CN109293781A

CN109293781A - 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用

Info

Publication number: CN109293781A
Application number: CN201811062721.XA
Authority: CN
Inventors: 伍志强; 韩为东; 王瑶; 佟川; 张文英; 王晓慧
Original assignee: Chinese PLA General Hospital
Current assignee: Chinese PLA General Hospital
Priority date: 2018-09-12
Filing date: 2018-09-12
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CD19‑CD20双靶向性的T细胞及其应用。所述嵌合抗原受体为CD20ScFv‑L‑CD19ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，包括依次串联的CD20ScFv、连接肽L、CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。在治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤时，本发明的嵌合抗原受体修饰的T细胞不仅能够特异性识别仅有其中CD19抗原或CD20抗原单个靶点表达的肿瘤细胞，而且还可以识别CD19抗原和CD20抗原两个靶点共表达的肿瘤细胞，较单靶点CAR T，双靶点CAR T具有更强的抗肿瘤活性，避免低丰度抗原表达的瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低复发风险。

Description

嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CD19-CD20双靶向性的T细胞及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CD19-CD20双靶向性的T细胞及其应用。

背景技术

以急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤等为代表的血液系统恶性肿瘤在我国的发病率有不断增高趋势，并且以中青年为主要患病群体，严重威胁着我国人口的健康与生命。尽管以化疗、放疗、造血干细胞移植、以及分子靶向药物与治疗性抗体为主的治疗手段在很大程度上提高了疾病的缓解率，延长了患者生存期，但20-50％的患者在缓解后复发，同时约有30％左右的患者对目前已有的诱导缓解手段存在原发性抵抗。针对这种情况，需要探索寻找新的有效治疗策略。

CD19和CD20均在临床水平被确认为表达在大多数B细胞恶性肿瘤的特异性抗原，而在造血干细胞、血浆细胞和其他正常组织中不表达。CD19和CD20抗原与B细胞的生物特性密切相关，存在于B细胞成熟的各个阶段。在B细胞增殖和分化中起重要的调节作用。而且，CD19和CD20分子在细胞膜上比较暴露，容易接近，与单克隆抗体结合后无显著内化及脱落，也不会因为与抗体的结合而发生抗原调变。因此CD19和CD20抗原是B细胞系血液系统肿瘤治疗的理想靶点。

肿瘤免疫治疗经过多年的临床前探索与临床研究在近年取得了令人瞩目的突破性进展，尤其以PD-1抗体在治疗实体瘤以及靶向CD19的嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR T)在治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤中获得了显著的临床突破，包括B-ALL(B-cell acutelymphoblastic leukemia，B细胞急性淋巴细胞白血病)，NHL(non-Hodgkins lymphoma，非霍奇金淋巴瘤)，B-CLL(B-cell Chronic lymphocytic leukemia，B细胞慢性淋巴细胞白血病)。

尽管2013年以来全球公开报道的临床数据显示，针对CD19的CAR T治疗可以使60-90％的复发难治性B-ALL患者获得再次缓解，约50％的复发难治性NHL患者获得疾病控制与缓解，但同时也暴露出了一些迫切需要对该疗法进行优化与解决的问题。从较长期临床效果观察方面来讲，最为突出的问题是缓解之后的再次复发，如约40％左右的CD19-CAR T治疗缓解后的B-ALL患者在6个月后会再次复发。究其复发的原因，其中最为常见的原因为靶抗原CD19转变为阴性或者其他表型。

因此，目前的单靶点CAR T对B细胞系恶性血液系统肿瘤的抗肿瘤效果还有待提高，且治疗后的复发率还有待进一步降低。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术中CAR T对肿瘤治疗过程中效率低和复发风险高的缺陷，提供一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞及其制备方法和应用，嵌合抗原受体修饰的T细胞在治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤时，具有更强的抗肿瘤活性，且治疗后显著降低复发风险。

本发明的发明人在研究中意外发现，采用嵌合抗原受体CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的T细胞治疗血液系统肿瘤时，具有很强的杀瘤活性，且显著降低治疗后的复发风险。

因此，为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括依次串联的CD20ScFv、连接肽L、CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。

第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。

第三方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。

第四方面，本发明提供了一种工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞，所述T细胞是由如上所述的嵌合抗原受体修饰的T细胞。

第五方面，本发明提供了如上所述的工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞的制备方法，所述方法包括：

包装携带如上所述的重组表达载体的慢病毒，得到病毒原液；利用得到的病毒原液感染T细胞，使T细胞表达嵌合抗原受体。

第六方面，本发明提供了上述工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞在制备用于治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤的制剂中的应用。

在治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤时，本发明的嵌合抗原受体修饰的T细胞，即工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞不仅能够特异性识别仅有其中CD19抗原和CD20抗原单个靶点表达的肿瘤细胞，而且还可以识别CD19抗原和CD20抗原两个靶点共表达的肿瘤细胞，较单靶点CAR T，双靶点CAR T具有更强的抗肿瘤活性，避免低丰度抗原表达的瘤细胞产生免疫逃逸，从而降低复发风险。此外，本发明的工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞为治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤(例如，非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病)提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

图1为本嵌合抗原受体CAR20-19(图1-1)的结构示意图，以及用于对照的CAR19(图1-2)和CAR20(图1-3)的结构示意图。

图2为本发明的慢病毒表达载体(pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ)的经限制性内切酶BamHI/MluI和BamHI/SalI双酶切片段的电泳鉴定图。

图3为流式细胞术对未感染T细胞和感染T细胞的表型分析结果(图3-1为未感染T细胞，图3-2为感染pRRLsin-CAR19的T细胞、图3-3为感染pRRLsin-CAR20的T细胞、图3-4为感染pRRLsin-CAR20-19的T细胞)。

图4为感染有pRRLsin-CAR20-19的T细胞、感染有pRRLsin-CAR19的T细胞、感染有pRRLsin-CAR20的T细胞和未感染的T细胞的记忆细胞表型分析结果。

图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体的病毒原液对T细胞的感染效率。

图6为LDH法检测免疫细胞与靶细胞效靶比(E：T)分别为1:1(图6-1)和0.1:1(图6-2)共培养48小时的效应细胞杀伤靶细胞活性结果图。

图7为ELASI法检测免疫细胞与靶细胞效靶比共培养48小时的效应细胞释放细胞因子IL-2、IFNγ和TNF-α的水平。其中，效靶比1:1结果如图7-1，效靶比0.1:1结果如图7-2。

图8为RTCA动态检测双靶点CART20-19细胞对靶细胞的杀伤活性图，效靶比(E：T)为1:1的结果见图8-1所示，效靶比(E：T)为1:10的结果见图8-2所示。

图9为双靶点CART20-19细胞治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤患者1(图9-1)和患者2(图9-2)过程中，外周血中的CAR20-19基因拷贝数的变化曲线图。

图10为双靶点CART20-19细胞治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤患者1(图10-1)和患者2(图10-2)过程中，外周血中的CD19和CD20阳性淋巴细胞百分比变化曲线图。

图11为双靶点CART20-19细胞治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤患者1(图11-1)和患者2(图11-2)的治疗效果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括依次串联的CD20ScFv、连接肽L、CD19ScFv、CD8的铰链区(Hinge)和跨膜区(CD8tm)、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。

优选情况下，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，更优选，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

根据本发明，CD20ScFv和CD19ScFv之间的连接肽可以为本领域公知的能够将两种肽进行连接的连接肽，而根据本发明，为了进一步提高工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞在治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤时的抗肿瘤细胞活性，降低治疗后的复发率，所述连接肽具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，更优选的，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

根据本发明，所述嵌合抗原受体是指成熟蛋白，其前体蛋白还可以含有信号肽结构域，所述信号肽结构域位于所述嵌合抗原受体的最上游。所述信号肽可以为本领域公知的各种信号肽，例如，CD8a信号肽。

第二方面，本发明提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。

根据本发明，在了解了如上所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列的情况下，本领域技术人员根据本领域的公知常识，其能够获得编码如上嵌合抗原受体的基因，并且由于密码子的简并性所获得的不同核苷酸序列的基因均应该视为在本发明的保护范围之内。

优选情况下，编码上述嵌合抗原受体的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，更优选编码上述嵌合抗原受体的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第三方面，本发明提供了含有上述基因的重组表达载体。

根据本发明，可用的负载载体可以为本领域公知的各种能够携带外来基因的载体，优选情况下，所述重组表达载体为慢病毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞如293T包装细胞，获得病毒原液及嵌合抗原受体修饰的T细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，其中，慢病毒表达载体pRRLsin的启动子CMV启动子更换为EF1a启动子。

对于慢病毒表达载体的制备方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒载体的制备方法包括以下步骤：

(1)从T细胞cDNA中分别扩增CD8的铰链区和跨膜区结构域、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域，并克隆至载体pRRLsin(慢病毒表达载体的启动子CMV启动子更换为EF1a启动子)中，构建得到pRRLsin-CD8-CD137-CD3ζ；

(2)合成编码CD8a信号肽和编码CD20ScFv-L-CD19ScFv的核苷酸序列，并克隆至pRRLsin-CD8-CD137-CD3ζ中，经测序验证后得到序列正确的慢病毒表达载体pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

步骤(1)中，对于从T细胞cDNA中分别扩增CD8的铰链区和跨膜区结构域、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为RT-PCR法。其中，T细胞可以通过分离人静脉血中的单个核细胞，然后进行培养获得。

具体地，得到pRRLsin-CD8-CD137-CD3ζ的方法可以包括：提取T细胞的总RNA，逆转录获得T细胞cDNA，以得到的T细胞cDNA为模板，利用引物P1(SEQ ID NO.13)和P2(SEQ IDNO.14)进行PCR扩增获得CD8的铰链区和跨膜区(SEQ ID NO.4)；利用引物P3(SEQ IDNO.15)和P4(SEQ ID NO.16)进行PCR扩增获得CD137基因的胞内信号结构域(SEQ IDNO.5)；利用引物P5(SEQ ID NO.17)和P6(SEQ ID NO.18)进行PCR扩增获得CD3ζ基因的胞内信号结构域(SEQ ID NO.6)，将获得的PCR产物分别进行双酶切，然后与MluI/SalI双酶切后的慢病毒表达载体pRRLsin连接。

步骤(2)中，对于合成编码CD8a信号肽和CD20ScFv-L-CD19ScFv的核苷酸序列的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以通过全基因合成技术合成。

具体地，得到序列正确的慢病毒表达载体的方法可以包括：通过全基因合成技术合成编码CD8a信号肽和CD20ScFv-L-CD19ScFv融合基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.7)，克隆至载体pGSI中，得到pGSI-CD20ScFv-L-CD19ScFv；然后将pGSI-CD20ScFv-L-CD19ScFv进行BamHI/MluI双酶切，与BamHI/MluI双酶切后的步骤(1)得到的重组质粒pRRLsin-CD8-CD137-CD3ζ连接，经测序鉴定，得到序列正确的pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。其中，CD8a信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示、CD19ScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD20ScFv的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

第四方面，本发明还提供了一种工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞，所述T细胞是由上述嵌合抗原受体修饰的T细胞。

第五方面，本发明还提供了如上所述的工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞的制备方法，所述方法包括：包装携带如上所述的重组表达载体的慢病毒，得到病毒原液；利用得到的病毒原液感染T细胞，使T细胞表达嵌合抗原受体。

根据本发明，对于包装携带如上所述的重组表达载体的慢病毒的方法没有特别的限定，可以为本领域技术人员常用的各种方法，本发明一种优选的包装携带如上所述的重组表达载体的慢病毒的方法包括，将慢病毒表达载体与辅助质粒(如psPAX2、pMD2.G)共转染293T包装细胞，转染48-72h时收集病毒上清，离心、过滤，获得病毒原液。

根据本发明，对于所述T细胞的制备方法没有特别限定，可以为本领域常用的各种方法，优选情况下，该方法包括：(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2、重组人纤维蛋白和血清的存在下，将单个T细胞进行第一阶段培养；(2)在CD3单克隆抗体、白介素-2、重组人纤维蛋的存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养。

具体的，将全血进行离心处理，得到上层血浆和下层沉淀，下层沉淀采用分离液对细胞进行分离，得到单个核细胞。上层血浆于50-60℃水浴灭火并离心后取上清液即为血清。然后将所述单个核细胞与白介素-2、血清、T细胞培养液(例如，X-VIVO 15^TM)混合，并将得到的混合液置于包被有重组人纤维蛋白和CD3单克隆抗体的培养容器中，于30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO₂培养箱中进行第一阶段培养70-80h，使细胞贴壁。之后将培养容器中的旧液弃去，更换新的T细胞培养液，并转移至未包被的培养容器中，在30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO₂培养箱中进行第二阶段培养，培养的过程中不断补充白介素-2。

优选的，第一阶段培养中，在第一T细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为250-350U/mL，血清的浓度为0.4-0.6体积％。

优选的，第二阶段培养中，补加白介素-2的量使得，相对于100ml的第二T细胞培养液中，所述白介素-2的浓度维持在250-350U/mL。

其中，根据本发明，将培养容器进行包被的方法可以为，将混有重组人纤维蛋白和CD3单克隆抗体的PBS缓冲液(包被液)加入到待培养的培养容器中，并在4-37℃的条件下静置1-12小时，之后弃去培养容器中的包被液。优选的，在弃去包被液之后，还包括使用PBS缓冲液对培养容器洗涤1-3次，使用T细胞培养液洗涤1-2次。其中，相对于10ml的所述包被液，所述人纤维蛋白的量可以为80-120μL，所述CD3单克隆抗体的量可以为40-60μL。

根据本发明，对于制备慢病毒感染T细胞的方法没有特别限定，可以为本领域常用的各种方法，优选情况下，该方法包括：(1)在病毒原液、白介素-2、聚凝胺(Polybrene)和重组人纤维蛋白存在下，将T细胞进行第一阶段感染培养；(2)在白介素-2下，将所述第一阶段感染培养的细胞进行第二阶段感染培养。

具体的，将300-800μL病毒原液添加至包被有重组人纤维蛋白的培养容器中，1800-2200g离心1.5-2.5h后，再向所述培养容器中添加300-800μL含有3×10⁵-8×10⁵个T细胞的新鲜T细胞培养液，250-350U/mL的白介素-2，0.3-1.0μg/mL聚凝胺置于30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO₂培养箱中进行第一阶段感染培养12-16h后，弃培养液，将细胞转至未包被的培养容器中，加入T细胞培养液、白介素-2，使T细胞的密度为1×10⁶-5×10⁶，白介素-2的浓度为250-350U/mL，于30-37℃、饱和湿度为3-6％的CO₂培养箱中进行第二阶段感染培养50-60h，获得嵌合抗原受体修饰的T细胞。

其中，将培养容器进行包被的方法可以为，将混有重组人纤维蛋白的PBS缓冲液(包被液)加入到待培养的培养容器中，并在4-37℃的条件下静置1-12小时，之后弃去培养容器中的包被液。优选的，在弃去包被液之后，还包括使用PBS缓冲液对培养容器洗涤1-3次，使用T细胞培养液洗涤1-2次。其中，相对于10ml的所述包被液，所述人纤维蛋白的量可以为80-120μL。

优选的，嵌合抗原受体修饰的T细胞表达的嵌合抗原受体的成熟蛋白氨基酸序列优选如SEQ ID NO.1所示。其中，本领域技术人员应该理解的是，嵌合抗原受体前体蛋白由CD8a信号肽、CD20ScFv、连接肽L、CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，蛋白质翻译后在细胞内粗面型内质网切除信号肽后成为成熟嵌合抗原受体蛋白，分泌输出后并定位于T细胞的细胞膜上。该嵌合抗原受体的成熟蛋白氨基酸序列对应的基因编码序列如SEQ ID NO.2所示。该嵌合抗原受体以CD8的铰链区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，对应的基因编码序列如SEQ ID NO.12所示。

第六方面，本发明还提供了所述的工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞在制备用于治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤的制剂中的应用。

优选的，所述B细胞系恶性血液系统肿瘤包括非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞白血病和B细胞急性淋巴细胞白血病中的至少一种。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：

T细胞培养液X-VIVO 15^TM无血清细胞培养基购自美国Lonza公司。

淋巴细胞分离液购自TBD公司。

CD3单克隆抗体、CD8单克隆抗体、CD4单克隆抗体、CD62L抗体、CD45RA抗体、Fab抗体、重组纤维连接蛋白(retronectin)均购自美国BD公司。

重组人白介素2购自protech公司。

总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent、高保真DNA聚合酶(HS DNAPolymerase)、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。

RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。

BglⅡ、EcoRI、MluI、BamHI、SalI购自Fermentas公司。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

IL-2、IFNγ和TNF-α的ELISA试剂盒均购自美国R&D公司

pRRLsin、psPAX2、pMD2.G均购自Addgene公司。

pGSI购自北京天一辉远生物科技有限公司。

Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

Lipofectamine^TM 2000 Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司。

Polybrene购自Sigma公司

293T包装细胞购自美国ATCC。

同时表达CD19和CD20的Raji细胞(表达CD19和CD20)购自美国ATCC。

K562细胞购自美国ATCC。

胎牛血清购自德国PAA公司。

5-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯购自上海谱振生物科技有限公司。

所有引物均由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

实施例1

本实施例用于说明T细胞的制备

(1)取人静脉血于含肝素的真空管中。采用淋巴细胞分离液，通过密度梯度离心方法分离获得单个核细胞(PBMCs)。

(2)PBMCs洗三次后，采用含有0.5体积％的人自体血清的X-VIVO 15^TM无血清T细胞培养液调整细胞终浓度为2×10⁶个细胞/mL；将细胞接种于预先经过终浓度为10μg/mL的retronectin和50ng/ml CD3单克隆抗体包被的75cm²细胞培养瓶中。然后在培养基里加入终浓度为300U/mL的重组人白介素2，在37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中培养。

(3)培养第4天，将细胞转移至未包被的培养瓶中，每2天按照细胞生长数量加入T细胞培养液X-VIVO 15^TM，控制细胞浓度为1×10⁸个细胞/mL，并加入终浓度为300U/ml的重组人白介素2；培养至第12天，得到T细胞，流式细胞术对T细胞表型进行分析，CD3：96.09％，CD3CD4:42.56％,CD3CD8:53.44％。

实施例2

本实施例用于说明慢病毒表达载体的构建

(1)T细胞cDNA的制备

离心沉淀实施例1培养得到的T细胞，用总RNA提取试剂盒RNAiso Reagent提取细胞的总RNA，-80℃保存备用。提取的总RNA用逆转录试剂盒RevertAid^TM First Strand cDNASynthesis Kit逆转录得T细胞cDNA，-20℃保存备用。

(2)慢病毒表达载体(pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8a-CD137-CD3ζ)的制备

设计并合成如下引物序列(其中，下划线标记为保护碱基，方框为酶切位点)：

以步骤(1)中T细胞cDNA为模板，用引物P1和P2进行PCR扩增，得到长227bp的CD8的铰链区和跨膜区，核苷酸序列如SEQID NO.4所示，两端分别含有MluI和BglⅡ酶切位点和保护碱基；用引物P3和P4进行PCR扩增，得到长146bp的CD137胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQID NO.5所示，两端分别含有BglⅡ和EcoRI酶切位点及保护碱基；用引物P5和P6进行PCR扩增，得到长359bp的CD3ζ的胞内信号结构域，核苷酸序列如SEQID NO.6所示，两端分别含有EcoRI和SalI酶切位点及保护碱基。各步PCR扩增反应体系相同，以扩增CD137胞内信号结构域为例，进行PCR扩增，PCR反应条件参照HS DNA Polymerase的说明书，反应体系(50μL)如下：

双蒸水：32.5μL

5×反应buffer：10μL

dNTP混合物(每种2.5mM)：4μL

P3(10mM):1μL

P4(10mM):1μL

T细胞cDNA(200ng/ul)：1μL

HS DNA Polymerase：0.5μL

将上述PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行DNA片段回收。得到片段后分别进行双酶切反应，酶切产物用普通DNA产物纯化试剂盒回收备用。

慢病毒表达载体pRRLsin用MluI/SalI双酶切，酶切产物经1％的琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收大的载体片段，然后与之前回收的CD8、CD137、CD3ζ片段通过T4DNA连接酶连接，连接产物转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后用质粒小提试剂盒提取质粒。将质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pRRLsin-CD8-CD137-CD3ζ。

(3)慢病毒表达载体(pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8a-CD137-CD3ζ)的制备

全基因合成编码CD8a信号肽(SEQID NO.8)和CD20ScFv-L-CD19ScFv(SEQID NO.7)融合基因的核苷酸序列，由北京天一辉远生物科技有限公司合成，其5’端含有BamHI、kozak序列，3’端含有MluI酶切位点，将前述融合基因分别克隆在质粒pGSI中，命名为pGSI-CD20ScFv-L-CD19ScFv质粒经BamHI/MluI双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段备用。

pRRLsin-CD8-CD137-CD3ζ质粒经限制性内切酶BamHI/MluI酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶进行分离，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收载体片段备用。然后分别与回收的含有编码CD20ScFv-L-CD19ScFv的DNA片段通过T4DNA连接酶进行连接，具体方法见说明书。将连接产物转化Trans1-T1Phage Resistant化学感受态细胞，37℃培养16h后挑取单克隆，37℃，250rpm培养12h后，用质粒小提试剂盒提取质粒。提取的质粒分别经限制性内切酶BamHI/MluI和BamHI/SalI双酶切鉴定，鉴定结果如图2所示，其中，M1：DNA分子量标记D15000；1泳道：质粒pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8a-CD137-CD3ζ；2永道：质粒pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8a-CD137-CD3ζ的BamHI/MluI酶切片段；3泳道：pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8a-CD137-CD3ζ的BamHI/SalI酶切片段；M2：DNA分子量标记D2000。将鉴定正确的质粒送北京天一辉远生物科技有限公司对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的慢病毒表达载体命名为pRRLsin-CAR20-19(包括抗CD20ScFv-L-CD19ScFv融合抗体、CD8的铰链区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域)，如图1-1所示，其中，该嵌合抗原受体以基因CD8的铰链区和跨膜区及CD137和CD3ζ的胞内信号结构域串联而成的结构为信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO.11所示，对应的基因编码序列如SEQID NO.12所示。

按照如上的方法制备慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19(包括抗CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域)和pRRLsin-CAR20(包括抗CD20ScFv、CD8的铰链区和跨膜区及CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域)，结果分别如图1-2和1-3所示。

实施例3

本实施例用于说明嵌合抗原受体修饰的T细胞的制备

(1)慢病毒的包装

用分光光度计分别测定慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20-19、慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19、慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20和辅助质粒psPAX2、pMD2.G的浓度，慢病毒表达载体、辅助质粒psPAX2、pMD2.G分别以4:2:1的质量比用Lipofectamine^TM2000Transfection Reagent转染试剂共转染293T包装细胞。分别在转染48h、72h时收集病毒，用4.5μm滤器过滤收集病毒上清。即得嵌合抗原受体修饰的病毒原液，即，病毒原液CAR20-19(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20-19)、病毒原液CAR19(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19)、病毒原液CAR20(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20)，按每管500μL进行分装，-80℃保存备用。

(2)慢病毒感染T细胞及感染后细胞的扩增培养

在6mlPBS中混合60μL retroNectin，形成包被液，加入12孔板中进行包被，每孔500ml溶液，37℃放置1h；之后弃12孔板中中包被液，PBS洗两遍，X-VIVO 15^TM洗一遍，得到包被的12孔板。

取实施例1的在75cm²培养瓶中培养的5×10⁵个T细胞，弃掉旧的培养液，加入500μL新鲜T细胞培养液、300U/mL的重组人白介素2、500μL步骤(1)得到的病毒原液，8μg/mLPolybrene添加至如上的包被的12孔板中，置于37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中感染12小时后，弃培养液，将感染后的细胞转至未进行任何包被的6孔板中，加入新鲜的T细胞培养液，300U/mL的重组人白介素2，使T细胞的浓度为1×10⁶/ml，于37℃、饱和湿度为5％的CO₂培养箱中继续培养，得到的T细胞称为双靶CAR T细胞，即，CART20-19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20-19)、单靶CAR T细胞，分别为CART19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19)、CART20细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20)。

(3)CART细胞感染效率及表型的检测

培养第三天未感染T细胞和感染T细胞各取500μl，离心弃上清；PBS洗涤细胞2次，离心弃上清后加入100μlPBS，并分别加入表型检测的流式抗体(CD3、CD4、CD8)，记忆表型检测的流式抗体(CD3、CD62L、CD45RA)及感染效率检测的流式抗体(Fab)，用流式细胞术检测细胞表型和病毒感染效率。细胞表型分析结果图3(图3-1为未感染T细胞，图3-2为感染CAR19的T细胞、图3-3为感染CAR20的T细胞、图3-4为感染CAR20-19的T细胞)。T细胞表型：CD3：96.09％，CD3CD4:42.56％,CD3CD8:53.44％；CAR19-T细胞表型：CD3：96.00％，CD3CD4:37.49％CD3CD8:58.38％；CAR20-T细胞表型：CD3：96.43％，CD3CD4:39.51％,CD3CD8:55.98％；CAR20-19-T细胞表型：CD3：97.04％，CD3CD4:35.77％,CD3CD8:59.04％。记忆细胞表型分析结果图4(NT代表未感染T细胞)。感染效率检测的结果如图5所示，CAR20-19为54.9％、pRRLsin-CAR19为54.8％和pRRLsin-CAR20为46％。结果显示慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20-19，慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19，慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20的感染对T细胞的表型未造成影响，对记忆T细胞的百分比也未造成影响，尤其是中枢记忆T细胞的百分比未发生变化。

实施例4

CART20-19细胞对人肿瘤细胞杀伤活性分析

(1)LDH法检测杀伤活性检测

按照LDH法检测说明书，分别取实施例3中制备的CART20-19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20-19)、CART19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19)、CART20细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20)和实施例1中培养的T效应细胞与靶细胞(仅表达CD20的Raji细胞(敲除CD19，记为Raji19KO)、仅表达CD19的Raji细胞(敲除CD20，记为Raji20KO)、同时表达CD19和CD20的Raji细胞和K562细胞)按照1:1和0.1：1的效靶比加入到96孔板中，于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中相互作用48小时后，分别取50μl上清于新的96孔板中，每孔均加入50μl配好的底物。用铝箔纸覆盖板子使之避光，室温孵育30分钟，每孔加入50μl中止液，在490nm测量吸光值(每个实验和对照组都设三个重复孔)。％靶细胞毒性＝(实验-效应细胞自发-靶细胞自发)/(靶细胞最大-靶细胞自发)×100。其中，效应细胞杀伤靶细胞活性的结果如图6(效靶比1:1结果如图6-1所示，效靶比为0.1:1结果如图6-2所示)所示，结果显示CART20-19细胞对表达CD19和CD20的Raji细胞均具有特异杀伤活性，而对不表达CD19的慢性粒细胞白血病细胞K562细胞(不表达CD19和CD20)无特异的杀伤活性。对比发现CART20-19细胞对CD19阳性肿瘤细胞的杀伤活性强于CART19细胞和CART20细胞，同时CART20-19细胞对CD20阳性肿瘤细胞的杀伤活性强于CART19细胞和CART20细胞，说明CART20-19细胞具有更强的肿瘤杀伤活性。

(2)ELISA检测细胞因子

由于效应细胞杀伤肿瘤依赖于释放的细胞因子，进一步对效应细胞释放的细胞因子进行检测。

分别取实施例3中制备的CART20-19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20-19)、CART19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19)、CART20细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20)和实施例1中培养的T效应细胞与靶细胞(同时表达CD19和CD20的Raji细胞和K562细胞)按照1:1和0.1：1的效靶比加入到96孔板中，于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中相互作用48小时后，收集上清并离心。按照IL2，IFN-γ，TNFα的ELISA试剂盒说明书分别检测上述上清中细胞因子的水平。如图7所示(效靶比1:1如图7-1，效靶比0.1:1，图7-2)，CART20-19细胞释放的细胞因子水平明显高于CAR19T，CAR20T及T细胞，证实了CART20-19细胞的高效杀瘤活性。

实施例5

RTCA动态检测CAR T细胞杀伤活性

利用CART20-19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20-19)、CART19细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR19)、CART20细胞(慢病毒表达载体pRRLsin-CAR20)及同时表达CD19和CD20的Raji细胞来检测感染T细胞介导的细胞杀伤活性。在96孔E-Plates的每个孔中接种5,000个同时表达CD19和CD20的Raji细胞作为靶细胞，RTCA系统每小时记录生长期，直到22h后细胞达到生长期。分别以效靶比(效应细胞：靶细胞)1:1或1:10加入上述T细胞，CART19细胞，CAR20T细胞，CART20-19细胞作为效应细胞，动态检测效应细胞对靶细胞的杀伤过程。其中效靶比为1:1的杀伤结果见图8-1所示，效靶比为1:10的结果见图8-2所示。由图可以看出，本发明的CART20-19细胞对靶细胞具有更强的杀伤活性。

实施例6

本发明的CART20-19细胞对非霍奇金淋巴瘤(PB)患者治疗效果

取CART20-19细胞，经过100ml生理盐水稀释后，静脉回输到非霍奇金淋巴瘤患者(在利用本发明的CAR20-19T细胞进行靶向免疫治疗前，已经过多次治疗(如放疗、化疗及其他药物对症治疗等)，但均无明显疗效)体内，其中患者1回输剂量为1×10⁶/kg、患者2回输剂量为3×10⁶/kg；患者1在第一次回输后200天进行同计量的2次回输，回输后对患者的治疗状况进行评估。

结果显示患者1，青年女性，诊断明确非霍奇金淋巴瘤弥漫大B细胞型IV期A，病程3年余。既往经11疗程化疗及自体造血干细胞移植治疗。患者疾病复发，查病理提示CD19(+)，CD20(+)。与经CART19-20细胞治疗。首次治疗后，患者疾病大部分缓解(PR)，CART20-19细胞在患者可以正常的扩增(图9-1)。外周血表达CD19和或表达CD20的细胞显著下降(图10-1)。疾病稳定6月余。患者外周血提示B细胞恢复后，我们进行了第二次CART19-20细胞回输。第二次治疗后，患者达完全缓解(CR)(图11-1)。治疗期间未见明显不良反应。

患者2，青年女性，诊断非霍奇金淋巴瘤滤泡细胞性III期B。患者病程10年余。患者经20余疗程及自体造血干细胞移植，疾病反复复发。就诊时，颈部大包块，直径约10cm左右。经CART19-20细胞治疗后，CART20-19细胞在患者可以正常的扩增(图9-2)，外周血表达CD19和或表达CD20的细胞显著下降(图10-2)，CART19-20细胞治疗后疾病达完全缓解(图11-2)。证实CAR T 20-19细胞具有良好的肿瘤治疗效果。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军总医院

<120> 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、CD19-CD20双靶向性的T细胞及其应用

<130> I53166RMJ

<160> 18

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 737

<212> PRT

<213> 嵌合抗原受体CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ

<400> 1

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met

20 25 30

Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu

115 120 125

Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met

130 135 140

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His Trp

145 150 155 160

Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Tyr

165 170 175

Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala

180 185 190

Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser

195 200 205

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asn

210 215 220

Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr

225 230 235 240

Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu

260 265 270

Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys

275 280 285

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

290 295 300

Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser

305 310 315 320

Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile

325 330 335

Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

340 345 350

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

355 360 365

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val

370 375 380

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

385 390 395 400

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu

405 410 415

Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys

420 425 430

Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu

435 440 445

Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

450 455 460

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu

465 470 475 480

Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro

485 490 495

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Thr Arg Thr Thr

500 505 510

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

515 520 525

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

530 535 540

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

545 550 555 560

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

565 570 575

Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe

580 585 590

Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly

595 600 605

Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Glu

610 615 620

Phe Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

625 630 635 640

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

645 650 655

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

660 665 670

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

690 695 700

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

705 710 715 720

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

725 730 735

Arg

<210> 2

<211> 2214

<212> DNA

<213> 嵌合抗原受体CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ

<400> 2

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccaggt 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360

ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 660

gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 720

acggtcaccg tctcctcagg tggaggcggc agtggcggag gtgggagcgg agggggcggt 780

tccggtggcg ggggatctga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 840

tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 900

agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 960

gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 1020

aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 1080

tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg tcaaggaacc 1140

tcagtcaccg tctcctcagg tggaggcggt tcaggcggag gtggctctgg cggtggcgga 1200

tcggacatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 1260

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 1320

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 1380

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 1440

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 1500

ggggggacta agttggaaat aacaacgcgt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 1560

ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 1620

gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 1680

cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaga 1740

tctaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta 1800

caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga 1860

tgtgaactgg aattcagagt gaagttcagc aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag 1920

ggccagaacc agctctataa cgagctcaat ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg 1980

gacaagagac gtggccggga ccctgagatg gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag 2040

gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat aagatggcgg aggcctacag tgagattggg 2100

atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca 2160

gccaccaagg acacctacga cgcccttcac atgcaggccc tgccccctcg ctaa 2214

<210> 3

<211> 60

<212> DNA

<213> 连接子L

<400> 3

ggtggaggcg gcagtggcgg aggtgggagc ggagggggcg gttccggtgg cgggggatct 60

<210> 4

<211> 227

<212> DNA

<213> CD8的hinge区和跨膜区

<400> 4

gatcacgcgt accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc 60

gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac 120

gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg 180

ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaga tctgatc 227

<210> 5

<211> 146

<212> DNA

<213> CD137的胞内信号结构域

<400> 5

gatcagatct aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag 60

accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga 120

aggaggatgt gaactggaat tcgatc 146

<210> 6

<211> 359

<212> DNA

<213> CD3ζ的胞内信号结构域

<400> 6

gatcgaattc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca 60

gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa 120

gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg 180

cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa 240

aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac 300

caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaag tcgacgatc 359

<210> 7

<211> 1599

<212> DNA

<213> CD8a信号肽和CD20ScFv-L-CD19ScFv融合基因

<400> 7

ggatccgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccggacat tgtgctgacc caatctccag ctatcctgtc tgcatctcca 120

ggggagaagg tcacaatgac ttgcagggcc agctcaagtg taaattacat ggactggtac 180

cagaagaagc caggttcctc ccccaaaccc tggatttatg ccacatccaa cctggcttct 240

ggagtccctg ctcgcttcag tggcagtggg tctgggacct cttactctct cacaatcagc 300

agagtggagg ctgaagatgc tgccacttat tactgccagc agtggagttt taatccaccc 360

acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaaggcagta ctagcggtgg tggctccggg 420

ggcggttccg gtgggggcgg cagcagcgag gtgcagctgc agcagtctgg ggctgagctg 480

gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt 540

tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct ggacagggcc tggaatggat tggagctatt 600

tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat cagaagttca aaggcaaggc cacattgact 660

gcagacaaat cctccagcac agcctacatg cagctcagca gcctgacatc tgaggactct 720

gcggactatt actgtgcaag atctaattat tacggtagta gctactggtt cttcgatgtc 780

tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tcaggtggag gcggcagtgg cggaggtggg 840

agcggagggg gcggttccgg tggcggggga tctgaggtga aactgcagga gtcaggacct 900

ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta 960

cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag cctccacgaa agggtctgga gtggctggga 1020

gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat aattcagctc tcaaatccag actgaccatc 1080

atcaaggaca actccaagag ccaagttttc ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac 1140

acagccattt actactgtgc caaacattat tactacggtg gtagctatgc tatggactac 1200

tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcaggtggag gcggttcagg cggaggtggc 1260

tctggcggtg gcggatcgga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 1320

ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 1380

tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 1440

cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 1500

attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 1560

ccgtacacgt tcggaggggg gactaagttg gaaataaca 1599

<210> 8

<211> 75

<212> DNA

<213> CD8a信号肽

<400> 8

ggatccgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccg 75

<210> 9

<211> 726

<212> DNA

<213> CD19ScFv

<400> 9

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

ggtggaggcg gttcaggcgg aggtggctct ggcggtggcg gatcggacat ccagatgaca 420

cagactacat cctccctgtc tgcctctctg ggagacagag tcaccatcag ttgcagggca 480

agtcaggaca ttagtaaata tttaaattgg tatcagcaga aaccagatgg aactgttaaa 540

ctcctgatct accatacatc aagattacac tcaggagtcc catcaaggtt cagtggcagt 600

gggtctggaa cagattattc tctcaccatt agcaacctgg agcaagaaga tattgccact 660

tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg tacacgttcg gaggggggac taagttggaa 720

ataaca 726

<210> 10

<211> 738

<212> DNA

<213> CD20ScFv

<400> 10

gacattgtgc tgacccaatc tccagctatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60

atgacttgca gggccagctc aagtgtaaat tacatggact ggtaccagaa gaagccaggt 120

tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagagt ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agttttaatc cacccacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaagg cagtactagc ggtggtggct ccgggggcgg ttccggtggg 360

ggcggcagca gcgaggtgca gctgcagcag tctggggctg agctggtgaa gcctggggcc 420

tcagtgaaga tgtcctgcaa ggcttctggc tacacattta ccagttacaa tatgcactgg 480

gtaaagcaga cacctggaca gggcctggaa tggattggag ctatttatcc aggaaatggt 540

gatacttcct acaatcagaa gttcaaaggc aaggccacat tgactgcaga caaatcctcc 600

agcacagcct acatgcagct cagcagcctg acatctgagg actctgcgga ctattactgt 660

gcaagatcta attattacgg tagtagctac tggttcttcg atgtctgggg cgcagggacc 720

acggtcaccg tctcctca 738

<210> 11

<211> 229

<212> PRT

<213> 信号传导结构域

<400> 11

Thr Arg Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

1 5 10 15

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

20 25 30

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

35 40 45

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

50 55 60

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu

65 70 75 80

Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln

85 90 95

Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly

100 105 110

Cys Glu Leu Glu Phe Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

115 120 125

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

130 135 140

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

145 150 155 160

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

165 170 175

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

180 185 190

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

195 200 205

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

210 215 220

Ala Leu Pro Pro Arg

225

<210> 12

<211> 690

<212> DNA

<213> 信号传导结构域

<400> 12

acgcgtacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 60

cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120

gggctggact tcgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 180

cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcagatcta aacggggcag aaagaaactc 240

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 300

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactggaatt cagagtgaag 360

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 420

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 480

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 540

aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 600

aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 660

cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 690

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列引物P1

<400> 13

gatcacgcgt accacgacgc cagcgccgcg 30

<210> 14

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列引物P2

<400> 14

gatcagatct gcagtaaagg gtgataacca gtga 34

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列引物P3

<400> 15

gatcagatct aaacggggca gaaagaaact cc 32

<210> 16

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列引物P4

<400> 16

gatcgaattc cagttcacat cctccttctt cttct 35

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列引物P5

<400> 17

gatcgaattc agagtgaagt tcagcaggag cg 32

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列引物P6

<400> 18

gatcgtcgac ttagcgaggg ggcagggcct 30

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，包括依次串联的CD20ScFv、连接肽L、CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述连接肽L具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

4.编码权利要求1-3中任意一项所述的嵌合抗原受体的基因；

优选的，编码所述嵌合抗原受体的基因具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

5.含有权利要求4所述的基因的重组表达载体；

优选的，所述重组表达载体为慢病毒表达载体；

优选的，所述慢病毒表达载体为pRRLsin-CD20ScFv-L-CD19ScFv-CD8-CD137-CD3ζ。

6.一种工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞，其特征在于，所述T细胞是由权利要求1-3中任意一项所述的嵌合抗原受体修饰的T细胞。

7.权利要求6所述的工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：

包装携带权利要求5所述的重组表达载体的慢病毒，得到病毒原液；利用得到的病毒原液感染T细胞，使T细胞表达嵌合抗原受体。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述T细胞的制备方法包括：

(1)在CD3单克隆抗体、白介素-2、重组人纤维蛋白和血清的存在下，将单个T细胞进行第一阶段培养；

优选地，所述第一阶段培养的方法包括：将单个T细胞与第一T细胞培养液混合，并将得到的混合液在包被有重组人纤维蛋白和CD3单克隆抗体的培养容器中进行培养，所述第一T细胞培养液含有T细胞培养液、白介素-2和血清；

进一步优选地，在第一T细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为250-350U/mL，血清的浓度为0.4-0.6体积％；

(2)在白介素-2的存在下，将所述第一阶段培养的细胞进行第二阶段培养；

优选地，所述第二阶段培养的方法包括：将第一阶段培养的细胞与第二T细胞培养液混合，并将得到的混合液在包被有重组人纤维蛋白的培养容器中进行培养，所述第二T细胞培养液含有T细胞培养液和白介素-2；

进一步优选地，在第二T细胞培养液中，所述白介素-2的浓度为250-350U/mL。

9.根据权利要求6所述的方法，其中，所述感染T细胞的方法包括：

(1)在病毒原液、聚凝胺、白介素-2和重组人纤维蛋白存在下，将T细胞进行第一阶段感染培养；

优选地，所述第一阶段感染培养的方法包括：将T细胞与第三T细胞培养液混合，并将得到的混合液在包被有重组人纤维蛋白的容器中进行感染培养，所述第三T细胞培养液含有T细胞培养液和病毒原液；

进一步优选地，第三T细胞培养液中，所述T细胞的浓度为3×10⁵-8×10⁵个，白介素-2的浓度为250-350U/mL，聚凝胺的浓度为0.3-1.0μg/mL；

(2)在白介素-2下，将所述第一阶段感染培养的细胞进行第二阶段感染培养；

优选地，所述第二阶段感染培养的方法包括：将所述第一阶段感染培养的细胞培养于所述T细胞培养液中，所述T细胞培养液中白介素-2的浓度为250-350U/mL。

10.权利要求6所述的工程化CD19和CD20双靶向性的T细胞在制备用于治疗B细胞系恶性血液系统肿瘤的制剂中的应用；