CN116003622A - 一种用于卵巢癌治疗的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于卵巢癌治疗的嵌合抗原受体及其应用。本发明公开的嵌合抗原受体包括CD8信号肽、特异性识别CLDN6的单链抗体CLDN6 scFv、CD8铰链区、NKG2D跨膜区、2B4胞内共刺激域、DAP10胞内共刺激域以及CD3ζ信号区。基于该嵌合抗原受体且靶向CLDN6的第三代CAR‑NK细胞，可以介导更强的NK细胞信号转导及杀伤能力，明显提升NK细胞活化水平以及分泌细胞因子的能力，杀伤作用更快、所需NK细胞数量更少，使NK细胞具备连续杀伤能力，和抗PD‑L1抗体的联合应用可以进一步提高CAR‑NK细胞在体内的持久性与瘤内浸润，增强杀伤效果。

Description

一种用于卵巢癌治疗的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于卵巢癌治疗的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤，是女性癌症相关死亡的主要原因之一。目前，多达80％的患者在完成手术与传统化疗后的两年内复发，并最终发展成化疗耐药，5年生存率仅为40-45％。虽然最近研发出了分子靶向药与免疫检查点抑制剂治疗方法，但并未表现出明显优于传统化疗的优势。因此，迫切需要研制新的卵巢癌有效治疗策略。

嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)修饰T细胞(CAR-T)治疗是一种有效的肿瘤治疗方法。CAR-T细胞是一种通过基因工程技术改造的T细胞，可在细胞表面表达具有特异识别肿瘤的嵌合抗体(CAR分子)，从而赋予T细胞在体内特异靶向肿瘤细胞并进行靶向杀伤的能力。如今靶向CD19的CAR-T细胞治疗已在白血病和淋巴瘤中得到了成功的应用，然而，靶外毒性、神经毒性、细胞因子释放综合征或移植物抗宿主病等限制了CAR-T细胞的进一步临床应用。此外，由于实体肿瘤中存在免疫抑制性肿瘤微环境，严重制约了效应细胞的瘤内浸润能力和体内的持久性，使得CAR-T细胞对实体瘤的治疗效果不如血液肿瘤的显著。因此，研发新型高效低毒的CAR修饰效应细胞具有重要的临床意义和重大的应用价值。

自然杀伤(Natural killer，NK)细胞是先天免疫系统的重要组成部分，由于NK细胞具有特殊的靶细胞识别机制、天然的抗肿瘤活性、高细胞毒性和较短的细胞生命周期等生物学特性，并且来源相对比较广泛，使其成为一种可通过CAR修饰来增强其抗肿瘤能力的效应细胞，CAR修饰的NK细胞(CAR-NK)可作为CAR-T细胞治疗的替代方案。目前，CAR-NK细胞治疗产品的开发已经成为肿瘤免疫治疗领域的研究新热点。

要实现CAR-NK细胞对肿瘤的有效治疗，在CAR分子的设计中选择合适的靶点抗原尤为重要。一个合适的CAR靶点应具备以下两个条件：一是在肿瘤组织上高表达，而在正常细胞上不表达或低表达；二是定位在细胞膜表面。目前，CAR-NK细胞在卵巢癌方面的临床前研究所应用的靶点包括间皮素、叶酸受体、CD24，所用NK细胞大部分来源于NK-92细胞系，都取得了良好的临床前效果。然而，卵巢癌可利用的特异性靶点有限，寻找新靶点迫在眉睫。

紧密连接蛋白Claudin-6(CLDN6)是一种参与细胞紧密连接形成的四次跨膜蛋白，在成人正常组织中不表达，高表达于卵巢癌、睾丸癌和子宫内膜癌等实体肿瘤，是一种理想的治疗靶点。已有研究组开发出靶向CLDN6的CAR-T细胞用于卵巢癌治疗，取得了较好的临床前研究成果，但靶向CLDN6的三代CAR-NK细胞用于治疗卵巢癌的可行性尚未得到评估。

除了靶点的适用性以外，CAR分子本身的结构设计对于其抗肿瘤效果也是至关重要的，优化CAR结构可以提高CAR-NK细胞免疫治疗的有效性和安全性。CAR是CAR-T/CAR-NK的核心部件，一般由3个结构组成：细胞外结构域、跨膜结构区和细胞内结构域。其中，单克隆抗体胞外结构域单链可变区(Single-chain varial Fragment，scFv)是一种抗体重链和轻链可变区的融合蛋白，是肿瘤抗原关键结合域，能特异性识别靶点抗原；跨膜结构域连接胞内区和胞外区，决定CAR的表达水平和稳定性，CD8与CD28是目前研究最多的细胞跨膜经典结构；细胞内结构域负责信号的传导和NK细胞的激活，由激活结构域(CD3ζ，效应细胞活化的第一信号)和胞内共刺激结构域(效应细胞活化的第二信号，刺激细胞扩增或分泌抗肿瘤细胞因子)组成。根据胞内区结构不同，可将CAR分为四代：第一代CAR仅包含靶向细胞膜分子的scFv和CD3ζ信号域；在原有胞内信号区的基础上串联上一个或者两个共刺激信号元件，从而派生出了二代和三代CAR；而引入细胞因子和共刺激配体的CAR结构被称为四代CAR。由于T细胞与NK细胞具有不同的生物学特性和活化机制，因此需要对NK细胞上的CAR分子结构进行相适应的优化改造，从而进一步提高CAR-NK细胞的功能和持久性。

当前，尽管CAR-T/NK细胞在抗血液肿瘤中已显示出巨大的潜力，但在实体瘤的应用过程中仍然面临着几个障碍，包括免疫细胞肿瘤浸润效率低和功能持久性不足等，因此需要开发新的治疗策略来增强CAR-T/NK细胞对实体瘤的治疗效果。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种嵌合抗原受体，基于该嵌合抗原受体且靶向CLDN6的第三代CAR-NK细胞，可以介导更强的NK细胞信号转导及杀伤能力，明显提升NK细胞活化水平以及分泌细胞因子的能力，杀伤作用更快、所需NK细胞数量更少，使NK细胞具备连续杀伤能力，和抗PD-L1抗体的联合应用可以进一步提高CAR-NK细胞在体内的持久性与瘤内浸润，增强杀伤效果。

为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括CD8信号肽、特异性识别CLDN6的单链抗体CLDN6 scFv、CD8铰链区、NKG2D跨膜区、2B4胞内共刺激域、DAP10胞内共刺激域以及CD3ζ信号区；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CLDN6 scFv的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述NKG2D跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，所述2B4胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述DAP10胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

该CAR属于第三代，不仅包含CD3ζ信号区，传递激活信号，还包含两个胞内共刺激域2B4和DAP10，进一步提高信号转导功能，解决CAR-NK细胞移植后体内扩增不足和作用不持久的问题；NKG2D、2B4与DAP10为NK细胞自身的活化元件，利用NK细胞自身的活化元件可以实现CAR信号的传递和增强，效果优于经典的CAR-T细胞活化元件结构。

第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明提供了一种慢病毒载体，所述慢病毒载体包括第二方面所述的编码基因。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的慢病毒载体和辅助质粒的哺乳细胞。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293F细胞中的至少一种。更有选地，所述哺乳细胞为293T细胞。

优选地，所述辅助质粒包括pUC57载体、慢病毒表达载体pWPXLd-2A-GFP、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G。

第五方面，本发明提供了一种CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞能表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述CAR-NK细胞能表达第一方面所述的嵌合抗原受体的人自然杀伤细胞系NK-92MI细胞。

优选地，所述CAR-NK细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。

优选地，所述CAR-NK细胞中包含有第三方面所述的慢病毒载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

在一个具体实施方式中，所述CAR-NK细胞的制备方法为将第二方面所述的编码基因通过慢病毒表达系统导入NK细胞中，并使所述编码基因得到表达，得到CAR-NK细胞。所述CAR-NK细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)慢病毒载体构建与包装：将第二方面所述的编码基因插入慢病毒表达载体，并将重组慢病毒表达载体转染包装细胞，然后进行细胞培养后获得含有CAR的慢病毒；

(2)慢病毒感染：用构建含有CAR的慢病毒感染NK细胞，进行大量细胞扩增培养以备流式分选；

(3)CAR-NK细胞分选：流式细胞分选仪首先选择富集模式，分选收集慢病毒感染阳性NK细胞，并进行阳性细胞的扩增培养，培养3-5天后流式分析检测阳性率并改用纯化模式再次进行分选和培养分析，直至慢病毒感染细胞的阳性率达到99％，筛选纯化CAR-NK细胞；

(4)CAR-NK细胞扩增培养：将流式分选富集与纯化获得的CAR-NK细胞进行扩增培养，收获细胞。

第六方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的嵌合抗原受体，和/或第二方面所述的编码基因，和/或第三方面所述的慢病毒载体，和/或第四方面所述的重组慢病毒，和/或第五方面所述的CAR-NK细胞。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括A组分和B组分，所述A组分为第一方面所述的嵌合抗原受体，和/或第二方面所述的编码基因，和/或第三方面所述的慢病毒载体，和/或第四方面所述的重组慢病毒，和/或第五方面所述的CAR-NK细胞中的至少一种，所述B组分为PD-L1抑制剂。

优选地，所述PD-L1抑制剂为度伐利尤单抗。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的嵌合抗原受体，和/或第二方面所述的编码基因，和/或第三方面所述的慢病毒载体，和/或第四方面所述的重组慢病毒，和/或第五方面所述的CAR-NK细胞、第六方面所述的药物组合物在制备抗癌药物中的应用。

动物体内研究结果表明，优化的CLDN6-CAR NK细胞对CLDN6阳性的卵巢癌小鼠模型具有良好的抗肿瘤活性，小鼠体重评估未观察到明显的瘤外毒性，并可通过反复给药、局部注射(瘤周或腹腔)的治疗策略，提高瘤内CAR-NK浸润的数量与体内的持久性，从而增强其抗肿瘤效果，同时降低副作用。

本发明还提供了第一方面所述的嵌合抗原受体，和/或第二方面所述的编码基因，和/或第三方面所述的慢病毒载体，和/或第四方面所述的重组慢病毒，和/或第五方面所述的CAR-NK细胞、第六方面所述的药物组合物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

本发明还提供一种新的免疫组合疗法，将制备的CAR-NK细胞联合免疫检查点抑制剂PD-L1单抗，相互协同提高卵巢癌的治疗效果。单纯输注CAR-NK细胞可能受到肿瘤微环境内PD-1/PD-L1轴的免疫抑制，导致CAR-NK于瘤内免疫抑制的微环境内持久性有限，从而影响治疗效果。而卵巢癌是一种典型的免疫抑制型肿瘤，大多数卵巢癌及其微环境内都高表达PD-L1。在小鼠卵巢癌模型中，本发明制备的靶向CLDN6的CAR-NK细胞和抗PD-L1抗体的联合应用改善了CAR-NK细胞的功能，进一步提高CAR-NK细胞在体内的持久性与瘤内浸润，增强CAR-NK细胞对卵巢癌的体内杀伤效果，延长小鼠的生存时间。

优选地，所述肿瘤为CLDN6表达阳性的肿瘤。

更优选地，所述CLDN6表达阳性的肿瘤包括但不限于卵巢癌等实体瘤。

优选地，所述肿瘤细胞为人卵巢癌细胞系。

更优选地，所述人卵巢癌细胞系包括但不限于SK-OV-3、OVCAR-3、A2780、Hey。

第八方面，本发明还提供了第五方面所述CAR-NK细胞在治疗卵巢癌的给药方法，一种反复给药、局部注射(瘤周或腹腔)的治疗策略。

通过优化给药策略来改善效应细胞的持久性与活性，细胞疗法可通过局部和静脉输注两种途径输送细胞，局部给药的途径有助于改善效应细胞在实体肿瘤内的浸润，并能够使效应细胞及时获得增殖分化能力，从而增强其抗肿瘤效果，还可避免全身暴露引起的严重非靶性毒性。

在本发明的一个具体实施例中，通过对比静脉、腹腔与瘤周注射三种给药方式在两种不同卵巢癌小鼠模型中的治疗效果，实验结果表明：经瘤周、腹腔途径多次注射CAR-NK细胞的抗肿瘤效果优于静脉注射。在皮下瘤模型中，相比尾静脉注射，瘤周注射明显增强了抗肿瘤效果，并且多次注射靶向CLDN6的CAR-NK细胞可诱导增强抗肿瘤活性；卵巢癌的转移方式主要为局部扩散转移及腹腔种植，在腹腔转移瘤模型中，多次腹腔注射靶向CLDN6的CAR-NK细胞取得了良好的抗肿瘤效果，并且延长了小鼠的生存期。

优选地，上述给予CAR-NK效应细胞的具体用法用量如下：每只小鼠经瘤周或腹腔给予500万个CAR-NK细胞，间隔1周，以同样的给药方式，每只小鼠注射500万个CAR-NK细胞。

第九方面，本发明还提供了一种抗卵巢癌免疫组合疗法。通过创新的组合治疗策略，即联合多种不同作用机制的治疗技术，进而增强CAR-T/NK的治疗效果，从而达到更好的实体瘤(包括卵巢癌)治疗效果。

将第五方面所述的靶向CLDN6的CAR-NK细胞联合免疫检查点抑制剂PD-L1单抗，相互协同提高卵巢癌的治疗效果。

在本发明的一个具体实施例中，通过对比第五方面所述的CAR-NK细胞、PD-L1抑制剂度伐利尤单抗以及二者联合在两种卵巢癌小鼠模型中的治疗效果，结果发现：PD-L1抑制剂可增强靶向CLDN6的CAR-NK细胞对卵巢癌的体内杀伤效果。在PD-L1+Hey卵巢癌皮下瘤模型中，采用多次、多点瘤周注射PD-L1抑制剂或CLDN6-CAR NK细胞的方式给药，与无治疗组相比，只给予10mg/kg PD-L1抑制剂治疗组的肿瘤体积无明显差异，而单独给予CLDN6-CARNK细胞治疗组的肿瘤体积显著减小；与单独CLDN6-CAR NK细胞治疗组相比，PD-L1抑制剂与CLDN6-CAR NK细胞联合治疗组的肿瘤体积显著缩小，体内抗肿瘤作用增强，表现出非常明显的协同效应。在PD-L1+Hey卵巢癌腹腔瘤模型中，采用多次腹腔注射PD-L1抑制剂或CLDN6-CAR NK细胞的方式给药，与无治疗组相比，只给予10mg/kg PD-L1抑制剂治疗组的肿瘤体积无明显差异，而单独给予CLDN6-CAR NK细胞治疗组的肿瘤体积显著减小；与单独CLDN6-CAR NK细胞治疗组相比，PD-L1抑制剂与CLDN6-CAR NK细胞联合治疗组的肿瘤体积显著缩小，说明PD-L1抑制剂与CAR-NK联合具有协同作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明公开了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括CD8信号肽、特异性识别CLDN6的单链抗体CLDN6 scFv、CD8铰链区、NKG2D跨膜区、2B4胞内共刺激域、DAP10胞内共刺激域以及CD3ζ信号区。同时基于该嵌合抗原受体提供了一种靶向CLDN6的第三代CAR-NK细胞，对CAR的胞内结构域和跨膜区进行了相应的优化，利用NK细胞自身的活化元件(NKG2D、2B4)构建CAR分子结构。该CAR分子结构含有NKG2D跨膜结构域，2B4与DAP10共刺激信号结构域和CD3ζ结构域，可以介导更强的NK细胞信号转导及杀伤能力，明显提升NK细胞活化水平以及分泌细胞因子的能力，杀伤作用更快、所需NK细胞数量更少，使NK细胞具备连续杀伤能力，且其活化能力及杀伤效果显著优于基于经典结构构建的CAR-NK细胞。此外，本发明的靶向CLDN6的CAR-NK细胞和抗PD-L1抗体的联合应用可以改善CAR-NK细胞的功能，进一步提高CAR-NK细胞在体内的持久性与瘤内浸润，增强CAR-NK细胞对卵巢癌的体内杀伤效果，延长小鼠的生存时间。可见，本发明设计的靶向CLDN6的新型第三代CAR-NK细胞具有更强的细胞活化及杀伤能力，并进一步提高了CAR-NK细胞治疗实体肿瘤的安全性和有效性，具有卵巢癌治疗的临床应用潜力。

附图说明

图1为CAR分子基因的结构示意图；

图2为CAR-NK细胞的构建与流式分选结果(经过CAR分子慢病毒转染、富集分选及纯化分选的过程，流式分析eGFP阳性率即为CAR分子表达阳性率)；

图3为靶向CLDN6的CAR-NK对卵巢癌细胞的体外杀伤效果(采用荧光素酶法检测CAR-NK细胞体外杀伤效果；本结果为三次独立实验所得，数据用平均值±标准差表示；^*P＜0.05，^**P＜0.01，^***P＜0.001，^****P＜0.0001)；

图4为靶向CLDN6的CAR-NK细胞体外细胞因子分泌能力的评估结果；

图5为CLDN6-CAR NK细胞对SK-OV-3构建的皮下瘤模型的治疗效果(A为小鼠实验流程图；B为剥离肿瘤拍照示意图；C为肿瘤重量统计图；D为肿瘤体积生长曲线；E为小鼠体重变化图)；

图6为瘤周注射与尾静脉注射CAR-NK细胞治疗OVCAR-3GL构建皮下瘤的效果(A为实验流程图；B为小鼠活体成像结果图；C为活体成像荧光信号统计学分析；D、E、F为实验结束后取新鲜瘤组织、外周血及脾脏，制备单细胞悬液流式检测CAR-NK细胞的比例)；

图7为靶向CLDN6的CAR-NK细胞在卵巢癌腹腔瘤模型中的抗肿瘤活性(A为实验流程图；B为小鼠活体成像结果图；C为活体成像荧光信号统计学分析；D为小鼠生存曲线图；E为外周血检测CAR-NK细胞比例)；

图8为PD-L1抑制剂联合CAR-NK治疗PD-L+卵巢癌皮下瘤模型的结果(A为实验流程图；B为小鼠活体成像示意图；C为活体成像荧光信号的ROI统计学分析；D-F为实验结束后取新鲜瘤组织、外周血及脾脏，制备单细胞悬液流式检测CAR-NK细胞的比例)；

图9为PD-L1抑制剂联合CAR-NK治疗PD-L1+卵巢癌腹腔瘤模型的结果(A为实验流程图；B为小鼠活体成像图；C为活体成像荧光信号的统计学分析；D为小鼠生存曲线图；E为外周血检测CAR-NK细胞的比例)。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到。

本发明所用的人卵巢癌细胞系SK-OV-3、OVCAR-3、A2780、Hey、人胚肾细胞系HEK-293T及人前列腺癌细胞系PC-3购买于ATCC；人自然杀伤细胞系NK-92MI细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

上述细胞的培养条件均为：37℃、5％CO₂的细胞培养箱。

其中，人前列腺癌细胞系PC-3、卵巢癌细胞系SK-OV-3、OVCAR-3、A2780、Hey在含10％胎牛血清(FBS，Gibco)和1％双抗(青霉素和链霉素，Gibco)的RPMI 1640完全培养基中培养，人胚肾细胞系HEK-293T在含10％FBS和1％双抗的DMEM完全培养基中培养；人自然杀伤细胞系NK-92MI细胞(NK细胞)在含0.2mM肌醇(Solarbio)、0.1mMβ-巯基乙醇(武汉普诺赛生命科技有限公司)、0.02mM叶酸(Sigma-Aldrich)、12.5％马血清(Gibco)、12.5％FBS和1％双抗的MEMα完全培养基中培养。

实施例1嵌合抗原受体及嵌合抗原受体修饰NK细胞(CAR-NK细胞)的制备

根据NK细胞自身激活受体的特性，利用NK细胞自身的活化元件(NKG2D、2B4)来构建CAR分子跨膜与胞内共刺激信号的CAR分子结构(CAR1)，探索其是否优于经典的CAR-T细胞活化元件结构(CAR2：包含CD28与4-1BB)。

所述嵌合抗原受体CLDN6-NKG2D-2B4-DAP10-CAR1(CLDN6-CAR1)依次包括CD8信号肽(CD8 leader)、特异性识别CLDN6的单链抗体(CLDN6 scFv)、CD8铰链区(CD8 hinge)、NKG2D跨膜区、2B4胞内共刺激域、DAP10胞内共刺激域及CD3ζ信号区(NK细胞自身活化元件结构)。其中NKG2D是NK细胞的重要激活受体；2B4是NK细胞重要的活化信号调节分子；DNAX激活蛋白10(DAP10)对NK细胞的胞内信号转导具有重要作用；DAP10与CD3ζ串联作为NK细胞的胞内信号转导结构域。

基于经典结构的CLDN6-CD28-CD28-4-1BB-CAR2(CLDN6-CAR2)包含CD8信号肽、CLDN6 scFv、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28胞内共刺激域、4-1BB胞内共刺激域及CD3ζ信号区(T细胞经典结构)。

同时，以靶向CD19的CAR分子结构CD19-NKG2D-2B4-DAP10-CAR(CD19-CAR)作为对照，所述CD19-CAR依次包括CD8信号肽、特异性识别CD19的单链抗体(CD19 scFv)、CD8铰链区、NKG2D跨膜区、2B4胞内共刺激域、DAP10胞内共刺激域及CD3ζ信号区。

其中，所述CLDN6-CAR1的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPSIMSVSPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLSIYSTSNLASGVPARFSGRGSGTSYSLTISRVAAEDAATYYCQQRSNYPPWTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

所述CLDN6-CAR1的编码基因序列(SEQ ID NO.2)为：

ATGGCCCTGCCTGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCTGAAGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGTCCTGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCTCCGGCTACTCTTTTACCGGCTATACAATGAACTGGGTCAAGCAGAGCCACGGCAAAAATCTGGAATGGATCGGCCTCATCAACCCCTACAACGGCGGCACCATCTACAACCAGAAATTCAAGGGCAAAGCCACACTGACAGTGGACAAGAGCTCTTCTACCGCCTACATGGAACTGCTGAGCTTGACATCTGAAGATTCTGCTGTGTACTACTGTGCCCGCGACTACGGCTTCGTGCTGGACTACTGGGGCCAAGGAACCACCCTGACCGTGTCCTCCGGCGGAGGCGGCAGCGGCGGAGGCGGCAGCGGCGGCGGAGGCAGCCAGATCGTGCTGACGCAGAGCCCAAGCATCATGTCTGTGAGCCCTGGCGAAAAGGTCACCATCACCTGTAGCGCCAGCAGCTCAGTCTCCTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCTGGAACAAGCCCCAAGCTGAGCATCTACAGCACAAGCAATCTGGCTAGCGGCGTGCCCGCCAGATTTTCCGGCAGAGGATCTGGCACCTCTTATTCGCTGACAATTAGTCGGGTGGCGGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGATCCAACTACCCTCCTTGGACCTTTGGCGGCGGGACCAAGCTGGAAATCAAGACCACAACCCCTGCCCCAAGGCCCCCCACCCCTGCTCCTACCATTGCTAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCAGAGGCCTGTAGACCTGCCGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACCCCTTCTTTTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCCATGGGCATCAGATTCATCATCATGGTGGCCTGGCGGCGGAAGAGAAAAGAGAAGCAGAGTGAAACCAGCCCCAAGGAATTCCTGACCATCTACGAGGACGTGAAAGATCTGAAGACCAGAAGAAACCACGAGCAAGAGCAGACATTCCCCGGCGGAGGGAGCACCATCTACAGCATGATCCAGTCTCAGTCCAGCGCCCCTACCAGCCAGGAGCCTGCATACACACTGTACAGCCTGATCCAGCCTAGCAGAAAGAGCGGATCTAGGAAACGGAACCACAGCCCTTCTTTCAACAGCACAATCTATGAGGTGATCGGCAAGTCCCAGCCTAAGGCCCAGAATCCTGCCAGACTGTCTCGGAAAGAGCTGGAAAACTTCGACGTGTACAGCCTGTGCGCCCGGCCACGGCGGAGCCCCGCCCAGGAGGATGGCAAGGTGTACATCAACATGCCTGGCAGGGGCCGAGTGAAGTTCAGCAGAAGCGCCGACGCCCCTGCCTACCAGCAAGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGACGCGAGGAATACGACGTTCTGGATAAGAGAAGAGGCAGAGATCCTGAGATGGGCGGCAAACCTAGACGGAAGAACCCTCAGGAGGGACTGTACAATGAGCTGCAAAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGCGGAGACGGGGAAAAGGCCACGACGGCCTGTATCAGGGCCTGTCTACAGCTACAAAGGACACCTACGATGCTCTTCATATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA。

所述CD8信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO.3)为：

MALPVTALLLPLALLLHAARP。

所述CLDN6 scFv的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)为：

EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPSIMSVSPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLSIYSTSNLASGVPARFSGRGSGTSYSLTISRVAAEDAATYYCQQRSNYPPWTFGGGTKLEIK。

所述CD8铰链区的氨基酸序列(SEQ ID NO.5)为：

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY。

所述NKG2D跨膜区的氨基酸序列(SEQ ID NO.6)为：

PFFFCCFIAVAMGIRFIIMVA。

所述2B4胞内共刺激域的氨基酸序列(SEQ ID NO.7)为：

WRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYS。

所述DAP10胞内共刺激域的氨基酸序列(SEQ ID NO.8)为：

LCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG。

所述CD3ζ信号区的氨基酸序列(SEQ ID NO.9)为：

RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

所述CLDN6-CAR2的氨基酸序列(SEQ ID NO.10)为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTIYNQKFKGKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARDYGFVLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPSIMSVSPGEKVTITCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLSIYSTSNLASGVPARFSGRGSGTSYSLTISRVAAEDAATYYCQQRSNYPPWTFGGGTKLEIKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(CD8信号肽的氨基酸序列为第1-21位，CLDN6 scFv的氨基酸序列为第22-260位，CD8铰链区的氨基酸序列为第261-307位，CD28跨膜区的氨基酸序列为第308-373位，CD28共刺激域的氨基酸序列为第374-414位，4-1BB胞内共刺激域的氨基酸序列为第415-456位，CD3ζ信号区的氨基酸序列为第457-568位。以上氨基酸位点区域均按顺数次序编排)。

所述CLDN6-CAR2的编码基因序列(SEQ ID NO.11)为：

ATGGCCCTGCCCGTGACCGCCCTGCTGCTGCCCCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCAGGCCCGAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCATGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACAGCTTCACCGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGCCACGGCAAGAACCTGGAGTGGATCGGCCTGATCAACCCCTACAACGGCGGCACCATCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGTGGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGGAGCTGCTGAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACTACGGCTTCGTGCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCGGCAGCCAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCAGCATCATGAGCGTGAGCCCCGGCGAGAAGGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCACCAGCCCCAAGCTGAGCATCTACAGCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCGCCAGGTTCAGCGGCAGGGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGGGTGGCCGCCGAGGACGCCGCCACCTACTACTGCCAGCAGAGGAGCAACTACCCCCCCTGGACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGACCACCACCCCCGCCCCCAGGCCCCCCACCCCCGCCCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGGCCCGAGGCCTGCAGGCCCGCCGCCGGCGGCGCCGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGACATCTACATCGAGGTGATGTACCCCCCCCCCTACCTGGACAACGAGAAGAGCAACGGCACCATCATCCACGTGAAGGGCAAGCACCTGTGCCCCAGCCCCCTGTTCCCCGGCCCCAGCAAGCCCTTCTGGGTGCTGGTGGTGGTGGGCGGCGTGCTGGCCTGCTACAGCCTGCTGGTGACCGTGGCCTTCATCATCTTCTGGGTGAGGAGCAAGAGGAGCAGGCTGCTGCACAGCGACTACATGAACATGACCCCCAGGAGGCCCGGCCCCACCAGGAAGCACTACCAGCCCTACGCCCCCCCCAGGGACTTCGCCGCCTACAGGAGCAAGAGGGGCAGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGGCCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGGTTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTGAGGGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTGTACAACGAGCTGAACCTGGGCAGGAGGGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCCGAGATGGGCGGCAAGCCCAGGAGGAAGAACCCCCAGGAGGGCCTGTACAACGAGCTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGCCTGAGCACCGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCCAGG。

所述CD19-CAR的氨基酸序列(SEQ ID NO.12)为：

MALPVTALLLPLALLLHAARPMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKTLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAWRRKRKEKQSETSPKEFLTIYEDVKDLKTRRNHEQEQTFPGGGSTIYSMIQSQSSAPTSQEPAYTLYSLIQPSRKSGSRKRNHSPSFNSTIYEVIGKSQPKAQNPARLSRKELENFDVYSLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR(CD8信号肽的氨基酸序列为第1-21位，CD19 scFv的氨基酸序列为第22-288位，CD8铰链区的氨基酸序列为第289-335位，NKG2D跨膜区的氨基酸序列为第336-356位，2B4胞内共刺激域的氨基酸序列为第357-476位，DAP10胞内共刺激域的氨基酸序列为第477-500位，CD3ζ信号区的氨基酸序列为第501-612位。以上氨基酸位点区域均按顺数次序编排)。

所述CD19-CAR的编码基因序列(SEQ ID NO.13)为：

ATGGCCCTGCCTGTGACAGCCCTGTTGCTGCCTCTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCCCGGCCTATGCTGCTGCTGGTGACCAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCTCACCCTGCTTTTCTGCTGATCCCTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCAGCCTGTCTGCTTCTCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCAGAGCCTCCCAGGACATTTCTAAGACCCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCTGATGGCACCGTGAAACTGCTTATCTACCACACATCCAGGCTGCATAGCGGAGTCCCCAGCCGGTTCAGCGGCTCTGGCTCAGGCACAGACTACAGCCTCACGATTAGCAACCTGGAACAGGAGGACATCGCCACATACTTCTGCCAGCAGGGCAACACCCTGCCCTACACATTCGGCGGAGGTACAAAGCTGGAGATCACAGGCAGCACAAGCGGATCCGGCAAGCCCGGCTCCGGCGAAGGCTCCACAAAGGGAGAAGTGAAGCTGCAGGAGAGCGGCCCCGGCCTCGTGGCCCCTTCTCAGAGCCTCAGCGTGACCTGTACCGTGTCTGGAGTCAGCCTGCCCGATTACGGCGTGTCCTGGATCCGGCAGCCACCTAGAAAAGGCCTGGAATGGCTGGGCGTTATCTGGGGAAGCGAAACCACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGAGCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCAAAGTCCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCAGACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGAGCAGCACCACCACACCTGCTCCAAGACCCCCTACCCCTGCCCCTACAATCGCCAGCCAACCTCTGAGCCTGAGACCAGAAGCCTGTAGACCCGCTGCTGGCGGAGCCGTGCACACCAGAGGCCTGGATTTCGCCTGCGACATCTACCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCGGTGGCCATGGGCATCAGATTTATCATCATGGTCGCCTGGCGGAGAAAACGGAAGGAAAAGCAGAGCGAGACATCACCTAAGGAGTTCCTGACCATCTACGAGGACGTGAAGGACCTGAAAACCCGGAGAAATCACGAGCAGGAGCAAACTTTTCCTGGCGGAGGCTCTACAATCTACAGCATGATACAATCTCAATCTAGCGCCCCAACATCCCAGGAGCCTGCATATACCCTTTATAGCCTGATCCAGCCCAGCAGGAAAAGCGGCTCTAGAAAGCGGAACCACAGCCCTAGCTTCAACAGCACCATCTACGAGGTGATCGGAAAGAGTCAGCCCAAGGCCCAAAACCCCGCCAGACTGTCTAGAAAAGAACTGGAAAACTTCGACGTGTACAGCCTGTGTGCCAGACCTCGGCGGAGCCCGGCCCAGGAGGATGGCAAGGTGTACATCAACATGCCTGGCAGAGGAAGAGTGAAGTTCAGCCGTAGCGCTGATGCCCCTGCTTATCAACAGGGCCAGAACCAGCTGTACAATGAGCTGAATCTGGGCCGCCGCGAGGAATACGATGTGCTGGATAAGAGGAGAGGCCGGGACCCCGAAATGGGCGGAAAGCCCAGAAGAAAGAACCCTCAGGAGGGCCTGTATAATGAGCTGCAGAAAGATAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGACGGCGGGGCAAGGGCCACGACGGCCTGTACCAGGGACTGAGCACCGCCACCAAAGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCTCCAAGA。

本实施例以NK-92MI细胞系为载体构建NK细胞系。由于转染NK细胞比较困难并且效率低下，本实施例利用CAR分子慢病毒转染NK-92MI细胞来提升转染效率，并利用流式细胞仪分选富集成功转染的CAR-NK细胞。具体构建方法如下：

一、CLDN6-CAR慢病毒表达载体的构建

如图1所示，本实施例构建了靶向CLDN6的两种不同结构域的第三代CAR分子慢病毒载体用于本实验(CLDN6-CAR1、CLDN6-CAR2)，并构建靶向CD19的CAR分子结构作为实验中的对照(CD19-CAR)。

所述CLDN6-CAR1、CLDN6-CAR2和CD19-CAR载体的构建过程均委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成，首先合成出所需的CAR分子基因序列，将合成的基因序列克隆到pUC57载体上，并进行测序鉴定与保存；之后通过PmeI和SpeI克隆位点将CAR分子克隆到慢病毒载体pWPXLd-2A-GFP中，得到重组慢病毒表达载体，并通过测序验证每个克隆的CAR序列。其中，GFP用于检测慢病毒包装及转染NK-92MI细胞CAR分子表达阳性率的标记。

本实施例中的慢病毒表达载体pWPXLd-2A-GFP、包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G均从南京金斯瑞生物科技由限公司获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

二、慢病毒的包装

CAR分子载体构建成功后，本实施例采用HEK-293T包装慢病毒，并检测慢病毒滴度。将步骤一中制备得到的重组慢病毒载体CLDN6-CAR1、CLDN6-CAR2和对照慢病毒载体CD19-CAR(统称pWPXLd-CAR-2A-GFP)，按照以下方法分别进行包装：

1、包装细胞的培养：将293T细胞接种到10cm细胞培养皿，待细胞密度长到约80-90％，去掉培养基，之后加入含1％FBS的DMEM培养基7mL，处理约2h。

2、包装细胞的感染：(1)A液配制：将9μg含各目的基因的质粒pWPXLd-CAR-2A-GFP、12μg包装质粒pSPAX2和3μg包膜质粒pMD2.G，在无菌EP管中溶入500μL的Opti-MEM培养基(Gibco)内，充分混匀；(2)B液配制：将PEI(聚乙烯亚胺，Sigma-Aldrich)按总质粒量的三倍(即72μg)溶于500μL的Opti-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5min；(3)转染复合物形成：将A溶液与B溶液充分混匀，在室温下孵育20min；将PEI质粒混合液1mL逐滴轻缓加入293T细胞中，混匀，培养6-10h；(4)换液：去除含PEI质粒混合液的培养基，加入10mL新鲜的含1％FBS的DMEM培养基，继续培养；(5)在转染次日于荧光显微镜下观察转染效率(即呈绿色荧光的细胞比例)。

3、病毒的收获：使用0.22μm滤膜过滤器收集病毒，24h收一次，共收集3次，可直接感染目的细胞或分装冻存于-80℃，以待病毒滴定NK-92MI细胞。

4、慢病毒滴度测定：(1)第一天，以1×10⁵/mL的浓度将293T细胞铺于96孔培养板，100μL/well；(2)第二天，每孔吸去50μL培养基，补加50μL/well新鲜培养基，并往每孔添加终浓度为6μg/mL的Polybrene(Sigma-Aldrich)，培养箱孵育30min后加10μL/well的病毒原液，并按5倍稀释4个梯度，培养箱继续培养；(3)第四天，感染48h后，荧光显微镜观察感染细胞荧光情况，流式检测eGFP，以阳性率为5～20％的细胞数为宜，根据GFP阳性率可估算病毒上清液的滴度，即1mL体积内含有病毒颗粒数目，计算滴度(TU/mL)＝阳性率×稀释倍数×100×10⁴。

本实施例检测慢病毒滴度如下表所示：

三、慢病毒转染NK-92MI细胞

1、NK-92MI的培养：选择生长状态最佳的NK-92MI细胞，必要时提前更换新鲜培养基，并进行细胞计数。

2、计算病毒加样量：(细胞数×MOI值/病毒滴度)×10³＝病毒加样量(μL)，根据预实验的结论，设置MOI梯度为20、30、50进行感染。

3、病毒感染：培养瓶内将NK-92MI轻轻重悬，吹散聚团细胞，然后将计算好的各目的基因病毒用移液枪缓慢注入NK-92MI培养基内，向培养基内加入Polybrene并使其终浓度为8μg/mL，轻轻晃动混匀，培养箱培养。

4、换液：感染8-12h后观察细胞状态，更换新鲜培养基。

5、第五天：感染72h后，荧光显微镜下观察细胞荧光，判断感染情况以及用流式检测GFP阳性率以确定转染效率，以备为流式分选做参考。

6、流式分选(Sorting)慢病毒转染NK-92MI细胞

(1)准备细胞：根据慢病毒感染的NK-92MI细胞的转染效率，进行大量细胞扩增，以最终分选出50-100万个GFP阳性细胞能够存活为准。

(2)制备分选细胞样品：将未转染NK-92MI细胞及感染的NK-92MI细胞收集至15mL离心管，于离心机800rpm，离心2min，PBS洗涤1次，用含有2％FBS的PBS重悬沉淀细胞，在40μm滤网内过滤，并预先准备含有3mL NK细胞培养基的15mL无菌离心管用以收集样品，等待上机；

(3)上机分选：首次分选选用富集模式，以保证细胞存活率，先上机未感染NK-92MI细胞进行流式分析，圈门，设定好分选区域即GFP阳性细胞群，然后上机感染的NK-92MI细胞样品，分选接收器内放置接收样品的15mL离心管，进行分选。

(4)收集样品：根据收集细胞数量决定是否停止分选(一般50-100万个细胞即可停止分选)。停止分选后收集样品，离心，用适量的NK专用培养基轻柔重悬沉淀细胞，移至培养瓶，放置培养箱培养。

(5)次日观察细胞生长状态；培养3-5天流式分析检测GFP的阳性率，确定分选效果，决定下步分选，最终保证GFP阳性率为99％。

CAR-NK细胞流式分选结果如图2所示：CAR分子慢病毒转染NK-92MI细胞后，流式检测eGFP转染率为CD19-CAR(6.28％)、CLDN6-CAR1(4.10％)、CLDN6-CAR2(5.43％)；接着，利用CAR分子携带的eGFP作为流式分选的标记物进行流式分选，初次分选后阳性率为CD19-CAR(17.5％)、CLDN6-CAR1(20.1％)、CLDN6-CAR2(18.2％)，所获的阳性细胞明显较前增多；经过3次纯化分选，最终eGFP表达阳性率在99.5％以上。由于eGFP与CAR共表达，检测eGFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞，因此确定CAR-NK构建成功。

实施例2 CAR-NK细胞体外肿瘤杀伤功能的评估

本实施例采用荧光素酶法检测不同结构域CAR-NK细胞对卵巢癌细胞的体外杀伤活性，采用ELISA方法评估CAR-NK细胞在体外的细胞因子分泌能力。

一、卵巢癌双阳性(Luciferase⁺,GFP⁺，即GL⁺)细胞系的构建

为了使用荧光素酶法检测体外杀伤实验的效果，本实施例利用慢病毒构建双阳性(Luciferase⁺,GFP⁺)卵巢癌GL⁺细胞系用于后续杀伤实验。荧光素酶是靠酶和底物荧光素的相互反应发光，特异性很强，灵敏度高。只有活细胞荧光素酶才具有活性和氧化荧光素，荧光强度大致可以反映活细胞的比例，因此可计算细胞实验的杀伤比例；GFP用作筛选表达荧光素酶基因的标志物。双阳性卵巢癌GL⁺细胞系与对照细胞系的构建方法参考实施例1，本实施例采用的表达荧光素酶慢病毒载体LV5-LUC-GFP-Puro购于上海市吉玛制药有限公司。本实施例构建了4株卵巢癌双阳性GL细胞系(SK-OV-3GL、OVCAR-3GL、A2780GL、HeyGL)和1株前列腺癌双阳性GL对照细胞系(PC-3GL)。

二、荧光素酶法检测CAR-NK细胞的体外杀伤活性

CAR-NK细胞效应功能主要表现为对表达特异性靶抗原肿瘤的杀伤裂解能力。为了评估不同结构域靶向CLDN6的CAR-NK细胞在卵巢癌细胞系中的杀伤活性，本实施例分为四组，即NK-92MI组、CD19-CAR NK组、CLDN6-CAR1 NK组、CLDN6-CAR2 NK组，然后按分组分别与靶细胞按不同效靶比(Effector:Target)进行共培养检测其杀伤能力。其中，以表达或不表达CLDN6抗原的人源性细胞SK-OV-3GL、OVCAR-3GL、A2780GL、HeyGL、PC-3GL作为靶细胞，采用不同效靶比(1:2、1:1、2:1、4:1)进行杀伤实验。具体实验方法如下：

(1)靶细胞(双阳GL⁺细胞)按1×10⁴个/孔的密度接种于96孔板中。

(2)吸取状态良好的CLDN6-CAR1 NK、CLDN6-CAR2 NK、CD19-CAR NK及NK-92MI细胞为效应细胞，800rpm离心2min，去上清，重悬计数，保证细胞终浓度约为8×10⁵/mL，按相应的效应细胞分为四组。

(3)先将NK-92MI细胞按照2倍连续梯度稀释法稀释，做3个梯度。用300μL的排枪在96孔板内预先加入100μL新鲜培养基，其中，第一排不加，第一排直接加入浓度为8×10⁵/mL的效应细胞100μL，添加培养基后，往第二排也加入100μL效应细胞，然后用排枪斜贴壁轻轻吹打第二排培养基，并吸取100μL加入第三排，以此类推，将NK-92MI细胞根据预先设置好的效靶比(E:T)比例，进行2倍比稀释。使最终的效靶比分别为8:1，4:1，2:1，1:1，1:2。其余三组按上述操作方法依次加样。

(4)依次加完样后，将96孔板轻轻平放入无菌细胞培养箱中进行共培养8h。

(5)待培养结束后，收集孔内100μL上清用于细胞因子检测。

(6)往待检测96孔板中加入荧光素钠盐(上海翌圣生物)，每孔加入100μL浓度为150μg/mL的荧光素钠盐，反应5-10min后在多功能酶标仪中检测荧光值。

(7)杀伤效率计算：以不加NK细胞的靶细胞孔作为参照，荧光值降低的比例即为杀伤百分比(Cytotoxicity(％))，公式为：杀伤百分比＝(对照孔荧光值－目的孔荧光值)÷对照孔荧光值×100％。

结果如图3所示，NK-92MI与靶向CD19的CAR-NK细胞对靶细胞几乎没有杀伤能力，与之相比，不同结构域靶向CLDN6的CAR-NK对CLDN6阳性表达的SK-OV-3GL、OVCAR-3GL、A2780GL、HeyGL均有显著的杀伤效果，杀伤效果随着效靶比增大而上升，而对不表达CLDN6的PC-3GL细胞杀伤能力并不显著。自身活化元件构建的CAR1-NK在效靶比为1:1与2:1的情况下杀伤活性明显优越于经典结构构建的CAR2-NK，而随着效应细胞数量增多，二者杀伤活性差异不大，这说明杀死同样多的癌细胞，相比CAR2-NK而言，需要CAR1-NK细胞的数量就更少些。整体而言，CAR-NK对靶细胞HeyGL的杀伤效率略低于其他靶细胞，并且对效应细胞数量具有依赖性。以上结果表明本发明构建的靶向CLDN6的不同结构域的CAR-NK是成功的，并且对CLDN6阳性的卵巢癌细胞具有特异性杀伤能力，而且自身活化元件构建的CAR1-NK杀伤活性优于经典结构构建的CAR2-NK。

三、CAR-NK细胞体外细胞因子分泌能力的评估

CAR-NK细胞被特异性抗原激活后，分泌穿孔素(Perforin)、颗粒酶B(GranzymeB)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等细胞因子的能力增强，以杀伤肿瘤细胞。细胞因子分泌能力是评估NK细胞效应功能的重要指标。为评估CAR-NK细胞分泌细胞因子的能力，本实施例在体外将CAR-NK与靶细胞共培养，收集细胞培养上清，并通过ELISA检测了五种细胞因子的表达水平。具体方法如下：

(1)准备GFP⁺,Luciferase⁺(GL⁺)双阳性靶细胞，按1×10⁴个/孔的细胞量接种于96孔板中；收集效应NK细胞(对照为NK-92MI)，使其终浓度约为1×10⁵/mL，按100μL/孔的量进行添加，设置效应细胞：靶细胞的效靶比1:1，即CAR-NK细胞的绝对数与靶细胞的绝对数相同均为1×10⁴个，于96孔板中共培养24h。

(2)共培养结束，收集96孔板中的上清，立即进行ELISA检测；

(3)根据ELISA试剂盒(R&D Systems)的操作说明严格执行每步操作。

实验结果如图4所示，CLDN6-CAR NK细胞释放Perforin、Granzyme B、IFN-γ、TNF-α和GM-CSF等细胞因子的能力较NK-92MI与CD19-CAR NK显著提升，具有显著的统计学差异(P＜0.05)，NK-92MI与CD19-CAR NK无统计学意义(P＞0.05)。不表达CLDN6的PC-3与CAR-NK共培养分泌细胞因子能力非常有限并且无统计学意义(P＞0.05)。整体而言，自身活化元件构建的CAR1-NK分泌细胞因子的能力优于经典结构构建的CAR2-NK，但与A2780共培养分泌的IFN-γ、GM-CSF和Perforin以及与Hey共培养分泌的Granzyme B、TNF-α和Perforin水平无明显统计学意义。这些结果说明CLDN6-CAR1 NK细胞分泌细胞因子的能力明显提升，侧面证明了其特异性杀伤能力更强，与体外细胞杀伤实验结果一致。

实施例3肿瘤移植模型检测CAR-NK细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用

本实施例采用人源卵巢癌细胞系构建皮下瘤与腹腔转移瘤两种卵巢癌模型，以此验证靶向CLDN6的CAR-NK细胞在小鼠体内杀伤CLDN6阳性的卵巢癌细胞的效果，并优化所述CAR-NK细胞在卵巢癌治疗的给药方式。本实施例所采用的靶向CLDN6的CAR-NK细胞是根据实施例2体外细胞杀伤实验的结果，采用杀伤效果最好的CLDN6-CAR1 NK细胞进行的(以CD19-CAR NK为对照)，该细胞是由自身活化元件构建的CAR分子结构域，具有良好的活化NK细胞与信号转导作用。

本实施例所用实验动物为4-5周龄的雌性NSG小鼠(NOD-Prkdc^scid IL2rg^null)，购于北京百奥赛图公司(Biocytogen)。该小鼠为三系敲除品种，是目前国际公认的免疫缺陷程度最高、最适合人源细胞移植的工具小鼠，无成熟T细胞、B细胞和功能性NK细胞等，因此不会对CAR-NK细胞造成干扰，适用于CAR-NK的体内研究。所有小鼠均饲养在无特定病原体(SPF)的环境中，温度、湿度、光照适宜。

本实施例所用实验试剂、耗材与仪器如下：4％多聚甲醛固定液(南京诺唯赞)、小动物活体成像系统(美国PerkinElmer，IVIS)，其他实验试剂、耗材与仪器如上述实施例所述。

一、CLDN6-CAR NK细胞对卵巢癌皮下瘤模型的抗肿瘤活性评估

1、小鼠卵巢癌皮下瘤模型构建、CAR-NK治疗方法及肿瘤生物学检测

本实施例用SK-OV-3卵巢癌细胞构建了皮下瘤，实验方法(图5A)如下：

(1)根据实验计划培养一定数量的卵巢癌SK-OV-3GL细胞，用胰酶消化SK-OV-3GL细胞，PBS洗涤，离心，计数，用PBS调整肿瘤细胞悬液浓度至1×10⁷/mL，混匀分装在EP管中，并置于冰上；

(2)对NSG小鼠左侧腹股沟皮下皮肤进行消毒，将肿瘤细胞悬液混匀，用1mL注射器对每只小鼠皮下注射(s.c.injection)SK-OV-3GL细胞100μL，固定好小鼠，用注射器针头轻轻挑起皮肤，缓慢推注可见局部皮肤隆起透亮的小皮球，构建皮下瘤模型；

(3)待皮下瘤大小约100mm³后，将小鼠随机分成3组：Mock组、CD19-CAR NK治疗组、CLDN6-CAR NK治疗组，每组5只小鼠。根据相应的治疗分组分别进行尾静脉输注(i.v.injection)细胞治疗，每只小鼠5×10⁶个NK细胞(CD19-CAR NK、CLDN6-CAR NK)以及等体积PBS，输注1次，无菌，操作轻柔；

(4)每3-4天定期检测小鼠的体重(Body weight)及肿瘤体积变化情况。肿瘤体积(Tumor volume)计算公式为：肿瘤体积V(mm³)＝a×b²/2，a为肿瘤长径，b为肿瘤短径；

(5)输注2周后取小鼠外周血，检测外周血CAR-NK细胞的比例；

(6)实验结束后安乐处死小鼠，解剖小鼠，取肿瘤组织用作H&E染色与免疫组化。

实验结果如图5所示，与Mock组和CD19-CAR NK治疗组相比，CLDN6-CAR NK治疗组的肿瘤生长明显得到了一定程度上的抑制，CLDN6-CAR NK治疗组的肿瘤重量较低，也没有观察到接受CAR-NK细胞治疗的小鼠体重下降，表明体内毒性是可以耐受的。这些结果表明，CLDN6-CAR NK细胞在皮下模型中杀伤卵巢癌细胞具有很大的潜力，具有良好的安全性。

2、比较经瘤周与静脉注射CAR-NK细胞治疗卵巢癌皮下瘤的疗效

鉴于前面实验尾静脉注射CAR-NK对卵巢癌皮下瘤具有一定程度上的抑制作用，而且无明显的瘤外毒性作用，但治疗效果上仍有待提高，因此本研究将进一步探讨不同的细胞给予方式与次数来对提高CAR-NK细胞在体内的持久性与瘤内浸润的影响，从而增强其抗肿瘤效果，同时避免副作用。首先，构建了OVCAR-3GL皮下瘤，第10天活体成像提示皮下瘤构建模型成功，用靶向CD19的CAR-NK或靶向CLDN6的CAR NK细胞通过不同的给药方式治疗小鼠，包括静脉注射(Intravenous,i.v)或瘤周注射(Peritumoral,p.t)。将小鼠分为5组：空白组，CD19-CAR i.v组，CD19-CAR p.t组，CLDN6-CAR i.v组和CLDN6-CAR p.t组。CLDN6-CAR组每只小鼠注射5×10⁶个CLDN6-CAR NK细胞，CD19-CAR组小鼠注射相同数量的CD19-CARNK细胞，于第17天以同样的注射细胞方式与数量进行第二次治疗(图6A)。

实验结果如图6所示，活体成像结果显示：瘤周注射和静脉注射CLDN6-CAR NK细胞均可显著的抑制肿瘤生长，并可诱导卵巢癌皮下瘤消退，但瘤周注射CLDN6-CAR NK细胞的抗肿瘤效果更好(图6B)；据测量的ROI结果显示，瘤周注射组的荧光值低于尾静脉注射组(图6C)；而空白组与CD19-CAR组中的肿瘤继续进展(图6B-C)。剥离肿瘤检测到瘤内CAR-NK细胞的存在，并且瘤周注射组比例高于尾静脉注射及CD19-CAR组(图6D)。此外，在外周血(PB)及脾脏内也检测到CAR-NK细胞的存在，CLDN6-CAR NK细胞比例高于CD19-CAR NK细胞(图6E-F)。以上数据表明，多次注射靶向CLDN6的CAR-NK细胞可诱导增强抗肿瘤活性，并且改变注射细胞途径，经瘤周给药的治疗效果更佳。

二、CLDN6-CAR NK细胞对卵巢癌腹腔转移瘤的抗肿瘤活性评估

卵巢癌的转移方式主要为局部扩散转移及腹腔种植，而腹腔给药又是卵巢癌等局限于腹腔肿瘤的主要给药途径，而增加药物与游离癌细胞接触的概率，可以最大限度的杀伤肿瘤细胞，减轻全身静脉给药引起的毒性反应。因此，本研究构建了卵巢癌腹腔转移瘤，待腹腔瘤构建成功后，随机分成三组，即空白组、CD19-CAR NK组及CLDN6-CAR NK组。其中，CLDN6-CAR NK组每只小鼠经腹腔注射5×10⁶个靶向CLDN6的CAR-NK细胞进行治疗，而CD19-CAR NK组每只小鼠经腹腔注射5×10⁶个靶向CD19的CAR-NK细胞进行治疗，间隔1周重复1次治疗；空白组注射等体积PBS(图7A)。

实验结果如图7所示：CLDN6-CAR NK细胞能够诱导SK-OV-3GL细胞显著消退，而空白组与CD19-CAR NK组中的肿瘤继续进展(图7B-C)；经CLDN6-CAR NK细胞处理的小鼠大多数存活时间得到了延长，空白组与CD19-CAR NK组中的小鼠中位生存期只有42和45天，与CLDN6-CAR NK组相比生存期明显缩短(图7D)。在外周血(PB)中检测到CLDN6-CAR NK细胞的存在，表明CAR-NK细胞在体内进行了增殖，具有扩增能力(图7E)。这些结果表明经腹腔注射CLDN6-CAR NK细胞治疗卵巢癌腹腔转移瘤具有良好的抗肿瘤效果。

综上所述，本发明制备的靶向CLDN6的CAR-NK细胞对CLDN6阳性的卵巢癌具有良好的体内抗肿瘤活性，可通过反复给药、局部注射(瘤周或腹腔)的治疗策略，尽早促使CAR-NK细胞与肿瘤细胞接触，以提高瘤内CAR-NK浸润的数量与抗肿瘤的持久性，同时可以降低副作用，具有一定的安全保证。

实施例4 CAR-NK细胞与免疫检查点抑制剂联合使用的抗肿瘤作用

鉴于肿瘤的复杂性和多样性，以及实体瘤局部的免疫抑制等因素，以CAR-NK细胞免疫治疗为中心，联合其它抗肿瘤策略可能会达到更好的治疗效果。因此本部分旨在探讨PD-L1免疫检查点的阻断是否可能解除卵巢癌免疫抑制的微环境，从而提高CAR-NK的瘤内活性并增强CAR-NK治疗效果。本研究所采用的靶细胞Hey为实施例2中构建的双阳性(Luciferase⁺,GFP⁺)卵巢癌GL⁺细胞系；所用实验动物为4-5周龄的雌性NSG小鼠(购于北京百奥赛图公司)；度伐利尤单抗(anti-PD-L1，PD-L1抑制剂，Durvalumab，英飞凡IMFINZI)。

1、PD-L1抑制剂联合CLDN6-CAR NK细胞对PD-L1+卵巢癌皮下瘤的疗效评估

小鼠卵巢癌皮下瘤建模成功后，随机分4组：Untreated组、anti-PD-L1治疗组、CLDN6-CAR NK治疗组和CLDN6-CAR NK+anti-PD-L1治疗组，按实验流程图(图9A)分别于瘤周多点注射CAR-NK细胞及anti-PD-L1进行治疗。CLDN6-CAR NK治疗组，经过瘤周注射5×10⁶个CLDN6-CAR NK，共注射2次，间隔7天；CLDN6-CAR NK+anti-PD-L1治疗组，经过瘤周注射5×10⁶个CLDN6-CAR NK细胞，共注射2次，间隔7天，同时瘤周给予10mg/kg的PD-L1抑制剂，共给予3次，每周1次；anti-PD-L1组，予以瘤周注射10mg/kg的PD-L1抑制剂。

实验结果如图8所示：与不添加anti-PD-L1组相比，添加anti-PD-L1的CLDN6-CARNK组的肿瘤体积显著缩小，而未治疗组与anti-PD-L1组肿瘤继续进展；PD-L1的表达带来了更高的肿瘤负担，肿瘤质地更硬；瘤内、外周血(PB)及脾脏内也可检测到CAR-NK细胞的存在。这些结果表明PD-L1抑制剂可以增强CLDN6-CAR NK细胞治疗PD-L1⁺卵巢癌皮下瘤的疗效。

2、PD-L1抑制剂联合CLDN6-CAR NK细胞对PD-L1⁺卵巢癌腹腔瘤的疗效评估

卵巢癌腹腔瘤是卵巢癌通过局部扩散转移及腹腔种植形成的常见转移瘤，因此本研究构建另一种PD-L1⁺卵巢癌腹腔瘤模型进一步验证PD-L1抑制剂与CAR-NK的联合效果。建模成功后，随机分成4组：Untreated组、anti-PD-L1治疗组、CLDN6-CAR NK治疗组和CLDN6-CAR NK+anti-PD-L1治疗组，经腹腔注射CAR-NK细胞及anti-PD-L1进行治疗。Untreated组，为空白对照；anti-PD-L1组，经腹腔注射PD-L1抑制剂(10mg/kg)，共3次，每周1次；CLDN6-CAR NK治疗组，经过腹腔注射5×10⁶个CLDN6-CAR NK，共注射2次，间隔7天；CLDN6-CAR NK+anti-PD-L1治疗组，经腹腔注射5×10⁶个CLDN6-CAR NK，共注射2次，间隔7天，同时腹腔给予10mg/kg的PD-L1抑制剂，共给予3次，每周1次；anti-PD-L1组予以腹腔注射PD-L1抑制剂。

实验结果如图9所示：与不添加anti-PD-L1组相比，添加anti-PD-L1的CAR-NK组的肿瘤体积显著缩小，荧光信号值降低，而Untreated组与anti-PD-L1组肿瘤继续进展，说明PD-L1抑制剂与CAR-NK联合具有协同作用；anti-PD-L1与CAR-NK细胞联合处理的小鼠大多数生存时间得到了延长，而Untreated组与anti-PD-L1组生存期明显缩短。外周血(PB)也可检测到CAR-NK细胞的存在，并且anti-PD-L1+CAR-NK组中的比例高于CAR-NK组，说明PD-L1抑制剂延长了CAR-NK体内的存活时间。这些实验结果表明在PD-L1⁺卵巢癌腹腔瘤模型中，PD-L1抑制剂同样可以增强靶向CLDN6-CAR NK的抗肿瘤效果。

综上所述，PD1/PD-L1免疫检查点抑制剂可延长CAR-NK细胞对体外卵巢癌细胞杀伤活性的持久性，靶向CLDN6的CAR-NK细胞和PD-L1抑制剂的联合应用改善了CAR-NK细胞的功能，延长了小鼠的生存时间，说明将抗PD-L1治疗与其他NK细胞疗法相结合可提高其疗效并充分释放NK细胞的杀伤潜能。

以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括CD8信号肽、特异性识别CLDN6的单链抗体CLDN6 scFv、CD8铰链区、NKG2D跨膜区、2B4胞内共刺激域、DAP10胞内共刺激域以及CD3ζ信号区；所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CLDN6 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述NKG2D跨膜区的氨基酸序列如SEQID NO.6所示，所述2B4胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述DAP10胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的嵌合抗原受体。

3.一种慢病毒载体，其特征在于，所述慢病毒载体包括权利要求2所述的编码基因。

4.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求3所述的慢病毒载体和辅助质粒的哺乳细胞。

5.一种CAR-NK细胞，其特征在于，所述CAR-NK细胞能表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的嵌合抗原受体，和/或权利要求2所述的编码基因，和/或权利要求3所述的慢病毒载体，和/或权利要求4所述的重组慢病毒，和/或权利要求5所述的CAR-NK细胞。

7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括A组分和B组分，所述A组分为权利要求1所述的嵌合抗原受体，和/或权利要求2所述的编码基因，和/或权利要求3所述的慢病毒载体，和/或权利要求4所述的重组慢病毒，和/或权利要求5所述的CAR-NK细胞中的至少一种，所述B组分为PD-L1抑制剂。

8.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的慢病毒载体、权利要求4所述的重组慢病毒、权利要求5所述的CAR-NK细胞、权利要求6-7所述的药物组合物在制备抗癌药物中的应用。

9.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3所述的慢病毒载体、权利要求4所述的重组慢病毒、权利要求5所述的CAR-NK细胞、权利要求6-7所述的药物组合物在制备抑制肿瘤细胞增殖的药物中的应用。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为CLDN6表达阳性的肿瘤。

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