013년 1월 2일, 2013년 3월 15일 및 2013년 6월 17일에 출원된, 발명의 명칭이 모두 SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION인 미국 가출원 제61/736,527호, 제61/748,427호, 제61/791,409호 및 제61/835,931호에 대하여 참조가 이루어진다. 또한, 각각 2013년 1월 29일 및 2013년 2월 25일에 출원된, 발명의 명칭이 SYSTEMS METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION인 미국 가출원 제61/757,972호 및 제61/768,959호에 대하여 참조가 이루어진다. 또한, 각각 2013년 6월 17일에 출원된 미국 가출원 제61/835,936호, 제61/836,127호, 제61/836,101호, 제61/836,080호 및 제61/835,973호에 대하여 참조가 이루어진다. 이들 특허, 특허 공보 및 출원 각각, 및 거기에 또는 그들 절차 중에 인용된 모든 문헌("출원 인용 문헌") 및 상기 출원 인용 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌은 상기 출원 인용 문헌에 또는 상기 출원 인용 문헌의 임의의 문헌 및 본원에 참조로서 포함된 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 지침서, 설명서, 제품 명세서, 및 제품 시이트와 함께, 참조로서 본원에 포함되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다. 모든 문헌(예를 들어, 이들 특허, 특허 공보 및 출원 및 출원 인용 문헌)은 각각의 개별적 문헌이 참조로서 포함하는 것이 구체적으로 그리고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로서 본원에 포함된다.
또한, CRISPR-Cas 시스템에 대한 일반적 정보와 관련하여, 하기가 언급되며(또한, 본원에 참조로 포함된다):
Figure pct00001
Multiplex genome engineering using CRISPR / Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15;339(6121):819-23 (2013);
Figure pct00002
RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR - Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9 (2013);
Figure pct00003
One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR / Cas -Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell May 9;153(4):910-8 (2013);
Figure pct00004
Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. 2013 Aug 22;500(7463):472-6. doi: 10.1038/Nature12466. Epub 2013 Aug 23;
Figure pct00005
Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F. Cell Aug 28. pii: S0092-8674(13)01015-5. (2013);
DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013);
Figure pct00007
Genome engineering using the CRISPR - Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F. Nature Protocols Nov;8(11):2281-308. (2013);
Figure pct00008
Genome-Scale CRISPR - Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12. (2013). [Epub ahead of print];
Figure pct00009
Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, O. Cell Feb 27. (2014). 156(5):935-49;
Figure pct00010
Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB., Cheng AW., Trevino AE., Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Biotechnol. (2014) Apr 20. doi: 10.1038/nbt.2889,
Figure pct00011
CRISPR - Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling, Platt et al., Cell 159(2): 440-455 (2014) DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.014,
Figure pct00012
Development and Applications of CRISPR - Cas9 for Genome Engineering, Hsu et al, Cell 157, 1262-1278 (June 5, 2014) (Hsu 2014),
Figure pct00013
Genetic screens in human cells using the CRISPR / Cas9 system, Wang et al., Science. 2014 January 3; 343(6166): 80-84. doi:10.1126/science.1246981,
Figure pct00014
Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR - Cas9 -mediated gene inactivation, Doench et al., Nature Biotechnology published online 3 September 2014; doi:10.1038/nbt.3026, 및
Figure pct00015
In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR - Cas9, Swiech et al, Nature Biotechnology ; published online 19 October 2014; doi:10.1038/nbt.3055.
그의 각각은 본원에 참조로 포함되고, 하기에 간단히 논의된다:
Figure pct00016
Cong 등은 스트렙토코커스 써모필러스 Cas9 및 또한 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 둘 모두를 기초로 하여 진핵 세포에서 사용하기 위해 II형 CRISPR/Cas 시스템을 조작하였고, Cas9 뉴클레아제가 짧은 RNA에 의해 유도되어 인간 및 마우스 세포에서 DNA의 정밀한 절단을 유도할 수 있는 것을 입증하였다. 이들의 연구는 닉킹 효소로 전환됨에 따라 Cas9가 최소의 돌연변이유발 활성을 갖는 진핵 세포에서 상동성-유도된 수복을 촉진하는데 이용될 수 있음을 추가로 보여준다. 또한, 그들의 연구는 다수의 가이드 서열이 단일의 CRISPR 어레이로 인코딩되어 포유류 게놈 내의 내인성 게놈 유전자좌 위치에서 몇몇의 동시 편집을 가능하게 할 수 있음을 입증하였으며, 이는 RNA-안내된 뉴클레아제 기술의 용이한 프로그램화가능성 및 폭넓은 응용 가능성을 입증한다. 세포에서 서열 특이적 DNA 절단을 프로그램화하기 위해 RNA를 이용하는 이러한 능력은 게놈 조작 도구의 새로운 부류를 규정하였다. 이들 연구는 다른 CRISPR 유전자좌가 포유류 세포로 이식될 수 있고, 또한 포유류 게놈 절단을 매개할 수 있음을 추가로 보여준다. 중요하게는, CRISPR/Cas 시스템의 여러 양태가 그의 효능 및 다능성을 증가시키기 위해 추가로 개선될 수 있음이 예견될 수 있다.
Figure pct00017
Jiang 등은 스트렙토코커스 뉴모니애 및 에스케리키아 콜라이의 게놈에서 정밀한 돌연변이를 도입시키기 위해 이중-RNA와 복합체화된 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR)-회합된 Cas9 엔도뉴클레아제를 이용하였다. 상기 접근법은 돌연변이되지 않은 세포를 사멸시키기 위해 표적화된 게놈 부위에서의 이중-RNA:Cas9-유도된 절단에 의존하며, 선택 마커 또는 반대-선택 시스템의 필요를 회피한다. 상기 연구는 편집 주형에서 수행되는 단일- 및 다중 뉴클레오티드 변화를 만들기 위해 짧은 CRISPR RNA(crRNA)의 서열을 변화시킴에 의한 이중-RNA:Cas9 특이성의 재프로그램화를 보고하였다. 상기 연구는 2개의 crRNA의 동시 사용이 멀티플렉스 돌연변이유발을 가능하게 하는 것을 보여준다. 또한, 상기 접근법이 리컴비니어링(recombineering)과 병용하여 이용된 경우, 스트렙토코커스 뉴모니애에서 기재된 접근법을 이용하여 회수된 세포의 거의 100%가 요망되는 돌연변이를 함유하였고, 에스케리키아 콜라이에서, 회수된 65%가 돌연변이를 함유하였다.
Figure pct00018
Konermann 등은 DNA-결합 도메인 기반 CRISPR Cas9 효소 및 또한 전사 활성화제 유사 이펙터의 광학적 및 화학적 조절을 가능하게 하는 다능성이고 강력한 기술에 대한 해당 분야의 요구를 다루었다.
Figure pct00019
미생물 CRISPR-Cas 시스템으로부터의 Cas9 뉴클레아제는 20 nt 가이드 서열에 의해 특정 게놈 유전자좌로 표적화되며, 이는 DNA 표적에 대한 특정 미스매치를 용인할 수 있고, 그에 의해 요망되지 않는 표적외 돌연변이유발을 촉진할 수 있다. 이를 다루기 위해, Ran 등은 표적화된 이중-가닥 파손을 도입시키기 위해 쌍을 형성하는 가이드 RNA와 Cas9 닉카아제 돌연변이체를 병용한 접근법을 기재하였다. 게놈 내의 개별의 닉은 높은 정확도로 수복되므로, 적절한 오프셋 가이드 RNA를 통한 동시 닉킹이 이중-가닥 파손에 필요하고, 표적 절단을 위한 특이적으로 인식된 염기의 수를 연장시킨다. 상기 저자는 쌍을 형성한 닉킹을 이용하는 것이 세포주에서 50 내지 1,500배까지 표적외 활성을 감소시킬 수 있고, 표적에 대한 절단 효율을 희생시키지 않고 마우스 접합체에서 유전자 낙아웃을 촉진하는 것을 입증하였다. 이러한 다능성 전략은 높은 특이성을 필요로 하는 매우 다양한 게놈 편집 응용을 가능하게 한다.
Figure pct00020
Hsu 등은 표적 부위의 선택을 알아내고, 표적외 효과를 피하기 위해 인간 세포에서 SpCas9 표적화 특이성을 특성화하였다. 상기 연구는 293T 및 293FT 세포에서 100개 초과의 예측 게놈 표적외 유전자좌에서 SpCas9-유도된 삽입-결실 돌연변이 수준 및 700개 초과의 가이드 RNA 변이체를 평가하였다. 상기 저자는 SpCas9가 미스매치의 수, 위치 및 분포에 민감한 서열-의존성 방식으로 상이한 위치에서 가이드 RNA와 표적 DNA 사이의 미스매치를 용인하는 것을 나타내었다. 상기 저자는 SpCas9-매개 절단이 DNA 메틸화에 의해 영향을 받지 않고, SpCas9 및 sgRNA의 투여량을 적정하여 표적외 변형을 최소화시킬 수 있음을 추가로 나타내었다. 또한, 포유류 게놈 조작 응용을 용이하게 하기 위해, 상기 저자는 표적 서열의 선택 및 확인뿐만 아니라 표적외 분석을 안내하기 위해 웹-기반 소프트웨어 도구를 제공한 것을 보고하였다.
Figure pct00021
Ran 등은 포유류 세포에서 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성-유도 수복(HDR)뿐만 아니라 하류 작용성 연구를 위한 변형된 세포주의 생성을 통한 Cas9-매개 게놈 편집을 위한 일련의 도구를 기재하였다. 표적외 절단을 최소화시키기 위해, 상기 저자는 쌍을 형성한 가이드 RNA와 함께 Cas9 닉카아제 돌연변이체를 이용한 이중-닉킹 전략을 추가로 기재하였다. 상기 저자에 의해 제공된 프로토콜은 표적 부위의 선택, 절단 효율의 평가 및 표적외 활성의 분석을 위한 가이드를 실험적으로 유래하였다. 상기 연구는 표적 설계로 시작하여, 유전자 변형은 1 내지 2주만큼 적은 기간 내에 달성될 수 있고, 변형된 클론성 세포주가 2 내지 3주 내에 유래될 수 있음을 나타내었다.
Figure pct00022
Shalem 등은 게놈-와이드 규모에서 유전자 작용을 질의하기 위한 새로운 방식을 기재한다. 그들의 연구는 64,751개의 독특한 가이드 서열을 이용하여 18,080개 유전자를 표적화시킨 게놈-규모의 CRISPR-Cas9 낙아웃(GeCKO) 라이브러리의 전달이 인간 세포에서 음성 및 양성 선택 스크리닝 둘 모두를 가능하게 하는 것을 보여주었다. 먼저, 상기 저자는 암 및 만능성 줄기 세포에서 세포 생존력에 필수적인 유전자를 확인하기 위한 GeCKO 라이브러리의 사용을 보여주었다. 다음으로, 흑색종 모델에서, 상기 저자는 유전자의 소실이 돌연변이 단백질 키나제 BRAF를 억제하는 치료제인 베무라페닙(vemurafenib)에 대한 내성과 관련된 유전자를 스크리닝하였다. 그들의 연구는 가장 높은 순위의 후보물질이 이전에 확인된 유전자 NF1 및 MED12뿐만 아니라 새로운 히트(hit) NF2, CUL3, TADA2B, 및 TADA1을 포함한 것을 나타내었다. 상기 저자는 동일한 유전자를 표적으로 하는 독립적 가이드 RNA와 높은 비율의 히트 확인 사이에 높은 수준의 일치를 관찰하였고, 따라서 Cas9를 이용한 게놈-규모 스크리닝의 가망성을 입증하였다.
Figure pct00023
Nishimasu 등은 2.5 A°해상도로 sgRNA 및 그의 표적 DNA와의 복합체에서 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 결정 구조를 보고하였다. 상기 구조는 그들의 계면에서 양으로 하전된 홈에서 sgRNA:DNA 헤테로듀플렉스를 수용하는 표적 인식 및 뉴클레아제 엽으로 구성된 2엽 구조를 나타내었다. 인식 엽이 sgRNA 및 DNA 결합에 필수적인 반면, 뉴클레아제 엽은 각각 표적 DNA의 상보적 및 비-상보적 가닥의 절단을 위해 적절하게 위치된 HNH 및 RuvC 뉴클레아제 도메인을 함유한다. 뉴클레아제 엽은 또한 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)와의 상호작용을 담당하는 카르복실-말단 도메인을 함유한다. 이러한 고-해상도 구조 및 수반하는 기능 분석은 Cas9에 의한 RNA-안내된 DNA 표적화의 분자 메카니즘을 나타내었고, 이에 따라 새로운 다능성 게놈-편집 기술의 합리적 설계를 용이하게 한다.
Figure pct00024
Wu 등은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 단일 가이드 RNA(sgRNA)가 로딩된 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 촉매적 비활성 Cas9(dCas9)의 게놈-와이드 결합 부위를 맵핑하였다. 저자는 4개의 sgRNA 각각이 NGG 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 및 sgRNA 내의 5-뉴클레오티드 씨드 영역을 종종 특징으로 하는 수십 내지 수천개의 게놈 부위에 대하여 표적 dCas9를 시험한 것을 보여주었다. 염색질 비접근성은 씨드 서열과 일치하는 다른 부위로의 dCas9 결합을 감소시키고; 따라서 표적외 부위의 70%가 유전자와 회합된다. 상기 저자는 촉매적 활성 Cas9로 트랜스펙션된 mESC 내의 295개의 dCas9 결합 부위의 표적화된 시퀀싱에 의해, 백그라운드 수준 초과로 돌연변이된 단지 하나의 부위가 확인된 것을 나타내었다. 상기 저자는 씨드 매치가 결합을 촉발하나, 표적 DNA와의 광범위한 쌍형성이 절단에 필요한 Cas9 결합 및 절단을 위한 2-상태 모델을 제안하였다.
Figure pct00025
Hsu(2014)는 요거트부터 세포의 유전적 스크리닝을 포함하는 게놈 편집까지 CRISPR-Cas9 전력를 일반적으로 논의하는 리뷰 기사이며, 이는 2014년 6월 5일 이전에 출원된 본 명세서 계통의 출원의 정보, 데이터 및 결과에 속한다. Hsu(2014)의 전반적 교시내용은 본 명세서의 특정 모델, 동물을 포함하지 않는다.
Figure pct00026
또한, 본 발명 또는 출원에 대한 종래 기술인 것으로 여겨지지 않지만 본 발명의 실시에 고려될 수 있는 문헌[Tsai et al, "Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing," Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014)]이 언급된다.
Figure pct00027
그리고 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,251호, 2014년 1월 22일에 출원된 제61/930,214호, 2014년 4월 15일에 출원된 제61/980,012호; 및 문헌[Nishimasu et al, "Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA," Cell 156(5):935-949, DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001 (2014)]이 언급되며, 그의 각각 및 전부는 본원에 참조로, 특히 Cas9 결정에 관한 "본원에 언급된 물질"인 것으로 포함된다.
유도물질 에너지원은 간단히 유도물질 또는 이량체화 물질인 것으로 여겨질 수 있다. 용어 '유도물질 에너지원'은 일관성을 위해 본원의 도처에 사용된다. 유도물질 에너지원(또는 유도물질)은 Cas9를 재구성하는 작용을 한다. 일부 구현예에서, 유도물질 에너지원은 Cas9의 2개의 부분을 유도성 이량체의 2개의 절반의 작용을 통해 결합시킨다. 따라서, 유도성 이량체의 2개의 절반은 유도물질 에너지원의 존재하에 결합된다. 이량체의 2개의 절반은 유도물질 에너지원 없이 이량체로 형성(이량체화)되지 않을 것이다.
따라서, 유도성 이량체의 2개의 절반은 유도물질 에너지원과 협력하여, 이량체를 이량체화한다. 이것은 차례로 Cas9의 제1 및 제2 부분을 결합시킴으로써 Cas9를 재구성한다.
CRISPR 효소 융합 작제물은 각각 분할형 Cas9의 하나의 부분을 포함한다. 이들은 바람직하게는 링커, 예를 들어, 본원에 기재된 GlySer 링커를 통해 이량체의 2개의 절반 중 하나에 융합된다. 이량체의 2개의 절반은 함께 동종이량체를 형성하는 실질적으로 동일한 2개의 단량체이거나, 그들은 함께 이종이량체를 형성하는 상이한 단량체일 수 있다. 그와 같이, 2개의 단량체는 전체 이량체의 하나의 절반으로 여겨질 수 있다.
Cas9는 Cas9 효소의 2개의 부분이 실질적으로 작용성 Cas9를 포함하는 의미에서 분할된다. Cas9는 (표적 DNA 및 가이드와 복합체를 형성하는 경우) 게놈 편집 효소, 예를 들어, 닉카아제 또는 뉴클레아제(DNA의 둘 모두의 가닥 절단)로 작용하거나, 그것은 전형적으로 그의 촉매 도메인 내의 2개 이상의 돌연변이(H840 또는 N863과 조합된 D10, 특히, H840A 또는 N863A와 조합된 D10A는 Sp Cas9에서 가장 바람직하며, 오솔로그에 대하여 상응하는 돌연변이체가 적절할 것임)로 인하여, 본질적으로 촉매 활성이 거의 없거나 촉매 활성이 없는 DNA-결합 단백질인 deadCas9일 수 있다.
분할형 Cas9의 2개의 부분은 분할형 Cas9의 N' 말단 부분 및 C' 말단 부분으로 여겨질 수 있다. 융합은 전형적으로 Cas9의 분할점에서 이루어진다. 다시 말하면, 분할형 Cas9의 N' 말단 부분의 C' 말단은 이량체 절반 중 하나에 융합되는 한편, C' 말단 부분의 N' 말단은 다른 이량체 절반에 융합된다.
Cas9는 파단이 새로 생성되는 의미에서 분할될 필요는 없다. 분할점은 전형적으로 가상 환경에서 지정되며, 작제물로 클로닝된다. 분할형 Cas9의 2개의 부분, N' 말단 및 C' 말단 부분은 함께, 바람직하게는 야생형 아미노산(또는 그들을 인코딩하는 뉴클레오티드) 중 적어도 70% 이상, 바람직하게는 야생형 아미노산(또는 그들을 인코딩하는 뉴클레오티드) 중 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 90% 이상, 바람직하게는 적어도 95% 이상, 가장 바람직하게는 적어도 99% 이상을 포함하는 완전한 Cas9를 형성한다. 일부 트리밍이 가능할 수 있으며, 돌연변이체가 예상된다. 비-작용성 도메인, 예를 들어, Rec2 도메인이 완전히 제거될 수 있다. 중요한 것은 2개의 부분이 결합될 수 있으며, 요망되는 Cas9 기능이 복구 또는 재구성된다는 것이다.
이량체는 동종이량체 또는 이종이량체일 수 있다. 예가 본원에 제공된다.
하나 이상의, 바람직하게는 2개의 NLS가 제1 CRISPR 효소 작제물에 작동 가능하게 연결되어 사용될 수 있다. 하나 이상의, 바람직하게는 2개의 NES가 제1 CRISPR 효소 작제물에 작동 가능하게 연결되어 사용될 수 있다. NLS 및/또는 NES는 바람직하게는 분할형 Cas9-이량체(즉, 절반 이량체) 융합체의 측부 배치되며, 즉, 하나의 NLS는 제1 CRISPR 효소 작제물의 N' 말단에 위치할 수 있으며, 하나의 NLS는 제1 CRISPR 효소 작제물의 N' 말단에 존재할 수 있다. 유사하게, 하나의 NES는 제2 CRISPR 효소 작제물의 N' 말단에 위치할 수 있으며, 하나의 NES는 제2 CRISPR 효소 작제물의 N' 말단에 존재할 수 있다. N' 또는 C' 말단이 참조되는 경우, 이들이 상응하는 뉴클레오티드 서열에서 5' 및 3' 말단에 상응하는 것이 인식될 것이다.
제1 CRISPR 효소 작제물이 5'-NLS-(N' 말단 Cas9 부분)-링커-(이량체의 제1 절반)-NLS-3' 배열되는 것이 바람직한 배열이다. 제2 CRISPR 효소 작제물이 5'-NES--(이량체의 제2 절반)-링커-(C' 말단 Cas9 부분)-NES-3' 배열되는 것이 바람직한 배열이다. 적합한 프로모터는 바람직하게는 작제물의 각각의 상류에 존재한다. 2개의 작제물은 따로 또는 함께 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 CRISPR 효소 작제물에 작동 가능하게 연결된 NES(들) 중 하나 또는 모두는 NLS로 교환될 수 있다. 그러나, 이것은 전형적으로 바람직하지 않으며, 다른 구현예에서, 제2 CRISPR 효소 작제물에 작동 가능하게 연결된 국소화 신호는 하나 이상의 NES(들)이다.
또한, NES가 분할형 Cas9의 N' 말단 단편에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, NLS가 분할형 Cas9의 C' 말단 단편에 작동 가능하게 연결될 수 있음이 인식될 것이다. 그러나, NLS가 분할형 Cas9의 N' 말단 단편에 작동 가능하게 연결되고, NES가 분할형 Cas9의 C' 말단 단편에 작동 가능하게 연결되는 배열이 바람직하다.
NES는 적어도 유도물질 에너지원이 제공될 때까지(예를 들어, 적어도 에너지원이 유도물질에 제공되어 그의 기능을 수행할 때까지) 핵의 외측에 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 국소화시키는 작용을 한다. 유도물질의 존재는 세포질 내에서 2개의 CRISPR 효소 융합체의 이량체화를 자극하며, 이량체화된, 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합체가 핵으로 국소화하는 것을 열역학적으로 가치있게 만든다. 이론에 제한되지 않고, 본 출원인들은 NES가 제2 CRISPR 효소를 세포질로(즉, 핵의 외측으로) 격리시키는 것으로 여긴다. 제1 CRISPR 효소에서 NLS는 그것을 핵으로 국소화시킨다. 둘 모두의 경우에, 본 출원인들은 NES 또는 NLS를 사용하여, 요망되는 방향으로 평형(핵 수송의 평형)을 이동시킨다. 이량체화는 전형적으로 핵의 외측에서 발생하며(매우 작은 분율이 핵에서 일어날 수 있음), 이량체화된 복합체에서 NLS는 핵 수송의 평형을 핵 국소화로 이동시켜, 이량체화되고 그에 따라 재구성된 Cas9는 핵으로 유입된다. 이를 보여주는 개략도는 도 6c 및 도 6d에 제공된다.
유리하게는, 본 출원인들은 분할형 Cas9에서 기능을 재구성할 수 있다. 일시적 트랜스펙션을 사용하여 유도물질 에너지원의 존재하에 백그라운드에서 발생하는 이량체화 및 개념을 입증하였다. CRISPR 효소의 개별 단편에서 활성이 관찰되지 않았다. 그 다음, 렌티바이러스 전달을 통한 안정적인 발현을 사용하여 이를 개발하였으며, 분할형 Cas9 방법이 사용될 수 있음을 보여준다.
이러한 본 발명의 분할형 Cas9 방법은 그것이 Cas9 활성을 유도 가능하게 하여, 시간적 조절을 가능하게 하기 때문에 유리하다. 추가로, 상이한 국소화 서열(즉, 바람직한 대로 NES 및 NLS)을 사용하여 자동-어셈블되는 복합체로부터의 백그라운드 활성을 감소시킬 수 있다. 또한, 조직 특이적 프로모터, 예를 들어, 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 각각을 위한 것을 조직-특이적 표적화를 위해 사용하여, 그에 따라 공간적 조절을 제공할 수 있다. 2가지 상이한 조직 특이적 프로모터를 사용하여 요구된다면 더욱 섬세한 정도의 조절을 발휘할 수 있다. 동일한 방법이 단계-특이적 프로모터에 관하여 사용될 수 있거나, 단계 및 조직 특이적 프로모터의 혼합물이 존재할 수 있으며, 여기서, 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물 중 하나는 조직-특이적 프로모터의 조절하에 있는(즉, 그에 작동 가능하게 연결되거나 그를 포함하는) 한편, 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 다른 것은 단계-특이적 프로모터의 조절하에 있다(즉, 그에 작동 가능하게 연결되거나 그를 포함한다).
유도성 CRISPR-Cas 시스템은 본원에 기재된 바와 같이, 예를 들어, 제1 CRISPR 효소 융합 작제물에 작동 가능하게 연결되는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS)을 포함한다. 이들 핵 국소화 서열은 이상적으로 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양의 상기 제1 CRISPR 효소 융합 작제물의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 것이다. 이론에 제한되지 않고, 핵 국소화 서열이 진핵생물에서 CRISPR 복합체 활성에 필요하지 않으니, 그러한 서열의 포함이 특히, 핵 내의 핵산 분자의 표적화에 관하여 시스템의 활성을 증진시키며, 본 발명의 2-부분 시스템의 작동을 보조하는 것으로 여겨진다.
동일하게, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 핵 이출 서열(NES)에 작동 가능하게 연결된다. 실제로, 그것은 하나 이상의 핵 이출 서열에 연결될 수 있다. 다시 말하면, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물과 함께 사용되는 이출 서열의 수는 바람직하게는 1개 또는 2개 또는 3개이다. 전형적으로, 2개가 바람직하지만, 1개가 충분하며, 그래서 일부 구현예에서 바람직하다. NLS 및 NES의 적합한 예가 해당 분야에 알려져 있다. 바람직한 예는 본원의 실시예에 사용되는 것들이다. 예를 들어, 인간 단백질 티로신 키나제 2인 바람직한 핵 이출 신호(NES); 및 (NLS)이다. 바람직한 신호는 종 특이적일 것이다.
FRB 및 FKBP 시스템이 사용되는 경우, FKBP는 바람직하게는 핵 국소화 서열(NLS)이 측부 배치된다. FRB 및 FKBP 시스템이 사용되는 경우, 바람직한 배열은 N' 말단 Cas9 - FRB - NES : C' 말단 Cas9-FKBP-NLS이다. 따라서, 제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 C'말단 Cas9 부분을 포함할 것이며, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 N'말단 Cas9 부분을 포함할 것이다.
본 발명에 대한 다른 유리한 양태는 그것이 신속하게 켜질 수 있는, 즉, 신속한 반응을 갖는 것이다. 이론에 제한되지 않고, Cas9 활성이 기존의(이미 존재하는) 융합 작제물의 이량체화를 통하여(유도물질 에너지원과의 접촉을 통하여) 새로운 융합 작제물의 발현(특히 번역)을 통한 것보다 더욱 신속하게 유도될 수 있는 것으로 여겨진다. 그와 같이, 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 조기에, 즉, Cas9 활성이 필요하기 전에 표적 세포에서 발현될 수 있다. 그 다음, Cas9 활성은 시간적으로 조절된 다음, 유도물질 에너지원의 첨가를 통하여 신속하게 구성될 수 있으며, 이는 이상적으로, 예를 들어, 벡터에 의해 전달되는 Cas9의 발현(전사의 유도 포함)을 통한 것보다 더욱 신속하게 작용한다(이종이량체를 이량체화하고, 그에 의해 Cas9 활성을 제공한다).
용어 Cas9 및 CRISPR 효소는 다르게 명백하지 않은 한, 본원에 상호교환 가능하게 사용된다. 그러나, CRISPR 효소는 바람직하게는 Cas9, 가장 바람직하게는 Sp(스트렙토코커스 피오게네스) Cas9 또는 그의 변이체 또는 유도체이다.
실시예 2에서, 본 출원인들은 Cas9가 2개의 성분으로 분할될 수 있으며, 이는 다시 결합되는 경우 작용성 뉴클레아제를 재구성함을 입증한다. 라파마이신 감수성 이량체화 도메인을 사용하여, 출원인들은 Cas9-매개의 게놈 편집 및 전사 조절의 시간적 조절을 위하여 화학적으로 유도성 Cas9를 생성하였다. 다르게 말하면, 본 출원인들은 Cas9가 2개의 단편으로 분할됨으로써 화학적으로 유도 가능하게 될 수 있으며, 라파마이신-감수성 이량체화 도메인이 Cas9의 조절된 리어셈블리를 위해 사용될 수 있음을 입증하였다. 본 출원인들은 리어셈블된 Cas9를 사용하여 게놈 편집(뉴클레아제/닉카아제 활성을 통함) 및 전사 조절(DNA-결합 도메인, 소위 "dead Cas9"로서)을 매개할 수 있음을 보여준다.
그와 같이, 라파마이신-감수성 이량체화 도메인의 사용이 바람직하다. Cas9의 리어셈블리가 바람직하다. 리어셈블리는 결합 활성의 복구에 의해 결정될 수 있다. Cas9가 닉카아제이거나 이중-가닥 파단을 유도하는 경우, 야생형에 비한 적합한 비교 백분율이 본원에 기재되어 있다.
라파마이신 처리는 12일 지속된다. 이는 200 nM로 투여하였다. 이러한 시간적 및/또는 몰 투여량은 인간 배아 신장 293FT(HEK293FT) 세포주에 적절한 용량의 일 예이며, 이는 또한 다른 세포주에서도 사용될 수 있다. 이러한 수치는 생체내에서의 치료적 이용을 위해 예를 들어, ㎎/㎏으로 추정될 수 있다. 그러나, 또한, 라파마이신을 대상체에게 투여하기 위한 표준 투여량이 본원에서도 사용되는 것이 예상된다. "표준 투여량"이란, 라파마이신의 보통의 치료적 이용 또는 주요 적응증 하의 투여량을 의미한다(즉, 기관 거부를 예방하기 위한 용도를 위해 라파마이신이 투여되는 경우 사용되는 용량).
도 8은 적색 및 녹색 화살표로 나타낸 11개의 분할 위치의 바람직한 예와 함께, Cas9 일차 구조의 개략도를 제공한다. 적색 화살표(번호 1 내지 4 및 10)는 루프 영역 내의 분할을 나타내는 한편, 녹색 화살표(번호 5 내지 9 및 11)는 비구조화 영역 내의 분할을 나타낸다. 고려되는 분할은 하기 논의된다.
Cas9-FRB/FKBP 조각의 바람직한 배열은 FRB 및 FKBP의 라파마이신-유도된 이량체화가 작용성 전장 Cas9 뉴클레아제의 리어셈블리를 야기할 때까지 분리되고 비활성인 것이 주목할만하다. 따라서, 유도성 이종이량체의 제1 절반에 부착되는 제1 CRISPR 효소 융합 작제물이 유도성 이종이량체의 제1 절반에 부착되는 제2 CRISPR 효소 융합 작제물로부터 개별적으로 전달되고/거나 개별적으로 국소화되는 것이 바람직하다.
Cas9(N)-FRB 단편을 핵-국소화 Cas9(C)-FKBP 단편과 이량체화할 가능성이 적은 세포질 내에 격리하기 위하여, 인간 단백질 티로신 키나제 2(Cas9(N)-FRB-NES)로부터 단일의 핵 이출 서열(NES)을 Cas9(N)-FRB에 사용하는 것이 바람직하다. 라파마이신의 존재하에, Cas9(N)-FRB-NES는 Cas9(C)-FKBP-2xNLS와 이량체화하여, 완전한 Cas9 단백질을 재구성하며, 이는 핵 수송의 균형을 핵 이입을 향해 이동시키고, DNA 표적화를 가능하게 한다(도 6c 및 도 6d).
높은 투여량의 Cas9는 가이드 가닥과 적은 미스매치를 나타내는 표적외(OT) 서열에서 삽입결실 빈도를 악화시킬 수 있다. 그러한 서열은 미스매치가 비-연속적이고/거나 가이드의 씨드 영역의 외측이면, 특히 민감하다. 따라서, Cas9 활성의 시간적 조절을 사용하여 장기간 발현 실험에서 투여량을 감소시킬 수 있으며, 이에 따라, 구성적으로 활성인 Cas9와 비교하여 감소된 표적외 삽입결실을 야기한다.
바이러스 전달이 바람직하다. 특히, 렌티바이러스 또는 AAV 전달 벡터가 예상된다. 본 출원인들은 lentiCRISPR 플라스미드와 유사한 분할형-Cas9 렌티바이러스 작제물을 생성하였다. 분할된 조각은 AAV의 약 4.7kb 크기 제한에 맞도록 충분히 작아야 한다.
본 출원인들의 데이터는 분할형 Cas9의 안정한, 낮은 카피 발현을 사용하여 표적-외 위치에서 유의미한 돌연변이 없이, 표적화된 유전자좌에서 상당한 삽입결실을 유도할 수 있음을 입증한다. 본 출원인들은 Cas9 단편(본원에 기재된 분할형 5에 기초한 2개의 부분)을 클로닝하였다.
또한, dead Cas9도 청구될 수 있다. 이러한 deadCas9는 FRB 융합체(dCas9(N)-FRB-2xNES)에서 D10A 점 돌연변이 및 FKBP 융합체에서 N863A 점 돌연변이를 지니며, Cas9(C)-FKBP-2xNLS에 부가되는 VP64 전사활성화(transactivation) 도메인을 가졌다(dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64)(도 7a). 이들 단편은 촉매적 비활성 Cas9-VP64 융합체(dCas9-VP64)를 재구성하였다. 라파마이신의 존재하에 VP64에 의해 전사 활성화를 유도하여, Cas9(C)-FKBP 융합체 및 Cas9(N)-FRB 융합체의 이량체화를 유도하였다. 다시 말하면, 본 출원인들은 분할형 dCas9-VP64의 유도 가능성을 시험하였고, 전사 활성화가 라파마이신의 존재하에 분할형 dCas9-VP64에 의해 유도되었음을 보여주었다. 그와 같이, 본 발명의 유도성 Cas9는 하나 이상의 작용성 도메인, 예를 들어, 전사 활성화제 또는 억제제 또는 뉴클레아제(예를 들어, Fok1)와 회합될 수 있다. 작용성 도메인은 분할형 Cas9의 하나의 부분에 결합되거나 그와 융합될 수 있다.
제1 CRISPR 효소 작제물이 5'-제1 국소화 신호-(N' 말단 Cas9 부분)-링커-(이량체의 제1 절반)-제1 국소화 신호-3'으로 배열되고, 제2 CRISPR 효소 작제물이 5'- 제2 국소화 신호--(이량체의 제2 절반)-링커-(C' 말단 Cas9 부분)-제2 국소화 신호-작용성 도메인-3'으로 배열되는 것이 바람직한 배열이다. 본원에서, 작용성 도메인은 제2 CRISPR 효소 작제물의 3' 말단에 배치된다. 대안적으로, 작용성 도메인은 제1 CRISPR 효소 작제물의 5' 말단에 배치될 수 있다. 하나 이상의 작용성 도메인이 3' 말단 또는 5' 말단에서 또는 둘 모두의 말단에서 사용될 수 있다. 적합한 프로모터는 바람직하게는 작제물의 각각의 상류이다. 2개의 작제물은 개별적으로 또는 함께 전달될 수 있다. 국소화 신호는 그들이 각각의 작제물에서 상호-혼합되지 않는 한, NLS 또는 NES일 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 Cas9(CRISPR 효소)가 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 CRISPR 효소와 비교하여, 적어도 97% 또는 100% 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 CRISPR 효소가 둘 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서, SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 D10, E762, H840, N854, N863 또는 D986, 또는 SaCas9 단백질에 따른 N580 중 둘 이상이 돌연변이되거나, 또는 CRISPR 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 여기서, 적어도 H840이 돌연변이되는 임의의 상기 언급된 시스템을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 CRISPR 효소가 SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 또는 D986A, 또는 SaCas9 단백질에 따른 N580A를 포함하는 둘 이상의 돌연변이, 또는 H840A를 포함하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 본원에 언급된 시스템을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 CRISPR 효소가 SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 H840A, 또는 D10A 및 H840A, 또는 D10A 및 N863A를 포함하는 임의의 본원에 언급된 시스템을 제공한다. 일 양태에서, 본 발명은 CRISPR 효소가 SaCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 N580A; 또는 SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 D10A 및 SaCas9 단백질에 따른 N580A를 포함하는 임의의 본원에 언급된 시스템을 제공한다.
따라서, Cas9가 dead Cas9인 것도 또한 바람직하다. 이상적으로, 분할은 항상 촉매 도메인이 영향을 받지 않도록 이루어져야 한다. deadCas9에 있어서, 본 발명은 DNA 결합이 일어나지만, 절단 또는 닉카아제 활성이 나타나지 않는 것이 의도된다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 여기서, 하나 이상의 작용성 도메인은 Cas9와 회합된다. 이러한 작용성 도메인은 분할형 Cas9의 하나의 부분 또는 둘 모두와 회합(즉, 그와 결합 또는 융합)될 수 있다. 분할형 Cas9의 2개의 부분의 각각과 회합된 것이 존재할 수 있다. 따라서, 이들은 전형적으로 제1 및/또는 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 부분으로서, 상기 작제물 내의 융합체로서 제공될 수 있다. 작용성 도메인은 전형적으로 본원에 논의된 바와 같이, 링커, 예를 들어, GlySer 링커를 통해 융합된다. 하나 이상의 작용성 도메인은 전사 활성화 도메인 또는 억제제 도메인일 수 있다. 그들이 상이한 도메인일 수 있지만, 모든 작용성 도메인이 활성화제 또는 억제제 중 어느 하나이며, 2개의 혼합물이 사용되지 않는 것이 바람직하다.
전사 활성화 도메인은 VP64, p65, MyoD1, HSF1, RTA 또는 SET7/9를 포함할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, Cas9와 회합된 하나 이상의 작용성 도메인은 전사 억제제 도메인이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 전사 억제제 도메인은 KRAB 도메인이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 전사 억제제 도메인은 NuE 도메인, NcoR 도메인, SID 도메인 또는 SID4X 도메인이다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 어댑터 단백질과 회합된 하나 이상의 작용성 도메인은 메틸라제 활성, 디메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성, DNA 절단 활성, DNA 통합 활성 또는 핵산 결합 활성을 포함하는 하나 이상의 활성을 갖는다.
또한, 히스톤 변형 도메인이 일부 구현예에서 바람직하다. 예시적인 히스톤 변형 도메인은 하기 논의되어 있다. 전이효소(transposase) 도메인, HR(상동성 재조합) 기구 도메인, 재조합효소 도메인 및/또는 인테그라제(integrase) 도메인도 또한 본 발명의 작용성 도메인으로서 바람직하다. 일부 구현예에서, DNA 통합 활성은 HR 기구 도메인, 인테그라제 도메인, 재조합효소 도메인 및/또는 전이효소 도메인을 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, DNA 절단 활성은 뉴클레아제에 기인한다.
일 양태에서, 본 발명은 본원에 논의된 바와 같은 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 뉴클레아제는 Fok1 뉴클레아제를 포함한다.
본 발명의 분할형 Cas9 시스템에서 바람직한 그러한 작용성 도메인의 용도도 또한 문헌[Konermann et al, ("Genome-scale transcriptional activation with an engineered CRISPR-Cas9 complex"Nature published 11 Dec 2014)]에 상세히 논의되어 있다. 본 발명의 시스템은 임의의 가이드와 함께 사용될 수 있지만, 최적화된 가이드가 일부 구현예에서 바람직하다. 상기 언급된 논문[Konermann Nature 11 Dec 2014]에 따른 가이드가 특히 바람직하다. 이들 가이드는 단백질-결합 RNA 부분(예를 들어, 압타머)이 테트라루프 및/또는 스템루프 2에 부가되거나 그를 대체하도록 변형된다. 이어서, RNA를 인식하고, 작용성 도메인, 예를 들어, 본원에 기재된 것들을 가이드에 동원하기 위하여 상응하는 RNA-결합 단백질 도메인이 청구된다. 이것은 주로 뉴클레아제, 예를 들어, Fok1을 통한 DNA 절단 또는 전사 활성화 또는 억제를 야기하는 deadCas9와 함께 사용하기 위한 것이다. deadCas9와 병용되는 그러한 가이드의 이용은 강력하며, 특히 Cas9 그 자체가 또한 본원에 논의된 바와 같이 그의 자체의 작용성 도메인과 회합된다면 강력하다. deadCas9(그 자체의 회합된 작용성 도메인 존재 또는 부재)가 본 발명에 따라 재구성하도록 유도되는 경우, 즉, 분할형 Cas9인 경우, 도구가 특히 유용하다.
또한, 본 발명에 사용하기에 바람직한 가이드 RNA(sgRNA)는 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함할 수 있으며, sgRNA의 적어도 하나의 루프는 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합되는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되고, 어댑터 단백질은 하나 이상의 작용성 도메인과 회합된다. CRISPR 효소는 바람직하게는 deadCas9이다. 그것은 CRISPR 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 CRISPR 효소의 뉴클레아제 활성의 5% 이하를 갖도록 적어도 하나의 돌연변이; 및/또는 적어도 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함할 수 있다. 또한, 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA(sgRNA), 적어도 하나 이상의 핵 국소화 서열을 포함하는 CRISPR 효소를 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 조성물이 제공되며, CRISPR 효소는 CRISPR 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 CRISPR 효소의 뉴클레아제 활성의 5% 이하를 갖게 하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하고, 적어도 하나의 sgRNA의 적어도 하나의 루프는 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되며, 어댑터 단백질은 하나 이상의 작용성 도메인과 회합된다.
바람직하게는 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입에 의해 변형되는 sgRNA의 적어도 하나의 루프는 테트라루프 또는 스템-루프 2 중 하나 또는 둘 모두이다. 하나 이상의 어댑터 단백질에 결합하는 별개의 RNA 서열(들)의 삽입은 바람직하게는 하나의 어댑터 서열, 또는 동일하거나 상이한 어댑터 단백질(들)에 특이적인 둘 이상의 어댑터 서열이다. 어댑터 단백질은 바람직하게는 MS2, PP7, Qβ, F2, GA, fr, JP501, M12, R17, BZ13, JP34, JP500, KU1, M11, MX1, TW18, VK, SP, FI, ID2, NL95, TW19, AP205, φCb5, φCb8r, φCb12r, φCb23r, 7s, PRR1을 포함한다. 특히 분할형 dCas9를 안정적으로 발현하는 세포주는 유용할 수 있다.
본 출원인들은 Cas9가 2개의 별개의 단편으로 분할될 수 있으며, 이것이 화학적 유도를 사용하여 다시 결합되는 경우 작용성 전장 Cas9 뉴클레아제를 재구성하는 것을 입증하였다. 분할형 Cas9 구조는 다양한 응용에 유용할 것이다. 예를 들어, 분할형 Cas9는 각 단편을 상이한 조직 특이적 프로모터 하에 둠으로써 Cas9 활성을 교차 세포 집단에 제한하기 위한 유전적 전략을 가능하게 할 수 있다. 또한, 상이한 화학적으로 유도성 이량체화 도메인, 예를 들어, APA 및 지베렐린도 또한 사용될 수 있다.
유도물질 에너지원은 바람직하게는 화학적 유도이다.
분할 자리 또는 위치는 Cas9 효소의 제1 부분이 제2 부분으로부터 분리되는 지점이다. 일부 구현예에서, 제1의 것은 아미노산 1에서 X까지를 포함하거나 그를 인코딩할 것인 한편, 제2 부분은 아미노산 X+1에서 말단까지를 포함하거나 그를 인코딩할 것이다. 이러한 예에서, 넘버링은 연속적이지만, 이것은 아미노산(또는 그들을 인코딩하는 뉴클레오티드)이 분할된 말단 중 어느 하나의 말단으로부터 트리밍될 수 있기 때문에, 항상 필요하지 않을 수 있되, 충분한 DNA 결합 활성 및 요구된다면, DNA 닉카아제 또는 절단 활성은 야생형 Cas9에 비하여 예를 들어, 적어도 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 활성을 유지한다.
본원에 제공되는 예시적인 넘버링은 야생형 단백질, 바람직하게는 야생형 SpCas9 단백질을 참조하여 이루어질 수 있다. 그러나, 야생형 SpCas9 단백질의 돌연변이체가 사용될 수 있는 것이 예상된다. 예를 들어, 결정 데이터 논문 그 자체에서, deadCas9를 사용하였으며, 이들은 일부 구현예에서, 바람직하며, 본원의 다른 곳의 논의를 참조한다. 또한, 예를 들어, 일부 N' 또는 C'말단 절두 또는 결실이 사용될 수 있기 때문에, 넘버링은 Sp Cas9 넘버링을 정확하게 따르지 않을 수 있지만, 이것은 표준 서열 정렬 도구를 사용하여 다루어질 수 있다. 오솔로그도 또한 서열 정렬 도구로서 바람직하다.
따라서, 분할 위치는 해당 분야의 통상의 기술을 사용하여, 예를 들어, 본원에 언급된 물질에 제공되는 결정 데이터에 기초하여 선택될 수 있다.
실시예 1 및 2에서, 본 출원인들은 SpCas9 내의 다수의 분할 위치를 조사하였으며, 그들 전부는 본 출원인들은 유도성 이량체화 도메인을 사용하여 Cas9를 재구성할 수 있었다는 점에서 작용을 하였다. 실시예 1에서, 다음을 도 1, 특히 도 1d에 나타내고 하기에 카피된 바와 같이 시도하였다:
Figure pct00028
잠재적인 분할면을 확인하는 것은 결정 구조의 도움으로 가장 간단히 행해진다. Sp 돌연변이체에 있어서, 예를 들어, 서열 정렬을 위한 상응하는 위치가 무엇인지 용이하게 명백해져야 한다. 비-Sp 효소에 있어서, 오솔로그와 의도되는 Cas9 사이에 상대적으로 높은 상동성 정도가 존재한다면, 오솔로그의 결정 구조를 사용할 수 있다.
이상적으로, 분할 위치는 영역 또는 루프 내에 위치해야 한다. 바람직하게는 분할 위치는 아미노산 서열의 중단이 구조적 특징부(예를 들어, 알파-헬릭스 또는 베타-시이트)의 부분적인 또는 완전한 파괴를 야기하지 않는 곳에서 발생한다. 비구조화 영역(이들 영역이 결정에서 "고착(frozen)"되기에 충분히 구조화되지 않기 때문에 결정 구조에서 보이지 않는 영역)은 종종 바람직한 선택사항이다. 본 발명의 실시예에서, 본 출원인들은 SpCas9의 표면상에 노출된 모든 비구조화 영역에서 분할을 만들었다. 비구조화 영역 또는 외측 루프 내의 위치는 정확히 상기 제공된 번호일 필요가 없을 수 있지만, 분할 위치가 여전히 외측 루프의 비구조화 영역 내에 있는 한, 루프의 크기에 따라, 상기 제공된 위치의 어느 하나의 측에서 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 심지어 10개의 아미노산이 달라질 수 있다.
Rec 2 도메인의 외측 루프 내의 분할이 일부 구현예에서 바람직하다. 다른 구현예에서, Rec 1의 외측 루프 내의 분할이 바람직하다. 다른 구현예에서, PI의 외측 루프 내의 분할이 바람직하다. 다른 구현예에서, Rec 1의 비구조화 영역 내의 분할이 바람직하다. 다른 구현예에서, RuvC3의 비구조화 영역 내의 분할이 바람직하다. 다른 구현예에서, PI의 비구조화 영역 내의 분할이 바람직하다.
본 출원인들은 바람직한 예로서, 그리고 지침으로서 제공되는 하기의 절차를 따랐다. 비구조화 영역이 결정 구조에서 나타나지 않기 때문에, 본 출원인들은 결정의 주변 아미노산 서열과 SpCas9의 일차 아미노산 서열을 교차-참조하였다. 각각의 비구조화 영역은 3 내지 10개의 아미노산으로 이루어지며, 이는 결정에서 나타나지 않았다. 따라서, 본 출원인들은 이들 아미노산 사이에서 분할을 만들었다. 비구조화 영역 내의 오직 6개의 분할만이 SpCas9에서 가능하였다. 더 많은 분할을 시험함으로써 본 출원인들이 작용하는 것을 찾을 기회를 더 많이 가질 것이라는 가정하에(큰 단백질을 사용한 분할이 조금이라도 작용할 것임은 초기에 회의적임). 더 많은 가능한 분할면을 포함하기 위하여, 본 출원인들은 비구조화 영역과 동일한 기준을 사용하여 Cas9의 외측에서 루프 내에 위치하는 분할을 포함시켰다. 상기 분할의 모두가 작용하였다는 것은 놀라운 것이었다.
일부 구현예에서, 분할 위치는 Cas9의 외측 루프 내에 존재한다. 다른 바람직한 구현예에서, 분할 위치는 Cas9의 비구조화 영역 내에 존재한다. 비구조화 영역은 전형적으로 그 구조가 결정 패턴으로부터 용이하게 결정될 수 없는 고도로 유연한 외측 루프이다.
분할은 바람직하게는 상기 언급된 2개의 아미노산 사이, 예를 들어, 첫번째 줄에서 202A에 대한 C' 말단에서 발생한다. 상기 분할 중 임의의 것이 SpCas9에서, 또는, 상응하는 위치가 돌연변이체 SpCas9 또는 오솔로그에서 바람직하다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 202A/203S 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 255F/256D 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 310E/311I 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 534R/535K 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 572E/573C 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 713S/714G 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 1003L/1004E 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 1054G/1055E 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 1114N/1115S 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 1152K/1153S 사이일 수 있다. 일부 구현예에서, 분할 위치는 1245K/1246G 사이일 수 있다. 다른 바람직한 위치는 실시예 1에 언급된 바와 같이 1098과 1099 사이의 분할이다.
일단 분할 위치가 확인되면, 적합한 작제물이 설계될 수 있다. 예를 들어, 그러한 하나의 작제물은 202A/203S 사이의 분할에 관하여 도 1c에 나타나 있다.
전형적으로, NES는 분할된 아미노산의 제1 부분의 N' 말단(또는 그것을 인코딩하는 뉴클레오티드의 5' 말단)에 배치된다. 그러한 경우, NLS는 분할된 아미노산의 제2 부분의 C' 말단(또는 그것을 인코딩하는 뉴클레오티드의 3' 말단)에 배치된다. 이러한 방식으로, 제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
물론, 역위 배열이 제공될 수 있으며, NLS는 분할된 아미노산의 제1 부분의 N' 말단(또는 그것을 인코딩하는 뉴클레오티드의 5' 말단)에 배치된다. 그 경우, NES는 분할된 아미노산의 제2 부분의 C' 말단(또는 그것을 인코딩하는 뉴클레오티드의 3' 말단)에 배치된다. 따라서, 제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
실시예 2는 상기의 것을 기반으로 하며, 유사한 위치를 사용한다. 이들은 하기에 기재되어 있으며, 상기 사용되는 것들과 유사하다. 또한, 도 2, 특히 도 2a 및 실시예 2를 참조한다.
Figure pct00029
팩킹 목적을 위하여 2개의 부분(분할형의 어느 하나의 측)을 대략적으로 동일한 길이로 유지하는 것이 몇몇 이점이 있다는 점에서, 상기 분할 4, 5 및 6이 일 양태에서 유리하다. 예를 들어, 전사물이 대략 동일한 크기인 경우, 둘 모두의 조각 사이에서 화학량론을 유지하는 것이 더 쉬운 것으로 여겨진다.
실시예 2에서, 인간 코돈-최적화 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 N- 및 C-말단 조각은 각각 FRB 및 FKBP 이량체화 도메인에 융합된다. 이러한 배열이 바람직하다. 그들은 전환될 수 있으며(즉, N' 말단이 FKBP에, C' 말단이 FRB에), 이러한 배열도 또한 작용하지만, 이러한 전환된 배열이 Cas9의 2개의 부분을 더 떨어뜨린다는 의견이 있다.
링커, 예를 들어, (GGGGS)3이 이량체화 도메인으로부터 Cas9 단편을 분리하기 위하여 본원에서 바람직하게 사용된다. (GGGGS)3이 바람직한데, 그 이유는 그것이 상대적으로 긴 링커(15개 아미노산)이기 때문이다. 글리신 잔기는 가장 유연하며, 세린 잔기는 링커가 단백질의 외측에 존재할 기회를 증진시킨다. (GGGGS)6 (GGGGS)9 또는 (GGGGS)12가 바람직하게 대안으로 사용될 수 있다. 다른 바람직한 대안은 (GGGGS)1, (GGGGS)2, (GGGGS)4, (GGGGS)5, (GGGGS)7, (GGGGS)8, (GGGGS)10 또는 (GGGGS)11이다.
예를 들어, 도 8은 N' 말단 Cas9 단편과 FRB 사이의 (GGGGS)3을 보여준다. 또한, 그것은 FKB와 C' 말단 Cas9 단편 사이의 것을 보여준다.
대안적인 링커가 이용 가능하지만, 매우 유연한 링커가 Cas9의 2개의 부분을 합쳐 Cas9 활성을 재구성할 최대의 기회를 가능하게 하도록 최적으로 작용하는 것으로 여겨진다. 하나의 대안은 뉴클레오플라스민(nucleoplasmin)의 NLS가 링커로 사용될 수 있다는 것이다.
또한, 링커는 Cas9와 임의의 작용성 도메인 사이에 사용될 수 있다. 다시, (GGGGS)3 링커가 여기에 사용될 수 있거나(또는 그에 따라 6, 9 또는 12 반복 버전) 뉴클레오플라스민의 NLS가 Cas9와 작용성 도메인 사이의 링커로 사용될 수 있다.
FRB/FKBP 시스템에 대한 대안이 예상된다. 예를 들어, ABA 및 지베렐린 시스템.
따라서, FKBP 과의 바람직한 예는 하기의 유도성 시스템 중 임의의 것이다. FK506의 존재하에 CalcineurinA(CNA)와 이량체화하는 FKBP; FKCsA의 존재하에 CyP-Fas와 이량체화하는 FKBP; 라파마이신의 존재하에 FRB와 이량체화하는 FKBP; 쿠메르마이신(coumermycin)의 존재하에 GryB와 이량체화하는 GyrB; 지베렐린의 존재하에 GID1과 이량체화하는 GAI; 또는 HaXS의 존재하에 HaloTag와 이량체화하는 Snap-tag.
FKBP 과 그 자체에서의 대안도 또한 바람직하다. 예를 들어, FKBP는 FK1012의 존재하에 동종-이량체화한다(즉, 하나의 FKBP는 다른 FKBP와 이량체화한다). 따라서,
유도성 동종이량체의 제1 절반에 부착된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물 및
유도성 동종이량체의 제2 절반에 부착된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템도 또한 제공되고,
제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결되며,
제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 (임의로 하나 이상의) 핵 이출 신호(들)에 작동 가능하게 연결되고,
유도물질 에너지원과의 접촉은 유도성 동종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키며,
유도성 동종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키는 것은 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 작용성 CRISPR-Cas 시스템을 구성하게 하고,
CRISPR-Cas 시스템은 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하며,
작용성 CRISPR-Cas 시스템은 표적 서열에 결합하고, 임의로 게놈 유전자좌를 편집하여, 유전자 발현을 변경시킨다.
일 구현예에서, 동종이량체는 바람직하게는 FKBP이고, 유도물질 에너지원은 바람직하게는 FK1012이다. 다른 구현예에서, 동종이량체는 바람직하게는 GryB이고, 유도물질 에너지원은 바람직하게는 쿠메르마이신이다. 다른 구현예에서, 동종이량체는 바람직하게는 ABA이며, 유도물질 에너지원은 바람직하게는 지베렐린이다.
다른 구현예에서, 이량체는 이종이량체이다. 이종이량체의 바람직한 예는 하기의 유도성 시스템 중 임의의 것이다: FK506의 존재하에 CalcineurinA(CNA)와 이량체화하는 FKBP; FKCsA의 존재하에 CyP-Fas와 이량체화하는 FKBP; 라파마이신의 존재하에, 쿠메르마이신의 존재하에 FRB와 이량체화하는 FKBP; 지베렐렌의 존재하에 GID1과 이량체화하는 GAI; 또는 HaXS의 존재하에 HaloTag와 이량체화하는 Snap-tag.
본 출원인들은 FKBP/FRB를 사용하였는데, 그 이유는 그것이 널리 특성화되고, 둘 모두의 도메인이 패키징을 보조하기에 충분히 작기 때문이다(100개 미만의 아미노산). 또한, 라파마이신은 오랫 동안 사용되어 왔으며, 부작용이 널리 이해되어 있다. 큰 이량체화 도메인(300개 초과의 아미노산)도 또한 작용할 것이지만, Cas9 재구성을 가능하게 만들기 위하여 더 긴 링커를 필요로 할 수 있다.
Paulmurugan 및 Gambhir(문헌[Cancer Res, August 15, 2005 65; 7413])은 FRB/FKBP/라파마이신 시스템에 대한 백그라운드를 논의하였다. 다른 유용한 논문은 Crabtree 등에 의한 논설(문헌[Chemistry & Biology 13, 99-107, Jan 2006])이다. 본 발명의 도 6b는 또한 작제물의 유용한 다이어그램 및 본 발명에 의해 예상되는 바와 같은 라파마이신의 존재하에 얻어진 발현 및 이량체화를 보여준다.
실시예 3에서, 단일의 벡터, 발현 카세트(플라스미드)를 도 9a에 나타낸 바와 같이 작제하였다. sgRNA는 U6 프로모터의 조절하에 있었다. 2가지 상이한 Cas9 분할을 사용하였다: 실시예 2로부터의 분할 4 및 5. 분할형 Cas9 작제물은 NLS가 측부 배치되고, GlySer 링커를 통하여 분할된 Cas9의 C 말단 부분에 융합된 FKBP가 있는 제1 CRISPR 효소 융합 작제물; 및 NES가 측부 배치되고, GlySer 링커를 통해 분할된 Cas9의 N 말단 부분과 융합된 FRB가 있는 제2 CRISPR 효소 융합 작제물에 기반하였다. 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 분리하기 위하여, P2A를 사용하여, 전사시에 분할시켰다. 분할형 Cas9는 라파마이신의 존재하에서 야생형과 유사한 삽입결실 형성을 보였지만, 라파마이신의 부재하에서 야생형보다 현저히 더 낮은 삽입결실 형성을 보였다.
따라서, 단일의 벡터가 제공된다. 벡터는
유도성 이량체의 제1 절반에 부착된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물 및
유도성 이량체의 제2 절반에 부착된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 포함하며,
제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결되며,
제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 하나 이상의 핵 이출 신호(들)에 작동 가능하게 연결되고,
유도물질 에너지원과의 접촉은 유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키며,
유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키는 것은 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 작용성 CRISPR-Cas 시스템을 구성하게 하고,
CRISPR-Cas 시스템은 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하며,
작용성 CRISPR-Cas 시스템은 표적 서열에 결합하고, 임의로 게놈 유전자좌를 편집하여, 유전자 발현을 변경시킨다. 이들 요소는 바람직하게는 단일의 작제물, 예를 들어, 발현 카세트 상에 제공된다.
제1 CRISPR 효소 융합 작제물은 바람직하게는 각 말단에 적어도 하나의 핵 국소화 신호가 측부 배치된다. 제2 CRISPR 효소 융합 작제물은 바람직하게는 각 말단에 적어도 하나의 핵 이출 신호가 측부 배치된다.
또한, 시스템을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터 중 임의의 것으로 대상체를 형질전환시켜 유전자 편집을 유도하는 단계 및 유도물질 에너지원을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법이 제공된다. 적합한 수복 주형도 또한 제공될 수 있으며, 예를 들어, 상기 수복 주형을 포함하는 벡터에 의해 전달될 수 있다.
또한, 본 발명의 시스템을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터 중 임의의 것으로 대상체를 형질전환시켜 전사 활성화 또는 억제를 유도하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 촉매적 비활성 CRISPR 효소 및 하나 이상의 회합된 작용성 도메인을 인코딩하거나 그를 포함하는 단계를 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법은 유도물질 에너지원을 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함한다.
상기 치료 방법에 사용하기 위한 본 발명의 시스템을 포함하는 조성물도 또한 제공된다. 또한, 그러한 치료 방법을 위한 약제의 제조에서의 본 발명의 시스템의 용도가 제공된다.
본 발명의 시스템에 의해 치료가능한 질환의 예는 본원에 또는 본원에 언급된 문헌에 기재되어 있다.
단일의 벡터는 전사물-분할 작용제, 예를 들어, P2A를 포함할 수 있다. P2A는 전사물을 2개로 분할하여, 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 분리한다. 분할은 "리보솜 스키핑(ribosomal skipping)"으로 인한 것이다. 요컨대, 리보솜은 번역 동안 아미노산을 건너뛰고, 이는 단백질 쇄를 파단시키고, 2개의 개별 폴리펩티드/단백질을 야기한다. 또한, 단일의 벡터가 낮은 백그라운드 활성은 상관이 없지만, 높은 유도성 활성이 요망되는 응용에 유용하다.
하나의 예는 클론 배아 줄기 세포주의 생성일 것이다. 보통의 절차는 야생형 Cas9 또는 Cas9 닉카아제를 인코딩하는 플라스미드로의 일시적인 트랜스펙션이다. 이들 플라스미드는 Cas9 분자를 생성하며, 이는 수일 동안 활성이 유지되며, 더 높은 표적외 활성의 기회를 갖는다. 분할형 Cas9에 대한 단일의 발현 벡터를 사용하는 것은 "높은" Cas9 활성을 더 짧은 시간창으로 제한한다(예를 들어, 1회 용량의 유도물질, 예를 들어, 라파마이신). 지속적(매일의) 유도물질(예를 들어, 라파마이신) 처리 없이, 단일 발현 분할형 Cas9 벡터의 활성은 낮으며, 원치않는 표적외 효과를 야기할 기회의 감소를 제시한다.
유도된 Cas9 활성의 최대치가 일부 구현예에서 유리하며, 단일의 전달 벡터를 사용하여 가장 용이하게 야기될 수 있지만, 이중 벡터 시스템(분할형 Cas9의 하나의 절반을 전달하는 각각의 벡터)을 통한 것도 또한 가능하다. 최대치는 짧은 기간, 전형적으로 유도물질의 수명 동안 높은 활성일 수 있다.
따라서, 본 발명의 시스템을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 벡터 중 하나로 하나 이상의 배아 줄기 세포를 트랜스펙션시켜, 본 발명의 분할형 Cas9를 발현하는 단계 및 본 발명의 유도물질 에너지원을 하나 이상의 줄기 세포에 투여하거나 그와 접촉시켜, Cas9의 재구성을 유도하는 단계를 포함하는 클론 배아 줄기 세포주의 생성 방법이 제공된다. 수복 주형이 제공될 수 있다.
본원에 기재된 모든 방법과 같이, 적합한 sgRNA 또는 가이드가 요구될 것이 인식될 것이다.
작용성 도메인 등이 효소의 하나의 또는 다른 부분과 "회합"되는 경우, 이들은 전형적으로 융합체이다. 용어 "와 회합되는"은 하나의 분자가 다른 것에 대하여, 예를 들어, CRISPR 효소의 부분과 작용성 도메인 사이에 '회합되는' 방법에 관하여 본원에 사용된다. 그러한 단백질-단백질 상호작용의 경우에, 이러한 회합은 항체가 에피토프를 인식하는 방식의 인식에 관하여 생각될 수 있다. 대안적으로, 하나의 단백질은 2개의 융합을 통하여 다른 단백질과 회합될 수 있으며, 예를 들어, 하나의 서브유닛은 다른 서브유닛에 융합된다. 융합은 전형적으로, 예를 들어, 각각 단백질 또는 서브유닛을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열이 같이 스플라이싱되는 것을 통하여, 하나의 아미노산 서열로의 다른 것의 아미노산 서열의 부가에 의해 발생된다. 대안적으로, 이것은 본질적으로 융합 단백질과 같이 2개의 분자 간의 결합 또는 직접적인 결합으로 생각될 수 있다. 임의의 사례에서, 융합 단백질은 2개의 관심 서브유닛 사이에(즉, 효소와 작용성 도메인 사이에, 또는 어댑터 단백질과 작용성 도메인 사이에) 링커를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, CRISPR 효소의 부분은 그로의 결합에 의해 작용성 도메인과 회합된다. 다른 구현예에서, CRISPR 효소는 임의로 중간체 링커를 통해 2개가 함께 융합되기 때문에 작용성 도메인과 회합된다. 링커의 예는 본원에 논의된 GlySer 링커를 포함한다.
유도물질의 다른 예는 광 및 호르몬을 포함한다. 광에 있어서, 유도성 이량체는 이종이량체일 수 있으며, 이량체의 제1 광-유도성 절반 및 이량체의 제2(및 상보성) 광-유도성 절반을 포함한다. 제1 및 제2 광-유도성 이량체 절반의 바람직한 예는 CIB1 및 CRY2 시스템이다. CIB1 도메인은 광-감수성 크립토크롬 2(CRY2)의 이종이량체 결합 파트너이다.
본 발명은 유도물질 에너지원이 열, 초음파, 전자기에너지 또는 화학물질일 수 있음을 이해한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 유도물질 에너지원은 항생제, 소분자, 호르몬, 호르몬 유도체, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 유도물질 에너지원은 아브시스산(ABA), 독시사이클린(DOX), 큐메이트(cumate), 라파마이신, 4-하이드록시타목시펜(4OHT), 에스트로겐 또는 엑디손일 수 있다. 본 발명은 적어도 하나의 전환이 항생제 기반의 유도성 시스템, 전자기 에너지 기반의 유도성 시스템, 소분자 기반의 유도성 시스템, 핵 수용체 기반의 유도성 시스템 및 호르몬 기반의 유도성 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음을 제공한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 전환은 테트라사이클린(Tet)/DOX 유도성 시스템, 광 유도성 시스템, ABA 유도성 시스템, 큐메이트 억제제/작동유전자 시스템, 4OHT/에스트로겐 유도성 시스템, 엑디손 기반의 유도성 시스템 및 FKBP12/FRAP(FKBP12-라파마이신 복합체) 유도성 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 그러한 유도물질은 또한 본원 및 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2013/051418호에 논의되어 있다.
일반적으로, 야생형이든지, 닉카아제이든지, deadCas9이든지(회합된 작용성 도메인 존재 또는 부재), Cas9로 이루어질 수 있는 임의의 용도가 본 발명의 분할형 Cas9 방법을 사용하여 추구될 수 있다. 이익은 Cas9 활성의 유도성 성질을 유지한다.
추가의 예로서, GFP와 같은 형광 단백질과 분할형 Cas9 융합이 이루어질 수 있다. 이는 유도성 방식이지만 게놈 유전자좌의 영상화를 가능하게 할 것이다(문헌["Dynamic Imaging of Genomic Loci in Living Human Cells by an Optimized CRISPR/Cas System" Chen B et al. Cell 2013] 참조). 그와 같이, 일부 구현예에서, Cas9 부분 중 하나 이상은 형광 단백질, 예를 들어, GFP와 회합(특히, 그와 융합)될 수 있다.
추가의 실험은 표적 상의 절단이 동일한 수준으로 존재하는 경우, 야생형(wt) 및 분할형 Cas9 간에 표적외 절단에서 차이가 존재하는지를 다룬다. 이를 행하기 위하여, 본 출원인들은 야생형 및 분할형 Cas9 플라스미드의 일시적 트랜스펙션을 사용하고, 상이한 시점에서 수집한다. 본 출원인들은 표적 상의 절단이 +/- 5% 이내인 일련의 시료를 찾아낸 후에 표적외 활성화를 찾았다. 본 출원인들은 가이드 없이, 야생형 또는 분할형 Cas9의 안정적인 발현을 갖는 세포주를 만들었다(렌티바이러스 사용). 항생제 선택 후에, 가이드는 개별 렌티바이러스를 사용하여 전달되며, 표적 상의/외의 절단을 측정하기 위하여 상이한 시점에 수집한다.
유도성 전사를 위한 시스템에 관하여, 본 출원인들은 분할형-11을 사용하여 상이한 구조의 분할형 dCas9를 클로닝하였다. 분할형-11은 복합체가 덜 안정적이며 이에 따라 라파마이신 제거 후에 해리될 가능성이 더 큰 것으로 예상됨에 따라, 2개의 Cas9 단편 사이에 최소의 결합 표면을 갖는다. 이러한 방법은 더 적은 유도이지만 유도를 가졌고, 더 많은 백그라운드를 가졌으며, 유도는 또한 가역적이지 않았다.
본 출원인들은 불안정화 서열(PEST, 문헌["Use of mRNA- and protein-destabilizing elements to develop a highly responsive reporter system" Voon DC et al. Nucleic Acids Research 2005] 참조)을 FRB(N)Cas9-NES 단편 내로 도입하여, 더 빠른 분해를 용이하게 하고, 이에 따라 분할형 dCas9-VP64 복합체의 안정성을 감소시켰다. 그러한 불안정화 서열(PEST 포함)은 본 발명의 시스템에서 유리할 수 있다.
분할형 dCas9-VP64 및 MS2-p65-HSF1 + 가이드를 안정적으로 발현하는 세포주를 생성한다. PLX 내성 스크린은 비-가역적인, 시간조절 전사 활성화가 약물 스크린에서 유용할 수 있음을 나타낼 수 있다. 이러한 방법은 분할형 dCas9-VP64가 가역적이지 않은 경우에 유리할 수 있다.
일반적으로, CRISPR-Cas 또는 CRISPR 시스템은 전술한 문헌, 예를 들어, WO 2014/093622호(PCT/US2013/074667호)에 사용되는 바와 같으며, 집합적으로 Cas 유전자를 인코딩하는 서열, tracr(전사-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어, tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "직접 반복부" 및 tracrRNA-가공 부분 직접 반복부 포함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭) 또는 당해 용어가 본원에 사용되는 바와 같은 "RNA(들)"(예를 들어, 가이드 Cas9에 대한 RNA(들), 예를 들어, CRISPR RNA 및 전사활성화(tracr) RNA 또는 단일의 가이드 RNA(sgRNA)(키메라 RNA)) 또는 CRISPR 유전자좌로부터의 기타 서열 및 전사물을 포함하는 CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현에 수반되거나, 그의 활성을 유도하는 전사물 및 다른 요소를 지칭한다. 일반적으로, CRISPR 시스템은 표적 서열의 위치에서 CRISPR 복합체의 형성을 증진시키는 요소(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 프로토스페이서로도 지칭)를 특징으로 한다. CRISPR 복합체의 형성의 맥락에서, "표적 서열"은 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서, 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 증진시킨다. 표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질 내에 위치한다. 일부 구현예에서, 직접 반복부는 다음의 기준을 일부 또는 전부 만족하는 반복 모티프를 검색함으로써 가상 환경에서 확인될 수 있다: 1. II형 CRISPR 유전자좌의 측부 배치된 게놈 서열의 2 Kb 창에서 발견됨; 2. 20 내지 50 bp에 걸쳐 있음; 3. 20 내지 50 bp 이격되어 있음. 일부 구현예에서, 이들 기준 중 2개가 사용될 수 있으며, 예를 들어 1과 2, 2와 3, 또는 1과 3이 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 3개 모두의 기준이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, CRISPR 복합체에서 tracr 서열이 하나 이상의 헤어핀을 가지며, 30개 이상의 뉴클레오티드 길이, 40개 이상의 뉴클레오티드 길이 또는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이이고; 가이드 서열이 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이이며, CRISPR/Cas 효소가 II형 Cas9 효소인 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 용어 가이드 서열 및 가이드 RNA는 상기 언급된 문헌, 예를 들어, WO2014/093622호(PCT/US2013/074667호)에서 상호교환 가능하게 사용된다. 일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고, 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하기에 충분한, 표적 폴리뉴클레오티드 서열과의 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 그의 상응하는 표적 서열 간의 상보성의 정도는 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬되는 경우, 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 최적의 정렬은 서열을 정렬하기에 적절한 임의의 알고리즘의 사용으로 결정될 수 있으며, 그의 비제한적인 예는 스미스-워터만(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 트랜스폼(Burrows-Wheeler Transform)에 기초한 알고리즘(예를 들어, 버로우즈 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), ClustalW, Clustal X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크라프트 테크놀로지즈(Novocraft Technologies)(www.novocraft.com에서 이용 가능함), ELAND(일루미나(Illumina), 미국 캘리포니아주 샌 디에고), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능) 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능)를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 75개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 약 75, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12개 이하의 뉴클레오티드 길이이다. 바람직하게는 가이드 서열은 10 내지 30개 뉴클레오티드 길이이다. 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하는 가이드 서열의 능력은 임의의 적절한 검정에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 시험되는 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체를 형성하기에 충분한 CRISPR 시스템의 성분은 예를 들어, CRISPR 서열의 성분을 인코딩하는 벡터로의 트랜스펙션에 의해서와 같이 상응하는 표적 서열을 갖는 숙주 세포로 제공될 수 있으며, 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 서베이어 검정에 의해서와 같은 표적 서열 내의 우선적인 절단의 평가로 이어질 수 있다. 유사하게, 표적 폴리뉴클레오티드 서열의 절단은 표적 서열, 시험되는 가이드 서열 및 시험 가이드 서열과 상이한 대조군 가이드 서열을 포함하는 CRISPR 복합체의 성분을 제공하고, 표적 서열에서 시험 및 대조군 가이드 서열 반응 간의 결합 또는 절단 비율을 비교함으로써 시험관에서 평가될 수 있다. 다른 검정이 가능하며, 해당 분야의 숙련자에게 떠오를 것이다. 가이드 서열은 임의의 표적 서열을 표적화하도록 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 세포의 게놈 내의 서열이다. 예시적인 표적 서열은 표적 게놈에서 독특한 것들을 포함한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGG(N은 A, G, T 또는 C이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGG(N은 A, G, T 또는 C이며; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXXAGAAW의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXXAGAAW(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXXAGAAW의 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXXAGAAW(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있으며; W는 A 또는 T임)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9에 대하여, 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMNNNNNNNNNNNNXGGXG의 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNNXGGXG(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 게놈 내의 독특한 표적 서열은 형태 MMMMMMMMMNNNNNNNNNNNXGGXG의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 표적 부위를 포함할 수 있으며, 여기서, NNNNNNNNNNNXGGXG(N은 A, G, T 또는 C이고; X는 임의의 것일 수 있음)는 게놈 내에 단일의 존재를 갖는다. 이들 서열 각각에서, "M"은 A, G, T 또는 C일 수 있으며, 서열을 독특한 것으로 확인하는데 고려될 필요는 없다. 일부 구현예에서, 가이드 서열은 가이드 서열 내의 2차 구조의 정도를 감소시키도록 선택된다. 일부 구현예에서, 가이드 서열의 뉴클레오티드의 약 75%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 이하가 최적으로 폴딩되는 경우 자가-상보성 염기 쌍형성에 참여한다. 최적의 폴딩은 임의의 적합한 폴리뉴클레오티드 폴딩 알고리즘에 의해서 결정될 수 있다. 일부 프로그램은 최소 깁스 자유 에너지의 계산에 기초한다. 그러한 한 알고리즘의 예는 mFold로서, 문헌[Zuker and Stiegler (Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148)]에서 설명되었다. 폴딩 알고리즘의 다른 예는 온라인 웹서버인 RNAfold인데, 이것은 중심 구조 예측 알고리즘을 사용하여, 비엔나 대학(University of Vienna)의 이론 화학 연구소(Institute for Theoretical Chemistry)에서 개발되었다(예를 들어, 문헌[A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24]; 및 문헌[PA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62] 참조).
일반적으로, tracr 메이트 서열은 다음 중 하나 이상을 증진시키기에 충분한, tracr 서열과의 상보성을 갖는 임의의 서열을 포함한다: (1) 상응하는 tracr 서열을 함유하는 세포에서 tracr 메이트 서열이 측부 배치된 가이드 서열의 절제; 및 (2) CRISPR 복합체가 tracr 서열에 혼성화되는 tracr 메이트 서열을 포함하는 표적 서열에서의 CRISPR 복합체의 형성. 일반적으로, 상보성의 정도는 2개의 서열 중 더 짧은 서열의 길이에 따른 tracr 메이트 서열과 tracr 서열의 최적의 정렬을 참조하여 이루어진다. 최적의 정렬은 임의의 적절한 정렬 알고리즘에 의해 결정될 수 있으며, tracr 서열 또는 tracr 메이트 서열 중 어느 하나에서의 자가-상보성과 같이 2차 구조를 추가로 설명할 수 있다. 일부 구현예에서, 2개 중 보다 짧은 것의 길이를 따른 tracr 서열과 tracr 메이트 서열 간의 상보성의 정도는 최적으로 정렬되는 경우, 약 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 이상이다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 구현예에서, tracr 서열 및 tracr 메이트 서열은 2개 간의 혼성화가 헤어핀과 같은 2차 구조를 갖는 전사물을 생성하도록 단일의 전사물 내에 함유된다. 본 발명의 일 구현예에서, 전사물 또는 전사된 폴리뉴클레오티드 서열은 적어도 2개 이상의 헤어핀을 갖는다. 바람직한 구현예에서, 전사물은 2, 3, 4 또는 5개의 헤어핀을 갖는다. 본 발명의 추가의 구현예에서, 전사물은 최대 5개의 헤어핀을 갖는다. 헤어핀 구조에서, 루프의 상류 및 마지막 "N"의 5' 서열의 부분은 tracr 메이트 서열에 상응하며, 루프의 3' 서열의 부분은 tracr 서열에 상응한다. 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열을 포함하는 단일의 폴리뉴클레오티드의 추가의 비제한적인 예는 하기와 같으며(5'에서 3'으로 표기), 여기서, "N"은 가이드 서열의 염기를 나타내고, 소문자의 제1 블록은 tracr 메이트 서열을 나타내며, 소문자의 제2 블록은 tracr 서열을 나타내고, 마지막 폴리-T 서열은 전사 종결자를 나타낸다: (1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaagatttaGAAAtaaatcttgcagaagctacaaagataa ggcttcatgccgaaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (2) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgttttcgttatttaaTTTTTT; (3) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgtttttgtactctcaGAAAtgcagaagctacaaagataaggcttcatgccg aaatcaacaccctgtcattttatggcagggtgtTTTTTT; (4) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAAtagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaactt gaaaaagtggcaccgagtcggtgcTTTTTT; (5) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctaGAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaac ttgaaaaagtgTTTTTTT; 및 (6) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNgttttagagctagAAATAGcaagttaaaataaggctagtccgttatcaTT TTTTTT. 일부 구현예에서, 서열 (1) 내지 (3)은 스트렙토코커스 써모필러스 CRISPR1 유래의 Cas9와 병용하여 사용된다. 일부 구현예에서, 서열 (4) 내지 (6)은 스트렙토코커스 피오게네스 유래의 Cas9와 병용하여 사용된다. 일부 구현예에서, tracr 서열은 tracr 메이트 서열을 포함하는 전사물과 별개의 전사물이다.
일부 구현예에서, 후보 tracrRNA가 다음의 기준을 일부 또는 전부 만족하는 서열에 의해서 연속하여 예측될 수 있다: 1. 직접 반복부에 대한 서열 상동성(최대 18-bp 미스매치를 사용하여 Geneious에서 모티프 검색); 2. 전사 방향에서 예측된 Rho-독립적 전사 종결자의 존재; 및 3. tracr RNA와 직접 반복부 사이의 안정한 헤어핀 2차 구조. 일부 구현예에서, 이들 기준 중 2개가 사용될 수 있으며, 예를 들어 1과 2, 2와 3, 또는 1과 3이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 3개의 기준이 모두 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 키메라 합성 가이드 RNA(sgRNA) 설계는 직접 반복부와 tracr RNA 사이에 적어도 12 bp의 듀플렉스 구조를 혼입할 수 있다.
독성 및 표적외 효과의 최소화를 위해, 전달되는 CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA의 농도를 조절하는 것이 중요할 것이다. CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA의 최적의 농도는 세포 또는 비-인간 진핵 동물 모델에서 상이한 농도를 시험함으로써, 그리고 잠재적인 표적외 게놈 유전자좌에서의 변형 정도를 분석하는 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈의 EMX1 유전자에서 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3'을 표적화하는 가이드 서열에 대해, 딥 시퀀싱은 다음의 2개의 표적외 유전자좌, 즉 1: 5'-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3' 및 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'에서 변형 수준을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 표적 상의 변형의 가장 높은 수준을 제공하는 한편 표적외 변형의 수준을 최소화하는 농도가 생체내 전달을 위해 선택되어야 한다. 대안적으로, 독성 수준 및 표적외 효과를 최소화하기 위해, CRISPR 효소 닉카아제 mRNA(예를 들어 D10A 돌연변이를 지니는 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)는 관심 부위를 표적화하는 가이드 RNA의 쌍과 함께 전달될 수 있다. 2개의 가이드 RNA는 다음과 같이 이격될 필요가 있다. 독성 및 표적외 효과를 최소화하기 위한 가이드 서열 및 전략은 WO 2014/093622호(PCT/US2013/074667호)에서와 같을 수 있다.
CRISPR 시스템은 유리하게는 II형 CRISPR 시스템으로부터 유래된다. 일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, CRISPR 시스템은 II형 CRISPR 시스템이며, Cas 효소는 Cas9이고, 이는 DNA 절단을 촉매작용시킨다. Cas 단백질의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csn1 및 Csx12로도 알려짐), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 그의 상동체 또는 그의 변형된 버전을 포함한다.
일부 구현예에서, 비변형 CRISPR 효소, 예를 들어, Cas9는 DNA 절단 활성을 갖는다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 상보물 내와 같은 표적 서열의 위치에서 1개 또는 둘 모두의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 표적 서열의 처음 또는 마지막 뉴클레오티드로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, 200, 500개 이상의 염기쌍에서 1개 또는 둘 모두의 가닥의 절단을 유도한다. 일부 구현예에서, 벡터는 상응하는 야생형 효소에 대하여 돌연변이되어, 돌연변이된 CRISPR 효소에 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 1개 또는 둘 모두의 가닥의 절단 능력이 결여되게 한 CRISPR 효소를 인코딩한다. 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스로부터의 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인 내에서의 아스파르트산에서 알라닌으로의 치환(D10A)은 Cas9를 두 가닥 모두를 절단하는 뉴클레아제에서 닉카아제(단일 가닥 절단)로 전환시킨다. Cas9가 닉카아제가 되게 하는 돌연변이의 다른 예는 제한 없이, H840A, N854A 및 N863A를 포함한다. 추가의 예로서, Cas9의 2개 이상의 촉매 도메인(RuvC I, RuvC II 및 RuvC III 또는 HNH 도메인)을 돌연변이시켜, 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 돌연변이된 Cas9를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, D10A 돌연변이를 H840A, N854A 또는 N863A 돌연변이 중 하나 이상과 조합하여, 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 Cas9 효소를 생성한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 비-돌연변이 형태의 효소의 DNA 절단 활성의 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 이하인 경우 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 것으로 여겨지며; 예는 돌연변이된 형태의 DNA 절단 활성이 0이거나, 비-돌연변이 형태에 비하여 무시해도 될 정도인 경우일 수 있다. 효소가 SpCas9가 아닌 경우, 돌연변이는 SpCas9의 위치 10, 762, 840, 854, 863 및/또는 986에 상응하는 임의의 또는 모든 잔기에서 이루어질 수 있다(이것은 예를 들어 표준 서열 비교 도구에 의해서 확인될 수 있다). 특히, 다음의 돌연변이 중 일부 또는 전부가 SpCas9에서 바람직하며: SpCas9에 관하여 D10A, E762A, H840A, N854A, N863A 및/또는 D986A; 및 다른 오솔로그에서의 유사한 또는 동일한 돌연변이, 예를 들어, SaCas9에서의 N580A; 대체 아미노산 중 임의의 것에 대한 보존적 치환도 예상된다. 다른 Cas9의 상응하는 위치에서의 동일한 돌연변이 (또는 이들 돌연변이의 보존적 치환)도 바람직하다. D10 및 H840이 SpCas9에서 특히 바람직하다. 그러나, 다른 Cas9에서도 SpCas9 D10 및 H840에 상응하는 잔기가 또한 바람직하다. SpCas9의 오솔로그가 본 발명의 실시에서 사용될 수 있다. Cas 효소는 이것이 II형 CRISPR 시스템으로부터의 다중의 뉴클레아제 도메인을 가진 가장 큰 뉴클레아제에 대한 상동성을 공유하는 일반적인 효소 부류를 말할 수 있음에 따라, 확인된 Cas9일 수 있다. 가장 바람직하게, Cas9 효소는 spCas9(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 또는 saCas9(스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) Cas9)로부터의 것이거나, 또는 그로부터 유래된다. "StCas9"는 스트렙토코커스 써모필러스로부터의 야생형 Cas9를 말하며, 이것의 단백질 서열은 수탁 번호 G3ECR1로서 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에 제공된다. 유사하게, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 또는 spCas9도 수탁 번호 Q99ZW2로서 스위스프로트에 포함된다. 본 출원인에 의하면, 유래된다는 것은 그 유래된 효소가 야생형 효소와 높은 정도의 서열 상동성을 가진다는 의미에 상당히 기초하지만, 그것이 본원에 기재된 바와 같이 몇몇 방식으로 돌연변이(변형)되었다는 것을 의미한다. 명백히 다르지 않다면, 용어 Cas 및 CRISPR 효소가 본원에 일반적으로 상호교환 가능하게 사용된다는 것이 인식될 것이다. 상기 언급된 대로, 본원에 사용된 잔기 넘버링의 다수는 스트렙토코커스 피오게네스에서 II형 CRISPR 유전자좌로부터의 Cas9 효소를 말한다. 그러나 본 발명은 SpCas9, SaCa9, St1Cas9 등과 같은 다른 미생물 종들로부터의 더 많은 Cas9를 포함한다는 것이 인식될 것이다. 스트렙토코커스 피오게네스로부터 유래된 Cas9 또는 임의의 밀접하게 관련된 Cas9에 의한 효소 작용은 표적 부위 서열에 이중 가닥 파단을 생성하며, 표적 부위 서열은 가이드 서열의 20개 뉴클레오티드와 혼성화하고, 표적 서열의 20개 뉴클레오티드 뒤에 프로토스페이서-인접 모티프(PAM) 서열(예는 NGG/NRG 또는 본원에 기재된 바와 같이 결정될 수 있는 PAM을 포함함)을 가진다. 위치-특이적 DNA 인식 및 절단에 대한 Cas9를 통한 CRISPR 활성은 가이드 서열, 가이드 서열과 부분적으로 혼성화하는 tracr 서열 및 PAM 서열에 의해서 한정된다. CRISPR 시스템의 더 많은 양태는 문헌[Karginov and Hannon, The CRISPR system: small RNA-guided defence in bacteria and archaea, Mole Cell 2010, January 15; 37(1): 7]에 기재되어 있다. 스트렙토코커스 피오게네스 SF370으로부터의 II형 CRISPR 유전자좌는 4개 유전자 Cas9, Cas1, Cas2 및 Csn1의 클러스터뿐만 아니라 2개의 비-코딩 RNA 요소, tracr RNA 및 비-반복 서열의 짧은 스트레치(스페이서, 각각 약 30bp)가 개재된 반복 서열(직접 반복부)의 특징적인 어레이를 함유한다. 이 시스템에서, 표적화된 DNA 이중-가닥 파단(DSB)이 순차적 4단계에서 생성된다. 먼저, 2개의 비-코딩 RNA, 예비-crRNA 어레이 및 tracr RNA가 CRISPR 유전자좌로부터 전사된다. 두 번째로, tracrRNA가 예비-crRNA의 직접 반복부와 혼성화하고, 이것은 이어서 개별 스페이서 서열을 함유하는 성숙 crRNA로 가공된다. 세 번째로, 성숙 crRNA:tracrRNA 복합체는 crRNA의 스페이서 영역과 프로토스페이서 DNA 간의 헤테로듀플렉스 형성을 통해 프로토스페이서와 상응하는 PAM으로 구성된 DNA 표적으로 Cas9를 지향시킨다. 마지막으로, Cas9는 PAM의 상류 표적 DNA의 절단을 매개하여 프로토스페이서 내에 DSB를 생성한다. 2개의 직접 반복부(DR)가 측부 배치된 단일 스페이서로 구성된 예비-crRNA 어레이도 용어 "tracr-메이트 서열"에 의해서 포함된다. 특정 구현예에서, Cas9는 구성적으로 존재하거나 유도 가능하게 존재하거나, 조건부로 존재하거나 투여되거나 전달될 수 있다. Cas9 최적화를 사용하여 기능을 증진시키거나 신규한 기능을 발생시킬 수 있으며, 키메라 Cas9 단백질을 생성할 수 있다. 그리고 Cas9는 총칭적인 DNA 결합 단백질로 사용될 수 있다.
일 양태에서, CRISPR 효소는 SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 H840A, 또는 D10A 및 H840A, 또는 D10A 및 N863A를 포함한다. Sa에서의 N580은 Sp Cas9에서의 N863에 상응한다. 따라서, 일 양태에서, CRISPR 효소는 SaCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 N580A; 또는 SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그에 따른 D10A 및 SaCas9 단백질에 따른 N580A를 포함한다.
통상적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고, 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화되는 가이드 서열을 포함)의 형성은 표적 서열 내의 또는 그 근처의(예를 들어, 그로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 내의) 하나 또는 두 가닥 모두의 절단을 야기한다. 이론에 구속되지 않으면서, 야생형 tracr 서열의 전부 또는 그의 일부(예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 그로 이루어질 수 있는 tracr 서열은 또한, 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전부 또는 일부로의 tracr 서열의 적어도 일부분에 따른 혼성화에 의해서와 같이 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다.
코돈 최적화된 서열의 예는, 이러한 예에서, 진핵생물, 예를 들어, 인간(즉, 인간에서의 발현을 위해 최적화됨) 또는 본원에 논의된 바와 같은 다른 진핵생물, 동물 또는 포유류에서의 발현을 위해 최적화된 서열이며; 예를 들어, WO 2014/093622호(PCT/US2013/074667호)에서의 SaCas9 인간 코돈 최적화 서열을 참조한다. 이것이 바람직하지만, 다른 예들도 가능하며, 인간 이외의 숙주 종에 대한 코돈 최적화 또는 특정 기관에 대한 코돈 최적화가 공지되어 있다는 것이 인식될 것이다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열이 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현에 대해 코돈 최적화된다. 진핵 세포는, 특정 유기체, 예를 들어, 제한은 아니지만, 인간 또는 본원에 논의된 바와 같은 비-인간 진핵생물 또는 동물 또는 포유류, 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 가축 또는 비인간 포유류 또는 영장류를 포함하는 포유류의 것들이거나 또는 그로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 인간이나 동물에 임의의 실질적인 의학적 이익 없이 그들을 고통스럽게 할 수 있는 인간의 생식계열 유전자 아이덴티티를 변형하기 위한 과정 및/또는 동물의 유전자 아이덴티티를 변형하기 위한 과정과 또한 이러한 과정으로부터 생긴 동물이 배제될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 고유 아미노산 서열을 유지하면서, 고유 서열의 적어도 하나의 코돈(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 코돈)을 숙주 세포의 유전자에 더욱 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체함으로써, 관심 숙주 세포에서의 발현의 증진을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대하여 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간의 코돈 사용의 차이)은 종종 전령 RNA(mRNA)의 번역의 효율과 상호관련되며, 이는 차례로, 다른 것들 중에, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 운반 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 좌우되는 것으로 여겨진다. 세포에서의 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영하는 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화에 기초하여 주어진 유기체에서의 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 코돈 사용 표는 예를 들어, "코돈 사용 데이터베이스"(www.kazusa.orjp/codon/에서 이용 가능함)에서 용이하게 이용 가능하며, 이들 표는 다수의 방식으로 적합하게 될 수 있다. 문헌[Nakamura, Y., et al. "Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000" Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]을 참조한다. 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 코돈 최적화시키는 컴퓨터 알고리즘도 또한 이용 가능하며, 예를 들어, 진 포르지(Gene Forge)(압타젠(Aptagen); 미국 펜실베니아주 야코부스)도 또한 이용 가능하다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 내의 하나 이상의 코돈(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50개 이상의 또는 모든 코돈)은 특정 아미노산에 대하여 가장 빈번하게 사용되는 코돈에 상응한다.
일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 핵 국소화 서열(NLS), 예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 NLS를 포함하는 CRISPR 효소를 인코딩한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소는 아미노-말단에 또는 그 근처에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 NLS, 카르복시-말단에 또는 그 근처에 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 NLS, 또는 이들의 조합(예를 들어, 아미노 말단에 0개 또는 적어도 하나 이상의 NLS 및 카르복시 말단에 0개 또는 하나 이상의 NLS)을 포함한다. 1개 초과의 NLS가 존재하는 경우, 각각은 단일의 NLS가 1개 초과의 카피로 존재하고/존재하거나 1개 이상의 카피로 존재하는 하나 이상의 다른 NLS와 병용될 수 있도록 다른 것들로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, CRISPR 효소는 최대 6개의 NLS를 포함한다. 일부 구현예에서, NLS는 NLS의 가장 가까운 아미노산이 N- 또는 C-말단으로부터 폴리펩티드 쇄를 따라 약 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50개 이상의 아미노산 내에 존재하는 경우 N- 또는 C-말단 근처에 있는 것으로 여겨진다. NLS의 비제한적인 예는 하기로부터 유래된 NLS 서열을 포함한다: 아미노산 서열 PKKKRKV를 갖는 SV40 바이러스 대형 T-항원의 NLS; 뉴클레오플라스민으로부터의 NLS(예를 들어, 서열 KRPAATKKAGQAKKKK를 갖는 뉴클레오플라스민 이분(bipartite) NLS); 아미노산 서열 PAAKRVKLD 또는 RQRRNELKRSP를 갖는 c-myc NLS; 서열 NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY를 갖는 hRNPA1 M9 NLS; 임포틴-알파로부터의 IBB 도메인의 서열 RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV; 마이오마(myoma) T 단백질의 서열 VSRKRPRP 및 PPKKARED; 인간 p53의 서열 POPKKKPL; 마우스 c-abl IV의 서열 SALIKKKKKMAP; 인플루엔자 바이러스 NS1의 서열 DRLRR 및 PKQKKRK; 간염 바이러스 델타 항원의 서열 RKLKKKIKKL; 마우스 Mx1 단백질의 서열 REKKKFLKRR; 인간 폴리(ADP-리보스) 중합효소의 서열 KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK; 및 스테로이드 호르몬 수용체(인간) 글루코코르티코이드의 서열 RKCLQAGMNLEARKTKK. 일반적으로, 하나 이상의 NLS는 진핵 세포의 핵에서 검출 가능한 양의 CRISPR 효소의 축적을 유도하기에 충분한 세기의 것이다. 일반적으로, 핵 국소화 활성의 세기는 CRISPR 효소 내의 NLS의 수, 사용되는 특정 NLS(들) 또는 이들 인자의 조합으로부터 유래할 수 있다. 핵에서의 축적의 검출은 임의의 적절한 기술에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 검출 가능한 마커는 예를 들어, 핵의 위치를 검출하기 위한 수단(예를 들어, 핵에 특이적인 염색제, 예를 들어, DAPI)과 함께 세포 내의 위치가 가시화될 수 있도록 CRISPR 효소에 융합될 수 있다. 또한, 세포 핵을 세포로부터 분리할 수 있으며, 그 다음, 그의 내용물을 단백질을 검출하기 위한 임의의 적절한 과정, 예를 들어, 면역조직화학, 웨스턴 블롯 또는 효소 활성 검정에 의해 분석할 수 있다. 또한, 핵에서의 축적은 예를 들어, CRISPR 효소 또는 복합체에 노출되지 않거나, 하나 이상의 NLS가 결여된 CRISPR 효소에 노출된 대조군과 비교하여, 간접적으로, 예를 들어, CRISPR 복합체 형성의 영향에 대한 검정(예를 들어, 표적 서열에서의 DNA 절단 또는 돌연변이에 대한 검정, 또는 CRISPR 복합체 형성 및/또는 CRISPR 효소 활성에 의해 영향을 받는 변경된 유전자 발현 활성에 대한 검정)에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 양태는 감소되는 유전자 산물의 발현 또는 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 분자 내로 추가로 도입되는 주형 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 5' 오버행이 재어닐링 및 라이게이션되게 함으로써 정밀하게 절단되는 개재 서열 또는 변경되는 유전자 산물의 활성 또는 작용 또는 증가되는 유전자 산물의 발현에 관한 것이다. 본 발명의 구현예에서, 유전자 산물은 단백질이다. 가이드 서열 사이에 8 bp 미만의 중첩(-8 bp 초과의 상쇄)을 갖는 5' 오버행을 생성하는 sgRNA 쌍만이 검출 가능한 삽입결실 형성을 매개할 수 있었다. 중요하게는, 이들 검정에서 사용되는 각각의 가이드는 야생형 Cas9와 쌍을 형성하는 경우 삽입결실을 효율적으로 유발할 수 있는데, 이는 가이드 쌍의 상대적 위치가 이중 닉킹 활성을 예측함에 있어 가장 중요한 파라미터임을 나타낸다. Cas9n 및 Cas9H840A가 DNA의 반대 가닥을 닉킹시키기 때문에, 주어진 sgRNA 쌍을 지니는 Cas9H840A로의 Cas9n의 치환은 오버행 유형의 역전을 초래할 것이나; 삽입결실 형성이 Cas9H840A를 사용하여 관찰되지 않으며, 이는 Cas9H840A가 모든 DNA 절단 활성이 실질적으로 결여된 CRISPR 효소임을 나타낸다(이는 돌연변이된 효소의 DNA 절단 활성이 효소의 비-돌연변이 형태의 DNA 절단 활성의 약 25%, 10%, 5%, 1%, 0.1%, 0.01% 이하인 경우이며; 그에 의해, 예는 돌연변이된 형태의 DNA 절단 활성이 0이거나 비-돌연변이된 형태와 비교하여 무시해도 될 정도인 경우, 예를 들어, 삽입결실 형성이 생화학적 또는 원핵 시스템과 대조적으로 진핵 시스템에서 Cas9H840A를 사용하여 관찰되지 않는 경우일 수 있음). 그럼에도 불구하고, Cas9n을 사용하여 5' 오버행을 생성할 sgRNA의 쌍은 대신에 원칙적으로 상응하는 3' 오버행 및 이중 닉킹을 생성하여야 한다. 따라서, Cas9n를 사용하여 3' 오버행의 생성을 야기하는 sgRNA 쌍은 다른 돌연변이된 Cas9와 함께 사용되어 5' 오버행 및 이중 닉킹을 생성할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 재조합 주형도 또한 제공된다. 재조합 주형은 개별 벡터에 포함되거나, 개별 폴리뉴클레오티드로서 제공되는 본원에 기술된 바와 같은 다른 벡터의 성분일 수 있다. 일부 구현예에서, 재조합 주형은 상동성 재조합에서, 예를 들어, CRISPR 복합체의 일부로서 CRISPR 효소에 의해 닉이 생기거나 절단되는 표적 서열 내 또는 그 근처에서 주형으로 소용되도록 설계된다. 주형 폴리뉴클레오티드는 임의의 적절한 길이, 예를 들어, 약 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000개 이상의 뉴클레오티드 길이의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드의 부분에 상보적이다. 최적으로 정렬되는 경우, 주형 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 하나 이상의 뉴클레오티드(예를 들어, 약 1, 5, 10, 15, 20개 이상의 뉴클레오티드)와 중첩할 수 있다. 일부 구현예에서, 주형 서열 및 표적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드가 최적으로 정렬되는 경우, 주형 폴리뉴클레오티드의 가장 가까운 뉴클레오티드는 표적 서열로부터 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000개 이상의 뉴클레오티드 이내이다.
일부 구현예에서, CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터는 CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 유도하도록 숙주 세포 내로 도입된다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 개별 벡터 상의 개별 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 또는, CRISPR 시스템의 RNA(들)는 트랜스제닉 Cas9 동물 또는 포유류, 예를 들어, 구성적으로 또는 유도에 의해 또는 조건부로 Cas9를 발현하는 동물 또는 포유류; 또는 예를 들어, Cas9를 코딩하고, 생체내에서 Cas9를 발현하는 벡터 또는 벡터들의 동물 또는 포유류로의 이전의 투여의 방식에 의해 Cas9를 함유하는 숙주 세포를 갖거나 다르게 Cas9를 발현하는 동물 또는 포유류로 전달될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현되는 요소 중 둘 이상은 단일의 벡터에서 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가의 벡터는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분을 제공한다. 단일의 벡터에서 조합되는 CRISPR 시스템 요소는 임의의 적절한 방향으로 배열될 수 있으며, 예를 들어, 하나의 요소는 제2 요소에 대하여 5'에(그의 "상류"에) 위치하거나 그에 대하여 3'에(그의 "하류"에) 위치한다. 하나의 요소의 코딩 서열은 제2 요소의 코딩 서열의 동일한 가닥 또는 마주하는 가닥에 위치할 수 있으며, 동일한 또는 반대 방향으로 배향될 수 있다. 일부 구현예에서, 단일의 프로모터는 CRISPR 효소를 인코딩하는 전사물 및 하나 이상의 인트론 서열 내에(예를 들어, 각각이 상이한 인트론 내에, 2개 이상이 적어도 하나의 인트론 내에 또는 전부가 단일의 인트론 내에) 매립된 가이드 서열, tracr 메이트 서열(임의로 가이드 서열에 작동 가능하게 연결), 및 tracr 서열 중 하나 이상의 발현을 유도한다. 일부 구현예에서, CRISPR 효소, 가이드 서열, tracr 메이트 서열 및 tracr 서열이 동일한 프로모터에 작동 가능하게 연결되고, 그로부터 발현된다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 위한 전달 비히클, 벡터, 입자, 나노입자, 제형 및 그의 성분은 전술한 문헌, 예를 들어, WO 2014/093622호(PCT/US2013/074667호)에 사용된 바와 같다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 삽입 부위, 예를 들어, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열("클로닝 부위"로도 지칭)을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위(예를 들어, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 삽입 부위)는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 상류 및/또는 하류에 위치한다. 일부 구현예에서, 벡터는 tracr 메이트 서열의 상류에 있고, 임의로 tracr 메이트 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소의 하류에 있는 삽입 부위를 포함하여, 삽입 부위로의 가이드 서열의 삽입 후에, 그리고 발현 시에, 가이드 서열이 진핵 세포 내의 표적 서열로의 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 유도하게 한다. 일부 구현예에서, 벡터는 2개 이상의 삽입 부위를 포함하며, 각각의 삽입 부위는 2개의 tracr 메이트 서열 사이에 위치하여, 각 부위에서 가이드 서열의 삽입을 가능하게 한다. 이러한 배열에서, 2개 이상의 가이드 서열은 단일의 가이드 서열의 2개 이상의 카피, 2개 이상의 상이한 가이드 서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 다중의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일의 발현 작제물을 사용하여 세포 내의 다중의 상이한 상응하는 표적 서열에 CRISPR 활성을 표적화할 수 있다. 예를 들어, 단일의 벡터는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20개 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 이러한 가이드-서열-함유 벡터가 제공될 수 있으며, 임의로 세포로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 CRISPR 효소, 예를 들어, Cas 단백질을 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결되는 조절 요소를 포함한다. CRISPR 효소 또는 CRISPR 효소 mRNA 또는 CRISPR 가이드 RNA 또는 RNA(들)는 개별적으로 전달될 수 있으며; 유리하게는 이들 중 적어도 하나는 나노입자 복합체를 통해 전달된다. CRISPR 효소 mRNA는 가이드 RNA 이전에 전달되어 CRISPR 효소가 발현될 시간을 제공할 수 있다. CRISPR 효소 mRNA는 가이드 RNA의 투여 전 1 내지 12시간(바람직하게는 약 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. 대안적으로, CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA는 함께 투여될 수 있다. 유리하게는, 가이드 RNA의 제2 부스터 용량은 CRISPR 효소 mRNA + 가이드 RNA의 초기 투여 후 1 내지 12시간(바람직하게는 약 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. CRISPR 효소 mRNA 및/또는 가이드 RNA의 추가 투여는 가장 효율적인 게놈 변형 수준을 달성하는데 유용할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 이용 방법을 제공한다. 본 발명의 CRISPR 복합체는 효율적인 표적 폴리뉴클레오티드의 변형 수단을 제공한다. 본 발명의 CRISPR 복합체는 다수의 세포 유형에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는(예를 들어, 결실시키는, 삽입하는, 전위시키는, 불활성화시키는, 활성화시키는) 것을 포함하는 매우 다양한 유용성을 갖는다. 이와 같이, 본 발명의 CRISPR 복합체는 예를 들어, 유전자 치료법, 약물 스크리닝, 질병 진단 및 예후에서 넓은 스펙트럼의 응용을 갖는다. 예시적인 CRISPR 복합체는 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열에 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화되는 CRISPR 효소를 포함한다. 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되며, tracr 메이트 서열은 차례로 tracr 서열에 혼성화된다. 일 구현예에서, 본 발명은 표적 폴리뉴클레오티드를 절단하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 표적 폴리뉴클레오티드와 결합하여 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 행하는 CRISPR 복합체를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 것을 포함한다. 전형적으로, 본 발명의 CRISPR 복합체는 세포 내로 도입되는 경우 게놈 서열에 파단(예를 들어, 단일 가닥 또는 이중 가닥 파단)을 생성한다. 예를 들어, 상기 방법은 세포에서 질병 유전자를 절단하기 위하여 사용될 수 있다. CRISPR 복합체에 의해서 생성된 파단은 오류 유발 비-상동성 말단 연결(NHEJ) 경로 또는 고 충실도 상동성-유도 수복(HDR)과 같은 수복 과정에 의해서 수복될 수 있다. 이들 수복 과정 동안, 외인성 폴리뉴클레오티드 주형이 게놈 서열에 도입될 수 있다. 일부 방법에서, HDR 과정은 게놈 서열을 변형하기 위해서 사용된다. 예를 들어, 상류 서열과 하류 서열이 측부 배치된 통합될 서열을 포함하는 외인성 폴리뉴클레오티드 주형이 세포에 도입된다. 상류 서열과 하류 서열은 염색체 내의 통합 부위의 어느 측과 서열 유사성을 공유한다. 요망되는 경우, 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA, 예를 들어 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 바이러스 벡터, DNA의 선형 조각, PCR 단편, 네이키드 핵산, 또는 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합체화된 핵산일 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드 주형은 통합될 서열을 포함한다(예를 들어, 돌연변이된 유전자). 통합을 위한 서열은 세포에 대해 내인성 또는 외인성인 서열일 수 있다. 통합될 서열의 예들은 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 비-코딩 RNA(예를 들어, 마이크로RNA)를 포함한다. 따라서, 통합을 위한 서열은 적절한 조절 서열 또는 서열들에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 통합될 서열은 조절 기능을 제공할 수 있다. 외인성 폴리뉴클레오티드 주형에서 상류 및 하류 서열은 관심 염색체 서열과 공여자 폴리뉴클레오티드 사이의 재조합을 촉진하도록 선택된다. 상류 서열은 통합을 위해 표적화된 부위의 상류 게놈 서열과 서열 유사성을 공유하는 핵산 서열이다. 유사하게, 하류 서열은 통합의 표적화된 부위의 하류 염색체 서열과 서열 유사성을 공유하는 핵산 서열이다. 외인성 폴리뉴클레오티드 주형의 상류 및 하류 서열은 표적화된 게놈 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 가질 수 있다. 바람직하게, 외인성 폴리뉴클레오티드 주형의 상류 및 하류 서열은 표적화된 게놈 서열과 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 일부 방법에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 주형의 상류 및 하류 서열은 표적화된 게놈 서열과 약 99% 또는 100% 서열 동일성을 가진다. 상류 또는 하류 서열은 약 20bp 내지 약 2500bp, 예를 들어, 약 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 또는 2500 bp를 포함할 수 있다. 일부 방법에서, 예시적인 상류 또는 하류 서열은 약 200 bp 내지 약 2000 bp, 약 600 bp 내지 약 1000 bp, 또는 더 구체적으로 약 700 bp 내지 약 1000 bp를 가진다. 일부 방법에서, 외인성 폴리뉴클레오티드 주형은 마커를 더 포함할 수 있다. 이러한 마커는 표적화된 통합의 스크리닝을 용이하게 할 수 있다. 적합한 마커의 예들은 제한 부위, 형광 단백질, 또는 선택성 마커를 포함한다. 본 발명의 외인성 폴리뉴클레오티드 주형은 재조합 기술을 사용하여 작제될 수 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 2001] 및 문헌[Ausubel et al., 1996] 참조). 외인성 폴리뉴클레오티드 주형을 통합함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법에서, 이중 가닥 파단이 CRISPR 복합체에 의해서 게놈 서열에 도입되며, 이 파단은 주형이 게놈에 통합되도록 외인성 폴리뉴클레오티드 주형의 상동성 재조합을 통해서 수복된다. 이중-가닥 파단의 존재는 주형의 통합을 촉진한다. 다른 구현예에서, 본 발명은 진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리뉴클레오티드에 결합하는 CRISPR 복합체를 사용하여 표적 폴리뉴클레오티드의 발현을 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함한다. 일부 방법에서, 표적 폴리뉴클레오티드는 세포에서 발현의 변형을 행하기 위해 불활성화될 수 있다. 예를 들어, 세포에서 CRISPR 복합체와 표적 서열의 결합시, 표적 폴리뉴클레오티드가 불활성화되며, 이로써 서열이 전사되지 않거나, 코딩된 단백질이 생성되지 않거나, 또는 서열이 야생형 서열처럼 기능하지 않는다. 예를 들어, 단백질 또는 마이크로RNA 코딩 서열은 단백질 또는 마이크로RNA 또는 예비-마이크로RNA 전사물이 생성되지 않도록 불활성화될 수 있다. 일부 방법에서, 조절 서열이 더 이상 조절 서열로서 기능하지 않도록 불활성화될 수 있다. 본원에서 사용된 "조절 서열"은 전사, 번역 또는 핵산 서열의 접근성을 가져오는 임의의 핵산 서열을 말한다. 조절 서열의 예들은 프로모터, 전사 종결자, 및 인핸서를 포함하며 이들이 조절 서열이다. CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에 내인성이거나 외인성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크(junk) DNA)일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 신호전달 생화학 경로와 관련된 서열, 예를 들어, 신호전달 생화학적 경로-관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오티드의 예는 질병 관련 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. "질병-관련" 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 질병이 없는 대조군의 조직 또는 세포와 비교하여, 질병-발생 조직으로부터 유래된 세포에서 비정상적인 수준 또는 비정상적인 형태로 전사 또는 번역 산물을 생성하는 임의의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 그것은 비정상적으로 높은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있으며; 그것은 비정상적으로 낮은 수준으로 발현되는 유전자일 수 있고, 여기서 변경된 발현은 질병의 발생 및/또는 진행과 관련이 있다. 또한, 질병-관련 유전자는 질병의 병인에 직접적인 원인이 있거나, 그에 원인이 있는 유전자(들)와 연관 불균형이 있는 돌연변이(들) 또는 유전적 변이를 갖는 유전자를 지칭한다. 전사 또는 번역된 산물은 공지된 것이거나 미공지된 것일 수 있으며, 정상 또는 비정상 수준으로 존재할 수 있다. CRISPR 복합체의 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포에 대해 내인성이거나 외인성인 임의의 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오티드는 진핵 세포의 핵에 존재하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 표적 폴리뉴클레오티드는 유전자 산물(예를 들어, 단백질)을 코딩하는 서열 또는 비-코딩 서열(예를 들어, 조절 폴리뉴클레오티드 또는 정크 DNA)일 수 있다. 이론에 구속되지 않으면서, 표적 서열이 PAM(프로토스페이서 인접 모티프); 즉, CRISPR 복합체에 의해 인식되는 짧은 서열과 회합될 것으로 여겨진다. PAM에 대한 정밀한 서열 및 길이 요건은 사용되는 CRISPR 효소에 따라 달라지지만, PAM은 통상적으로 프로토스페이서(즉, 표적 서열)에 인접한 2 내지 5개 염기쌍 서열이다. PAM 서열의 예는 하기 실시예 섹션에 제공되어 있으며, 해당 분야의 숙련자는 주어진 CRISPR 효소와 함께 사용하기 위한 추가의 PAM 서열을 확인할 수 있을 것이다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되게 하여, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 초래하여, 그에 의해 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 단계를 포함하며, CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열과 혼성화된 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되고, 이어서 tracr 서열에 혼성화된다. 일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서의 폴리뉴클레오티드의 발현의 변형 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합되게 하여, 상기 결합이 상기 폴리뉴클레오티드의 증가된 또는 감소된 발현을 초래하게 하는 단계를 포함하며; 여기서 CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열과 혼성화되는 가이드 서열과 복합체화되는 CRISPR 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열과 연결되고, tracr 메이트 서열은 이어서 tracr 서열에 혼성화된다. 유사한 고려사항 및 조건이 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법을 위해 상기 설명된 것과 같이 적용된다. 사실상, 이들 시료추출, 배양 및 재도입 선택사항은 본 발명의 전 양태에 적용된다. 일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법을 제공하며, 이것은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 인간 또는 비인간 동물로부터 세포 또는 세포 집단을 시료추출하는 단계, 및 세포 또는 세포들을 변형하는 단계를 포함한다. 배양은 생체외에서 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 세포 또는 세포들은 심지어 비인간 동물 또는 식물에 재도입될 수 있다. 재도입된 세포의 경우, 세포가 줄기 세포인 것이 특히 바람직하다.
실제로, 본 발명의 임의의 양태에서, CRISPR 복합체는 표적 서열과 혼성화된 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결될 수 있으며, tracr 메이트 서열은 이어서 tracr 서열에 혼성화될 수 있다.
본 발명은 CRISPR-Cas 시스템 및 그의 성분에 관한 서열 표적화를 수반하는 유전자 발현의 조절, 예컨대 게놈 변동 또는 유전자 편집을 위해 사용되는 시스템, 방법 및 조성물의 조작 및 최적화에 관한 것이다. 유리한 구현예에서, Cas 효소는 Cas9이다. 본 방법의 이점은 CRISPR 시스템이 표적외 결합 및 그 결과의 부작용을 최소화시키거나 회피한다는 점이다. 이는 표적 DNA에 대하여 고도의 서열 특이성을 갖도록 배열된 시스템을 사용하여 달성된다.
일반적인 전달
바이러스 전달, 예를 들어, 플라스미드, 바이러스 전달: CRISPR 효소, 예를 들어 Cas9, 및/또는 임의의 본 발명의 RNA, 예를 들어 가이드 RNA는 임의의 적합한 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 예를 들어, 아데노 연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 바이러스 벡터 유형, 또는 그들의 조합을 사용하여 전달될 수 있다. Cas9 및 하나 이상의 가이드 RNA는 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 내로 패키징될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터, 예를 들어, 플라스미드 또는 바이러스 벡터는, 예를 들어 근육내 주사에 의해 관심 조직에 전달되는 한편, 다른 때에, 전달은 정맥내, 경피, 비강내, 구강, 점막 또는 다른 전달 방법을 통한다. 그러한 전달은 단일 용량 또는 다회 용량을 통한 것일 수 있다. 해당 분야의 숙련자는 본원에서 전달될 실제 투여량이 다양한 인자, 예컨대 벡터 선택, 표적 세포, 유기체 또는 조직, 치료될 대상체의 일반적 질환, 추구되는 형질전환/변형 정도, 투여 경로, 투여 방식, 추구되는 형질전환/변형 유형 등에 따라서 크게 달라질 수 있다는 것을 이해한다.
그러한 투여량은, 예를 들어 담체(물, 식염수, 에탄올, 글리세롤, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참깨유 등), 희석제, 약제학적으로 허용 가능한 담체(예를 들어, 인산염 완충 식염수), 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 및/또는 해당 분야에 공지된 다른 화합물을 추가로 함유할 수 있다. 투여량은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염, 예를 들어 무기산 염, 예컨대 염산염, 브롬화수소산염, 인산염, 황산염 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세트산염, 프로피온산염, 말론산염, 벤조산염 등을 추가로 함유할 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질, 겔 또는 겔화 물질, 향미제, 착색제, 미소구체, 중합체, 현탁제 등은 또한 본원에 존재할 수 있다. 추가로, 특히 투여형이 재구성 가능한 형태라면 하나 이상의 다른 통상적인 약제학적 성분, 예컨대 보존제, 습윤제, 현탁화제, 계면활성제, 항산화제, 고화방지제, 충전제, 킬레이트제, 코팅제, 화학적 안정화제 등이 또한 존재할 수 있다. 적합한 예시적 성분은 미정질 셀룰로스, 카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리소르베이트 80, 페닐에틸 알코올, 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 갈산프로필, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀, 파라클로로페놀, 젤라틴, 알부민 및 그들의 조합을 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 부형제의 철저한 논의는 본원에 참고로 포함되는 문헌[REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용 가능하다.
본원의 구현예에서, 전달은 적어도 1 × 105개 입자(또한 단위 입자로서 pu로 지칭됨)의 아데노바이러스 벡터를 함유하는 단일 부스터 용량에 있을 수 있는 아데노바이러스를 통한다. 본원의 구현예에서, 용량은 바람직하게는 적어도 약 1 × 106개 입자(예를 들어, 약 1 × 106 내지 1 × 1012개 입자), 더 바람직하게는 적어도 약 1 × 107개 입자, 더 바람직하게는 적어도 약 1 × 108개 입자(예를 들어, 약 1 × 108 내지 1 × 1011개 입자 또는 약 1 × 108 내지 1 × 1012개 입자), 및 가장 바람직하게는 적어도 약 1 × 100개 입자(예를 들어, 약 1 × 109 내지 1 × 1010개 입자 또는 약 1 × 109 내지 1 × 1012개 입자), 또는 심지어 적어도 약 1 × 1010개 입자(예를 들어, 약 1 × 1010 내지 1 × 1012개 입자)의 아데노바이러스 벡터이다. 대안적으로, 용량은 1 × 1014개 이하의 입자, 바람직하게는 약 1 × 1013개 이하의 입자, 더더욱 바람직하게는 약 1 × 1012개 이하의 입자, 더더욱 바람직하게는 약 1 × 1011개 이하의 입자, 가장 바람직하게는 약 1 × 1010개 이하의 입자(예를 들어, 약 1 × 109개 이하의 입자)를 포함한다. 따라서, 용량은, 예를 들어 약 1 × 106개 입자 단위(pu), 약 2 × 106 pu, 약 4 × 106 pu, 약 1 × 107 pu, 약 2 × 107 pu, 약 4 × 107 pu, 약 1 × 108 pu, 약 2 × 108 pu, 약 4 × 108 pu, 약 1 × 109 pu, 약 2 × 109 pu, 약 4 × 109 pu, 약 1 × 1010 pu, 약 2 × 1010 pu, 약 4 × 1010 pu, 약 1 × 1011 pu, 약 2 × 1011 pu, 약 4 × 1011 pu, 약 1 × 1012 pu, 약 2 × 1012 pu, 또는 약 4 × 1012 pu의 아데노바이러스 벡터를 갖는 단일 용량의 아데노바이러스 벡터를 함유할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 2013년 6월 4일 등록된 Nabel 등의 미국 특허 제8,454,972 B2호에서의 아데노바이러스 벡터, 및 이의 29 칼럼, 36 내지 58줄에서의 투여량을 참조한다. 본원의 구현예에서, 아데노바이러스는 다회 용량을 통해 전달된다.
본원의 구현예에서, 전달은 AAV를 통한다. 인간에 대한 AAV의 생체내 전달을 위한 치료적 유효량은 약 1 × 1010 내지 약 1 × 1010개의 작용성 AAV/㎖(용액)을 함유하는 약 20 내지 약 50 ㎖의 범위의 식염수 용액인 것으로 여겨진다. 투여량은 임의의 부작용에 대해 치료적 이점의 균형을 맞추도록 조절될 수 있다. 본원의 구현예에서, AAV 용량은 일반적으로 약 1 × 105 내지 1 × 1050개 게놈 AAV, 약 1 × 108개 내지 1 × 1020개 게놈 AAV, 약 1 × 1010 내지 약 1 × 1016개 게놈, 또는 약 1 × 1011 내지 약 1 × 1016개 게놈 AAV의 농도 범위이다. 인간 투여량은 약 1 × 1013개 게놈 AAV일 수 있다. 이러한 농도는 약 0.001 ㎖ 내지 약 100 ㎖, 약 0.05 내지 약 50 ㎖, 또는 약 10 내지 약 25 ㎖의 담체 용액에서 전달될 수 있다. 다른 유효한 투여량은 용량 반응 곡선을 확립하는 일상적 시도를 통해 해당 분야의 숙련자에 의해 용이하게 확립될 수 있다. 예를 들어, 2013년 3월 26일 등록된 Hajjar 등의 미국 특허 제8,404,658 B2호, 27 칼럼 45 내지 60줄을 참조한다.
본원의 구현예에서, 전달은 플라스미드를 통한다. 이러한 플라스미드 조성물에서, 투여량은 반응을 유발하는데 충분한 양의 플라스미드여야한다. 예를 들어, 플라스미드 조성물 중의 플라스미드 DNA의 적합한 양은 70 ㎏의 개체당 약 0.1 내지 약 2 ㎎, 또는 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍일 수 있다. 본 발명의 플라스미드는 일반적으로 (i) 프로모터; (ii) 상기 프로모터에 작동 가능하게 연결된 CRISPR 효소를 인코딩하는 서열; (iii) 선택 가능 마커 (iv) 복제 원점; 및 (v) (ii)에 작동 가능하게 연결되는 (ii)의 하류 전사 종결자를 포함할 것이다. 플라스미드는 또한 CRISPR 복합체의 RNA 성분을 인코딩할 수 있지만, 대신에 이들 중 하나 이상은 상이한 벡터상에서 인코딩될 수 있다.
본원의 용량은 평균 70 ㎏ 개체를 기준으로 한다. 투여 빈도는 해당 분야의 숙련된 의학적 또는 수의학적 실행자(예를 들어, 의사, 수의사) 또는 과학자의 영역 내이다. 또한, 실험에 사용된 마우스는 전형적으로 약 20 g이며, 마우스 실험으로부터 70 ㎏ 개체까지 증대될 수 있음이 주목된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 RNA 분자는 리포좀 또는 리포펙틴 제형 등으로 전달되며, 해당 분야의 숙련자에게 잘 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제5,593,972호, 제5,589,466호, 및 제5,580,859호에 기재되어 있다. 포유류 세포 내로의 siRNA의 향상 및 개선된 전달을 구체적으로 목표로 하는 전달 시스템이 개발되었고, (예를 들어, 문헌[Shen et al FEBS Let. 2003, 539:111-114]; 문헌[Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010]; 문헌[Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216]; 문헌[Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766]; 문헌[Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108] 및 문헌[Simeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724] 참조) 본 발명에 적용될 수 있다. siRNA는 최근에 영장류에서 유전자 발현의 저해를 위해 성공적으로 사용되었다(예를 들어, 또한 본원에 적용될 수 있는 문헌[Tolentino et al., Retina 24(4):660] 참조).
실제로, RNA 전달은 생체내 전달의 유용한 방법이다. 리포좀 또는 나노입자를 사용하여 Cas9 및 gRNA(예를 들어, HR 수복 주형)를 세포 내로 전달할 수 있다. 따라서 Cas9와 같은 CRISPR 효소의 전달 및/또는 본 발명의 RNA의 전달은 RNA 형태로, 그리고 미세소포, 리포좀 또는 나노입자를 통해 이루어질 수 있다. 예를 들어, Cas9 mRNA 및 gRNA는 생체내 전달을 위해 리포좀 입자 내로 패키징될 수 있다. 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)로부터의 리포펙타민과 같은 리포좀 트랜스펙션 시약 및 시판 중인 다른 시약은 RNA 분자를 간에 효과적으로 전달할 수 있다.
RNA의 전달 수단은 또한 바람직하게는 나노입자(문헌[Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R. and Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells, Advanced Functional Materials, 19: 3112-3118, 2010]) 또는 엑소좀(문헌[Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R., and Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641])을 통한 RNA의 전달을 포함한다. 사실, 엑소좀은 CRISPR 시스템과 조금 유사한 시스템인 전달 siRNA에서 특히 유용한 것으로 나타났다. 예를 들어, El-Andaloussi S, 등(문헌["Exosomes-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo." Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.])은 엑소좀이 상이한 생물학적 장벽을 가로질러 약물을 전달하기 위한 촉망받는 도구가 되고 시험관내 및 생체내에서 siRNA의 전달을 위해 이용될 수 있는 방법을 기재한다. 그들의 접근법은 펩티드 리간드와 융합된 엑소좀 단백질을 포함하여, 발현 벡터의 트랜스펙션을 통해 표적화된 엑소좀을 생성하는 것이다. 이어서, 엑소좀은 트랜스펙션된 세포 상청액으로부터 정제 및 특성화된 다음, RNA는 엑소좀에 로딩된다. 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 엑소좀을 사용하여, 특히 비제한적으로 뇌로 수행될 수 있다. 비타민 E(α-토코페롤)는 CRISPR Cas와 컨쥬게이트될 수 있고, 예를 들어 뇌에 짧은 간섭 RNA(siRNA)를 전달하기 위해 Uno 등(문헌[HUMAN GENE THERAPY 22:711-719 (June 2011)])에 의해 행해지는 것과 유사한 방식으로 고밀도 지단백질(HDL)과 함께 뇌에 전달될 수 있다. 마우스에 인산염 완충 식염수(PBS) 또는 유리 TocsiBACE 또는 Toc-siBACE/HDL이 충전되고, 뇌 주입 키트 3(Brain Infusion Kit 3)(알제트(Alzet))과 연결된 삼투 미니펌프(Osmotic minipump)(모델 1007D; 알제트, 미국 캘리포니아주 쿠퍼티노 소재)를 통해 주입하였다. 뇌 주입 캐뉼라를 등쪽의 제3 뇌실 내로의 주입을 위해 중앙에서 브레그마(bregma)보다 약 0.5 mm 뒤에 위치시켰다. Uno 등은 HDL과 함께 3 nmol만큼 적은 Toc-siRNA가 동일한 ICV 주입 방법에 의해 유사한 정도로 표적 감소를 유도할 수 있었다는 것을 발견하였다. α-토코페롤에 컨쥬게이트되고 뇌에 표적화된 HDL과 동시-투여되는 유사한 투여량의 CRISPR Cas가 본 발명에서 인간에 대해 고려될 수 있으며, 예를 들어, 뇌에 표적화된 약 3 nmol 내지 약 3 μmol의 CRISPR Cas가 고려될 수 있다. Zou 등(문헌[HUMAN GENE THERAPY 22:465-475 (April 2011)])은 랫트의 척수에서 생체내 유전자 침묵화를 위한 PKCγ를 표적화하는 짧은 헤어핀 RNA의 렌티바이러스-매개의 전달 방법을 기재한다. Zou 등은 척추강내 카테터에 의해 1 × 109 형질도입 단위(TU)/㎖의 역가를 갖는 재조합 렌티바이러스 약 10 ㎕를 투여하였다. 뇌에 표적화된 렌티바이러스 벡터에서 발현된 유사한 투여량의 CRISPR Cas가 본 발명에서 인간에 대해 고려될 수 있으며, 예를 들어, 1 × 109 형질도입 단위(TU)/㎖의 역가를 갖는 렌티바이러스에서 뇌에 표적화된 약 10 내지 50 ㎖의 CRISPR Cas가 고려될 수 있다.
뇌로의 국소 전달에 관하여, 이는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 물질은 예를 들어, 주사에 의해 선상체 내로 전달될 수 있다. 주사는 개두술을 통해 정위적으로 수행될 수 있다.
NHEJ 또는 HR 효율을 향상시키는 것은 또한 전달에 도움을 준다. NHEJ 효율은 Trex2와 같은 최종 가공 효소를 동시발현시킴으로써 향상되는 것이 바람직하다(문헌[Dumitrache et al. Genetics. 2011 August; 188(4): 787-797]). HR 효율은 Ku70 및 Ku86과 같은 NHEJ 기구를 일시적으로 저해함으로써 증가되는 것이 바람직하다. HR 효율은 또한 RecBCD, RecA와 같은 원핵 또는 진핵 상동성 재조합 효소를 동시발현시킴으로써 증가될 수 있다.
일반적인 패키징 및 프로모터
생체내에서 게놈 변형을 매개하기 위해 Cas9 코딩 핵산 분자, 예를 들어, DNA를 벡터, 예를 들어, 바이러스 벡터 내로 패키징하는 방법은 다음을 포함한다:
● NHEJ-매개 유전자 낙아웃을 달성하기 위한 것:
● 단일 바이러스 벡터:
● 2개 이상의 발현 카세트를 함유하는 벡터:
● 프로모터-Cas9 코딩 핵산 분자 -종결자
● 프로모터-gRNA1-종결자
● 프로모터-gRNA2-종결자
● 프로모터-gRNA(N)-종결자(벡터의 크기 제한까지)
● 이중 바이러스 벡터:
● Cas9의 발현을 유도하기 위한 하나의 발현 카세트를 함유하는 벡터 1
● 프로모터-Cas9 코딩 핵산 분자-종결자
● 하나 이상의 가이드RNA의 발현을 유도하기 위한 하나 이상의 발현 카세트를 함유하는 벡터 2
● 프로모터-gRNA1-종결자
● 프로모터-gRNA(N)-종결자(벡터의 크기 제한까지)
● 상동성-유도 수복을 매개하는 것.
● 상기 기재한 단일 및 이중 바이러스 벡터 접근법에 더하여, 추가적인 벡터를 사용하여 상동성-유도 수복 주형을 전달할 수 있다.
Cas9 코딩 핵산 분자 발현을 유도하기 위해 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: AAV ITR은 프로모터로서 작용할 수 있다: 이는 추가적인 프로모터 요소(벡터 내 공간을 차지할 수 있음)에 대한 필요를 없애는데 유리하다. 추가의 비어 있는 공간은 추가적인 요소(gRNA 등)의 발현을 유도하는데 사용될 수 있다. 또한, ITR 활성은 상대적으로 더 약하고, 따라서 Cas9의 과발현에 기인하는 잠재적인 독성을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 편재하는 발현을 위해, 다음의 프로모터 중 임의의 것을 사용할 수 있다: CMV, CAG, CBh, PGK, SV40, 페리틴 중쇄 또는 경쇄 등. 뇌 또는 다른 CNS 발현을 위하여, 다음의 프로모터를 사용할 수 있다: 모든 뉴런에 대해 시냅신I(SynapsinI), 흥분성 뉴런에 대해 CaMKII알파, GABA성 뉴런에 대해 GAD67 또는 GAD65 또는 VGAT 등. 간 발현을 위해, 알부민 프로모터를 사용할 수 있다. 폐 발현을 위해, SP-B를 사용할 수 있다. 내피세포를 위해 ICAM을 사용할 수 있다. 조혈모세포를 위해 IFN베타 또는 CD45를 사용할 수 있다. 조골세포를 위해 OG-2를 사용할 수 있다.
가이드 RNA를 유도하기 위해 사용되는 프로모터는 다음을 포함할 수 있다: U6 또는 H1과 같은 Pol III 프로모터. gRNA를 발현시키기 위한 Pol II 프로모터 및 인트론 카세트.
아데노 연관 바이러스( AAV )
Cas9 및 하나 이상의 가이드 RNA는 아데노 연관 바이러스(AAV), 렌티바이러스, 아데노바이러스 또는 다른 플라스미드 또는 바이러스 벡터 유형을 사용하여, 특히, 예를 들어, 미국 특허 제8,454,972호(아데노바이러스에 대한 제형, 용량), 제8,404,658호(AAV에 대한 제형, 용량) 및 제5,846,946호(DNA 플라스미드에 대한 제형, 용량)로부터의 제형 및 용량, 및 렌티바이러스, AAV 및 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험 및 임상 시험에 관한 간행물로부터의 제형 및 용량을 사용하여 전달될 수 있다. 예를 들어, AAV에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,454,972호에서와 같고, AAV를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 아데노바이러스에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제8,404,658호에서와 같을 수 있고 아데노바이러스를 수반하는 임상 시험에서와 같을 수 있다. 플라스미드 전달에 대해, 투여 경로, 제형 및 용량은 미국 특허 제5,846,946호에서와 같고, 플라스미드를 수반하는 임상 연구에서와 같을 수 있다. 용량은 평균 70 kg 개체(예를 들어, 성인 남성)를 기준으로 하거나 또는 이로 추정될 수 있고, 상이한 체중 및 종의 환자, 대상체, 포유류에 대해 조절될 수 있다. 투여 빈도는 환자 또는 대상체의 연령, 성별, 일반적 건강상태, 다른 질환 및 다루어질 특정 질환 또는 증상을 포함하는 보통의 인자에 따라서 의학적 또는 수의학적 실행자(예를 들어, 의사, 수의사)의 영역 내에 있다. 바이러스 벡터는 관심 조직 내에 주사될 수 있다. 세포 유형 특이적 게놈 변형을 위해, Cas9의 발현은 세포 유형 특이적 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 예를 들어, 간 특이적 발현은 알부민 프로모터를 사용할 수 있고, 뉴런 특이적 발현(예를 들어, CNS 장애를 표적화하기 위함)은 시냅신 I 프로모터를 사용할 수 있다. 생체내 전달에 관하여, AAV는 몇가지 이유로 다른 바이러스 벡터에 비해 유리하다: 낮은 독성(이것은 면역 반응을 활성화시킬 수 있는 세포 입자의 초원심분리를 필요로 하지 않는 정제 방법 때문일 수 있다).
숙주 게놈 내로 통합하지 않기 때문에 삽입 돌연변이유발을 야기할 확률이 낮음.
AAV는 4.5 또는 4.75 Kb의 패키징 제한을 갖는다. 이는 Cas9뿐만 아니라 프로모터 및 전사 종결자가 모두 동일한 바이러스 벡터에 핏팅되어야 함을 의미한다. 4.5 또는 4.75 Kb보다 큰 작제물은 상당히 감소된 바이러스 생산을 야기할 것이다. SpCas9는 상당히 크며, 유전자 그 자체가 4.1 Kb가 넘는데, 이는 그것이 AAV 내로 패키징되는 것을 어렵게 만든다. 따라서 본 발명의 구현예는 더 짧은 Cas9의 상동체를 이용하는 것을 포함한다. 예를 들어:
Figure pct00030
따라서 이들 종은 일반적으로 Cas9 종이 바람직하다.
AAV에 관해서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5 또는 그들의 임의의 조합일 수 있다. 표적화될 세포에 관한 AAV의 AAV를 선택할 수 있으며; 예를 들어, 뇌 또는 뉴런 세포를 표적화하기 위하여 AAV 혈청형 1, 2, 5 또는 하이브리드 캡시드 AAV1, AAV2, AAV5 또는 그들의 임의의 조합을 선택할 수 있으며; 심장 조직을 표적화하기 위하여 AAV4를 선택할 수 있다. AAV8은 간으로의 전달에 유용하다. 본원의 프로모터 및 벡터는 개별적으로 바람직하다. 이들 세포에 관한 특정 AAV 혈청형의 표 작성(문헌[Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)] 참조)은 하기와 같다:
Figure pct00031
Figure pct00032
렌티바이러스
렌티바이러스는 유사분열과 유사분열 후 세포 둘 다에서 그들의 유전자를 감염 및 발현시키는 능력을 갖는 복합 레트로바이러스이다. 가장 흔히 알려진 렌티바이러스는 광범위한 세포 유형을 표적화하기 위해 다른 바이러스의 외피 당단백질을 사용하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)이다.
렌티바이러스는 다음과 같이 제조될 수 있다. (렌티바이러스 전달 플라스미드 백본을 함유하는) pCasES10의 클로닝 후에, 낮은 계대(p=5)에서 HEK293FT를 10% 우태아혈청이 있고 항생제가 없는 DMEM 중의 트랜스펙션 전날에 50% 컨플루언스(confluence)까지 T-75 플라스크에 씨딩하였다. 20시간 후에, 배지를 OptiMEM(무혈청) 배지로 바꾸고, 4시간 후에 트랜스펙션을 행하였다. 세포를 10 ㎍의 렌티바이러스 전달 플라스미드(pCasES10) 및 다음의 패키징 플라스미드: 5 ㎍의 pMD2.G(VSV-g 위형), 및 7.5 ㎍의 psPAX2(gag/pol/rev/tat)로 트랜스펙션시켰다. 양이온성 지질 전달제(50 ㎕ 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 및 100 ㎕ 플러스(Plus) 시약)를 이용하여 4 ㎖ OptiMEM 중에서 트랜스펙션을 행하였다. 6시간 후, 배지를 10% 우태아혈청이 있는 무항생제 DMEM으로 바꾸었다. 이들 방법은 세포 배양 동안 혈청을 사용하지만, 무혈청 방법이 바람직하다.
렌티바이러스는 다음과 같이 정제될 수 있다. 바이러스 상청액을 48시간 후에 수집하였다. 상청액을 먼저 데브리스(debris)를 없애고, 0.45 ㎛ 저 단백질 결합(PVDF) 필터를 통해 여과시켰다. 이어서, 그들을 24,000 rpm에서 2시간 동안 초원심분리기에서 회전시켰다. 바이러스 펠렛을 4℃에서 밤새 50 ㎕의 DMEM 중에서 재현탁화시켰다. 이어서 그들을 분주하고 즉시 -80℃에서 즉시 동결시켰다.
다른 구현예에서, 말 감염성 빈혈 바이러스(equine infectious anemia virus: EIAV)에 기반한 최소 비영장류 렌티바이러스 벡터는 또한, 특히 눈 유전자 요법을 위해 고려된다(예를 들어, 문헌[Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285] 참조). 다른 구현예에서, RetinoStat®, 망(web) 형태의 노인성 황반변성의 치료를 위한 망막하 주사를 통해 전달되는 혈관신생억제 단백질 엔도스타틴 및 앤지오스타틴을 발현시키는 말 감염성 빈혈 바이러스-기반의 렌티바이러스 유전자 요법 벡터가 또한 고려되며(예를 들어, 문헌[Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012)]), 이러한 벡터는 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템을 위해 변형될 수 있다.
다른 구현예에서, HIV tat/rev에 의해 공유되는 공통 엑손을 표적화하는 siRNA, 핵소체-국소화 TAR 데코이(decoy), 및 항-CCR5-특이적 해머헤드(hammerhead) 리보자임을 이용하는 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터(예를 들어, 문헌[DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43] 참조)가 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템에 대해 사용되고/되거나 적합하게 될 수 있다. 최소 2.5 × 106개 CD34+ 세포/킬로그램(환자의 체중)을 수집하고, 2 × 106개 세포/㎖의 밀도에서 2 μmol/L-글루타민, 줄기 세포 인자(100 ng/㎖), Flt-3 리간드(Flt-3L)(100 ng/㎖), 및 트롬보포이에틴(10 ng/㎖)(셀제닉스(CellGenix))을 함유하는 X-VIVO 15 배지(론자(Lonza))에서 16 내지 20시간 동안 사전자극할 수 있다. 사전자극된 세포는 피브로넥틴(25 ㎎/㎠)으로 코팅된 75-㎠ 조직 배양 플라스크에서 16 내지 24 시간 동안 감염다중도 5로 렌티바이러스에 의해 형질도입될 수 있다(레트로넥틴(RetroNectin), 타카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc.)).
렌티바이러스 벡터는 파킨슨병의 치료에서와 같이 개시되었다, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20120295960호 및 미국 특허 제7303910호 및 제7351585호를 참조한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 안질환의 치료용으로 개시되었다, 예를 들어, 미국 특허 공개 제20060281180호, 제20090007284호, 제US20110117189호; 제US20090017543호; 제US20070054961호, 제US20100317109호를 참조한다. 렌티바이러스 벡터는 또한 뇌에 대한 전달용으로 개시되었다, 예를 들어, 미국 특허 공개 제US20110293571호; 제US20110293571호, 제US20040013648호, 제US20070025970호, 제US20090111106호 및 미국 특허 제US7259015호를 참조한다.
RNA 전달
RNA 전달: CRISPR 효소, 예를 들어 Cas9, 및/또는 임의의 본 발명의 RNA, 예를 들어 가이드 RNA는 또한 RNA의 형태로 전달될 수 있다. Cas9 mRNA는 시험관내 전사를 사용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, Cas9 mRNA는 다음의 요소를 함유하는 PCR 카세트를 사용하여 합성될 수 있다: 베타 글로빈-폴리A 테일(120개 이상의 아데닌의 스트링(string))로부터의 T7_프로모터-코작 서열(GCCACC)-Cas9-3' UTR. 카세트는 T7 중합효소에 의한 전사를 위해 사용될 수 있다. 가이드 RNA는 또한 T7_프로모터-GG-가이드 RNA 서열을 함유하는 카세트로부터의 시험관내 전사를 사용하여 전사될 수 있다.
발현을 향상시키고 가능한 독성을 감소시키기 위해, CRISPR 효소-코딩 서열 및/또는 가이드 RNA는 예를 들어, 슈도-U 또는 5-메틸-C를 사용하여 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드를 포함하도록 변형될 수 있다.
mRNA 전달 방법은 현재 간 전달용으로 특히 촉망된다.
RNA 전달에 대한 많은 임상적 연구는 RNAi 또는 안티센스에 집중되어 있으나, 이들 시스템은 본 발명을 이행하기 위하여 RNA의 전달에 적합하게 될 수 있다. 따라서, RNAi 등에 대한 하기의 참고문헌을 확인해야 한다.
나노입자
CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA는 나노입자 또는 지질 외피를 사용하여 동시에 전달될 수 있다.
예를 들어, Su X, Fricke J, Kavanagh DG, Irvine DJ(문헌["In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles" Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87. doi: 10.1021/mp100390w. Epub 2011 Apr 1])는 인지질 이중층 껍질에 의해 둘러싸인 폴리(β-아미노 에스테르)(PBAE) 코어를 지니는 생분해성 코어 껍질 구조의 나노입자를 기재한다. 이들은 생체내 mRNA 전달을 위해 개발되었다. pH-반응성 PBAE 성분은 엔도솜 파괴를 촉진하도록 선택되는 한편, 지질 표면층은 다가양이온 코어의 독성을 최소화하도록 선택되었다. 따라서 그러한 것은 본 발명의 RNA를 전달하는데 바람직하다.
일 구현예에서, 모두 뇌로의 펩티드의 구강 전달, 펩티드의 정맥내 전달 및 펩티드의 비강 전달에 적용될 수 있는 생접착성 중합체의 자가 어셈블링에 기반한 나노입자가 고려된다. 다른 구현예, 예컨대 소수성 약물의 구강 흡수 및 눈 전달이 또한 고려된다. 분자 외피 기술은 보호되고, 질환의 부위에 전달되는 조작된 중합체 외피를 수반한다(예를 들어, 문헌[Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026]; 문헌[Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1):14-28]; 문헌[Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2):523-36]; 문헌[Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6):1665-80]; 문헌[Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6):1764-74]; 문헌[Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68]; 문헌[Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688]; 문헌[Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33]; 문헌[Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40]; 문헌[Qu, X.,et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9] 및 문헌[Uchegbu, I.F., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199] 참조). 표적 조직에 따라, 약 5 ㎎/kg의 단일 또는 다중 용량이 고려된다.
일 구현예에서, MIT의 댄 앤더슨 연구소(Dan Anderson's lab)에 의해 개발된 종양 성장을 중단시키기 위해 암 세포에 RNA를 전달할 수 있는 나노입자가 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 대해 사용되고/사용되거나 적합하게 될 수 있다. 특히, 앤더슨 연구소는 새로운 생체재료 및 나노제형의 합성, 정제, 특성화 및 제형화를 위한 완전히 자동화된 조합 시스템을 개발하였다. 예를 들어, 문헌[Alabi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 6;110(32):12881-6]; 문헌[Zhang et al., Adv Mater. 2013 Sep 6;25(33):4641-5]; 문헌[Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13;13(3):1059-64]; 문헌[Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 Oct 23;6(10):8484-7]; 문헌[Whitehead et al., ACS Nano. 2012 Aug 28;6(8):6922-9] 및 문헌[Lee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3;7(6):389-93]을 참조한다.
미국 특허 출원 제20110293703호는 또한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 전달하기 위해 적용될 수 있는 폴리뉴클레오티드의 투여에서 특히 유용한 리피도이드(lipidoid) 화합물에 관한 것이다. 일 양태에서, 아미노알코올 리피도이드 화합물은 작용제와 병용되어 세포 또는 대상체에게 전달되어 마이크로입자, 나노입자, 리포좀, 또는 미셀을 형성한다. 입자, 리포좀 또는 미셀에 의해 전달될 작용제는 기체, 액체 또는 고체의 형태일 수 있고, 작용제는 폴리뉴클레오티드, 단백질, 펩티드 또는 소분자일 수 있다. 미노알코올 리피도이드 화합물은 다른 아미노알코올 리피도이드 화합물, 중합체(합성 또는 천연), 계면활성제, 콜레스테롤, 탄수화물, 단백질, 지질 등과 조합되어 입자를 형성할 수 있다. 이어서 이들 입자는 임의로 약제학적 부형제와 조합되어 약제학적 조성물을 형성할 수 있다.
미국 특허 공개 제20110293703호는 또한 아미노알코올 리피도이드 화합물의 제조 방법을 제공한다. 1 이상의 당량의 아민을 본 발명의 아미노알코올 리피도이드 화합물을 형성하기에 적합한 조건하에서 에폭시드-말단 화합물의 1 당량 이상과 반응되게 한다. 특정 구현예에서, 아민의 모든 아미노기는 에폭시드-말단 화합물과 완전히 반응되어 3차 아민을 형성한다. 다른 구현예에서, 아민의 모든 아미노기는 3차 아민을 형성하기 위하여 에폭시드-말단 화합물과 완전히 반응되지 않으며, 이에 의해 아미노알코올 리피도이드 화합물에서 1차 또는 2차 아민이 초래된다. 이들 1차 또는 2차 아민은 그대로 남아 있거나, 다른 친핵체, 예를 들어, 상이한 에폭시드-말단 화합물과 반응할 수 있다. 해당 분야의 숙련자에 의해 인식될 바와 같이, 아민을 과량 미만의 에폭시드-말단 화합물과 반응시키는 것은 다수의 테일을 지니는 복수의 상이한 아미노알코올 리피도이드 화합물을 초래할 것이다. 특정 아민은 2개의 에폭시드 유래 화합물 테일로 완전히 작용화될 수 있는 반면, 다른 분자는 에폭시드 유래 화합물 테일에 의해 완전히 작용화되지 않을 것이다. 예를 들어, 디아민 또는 폴리아민은 분자의 다양한 아미노 모이어티를 제거하는 1개, 2개, 3개 또는 4개의 에폭시드 유래 화합물 테일을 함유하여 1차, 2차 및 3차 아민을 야기할 수 있다. 특정 구현예에서, 모든 아미노기는 완전히 작용화되지 않는다. 특정 구현예에서, 2가지 동일 유형의 에폭시드 말단 화합물이 사용된다. 다른 구현예에서, 2개 이상의 상이한 에폭시드 말단 화합물이 사용된다. 아미노알코올 리피도이드 화합물의 합성은 용매와 함께 또는 용매 없이 수행되고, 합성은 30 내지 100℃, 바람직하게는 대략 50 내지 90℃ 범위의 고온에서 수행될 수 있다. 제조된 아미노알코올 리피도이드 화합물은 임의로 정제될 수 있다. 예를 들어, 아미노알코올 리피도이드 화합물의 혼합물을 정제하여, 특정 수의 에폭시드 유래 화합물 테일을 지니는 아미노알코올 리피도이드 화합물을 수득할 수 있다. 또는 혼합물을 정제하여 특정 입체 이성질체 또는 구조 이성질체를 수득할 수 있다. 아미노알코올 리피도이드 화합물은 또한 알킬 할로겐화물(예를 들어, 요오드화메틸) 또는 다른 알킬화제를 사용하여 알킬화될 수 있고/있거나 그들은 아실화될 수 있다.
미국 특허 공개 제20110293703호는 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된 아미노알코올 리피도이드 화합물의 라이브러리를 제공한다. 이들 아미노알코올 리피도이드 화합물은 액체 핸들러(handler), 로봇, 마이크로타이터 플레이트, 컴퓨터 등을 수반하는 고처리량 기술을 사용하여 제조 및/또는 스크리닝될 수 있다. 특정 구현예에서, 아미노알코올 리피도이드 화합물을 폴리뉴클레오티드 또는 다른 작용제(예를 들어, 단백질, 펩티드, 소분자)를 세포에 트랜스펙션하는 그들의 능력에 대해 스크리닝한다.
미국 특허 공개 제20130302401호는 조합 중합을 사용하여 제조된 폴리(베타-아미노 알코올)(PBAA)의 부류에 관한 것이다. 본 발명의 PBAA는 코팅(예컨대 의료장치 또는 이식물에 대한 필름 또는 다중층 필름의 코팅), 첨가제, 재료, 부형제, 비생물오손제(non-biofouling agent), 미세패터닝제 및 세포 캡슐화제로서 생명공학 및 생체의학 적용분야에서 사용될 수 있다. 표면 코팅으로서 사용될 때, 이들 PBAA는 그들의 화학적 구조에 따라서 시험관내와 생체내 둘 다에서 상이한 염증 수준을 유발하였다. 이러한 부류의 물질의 큰 화학적 다양성은 본 출원인들이 시험관내 대식세포 활성화를 저해하는 중합체 코팅을 확인하게 하였다. 더욱이, 이들 코팅은 카르복실화된 폴리스티렌 마이크로입자의 피하 이식 후에 염증 세포의 동원을 감소시키고, 섬유증을 감소시킨다. 이들 중합체를 사용하여 세포 캡슐화를 위한 고분자전해질 복합체 캡슐을 형성할 수 있다. 본 발명은 또한 미생물방지 코팅, DNA 또는 siRNA 전달, 및 줄기 세포 조직 조작과 같은 다수의 다른 생물학적 적용분야를 가질 수 있다. 미국 특허 공개 제20130302401호의 교시는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 적용될 수 있다.
다른 구현예에서, 지질 나노입자(LNP)가 고려된다. 특히, 지질 나노입자에서 캡슐화되고, 인간으로 전달되는 항트렌스티레틴(antitransthyretin) 짧은 간섭 RNA(예를 들어, 문헌[Coelho et al., N Engl J Med 2013;369:819-29] 참조) 및 그러한 시스템은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 적합하게 되고, 적용될 수 있다. 정맥내로 투여된 체중 kg 당 약 0.01 내지 약 1 ㎎의 용량이 고려된다. 주입 관련 반응의 위험을 감소시키기 위한 의약이 고려되며, 예컨대 덱사메타손, 아세탐피노펜, 디펜하이드라민 또는 세티리진 및 라니티딘이 고려된다. 5회 용량에 대한 4주마다 킬로그램 당 약 0.3 ㎎의 다회 용량이 또한 고려된다.
LNP는 siRNA를 간에 전달함에 있어 고도로 효과적인 것으로 나타났으며(예를 들어, 문헌[Tabernero et al., Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470] 참조), 이에 따라 CRISPR Cas를 인코딩하는 RNA를 간으로 전달하기 위해 고려된다. 2주마다 6 ㎎/kg의 LNP의 약 4회 용량의 투여량이 고려될 수 있다. Tabernero 등은 0.7 ㎎/kg으로 투여한 LNP의 처음 2 사이클 후에 종양 억제를 관찰하였고, 6 사이클의 마지막까지 환자는 림프절 전이의 완전한 억제 및 간 종양의 실질적 수축으로 부분적 반응을 달성하였음을 입증하였다. 관해가 남아 있는 이러한 환자에서 40회 용량 후에 완전한 반응을 수득하였고, 26개월에 걸쳐 용량을 제공받은 후에 치료를 완료하였다. VEGF 경로 저해제를 이용한 사전 요법 후에 진행한 신장, 폐 및 림프절을 포함하는 RCC 및 간외영역 질병을 지니는 2명의 환자는 대략 8 내지 12개월 동안 모든 부위에서 안정한 질병을 가졌고, PNET 및 간 전이를 지니는 환자는 안정한 질병과 함께 18개월(36회 용량) 동안 연장 연구를 계속되었다.
그러나, LNP의 전하를 고려하여야 한다. 양이온성 지질은 세포내 전달을 용이하게 하는 비이중층 구조를 유발하기 위해 음으로 하전된 지질과 조합되기 때문이다. 하전된 LNP는 정맥내 주사 후 순환으로부터 빠르게 제거되기 때문에, 7 미만의 pKa 값을 지니는 이온화 가능한 양이온성 지질을 개발하였다(예를 들어, 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011] 참조). 음으로 하전된 중합체, 예컨대 RNA는 이온화 가능한 지질이 양전하를 나타내는 경우 낮은 pH 값(예를 들어, pH 4)에서 LNP에 로딩될 수 있다. 그러나, 생리적 pH 값에서, LNP는 더 긴 순환 시간과 양립가능한 낮은 표면 전하를 나타낸다. 이온화 가능한 양이온성 지질의 4개 종, 즉, 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄-프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시-케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinKDMA), 및 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA)에 중점을 두었다. 이들 지질을 함유하는 LNP siRNA 시스템은 생체내 간세포에서 현저하게 상이한 유전자 침묵화 특성을 나타내는 것으로 나타났고, 효능은 인자 VII 유전자 침묵화 모델을 사용하는 시리즈 DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAP에 따라 다르다(예를 들어, 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011] 참조). 특히 DLinKC2-DMA을 함유하는 제형에 대하여, 1 ㎍/㎖의 투여량의 LNP 또는 LNP 중의 또는 그와 회합된 CRISPR Cas RNA가 고려될 수 있다.
LNP의 제조 및 CRISPR Cas 캡슐화가 사용될 수 있고/있거나 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011]으로부터 적합하게 될 수 있다. 양이온성 지질 1,2-디리네오일-3-디메틸암모늄-프로판(DLinDAP), 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N-디메틸아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디리놀레일옥시케토-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinK-DMA), 1,2-디리놀레일-4-(2-디메틸아미노에틸)-[1,3]-디옥솔란(DLinKC2-DMA), (3-o-[2″-(메톡시폴리에틸렌글리콜 2000) 숙시노일]-1,2-디미리스토일-sn-글리콜(PEG-S-DMG) 및 R-3-[(ω-메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)2000) 카르바모일]-1,2-디미리스틸옥시프로필-3-아민(PEG-C-DOMG)은 테크미라 파마슈티컬즈(Tekmira Pharmaceuticals)(캐나다 밴쿠버에 소재)에 의해 제공될 수 있거나 합성될 수 있다. 콜레스테롤은 시그마(Sigma)(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입할 수 있다. 특정 CRISPR Cas RNA는 DLinDAP, DLinDMA, DLinK-DMA 및 DLinKC2-DMA(40:10:40:10 몰비의 양이온성 지질:DSPC:CHOL: PEGS-DMG 또는 PEG-C-DOMG)를 함유하는 LNP 내에 캡슐화될 수 있다. 필요하다면, 0.2% SP-DiOC18(캐나다 벌링턴 소재의 인비트로겐(Invitrogen))을 혼입시켜 세포 흡수, 세포내 전달 및 생체분포를 평가할 수 있다. 캡슐화는 10 mmol/ℓ의 최종 지질 농도로 양이온성 지질:DSPC:콜레스테롤:PEG-c-DOMG(40:10:40:10 몰비)로 이루어진 지질 혼합물을 에탄올 중에 용해함으로써 수행될 수 있다. 이러한 지질의 에탄올 용액을 50 mmol/ℓ 시트르산염, pH 4.0에 적가하여 다중 라멜라 소낭를 형성하여 30% 에탄올 vol/vol의 최종 농도를 생성할 수 있다. 압출기(캐나다 벤쿠버 소재의 노던 리피즈(Northern Lipids))를 사용하여 2개의 적층 80 nm 뉴클레포어(Nuclepore) 폴리카르보네이트 필터를 통해 다중 라멜라 소낭을 압출한 후 거대 라멜라 소낭이 형성될 수 있다. 30% 에탄올 vol/vol을 함유하는 50 mmol/ℓ 시트르산염, pH 4.0 중에 2 ㎎/㎖로 용해시킨 RNA를 압출된 사전형성된 거대 단일 라멜라 소낭에 적가하고, 0.06/1 wt/wt의 최종 RNA/지질 중량비로 일정하게 혼합하면서 30분 동안 31℃에서 인큐베이션함으로써 캡슐화를 달성할 수 있다. Spectra/Por 2 재생 셀룰로스 투석막을 사용하여 16시간 동안 인산염 완충 식염수(PBS), pH 7.4에 대해 투석함으로써 에탄올의 제거 및 제형 완충제의 중화를 수행하였다. NICOMP 370 입도 분석기, 소낭/강도 모드, 및 가우시안(Gaussian) 핏팅(미국 캘리포니아주 산타 바바라 소재의 니콤프 파티클 사이징(Nicomp Particle Sizing))을 사용하여 동적 광 산란에 의해 나노입자 크기 분포를 결정할 수 있다. 3개 모두의 LNP 시스템에 대한 입자 크기는 직경이 약 70 nm일 수 있다. VivaPureD MiniH 컬럼(사르토리우스 스테딤 바이오테크(Sartorius Stedim Biotech))을 사용하여 투석 전 및 후에 수집한 시료로부터 유리 RNA를 제거함으로써 RNA 캡슐화 효율을 결정할 수 있다. 캡슐화된 RNA는 용리된 나노입자로부터 추출되고, 260 nm에서 정량화될 수 있다. RNA 대 지질 비는 와코 케미컬즈 유에스에이(Wako Chemicals USA)(미국 버지니아주 리치몬드 소재)로부터의 콜레스테롤 E 효소 검정을 사용하여 소낭 내 콜레스테롤 함량의 측정에 의해 결정될 수 있다. LNP 및 PEG 지질의 본원의 논의와 함께, PEG화 리포좀 또는 LNP는 마찬가지로 CRISPR-Cas 시스템 또는 그의 성분의 전달에 적합하다.
거대 LNP의 제조는 문헌[Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011]으로부터 사용될 수 있고/있거나 이에 적합하게 될 수 있다. 지질 예비혼합 용액(20.4 ㎎/㎖ 총 지질 농도)은 50:10:38.5 몰비로 DLinKC2-DMA, DSPC 및 콜레스테롤을 함유하는 에탄올 중에서 제조될 수 있다. 아세트산나트륨은 0.75:1의 몰비(아세트산나트륨:DLinKC2-DMA)로 지질 예비혼합물에 첨가될 수 있다. 지질은 격렬한 교반과 함께 1.85 부피의 시트르산염 완충제(10 mmol/ℓ, pH 3.0)와 혼합물을 합함으로써 이후에 수화되어, 35% 에탄올을 함유하는 수성 완충제 중의 자발적 리포좀 형성을 초래할 수 있다. 리포좀 용액을 37℃에서 인큐베이션시켜 시간-의존적 입자 크기의 증가를 가능하게 할 수 있다. 분취물을 인큐베이션 동안 다양한 시간에 제거하여, 동적 광 산란에 의해 리포좀 크기의 변화를 조사할 수 있다(제타사이저 나노(Zetasizer Nano) ZS, 영국 우스터셔 소재의 몰번 인스트루먼츠(Malvern Instruments)). 일단 요망되는 입자 크기가 달성되면, 수성 PEG 지질 용액(원액 = 35%(vol/vol) 에탄올 중의 10 ㎎/㎖ PEG-DMG)을 리포좀 혼합물에 첨가하여 3.5%의 총 지질의 최종 PEG 몰 농도를 제공할 수 있다. PEG-지질의 첨가 시, 리포좀을 추가 성장을 효과적으로 켄칭시켜 그들의 크기를 해야 한다. 이어서, RNA를 대략 1:10(wt:wt)의 RNA 대 총 지질 비로 빈 리포좀에 첨가한 후에 37℃에서 30분 동안 인큐베이션시켜 로딩된 LNP를 형성할 수 있다. 혼합물을 후속적으로 PBS 중에 밤새 투석시키고, 0.45-㎛ 주사기 필터로 여과할 수 있다.
구체 핵산(Spherical Nucleic Acid: SNA™) 작제물 및 다른 나노입자(특히 금 나노입자)는 또한 의도된 표적에 CRISPR/Cas 시스템을 전달하기 위한 수단으로서 고려된다. 유의한 데이터는 핵산 작용화된 금 나노입자에 기반한 아우라센스 테라퓨틱스(AuraSense Therapeutics)의 구체 핵산(SNA™) 작제물이 유용한 것을 보여준다.
본원의 교시와 함께 사용될 수 있는 문헌은 문헌[Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257], 문헌[Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162], 문헌[Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970], 문헌[Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391], 문헌[Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71], 문헌[Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80], 문헌[Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638], 문헌[Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691], 문헌[Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16], 문헌[Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630], 문헌[Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013)] 및 문헌[Mirkin, et al., Small, 10:186-192]을 포함한다.
RNA를 지니는 자가 어셈블링 나노입자는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)의 원위 단부에 부착된 Arg-Gly-Asp(RGD) 펩티드 리간드로 PEG화된 폴리에틸렌이민(PEI)을 이용하여 작제될 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어, 인테그린을 발현하는 종양 신생혈관을 표적화하고, 혈관 내피 성장 인자 수용체-2(VEGF R2) 발현을 억제하는 siRNA를 전달하여, 그에 의해, 종양 혈관형성을 달성하기 위한 수단으로 사용된다(예를 들어, 문헌[Schiffelers et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19] 참조). 나노플렉스(nanoplex)를 동일한 부피의 양이온성 중합체 및 핵산의 수용액을 혼합함으로써 제조하여 2 내지 6의 범위에 걸쳐 인산염(핵산)에 대한 순 몰 과량의 이온화 가능한 질소(중합체)를 제공할 수 있다. 양이온성 중합체와 핵산 간의 정전기적 상호작용은 약 100 nm의 평균 입자 크기 분포를 갖는 폴리플렉스(polyplex)의 형성을 야기하며, 따라서 본원에서 나노플렉스로서 지칭된다. Schiffelers 등의 자가 어셈블링 나노입자에서의 전달을 위해 약 100 내지 200 ㎎의 CRISPR Cas의 투여량이 예상된다.
Bartlett 등(문헌[PNAS, September 25, 2007,vol. 104, no. 39])의 나노플렉스는 또한 본 발명에 적용될 수 있다. Bartlett 등의 나노플렉스는 동일 부피의 양이온성 중합체 및 핵산의 수용액을 혼합함으로써 제조되어 2 내지 6의 범위에 걸쳐 인산염(핵산)에 대한 순 몰 과량의 이온화 가능한 질소(중합체)를 제공한다. 양이온성 중합체와 핵산 간의 정전기적 상호작용은 약 100 nm의 평균 입자 크기 분포를 지니는 폴리플렉스의 형성을 초래하였고, 따라서 본원에서 나노플렉스로서 지칭된다. Bartlett 등의 DOTA-siRNA를 다음과 같이 합성하였다: 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산 모노(N-하이드록시숙신이미드 에스테르)(DOTA-NHS에스테르)는 마크로사이클릭스(Macrocyclics)(미국 텍사스주 달라스 소재)로부터 주문하였다. 탄산염 완충제(pH 9) 중의 100배 몰 과량의 DOTA-NHS-에스테르에 의한 아민 변형 RNA 센스 가닥을 마이크로원심분리 튜브에 첨가하였다. 내용물을 실온에서 4시간 동안 교반시킴으로써 반응시켰다. DOTA-RNA센스 컨쥬게이트를 에탄올 침전시키고, 수 중에 재현탁화하고, 미변형 안티센스 가닥에 어닐링시켜 DOTA-siRNA를 수득하였다. 모든 액체를 Chelex-100(미국 캘리포니아주 허큘러스 소재의 바이오-라드(Bio-Rad))으로 전처리하여 미량의 금속 오염물질을 제거하였다. Tf-표적화 및 비표적화 siRNA 나노입자를 사이클로덱스트린 함유 다가양이온을 사용함으로써 형성할 수 있다. 전형적으로, 나노입자를 전하비 3(+/-) 및 siRNA 농도 0.5 g/리터에서 수 중에서 형성하였다. 표적화된 나노입자의 표면상의 아다만탄-PEG 분자의 1%를 Tf로 변형시켰다(아다만탄-PEG-Tf). 나노입자를 주사용 5%(wt/vol) 글루코스 담체 용액 중에서 현탁화시켰다.
Davis 등(문헌[Nature, Vol 464, 15 April 2010])은 표적화된 나노입자 전달 시스템(임상 시험 등록 번호 NCT00689065)을 사용하는 RNA 임상 시험을 수행한다. 표준 치료 요법에 난치성인 고형암을 지니는 환자에게 30분 정맥내 주입에 의해 21일 사이클 중 제1일, 제3일, 제8일 및 제10일에 표적화된 나노입자의 용량을 투여한다. 나노입자는 하기를 함유하는 합성 전달 시스템으로 이루어진다: (1) 선형, 사이클로덱스트린 기반 중합체(CDP), (2) 암 세포의 표면상의 TF 수용체(TFR)에 맞물리는 나노입자 외부에 나타나는 인간 트랜스페린 단백질(TF) 표적화 리간드, (3) 친수성 중합체(생물학적 유체 중에서 나노입자 안정성을 촉진하기 위해 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)), 및 (4) RRM2의 발현을 감소시키도록 설계된 siRNA(임상에서 사용한 서열은 앞서 정의한 siR2B+5였음). TFR는 악성 세포에서 상향조절되는 것으로 알려져 있고, RRM2는 확립된 항암 표적이다. 이들 나노입자(CALAA-01로서 정의된 임상 형태)는 비인간 영장류에서의 다회 투여 연구에서 잘 용인되는 것으로 나타났다. 만성 골수성 백혈병을 지니는 단일 환자에게 리포좀 전달에 의해 siRNA가 투여되었지만, Davis 등의 임상 시험은 표적화된 전달 시스템을 이용하여 siRNA를 전신으로 전달하기 위한 그리고 고형암을 지니는 환자를 치료하기 위한 초기 인간 시험이다. 표적화된 전달 시스템이 인간 종양으로의 작용성 siRNA의 효과적인 전달을 제공할 수 있는지 여부를 확인하기 위해, Davis 등은 3개의 상이한 투여 코호트로부터의 3명 환자로부터의 생검을 조사하였고; 환자 A, B 및 C는 모두 전이성 흑색종을 가졌고, 각각 18, 24 및 30 ㎎ m-2 siRNA의 CALAA-01 용량을 받았다. 유사한 용량은 또한 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 위해 고려될 수 있다. 본 발명의 전달은 선형, 사이클로덱스트린 기반 중합체(CDP), 암세포의 표면상의 TF 수용체(TFR)에 맞물리는 나노입자 외부에 나타나는 인간 트랜스페린 단백질(TF) 표적화 리간드 및/또는 친수성 중합체(예를 들어, 생물학적 유체 중에서 나노입자 안정성을 촉진하기 위해 사용되는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))를 함유하는 나노입자에 의해 달성될 수 있다.
입자 전달 시스템 및/또는 제형:
여러 유형의 입자 전달 시스템 및/또는 제형이 다양한 스펙트럼의 생체의학 응용에 유용한 것으로 공지되어 있다. 일반적으로, 입자는 이의 운반 및 특성과 관련하여 완전한 단위로서 거동하는 작은 대상으로 규정된다. 입자는 직경에 따라 추가로 분류된다. 조립 입자는 2,500 내지 10,000 나노미터의 범위를 포함한다. 미세 입자는 100 내지 2,500 나노미터의 크기이다. 초미세 입자, 또는 나노입자는 일반적으로 크기가 1 내지 100 나노미터이다. 100-nm 한계의 근거는 벌크 물질로부터 입자를 구별하는 신규한 특성은 100 nm 아래의 결정적인 길이 규모에서 통상적으로 발생한다는 점이다.
본원에서 사용되는 바와 같은, 입자 전달 시스템/제형은 본 발명에 따른 입자를 포함하는 임의의 생물학적 전달 시스템/제형으로 규정된다. 본 발명에 따른 입자는 100 미크론(㎛) 미만의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는 임의의 엔티티(entity)이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 10 ㎛ 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 2000 나노미터(nm) 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 1000 나노미터(nm) 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 900 nm, 800 nm, 700 nm, 600 nm, 500 nm, 400 nm, 300 nm, 200 nm, 또는 100 nm 미만의 가장 큰 치수를 갖는다. 통상적으로, 본 발명의 입자는 500 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 250 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 200 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 150 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 100 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 예를 들어, 50 nm 이하의 가장 큰 치수를 갖는 더 작은 입자가 본 발명의 일부 구현예에서 이용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 입자는 25 nm 내지 200 nm 범위의 가장 큰 치수를 갖는다.
입자 특성화(예를 들어, 형태, 치수 등의 특성화를 포함함)는 다양한 상이한 기술을 이용하여 수행된다. 일반적인 기술은 전자 현미경검사법(TEM, SEM), 원자력 현미경검사법(AFM), 동적 광 산란(DLS), X-선 광전자 분광법(XPS), 분말 X-선 회절(XRD), 푸리에 변환 적외선 분광광도법(FTIR), 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행시간형 질량분석기(MALDI-TOF), 자외선-가시 분광법, 이중 분극 간섭계 및 핵 자기 공명(NMR)이다. 특성화(치수 측정)는 본 발명의 임의의 시험관내, 생체외 및/또는 생체내 적용을 위한 전달을 위한 최적의 크기의 입자를 제공하기 위해 고유 입자(즉, 로딩 이전)에 대해 또는 카고(cargo)의 로딩 후(본원에서 카고는, 예를 들어, CRISPR-Cas 시스템의 하나 이상의 요소, 예를 들어, CRISPR 효소 또는 mRNA 또는 가이드 RNA, 또는 이들의 임의의 조합을 나타내고, 추가 담체 및/또는 부형제를 포함할 수 있음)에 이루어질 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에서, 입자 치수(예를 들어, 직경) 특성화는 동적 레이저 산란(DLS)을 이용한 측정을 기초로 한다. 입자, 이들을 제조하고 이용하는 방법 및 이들의 측정과 관련하여 미국 특허 제8,709,843호; 미국 특허 제6,007,845호; 미국 특허 제5,855,913호; 미국 특허 제5,985,309호; 미국 특허 제5,543,158호; 및 2014년 5월 11일에 온라인에 공개된 공보(James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014), doi:10.1038/nnano.2014.84)가 언급된다.
본 발명의 범위 내의 입자 전달 시스템은 고체, 반고체, 에멀젼 또는 콜로이드 입자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 임의의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 지질-기반 시스템, 리포좀, 미셀, 미세소포, 엑소좀, 또는 유전자총을 포함하나 이에 제한되지는 않는 본원에 기재된 전달 시스템 중 임의의 전달 시스템이 본 발명의 범위 내의 입자 전달 시스템으로서 제공될 수 있다.
나노입자
본 발명과 관련하여, 나노입자 또는 지질 외피를 이용하여 CRISPR 복합체의 하나 이상의 성분, 예를 들어, CRISPR 효소 또는 mRNA 또는 가이드 RNA가 전달되는 것이 바람직하다. 다른 전달 시스템 또는 벡터가 본 발명의 나노입자 양태와 함께 이용될 수 있다.
일반적으로, "나노입자"는 1000 nm 미만의 직경을 갖는 임의의 입자를 나타낸다. 특정한 바람직한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 500 nm 이하의 가장 큰 치수(예를 들어, 직경)를 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 25 nm 내지 200 nm 범위의 가장 큰 치수를 갖는다. 다른 바람직한 구현에에서, 본 발명의 나노입자는 100 nm 이하의 가장 큰 치수를 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 나노입자는 35 nm 내지 60 nm 범위의 가장 큰 치수를 갖는다.
본 발명에 포함된 나노입자는 상이한 형태, 예를 들어, 고체 나노입자(예를 들어, 금속, 예를 들어, 은, 금, 철, 티타늄), 비-금속, 지질-기반 고체, 중합체), 나노입자의 현탁액, 또는 이들의 조합물로 제공될 수 있다. 금속, 유전체, 및 반도체 나노입자뿐만 아니라 하이브리드 구조(예를 들어, 코어-쉘 나노입자)가 제조될 수 있다. 반도체 물질로 제조된 나노입자는 또한 이들이 전자 에너지 수준의 양자화가 발생하기에 충분히 작은(통상적으로, 10 nm 이하) 경우 양자점으로 표지될 수 있다. 이러한 나노규모 입자는 약물 담체 또는 영상화 작용제로서 생물의학 응용에서 사용되며, 본 발명에서 유사한 목적을 위해 적합하게 될 수 있다.
반고체 및 연성 나노입자가 제조되었고, 이들은 본 발명의 범위 내이다. 반고체 성질의 프로토타입 나노입자는 리포좀이다. 다양한 유형의 리포좀 나노입자가 항암 약물 및 백신을 위한 전달 시스템으로서 현재 임상적으로 사용된다. 절반이 친수성이고, 나머지 절반이 소수성인 나노입자는 야누스(Janus) 입자로 명명되며, 에멀젼을 안정화시키는데 특히 효과적이다. 이들은 물/오일 계면에서 자가-어셈블되며, 고체 계면활성제로 작용할 수 있다.
참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제8,709,843호는 조직, 세포, 및 세포내 구획으로의 치료제 함유 입자의 표적화된 전달을 위한 약물 전달 시스템을 제공한다. 상기 발명은 계면활성제, 친수성 중합체 또는 지질에 컨쥬게이트된 중합체를 포함하는 표적화된 입자를 제공한다.
참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제6,007,845호는 다작용성 화합물과 하나 이상의 소수성 중합체 및 하나 이상의 친수성 중합체를 공유적으로 연결시킴으로써 형성된 멀티블록 공중합체의 코어를 갖고, 생물학적으로 활성인 물질을 함유하는 입자를 제공한다.
참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제5,855,913호는 폐기관계로의 약물 전달을 위해 표면상에 계면활성제가 혼입된, 0.4 g/㎤ 미만의 탭 밀도(tap density)와 함께 5 ㎛ 내지 30 ㎛의 평균 직경을 갖는 공기역학적으로 가벼운 입자를 갖는 미립자 조성물을 제공한다.
참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제5,985,309호는 폐기관계로의 전달을 위한 계면활성제 및/또는 양으로 또는 음으로 하전된 치료제 또는 진단제 및 반대 전하로 하전된 분자의 친수성 또는 소수성 복합체가 혼입된 입자를 제공한다.
참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 제5,543,158호는 표면상에 폴리(알킬렌 글리콜) 모이어티 및 생물학적 활성 물질을 함유하는 생분해성 고체 코어를 갖는 생분해성 주사가능한 나노입자를 제공한다.
참조로서 본원에 포함되는 WO2012135025호(US20120251560호로 또한 공개됨)에는 컨쥬게이트된 폴리에틸렌이민(PEI) 중합체 및 컨쥬게이트된 아자-마크로사이클(집합적으로, "컨쥬게이션된 리포머" 또는 "리포머"로 언급됨)이 기재되어 있다. 특정 구현예에서, 그러한 컨쥬게이트된 리포머가 단백질 발현의 변형을 포함하여 유전자 발현을 변형시키기 위한 시험관내, 생체외 및 생체내 게놈 변동을 달성하기 위해 CRISPR-Cas 시스템의 상황에서 이용될 수 있음이 계획될 수 있다.
일 구현예에서, 나노입자는 에폭시드-변형된 지질-중합체, 유리하게는 7C1일 수 있다(예를 들어, 문헌[James E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014) published online 11 May 2014, doi:10.1038/nnano.2014.84] 참조). C71을 14:1의 몰비로 C15 에폭시드-말단 지질과 PEI600을 반응시킴으로써 합성하였고, 적어도 40일 동안 PBS 용액에서 안정적인 나노입자(35 내지 60 nm의 직경)를 생성시키기 위해 C14PEG2000과 함께 제형화하였다.
폐, 심혈관 또는 신장 세포로 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템을 전달하기 위해 에폭시드-변형된 지질-중합체가 이용될 수 있으나, 해당 분야의 숙련자는 다른 표적 기관으로 전달하기 위해 시스템을 적합하게 할 수 있다. 약 0.05 내지 약 0.6 ㎎/㎏ 범위의 투여량이 계획된다. 약 2 ㎎/㎏의 전체 투여량의 수일 또는 수주에 걸친 투여량이 또한 계획된다.
엑소좀
엑소좀은 뇌 및 다른 표적 기관에 RNA를 전달할 수 있는, 단백질 및 RNA를 수송하는 내인성 나노-소낭이다. 면역원성을 감소시키기 위해, Alvarez-Erviti 등(문헌[2011, Nat Biotechnol 29: 341])은 엑소좀 생성을 위해 자가 유래 수지상 세포를 사용하였다. 뉴런 특이적 RVG 펩티드에 융합된 엑소좀 막 단백질인 Lamp2b를 발현하도록 수지상 세포를 조작함으로써 뇌로의 표적화를 달성하였다. 정제된 엑소좀에 전기천공법에 의해 외인성 RNA를 로딩하였다. 정맥내로 주사한 RVG-표적화 엑소좀을 뇌 내의 뉴런, 미세아교세포, 희소돌기신경교에 GAPDH siRNA를 특이적으로 전달하여, 특이적 유전자 낙다운을 초래하였다. RVG 엑소좀에 대한 사전 노출은 낙다운을 약화시키지 않았고, 다른 조직에서의 비특이적 흡수는 관찰되지 않았다. 엑소좀 매개 siRNA 전달의 치료 잠재력은 알츠하이머 질환에서의 치료 표적인 BACE1의 강력한 mRNA(60%) 및 단백질(62%) 낙다운에 의해 입증되었다.
면역학적으로 비활성인 엑소좀의 풀을 얻기 위해, Alvarez-Erviti 등은 상동성 주조직적합성 복합체(MHC) 단상형을 지니는 근친교배 C57BL/6 마우스로부터 골수를 수집하였다. 미성숙 수지상 세포가 MHC-II 및 CD86과 같은 T-세포 활성화제가 없는 다량의 엑소좀을 생성하기 때문에, Alvarez-Erviti 등은 7일 동안 과립구/대식세포-콜로니 자극 인자(GM-CSF)를 지니는 수지상 세포에 대해 선택하였다. 잘 확립된 초원심분리 프로토콜을 사용하여 다음날 배양 상청액으로부터 엑소좀을 정제하였다. 생성된 엑소좀은 물리적으로 균질하였고, 크기 분포는 나노입자 트래킹 분석(NTA) 및 전자 현미경에 의해 결정하여 직경 80 nm에서 최고였다. Alvarez-Erviti 등은 106개 세포당 6 내지 12 ㎍의 엑소좀(단백질 농도를 기준으로 측정)을 얻었다.
다음에, Alvarez-Erviti 등은 나노규모 적용에 적합한 전기천공법 프로토콜을 사용하여 외인성 카고로의 변형된 엑소좀의 로딩 가능성을 조사하였다. 나노미터 규모에서 막 입자에 대한 전기천공법은 제대로 특성화되지 않기 때문에, 비특이적 Cy5-표지 RNA를 전기천공법 프로토콜의 경험적 최적화를 위해 사용하였다. 캡슐화된 RNA의 양을 엑소좀의 초원심분리 및 용해 후에 분석하였다. 400 V 및 125 μF에서의 전기천공법은 RNA의 가장 큰 보유를 초래하였고, 모든 후속 실험에 대해 사용하였다.
Alvarez-Erviti 등은 150 ㎍의 RVG 엑소좀 중에 캡슐화된 150 ㎍의 각각의 BACE1 siRNA를 정상 C57BL/6 마우스에게 투여하고, 낙다운 효율을 4개의 대조군(미처리 마우스, RVG 엑소좀만을 주사한 마우스, 생체내 양이온성 리포좀 시약에 복합체화된 BACE1 siRNA를 주사한 마우스 및 RVG-9R, siRNA에 정전기적으로 결합된 9개의 D-아르기닌에 컨쥬게이트된 RVG 펩티드에 복합체화된 BACE1 siRNA를 주사한 마우스에 대하여 비교하였다. 투여 3일 후 피질 조직 시료를 분석하였고, siRNA-RVG-9R-처리 마우스와 siRNARVG 엑소좀 처리 마우스 둘 다에서 BACE1 mRNA 수준의 상당한 감소(66% [+ 또는 -] 15%, P < 0.001 및 61% [+ 또는 -] 13% 각각, P < 0.01)로부터 초래되는 상당한 단백질 낙다운(45%, P < 0.05, 대 62%, P < 0.01)을 관찰하였다. 게다가, 본 출원인들은 RVG-엑소좀 처리 동물에서 알츠하이머 병증에서의 아밀로이드 플라크의 주요 구성인 총 [베타]-아밀로이드 1 내지 42 수준에서 상당한 감소(55%, P < 0.05)를 입증하였다. 관찰한 감소는 BACE1 저해제의 정맥내 주사 후 정상 마우스에서 입증된 β-아밀로이드 1 내지 40 감소보다 더 컸다. Alvarez-Erviti 등은 BACE1 절단 산물에 대해 cDNA 말단의 5'-신속한 증폭(RACE)을 수행하였는데, 이는 siRNA에 의한 RNAi-매개 낙다운의 증거를 제공하였다.
최종적으로, Alvarez-Erviti 등은 IL-6, IP-10, TNFα 및 IFN-α 혈청 농도를 평가함으로써 RNA-RVG 엑소좀이 생체내 면역 반응을 유발하였는지 여부를 조사하였다. 엑소좀 처리 후에, 모든 사이토카인에서의 중요하지 않은 변화가 IL-6 분비를 잠재적으로 자극한 siRNA-RVG-9R과 대조적으로 siRNA-트랜스펙션 시약 처리와 유사하게 등록되었는데, 이는 엑소좀 처리의 면역학적 비활성 프로파일을 확인시켜준다. 엑소좀이 단지 20%의 siRNA를 캡슐화하는 것을 고려해 볼 때, RVG-엑소좀에 의한 전달은 비슷한 mRNA 낙다운으로서 RVG-9R 전달보다 더 효율적인 것으로 나타나며, 대응하는 면역 자극 수준 없이, 더 큰 단백질 낙다운이 5배 더 적은 siRNA에 의해 달성되었다. 이 실험은 신경변성 질병과 관련된 유전자의 장기간 침묵화에 잠재적으로 적합한 RVG-엑소좀 기법의 치료 잠재력을 입증하였다. Alvarez-Erviti 등의 엑소좀 전달 시스템은 치료 표적, 특히 신경변성 질병에 본 발명의 CRISPR-Cas 시스템을 전달하기 위해 적용될 수 있다. 약 100 내지 1000 ㎎의 RVG 엑소좀에서 캡슐화된 약 100 내지 1000 ㎎의 CRISPR Cas의 투여량은 본 발명을 위해 고려될 수 있다.
El-Andaloussi 등(문헌[Nature Protocols 7,2112-2126(2012)])은 배양 세포로부터 유래된 엑소좀이 시험관내 및 생체내 RNA의 전달을 위해 이용될 수 있는 방법을 개시한다. 이 프로토콜은 펩티드 리간드와 융합된 엑소좀 단백질을 포함하는 발현 벡터의 트랜스펙션을 통한 표적화된 엑소좀의 생성을 처음으로 기재한다. 다음에, El-Andaloussi 등은 트랜스펙션 세포 상청액으로부터 엑소좀을 정제하고 특성화하는 방법을 설명한다. 다음에, El-Andaloussi 등은 RNA를 엑소좀에 로딩하기 위한 결정적인 단계를 상술한다. 최종적으로, El-Andaloussi 등은 마우스 뇌에서 시험관내 및 생체내 RNA를 효율적으로 전달하기 위해 엑소좀을 사용하는 방법을 약술한다. 엑소좀-매개 RNA 전달이 작용성 분석 및 영상에 의해 평가되는 예상된 결과의 예가 또한 제공된다. 전체 프로토콜은 약 3주가 걸린다. 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 자가 유래 수지상 세포로부터 생성된 엑소좀을 사용하여 수행될 수 있다. 본원의 교시로부터, 이것은 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, Wahlgren 등(문헌[Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130])의 혈장 엑소좀이 고려된다. 엑소좀은 수지상 세포(DC), B 세포, T 세포, 비만 세포, 상피 세포 및 종양 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에 의해 생성된 나노 크기 소낭(30 내지 90 nm 크기)이다. 이들 소낭은 후기 엔도솜의 안쪽으로 향하는 출아에 의해 형성되며, 이어서 혈장막과 융합시 세포외 환경으로 방출된다. 엑소좀은 천연적으로 세포 간에 RNA를 운반하기 때문에, 이 특성은 유전자 요법에 유용할 수 있으며, 이러한 개시내용으로부터, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
혈장으로부터의 엑소좀은 20분 동안 900 g에서 버피 코트의 원심분리로 혈장을 단리시킨 다음에 세포 상청액을 수집하고 10분 동안 300 g에서 그리고 30분 동안 16 500 g에서 원심분리하여 세포를 제거한 후 0.22 mm 필터를 통해 여과시킴으로써 제조될 수 있다. 엑소좀을 120 000 g에서 70분 동안 초원심분리에 의해 펠렛화시킨다. siRNA의 엑소좀 내로의 화학적 트랜스펙션을 RNAi 인간/마우스 스타터 키트(Human/Mouse Starter Kit)(독일 힐덴 소재의 퀴아젠(Quiagen))에서 제조업자의 지침서에 따라 수행한다. siRNA를 2 mmol/㎖의 최종 농도로 100 ㎖ PBS에 첨가한다. HiPerFect 트랜스펙션 시약을 첨가한 후에, 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션시킨다. 과량의 미셀을 제거하기 위해, 알데하이드/설페이트 라텍스 비드를 사용하여 엑소좀을 재단리시킨다. 엑소좀 내로의 CRISPR Cas의 화학적 트랜스펙션은 siRNA와 유사하게 수행될 수 있다. 엑소좀은 건강한 공여자의 말초혈액으로부터 단리된 림프구 및 단핵구와 동시배양될 수 있다. 따라서, CRISPR Cas를 함유하는 엑소좀은 인간의 단핵구 및 림프구에 도입될 수도 있고 인간에게 자가 조직으로 재도입될 수도 있는 것이 고려될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 전달 또는 투여는 혈장 엑소좀을 사용하여 수행될 수 있다.
리포좀
본 발명에 따른 전달 또는 투여는 리포좀에 의해 수행될 수 있다. 리포좀은 내부 수성 구획을 둘러싸는 단일 또는 다중 라멜라 지질 이중층 및 상대적으로 불투과성인 외측 친지성 인지질 이중층으로 구성된 구체 소낭 구조이다. 리포좀은 그들이 생체적합성, 비독성이기 때문에 약물 전달 담체로서 상당한 관심을 얻었고, 친수성과 친지성 약물 분자를 둘 다 전달할 수 있으며, 혈장 효소에 의한 분해로부터 그들의 카고를 보호하고, 생물학적 막 및 혈액 뇌 장벽(BBB)을 가로질러 그들의 로드를 수송할 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
리포좀은 몇몇 상이한 유형의 지질로부터 만들어질 수 있지만; 약물 담체로서 리포좀을 생성하는데 인지질이 가장 통상적으로 사용된다. 지질 필름이 수용액과 혼합될 때 리포좀 형성은 자발적이지만, 또한 균질화기, 초음파처리기 또는 압출 장치를 사용하는 것에 의한 진탕 형태로 힘을 적용함으로써 더 신속히 처리될 수 있다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
그들의 구조 및 특성을 변형시키기 위해 몇몇 다른 첨가제가 리포좀에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 콜레스테롤 또는 스핑고미엘린을 리포좀 혼합물에 첨가하여 리포좀 구조를 안정화시키는 데 도움을 주고 리포좀 내부 카고의 누출을 방지할 수 있다. 추가로, 리포좀을 수소화된 난(egg) 포스파티딜콜린 또는 난 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 디세틸 포스페이트로부터 제조하고, 그들의 평균 소낭 크기를 약 50 및 100 nm로 조절하였다. (예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
리포좀 제형은 주로 천연 인지질 및 지질, 예컨대 1,2-디스테아로릴-sn-글리세로-3-포스파티딜 콜린(DSPC), 스핑고미엘린, 난 포스파티딜콜린 및 모노시알로강글리오사이드로 구성될 수 있다. 이 제형은 인지질만으로 구성되기 때문에, 리포좀 제형은 다수의 난제와 마주치는데, 그 중 하나는 혈장 내 불안정성이다. 특이적으로 지질막의 조작에서 이들 난제를 극복하기 위한 몇몇 시도가 이루어졌다. 이들 시도 중 하나는 콜레스테롤의 조작에 집중되어 있다. 통상의 제형으로의 콜레스테롤의 첨가는 캡슐화된 생활성 화합물의 혈장 내로의 신속한 방출을 감소시키거나 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DOPE)은 안정성을 증가시킨다(예를 들어, 검토를 위해 문헌[Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679] 참조).
특히 유리한 구현예에서, 트로이 목마 리포좀(또한 분자 트로이 목마로 알려져 있음)이 바람직하며, 프로토콜은 http://cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.long에서 찾을 수 있다. 이들 입자는 혈관내 주사 후 전체 뇌로의 트랜스유전자의 전달을 가능하게 한다. 제한에 의해 구속되지 않고, 표면에 컨쥬게이트된 특이적 항체를 지니는 중성 지질 입자는 내포작용을 통해 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 것으로 여겨진다. 본 출원인들은 혈관내 주사를 통해 뇌에 뉴클레아제의 CRISPR 과를 전달하기 위해 트로이 목마 리포좀을 이용하는 것을 가정하는데, 이는 배아 조작에 대한 필요 없이 전체 뇌 트랜스제닉 동물을 가능하게 할 것이다. 약 1 내지 5 g의 DNA 또는 RNA가 리포좀 내 생체내 투여를 위해 고려될 수 있다.
다른 구현예에서, CRISPR Cas 시스템은 안정한 핵산 지질 입자(SNALP)와 같은 리포좀에서 투여될 수 있다(예를 들어, 문헌[Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005] 참조). SNALP에서 표적화된 특이적 CRISPR Cas의 약 1, 3 또는 5 ㎎/㎏/일의 매일의 정맥내 주사가 고려된다. 매일의 치료는 약 3일에 걸쳐 이루어질 수 있고, 이어서 약 5주 동안 주마다 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 약 1 또는 2.5 ㎎/㎏의 용량에서 정맥내 주사에 의해 투여되는 특정 CRISPR Cas 캡슐화된 SNALP가 또한 고려된다(예를 들어, 문헌[Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006] 참조). SNALP 제형은 지질 3-N-[(w메톡시폴리(에틸렌 글리콜) 2000) 카바모일]-1,2-디미리스틸옥시-프로필아민(PEG-C-DMA), 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(DLinDMA), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC) 및 콜레스테롤을 2:40:10:48 몰 백분율 비로 함유할 수 있다(예를 들어, 문헌[Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006] 참조).
다른 구현예에서, 안정한 핵산 지질 입자(SNALP)는 고도로 혈관화된 HepG2-유래 간 종양에 대해 효과적인 전달 분자인 것으로 입증되었지만, 불량하게 혈관화된 HCT-116 유래 간 종양에 대해서는 그렇지 않다(예를 들어, 문헌[Li, Gene Therapy (2012) 19, 775-780] 참조). SNALP 리포좀은 25:1의 지질/siRNA 비 및 48/40/10/2 몰비의 콜레스테롤/D-Lin-DMA/DSPC/PEG-C-DMA를 사용하여 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 siRNA로 D-Lin-DMA 및 PEG-C-DMA를 제형화함으로써 제조될 수 있다. 얻어진 SNALP 리포좀은 크기가 약 80 내지 100 nm이다.
또 다른 구현예에서, SNALP는 합성 콜레스테롤(미국 미주리주 세인트루이스 소재의 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)), 디팔미토일포스파티딜콜린(미국 앨라배마주 앨러배스터 소재의 아반티 폴라 리피즈(Avanti Polar Lipids)), 3-N-[(w-메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)카바모일]-1,2-디미레스틸옥시프로필아민, 및 양이온성 1,2-디리놀레일옥시-3-N,N디메틸아미노프로판(예를 들어, 문헌[Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905] 참조)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 볼루스 정맥내 주입으로서 투여되는 용량당 약 2 ㎎/㎏의 총 CRISPR Cas의 투여량이 고려될 수 있다.
또 다른 구현예에서, SNALP는 합성 콜레스테롤(시그마-알드리치), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DSPC; 아반티 폴라 리피즈 인코포레이티드), PEG-cDMA, 및 1,2-디리놀레일옥시-3-(N;N-디메틸)아미노프로판(DLinDMA)(예를 들어, 문헌[Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673 (2009)] 참조)을 포함할 수 있다. 생체내 연구를 위해 사용되는 제형은 약 9:1의 최종 지질/RNA 질량비를 포함할 수 있다.
RNAi 나노의학의 안전성 프로파일은 알닐람 파마슈티컬즈(Alnylam Pharmaceuticals)의 Barros 및 Gollob에 의해 검토되었다(예를 들어, 문헌[Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730-1737] 참조). 안정한 핵산 지질 입자(SNALP)는 4가지 상이한 지질 - 낮은 pH에서 양이온성인 이온화 가능한 지질(DLinDMA), 중성 헬퍼 지질, 콜레스테롤 및 확산성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-지질로 구성된다. 입자는 직경이 대략 80 nm이고, 생리학적 pH에서 중성 전하이다. 제형화 동안, 이온화 가능한 지질은 입자 형성 동안 음이온성 RNA와 지질을 축합하는 작용을 한다. 점점 더 산성인 엔도좀 조건하에 양으로 하전될 때, 이온화 가능한 지질은 또한 RNA의 세포질 내로의 방출을 가능하게 하는 엔도좀 막과 SNALP의 융합을 매개한다. PEG-지질은 입자를 안정화시키고, 제형화 동안 응집을 감소시키며, 후속적으로 외부의 중성 친수성을 제공하며, 이는 약동학적 특성을 개선시킨다.
지금까지, RNA가 있는 SNALP 제형을 사용하여 2가지 임상 프로그램을 개시하였다. 테크미라 파마슈티컬즈는 최근에 상승된 LDL 콜레스테롤을 지니는 성인 지원자에서 SNALP-ApoB의 I상 단일 용량 연구를 완료하였다. ApoB는 간 및 공장에서 대부분 발현되며, VLDL 및 LDL의 어셈블리 및 분비에 필수적이다. 17명의 대상체에 단일 용량의 SNALP-ApoB를 제공하였다(7가지 용량 수준에 걸친 용량 상승). 간 독성의 증거는 없었다(전임상 연구에 기반한 잠재적 용량 제한 독성으로서 예상). 가장 높은 용량에서 (둘 중) 한 명의 대상체는 면역계 자극과 일치되는 감기-유사 증상을 경험하였고, 시험을 끝내는 결정을 하였다.
알닐람 파마슈티컬즈는 상기 기재한 SNALP 기법을 사용하고, TTR 아밀로이드증(ATTR)을 치료하기 위해 돌연변이체와 야생형 TTR 둘 다의 간세포 생성을 표적화하는 유사하게 진보된 ALN-TTR01을 갖는다. 3가지 ATTR 증후군이 기재되었다: 가족성 아밀로이드성 다발신경병증(FAP) 및 가족성 아밀로이드성 심근증(FAC) - 둘 다 TTR에서의 상염색체 우성 돌연변이에 의해 야기됨; 및 야생형 TTR에 의해 야기되는 노인 전신성 아밀로이드증(SSA). ALN-TTR01의 위약 조절, 단일 용량 상승 I상 시험을 ATTR을 지니는 환자에서 최근에 완료하였다. ALN-TTR01을 0.01 내지 1.0 ㎎/㎏(siRNA 기준)의 용량 범위 내에서 31명의 환자(연구 약물에 의한 23명 및 위약에 의한 8명)에 대한 15분 IV 주입으로서 투여하였다. 간 기능 시험에서 유의미한 증가 없이 치료는 잘 용인되었다. 주입 관련 반응은 0.4 ㎎/㎏ 이상에서 23명의 환자 중 3명에서 언급되었고; 모두 주입 속도의 늦춤에 반응하였으며, 모두 연구를 계속하였다. 1 ㎎/㎏의 가장 높은 용량에서 2명의 환자에서 혈청 사이토카인 IL-6, IP-10 및 IL-1ra의 최소 및 일시적 상승이 언급되었다(전임상 및 NHP 연구로부터 예상되는 바와 같음). 혈청 TTR의 저하, ALN-TTR01의 예상된 약동학적 효과가 1 ㎎/㎏에서 관찰되었다.
또 다른 구현예에서, SNALP는 양이온성 지질, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질을 예를 들어, 각각 40:10:40:10의 몰비로, 예를 들어, 에탄올 중에 용해시킴으로써 제조될 수 있다(문헌[Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177] 참조). 지질 혼합물을 혼합하면서, 각각 30%(vol/vol) 및 6.1 ㎎/㎖의 최종 에탄올 및 지질 농도로 수성 완충제(50 mM 시트르산염, pH 4)에 첨가하고, 2분 동안 22℃에서 평형화되게 한 후 압출시켰다. 수화된 지질을 동적 광 산란 분석에 의해 결정된 바와 같은 70 내지 90 nm의 소낭 직경이 수득될 때까지 리펙스 압출기(Lipex Extruder)(노던 리피즈(Northern Lipids))를 사용하여 22℃에서 2층 80 nm 기공 크기 필터(뉴클레오포어(Nuclepore))를 통해 압출하였다. 이는 일반적으로 1 내지 3회의 통과를 필요로 하였다. siRNA(30% 에탄올을 함유하는 50 mM 시트르산염, pH 4 수용액 중에 용해)를 혼합하면서 약 5 ㎖/분의 속도로 사전 평형화된(35℃) 소낭에 첨가하였다. 0.06(wt/wt)의 최종 표적 siRNA/지질 비에 도달한 후, 혼합물을 35℃에서 추가 30분 동안 인큐베이션시켜 소낭 재조직화 및 siRNA의 캡슐화를 가능하게 하였다. 이어서, 에탄올을 제거하고, 투석 또는 접선 유동 정용여과에 의해 외부 완충제를 PBS로 대체하였다(155 mM NaCl, 3 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4, pH 7.5). siRNA를 조절된 계단식 희석 방법 과정을 사용하여 SNALP에서 캡슐화하였다. KC2-SNALP의 지질 성분은 57.1:7.1:34.3:1.4의 몰비로 사용한 DLin-KC2-DMA(양이온성 지질), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC; 아반티 폴라 리피즈), 합성 콜레스테롤(시그마) 및 PEG-C-DMA였다. 로딩된 입자의 형성시에, SNALP를 PBS에 대해 투석하였고, 사용 전 0.2 μm 필터를 통해 멸균 여과시켰다. 평균 입자 크기는 75 내지 85 nm였고, siRNA의 90 내지 95%는 지질 입자 내에서 캡슐화되었다. 생체내 시험을 위해 사용한 제형 내 최종 siRNA/지질 비는 약 0.15(wt/wt)였다. 인자 VII siRNA를 함유하는 LNP-siRNA 시스템을 사용 직전에 멸균 PBS 중에서 적절한 농도로 희석시켰고, 제형을 총 10 ㎖/㎏의 부피로 옆 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 투여하였다. 이러한 방법 및 이들 전달 시스템은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 대해 추론될 수 있다.
기타 지질
기타 양이온성 지질, 예컨대 아미노 지질 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란(DLin-KC2-DMA)은 예를 들어, siRNA와 유사한 CRISPR Cas 또는 그의 성분 또는 그를 코딩하는 핵산 분자(들)를 캡슐화하기 위해 이용될 수 있으며(예를 들어, 문헌[Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529 - 8533] 참조), 이런 이유로, 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 다음의 지질 조성물이 있는 사전 형성된 소낭이 고려될 수 있다: 대략 0.05(w/w)의 FVII siRNA/총 지질 비 및 각각 40/10/40/10의 몰비의 아미노 지질, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 콜레스테롤 및 (R)-2,3-비스(옥타데실옥시) 프로필-1-(메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)2000)프로필카바메이트(PEG-지질). 70 내지 90 nm의 범위의 좁은 입자 크기 분포 및 낮은 다분산지수 0.11±0.04(n=56)를 보장하기 위해, 입자를 CRISPR Cas RNA를 첨가하기 전에 80 nm 막을 통해 3회까지 압출시킬 수 있다. 매우 강력한 아미노 지질 16을 함유하는 입자가 사용될 수 있으며, 여기서, 4가지 지질 성분, 16, DSPC, 콜레스테롤 및 PEG-지질의 몰비(50/10/38.5/1.5)는 생체내 활성을 증진시키도록 추가로 최적화될 수 있다.
Michael S D Kormann 등(문헌["Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice: Nature Biotechnology, Volume:29, Pages: 154-157 (2011)])은 RNA를 전달하기 위한 지질 외피의 사용을 기재한다. 지질 외피의 사용은 또한 본 발명에서 바람직하다.
다른 구현예에서, 지질은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템과 함께 제형화되어 지질 나노입자(LNP)를 형성할 수 있다. 지질은 DLin-KC2-DMA4, C12-200 및 공지질 디스테로일포스파티딜 콜린, 콜레스테롤 및 PEG-DMG를 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 자발적 소낭 형성 절차를 사용하여 siRNA 대신 CRISPR Cas를 이용하여 제형화될 수 있다(예를 들어, 문헌[Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3] 참조). 성분 몰비는 약 50/10/38.5/1.5(DLin-KC2-DMA 또는 C12-200/디스테로일포스파티딜 콜린/콜레스테롤/PEG-DMG)일 수 있다. 최종 지질:siRNA 중량비는 DLin-KC2-DMA 및 C12-200 지질 나노입자(LNP)의 경우에 각각 약 12:1 및 9:1일 수 있다. 제형은 90% 초과의 포획 효율을 지니는 약 80 nm의 평균 입자 직경을 가질 수 있다. 3 ㎎/㎏ 용량이 고려될 수 있다.
테크미라는 LNP 및 LNP 제형의 다양한 양태와 관련된 미국 및 해외에서의 대략 95개의 특허 패밀리의 포트폴리오를 가지며(예를 들어, 미국 특허 제7,982,027호; 제7,799,565호; 제8,058,069호; 제8,283,333호; 제7,901,708호; 제7,745,651호; 제7,803,397호; 제8,101,741호; 제8,188,263호; 제7,915,399호; 제8,236,943호 및 제7,838,658호 및 유럽 특허 제1766035호; 제1519714호; 제1781593호 및 제1664316호 참조), 이들 모두는 본 발명에 대해 사용되고/사용되거나 적합하게 될 수 있다.
CRISPR Cas 시스템 또는 그의 성분 또는 그를 코딩하는 핵산 분자(들)는 단백질, 단백질 전구체, 또는 단백질 또는 단백질 전구체의 부분적으로 또는 완전히 가공된 형태를 인코딩할 수 있는 변형된 핵산 분자를 포함하는 조성물의 제형의 양태에 관한 미국 출원 공개 제20130252281호 및 제20130245107호 및 제20130244279호(모데르나 테라퓨틱스(Moderna Therapeutics) 출원)에서 추가로 기재된 것과 같은 PLGA 미소구체에서 캡슐화되어 전달될 수 있다. 제형은 몰비 50:10:38.5:1.5-3.0(양이온성 지질:융합생성 지질:콜레스테롤:PEG 지질)을 가질 수 있다. PEG 지질은 PEG-c-DOMG, PEG-DMG로부터 선택될 수 있지만, 이들로 제한되지 않는다. 융합생성 지질은 DSPC일 수 있다. 또한, Schrum 등의 미국 출원 공개 제20120251618호(Delivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids)를 참조한다.
나노머 기술은 저분자량 소수성 약물, 펩티드 및 핵산 기반 치료제(플라스미드, siRNA, miRNA)를 포함하는 광범위한 치료제에 대한 생체이용성 난제를 다룬다. 기술이 명확한 이점을 입증한 특정 투여 경로는 경구 경로, 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 수송, 고형 종양으로의 전달뿐만 아니라 눈으로의 전달을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2):1016-26]; 문헌[Uchegbu and Siew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10] 및 문헌[Lalatsa et al., 2012, J Control Release. 2012 Jul 20;161(2):523-36]을 참조한다.
미국 특허 공개 제20050019923호는 생활성 분자, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 분자, 펩티드 및 폴리펩티드 및/또는 약제학적 작용제를 포유류 신체에 전달하기 위한 양이온성 덴드리머를 기재한다. 덴드리머는, 예를 들어 간, 비장, 폐, 신장 또는 심장(또는 심지어 뇌)으로의 생활성 분자의 전달을 표적화하는데 적합하다. 덴드리머는 단순한 분지형 단량체 단위로부터 단계적 방식으로 제조된 합성 3-차원 거대분자이며, 그의 특성 및 작용성은 용이하게 조절되고 달라질 수 있다. 덴드리머는 다작용성 코어에 대한(합성에 대한 확산적 접근), 또는 다작용성 코어를 향한(합성에 대한 수렴적 접근) 빌딩 블록의 반복된 부가로부터 합성되고, 빌딩 블록의 3차원 쉘의 각각의 첨가는 덴드리머의 더 고차 세대의 형성을 야기한다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 디아미노부탄 코어로부터 출발하며, 이것에 일차 아민으로의 아크릴로니트릴의 이중 마이클 첨가(Michael addition)에 의해 아미노기 수의 2배가 부가된 후, 니트릴이 수소화된다. 이는 아미노기의 배가를 초래한다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 100% 양성자화 가능한 질소 및 최대 64개의 말단 아미노기를 함유한다(5세대, DAB 64). 양성자화 가능한 기는 보통 중성 pH에서 양성자를 수용할 수 있는 아민기이다. 유전자 전달제로서 덴드리머의 용도는 컨쥬게이팅 단위로서 각각 아민/아미드 또는 N--P(O2)S의 혼합물과 함께 폴리아미도아민 및 인 함유 화합물의 용도에 크게 집중되어 있는데 유전자 전달을 위한 더 낮은 세대 폴리프로필렌이민 덴드리머의 용도에 대해 보고한 연구는 없었다. 폴리프로필렌이민 덴드리머는 또한 주위 아미노기에 의해 화학적으로 변형될 때 약물 전달을 위해 그리고 게스트 분자의 캡슐화를 위해 pH 감수성 조절 방출 시스템으로서 연구되었다. 세포독성 및 DNA와 폴리프로필렌이민 덴드리머의 상호작용뿐만 아니라 DAB 64의 트랜스펙션 효능이 또한 연구되었다.
미국 특허 공개 제20050019923호는 이전의 보고와 상반되게 양이온성 덴드리머, 예컨대 폴리프로필렌이민 덴드리머가 유전물질과 같은 생활성 분자의 표적화된 전달에서 사용하기 위한 적합한 특성, 예컨대 특이적 표적화 및 낮은 독성을 나타낸다는 관찰에 기반한다. 추가로, 양이온성 덴드리머의 유도체는 또한 생활성 분자의 표적화된 전달을 위한 적합한 특성을 나타낸다. 또한, 미국 출원 공개 제20080267903호의 생활성 중합체를 참조하며, 이는 "양이온성 폴리아민 중합체 및 덴드리머 중합체를 포함하는 다양한 중합체가 항증식 활성을 갖는 것으로 나타나며, 따라서 신생물 및 종양과 같은 바람직하지 않은 세포 증식을 특징으로 하는 장애, 염증 장애(자가면역 장애를 포함), 건선 및 아테롬성 동맥경화증의 치료에 유용할 수 있음을 개시한다. 중합체는 단독으로 활성제로서 또는 다른 치료제, 예를 들어, 약물 분자 또는 유전자 전달을 위한 핵산을 위한 전달 비히클로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 중합체 자체의 고유 항종양 활성은 전달될 작용제의 활성을 보완할 수 있다". 이들 특허 간행물의 개시내용은 CRISPR Cas 시스템(들) 또는 그의 성분(들) 또는 그를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달을 위한 본 발명의 교시와 함께 사용될 수 있다.
초하전 (Supercharged) 단백질
초하전 단백질은 대단히 높은 양 또는 음의 이론적 순전하를 지니는 조작된 또는 천연적으로 발생하는 단백질의 부류이며, CRISPR Cas 시스템(들) 또는 그의 성분(들) 또는 그를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달에 사용될 수 있다. 초음성으로 하전된 단백질과 초양성으로 하전된 단백질은 둘 다 열적으로 또는 화학적으로 유도된 응집을 견뎌내는 현저한 능력을 나타낸다. 초양성으로 하전된 단백질은 또한 포유류 세포를 침투할 수 있다. 카고와 이들 단백질, 예를 들어, 플라스미드 DNA, RNA 또는 다른 단백질의 회합은 시험관내와 생체내 둘 다에서 포유류 세포 내로 이들 거대분자의 작용성 전달을 가능하게 할 수 있다. David Liu 연구소는 2007년에 초하전 단백질의 생성 및 특성화를 보고하였다(문헌[Lawrence et al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112]).
포유류 세포 내로의 RNA 및 플라스미드 DNA의 비바이러스 전달은 연구와 치료 응용 둘 다에 대해 가치있다(문헌[Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561-569]). 정제된 +36 GFP 단백질(또는 다른 초양성으로 하전된 단백질)은 적절한 무혈청 배지에서 RNA와 혼합되고, 세포에 첨가 전 복합체화되게 한다. 이 단계에서 혈청의 포함은 초하전 단백질-RNA 복합체의 형성을 저해하고, 치료 효능을 감소시킨다. 다음의 프로토콜은 다양한 세포주에 대해 효과적이 되는 것으로 관찰되었다(문헌[McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116]). 그러나, 단백질 및 RNA의 용량을 변화시키는 파일럿 실험은 특정 세포주에 대하여 절차를 최적화하도록 수행되어야 한다.
(1) 치료 하루 전, 48-웰 플레이트에서 웰당 1 × 105개 세포를 플레이팅.
(2) 치료일에, 최종 농도 200 nM로 무혈청 배지에서 정제된 +36 GFP 단백질을 희석시킴. RNA를 50 nM의 최종 농도로 첨가함. 와류시켜 혼합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션시킴.
(3) 인큐베이션 동안, 세포로부터 배지를 흡입하고, PBS로 1회 세척함.
(4) +36 GFP 및 RNA의 인큐베이션 후에, 단백질-RNA 복합체를 세포에 첨가함.
(5) 37℃에서 4시간 동안 복합체와 세포를 인큐베이션시킴.
(6) 인큐베이션 후에, 배지를 흡입하고, 20 U/㎖ 헤파린 PBS로 3회 세척. 활성에 대한 검정에 따라 추가 48시간 또는 그 이상 동안 혈청-함유 배지와 세포를 인큐베이션시킴.
(7) 세포를 면역블롯, qPCR, 표현형 분석 또는 다른 적절한 방법에 의해 분석함.
David Liu 연구소는 다양한 세포에서 +36 GFP가 효과적인 플라스미드 전달 시약인 것으로 추가로 발견하였다. 플라스미드 DNA는 siRNA보다 더 큰 카고이기 때문에, 비례하여 더 많은 +36 GFP 단백질이 효과적으로 플라스미드와 복합체화하는데 필요로 한다. 효과적인 플라스미드 전달을 위해, 본 출원인들은 인플루엔자 바이러스 혈구응집소 단백질로부터 유래된 공지된 엔도좀 파괴 펩티드인 C-말단의 HA2 펩티드 태그를 보유하는 +36 GFP의 변이체를 개발하였다. 다음의 프로토콜은 다양한 세포에서 효과적이었지만, 상기와 같이 플라스미드 DNA 및 초하전 단백질 용량이 특정 세포주 및 전달 응용분야를 위해 최적화되는 것이 권고된다.
(1) 치료 하루 전, 48-웰 플레이트에서 1 × 105개/웰을 플레이팅.
(2) 치료일에, 최종 농도 2 mM로 무혈청 배지에서 정제된 þ36 GFP 단백질을 희석시킴. 1 ㎎의 플라스미드 DNA를 첨가. 와류시켜 혼합하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션시킴.
(3) 인큐베이션 동안, 세포로부터 배지를 흡입하고, PBS로 1회 세척함.
(4) þ36 GFP 및 플라스미드 DNA의 인큐베이션 후에, 단백질-DNA 복합체를 세포에 온건하게 첨가함.
(5) 37℃에서 4시간 동안 복합체와 세포를 인큐베이션시킴.
(6) 인큐베이션 후에, 배지를 흡입하고, PBS로 세척. 혈청-함유 배지에서 세포를 인큐베이션시키고 추가 24 내지 48시간 동안 인큐베이션시킴.
(7) 적절하다면 (예를 들어, 플라스미드-유도 유전자 발현에 의해) 플라스미드 전달을 분석함.
또한, 예를 들어, 문헌[McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009)]; 문헌[Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010)]; 문헌[Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011)]; 문헌[Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012)]; 문헌[Thompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012)]을 참조한다. 초하전된 단백질의 방법은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템의 전달을 위해 사용되고/거나 그를 위해 적합하게 될 수 있다. Lui 박사 및 본원의 교시와 함께 본원의 문헌의 이들 시스템은 CRISPR Cas 시스템(들) 또는 그의 성분(들) 또는 그를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달에 사용될 수 있다.
이식 가능한 장치
다른 구현예에서, CRISPR Cas 시스템 또는 그의 성분(들) 또는 그를 코딩하는 핵산 분자(들)의 전달을 위해 이식 가능한 장치가 또한 고려된다. 예를 들어, 미국 특허 공개 제20110195123호는 국소적으로 그리고 연장된 기간 동안 약물을 용리하는 이식 가능한 의료 장치를 개시하며, 이러한 장치의 몇가지 유형, 실행의 처리 방식 및 이식 방법을 포함하여 제공된다. 장치는 중합체 기질, 예를 들어 장치 몸체로서 사용되는 매트릭스, 및 약물, 및 일부 경우에 추가적인 스캐폴딩 재료, 예컨대 금속 또는 추가적인 중합체, 및 가시성 및 영상화를 향상시키는 재료를 포함한다. 이식 가능한 전달 장치는 국소적인, 그리고 연장된 기간에 걸친 방출을 제공하는데 유리할 수 있으며, 여기서, 약물은 예를 들어, 종양, 염증, 변성과 같은 병에 걸린 영역의 세포외 매트릭스(ECM)로 직접 방출되고, 증상 목표를 위해, 또는 손상된 평활근 세포에 또는 예방을 위해 방출된다. 한 종류의 약물은 상기 개시된 바와 같은 RNA이며, 이러한 시스템은 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다. 일부 구현예에서 이식 방식은 근접 요법 및 바늘 생검을 포함하는 다른 치료를 위해 오늘날 개발되고 사용되는 기존의 이식 절차이다. 이러한 경우에, 본 발명에서 기재된 새로운 이식물의 치수는 본래의 이식물과 유사하다. 전형적으로 소수의 장치는 동일한 치료 절차 동안 이식된다.
미국 특허 공개 제20110195123호에 기재되어 있는 바와 같이, 복강과 같은 강에 적용 가능한 시스템을 포함하는 약물 전달 이식 가능한 또는 삽입 가능한 시스템 및/또는 임의의 다른 유형의 투여가 제공되며, 여기서, 예를 들어 임의로 매트릭스일 수 있는 생체안정성 및/또는 분해가능한 및/또는 생체흡수성 중합체성 기질을 포함하는 약물 전달 시스템은 고정 또는 부착되지 않는다. 용어 "삽입"은 또한 이식을 포함하는 것으로 언급되어야 한다. 약물 전달 시스템은 바람직하게는 미국 특허 공개 제20110195123호에 기재되어 있는 바와 같은 "로더(Loder)"로서 실행된다.
중합체 또는 복수의 중합체는 생체적합성이며, 조절된 속도로 작용제를 방출시킬 수 있는 작용제 및/또는 복수의 작용제를 혼입하며, 중합체성 기질, 예컨대 일부 구현예에서 매트릭스의 총 부피는, 임의로 및 바람직하게는 작용제의 치료 수준이 도달되게 하는 최대 부피 이하이다. 비제한적 예로서, 이러한 부피는 작용제 로드를 위한 부피에 의해 필요한 바와 같은 바람직하게는 0.1 ㎥ 내지 1000 ㎣ 범위 내에 있다. 로더는, 예를 들어 크기가 작용성에 의해 결정되는 장치, 예를 들어 제한 없이, 무릎 관절, 자궁내 또는 자궁경부 링 등과 함께 혼입될 때, 임의로 더 클 수 있다.
(조성물을 전달하기 위한) 약물 전달 시스템은 바람직하게는 일부 구현예에서 분해성 중합체를 사용하도록 설계되거나(주요 방출 메카니즘은 벌크 침식(bulk erosion)임); 또는 일부 구현예에서, 비분해성 또는 서서히 분해되는 중합체가 사용되며(주요 방출 메카니즘은 벌크 침식보다는 확산임), 따라서 외부는 막으로서 기능하고, 내부는 약물 저장소로서 기능하는데, 이는 연장된 기간(예를 들어 약 1주 내지 약 수개월) 동안 주변에 의해 실제로 영향받지 않는다. 상이한 방출 메카니즘을 지니는 상이한 중합체의 조합이 또한 임의로 사용될 수 있다. 표면에서 농도 기울기는 바람직하게는 총 약물 방출 기간의 상당한 기간 동안 효과적으로 일정하게 유지되고, 따라서 확산 속도는 효과적으로 일정하다("제로 방식" 확신으로 지칭됨). 용어 "일정한"은 더 낮은 치료적 유효성의 역치 초과로 바람직하게 유지되지만, 여전히 임의로 초기 버스트를 특징으로 하고/하거나 변동하는, 예를 들어 특정 정도로 증가 및 감소할 수 있는 확산 속도를 의미한다. 확산 속도는 바람직하게는 연장된 기간 동안 이렇게 유지되며, 치료적으로 효과적인 기간, 예를 들어 효과적인 침묵화 기간을 최적화하기 위해 특정 수준으로 일정한 것으로 고려될 수 있다.
약물 전달 시스템은 임의로 및 바람직하게는 성질이 화학물질이든 대상체의 체내의 효소 및 다른 인자로부터의 공격에 기인하든, 분해로부터 뉴클레오티드 기반 치료제를 보호하도록 설계된다.
미국 특허 공개 제20110195123호에 기재된 바와 같은 약물 전달 시스템은 장치의 이식 시 및/또는 이식 후에, 활성화 및/또는 가속화/감속화의 비침습적 및/또는 최소 침습적 방법에 의해 작동되는 감지 및/또는 활성화 기기와 임의로 연동되며, 예를 들어 임의로 제한되는 것은 아니지만, 열적인 가열 및 냉각, 레이저 빔 및 집속 초음파를 포함하는 초음파 및/또는 RF(무선주파수) 방법 또는 장치를 포함한다.
미국 특허 공개 제20110195123호의 일부 구현예에 따르면, 국소 전달을 위한 부위는 임의로 종양을 포함하는 세포의 고도 비정상 증식, 및 억제된 세포자멸사, 자가면역질환 상태를 포함하는 활성 및 또는 만성 염증 및 감염, 근육 및 신경 조직을 포함하는 변성 조직, 만성 통증, 변성 부위, 및 뼈 골절 위치 및 조직 재생의 향상을 위한 다른 상처 위치, 및 손상된 심근, 평활근 및 횡문근을 특징으로 하는 표적 부위를 포함할 수 있다.
조성물의 이식을 위한 부위, 또는 표적 부위는 바람직하게는 표적화된 국소 전달에 충분히 작은 반경, 면적 및/또는 부피를 특징으로 한다. 예를 들어, 표적 부위는 임의로 약 0.1 ㎜ 내지 약 5 ㎝ 범위의 직경을 가진다.
표적 부위의 위치는 바람직하게는 최대 치료 효능에 대해 선택된다. 예를 들어, 약물 전달 시스템의 조성물(임의로 상기 기재한 바와 같은 이식을 위한 장치와 함께)은 임의로 및 바람직하게는 종양 환경 또는 이들의 관련된 혈액 공급 내에서 또는 이에 근접하여 이식된다.
예를 들어 조성물은 (임의로 장치와 함께) 임의로 췌장, 전립선, 유방, 간 내에 또는 그에 근접하여, 니플을 통해, 혈관계 내 등에 이식된다.
표적 위치는 (임의로 체내의 임의의 부위가 로더를 이식하는데 적합할 수 있기 때문에 단지 비제한적 예로서): 1. 기저핵, 백질 및 회백질에서 파킨슨병 또는 알츠하이머병에서와 같은 변성 부위의 뇌; 2. 근위축성 측삭경화증(ALS)의 경우에서와 같은 척추; 3. HPV 감염을 예방하기 위한 자궁경부; 4. 활성 및 만성 염증 관절; 5. 건선의 경우에서와 같은 진피; 6. 진통 효과를 위한 교감 및 감각 신경 부위; 7. 골내이식; 8. 급성 및 만성 감염 부위; 9. 질내; 10. 내이--청각기관, 내이의 미로, 전정계; 11. 기관내; 12. 심장내; 관상동맥, 심외막; 13. 방광; 14. 담도계; 15. 신장, 간, 비장을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 실질세포; 16. 림프절; 17. 침샘; 18. 치과용 수지; 19. 관절내(관절 내로); 20. 안내; 21. 뇌조직; 22. 뇌실; 23. 복강을 포함하는 강(예를 들어, 제한되는 것은 아니지만, 난소암); 24. 식도내 및 25. 직장내로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된다.
임의로 시스템의 삽입(예를 들어, 조성물을 함유하는 장치)는 표적 부위의 및 이러한 부위 부근의, 국소 pH 및/또는 온도 및/또는 ECM 내 약물의 확산 및/또는 약물 역학에 영향을 미치는 다른 생물학적 인자에 영향을 미치도록 하는 표적 부위 및 해당 부위 부근에서 ECM에 대한 물질의 주사와 연관된다.
임의로, 일부 구현예에 따르면, 상기 작용제의 방출은 삽입 전 및/또는 삽입 시 및/또는 삽입 후, 레이저빔, 조사, 열적 가열 및 냉각, 집속 초음파를 포함하는 초음파 및/또는 RF(무선주파수) 방법 또는 장치 및 화학적 활성화제를 포함하는 활성화 및/또는 가속화/감속화의 비침습적 및/또는 최소 침습적 및/또는 그 밖의 방법에 의해 작동되는 감지 및/또는 활성화 기기와 연관될 수 있었다.
미국 특허 공개 제20110195123호의 다른 구현예에 따르면, 약물은 바람직하게는, 예를 들어 이하에 기재되는 바와 같이 유방, 췌장, 뇌, 신장, 방광, 폐 및 전립선에서 국소화된 암 경우를 위한 RNA를 포함한다. RNAi로 예시되지만, 약물이 로더 기질, 예컨대 매트릭스와 함께 캡슐화될 수 있는 한, 다수 약물이 로더에서 캡슐화되어 적용 가능한 것으로 본 발명과 함께 사용될 수 있으며, 이러한 시스템이 본 발명의 CRISPR Cas 시스템을 전달하는데 사용되고/거나 그에 적합하게 될 수 있다.
구체적 응용의 다른 예로서, 신경 및 근육 변성 질병은 비정상 유전자 발현에 기인하여 발생한다. RNA의 국소 전달은 이러한 비정상 유전자 발현을 방해하는 치료적 특성을 가질 수 있다. 작은 약물 및 거대분자를 포함하는 세포자멸사방지, 염증방지 및 변성방지 약물의 국소 전달은 또한 임의로 치료적일 수 있다. 이러한 경우에, 로더는 일정한 속도로 및/또는 별도로 이식되는 전용 장치를 통해 연장된 방출을 위해 적용된다. 이것 모두는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다.
구체적 응용의 또 다른 예로서, 정신과적 및 인지 장애가 유전자 변형자를 이용하여 치료된다. 유전자 낙다운은 치료적 선택사항이다. 중추 신경계 부위에 작용제를 국소적으로 전달하는 로더는 정신병, 양극성 질병, 신경성 장애 및 행동 병폐를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 정신과적 및 인지 장애에 대한 치료적 선택사항이다. 로더는 또한 특정 뇌 부위에 이식시 작은 약물 및 거대분자를 포함하는 약물을 국소적으로 전달할 수 있었다. 이것 모두는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다.
구체적 응용의 다른 예로서, 국소 부위에서 선천성 및/또는 적응성 면역 매개체의 침묵화는 기관 이식 거부를 예방할 수 있다. 이식된 기관 및/또는 이식된 부위에 이식된 로더를 사용한 RNA 및 면역조절 시약의 국소 전달은 이식 기관에 대해 활성화된 CD8과 같은 면역 세포를 퇴치함으로써 국소 면역 억제를 제공한다. 이것 모두는 본 발명의 CRISPR Cas 시스템에 사용될 수 있고/있거나 적합하게 될 수 있다.
구체적 응용의 다른 예로서, VEGF 및 안지오제닌 등을 포함하는 혈관 성장 인자는 신혈관형성에 필수적이다. 인자, 펩티드, 펩티드모방체의 국소 전달 또는 그들의 억제제의 억제는 중요한 치료적 양식이며; 억제제의 침묵화 및 로더를 사용한 혈관형성을 자극하는 인자, 펩티드, 거대분자 및 작은 약물의 국소 전달은 말초, 전신 및 심혈관 질병에 대하여 치료적이다.
이식과 같은 삽입 방법은 임의로 다른 유형의 조직 이식을 위해 및/또는 삽입을 위해 및/또는 조직 시료추출을 위해 임의로 변형 없이 또는 대안적으로 임의로 이러한 방법에서 주요하지 않은 변형만을 사용하여 이전에 사용될 수 있다. 이러한 방법은 임의로 근접치료 방법, 생검, 초음파와 함께 및/또는 초음파 없이 내시경, 예컨대 ERCP, 뇌 조직 내로의 정위적 방법, 관절, 복부 기관, 방광벽 및 체강 내로의 복강경의 이식을 포함하는 복강경검사를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
환자-특이적 스크리닝 방법
뉴클레오티드, 예를 들어, 트리뉴클레오티드 반복부를 표적으로 하는 CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 그러한 반복부의 존재에 대하여 환자 또는 환자 시료를 스크리닝할 수 있다. 반복부는 CRISPR-Cas 시스템의 RNA의 표적일 수 있으며, CRISPR-Cas 시스템에 의한 그로의 결합이 존재한다면, 결합을 검출하여, 그러한 반복부가 존재하는 것을 나타낼 수 있다. 따라서, CRISPR-Cas 시스템을 사용하여 환자 또는 환자 시료를 반복부의 존재에 대하여 스크리닝할 수 있다. 그 다음, 환자에게 질환을 다루기 위한 적합한 화합물(들)을 투여할 수 있거나; 또는 그에 결합하고 삽입, 결실 또는 돌연변이를 야기하고, 질환을 완화시키는 CRISPR-Cas 시스템을 투여할 수 있다.
핵산, 아미노산 및 단백질, 조적 서열, 벡터 등
핵산, 아미노산 및 단백질: 본 발명은 표적 DNA 서열과 결합할 수 있는 핵산을 사용한다. 이것은 핵산이 단백질보다 생산하기 훨씬 더 용이하고 저렴하며, 상동성이 추구되는 스트레치의 길이에 따라 특이성이 변화될 수 있기 때문에 유익하다. 예를 들어, 다중 핑거의 복합체 3-D 배치는 필요하지 않다. 용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환 가능하게 사용된다. 그것들은 임의의 길이의 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중 어느 하나, 또는 그의 유사체의 중합체 형태를 말한다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 3차원 구조를 가질 수 있으며, 기지의 또는 미지의 임의의 기능을 수행할 수 있다. 다음은 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연관 분석으로부터 정의된 유전자좌들(유전자좌), 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 분리된 DNA, 임의의 서열의 분리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 또한, 상기 용어는 합성 백본이 있는 핵산-유사 구조를 포함하며, 예를 들어, 문헌[Eckstein, 1991]; 문헌[Baserga et al., 1992]; 문헌[Milligan, 1993]; WO 97/03211호; WO 96/39154호; 문헌[Mata, 1997]; 문헌[Strauss-Soukup, 1997]; 및 문헌[Samstag, 1996]을 참조한다. 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어, 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재한다면, 중합체의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비뉴클레오티드 성분에 의해 단속될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 중합 후에, 예를 들어, 표지화 성분과의 컨쥬게이션에 의해 추가로 변형될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "야생형"은 해당 분야의 숙련자에 의해 이해되는 해당 분야의 용어이며, 그것이 돌연변이체 또는 변이체로부터 구별되는 정도로 천연에서 발생하는 것과 같은 전형적인 형태의 유기체, 균주, 유전자 또는 특징을 의미한다. "야생형"은 기준선일 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "변이체"는 천연에서 발생하는 것에서 벗어난 패턴을 갖는 특질의 표현을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "비-천연 발생" 또는 "조작된"은 상호교환 가능하게 사용되며, 인간의 손의 개입을 나타낸다. 상기 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 대하여 언급되는 경우, 핵산 분자 또는 폴리펩티드에 그들이 천연에서 천연적으로 회합되어 있고, 천연에서 관찰되는 적어도 하나의 다른 성분이 적어도 실질적으로 없음을 의미한다. "상보성"은 통상의 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성 또는 기타 비-통상적 유형에 의해 다른 핵산 서열과 수소 결합(들)을 형성하는 핵산의 능력을 지칭한다. 상보성 백분율은 제2 핵산 서열과 수소 결합(예를 들어, 왓슨-크릭 염기 쌍형성)을 형성할 수 있는 핵산 분자 내의 잔기의 백분율을 나타낸다(예를 들어, 10개 중 5, 6, 7, 8, 9, 10개는 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 상보성임). "완전한 상보성"은 핵산 서열의 모든 연속 잔기가 동일한 수의 제2 핵산 서열 내의 연속 잔기와 수소 결합할 것임을 의미한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "실질적인 상보성"은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50개 이상의 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100%인 상보성 정도를 지칭하거나, 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 2개의 핵산을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 표적 서열에 대하여 상보성을 갖는 핵산 서열이 대개 표적 서열과 혼성화하며, 비-표적 서열에는 실질적으로 혼성화하지 않는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 일반적으로 서열-의존적이며, 다수의 요인에 따라 달라진다. 일반적으로, 서열이 길수록, 서열이 그의 표적 서열에 특이적으로 혼성화하는 온도가 더 높아진다. 엄격한 조건의 비제한적인 예는 문헌[Tijssen (1993), Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I, Second Chapter "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay", Elsevier, N.Y.]에 상세히 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드 서열이 언급될 때, 상보성 또는 부분 상보성 서열도 생각된다. 이들은 바람직하게 높은 엄격성 조건하에 기준 서열에 혼성화할 수 있다. 일반적으로, 혼성화 비율을 최대화하기 위해서, 상대적으로 낮은 엄격성 혼성화 조건이 선택된다: 열 융점(Tm)보다 약 20 내지 25℃ 낮은 온도. Tm은 특정 표적 서열의 50%가 규정된 이온 세기와 pH에서 용액 중에서 완전히 상보성인 프로브와 혼성화하는 온도이다. 일반적으로, 혼성화된 서열의 적어도 약 85% 뉴클레오티드 상보성을 요구하기 위해서, 높은 엄격성 세척 조건은 Tm보다 약 5 내지 15℃ 낮도록 선택된다. 혼성화된 서열의 적어도 약 70% 뉴클레오티드 상보성을 요구하기 위해서, 중등의 엄격성 세척 조건은 Tm보다 약 15 내지 30℃ 낮도록 선택된다. 아주 관대한(매우 낮은 엄격성) 세척 조건은 Tm보다 50℃ 정도 낮을 수 있으며, 이것은 혼성화된 서열들 간에 높은 수준의 미스매칭을 허용한다. 해당 분야의 숙련자는 표적 서열과 프로브 서열 간 상동성의 특정 수준으로부터 검출 가능한 혼성화 신호의 결과에 영향을 미치기 위해서 혼성화 및 세척 단계에서 다른 물리화학적 변수들도 변경될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 바람직한 높은 엄격성 조건은 42℃에서 50% 포름아미드, 5×SSC, 및 1% SDS 인큐베이션, 또는 65℃에서 5×SSC 및 1% SDS 인큐베이션과 65℃에서 0.2×SSC 및 0.1% SDS 세척을 포함한다. "혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드가 반응하여, 복합체를 형성하고, 이 복합체는 뉴클레오티드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭 염기 쌍형성, 후그스타인(Hoogstein) 결합 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생할 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 2개의 가닥, 다중 가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일의 자가 혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 PCR의 개시 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오티드의 절단과 같은 보다 광범위한 과정에서 하나의 단계를 이룰 수 있다. 주어진 서열과 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "상보물"로 지칭된다. 본원에서 사용된 용어 "게놈 유전자좌" 또는 "유전자좌"(복수의 유전자좌)는 염색체에서 유전자 또는 DNA 서열의 특정 위치이다. "유전자"는 유기체에서 활동하는 기능적 역할을 가진 RNA 사슬 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 또는 RNA의 스트레치로서, 이에 따라, 살아있는 유기체에서 유전의 분자 단위를 말한다. 본 발명의 목적을 위해서, 유전자는 이러한 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하든 아니든 유전자 산물의 생성을 조절하는 영역을 포함하는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 유전자는 프로모터 서열, 종결자, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 번역 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 원점, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 조절 영역을 포함한다. 본원에서 사용된 "게놈 유전자좌의 발현" 또는 "유전자 발현"은 유전자로부터의 정보가 기능적 유전자 산물의 합성에서 사용되는 과정이다. 유전자 발현의 산물은 주로 단백질이지만, rRNA 유전자 또는 tRNA 유전자와 같은 비-단백질 코딩 유전자에서는 이 산물은 기능적 RNA이다. 유전자 발현 과정은 생존을 위한 기능적 산물들을 생성하기 위해서 모든 알려진 생명체, 즉 진핵생물(다세포 유기체 포함), 원핵생물(박테리아 및 고세균) 및 바이러스에 의해서 사용된다. 본원에서 사용된 유전자 또는 핵산의 "발현"은 세포 유전자 발현뿐만 아니라 클로닝 시스템 및 임의의 다른 맥락에서 핵산(들)의 전사 및 번역을 포괄한다. 본원에서 사용된 "발현"은 또한 폴리뉴클레오티드가 DNA 주형으로부터 (예컨대 mRNA 또는 다른 RNA 전사물로) 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA가 이어서 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 말한다. 전사물 및 암호화된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 산물"이라고 언급될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래된다면, 발현은 진핵 세포에서 mRNA의 스플라이싱을 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 상호교환 가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 그것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 그것은 비-아미노산에 의해 단속될 수 있다. 또한, 상기 용어는 변형된 아미노산 중합체; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화(lipidation), 아세틸화, 인산화 또는 임의의 기타 조작, 예를 들어, 표지화 성분과의 컨쥬게이션을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 포함하는 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "도메인" 또는 "단백질 도메인"은 단백질 사슬의 나머지 부분과 독립적으로 존재하며 기능할 수 있는 단백질 서열의 일부를 말한다. 본 발명의 양태들에서 설명된 대로, 서열 동일성은 서열 상동성과 관련된다. 상동성 비교는 눈으로, 또는 더 일반적으로는 쉽게 이용 가능한 서열 비교 프로그램의 도움으로 수행될 수 있다. 이들 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 이상의 서열 사이의 상동성 백분율(%)을 계산할 수 있고, 또한 둘 이상의 아미노산 또는 핵산 서열에 의해서 공유된 서열 동일성을 계산할 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 본원에 기재된 dTALE의 캡핑 영역은 본원에 제공된 캡핑 영역 아미노산 서열과 적어도 95% 동일하거나 동일성을 공유하는 서열을 가진다. 서열 상동성은 본 분야에 알려진 다수의 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 BLAST 또는 FASTA 등의 임의의 것에 의해서 생성될 수 있다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏(Wisconsin Bestfit) 패키지이다(University of Wisconsin, U.S.A; 문헌[Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387]). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예들은, 제한은 아니지만, BLAST 패키지(상기 문헌[Ausubel et al., 1999] - 18장 참조), FASTA(문헌[Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410]) 및 GENEWORKS 비교 도구 일습을 포함한다. BLAST와 FASTA는 모두 오프라인과 온라인 검색을 위해 이용할 수 있다(상기 문헌[Ausubel et al., 1999], 페이지 7-58 내지 7-60 참조). 그러나, GCG 베스트핏 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. 서열 상동성 백분율(%)은 연속 서열에 걸쳐서 계산될 수 있는데, 즉 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고, 하나의 서열에서 각 아미노산 또는 뉴클레오티드가 다른 서열에서 상응하는 아미노산 또는 뉴클레오티드와 한번에 하나의 잔기씩 직접 비교된다. 이것은 "비갭"(ungapped) 정렬이라고 불린다. 통상적으로, 이러한 비갭 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에 걸쳐서만 수행된다. 이것은 매우 간단하고 일관된 방법이지만, 예를 들어 다른 동일한 쌍의 서열에서, 하나의 삽입 또는 결실이 이후의 아미노산 잔기를 정렬되지 않도록 할 수 있다는 것을 고려하지 않으므로, 전반적 정렬이 수행될 때는 잠재적으로 상동성%에 상당한 감소가 있게 된다. 결론적으로, 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 또는 동일성 점수에 과도한 패널티 부과 없이 가능한 삽입과 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 설계된다. 이것은 국소 상동성 또는 동일성을 최대화하도록 시도하도록 서열 정렬에 "갭"을 삽입함으로써 달성된다. 그러나, 이런 더 복잡한 방법은 정렬에서 발생한 각 갭에 "갭 패널티"를 배정하며, 이로써 동일한 수의 동일한 아미노산에 대해, 가능한 적은 갭을 가진 서열 정렬 - 비교된 두 서열 간의 더 높은 관련성 반영 - 이 많은 갭을 가진 것보다 더 높은 점수를 달성할 수 있다. "친화성 갭 점수"가 통상적으로 사용되는데, 이것은 갭의 존재에는 상대적으로 높은 점수를 매기고, 갭의 각 연속 잔기에는 더 적은 패널티를 매긴다. 이것은 가장 흔히 사용되는 갭 점수배정 시스템이다. 높은 갭 패널티는 당연히 갭이 적을수록 최적화된 정렬을 생성할 수 있다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티의 변형을 허용한다. 그러나, 서열 비교에 이러한 소프트웨어를 사용할 때 디폴트 값을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, GCG 위스콘신 베스트핏 패키지를 사용할 때, 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭 에 대해 -12 및 각 연장에 대해 -4이다. 따라서, 최대 상동성%의 계산은 먼저 갭 패널티를 고려한 최적 정렬의 생성을 요구한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적합한 컴퓨터 프로그램은 GCG 위스콘신 베스트핏 패키지이다(문헌[Devereux et al., 1984 Nuc. Acids Research 12 p387]). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예들은, 제한은 아니지만, BLAST 패키지(문헌[Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. Chapter 18] 참조), FASTA(문헌[Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410]) 및 GENEWORKS 비교 도구 일습을 포함한다. BLAST와 FASTA는 모두 오프라인과 온라인 검색으로 이용할 수 있다(문헌[Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, pages 7-58 to 7-60] 참조). 그러나, 일부 응용을 위해, GCG 베스트핏 프로그램을 사용하는 것이 바람직하다. BLAST 2 서열이라고 불리는 새로운 도구도 단백질 및 뉴클레오티드 서열을 비교하는데 이용할 수 있다(문헌[FEMS Microbiol Lett. 1999 174(2): 247-50]; 문헌[FEMS Microbiol Lett. 1999 177(1): 187-8] 및 National Institutes for Health 웹사이트에서 National Center for Biotechnology 웹사이트 참조). 최종 상동성%는 동일성에 관하여 측정될 수 있지만, 통상적으로 정렬 과정 자체는 모 아니면 도의 쌍 비교에 기초하지 않는다. 대신, 축척된 유사성 점수 행렬이 일반적으로 사용되는데, 이것은 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기초하여 각 쌍-방식 비교에 점수를 배정한다. 흔히 사용되는 이러한 행렬의 예는 BLOSUM62 행렬로서, 이것은 BLAST 프로그램 일습의 디폴트 행렬이다. GCG 위스콘신 프로그램은 일반적으로 공개된 디폴트 값이나 제공되는 경우에는 사용자 지정 기호 비교표(추가의 상세한 설명을 위해 사용자 매뉴얼 참조)를 사용한다. 일부 응용을 위하여, GCG 패키지에 대한 공개된 디폴트 값을 사용하거나, 또는 다른 소프트웨어의 경우에는 BLOSUM62와 같은 디폴트 행렬을 사용하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 상동성 백분율은 CLUSTAL과 유사한 알고리즘에 기초한, DNASIS™(히타치 소프트웨어(Hitachi Software))의 다중 정렬 특징을 사용하여 계산될 수 있다(문헌[Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244]). 일단 소프트웨어가 최적 정렬을 생성하면, 상동성%, 바람직하게는 서열 동일성%를 계산하는 것이 가능하다. 이 소프트웨어는 통상적으로 서열 비교의 일부로서 이것을 행하고, 수치 결과를 생성한다. 서열은 또한 침묵성 변화를 야기하여 기능적으로 동등한 물질을 가져오는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 가질 수 있다. 아미노산 특성(예컨대 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성)의 유사성을 기초로 의도적인 아미노산 치환이 만들어질 수 있으며, 따라서 작용기에 있어서 아미노산을 함께 그룹화하는데 유용하다. 아미노산은 그것의 측쇄만의 특성에 기초하여 그룹화될 수 있다. 그러나, 돌연변이 데이터를 포함하는 것도 역시 더 유용하다. 이렇게 유도된 아미노산 세트는 구조적 이유로 보존될 수 있다. 이들 세트는 벤다이어그램의 형태로 설명될 수 있다(문헌[Livingstone C.D. and Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl. Biosci. 9: 745-756])(문헌[Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218]). 보존적 치환은, 예를 들어 일반적으로 용인된 벤다이어그램 아미노산 그룹화를 설명한 아래 표에 따라서 이루어질 수 있다.
Figure pct00033
본 발명의 구현예는, 아미노산의 경우 유사한 것으로의 치환, 예컨대 염기성을 염기성으로, 산성을 산성으로, 극성을 극성으로 등등의 치환을 일으킬 수 있는 상동성 치환(치환 및 대체는 모두 본원에서 기존 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 대안적인 잔기 또는 뉴클레오티드로의 교환을 의미하도록 사용됨)을 포함할 수 있는 서열(폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모두)을 포함한다. 비-상동성 치환, 즉 한 부류의 잔기로부터 다른 부류의 잔기로의 치환, 또는 대안적으로 오르니틴(이후 Z로 언급), 디아미노부티르산 오르니틴(이후 B로 언급), 노르류신 오르니틴(이후 O로 언급), 피리일알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글리신과 같은 비천연 아미노산의 포함을 수반하는 치환이 일어날 수 있다. 변이체 아미노산 서열은 글리신 또는 β-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서에 더하여 메틸, 에틸 또는 프로필기와 같은 알킬기를 포함하는 서열의 임의의 두 아미노산 잔기 사이에 삽입될 수 있는 적합한 스페이서 기를 포함할 수 있다. 펩토이드 형태로 하나 이상의 아미노산 잔기의 존재를 포함하는 추가의 형태의 변형도 해당 분야의 숙련자에게 잘 이해될 수 있다. 의심을 피하기 위해서, "펩토이드 형태"는 α-탄소 치환기가 α-탄소가 아니라 잔기의 질소 원자에 존재하는 변이체 아미노산 잔기를 말하기 위해서 사용된다. 펩토이드 형태로 펩티드를 제조하는 과정은 해당 분야에, 예를 들어 문헌[Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371] 및 문헌[Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134]에 공지되어 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 증폭은 타당한 충실도로 표적 서열을 복제할 수 있는 중합효소 및 프라이머를 사용하는 임의의 방법을 의미한다. 증폭은 천연 또는 재조합 DNA 중합효소, 예를 들어, TaqGold™, T7 DNA 중합효소, 에스케리키아 콜라이 DNA 중합효소의 클레나우(Klenow) 단편 및 역전사효소에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 증폭 방법은 PCR이다.
특정 양태에서, 본 발명은 벡터를 포함한다. 본원에서 사용된 "벡터"는 하나의 환경에서 다른 환경으로 엔티티의 전달을 허용하거나 용이하게 하는 도구이다. 그것은 레플리콘, 예컨대 플라스미드, 파지, 또는 코스미드이며, 여기에 다른 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있고, 이로써 삽입된 세그먼트의 복제가 야기된다. 일반적으로, 벡터는 적절한 제어 요소와 회합되는 경우 복제 가능하다. 일반적으로, 용어 "벡터"는 그것이 결합되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터는, 제한은 아니지만, 단일 가닥, 이중 가닥, 또는 부분적으로 이중 가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는 핵산 분자, 자유 말단이 없는 핵산 분자(예를 들어, 원형); DNA, RNA 또는 둘 다 포함하는 핵산 분자; 및 해당 분야에 공지된 폴리뉴클레오티드의 다른 변종을 포함한다. 벡터의 하나의 종류는 "플라스미드"인데, 이것은 원형 이중 가닥 DNA 루프를 말하며, 여기에 예컨대 표준 분자 클로닝 기술에 의해서 추가의 DNA 세그먼트가 삽입될 수 있다. 벡터의 다른 종류는 바이러스 벡터이며, 바이러스-유래된 DNA 또는 RNA 서열이 바이러스(예를 들어, 레트로바이러스, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스, 복제 결함 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스(AAV))로의 패키징을 위한 벡터에 존재한다. 바이러스 벡터는 또한 숙주 세포로의 트랜스펙션을 위한, 바이러스가 지니는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 특정 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적 복제가 가능하다(예를 들어, 박테리아 복제 원점을 가진 박테리아 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포에 도입시 숙주 세포의 게놈에 통합되며, 이로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 그것이 작동 가능하게 연결된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"라고 언급된다. 재조합 DNA 기술에서 활용되는 통상적인 발현 벡터는 주로 플라스미드의 형태이다.
재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함할 수 있는데, 이것은 재조합 발현 벡터가 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 것을 의미하며, 하나 이상의 조절 요소는 발현에 사용될 숙주 세포에 기초하여 선택될 수 있고, 발현될 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 재조합 발현 벡터에서 "작동 가능하게 연결된"은 관심 뉴클레오티드 서열이 그 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 요소(들)에 연결된 것을 의미하고자 한다(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포에 도입되었을 때는 숙주 세포에서). 재조합 및 클로닝 방법과 관련하여, US 2004-0171156 A1호로 2004년 9월 2일자 공개된 미국 특허 출원 10/815,730호를 참조하며, 이것의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 양태는 키메라 RNA 및 Cas9에 대한 비시스트로닉 벡터에 관한 것이다. 키메라 RNA 및 Cas9에 대한 비시스트로닉 발현 벡터가 바람직하다. 일반적으로 그리고 특히 이 구현예에서, Cas9는 바람직하게 CBh 프로모터에 의해서 유도된다. 키메라 RNA는 바람직하게 Pol III 프로모터, 예를 들어, U6 프로모터에 의해 유도된다. 이상적으로 2개가 조합된다. 키메라 가이드 RNA는 통상적으로 20 bp 가이드 서열(N)로 구성되며, 이것은 tracr 서열과 연결될 수 있다(아래 가닥의 첫 번째 "U"에서 전사체의 끝까지 이어진다). tracr 서열은 나타낸 대로 다양한 위치에서 절두될 수 있다. 가이드 서열과 tracr 서열은 tracr-메이트 서열에 의해서 분리되는데, tracr-메이트 서열은 GUUUUAGAGCUA일 수 있다. 이것 다음에는 나타낸 대로 루프 서열 GAAA가 올 수 있다. 이들은 모두 바람직한 예들이다. 본 출원인들은 서베이어 검정에 의해 인간 EMX1 및 PVALB 유전자좌에서 Cas9-매개의 삽입결실을 입증하였다. ChiRNA는 "+n" 표기로 나타내며, crRNA는 가이드 서열과 tracr 서열이 개별 전사물로서 발현되는 하이브리드 RNA를 말한다. 본 출원 전체에서, 키메라 RNA는 또한 단일의 가이드, 또는 합성 가이드 RNA(sgRNA)로 칭해질 수 있다. 이 루프는 바람직하게 GAAA이지만, 이 서열에만 제한되는 것은 아니며, 실제로 단지 4 bp 길이에만 제한되는 것도 아니다. 실제로, 헤어핀 구조에서 사용하기 위한 바람직한 루프 형성 서열은 4 뉴클레오티드 길이이고, 가장 바람직하게 서열 GAAA를 가진다. 그러나, 더 길거나 짧은 루프 서열도 사용될 수 있으며, 대안적인 서열도 사용될 수 있다. 서열은 바람직하게 뉴클레오티드 트리플렛(예를 들어, AAA), 및 추가의 뉴클레오티드(예를 들어, C 또는 G)를 포함한다. 루프 형성 서열의 예들은 CAAA 및 AAAG를 포함한다. 본원에 개시된 방법 중 임의의 것을 실시하는데 있어서, 적합한 벡터가, 제한은 아니지만 마이크로인젝션, 전기천공, 소노포레이션, 바이오리스틱스, 칼슘 포스페이트-매개 트랜스펙션, 양이온 트랜스펙션, 리포좀 트랜스펙션, 덴드리머 트랜스펙션, 열 충격 트랜스펙션, 뉴클레오펙션 트랜스펙션, 마그네토펙션, 리포펙션, 임페일펙션, 광학 트랜스펙션, 핵산의 전용 제제-증진 흡수, 및 리포좀, 면역리포좀, 비로솜 또는 인공 비리온을 통한 전달을 포함하는 해당 분야에 공지된 하나 이상의 방법을 통해서 세포 또는 배아에 도입될 수 있다. 일부 방법에서, 벡터는 마이크로인젝션에 의해서 배아에 도입된다. 벡터 또는 벡터들은 배아의 핵 또는 세포질에 마이크로인젝션될 수 있다. 일부 방법에서, 벡터 또는 벡터들은 뉴클레오펙션에 의해서 세포에 도입될 수 있다.
용어 "조절 요소"는 프로모터, 인핸서, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 및 다른 발현 조절 요소(예를 들어, 전사 종결 신호, 예컨대 폴리아데닐화 신호 및 폴리-U 서열)를 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 조절 요소는, 예를 들어 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 설명된다. 조절 요소는 많은 종류의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 구성적 발현을 유도하는 것들과 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 유도하는 것들(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 조직-특이적 프로모터는 근육, 뉴런, 뼈, 피부, 혈액, 특정 장기(예를 들어, 간, 췌장)와 같은 요망되는 관심 조직, 또는 특정 세포 유형(예를 들어, 림프구)에서 주로 발현을 유도할 수 있다. 또한, 조절 요소는 시간-의존적 방식으로, 예컨대 세포-주기 의존적 또는 발생 단계 의존적 방식으로 발현을 유도할 수 있으며, 이것은 조직 특이적이거나 세포-유형 특이적일 수 있거나, 그렇지 않을 수도 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 하나 이상의 pol III 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol III 프로모터), 하나 이상의 pol II 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol II 프로모터), 하나 이상의 pol I 프로모터(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 pol I 프로모터), 또는 이들의 조합을 포함한다. pol III 프로모터의 예들은, 제한은 아니지만, U6 및 H1 프로모터를 포함한다. pol II 프로모터의 예들은, 제한은 아니지만, 레트로바이러스 라우스(Rous) 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(임의로 RSV 인핸서와 함께), 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터(임의로 CMV 인핸서와 함께)[예를 들어, 문헌[Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)] 참조], SV40 프로모터, 디하이드로폴레이트 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, 및 EF1α 프로모터를 포함한다. 또한, 용어 "조절 요소"에는 인핸서 요소, 예컨대 WPRE; CMV 인핸서; HTLV-I의 LTR에서 R-U5' 세그먼트(문헌[Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988]); SV40 인핸서; 및 토끼 β-글로빈의 엑손 2와 3 사이의 인트론 서열(문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981])도 포함된다. 발현 벡터의 설계는 형질전환될 숙주 세포의 선택, 요망되는 발현 수준 등과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다는 것이 해당 분야의 숙련자에 의해서 인정될 것이다. 벡터는 숙주 세포에 도입될 수 있고, 이로써 본원에 설명된 대로 핵산에 의해서 인코딩되는 전사물, 융합 단백질 또는 펩티드를 포함하는 단백질 또는 펩티드가 생성될 수 있다(예를 들어, 클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부(CRISPR) 전사물, 단백질, 효소, 이들의 돌연변이 형태, 이들의 융합 단백질 등). 조절 서열과 관련하여, 미국 특허 출원 10/491,026호를 참조하며, 이것의 내용은 그 전체가 여기 참고로 포함된다. 프로모터와 관련하여, PCT 공보 WO 2011/028929호 및 미국 출원 12/511,940호를 참조하며, 이들의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 CRISPR 전사물(예를 들어, 핵산 전사물, 단백질 또는 효소)의 발현을 위해 설계될 수 있다. 예를 들어, CRISPR 전사물은 박테리아 세포, 예를 들어, 에스케리키아 콜라이, 곤충 세포(배큘로바이러스 발현 벡터 사용), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 발현될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)]에 추가로 논의되어 있다. 대안적으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.
벡터는 원핵생물, 또는 원핵 세포에 도입되고, 그에서 증식될 수 있다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 진핵 세포로 도입될 벡터 또는 진핵 세포로 도입되는 벡터의 생성에서 중간체 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터 패키징 시스템의 일부로서 플라스미드 증폭)로서 벡터의 카피를 증폭시키기 위해서 사용된다. 일부 구현예에서, 원핵생물은 벡터의 카피를 증폭시키고, 하나 이상의 핵산을 발현하기 위해, 예를 들어, 숙주 세포 또는 숙주 유기체로의 전달을 위한 하나 이상의 단백질의 공급원을 제공하기 위해 사용된다. 원핵생물에서의 단백질의 발현은 자주 융합 또는 비-융합 단백질 중 어느 하나의 발현을 유도하는 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터를 사용하여 에스케리키아 콜라이에서 수행된다. 융합 벡터는 거기에 인코딩된 단백질에, 예를 들어, 재조합 단백질의 아미노 말단에 수많은 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 다음과 같은 하나 이상의 목적을 제공할 수 있다: (i) 재조합 단백질의 발현의 증가; (ii) 재조합 단백질의 용해도의 증가; 및 (iii) 친화성 정제에서 리간드로 작용함으로써 재조합 단백질의 정제의 보조. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질분해 절단 부위는 융합 모이어티와 재조합 단백질의 연접부에 도입되어, 융합 단백질의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 단백질의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소 및 그들의 동족 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나아제를 포함한다. 예시적인 융합 발현 벡터는 pGEX(파마시아 바이오테크 인코포레이티드(Pharmacia Biotech Inc); 문헌[Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40]), pMAL(미국 매사추세츠주 비벌리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 및 pRIT5(미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재의 파마시아(Pharmacia))를 포함하며, 이는 각각 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 말토스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 표적 재조합 단백질에 융합시킨다. 적절한 유도성 비-융합 에스케리키아 콜라이 발현 벡터의 예는 pTrc(문헌[Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315]) 및 pET 11d(문헌[Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89])를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모 사카로마이세스 세레비지애에서의 발현을 위한 벡터의 예에는 pYepSec1(문헌[Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234]), pMFa(문헌[Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943]), pJRY88(문헌[Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123]), pYES2(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션) 및 picZ(미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재의 인비트로겐 코포레이션)가 포함된다. 일부 구현예에서, 벡터는 배큘로바이러스 발현 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 단백질 발현을 유도한다. 배양된 곤충 세포(예를 들어, SF9 세포)에서 단백질의 발현에 이용 가능한 배큘로바이러스 벡터는 pAc 시리즈(문헌[Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165]) 및 pVL 시리즈(문헌[Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39])를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 포유류 발현 벡터를 사용하여 포유류 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유류 발현 벡터의 예는 pCDM8(문헌[Seed, 1987. Nature 329: 840]) 및 pMT2PC(문헌[Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195])를 포함한다. 포유류 세포에서 사용되는 경우, 발현 벡터의 조절 기능은 통상적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 사이토메갈로바이러스, 유인원 바이러스 40 및 본원에 개시되고 당업계에 공지되어 있는 기타의 것으로부터 유래된다. 원핵 및 진핵 세포 둘 모두를 위한 다른 적절한 발현 시스템에 대하여, 예를 들어, 문헌[Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]의 16 및 17장을 참조한다.
일부 구현예에서, 재조합 포유류 발현 벡터는 특정 세포 유형에서 우선적으로 핵산의 발현을 유도할 수 있다(예를 들어, 핵산을 발현하기 위하여 조직-특이적 조절 요소가 사용됨). 조직-특이적 조절 요소가 해당 분야에 공지되어 있다. 적절한 조직-특이적 프로모터의 비제한적인 예에는 알부민 프로모터(간-특이적; 문헌[Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277]), 림프-특이적 프로모터(문헌[Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275]), 특히, T 세포 수용체(문헌[Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733]) 및 면역글로불린의 프로모터(문헌[Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740]; 문헌[Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748]), 뉴런-특이적 프로모터(예를 들어, 신경섬유 프로모터; 문헌[Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477]), 췌장-특이적 프로모터(문헌[Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916]) 및 유선-특이적 프로모터(예를 들어, 유장(milk whey) 프로모터; 미국 특허 제4,873,316호 및 유럽 출원 공개 제264,166호)가 포함된다. 발생-조절 프로모터, 예를 들어, 쥣과 hox 프로모터(문헌[Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379]) 및 α-태아단백질 프로모터(문헌[Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546])도 또한 포함된다. 이들 원핵 및 진핵 벡터와 관련하여, 미국 특허 6,750,059호를 참조하며, 이것의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 본 발명의 다른 구현예들은 바이러스 벡터의 사용에 관한 것일 수 있으며, 이것과 관련해서는 미국 특허 출원 13/092,085호를 참조하고, 이것의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 조직-특이적 조절 요소는 해당 분야에 공지이며, 이것과 관련하여 미국 특허 7,776,321호를 참조하고, 이것의 내용은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일부 구현예에서, 조절 요소는 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소에 작동 가능하게 연결되어 CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도한다. 일반적으로, SPIDR(스페이서 산재 직접 반복부)로도 공지되어 있는 CRISPR(클러스터링되고 규칙적으로 산재된 짧은 팔린드로믹 반복부)은 통상 특정 박테리아 종에 특이적인 DNA 유전자좌의 과를 구성한다. CRISPR 유전자좌는 에스케리키아 콜라이에서 인식되는 별개의 부류의 산재된 짧은 서열 반복부(SSR) 및 관련 유전자를 포함한다(문헌[Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]]; 및 문헌[Nakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]]). 유사한 산재된 SSR이 할로페락스 메디테라네이(Haloferax mediterranei), 스트렙토코커스 피오게네스, 아나바에나(Anabaena) 및 마이코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)에서 확인되었다(문헌[Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]]; 문헌[Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]]; 문헌[Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]]; 및 문헌[Mojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]] 참조). CRISPR 유전자좌는 통상적으로 SRSR(규칙적으로 산재된 짧은 반복부(short regularly spaced repeat))로 명명된 반복부의 구조가 다른 SSR과 상이하다(문헌[Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]]; 및 문헌[Mojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]]). 일반적으로, 반복부는 실질적으로 고정된 길이를 갖는 독특한 개재 서열에 의해 규칙적으로 이격된 클러스터에 존재하는 짧은 요소이다(상기 문헌[Mojica et al., [2000]]). 반복 서열이 균주들 간에 고도로 보존되어 있지만, 산재된 반복부의 수와 스페이서 영역의 서열은 통상적으로 균주마다 상이하다(문헌[van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]]). CRISPR 유전자좌는 아에로피룸(Aeropyrum), 피로바쿨룸(Pyrobaculum), 술폴로부스(Sulfolobus), 아캐오글로부스(Archaeoglobus), 할로카르쿨라(Halocarcula), 메타노박테리움(Methanobacterium), 메타노코커스(Methanococcus), 메타노사르시나(Methanosarcina), 메타노피러스(Methanopyrus), 피로코커스(Pyrococcus), 피크로필러스(Picrophilus), 써모플라스마(Thermoplasma), 코리네박테리움(Corynebacterium), 마이코박테리움(Mycobacterium), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 아퀴펙스(Aquifex), 포르피로모나스(Porphyromonas), 클로로비움(Chlorobium), 써머스(Thermus), 바실러스(Bacillus), 리스테리아(Listeria), 스타필로코커스(Staphylococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 써모아나에로박터(Thermoanaerobacter), 마이코플라스마(Mycoplasma), 푸소박테리움(Fusobacterium), 아자쿠스(Azarcus), 크로모박테리움(Chromobacterium), 네이세리아(Neisseria), 니트로소모나스(Nitrosomonas), 디설포비브리오(Desulfovibrio), 게오박터(Geobacter), 믹소코커스(Myxococcus), 캄필로박터(Campylobacter), 볼리넬라(Wolinella), 아시네토박터(Acinetobacter), 에르위니아(Erwinia), 에스케리키아, 레지오넬라(Legionella), 메틸로코커스(Methylococcus), 파스퇴렐라(Pasteurella), 포토박테리움(Photobacterium), 살모넬라(Salmonella), 잔토모나스(Xanthomonas), 예르시니아(Yersinia), 트레포네마(Treponema) 및 써모토가(Thermotoga)를 포함하나 이들에 한정되지 않는 40개 초과의 원핵생물에서 확인되었다(예를 들어, 문헌[Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]]; 및 문헌[Mojica et al., [2005]] 참조).
일부 구현예에서, CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인(예를 들어, CRISPR 효소에 더하여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 도메인)을 포함하는 융합 단백질의 부분이다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가의 단백질 서열 및 임의로 임의의 2개 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는 비제한적으로 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열 및 하기의 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 디메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자(transcription release factor) 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 헤마글루티닌(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST), 호스라디시(horseradish) 과산화효소(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함하는 자가형광 단백질을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. CRISPR 효소는 DNA 분자에 결합하거나, 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합체, GAL4 DNA 결합 도메인 융합체 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합체를 포함하나 이들에 한정되지 않는 다른 세포 분자에 결합하는 단백질 또는 단백질의 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 부분을 형성할 수 있는 추가의 도메인은 본원에 참조로 포함되는 US20110059502호에 기술되어 있다. 일부 구현예에서, 태그가 부착된 CRISPR 효소를 사용하여 표적 서열의 위치를 확인한다.
일부 구현예에서, CRISPR 효소는 유도성 시스템의 성분을 형성할 수 있다. 이 시스템의 유도성 성질은 에너지 형태를 사용하여 유전자 편집이나 유전자 발현의 시공간적 제어를 허용할 것이다. 에너지 형태는, 제한은 아니지만, 전자기선, 소리 에너지, 화학 에너지 및 열 에너지를 포함할 수 있다. 유도성 시스템의 예들은 테트라사이클린 유도성 프로모터(Tet-On 또는 Tet-Off), 소 분자 2-하이브리드 전사 활성화 시스템(FKBP, ABA 등) 또는 광 유도성 시스템(피토크롬, LOV 도메인 또는 크립토크롬)을 포함한다. 일 구현예에서, CRISPR 효소는 서열-특이적 방식으로 전사 활성에 변화를 유도할 수 있는 광 유도성 전사 이펙터(LITE)의 일부일 수 있다. 광의 성분은 CRISPR 효소, 광-반응성 시토크롬 이종이량체(예를 들어, 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) 유래), 및 전사 활성화/억제 도메인을 포함할 수 있다. 유도성 DNA 결합 단백질의 추가의 예들과 이들의 사용을 위한 방법은 US 61/736465호 및 US 61/721,283호에 제공되며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 면역학, 생화학, 화학, 분자 생물학, 미생물학, 세포 생물학, 유전체학 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 사용한다. 문헌[Sambrook, Fritsch and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd edition (1989)]; 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))]; 시리즈 문헌[METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor eds. (1995))], 문헌[Harlow and Lane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL] 및 문헌[ANIMAL CELL CULTURE (R.I. Freshney, ed. (1987))]을 참조한다.
표적 변형
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법을 제공하며, 이것은 생체내, 생체외 또는 시험관내에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 인간 또는 비인간 동물로부터 세포 또는 세포 집단을 시료추출하는 단계, 및 세포 또는 세포들을 변형하는 단계를 포함한다. 배양은 생체외에서 임의의 단계에서 일어날 수 있다. 세포 또는 세포들은 심지어 비인간 동물 또는 식물에 재도입될 수 있다. 재도입된 세포의 경우, 세포가 줄기 세포인 것이 특히 바람직하다.
일부 구현예에서, 방법은 CRISPR 복합체가 표적 폴리뉴클레오티드에 결합되게 하여, 상기 표적 폴리뉴클레오티드의 절단을 행함으로써 표적 폴리뉴클레오티드를 변형시키는 단계를 포함하고, 여기서 CRISPR 복합체는 상기 표적 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열과 혼성화되거나 혼성화 가능한 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하며, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되고, 이어서 tracr 메이트 서열은 tracr 서열과 혼성화된다.
일 양태에서, 본 발명은 진핵 세포에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 변형하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 방법은 결합이 폴리뉴클레오티드의 증가된 또는 감소된 발현을 가져오도록 CRISPR 복합체가 폴리뉴클레오티드에 결합되게 하는 단계를 포함하며, 여기서 CRISPR 복합체는 상기 폴리뉴클레오티드 내의 표적 서열과 혼성화되거나 혼성화 가능한 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함하고, 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되고, 이어서 tracr 메이트 서열은 tracr 서열과 혼성화된다. 유사한 고려사항 및 조건이 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법에 대해 상기 설명된 것과 같이 적용된다. 실제로 이들 시료추출, 배양 및 재도입 선택사항은 본 발명의 전 양태에 적용된다.
실제로, 본 발명의 임의의 양태에서, CRISPR 복합체는 표적 서열과 혼성화되거나 혼성화 가능한 가이드 서열과 복합체화된 CRISPR 효소를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 가이드 서열은 tracr 메이트 서열에 연결되고, 이어서 tracr 메이트 서열은 tracr 서열과 혼성화될 수 있다. 유사한 고려사항 및 조건이 표적 폴리뉴클레오티드를 변형하는 방법에 대해 상기와 같이 적용된다.
키트
일 양태에서, 본 발명은 상기 방법 및 조성물에서 개시된 요소들 중 임의의 하나 이상을 함유하는 키트를 제공한다. 요소들은 개별적으로 또는 조합하여 제공될 수 있으며, 임의의 적합한 용기, 예컨대 바이알, 보틀 또는 튜브에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 언어로 된, 예를 들어 하나 초과의 언어로 된 설명서를 포함한다.
일부 구현예에서, 키트는 본원에 기술된 요소 중 하나 이상을 사용하는 과정에 사용하기 위한 하나 이상의 시약을 포함한다. 시약은 임의의 적절한 용기에 제공될 수 있다. 예를 들어, 키트는 하나 이상의 반응 또는 저장 완충제를 제공할 수 있다. 시약은 특정 검정에 사용가능한 형태 또는 사용 전에 하나 이상의 다른 성분의 첨가를 필요로 하는 형태(예를 들어, 농축물 또는 동결건조 형태)로 제공될 수 있다. 완충제는 탄산나트륨 완충제, 중탄산나트륨 완충제, 붕산염 완충제, 트리스(Tris) 완충제, MOPS 완충제, HEPES 완충제 및 그들의 조합을 포함하나 이들에 한정되지 않는 임의의 완충제일 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제는 알칼리성이다. 일부 구현예에서, 완충제는 약 7 내지 약 10의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 키트는 가이드 서열과 조절 요소를 작동 가능하게 연결하도록, 벡터에 삽입하기 위한 가이드 서열에 상응하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 상동성 재조합 주형 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 키트는 본원에 설명된 벡터 중 하나 이상 및/또는 폴리뉴클레오티드 중 하나 이상을 포함한다. 키트는 유리하게 본 발명의 시스템의 모든 요소가 제공되게 할 수 있다.
CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA
CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA는 또한 별개로 전달될 수 있다. CRISPR 효소 mRNA를 가이드 RNA 전에 전달하여 CRISPR 효소가 발현될 시간을 제공할 수 있다. CRISPR 효소 mRNA는 가이드 RNA의 투여 전 1 내지 12시간(바람직하게는 약 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. 대안적으로, CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA는 함께 투여될 수 있다. 유리하게는, 가이드 RNA의 제2 부스터 용량은 CRISPR 효소 mRNA + 가이드 RNA의 초기 투여 후 1 내지 12시간(바람직하게는 약 2 내지 6시간)에 투여될 수 있다. CRISPR 효소 mRNA 및/또는 가이드 RNA의 추가 투여는 가장 효율적인 게놈 변형 수준을 달성하는데 유용할 수 있다. 독성 및 표적외 효과의 최소화를 위해, 전달되는 CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA의 농도를 조절하는 것은 중요할 것이다. 최적의 농도의 CRISPR 효소 mRNA 및 가이드 RNA는 세포 또는 동물 모델에서 상이한 농도를 시험함으로써, 그리고 잠재적인 표적외 게놈 유전자좌에서의 변형 정도를 분석하는 딥 시퀀싱(deep sequencing)을 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 인간 게놈의 EMX1 유전자에서 5'-GAGTCCGAGCAGAAGAAGAA-3'을 표적화하는 가이드 서열에 대해, 딥 시퀀싱을 사용하여, 다음의 2개의 표적외 유전자좌, 즉 1: 5'-GAGTCCTAGCAGGAGAAGAA-3' 및 2: 5'-GAGTCTAAGCAGAAGAAGAA-3'에서 변형 수준을 평가할 수 있다. 가장 높은 수준의 표적 상의 변형을 제공하는 한편 표적외 변형의 수준을 최소화하는 농도가 생체내 전달을 위해 선택되어야 한다.
CRISPR-Cas9의 결정화 및 결정 구조의 특성화: 본 발명의 결정은 뱃치(batch), 액체 브리지(liquid bridge), 투석, 증기 확산 및 현적법(hanging drop method)을 포함하는 단백질 결정학의 기술에 의해 수득될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 결정은 실질적으로 순수한 CRISPR-Cas9 및 그것이 결합하는 핵산 분자를 침전하는데 필요한 농도 바로 아래의 농도로 침전제를 함유하는 수성 완충제 중에 용해시킴으로써 성장한다. 물을 조절된 증발에 의해 제거하여 결정 성장이 중단될 때까지 유지되는 침전 조건을 생성한다.
결정, 결정 구조 및 원자 구조 좌표의 이용: CRISPR 효소 결정 및 특히 그로부터 수득되는 원자 구조 좌표는 매우 다양한 용도를 갖는다. 결정 및 구조 좌표는 CRISPR-Cas9에 결합하는 화합물(핵산 분자) 및 특정 화합물(핵산 분자)에 결합할 수 있는 CRISPR-Cas9를 확인하는데 특히 유용하다. 따라서, 본원에 기재된 구조 좌표는 추가의 합성 또는 돌연변이 CRISPR-Cas9, Cas9, 닉카아제, 결합 도메인의 결정 구조의 결정에서 페이징(phasing) 모델로 사용될 수 있다. 본원에 언급된 물질에서와 같이 핵산 분자와 복합체화된 CRISPR-Cas9의 결정 구조의 제공은 해당 분야의 숙련자에게 CRISPR-Cas9의 작용 메카니즘에 대한 구체화된 식견을 제공한다. 이러한 식견은 예를 들어, 그에 작용기, 예를 들어, 억제제 또는 활성화제를 부착시킴으로써 변형된 CRISPR-Cas9를 설계하기 위한 수단을 제공한다. 작용기, 예를 들어, 억제제 또는 활성화제를 CRISPR-Cas9의 N 또는 C 말단에 부착할 수 있지만, 결정 구조는 N 말단이 모호하거나 숨겨져 있는 한편, C 말단은 작용기, 예를 들어, 억제제 또는 활성화제에 더욱 이용 가능한 것을 입증한다. 더욱이 결정 구조는 작용기, 예를 들어, 활성화제 또는 억제제의 부착에 적합한, 대략적으로 CRISPR-Cas9(스트렙토코커스 피오게네스) 잔기 534 내지 676 사이에 유연성 루프가 존재하는 것을 입증한다. 부착은 링커, 예를 들어, 유연성 글리신-세린(GlyGlyGlySer) 또는 (GGGS)3 또는 경성 알파-헬리컬 링커, 예를 들어, (Ala(GluAlaAlaAlaLys)Ala)를 통해 이루어질 수 있다. 유연성 루프에 더하여, 뉴클레아제 또는 H3 영역, H2 영역 및 헬리컬 영역도 또한 존재한다. "헬릭스" 또는 "헬리컬"은 알파-헬릭스를 포함하나 이에 제한되지 않는 해당 분야에 알려져 있는 헬릭스를 의미한다. 또한, 용어 헬릭스 또는 헬리컬은 또한 N-말단 턴(turn)과 함께 c-말단 헬리컬 요소를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
핵산 분자와 복합체화된 CRISPR-Cas9의 결정 구조의 제공은 약물 또는 화합물 발견, CRISPR-Cas9에 결합할 수 있는 화합물에 대한 확인 및 설계를 위한 신규한 방법을 가능하게 하며, 이에 따라, 본 발명은 다세포 유기체, 예를 들어, 조류, 식물, 무척추동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류, 포유류; 예를 들어, 재배 식물, 동물(예를 들어, 생산 동물, 예를 들어, 돼지, 소, 닭; 반려 동물, 예를 들어, 고양이, 개, 설치류(토끼, 게르빌루스쥐, 햄스터); 실험실 동물, 예를 들어, 마우스, 랫트) 및 인간의 질환 또는 질병의 진단, 치료 또는 예방에 유용한 도구를 제공한다. 따라서, 본 발명은 CRISPR-Cas9 복합체의 합리적인 컴퓨터 기반의 설계 방법을 수반한다. 이러한 합리적인 설계는 본원에 언급된 물질에서 일부 또는 모든(예를 들어, 구조의 적어도 2개 이상, 예를 들어, 적어도 5개, 유리하게는 적어도 10개, 더욱 유리하게는 적어도 50개, 더더욱 유리하게는 적어도 100개의 원자) 좌표에 의해 정의되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 구조를 제공하는 단계; 어떤 CRISPR-Cas9 복합체가 요망되는지에 관하여 요망되는 핵산 분자의 구조를 제공하는 단계; 및 본원에 언급된 물질에서 일부 또는 모든 좌표에 의해 정의되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 구조를 요망되는 핵산 분자에 핏팅시키는 단계로서, 상기 핏팅에서 상기 요망되는 핵산 분자가 요망되는 핵산 분자를 포함하는 CRISPR-Cas9 복합체(들)에 결합하도록 하는 본원에 언급된 물질에서의 일부 또는 모든 좌표에 의해 결정되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 추정의 변형(들)을 수득하는 것을 포함하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법 또는 방법의 핏팅은 활성 부위 또는 결합 영역의 부근을 모델링하기 위하여 활성 부위 또는 결합 영역의 부근(예를 들어, 구조의 적어도 2개 이상, 예를 들어, 적어도 5개, 유리하게는 적어도 10개, 더욱 유리하게는 적어도 50개, 더더욱 유리하게는 적어도 100개 원자)에 존재하는 본원에 언급된 물질에서 일부 또는 모든 좌표에 의해 정의되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 관심 원자의 좌표를 사용할 수 있다. 이들 좌표를 사용하여, 이어서 요망되는 또는 후보 핵산 분자에 대하여 "가상 환경"에서 스크리닝되는 공간을 정의할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CRISPR-Cas9 복합체의 합리적인 컴퓨터-기반의 설계 방법을 제공한다. 이러한 방법은 본원에 언급된 물질의 적어도 2개의 원자의 좌표("선택된 좌표")를 제공하는 단계; 후보 또는 요망되는 핵산 분자의 구조를 제공하는 단계; 및 후보물질의 구조를 선택된 좌표에 핏팅시키는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 방식으로, 해당 분야의 숙련자는 또한 작용기 및 후보 또는 요망되는 핵산 분자를 핏팅시킬 수 있다. 예를 들어, 본원에 언급된 물질에서 일부 또는 모든(예를 들어, 구조의 적어도 2개 이상, 예를 들어, 적어도 5개, 유리하게는 적어도 10개, 더욱 유리하게는 적어도 50개, 더더욱 유리하게는 적어도 100개 원자) 좌표에 의해 정의되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 구조를 제공하는 단계; 어떤 CRISPR-Cas9 복합체가 요망되는지에 관하여 요망되는 핵산 분자의 구조를 제공하는 단계; 본원에 언급된 물질에서 일부 또는 모든 좌표에 의해 정의되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 구조를 요망되는 핵산 분자에 핏팅시키는 단계로서, 상기 핏팅에서 상기 요망되는 핵산 분자가 요망되는 핵산 분자를 포함하는 CRISPR-Cas9 복합체(들)에 결합하게 하는 본원에 언급된 물질에서의 일부 또는 모든 좌표에 의해 결정되는 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 추정의 변형(들)을 수득하는 것을 포함하는 단계; 추정의 핏팅된 CRISPR-Cas9-요망되는 핵산 분자 복합체(들)를 선택하고, 예를 들어, 작용기를 위치시키기 위한 위치(예를 들어, 유연성 루프 내의 위치) 및/또는 작용기를 위치시키기 위한 위치를 생성하기 위한 추정의 핏팅된 CRISPR-Cas9-요망되는 핵산 분자 복합체(들)의 추정의 변형에 관하여, 그러한 추정의 핏팅된 CRISPR-Cas9-요망되는 핵산 분자 복합체(들)를 작용기(예를 들어, 활성화제, 억제제)에 핏팅시키는 단계를 포함할 수 있다. 언급된 바와 같이, 본 발명은 활성 부위 또는 결합 영역의 부근에 존재하는 본원에 언급된 물질에서 좌표를 사용하여 실시될 수 있으며; 이에 따라, 본 발명의 방법은 CRISPR-Cas9 복합체의 관심 하위-도메인을 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 도메인 또는 하위-도메인의 좌표를 사용하여 실시될 수 있다. 상기 방법은 임의로 "가상 환경" 결과로부터 후보 또는 요망되는 핵산 분자 및/또는 CRISPR-Cas9 시스템을 합성하고, "웨트(wet)" 또는 실제 후보 또는 요망되는 핵산 분자에 결합된 "웨트" 또는 실제 CRISPR-Cas9 시스템에 연결된 "웨트" 또는 실제 작용기의 결합 및/또는 활성을 시험하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 "가상 환경" 결과로부터 CRISPR-Cas9 시스템(작용기 포함)을 합성하고, 생체내에서 "웨트(wet)" 또는 실제 후보 또는 요망되는 핵산 분자에 결합된 "웨트" 또는 실제 CRISPR-Cas9 시스템에 연결된 "웨트" 또는 실제 작용기의 결합 및/또는 활성을 시험하는 단계, 예를 들어, "가상 환경" 결과로부터 작용기를 포함하는 "웨트" 또는 실제 CRISPR-Cas9 시스템을 요망되는 또는 후보 핵산 분자를 함유하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 이들 방법은 요망되는 반응, 예를 들어, 증상 또는 질환 또는 질병의 감소에 대하여 세포 또는 세포를 함유하는 유기체를 관찰하는 단계를 포함할 수 있다. 후보 핵산 분자의 구조를 제공하는 단계는 핵산 분자 데이터, 예를 들어, 질환 또는 질병에 관한 그러한 데이터를 포함하는 데이터베이스를 컴퓨터에 의해 스크리닝함으로써 화합물을 선택하는 것을 포함할 수 있다. 후보 핵산 분자의 결합에 대한 3차원 기술어는 본원에 언급된 물질 유래의 CRISPR-Cas9 복합체 또는 그의 도메인 또는 영역의 구조 및 화학적 성질로부터 유래되는 기하학적 및 기능적 제약으로부터 유래될 수 있다. 사실상, 기술어는 CRISPR-Cas9가 후보 또는 요망되는 핵산 분자로 결합하기 위한 본원의 CRISPR-Cas9 복합체 결정 구조의 가상의 변형(들)의 유형일 수 있다. 그 다음, 기술어를 사용하여, 핵산 분자 데이터베이스의 정보를 얻어서, 추정적으로 우수한 기술어의 결합을 갖는 데이터베이스의 핵산 분자를 확인할 수 있다. 그 다음, 본원에서 "웨트" 단계는 추정적으로 우수한 결합을 갖는 핵산 분자 및 기술어를 사용하여 수행될 수 있다.
"핏팅"은 자동 또는 반자동 수단에 의해, 후보물질의 적어도 하나의 원자와 CRISPR-Cas9 복합체의 적어도 하나의 원자 사이의 상호작용을 결정하고 그러한 상호작용이 안정적인 정도를 계산하는 것을 의미할 수 있다. 상호작용은 전하에 의해 야기되는 인력, 반발, 입체적 고려사항 등을 포함할 수 있다. "하위-도메인"은 2차 구조의 적어도 1개, 예를 들어, 1개, 2개, 3개 또는 4개의 완전한 요소(들)를 의미할 수 있다. CRISPR-Cas9의 특정 영역 또는 도메인은 본원에 언급된 물질에서 확인된 것들을 포함한다.
CRISPR-cas 9(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 복합체의 3차원 구조의 결정은 예를 들어, 다양한 핵산 분자에 결합하게 하는 CRISPR-Cas9 시스템의 변형의 방식에 의한, 서로, CRISPR-Cas9(예를 들어, 기능의 자가-활성화 및/또는 자가-종결을 제공하는 유도성 시스템)와, 핵산 분자 (예를 들어, 작용기는 전사 억제제, 전사 활성화제, 뉴클레아제 도메인, DNA 메틸 트랜스퍼라제, 단백질 아세틸트랜스퍼라제, 단백질 디아세틸라제, 단백질 메틸트랜스퍼라제, 단백질 디아미나제, 단백질 키나제 및 단백질 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 조절 또는 작용성 도메인일 수 있고; 일부 양태에서, 작용성 도메인은 후성적 조절제이고; 예를 들어, Zhang 등의 미국 특허 제8,507,272호를 참조하며, 그것 및 본원에 언급된 모든 문헌 및 모든 출원서에 언급된 문헌은 본원에 참조로 포함되는 것이 다시 언급됨)와 상호작용할 수 있는 다양한 작용기 중 임의의 하나 이상에 대한 그에 연결되는 CRISPR-Cas9 시스템의 변형의 방식에 의한, Cas9의 변형의 방식에 의한, 신규한 닉카아제의 방식에 의한 CRISPR-cas 9(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)에 결합하는 신규한, 특정 핵산 분자의 설계, 및 신규한 CRISPR-Cas9 시스템의 설계를 위한 기반을 제공한다. 실제로, 여기서 CRISPR-Cas9(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 결정 구조는 다수의 용도를 갖는다. 예를 들어, CRISPR-Cas9(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 결정 구조의 3차원 구조를 인식하여, 컴퓨터 모델링 프로그램을 사용하여 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)의 가능한 또는 확인된 부위, 예를 들어, 결합 부위 또는 다른 구조적 또는 기능적 특징부와 상호작용하는 것으로 예상되는 상이한 분자를 설계하거나 확인할 수 있다. 잠재적으로 결합하는 화합물("결합제")은 도킹(docking) 프로그램을 사용하여 컴퓨터 모델링의 사용을 통해 시험될 수 있다. 도킹 프로그램, 예를 들어, GRAM, DOCK 또는 AUTODOCK(문헌[Walters et al. Drug Discovery Today, vol. 3, no. 4 (1998), 160-178] 및 문헌[Dunbrack et al. Folding and Design 2 (1997), 27-42] 참조)가 알려져 있다. 이러한 절차는 잠재적인 결합제의 형상 및 화학적 구조가 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)에 얼마나 잘 결합할 지를 확인하는 잠재적인 결합제의 컴퓨터 핏팅을 포함할 수 있다. CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)의 활성 부위 또는 결합 부위의 컴퓨터-보조 수동 시험을 수행할 수 있다. 또한, 프로그램, 예를 들어, GRID(문헌[P. Goodford, J. Med. Chem, 1985, 28, 849-57])-분자와 다양한 작용기 간의 예상되는 상호작용 부위를 결정하는 프로그램-을 사용하여 활성 부위 또는 결합 부위를 분석하여, 결합 화합물의 부분 구조를 예측할 수 있다. 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 결합 파트너, 예를 들어, CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 및 후보 핵산 분자 또는 핵산 분자 및 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)의 인력, 반발 또는 입체적 장애를 추정할 수 있으며; 여기서 CRISPR-Cas9 결정 구조(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)는 그러한 방법을 가능하게 한다. 일반적으로, 핏팅이 더 단단할수록, 입체 장애가 더 적고, 인력이 더 크며, 잠재적인 결합제가 더 강한데, 이는 이들 특성이 더 단단한 결합 상수와 일치하기 때문이다. 추가로, 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)의 설계에서 특이성이 더 클수록, 그것이 표적외 분자와 상호작용하지 않을 가능성이 더 크다. 또한, "웨트" 방법은 본 발명에 의해 가능해진다. 예를 들어, 일 양태에서, 본 발명은 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)에 결합하는 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)의 결합제(예를 들어, 표적 핵산 분자)의 구조를 결정하기 위한 방법을 포함하며, 상기 방법은 (a) 본 발명에 따른 후보 CRISPR-Cas9 시스템(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)의 제1 결정 또는 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)의 제2 결정을 제공하는 단계, (b) 제1 결정 또는 제2 결정을 상기 결합제와 복합체를 형성할 수 있는 조건하에서 접촉시키는 단계; 및 (c) 상기 후보(예를 들어, CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 또는 CRISPR-Cas9 시스템(스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 복합체의 구조를 결정하는 단계를 포함한다. 그러나, 제2 결정은 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9인 것에 비하여 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9인 그러한 시스템의 Cas9로부터)의 최소의 변경으로 인하여 본질적으로 본원에 논의된 동일한 좌표를 가질 수 있으며, 여기서, "예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9"는 Cas9가 Cas9이며, 스트렙토코커스 피오게네스의 것이거나 그로부터 유래되거나 또는 그의 오솔로그일 수 있음을 나타내며, 결정은 상이한 공간군에서 형성할 수 있다.
본 발명은 추가로 "가상 환경" 방법 대신에 또는 그에 더하여, 결합 활성이 있는 화합물을 선택하기 위한 결합제(예를 들어, 표적 핵산 분자) 및 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 또는 후보 결합제(예를 들어, 표적 핵산 분자) 및 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9), 또는 후보 결합제(예를 들어, 표적 핵산 분자) 및 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)(하나 이상의 작용기(들)가 있거나 그것이 없는 전술한 CRISPR-Cas9 시스템(들))의 고효율 스크리닝을 포함하는 다른 "웨트" 방법을 포함한다. 결합 활성을 보이는 결합제 및 CRISPR-Cas9 시스템의 그들 쌍이 선택될 수 있으며, X-선 분석을 위하여 예를 들어, 동시-결정화에 의해 또는 침지에 의해, 본원의 구조를 갖는 CRISPR-Cas9 결정으로 추가로 결정화될 수 있다. 얻어진 X-선 구조를 다양한 목적을 위하여, 예를 들어, 중첩 영역에 대하여 본원에 언급된 물질의 것과 비교될 수 있다. 바람직한 핏팅 특성, 예를 들어, 결합제 및 본원의 CRISPR-Cas9 결정 구조 데이터의 쌍에 기초하여 예측되는 강력한 인력을 갖는 것들을 결정함으로써 가능한 결합제 및 CRISPR-Cas9 시스템의 쌍을 설계하거나, 확인하거나 선택하여, 이어서, 이들 가능한 쌍을 활성에 대한 "웨트" 방법에 의해 스크리닝할 수 있다. 결과적으로, 일 양태에서, 본 발명은 가능한 쌍을 수득하거나 합성하는 단계; 및 결합제(예를 들어, 표적 핵산 분자) 및 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9) 또는 후보 결합제(예를 들어, 표적 핵산 분자) 및 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9), 또는 후보 결합제(예를 들어, 표적 핵산 분자) 및 후보 CRISPR-Cas9 시스템(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)(하나 이상의 작용기(들)가 있거나 그것이 없는 전술한 CRISPR-Cas9 시스템(들))을 접촉시켜, 결합하는 능력을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 후자의 단계에서, 접촉은 유리하게는 기능을 결정하기 위한 조건하에 이루어진다. 그러한 검정을 수행하는 것 대신에 또는 그에 더하여, 본 발명은 상기 접촉으로부터 복합체(들)를 수득하거나 합성하는 단계 및 예를 들어, X-선 회절 또는 NMR 또는 다른 수단에 의해 복합체(들)를 분석하여, 결합하거나 상호작용하는 능력을 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 그 다음, 결합에 대한 상세한 구조 정보가 수득될 수 있으며, 이러한 정보에 비추어, 후보 CRISPR-Cas9 시스템 또는 그의 성분의 구조 또는 작용성에 대하여 조정이 이루어질 수 있다. 이들 단계는 필요에 따라 반복되고 재-반복될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 전술한 방법으로부터의 또는 전술한 방법에서의 잠재적인 CRISPR-Cas9 시스템은 제한 없이 유기체(비-인간 동물 및 인간 포함)로의 투여에 의한 것을 포함하여, 생체내에서 핵산 분자와 함께 존재하여, 요망되는 결과(예를 들어, 증상의 감소, 치료)가 그로부터 야기되는지를 포함하여, 작용을 확정하거나 확인할 수 있다.
본 발명은 추가로 본원에 언급된 물질의 구조 좌표를 사용함에 의한 미지의 구조의 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체(들)의 3차원 구조의 결정 방법을 포함한다. 예를 들어, X-선 결정학 또는 NMR 분광 데이터가 미지의 결정 구조의 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체에 대하여 제공된다면, 본원에 언급된 물질에서 정의된 바와 같은 CRISPR-Cas9 복합체의 구조를 사용하여, X-선 결정학의 경우의 상 모델링에 의한 것과 같은 그러한 기술에 의해 그 데이터를 해석하여 미지의 시스템 또는 복합체에 대한 유망한 구조를 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 미지의 결정 구조를 갖는 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체의 표현을 본원의 결정 구조의 CRISPR-cas(9) 시스템 및 복합체의 유사한 표현과 정렬시켜, 상동성 또는 유사성 영역(예를 들어, 상동성 또는 유사성 서열)을 매치시키는 단계; 상응하는 영역(예를 들어, 서열)의 본원에 언급된 물질에 정의된 바와 같은 구조에 기초하여 미지의 결정 구조의 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체의 매치되는 상동성 또는 유사성 영역(예를 들어, 서열)의 구조를 모델링하는 단계; 및 상기 매치되는 상동성 영역의 구조를 실질적으로 보존하는 미지의 결정 구조에 대한 입체형태를 결정하는 단계(예를 들어, 바람직한 상호작용은 저 에너지 입체형태가 형성되도록 형성되어야 하는 것을 고려하여)를 포함할 수 있다. "상동성 영역"은 예를 들어, 아미노산에 관하여, 동일하거나 유사한, 예를 들어, 지방족, 방향족, 극성, 음으로 하전된 또는 양으로 하전된 화학적 측쇄 기인 2개의 서열에서의 아미노산 잔기를 설명한다. 핵산 분자에 관한 상동성 영역은 적어도 85% 또는 86% 또는 87% 또는 88% 또는 89% 또는 90% 또는 91% 또는 92% 또는 93% 또는 94% 또는 95% 또는 96% 또는 97% 또는 98% 또는 99%의 상동성 또는 동일성을 포함할 수 있다. 동일한 및 유사한 영역은 때때로 해당 분야의 숙련자에 의해 각각 "불변의" 및 "보존된"으로 기재된다. 유리하게는, 제1 및 제3 단계는 컴퓨터 모델링에 의해 수행된다. 상동성 모델링은 해당 분야의 숙련자에게 잘 알려져 있는 기술이다(예를 들어, 문헌[Greer, Science vol. 228 (1985) 1055, and Blundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513] 참조). 본원에 언급된 물질에서 CRISPR-Cas9 결정 구조의 보존된 영역 및 미지의 결정 구조의 CRISPR-cas 시스템의 것들의 컴퓨터 표현은 미지의 결정 구조의 CRISPR-cas 시스템의 결정 구조의 예측 및 결정을 보조한다. 추가로, 가상 환경에서 CRISPR-Cas9 결정 구조를 사용하는 본 발명의 양태는 본원의 CRISPR-Cas9 결정 구조를 사용하여 예측되는 새로운 CRISPR-cas 결정 구조에 동등하게 적용될 수 있다. 이러한 방식으로, CRISPR-cas 결정 구조의 라이브러리가 수득될 수 있다. 이에 따라, 합리적인 CRISPR-cas 시스템 설계가 본 발명에 의해 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체의 입체형태 또는 결정 구조를 결정하여, 결정 구조가 아직 알려져 있지 않은 다른 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체의 입체형태 또는 결정 구조를 결정하기 위한 본원의 컴퓨터 기반의 방법에서 그러한 입체형태가 사용될 수 있다. 이들 결정 구조의 모두로부터의 데이터는 데이터베이스에 존재할 수 있으며, 본원의 방법은 라이브러리 내의 하나 이상의 결정 구조에 관하여 이루어지는 본원의 결정 구조 또는 그의 부분을 수반하는 본원의 비교에 의하여, 더욱 강력해질 수 있다. 본 발명은 추가로 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체의 구조를 생성하고/거나 합리적인 설계를 수행하도록 의도되는 시스템, 예를 들어, 컴퓨터 시스템을 포함한다. 시스템은 본원에 언급된 물질에 따른 또는 예를 들어 모델링에 의하여 그들로부터 유래되는 원자 좌표 데이터를 포함할 수 있으며, 상기 데이터는 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체 또는 그의 적어도 하나의 도메인 또는 하위-도메인의 3차원 구조, 또는 그에 대한 구조 인자 데이터를 정의하며, 상기 구조 인자 데이터는 본원에 언급된 물질의 원자 좌표 데이터로부터 유도 가능하다. 또한, 본 발명은 본원에 언급된 물질에 따른 또는 예를 들어, 상동성 모델링에 의해 그로부터 유래되는 원자 좌표 데이터가 있는 컴퓨터 판독 가능한 매체를 포함하며, 상기 데이터는 CRISPR-cas 시스템 또는 복합체 또는 그의 적어도 하나의 도메인 또는 하위-도메인의 3차원 구조, 또는 그에 대한 구조 인자 데이터를 정의하며, 상기 구조 인자 데이터는 본원에 언급된 물질의 원자 좌표 데이터로부터 유도 가능하다. "컴퓨터 판독 가능한 매체"는 컴퓨터에 의해 판독되고, 직접 접근될 수 있는 임의의 매체를 말하며, 자기 저장 매체; 광학 저장 매체; 전기 저장 매체; 클라우드 저장 및 이들 카테고리의 하이브리드를 포함하나 이들에 제한되지 않는다. 그러한 컴퓨터 판독 가능한 매체를 제공함으로써, 모델링 또는 다른 "가상 환경" 방법을 위하여 원자 좌표 데이터가 통상적으로 접근될 수 있다. 본 발명은 인터넷 또는 글로벌 통신/컴퓨터 네트워크를 통해, 예를 들어, 구독에 기초하여, 그러한 컴퓨터 판독 가능한 매체로의 접근을 제공함으로써 사업을 행하는 방법을 추가로 이해하거나; 또는 컴퓨터 시스템은 구독에 기초하여 사용자에게 접근가능할 수 있다. "컴퓨터 시스템"은 본 발명의 원자 좌표 데이터를 분석하기 위해 사용되는 하드웨어 수단, 소프트웨어 수단 및 데이터 저장 수단을 말한다. 본 발명의 컴퓨터 기반의 시스템의 최소한의 하드웨어 수단은 중앙 처리 장치(CPU), 입력 수단, 출력 수단 및 데이터 저장 수단을 포함할 수 있다. 바람직하게, 디스플레이 또는 모니터는 구조 데이터를 가시화하기 위해 제공된다. 본 발명은 추가로 예를 들어, 전기통신, 전화, 매스컴, 매스 미디어, 프레젠테이션(presentation), 인터넷, 이메일 등을 통한, 본원에 기재된 임의의 방법 또는 그의 단계에서 수득되는 정보 또는 본원에 기재된 임의의 정보의 전송 방법을 이해한다. 본 발명의 결정 구조를 분석하여, CRISPR-cas 시스템 또는 복합체의 푸리에(Fourier) 전기 밀도 맵(들)을 생성할 수 있으며; 유리하게는 3차원 구조는 본원에 언급된 물질에 따른 원자 좌표 데이터에 의해 정의되는 바와 같다. 푸리에 전기 밀도 맵은 X-선 회절 패턴에 기초하여 계산될 수 있다. 그 다음, 이들 맵을 사용하여 결합 또는 다른 상호작용의 양태를 결정할 수 있다. 전기 밀도 맵은 알려져 있는 프로그램, 예를 들어, CCP4 컴퓨터 패키지로부터의 것(문헌[Collaborative Computing Project, No. 4. The CCP4 Suite: Programs for Protein Crystallography, Acta Crystallographica, D50, 1994, 760-763])을 사용하여 계산될 수 있다. 맵 가시화 및 모델 구축을 위하여, 프로그램, 예를 들어, "QUANTA"(문헌[1994, San Diego, Calif.: Molecular Simulations, Jones et al., Acta Crystallography A47 (1991), 110-119])가 사용될 수 있다.
본원에 언급된 물질은 CRISPR-Cas9(스트렙토코커스 피오게네스)에 대한 원자 좌표 데이터를 제공하며, 각 원자를 독특한 수에 의해; 각 아미노산 잔기에 대한 화학적 요소 및 그의 위치(전기 밀도 맵 및 항체 서열 비교에 의해 결정되는 바와 같음), 요소가 위치되는 아미노산 잔기, 사슬 식별자, 잔기의 수, 각각의 원자의 결정학 축 원자 위치(옹스트롬 단위)에 관하여 정의되는 좌표(예를 들어, X, Y, Z), 각 위치에서의 원자의 점유, "B", 그의 원자 중심 주위의 원자의 이동을 설명하는 등방성 변위 파라미터(옹스트롬2 단위) 및 원자 번호를 열거한다.
본 발명의 특정 구현예에서, CRISPR-Cas9 시스템의 또는 CRISPR-Cas9의 성분의 결정 구조의 입체형태 변이는 CRISPR-Cas 시스템 기능에 중요할 수 있는 뉴클레오티드(RNA 또는 DNA) 구조 영역에 비한 단백질 구조 영역의 유연성 또는 이동에 관한 중요한 결정적인 정보를 제공한다. 본 발명에서 CRISPR 효소로서 Cas9(예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9)에 대하여 제공되는 구조 정보를 사용하여 CRISPR-Cas 시스템을 추가로 조작하고 최적화시킬 수 있으며, 이를 추론하여, 다른 CRISPR 효소 시스템에서도 구조-기능 관계, 특히 다른 II형 CRISPR 효소 또는 Cas9 오솔로그에서 구조-기능 관계의 정보를 얻을 수 있다. 본 발명의 일 양태는 2.4 Å 해상도에서 sgRNA 및 그의 표적 DNA와의 복합체에서의 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9의 결정 구조에 관한 것이다. 상기 구조에 의해, 그들의 계면에서 양으로 하전된 홈 내에 sgRNA:DNA 듀플렉스를 수용하는 표적 인식 및 뉴클레아제 엽으로 구성된 2엽형(bilobed) 구조가 드러났다. 인식 엽은 sgRNA 및 DNA 결합에 필수적이며, 뉴클레아제 엽은 HNH 및 RuvC 뉴클레아제 도메인을 함유하며, 이는 표적 DNA의 각각 상보성 및 비상보성 가닥의 절단을 위해 적절하게 배치된다. 본원에 제공되는 이러한 고-해상도 구조 및 기능 분석은 Cas9에 의한 RNA-안내 DNA 표적화의 분자 메카니즘을 설명하며, 최적화된 CRISPR-Cas 시스템 및 그의 성분을 생성하기 위한 풍부한 정보를 제공한다.
결정 구조는 Cas9에 의한 RNA-안내 DNA 표적화의 분자 메카니즘의 이해로의 일보를 제공할 수 있다. 본원의 구조 및 기능 분석은 Cas9-기반의 게놈 조절 기술의 합리적인 조작을 위한 유용한 스캐폴드를 제공하며, 표적 DNA 상의 PAM 서열의 Cas9-매개의 인식 또는 sgRNA:DNA 듀플렉스 사이의 미스매치 용인성에 관한 지침을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 양태는 절두 돌연변이체에 관한 것이며, 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 절두 돌연변이체는 생체내 및 치료적 응용을 위한 크기-제한 바이러스 벡터로의 Cas9의 패키징을 용이하게 할 수 있다. 유사하게, PAM 상호작용(PI) 도메인의 장래의 조작은 PAM 특이성의 프로그래밍을 가능하게 하고, 표적 부위 인식 충실도를 개선시키고, Cas9 게놈 조작 플랫폼의 다능성을 증가시킬 수 있다.
본원에 제공되는 구조 정보는 CRISPR 효소의 모듈형 또는 다수-부분 성분의 조작 또는 변경 또는 생성을 허용하는 sgRNA(또는 키메라 RNA) 및 표적 DNA와의 CRISPR 효소(예를 들어, Cas9)의 상호작용의 질의를 가능하게 하여, 신규한 작용성에 도달하거나 전체 CRISPR-Cas 시스템의 작용성을 최적화시킨다. 모듈형 또는 다수-부분 CRISPR 효소, 예를 들어, SpCas9 융합 작제물은 추가로 최적화될 수 있는 유도성 CRISPR-Cas 시스템의 생성을 가능하게 한다. 유도성 CRISPR-Cas 시스템의 양태는 2013년 7월 21일에 출원되고, 2014년 1월 30일에 PCT 공개 WO2014018423A2호로 공개된 발명의 명칭이 "INDUCIBLE DNA BINDING PROTEINS AND GENOME PERTURBATION TOOLS AND APPLICATIONS THEREOF"인 PCT 출원 PCT/US2013/051418호에 기재되어 있으며, 그의 내용은 그의 전문이 본원에 참조로 포함된다.
일 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 스위치를 포함할 수 있는 비-천연 발생 또는 조작된 CRISPR-Cas 시스템을 제공하며, 상기 CRISPR-Cas 시스템의 활성은 스위치에 관하여 적어도 하나의 유도물질 에너지원과의 접촉에 의해 조절된다. 본 발명의 일 구현예에서, 적어도 하나의 스위치 또는 상기 CRISPR-Cas 시스템의 활성에 관한 조절은 활성화되거나, 증진되거나, 종결되거나 억제될 수 있다. 적어도 하나의 유도물질 에너지원과의 접촉은 일차적 효과 및 이차적 효과를 초래할 수 있다. 일차적 효과는 핵 이입, 핵 이출, 제2 성분(예를 들어, 이펙터 분자)의 동원, (단백질, DNA 또는 RNA의) 입체형태 변화, 절단, 카고(예를 들어, 속박된(caged) 분자 또는 보조 인자)의 방출, 회합 또는 해리 중 하나 이상일 수 있다. 이차적 효과는 적어도 하나의 스위치 또는 상기 CRISPR-Cas 시스템의 활성에 관한 조절의 활성화, 증진, 종결 또는 억제 중 하나 이상일 수 있다. 일 구현예에서, 일차적 효과 및 이차적 효과는 캐스케이드로 발생할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, CRISPR-Cas 시스템은 적어도 하나 이상의 핵 국소화 신호(NLS), 핵 이출 신호(NES), 작용성 도메인, 유연성 링커, 돌연변이, 결실, 변경 또는 절두를 추가로 포함할 수 있다. NLS, NES 또는 작용성 도메인 중 하나 이상은 조건에 따라 활성화되거나 비활성화될 수 있다. 다른 구현예에서, 돌연변이는 전사 인자 상동성 영역 내의 돌연변이, DNA 결합 도메인 내의 돌연변이(예를 들어, 염기성 헬릭스 루프 헬릭스의 염기성 잔기의 돌연변이), 내인성 NLS 내의 돌연변이 또는 내인성 NES 내의 돌연변이 중 하나 이상일 수 있다. 본 발명은 유도물질 에너지원이 열, 초음파, 전자기 에너지 또는 화학물질일 수 있음을 이해한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 유도물질 에너지원은 항생제, 소분자, 호르몬, 호르몬 유도체, 스테로이드 또는 스테로이드 유도체일 수 있다. 더욱 바람직한 구현예에서, 유도물질 에너지원은 아브시스산(ABA), 독시사이클린(DOX), 큐메이트, 라파마이신, 4-하이드록시타목시펜(4OHT), 에스트로겐 또는 엑디손일 수 있다. 본 발명은 적어도 하나의 스위치가 항생제 기반의 유도성 시스템, 전자기 에너지 기반의 유도성 시스템, 소분자 기반의 유도성 시스템, 핵 수용체 기반의 유도성 시스템 및 호르몬 기반의 유도성 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있음을 제공한다. 더욱 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 스위치는 테트라사이클린(Tet)/DOX 유도성 시스템, 광 유도성 시스템, ABA 유도성 시스템, 큐메이트 억제제/오퍼레이터 시스템, 4OHT/에스트로겐 유도성 시스템, 엑디손 기반의 유도성 시스템 또는 FKBP12/FRAP(FKBP12-라파마이신 복합체) 유도성 시스템으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에 상세화된 바와 같은 조절의 양태는 적어도 하나 이상의 스위치(들)에 관한 것이다. 본원에 사용되는 용어 "스위치"는 협동 방식으로 생물학적 기능의 모든 양태, 예를 들어, 상기 기능의 활성화, 억제, 증진 또는 종결을 포함하는 변화에 영향을 미치도록 작용하는 시스템 또는 일련의 성분을 말한다. 일 양태에서, 용어 스위치는 유전자 조절 단백질의 기본 성분 및 이들 단백질이 인식하는 특정 DNA 서열을 포함하는 유전자 스위치를 포함한다. 일 양태에서, 스위치는 유전자 조절에 사용되는 유도성 및 억제성 시스템에 관한 것이다. 일반적으로, 유도성 시스템은 유전자 발현을 가능하게 하는 일부 분자(유도물질로 지칭)의 존재가 있지 않는 한, 작동이 안될 수 있다. 분자는 "발현을 유도"하는 것으로 지칭된다. 이것이 일어나는 방식은 조절 메카니즘 및 세포 유형의 차이에 좌우된다. 억제성 시스템은 유전자 발현을 억제하는 일부 분자(보조억제인자로 지칭)의 존재를 제외하고 작동된다. 분자는 "발현을 억제"하는 것으로 지칭된다. 이것이 일어나는 방식은 조절 메카니즘 및 세포 유형의 차이에 좌우된다. 본원에 사용되는 용어 "유도성"은 수반되는 분자적 메카니즘에 관련 없이 모든 양태의 스위치를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의해 이해되는 바와 같은 스위치는 항생제 기반의 유도성 시스템, 전자기 에너지 기반의 유도성 시스템, 소분자 기반의 유도성 시스템, 핵 수용체 기반의 유도성 시스템 및 호르몬 기반의 유도성 시스템을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 구현예에서, 스위치는 테트라사이클린(Tet)/DOX 유도성 시스템, 광 유도성 시스템, 아브시스산(ABA) 유도성 시스템, 큐메이트 억제제/오퍼레이터 시스템, 4OHT/에스트로겐 유도성 시스템, 엑디손-기반의 유도성 시스템 및 FKBP12/FRAP(FKBP12-라파마이신 복합체) 유도성 시스템일 수 있다.
CasLITE는 시간적으로, 그리고 공간적으로 정확한 방식으로 개별 내인성 유전자의 발현을 조절하거나 변경하도록 설계된다. CasLITE에서 사용되는 바와 같은 CRISPR-Cas 시스템은 관심 유전자의 프로모터 서열에 결합하여, 유전자 발현을 변경시키도록 설계될 수 있다. CRISPR 효소는 2개로 분할될 수 있으며, 여기서, 하나의 절반은 크립토크롬 이종이량체(크립토크롬-2 또는 CIB1)의 하나의 절반에 융합되는 한편, 나머지 크립토크롬 파트너는 CRISPR 효소의 다른 절반에 융합된다. 일부 양태에서, 전사 이펙터 도메인은 또한 CasLITE 시스템에 포함될 수 있다. 이펙터 도메인은 어느 하나의 활성화제, 예를 들어, VP16, VP64 또는 p65, 또는 억제제, 예를 들어, KRAB, EnR 또는 SID일 수 있다. LITE의 비자극 상태에서, 하나의 절반의 CRISPR 효소-크립토크롬2 단백질은 관심 유전자의 프로모터에 국소화되지만, CIB1-이펙터 단백질에 결합되지 않는다. 청색 스펙트럼 광을 사용한 LITE의 자극시에, 크립토크롬-2는 활성화되고, 입체형태 변화를 겪으며, 그의 결합 도메인을 드러낸다. CIB1은 차례로, 크립토크롬-2에 결합하여, 관심 유전자의 프로모터 영역으로의 CRISPR 효소의 제2 절반의 국소화를 초래하며, 게놈 편집을 개시하며, 이는 유전자 과발현 또는 침묵화를 야기할 수 있다. LITE의 양태는 문헌[Liu, H et al., Science, 2008] 및 문헌[Kennedy M et al., Nature Methods 2010]에 추가로 기재되어 있으며, 그의 내용은 본원에 그들 전문이 참조로 포함된다.
기능을 추가로 조절할 수 있는 활성화제 및 억제제 도메인은 종, 세기, 메카니즘, 기간, 크기 또는 임의의 수의 다른 파라미터에 기초하여 선택될 수 있다. 바람직한 이펙터 도메인은 전이효소 도메인, 인테그라제 도메인, 재조합효소 도메인, 레졸바제(resolvase) 도메인, 인버타제 도메인, 프로테아제 도메인, DNA 메틸트랜스퍼라제 도메인, DNA 디메틸라제 도메인, 히스톤 아세틸라제 도메인, 히스톤 디아세틸라제 도메인, 뉴클레아제 도메인, 억제제 도메인, 활성화제 도메인, 핵-국소화 신호 도메인, 전사-단백질 동원 도메인, 세포 흡수 활성 관련 도메인, 핵산 결합 도메인 또는 항체 제시 도메인을 포함하나 그들에 한정되지 않는다.
또한, 화학적 유도성 시스템을 생성하기 위한 몇몇의 상이한 방식이 존재한다: 1. 아브시스산(ABA)에 의해 유도성 ABI-PYL 기반의 시스템(예를 들어, stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/sigtrans;4/164/rs2의 웹사이트 참조), 2. 라파마이신(또는 라파마이신에 기초한 관련 화학물질)에 의해 유도성 FKBP-FRB 기반의 시스템(예를 들어, nature.com/nmeth/journal/v2/n6/full/nmeth763.html의 웹사이트 참조), 3. 지베렐린(GA)에 의해 유도성 GID1-GAI 기반의 시스템(예를 들어, nature.com/nchembio/journal/v8/n5/full/nchembio.922.html의 웹사이트 참조).
본 발명에 의해 고려되는 다른 시스템은 하위-세포 국소화의 변화에 기초하여 화학적으로 유도성 시스템이다. 또한, 본 출원인들은 관심 게놈 유전자좌를 표적으로 하도록 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 이해하며, Cas 효소는 2개의 융합 작제물로 분할되며, 이들은 화학물질 또는 에너지 감수성 단백질의 상이한 부분에 추가로 연결된다. 이러한 화학물질 또는 에너지 감수성 단백질은 화학물질 또는 에너지 감수성 단백질로의 화학물질의 결합 또는 에너지 전달시에 Cas 효소의 어느 하나의 절반의 하위-세포 국소화의 변화(즉, 세포질로부터 세포의 핵으로의 Cas 효소의 어느 하나의 절반의 수송)를 야기할 것이다. 그의 활성이 재구성된 CRISPR-Cas 시스템에 대한 기질의 결여로 인하여 격리되는 하나의 하위-세포 구획 또는 세포소기관으로부터 기질이 존재하는 다른 것으로의 융합 작제물의 이러한 수송은 성분이 결합되고, 기능적 활성이 재구성되게 할 것이며, 이어서, 그의 요망되는 기질(즉, 포유류 핵 내의 게놈 DNA)과 접촉되게 하고, 표적 유전자 발현의 활성화 또는 억제를 초래할 것이다.
다른 유도성 시스템이 고려되며, 예를 들어, 비제한적으로, 중금속에 의한 조절[문헌[Mayo KE et al., Cell 1982, 29:99-108]; 문헌[Searle PF et al., Mol Cell Biol 1985, 5:1480-1489] 및 문헌[Brinster RL et al., Nature (London) 1982, 296:39-42]], 스테로이드 호르몬[문헌[Hynes NE et al., Proc Natl Acad Sci USA 1981, 78:2038-2042]; 문헌[Klock G et al., Nature (London) 1987, 329:734-736] 및 문헌[Lee F et al., Nature (London) 1981, 294:228-232.]], 열 충격[문헌[Nouer L: Heat Shock Response. Boca Raton, FL: CRC; 1991]] 및 다른 시약이 개발되었다[문헌[Mullick A, Massie B: Transcription, translation and the control of gene expression. In Encyclopedia of Cell Technology Edited by: Speir RE. Wiley; 2000:1140-1164] 및 문헌[Fussenegger M, . Biotechnol Prog 2001, 17:1-51]]. 그러나 이들 유도성 포유류 프로모터가 가진 한계, 예를 들어, 유도물질(열 충격, 중금속, 글루코코르티코이드 등)의 다면발현 효과 및 "오프" 상태의 "누출(leakiness)"이 있다. 곤충 호르몬(엑티손)의 사용은 포유류 세포에서 세포 과정의 간섭을 감소시키기 위한 시도로 제안되었다[문헌[No D et al., Proc Natl Acad Sci USA 1996, 93:3346-3351]]. 다른 적합한 시스템은 유도물질로서 라파마이신을 사용하지만[문헌[Rivera VM et al., Nat Med 1996, 2:1028-1032]], 면역억제제로서의 라파마이신의 역할은 생체내에서 그의 이용에 대한 주요 제한이 되고, 이에 따라, 유전자 발현의 조절을 위하여 생물학적 비활성 화합물을 찾는 것이 필요하였다[문헌[Saez E et al., Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97:14512-14517]].
본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예의 방식으로 추가로 기재될 것이다.
실시예
하기의 실시예는 본 발명의 다양한 구현예를 예시할 목적으로 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하고자 하지 않는다. 본원에 기술된 방법과 함께 본 발명의 실시예는 본원에서 바람직한 구현예를 대표하는 것이며, 예시적이고, 본 발명의 범주에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 거기에서의 변화 및 다른 용도는 청구범위의 범주에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 목적에 포함되며, 해당 분야의 숙련자에 의해서 수행될 것이다.
실시예 1: 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9 결정 구조에 기초한 모듈형 또는 다수-부분 유도성 CRISPR - Cas 시스템의 조작
결정 구조 정보(각각 및 전부가 본원에 참조로 포함되는 2013년 12월 12일에 출원된 미국 가출원 제61/915,251호, 2014년 1월 22일에 출원된 제61/930,214호, 2014년 4월 15일에 출원된 제61/980,012호; 및 문헌[Nishimasu et al, "Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA," Cell 156(5):935-949, DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.cell.2014.02.001 (2014)]에 기재된 바와 같음)는 유도성 CRISPR-Cas 시스템으로 혼입될 수 있는 모듈형 또는 다수-부분 CRISPR 효소를 절두시키고, 생성하기 위한 구조적 정보를 제공한다. 특히, 스트렙토코커스 피오게네스 Cas9(SpCas9)에 대한 구조적 정보가 제공되며, 이것은 다른 Cas9 오솔로그 또는 다른 II형 CRISPR 효소로 추론될 수 있다. 일련의 화학적-유도성 Cas9를 2-성분 시스템으로 작제하였으며, Cas9 단백질의 하나의 부분은 FKBP에 융합되고, 나머지는 FRB에 융합된다(예를 들어, FKBP-Cas9(아미노산 1 내지 1098), FRB-Cas(1099 내지 1368))(일련의 유력한 융합 작제물은 도 1로부터 결정될 수 있음). 화학물질 유도의 부재하에서, 2개의 유도성 Cas9 성분의 동시-트랜스펙션은 촉매 활성을 갖지 않지만, 성분의 기능적 어셈블리는 라파마이신[5 nM 내지 10 μM]을 사용하여 유도될 수 있다.
SpCas9 융합 작제물을 깁슨 어셈블리에 의해 생성하였다. 약술하면, SpCas9, FKBP 및 FRB 단편을 PCR 증폭에 의해 생성하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, PX330으로부터의 코돈 최적화된 SpCas9를 SpCas9에 대한 주형으로 사용하였으며, pTB005를 FKBP 및 FRB에 대한 주형으로 사용하였다. NLS에 대한 서열, 15개 아미노산 링커 및 20 bp 깁슨 상동성 측에 대한 서열을 PCR 프라이머에 혼입시켰다(도 3). SpCas9 PCR 단편 및 FKBP 또는 FRB PCR 단편을 깁슨 어셈블리 시약에서 1시간 동안 벡터 백본과 인큐베이션시켰다. 벡터 백본을 Age1 및 EcoR1으로 절단된 PX330으로부터 제조하고, Fast-AP(모든 효소는 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)으로부터의 것)로 처리하였다(도 2).
NLS 부재 FRB-Cas9 융합 조각을 NLS 서열이 프라이머에 혼입되지 않은 것을 제외하고, 상기 기재된 바와 같이 생성하였다(도 4). NES-FRB-Cas9 융합 조각을 깁슨 어셈블리에 의해 생성하였다. 약술하면, NES 울트라머(도 4)를 어닐링시키고, 깁슨 어셈블리 시약에서 1시간 동안 Age1 절단된 NLS 부재 FRB-Cas9 융합 플라스미드와 인큐베이션시켰다.
시퀀싱된 확인된 클론을 HEK293FT 세포로의 트랜스펙션을 위해 사용하였다: HEK 세포를 100 ng의 각각의 SpCas9-FKBP 및 SPCas9-FRB 및 100 ng의 EMX1을 표적으로 하는 sgRNA 가이드로 트랜스펙션시켰다. SpCas9 어셈블리의 유도를 위하여, 세포를 트랜스펙션 직후에 1 ㎛ 라파마이신으로 처리하고, 신규한 라파마이신을 24시간마다 첨가하였다. 트랜스펙션된 미처리 세포를 대조군으로 사용하였다. 세포를 트랜스펙션 후 72시간에 수집하고, 표적화된 EMX1 유전자좌에서의 삽입결실 형성을 서베이어 검정에 의해 평가하였다(도 5).
실시예 2: 조건적 게놈 편집 및 전사 조절을 위한 분할형 Cas9 구조
CRISPR-Cas는 미생물 적응 면역계이며, 이는 외래 DNA에 대하여 보호를 제공한다1. RNA-안내된 엔도뉴클레아제 Cas9를 포유류 세포 및 동물 모델에서의 게놈 편집을 위한 도구로서 적합화시켰다2. 키메라 단일-가이드 RNA(sgRNA)를 사용하여3, Cas9를 사용하여 포유류 세포에서 효율적인 게놈 편집을 용이하게 할 수 있다4 ,5. 또한, 촉매적 비활성 Cas를 사용하는 전략은 이펙터 단백질을 게놈 표적에 지향시켜6 -9, 전사 조절을 달성할 수 있다. 본원에서, 본 출원인들은 Cas9가 조절된 재조립을 위하여 2개의 단편으로 분할되고, 라파마이신 감수성 이량체화 도메인을 사용하여 화학적으로 유도 가능하게 되어, 게놈 편집 및 전사 조절을 매개할 수 있음을 입증한다.
분할형 Cas9 시스템을 개발하기 위하여, 본 출원인들은 sgRNA 및 상보성 표적 DNA와의 복합체에서의 Cas9의 결정 구조에 기초하여 11개의 유력한 분할 부위를 확인하였다10. 5개의 부위가 비구조화 영역에 위치하며, 6개의 부위가 단백질 표면상의 루프에 위치한다(도 6a 및 도 8a). 얻어진 C- 및 N-말단 Cas9 단편을 각각 라파마이신의 포유류 표적(mTOR)의 FK506 결합 단백질 12(FKBP) 및 FKBP 라파마이신 결합(FRB) 도메인11에 융합시켰다(도 8b 및 도 6b). 본 출원인들은 이전에 입증된 sgRNA를 사용하여 인간 배아 신장 293FT(HEK293FT) 세포에서 EMX1 유전자좌를 표적으로 함으로써 모든 11개의 분할형-Cas9 세트를 시험하였다4. 서베이어 뉴클레아제 검정을 사용하여, 본 출원인들은 라파마이신으로 처리된 세포에서 모든 분할형-Cas9 세트에 의해 매개되는 삽입/결실(삽입결실) 돌연변이를 검출할 수 있었다. 또한, 중등의 수준의 삽입결실도 또한 라파마이신의 부재하에 검출될 수 있었다(도 8c 내지 도 8d). 관찰되는 백그라운드 활성은 개별의 분할된 조각의 잔류 뉴클레아제 활성 때문이 아니었는데, 이는 그들의 대응부가 없는 조각 중 어느 것도 서베이어를 사용하여 검출 가능한 수준의 삽입결실을 보이지 않았기 때문이다(데이터 미도시). 이량체화 도메인이 결여된 작은 세트의 분할형-Cas9를 사용하여, 본 출원인들은 Cas9 분할 단편이 세포에서 자가-조립될 수 있는 것을 관찰하였으며(도 8e 내지 도 8g), 이는 관찰되는 백그라운드 활성을 설명하였다.
분할형-Cas9 시스템에서 백그라운드 활성이 Cas9의 자발적인 자가-어셈블리에 기인한다는 것을 확립한 후에, 본 출원인들은 공간적으로 각각의 Cas9 단편을 분리하여 유지하는 것이 백그라운드 활성을 감소시킬 수 있다는 가설을 세웠다12. 핵-국소화된 Cas9(C)-FKBP 단편과 이량체화할 가능성이 더 적은 세포질 내에, Cas9(N)-FRB 단편을 격리시키기 위하여, 본 출원인들은 Cas9(N)-FRB 상의 2개의 핵 국소화 서열(NLS)을 인간 단백질 티로신 키나제 2 유래의 단일의 핵 이출 서열(NES)로 대체하였다13(Cas9(N)-FRB-NES). 라파마이신의 존재하에서, Cas9(N)-FRB-NES는 Cas9(C)-FKBP-2xNLS와 이량체화되어, 완전한 Cas9 단백질을 재구성하며, 이는 핵 수송의 균형을 핵 이입을 향해 이동시키고, DNA 표적화를 가능하게 한다(도 6c 내지 도 6d). 본 출원인들은 높은 수준의 활성을 나타내는(도 8d) 분할형-4 및 분할형-5를 사용하여 이러한 전략을 시험하였으며(도 6a), 단일의 NES가 백그라운드 활성을 서베이어 검정의 검출 한계 미만으로 감소시키기에 충분한 것을 발견하였다(도 6e). 본 출원인들의 데이터는 라파마이신 활성화된 이량체화와 병용되는 세포 내측으로의 Cas9-FRB/FKBP 분할형 단편의 공간적 격리가 Cas9 뉴클레아제의 유도성 활성화를 가능하게 하는 것을 보여준다.
고 용량의 Cas9는 가이드 가닥에 소수의 미스매치를 나타내는 표적외(OT) 서열에서 삽입결실 빈도를 가중시킬 수 있다14. 미스매치가 비-연속적이고/거나 가이드의 씨드 영역의 외측이면, 그러한 서열은 특히 민감하다4 , 14, 15. 시간이 지남에 따라, OT 부위에서의 삽입결실의 축적은 구성적으로 발현되는 Cas9와 함께 관찰된다16. 본 출원인들은 Cas9 활성의 시간적 조절을 사용하여 장기간 발현 실험에서 투여량을 감소시킬 수 있고, 이에 따라, 구성적으로 활성인 Cas9에 비하여 감소된 표적외 삽입결질을 초래하는 것을 이해한다. 그 목적을 위하여, 본 출원인들은 분할형-5에 대한 lentiCRISPR 플라스미드16와 유사한 분할형-Cas9 렌티바이러스 작제물을 생성하였다(렌티 분할형-Cas9 분할형-5에 대한 LSC-5)(도 6f). 둘 모두의 분할된 조각 및 퓨로마이신 내성 유전자(puro)는 신장 인자 1α 짧은(EFS) 프로모터의 조절하에 존재한다. HEK293FT 세포를 0.3 이하의 MOI로 형질도입하고, 5일 동안 퓨로마이신을 사용하여 선택하였다.
야생형-Cas9 형질도입된 HEK293FT 세포를 형질도입 후 4주에 딥 시퀀싱에 의해 분석하는 한편, LSC-5 형질도입된 세포를 6주 후에 분석하여, 200 nM 라파마이신으로의 12일의 연속 처리를 설명하였다(도 6g). 야생형-Cas9 및 이전에-입증된 EMX1-표적화 sgRNA4 둘 모두를 지니는 렌티바이러스가 형질도입된 세포에서, 본 출원인들은 표적 상의 부위에서 약 95%의 삽입결실 및 4개의 입증된 표적-외 부위(OT-1 내지 4)에서 돌연변이를 검출하였다17. 비교하여, LSC-5가 형질도입된 세포에서의 표적 상 삽입결실 빈도는 12일의 라파마이신 처리 후에 약 43%였다. 미처리 세포에서, EMX1 표적 상의 삽입결실에서, LSC-5와 대조군 시료 간에 유의미한 차이를 검출할 수 없었다. 추가로, OT 삽입결실에서 유의미한 증가를 라파마이신 처리와 관계없이, LSC-5가 형질도입된 세포에서 검출할 수 없었다(일원분산분석, p>0.9999). 이들 데이터는 분할형 Cas9의 안정적인 저 카피의 발현을 사용하여 표적외 부위에서 유의미한 돌연변이 없이 표적화된 유전자좌에서 상당한 삽입결실을 유도할 수 있음을 입증한다.
또한, Cas9의 뉴클레아제 활성은 DNA 결합 능력을 방해하지 않고 비활성이 될 수 있다. 얻어진 촉매적으로 사멸된 Cas9(dCas9)를 사용하여, 전사활성화(transactivation) 도메인을 표적화된 유전자좌로 수송할 수 있다7. 본 출원인들은 분할형-Cas9 구조를 dCas9에 적용하여 유도성 전사 활성화를 매개할 수 있음을 보여주려고 하였다. 이러한 목적을 위하여, 본 출원인들은 FRB 융합체(dCas9(N)-FRB-2xNES) 내에 D10A 점 돌연변이 및 FKBP 융합체 내의 N863A 점 돌연변이를 지니는 분할형-4 단편을 클로닝하였으며, VP64 전사활성화 도메인을 Cas9(C)-FKBP-2xNLS에 부가하였다(dCas9(C)-FKBP-2xNLS-VP64)(도 7a). 이들 단편은 촉매적 비활성 Cas9-VP64 융합체(dCas9-VP64)를 재구성할 것이다.
본 출원인들은 유전자마다 4개의 이전에 입증된 sgRNA7를 사용하여 HEK293FT 세포에서 ASCL1, MYOD1 또는 IL1RN 전사를 활성화시킴으로써 분할형 dCas9-VP64의 유도성을 시험하였다. 세포를 트랜스펙션 후 24시간에 라파마이신으로 처리하고, 트랜스펙션 후 48시간에 RNA에 대하여 수집될 때까지 200 nM 라파마이신에서 유지하였다. 비트랜스펙션된 HEK293FT에 비한 mRNA 수준의 유의미한 증가가 모든 3개의 유전자에 대한 정량적 리얼-타임 PCR(qPCR)을 사용하여 검출될 수 있었다(일원분산분석, ASCL1 p<0.0001, MYOD1 p<0.0001, IL1RN p<0.0001)(도 7b). 백그라운드 활성은 라파마이신 유도된 세포에 비하여 낮았고(+라파마이신/-라파마이신 비, ASCL1 = 77, MYOD1 = 29, IL1RN = 649), 비트랜스펙션된 세포에 비하여 유의미하지 않았다(일원분산분석, p>0.99). 따라서, 전사 활성화를 라파마이신의 존재하에 분할형 dCas9-VP64에 의해 유도하였다.
전사 활성화가 라파마이신의 제거시에 가역적인지를 시험하기 위하여, 본 출원인들은 HEK293FT 세포에서 ASCL1 발현 및 N2A 세포에서 Neurog2를 활성화시켰다(도 7c). 세포를 트랜스펙션 후 24시간에 라파마이신으로 처리하였다. 라파마이신을 2시간 후에 중단시키거나 지속적인 유도를 위하여 24시간마다 대체하였다. 세포를 라파마이신 처리 후 2, 6, 12, 24 및 72시간에 수집하고, mRNA 수준을 qPCR에 의해 분석하였다. ASCL1 및 Neurog2 수준은 전체 연구 동안 증가되었으며, 지속적인 라파마이신 처리 및 2시간 처리 간에 유의미한 차이가 없었다(상관 계수, ASCL1 = 1, Neurog2 = 1).
본 출원인들은 Cas9가 2개의 별개의 단편으로 분할될 수 있음을 입증하였으며, 이는 화학적 유도를 사용하여 다시 결합되는 경우 작용성 전장 Cas9 뉴클레아제를 재구성한다. 분할형 Cas9 구조는 다양한 응용에 유용하다. 예를 들어, 분할형 Cas9는 각 단편을 상이한 조직 특이적 프로모터 하에 둠으로써 Cas9 활성을 교차 세포 집단에 제한하기 위한 유전적 전략을 가능하게 한다. 또한, 상이한 화학적 유도성 이량체화 도메인, 예를 들어, APA18 및 지베렐린19을 사용하여 또한 상이한 조절 도메인에 융합된 유도성 Cas9의 어레이를 생성하여, 합성 전사 네트워크를 작제할 수 있다.
재료 및 방법
분할형- Cas9의 설계 및 작제
개별 분할형-Cas9 플라스미드를 깁슨 어셈블리 클로닝20(뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)로부터의 깁슨 마스터 믹스(Gibson master mix))에 의해 생성하였다. 약술하면, 개별 분할형-Cas9 조각을 PX330으로부터 PCR 증폭시키고, FKBP/FRB 조각을 gBlock 유전자 단편(인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies))에서 증폭하였다. 깁슨 상동성, 글리신-세린 링커, P2A, NLS 및/또는 NES 서열을 하기와 같은 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 도입하였다:
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
LSC-5를 PCR 주형으로서 이전에 생성된 분할형-Cas9 조각을 사용하여 깁슨 어셈블리에 의해 생성하였다. 전사활성화 분할형 dCas9-VP64를 PCR 주형으로서 D10A, N863A 돌연변이체 Cas9를 사용하여 생성하고, 깁슨 상동성을 갖는 VP64를 gBlock 유전자 단편(인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈)으로서 구입하였다.
세포 배양, 트랜스펙션 및 라파마이신 처리
인간 배아 신장 293FT(HEK293FT) 세포주(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)) 및 마우스 Neuro 2a(N2a) 세포주(시그마 알드리치)를 5% CO2 인큐베이션과 함께 37℃에서 10% FBS(하이클론(HyClone)), 2 mM GlutaMAX(라이프 테크놀로지즈), 100 U/㎖ 페니실린, 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium)(DMEM)에서 유지시켰다. HEK293FT 세포를 트랜스펙션 24시간 전에 24-웰 플레이트(코닝(Corning)) 상에 씨딩하였다. 세포를 제조업체의 권장 프로토콜에 따라 80% 내지 90% 컨플루언시에서 Lipofectamine 2000(라이프 테크놀로지즈)을 사용하여 트랜스펙션시켰다. 24-웰 플레이트의 각 웰에 대하여, 총 500 ng의 DNA를 사용하였다. 분할형-Cas9 트랜스펙션을 위하여, 200 ng의 FKBP-Cas9 및 200 ng의 FRB-Cas9 + 100 ng의 U6-sgRNA PCR 산물을 사용하였다. 야생형-Cas9에 있어서, 200 ng의 PX330 및 200 ng의 pUC19 + 100 ng의 U6-sgRNA PCR 산물이었다. 전사 활성화를 위하여, 200 ng의 FKBP-Cas9 및 200 ng의 FRB-Cas9 + 4개의 가이드를 지니는 플라스미드 각각에 대하여 25 ng을 트랜스펙션시켰다.
분할형-Cas9 이량체화를 200 nM 라파마이신(아브캄(Abcam))으로 유도하였다. 달리 언급되지 않는 한, 라파마이신 함유 배지를 24시간마다 200 nM 라파마이신을 함유하는 신선한 배지로 교체하였다.
게놈 변형에 대한 서베이어 뉴클레아제 검정
HEK293FT 세포를 상기 기재된 바와 같이 DNA로 트랜스펙션시켰다. 세포를 게놈 DNA 추출 전에 트랜스펙션 후 72 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 게놈 DNA를 제조업체의 프로토콜에 따라 QuickExtract DNA 추출 용액(에피센터(Epicentre))을 사용하여 추출하였다. 간단히, 펠렛화된 세포를 QuickExtract 용액에 재현탁시키고, 15분 동안 65℃, 15분 동안 68℃, 및 10분 동안 98℃에서 인큐베이션하였다. 각각의 유전자에 대한 CRISPR 표적 부위에 측부 배치된 게놈 영역을 하기와 같은 표적 부위 및 프라미어를 사용하여 PCR 증폭시켰다:
서베이어 검정 및 차세대 시퀀싱을 위한 앰플리콘을 생성하기 위해 사용되는 프라이머
Figure pct00037
산물을 제조처의 프로토콜에 따라 퀴아퀵 스핀 컬럼(QiaQuick Spin Column)(퀴아젠(Qiagen))을 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 산물 총 200 ng을 1 ㎕의 10× Taq DNA 중합효소 PCR 완충제(엔자이머틱스(Enzymatics)) 및 10 ㎕의 최종 부피까지 초순수와 혼합하고, 재-어닐링 과정을 겪게 하여, 헤테로듀플렉스 형성을 가능하게 하였다: 95℃에서 10분, -2℃/초의 경사로 95℃에서 85℃, -0.25℃/초로 85℃에서 25℃ 및 25℃에서 1분 유지. 재-어닐링 후에, 산물을 제조처의 권고된 프로토콜에 따라 서베이어 뉴클레아제 및 서베이어 인핸서 S(트랜스게노믹스(Transgenomics))로 처리하고, 4 내지 20% 노벡스(Novex) TBE 폴리아크릴아미드 겔(라이프 테크놀로지즈)에서 분석하였다. 겔을 SYBR 골드(Gold) DNA 염료(라이프 테크놀로지즈)로 30분 동안 염색하고, Gel Doc 겔 영상화 시스템(바이오-라드(Bio-rad))으로 영상화시켰다. 정량화는 상대적인 밴드 세기에 기초하였다. 삽입결실 백분율을 식, 100 × (1 - (1 - (b + c)/(a + b + c))1/2)에 의해 결정하였으며, 여기서, a는 분해되지 않은 PCR 산물의 통합 세기이며, b 및 c는 각 절단 산물의 통합 세기이다.
표적화 특이성을 평가하기 위한 딥 시퀀싱
24-웰 플레이트에 플레이팅된 HEK 293FT 세포를 게놈 DNA 추출 72시간 전에 Cas9 플라스미드 DNA 및 sgRNA PCR 카세트로 트랜스펙션시켰다. EMX1에 대한 CRISPR 표적 부위의 측부 배치된 게놈 영역 또는 표적외를 하기와 같은 프라이머를 사용하여 융합 PCR 방법에 의해 증폭시켜, 일루미나(Illumina) P5 어댑터 및 독특한 시료-특이적 바코드를 표적 앰플리콘14에 부착시켰다:
Cas9 결합을 유도하기 위해 사용되는 가이드.
Figure pct00038
PCR 산물을 제조처의 권고된 프로토콜에 따라 QiaQuick 스핀 컬럼(퀴아젠)을 사용하여 겔 추출에 의해 정제하였다. 바코드가 부착되고, 정제된 DNA 시료를 Quant-iT 피코그린(PicoGreen) dsDNA 검정 키트 또는 Qubit 2.0 플루오로미터(Fluorometer)(라이프 테크놀로지즈)에 의해 정량화시키고, 등몰비로 풀링하였다. 그 다음, 시퀀싱 라이브러리를 일루미나 MiSeq 퍼스널 시퀀서(Personal Sequencer)(라이프 테크놀로지즈)를 사용하여 시퀀싱하였다.
시퀀싱 데이터 분석 및 삽입결실 검출.
MiSeq 판독물을 평균 프레드(Phred) 품질(Q 스코어)이 적어도 30이면서 바코드 및 앰플리콘 정방향 프라이머에 서열이 완전히 매치해야 하는 조건의 요구에 의해 필터링하였다. 표적 상 유전자 좌 및 표적외 유전자 좌로부터 얻어진 판독물을, 파이썬 디플립 모듈(Python difflib module)에서 구현되는 바와 같이, 표적 위치의 상류 및 하류 30개 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 좌 서열(총 80 bp)에 대한 랫클리프-오버쉘프(Rarcliff-Obershelp) 스트링 비교에 의해 분석하였다. 얻어진 편집 조작을 분석하였으며, 판독물은 만일 삽입 또는 결실 조작이 확인되었다면 삽입결실로서 계수되었다. 만일 표적 영역 정렬의 일부가 MiSeq 판독물 그 자체에 포함되지 않거나, 또는 만일 5개 초과의 염기가 호출되지 않는다면, 분석된 표적 영역들을 제외하였다.
상대적 유전자 발현의 pPCR 분석.
RNA를 제조처의 지침에 따라 RNeasy 키트(퀴아젠)를 사용하여 추출하고, 시료마다 1 ㎍의 RNA를 qScript(퀀타 바이오시스템즈(Quanta Biosystems))를 사용하여 역전사시켰다. 상대적 mRNA 수준을 표적화된 유전자에 특이적인 택맨(TaqMan) 프로브 및 내인성 대조군으로서 GAPDH(라이프 테크놀로지즈)를 사용하여 역전사 및 정량적 PCR(qPCR)에 의해 측정하였으며, 택맨 프로브 ID는 하기와 같다:
택맨 프로브 ID
유전자 ID
ASCL1 Hs00269932_ml
MYOD1 Hs02330075_gl
NEUROG2 Mm00437603_gl
IL1RN Hs00893626_ml
ΔΔCt 분석을 사용하여, 200 nM 라파마이신으로 처리된 비트랜스펙션된 세포에 비한 배수-변화를 수득하였다. 결과는 본원에 논의된 바와 같이 도 6, 7 및 8에 나타나 있다.
실시예 2를 위한 참고문헌
Figure pct00039
Figure pct00040
실시예 3 sgRNA 및 분할형 Cas9의 전달을 위한 단일 발현 벡터
방법: 벡터를 도 9a에 나타낸 바와 같이 작제하였다. sgRNA는 U6 프로모터의 조절하에 있었다. 2개의 상이한 Cas9 분할형을 사용하였다: 실시예 2로부터의 분할형 4 및 5. 분할형 Cas9 작제물은 다음에 기초하였다: GlySer 링커를 통해 분할형 Cas9의 C 말단 부분에 융합된 FKBP가 있는, NLS가 측부 배치된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물; 및 GlySer 링커를 통해 분할형 Cas9의 N 말단 부분, NES가 측부 배치된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물. 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 분리하기 위하여, P2A를 사용하여, 전사시에 분할시켰다. 분할은 "리보솜 스키핑"에 기인한다. 요컨대, 리보솜은 번역 동안 아미노산을 건너뛰고, 이는 단백질 쇄를 파단시키고, 2개의 개별 단백질을 야기한다. 다른 특징은 폴리A 테일 및 원형 플라스미드(발현 카세트)를 포함하였다. 벡터를 EMX1을 표적화하는 가이드(실시예 2에서 사용되는 것과 동일한 가이드)를 사용하여 HEK293FT 세포에서 시험하였다. 24개 웰마다 500 ng의 단일의 발현 벡터를 트랜스펙션시켰다. 라파마이신을 약 72시간 동안 처리하였다(24시간마다 신선한 라파마이신). 삽입결실을 딥 시퀀싱에 의해 검출하였다.
결과: 꽤 높은 백그라운드가 관찰되었으나, 이러한 방법이 장점을 갖는 것이 명백하다. 도 9b의 좌측의 3개의 컬럼은 라파마이신을 사용한 것이며, 우측의 3개의 컬럼은 라파마이신을 사용하지 않은 것이다. 라파마이신의 존재 대 부재하에 예상될 것과 같이 야생형 효소 간의 차이가 거의 없었지만, 라파마이신의 존재 또는 부재하의 2개의 분할형 Cas9(분할형4 및 분할형5)에 대한 결과 간에는 현저한 차이가 있었다. 분할형 Cas9는 라파마이신의 존재하에 야생형과 유사한 삽입결실 형성을 보였지만, 라파마이신의 부재하에 야생형보다 현저히 더 낮은 삽입결실 형성을 보였다.
일반 참고문헌:
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
* * *
본 발명의 바람직한 구현예가 본원에 제시되고 기재되었으나, 상기 구현예는 단지 예로 제공된 것이 해당 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 본 발명을 벗어나지 않고 다수의 변동, 변화, 및 치환이 해당 분야의 숙련자에 의해 이제 발생될 것이다. 본원에 기재된 본 발명의 구현예에 대한 다양한 대안이 본 발명의 실시에서 이용될 수 있음이 이해되어야 한다. 하기의 청구범위가 본 발명의 범위를 한정하며, 이들 청구범위 및 그들의 등가물의 범주 내의 방법 및 구조가 그에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BROAD INSTITUTE INC. MASSACHUSETTS INSTITUTE OF TECHNOLOGY <120> CRISPR-CAS SYSTEMS AND METHODS FOR ALTERING EXPRESSION OF GENE PRODUCTS, STRUCTURAL INFORMATION AND INDUCIBLE MODULAR CAS ENZYMES <130> 47627.99.2051 <140> PCT/US2014/070068 <141> 2014-12-12 <150> 61/939,228 <151> 2014-02-12 <150> 61/915,267 <151> 2013-12-12 <160> 163 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 2 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 3 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 3 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 4 <211> 60 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 4 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 5 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 7 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 <210> 9 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 9 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser 35 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 10 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 <210> 11 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser 50 <210> 12 <211> 55 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 12 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 13 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23 <210> 14 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 14 nnnnnnnnnn nnngg 15 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 15 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn ngg 23 <210> 16 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(11) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 16 nnnnnnnnnn nngg 14 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 17 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw 27 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (13)..(14) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 18 nnnnnnnnnn nnnnagaaw 19 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(22) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 19 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagaaw 27 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(11) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (12)..(13) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 20 nnnnnnnnnn nnnagaaw 18 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 21 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nggng 25 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(12) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (13)..(13) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 22 nnnnnnnnnn nnnggng 17 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (21)..(21) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (24)..(24) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 23 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nggng 25 <210> 24 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(11) <223> a, c, t or g <220> <221> modified_base <222> (12)..(12) <223> a, c, t, g, unknown or other <220> <221> modified_base <222> (15)..(15) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 24 nnnnnnnnnn nnggng 16 <210> 25 <211> 136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 25 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcaagatt tagaaataaa tcttgcagaa 60 gctacaaaga taaggcttca tgccgaaatc aacaccctgt cattttatgg cagggtgttt 120 tcgttattta attttt 136 <210> 26 <211> 123 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 26 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcagaaat gcagaagcta caaagataag 60 gcttcatgcc gaaatcaaca ccctgtcatt ttatggcagg gtgttttcgt tatttaattt 120 ttt 123 <210> 27 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 27 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gtttttgtac tctcagaaat gcagaagcta caaagataag 60 gcttcatgcc gaaatcaaca ccctgtcatt ttatggcagg gtgttttttt 110 <210> 28 <211> 102 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 28 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tt 102 <210> 29 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 29 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt gttttttt 88 <210> 30 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <220> <221> modified_base <222> (1)..(20) <223> a, c, t, g, unknown or other <400> 30 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcatt tttttt 76 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 31 gagtccgagc agaagaagaa 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 32 gagtcctagc aggagaagaa 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 33 gagtctaagc agaagaagaa 20 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 34 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 35 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 35 Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1 5 10 15 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 36 Pro Ala Ala Lys Arg Val Lys Leu Asp 1 5 <210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 37 Arg Gln Arg Arg Asn Glu Leu Lys Arg Ser Pro 1 5 10 <210> 38 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 38 Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly 1 5 10 15 Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro 20 25 30 Arg Asn Gln Gly Gly Tyr 35 <210> 39 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 39 Arg Met Arg Ile Glx Phe Lys Asn Lys Gly Lys Asp Thr Ala Glu Leu 1 5 10 15 Arg Arg Arg Arg Val Glu Val Ser Val Glu Leu Arg Lys Ala Lys Lys 20 25 30 Asp Glu Gln Ile Leu Lys Arg Arg Asn Val 35 40 <210> 40 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 40 Val Ser Arg Lys Arg Pro Arg Pro 1 5 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 41 Pro Pro Lys Lys Ala Arg Glu Asp 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 42 Pro Gln Pro Lys Lys Lys Pro Leu 1 5 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 43 Ser Ala Leu Ile Lys Lys Lys Lys Lys Met Ala Pro 1 5 10 <210> 44 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 44 Asp Arg Leu Arg Arg 1 5 <210> 45 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 45 Pro Lys Gln Lys Lys Arg Lys 1 5 <210> 46 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 46 Arg Lys Leu Lys Lys Lys Ile Lys Lys Leu 1 5 10 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 47 Arg Glu Lys Lys Lys Phe Leu Lys Arg Arg 1 5 10 <210> 48 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 48 Lys Arg Lys Gly Asp Glu Val Asp Gly Val Asp Glu Val Ala Lys Lys 1 5 10 15 Lys Ser Lys Lys 20 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 49 Arg Lys Cys Leu Gln Ala Gly Met Asn Leu Glu Ala Arg Lys Thr Lys 1 5 10 15 Lys <210> 50 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 50 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaa 68 <210> 51 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 51 guuuuagagc ua 12 <210> 52 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 52 Gly Gly Gly Ser 1 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 53 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 54 Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala 1 5 <210> 55 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 55 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccggcgt tgatggggtt ttcct 85 <210> 56 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 56 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgaagt tgctcttgaa gttgg 85 <210> 57 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 57 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccctcgg tgttcactct cagga 85 <210> 58 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 58 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacctctca ttccctcggt cacgt 85 <210> 59 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 59 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccctcga ttttcttgaa gtagtcc 87 <210> 60 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 60 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccggaca cctgggcttt ctgga 85 <210> 61 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 61 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccagct tagggtactt tttga 85 <210> 62 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 62 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgccgt tggccagggt aatct 85 <210> 63 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 63 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgttcc tcttgggcag gatag 85 <210> 64 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 64 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccttgc ccttttccac tttggcc 87 <210> 65 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 65 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccttca gcttctcata gtggc 85 <210> 66 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 66 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgagcgg cgtggacgcc aaggc 85 <210> 67 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 67 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcggacct ggccgaggat gccaa 85 <210> 68 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 68 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgatcac caaggccccc ctgag 85 <210> 69 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 69 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgaagcc cgccttcctg agcgg 85 <210> 70 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 70 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgtgctt cgactccgtg gaaat 85 <210> 71 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 71 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgggcca gggcgatagc ctgca 85 <210> 72 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 72 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcggaaag cgagttcgtg tacgg 85 <210> 73 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 73 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcggagat ccggaagcgg cctct 85 <210> 74 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 74 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgagcga taagctgatc gccag 85 <210> 75 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 75 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgtccaa gaaactgaag agtgtg 86 <210> 76 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 76 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgggctc ccccgaggat aatga 85 <210> 77 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 77 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggcccc aaagaagaag cgg 53 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 78 ctagagctcg ctgatcagcc 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 79 gagatgtggc acgagggcct 20 <210> 80 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 80 ggctgatcag cgagctctag gaattcttac tttttctttt ttgcctggcc ggcctttttc 60 gtggccgccg gccttttctg cttgctgatt cttctga 97 <210> 81 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 81 atcacttttt ttcaggttgg accggtatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc 60 acggagtccc agcagccggc gtgcaggtgg agaccat 97 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 82 ctccagcttc agcagctcca 20 <210> 83 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 83 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca tggacaagaa gtacagcatc ggc 53 <210> 84 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 84 ggctgatcag cgagctctag gaattcttag aggattaagc tagctaaatc tagctgcttg 60 ctgattcttc tga 73 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 85 ccatcccctt ctgtgaatgt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 86 ggagattgga gacacggaga 20 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 87 ggaggacaaa gtacaaacgg c 21 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 88 atcgatgtcc tccccattgg 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 89 tgggagagag accccttctt 20 <210> 90 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 90 tcctgctctc acttagactt tctc 24 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 91 gacattcctc ctgagggaaa a 21 <210> 92 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 92 gataaaatgt attccttctc accattc 27 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 93 ccagactcag taaagcctgg a 21 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 94 tggccccagt ctctcttcta 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 95 cacggccttt gcaaatagag 20 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 96 catgacttgg cctttgtagg a 21 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 97 gagtccgagc agaagaagaa 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 98 gcagccgctc gctgcagcag 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 99 atggagagtt tgcaaggagc 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 100 ggctgggtgt cccattgaaa 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 101 tgtttattca gccgggagtc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 102 gggcccctgc ggccaccccg 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 103 gaggtttgga aagggcgtgc 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 104 gcctgggctc cggggcgttt 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 105 cctccctccc tgcccggtag 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 106 ttgtactctc tgaggtgctc 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 107 tacgcagata agaaccagtt 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 108 gcatcaagtc agccatcagc 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 109 tgagtcaccc tcctggaaac 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 110 tggttcagtg gctgcgtgtc 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 111 atacgatgaa aagaataagc 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 112 gggggagagg gactaaagaa 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 113 cggctttaac tggagtgcct 20 <210> 114 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 114 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccggcgt tgatggggtt ttcct 85 <210> 115 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 115 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgaagt tgctcttgaa gttgg 85 <210> 116 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 116 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccctcgg tgttcactct cagga 85 <210> 117 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 117 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacctctca ttccctcggt cacgt 85 <210> 118 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 118 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccctcga ttttcttgaa gtagtcc 87 <210> 119 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 119 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccggaca cctgggcttt ctgga 85 <210> 120 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 120 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccagct tagggtactt tttga 85 <210> 121 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 121 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgccgt tggccagggt aatct 85 <210> 122 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 122 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgttcc tcttgggcag gatag 85 <210> 123 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 123 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccttgc ccttttccac tttggcc 87 <210> 124 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 124 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccttca gcttctcata gtggc 85 <210> 125 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 125 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgagcgg cgtggacgcc aaggc 85 <210> 126 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 126 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcggacct ggccgaggat gccaa 85 <210> 127 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 127 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgatcac caaggccccc ctgag 85 <210> 128 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 128 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgaagcc cgccttcctg agcgg 85 <210> 129 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 129 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgtgctt cgactccgtg gaaat 85 <210> 130 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 130 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgggcca gggcgatagc ctgca 85 <210> 131 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 131 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcggaaag cgagttcgtg tacgg 85 <210> 132 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 132 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcggagat ccggaagcgg cctct 85 <210> 133 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 133 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgagcga taagctgatc gccag 85 <210> 134 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 134 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgtccaa gaaactgaag agtgtg 86 <210> 135 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 135 tggagctgct gaagctggag ggtggcggtg gctcgggtgg cggtggctcg ggtggcggtg 60 gctcgggctc ccccgaggat aatga 85 <210> 136 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 136 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatggcccc aaagaagaag cgg 53 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 137 ctagagctcg ctgatcagcc 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 138 gagatgtggc acgagggcct 20 <210> 139 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 139 ggctgatcag cgagctctag ctttttcttt tttgcctggc cggccttttt cgtggccgcc 60 ggccttttga attcttactg cttgctgatt cttctga 97 <210> 140 <211> 97 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 140 atcacttttt ttcaggttgg accggtatgg ccccaaagaa gaagcggaag gtcggtatcc 60 acggagtccc agcagccggc gtgcaggtgg agaccat 97 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 141 ctccagcttc agcagctcca 20 <210> 142 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 142 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccggcgt tgatggggtt ttcct 85 <210> 143 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 143 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgaagt tgctcttgaa gttgg 85 <210> 144 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 144 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccctcgg tgttcactct cagga 85 <210> 145 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 145 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacctctca ttccctcggt cacgt 85 <210> 146 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 146 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccctcga ttttcttgaa gtagtcc 87 <210> 147 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 147 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccggaca cctgggcttt ctgga 85 <210> 148 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 148 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccagct tagggtactt tttga 85 <210> 149 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 149 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgccgt tggccagggt aatct 85 <210> 150 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 150 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccaccgttcc tcttgggcag gatag 85 <210> 151 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 151 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccttgc ccttttccac tttggcc 87 <210> 152 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 152 aggccctcgt gccacatctc cgagccaccg ccacccgagc caccgccacc cgagccaccg 60 ccacccttca gcttctcata gtggc 85 <210> 153 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 153 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca tggacaagaa gtacagcatc ggc 53 <210> 154 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 154 ggctgatcag cgagctctag gaattcttac tgcttgctga ttcttctga 49 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 155 gagatgtggc acgagggcct 20 <210> 156 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 156 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatgctata ccccgagcgt ctacgtcgta 60 tcttgactga caagaagtac agcatcgg 88 <210> 157 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 157 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatgctaca gctacccccc ctagagcgtc 60 tcactctaga caagaagtac agcatcgg 88 <210> 158 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 158 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatgctaga tttagctagc ttaatcctcg 60 acaagaagta cagcatcgg 79 <210> 159 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 159 atcacttttt ttcaggttgg accggtgcca ccatgagtct tcaaaaaaag ttagaggaat 60 tagaactaga caagaagtac agcatcgg 88 <210> 160 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 160 ccgatgctgt acttcttgtc agtcaagata cgacgtagac gctcggggta tagcatggtg 60 gcaccggtcc aacctgaaaa aaagtgat 88 <210> 161 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 161 ccgatgctgt acttcttgtc tagagtgaga cgctctaggg ggggtagctg tagcatggtg 60 gcaccggtcc aacctgaaaa aaagtgat 88 <210> 162 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 162 ccgatgctgt acttcttgtc gaggattaag ctagctaaat ctagcatggt ggcaccggtc 60 caacctgaaa aaaagtgat 79 <210> 163 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic primer" <400> 163 ccgatgctgt acttcttgtc tagttctaat tcctctaact ttttttgaag actcatggtg 60 gcaccggtcc aacctgaaaa aaagtgat 88

Claims (29)

  1. 유도성 이량체의 제1 절반에 부착된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물 및
    유도성 이량체의 제2 절반에 부착된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템으로서,
    상기 제1 CRISPR 효소 융합 작제물이 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결되며,
    상기 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 하나 이상의 핵 이출(export) 신호에 작동 가능하게 연결되고,
    유도물질 에너지원과의 접촉이 상기 유도성 이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키며,
    상기 유도성 이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키는 것은 상기 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 작용성 CRISPR-Cas 시스템을 구성하게 하고,
    상기 CRISPR-Cas 시스템이 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하며,
    상기 작용성 CRISPR-Cas 시스템이 상기 표적 서열에 결합하고, 임의로, 게놈 유전자좌를 편집하여, 유전자 발현을 변경시키는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유도성 이량체가 유도성 이종이량체인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 유도성 이종이량체의 제1 절반이 FKBP, 임의로 FKBP12인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  4. 제2항에 있어서, 상기 유도성 이종이량체의 제2 절반이 FRB인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 제1 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열이 N' 말단 Cas9 부분 - FRB - NES인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 제1 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열이 NES - N' 말단 Cas9 부분 - FRB - NES인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  7. 제3항에 있어서, 상기 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열이 C' 말단 Cas9 부분 - FKBP - NLS인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 배열이 NLS - C' 말단 Cas9 부분 - FKBP - NLS인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  9. 제5항, 제6항, 제7항 또는 제8항에 있어서, 링커가 상기 Cas9 부분을 상기 유도성 이량체의 절반으로부터 분리하는 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유도물질 에너지원이 라파마이신인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  11. 제1항에 있어서, 상기 유도성 이량체가 유도성 동종이량체인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR 효소가 Cas9인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CRISPR 효소가 Sp Cas9인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas9가 Sp Cas9에 따라 하기의 분할점 중 어느 하나에서 2개의 부분으로 분할되는 유도성 CRISPR-Cas 시스템: 202A/203S 사이의 분할 위치; 255F/256D 사이의 분할 위치; 310E/311I 사이의 분할 위치; 534R/535K 사이의 분할 위치; 572E/573C 사이의 분할 위치; 713S/714G 사이의 분할 위치; 1003L/1004E 사이의 분할 위치; 1054G/1055E 사이의 분할 위치; 1114N/1115S 사이의 분할 위치; 1152K/1153S 사이의 분할 위치; 1245K/1246G 사이의 분할 위치; 또는 1098 및 1099 사이의 분할.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 작용성 도메인이 상기 Cas9 효소의 하나의 또는 둘 모두의 부분과 회합되며, 상기 작용성 도메인이 임의로 전사 활성화제, 전사 또는 뉴클레아제, 예를 들어, Fok1 뉴클레아제를 포함하는 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용성 CRISPR-Cas 시스템이 표적 서열에 결합하며, 상기 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 갖지 않는 CRISPR 효소와 비교하여, 임의로 적어도 97% 또는 100% 감소된 뉴클레아제 활성을 갖는 deadCas9인 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 상기 deadCas9(CRISPR 효소)가 2개 이상의 돌연변이를 포함하며, 여기서, SpCas9 단백질 또는 임의의 상응하는 오솔로그(ortholog)에 따른 D10, E762, H840, N854, N863 또는 D986, 또는 SaCas9 단백질에 따른 N580 중 2개 이상이 돌연변이되거나, 또는 CRISPR 효소가 적어도 하나의 돌연변이를 포함하며, 적어도 H840이 돌연변이되는 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 유도성 이량체의 제1 절반에 부착되고, 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물의 전달을 위한 벡터.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 유도성 이량체의 제2 절반에 부착되고, 하나 이상의 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물의 전달을 위한 벡터.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 유도성 이량체의 제1 절반에 부착되고, 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물; 및
    제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 유도성 이량체의 제2 절반에 부착되고, 하나 이상의 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물 둘 모두의 전달을 위한 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 단일의 플라스미드 또는 발현 카세트인 벡터.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환되거나, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 진핵 숙주 세포 또는 세포주.
  24. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환되거나, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 발현하는 트랜스제닉 유기체 또는 그의 자손.
  25. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유도성 CRISPR-Cas 시스템을 구성적으로 발현하는 모델 유기체.
  26. 유도성 이종이량체의 제1 절반에 부착된 제1 CRISPR 효소 융합 작제물, 및
    유도성 이종이량체의 제2 절반에 부착된 제2 CRISPR 효소 융합 작제물을 포함하는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템으로서,
    상기 제1 CRISPR 효소 융합 작제물이 하나 이상의 핵 국소화 신호에 작동 가능하게 연결되고,
    상기 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 핵 이출 신호에 작동 가능하게 연결되며,
    유도물질 에너지원과의 접촉이 상기 유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키고,
    상기 유도성 이종이량체의 제1 및 제2 절반을 결합시키는 것은 상기 제1 및 제2 CRISPR 효소 융합 작제물이 작용성 CRISPR-Cas 시스템을 구성하게 하며,
    상기 CRISPR-Cas 시스템이 세포 내의 관심 게놈 유전자좌 내의 표적 서열에 혼성화할 수 있는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)를 포함하고,
    상기 작용성 CRISPR-Cas 시스템이 상기 게놈 유전자좌를 편집하여, 유전자 발현을 변경시키는 비-천연 발생 또는 조작된 유도성 CRISPR-Cas 시스템.
  27. 제18항의 폴리뉴클레오티드 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터로 대상체를 형질전환시키고, 유도물질 에너지원을 상기 대상체에게 투여함으로써 유전자 편집을 유도하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법.
  28. 제27항에 있어서, 예를 들어, 수복 주형을 포함하는 벡터에 의해 전달되는 상기 수복 주형도 또한 제공되는 방법.
  29. 제18항의 폴리뉴클레오티드 또는 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항의 벡터로 대상체를 형질전환시킴으로써 전사 활성화 또는 억제를 유도하는 단계를 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 촉매적 비활성 CRISPR 효소 및 제15항의 하나 이상의 회합된 작용성 도메인을 인코딩하거나 그를 포함하며; 상기 방법이 유도물질 에너지원을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법.
KR1020167018582A 2013-12-12 2014-12-12 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법 KR20160097327A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361915267P 2013-12-12 2013-12-12
US61/915,267 2013-12-12
US201461939228P 2014-02-12 2014-02-12
US61/939,228 2014-02-12
PCT/US2014/070068 WO2015089427A1 (en) 2013-12-12 2014-12-12 Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular cas enzymes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20160097327A true KR20160097327A (ko) 2016-08-17

Family

ID=52394329

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167018582A KR20160097327A (ko) 2013-12-12 2014-12-12 유전자 산물, 구조 정보 및 유도성 모듈형 ｃａｓ 효소의 발현의 변경을 위한 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 시스템 및 방법

Country Status (8)

Country Link
US (2) US10377998B2 (ko)
EP (1) EP3080260B1 (ko)
JP (1) JP2017503485A (ko)
KR (1) KR20160097327A (ko)
CN (1) CN105899657A (ko)
AU (1) AU2014361834B2 (ko)
CA (1) CA2932439A1 (ko)
WO (1) WO2015089427A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019231149A1 (ko) * 2018-05-30 2019-12-05 한국생명공학연구원 Crispri 시스템을 이용하여 목적 유전자로 형질전환된 숙주세포를 선별하기 위한 키트 및 이의 용도

Families Citing this family (189)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2734621B1 (en) 2011-07-22 2019-09-04 President and Fellows of Harvard College Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
WO2013163628A2 (en) 2012-04-27 2013-10-31 Duke University Genetic correction of mutated genes
EP3434776A1 (en) 2012-12-12 2019-01-30 The Broad Institute, Inc. Methods, models, systems, and apparatus for identifying target sequences for cas enzymes or crispr-cas systems for target sequences and conveying results thereof
SG10201707569YA (en) 2012-12-12 2017-10-30 Broad Inst Inc Delivery, Engineering and Optimization of Systems, Methods and Compositions for Sequence Manipulation and Therapeutic Applications
WO2014150624A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Caribou Biosciences, Inc. Compositions and methods of nucleic acid-targeting nucleic acids
HUE040575T2 (hu) 2013-04-16 2019-03-28 Regeneron Pharma A patkány genom célzott módosítása
KR20160034901A (ko) 2013-06-17 2016-03-30 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 서열 조작에 최적화된 ｃｒｉｓｐｒ-ｃａｓ 이중 닉카아제 시스템, 방법 및 조성물
AU2014281026B2 (en) 2013-06-17 2020-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, engineering and optimization of tandem guide systems, methods and compositions for sequence manipulation
WO2014204727A1 (en) 2013-06-17 2014-12-24 The Broad Institute Inc. Functional genomics using crispr-cas systems, compositions methods, screens and applications thereof
BR112015031608A2 (pt) 2013-06-17 2017-08-22 Massachusetts Inst Technology Aplicação e uso dos sistemas crispr-cas, vetores e composições para direcionamento e terapia hepáticos
RU2716421C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, применение и применения в терапии систем crispr-cas и композиций для целенаправленного воздействия на нарушения и заболевания с использованием вирусных компонентов
US9163284B2 (en) 2013-08-09 2015-10-20 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
DK3066201T3 (en) 2013-11-07 2018-06-06 Editas Medicine Inc CRISPR-RELATED PROCEDURES AND COMPOSITIONS WITH LEADING GRADES
MX2016007654A (es) 2013-12-11 2017-08-15 Regeneron Pharma Metodos y composiciones para la modificacion dirigida de un genoma.
US11053481B2 (en) 2013-12-12 2021-07-06 President And Fellows Of Harvard College Fusions of Cas9 domains and nucleic acid-editing domains
WO2015089364A1 (en) 2013-12-12 2015-06-18 The Broad Institute Inc. Crystal structure of a crispr-cas system, and uses thereof
BR112016013201B1 (pt) 2013-12-12 2023-01-31 The Broad Institute, Inc. Uso de uma composição compreendendo um sistema crispr-cas no tratamento de uma doença genética ocular
EP3080271B1 (en) 2013-12-12 2020-02-12 The Broad Institute, Inc. Systems, methods and compositions for sequence manipulation with optimized functional crispr-cas systems
SG10201804974RA (en) 2013-12-12 2018-07-30 Broad Inst Inc Compositions and Methods of Use of Crispr-Cas Systems in Nucleotide Repeat Disorders
CA2935960C (en) 2014-01-08 2023-01-10 Bart Lipkens Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
CA2951707A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Massachusetts Institute Of Technology Method for gene editing
US10077453B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 President And Fellows Of Harvard College CAS9 proteins including ligand-dependent inteins
EP3215617B1 (en) 2014-11-07 2024-05-08 Editas Medicine, Inc. Systems for improving crispr/cas-mediated genome-editing
CN107109422B (zh) * 2014-11-19 2021-08-13 基础科学研究院 使用由两个载体表达的拆分的Cas9的基因组编辑
LT3221457T (lt) 2014-11-21 2019-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Nukreipiančios genetinės modifikacijos būdai ir kompozicijos, naudojant suporuotas kreipiančiąsias rnr sekas
EP3224381B1 (en) 2014-11-25 2019-09-04 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Method of identifying a person having a predisposition to or afflicted with a cardiometabolic disease
JP7068821B2 (ja) 2014-12-03 2022-05-17 アジレント・テクノロジーズ・インク 化学修飾を有するガイドｒｎａ
WO2016094874A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 The Broad Institute Inc. Escorted and functionalized guides for crispr-cas systems
EP3985115A1 (en) 2014-12-12 2022-04-20 The Broad Institute, Inc. Protected guide rnas (pgrnas)
EP3230452A1 (en) 2014-12-12 2017-10-18 The Broad Institute Inc. Dead guides for crispr transcription factors
WO2016100974A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing
WO2016106236A1 (en) 2014-12-23 2016-06-30 The Broad Institute Inc. Rna-targeting system
EP3702456A1 (en) 2014-12-24 2020-09-02 The Broad Institute, Inc. Crispr having or associated with destabilization domains
WO2016108926A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 The Broad Institute Inc. Crispr mediated in vivo modeling and genetic screening of tumor growth and metastasis
US11208638B2 (en) 2015-01-12 2021-12-28 The Regents Of The University Of California Heterodimeric Cas9 and methods of use thereof
CN107787367B (zh) 2015-04-06 2021-10-26 里兰斯坦福初级大学理事会 用于crispr/cas介导的基因调控的化学修饰的引导rna
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
WO2016182959A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Editas Medicine, Inc. Optimized crispr/cas9 systems and methods for gene editing in stem cells
CN106011104B (zh) * 2015-05-21 2019-09-27 清华大学 利用拆分Cas系统进行基因编辑和表达调控方法
EP3307887A1 (en) 2015-06-09 2018-04-18 Editas Medicine, Inc. Crispr/cas-related methods and compositions for improving transplantation
EP3436575A1 (en) 2015-06-18 2019-02-06 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
CA2989830A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute, Inc. Crispr enzyme mutations reducing off-target effects
AU2016279077A1 (en) 2015-06-18 2019-03-28 Omar O. Abudayyeh Novel CRISPR enzymes and systems
WO2016205759A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
AU2016285724A1 (en) 2015-06-29 2017-11-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modified CRISPR RNA and modified single CRISPR RNA and uses thereof
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
WO2017053879A1 (en) 2015-09-24 2017-03-30 Editas Medicine, Inc. Use of exonucleases to improve crispr/cas-mediated genome editing
CN105177038B (zh) * 2015-09-29 2018-08-24 中国科学院遗传与发育生物学研究所 一种高效定点编辑植物基因组的CRISPR/Cas9系统
EP4089175A1 (en) 2015-10-13 2022-11-16 Duke University Genome engineering with type i crispr systems in eukaryotic cells
IL310721A (en) 2015-10-23 2024-04-01 Harvard College Nucleobase editors and their uses
WO2017075265A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 The Broad Institute, Inc. Multiplex analysis of single cell constituents
WO2017078631A1 (en) * 2015-11-05 2017-05-11 Agency For Science, Technology And Research Chemical-inducible genome engineering technology
WO2017087708A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity
EP3420093B1 (en) * 2016-02-26 2022-11-23 Cellectis Micelle based system nuclease encapsulation for in-vivo gene editing
EP3219799A1 (en) 2016-03-17 2017-09-20 IMBA-Institut für Molekulare Biotechnologie GmbH Conditional crispr sgrna expression
EP3433363A1 (en) 2016-03-25 2019-01-30 Editas Medicine, Inc. Genome editing systems comprising repair-modulating enzyme molecules and methods of their use
WO2017180694A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Editas Medicine, Inc. Cas9 fusion molecules gene editing systems, and methods of use thereof
EP3443088A1 (en) 2016-04-13 2019-02-20 Editas Medicine, Inc. Grna fusion molecules, gene editing systems, and methods of use thereof
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
KR20230080515A (ko) 2016-05-27 2023-06-07 더 보드 오브 트러스티즈 오브 더 유니버시티 오브 일리노이 광합성 효율 및 성장이 증가된 형질전환 식물
US10767175B2 (en) 2016-06-08 2020-09-08 Agilent Technologies, Inc. High specificity genome editing using chemically modified guide RNAs
US11078481B1 (en) 2016-08-03 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for screening for cancer targets
CA3032699A1 (en) 2016-08-03 2018-02-08 President And Fellows Of Harvard College Adenosine nucleobase editors and uses thereof
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
CN110312799A (zh) 2016-08-17 2019-10-08 博德研究所 新型crispr酶和系统
US11352647B2 (en) 2016-08-17 2022-06-07 The Broad Institute, Inc. Crispr enzymes and systems
WO2018039438A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
US11078483B1 (en) 2016-09-02 2021-08-03 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for measuring and improving CRISPR reagent function
CN110214180A (zh) 2016-10-14 2019-09-06 哈佛大学的校长及成员们 核碱基编辑器的aav递送
JP2020513248A (ja) 2016-10-19 2020-05-14 フロデザイン ソニックス， インク．Ｆｌｏｄｅｓｉｇｎ Ｓｏｎｉｃｓ， Ｉｎｃ． 音響による親和性細胞抽出
CN108148872A (zh) * 2016-12-13 2018-06-12 广东赤萌医疗科技有限公司 一种dead SaCas9-Fok1系统及其构建方法与应用
WO2018119359A1 (en) 2016-12-23 2018-06-28 President And Fellows Of Harvard College Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection
TW201839136A (zh) 2017-02-06 2018-11-01 瑞士商諾華公司 治療血色素異常症之組合物及方法
US20190359993A1 (en) * 2017-02-15 2019-11-28 National Agriculture And Food Research Organization Method for producing genome-edited plant utilizing plant virus vectors
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
US11542496B2 (en) 2017-03-10 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Cytosine to guanine base editor
WO2018170333A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 The Broad Institute, Inc. Novel cas13b orthologues crispr enzymes and systems
CN110914426A (zh) 2017-03-23 2020-03-24 哈佛大学的校长及成员们 包含核酸可编程dna结合蛋白的核碱基编辑器
WO2018183908A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating ovarian tumors
EP3610266A4 (en) 2017-04-12 2021-04-21 Massachusetts Eye and Ear Infirmary TUMOR SIGNATURE OF METASTASIS, COMPOSITIONS OF SUBSTANCES AND USES THEREOF
EP3610009A1 (en) * 2017-04-12 2020-02-19 The Broad Institute, Inc. Novel type vi crispr orthologs and systems
US20210115407A1 (en) 2017-04-12 2021-04-22 The Broad Institute, Inc. Respiratory and sweat gland ionocytes
EP3612232A1 (en) 2017-04-21 2020-02-26 The Broad Institute, Inc. Targeted delivery to beta cells
US11499151B2 (en) 2017-04-28 2022-11-15 Editas Medicine, Inc. Methods and systems for analyzing guide RNA molecules
US20200407737A1 (en) * 2017-05-03 2020-12-31 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of crispr-cas endonucleases for plant genome engineering
WO2018204777A2 (en) 2017-05-05 2018-11-08 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncrna associated with target genotypes and phenotypes
WO2018209320A1 (en) 2017-05-12 2018-11-15 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation
KR20200026804A (ko) 2017-05-18 2020-03-11 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 표적화된 핵산 편집을 위한 시스템, 방법 및 조성물
EP3635113A4 (en) 2017-06-05 2021-03-17 Fred Hutchinson Cancer Research Center GENOMIC SAFE HARBORS FOR GENETIC THERAPIES IN HUMAN STEM CELLS AND MANIPULATED NANOPARTICLES TO DELIVER TARGETED GENETIC THERAPIES
WO2018227114A1 (en) 2017-06-09 2018-12-13 Editas Medicine, Inc. Engineered cas9 nucleases
EP3638218A4 (en) 2017-06-14 2021-06-09 The Broad Institute, Inc. COMPOSITIONS AND METHOD OF TARGETING COMPLEMENTING COMPONENT 3 FOR INHIBITION OF TUMOR GROWTH
WO2018232114A1 (en) 2017-06-14 2018-12-20 Wisconsin Alumni Research Foundation Modified guide rnas, crispr-ribonucleotprotein complexes and methods of use
WO2019005853A2 (en) * 2017-06-26 2019-01-03 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University CRISPR SYNTHETIC GENE CIRCUITS AS GENERIC THERAPY OF THE NEW GENERATION INTERNAL EAR
US11773407B2 (en) 2017-06-26 2023-10-03 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University CRISPR logic circuits for safer and controllable gene therapies
JP7454494B2 (ja) 2017-06-26 2024-03-22 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 標的化された核酸編集のためのｃｒｉｓｐｒ／ｃａｓ－アデニンデアミナーゼ系の組成物、系及び方法
CN111094561B (zh) * 2017-07-07 2024-03-12 株式会社图尔金 靶特异性crispr变体
US11866726B2 (en) 2017-07-14 2024-01-09 Editas Medicine, Inc. Systems and methods for targeted integration and genome editing and detection thereof using integrated priming sites
CN111801345A (zh) 2017-07-28 2020-10-20 哈佛大学的校长及成员们 使用噬菌体辅助连续进化(pace)的进化碱基编辑器的方法和组合物
US11319532B2 (en) 2017-08-30 2022-05-03 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising Gam
CN111511388A (zh) 2017-09-21 2020-08-07 博德研究所 用于靶向核酸编辑的系统、方法和组合物
US10933027B1 (en) * 2017-09-25 2021-03-02 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Expanded pore particles and delivery methods thereof
US20200255828A1 (en) 2017-10-04 2020-08-13 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains
AU2018352592A1 (en) 2017-10-16 2020-06-04 Beam Therapeutics, Inc. Uses of adenosine base editors
BR112020007823A2 (pt) 2017-10-20 2020-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center sistemas e métodos para produzir células b geneticamente modificadas para expressar anticorpos selecionados
US11332736B2 (en) 2017-12-07 2022-05-17 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for multiplexing single cell and single nuclei sequencing
BR112020009889A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-03 Flodesign Sonics, Inc. acionador e controlador de transdutor acústico
CN109971763A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 未名生物农业集团有限公司 花期调控基因cmp1和相关的载体及其应用
US11994512B2 (en) 2018-01-04 2024-05-28 Massachusetts Institute Of Technology Single-cell genomic methods to generate ex vivo cell systems that recapitulate in vivo biology with improved fidelity
KR20200103769A (ko) * 2018-01-23 2020-09-02 기초과학연구원 연장된 단일 가이드 rna 및 그 용도
WO2019148184A2 (en) * 2018-01-29 2019-08-01 The Regents Of The University Of California Guided magnetic nanostructures for targeted and high-throughput intracellular delivery
WO2019173728A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 Lee Hye Young Crispr-nanoparticles and methods of use in brain disorders
WO2019204585A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Massachusetts Institute Of Technology Single-stranded break detection in double-stranded dna
SI3560330T1 (sl) 2018-04-24 2022-08-31 KWS SAAT SE & Co. KGaA Rastline z izboljšano prebavljivostjo in markerskimi haplotipi
US11957695B2 (en) 2018-04-26 2024-04-16 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses
CN108588128A (zh) * 2018-04-26 2018-09-28 南昌大学 一种高效率大豆CRISPR/Cas9系统的构建方法及应用
US20210147831A1 (en) 2018-04-27 2021-05-20 The Broad Institute, Inc. Sequencing-based proteomics
US20210386829A1 (en) 2018-05-04 2021-12-16 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses
JP2021522825A (ja) * 2018-05-11 2021-09-02 ユニベルシテ ラバル ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムおよびその使用
WO2019232542A2 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients
KR20210024009A (ko) 2018-06-26 2021-03-04 더 브로드 인스티튜트, 인코퍼레이티드 Crispr/cas 및 트랜스포사제 기반 증폭 조성물, 시스템 및 방법
CN112543812A (zh) 2018-06-26 2021-03-23 麻省理工学院 基于crispr效应系统的扩增方法、系统和诊断
CA3106035A1 (en) 2018-08-07 2020-02-13 The Broad Institute, Inc. Cas12b enzymes and systems
WO2020041380A1 (en) 2018-08-20 2020-02-27 The Broad Institute, Inc. Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9
US20210324357A1 (en) 2018-08-20 2021-10-21 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Degradation domain modifications for spatio-temporal control of rna-guided nucleases
WO2020051507A1 (en) 2018-09-06 2020-03-12 The Broad Institute, Inc. Nucleic acid assemblies for use in targeted delivery
US20220098613A1 (en) 2018-09-12 2022-03-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
WO2020061229A2 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Vnv Newco Inc. Arc-based capsids and uses thereof
CN112955549A (zh) * 2018-09-19 2021-06-11 香港大学 改进的高通量组合基因修饰系统和优化的Cas9酶变体
EP3863683A4 (en) * 2018-10-11 2022-08-24 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University COMPARTMENT SPATIAL ORGANIZATION SYSTEMS AND METHODS
WO2020077236A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 The Broad Institute, Inc. Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues
WO2020081730A2 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for modulating microenvironment
US11739320B2 (en) 2018-11-05 2023-08-29 Wisconsin Alumni Research Foundation Gene correction of Pompe disease and other autosomal recessive disorders via RNA-guided nucleases
CN113462672A (zh) * 2018-11-15 2021-10-01 中国农业大学 CRISPR-Cas12j酶和系统
EP3898958A1 (en) 2018-12-17 2021-10-27 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof
US20220062394A1 (en) 2018-12-17 2022-03-03 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
US11739156B2 (en) 2019-01-06 2023-08-29 The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology Methods and compositions for overcoming immunosuppression
CA3133226A1 (en) 2019-03-11 2020-09-17 Sorrento Therapeutics, Inc. Improved process for integration of dna constructs using rna-guided endonucleases
AU2020242032A1 (en) 2019-03-19 2021-10-07 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions for editing nucleotide sequences
EP3969607A1 (en) 2019-05-13 2022-03-23 KWS SAAT SE & Co. KGaA Drought tolerance in corn
WO2020236972A2 (en) 2019-05-20 2020-11-26 The Broad Institute, Inc. Non-class i multi-component nucleic acid targeting systems
AR118995A1 (es) 2019-05-25 2021-11-17 Kws Saat Se & Co Kgaa Mejorador de la inducción de haploides
US20220243178A1 (en) 2019-05-31 2022-08-04 The Broad Institute, Inc. Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5
JP2022539248A (ja) 2019-07-02 2022-09-07 フレッド ハッチンソン キャンサー リサーチ センター 組換えａｄ３５ベクター及び関連遺伝子治療改善
EP3772542A1 (en) 2019-08-07 2021-02-10 KWS SAAT SE & Co. KGaA Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2
CN110577972B (zh) * 2019-08-08 2022-10-11 复旦大学 CRISPR/Sa-ShaCas9基因编辑系统及其应用
EP3783104A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-24 Kemijski Institut Coiled-coil mediated tethering of crispr-cas and exonucleases for enhanced genome editing
WO2021041922A1 (en) 2019-08-30 2021-03-04 The Broad Institute, Inc. Crispr-associated mu transposase systems
US11981922B2 (en) 2019-10-03 2024-05-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions for the modulation of cell interactions and signaling in the tumor microenvironment
US20230357788A1 (en) 2019-10-17 2023-11-09 KWS SAAT SE & Co. KGaA Enhanced disease resistance of crops by downregulation of repressor genes
WO2021202382A1 (en) * 2020-03-31 2021-10-07 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for identifying host cell target proteins for treating rna virus infections
US11433121B1 (en) 2020-04-03 2022-09-06 National Technology & Engineering Solutions Of Sandia, Llc Lipid composition for the delivery of therapeutic cargos
CA3177481A1 (en) 2020-05-08 2021-11-11 David R. Liu Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence
PE20230080A1 (es) 2020-05-29 2023-01-11 Kws Saat Se And Co Kgaa Induccion de haploides en plantas
US11572565B2 (en) 2020-07-21 2023-02-07 Trustees Of Boston University Inducible control of gene expression
CN112575035B (zh) * 2020-12-09 2022-11-29 贵州医科大学 一种诱导细胞凋亡的载体系统
US20240102007A1 (en) 2021-06-01 2024-03-28 Arbor Biotechnologies, Inc. Gene editing systems comprising a crispr nuclease and uses thereof
WO2023282710A1 (ko) * 2021-07-08 2023-01-12 한국과학기술원 Cas13 단백질의 활성 조절을 통한 rna 발현 조절 또는 편집 방법
CA3227103A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Matthew P. GEMBERLING Compositions and methods for modulating expression of frataxin (fxn)
WO2023010135A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tune Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating expression of methyl-cpg binding protein 2 (mecp2)
EP4376596A1 (en) 2021-07-30 2024-06-05 KWS SAAT SE & Co. KGaA Plants with improved digestibility and marker haplotypes
WO2023039586A1 (en) 2021-09-10 2023-03-16 Agilent Technologies, Inc. Guide rnas with chemical modification for prime editing
WO2023077148A1 (en) 2021-11-01 2023-05-04 Tome Biosciences, Inc. Single construct platform for simultaneous delivery of gene editing machinery and nucleic acid cargo
WO2023114052A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Labsimply, Inc. Tuning cascade assay kinetics via molecular design
WO2023122764A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Tome Biosciences, Inc. Co-delivery of a gene editor construct and a donor template
WO2023137472A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene repression
WO2023137471A1 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for programming t cell phenotypes through targeted gene activation
WO2023178297A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Obsidian Therapeutics, Inc. Compact drug responsive domains for regulation of function/abundance and delivery of polypeptide payloads
WO2023205744A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Tome Biosciences, Inc. Programmable gene insertion compositions
WO2023215831A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Tome Biosciences, Inc. Guide rna compositions for programmable gene insertion
WO2023225670A2 (en) 2022-05-20 2023-11-23 Tome Biosciences, Inc. Ex vivo programmable gene insertion
WO2023250511A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for reducing low-density lipoprotein through targeted gene repression
WO2024015881A2 (en) 2022-07-12 2024-01-18 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for targeted transcriptional activation
WO2024020587A2 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Tome Biosciences, Inc. Pleiopluripotent stem cell programmable gene insertion
US20240067968A1 (en) 2022-08-19 2024-02-29 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for regulation of hepatitis b virus through targeted gene repression
WO2024042199A1 (en) 2022-08-26 2024-02-29 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of paired genes in hybrid breeding
WO2024064642A2 (en) 2022-09-19 2024-03-28 Tune Therapeutics, Inc. Compositions, systems, and methods for modulating t cell function
US11982677B2 (en) 2022-10-02 2024-05-14 Vedabio, Inc. Dimerization screening assays

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7150982B2 (en) 1991-09-09 2006-12-19 Third Wave Technologies, Inc. RNA detection assays
AU2003224897A1 (en) 2002-04-09 2003-10-27 Kenneth L. Beattie Oligonucleotide probes for genosensor chips
US8053232B2 (en) 2004-01-23 2011-11-08 Virxsys Corporation Correction of alpha-1-antitrypsin genetic defects using spliceosome mediated RNA trans splicing
US7892224B2 (en) 2005-06-01 2011-02-22 Brainlab Ag Inverse catheter planning
WO2007106690A2 (en) 2006-03-15 2007-09-20 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Degenerate nucleobase analogs
ES2719789T3 (es) 2007-03-02 2019-07-16 Dupont Nutrition Biosci Aps Cultivos con resistencia mejorada a fagos
WO2010011961A2 (en) 2008-07-25 2010-01-28 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Prokaryotic rnai-like system and methods of use
US20100076057A1 (en) 2008-09-23 2010-03-25 Northwestern University TARGET DNA INTERFERENCE WITH crRNA
US9404098B2 (en) 2008-11-06 2016-08-02 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Method for cleaving a target RNA using a Cas6 polypeptide
US20110016540A1 (en) 2008-12-04 2011-01-20 Sigma-Aldrich Co. Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals
US20110239315A1 (en) 2009-01-12 2011-09-29 Ulla Bonas Modular dna-binding domains and methods of use
US10087431B2 (en) 2010-03-10 2018-10-02 The Regents Of The University Of California Methods of generating nucleic acid fragments
MX2012013037A (es) 2010-05-10 2013-07-29 Univ California Composiciones de endorribonucleasa y metodos de uso de las mismas.
WO2011146121A1 (en) 2010-05-17 2011-11-24 Sangamo Biosciences, Inc. Novel dna-binding proteins and uses thereof
US9081737B2 (en) 2010-08-02 2015-07-14 Integrated Dna Technologies, Inc. Methods for predicting stability and melting temperatures of nucleic acid duplexes
WO2012164565A1 (en) * 2011-06-01 2012-12-06 Yeda Research And Development Co. Ltd. Compositions and methods for downregulating prokaryotic genes
EP2591770B1 (en) 2011-11-14 2016-03-16 Silenseed Ltd Compositions for siRNA delivery and methods of manufacturing and using same
US8450107B1 (en) 2011-11-30 2013-05-28 The Broad Institute Inc. Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors
GB201122458D0 (en) 2011-12-30 2012-02-08 Univ Wageningen Modified cascade ribonucleoproteins and uses thereof
BR112014021104B1 (pt) 2012-02-29 2023-03-28 Sangamo Biosciences, Inc Proteína de fusão de ocorrência não natural compreendendo um domínio de ligação de dna de dedo de zinco manipulado que se liga a um gene htt, seu uso, método in vitro de modificação da expressão de um gene htt em uma célula, e método de geração de um sistema modelo para o estudo da doença de huntington
WO2013141680A1 (en) 2012-03-20 2013-09-26 Vilnius University RNA-DIRECTED DNA CLEAVAGE BY THE Cas9-crRNA COMPLEX
US9637739B2 (en) 2012-03-20 2017-05-02 Vilnius University RNA-directed DNA cleavage by the Cas9-crRNA complex
DE202013012242U1 (de) 2012-05-25 2016-02-02 Emmanuelle Charpentier Zusammensetzungen für die durch RNA gesteuerte Modifikation einer Ziel-DNA und für die durch RNA gesteuerte Modulation der Transkription
DE202013012597U1 (de) 2012-10-23 2017-11-21 Toolgen, Inc. Zusammensetzung zum Spalten einer Ziel-DNA, umfassend eine für die Ziel-DNA spezifische guide-RNA und eine Cas-Protein-codierende Nukleinsäure oder ein Cas-Protein, sowie deren Verwendung
PL3138910T3 (pl) 2012-12-06 2018-01-31 Sigma Aldrich Co Llc Oparta na CRISPR modyfikacja i regulacja genomu
WO2014093479A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Montana State University Crispr (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) rna-guided control of gene regulation
MX2015007549A (es) 2012-12-12 2017-01-20 Broad Inst Inc Modificaciones de sistemas, métodos y composiciones guía optimizadas para la manipulación de secuencias.
JP6552965B2 (ja) * 2012-12-12 2019-07-31 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 配列操作のための改善された系、方法および酵素組成物のエンジニアリングおよび最適化
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
SG10201707569YA (en) 2012-12-12 2017-10-30 Broad Inst Inc Delivery, Engineering and Optimization of Systems, Methods and Compositions for Sequence Manipulation and Therapeutic Applications
WO2014099744A1 (en) 2012-12-17 2014-06-26 President And Fellows Of Harvard College Rna-guided human genome engineering
ES2645393T3 (es) * 2013-05-29 2017-12-05 Cellectis Métodos de manipulación de linfocitos T para inmunoterapia usando el sistema de nucleasa Cas guiada por ARN
JP6670743B2 (ja) * 2013-05-29 2020-03-25 セレクティスＣｅｌｌｅｃｔｉｓ Ｉｉ型ｃｒｉｓｐｒシステムにおける新規のコンパクトなｃａｓ９足場
RU2716421C2 (ru) 2013-06-17 2020-03-11 Те Брод Инститьют Инк. Доставка, применение и применения в терапии систем crispr-cas и композиций для целенаправленного воздействия на нарушения и заболевания с использованием вирусных компонентов

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019231149A1 (ko) * 2018-05-30 2019-12-05 한국생명공학연구원 Crispri 시스템을 이용하여 목적 유전자로 형질전환된 숙주세포를 선별하기 위한 키트 및 이의 용도
KR20190136155A (ko) * 2018-05-30 2019-12-10 한국생명공학연구원 CRISPRi 시스템을 이용하여 목적 유전자로 형질전환된 숙주세포를 선별하기 위한 키트 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US20180066242A1 (en) 2018-03-08
AU2014361834A1 (en) 2016-06-16
JP2017503485A (ja) 2017-02-02
US10377998B2 (en) 2019-08-13
AU2014361834B2 (en) 2020-10-22
EP3080260B1 (en) 2019-03-06
CA2932439A1 (en) 2015-06-18
WO2015089427A1 (en) 2015-06-18
US11149259B2 (en) 2021-10-19
EP3080260A1 (en) 2016-10-19
CN105899657A (zh) 2016-08-24
US20190330605A1 (en) 2019-10-31
AU2014361834A8 (en) 2016-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11149259B2 (en) CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products, structural information and inducible modular Cas enzymes
US20230287373A1 (en) Engineering and optimization of systems, methods, enzymes and guide scaffolds of cas9 orthologs and variants for sequence manipulation
US20210277371A1 (en) Engineering of systems, methods and optimized guide compositions with new architectures for sequence manipulation
US20240035006A1 (en) Crystal structure of crispr cpf1
US11001829B2 (en) Functional screening with optimized functional CRISPR-Cas systems
AU2015101792A4 (en) Engineering of systems, methods and optimized enzyme and guide scaffolds for sequence manipulation
EP3237615B2 (en) Crispr having or associated with destabilization domains
JP6712948B2 (ja) 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法
US20170349914A1 (en) DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF CRISPR SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOIETIC STEM CELLS (HSCs)
US20170306335A1 (en) Rna-targeting system
US20180163265A1 (en) Unbiased identification of double-strand breaks and genomic rearrangement by genome-wide insert capture sequencing

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid