CN112575035B - 一种诱导细胞凋亡的载体系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，公开了一种诱导细胞凋亡的载体系统，包括Plasmid CMV‑FKBP‑tdTomato和Plasmid EF1α‑FRBCaspase8‑2A‑BSD；还公开了制备方法；还公开了载体系统的应用。本发明的载体系统制备过程简单，可通过局部导入并表达在特定部位，系统作用与病变机体方法直接，起效周期短，可缩短研究时间，标记和清除过程独立控制，实验结果更加直观，因此，本发明的载体系统可广泛应用于疾病的机制研究和治疗策略探索中，例如疾病的体内病变细胞分布研究，病变细胞与疾病的发生和治疗关系的研究。

Description

一种诱导细胞凋亡的载体系统
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种诱导细胞凋亡的载体系统。
背景技术
在生物医学的研究中，多种疾病如肿瘤、基因相关疾病、衰老相关疾病的发生都是由机体内部某种细胞的特殊病理变化所引起的，对于这种具有细胞特殊性或细胞内表型特殊性的异常细胞的靶向清除，对于疾病的病理机制研究、疾病的治疗策略探索都具有重要的意义。目前，肿瘤基因药物、靶向治疗以及基于Cre-LoxP重组酶系统靶向清除细胞的特定细胞清除策略较为热门，但是其重组过程复杂、耗时长，在动物体内一般要经过数代的繁殖和基因筛选过程，对于疾病的治疗策略探索，实际应用中仍然存在许多技术难题需要进行进一步研究。因此，发明人发明一种诱导细胞凋亡的载体系统。
发明内容
基于以上问题，本发明提供一种诱导细胞凋亡的载体系统，本发明构建的载体系统可显著的诱导细胞凋亡从而清除细胞。
为解决以上技术问题，本发明提供了一种诱导细胞凋亡的载体系统，包括重组载体一和重组载体二，重组载体一为PlasmidCMV-FKBP-tdTomato，重组载体二为PlasmidEF1α-FRBCaspase8-2A-BSD，重组载体一和重组载体二的序列分别见SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4；重组载体一由FKBP基因片段与骨架质粒tdTomato-N1连接而成，FKBP基因片段为具有F36V和L106P突变位点的基因序列片段，FKBP基因片段的序列见SEQ ID NO：1；重组载体二由FRB Caspase8-2A-BSD片段与骨架质粒lenti Cas9-Blast连接而成，FRB Caspase8-2A-BSD片段的序列见SEQ ID NO：2。
为解决以上技术问题，本发明还提供了载体系统的制备方法，包括如下步骤：
S1：合成FKBP基因片段和FRB Caspase8-2A-BSD基因片段；
S2：扩增tdTomato-N1质粒和lentiCas9-Blast质粒，扩增后提取质粒，备用；
S3：使用HindIII和BamHI限制性内切酶酶切步骤S1中的FKBP基因片段和步骤S2中的tdTomato-N1质粒，之后将酶切后的FKBP基因片段与酶切后的tdTomato-N1质粒连接得重组载体一；使用XbaI和BamHI限制性内切酶酶切步骤S1中的FRB Caspase8-2A-BSD基因片段和步骤S2中的lentiCas9-Blast质粒，之后将酶切后的FRB Caspase8-2A-BSD基因片段与酶切后的lentiCas9-Blast质粒连接得重组载体二。
为解决以上技术问题，本发明还提供了载体系统在制备检测或诊断或治疗癌症的产品中的应用。
进一步的，所述产品为慢病毒载体，所述慢病毒载体起到了荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用。
进一步的，所述细胞为人胃腺癌细胞或人胶质瘤细胞或人慢性髓源白血病细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的载体系统制备过程简单，可通过局部导入并表达在特定部位，系统作用与病变机体方法直接，起效周期短，可缩短研究时间，标记和清除过程独立控制，实验结果更加直观，因此，本发明的载体系统可广泛应用于疾病的机制研究和治疗策略探索中，例如疾病的体内病变细胞分布研究，病变细胞与疾病的发生和治疗关系的研究；本发明设计使用的FKBP基因片段为具有F36V和L106P突变位点的基因序列片段，其编码合成的蛋白质稳定性差，与其他蛋白具有更强的结合能力，FRBCaspase8-2A-BSD片段是具有三点突变(FRB*)的FRB，旨在结合雷帕霉素类似物；本发明首次采用FKBP与FRB的结合来使caspase8形成二聚体，从而诱导细胞凋亡，本发明的载体系统可通过腺病毒、慢病毒等载体导入动物细胞中，并在包含靶向细胞特异性启动子的情况下，在特定细胞中表达并呈现红色荧光标记，同时在雷帕霉素存在的情况下诱导FKBP与FRB结合，启动Caspase8，激活凋亡信号介导细胞凋亡，起到荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用。
附图说明
图1为本发明的实施例的重组载体一和重组载体二的结构及作用原理示意图；
图2为本发明的实施例中载体系统转染至293T细胞中之后的荧光图；
图3为本发明的实施例中AP20187+rapamycin处理Plasmid FKBP+Plasmid FBR转染的293T细胞后的凋亡情况结果图；
图4为本发明的实施例中慢病毒载体共感染AGS细胞的荧光图；
图5为本发明的实施例中AP20187+rapamycin处理慢病毒FKBP+慢病毒FRB感染的AGS细胞的凋亡情况结果图；
图6为本发明的实施例中慢病毒载体共感染U251细胞的荧光图；
图7为本发明的实施例中AP20187+rapamycin处理慢病毒FKBP+慢病毒FRB感染的U251细胞的凋亡情况结果图；
图8为本发明的实施例中慢病毒载体共感染K562细胞的荧光图；
图9为本发明的实施例中AP20187+rapamycin处理慢病毒FKBP+慢病毒FRB感染的K562细胞的凋亡情况结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。
实施例：
一种诱导细胞凋亡的载体系统，包括重组载体一和重组载体二，重组载体一为Plasmid CMV-FKBP-tdTomato，重组载体二为Plasmid EF1α-FRBCaspase8-2A-BSD，重组载体一和重组载体二的序列分别见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；重组载体一由FKBP基因片段与骨架质粒tdTomato-N1连接而成，FKBP基因片段为具有F36V和L106P突变位点的基因序列片段，其编码合成的蛋白质稳定性差，但与其他蛋白具有更强的结合能力，FKBP基因片段的序列见SEQ ID NO：1；重组载体二由FRB Caspase8-2A-BSD片段与骨架质粒lenti Cas9-Blast连接而成，FRB Caspase8-2A-BSD片段为三点突变(FRB*)的FRB，旨在结合雷帕霉素类似物，FRB Caspase8-2A-BSD片段的序列见SEQ ID NO：2。
上述载体系统的制备方法，包括如下步骤：
S1：按文献及基因数据设计FKBP基因片段和FRB Caspase8-2A-BSD基因片段，经
Figure BDA0002825183580000031
Gene Fragments Entry(https://www.idtdna.com/site/order/gblockentry)明确片段可通过人工合成，之后委托华大基因公司合成FKBP基因片段和FRB Caspase8-2A-BSD基因片段；
S2：扩增tdTomato-N1质粒和lentiCas9-Blast质粒，扩增后提取质粒，备用；
S3：使用HindIII和BamHI限制性内切酶酶切步骤S1中的FKBP基因片段和步骤S2中的tdTomato-N1质粒，酶切位点如下：
HindIII：
Figure BDA0002825183580000041
BamHI：
Figure BDA0002825183580000042
之后采用Nebuilder试剂盒将酶切后的FKBP基因片段与酶切后的tdTomato-N1质粒连接得重组载体一；使用XbaI和BamHI限制性内切酶酶切步骤S1中的FRB Caspase8-2A-BSD基因片段和步骤S2中的lentiCas9-Blast质粒，酶切位点如下：
XbaI：
Figure BDA0002825183580000043
BamHI：
Figure BDA0002825183580000044
之后采用Nebuilder试剂盒将酶切后的FRB Caspase8-2A-BSD基因片段与酶切后的lentiCas9-Blast质粒连接得重组载体二。
上述的tdTomato-N1质粒为tdTomato-N1，Addgene，Plasmid#54642。上述的lentiCas9-Blast质粒为lentiCas9-Blast，Addgene，Plasmid#52962。
见附图1，本实施例的重组载体一通过CMV启动子启动细胞中FKBP及tdTomato(一种红色荧光蛋白，其荧光强度是GFP绿色荧光蛋白的6倍)同时表达；本实施例的重组载体二通过EF-1α启动子启动细胞中FRB及Caspase8-Flag表达。本实施例的载体系统可通过腺病毒、慢病毒等载体导入动物细胞，重组载体一和重组载体二两个载体系统在细胞中表达合成的突变型FKBP在AP20187(AP20187是一种细胞渗透性分子，使FK506结合蛋白(FKBP)二聚化，启动生物信号传导级联反应和基因表达，或破坏蛋白-蛋白之间相互作用)的诱导下二聚化；雷帕霉素诱导FKBP与FRB结合，引起FRB所连接的Caspase8形成二聚体，从而启动Caspase8，并通过自我剪切而活化，从而激活下游凋亡信号通路促进细胞凋亡，进而起到荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用。
本实施例的载体系统可广泛应用于疾病的机制研究和治疗策略探索中，例如疾病的体内病变细胞分布研究，病变细胞与疾病的发生和治疗关系的研究。
本实施例的重组载体一Plasmid CMV-FKBP-tdTomato的序列为：，重组载体二Plasmid EF1α-FRBCaspase8-2A-BSD的序列为，FKBP基因片段的序列为：，FRB Caspase8-2A-BSD片段的序列为。
本实施例经测序可验证本实施例的载体系统构建成功。
本实施例将重组载体一和重组载体二通过Lipo 3000转染试剂转染至293T细胞中，转染48小时后暴露于3uMAP20187(B/B Homodimerizer)中12小时，再加入1uM雷帕霉素(rapamycin)处理24小时，之后在荧光显微镜下通过荧光强度观察细胞的红色荧光(tdTomato)。见附图2，其中图2A为明场下观察的细胞形态，图2B为荧光显微镜下观察的细胞形态，图2B中用箭头及R标明的白色部分(此部分在彩色图片下为红色荧光)为转染Plasmid FKBP+Plasmid FRB的细胞，图2C为转染后+AP20187+Rapamycin明场下的细胞形态，图2D为荧光显微镜下细胞转染后+AP20187+Rapamycin观察的细胞形态，标尺100um，放大倍数100x。图2显示与转染组(图2B)相比，转染加药组(图2D)中红色荧光减少，结果显示在转染组tdTomato在转染阳性细胞中得到表达并二聚化发出红色荧光，使用AP20187和Rapamycin后启动Caspase8凋亡途径，引起了转染阳性细胞凋亡，红色荧光阳性细胞减少，说明本载体系统在质粒载体转染细胞内可稳定发挥作用。
本实施例在后续的流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平中发现，见附图3，为AP20187+rapamycin处理Plasmid FKBP+Plasmid FBR转染的293T细胞后的凋亡情况结果图，与空载NC组相比，NC+AP20187+Rapamycin组凋亡率没有明显变化；与转染组(Transfection)相比，转染+AP20187+rapamycin处理组的细胞凋亡率明显增加，此处的实验结果再次说明在AP20187和Rapamycin存在情况下，转染阳性细胞启动了凋亡途径，提高了其凋亡率。
本实施例设计并构建了两个慢病毒载体，分别为：(1)慢病毒FKBP：由CMV启动子启动细胞中FKBP及tdTomato同时表达；(2)慢病毒FRB：EF-1α启动子启动细胞中FRB及Caspase8-Flag表达。将两种慢病毒载体共感染多种细胞，如AGS(人胃腺癌细胞)、U251(人胶质瘤细胞)、K562(人慢性髓源白血病细胞)，通过红色荧光的检测及AP20187与Rypamycin处理，以验证肿瘤细胞能够通过此系统诱导细胞凋亡。本实施例根据细胞MOI及病毒滴度，加入相应病毒量至AGS细胞中，感染后约72小时，观察感染效率后再暴露于2uM AP20187(B/B Homodimerizer)中12小时，再加入1uM雷帕霉素(rapamycin)中处理12小时，在荧光显微镜下通过荧光强度观察细胞的红色荧光(tdTomato)。见附图4，图4A为明场下观察的细胞形态，图4B为荧光显微镜下观察的细胞形态，图4B中用箭头及G标明的白色部分(此部分在彩色图片下为红色荧光)为感染慢病毒FKBP+慢病毒FRB的细胞；图4C为感染后+AP20187+Rapamycin明场下的细胞形态，图4D为荧光显微镜下细胞感染后+AP20187+Rapamycin观察的细胞形态，标尺100um，放大倍数100x。图4显示与转染组(图4B)相比，转染加药组(图4D)中红色荧光减少，本实验结果表明在使用慢病毒载体感染细胞时，也可在目标细胞内稳定表达，并在AP20187和Rapamycin存在的情况下启动Caspase8下游凋亡途径介导细胞凋亡。
随后在流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平中发现，见附图5，与NC组相比，NC+AP20187+Rapamycin组的凋亡率没有明显变化；与感染组(Infection)相比，感染+AP20187+rapamycin处理组的细胞的凋亡率明显增加，说明利用本实施例的载体系统构建的慢病毒载体感染人胃腺癌细胞后可诱导癌细胞凋亡，也再次说明了本实施例构建的载体系统起到了荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用。
本实施例还根据细胞MOI及病毒滴度，加入相应病毒量至U251细胞中，感染后约72小时，观察感染效率后再暴露于2uMAP20187(B/B Homodimerizer)中24小时，再加入2uM雷帕霉素(rapamycin)处理24小时，在荧光显微镜下通过荧光强度观察细胞的红色荧光(tdTomato)。见附图6，图6A表示明场下观察的细胞形态，图6B表示在荧光显微镜下观察的细胞形态，图6B中用箭头及G标明的白色部分(此部分在彩色图片下为红色荧光)为感染慢病毒FKBP+慢病毒FRB的细胞；图6C表示感染后+AP20187+Rapamycin明场下的细胞形态，图6D表示荧光显微镜下细胞感染后+AP20187+Rapamycin观察的细胞形态，标尺100um，放大倍数100x。图6显示，与转染组(图6B)相比，转染加药组(图6D)中红色荧光减少，此实验证实，在U251细胞中该系统也可稳定表达，并且在AP20187和Rapamycin存在的情况下启动Caspase8凋亡途径，可在多种细胞中得到应用。
随后在流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平中发现，见附图7，与NC组相比，NC+AP20187+Rapamycin组的细胞凋亡率没有明显变化；与感染组(Infection)相比，感染+AP20187+rapamycin处理组的细胞凋亡率明显增加，说明利用本实施例的载体系统构建的慢病毒载体感染人胶质瘤细胞后可诱导癌细胞凋亡，也再次说明了本实施例构建的载体系统起到了荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用。
本实施例还根据细胞MOI及病毒滴度，加入相应病毒量至K562(人慢性髓源白血病细胞)细胞中，感染后约72小时，观察感染效率后再暴露于1uM AP20187(B/BHomodimerizer)中24小时，再加入3uM雷帕霉素(rapamycin)处理24小时，在荧光显微镜下通过荧光强度观察细胞的红色荧光(tdTomato)。见附图8，图8A表示明场下观察的细胞形态，图8B表示在荧光显微镜下观察的细胞形态，图8B中用箭头及G标明的白色部分(此部分在彩色图片下为红色荧光)为感染慢病毒FKBP+慢病毒FRB的细胞；图8C表示感染后+AP20187+Rapamycin明场下的细胞形态，图8D表示荧光显微镜下细胞感染后+AP20187+Rapamycin观察的细胞形态，标尺100um，放大倍数100x。图8显示，与感染组(图8B)相比，感染加药组(图8D)中红色荧光减少，此实验表明在K562细胞中也可稳定表达，并且在AP20187和Rapamycin存在时启动凋亡途径，说明该系统在K562细胞中也可得到很好应用。。
随后在流式细胞术检测各组细胞的凋亡水平中发现，见附图9，与NC组相比，NC+AP20187+Rapamycin组的细胞凋亡率没有明显变化；与感染组(Infection)相比，感染+AP20187+rapamycin处理组的细胞凋亡率明显增加，说明利用本实施例的载体系统构建的慢病毒载体感染人慢性髓源白血病细胞后可诱导癌细胞凋亡，也再次说明了本实施例构建的载体系统起到了荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用。
本实施例对上述实验中提及的细胞MOI及病毒滴度的解释如下：病毒体积(病毒量)＝(各种细胞对应的MOI值x细胞数目)/病毒滴度，其中AGS细胞的MOI值为10，U251细胞的MOI值为5，293T细胞的MOI值为5，K562细胞的MOI值为30，细胞数目为5x104，病毒滴度在慢病毒载体构建完成时便已成为已知。
综上所述，本实施例构建的载体系统可诱导细胞发生凋亡。本实施例的载体系统在现在以及未来均具有很大的应用价值，本实施例的载体系统可应用于制备检测或诊断或治疗癌症的产品中，所述产品可以是慢病毒载体，所述慢病毒载体起到了荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用，所述细胞可以是人胃腺癌细胞或人胶质瘤细胞或人慢性髓源白血病细胞，但并不限于上述细胞。
如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 贵州医科大学
<120> 一种诱导细胞凋亡的载体系统
<130> 2020.10.29
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 696
<212> DNA
<213> DNA
<400> 1
atggggagta gcaagagcaa gcctaaggac cccagccagc gctctagagg cgtccaagtc 60
gaaaccatta gtcccggcga tggcagaaca tttcctaaaa ggggacaaac atgtgtcgtc 120
cattatacag gcatgttgga ggacggcaaa aaggtggaca gtagtagaga tcgcaataaa 180
cctttcaaat tcatgttggg aaaacaagaa gtcattaggg gatgggagga gggcgtggct 240
caaatgtccg tcggccaacg cgctaagctc accatcagcc ccgactacgc atacggcgct 300
accggacatc ccggaattat tccccctcac gctaccttgg tgtttgacgt cgaactgttg 360
aagccagaga ctagaggagt gcaggtggag actatctccc caggagacgg gcgcaccttc 420
cccaagcgcg gccagacctg cgtggtgcac tacaccggga tgcttgaaga tggaaagaaa 480
gttgattcct cccgggacag aaacaagccc tttaagttta tgctaggcaa gcaggaggtg 540
atccgaggct gggaagaagg ggttgcccag atgagtgtgg gtcagagagc caaactgact 600
atatctccag attatgccta tggtgccact gggcacccag gcatcatccc accacatgcc 660
actctcgtct tcgatgtgga gcttctaaaa cctgaa 696
<210> 2
<211> 273
<212> DNA
<213> DNA
<400> 2
atggagatgt ggcacgaggg cctggaggag gccagcagac tgtacttcgg cgagagaaac 60
gtgaagggca tgttcgaggt gctggagccc ctgcacgcca tgatggagag aggcccccag 120
accctgaagg agaccagctt caaccaggcc tacggcagag acctgatgga ggcccaggag 180
tggtgcagaa agtacatgaa gagcggcaac gtgcctgacc tgctccaggc cttcgacctg 240
tactaccacg tgttcagaag aatcagcaag cag 273
<210> 3
<211> 2271
<212> DNA
<213> DNA
<400> 3
tcagatccgc tagcgctacc ggactcagat ctcgagctca agcttgccac catggggagt 60
agcaagagca agcctaagga ccccagccag cgctctagag gcgtccaagt cgaaaccatt 120
agtcccggcg atggcagaac atttcctaaa aggggacaaa catgtgtcgt ccattataca 180
ggcatgttgg aggacggcaa aaaggtggac agtagtagag atcgcaataa acctttcaaa 240
ttcatgttgg gaaaacaaga agtcattagg ggatgggagg agggcgtggc tcaaatgtcc 300
gtcggccaac gcgctaagct caccatcagc cccgactacg catacggcgc taccggacat 360
cccggaatta ttccccctca cgctaccttg gtgtttgacg tcgaactgtt gaagccagag 420
actagaggag tgcaggtgga gactatctcc ccaggagacg ggcgcacctt ccccaagcgc 480
ggccagacct gcgtggtgca ctacaccggg atgcttgaag atggaaagaa agttgattcc 540
tcccgggaca gaaacaagcc ctttaagttt atgctaggca agcaggaggt gatccgaggc 600
tgggaagaag gggttgccca gatgagtgtg ggtcagagag ccaaactgac tatatctcca 660
gattatgcct atggtgccac tgggcaccca ggcatcatcc caccacatgc cactctcgtc 720
ttcgatgtgg agcttctaaa acctgaaaag cttggaagcg gagctactaa cttcagcctg 780
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggacctg cggatccacc ggtcgccacc 840
atggtgagca agggcgagga ggtcatcaaa gagttcatgc gcttcaaggt gcgcatggag 900
ggctccatga acggccacga gttcgagatc gagggcgagg gcgagggccg cccctacgag 960
ggcacccaga ccgccaagct gaaggtgacc aagggcggcc ccctgccctt cgcctgggac 1020
atcctgtccc cccagttcat gtacggctcc aaggcgtacg tgaagcaccc cgccgacatc 1080
cccgattaca agaagctgtc cttccccgag ggcttcaagt gggagcgcgt gatgaacttc 1140
gaggacggcg gtctggtgac cgtgacccag gactcctccc tgcaggacgg cacgctgatc 1200
tacaaggtga agatgcgcgg caccaacttc ccccccgacg gccccgtaat gcagaagaag 1260
accatgggct gggaggcctc caccgagcgc ctgtaccccc gcgacggcgt gctgaagggc 1320
gagatccacc aggccctgaa gctgaaggac ggcggccact acctggtgga gttcaagacc 1380
atctacatgg ccaagaagcc cgtgcaactg cccggctact actacgtgga caccaagctg 1440
gacatcacct cccacaacga ggactacacc atcgtggaac agtacgagcg ctccgagggc 1500
cgccaccacc tgttcctggg gcatggcacc ggcagcaccg gcagcggcag ctccggcacc 1560
gcctcctccg aggacaacaa catggccgtc atcaaagagt tcatgcgctt caaggtgcgc 1620
atggagggct ccatgaacgg ccacgagttc gagatcgagg gcgagggcga gggccgcccc 1680
tacgagggca cccagaccgc caagctgaag gtgaccaagg gcggccccct gcccttcgcc 1740
tgggacatcc tgtcccccca gttcatgtac ggctccaagg cgtacgtgaa gcaccccgcc 1800
gacatccccg attacaagaa gctgtccttc cccgagggct tcaagtggga gcgcgtgatg 1860
aacttcgagg acggcggtct ggtgaccgtg acccaggact cctccctgca ggacggcacg 1920
ctgatctaca aggtgaagat gcgcggcacc aacttccccc ccgacggccc cgtaatgcag 1980
aagaagacca tgggctggga ggcctccacc gagcgcctgt acccccgcga cggcgtgctg 2040
aagggcgaga tccaccaggc cctgaagctg aaggacggcg gccactacct ggtggagttc 2100
aagaccatct acatggccaa gaagcccgtg caactgcccg gctactacta cgtggacacc 2160
aagctggaca tcacctccca caacgaggac tacaccatcg tggaacagta cgagcgctcc 2220
gagggccgcc accacctgtt cctgtacggc atggacgagc tgtacaagta a 2271
<210> 4
<211> 1656
<212> DNA
<213> DNA
<400> 4
tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gaccggttct agagcgctgc caccatggag 60
atgtggcacg agggcctgga ggaggccagc agactgtact tcggcgagag aaacgtgaag 120
ggcatgttcg aggtgctgga gcccctgcac gccatgatgg agagaggccc ccagaccctg 180
aaggagacca gcttcaacca ggcctacggc agagacctga tggaggccca ggagtggtgc 240
agaaagtaca tgaagagcgg caacgtgcct gacctgctcc aggccttcga cctgtactac 300
cacgtgttca gaagaatcag caagcagggt ggcggtggct cgggtggcgg tggctcgggt 360
ggcggtggct cgactagtag tgaatcacag actttggaca aagtttacca aatgaaaagc 420
aaacctcggg gatactgtct gatcatcaac aatcacaatt ttgcaaaagc acgggagaaa 480
gtgcccaaac ttcacagcat tagggacagg aatggaacac acttggatgc aggggctttg 540
accacgacct ttgaagagct tcattttgag atcaagcccc acgatgactg cacagtagag 600
caaatctatg agattttgaa aatctaccaa ctcatggacc acagtaacat ggactgcttc 660
atctgctgta tcctctccca tggagacaag ggcatcatct atggcactga tggacaggag 720
gcccccatct atgagctgac atctcagttc actggtttga agtgcccttc ccttgctgga 780
aaacccaaag tgttttttat tcaggcttgt cagggggata actaccagaa aggtatacct 840
gttgagactg attcagagga gcaaccctat ttagaaatgg atttatcatc acctcaaacg 900
agatatatcc cggatgaggc tgactttctg ctggggatgg ccactgtgaa taactgtgtt 960
tcctaccgaa accctgcaga gggaacctgg tacatccagt cactttgcca gagcctgaga 1020
gagcgatgtc ctcgaggcga tgatattctc accatcctga ctgaagtgaa ctatgaagta 1080
agcaacaagg atgacaagaa aaacatgggg aaacagatgc ctcagcctac tttcacacta 1140
agaaaaaaac ttgtcttccc ttctgatgat tacaaggatg acgacgataa gggatccggc 1200
gcaacaaact tctctctgct gaaacaagcc ggagatgtcg aagagaatcc tggaccgatg 1260
gccaagcctt tgtctcaaga agaatccacc ctcattgaaa gagcaacggc tacaatcaac 1320
agcatcccca tctctgaaga ctacagcgtc gccagcgcag ctctctctag cgacggccgc 1380
atcttcactg gtgtcaatgt atatcatttt actgggggac cttgtgcaga actcgtggtg 1440
ctgggcactg ctgctgctgc ggcagctggc aacctgactt gtatcgtcgc gatcggaaat 1500
gagaacaggg gcatcttgag cccctgcgga cggtgccgac aggtgcttct cgatctgcat 1560
cctgggatca aagccatagt gaaggacagt gatggacagc cgacggcagt tgggattcgt 1620
gaattgctgc cctctggtta tgtgtgggag ggctaa 1656

Claims (5)

1.一种诱导细胞凋亡的载体系统，其特征在于，包括重组载体一和重组载体二，重组载体一为Plasmid CMV-FKBP-tdTomato，重组载体二为Plasmid EF1α-FRBCaspase8-2A-BSD，重组载体一和重组载体二的序列分别见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；重组载体一由FKBP基因片段与骨架质粒tdTomato-N1连接而成，FKBP基因片段为具有F36V和L106P突变位点的基因序列片段，FKBP基因片段的序列见SEQ ID NO：1；重组载体二由FRB Caspase8-2A-BSD片段与骨架质粒lenti Cas9-Blast连接而成，FRB Caspase8-2A-BSD片段的序列见SEQ IDNO：2。
2.权利要求1所述的载体系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：合成FKBP基因片段和FRB Caspase8-2A-BSD基因片段；
S2：扩增tdTomato-N1质粒和lentiCas9-Blast质粒，扩增后提取质粒，备用；
S3：使用HindIII和BamHI限制性内切酶酶切步骤S1中的FKBP基因片段和步骤S2中的tdTomato-N1质粒，之后将酶切后的FKBP基因片段与酶切后的tdTomato-N1质粒连接得重组载体一；使用XbaI和BamHI限制性内切酶酶切步骤S1中的FRB Caspase8-2A-BSD基因片段和步骤S2中的lentiCas9-Blast质粒，之后将酶切后的FRB Caspase8-2A-BSD基因片段与酶切后的lentiCas9-Blast质粒连接得重组载体二。
3.权利要求1中所述的载体系统在制备检测或诊断或治疗癌症的产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为慢病毒载体，所述慢病毒载体起到了荧光标记并特异性靶向清除特定细胞的作用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述细胞为人胃腺癌细胞或人胶质瘤细胞或人慢性髓源白血病细胞。
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