CN107446937A - 嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 - Google Patents
嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的t细胞及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。该嵌合抗原受体表达基因包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因。第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白‑2表达基因。第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白‑1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。这种创新设计的嵌合抗原受体表达基因能够成功导入T细胞中形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，在特定的蓝光条件和特定抗原条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是人工构建的融合基因编码的跨膜分子。一般包括胞外抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域组成。CAR-T，即嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞。CAR-T细胞应用于癌症治疗，显示了极佳疗效和巨大的潜力。如诺华于2015年12月5日在ASH会议上公布了其靶向CD19分子的CAR-T(CTL019)在治疗难治、复发急性淋巴性白血病(ALL)方面的2期临床数据，2期数据与2014年公布的1期数据相似，完全缓解率(CR)分布高达93％(55/59)和92％(36/39)。
传统的CARs主要可以分为三代，如图1，第一代CARs通常使用一条信号链，称为“信号1”(signal 1)。第一代CAR-T细胞在临床试验中表现出了有限的功效，这可能是由于移植T细胞激活诱导的细胞死亡(activation-induced cell death，AICD)，或者缺乏长期的T细胞扩增。第二代CARs利用第一代CARs作为一种支柱，增加了一个额外的共刺激信号域，称为“信号2”；因此，相同的受体需传递“信号1”和“信号2”以优化T细胞的激活。第二代CAR-T与第一代CAR-T相比，回输到非霍奇金淋巴瘤患者中的持久性和扩增性增强了。但是究竟哪一种是最佳的第二信号还有待确定。另一个需要解决的问题是，当比较不同的CAR-T细胞设计时，是否持久性和/或扩增性的阈值对产生有效临床结果是必须的。第三代CARs的信号域包两个共刺激域，临床前研究表明，第三代CAR-T细胞比第二代CAR-T细胞具有更强的抗肿瘤效力。
然而，CAR-T细胞应用于癌症治疗，在显示出疗效的同时，伴随有毒性和风险，甚至导致病人死亡。2016年9月26日，Kite公布了KTE-C19的II期临床数据的中期分析结果。治疗的完全缓解率达到了47％。然而，此次参与试验的62名患者中，有1/3患者产生了严重的神经毒性，18％的患者受到了细胞因子释放综合征的影响，2人死于KTE-C19相关的不良反应。
其中，细胞因子释放综合症(cytokines release syndrome，CRS)是最显著的毒性，为头号安全风险。细胞因子释放综合症是基于T细胞的激活，是T细胞激活活性的一个反应，所以副作用是与CAR-T的治疗机制正相关的临床反应。高度增殖的T细胞能引起CRS，表现为高热和肌痛，不稳定的低血压和呼吸衰竭。这是一个意想不到的结果，因为在临床前动物模型中没有出现类似症状。从CRS观察中发现一个关键的点，除了预期的效应细胞因子INF-γ外，IL-6在CART治疗的细胞指数级增殖期间也会迅速提升。CRS可能直接与另一个毒性相关联，即巨噬细胞活化综合征。
除了CRS，还存在由工程改造的T细胞的抗原特异性导致的“靶向”毒性。例如溶瘤综合征，它直接是由肿瘤细胞的裂解而导致的。当CARs靶向于B细胞表面表达的靶点如CD19时，会引起B细胞发育不良，这就是一个“靶向”毒性，但却错误的攻击了正常组织细胞的结果。只要CD19CAR-T细胞长时间存在，B细胞发育不良的情况就不会改善。B细胞发育不良与CD20特异性单抗治疗一样会造成严重的低丙种球蛋白血症，需要静脉注射免疫球蛋白。最近报告了输注改造的T细胞引发致命毒性的2个案例，有一例患者接受了HER2-CAR治疗，两例患者接受了靶向MAGE-A3的TCR-T细胞治疗。在这2个案例中，均是因为正常组织表达这些靶点，导致急性不可逆的心肺毒性。所有的靶向毒性均是由于改造的T细胞无法区别表达靶向抗原的正常细胞和肿瘤细胞所致。
CAR-T治疗白血病会引起神经系统症状，具有神经毒性。几个研究小组报道，这些症状具有多样性但可自行消退，如谵妄、语言障碍、运动障碍、缄默症和癫痫发作。虽然与全身CRS的发生有些时间上的关联，当然也与CAR-T存在于脑脊液中相关。这些症状的机制与靶组织仍有待确认。
另外，CAR-T细胞应用于癌症治疗还有潜在的风险，如输注活化的T细胞存在引起自身免疫性疾病的风险，输注同种异体T细胞存在抗宿主移植病的潜在风险。这可能会引起曾接受同种异体造血干细胞移植的患者的担心。
综上，传统的嵌合抗原受体存在治疗副作用多、特异性差等问题。
发明内容
基于此，有必要提供一种治疗副作用少、特异性高的嵌合抗原受体及其表达基因和应用。
此外，还有必要提供一种光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用。
一种嵌合抗原受体表达基因，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因；
所述第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因；
所述第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。
在一个实施方式中，还包括连接肽表达基因，所述连接肽表达基因一端与所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因连接，所述连接肽表达基因的另一端与所述第二跨膜蛋白表达基因连接。
在一个实施方式中，所述抗原结合区域表达基因用于表达抗原结合区域，所述抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种；及/或，
所述铰链蛋白表达基因用于表达铰链蛋白，所述铰链蛋白包括CD8α；及/或，
所述第一跨膜蛋白表达基因用于表达第一跨膜蛋白，所述第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28TM-CD28-4-1BB区域；及/或，
所述第二跨膜蛋白表达基因用于表达第二跨膜蛋白，所述第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，
所述胞内信号传导蛋白表达基因用于表达胞内信号传导蛋白，所述胞内信号传导蛋白包括CD3ζ。
在一个实施方式中，所述抗原结合区域表达基因包括：(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述铰链蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述第一跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因包括：(a)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述第二跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因包括：(a)、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ IDNo.6所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述胞内信号传导蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
一种表达载体，所述表达载体中含有上述任一项所述的嵌合抗原受体表达基因。
一种嵌合抗原受体，包括第一融合蛋白和第二融合蛋白；
所述第一融合蛋白包括依次连接的抗原结合区域、铰链蛋白、第一跨膜蛋白和拟南芥隐花色素蛋白-2；
所述第二融合蛋白包括依次连接的第二跨膜蛋白、碱性螺旋环螺旋蛋白-1和胞内信号传导蛋白。
在一个实施方式中，所述抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种；及/或，
所述铰链蛋白包括CD8α；及/或，
所述第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，
所述第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，
所述胞内信号传导蛋白包括CD3ζ。
在一个实施方式中，所述抗原结合区域包括：(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽，或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述铰链蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述第一跨膜蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述拟南芥隐花色素蛋白-2包括：(a)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述第二跨膜蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述碱性螺旋环螺旋蛋白-1包括：(a)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述胞内信号传导蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
一种光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞，所述T细胞中导入了如上述任一项所述的嵌合抗原受体表达基因，或者所述T细胞中转染了上述的表达载体，或者所述T细胞能够表达上述的嵌合抗原受体。
上述任一项所述嵌合抗原受体表达基因、上述表达载体、上述任一项所述的嵌合抗原受体或上述的光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤的药物或抗病毒感染的药物中的应用。
上述嵌合抗原受体表达基因包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因。第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因。第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。这种创新设计的嵌合抗原受体表达基因能够成功导入T细胞中形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，用于癌症或病毒感染等的治疗。通过该嵌合抗原受体表达基因表达的嵌合抗原受体中，抗原结合区域能够与特定的抗原结合，从而将嵌合抗原受体特异性的靶向到相应的病灶位点。拟南芥隐花色素蛋白-2(cryptochromes，CRY2)是一种蓝光光敏蛋白，在遇到蓝光的条件下，拟南芥隐花色素蛋白-2(cryptochromes，CRY2)结构发生改变从而与碱性螺旋环螺旋蛋白1(cryptochrome-interacting basic-helix-loophelix 1，CIB1)结合，CRY2与CIB1发生相互作用，将CIB1改造成具有DNA结合功能的融合蛋白，同时将CRY2改造成具有转录激活结构域的融合蛋白，两者协同作用行使细胞的遗传指令—调控DNA转录成mRNA，翻译成目的蛋白。在没有蓝光的条件下或即使有蓝光但无特定抗原存在的条件下，该嵌合抗原受体不会发动免疫攻击，处于关闭状态。因此蓝光是T细胞中嵌合抗原受体行为的“开关”，在特定的蓝光条件和特定抗原条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。
附图说明
图1为一实施方式CARs结构示意图；
图2为一实施方式的光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞在蓝光条件下细胞内信号传导示意图；
图3为一实施方式的光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法的流程图；
图4为实施例1中pLV-IRES-Puro慢病毒表达载体酶切产物的电泳图；
图5为显微镜下观察实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞(JurkatCAR)的图片；
图6为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下的增殖结果对比图；
图7为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下的IFNγ分泌量结果对比图；
图8为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下杀伤靶细胞的流式散点结果比对图；
图9为实施例1中获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在不同条件下对靶细胞杀伤率的统计结果比对图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一种嵌合抗原受体表达基因，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因。第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因。第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。
该嵌合抗原受体表达基因能够表达嵌合抗原受体(CAR)，从而用于癌症或病毒感染等的治疗。
具体地，抗原结合区域表达基因用于表达抗原结合区域。嵌合抗原受体基因表达后，抗原结合区域一般位于细胞外从而与相应的抗原结合。抗原结合区域能够将嵌合抗原受体特异性的靶向到相应的病灶位点，提高特异性。抗原例如可以为肿瘤相关抗原也可以为其他疾病相关的抗原，抗原结合区域则为抗原对应的抗体。
具体地，抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种。
在一个实施方式中，抗原结合区域为表达间皮素抗体(anti-mesothelin)的区域。间皮素(mesothelin)在肿瘤细胞中表达量较高，而正常组织中表达量较低或几乎不表达，因此间皮素(mesothelin)能够作为治疗肿瘤的“理想抗原”。通过在嵌合抗原受体(CAR)中设计间皮素(mesothelin)结合区域，转染了该嵌合抗原受体(CAR)的T细胞能够特异性的靶向到肿瘤组织部位，提高特异性，减少对其他组织的伤害，有效减少肿瘤治疗的副作用。
进一步地，抗原结合区域表达基因包括：(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。该抗原结合区域表达基因能够顺利表达获得间皮素抗体(anti-mesothelin)。
具体地，铰链蛋白表达基因用于表达铰链蛋白，表达的铰链蛋白一端连接抗原结合区域另一端连接第一跨膜蛋白。在抗原结合区域和第一跨膜蛋白之间设置铰链蛋白有利于将抗原结合区域的识别信号传导进入细胞内，提高抗原结合区域识别抗原的能力。
在一个实施方式中，铰链蛋白包括CD8α。CD8α信号传导能力强，提高抗原结合区域识别抗原的能力。当然，在其他实施方式中，铰链蛋白还可以是其他的分子如CD8β等。
进一步地，铰链蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。该铰链蛋白表达基因能够顺利表达获得CD8α。
具体地，第一跨膜蛋白表达基因用于表达第一跨膜蛋白。嵌合抗原受体基因表达后，第一跨膜蛋白穿过细胞膜，第一跨膜蛋白对嵌合抗原受体(CAR)的表达起到重要的作用。
在一个实施方式中，第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28TM-CD28-4-1BB区域，其中CD28TM区域与铰链蛋白连接，4-1BB区域与拟南芥隐花色素蛋白-2连接。
进一步地，第一跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。该第一跨膜蛋白表达基因能够顺利表达获得CD28TM-CD28-4-1BB。
具体地，拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因用于表达拟南芥隐花色素蛋白-2(cryptochromes，CRY2)。拟南芥隐花色素蛋白-2是一种蓝光光敏蛋白，在遇到蓝光的条件下能够发生结构改变，从而起到分子开关的作用。
在一个实施方式中，使拟南芥隐花色素蛋白-2发生结构改变的蓝光的波长为470nm±20nm。
在一个实施方式中，拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因包括：(a)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施方式中，第一融合蛋白表达基因包括依次连接的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列。该核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽表达式为anti-mesothelin-CD8αhinge-CD28TM-CD28-4-1BB-CRY2。
具体地，第二跨膜蛋白表达基因用于表达第二跨膜蛋白。嵌合抗原受体基因表达后，第二融合蛋白中的第二跨膜蛋白穿过细胞膜，第二跨膜蛋白对嵌合抗原受体(CAR)的表达也起到重要的作用。
在一个实施方式中，第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域。
进一步的，第一跨膜蛋白与第二跨膜蛋白含有相同的分子。
进一步地，第二跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。该第二跨膜蛋白表达基因能够顺利表达获得CD28-4-1BB。
具体地，碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因用于表达碱性螺旋环螺旋蛋白-1(cryptochrome-interacting basic-helix-loophelix 1，CIB1)。CIB1能够与结构变形后的拟南芥隐花色素蛋白-2结合，行使细胞的遗传指令—调控DNA转录成mRNA，翻译成目的蛋白。
在一个实施方式中，碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因包括：(a)、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
具体地，胞内信号传导蛋白表达基因用于表达胞内信号传导蛋白。胞内信号传导蛋白能够向细胞内传递嵌合抗原受体(CAR)的信号，指导细胞内的信号传导，调控蛋白的合成表达。
在一个实施方式中，胞内信号传导蛋白为CD3ζ。CD3ζ分子量小，传导效率高。当然，在其他实施方式中胞内信号传导蛋白还可以为CD3α或CD3γ等。
进一步地，胞内信号传导蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQID No.7所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
在一个实施方式中，第二融合蛋白表达基因包括依次连接的SEQ ID No.5所示的核苷酸序列、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。该核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽表达式为CD28-4-1BB-CIB1-CD3ζ。
在一个实施方式中，该嵌合抗原受体表达基因中还包括连接肽表达基因，连接肽表达基因一端与拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因连接，连接肽表达基因的另一端与第二跨膜蛋白表达基因连接。
连接肽表达基因将第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因连接，使第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因能够在T细胞内同时表达，获得拟南芥隐花色素蛋白-2(cryptochromes，CRY2)与碱性螺旋环螺旋蛋白1(cryptochrome-interactingbasic-helix-loophelix 1，CIB1)结合的分子开关。
具体地，连接肽表达基因表达的连接肽为2A肽，2A肽在表达过程中能够“自我剪切”，在蛋白翻译时通过核糖体跳跃从自身最后2个氨基酸C末端断裂，从而使一个转录单元里两个蛋白(第一融合蛋白和第二融合蛋白)独立表达。
具体地，连接肽表达基因包括SEQ ID No.8所示的核苷酸序列。
在一个实施方式中，嵌合抗原受体表达基因包括依次连接的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列、SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列、SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
这种创新设计的嵌合抗原受体表达基因能够成功导入T细胞中形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，用于癌症或病毒感染等的治疗。
一种表达载体，该表达载体中含有上述嵌合抗原受体表达基因。
具体地，表达载体例如可以为插入了上述嵌合抗原受体表达基因的慢病毒载体pLV-IRES-Puro，将上述嵌合抗原受体表达基因插入到慢病毒载体中再转染进入T细胞，获得嵌合抗原受体修饰的T细胞。
一实施方式的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)，包括第一融合蛋白和第二融合蛋白。第一融合蛋白包括依次连接的抗原结合区域、铰链蛋白、第一跨膜蛋白和拟南芥隐花色素蛋白-2。第二融合蛋白包括依次连接的第二跨膜蛋白、碱性螺旋环螺旋蛋白-1和胞内信号传导蛋白。
具体地，抗原结合区域、铰链蛋白、第一跨膜蛋白、拟南芥隐花色素蛋白-2、第二跨膜蛋白、碱性螺旋环螺旋蛋白-1和胞内信号传导蛋白的具体功能以及性质可参见上文描述，在此不作赘述。
在一个实施方式中，抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种。
具体地，抗原结合区域包括：(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽，或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，铰链蛋白包括CD8α。当然，在其他实施方式中，铰链蛋白还可以是其他的分子如CD8β等。
具体地，铰链蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域。
具体地，第一跨膜蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，拟南芥隐花色素蛋白-2包括：(a)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域。
具体地，第二跨膜蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，碱性螺旋环螺旋蛋白-1包括：(a)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
在一个实施方式中，胞内信号传导蛋白包括CD3ζ。当然，在其他实施方式中胞内信号传导蛋白还可以为CD3α或CD3γ等。
具体地，胞内信号传导蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
进一步地，第一融合蛋白包括依次连接的抗原结合区域、铰链蛋白、第一跨膜蛋白和拟南芥隐花色素蛋白-2。抗原结合区域为间皮素抗体表达区域，铰链蛋白为CD8α，第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28TM区域和CD28-4-1BB区域。第一融合蛋白的表达式为anti-mesothelin-CD8αhinge-CD28TM-CD28-4-1BB-CRY2。
进一步地，第二融合蛋白包括依次连接的第二跨膜蛋白、碱性螺旋环螺旋蛋白-1和胞内信号传导蛋白。第二跨膜蛋白为CD28-4-1BB区域，胞内信号传导蛋白为CD3ζ。第二融合蛋白的表达式为CD28-4-1BB-CIB1-CD3ζ。
可以理解，由于嵌合抗原受体的表达基因的多态性及变异，编码相同的蛋白可能会存在多种形式的表达基因。如果表达基因中碱基被缺失、替代或增加，或氨基酸的缺失、插入、取代或其它变异，从而导致蛋白质的氨基酸序列出现一个或多个氨基酸被缺失、替代或增加。表达得到的蛋白质不同于相应的蛋白质，但与该蛋白质没有明显的功能差异的多肽或蛋白称为功能等同变异体。因此，能够表达获得与嵌合抗原受体没有明显的功能差异的多肽或蛋白的表达基因应当认为与本申请中的嵌合抗原受体表达基因等同的表达基因。与嵌合抗原受体没有明显的功能差异的多肽或蛋白都应当认为与本申请中的嵌合抗原受体等同的蛋白。
经过不断的研究探索，成功设计出上述功能结构的嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体(CAR)能够在T细胞中特异性的表达从而用于癌症或病毒感染等的治疗。在特定抗原条件且遇到蓝光的条件下，第一融合蛋白中的拟南芥隐花色素蛋白-2(cryptochromes，CRY2)结构改变从而与第二融合蛋白中的碱性螺旋环螺旋蛋白1(cryptochrome-interacting basic-helix-loophelix 1，CIB1)结合。CRY2与CIB1发生相互作用，将CIB1改造成具有DNA结合功能的融合蛋白，同时将CRY2改造成具有转录激活结构域的融合蛋白，两者协同作用行使细胞的遗传指令—调控DNA转录成mRNA，翻译成目的蛋白。在没有蓝光的条件下或即使有蓝光但无特定抗原时，该嵌合抗原受体不会发动免疫攻击，处于关闭状态。该嵌合抗原受体(CAR)的行为在特定的蓝光条件和特定抗原条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少，特异性高。
上述嵌合抗原受体(CAR)能够运用在抗肿瘤的药物或抗病毒感染的药物中。
一实施方式的应用中，嵌合抗原受体(CAR)具有间皮素结合区域，该嵌合抗原受体(CAR)能够运用在抗乳腺癌的药物中。
一实施方式的光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)，该T细胞中T细胞中导入了上述的嵌合抗原受体表达基因。或者该T细胞中转染了上述表达载体。或者该T细胞能够表达如上述的嵌合抗原受体。
嵌合抗原受体(CAR)的表达基因以及结构请参阅上文所述，在此不作赘述。
在一个实施方式中，请参阅图2，嵌合抗原受体修饰的T细胞中的第一融合蛋白通过抗原结合区域(ScFv)与肿瘤细胞上的抗原结合，在遇到蓝光(hγ)的条件下，第一融合蛋白上的拟南芥隐花色素蛋白-2(cryptochromes，CRY2)结构发生改变从而与第二融合蛋白中的碱性螺旋环螺旋蛋白1(cryptochrome-interacting basic-helix-loophelix 1，CIB1)结合。CRY2与CIB1发生相互作用，将CIB1改造成具有DNA结合功能的融合蛋白，同时将CRY2改造成具有转录激活结构域的融合蛋白，两者协同作用行使细胞的遗传指令—调控DNA转录成mRNA，翻译成目的蛋白。
在没有蓝光的条件下或即使有蓝光但无肿瘤细胞表面抗原的条件下，第一融合蛋白上的拟南芥隐花色素蛋白-2(cryptochromes，CRY2)不会与第二融合蛋白中的碱性螺旋环螺旋蛋白1(cryptochrome-interactingbasic-helix-loophelix 1，CIB1)相互作用。细胞内的信号传导处于关闭状态，嵌合抗原受体免疫攻击停止。因此蓝光是T细胞中嵌合抗原受体行为的“开关”，在特定的蓝光条件和特定抗原条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少。
在一个实施方式中，T细胞为Jurkat细胞。Jurkat细胞属于T淋巴细胞中的一种，其增殖能力强，适宜作为嵌合抗原受体(CAR)的宿主细胞。
实验结果表明，上述光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)特定的蓝光条件下对分泌特定抗原的肿瘤细胞有特异性的高效杀伤作用，而在无蓝光或即使有蓝光但没有分泌特定抗原的细胞杀伤作用很小。因此，该嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)有望应用在抗肿瘤的药物中，为肿瘤治疗提供一种思路。该嵌合抗原受体修饰的T细胞在特定的蓝光以及特定的抗原存在条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少。
上述光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)能够运用在抗肿瘤的药物或抗病毒感染的药物中。
一实施方式的应用中，光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞具有间皮素结合区域，该光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)能够运用在抗乳腺癌的药物中。
请参阅图3，一实施方式的光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备方法，包括如下步骤S110～S130。
S110、提供嵌合抗原受体表达基因，嵌合抗原受体表达基因用于编码得到嵌合抗原受体，其中嵌合抗原受体包括第一融合蛋白和第二融合蛋白，第一融合蛋白包括依次连接的抗原结合区域、铰链蛋白、第一跨膜蛋白和拟南芥隐花色素蛋白-2，第二融合蛋白包括依次连接的第二跨膜蛋白、碱性螺旋环螺旋蛋白-1和胞内信号传导蛋白。
具体地，嵌合抗原受体(CAR)的结构请参阅上文所述，在此不作赘述。
在一个实施方式中，编码的第一融合蛋白的表达式为anti-mesothelin-CD8αhinge-CD28TM-CD28-4-1BB-CRY2。编码的第二融合蛋白的表达式为CD28-4-1BB-CIB1-CD3ζ。
具体地，通过基因合成的方式合成anti-mesothelin-CD8αhinge-CD28TM-CD28-4-1BB-CRY2的核酸序列以及CD28-4-1BB-CIB1-CD3ζ的核酸序列，将获得的两个序列中间用连接肽表达基因连接。获得嵌合抗原受体表达基因。
在一个实施方式中，嵌合抗原受体表达基因包括依次连接的SEQ ID No.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列、SEQ ID No.8所示的核苷酸序列、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
S120、将S110中获得的嵌合抗原受体表达基因连接到慢病毒载体中，得到表达载体。
具体地，将获得的嵌合抗原受体表达基因通过限制性内切酶双酶切，然后连接到经过相同限制性内切酶双酶切处理的慢病毒载体中。
在一个实施方式中，限制性内切酶包括XhoI和NotI。
在一个实施方式中，慢病毒载体为pLV-IRES-Puro。
S130、将S120中获得的表达载体包装为慢病毒并转染至T细胞中，得到光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞。
具体地，将S120中获得的表达载体先转染到宿主细胞如239T细胞中，扩增获得大量的慢病毒。然后将一定病毒滴度的慢病毒转染至T细胞中，获得光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)。
在一个实施方式中，表达质粒包装为慢病毒并转染至T细胞中的操作中，转染的病毒MOI值约为10。
上述制备光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞的方法，操作简便，制备获得的嵌合抗原受体修饰的T细胞在特定的蓝光以及特定的抗原存在条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少。
下面为具体实施例部分。
以下实施例中，如无特别说明，未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如参见萨姆布鲁克、EF弗里奇、T曼尼阿蒂斯等(金冬雁，黎孟枫等译)所著的分子克隆实验指南[M](北京：科学出版社，1992)中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。实施例中所使用的试剂均为市售。
实施例1
制备光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞
通过基因公司分别合成编码第一融合蛋白的核酸序列(包括依次连接的SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列)。第一融合蛋白的表达式为anti-mesothelin-CD8αhinge-CD28TM-CD28-4-1BB-CRY2。
通过基因公司分别合成编码第二融合蛋白的核酸序列(包括依次连接的SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列和SEQ ID No.7所示的核苷酸序列)。第二融合蛋白的表达式为CD28-4-1BB-CIB1-CD3ζ。
将编码第一融合蛋白的核酸序列和编码第二融合蛋白的核酸序列两者通过编码连接肽的核酸序列(如SEQ ID No.8所示)连接，获得嵌合抗原受体表达基因。
通过Xho I和Not I双酶切该嵌合抗原受体表达基因并克隆进慢病毒载体pLV-IRES-Puro中，得到表达载体。将构建好的慢病毒表达载体经过Xho I和Not I双酶切进行鉴定，酶切产物电泳图如图4所示(其中图4中5.5kb片段为目的片段，8.1kb片段为载体本身片段)。目的片段的大小与预期相符，说明载体构建成功。将上述获得的表达质粒包装为慢病毒，并将病毒(病毒MOI值为10)转染至Jurkat E6.1细胞中(T淋巴细胞株，购自美国典型物保藏中心，ATCC)，得到光控调节的嵌合抗原受体修饰的Jurkat细胞(JurkatCAR)。
2天后，将转染后的Jurkat E6.1细胞转移到具有嘌呤霉素的RPMI 1640培养基中，并通过有限稀释法将细胞克隆化。经21天的筛选，建立具有嘌呤霉素抗性的光控调节的嵌合抗原受体修饰的Jurkat E6.1细胞株(JurkatCAR)。显微镜下观察转染后的Jurkat E6.1(JurkatCAR)细胞的生长照片如图5所示，Jurkat E6.1生长状态良好，转染成功。
测试一
光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞增殖情况测定
将5×105个实施例1中制备的JurkatCAR细胞分别加入含有K562、K562/mesothelin+、MCF7细胞的6孔板(5×105/孔)中。其中，K562为人类红白血病细胞，MCF7为人乳腺癌细胞，K562和MCF7均购自ATCC。K562/mesothelin+表示在K562细胞的基础通过mesothelin遗传修饰，使K562过表达mesothelin基因。上述细胞中，K562不表达Mesothelin，K562/mesothelin+和MCF7均能表达Mesothelin。
实验分为两组，A组不用蓝光照射，B组用蓝光持续照射。蓝光具体为用470nm的LED光源进行照射，蓝光强度为1.5W/m2。分别在第3天(D3)、第7天(D7)，对悬浮的JurkatCAR细胞进行细胞计数。
结果如图6所示，B组中K562/mesothelin+、MCF7孔内的JurkatCAR能够大量增殖，而其它孔内细胞几乎不增殖。以上结果表明，当在蓝光持续照射以及Mesothelin抗原存在时，经CAR修饰的T细胞与相应抗原(mesothelin)结合后才能大量增殖。而当蓝光不存在或没有特定抗原存在时，JurkatCAR(光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)基本不增殖。
测试二
光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞中IFNγ分泌量测定
将5×105个实施例1中制备的JurkatCAR细胞在24孔板中与K562、K562/mesothelin+、MCF7细胞(5×105/孔)共培养。
实验分为两组，A组不用蓝光照射，B组用蓝光持续照射。72小时后收集上清，通过IFNγ的ELISA检测试剂盒(BD Biosciences)检测IFNγ的分泌量。
结果如图7所示，B组中K562/mesothelin+、MCF7孔内的JurkatCAR细胞能够大量分泌IFNγ，而其它孔内细胞几乎不分泌IFNγ。以上结果表明，当在蓝光持续照射以及Mesothelin抗原存在时，经CAR修饰的T细胞与特定抗原(mesothelin)结合后能大量分泌IFNγ。而当蓝光不存在或没有特定抗原存在时，JurkatCAR(光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)基本不分泌IFNγ。
测试三
光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞体外杀伤作用测定
将实施例1中制备的JurkatCAR细胞与靶细胞K562、K562/mesothelin+、MCF7细胞共培养(效靶比1:1)。应用CFSE/PI双标法检测遗传修饰后的JurkatCAR细胞对不同类型肿瘤细胞的体外杀伤能力。
实验分为两组，A组不用蓝光照射，B组连续用蓝光照射。方法如下：用终浓度为0.05μM的CFSE对1×106个靶细胞进行活细胞染色标记，将1×106个JurkatCAR细胞和1×106个CFSE标记的靶细胞混匀，200g，1min离心使细胞相互接触，在5％CO2，37℃培养箱中共孵育4h，反应结束后，加入1μg/ml PI染液，混匀，室温避光孵育15min后进行流式检测。
结果如图8和图9所示，图8中右上象限细胞群为被杀死的细胞比例。在蓝光持续照射下，JurkatCAR能有效杀伤K562/mesothelin+、MCF7癌细胞；而其他组细胞基本不杀伤。以上结果表明，当在蓝光照射下，经CAR修饰的T细胞与相应抗原(mesothelin)结合后能有效杀伤靶细胞；而不存在蓝光情况或没有特定抗原存在时，JurkatCAR(光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞)基本不杀伤靶细胞。
综上，上述光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞(JurkatCAR)在特定的蓝光条件下对分泌特定抗原的肿瘤细胞有特异性的高效杀伤作用，而在无蓝光或即使有蓝光但没有分泌特定抗原的细胞杀伤作用很小。因此，该嵌合抗原受体修饰的T细胞能够作为抗肿瘤的药物，为肿瘤治疗提供一种思路。该嵌合抗原受体修饰的T细胞在特定的蓝光以及特定的抗原存在条件下才产生免疫反应，实现嵌合抗原受体免疫反应可控，治疗副作用少。
此外，以上测试数据以mesothelin作为抗原说明，在其他实施例中，当第一融合蛋白上设计不同的抗原结合区域时，在蓝光条件下，光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞对分泌相应的抗原的靶细胞也能产生良好杀伤作用。
以上所述实施例仅表达了本发明的一种或几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 嵌合抗原受体及其表达基因、光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 807
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccaccatgg ccttaccagt gaccgccttg ctcctgccgc tgccgctggc cttgctgctc 60
cacgccgcca ggccgggatc ccaggtacaa ctgcagcagt ctgggcctga gctggagaag 120
cctggcgctt cagtgaagat atcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacacc 180
atgaactggg tgaagcagag ccatggaaag agccttgagt ggattggact tattactcct 240
tacaatggtg cttctagcta caaccagaag ttcaggggca aggccacatt aactgtagac 300
aagtcatcca gcacagccta catggacctc ctcagtctga catctgaaga ctctgcagtc 360
tatttctgtg caaggggggg ttacgacggg aggggttttg actactgggg ccaagggacc 420
acggtcaccg tctcctcagg tgtaggcggt tcaggcggcg gtggctctgg cggtggcgga 480
tcggacatcg agctcactca gtctccagca atcatgtctg catctccagg ggagaaggtc 540
accatgacct gcagtgccag ctcaagtgta agttacatgc actggtacca gcagaagtca 600
ggcacctccc ccaaaagatg gatttatgac acatccaaac tggcttctgg agtcccaggt 660
cgcttcagtg gcagtgggtc tggaaactct tactctctca caatcagcag cgtggaggct 720
gaagatgatg caacttatta ctgccagcag tggagtggtt accctctcac gttcggtgct 780
gggacaaagt tggaaatcaa agctagc 807
<210> 2
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 3
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc acagtgacta catgaacatg 120
actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag cattaccagc cctatgcccc accacgcgac 180
ttcgcagcct atcgctccaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 240
tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 300
gaagaagaag gaggatgtga actg 324
<210> 4
<211> 1836
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaagatgg acaaaaagac tatagtttgg tttagaagag acctaaggat tgaggataat 60
cctgcattag cagcagctgc tcacgaagga tctgtttttc ctgtcttcat ttggtgtcct 120
gaagaagaag gacagtttta tcctggaaga gcttcaagat ggtggatgaa acaatcactt 180
gctcacttat ctcaatcctt gaaggctctt ggatctgacc tcactttaat caaaacccac 240
aacacgattt cagcgatctt ggattgtatc cgcgttaccg gtgctacaaa agtcgtcttt 300
aaccacctct atgatcctgt ttcgttagtt cgggaccata ccgtaaagga gaagctggtg 360
gaacgtggga tctctgtgca aagctacaat ggagatctat tgtatgaacc gtgggagata 420
tactgcgaaa agggcaaacc ttttacgagt ttcaattctt actggaagaa atgcttagat 480
atgtcgattg aatccgttat gcttcctcct ccttggcggt tgatgccaat aactgcagcg 540
gctgaagcga tttgggcgtg ttcgattgaa gaactagggc tggagaatga ggccgagaaa 600
ccgagcaatg cgttgttaac tagagcttgg tctccaggat ggagcaatgc tgataagtta 660
ctaaatgagt tcatcgagaa gcagttgata gattatgcaa agaacagcaa gaaagttgtt 720
gggaattcta cttcactact ttctccgtat ctccatttcg gggaaataag cgtcagacac 780
gttttccagt gtgcccggat gaaacaaatt atatgggcaa gagataagaa cagtgaagga 840
gaagaaagtg cagatctttt tcttagggga atcggtttaa gagagtattc tcggtatata 900
tgtttcaact tcccgtttac tcacgagcaa tcgttgttga gtcatcttcg gtttttccct 960
tgggatgctg atgttgataa gttcaaggcc tggagacaag gcaggaccgg ttatccgttg 1020
gtggatgccg gaatgagaga gctttgggct accggatgga tgcataacag aataagagtg 1080
attgtttcaa gctttgctgt gaagtttctt ctccttccat ggaaatgggg aatgaagtat 1140
ttctgggata cacttttgga tgctgatttg gaatgtgaca tccttggctg gcagtatatc 1200
tctgggagta tccccgatgg ccacgagctt gatcgcttgg acaatcccgc gttacaaggc 1260
gccaaatatg acccagaagg tgagtacata aggcaatggc ttcccgagct tgcgagattg 1320
ccaactgaat ggatccatca tccatgggac gctcctttaa ccgtactcaa agcttctggt 1380
gtggaactcg gaacaaacta tgcgaaaccc attgtagaca tcgacacagc tcgtgagcta 1440
ctagctaaag ctatttcaag aacccgtgaa gcacagatca tgatcggagc agcacctgat 1500
gagattgtag cagatagctt cgaggcctta ggggctaata ccattaaaga acctggtctt 1560
tgcccatctg tgtcttctaa tgaccaacaa gtaccttcgg ctgttcgtta caacgggtca 1620
aagagagtga aacctgagga agaagaagag agagacatga agaaatctag gggattcgat 1680
gaaagggagt tgttttcgac tgctgaatct tcttcttctt cgagtgtgtt tttcgtttcg 1740
cagtcttgct cgttggcatc agaagggaag aatctggaag gtattcaaga ttcatctgat 1800
cagattacta caagtttggg aaaaaatggt tgcaaa 1836
<210> 5
<211> 249
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aggagtaaga ggagcagggg agggcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tccaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 180
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 240
tgtgaactg 249
<210> 6
<211> 1008
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaatggag ctataggagg tgaccttttg ctcaattttc ctgacatgtc ggtcctagag 60
cgccaaaggg ctcacctcaa gtacctcaat cccacctttg attctcctct cgccggcttc 120
tttgccgatt cttcaatgat taccggcggc gagatggaca gctatctttc gactgccggt 180
ttgaatcttc cgatgatgta cggtgagacg acggtggaag gtgattcaag actctcaatt 240
tcgccggaaa cgacgcttgg gactggaaat ttcaagaaac ggaagtttga tacagagact 300
aaggattgta atgagaagaa gaagaagatg acgatgaaca gagatgacct agtagaagaa 360
ggagaagaag agaagtcgaa aataacagag caaaacaatg ggagcacaaa aagcatcaag 420
aagatgaaac acaaagccaa gaaagaagag aacaatttct ctaatgattc atctaaagtg 480
acgaaggaat tggagaaaac ggattatatt catgttcgtg cacgacgagg ccaagccact 540
gatagtcaca gcatagcaga acgagttaga agagaaaaga tcagtgagag aatgaagttt 600
ctacaagatt tggttcctgg atgcgacaag atcacaggca aagcagggat gcttgatgaa 660
atcattaact atgttcagtc tcttcagaga caaatcgagt tcttatcgat gaaactagca 720
attgtgaatc caaggccgga ttttgatatg gatgacattt ttgccaaaga ggttgcctca 780
actccaatga ctgtggtgcc atctcctgaa atggttcttt ccggttattc tcatgagatg 840
gttcactctg gttattctag tgagatggtt aactccggtt accttcatgt caatccaatg 900
cagcaagtga ataccagttc tgatccattg tcatgcttca acaatggcga agctccttcg 960
atgtgggact ctcatgtgca gaatctctat ggcaatttag gagtttga 1008
<210> 7
<211> 340
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta 60
taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg 120
ggaccctgag atggggggaa agccgcagag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa 180
tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg 240
ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac 300
ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 340
<210> 8
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggaggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga 60
accctggacc tg 72
Claims (10)
1.一种嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，包括第一融合蛋白表达基因和第二融合蛋白表达基因；
所述第一融合蛋白表达基因包括依次连接的抗原结合区域表达基因、铰链蛋白表达基因、第一跨膜蛋白表达基因和拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因；
所述第二融合蛋白表达基因包括依次连接的第二跨膜蛋白表达基因、碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因和胞内信号传导蛋白表达基因。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，还包括连接肽表达基因，所述连接肽表达基因一端与所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因连接，所述连接肽表达基因的另一端与所述第二跨膜蛋白表达基因连接。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述抗原结合区域表达基因用于表达抗原结合区域，所述抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种；及/或，
所述铰链蛋白表达基因用于表达铰链蛋白，所述铰链蛋白包括CD8α；及/或，
所述第一跨膜蛋白表达基因用于表达第一跨膜蛋白，所述第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28TM-CD28-4-1BB区域；及/或，
所述第二跨膜蛋白表达基因用于表达第二跨膜蛋白，所述第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，
所述胞内信号传导蛋白表达基因用于表达胞内信号传导蛋白，所述胞内信号传导蛋白包括CD3ζ。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，所述抗原结合区域表达基因包括：(a)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述铰链蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述第一跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ IDNo.3所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述拟南芥隐花色素蛋白-2表达基因包括：(a)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述第二跨膜蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ IDNo.5所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述碱性螺旋环螺旋蛋白-1表达基因包括：(a)、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列；及/或，
所述胞内信号传导蛋白表达基因包括：(a)、SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，(b)、与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列具有至少95％同源性的核苷酸序列，或(c)、SEQ ID No.7所示的核苷酸序列，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的核苷酸序列。
5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体中含有如权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体表达基因。
6.一种嵌合抗原受体，其特征在于，包括第一融合蛋白和第二融合蛋白；
所述第一融合蛋白包括依次连接的抗原结合区域、铰链蛋白、第一跨膜蛋白和拟南芥隐花色素蛋白-2；
所述第二融合蛋白包括依次连接的第二跨膜蛋白、碱性螺旋环螺旋蛋白-1和胞内信号传导蛋白。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，
所述抗原结合区域选自肿瘤相关抗原结合区域和病毒相关抗原结合区域中的至少一种；及/或，
所述铰链蛋白包括CD8α；及/或，
所述第一跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，
所述第二跨膜蛋白包括依次连接的CD28-4-1BB区域；及/或，
所述胞内信号传导蛋白包括CD3ζ。
8.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体表达基因，其特征在于，
所述抗原结合区域包括：(a)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽，(b)、与SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽，或(c)、由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述铰链蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述第一跨膜蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述拟南芥隐花色素蛋白-2包括：(a)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.4所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述第二跨膜蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.5所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述碱性螺旋环螺旋蛋白-1包括：(a)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.6所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽；及/或，
所述胞内信号传导蛋白包括：(a)、由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸编码得到的多肽；(b)、与SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸具有至少98％同源性的多核苷酸编码得到的多肽；或(c)、由SEQ ID No.7所示的核苷酸序列组成的多核苷酸，其中一个或多个碱基被缺失、替代或增加得到的多核苷酸编码得到的多肽。
9.一种光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于，所述T细胞中导入了如权利要求1～4任一项所述的嵌合抗原受体表达基因，或者所述T细胞中转染了如权利要求5所述的表达载体，或者所述T细胞能够表达如权利要求6～8任一项所述的嵌合抗原受体。
10.如权利要求1～4任一项所述嵌合抗原受体表达基因、如权利要求5所述的表达载体、如权利要求6～8任一项所述的嵌合抗原受体或如权利要求9所述的光控调节的嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备抗肿瘤的药物或抗病毒感染的药物中的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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