CN105960413A - 人工dna-结合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及由人工DNA‑结合结构域(DBD)和相关分子组成的蛋白质及其用途。具体地，该蛋白质是ZF‑DBD或TALE‑DBD并且用于治疗由于功能获得突变导致的眼部疾病。该疾病可以是ADRP，具体是由视紫红质基因突变导致的ADRP。本发明还涉及鉴定顺式调节元件以及通过DBD调节它们的方法。

Description

人工DNA-结合蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及由人工DNA-结合结构域(DBD)和相关分子组成的蛋白质及其用途。具体地，该蛋白质是ZF-DBD或TALE-DBD，并且用于治疗由于功能获得突变导致的眼部疾病。该疾病可以是ADRP，具体是由视紫红质基因突变导致的ADRP。本发明还涉及鉴定顺式调节元件的方法。
背景技术
从基因组序列中提取生物信息内容仍然是具有挑战性的。除了进化中保守的DNA-序列基序以外，预测在特定DNA序列中体现的顺式调节模块/元件(CRM/CRE，即一段DNA，其中多个效应/转录因子可结合并调节周围基因的表达)并且理解它们的功能仍然是一个具有挑战性的任务。此外，现有的DNA序列功能模型一般不能提取CRM序列的特殊性质。CRM序列的特殊性质部分由ENCODE项目揭示，其提供对CRM和基因调节的关键洞见。新方案正显示CRM之间物理联系的结构和染色体上的空间分步在基因调节中起到关键作用。事实上，基因调节根本上是一种动态过程，涉及基因组DNA和核蛋白器之间的组合相互作用。显而易见的是特定CRE的衔接决定细胞类型选择性DNA调节转录网络。因此，出现的情况是，基因调节(而非功能)必须进化以使调节的替代性选择与特定基因相关，并且这进而产生个体内和个体间以及物种间的多样性。因此，通过在基因组调节区CRE中含有的调节组合性质来生成细胞特异性多样性，最后调节基因集(genes set)。
DNA元件百科全书(ENCODE)联盟是由国家人类基因组研究所资助的研究组国际协作。ENCODE的目标是构建人类基因组中功能性元件的详细部分列表，包括在蛋白质和RNA水平上作用的元件，以及控制细胞的调节元件和使基因有活性的环境。然而，广为人知的是同一DNA元件可被不同细胞环境中不同(一般相关)的转录因子识别，具有替代性的功能后果。另外，作者现在知晓许多ENCODE-定义的元件的生物化学特征(signature)显示出复杂的跨细胞活性模式(ENCODE项目联盟.2012.An integrated encyclopedia of DNA elementsin the human genome(人类基因组中DNA元件的整合百科全书)Nature.2012年9月6日；489(7414)：57-74.doi：10.1038/nature11247；Thurman等.2012.The accessible chromatinlandscape of the human genome(人类基因组的可及染色质相图).Nature.2012年9月6日；489(7414)：75-82.doi：10.1038/nature11232)，其可以伴随着功能性质，如与不同目标基因相互作用的增强子(Santos-Rosa等.2002Active genes are tri-methylated at K4of histone H3(活化蛋白在组蛋白H3的K4处三甲基化).Nature 419：407-411；Sanyal等.2012.The long-range interaction landscape of gene promoters(基因启动子的长程相互作用相图).Nature.2012年9月6日；489(7414)：109-13.doi：10.1038/nature11279；Thurman等.2012 The accessible chromatin landscape of the human genome(人类基因组的可及染色质相图).Nature.2012年9月6日；489(7414)：75-82.doi：10.1038/nature11232)。总之，这些观察表明，事实上，基因组可被广泛多重编码，即同一DNA元件在不同细胞类型中产生不同的活性。由ENCODE揭示的远端调节DNA中明显的交叉细胞类型调节模式(Song等.2011 Open chromatin defined by DNase I and FAIRE identifiesregulatory elements that shape cell-type identity(由DNA酶I和FAIRE定义的开放染色质鉴定形成细胞类型相同性的调节元件).Genome Res 21：1757-1767；Thurman等.2012The accessible chromatin landscape of the human genome(人类基因组的可及染色质相图).Nature.2012年9月6日；489(7414)：75-82.doi：10.1038/nature11232)表明巨大的异质性和功能多样性。
上述考虑表明DNA-结合蛋白的蛋白质组成并非唯一地结合至相同细胞类型中的同一DNA元件。相反，同一DNA元件在不同细胞类型中产生不同活性。
因此，顺式调节元件和反式元件之间的界面和相互作用强烈依赖于精细独特细胞亚型环境中的顺式调节元件和对应特定细胞亚型而改变的反式结合元件性质(生物化学性质)(Stamatoyannopoulos JA.Genome Res.2012年9月；22(9)：1602-11)。
显性遗传的遗传疾病的基因治疗比隐性疾病的基于基因的治疗更难，后者可用基因补充来治疗。显性疾病的治疗需要基因补充伴随通过DNA水平的基因修复，或通过RNA水平的RNA干扰或转录抑制的对于突变基因的表达抑制。
遗传沉默策略的主要目标是信使RNA(mRNA)转录物，其功能可受到基于反义-RNA、基于核酶和最近采用的基于小干扰(si)RNA和微小(mi)RNA的方法的抑制。具体地，RNA干扰(RNAi)对于以突变依赖和独立方式治疗显性疾病而言有很好的前景，利用其mRNA转录物切割的效率(LaVail等.2000 PNAS USA 97：11488-11493；Lewin等.1998 Nat Med 4：967-971；O’Reilly等.2007 Am J Hum Genet 81：127-135；Xia等.2004 Nat Med 10：816-820)。无论如何，研究已经显示高水平的siRNA可通过多种机制导致细胞毒性(Boudreau等，2009；Grimm等，2006)。
这类RNA-靶向方法的可能替代是通过使用基于锌指(ZF)的人工转录因子(ZF-ATF)在转录水平调节基因表达，该人工转录因子可经调整适应所需的DNA目标序列。这类人工ZF蛋白(也称为ZFP)正成为基因操作和治疗方法开发的新型和强力技术平台(Jamieson等.2003 Nat Rev Drug Discov 2：361-368；Pearson 2008 Nature 455：160-164；Segal和Barbas 2001 Curr Opin Biotechnol 12：632-637)。人工ZFP包含DNA-结合结构域(DBD，即独立折叠的蛋白质结构域，其含识别双链或单链DNA的至少一个基序。DBD可识别特异性DNA序列(识别序列)或对DNA有一般亲和性)，其基于与转录调节结构域(如激活子或抑制子)融合的Cys2His2 ZF支架。它们的模块结构允许同时依次组装多个ZF以生成具有不同目标特异性的DBD和使用各种效应结构域来对ATF或核酸酶进行工程改造。
迄今为止，已经生成了几种功能性ZF-ATF来体外和体内调节目标基因表达(Mattei等.2007 PLOS One 2：e774；Rebar等.2002 Nat Med 8：1427-1432)。Mussolino等能够证明在ADRP小鼠模型中通过载体介导的体基因转移体内沉默人疾病基因视紫红质(hRHO)归功于包含抑制子结构域的ZF(Mussolino等.2011 EMBO Mol Med 3：118-128)。WO2012106725涉及包含工程改造的DNA结合结构域和功能结构域的融合蛋白，其中该蛋白结合至少一个内源性视紫红质等位基因中的目标位点，并且调节该至少一个内源性视紫红质等位基因的表达。该文献公开了包括核酸酶作为效应结构域的靶向视紫红质的锌指蛋白。这类蛋白质识别视紫红质基因的特异性目标序列。这类序列对应于特异性核酸酶的剪切位点并且位于特异性RHO突变附近。因此，各所述锌指蛋白仅作用于可由ZFN-驱动的DNA修复改性的视紫红质的特定突变上。
类似地，可使用人工TAL(转录激活物样)效应蛋白(通常称为TALE)。它们包含可通过中央重复结构域识别DNA序列的DBD，该中央重复结构域包含与转录调节结构域(如激活子或抑制子)融合的变化数量的约34个氨基酸重复。目标序列中的各DNA碱基和各重复中2个关键氨基酸的相同性之间似乎存在一一对应。多个工作组已经设计出能够在多个实验系统中识别新DNA序列的人工TAL效应物。这类工程改造的TAL效应物已经用于同样地在人类系统中产生可用于靶向并激活或抑制内源性基因的人工转录因子(Miller等.(2010).″ATALE nuclease architecture for efficient genome editing(高效基因组编辑的TALE核酸酶结构)″.Nature Biotechnology 29(2)：143-148；Cong等.″Comprehensiveinterrogation of natural TALE DNA-binding modules and transcriptionalrepressor domains(天然TALE DNA-结合模块和转录抑制子结构域的全面解调)″.NatureCommunications.968 3；Zhang等.(2011).″Efficient construction of sequence-specific TAL effectors for modulating mammalian transcription(用于调节哺乳动物转录的序列特异性TAL效应物的高效构建)″.Nature Biotechnology 29(2)：149)。
常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)是人类中最具有遗传异质性的遗传疾病：超过30种基因和许多不同的突变，仅在视紫红质上有超过100种突变，已与视网膜色素变性相关联。视网膜色素变性的显性形式包括分子上易于发生功能获得突变的那些或单倍体不足(aplo-insufficiency)或显性负面效应的那些。这种遗传异质性与变性的程度和速率差异相关。占所有视网膜色素变性病例的30％-40％，常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)是24种已知基因(表1)中突变的结果(Rossmiller等.Molecular Vision 2012；18：2479-2496)。不论导致ADRP的基因的范围，大约30％的ADRP来自视紫红质基因中的突变，因此作者着重于治疗影响视紫红质基因的突变。
表1：导致ADRP的已知基因和相关蛋白质名称。参考RetNet：https：//sph.uth.edu/retnet/。
目前，还没有对ADRP的有效治疗。特征是维生素A或维生素A加二十二碳六烯酸的营养治疗在一些患者中降低了变性速率。功能为分子伴侣的视网膜类似物和药物显示在动物模型中保护视网膜的一些进展，并且几个抗氧化剂研究已经显示脂溶性抗氧化剂牛磺脱氧胆酸(TUDCA)、金属复合物锌去铁敏(metallocomplex zinc desferrioxamine)、N-乙酰基-半胱氨酸，和抗氧化剂的混合物在啮齿类rd1、rd10，和Q344ter模型中延缓了视网膜变性。已经开始并着手进行临床试验来测试蛋白质去乙酰化酶抑制剂丙戊酸作为视网膜色素变性治疗的功效。丙戊酸阻断T-型钙通道和电压门控的钠通道，并且与明显的副作用(如听力损失和腹泻)相关。因此，使用丙戊酸作为视网膜色素变性治疗已经受到质疑(Rossmiller等.Molecular Vision 2012；18：2479-2496)。
发明内容
在本发明中，作者生成了新型功能性DNA结合结构域，并且，通过将其与之前描述的还包括抑制子结构域的系统相比，并功能性地评估2个动物物种中健康和患病视网膜感光体细胞特异性亚型上的转录输出和生理和病理结果而出乎预料地确定了这种分离的结构域的新性质。另外，作者还研究了在感光体细胞特异性亚型中改变DNA目标位点上的顺式作用元件的结果。
具体地，在该研究中，作者证明，当通过体基因转移至视网膜-视杆感光体时，靶向人视紫红质(RHO)近端启动子的20碱基对(bp)长的序列的人工DNA-结合结构域(ZF6-DBD)本身能阻断视紫红质表达。与天然转录因子(TF)不同，这种人工DNA-结合结构域缺少效应结构域，因此，这种ZF6-DBD令人惊讶地由于其DNA-结合性质本身而产生了转录沉默。
在此，作者证明仅ZF-DBD，没有其他功能性结构域如抑制子结构域，能够令人惊讶地在2种不同的动物设定(小鼠和猪)中抑制人类疾病基因视紫红质。本发明是一个示例，并且也可应用于其他DNA结合结构域，例如，其他锌指和TAL衍生的DNA结合结构域以及RNA-导向的DNA-结合结构域(Crispr/cas 9)。
这些令人惊讶的结果对于显性遗传的遗传性眼病，尤其是常染色体显性视网膜色素变性有明显有益的效果。具体地，从人工DNA-结合蛋白融除效应结构域生成具有不同性质(与包含DNA-结合结构域和效应结构域的完整蛋白质，即KRAB相比)的蛋白质，其反映在不同的功能结果上，这些包括：
1-当通过腺相关病毒(AAV)载体递送至常染色体显性视网膜色素变性(adRP)的小鼠模型的感光体时视网膜功能的更高恢复(图3)，
2-当在不同时间点通过AAV载体递送至adRP的小鼠模型的感光体时视网膜功能的更高恢复(图6)，
3-当通过腺相关病毒(AAV)载体递送至2个物种(小鼠和猪)的感光体时更高的视紫红质转录下调(图4和8)，
4-当在不同时间点通过腺相关病毒(AAV)载体递送至2个物种(小鼠和猪)的感光体时更高的视紫红质转录下调(图4、8、12)，
5-没有潜在副作用(没有脱靶；没有Arr3减少，图8)；
6-良好的载体产率(改善的蛋白质生产)，尤其是腺相关病毒载体，更具体地是AAV8-CMV系统(图14)。
天然转录因子(TF)同时具有DBD和效应结构域，其通过蛋白质-蛋白质相互作用吸引多种其他蛋白质，这可最终导致转录抑制或转录激活。转录抑制和转录激活生成细胞特异性信号转导，包括全细胞特异性转录组图(whole cell-specific transcriptome map)。相反，人工DBD是外部的并且独立于调节网络的拓扑结构(它们如实施例中那样被CMV启动子驱动并且它们不通过蛋白质-蛋白质调节图相连)并且在转录上独立于内源性细胞特异性调节代码(全细胞特异性转录组图)。事实上，天然TF本身属于细胞特异性转录组图，即调节子的调节子，因此它们受到其他细胞特异性TF设定的精细调节，其通过结合至TF结合位点控制转录激活或抑制，最终产生细胞特异性功能。
本发明的数据表明，新型短(20bp)顺式作用DNA序列(顺式调节元件，CRE)在进化中并不完全保守，其不是增强子，但可明显控制RHO水平。这些结果支持了DNA目标顺式作用元件本身(除了结合蛋白质的活性以外)含有RHO表达的关键信息内容。
关于顺式作用DNA目标序列，观察到：
1-当在合适的特异性细胞亚型环境中用AAV载体表达时，DNA目标的位点特异性融除导致转基因表达的明显下降(图19)，
2-当在合适的特异性细胞亚型环境中用AAV载体表达时，DNA目标的位点特异性诱变导致转基因表达的明显下降(图20)。
然后，作者提出2步抑制-替换策略：(i)通过ZF-DBD的人视紫红质基因的突变非依赖沉默(靶向野生型和突变的RHO等位基因的转录沉默)；和任选的(ii)通过载体介导的感光体外源基因转移的内源性RHO拷贝的基因替换。
所提出的该方案的可行性基于以下考虑：
(i)作者已经证明ZF-DBD递送下调RHO基因转录水平的优越能力，其表示该策略中的主要限制步骤；(ii)治疗水平的转录沉默导致表型改善；
(iii)作者已经证明与包含DNA结合结构域和功能性结构域的蛋白质相比，ZF-DBD递送的优越安全性(具体由于更少的脱靶效应)；
(iv)能够将沉默和替换构建体整合到同一载体中。
事实上，整合ZF-DBD和替换基因的载体将确保它们在同一转导的感光体中同时作用，例如，使用允许协调表达2种转基因的双向启动子。
本发明提供了一种由DNA结合结构域组成的蛋白质，该DNA结合结构域靶向选自下组的基因的DNA调节序列：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2、RP33。
优选地，DNA调节序列的靶向诱导对所述基因表达的抑制。
优选地，所述基因是突变形式或野生形式。所述基因的突变形式造成遗传眼病，优选常染色体显性遗传眼病，优选常染色体隐性遗传眼病。其可以是表1报告的基因中的任意突变。
在一个优选的实施方式中，基因是突变形式。
在一个优选的实施方式中，DNA结合结构域选自下组：锌指结构域、转录激活物样(TAL)DNA结合结构域或RNA-导向的DNA结合结构域或其功能性片段或其衍生物。
优选地，在所述基因的启动子区序列中包含DNA调节序列。
优选地，在RHO的启动子区序列中包含DNA调节序列。
更优选地，DNA调节序列包含选自下组的序列：GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ IDNo.22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQ ID No.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ IDNo.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID No.25)、GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQ ID No.26)、TGAACACCCCCAATCTCC(SEQ ID No.27)或GTGGGGGTTAGAGGGT(SEQ ID No.28)。
更优选地，DNA调节序列基本是选自下组的序列：GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ IDNo.22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQ ID No.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ IDNo.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID No.25)、GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQ ID No.26)、TGAACACCCCCAATCTCC(SEQ ID No.27)或GTGGGGGTTAGAGGGT(SEQ ID No.28)。
在一个优选的实施方式中，蛋白质基本由选自下组的序列组成：SEQ ID No.3、SEQID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17，或其片段或其衍生物。
本发明提供了编码上述蛋白质的核酸分子。
本发明提供了包含本发明的核酸分子的载体。
优选地，所述载体是病毒载体。优选地，该载体选自下组：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关载体(AAV)或裸质粒DNA载体。
在一个优选的实施方式中，所述载体还包括选自下组的基因的核苷酸序列：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33。
在一个优选的实施方式中，载体还包括视网膜特异性启动子，和任选的，调节序列。
优选地，视网膜特异性启动子是视紫红质激酶(RHOK)启动子或转导蛋白1(GNAT1)启动子，优选人转导蛋白1(GNAT1)启动子。
本发明提供了用本发明的载体转化的宿主细胞。
本发明提供了含本发明的载体的病毒颗粒。
本发明提供了包含上述蛋白质或核酸或含有上述载体的宿主细胞或病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本发明提供了包含上述载体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在本发明中，在药物组合物中可使用上述蛋白质、核酸、宿主细胞或载体的任意组合。
优选地，该组合物还包括包含选自下组的基因的核苷酸序列的载体：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33。
优选地，上述的本发明的蛋白质或核酸或载体或宿主细胞或病毒颗粒或药物组合物用于治疗常染色体显性遗传眼病和/或常染色体隐性遗传眼病。
具体地，BEST1、NR2E3、NRL、RHO、RP1、RPE65是导致常染色体显性和隐性遗传眼病，如常染色体显性视网膜色素变性和常染色体隐性视网膜色素变性的基因。
优选地，治疗是基因治疗。更优选地，常染色体显性遗传眼病是常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)或先天性静止性夜盲。更优选地，常染色体显性遗传眼病是常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)。
优选地，常染色体隐性遗传眼病是常染色体隐性视网膜色素变性。
本发明提供了用于治疗有此需要的对象中常染色体显性遗传眼部疾病或常染色体隐性遗传眼病的方法，所述方法包括给予合适量的上述的蛋白质或核酸或载体或宿主细胞或病毒或药物组合物。
本发明提供了鉴定靶向潜在DNA调节序列的DNA结合结构域的方法，包括：
a)生成2个独立构建体：
-包含在潜在DNA调节序列控制之下的报告基因序列的第一构建体；
-包含在已经突变的潜在DNA调节序列控制之下的报告基因序列的第二构建体；
b)在视网膜中体内表达步骤a)的各构建体；
c)比较在潜在DNA调节序列控制下的报告基因的表达与在突变的潜在DNA调节基因控制下的报告基因的表达；
其中，如果观察到与在潜在DNA调节序列控制下的报告基因的表达相比突变的潜在DNA调节序列控制下报告基因的表达减少，则潜在DNA调节序列是DNA调节序列并且由此鉴定到了DNA结合结构域；
d)任选地，设计靶向DNA调节序列的DNA结合蛋白。
本发明提供了由上述方法鉴定的靶向潜在DNA调节序列的DNA结合结构域。优选地，由上述方法鉴定的靶向潜在DNA调节序列的DNA结合结构域如上文定义。
在本发明中，通过唯一DNA-结合结构域的方式靶向DNA调节序列诱导了对感兴趣基因表达的抑制。术语抑制表示阻滞、降低、减少基因表达。
在本发明中，可通过给予单一载体来实现基因治疗，包括：
-一种编码DNA结合结构域的核酸分子，该DNA结合结构域靶向控制选自下组的基因表达的DNA调节序列：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33，
-选自下组的野生型基因的核酸分子：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33。
或者，可使用2种载体，其各自分别包含i)或ii)。
在本发明中，可基于所需效果和已知方法容易地确定待给予的剂量。优选地，本发明的分子或组合物在视网膜内给予。
本发明的递送载剂可给予患者。本领域技术人员能够确定适当的给药速率。术语“给予”包括通过病毒或非病毒技术递送。载体可以是，例如，质粒载体、mRNA载体(例如，体内转录的mRNA载体)或病毒载体。病毒递送机制包括但不限于上文所述腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、和杆状病毒载体、痘苗病毒、泡沫病毒、巨细胞病毒、塞姆利基森林病毒、痘病毒、RNA病毒载体和DNA病毒载体等，如上所述。此类病毒载体为本领域熟知。非病毒递送机制包括脂质介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质体转染试剂、阳离子表面两亲物(CFA)及其组合。
作为向细胞递送多核苷酸的替代，本发明的DBD可通过蛋白质转导递送至细胞。蛋白质转导，例如，可以通过载体递送或通过直接蛋白质递送来进行。
本发明还提供了用于治疗个体的药物组合物，其中该组合物包含治疗有效量的本发明的蛋白质/核酸/载体或宿主细胞或由其产生或获得的病毒颗粒。该药物组合物可用于人或动物用途。通常，医师都可确定对单个患者而言最适用的实际剂量且其会根据特定个体的年龄、体重和反应而变化。该组合物可任选包含药学上可接受的运载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用运载体、赋形剂或稀释剂的选择可基于指定的给药途径和标准药学实践。
除运载体、赋形剂或稀释剂外，该药物组合物还可包含任何合适的粘合剂、润滑剂、助悬剂、包衣剂、增溶剂和辅助或提高病毒进入靶位点的其他运载体试剂(例如脂质递送系统)。
适当时，药物组合物可通过以下任意一种或多种方式给予：吸入给予，以栓剂或阴道栓的形式给予，以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒粉的形式外用，使用皮肤贴片，以包含淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式口服给予，或单独或与赋形剂混合的胶囊或卵泡形式，以包含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或混悬剂形式给予，或者可以胃肠外注射给予，例如海绵体内、静脉内、肌内或皮下。在一个方面中，胃肠外给药途径可以是眼内给药。本发明的眼内给药可通过注射或直接(例如，局部)给药至眼来完成。除上述对眼给药的局部途径外，合适的眼内给药途径还包括玻璃体内、视网膜内、视网膜下、眼筋膜囊下、眼球周边和眼球后、跨角膜和跨巩膜给药。这类眼内给药途径是本领域公知常识。
对于胃肠外给药，这些组合物最好是无菌水溶液形式，可包含其他物质如足量的盐或单糖以使溶液与血液等渗。对于含服或舌下给药，这些组合物可以是采用常规方式配制的片剂或锭剂形式。
本领域技术人员应理解将多核苷酸或载体整合至宿主细胞内的标准方法，例如转染、脂质转染、电穿孔、微注射、病毒感染、热击、转化(细胞融合或细胞膜的化学通透后)。
本文中，术语“宿主细胞或遗传工程改造的宿主细胞”指使用本文所述构建体或载体转导、转化或转染的宿主细胞。
作为适当宿主细胞的代表性示例，可举例细菌细胞(如大肠杆菌、链霉菌属、鼠伤寒沙门氏菌)、真菌细胞(如酵母)、昆虫细胞(如Sf9)、动物细胞(如CHO或COS)、植物细胞等。本领域技术人员根据本文教导能够选择合适的宿主。优选地，所述宿主细胞是动物细胞，且更优选是人细胞。该宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞，即直接从生物体(如人)中分离。该宿主细胞可以是粘附性细胞或悬浮的细胞，即悬液形式生长的细胞。
给予治疗活性量的本发明的组合物或“有效量”定义为在一定剂量和作用时间下，有效于实现提高/降低蛋白质生成的所需结果的量。物质的治疗有效量可根据一些因素而变化，所述因素包含，例如疾病状态/健康、接受者的年龄、性别和体重、特定多肽、编码其的核酸或重组病毒引发所需应答的固有能力。可调节剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可每天或采取其它合适的时间间隔给予数个分开的剂量，或者该剂量可按治疗情况危急程度的指示按比例减少。例如，通常对于病毒载体给药，合适的剂量范围是108至1013vg(载体基因组)/眼。
本发明中使用的转录、突变非依赖性策略目标在于改善ZF的用途以克服开发针对常染色体显性遗传眼病中功能获得突变(gain-of function mutation)的有效治疗策略中的障碍。
“蛋白质结构域”是给定的蛋白质序列和结构的保守部分，其可独立于蛋白质链的其余部分进化、发挥功能和存在。各结构域形成紧密的三维结构并且通常可独立地稳定并折叠。许多蛋白质由几个结构结构域组成。分子进化使用结构域作为建造模块并且这些可以不同的排列重组以产生具有不同功能的蛋白质。结构域的长度在约25个氨基酸至500个氨基酸之间变化。因为它们是独立稳定的，结构域可通过在一个蛋白质和另一个之间的遗传工程改造“交换”以制备嵌合蛋白质。
“DNA-结合结构域”(DBD)是独立折叠的蛋白质结构域，其含有识别双链或单链DNA的至少一个基序。DBD可识别特异性DNA序列(识别或调节序列)或具有对DNA的一般亲和性。一个或多个DNA-结合结构域通常是所谓的DNA结合蛋白(即由其他不同功能的结构域组成的较大蛋白质)的部分。其他结构域通常调节DNA-结合结构域的活性。DNA结合的功能是结构性的或包括转录调节，这2种作用有时重叠。
在本发明中，DNA结合结构域可以是锌指结构域(ZF结构域)或转录激活物样DNA结合结构域(TAL结构域)或RNA-导向的DNA结合结构域(Crispr/cas 9)。具体地，合成或人工ZF或TAL结构域或者RNA-导向的DNA-结合结构域(Crispr/cas 9)。DNA结合结构域可以是上述结构域的功能性片段或功能性衍生物。功能性片段是缺少一个或多个分子并仍然维持识别特异性调节序列的能力的结构域。功能性衍生物是含有突变、取代并仍然维持识别特异性调节序列的能力的结构域。本领域技术人员熟知设计ZF或TAL或Crispr/cas结构域及其功能性片段和功能性衍生物并测试特异性的方法。
单个ZF基序(也称为模块)由具有简单β-β-α折叠的大约30个氨基酸组成，其通过疏水相互作用和单一锌离子的螯合稳定化。各ZF模块主要识别重叠的3-4-bp DNA序列，其中最后一个碱基对是之后目标的第一个碱基度(各目标的第四碱基在相对链上)。结合通过关键的氨基酸残基发生，其可经交换以生成具有不同序列特异性的ZF模块。为了获得调整适应哺乳动物基因组DNA(人类基因组大小，3.0_109bp)中独特目标序列(也称为调节序列)的DBD，理论上，需要超过18bp的序列，并且这可通过连续连接一个或多个ZF模块，尤其是至少2个ZF模块，至少3个ZF模块、至少4个ZF模块、至少5个或6个ZF模块来完成。然而，这种理论序列长度是不考虑人类感光体细胞特异性基因组特征的一般推测。因此，短于18bp的特异性序列可在特异性组织和细胞类型中被同等唯一地识别。
衍生自转录激活物样效应物(TALE)的DNA-结合结构域的一般结构，TALE衍生自植物病原性黄单胞菌属细菌，或来自青枯菌的TALE-样蛋白质也可经工程改造以结合预定DNA序列(Li，L.等.Characterization and DNA-binding specificities of Ralstonia TAL-like effectors(青枯菌TAL-样效应物的表征和DNA-结合特异性).Mol.Plant 6，1318-1330；2013)。TAL-DBD包含33-35个氨基酸重复的串联阵列，其各自识别大沟中的单一碱基对。通过12和13位处的2个氨基酸确定各重复模块的核苷酸特异性(Moscou，M.J.和Bogdanove，A.J.A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors(简单密码支配TAL效应物识别DNA).Science 326，1501；2009)，其称为重复可变双残基(RVD)。4个不同的RVD模块-即Asn-Asn、Asn-Ile、His-Asp和Asn-Gly被最广泛地用于分别识别鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。
CRISPR(成簇且规律间隔的短回文重复序列)系统提供针对靶向的基因调节的潜在平台(Barrangou等，2007)。已经在不同生物体中发现CRISPR系统；最简单的之一是来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型CRISPR系统。在该系统中，编码Cas9蛋白质的单个基因以及2个RNA，一个成熟CRISPR RNA(crRNA)和部分互补反式作用RNA(tracrRNA)是必需的，并且足以用于对外来DNA进行RNA-导向的沉默。DNA切割中具有缺陷的突变蛋白质Cas9实际上能够作为简单RNA-导向的DNA-结合结构域起作用。
因此，酿脓链球菌的CRISPR/Cas系统可经编程以通过用针对这种调节DNA位点的碱基配对互补性引导RNA进行简单工程改造来设计针对特定真核调节序列的DNA结合结构域。Cas9可用作定制的RNA-导向的DNA-结合平台。
DNA-结合结构域(即，缺少效应结构域的DNA-结合蛋白)本身是强效的因为它们在信号转导的来源处(基因组DNA)发生作用，模拟并胜过转录信号转导性质的固有稳健性，考虑到特异性和因此的治疗安全性和效力。
转录因子(TF)是包括2个主要功能性结构域、效应结构域和DNA结合结构域的DNA-结合蛋白。效应结构域导致转录激活和抑制。激活子结构域和抑制子结构域主要通过大转录共激活子和共抑制子复合物通过蛋白质-蛋白质相互作用的募集来实现。然后，这些共因子同时进行直接和间接作用，来调节RNA聚合酶II转录器(transcriptional machinery)在核心启动子处的活性。DNA结合结构域具有确定DNA识别性质(DNA-结合特异性)的功能。特定类别的成员(即旁系同源TF)通常具有相似的DNA结合偏好(Badis等，2009)。然而，不论DNA结合结构域明显共有的蛋白质结构，TF可能显示出非保守性结合性质。在这些情况中，认为一般发生在效应结构域和其他细胞特异性核蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用导致体内DNA对TF结合的差异。例如，KRAB-介导的基因沉默需要结合至共抑制子KAP-1。KRAB：KAP-1相互作用需要RING-B盒-卷曲螺旋(RBCC)结构域(Peng H.等)。因此，蛋白质-蛋白质相互作用还参与生成不同的DNA-结合特异性。确定体内TF结合的另一个因素是局部染色质环境(Arvey等，2012)。另外，天然TF本身属于细胞特异性转录组图(调节子的调节子)，因此它们受到其他细胞特异性TF设定的精细调节，其控制它们的激活或抑制，最终产生细胞特异性功能。
因此，总之，天然转录因子和偶联效应结构域的人工DBD都具有DBD和效应结构域，其通过蛋白质-蛋白质相互作用吸引多种其他蛋白质，这可最终导致转录抑制或转录激活。
相反，人工分离的DBD在调节网络的拓扑结构的外部，并且转录上不依赖于内源性细胞特异性调节代码(全细胞特异性转录组图)。因此，人工DNA-结合结构域适于生成有效并安全地调节转录的强效方式，然后生成治疗剂。
通过参考下图非限制性实施例阐述本发明。
图1.A-ZF6转录抑制子(ZF6-KRAB；Mussolino等2011(EMBO Mol Med.2011年3月；3(3)：118-28)和新ZF6-DBD的示意图。B-人类启动子邻近区域上的DNA序列，大写字母是同时针对ZF6-KRAB和ZF6-DBD的DNA碱基结合位点。C-HEK293细胞上转染后的使用抗HA表位抗体的Western印迹分析，显示相比之下ZF6-KRAB(34KDa)与ZF6-DBD(22KDa)不同的分子量。用抗微管蛋白抗体对总蛋白质的量标准化。
图2.在P30时用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-ZF6-KRAB或AAV8-CMV-EGFP(1x10E9vg)视网膜下注射的P347S小鼠上由ERG分析记录的视网膜电生理响应。A-C，幅度表示通过在暗光适应(暗光)和光适应(亮光)条件下增加光强度引发的视网膜响应。处理前(基线：P30；黑色圆圈)和处理后(P50；三角形)的B-波振幅。载体递送20天后，与对照对侧EGFP注射的眼相比，视网膜的电生理响应在ZF6-DBD和ZF6-KRAB处理的眼中保留。D图表示与对照相比，ZF6-DBD和ZF6-KRAB视网膜中都保持功能性响应，然而，在视网膜功能保持水平上，ZF6-DBD胜过ZF6-KRAB。统计学显著性差异(t-检验)统计值为*p＜0.01，**p＜0.001，***p＜0.0001：图2A[注射eGFP之前的眼(基线，P30)对比用eGFP注射的眼(P50)]；图2B[注射ZF6-KRAB之前的眼(基线，P30)对比用ZF6-KRAB注射的眼(P50)]；图2B[注射ZF6-DBD之前的眼(基线，P30)对比用ZF6-DBD注射的眼(P50)]。
图3.在P14时用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-ZF6-KRAB或AAV8-CMV-EGFP(1x10E9vg)视网膜下注射并在P30时死的P347S小鼠上由ERG分析记录的视网膜电生理响应的比较。A-B，幅度表示通过在暗光适应(暗光)和光适应(亮光)条件下增加光强度引发的视网膜a-和b-波响应。组A中EGFP对照眼和ZF6-DBD注射的眼之间；组B中eGFP对照眼和ZF6-DBD注射的眼之间以及ZF6-DBD和ZF6-KRAB之间的统计学显著差异(方括号)。C，载体递送14天后，在ZF6-DBD处理的眼中视网膜的电生理响应比ZF6-KRAB处理的眼中保留的明显更多；ZF6-DBD和ZF6-KRAB注射的眼对比eGFP注射的眼之间的统计学显著差异。D，代表相对于ZF6-DBD和ZF6-KRAB的视网膜ERG响应保留的直接比较的图；ZF6-DBD注射的眼(n＝32)对比ZF6-KRAB注射的眼(n＝10)之间的统计学显著差异。统计学显著差异为*p＜0.01，**p＜0.001，***p＜0.0001，(t-检验)。
图4.(A)在用ZF6-DBD(21只分析的眼中17只眼视紫红质下调)和ZF6-KRAB(11只分析的眼中10只眼视紫红质下调)转导的视网膜中对hRHO和Gnat1 mRNA水平的定量RT-PCR分析的柱状图。所得值用鼠GAPDH和Actβ转录物水平标准化，ZF6-DBD注射的眼对比eGFP注射的眼之间的统计学显著差异为*p＜0.01，**p＜0.001，***p＜0.0001(t-检验)。(B)在视网膜下注射1x10E9的AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB载体颗粒后AAV8载体转基因的平均表达水平。(C)用AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB处理的视网膜样品中对RHO的Western印迹分析。(D)对用AAV8-CMV-ZF6-DBD注射的P347S小鼠的免疫荧光分析。(E)HA染色的视网膜显示HA标签的核定位，并且在AAV8-CMV-EGFP对照中缺少其存在。(F-H)人特异性3A6抗体并不标记野生型视网膜(F)，在AAV8-CMV-ZF6-DBD处理的眼(G)中实际上不存在，并且标记AAV8-CMV-EGFP处理的对照视网膜(H)。
图5.在P4时用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-EGFP(1x10E9vg)视网膜下注射并在P30时分析的P347S小鼠上，由ERG分析记录的视网膜电生理响应，ZF6-DBD注射的眼对比eGFP注射的眼之间的统计学显著性差异为*p＜0.01；**p＜0.001(t-检验)。
图6.在P4、P14和P30时用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-EGFP(1x10E9vg)视网膜下注射并在P30或P50时分析(P30注射组)的P347S小鼠的ERG分析所记录的视网膜电生理响应。A不同荧光下用ZF6-DBD(P4，P14，P30)处理的眼和eGFP处理的眼(P30)的代表性波形。B不同注射时间点处用ZF6-DBD(黑线)处理的眼和eGFP处理的眼(灰线)的波形；P4顶部组图，P14中间组图和P30底部组图。C不同时间点处ZF6-DBD注射的眼对比用eGFP注射的对侧眼之间的中值ΔERG响应。
图7.A.近端视紫红质启动子的染色体定位。视紫红质近端启动子的示意图，表示转录启示位点和顺式调节元件的位置及其同源结合蛋白。B.人和猪近端启动子的比对；粗体是ZF6-DBDCis-seq；红色是人和猪ZF6-DBDCis-seq之间的错配。C.用人和猪视紫红质启动子结合ZF6-DBD的示意图。
图8.在P90时用AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-ZF6-KRAB处理野生型猪的视网膜，并在15天后处死(载体剂量2x10e10vg)。A通过q实时PCR评价的视网膜转录本水平。与eGFR处理的眼相比，ZF6-DBD降低了内源性视紫红质表达，其中视网膜的其他基因未改变；**p值＜0,01。B使用α-RHO(1D4)的对猪视网膜裂解物的Western印迹分析；α-微管蛋白抗体用于标准化。
图9.A.与由AAV在猪视网膜中递送的ZF6-DBD相比的内源性转录因子(CRX和NRL)的表达分析。B.视网膜中已知主转录因子的表达水平(以FPKM计)。
图10.ZF6-DBD(Zf6DBD)对视紫红质启动子的结合。在猪(Sus scrofa)视网膜中使用针对HA的抗体的ChIP分析。我们比较了ZF6-DBD对视网膜的ZF6-DBD处理的部分对比未处理的部分中视紫红质转录起始位点(Tss)的物理结合。我们观察到与在未处理区域中的结合水平相比，在处理的区域中特异性和统计学显著的富集。
我们使用视紫红质启动子(3000bp上)的上游区域作为隐性对照，在这种情况中，处理的和未处理的区域之间没有差异。*p值＜0,05。
图11.用AAV8-CMV-ZF6-DBD注射的猪视网膜的形态表征。A.猪视网膜对1D4(绿色)和HA-标签(红色)的共免疫标记分析，其鉴定ZF6-DBD蛋白质，注射的ZF6-DBD。B.使用视紫红质1D4(蓝色)、HA-标签(红色)和GNAT1(绿色)对ZF6-DBD注射的视网膜的三重免疫荧光分析；红色箭头表示HA-标签阳性细胞；绿色箭头表示HA-标签阴性细胞。C.使用视锥抑制蛋白抗体(Arr3；未注射的视网膜中红色并且注射的视网膜中绿色)和表示视锥完整性的HA-标签(红色)的免疫荧光分析。放大：40倍；OS，外节；IS，内节；ONL，外核层。
图12.A)在1x10E10vg的载体剂量下AAV8-CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB递送至P90猪视网膜导致与对照(ZF-KRAB未转导区(NT)和ZF-DBD未转导区(NT))相比在P97时高度显著的内源性猪视紫红质转录抑制。B)从收获的视网膜中获得的转基因表达水平(RT-PCR)。
图13.A.ZF6-KRAB和ZF-DBD差异表达的基因之间的交叉；B.由ZF-DBD和ZF-DBD-KRAB共有的DEG的倍数变化水平之间的关系；差异表达的基因(FDR＜0.05)显示DBD-KRAB和DBD处理之间共有的差异表达的基因的倍数变化水平之间的相关水平和维恩图，显示ZF6-KRAB和ZF6-DBD之间的交叉(57DEG)在功能上相关并且因此可能结合相同的基因组目标。
图14.在AAV8载体产生之后，由qPCR评价载体颗粒。N＝4AAV8-CMV-ZF6-KRAB，n＝2AAV8-RHOK-ZF6-KRAB，n＝2AAV8-CMV-ZF6-DBD。ZF6-DBD对比ZF6-KRAB(遍在启动子)之间的统计学差异为*p＜0.01。
图15.在猪成年视网膜中评价针对沉默替换策略的RHO替换步骤的人GNAT1启动子强度。左上组图：表示包括CRX TF结合位点中的突变的GNAT1启动子基因座的图，其突变能够增强基因表达(J.Lee等，Gene Therapy 2010)。右下图：含GNAT1元件的增加的AAV8载体剂量(AAV8hGNAT1-EGFP：1x10e10；1x10e11；1x10e12vg)在视网膜下空间中递送之后转基因转录物的水平(EGFP)。下图：不同载体剂量(1x10e10；1x10e11；1x10e12vg)下处理的视网膜的组织学分析的代表图。
图16.猪中进行的沉默和替换实验。A.用AAV8-CMV-ZF6-DBD(剂量：1x10^11)和AAV8-hGNAT1-hRHO(剂量：1x10^12)注射并在注射后15天处死的猪的内源性视网膜基因的表达水平。B.注射的眼中ZF6-DBD的表达水平。
图17.由ZF6-DBD识别的最小核心序列的鉴定。结合至包括ZF6-DBDCis-seq的hRho近端启动子区(hRho 43bp)的ZF6-DBD DNA的凝胶移位分析(A)。显示了hRho 43bp野生型、hRho 43bp突变F和hRho43bp突变L寡核苷酸的序列(B)；核心序列用下划线表示，并且已经突变的碱基表示为绿色(B)。
图18.A.人视紫红质近端启动子的序列：分别是野生型、ZF6-DBDCis-seq突变(MZF6-DBD)和ZF6-DBDCis-seq缺失(ΔZF6-DBD)(绿色是CRX结合位点，蓝色是NRL结合位点，粗体是ZF6-DBDCis-seq，红色是突变和缺失的序列)。B.通过相对于报告载体(hRHO)表达的倍数变化分析评价eGFP的表达水平。
图19.通过AAV8载体(1x10E9vg)视网膜递送缺少ZF6目标DNA基序的报告子(EGFP)的表达盒(GGGGGTTAGagGGTCTACGA SEQ ID No.22；ΔZF6；AAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP)进行体内顺式调节(ZF6DNA-结合基序)显著性的评价。通过使用针对聚腺苷酸(bGH，牛生长激素聚腺苷酸)的引物的qRT-PCR评价的注射的眼中AAV8-hRHO-5’UTR-EGFP和AAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP的eGFP表达水平。RHO-5’UTR-eGFP注射的眼对比hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP之间的显著性统计学差异为***p＜0.0001。B通过组织学分析的注射的眼中AAV8-hRHO-5’UTR-EGFP和AAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP的eGFP表达水平。
图20.通过AAV8载体(1x10E9vg)视网膜递送缺少ZF6目标DNA基序的报告子(EGFP)表达盒(TTACTGTAATCTTAACCGGA[SEQ ID No.29]；MutZF6；AAV8-hRHO-MutZF6-5’UTR-EGFP)进行体内顺式调节(ZF6DNA-结合基序)显著性的评价。通过使用针对聚腺苷酸(bGH，牛生长激素聚腺苷酸)的引物的qRT-PCR评价的注射的眼中AAV8-hRHO-5’UTR-EGFP和AAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP的eGFP表达水平。RHO-5’UTR-eGFP注射的眼对比hRHO-MutZF6-5’UTR-EGFP之间的显著性统计学差异为***p＜0.0001。B通过组织学分析的注射的眼中AAV8-hRHO-5’UTR-EGFP和AAV8-hRHO-MutZF6-5’UTR-EGFP的eGFP表达水平。
图21.A.视紫红质近端启动子的序列：hRHO、mRHO、hRHO insMurine、mRHOinsHuman、hRHOΔEvo、hRHO Mevo、hRHO 5G和hRHO T3C(绿色是CRX结合位点，蓝色是NRL结合位点，粗体是ZF6-DBDCis-seq，红色是突变和缺失的序列)。B.通过相对于报告载体(hRHO)表达的倍数变化分子评价eGFP的表达水平。**p值＜0,01；***p值＜0,001。
图22A.含ZF6-DBDCis-seq的25bp(TSS上游100bp)的Transfac分析。该位点在文献中报道含有针对klf15(猪序列)的结合位点。B.用AAV8-CMV-hKLF15(剂量：2x10^10)注射并在注射后15天处死的猪的内源性视网膜的表达水平(NT，未转导区)。
图23.显示由ZF6-KRAB、ZF6-DBD、TALE-DBD和对照ZF9-KRAB介导的相对于荧光素酶活性的CRX反式激活的抑制程度的柱状图。ZF6-KRAB、ZF6-DBD和TALE-DBD明显抑制由CRX诱导的荧光素酶活性。
图24.pAAV2.1-CMV-ZF6-DBD。特征：
ITR：末端反向重复
CMV：巨细胞病毒
BGH：牛生长激素聚腺苷酸
AmpR：抗氨苄青霉素
WPRE：土拨鼠肝炎转录后调控元件
图25.pAAV2.1-hGNAT1-hRHO。特征：
图26.生成靶向顺式作用元件以调节转录的DNA-结合蛋白的总体方法。A-利用AAV载体向感光体的基因转移效力，能够研究合适的细胞特异性环境内顺式作用元件的活性(AAV-顺式作用元件-报告子，即，体内递送至感光体的AAV-RHO-启动子-突变体-EGFP)。一旦鉴定到敏感的顺式作用元件，即能够生成靶向该序列(例如AAV-ZF6-DBD)的DNA-结合蛋白，以模拟顺式作用效应。在RHO启动子内分离顺式作用性质后生成ZF6DBD-5TALRHO-02和TAL7DBD结构域。B-在如报道所述生成RHO沉默子之后，能够生成含有该沉默子的AAV载体并将其偶联至替换构建体(即，视紫红质)以生成沉默(ZF6-DBD)和替换(视紫红质)策略。
图27.pAAV2.1-CMV-ZF6-5F。特征：
图28.pAAV2.1-CMV-TAL7-DBD。特征：
特征：
图29.pAAV2.1-CMV-TALRHO(02)DBD。特征：
图30.ZF6-5F、TAL7-DBD和TALRHO(02)DBD与人和猪视紫红质启动子的结合的示意图。基于ZF6-DBDCis-seq元件结果使DBD结构域的目标位点移位(基于锌指和TALE技术)，参见图21。考虑到基因组ZF6-DBDCis-seq内CCCCCA[SEQ ID No.30]序列的敏感性，人工DNA结合蛋白是部分片段化的，ZF6-5F，对应于ZF6-DBD的相同氨基酸组成但是缺少最后的指(指6，图7)或者靶向CCCCCA[SEQ ID NO.30]序列中心的5”上游序列。在TALRHO(02)(17模块)中，+链上游6个碱基。在TAL7(15模块)中，-链上游2个碱基。目标序列用下划线表示，ZF6-DBDCis-seq加粗表示。框是CRX结合位点，虚线框是NRL结合位点。
图31.在P15时用AAV8-CMV-ZF6-5F或TALRHO(02)DBD或AAV8-CMV-TAL7-DBD(1x10E9vg)视网膜下注射的P347S小鼠上由ERG分析记录的视网膜电生理响应。幅度表示通过在暗光适应(暗光)和光适应(亮光)条件下增加光强度引发的视网膜响应。载体递送15天后的B-波振幅(P30小鼠)，与对照对侧EGFP注射的眼相比，在ZF6-5F、TALRHO(02)和TAL7处理的眼中保留视网膜的电生理响应。
发明详述
材料和方法
序列
人视紫红质启动子及其5’UTR的核苷酸序列(SEQ ID No.1)
Cagatcttccccacctagccacctggcaaactgctccttctctcaaaggcccaaacatggcctcccagactgcaacccccaggcagtcaggccctgtctccacaacctcacagccaccctggacggaatctgcttcttcccacatttgagtcctcctcagcccctgagctcctctgggcagggctgtttctttccatctttgtattcccaggggcctgcaaataaatgtttaatgaacgaacaagagagtgaattccaattccatgcaacaaggattgggctcctgggccctaggctatgtgtctggcaccagaaacggaagctgcaggttgcagcccctgccctcatggagctcctcctgtcagaggagtgtggggactggatgactccagaggtaacttgtgggggaacgaacaggtaaggggctgtgtgacgagatgagagactgggagaataaaccagaaagtctctagctgtccagaggacatagcacagaggcccatggtccctatttcaaacccaggccaccagactgagctgggaccttgggacagacaagtcatgcagaagttaggggaccttctcctcccttttcctggatcctgagtacctctcctccctgacctcaggcttcctcctagtgtcaccttggcccctcttagaagccaattaggccctcagtttctgcagcggggattaatatgattatgaacacccccaatctcccagatgctgattcagccaggagcttaggagggggaggtcactttataagggtctgggggggtcagaacccagagtcatccagctggagccctgagtggctgagctcaggccttcgcagcattcttgggtgggagcagccacgggtcagccacaagggccacagcc
ZF6-DBD的核苷酸序列(SEQ ID No.2)
atgatcgatctggaacctggcgaaaaaccgtataagtgcccagaatgcggcaagtctttttcccagtctggccacctgacggaacatcagcgcactcacaccggcgagaaaccatataaatgtccggagtgcggcaagagctttagccagaatagcaccctgaccgaacatcagcgtacgcacacgggtgaaaagccatataaatgccctgagtgcggcaaatcctttagcacctctggccatctggtccgtcaccagcgcacccaccagaataagaagggcggttctggtgacggtaaaaagaaacagcacgcctgtccagagtgtggcaaatctttttcccgtgaagacaacctgcacactcaccagcgcactcatactggcgagaaaccttacaagtgtccggaatgtggtaagagcttctccacttccggccatctggttcgtcaccagcgcacgcacaccggcgaaaaaccatacaagtgcccggaatgcggcaaatcattctcccgtagcgacaaactggttcgtcaccaacgtacgcataccggtaaaaagacttcctctagatacccgtacgacgttccagactatgcatcttga
ZF6-DBD的蛋白质序列(SEQ ID No.3)
MIDLEPGEKPYKCPECGKSFSQSGHLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSQNSTLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGHLVRHQRTHQNKKGGSGDGKKKQHACPECGKSFSREDNLHTHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTHTGKKTSSRYPYDVPDYAS*
ZF2的核苷酸序列(SEQ ID No.4)
atgatcgatctggaacctggcgaaaaaccgtataagtgcccagaatgcggcaagtctttttccacctctggcaatctggtgcgccatcagcgcactcacaccggcgagaaaccatataaatgtccggagtgcggcaagagctttagcactagcggcgagctggtccgtcatcagcgtacgcacacgggtgaaaagccatataaatgccctgagtgcggcaaatcctttagcacctctggtaacctggtacgtcaccagcgcacccacacgggccgttcttctgtagagtctgcgtgcgtcacctctgtactggttgccctcctgccggctacctctgcaccgactcaggtgagcggtgaaaagccatacaaatgtccagagtgtggcaaatctttttcccagtctggcaacctgactgaacaccagcgcactcatactggcgagaaaccttacaagtgtccggaatgtggtaagagcttctcctccaaaaagcatctggctgagcaccagcgcacgcacaccggcgaaaaaccatacaagtgcccggaatgcggcaaatcattcagctccaaaaaggctctgactgagcaccaacgtacgcataccggtaaaaagacttcctctagaccgaaaaagaaacgcaaagtttacccatacgacgtacctgattatgcaagctga
ZF2的蛋白质序列(SEQ ID No.5)
MIDLEPGEKPYKCPECGKSFSTSGNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGELVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGNLVRHQRTHTGRSSVESACVTSVLVALLPATSAPTQVSGEKPYKCPECGKSFSQSGNLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSSKKHLAEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSSKKALTEHQRTHTGKKTSSRPKKKRKVYPYDVPDYAS*
TAL01的核苷酸序列(SEQ ID No.6)
atgtacccatacgatgtcccagactacgcgaatttaatgtcgcggacccggctcccttccccacccgcacccagcccagcgttttcggccgactcgttctcagacctgcttaggcagttcgacccctcactgtttaacacatcgttgttcgactcccttcctccgtttggggcgcaccatacggaggcggccaccggggagtgggatgaggtgcagtcgggattgagagctgcggatgcaccacccccaaccatgcgggtggccgtcaccgctgcccgaccgccgagggcgaagcccgcaccaaggcggagggcagcgcaaccgtccgacgcaagccccgcagcgcaagtagatttgagaactttgggatattcacagcagcagcaggaaaagatcaagcccaaagtgaggtcgacagtcgcgcagcatcacgaagcgctggtgggtcatgggtttacacatgcccacatcgtagccttgtcgcagcaccctgcagcccttggcacggtcgccgtcaagtaccaggacatgattgcggcgttgccggaagccacacatgaggcgatcgtcggtgtggggaaacagtggagcggagcccgagcgcttgaggccctgttgacggtcgcgggagagctgagagggcctccccttcagctggacacgggccagttgctgaagatcgcgaagcggggaggagtcacggcggtcgaggcggtgcacgcgtggcgcaatgcgctcacgggagcacccctcaacctgaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagccatgacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggacttacgccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacatcgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggactaaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacaacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacgggttgaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagccatgacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggcctgaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacatcgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggactgacaccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacggagggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggacttacacccgaacaagtcgtggcaattgcgagccatgacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggacttacgccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacggagggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggactaaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacaacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacgggttgaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacaacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggcctgaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacaacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggactgacaccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacatcgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggcctcaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacaacgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggacttacgccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacatcgggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggactaaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacggagggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacgggttgaccccagagcaggtcgtggcaattgcgagcaacggagggggaaagcaggcactcgaaaccgtccagaggttgctgcctgtgctgtgccaagcgcacggactcacgcctgagcaggtagtggctattgcatccaataacgggggcagacccgcactggagtcaatcgtggcccagctttcgaggccggaccccgcgctggccgcactcactaatgatcatcttgtagcgctggcctgcctcggcggacgacccgccttggatgcggtgaagaaggggctcccgcacgcgcctgcattgattaagcggaccaacagaaggattcccgagaggacatcacatcgagtggcagatcacgcgcaagtggtccgcgtgctcggattcttccagtgtcactcccaccccgcacaagcgttcgatgacgccatgactcaatttggtatgtcgagacacggactgctgcagctctttcgtagagtcggtgtcacagaactcgaggcccgctcgggcacactgcctcccgcctcccagcggtgggacaggattctccaagcgagcggtatgaaacgcgcgaagccttcacctacgtcaactcagacacctgaccaggcgagccttcatgcgttcgcagactcgctggagagggatttggacgcgccctcgcccatgcatgaaggggaccaaactcgcgcgtcagctagccccaagaagaagagaaaggtggaggccagctga
TAL01的蛋白质序列(SEQ ID No.7)
MYPYDVPDYANLMSRTRLPSPPAPSPAFSADSFSDLLRQFDPSLFNTSLFDSLPPFGAHHTEAATGEWDEVQSGLRAADAPPPTMRVAVTAARPPRAKPAPRRRAAQPSDASPAAQVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADHAQVVRVLGFFQCHSHPAQAFDDAMTQFGMSRHGLLQLFRRVGVTELEARSGTLPPASQRWDRILQASGMKRAKPSPTSTQTPDQASLHAFADSLERDLDAPSPMHEGDQTRASASPKKKRKVEAS*
TAL02的核苷酸序列(人视紫红质启动子的反向链上)(SEQ ID No.8)
atgtacccatacgatgtcccagactacgcgaatttaaaccccaagaagaagcggaaggtgcacgggaattctgcgagcgcgccgcgccgccgcgcggcgcagccgagcgatgcgagcccggcggcgcaggtggatctgcgcaccctgggctatagccagcagcagcaggaaaaaattaaaccgaaagtgcgcagcaccgtggcgcagcatcatgaagcgctggtgggccatggctttacccatgcgcatattgtggcgctgagccagcatccggcggcgctgggcaccgtggcggtgaaatatcaggatatgattgcggcgctgccggaagcgacccatgaagcgattgtgggcgtgggcaaacagtggagcggcgcgcgcgcgctggaagcgctgctgaccgtggcgggcgaactgcgcggcccgccgctgcagctggataccggccagctgctgaaaattgcgaaacgcggcggcgtgaccgcggtggaagcggtgcatgcgtggcgcaacgcgctgaccggcgcgccgctgaacctgaccccgcagcaggtggtggcgattgcgagccatgatggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacggcggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacattggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccgcagcaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcaggcgctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacattggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcaggcgctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacggcggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccgcagcaggtggtggcgattgcgagcaacggcggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccgcagcaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccggaacaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggcaaacaggcgctggaaaccgtgcagcgcctgctgccggtgctgtgccaggcgcatggcctgaccccgcagcaggtggtggcgattgcgagcaacaacggcggccgcccggcgctggaaagcattgtggcgcagctgagccgcccggatccggcgctggcggcgctgaccggcagcTGA
TAL02的蛋白质序列(SEQ ID No.9)
MYPYDVPDYANLNPKKKRKVHGNSASAPRRRAAQPSDASPAAQVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTGS*
pAAV2.1 CMV_ZF6-DBD(SEQ ID No.10)
agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTtgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagctagtt attaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaat ggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcata tgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgg gactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaa tgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggc accaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacgg tgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatcctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcag gtgtccaggcggccgcatgatcgatctggaacctggcgaaaaaccgtataagtgcccagaatgcggcaagtctttttcccagtctggccacctgacggaacatcagcgcactcacaccggcgagaaaccatataaatgtccggagtgcggcaagagctttagccagaatagcaccctgaccgaacatcagcgtacgcacacgggtgaaaagccatataaatgccctgagtgcggcaaatcctttagcacctctggccatctggtccgtcaccagcgcacccaccagaataagaagggcggttctggtgacggtaaaaagaaacagcacgcctgtccagagtgtggcaaatctttttcccgtgaagacaacctgcacactcaccagcgcactcatactggcgagaaaccttacaagtgtccggaatgtggtaagagcttctccacttccggccatctggttcgtcaccagcgcacgcacaccggcgaaaaaccatacaagtgcccggaatgcggcaaatcattctcccgtagcgacaaactggttcgtcaccaacgtacgcataccggtaaaaagacttcctctagatacccgtacgacgttccagactatgcatcttgaaagcttggatccaatca agatctGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGAC CCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATT CTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGActcgagttaagggcgaattcccgattaggatcttcctagagCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTA ACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGccttaattaacctaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccccgatagacggtttttcgccctttgacgctggagttcacgttcctcaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttttccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagt ctgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctgcggttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag
特征：
人转导蛋白1(GNAT1)启动子的核苷酸序列(SEQ ID No.11)
TccctgcaggtcataaaatcccagtccagagtcaccagcccttcttaaccacttcctactgtgtgaccctttcagcctttacttcctcatcagtaaaatgaggctgatgatatgggcatccatactccagggccagtgtgagcttacaacaagataaggagtggtgctgagcctggtgccgggcaggcagcaggcatgtttctcccaattatgccctctcactgccagccccacctccattgtcctcacccccagggctcaaggttctgccttcccctttctcagccctgaccctactgaacatgtctccccactcccaggcagtgccagggcctctcctggagggttgcggggacagaaggacagccggagtgcagagtcagcggttgagggattggggctatgccagcTAatCCgaagggttgggggggctgagctggattcacctgtccttgtctctgattggctcttggacacccctagcccccaaatcccactaagcagccccaccagggattgcacaggtccgtagagagccagttgattgcaggtcctcctggggccagaagggtgcctgggaggccaggttctggggatcccctccatccagaagaaccacctgctcactctgtcccttcgcctgctgctgggaccgcggccgc
ZF6-5F(也称为ZF6-5)的核苷酸序列(SEQ ID No.12)
atgatcgatctggagccaggtgaaaagccttataagtgccctgaatgcgggaaatcattcagccagaactccacacttaccgagcaccagagaacccatactggggagaaaccctataagtgcccagaatgtgggaagtctttctctaccagcggacacttggtcaggcaccagagaacgcaccagaacaagaaaggaggttctggtgatggcaagaagaagcagcatgcttgtcccgaatgcggcaagtcctttagcagggaggacaatctgcacactcaccaacgcacacatactggcgagaagccgtacaagtgtcccgaatgtggcaaaagtttctccacaagtggacatctcgttcgtcaccagcgaacccacaccggagagaaaccctacaaatgcccagagtgtgggaaatccttttcacggagcgacaaactggtgagacatcaacgcactcatacaggcaagaaaacgagctcacggtacccttacgatgtgcctgactatgccagttaataa
ZF6-5F(也称为ZF6-5)的蛋白质序列(SEQ ID No.13)
MIDLEPGEKPYKCPECGKSFSQNSTLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGHLVRHQRTHQNKKGGSGDGKKKQHACPECGKSFSREDNLHTHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTSGHLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSRSDKLVRHQRTHTGKKTSSRYPYDVPDYAS
TAL7-DBD的核苷酸序列(SEQ ID No.14)
gcaagtgccccaagaaggcgggccgcccagccttctgacgctagccccgctgcccaggtggatctgcgaacgctgggttattctcagcagcagcaagagaagattaagcctaaggtccggagtactgtggcacagcaccatgaggctctggtcgggcacggcttcacgcacgcacacatcgttgcactctcccagcaccctgccgcgctgggcacagtggcagtgaagtaccaagatatgattgcggcacttcccgaagctactcacgaggccatcgtcggcgttgggaagcagtggtcaggcgctagggcactggaggcactgctgactgtggccggggagcttcgcggaccccccctgcagttggacacaggccagctgctgaagatagcaaaacgaggaggcgtcacagctgtagaggccgtgcatgcgtggcgcaatgcccttaccggggcccctctgaatctgaccccgcagcaagtggtagccattgcgtctaacaacggagggaaacaggcactcgagacagttcaacggctgctccccgtgctttgccaggcgcacggactgaccccagaacaagtggtggcgatcgcctcaaataacggcggcaaacaggctcttgaaaccgtgcagagactgctgccagtactgtgccaggctcatggcctgaccccagagcaggttgtggccatcgcttcaaacaatggcggtaaacaggcgctcgagactgtccagaggctgttgcctgtgctctgccaagctcatggcctgacgcccgaacaggtggttgccatcgctagcaacatcggcggcaagcaagctctcgagacagtgcaacggctgctgcccgtactctgccaggcacatgggctgactcccgagcaagtggttgctattgcatctaacaacggcggaaagcaggcgctggagactgtccagcgtttgcttcctgttttgtgtcaggctcacggcttgacgcccgaacaggtagtggccatagcctccaacatcggaggaaaacaggcacttgaaacagtccagaggcttctccccgtcctgtgccaagcccatggcctcactccacagcaagtagtggctattgcatccaatggaggcgggaaacaagccttggaaaccgtccaggccctgctgcctgtcctgtgccaggcacacgggctgacacctgaacaggtggtcgcaattgccagtaatggtggcgggaagcaagccctggagactgttcaggctttgctgcccgttctgtgtcaagcacacggtctgactccagaacaggttgtggctatcgcctccaataatggtggcaaacaggctctcgaaacagtgcagaggctgctgcccgtgctgtgtcaagcccatggcctgaccccacagcaggtcgtggccattgcctctaataatggaggtaaacaggccctggagacagtccagagattgcttccagttctgtgtcaggcccacgggctgacccctcaacaggtcgtcgccatcgcctcaaacaacggtggcaagcaggcactcgagactgtgcagcggctcttgcctgtgctgtgtcaagcccatggactgaccccggaacaggtggttgccattgccagcaacaacggtgggaaacaggctttggaaaccgtgcaacgcctgctgccggttctgtgccaggctcacgggcttaccccggaacaggtggtagctatcgctagcaataatggagggaagcaggccctggaaacagtgcagagactgctccccgtcctctgccaggcacacggactcaccccggagcaagtggtcgccatagcctccaacggtggagggaagcaggcactggagacagtgcagagacttctcccagtgctctgtcaggctcatgggctcacccctcaacaggtagtagccatagctagtaacaatggaggtcgtccagcattggagagcatcgtggcgcagctgagccgcccagacccagcgcttgccgccttgaccggaagctatccctacgacgtgcctgattacgcttaataaaagctt
TAL7-DBD的蛋白质序列(SEQ ID No.15)
MPKKKRKVTSASAPRRRAAQPSDASPAAQVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNNGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTGSYPYDVPDYA-
TALRHO(02)DBD的核苷酸序列(SEQ ID No.16)
ctagcgcccccagaagaagggccgctcagccttccgatgcctctcctgccgcccaggtggacctgagaaccctgggctacagccagcagcagcaggaaaagatcaagcccaaagtgcggagcaccgtggcccagcaccacgaagccctcgtgggccacggctttacccacgctcacatcgtggccctgagccagcatcctgccgctctgggaaccgtggccgtgaagtaccaggacatgatcgccgccctgcccgaggccacacacgaggctatcgtgggcgtgggcaagcagtggtccggcgctagagcactcgaggccttgctgacagtggccggcgagctgagaggccctccactgcagctggacaccggccagctgctgaagatcgccaagcggggaggcgtgacagccgtggaagccgtgcacgcttggcggaatgccctgacaggcgctcccctgaaccttacgccgcagcaggtggtggccatcgccagccacgatggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgcttccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatattggtggcaagcaggcgctggagacggtgcagcgattgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagccacgacggtggcaagcaggcgctggagactgtccagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcggtggcaagcaggcgcttgagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcggtggcaagcaggctctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcgggggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccgcagcaggtggtggccatcgccagcaatattggcggcaagcaggcgctggagacggtgcaggcgctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgcaagcaatggcggtggcaagcaggcgctggagacggtgcaggcgctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggcaatcgccagcaatattggtggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccgcaacaggtggtagccatcgccagcaatattggtggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgacaccccagcaggtggtagcgatcgccagcaataagggtggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgcttccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaataagggtggcaagcaggcgctggagacggtgcagcgattgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaataagggtggcaagcaggcgctggagactgtccagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcggtggcaagcaggcgcttgagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccgcagcaggtggtggccatcgccagccacgacggtggcaagcaggctctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcgggggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccgcagcaggtggtggccatcgccagcaataagggcggcaagcaggcgctggagacggtgcaggcgctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgacaccccagcaggtcgtggccattgccagcaacaagggaggcagacccgccctggaatctattgtggcccagctgagcagacccgacccagctctggccgccctgacaggatcc
TALRHO02DBD的蛋白质序列(SEQ ID No.17)
MPKKKRKVTSAPRRRAAQPSDASPAAQVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNIGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNKGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPEQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNKGGKQALETVQALLPVLCQAHGLTPQQVVAIASNKGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTGSYPYDVPDYAS-
pAAV2.1 hGNAT1-hRHO(SEQ ID No.18)
特征：
agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggc gtgt tcacaCAGGAAACAGCTATGACCATGattacgccagatttaattaaggCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTtgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagctccctgcaggtcataaaatcccagtccagagtcacc agcccttcttaaccacttcctactgtgtgaccctttcagcctttacttcctcatcagtaaaatgaggctgatgatat gggcatccatactccagggccagtgtgagcttacaacaagataaggagtggtgctgagcctggtgccgggcaggcag caggcatgtttctcccaattatgccctctcactgccagccccacctccattgtcctcacccccagggctcaaggttc tgccttcccctttctcagccctgaccctactgaacatgtctccccactcccaggcagtgccagggcctctcctggag ggttgcggggacagaaggacagccggagtgcagagtcagcggttgagggattggggctatgccagctaatccgaagg gttgggggggctgagctggattcacctgtccttgtctctgattggctcttggacacccctagcccccaaatcccact aagcagccccaccagggattgcacaggtccgtagagagccagttgattgcaggtcctcctggggccagaagggtgcc tgggaggccaggttctggggatcccctccatccagaagaaccacctgctcactctgtcccttcgcctgctgctggga ccgcggccgcatgaatggcacagaaggccctaacttctacgtgcccttctccaatgcgacgggtgtggtacgcagccccttcgagtacccacagtactacctggctgagccatggcagttctccatgctggccgcctacatgtttctgctgatcgtgctgggcttccccatcaacttcctcacgctctacgtcaccgtccagcacaagaagctgcgcacgcctctcaactacatcctgctcaacctagccgtggctgacctcttcatggtcctaggtggcttcaccagcaccctctacacctctctgcatggatacttcgtcttcgggcccacaggatgcaatttggagggcttctttgccaccctgggcggtgaaattgccctgtggtccttggtggtcctggccatcgagcggtacgtggtggtgtgtaagcccatgagcaacttccgcttcggggagaaccatgccatcatgggcgttgccttcacctgggtcatggcgctggcctgcgccgcacccccactcgccggctggtccaggtacatccccgagggcctgcagtgctcgtgtggaatcgactactacacgctcaagccggaggtcaacaacgagtcttttgtcatctacatgttcgtggtccacttcaccatccccatgattatcatctttttctgctatgggcagctcgtcttcaccgtcaaggaggccgctgcccagcagcaggagtcagccaccacacagaaggcagagaaggaggtcacccgcatggtcatcatcatggtcatcgctttcctgatctgctgggtgccctacgccagcgtggcattctacatcttcacccaccagggctccaacttcggtcccatcttcatgaccatcccagcgttctttgccaagagcgccgccatctacaaccctgtcatctatatcatgatgaacaagcagttccggaactgcatgctcaccaccatctgctgcggcaagaacccactgggtgacgatgaggcctctgctaccgtgtccaagacggagacgagccaggtggccccggcctaaaagcttggatcc agatctGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCT CCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGtGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCAT TGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAG CAGGCATGCTGGGGActcgagttaagggcgaattcccgattaggatcttcctagagCATGGCTACGTAGATAAGTAG CATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGccttaattaacctaattcACTGGCCGTCGTTTTACAacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagc gacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccccgatagacggtttttcgccctttgacgctggagttcacgttcctcaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttttccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaataca aaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaatagtggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagtaatggtaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattgtcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccg tttttacggttc catgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag
pAAV2.1-CMV-ZF6-5F(SEQ ID No.19)
特征：
agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggc gtgt tcacaattacgccagatttaattaaggCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTtgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagctagttattaatagtaatcaattacg gggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcc caacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctatt gacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagta catctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggacttt ccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcag agctggtttagtgaaccgtcagatcctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcag gtgtccaggcggccgcatgatcgatctggagccaggtgaaaagccttataagtgccctgaatgcgggaaatcattcagccagaactccacacttaccgagcaccagagaacccatactggggagaaaccctataagtgcccagaatgtgggaagtctttctctaccagcggacacttggtcaggcaccagagaacgcaccagaacaagaaaggaggttctggtgatggcaagaagaagcagcatgcttgtcccgaatgcggcaagtcctttagcagggaggacaatctgcacactcaccaacgcacacatactggcgagaagccgtacaagtgtcccgaatgtggcaaaagtttctccacaagtggacatctcgttcgtcaccagcgaacccacaccggagagaaaccctacaaatgcccagagtgtgggaaatccttttcacggagcgacaaactggtgagacatcaacgcactcatacaggcaagaaaacgagctcacgg agttaataaaagcttggatcc agatctGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGC CAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATA AAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGG GGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGActcgagttaagggcgaattcccgattaggatcttcctagagCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGccttaattaacctaattcacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagc gacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccccgatagacggtttttcgccctttgacgctggagttcacgttcctcaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggatttttccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttataatttcaggtggcatctttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacaaaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaatagtggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagtaatggtaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccg tttttacggttcctggccttttgctgcggttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaag
pAAV2.1-CMV-TALRHO(02)DBD(SEQ ID No.20)
特征：
agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTtgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagc cagatcctgcagaagttggtcgtgaggcactgggcag gtgtccaggcggccgc ctagcgcccc cagaagaagggccgctcagccttccgatgcctctcctgccgcccaggtggacctgagaaccctgggctacagccagc agcagcaggaaaagatcaagcccaaagtgcggagcaccgtggcccagcaccacgaagccctcgtgggccacggcttt acccacgctcacatcgtggccctgagccagcatcctgccgctctgggaaccgtggccgtgaagtaccaggacatgat cgccgccctgcccgaggccacacacgaggctatcgtgggcgtgggcaagcagtggtccggcgctagagcactcgagg ccttgctgacagtggccggcgagctgagaggccctccactgcagctggacaccggccagctgctgaagatcgccaag cggggaggcgtgacagccgtggaagccgtgcacgcttggcggaatgccctgacaggcgctcccctgaaccttacgcc gcagcaggtggtggccatcgccagccacgatggcggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgcttccggtgc tgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatattggtggcaagcaggcgctggag acggtgcagcgattgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcca cgacggtggcaagcaggcgctggagactgtccagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccgg agcaggtggtggccatcgccagcaatggcggtggcaagcaggcgcttgagacggtgcagcggctgttgccggtgctg tgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatggcggtggcaagcaggctctggagac ggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgccagcaatg gcgggggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccgcag caggtggtggccatcgccagcaatattggcggcaagcaggcgctggagacggtgcaggcgctgttgccggtgctgtg ccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggccatcgcaagcaatggcggtggcaagcaggcgctggagacgg tgcaggcgctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccggagcaggtggtggcaatcgccagcaatatt ggtggcaagcaggcgctggagacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggcccatggcctgaccccgcaaca 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CTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCC ACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGT 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pAAV2.1-CMV-TAL7-DBD(SEQ ID No.21)
特征：
agcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccagatttaattaaggCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTtgtagttaatgattaacccgccatgctacttatctacgtagccatgctctaggaagatcggaattcgcccttaagctagctagtt attaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaat ggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaat agggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcata tgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgg gactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaa tgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggc 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RT-PCR研究
按照生产商方案，使用RNAeasy小型试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从组织分离RNA。按照生产商的说明，使用QuantiTect逆转录试剂盒(凯杰公司)从1000μg分离的RNA中扩增cDNA。使用LightCycler 480(罗氏公司(Roche))和以下引物通过实时PCR测量转录本的转录水平：
hRho_正向5’...CCATCCCAGCGTTCTTTGCC..3’[SEQ ID No.31]和
hRho_反向5’..GGCCTCATCGTCACCCAGTGGG...3’[SEQ ID No.32]；
mRho_正向5’...CTCTGCCAGCTTTCTTTGCT...3’[SEQ ID No.33]和
mRho_反向5’...GGCGTCGTCATCTCCCAGTGGA...3’[SEQ ID No.34]；
Gnat1_正向5’...GACCGAGCCTCAGAATACCA...3’[SEQ ID No.35]和
Gnat1_反向5’...GGAGAATTGAGTCTCGATAATACC...3’[SEQ ID No.36]。
使用以下引物评价转基因水平：
bGH_正向5’...TCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGT...3’[SEQ ID No.37]和
bGH_反向5’...GGGAGTGGCACCTTCC...3’[SEQ ID No.38]。
在20μl的总体积中使用10μl LightCycler 480 SYBR Green I主混合物(罗氏公司)和400nM引物，在以下条件下进行cDNA的PCR：预孵育，50℃持续5分钟，循环：95℃持续10s，60℃持续20s和72℃持续20s的45次循环。所有的反映针对使用以下引物的鼠GAPDH和Actβ标准化：
mGAPDH_正向5’...GTCGGTGTGAACGGATTTG...3’[SEQ ID No.39]
mGAPDH_反向5’...CAATGAAGGGGTCGTTGATG...3’[SEQ ID No.40]；
Act_正向5’...CAAGATCATTGCTCCTCCTGA...3’[SEQ ID No.41]和
Act_反向5’CATCGTACTCCTGCTTGCTGA...3’[SEQ ID No.42]
各样品在2个独立实验中重复分析。
免疫染色抗-HA抗体
将冷冻的视网膜切片用PBS清洗一次，随后在4％PFA中固定10分钟。切片浸没在回收溶液(0,01M柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0)中并在微波中沸腾3次。之后，加入封闭溶液(10％FBS，10％NGS，1％BSA)持续1小时。一抗小鼠抗-HA(1∶300，科文斯公司(Covance))在封闭溶液中稀释并在4℃下过夜孵育。将二抗(Alexa594，抗小鼠1∶1000；分子探针公司(Molecular Probes)，英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)孵育1小时。使用Vectashield(载体实验室公司，英国彼得堡)观察细胞核。切片使用Zeiss 700共聚焦显微镜(德国上科亨的卡尔蔡司公司(Carl Zeiss))或Leica荧光显微系统(德国韦次拉尔的莱卡微系统有限公司(Leica Microsystems GmbH))来照相。
h-视紫红质3A6抗体
用PBS洗涤冷冻视网膜切片一次。切片然后在含0.2％X-100的PBS中透化1小时。施用含有10％正常山羊血清的封闭溶液(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)，持续1小时。一抗在封闭溶液中稀释并在4℃下过夜孵育小鼠抗-h视紫红质3A6(1∶5，由加拿大英属哥伦比亚大学的Robert S.Molday友情提供)。将二抗(Alexa594，抗小鼠1∶1000；分子探针公司(Molecular Probes)，英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)孵育1小时。使用Vectashield(载体实验室公司，英国彼得堡)观察细胞核。切片用Leica荧光显微系统(德国韦次拉尔的莱卡微系统有限公司)来照相。
AAV载体制备
AAV载体由TIGEM AAV载体中心生成，通过三重转染HEK293细胞随后进行两轮CsCl2纯化[Auricchio A，Hildinger M，O’Connor E，Gao GP，Wilson JM(2001)Isolationof highly infectious and pure adeno-associated virus type 2 vectors with asingle-step gravity-flow column(用一步重力流动柱分离高度感染性和纯的2型腺相关病毒载体).Hum Gene Ther 12∶71-76.]。对于各病毒制备物，通过平均点印迹分析[DoriaM，Ferrara A，Auricchio A(2013)AAV2/8 vectors purified from culture medium witha simple and rapid protocol transduce murine liver，muscle，and retinaefficiently(用简单快速方案从培养基中纯化的AAV2/8载体有效转导肝脏、肌肉和视网膜).Hum Gene Ther Methods]和使用TaqMan的PCR定量(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的应用生物系统公司(Applied Biosystems))实现的效价来确定物理效价[基因组拷贝(GC)/ml]。用于载体制备的pAAV2.1-CMV-ZF6-DBD和pAAV2.1-hGNATl-hRHO分别示于图24和25。用于载体制备的pAAV2.1-CMV--ZF6-5F、pAAV2.1-CMV-TAL7-DDB和pAAV2.1-CMV-TALRHO02DBD分别示于图27、28和29。pAAV2.1-CMV用于所有载体制备(图26)。
顺式-序列诱变
通过QuikChange II XL定点突变试剂盒(安捷伦科技有限公司(AgilentTechnologies))按照生产商说明书所示使用以下引物由pAAV2.1 hRhoPromoter_eGFP质粒诱变生成pAAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP：
Mut_正向5’...attaatatgattatgaacagattcagccaggagctta...3’[SEQ ID No.43]和
Mut_反向5’...taagctcctggctgaatctgttcataatcatattaat...3’[SEQ IDNo.44]。
通过QuikChange II XL定点突变试剂盒(安捷伦科技有限公司)按照生产商说明书所示使用以下引物由pAAV2.1 hRhoPromoter eGFP质粒诱变生成pAAV8-hRHO-MutZF6-5’UTR-EGFP：
Mut_正向5’...attaatatgattatgaacaTTACTGTAATCTTAACCGGAgattcagccaggagctta...3’[SEQ ID No.45]和
Mut_反向5’...taagctcctggctgaatcTCCGGTTAAGATTACAGTAAtgttcataatcatattaat...3’[SEQ ID No.46]。
电生理测试
方法描述于Surace EM，Domenici L，Cortese K，Cotugno G，Di Vicino U等，(2005)Amelioration ofboth functional and morphological abnormalities in theretina of a mouse model of ocular albinism following AAV-mediated genetransfer(在AAV-介导的基因转移后眼白化病小鼠模型的视网膜中功能性和形态异常的改善).Mol Ther 12∶652-658。
小鼠在黑暗中培育2小时并麻醉。由通过Ganzfeld刺激器(CSO，CostruzioneStrumenti Oftalmici，佛罗伦萨，意大利)生成的10-ms闪光引发闪光视网膜电图(ERG)并如前所述记录。使用以下的方案评价ERG和b-波阈值。在暗光适应条件下，用从-5.2增加至+1.3log cd*s/m2(对应于1×10-5.2至20.0cd*s/m2)的闪光刺激眼。刺激之间的log单位间隔为从-5.4至0.0log cd*s/m2之间0.3log，并且从0.0至+1.3log cd*s/m2之间0.6log。对于在暗光适应条件下的ERG分析，考虑0.6log单位间隔的11次刺激(从-4至+1.3log cd*s/m2)引发的响应。为了模拟噪音，在从-4至0.0log cd*s/m2的各0.6log单位刺激处3次ERG响应取平均，对于更高(0.0-+1.3log cd*s/m2)的刺激考虑一次ERG响应。刺激之间的时间间隔为从-5.4至0.7log cd*s/m2为10秒，从0.7至+1log cd*s/m2之间为30秒，或从+1至+1.3logcd*s/m2之间为120秒。暗光适应条件中记录的a-和b-波幅度作为光强度增加的变量作图(从-4至+1.3log cd*s/m2，图1、S1和S2)。在暗光适应部分之后通过用50cd/m2的恒定背景照射上10次10ms的20.0cd*s/m2闪光来记录光适应ERG。
载体给予和动物模型
用于交配的P347S+/+动物(Li T，Snyder WK，Olsson JE，Dryja TP(1996)Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S：evidence fordefective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments(携带显性视紫红质突变P347S的转基因小鼠：视紫红质向外节的缺陷定向转运的证据).Proc Natl AcadSci USA 93∶14176-14181)由G.Jane Farrar博士(爱尔兰都柏林，都柏林圣三一学院，斯墨菲基因研究所(Smurfit Institute of Genetics))友情提供并且在卡达雷利医院(意大利那不勒斯)生物技术中心的动物设施中与C57BL/6小鼠(意大利坎诺瓦的查尔斯河实验室(Charles Rivers Laboratories))交配以获得P347S+/-小鼠。
小鼠
通过腹膜内注射2ml/100g体重的阿佛丁(1.25％w/v的2，2，2-三溴甲醇和2.5％v/v的2-甲基-2-丁醇(意大利米兰的西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)))麻醉小鼠，随后通过Liang等所述的经巩膜经脉络膜方法视网膜下递送AAV载体[Liang FQ，Anand V，Maguire AM，Bennett J(2000)Intraocular delivery of recombinant virus(重组病毒的眼内递送).刊于：Rakoczy PE编.《视觉研究方案》(Vision Research Protocols).托托瓦：胡马纳出版公司(Totowa：Humana Press Inc.)125-139]。
猪
采用11周龄的大白(LW)雌性小猪。猪过夜禁食，自由饮水。先前描述了猪的麻醉和手术过程[Mussolino C，della Corte M，Rossi S，Viola F，Di Vicino U，等.(2011)AAV-mediated photoreceptor transduction of the pig cone-enriched retina(猪视锥富集视网膜的AAV-介导的感光体转导).Gene Ther 18∶637-645]。
在两条主要血管弓之间的后极的缺血性鼻区中视网膜下接种AAV载体，如Mussolino等所述进行[Mussolino C，della Corte M，Rossi S，Viola F，Di Vicino U，等.(2011)AAV-mediated photoreceptor transduction of the pig cone-enriched retina(猪视锥富集视网膜的AAV-介导的感光体转导).Gene Ther 18∶637-645]。这种视网膜区与从鼻延伸至与水平子午线平行的颞边缘交叉，其中视锥密度高，达到20000至35000视锥细胞/mm2。各病毒载体注射到100μl的总体积中，导致形成具有典型“穹顶形”视网膜脱落的视网膜下水泡形成，尺寸对应于5个光盘(optical disc)。
Western印迹分析
在收获的视网膜上进行Western印迹分析。样品在低渗缓冲液(10 mM Tris-HCl[pH 7.5]，10mM NaCl，1，5mM MgCl2，1％CHAPS，1mM PMSF，和蛋白酶抑制剂)中裂解，并且通过12％SDS-PAGE分离20μg的该裂解物。在获得印迹之后，用抗-1D4抗体、抗-视紫红质-1D4(1∶500；马萨诸塞州剑桥的艾碧康公司(Abcam))和抗-β-微管蛋白(1∶1000；意大利米兰的西格玛-奥德里奇公司)抗体标记特定蛋白质。
蛋白质的克隆和纯化：
通过使用质粒pAAV2.1 CMV ZF6-KRAB和pAAV2.1 CMV ZF6-DBD作为DNA模板的PCR生成编码待以麦芽糖-结合蛋白(MBP)融合物表达的工程改造的转录因子ZF6-KRAB和ZF6-DBD的序列的DNA片段。使用以下寡核苷酸作为引物：对于ZF6-KRAB，引物1，5’-GGAATTCCATATGGAATTCCCCATGGATGC-3’[SEQ ID No.47]和引物2，5’-CGGGATCCCTATCTAGAAGTCTTTTTACCGGTATG-3’[SEQ ID No.48]，并且对于ZF6-DBD，引物3，5’-GGAATTCCATATGCTGGAACCTGGCGAAAAACCG[SEQ ID No.49]和引物45’-CGGGATCCCTATCTAGAAGTCTTTTTACCGGTATG-3’[SEQ ID No.50]。用限制性酶NdeI和BamH1消化2种PCR产物并且克隆到NdeI BamH1-消化的pMal C5G(新英格兰生物实验室公司(NewEngland Biolabs))细菌表达载体中。人K1f15和人NR2E3编码区从人视网膜cDNA上PCR扩增。在公开序列(分别是GeneBank登录号NM_014079.3和NM_014249.3)的基础上合成以下寡核苷酸：对于hNR2e3，引物5，5’-GGAATTCCATATG GAGACCAGACCAACAGCTC-3’[SEQ ID No.51]和引物6，5’-CGGAATTCCTAGTTTTTGAACATATCAC-3’[SEQ ID No.52]；对于hKlf15，引物7，5’-GGAATTCCATATGGTGGACCACTTACTTCCAG-3’[SEQ ID No.53]和引物8，5’-CGGGATCCTCAGTTCACGGAGCGCACGGAG-3’[SEQ ID No.54]。用限制性酶NdeI和BamHl消化hKlf15 PCR产物并且克隆到NdeI BamH1-消化的pMal C5G中，并且用限制性酶NdeI和EcoRI消化Nr2e3PCR产物并且克隆到NdeI EcoRI-消化的pMal C5G中(新英格兰生物实验室公司)。所有获得的质粒经测序以确认在编码序列中没有突变。融合蛋白在大肠杆菌BL21DE3宿主菌株中表达。转化的细胞在37℃下在加0.2％葡萄糖的富培养基中生长(按照新英格兰生物实验室公司的方案)直至600 nm的吸光度达到0.6-0.8，同时用200μM ZnSO4补充培养基，并且用0.3mM异丙基1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷来诱导蛋白质表达并允许进行2小时。然后收获细胞，在1X PBS(pH 7.4)(25)、1mM苯甲基磺酰氟、1μM亮抑肽酶、1μM抑肽酶和10μg/ml溶菌酶中重悬，超声，并在27，500相对离心力下离心30分钟。然后，将上清按照生产商的方案加载到直链淀粉树脂(新英格兰生物实验室公司)上。之后用1X PBS洗涤，纯化的部分在麦芽糖洗脱缓冲液(10mM麦芽糖，100mM Tris(pH 8.0)，和100mM NaCl)中洗脱。
凝胶移位分析：
除非另外说明，5pmol的各纯化蛋白在冰上在25mM Hepes(pH 7.9)，50mM KCl，6.25mM MgCl2，1％Nonidet P-40和5％甘油存在下与5pmol的特定标记的双链体寡核苷酸孵育15分钟。孵育后，将混合物加载到5％聚丙烯酰胺凝胶(29∶1丙烯酰胺/二丙烯酰胺比率)上并在4℃下在0.5X TBE中运行(200V持续2小时15分钟)。凝胶然后用SYBR Green(英杰公司(Invitrogen))染色并且用Typhoon Trio++扫描仪(GE医疗公司(GE Healthcare))采集。通过Bradford法(伯乐蛋白质试验)的修改形式确定蛋白质浓度。在NR2E3蛋白质的情况中，可能获得表面上较高的蛋白质浓度(20，50和100pmol)，因为不是所有的蛋白质样品都正确折叠(参见图S1)。通过用hRho 65bp和hRho 43bp寡核苷酸滴定蛋白质由凝胶移位试验来测量表面亲和结合试验。蛋白质-结合DNA的分数对反映混合物中的蛋白质浓度作图。所有的数字通过使用Amersham Biosciences Typhoon Trio++设备的计算机图像定量来获得。
ChIP
对于ChIP实验，从眼切下相同视网膜的ZF6-KRAB转导的区域和未转导的区域。
如下进行ChIP：视网膜机械匀浆化并在室温下使用PBS中1％甲醛交联10分钟，然后通过加入终浓度125mM的甘氨酸猝灭并在室温下孵育5分钟。视网膜在冷PBS 1X中洗涤3次，然后细胞在细胞裂解缓冲液(PIPES 5mM pH 8.0，Igepal 0，5％，Kcl 85mM)中裂解15分钟。细胞核在细胞核裂解缓冲液(Tris HCl pH8.0 50mM，EDTA 10mM，SDS 0，8％)中裂解30分钟。
使用Covaris s220剪切染色质。经剪切的染色质与抗HA ChIP级(阿柏堪穆公司(abcam)，ab 9110)过夜免疫沉淀。经免疫沉淀的染色质与磁性蛋白质A/G珠(英杰公司)孵育3小时。然后用洗涤缓冲液洗涤珠并且在洗脱缓冲液(Tris HCl pH 8 50mM，EDTA 1mM，SDS 1％)中洗脱DNA。然后使用引物对视紫红质TSS和Rpl30TSS进行实时处理。
抗-HA、抗-GNAT1，和抗-视紫红质的三重免疫染色。
将冷冻的视网膜切片用PBS清洗一次，随后在4％PFA中固定10分钟。切片浸没在回收溶液(0，01M柠檬酸钠缓冲液，pH 6.0)中并在微波中沸腾3次。之后，加入封闭溶液(10％FBS，10％NGS，1％BSA)持续1小时。2种一抗小鼠抗-HA(1∶300，科文斯公司(Covance))和兔GαT1(圣克鲁兹生物技术公司(Santacruz Biotechnology))在封闭溶液中稀释并在4℃下过夜孵育。二抗(Alexa594，抗-小鼠1∶800，分子探针公司(Molecular Probes)，和Alexa488，抗-兔1∶500，分子探针公司，英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)孵育1小时，之后用PBS清洗3次。载玻片在封闭溶液(10％NGS)中孵育1小时之后，然后用一抗小鼠-1D4(1∶500，阿柏堪穆公司)孵育过夜。使用二抗(Alexa405，抗-小鼠1∶200，分子探针公司(Molecular Probes)，英杰公司)Vectashield(英国彼得堡的载体实验室公司)来观察细胞核。切片用Leica荧光显微系统(德国韦次拉尔的莱卡微系统有限公司)来照相。
RNASEQ
样品与猪基因组比对(总体(ensemble)10.2)并且用RSEM来估计计数。用egdeRbioconductor包来进行标准化和差异表达分析。我们从数据集中去除平均计数小于3的基因。过滤和标准化过程保留起始条件的22863中的15508个基因。
超几何测试
我们再次使用从数据集中提取的GO类别并计算发现在差异表达的基因的提取中从包括总背景的15508个基因中富集特定GO类别(分别为204和81)，然后是交叉的57个基因的概率。
基因集富集分析GSEA
实验中的基因按照它们的倍数变化值排序以得到包括过滤实验的总共15508个基因的基因列表。从该数据集中，我们提取了10734个基因本体类别(biomaRt包)，并且我们滤去具有低于10个基因的那些，获得我们用作基因集的1426个GO类别。
我们进行1426次基因集富集分析过程(从BroadInstitute-链接下载源代码)，获得1426个富集分数和相关的P值。
结果与讨论
人工锌指基蛋白质的DNA-结合特异性：ZF6-DBD的生成和表征。
为了如Mussolino等，2011(EMBO Mol Med.2011Mar；3(3)：118-28)所述在转录上抑制人视紫红质基因座，生成ZF6-KRAB构建体。该构建体含有DNA-结合结构域，其通过连续组装靶向人RHO近端启动子的人视紫红质近端区域的人工锌指基平台、蛋白质N-端处的人衍生的Krüppel-相关盒(KRAB)抑制结构域、核定位信号(NLS)和HA标签来生成。
作者从构建体中去除KRAB结构域(图1)。所得的构建体ZF6-DBD编码仅具有DNA-结合结构域的蛋白质，因此原理上具有明显减少的功能性含量，没有抑制能力，并且分子量小于ZF6-KRAB对应物(图1C)。除了在ZF6-DBD基因座处的局部性质，KRAB结构域赋予转录输出主要功能基因组和表观后果。事实上，KRAB-ZFP(Krüppel-相关盒结构域-锌指蛋白)是由小鼠和人基因组以成百上千编码的脊椎动物限制性转录抑制子。它们通过必需的辅助因子KAP1发挥作用，其募集导致兼性异染色质形成的效应物。KRAB/KAP1可通过异染色质伸展来介导长程转录抑制，并且该过程发生在内源性影响反击(counter)时。因此，原理上，缺少KRAB结构域在递送至视网膜之后应该不产生不同的生物结果。
为了评价ZF6-DBD的体内功能活性，作者生成含有在遍在巨细胞病毒启动子片段(CMV)转录控制下的ZF6-DBD的腺相关病毒(AAV)载体血清型8。为了直接比较ZF6-DBD与之前所述的ZF6-KRAB的活性，作者将2种载体(AAV8-CMV-ZF6-KRAB和新型AAV8-CMV-ZF6-DBD)独立地递送至adRP的P347S小鼠模型的视网膜。在给予载体之前，在第30天(P30)，作者通过视网膜电图响应测量了基线视网膜功能响应(ERG；EMBO Mol Med.2011年3月；3(3)：118-28)。在递送后20天(P50，视网膜下分别注射2.5x10e8载体剂量的AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB的载体颗粒)，再测量视网膜ERG响应以评价视网膜疾病进程。如图2所示，在EGFP对照眼中观察到ERG响应的最显著下降，随后分别是ZF6-KRAB和ZF6-DBD(图2，图2D)。具体地，在ZF6-KRAB和ZF6-DBD ERG响应之间观察到明显高度显著性差异。ZF6-DBD处理的眼显示与基线测量相比保留的响应，其中在ZF6-KRAB中观察到ERG响应降低，与Mussolino等2011(EMBO Mol Med.2011年3月；3(3)：118-28)中的同等数据一致。为了深化ZF6-DBD的分子机制和治疗活性的表征，作者选择P347S小鼠视网膜下递送AAV8-CMV-ZF6-DBD载体递送的较早时间点，即，P14。在该阶段，视网膜完全分化并且P347S病变还不明显。作者注射大量小鼠(n＝32)以生成多个观察结果和ERG测量结果。如图3所示，当与EGFP处理的眼比较时，用AAV8-CMV-ZF6-DBD处理的眼证明在暗光适应和光适应条件下ERGa-波和b-波响应沿着宽范围荧光的稳健且持续的恢复。另外，当ZF6-DBD处理的眼与AAV8-CMV-ZF6-KRAB处理的眼比较时，在AAV8-CMV-ZF6-DBD处理的眼中观察到统计学上明显更高的响应(图3C)。事实上，处理前后的ZF6-DBD与ZF6-KRAB之间ERG响应的直接比较显示ZF6-DBD处理的眼中P347S视网膜响应损失的统计学显著的进展降低(图3D)。这些数据强烈表明向P347S视网膜递送AAV8-CMV-ZF6-DBD产生比AAV8-CMV-ZF6-KRAB明显更高的功能和治疗价值。
为了研究P347S动物的不同组中AAV8-CMV-ZF6-DBD载体处理的转录分子结果，作者收集视网膜并且测定感光体特异性转录本的表达水平。如图4所示，AAV8-CMV-ZF6-DBD的视网膜下给予导致人RHO转录水平显著且特异性下调，而GNA1感光体特异性基因的水平不变(图4A)。另外，作者计算了视网膜下注射1x10E9的AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB载体颗粒后AAV8载体转基因的平均表达水平(图4B)，并且没有发现统计学显著差异。为了在蛋白质水平确定处理的影响，在用AAV8-CMV-EGFP、AAV8-CMV-ZF6-DBD和AAV8-CMV-ZF6-KRAB处理的视网膜样品中对RHO进行Western印迹分析。如图所示(图4C)，与EGFP对照视网膜相比，在ZF6-DBD和ZF6-KRAB处理的视网膜中都观察到RHO蛋白质的减少。此外，通过免疫荧光分析，相对于ZF6-KRAB处理的视网膜，在ZF6-DBD中观察到RHO蛋白质量明显更高的减少(图4F-H)。该结果也在组织切片中定性地确认(图4)。事实上，可区分人和非人RHO蛋白质的抗体用于P347S视网膜上并且显示与EGFP对照相比，在ZF6-DBD处理的视网膜中没有人视紫红质蛋白染色，在EGFP对照中，阳性染色在变性的感光体外节中是明显的。为了进一步表征P347S表型，作者进行了免疫组学研究。图4D显示在P30时在P347S中AAV8视网膜下基因转化后20天时的ZF6-DBD的核定位。抗-HA标签染色显示核定位和感光体细胞的高转导效率。除了没有HA染色，EGFP对照视网膜显示明显减少的感光体细胞核。这些数据表明ZF6-DBD的AAV8递送产生高效且合适的核定位，导致视网膜结构的部分保留。
在细胞命运转变、谱系关系和功能障碍期间，动态激活调节DNA元件和表观遗传学特征。因此，DNA-结合蛋白对DNA的可及性同步动态变化。大体上，根据目标细胞的发育和代谢状态，可确保DNA-结合蛋白可能遇到完全不同的基因组特征。在这种布置下，作者决定在活性感光体分化状态期间测试ZF6-DBD是否对视网膜分化有影响，并且P347S视网膜功能的功能恢复是否可能与之前可观察到的结果一致。作者在P4时用AAV8-CMV-ZF6-DBD视网膜下注射P347S小鼠。在P4时，视网膜成神经细胞部分仍然在分裂，其中离开细胞循环的那些处于活性分化状态。如图5所示，处理后26天(P30)，作者观察到与P14和P30处理的眼相比更高的视网膜功能恢复(图6)。这些数据表明视网膜发育并不影响ZF6-DBD的安全性和功效。
图6显示当在早期时间点上进行AAV8-CMV-ZF6-DBD时治疗结果的主要增加。
评估对于靶向的基因组特征(如人疾病感光体的人RHO启动子区)指定的DNA-结合蛋白的DNA结合特异性的主要困难之一是其他相似基因组内容对测试的可及性。具体地，除了P347S突变人视紫红质基因以外，P347S小鼠模型仅具有3.4kb的人RHO启动子，即，RHO启动子的有效部分，并且明显在人视紫红质基因周围没有部分，因此限制了体(感光体)基因组细胞-特异性特征的人基因组特异性(Li T，Snyder WK，Olsson JE，Dryja TP(1996)Transgenic mice carrying the dominant rhodopsin mutation P347S：evidence fordefective vectorial transport of rhodopsin to the outer segments(携带显性视紫红质突变P347S的转基因小鼠：视紫红质向外节的缺陷定向转运的证据).Proc Natl AcadSci USA 93：14176-14181)。事实上，P347S突变人视紫红质基因的随机整合和拷贝数变化可能影响人RHO感光体基因座在视杆中的忠实相似度(faithful resembling)。
基于人和猪ZF6-DBD目标位点之间的序列相同性(图7)，作者决定在猪视网膜中评估构建体的功能性能力。作者在猪视网膜(成年雌性P90)的生理完整的基因组特征中视网膜下注射低剂量(1x10e10)的AAV8-CMV-ZF6-DBD，该猪视网膜的RHO近端启动子基因座区含ZF6结合序列，除了1个错配以外(图7)。为了评估“纯”转录效果而非由于视网膜敲减的可能的二次变性，进行早期处死。在载体给予15天后，视网膜的转导部分(EGFP阳性)上的qRT-PCR和authorsstern印迹分析分别证明抑制45％视紫红质转录和Rho蛋白质水平的稳健下降(图8)。显然，ZF6-DBD的相对表达水平和抑制的所得水平之间的比率为3个log单位。
定量为AAV8-CMV-ZF6-DBD转基因转录水平(qRT-PCR)的视网膜转导效率平均比NRL和CRX低148至32倍，NRL和CRX是用作参照的2种视杆特异性转录因子(图9)。在AAV载体转导的视网膜上的染色质免疫沉淀实验(ChIP)显示ZF6-DBD合适地占据在基因组目标上(图10)。ZF6-DBD AAV-转导的视网膜与抗-HA标签抗体的共免疫组化染色显示强的核定位。与视杆特异性标志物(GNAT)共免疫染色显示ZF6-DBD的表达与视紫红质蛋白质表达水平逆相关。具体地，在最强HA-染色的视杆中，视紫红质实际上不存在。另外，ZF6-DBD转导的视杆的外节似乎完全塌缩，这与视杆外节在量上包含90％的视紫红质(其赋予外节结构性质)的事实一致(如rho敲除小鼠中所观察到)。尽管没有视紫红质，感光体细胞核的排数似乎是保守的(图11)。此外，ZF6-DBD在视锥细胞中的错误表达并不影响它们的形态外观，还如视锥细胞特异性转录物抑制蛋白3的水平所示(图8)。
为了评估较早的时间点，作者测量了注射后7天的感光体转录水平，如图所示(图12)，结果与注射后15天观察到的相似。
为了评价载体剂量对ZF6-DBD功能性的影响，作者用双倍前述所用剂量，即2x10e10vg的载体剂量注射一系列猪视网膜。如图12B所示，AAV8-CMV-ZF6-DBD或AAV8-CMV-EGFP的更高剂量在评估的转基因转录水平中反映。然而，视紫红质转录水平值与用1x10e10vg所获得的值相似。
通过RNA-seq在ZF6KRAB和ZF6-DBD之间比较以评价脱靶。
为了进一步了解对由我们的人工转录因子诱导的干扰特征，作者进行了整个转录组测序[RNA-Seq](Mortazavi A，Williams BA，McCue K，Schaeffer L，Wold B.NatMethods.2008Jul；5(7)：621-8)。RNA-seq能够检测从转录器活性产生的RNA-转录本和水平。因此，RNA-seq测量DNA-结合蛋白的脱靶活性和目标的最后输出。与其中提供给定DBD的整个基因组图的ChIP-seq分析不同，RNA-seq能够检测来自功能相关基因组位点中的结合的相关功能活性(转录本)(转录上敏感)。作者具有来自在3个月用ZF6-KRAB或ZF6-DBD注射并在注射后8或15天处死的猪的11个视网膜。数据集由3个ZF6-KRAB处理的和3个ZF6-DBD处理的视网膜加上5个对照(与内部对照相同的视网膜的非转导区域，表2)组成。
表2：用于全转录组测序[RNA-Seq]的视网膜
用以下亿明达(Illumina)索引来评估读数质量：
每条通道的原始簇。由图像分析模块检测到的簇的数量。
完美索引读数％。在完美匹配给定索引的该样品中索引读数的百分比。
一个错配读数(索引)％。与给定索引有1个错配的该样品中索引读数的百分比。
＞＝Q30的％。来自通过滤器的簇的具有Q30或更高的碱基的碱基产率除以通过滤器的簇的总产量。
平均质量分数(PF)。通过滤器的簇的质量分数的总和除以通过滤器的簇的总产率。
作者用平均计数大于或等于3来过滤基因，并且选择具有小于或等于0.05的调整的P值的那些来鉴定处理的视网膜中与对照相比差异表达的基因(DEG)。令人惊讶的是，作者发现与ZF6-KRAB处理相比，ZF6-DBD处理诱导较低数量的未调节基因，并且与野生型条件相比，来自经处理的样品的基因的波动水平可忽略。我们分别在ZF6-DBD处理的视网膜中获得81个DEG(其中的2个包括EGFP和ZF6-DBD)，并在ZF6-KRAB处理的视网膜中获得204个DEG(图13以及表3和4)。
表3A：ZF6-DBD差异表达的基因(81，FDR＜0.05)
表3B：ZF6-DBD差异表达的基因的功能说明(81，FDR＜0.05)
表4：ZF6-KRAB差异表达的基因(204，FDR＜0.05)
作者发现2个差异表达基因集之间的高一致性说明，及其倍数变化值上的高度相关性，表明2个人工构建体有相同的生物化学性质并且考虑它们经工程改造的结合特异性能够结合相同基因。
为了排除2次实验之间共同的57个目标基因的数量是偶然的，作者计算了超几何概率，其测试从组成已知的群体中获得特定基因亚组的概率，得到p值＜4.711962e-93。该值证实了以下发现，即2次实验共有大部分的干扰基因。
如表3所示，有趣的是，在ZF6-DBD处理的视网膜中，81个DEG中的60个上调而21个下调。不预期该DEG集在任何功能关系中富集。为了确定关系是否在81个DEG之间存在，作者进行了超集合测试。作者发现在2个不相关类别(GO：0005576，胞外区；GO：0010951，内肽酶活性的负调节)中富集(FDR＜0.05)。每一百万个片段映射的FPKM(认作表达水平)中每一千个碱基外显子的片段证明表达，其与内源性转录因子相比似乎非常低。该结果强调了ZF6-DBD功能的效力(图9)。事实上，ZF6-DBD的表达水平强烈地表明其特异性和亲和性，也表明ZF6-DBD至少部分不与其他内源性TF竞争。
值得注意的是，如果与天然转录因子如视杆特异性转录因子NRL的那些数量(457)相比，与ZF6-DBD处理相关的DEG的数量(81)一直很小。另外，通过用qRT-PCR测量，ZF6-DBD使RHO转录沉默，表达水平比NRL低148倍。
作者进行了在2个差异表达的基因集上进行了基因集富集分析(基因集富集分析：一种用于解释基因组范围表达概况的基于知识的方法；Subramanian等，2005)以鉴定2个实验中的上调或下调过程。作者观察到2个集有相似的功能。尤其是在光传导的内容中，发现这些过程的显著下调[GO：0042462，眼感光系细胞发育；GO：0007602，光传导]。这些数据与由于ZF6-DBD或ZF6-KRAB活性的RHO下调导致二次转录变化的事实相一致(内源细胞特异性调节代码，即，全细胞特异性转录组图)。因此，可能推导出ZF6-DBD或ZF6-KRAB(结合的ZF6-DBD或ZF6-KRAB基因组)的主要物理目标远少于观察到的那些，并且在RHO下调之后一系列功能相关的转录物被二次扰乱。
因此，由于以下事实，ZF6-DBD本身是强效的并且模拟并胜过转录信号转导的固有稳健性：
·人工DNA-结合结构域在调节网络的拓扑结构的外部(转录因子结合至其目标基因附近的特定DNA结合位点的相互作用)
·人工DNA-结合结构域在转录上独立于内源性细胞特异性调节代码(全细胞特异性转录组图)。事实上，天然TF本身属于细胞特异性转录组图(调节子的调节子)，因此它们受到其他细胞特异性TF设定的精细调节，其控制它们的转录激活或抑制，最终产生细胞特异性功能。
·人工DNA-结合结构域没有蛋白质-蛋白质相互作用结构域
作为进一步观察，作者还假设ZF6-DBD在AAV载体生产期间可能具有比ZF6-KRAB更安全的概况，其中含有转基因(在AAV-ITR之间)的质粒与REP和CAP质粒共转染到HEK 293细胞中(方法参见Auricchio等，2001)。值得注意的是，在AAV载体生产期间，如果ITR之间的转基因(即，ZF-KRAB或ZF-DBD)处于遍在启动子如CMV控制下，则其在HEK 293细胞中表达。作者观察到，当产生AAV8-CMV-ZF6-KRAB时，观察到非常低的载体产率(图14)。相反，当ZF6-KRAB处于视网膜特异性启动子(RHOK)控制下时，载体的效价恢复至正常产率(约1x10E12)。在ZF6-DBD生产的情况中，生产细胞中遍在CMV启动子元件和由此的ZF-DBD表达没有负面影响并且载体产率在正常值内(图10)。
替代策略
对于我们用于治疗常染色体显性视网膜色素变性的治疗策略的第二部分，作者评价了用人视紫红质CDS的野生型拷贝替代ZF6被抑制等位基因。为了建立替换条件，作者选择人转导蛋白1(GNAT1)启动子，其对于视杆有特异性(J Lee等，Gene Therapy 2010)以在视杆中特异性递送转基因，并且提高AAV的剂量以具有最佳的视杆转导。由于人视紫红质启动子含有ZF6的结合位点，其不可用于替代策略。作者生成了具有eGFP报告基因的AAV以提高转导水平并进行剂量响应研究。作者在猪视网膜中注射3种不同剂量的AAV8-hGNAT1-eGFP，1x1010、1x1011和1x1012。15天后，我们处死动物，并且收集视网膜用于评价视网膜中eGFP的定位和转录水平。通过q实时PCR，我们评估eGFP的转录水平，并且观察到eGFP mRNA的表达增加与使用的剂量增加相关。当我们评价视网膜中eGFP的定位时，我们注意到表达仅限定于视杆中。基于这些结果，作者使用1x1012剂量来替代。因此，作者在3月龄猪中使用2种AAV来进行沉默和替代实验，1x1011剂量的AAV8-CMV-ZF6-DBD，用于抑制内源性猪视紫红质，和1x1012剂量的AAV8-hGNAT1-hRHO。注射后15天分析的转录本表达水平显示，抑制约55％的内源性猪紫红质，并且被抑制的蛋白质用人野生型CDS替代(总猪视紫红质的约33％)。该数据证明抑制内源性视紫红质并用外源性人视紫红质将其替代是可行的。这些对于由视紫红质序列突变以突变依赖方式引起的常染色体显性视网膜色素变性的治疗是非常理想的结果(图15和16)。如所示，GNAT1(视杆特异性)和Arr3(视锥特异性)转录水平不受ZF6-错误表达的影响。这也得到RNA-seq数据的强力确认。
顺式作用DNA元件(顺式调节元件，CRE)对基因表达的贡献。
结合和非结合DNA基因组序列基序的顺式调节潜力由以下确定：1-DNA本身的化学物理性质(A、C、G和T碱基是化学实体，其锁着主链糖和磷酸基团的纳入产生三维双链结构，其中各碱基对具有特定化学和构象特征)和2-表观遗传约束、3-蛋白质-蛋白质相互作用的复合物、4-长距离物理连通(沿着远距离基因座，包括不同染色体的3D物理连通)(Stamatoyannopoulos JA.Genome Res.2012 Sep；22(9)：1602-11和Rohs R，Jin X，WestSM，Joshi R，Honig B，Mann RS.Annu Rev Biochem.2010；79：233-69)。事实上，大多数由生物化学特征限定的基因组DNA序列缺少强的进化保守性，并且大多数高度保守的基因组DNA序列元件避开了使用生物化学和其他功能性试验的注释。此外，核苷酸水平的进化保守性本身是功能性调节变化和功能的较差预测物(Maurano MT，Wang H，Kutyavin T，Stamatoyannopoulos JA.PLoS Genet.2012；8(3)：e1002599)。
因此，DNA序列特征或DNA信息内容是超过作为仅由4个字A、C、G和T组成的字母表的一维字母链的核苷酸序列角度的方式，相反，存在蛋白质和基因组DNA之间更高级复合物(Stamatoyannopoulos JA.Genome Res.2012年9月；22(9)：1602-11和Rohs R，Jin X，WestSM，Joshi R，Honig B，Mann RS.Annu Rev Biochem.2010；79：233-69)。
已经采用一系列不同方法来确定基因组DNA中含有的DNA序列特征(Genomicapproaches towards finding cis-regulatory modules in animals(基因组方法指向发现动物中的顺式调节模块).Hardison RC，Taylor J.Nat Rev Genet.2012年6月18日；13(7)：469-83)。无论如何，这些方法中的许多依赖于种系基因组工程改造并且因此缺少在基础科学和医学中急需的主要特征，在发育、成年和衰老中在体细胞中的特性细胞类型中(因此，在各自或不同类别的体细胞类型中)空间和时间上鉴定活性选择性调节DNA之一。
考虑到基于一级DNA序列的预测较弱，需要用于在特定体细胞类型中在空间和时间上生成可能的活性调节DNA的无偏好筛选的系统。作者测试了上述提及的ZF6-DBD生物化学特征可用作通过AAV载体介导的体细胞(感光体)基因转化确定特性细胞类型(感光体)中的顺式调节元件的方法的假设。
作者能够证明ZF6-DBD目标位点内的短序列(ZF6-DBDCis-seq)具有赋予RHO启动子活性所需的碱基组成和长度。这种关联的20bp ZF6-DBD目标位点位于距离转录起始位点94位处的人基因组启动子上(图7)。
具体地，作者显示覆盖人视紫红质近端启动子(ZF6-DBDCis-seq)的20bp并且改变这些序列中含有的5bp的人工DNA-结合蛋白完全消除的RHO表达。此外，作者也能够证明单个DNA碱基变化能够消除RHO启动子驱动的表达。另外，作者显示在非视杆特异性细胞中该区域通过内源性转录抑制子KLF15受到潜在控制，其靶向ZF6-DBD的相同基因组序列并且其在视杆中的错误表达生成RHO转录沉默。
ZF6-DBDCis-seq基因组元件的特征。
首先作者研究ZF6-DBDCis-seq的DNA-蛋白质相互作用性质。凝胶移位分析证明ZF6-DBD在hRho近端启动子区43bp寡核苷酸双链体上的结合，包括ZF6-DBD共有序列。当18bp ZF6-DBD核心序列保留并且43bp寡核苷酸双链体的25bp改变时，特异性还得到ZF6-DBD结合的支持(hRho mut F和hRho mut L；图17)。
作者接着通过互补研究基因组ZF6-DBDCis-seq。为了以高度空间分辨率分离ZF6-DBDCis-seq的特征，作者生成了259bp的短的人RHO近端启动子(164bp来自TSS并且95bp是5′UTR；hRHO)。为了确定hRHO驱动的转录输出，作者生成了AAV-EGFP报告构建体(AAV8-hRHO-EGFP)并注射至成年WT C57BL6小鼠中并评估hRHO体内驱动的EGFP表达(科尔沃号(Corbo Ref))。因此，在该实验设定中，作者用该hRHO启动子序列刺激整个小鼠感光体核蛋白质组。视网膜下递送15天后的qRT-PCR分析显示，hRHO报告构建体能够在体内持续表达EGFP(图18)。
为了通过在体细胞(感光体)上的AAV载体介导的基因转化证明特定细胞类型(感光体)中的顺式调节元件(空间和时间上活性调节DNA)，作者接着生成携带ZF6-DBDCis-seq诱变或缺失的构建体。作者生成了2个构建体：1-完全缺失(GGGGGTTAGagGGTCTACGA[SEQ IDNo.22]；ZF6)；2-诱变的ZF6-DBD目标(TTACTGTAATCTTAACCGGA[SEQ ID No.29]；MutZF6)(图19和20)。
为了体内测试合适细胞类型中ΔZF6和MutZF6 DNA变化的功能结果，作者寻求研究AAV载体基因向感光体的转化是否可能代表进行这种评估的方便方法。因此，作者生成了5’UTR处含人RHO启动子(参见方法)并且在其RHO启动子序列中嵌入ΔZF6或MutZF6以控制EGFP表达的AAV8载体(AAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP和AAV8-hRHO-MutZF6-5’UTR-EGFP)。在产生AAV载体之后，野生型小鼠(P30)以1x10e9vg的载体剂量接受AAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP、或AAV8-hRHO-MutZF6-5’UTR-EGFP、或AAV8-hRHO-5’UTR-EGFP作为阳性对照。如图11和12所示，在处死(P50)之后，RT-PCR和免疫组学研究显示在AAV8-hRHO-ΔZF6-5’UTR-EGFP或AAV8-hRHO-MutZF6-5’UTR-EGFP注射的眼中，与含有完全RHO近端启动子DNA序列的启动子相比，EGFP表达水平高度显著下降。该结果表明感光体中hRHO元件的活性需要ZF6-DBD顺式作用元件。另外，小鼠中ZF6目标序列缺少保守性强调了控制基因表达和体内AAV载体在合适的体细胞目标(即感光体)中递送方法强度的调节DNA序列中含有的关键特征和信息内容(包括结构)以阐明顺式调节元件功能。
为了缩小该ZF6-DBDCis-seq的活性的功能性基础，作者进行了系统发生序列分析。意外的是，ZF6-DBDCis-seq的5’在小鼠Rho启动子序列中不保守。作者生成了鼠形式的报告构建体；243bp(165bp来自TSS并且78bp是5′UTR；mRHO)。在成年WT C57BL6小鼠中注射15天后，与人对应物相比报告子活性降低(35％)。然而，活性被保留。然后，作者想知道TF结合位点结构在2个物种之间是否偏离。TF结合位点作图显示NRL和CRX结合位点侧接ZF6-DBDCis-seq。人存在脊椎动物中保守的另一个CRX结合位点，其似乎在小鼠中缺失。因此，作者测试了CRX和NRL结合位点与ZF6-DBDCis-seq一起是否生成功能性单元的假设。在人hRHO中插入鼠“功能性单元”(hRHO InsMurine)明显模拟鼠启动子片段的转录功能(图21)。相反(mRHO InsHuman)，与hRHO相比，鼠RHO近端启动子中的人片段产生稍高的表达。这些结果支持了在人和鼠启动子中都存在离散的功能性单元的模型。为了进一步解析该序列的性质，作者测试了20bp ZF6-DBDCis-seq的关键特征是否位于小鼠序列中不存在的CACCCCCA[SEQID No.55]。核苷酸变化(hRHO MEvo)完全消除了活性，而同一序列的删除(hRHOΔEvo)令人惊讶地产生持久活性。该结果支持基因组上的ZF6-DBD DNA结合位点不是在TF结合后控制视紫红质反式激活的明显内源性TF结合位点。缺少与活性保留偶联的结合位点和使用的启动子的缩短也排除了“CTCF”循环机制。另外，该结果支持序列并不作为TF结合位点发挥作用，但是该核苷酸组成和长度可能在生成启动子功能中起到必要作用。作者还用GGGGG[SEQID No.57](hRHO 5G)替代CCCCC[SEQ ID No.56]伸展测试了核苷酸变化是否对序列组成敏感，但是观察到类似的活性损失。为了进一步确定该序列的敏感性水平，作者仅突变了1个碱基(CCACC[SEQ ID No.58]；hRHO T3C)并且明显消除了启动子活性(图21)。这些数据支持了一种模型，其中，该RHO调节基因组功能性单元的性质遵从准确规律，连接CRX和NRL DNA-结合位点的20bp-长基因组DNA(ZF6-DBDCis-seq)携带在长度和核苷酸组成上复杂且有特异性的特征。该功能单元在小鼠中偏离，然而其保留了控制人对应物的基础规则。事实上，该功能单元在人和小鼠RHO启动子(hRHO InsMurine；mRHO InsHuman)中是可交互运输的，产生与其所属物种中产生的相同的转录输出。
基于在感光体具体上下文中通过上述实验回收的RHO顺式作用调节性质的提取，作者决定使用其中存在的反式DBD结构域方法以反映通过诱变分析生成的顺式作用效果(上述)。作者生成了缺少第6指，并且因此限制DBD结构域的目标位点的ZF6-DBD的较短形式(图30)。称为ZF6-5或ZF6-5F(5代表5指)的该人工DBD结构域生成更精确地靶向鉴定的新型RHO顺式作用元件，避免ZF6-DBD在NRL位点上的潜在干扰。该新型蛋白质可生成特异性地以RHO顺式作用元件CCCCCA[SEQ ID NO.30]为中心的干扰。为了测试ZF6-5的活性，P15时在P347S小鼠中注射AAV8载体(AAV8-CMV-ZF6-5F)并且在P30(载体给予后15天)时通过ERG分析评估功能性结果。如图31所示，与对照(AAV8-EGFP)相比，ZF6-5的活性产生对视网膜功能的保留。为了进一步探索其他基于TAL技术并同时更为适当地靶向鉴定的RHO顺式作用元件的潜在反式DBD结构域，作者生成了如图30所示的2个TAL-基DNA结合结构域。然后，这2个DBD结构域TALRHO(02)和TAL7用于生成AAV8载体(AAV8-CMV-TALRHO(02)-DBD和AAV8-CMV-TAL7-DBD)并且在P347S小鼠中测试，如上所述。与ZF6-5类似，与EGFP注射的对照相比，AAV8-CMV-TALRHO-(02)-DBD和AAV8-CMV-TALRHO-(02)-DBD都产生了对视网膜功能的明显保留。
为了进一步分析ZF6-DBDCis-seq，作者通过TRANSFAC分析扫描了20bp和相应的鼠序列(TATGATATCTCGCGGATGCT，[SEQ ID No.59])。如图22所示，作者回收了人的3个基质和小鼠序列的1个不同基质。以CCCCCA[SEQ ID NO.30]序列为中心的基质显示RREB-1因子，其属于视网膜特异性KLF15TF。KLF15是锌指TF，其显示在体外结合CCCCCA[SEQ ID NO.30]序列。基于KLF15在除了感光体以外的视网膜表达的表达特征，表明其功能可能依赖于视网膜的非视杆细胞中视紫红质转录表达阻断。作者认为，如果确实如此，KLF15在感光体中的错误表达可能会导致RHO沉默。作者生成了携带人KLF15(AAV8-CMV-KLF15)的AAV8载体并且注射猪视网膜。递送后15天，AAV8-CMV-KLF15转导导致令人瞩目的猪视紫红质的50％抑制和视杆特异性GNAT1基因的类似相对抑制。这些结果表明当在视杆细胞中错误表达时，已知结合序列CCCCCA[SEQ ID NO.30]的另一种反式作用元件(内源性TF)与ZF6-DBD有类似作用。
这些数据强烈地表明ZF6-DBD所靶向的顺式调节元件是对于视紫红质表达关键的人视紫红质启动子的新型顺式调节元件。
因此，ZF技术和AAV视网膜基因转移允许以2种倒易的方式确定调节DNA元件的功能：
A)不含效应结构域的靶向DNA序列的ZF DBD的设计可用于鉴定新型顺式调节元件。在ZF6-DBD的情况中，作者鉴定了先前未知的元件。此外，考虑到顺式调节元件发挥作用的具体细胞类型，AAV载体在空间(在作者的情况中，a-视网膜下给予，b-具有对感光体的趋向性的载体，并且可能用感光体特异性启动子)和时间(在不同时间点上视网膜下给予)上表达ZF6-DBD构建体的能力允许经调整的方法来在时间和空间上鉴定并确定顺式调节元件的性质。
B)可采用许多策略来研究基因组调节序列(Genomic approaches towardsfinding cis-regulatory modules in animals(基因组方法指向发现动物中的顺式调节模块).Hardison RC，Taylor J.Nat Rev Genet.2012年6月18日；13(7)：469-83)。然而，首次采用体内AAV载体介导的基因转移的应用。作者显示的数据描述了一种鉴定体细胞中AAV载体的顺式调节元件活性的方法(图14和19)。White MA等PNAS 2013 11952-11957，2013年7月(Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly localfeatures determine the cis-regulatory function of ChIP-seq peaks(体内大致平行的增强子试验解释了高度局部特征确定ChIP-seq峰的顺式调节功能).White MA，MyersCA，Corbo JC，Cohen BA.Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月16日；110(29)：11952-7)描述了一种原理上相似的方法。无论如何，在那种情况下使用视网膜电穿孔(代替AAV8载体)。
因此，作者提出了2步方法：
-体内测试(通过作者所示的AAV-载体递送，或通过White MA，Myers CA，CorboJC，Cohen BA.Proc Natl Acad Sci U S A.2013年7月16日；110(29)：11952-7.Massivelyparallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determinethe cis-regulatory function of ChIP-seq peaks(体内大致平行的增强子试验解释了高度局部特征确定ChIP-seq峰的顺式调节功能)报道的高通量电穿孔)一系列顺式突变体(感兴趣的基因的启动子、增强子)来鉴定控制表达的关键区；
-生成人工DNA-结合蛋白来模拟原理上可发挥激活子或抑制子功能的顺式功能。
Barrow等，PNAS 2012测试了以下假设，使用针对β-球蛋白的已知顺式调节元件的锌指技术并且使用转基因方法来证明没有效应结构域的锌指可用于研究并且调节已知顺式调节DNA元件的功能而非鉴定新型CRE的方法。另外，Barrow使用的转基因与种系方法(以不受控制的时间和空间表达与剂量随机整合转基因)而非采用在遍在启动子控制下的ZF-DBD的非种系靶向方法联用。因此，该研究主要受限于缺少时间和空间的控制，这对于在特定细胞类型中确定顺式调节元件(在空间和时间中有活性的调节DNA)的功能明显是关键的。相反，作者使用的与AAV载体介导的体基因转移联用的方法允许控制剂量、细胞限制(空间分辨)和时间(载体递送时间；时间分辨)；这是特定细胞类型中顺式调节元件(空间和时间上有活性的调节DNA)的合适评估的重要决定因素，尤其是考虑到现有的基因组研究表明作者可合理地认为“由体细胞构成的身体是遗传功能镶嵌现象”。
为了评估在同一ZF6目标DNA区上是否可应用另一种技术生成DNA-结合结构域，作者使用转录激活物样效应物(TALE)技术(Breaking the code of DNA bindingspecificity of TAL-type III effectors(打断TAL-III型效应物的DNA结合特异性的代码).Boch J，Scholze H，Schornack S，Landgraf A，Hahn S，Kay S，Lahaye T，NickstadtA，Bonas U.Science.2009年12月11日；326(5959)：1509-12)。由于该平台允许调整从T DNA碱基开始的任何DNA-结合蛋白，作者在ZF6目标位点上生成了以下2个构建体：TCAGCATCTGGGAGATTG[SEQ ID No.24]和互补序列TCTGGGAGATTGGGGG[SEQ ID No.60]。HEK293细胞上的瞬时转染实验显示TALE-DBD在体外以与ZF6-DBD和ZF6-KRAB相似的程度抑制CRX介导的表达(图23)，表明TALE技术可替代锌指技术采用上述系统。

Claims (31)

1.一种由DNA结合结构域组成的蛋白质，所述DNA结合结构域靶向选自下组的基因的DNA调节序列：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2、RP33。
2.如权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，对所述DNA调节序列的靶向诱导所述基因的表达的抑制。
3.如权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于，所述基因是突变型或野生型。
4.如权利要求1或2所述的蛋白质，其特征在于，所述基因是突变型。
5.如前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述DNA结合结构域选自下组：锌指结构域、转录激活物样(TAL)DNA结合结构域或RNA-导向的DNA结合结构域或其功能性片段或其功能性衍生物。
6.如前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其特征在于，在所述基因的启动子区序列中包含所述DNA调节序列。
7.如前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其特征在于，在RHO的启动子区序列中包含所述DNA调节序列。
8.如前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述DNA调节序列包含选自下组的序列：GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ ID No.22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQ IDNo.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ ID No.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID No.25)、GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQ ID No.26)、TGAACACCCCCAATCTCC(SEQ ID No.27)或GTGGGGGTTAGAGGGT(SEQ ID No.28)。
9.如前述权利要求中任一项所述的蛋白质，其特征在于，所述DNA调节序列基本具有选自下组的序列：GGGGGTTAGAGGGTCTACGA(SEQ ID No.22)、CACCCCCAATCTCCCAGATGCTGAT(SEQID No.23)、TCAGCATCTGGGAGATTG(SEQ ID No.24)、GGGGGTTAGAGGGTCT(SEQ ID No.25)、GGGGGTTAGAGGGTCTA(SEQ ID No.26)、TGAACACCCCCAATCTCC(SEQ ID No.27)或GTGGGGGTTAGAGGGT(SEQ ID No.28)。
10.如权利要求7、8或9中任一项所述的蛋白质，所述蛋白质基本由选自下组的序列组成：SEQ ID No.3、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17，或其功能性片段或功能性衍生物。
11.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1-10中任一项所述的蛋白质。
12.一种载体，所述载体包含如权利要求11所述的核酸分子。
13.如权利要求12所述的载体，其特征在于，所述载体是病毒载体。
14.如权利要求13所述的载体，所述载体选自下组：腺病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关载体(AAV)或裸质粒DNA载体。
15.如权利要求12-14中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包括选自下组的基因的核苷酸序列：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33。
16.如权利要求12-15中任一项所述的载体，其特征在于，所述载体还包含视网膜特异性启动子和任选的调节序列。
17.如权利要求16所述的载体，其特征在于，所述视网膜特异性启动子是视紫红质激酶(RHOK)启动子或转导蛋白1(GNAT1)启动子，优选人转导蛋白1(GNAT1)启动子。
18.一种宿主细胞，所述宿主细胞由权利要求12-17中任一项所述的载体转化。
19.一种病毒颗粒，所述病毒颗粒含有权利要求12-17中任一项所述的载体。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-10中任一项所述的蛋白质或权利要求11所述的核酸或权利要求18所述的宿主细胞或权利要求19所述的病毒颗粒和药学上可接受的赋形剂。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求12-17中任一项所述的载体和药学上可接受的赋形剂。
22.如权利要求21所述的药物组合物，所述药物组合物还包含含有选自下组的基因的核苷酸序列的载体：RHO、BEST1、CA4、RP17、CRX、FSCN2、RP30、GUCA1B、RP48、IMPDH1、RP10、KLHL7、RP42、NR2E3、NRL、RP27、ORP1、DCDC4A、RP1、PRPF3、RP18、PRPF31、PRPF6、rp60、PRPF8、PRPH2、RDS、RP7、ROM1、RP1、L1、RP63、RP9、RPE65、RP20、SEMA4A、RP35、MERTK、RP33、TOPORS、HK1、PRPF4、RDH12、LCA13、RP53、SNRNP200、ASCC3L1、BRR2、HECIC2和RP33。
23.用于治疗常染色体显性遗传眼病和/或常染色体隐性遗传眼病的权利要求1-10中任一项所述的蛋白质或权利要求11所述的核酸或权利要求12-17中任一项所述的载体或权利要求18所述的宿主细胞或权利要求19所述的病毒颗粒或权利要求20-22中任一项所述的药物组合物。
24.用于权利要求23的用途的权利要求1-10中任一项所述的蛋白质或权利要求11所述的核酸或权利要求12-17中任一项所述的载体或权利要求18所述的宿主细胞或权利要求19所述的病毒颗粒或权利要求20-22中任一项所述的药物组合物，其中所述治疗是基因治疗。
25.用于权利要求23或24的用途的权利要求1-10中任一项所述的蛋白质或权利要求11所述的核酸或权利要求12-17中任一项所述的载体或权利要求18所述的宿主细胞或权利要求19所述的病毒颗粒或权利要求20-22中任一项所述的药物组合物，其中所述常染色体显性遗传眼病是常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)或先天性静止性夜盲。
26.用于权利要求23或24的用途的权利要求1-10中任一项所述的蛋白质或权利要求11所述的核酸或权利要求12-17中任一项所述的载体或权利要求18所述的宿主细胞或权利要求19所述的病毒颗粒或权利要求20-22中任一项所述的药物组合物，其中所述常染色体显性遗传眼病是常染色体显性视网膜色素变性(ADRP)。
27.用于权利要求23或24的用途的权利要求1-10中任一项所述的蛋白质或权利要求11所述的核酸或权利要求12-17中任一项所述的载体或权利要求18所述的宿主细胞或权利要求19所述的病毒颗粒或权利要求20-22中任一项所述的药物组合物，其中所述常染色体隐性遗传眼病是常染色体隐性视网膜色素变性。
28.一种用于治疗有此需要的对象中的常染色体显性遗传眼病或常染色体隐性遗传眼病的方法，所述方法包括给予合适量的权利要求1-10中任一项所述的蛋白质或权利要求11所述的核酸或权利要求12-17中任一项所述的载体或权利要求18所述的宿主细胞或权利要求19所述的病毒颗粒或权利要求20-22中任一项所述的药物组合物。
29.一种鉴定靶向潜在DNA调节序列的DNA结合结构域的方法，所述方法包括：
e)生成2个独立构建体：
-包含在所述潜在DNA调节序列控制之下的报告基因序列的第一构建体；
-包括在已经突变的所述潜在DNA调节序列控制之下的报告基因序列的第二构建体；
f)在视网膜中体内表达步骤a)的各构建体；
g)比较在所述潜在DNA调节序列控制下的报告基因的表达与在突变的潜在DNA调节基因控制下的报告基因的表达；
其中，如果观察到与在潜在DNA调节序列控制下的报告基因的表达相比突变的潜在DNA调节序列控制下报告基因的表达减少，则所述潜在DNA调节序列是DNA调节序列并且由此鉴定到了DNA结合结构域；
h)任选地，设计靶向所述DNA调节序列的DNA结合蛋白。
30.一种通过权利要求29所述的方法鉴定的靶向潜在DNA调节序列的DNA结合结构域。
31.通过权利要求29所述的方法鉴定的靶向潜在DNA调节序列的DNA结合结构域，其中所述DNA结合结构域如权利要求1-10中任一项所限定。
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