CN101237884A - 与低氧应激反应有关的Int6蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种与低氧应激反应有关的Int6蛋白及其用途。本发明成功地鉴定出一种HIF2α结合因子(Int6)，其具有与HIF2α结合的活性，是一种能促进血管发生的与低氧应激反应有关的因子。此外，本发明发现，通过与HIF2α相互作用，Int6基因能抑制由HIF2α介导的低氧应激应答基因的转录。抑制Int6表达或其功能的物质通过提高HIF2α的活性以促进低氧应激应答基因的转录，从而促进了血管发生，并且其被期待对于包括心肌梗死在内的各种血管疾病具有疗效。

Description

与低氧应激反应有关的Int6蛋白及其用途
技术领域
本发明涉及调节低氧应激反应的Int6蛋白，包含调节该蛋白功能或该蛋白表达的物质的血管疾病治疗剂和抗癌剂，以及用于筛选这些药剂的方法。
背景技术
生物通过适应各种环境变化来维持其生命。对于该环境应激的应答反应不仅发生在生理水平上，还发生在细胞水平上，并且分子水平的应激反应机制业已被阐明。特别是，氧的存在是对所有生活在地球上的生物来说最重要的环境因素之一。
由于氧是对于在生物体内维持细胞功能所必需的能量源，缺氧就成为影响生命维持的严重问题。生物体处于低氧状态的原因包括贫血、心肺功能异常和高原生活。在这些状态下，活体内的每个细胞改变各种基因的表达方式并设法适应低氧应激。例如，由于细胞低氧应激的应答反应，活化了糖酵解途径并诱导了血管发生。
与低氧应激反应有关的一些基因在其上游区具有低氧反应元件(HRE)。低氧诱导转录因子(HIF)与HRE结合并促进转录。HIF业已被详细地分析，并已知其产生对于肿瘤内血管发生所必需的血管内皮生长因子(VEGF)，并调节与线粒体内能量代谢有关的多种糖酵解途径酶的转录。在实体瘤(如癌)中，尽管血流丰富，仍处于肿瘤内部相当低氧的状态，而该状态因而会促进血管发生。除血管发生外，HIF还在细胞内扮演各种角色，并据报导其与能量代谢途径、红细胞生长、铁代谢、细胞生长、细胞死亡、多巴胺代谢等有关。例如，促红细胞生成素基因表达的增强对于低氧下红细胞的生长是必需的，而VEGF基因的增加的表达对于血管发生是重要的。已知包括低氧诱导因子1α(HIF1α)、类HIF1因子(HLF)和GATA-2在内的转录因子在这些低氧反应基因的表达的调节中扮演重要的角色。HIF1α与细胞对低氧的反应密切相关。其在正常氧浓度(21％)下被遍在蛋白-蛋白酶体体系分解，但在低氧状态下其免除了这种分解，并转移到细胞核中以引发作为转录因子的各种因子的诱导。
pVHL是在正常氧浓度下分解HIF1α的因子的一例。pVHL与HIF1α结合并使HIF1α遍在蛋白化使其分解。此时，脯氨酸羟化酶(PHD)使HIF1α上的脯氨酸残基羟化，这使得pVHL可识别该位点。
HIF主要被分为三种：HIF1α、HIF2α和HIF3α。与遍在表达的HIF1α不同，HIF2α在血管内皮细胞、骨骼肌、心肌等中特异表达，而HIF3α在脑神经系中特异表达。已知HIF1α与例如脑梗死或心肌梗死的缺血性疾病有关(见非专利文献1～4)。HIF2α与低氧应激相关疾病(特别是癌)中的血管发生有关(见非专利文献5)。尽管已报道了与该HIF2α结合的几种因子，但能调节其功能的因子尚未被发现。
非专利文献1：Semenza G.L.，“HIF-1 and mechanisms of hypoxia sensing”Curr.Opin.Cell Biol.，2001 Apr，Vol.13(2)，p.167-71.
非专利文献2：Giaccia A.及其他两个作者，“HIF-1 as a target for drugdevelopment”2003 Oct，Vol.2(10)，p.803-11.
非专利文献3：Jelkmann W.，“Effects of erythropoietin on brain function”Curr.Pharm.Biotechnol.，2005 Feb，Vol.6(1)，p.65-79.
非专利文献4：Marti H.H.，“Erythropoietin and the hypoxic brain”J.Exp.Biol.，2004 Aug，Vol.207(Pt 18)，p.3233-42.
非专利文献5：Favier J.及其他三个作者，“Coexpression of endothelialPAS protein 1 with essential angiogenic factors suggests its involvement inhuman vascular development”Dev.Dyn.，2001 Nov，Vol.222(3)，p.377-88.
发明内容
本发明是鉴于上述情况而作出的。本发明的一个目的是阐明在低氧应激情况下与血管发生有关的基因的表达反应的机制，另一个目的是鉴定调节HIF2α功能(特别是能促进诱导血管发生的低氧应激反应的功能)的因子。更具体地，一个目的是提供调节低氧应激反应的药剂，对血管疾病有疗效的药剂，以及筛选这些药剂的方法。
本发明的发明者已进行了深入的研究以达到上述目的，并成功地得到了作为与促进血管发生的低氧应激反应有关的因子具有HIF2α的结合活性的新鉴定出的Int6。
已知低氧应答基因的转录在低氧应激时由HIF2α的作用促进。本发明揭示出，在该状态下，HIF2α的转录功能由Int6调节。更具体地，本发明揭示出，Int6与HIF2α相互作用，以HIF2α来抑制的低氧应激应答基因的转录。
抑制Int6基因表达或其功能(如，与HIF2α的结合活性)的物质被期待能通过提高HIF2α的活性以促进低氧应激应答基因的转录而增加血管发生的效果。这些物质被期待具有明显的血管发生效果，并对于各种血管疾病如闭塞性动脉硬化、经皮血管舒张治疗(PCT)后的再狭窄以及心肌梗死具有疗效。
此外，本发明的发明者准备了实验动物，它们的Int6基因表达被siRNA抑制，并发现在这些实验动物中血管发生效果确实提高了。因此，本发明的发明者已成功地确认，在实验动物水平上，抑制Int6表达或其功能的物质确实有效地提高了血管发生的效果。特别是，被期待具有对Int6基因表达有特异抑制作用的siRNA通过对转录调节因子的抑制，促进了对血管疾病有疗效的基因的表达，并被高度期待成为全新概念上的血管疾病治疗剂。
此外，人们期待提高Int6表达或其功能的物质能通过降低HIF2α的活性以促进低氧应激应答基因的转录而抑制血管发生的效果。由于在癌组织中血管发生效果增加了，这些物质可成为新的抗癌剂，其机制包括抑制血管发生。
此外，本发明的发明者首次发现，雌性激素抑制Int6的表达。也就是说，雌性激素通过抑制Int6基因表达来提高HIF2α的活性，从而促进低氧应激应答基因的转录，并被认为结果促进了血管发生。因此，雌性激素对于治疗例如通过改善血流量而改善病症的疾病(如闭塞性动脉硬化)是有效的。相反，人们期待雌性激素抑制剂具有通过抑制血管发生而具有的效果，例如抗癌效果。
基于本发明的发明者所获得的这些发现，可以筛选出血管疾病治疗剂和抗癌剂等。
本发明涉及调节低氧应激反应的药剂，对血管疾病或癌症有疗效的药剂，以及筛选这些药剂的方法。更特别的是，本发明提供：
[1]一种低氧应激反应促进剂，包含抑制Int6蛋白表达的物质或抑制Int6蛋白功能的物质作为有效成分；
[2]根据[1]的低氧应激反应促进剂，其中抑制Int6蛋白表达的物质是从由以下(a)～(c)构成的群组中选出的一种化合物：
(a)Int6基因转录物或其一部分的反义核酸；
(b)具有特异地剪切Int6基因转录物的核糖核酸酶活性的核酸；和
(c)具有利用RNAi效果来抑制Int6基因表达的功能的核酸；
[3]根据[1]的低氧应激反应促进剂，其中抑制Int6蛋白表达的物质是雌性激素、雌性激素分泌促进剂或雌性激素受体激动剂；
[4]根据[1]的低氧应激反应促进剂，其中抑制Int6蛋白功能的物质是从由以下(a)～(c)构成的群组中选出的一种化合物：
(a)与Int6蛋白结合的抗体；
(b)与Int6蛋白结合的低分子量化合物；和
(c)抑制Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性的化合物；
[5]根据[1]～[4]中任一项的低氧应激反应促进剂，其中低氧应激反应的促进是血管发生的诱导；
[6]一种低氧应激反应抑制剂，包含提高Int6蛋白表达的物质或提高Int6蛋白功能的物质作为有效成分；
[7]根据[6]的低氧应激反应抑制剂，其中提高Int6蛋白表达的物质是雌性激素抑制剂；
[8]根据[7]的低氧应激反应抑制剂，其中低氧应激反应的抑制是血管发生的抑制；
[9]一种血管疾病治疗剂，含有[1]～[5]中任一项的低氧应激反应促进剂作为有效成分；
[10]根据[9]的血管疾病治疗剂，其中血管疾病是缺血性脑疾病或缺血性心疾病、神经变性疾病、创伤性脑损伤、或者肝疾病、胰腺疾病、肌肉疾病或皮肤疾病；
[11]一种与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)，包含[6]～[8]中任一项的低氧应激反应抑制剂作为有效成分；
[12]根据[11]的与血管发生有关的疾病的治疗剂，其中与血管发生有关的疾病是癌症；
[13]一种Int6基因表达被人为地抑制了的非人类转基因动物；
[14]根据[13]的非人类转基因动物，其中Int6基因表达通过如下(a)～(c)中任一种核酸的作用而被抑制：
(a)Int6基因转录物或其一部分的反义核酸；
(b)具有特异地剪切Int6基因转录物的核糖核酸酶活性的核酸；和
(c)具有利用RNAi效果来抑制Int6基因表达功能的核酸；
[15]根据[13]或[14]的非人类转基因动物，其中血管发生效果被促进了；
[16]一种筛选血管疾病治疗剂的方法，其中选择使Int6基因表达水平或Int6蛋白活性降低的化合物；
[17]一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6基因表达细胞接触；
(b)测定所述细胞中Int6基因表达的水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物降低了表达水平；
[18]一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与细胞或细胞提取液接触，所述细胞包含具有如下结构的DNA，在该结构中，报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物降低了表达水平；
[19]一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白或表达该蛋白的细胞或该细胞的提取液接触；
(b)测定所述蛋白的活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的活性相比，该化合物降低了所述蛋白的活性；
[20]一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括对抑制Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性的化合物进行选择；
[21]一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白和HIF2α蛋白接触；
(b)测定Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的结合活性相比，该化合物降低了所述结合活性；
[22]一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，包括对提高Int6基因表达水平或Int6蛋白活性的化合物进行选择；
[23]一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6基因表达细胞接触；
(b)测定所述细胞中Int6基因表达的水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物提高了表达水平；
[24]一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与细胞或细胞提取液接触，所述细胞包含具有如下结构的DNA，在该结构中，报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物提高了表达水平；
[25]一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白或表达该蛋白的细胞或该细胞的提取液接触；
(b)测定所述蛋白的活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的活性相比，该化合物提高了所述蛋白的活性；
[26]一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，包括对提高Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性的化合物进行选择；
[27]一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白和HIF2α蛋白接触；
(b)测定Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的结合活性相比，该化合物提高了所述结合活性；以及
[28]一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，包括如下步骤：
(a)用测试化合物对[13]～[15]中任一项的非人类转基因动物给药；
(b)测定所述非人类转基因动物中的Int6表达水平或活性，或测定所述动物中的血管发生效果；并且
(c)选择一种化合物，与没有用所述测试化合物给药的情况(对照组)相比，该化合物降低了血管发生效果，或该化合物提高了Int6表达水平或活性。
此外，本发明还提供：
[29]一种血管发生诱导剂，包含Int6的显性失活突变体作为有效成分；
[30]根据[29]的血管发生诱导剂，其中Int6的显性失活突变体是一种Int6蛋白的C末端PINT区已缺失的Int6蛋白突变体；
[31]一种血管发生抑制剂(优选癌细胞的血管发生抑制剂)，包含Int6蛋白或Int6蛋白的表达载体作为有效成分；
[32]一种载体细胞，其中Int6基因表达已被抑制，并且血管发生已被诱导；
[33]根据[32]的载体细胞，在其中导入有Int6基因的siRNA；
[34]一种血管疾病治疗剂，包含[31]的血管发生抑制剂或者[32]或[33]的载体细胞作为有效成分；
[35]一种血管疾病治疗剂的生产方法，包括将Int6基因的siRNA导入到分离的载体细胞中的步骤；
[36]一种治疗血管疾病的方法，包括用有效量的如下(a)～(c)中的任一种给药的步骤：
(a)本发明的低氧应激反应促进剂；
(b)本发明的血管发生诱导剂；和
(c)本发明的载体细胞；
[37]一种治疗血管疾病的方法，包括如下步骤：
(a)将Int6基因的siRNA导入到分离的载体细胞中；并且
(b)用有效量的步骤(a)中的导入了siRNA的载体细胞给药；以及
[38]一种自体移植疗法，包括如下步骤：
(a)收集载体细胞；
(b)将Int6基因的siRNA导入到所收集的载体细胞中；并且
(c)用有效量的步骤(a)中的导入了siRNA的载体细胞给药。
附图说明
图1示出了抑制Int6基因表达的siRNA表达载体的结构(序列)。
图2示出了Int6对HIF2α转录活性的抑制效果。
图3示出了指示Int6 siRNA对内源Int6基因表达的抑制效果的图和照片。
图4示出了指示Int6 siRNA的血管发生提高效果的照片。
图5是一张图表，指示了Int6 mRNA在MCF-7细胞中表达的定量结果，所述MCF-7细胞在用雌二醇(E2)、孕酮(Progestin)或雌激素受体抑制剂Tamoxifen(4OH-TAM)处理后培养24小时。横坐标上示出的标记如下：A-1：E2(-)；A-2：E2(1nM)；A-4：Progestin(1nM)；A-5：E2(1nM)+Progestin(1nM)；A-8：4OH-TAM(1μM)；以及A-12：E2(1nM)+4OH-TAM(1μM)。
图6示出了由HIF转录活性诱导的因子群，以及遍在蛋白介导的调节机制。
图7概括了与由酵母双杂交方法鉴定的新HIF2α结合因子有关的事项。
图8示出了MMTV诱导的Int6突变体与HIF2α之间的关系。
图9示出了使用“siRNA处理的血管发生诱导细胞”通过自体移植的新生血管旁路疗法的基本概念，所述“siRNA处理的血管发生诱导细胞”由于导入了合成Int6-siRNA而分泌出血管发生因子群。
图10是使用siRNA处理的血管发生诱导细胞的新生血管旁路疗法的概念图。
图11示出了Int6对HIF2α的结合特性。
图12示出了Int6上的HIF2α结合位点。
图13示出了指示在正常氧状态和低氧状态下，HIF1α、HIF2α和HIF3α对于野生型Int6和组成型失活(显性失活)突变体Int6ΔC的转录活性的图表。
图14是示出了利用Int6-siRNA表达载体的小鼠皮下明显的血管发生诱导的结果的照片。
图15示出了指示通过Int6-siRNA进行的血管发生的定量分析结果的图表。左图示出了新生血管面积(AREA)，右图示出了新生血管的长度(LENGTH)。
图16示出了指示由于Int6-siRNA而新形成的血管的组织病理图像的照片。照片中的箭头指出了新形成的血管。
具体实施方式
本发明指出，抑制(阻碍)Int6表达或功能(活性)的物质具有通过提高HIF2α转录调节因子的功能而促进低氧应激反应的功能。
因此，本发明提供了低氧应激反应促进剂，其包含作为活性成分的抑制Int6表达的物质或抑制Int6蛋白功能的物质。
已知本发明的Int6基因存在于包括人类在内的各种生物体中。已知Int6基因是与eIF3e/p48相同的基因，后者是翻译调节因子(翻译起始因子)的组成部分之一，并且已经在人类、小鼠、大鼠、蛙等中鉴定出相应于Int6基因的那些基因(同源基因，同系物)。
本发明的Int6蛋白优选为人类Int6蛋白，但是产生蛋白的动物种类没有特别的限制，且其可以是来自非人类动物种类(例如包括猩猩、黑猩猩、狗、小鼠、挪威大鼠(大鼠)在内的哺乳动物，包括小鸡在内的禽类，或者包括异爪蛙在内的两栖动物类)的同系物等。在公共基因数据库GenBank中，人类Int6基因的编号为NM_001568。基因数据库的名称以及在这些基因数据库中这些非人类动物Int6同系物的编号示出于下(gb表示GenBank，emb表示EMBL，ref表示RefSeq数据库)。猩猩(emb，CR860517.1)，狗(ref，XM_532304.1)，挪威大鼠(gb，BC082087.1)，小鼠(ref，NM_008388.1)，黑猩猩(ref，XM_519906.1)，小鸡(emb，AJ719829.1；ref，NM_001006349.1)，以及异爪蛙(gb，AF162775.1和AF162775)。
编码人类Int6的基因的核苷酸序列表示为SEQ ID NO：1。由该核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：2。除这些之外，与本发明的序列表中所示序列具有高度同源性(通常为70％或更高，优选80％或更高，更优选90％或更高，最优选95％或更高)且具有Int6功能(例如，与HIF2α蛋白结合的功能)的蛋白质也包括在本发明的Int6之列。该蛋白质例如可以是这样的蛋白质，其包含在SEQ ID NO：2的氨基酸序列上添加、缺失、取代或插入有一个或多个氨基酸的氨基酸序列，而通常改变的氨基酸的数量为30个氨基酸或更少，优选10个氨基酸或更少，更优选5个氨基酸或更少，最优选3个氨基酸或更少。
本发明的“Int6蛋白”可以是天然来源的蛋白质，或者可以利用基因重组技术作为重组蛋白来制备。天然来源的蛋白质例如可以通过使用Int6蛋白的抗体的亲和层析方法，由表达Int6蛋白的细胞(组织)的提取液来制备。同时，重组蛋白可以通过对已经用Int6蛋白的编码DNA转化的细胞进行培养来制备。
在本发明中对低氧应激进行应答的试剂特别是指这样一种药剂，其具有提高对低氧应激进行应答的基因(在本说明书中，其还被称为“低氧应激应答基因”)的表达的功能。更具体地，本发明中的低氧应激应答基因是一种其转录由HIF2α调控的基因，且它们通常是与血管发生的诱导有关的基因。通常，在各种生物体中存在多个低氧应激应答基因。
本发明低氧应激应答基因的例子包括对人类血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生成素、胰岛素生长因子(IGF)-1、葡萄糖转运蛋白碳酸酐酶IX和转化生长因子进行编码的基因。
更具体地，本发明抑制Int6表达或其功能的物质例如具有提高这些基因表达的功能。
期待用本发明的低氧应激反应抑制剂具有疗效的疾病包括伴有缺血(典型的血流减少)的疾病，其中缺血状况可通过血管发生而改善血流量来改善，例如包括血管疾病。更为具体的例子包括：缺血性脑疾病，例如闭塞性动脉硬化、经皮血管舒张治疗后的再狭窄、心肌梗死、脑梗死或脑内出血；神经变性疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病或脊髓小脑变性；神经疾病，包括创伤性脑损伤如脊髓损伤和脑挫伤；肝疾病如肝硬化；以及萎缩性肌肉紊乱。
在本发明中，抑制Int6蛋白表达的物质例如包括抑制Int6的转录或抑制其由转录物进行翻译的物质。本发明这些抑制表达的物质的优选方案例如包括从由以下(a)～(c)构成的群组中选出的化合物(核酸)：
(a)Int6基因转录物或其一部分的反义核酸；
(b)具有特异地剪切Int6基因转录物的核糖核酸酶活性的核酸；和
(c)具有利用RNAi效果来抑制Int6基因表达的功能的核酸(siRNA)。
本发明中的“核酸”指的是RNA或DNA。此外，化学合成的核酸类似物如所谓的PNA(肽核酸)也包括在本发明的核酸之列。在PNA中，戊糖磷酸骨架(其是核酸的基本骨架结构)被由甘氨酸单元构成的聚酰胺骨架取代。PNA具有与核酸非常相似的三维结构。另外，所谓的LNA(锁定核酸)也包括在本发明的核酸之列。
对于本领域技术人员来说公知的抑制特定内源基因表达的方法包括在反义技术中使用的那些方法。使用反义核酸进行的目标基因的抑制可归结为多种因素。这些因素例如包括：通过三链结构对转录起始的抑制；通过在由RNA聚合酶形成的局部开环结构部位用一序列进行杂化物形成而对转录进行的抑制；使用合成的RNA通过杂化物形成对转录进行的抑制；通过在内含子-外显子接点用一序列进行杂化物形成而对剪接进行的抑制；通过在剪接体形成部位用一序列进行杂化物形成而对剪接进行的抑制；使用mRNA通过杂化物形成对由细胞核至细胞质的转移进行的抑制；通过在加帽部位或聚腺苷酸部位用一序列进行杂化物形成而对剪接进行的抑制；通过在结合翻译起始因子的部位用一序列进行杂化物形成而对翻译起始进行的抑制；通过在起始密码子附近的核糖体结合部位用一序列进行杂化物形成而对翻译进行的抑制；通过在mRNA的翻译区或多核糖体结合部位用一序列进行杂化物形成而对肽链的延伸进行的抑制；以及通过在蛋白质与核酸相互作用的部位用一序列进行杂化物形成而对基因表达进行的抑制。因此，通过对例如转录、剪接和翻译等多种过程进行抑制，反义核酸抑制了目标基因的表达(Hirashima和Inoue，Shin Seikagaku JikkenKoza 2(New Lecture for Experimental Biochemistry 2)，Kakusan IV(NucleicAcid IV)，Replication and Expression of Genes；Ed.，Japanese BiochemicalSociety，Tokyo Kagaku Dozin Co.，Ltd.，pp.319-347，1993)。
在本发明中使用的反义核酸可以通过上面描述的任一种作用来抑制Int6基因的表达。在一个实施方案中，设计一种与Int6基因mRNA的5’非翻译区互补的反义序列，因此期待该反义序列能有效地抑制该基因的翻译。与编码区或3’非翻译区互补的序列也可用于该目的。因此，包含与Int6基因的翻译区和非翻译区的序列相应的反义序列的核酸也包括在用于本发明的反义核酸之列。待用的反义核酸在适当的启动子下游连接，并优选与在3’端包含转录终止信号的序列连接。如此制备的核酸可被用于通过已知的方法来对所需动物进行转化。反义核酸序列优选与转化的动物中内源Int6基因的序列或其一部分互补，但是，只要反义核酸能有效地抑制基因表达，就不需要完全互补。转录的RNA优选与目标基因转录物有90％或更高的互补性，更优选有95％或更高的互补性。用于有效抑制目标基因(Int6)表达的反义核酸的长度优选为至少15个核苷酸或更长，且少于25个核苷酸。但是，本发明的反义核酸不限定为此长度，例如也可以为100个核苷酸或更长，或500个核苷酸或更长。
本发明的反义不作特别限制，但是，其可以基于如由GenBank编号NM 001568获得的Int6基因的核苷酸序列构建而成。
Int6基因表达还可通过使用核糖核酸酶或核糖核酸酶的编码DNA来得到抑制。核糖核酸酶指的是具有催化活性的RNA分子。核糖核酸酶具有多种活性，并且对于将核糖核酸酶作为RNA剪切酶使用的研究允许人们设计出以位点特异性方式剪切RNA的核糖核酸酶。核糖核酸酶如I型内含子核糖核酸酶和M1 RNA(它们是RNase P核糖核酸酶)的长度为400个核苷酸或更长。其他的核糖核酸酶如锤头核糖核酸酶和发夹型核糖核酸酶具有包括约40个核苷酸的活性位点(Koizumi，M.和Otsuka，E.，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，35：2191，1990)。
例如，锤头核糖核酸酶的自溶区剪切G13U14C15序列的C15的3’端。U14和A9之间的碱基对在此活性中扮演了重要的角色，并且A15或U15也可以代替C15被剪切(Koizumi，M.等，FEBS Lett，228：228，1988)。识别目标RNA序列UC、UU或UA的类限制性内切酶的RNA剪切核糖核酸酶可通过设计核糖核酸酶，使底物结合位点与目标位点附近的RNA序列互补而得以制造(Koizumi，M.等，FEBSLett，239：285，1988；Koizumi，M.和Otsuka，E.，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，35：2191，1990；以及Koizumi，M.等，Nucl.Acids Res.，17：7059，1989)。
发夹型核糖核酸酶也可被用于本发明的目的。这种核糖核酸酶在例如烟草环斑病毒的卫星RNA的负链上被发现(Buzayan，J.M.，Nature，323：349，1986)。目标特异性的RNA剪切核糖核酸酶也可由发夹型核糖核酸酶来制造(Kikuchi，Y.和Sasaki，N.，Nucl.Acids Res.，19：6751，1991；Kikuchi，H.，Kagaku to Seibutsu(Chemistry and Biology)，30：112，1992)。因此，在本发明中，Int6基因表达可以通过使用核糖核酸酶对Int6基因转录物特异性消化而得到抑制。
使用核糖核酸酶的方法曾被作为特异性地抑制基因表达的方法使用(Beger C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：130-135，2001)，而近来RNA干涉(下文中简称为“RNAi”)作为可更有效地抑制基因表达的方法而备受关注。由于RNAi效果而具有抑制活性的核酸通常也被称为siRNA。RNAi是这样一种现象，其中通过将具有短双链RNA(下文中简称为“dsRNA”)(由与目标基因的mRNA同源的有义RNA和由其互补序列构成的反义RNA构成)导入细胞等，诱导目标基因mRNA的破坏，并抑制目标基因的表达。因此，RNAi可抑制目标基因的表达，并因此作为敲除基因的简单方法受到关注，其取代了复杂而又低效的同源重组的传统基因破坏法，并成为基因治疗的一种可行方法。用于RNAi的RNA并不需要与Int6基因或该基因的部分区域完全相同，但是，完全相同是优选的。
上述(c)中所述的核酸(siRNA)的优选方案是对Int6基因具有RNAi效果的双链RNA。更特殊的例子包括这样的双链RNA，其包含与核苷酸序列SEQ ID NO：1的部分序列相应的有义RNA和反义RNA。
尽管RNAi机制的详情仍有部分不清楚，但确信被称为DICER的酶(RNase III核酸酶家族中的一员)与双链RNA接触，后者被分解为被称为小干涉RNA(或称siRNA)的小片段。本发明具有RNAi效果的双链RNA还包含被DICER分解前的双链RNA。换句话说，由于即使本身不具有RNAi效果的长链RNA也会在细胞中分解以形成具有RNAi效果的siRNA，所以本发明的双链RNA的长度没有特别的限制。
例如，与本发明的Int6基因的mRNA的全长或接近全长的区域相应的长双链RNA可以用DICER进行预分解，其分解产物可以作为本发明的药剂使用。该分解产物被期待包含具有RNAi效果的双链RNA分子(siRNA)。在该方法中，对于期待具有RNAi效果的mRNA区域不用特别地进行选择。因此，对于具有RNAi效果的本发明的Int6基因的mRNA上的区域不用特别精确地进行规定。
对于上述RNA分子，在一端上具有封闭结构的分子，如包含发夹型结构的siRNA(shRNA)，也包含在本发明中。因此，可在分子内形成双链RNA结构的单链RNA分子也包含在本发明中。
本领域的技术人员可基于成为双链RNA目标的本发明Int6基因的核苷酸序列合适地制备本发明的“通过RNAi效果而得到抑制的双链RNA”。例如，本发明的双链RNA可基于核苷酸序列SEQID NO：1来制备。更具体地，本领域的技术人员可适宜地选择mRNA(其为基于核苷酸序列SEQ ID NO：1的序列的转录物)的任意连续RNA区域，并在通常的实验范围内相应于该区域制备双链RNA。此外，本领域的技术人员还可利用公知的方法从mRNA序列(其为该序列的转录物)中适宜地选择具有较强RNAi效果的siRNA序列。如果所述链中的一条(例如，核苷酸序列SEQ ID NO：1)被鉴定出，本领域的技术人员就可以容易地找出另一条链(互补链)的核苷酸序列。siRNA可由本领域的技术人员使用可商购的核酸合成仪来合适地制备。为合成所需的RNA，可使用常规的委托合成服务(contract synthesis service)。
此外，可表达本发明RNA的DNA(载体)也包括在能抑制本发明Int6基因表达的化合物的优选方案之列。例如，可表达本发明双链RNA的DNA(载体)是包含以下结构的DNA，在该结构中，编码双链RNA中一条链的DNA与编码双链RNA中另一条链的DNA通过启动子相连，从而它们中的每一个都可以被表达。本发明的这种DNA可由本领域的技术人员利用常规的遗传工程技术来合适地制备。更具体地，本发明的表达载体可通过在各种公知表达载体中合适地插入编码本发明RNA的DNA来制备。
本发明的抑制表达的物质例如包括可通过连接到Int6上的表达调控区(例如，启动子区)来抑制Int6表达的化合物。这种化合物例如可通过一种使用Int6启动子DNA片段并使用结合DNA片段的活性作为指标的筛选方法来获得。此外，所需化合物是否能抑制本发明Int6的表达可由本领域的技术人员利用公知方法如报告分析法来合适地确定。
此外，可表达本发明RNA的DNA(载体)也包括在能抑制本发明Int6基因表达的化合物的优选方案之列。例如，可表达本发明双链RNA的DNA(载体)是包含以下结构的DNA，在该结构中，编码双链RNA中一条链的DNA与编码双链RNA中另一条链的DNA通过启动子相连，从而它们中的每一个都可以被表达。本发明的这种DNA可由本领域的技术人员利用常规的遗传工程技术来合适地制备。更具体地，本发明的表达载体可通过在各种公知表达载体中合适地插入编码本发明RNA的DNA来制备。
本发明载体的一个优选方案包括表达能抑制Int6表达的siRNA的载体。例如，这些载体中表达siRNA区域的核苷酸序列可包括图1所示的序列(SEQ ID NOs：5～7)，但不限于此。
本发明siRNA的一个优选例子是包含如下结构的一种siRNA，在该结构中，图1所示每一个核苷酸序列中被描述为有义寡核苷酸和反义寡核苷酸的区域的各自序列被杂交。
本发明的抑制表达的物质例如包括可通过连接到Int6上的表达调控区(例如，启动子区)来抑制Int6表达的化合物。这种化合物例如可通过一种使用Int6启动子DNA片段并使用结合DNA片段的活性作为指标的筛选方法来获得。此外，所需化合物是否能抑制本发明Int6的表达可由本领域的技术人员利用公知方法如报告分析法来合适地确定。
本发明还提供低氧应激反应促进剂，其包含抑制Int6蛋白功能的物质作为有效成分。由于Int6蛋白与HIF2α结合并具有抑制HIF2α功能的功能，对Int6蛋白功能的抑制就活化了HIF2α的功能，并提高了转录低氧应激应答基因的功能。因此，抑制Int6蛋白功能的物质被认为作为低氧应激反应促进剂是有用的。
本发明的抑制Int6蛋白功能的物质例如包括如下的化合物：
(a)与Int6蛋白结合的抗体；
(b)与Int6蛋白结合的低分子量化合物；以及
(α)抑制Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性的化合物。
与Int6蛋白结合的抗体(抗Int6抗体)可通过本领域技术人员公知的方法来制备。当抗体为多克隆抗体时，它们例如可通过如下方法来制备：用天然Int6蛋白，或在微生物如大肠杆菌中与GST表达成为融合蛋白的(重组)Int6蛋白，或其部分肽，对小动物如兔进行免疫，得到抗血清。可使用例如硫酸铵沉淀、A蛋白柱、G蛋白柱、DEAE离子交换层析、固定化有Int6蛋白或其合成肽的亲和柱等从血清中纯化得到抗体。另外，单克隆抗体可通过如下方法来制备：用Int6蛋白或其部分肽对小动物如小鼠进行免疫，摘除脾脏，轻轻地研磨脾脏以分离出细胞，用例如聚乙二醇等试剂将该细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选融合细胞以选择能产生与Int6蛋白结合的抗体的克隆。其后，将这些杂交瘤移植到小鼠的腹膜腔中，然后从同一小鼠中收集腹水。如此制备的单克隆抗体可使用例如硫酸铵沉淀、A蛋白柱、G蛋白柱、DEAE离子交换层析、固定化有Int6蛋白或合成肽的亲和柱等进行纯化。
本发明的抗体没有特别限制，只要它们能与本发明的Int6蛋白结合，并且，除多克隆抗体和单克隆抗体之外，本发明的抗体还包括人类抗体、通过基因重组制备的人源化抗体以及它们的抗体片段和改良抗体。
作为用来得到抗体的致敏原使用的本发明的Int6蛋白对得到它们的动物种类没有限制，但优选来源于哺乳动物如小鼠或人类的蛋白质，而来源于人类的蛋白质是特别优选的。来源于人类的蛋白质可由本领域的技术人员使用公开于本发明的基因序列或氨基酸序列合适地获得。
在本发明中作为免疫抗原使用的蛋白质可以是全长的蛋白质或来源于这些蛋白质的部分肽。所述部分蛋白肽例如包括蛋白质的氨基(N)末端片段和羧基(C)末端片段。在此使用的“抗体”指的是与全长蛋白质或其片段反应的抗体。
除了使用抗原使非人类动物免疫来得到上述杂交瘤之外，产生所需抗体并具有蛋白结合活性的杂交瘤还可通过下述方法体外制备：用蛋白质、表达蛋白质的细胞或这些细胞的溶胞产物来使人类淋巴细胞致敏，如被EB病毒侵染的人类淋巴细胞，然后将这些致敏淋巴细胞与永生化人类淋巴细胞如U266细胞一起融合。
本发明的抗Int6蛋白抗体通过与Int6蛋白结合来抑制Int6蛋白的功能，并且被期待具有例如改善或治疗血管疾病的效果。当所得到的抗体被用于为人类给药的目的(抗体疗法)时，人类抗体或人源化抗体由于其低的免疫原性而是优选的。
此外，本发明包括与Int6蛋白结合的低分子量物质作为能抑制Int6蛋白功能的物质。本发明与Int6蛋白结合的低分子量物质可以是天然化合物或人工化合物。通常，它们是可通过本领域技术人员公知的方法制造或得到的化合物。此外，本发明的化合物还可通过以下将要描述的筛选方法获得。
与Int6蛋白结合并抑制其功能的上述低分子量化合物(b)的例子包括对Int6具有高亲和性的化合物。
本发明抑制Int6功能的物质的优选方案例如包括抑制HIF2α与Int6之间的结合(互作)的化合物。这些化合物通过抑制HIF2α与Int6之间的结合而提高了作为转录因子的游离HIF2α的量，结果，认为它们促进了低氧应激应答基因的转录。
本发明能抑制Int6蛋白功能的物质的例子包括对于Int6蛋白具有显性失活特性的Int6蛋白突变体(Int6显性失活蛋白质)。“对于Int6蛋白具有显性失活特性的Int6蛋白突变体”指的是具有通过表达编码蛋白质的基因而消除或减少内源野生型蛋白质的活性的功能的蛋白质。更具体地，Int6显性失活蛋白质的例子包括失去了与HIF2α结合的活性的蛋白质。
Int6显性失活蛋白质的例子包括这样一种蛋白质，其中Int6蛋白的C末端已经缺失(Int6-ΔC)。具体而言，这种Int6-ΔC例如是这样一种Int6蛋白突变体，其中Int6蛋白的C末端区中的PINT区域已经缺失(见图2)。
本发明所提供的低氧应激反应促进剂由于其具有诱导(促进)血管发生的效果而被期待对血管疾病具有疗效。
因此，本发明提供血管疾病治疗剂(医药组合物)，其包含本发明的低氧应激反应促进剂作为有效成分。
本发明提高Int6表达或其功能的物质被期待具有通过降低HIF2α转录调节因子的功能而减少低氧应激反应的功能。
因此，本发明提供低氧应激反应抑制剂，其包含提高Int6蛋白表达或其功能的物质作为有效成分。“蛋白表达的提高”包括基因转录水平的提高以及由转录物进行翻译的水平的提高。
这种物质的例子包括提高Int6与HIF2α之间的结合(互作)的物质。这些物质可通过将Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性作为指标对提高结合活性的物质进行筛选而适宜地得到。
由于本发明所提供的低氧应激反应抑制剂具有抑制(阻碍)血管发生的效果，期待它们对于与血管发生有关的疾病(血管发生相关疾病)如癌症具有疗效。期待对其具有疗效的癌症的例子优选包括乳癌、结肠癌、口腔癌、咽癌和喉癌、食道癌、胃癌、肝癌、肾癌、膀胱癌和子宫癌。除癌症外，由于抑制血管发生而期待对其具有疗效的疾病例如包括视网膜内异常血管增加的疾病如糖尿病性视网膜变性，以及肺动脉高压。对于HIF2α转录调节因子的功能的抑制不仅抑制(阻碍)了血管发生，还可对红细胞增多或糖尿病中的糖代谢异常具有效果。
本发明的发明人已发现，雌性激素抑制Int6的表达。更具体地，雌性激素通过对Int6基因表达进行抑制，从而提高了HIF2α促进低氧应激应答基因的转录的活性，结果，认为其促进了血管发生。因此，雌性激素对于例如治疗其病理通过改善血流量而得到改善的疾病(例如，闭塞性动脉硬化)是有效的。
雌性激素是在本发明中抑制Int6表达的优选物质。更具体地，雌性激素的例子为雌激素、孕酮等。同时，除雌性激素外，提高Int6蛋白表达或其功能的物质还包括雌性激素分泌促进剂、雌性激素受体激动剂等。
雌性激素抑制剂被期待能通过提高Int6基因的表达来减少血管发生，并因此降低HIF2α促进低氧应激应答基因的转录的活性。因此，雌性激素抑制剂对于例如治疗其病理通过抑制血管发生而得到改善的疾病(例如，癌症)是有用的。
本发明还涉及载体细胞，其Int6基因表达已被抑制，并且血管发生已被诱导。这种细胞被期待对于血管疾病具有疗效。本发明“载体细胞”的例子包括成纤维细胞和神经胶质细胞。Int6基因表达例如可通过使用Int6的siRNA来得到抑制。
本发明提供与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂和抗肿瘤医药组合物)，其包含本发明的低氧应激反应抑制剂作为有效成分。与血管发生有关的疾病的治疗剂的优选方案的例子包括这样的与血管发生有关的疾病的治疗剂，其包含雌性激素抑制剂作为有效成分。
此外，本发明提供Int6基因表达被人为地抑制了的非人类转基因动物(在本说明书中，其被描述为“非人类转基因动物”、“基因敲除非人类动物”或单纯的“动物”)。
本发明的非人类转基因动物可被有利地用来例如筛选治疗需要调节低氧应激反应的疾病的药剂。它们还作为用于阐明这些疾病的机理以及低氧应激反应的研究的实验模型动物非常有用。
本发明的非人类转基因动物包括所谓的“基因敲除动物”，其基因表达通过反义RNA或siRNA的作用而被抑制。
本发明中“Int6基因表达被人为地抑制了的”状态的例子包括：(1)Int6基因的表达通过遗传修饰(在基因对中之一或两者中进行核苷酸插入、缺失或取代)的存在而得到抑制的状态；以及(2)基因表达通过本发明核酸(例如反义RNA或siRNA)的作用而得到抑制的状态。
本发明中的“抑制”包括Int6基因表达被完全抑制的情况，以及与野生型动物中Int6基因表达水平相比，在本发明的动物中Int6基因表达水平明显降低的情况。
上述状态(1)还包括Int6基因的基因对中仅一个基因的表达被抑制的情况。存在基因修饰的区域在本发明中不作特别限定，只要它们是抑制基因表达的区域即可，其例子包括外显子区域和启动子区域。
本发明的非人类转基因动物可由本领域的技术人员利用通常公知的遗传工程技术来制备。例如，可通过如下方法制备基因敲除小鼠。首先，将包含本发明Int6基因的外显子区域的DNA从小鼠中分离，并在此DNA片段中插入合适的标记基因来构建目标载体。通过电穿孔法等将此目标载体导入到小鼠ES细胞系中，并选择已经历同源重组的细胞系。待插入的标记基因优选是抗生素抗性基因，例如新霉素抗性基因。在抗生素抗性基因插入后，可通过在含有抗生素的培养基中培养来选择已经历同源重组的细胞系。或者，为更有效地选择，可将胸苷激酶等与目标载体连接。这样，去除了已经历非同源重组的细胞系。通过PCR或Southernblotting进行同源重组分析，还可有效地获得这样的细胞系，其中本发明基因的基因对中的一者已失活。
在选择已发生同源重组的细胞系时，由于因基因插入而在同源重组位点之外的部位有发生未知基因破坏的危险，优选使用多个克隆以产生嵌合体。嵌合小鼠可通过将所得的ES细胞系注射到小鼠胚盘中获得。通过使这些嵌合小鼠杂交，可获得在本发明Int6基因的基因对中的一者已失活的小鼠。此外，通过使这些小鼠杂交，可获得在本发明基因的基因对中的两者均失活的小鼠。可使用相似的步骤来对除小鼠之外的ES细胞已建立的动物进行遗传改良。
本发明的基因敲除动物优选是这样的基因敲除动物，其中通过将本发明的核酸导入到非人类动物中而使Int6基因表达得到抑制。
上述的敲除动物可通过将使本发明的核酸(反义RNA、siRNA等)得到表达而构建的载体导入到非人类动物中来进行构建。
例如，Int6表达被降低的非人类动物可通过将含有核苷酸序列SEQ ID NO：5、6或7且表达siRNA的载体颈背皮下注射到非人类动物中来进行制备。
本发明转基因动物的类型不作特别限定，只要它们是非人类动物即可，但它们通常是哺乳动物，优选为灵长类动物。更具体地，本发明的动物优选为小鼠、大鼠、蝇、线虫(C.Elegans)、牛、猪、鸟或羊，更优选小鼠。当在植物中存在相应于Int6的基因时，也有可能制备定位该基因的敲除(转基因)植物。
在一个优选方案中，本发明的非人类转基因动物是(但并不限定为)这样一种动物，其中Int6基因表达通过从以下(a)～(c)中选出的任一种核酸的作用而得到抑制：
(a)Int6基因转录物或其一部分的反义核酸；
(b)具有特异地剪切Int6基因转录物的核糖核酸酶活性的核酸；和
(c)具有利用RNAi效果来抑制Int6基因表达的功能的核酸。
由于在本发明的非人类转基因动物中Int6基因的表达被抑制且血管发生被诱导，该动物对于例如筛选抑制血管发生的物质或药剂(与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂))并分析血管发生的机制特别有用。
此外，本发明提供利用Int6表达水平或活性作为指标来筛选血管疾病治疗剂的方法。
减少(抑制)Int6基因的表达水平的化合物被预期作为治疗血管疾病的潜在药剂。反之，增加(提高)Int6基因表达水平的化合物被预期作为治疗由血管发生引起的疾病(如癌症)的潜在药剂。
本发明方法的优选方案是这样一种筛选血管疾病治疗剂的方法，其包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6基因表达细胞接触；
(b)测定所述细胞中Int6基因表达的水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物降低了表达水平。
本发明方法的其他方案是这样一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，其包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6基因表达细胞接触；
(b)测定所述细胞中Int6基因表达的水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物提高了表达水平。
在上述方法中，首先将测试化合物与表达Int6基因的细胞接触。所使用的“细胞”可以是来源于人类、小鼠、大鼠等的细胞，但不限于来源于它们的细胞，并且还可以使用已经转化以表达Int6的微生物(如大肠杆菌)和酵母的细胞。表达内源Int6基因的细胞或者通过导入外源Int6基因来表达该基因的细胞可以作为“表达Int6基因的细胞”使用。通常，表达外源Int6基因的细胞可以通过将插入有Int6基因的表达载体导入到宿主细胞中来制备。这些表达载体可通过常规的遗传工程技术来制备。
本方法中使用的测试化合物并无特别限制，其例如包括单一化合物，如天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质和肽，以及化学品库，基因库的表达产物，细胞提取物，细胞培养的上清液，细菌发酵产物、海洋生物提取物和植物提取物。
通常，但无任何限制的意思，通过将测试化合物加入到表达Int6基因的细胞的培养基中以使该测试化合物与表达Int6基因的细胞接触。当测试化合物是一种蛋白质时，所述接触可通过将允许蛋白表达的DNA载体导入到细胞中来实现。
这些方法的接下来的步骤包括确定Int6基因的表达水平。这里短语“基因表达”指的是转录和翻译两者。基因表达水平可通过使用本领域技术人员公知的方法来确定。例如，mRNA可通过将该mRNA作为模板用常规方法从表达Int6基因的细胞中提取出来，基因的转录水平可通过使用Northern杂交法或RT-PCR来确定。或者，基因的转录水平可通过从表达Int6基因的细胞中收集蛋白部分来确定，然后Int6蛋白的表达可通过电泳法如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来检测。此外，基因的翻译水平可通过使用蛋白质的抗体，用Western blotting分析检测Int6蛋白的表达来确定。用于Int6蛋白检测的抗体的类型没有限制，只要蛋白质能被检测即可。这种抗体例如包括单克隆抗体和多克隆抗体。
在本方法接下来的步骤中，与在测试化合物未接触的情况(对照组)下测定的表达水平相比，提高或降低了表达水平的化合物被选出。降低表达水平的化合物成为血管疾病治疗剂，而提高表达水平的化合物成为治疗那些以显示出抑制血管发生为疗效的疾病(如癌症)的治疗剂。
本发明筛选方法的另一个方案是通过使用报告基因的表达作为指标来选择降低或提高本发明Int6基因的表达水平的化合物的方法。
本发明上述方法的优选方案为包括以下步骤(a)～(c)的筛选血管疾病治疗剂的方法：
(a)将测试化合物与细胞或细胞提取液接触，所述细胞包含具有如下结构的DNA，在该结构中，报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物降低了表达水平。
此外，本发明上述方法的另外的方案为包括以下步骤(a)～(c)的筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法：
(a)将测试化合物与细胞或细胞提取液接触，所述细胞包含具有如下结构的DNA，在该结构中，报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物提高了表达水平。
在这些方法中，测试化合物首先与细胞(或细胞提取液)接触，所述细胞包含具有如下结构的DNA，在该结构中，报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接。这里所使用的短语“可操作地进行连接”指的是，Int6基因的转录调控区与报告基因以这样一种方式连接，该方式使得当转录因子与Int6基因的转录调控区结合时，可诱导报告基因的表达。这样，即使当报告基因与其他基因连接并因此形成了具有该基因产物的融合蛋白时，所述连接仍可用短语“可操作地进行连接”来表达，只要当转录因子与Int6基因的转录调控区结合时融合蛋白的表达被诱导即可。通过使用公知方法并基于Int6基因的cDNA核苷酸序列，本领域的技术人员可从基因组中获得Int6基因的转录调控区。
在这些方法中使用的报告基因的类型没有限制，只要其表达能被检测即可。这样的报告基因例如包括CAT基因、lacZ基因、荧光素酶基因和GFP基因。“包含使报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接的DNA结构的细胞”例如包括导入了插入有该结构的载体的细胞。本领域的技术人员可通过使用常规的遗传工程技术来制备该载体。这样的载体可通过使用常规的方法，例如磷酸钙沉淀法、电穿孔法、脂质体转染(lipofectamine)法、显微注射法等导入到细胞中。“包含使报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接的DNA结构的细胞”还包括所述结构已被插入到其染色体中的细胞。该DNA结构可通过本领域技术人员常规使用的方法如使用了同源重组的基因转移法来插入到染色体中。
“包含使报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接的DNA结构的细胞的提取物”例如包括通过将DNA添加到细胞提取物(包含在市售的体外转录翻译试剂盒中)中而制备的混合物，其中，所述添加的DNA具有使报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接的结构。
在该方法中，“接触”可通过将测试化合物添加到“包含使报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接的DNA结构的细胞”的培养基中来实现，或者可通过将测试化合物添加到包含所述DNA的上述市售细胞提取物中来实现。当测试化合物是蛋白质时，所述接触还可通过例如将表达这些蛋白质的DNA载体导入到细胞中来实现。
这些方法中的接下来的步骤是确定报告基因的表达水平。报告基因的表达水平可通过本领域技术人员公知的取决于报告基因类型的方法来确定。例如，当报告基因是CAT基因时，其表达水平可通过对氯霉素的乙酰化(其由CAT基因产物介导)进行检测来确定。当报告基因是lacZ基因时，表达水平可通过对显色化合物中的显色(由lacZ基因表达产物的催化作用介导)进行检测来确定。当报告基因是荧光素酶基因时，表达水平可通过对荧光化合物的荧光(由荧光素酶基因表达产物的催化作用介导)进行检测来确定。或者，当报告基因是GFP基因时，表达水平可通过对GFP蛋白的荧光进行检测来确定。
在本方法中，接下来，与在没有测试化合物存在时测定的表达水平相比，降低(抑制)或增加(提高)了所测定的报告基因表达水平的化合物被选出。降低(抑制)表达水平的化合物成为治疗血管疾病的药剂，而增加(提高)表达水平的化合物成为对抑制血管发生显示出疗效的疾病(如癌症)的治疗剂。
本发明筛选方法的另外的方案为将Int6蛋白活性作为指标的方法。例如该方法为筛选血管疾病治疗剂的方法，其包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白或表达该蛋白的细胞或该细胞的提取液接触；
(b)测定所述蛋白的活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的活性相比，该化合物降低了所述蛋白的活性。
本发明上述方法的另外的方案例如为筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，其包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白或表达该蛋白的细胞或该细胞的提取液接触；
(b)测定所述蛋白的活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的活性相比，该化合物提高了所述蛋白的活性。
在本方法中，首先，将测试化合物与Int6蛋白或表达该蛋白的细胞或该细胞的提取液接触。
接下来，测定Int6蛋白的活性。Int6蛋白的活性的例子包括与HIF2α蛋白的结合活性(互作活性)。该活性可由本领域的技术人员使用公知方法如免疫沉淀法或酵母双杂交方法来合适地测定。
HIF2α中与Int6蛋白结合有关的氨基酸区域为HIF2α的氨基酸区域(SEQ ID NO：4)的第571～700位。因此，举例来说，结合活性可通过使用包含HIF2α蛋白的上述氨基酸区域的多肽片段来测定。HIF2α基因的核苷酸序列表示为SEQ ID NO：3，由该基因编码的蛋白质的氨基酸序列表示为SEQ ID NO：4。HIF2α基因在公共基因数据库中的编号为NM_001430。
此外，与在没有测试化合物存在时测定的活性相比，降低(抑制)或增加(提高)了该蛋白活性的化合物被选出。降低(抑制)活性的化合物成为治疗血管疾病的药剂，而增加(提高)活性的化合物成为对抑制血管发生显示出疗效的疾病(如癌症)的治疗剂。
本发明筛选方法的其他方案的例子包括将Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性作为指标的方法。本发明的Int6蛋白是具有与HIF2α蛋白结合(互作)的活性的蛋白质。因此，通过将Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性作为指标，对提高该结合活性的物质或降低(抑制)该结合活性的物质进行选择，使得对治疗血管疾病的药剂或对抑制血管发生显示出疗效的疾病(如癌症)的治疗剂的筛选成为可能。
本发明的方法例如为筛选血管疾病治疗剂的方法，其包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白和HIF2α蛋白接触；
(b)测定Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的结合活性相比，该化合物降低了所述结合活性。
本发明的上述方法例如包括筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂(例如抗癌剂)的方法，其包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白和HIF2α蛋白接触；
(b)测定Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的结合活性相比，该化合物提高了所述结合活性。
在本方法中，首先，将测试化合物与Int6蛋白和HIF2α蛋白接触。接着，测定Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性。
通常，Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合(互作)活性可由本领域的技术人员容易地进行测定，上述步骤(b)中的结合活性可通过常规方法如共免疫沉淀法合适地进行测定。
在该方法中使用的Int6蛋白和HIF2α蛋白优选是不含突变的野生型蛋白质，但只要它们具有互作活性，它们也可以是氨基酸序列中的一部分被取代或缺失的蛋白质(多肽)。
在上述方法中使用的Int6蛋白优选是不含突变的野生型蛋白质(全长蛋白质)，但只要它保持与HIF2α蛋白的结合活性，它也可以是部分肽片段，或氨基酸序列中的一部分被取代或缺失的蛋白质(多肽)。
Int6蛋白中与HIF2α蛋白结合有关的区域通常是存在于N末端的被称为“结构域1(Domain 1)”的区域。因此，在上述方法中使用的Int6蛋白可以是包含“结构域1”的蛋白质的部分肽片段。“结构域1”是与SEQ ID NO：2所示的Int6蛋白的氨基酸序列中第1～80位对应的区域。
接下来，上述方法选择了与没有测试化合物存在时测定的结合活性相比，降低(抑制)或增加(提高)了结合活性的化合物。降低(抑制)结合活性的化合物成为治疗血管疾病的药剂，而增加(提高)结合活性的化合物成为对抑制血管发生显示出疗效的疾病(如癌症)的治疗剂。
在本发明的上述非人类转基因动物中，Int6基因表达被抑制，结果，观察到了明显的血管发生的效果。通过使用这些非人类转基因动物，可有效地对抑制血管发生的化合物进行筛选。通过该筛选方法获得的化合物被期待成为与血管发生有关的疾病的潜在治疗剂(例如抗癌剂)。
本发明的筛选方法是使用本发明的非人类转基因动物的方法，并且使用血管发生效果或Int6的表达或功能(活性)作为指标。
上述方法例如是筛选血管疾病治疗剂的方法，其包括如下步骤：
(a)用测试化合物对本发明的非人类转基因动物给药；
(b)测定所述非人类转基因动物中的Int6表达水平或活性，或测定所述动物中的血管发生效果；并且
(c)选择一种化合物，与没有用所述测试化合物给药的情况(对照组)相比，该化合物降低了血管发生效果，或该化合物提高了Int6表达水平或活性。
在本方法中，首先，用测试化合物对非人类转基因动物给药。测试化合物可通过口服或肠外方式给药，但当测试化合物是肽时，优选肠外给药。更具体地，给药可包括血管给药、经鼻给药、经肺给药和经皮给药。血管给药的例子包括静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射和皮下注射，并且给药方式可以是全身的或局部的。
当DNA是测试化合物时，它们可通过病毒载体如反转录病毒、腺病毒和仙台病毒以及非病毒载体如脂质体给药到身体中。给药方法的例子包括体内方法和体外的方法。
接下来，测定非人类转基因动物(或源自这些动物的组织或细胞)中Int6的表达水平或活性。或者，观察这些动物(或源自这些动物的组织)中的血管发生效果。
然后，与没有用测试物质给药的情况(对照组)相比，降低Int6基因的表达水平或活性的化合物或抑制血管发生的化合物被选出。
本发明的药剂可与药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等混合作为医药组合物口服给药或肠外给药。口服剂可被制成颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等剂型。肠外用剂可选择注射剂、滴注剂、外用剂或栓剂等剂型。注射剂可包括皮下注射剂、肌肉注射剂和腹腔内注射剂。外用剂可包括经鼻给药剂和软膏剂。调配这些剂型以将本发明的药剂作为主成分包含在内的技术是公知的。
举例来说，可通过将赋形剂、崩解剂、粘合剂、滑润剂等添加到本发明的药剂中，将它们混合，然后将混合物压缩成型制备出用于口服给药的片剂。作为赋形剂，通常使用乳糖、淀粉、甘露醇等。作为崩解剂，通常使用碳酸钙、羧甲基纤维素钙等。作为粘合剂，通常使用阿拉伯树胶、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮。作为滑润剂，滑石、硬脂酸镁等是公知的。
包含本发明药剂的片剂可用公知的方法包衣来掩蔽或形成肠溶制剂。作为包衣用剂，可使用乙基纤维素、聚乙二醇等。
注射剂可通过将作为主成分的本发明药剂与合适的分散剂一起溶解来获得，或者通过溶解或分散于分散介质中来获得。通过选择分散介质，可制备出水型或油型的剂型。为制备水型剂型，应使用蒸馏水、生理盐水、林格液等作为分散介质。对于油型剂型，可使用各种植物油、丙二醇等作为分散介质。如果需要，还可以添加防腐剂，如对羟基苯甲酸酯。在注射剂中，还可添加公知的等渗剂，如氯化钠、葡萄糖等。此外，还可添加镇痛剂，如苯扎氯铵或盐酸普鲁卡因。
此外，当本发明的药剂被配合到固状、液状或半固状组合物中时，还可作为外用剂使用。固状或液状组合物可通过形成与前面描述的类似的组合物而被制成外用剂。半固状组合物可通过将增稠剂添加到根据所需的合适溶剂中来制备。作为溶剂，可使用水、乙醇、聚乙二醇等。作为增稠剂，通常使用皂粘土、聚乙烯醇、丙烯酸、甲基丙烯酸、聚乙烯吡咯烷酮等。还可在该组合物中添加防腐剂，如苯扎氯铵。此外，栓剂可通过结合使用油性基材如可可脂或水性胶基如纤维素衍生物作为载体来制备。
本发明的药剂在被认为是安全的剂量范围内以所需量为包括人类在内的哺乳动物给药。本发明药剂的剂量可通过考虑剂型的类型、给药方式、病人的年龄和体重、病人的症状等来合适地进行确定，但最终由医师或兽医来决定。
本发明中的“治疗剂”包括具有预防效果以及治疗效果的药剂。
文中提到的所有现有技术文献都并入于此作为参考。
实施例
以下，将参照实施例对本发明进行详细描述，但不能认为本发明受限于这些实施例。
[实施例1]酵母双杂交库筛选
通过酵母双杂交方法(Clontech)，用来自于人类心脏或脑的库(pACT2-cDNA，Takara)筛选1.2×106个基因，以获得克隆CL263。根据测序结果，鉴定出克隆CL263为Int6，这是因为克隆CL263中与HIF2α结合的区域的氨基酸序列与Int6的aa3-aa151相匹配。Int6的功能几乎是未知的。至今，已知Int6包含三个部分。一些证据表明，正常的Int6功能对于预防小鼠和人的乳腺瘤的发生是重要的。
[实施例2]酵母细胞中Int6与HIF1α、HIF2α和HIF3α的特异相互作用
通过酵母双杂交方法评价了Int6与HIF2α之间的结合(互作)活性。结果示于表1。
表1
  pGBKT7   pACT2   α-半乳糖苷酶活性   β-α-半乳糖苷酶活性
  HIF1α   Int6
  HIF2α   Int6     +     +
  HIF3α   Int6
  载体   Int6
  HIF1α   载体
  HIF2α   载体
  HIF3α   载体
作为结果，仅发现HIF2α与Int6的组合具有α-半乳糖苷酶活性和β-α-半乳糖苷酶活性，这表明HIF2α与Int6相互作用。
[实施例3]MCF7、A549和COS7细胞中HIF2α与Int6之间的相互作用
将质粒pMepHA-Int6wt转染三种细胞MCF7、A549和COS7。之后，发现Int6主要在细胞的细胞溶胶中表达。尽管由于细胞死亡而很难确认IF，但观察到已转移到细胞核中的一些Int6与HIF2α的局部化存在。
发现当Int6与HIF2α一起转染时，其抑制HIF2α的表达(表2)。
表2
Figure A20068002566000431
[实施例4]Int6对HIF2α转录活性的调节
对MCF7细胞进行实验，以评价Int6中PINT(PCI)结构域的存在是否影响HIF2α的转录活性，以及HIF2α的转录活性是否由Int6来调节。将MCF7细胞在正常氧状态和低氧状态培养4小时或24小时，其中使用了HIF2α、具有Int6 PINT(PCI)结构域(Int6 wt)的野生型Int6以及通过分子生物方法将Int6 PINT(PCI)结构域去除的突变体(Int6-ΔC)。
结果表明，Int6通过其PINT(PCI)结构域调节HIF2α的转录活性(图2)。当与HIF2α共表达时，Int6-ΔC在正常氧状态和低氧状态下均能促进HIF2α的转录活性。Int6 wt造成了MCF7细胞的细胞死亡，并且在正常氧状态和低氧状态下均能抑制HIF2α的转录活性(图2)。
[实施例5]Int6 siRNA对内源Int6基因表达的抑制
进行实验，以评价siRNA是否抑制内源Int6。通过使用来自Ambion的pSilence 2.1-U6载体，并且设计发夹型siRNA1(Int6 siRNA145)、siRNA2(Int6 siRNA 219)和siRNA3(Int6 siRNA 358)的插入片段来制备siRNA表达质粒。然后，将siRNA表达质粒和Int6-ΔC转染到MCF7细胞中。
在正常氧状态和低氧状态下确定低氧反应元件(HRE)的荧光素酶活性，发现siRNA2在正常氧状态和低氧状态下均表现出对内源Int6的最强的抑制(图3A)。同时，正常氧状态下Int6-ΔC在MCF7细胞中的表达通过免疫染色法来确定，没有观察到Int6-ΔC由于siRNA2的表达(图3B)。另外发现，低氧状态下HIF2α在MCF7细胞中的表达被siRNA2增强了(图3C)。
siRNA的生物体外抑制效果通过免疫染色法来确定。作为结果，被siRNA1、siRNA2和siRNA3抑制的Int6-ΔC表达的百分比分别为50％、100％和70％。
所使用的人类Int6寡核苷酸序列如下：
1.5-Int6 RNAi-145：
gAT CCC/AAC ATg gTA gAC TTT gCT A/TTC AAg AgA/TAgCAAAgTC TAC CAT gTT/TTT TTT/ggAAA(SEQ ID NO：8)
2.5-Int6 RNAi-219：
gAT CCC/AAg AAC CAC AgT ggT TgC A/TTC AAg AgA/TgCAACC ACT gTg gTT CTT/TTT TTT/ggAAA(SEQ ID NO：5)
3.5-Int6 RNAi-358：
gAT CCC/AAg CAT ggT TTT Agg CAg g/TTC AAg AgA/C CTg CCT AAA ACCATg CTT/TTT TTT/ggAAA(SEQ ID NO：6)
这些核苷酸序列的每一个中，下划线表示“有义寡核苷酸”和“反义寡核苷酸”。在这些区域中形成双链的RNA分子起siRNA的作用。
[实施例6]由siRNA产生的Int6基因表达敲除动物
(1)制备封入了HVJ-E的siRNA
按如下方式为每只小鼠制备封入了HVJ-E的siRNA：
将40μL的1AU HVJ包膜(HVJ-E)：GenomONE-Neo(Ishihara Sangyo)置于微管中；
在4℃下以12,000rpm的速度离心分离5分钟进行沉淀；
加入10μL的0.5mg/mL pSilencer 1.0V6小鼠Int6-219，或加入pSilencer 1.0V6小鼠GAPDH作为对照，并将其混合；
加入1μL的试剂B(封入剂)，并将其混合；
在4℃下以12,000rpm的速度离心分离5分钟进行沉淀；并且
加入40μL的PBS，并通过移液20～30次达到悬浮。
以上是根据GenomONE-Neo(Ishihara Sangyo)的使用手册进行的。
(2)评价siRNA(Int6)对小鼠血管发生的效果
使用10周龄的雌性BALB/C小鼠(体重约25g)进行实验。在用Int6载体型siRNA皮下注射两目前，用脱毛膏对小鼠的颈背部进行处理。在实验当日，对小鼠施以氟烷麻醉，并使用27GX3/4注射器将50μL的封入了HVJ-E的siRNA皮下注射到颈背部。其后，用普通的饲料和水饲养小鼠五日。接下来，通过扭断颈部宰杀小鼠，并剥除以siRNA注射部为中心约1.5cm2的皮肤。在对皮肤背面照相后，用福尔马林固定。
与对照siRNA比较的结果显示出，血管发生的促进以Int6siRNA1、Int6 siRNA3和Int6 siRNA2的次序依次增大。
所使用的小鼠Int6寡核苷酸序列如下。每一寡核苷酸序列基于小鼠序列制备。
(1)Int6 siRNA1-145：
5’-AAT ATg gTg gAC TTT gCT A/TTC AAg AgA/T AgC AAA gTC CAC CAT ATT/TTT TTT(SEQ ID NO：9)
(2)Int6 siRNAi2-219：
5’-AAg AAC CAC AgT TgT TgC g/TTC AAg AgA/C gCAACAACT gTg gTT CTT/TTT TTT(SEQ ID NO：10)
(3)Int6 siRNAi3-358：
5’-AAA CAT ggg TTT Agg CAA g/TTC AAg AgA/C TTg CCT AAA CCC ATg TTT/TTT TTT(SEQ ID NO：11)
这些核苷酸序列的每一个中，下划线表示“有义寡核苷酸”和“反义寡核苷酸”。在这些区域中形成双链的RNA分子起siRNA的作用。
[实施例7]激素处理对Int6 mRNA表达的抑制
将雌激素(雌二醇，E2)、孕酮(Progestin)或雌激素受体抑制剂三苯氧胺(4OH-TAM)加入到乳癌细胞系MCF-7中。培养24小时后，将这些细胞的mRNA提取出来，并通过实时PCR对mRNA的量定量。
作为结果，如图5所示，发现用不同种类的雌性激素进行处理抑制了Int6基因的表达。此外，孕酮显示出较雌二醇(E2)更明显的抑制效果。
[实施例8]Int6通过HIF2α对血管发生进行调节的机制
使用酵母双杂交方法和VEGF启动子分析的研究结果表明，与VHL对HIF1α的作用类似，Int6直接与HIF2α相互作用(图11)，结合位点位于HIF2α C末端的571～640aa区(图1 2)，并且对于HIF2α介导的低氧应激应答基因的转录产生了强抑制。
与野生型正相反，由MMTV突变体产生的组成型失活(显性失活)的C末端缺失突变体几乎使HIF2α的表达和转录活性加倍(图13)。该结果表明了癌化的新机制，其中由于HIF2α活性的长期增加，在将MMTV整合到基因组中阶段产生的Int6突变导致了细胞生长和血管发生，引起了癌化。
Int6调节HIF2α的本质被理解为：Int6在其C末端具有能与蛋白酶体盖(盖部位)结合的区域，而与Int6结合的HIF2α被带入到蛋白酶体中进行分解。HIF2α与低氧无关的一方面已经有所报道，并且本发明的发明者指出，虽然HIF1α百分之百与低氧有关，但HIF2α与低氧无关的分解由Int6来调节。更具体地，认为HIF2α主要由Int6来调节。
抑制Int6基因表达或其功能(例如，HIF2α结合活性)的物质由于能与低氧无关地促进HIF2α表达以及HIF2α至细胞核的转移，从而促进低氧应激应答基因群的转录，因而被期待显示出血管发生的效果。该物质被期待具有明显的血管发生效果和特异性，以及对于包括闭塞性动脉硬化、经皮血管舒张治疗(PCT)后的再狭窄以及心肌梗死在内的血管疾病具有疗效。
[实施例9]将小鼠的Int6基因的siRNA(Int6-siRNA)经皮下导入到小鼠体内产生的正常血管发生
通过使用GenomOne(HVJ-包膜基因导入试剂，Ishihara Sangyo)将siRNA表达载体转移到小鼠体内的皮下基因转移显示出，导入五日后，可获得明显的血管发生效果(图14)。使用血管发生分析软件(Kurabo)，结果表明，血管面积和血管长度有5～10倍的明显增加(图15)。
观察到这些结果与载体的导入量是成比例的，并且明显依赖于所表达的siRNA的效果。此外，使用生物体外血管发生分析试剂盒(Kurabo)的详细分析结果确认了合成siRNA的效果也是与用量有关的。由于HIF2α过表达而产生的血管发生效果也是阳性的，这强烈地暗示出，Int6-siRNA诱导了内源HIF2α的表达，并诱导了血管发生因子群。
病理学分析表明，新形成的血管是具有内皮和弹性纤维的正常动脉，而见于肿瘤性血管发生的出血斑并不存在。此外，Int6siRNA表达载体被主要导入到血管内皮的成纤维细胞中，这暗示了在这些成纤维细胞中分泌出了血管发生因子群(图16)。
[实施例11]并未由于Int6-siRNA导入到细胞中而发生的癌化确认
Int6被发现在乳癌等癌化过程中起肿瘤抑制因子的作用。因此，有当特异的siRNA被导入到细胞中时会引起癌化的顾虑，并且这特别会在临床应用中产生很大的问题。为详细地研究该问题，本发明的发明者将当导入到细胞中时能组成型表达Int6-siRNA的载体型siRNA导入到细胞中，并且对其进行长期观察。在癌化细胞系如MCF-7和HeLa细胞中，完全抑制内源Int6的载体型siRNA的导入缩短了细胞的存活时间，细胞生长在七周内停止，而且诱导了细胞死亡。这可以解释为，Int6的角色之一是翻译控制，并且其完全抑制引起了翻译控制的异常。
在使用得自小鼠的原代培养的成纤维细胞的实验中，以及使用得自Kurabo的用于血管发生分析的培养细胞的实验中，十一天的观察结果表明，当siRNA表达载体和合成siRNA的导入显示出有效的血管发生时，完全观察不到癌化。
工业实用性
在与低氧应激反应有关的基因中，报道了转录因子HIF(低氧诱导因子)。已知这些因子可以产生肿瘤血管发生所必需的血管内皮生长因子(VEGF)，并能调节与线粒体的能量代谢有关的多种糖酵解途径酶的转录。在实体瘤(如癌)中，尽管血流丰富，仍处于肿瘤内部相当低氧的状态，而该状态因而会促进血管发生。除血管发生外，HIF还在细胞内扮演各种角色，并且，举例来说，促红细胞生成素基因表达的增强对于低氧下红细胞的生长是必需的，而增加的VEGF基因表达对于血管发生是重要的(图6)。
在正常氧浓度(21％)下，HIF1α被遍在蛋白酶体体系分解，但在低氧状态下其免除了这种分解，并转移到细胞核中以引发作为转录因子的各种因子的诱导。HIF自身主要被分为三种：HIF1α、HIF2α和HIF3α。与遍在表达的HIF1α不同，HIF2α在血管内皮、脑胶质、成纤维细胞、骨骼肌和心肌中特异表达，而HIF3α在脑神经系中特异表达。已知HIF1α与例如脑梗死或心肌梗死的缺血性疾病有关。HIF2α与低氧应激相关疾病(特别是癌)中的血管发生有关。HIF1α在细胞内的行为已经被阐明。反之，尽管已报道了与HIF2α结合的几种因子，能调节其功能的因子完全没有被探清。从HIF2α与血管发生的紧密关系，已推测对其细胞内行为的调节将允许新的血管发生的诱导，因此本发明的发明者分析了HIF2α的新的调节因子。
本发明的发明者使用酵母双杂交方法，成功地从人类心脏库或脑库中鉴定出六种新的因子作为HIF2α互作因子(图7)。在这些因子中，Int6曾被报道作为小鼠或人类体内乳癌的肿瘤抑制因子，但其作用机制完全未知。
Int6最初是翻译调节因子eIF3e/p48，并且当小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)侵染小鼠时，其与9个基因座结合，而该部位的目标基因被破坏。由于其对应于被破坏的基因中的第6个结合位点，故被命名为Int6。MMTV的侵染致使Int6成为C末端部分缺失的组成型失活(显性失活)突变体(Int6-ΔC)，并且逐渐形成了乳癌(图8)。但是，该突变体如何导致乳癌产生的机制尚不清楚。
本发明的发明者鉴定出了作为与HIF2α结合的因子的Int6蛋白，并且首次揭示出，通过提高HIF2α的活性，促进低氧应激应答基因的转录，抑制Int6表达或其功能的物质以及Int6的显性失活突变体(Int6-ΔC)能提高血管发生的效果。
特别是，具有抑制Int6表达效果的物质被期待具有明显的血管发生效果，并被期待用于闭塞性动脉硬化、经皮血管舒张治疗(PCT)后的再狭窄和心肌梗死等的治疗。特别地，被期待对Int6表达具有特异的抑制效果的siRNA通过抑制转录调节因子的表达而促进了具有疗效的基因的表达，并被高度期待成为全新概念上的治疗剂。
此外，本发明的发明者表明，通过使用siRNA表达载体来敲除Int6(其通常被报道作为翻译调节因子(eIF3e)或乳癌的肿瘤抑制因子)，在使用小鼠的动物实验中完全有可能形成新的正常动脉而不发生癌化。此外，本发明的发明者表明，siRNA的靶细胞是载体细胞，如成纤维细胞。这强有力地暗示出新动脉通过如下方式形成的可能性：培养收集自病人的载体细胞如成纤维细胞并使之生长，从体外导入合成的siRNA，然后将其自体移植到病患处。使用将导入了siRNA的收集自病人的细胞(siRNA处理的血管发生诱导细胞)返回到病患处的自体移植方法，以免除载体的开发(其是siRNA药物开发中的瓶颈)。
治疗方法的开发被预期用于闭塞性动脉硬化、心肌梗死和脑梗死等疾病，而且由于与生活方式有关的疾病的增加，将来病人数量也会增长。期待通过构建新血管可使这些疾病得到治疗。期待新血管的构建还能用于使肝硬化的肝实质细胞恢复血流，并用于使神经肌肉变性疾病的肌肉由于血管发育而再生。并且在使用胚胎干细胞(ES细胞)和基质干细胞的再生医疗中，血管发生对于确保血液循环以重构组织是必需的。
本发明提供了新生血管旁路疗法，其可被用于闭塞性动脉硬化、心肌梗死和脑梗死的治疗，并提供了再生医疗如肝再生，其中载体细胞如病人的成纤维细胞在用Int6的合成siRNA处理后被自体移植(siRNA处理的血管发生诱导细胞)。作为本发明新生血管旁路疗法的一例，该方法的基本概念示于图9。
如本发明的实施例所述，本发明的发明者论证了抑制Int6表达或其功能的物质有效地增加了动脉血管发生，并在动物实验水平上确认了该事实。特别地，被期待对Int6基因表达具有特异的抑制效果的siRNA通过抑制转录调节因子的表达促进了对血管疾病有疗效的基因的表达，并被高度期待成为全新概念上的血管疾病治疗剂。在以血管发生为目的的传统基因疗法中，只有相关基因被强制地表达。与之不同，基于本概念的siRNA试剂(诱导血管发生的siRNA试剂)通过特异性地抑制目标基因的表达，能提高对血管发生所必需的一群相关基因的总体表达，从而其被期待能获得明显的疗效。
本发明动物实验结果的详细评价暗示出成纤维细胞中诱导血管发生的siRNA有表达效果的可能性。这表明了基于全新概念的“siRNA处理的血管发生诱导细胞”的可能应用，其中，成纤维细胞中对Int6基因表达的特异性抑制导致了对血管发生有效的低氧应激应答基因群的全面表达(图10)。由于成纤维细胞可获自病人自身，生长，并易于自体移植，预期在移植“siRNA处理的血管发生诱导细胞”时排斥反应等发生的可能性会降低。
至于载体细胞如成纤维细胞的自体移植，其作为人工皮肤的应用早已被证实，并且根据这些方案制备“siRNA处理的血管发生诱导细胞”是可能的。特别是，载体细胞如成纤维细胞是从病毒检测结果为阴性的病人皮肤小片中收集的，并大量培养以制备主细胞和工作细胞。在主细胞的病毒检测被再次确认为阴性后，工作细胞被依次解冻并传代培养以制备用于“siRNA处理的血管发生诱导细胞”的载体细胞。在制备细胞时，还需要进行支原体检测以及细菌/真菌检测以确认结果为阴性。用于制备“siRNA处理的血管发生诱导细胞”的载体细胞通过冷冻来保存，以在需要时提供。
此外，通过体外的电穿孔法等将血管发生诱导siRNA导入到源自病人的成纤维细胞中，可获得高的导入效果。由于该方法使用siRNA暂时性地形成了“siRNA处理的血管发生诱导细胞”，并且细胞癌化等的可能性由于遗传修饰而变得很低，因此与使用目的基因表达载体的制备移植用细胞的方法(基因疗法)相比，该方法被认为是极度安全的方法。同时，在传统的siRNA药物开发中被认为是问题的特殊输送系统也是不需要的。
此外，对于本发明的“siRNA处理的血管发生诱导细胞”，载体细胞可容易地收集自病人并生长。在髓单核细胞的移植中，预想在血流明显阻滞之处很难发挥效果，这是因为主要发挥血管发生效果的血管内皮前体细胞是通过血流供给的。与之不同，在本实际应用研究中的“siRNA处理的血管发生诱导细胞”由于可通过直接注射被移植到任何部位，其被期待即使在血流阻滞的部位也能发挥效果。另外，血流阻滞的部位处于低氧状态，而该低氧状态被期待能进一步增加内源HIF2α在“siRNA处理的血管发生诱导细胞”中的活性，因此产生了协同效应。
本发明揭示了Int6将会成为药物开发的合适靶分子。本发明中获得的各种发现对于阐明低氧应激反应的机制同样是非常有用的学术信息。
序列表
<110>财团法人东京都医学研究机构有限公司照顾技术
<120>与低氧应激反应有关的Int6蛋白及其用途
<130>TKT-A0501P
<150>JP 2005-142553
<151>2005-05-16
<160>11
<170>Patentln version 3.1
<210>1
<211>1510
<212>DNA
<213>人类(Homo sapiens)
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<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>2
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agagcagctg gtccagacca gccctgcagc ccccactcag ccggcagcca gatggccccg  4500
caaggcctcc agggatggcc cctagccaca ggccctggct gaggtctctg ggtcggtcag  4560
tgacatgtag gtaggaagca ctgaaaatag tgttcccaga gcactttgca actccctggg  4620
taagagggac gacacctctg gtttttcaat accaattaca tggaactttt ctgtaatggg  4680
tacaatgaag aagtttctaa aaacacacac aaagcacatt gggccaacta tttagtaagc  4740
ccggatagac ttattgccaa aaacaaaaaa tagctttcaa aagaaattta agttctatga  4800
gaaattcctt agtcatggtg ttgcgtaaat catattttag ctgcacggca ttaccccaca  4860
cagggtggca gaacttgaag ggttactgac gtgtaaatgc tggtatttga tttcctgtgt  4920
gtgttgccct ggcattaagg gcattttacc cttgcagttt tactaaaaca ctgaaaaata  4980
ttccaagctt catattaacc ctacctgtca acgtaacgat ttcatgaacg ttattatatt  5040
gtcgaattcc tactgacaac attataactg tatgggagct taactttata aggaaatgta  5100
ttttgacact ggtatcttat taaagtattc tgatcctaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa  5160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa                                       5186
<210>4
<211>870
<212>PRT
<213>人类(Homo sapiens)
<400>4
Met Thr Ala Asp Lys Glu Lys Lys Arg Ser Ser Ser Glu Arg Arg Lys
1               5                   10                  15
Glu Lys Ser Arg Asp Ala Ala Arg Cys Arg Arg Ser Lys Glu Thr Glu
            20                  25                  30
Val Phe Tyr Glu Leu Ala His Glu Leu Pro Leu Pro His Ser Val Ser
        35                  40                  45
Ser His Leu Asp Lys Ala Ser Ile Met Arg Leu Ala Ile Ser Phe Leu
    50                  55                  60
Arg Thr His Lys Leu Leu Ser Ser Val Cys Ser Glu Asn Glu Ser Glu
65                  70                  75                  80
Ala Glu Ala Asp Gln Gln Met Asp Asn Leu Tyr Leu Lys Ala Leu Glu
                85                  90                  95
Gly Phe Ile Ala Val Val Thr Gln Asp Gly Asp Met Ile Phe Leu Ser
            100                 105                 110
Glu Asn Ile Ser Lys Phe Met Gly Leu Thr Gln Val Glu Leu Thr Gly
        115                 120                 125
His Ser Ile Phe Asp Phe Thr His Pro Cys Asp His Glu Glu Ile Arg
    130                 135                 140
Glu Asn Leu Ser Leu Lys Asn Gly Ser Gly Phe Gly Lys Lys Ser Lys
145                 150                 155                 160
Asp Met Ser Thr Glu Arg Asp Phe Phe Met Arg Met Lys Cys Thr Val
                165                 170                 175
Thr Asn Arg Gly Arg Thr Val Asn Leu Lys Ser Ala Thr Trp Lys Val
            180                 185                 190
Leu His Cys Thr Gly Gln Val Lys Val Tyr Asn Asn Cys Pro Pro His
        195                 200                 205
Asn Ser Leu Cys Gly Tyr Lys Glu Pro Leu Leu Ser Cys Leu Ile Ile
    210                 215                 220
Met Cys Glu Pro Ile Gln His Pro Ser His Met Asp Ile Pro Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ser Lys Thr Phe Leu Ser Arg His Ser Met Asp Met Lys Phe Thr Tyr
                245                 250                 255
Cys Asp Asp Arg Ile Thr Glu Leu Ile Gly Tyr His Pro Glu Glu Leu
            260                 265                 270
Leu Gly Arg Ser Ala Tyr Glu Phe Tyr His Ala Leu Asp Ser Glu Asn
        275                 280                 285
Met Thr Lys Ser His Gln Asn Leu Cys Thr Lys Gly Gln Val Val Ser
    290                 295                 300
Gly Gln Tyr Arg Met Leu Ala Lys His Gly Gly Tyr Val Trp Leu Glu
305                 310                 315                 320
Thr Gln Gly Thr Val Ile Tyr Asn Pro Arg Asn Leu Gln Pro Gln Cys
                325                 330                 335
Ile Met Cys Val Asn Tyr Val Leu Ser Glu Ile Glu Lys Asn Asp Val
            340                 345                 350
Val Phe Ser Met Asp Gln Thr Glu Ser Leu Phe Lys Pro His Leu Met
        355                 360                 365
Ala Met Asn Ser Ile Phe Asp Ser Ser Gly Lys Gly Ala Val Ser Glu
    370                 375                 380
Lys Ser Asn Phe Leu Phe Thr Lys Leu Lys Glu Glu Pro Glu Glu Leu
385                 390                 395                 400
Ala Gln Leu Ala Pro Thr Pro Gly Asp Ala Ile Ile Ser Leu Asp Phe
                405                 410                 415
Gly Asn Gln Asn Phe Glu Glu Ser Ser Ala Tyr Gly Lys Ala Ile Leu
            420                 425                 430
Pro Pro Ser Gln Pro Trp Ala Thr Glu Leu Arg Ser His Ser Thr Gln
        435                 440                 445
Ser Glu Ala Gly Ser Leu Pro Ala Phe Thr Val Pro Gln Ala Ala Ala
    450                 455                 460
Pro Gly Ser Thr Thr Pro Ser Ala Thr Ser Ser Ser Ser Ser Cys Ser
465                 470                 475                 480
Thr Pro Asn Ser Pro Glu Asp Tyr Tyr Thr Ser Leu Asp Asn Asp Leu
                485                 490                 495
Lys Ile Glu Val Ile Glu Lys Leu Phe Ala Met Asp Thr Glu Ala Lys
            500                 505                 510
Asp Gln Cys Ser Thr Gln Thr Asp Phe Asn Glu Leu Asp Leu Glu Thr
        515                 520                 525
Leu Ala Pro Tyr Ile Pro Met Asp Gly Glu Asp Phe Gln Leu Ser Pro
    530                 535                 540
Ile Cys Pro Glu Glu Arg Leu Leu Ala Glu Asn Pro Gln Ser Thr Pro
545                 550                 555                 560
Gln His Cys Phe Ser Ala Met Thr Asn Ile Phe Gln Pro Leu Ala Pro
                565                 570                 575
Val Ala Pro His Ser Pro Phe Leu Leu Asp Lys Phe Gln Gln Gln Leu
            580                 585                 590
Glu Ser Lys Lys Thr Glu Pro Glu His Arg Pro Met Ser Ser Ile Phe
        595                 600                 605
Phe Asp Ala Gly Ser Lys Ala Ser Leu Pro Pro Cys Cys Gly Gln Ala
    610                 615                 620
Ser Thr Pro Leu Ser Ser Met Gly Gly Arg Ser Asn Thr Gln Trp Pro
625                 630                 635                 640
Pro Asp Pro Pro Leu His Phe Gly Pro Thr Lys Trp Ala Val Gly Asp
                645                 650                 655
Gln Arg Thr Glu Phe Leu Gly Ala Ala Pro Leu Gly Pro Pro Val Ser
            660                 665                 670
Pro Pro His Val Ser Thr Phe Lys Thr Arg Ser Ala Lys Gly Phe Gly
        675                 680                 685
Ala Arg Gly Pro Asp Val Leu Ser Pro Ala Met Val Ala Leu Ser Asn
    690                 695                 700
Lys Leu Lys Leu Lys Arg Gln Leu Glu Tyr Glu Glu Gln Ala Phe Gln
705                 710                 715                 720
Asp Leu Ser Gly Gly Asp Pro Pro Gly Gly Ser Thr Ser His Leu Met
                725                 730                 735
Trp Lys Arg Met Lys Asn Leu Arg Gly Gly Ser Cys Pro Leu Met Pro
            740                 745                 750
Asp Lys Pro Leu Ser Ala Asn Val Pro Asn Asp Lys Phe Thr Gln Asn
        755                 760                 765
Pro Met Arg Gly Leu Gly His Pro Leu Arg His Leu Pro Leu Pro Gln
    770                 775                 780
Pro Pro Ser Ala Ile Ser Pro Gly Glu Asn Ser Lys Ser Arg Phe Pro
785                 790                 795                 800
Pro Gln Cys Tyr Ala Thr Gln Tyr Gln Asp Tyr Ser Leu Ser Ser Ala
                805                 810                 815
His Lys Val Ser Gly Met Ala Ser Arg Leu Leu Gly Pro Ser Phe Glu
            820                 825                 830
Ser Tyr Leu Leu Pro Glu Leu Thr Arg Tyr Asp Cys Glu Val Asn Val
        835                 840                 845
Pro Val Leu Gly Ser Ser Thr Leu Leu Gln Gly Gly Asp Leu Leu Arg
    850                 855                 860
Ala Leu Asp Gln Ala Thr
865                 870
<210>5
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>人工合成的序列
<400>5
gatcccaaga accacagtgg ttgcattcaa gagatgcaac cactgtggtt cttttttttg    60
gaaa                                                                 64
<210>6
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>人工合成的序列
<400>6
gatcccaagc atggttttag gcaggttcaa gagacctgcc taaaaccatg cttttttttg    60
gaaa                                                                 64
<210>7
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>人工合成的序列
<400>7
gatcccaatg ctttaagttc actctttcaa gagaagagtg aacttaaagc attttttttg    60
gaaa                                                                 64
<210>8
<211>64
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>人工合成的序列
<400>8
gatcccaaca tggtagactt tgctattcaa gagatagcaa agtctaccat gttttttttg    60
gaaa                                                                 64
<210>9
<211>53
<212>DNA
<213>家鼠(Mus musculus)
<400>9
aatatggtgg actttgctat tcaagagata gcaaagtcca ccatattttt ttt           53
<210>10
<211>53
<212>DNA
<213>家鼠(Mus musculus)
<400>10
aagaaccaca gttgttgcgt tcaagagacg caacaactgt ggttcttttt ttt           53
<210>11
<211>53
<212>DNA
<213>家鼠(Mus musculus)
<400>11
aaacatgggt ttaggcaagt tcaagagact tgcctaaacc catgtttttt ttt           53

Claims (35)

1. 一种低氧应激反应促进剂，包含抑制Int6蛋白表达的物质或抑制Int6蛋白功能的物质作为有效成分。
2. 权利要求1所述的低氧应激反应促进剂，其中所述抑制Int6蛋白表达的物质是从由以下(a)～(c)构成的群组中选出的一种化合物：
(a)Int6基因转录物或其一部分的反义核酸；
(b)具有特异地剪切Int6基因转录物的核糖核酸酶活性的核酸；和
(c)具有利用RNAi效果来抑制Int6基因表达的功能的核酸。
3. 权利要求1所述的低氧应激反应促进剂，其中所述抑制Int6蛋白表达的物质是雌性激素、雌性激素分泌促进剂或雌性激素受体激动剂。
4. 权利要求1所述的低氧应激反应促进剂，其中所述抑制Int6蛋白功能的物质是从由以下(a)～(c)构成的群组中选出的一种化合物：
(a)与Int6蛋白结合的抗体；
(b)与Int6蛋白结合的低分子量化合物；和
(c)抑制Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性的化合物。
5. 权利要求1～4中任一项所述的低氧应激反应促进剂，其中所述低氧应激反应的促进是血管发生的诱导。
6. 一种低氧应激反应抑制剂，包含提高Int6蛋白表达的物质或提高Int6蛋白功能的物质作为有效成分。
7. 权利要求6所述的低氧应激反应抑制剂，其中所述提高Int6蛋白表达的物质是雌性激素抑制剂。
8. 权利要求7所述的低氧应激反应抑制剂，其中所述低氧应激反应的抑制是血管发生的抑制。
9. 一种血管疾病治疗剂，含有权利要求1～5中任一项所述的低氧应激反应促进剂作为有效成分。
10. 权利要求9所述的血管疾病治疗剂，其中所述血管疾病是缺血性脑疾病或缺血性心疾病、神经变性疾病、创伤性脑损伤、或者肝疾病、胰腺疾病、肌肉疾病或皮肤疾病。
11. 一种与血管发生有关的疾病的治疗剂，包含权利要求6～8中任一项所述的低氧应激反应抑制剂作为有效成分。
12. 权利要求11所述的与血管发生有关的疾病的治疗剂，其中与所述血管发生有关的疾病是癌症。
13. 一种Int6基因表达被人为地抑制了的非人类转基因动物。
14. 权利要求13所述的非人类转基因动物，其中所述Int6基因表达通过如下(a)～(c)中任一种核酸的作用而被抑制：
(a)Int6基因转录物或其一部分的反义核酸；
(b)具有特异地剪切Int6基因转录物的核糖核酸酶活性的核酸；和
(c)具有利用RNAi效果来抑制Int6基因表达的功能的核酸。
15. 权利要求13或14所述的非人类转基因动物，其中血管发生效果被促进了。
16. 一种筛选血管疾病治疗剂的方法，其中选择使Int6基因表达水平或Int6蛋白活性降低的化合物。
17. 一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6基因表达细胞接触；
(b)测定所述细胞中Int6基因表达的水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物降低了表达水平。
18. 一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与细胞或细胞提取液接触，所述细胞包含具有如下结构的DNA，在该结构中，报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物降低了表达水平。
19. 一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白或表达该蛋白的细胞或该细胞的提取液接触；
(b)测定所述蛋白的活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的活性相比，该化合物降低了所述蛋白的活性。
20. 一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括对抑制Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性的化合物进行选择。
21. 一种筛选血管疾病治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白和HIF2α蛋白接触；
(b)测定Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的结合活性相比，该化合物降低了所述结合活性。
22. 一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂的方法，包括对提高Int6基因表达水平或Int6蛋白活性的化合物进行选择。
23. 一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6基因表达细胞接触；
(b)测定所述细胞中Int6基因表达的水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物提高了表达水平。
24. 一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与细胞或细胞提取液接触，所述细胞包含具有如下结构的DNA，在该结构中，报告基因与Int6基因的转录调控区可操作地进行连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的表达水平相比，该化合物提高了表达水平。
25. 一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白或表达该蛋白的细胞或该细胞的提取液接触；
(b)测定所述蛋白的活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的活性相比，该化合物提高了所述蛋白的活性。
26. 一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂的方法，包括对提高Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性的化合物进行选择。
27. 一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)将测试化合物与Int6蛋白和HIF2α蛋白接触；
(b)测定Int6蛋白与HIF2α蛋白之间的结合活性；并且
(c)选择一种化合物，与在没有所述测试化合物存在时测定的结合活性相比，该化合物提高了所述结合活性。
28. 一种筛选与血管发生有关的疾病的治疗剂的方法，包括如下步骤：
(a)用测试化合物对权利要求13～15中任一项所述的非人类转基因动物给药；
(b)测定所述非人类转基因动物中的Int6表达水平或活性，或测定所述动物中的血管发生效果；并且
(c)选择一种化合物，与没有用所述测试化合物给药的情况相比，该化合物降低了血管发生效果，或该化合物提高了Int6表达水平或活性。
29. 一种血管发生诱导剂，包含Int6的显性失活突变体作为有效成分。
30. 权利要求29所述的血管发生诱导剂，其中所述Int6的显性失活突变体是一种Int6蛋白的C末端PINT区已缺失的Int6蛋白突变体。
31. 一种血管发生抑制剂，包含Int6蛋白或Int6蛋白的表达载体作为有效成分。
32. 一种载体细胞，其中Int6基因表达已被抑制，并且血管发生已被诱导。
33. 权利要求32所述的载体细胞，在其中导入有Int6基因的siRNA。
34. 一种血管疾病治疗剂，包含权利要求31所述的血管发生抑制剂或者权利要求32或33所述的载体细胞作为有效成分。
35. 一种血管疾病治疗剂的生产方法，包括将Int6基因的siRNA导入到分离的载体细胞中的步骤。
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