DE60126654T2 - Modulatoren der aktivität von g-protein gekoppelten rezeptor kinasen - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Inhibitoren GRK-assoziierter Signaltransduktion (GAST), die in den Ansprüchen definiert sind, insbesondere auf die Verbindung K024H107 (SEQ ID NO.: 10). Die genannten Inhibitoren sind als Medikamente verwendbar, insbesondere zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Obesitas, Dyslipidämie, Cholesterinämie, Koagulationsstörungen, Syndrom X, Diabetes, Hypertone oder Ateriosklerose, insbesondere von Diabetes-assoziierten Phänomenen, z.B. Diabetes Typ II, Diabetes-assoziierte Obesität bzw. Fettleibigkeit, durch Diabetes verursachte Hypertonie oder Diabetes-assoziierte Dyslipidämie.
  • Serin/Threonin-Kinasen sind Mitglieder der eukaryotischen Proteinkinase-Superfamilie. Enzyme dieser Klasse phosphorylieren spezifisch Serin- oder Threoninreste von intracellulären Proteinen und sind bei der Vermittlung der Signaltransduktion in multicellulären Organismen von Bedeutung. Viele Serin/Threonin-Kinasen treten als intracelluläre Proteine auf, die an der Signaltransduktion innerhalb der Zelle beteiligt sind, einschließlich Signaltransduktion an den Nucleus und der Aktivierung anderer Proteine.
  • Als solche ist die Phosphorylierung von Serin oder Threonin durch Serin/Threonin-Kinasen ein wichtiger Mechanismus zur Regulierung intracellulärer Ereignisse als Reaktion auf Änderungen in der Umgebung. Eine weite Vielzahl von cellulären Ereignissen wird durch Serin/Threonin-Kinasen reguliert. Einige Beispiele umfassen die Fähigkeit von Zellen, in die Mitose einzutreten und/oder diese zu vollenden, celluläre Proliferation, celluläre Differenzierung, die Kontrolle des Fettmetabolismus, von Immunreaktionen, inflammatorischen Reaktionen und die Kontrolle des Glycogenmetabolismus.
  • Eine wichtige Superfamilie von Zellmembranrezeptoren ist die Gruppe, die als G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) bekannt ist, die auch als Sieben-Transmembranrezeptoren (7TM) bekannt sind. Diese Rezeptorsuperfamilie ist bei der Transmission von Signalen involviert, die aus Liganden mit niedrigem Molekulargewicht, z.B. Adrenalin, oder aus Peptidliganden, z.B. Chemokine und eine Vielzahl von Hormonen, z.B. Melanozyten-stimulierendes Hormon (MSH), herrühren.
  • Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass intracelluläre Proteinkinasen, die spezifisch mit verschiedenen Mitgliedern der 7TM-Rezeptoren wechselwirken, fähig sind, sie zu desensibilisieren und dadurch die Signaltransmission, die durch 7TM bewerkstelligt wird, zu verringern oder zu eliminieren. Diese Proteinkinasen sind als G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinasen (GRKs) bekannt, die Serin/Threonin-Kinasen sind. Bisher wurden sechs dieser Kinasen entdeckt (GRK1-6). Einige der GRKs sind auf eine kleine Zahl von Geweben beschränkt (z.B. GRK1), während GRK2 und GRK3, die auch als β-ARGK1 und β-ARK2 bekannt sind, reichlich exprimiert werden. Eine umfassende Übersicht wird z.B. von M. Bunemann und M. M. Hosey, „G- Protein Coupled Receptor Kinases as Modulators of G-Protein Signalling," J. of Physiology, Bd. 517(1):5-23 (1999) bereitgestellt.
  • Syndrom X ist ein Ausdruck, der 1988 von dem Endokrinologen Dr. Gerald Risson von der Stanford University geprägt wurde, der eine Gruppe von Symptomen beschreibt, welche umfassen: hohen Blutdruck, Abdomenfettleibigkeit, Insulinresistenz, hohe Level an Triglyceriden und niedrige Level an HDL, niedrige Level an Antioxidans-Vitaminen und DHEA, hohe Cortisonspiegel sowie Depression. Einige Experten schätzen, dass zwei Drittel der Amerikaner an Syndrom X leiden können, obgleich es über Jahre wirksam als Symptome für andere Zustände, z.B. Müdigkeit, schlechte mentale Konzentration, Abdomen-Fettleibigkeit, Ödem, Nervenschädigung und intensive Lust nach Süßigkeiten, verborgen werden kann.
  • Die Internationalen Patentanmeldungen WO 9853050, WO 9853051 und WO 200018895 offenbaren Proteinkinase-modulierende Peptide der HJ-Schleife von Serin/Threonin-Kinase, der HJ-Schleife von Serin/Tyrosin-Kinase, der αD-Region einer Proteinkinase. Keine der in diesen Patentanmeldungen diskutierten Proteinkinasen ist zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Obesitas, Dyslipidämie, Cholesterinämie, Koagulationsstörungen, Syndrom X bzw. metabolischem Syndrom, Diabetes, Hypertonie oder Arteriosklerose, insbesondere Diabetes-assoziierten Phänomenen, wie Diabetes Typ II, Diabetes-assoziierte Obesitas bzw. Fettleibigkeit, durch Diabetes verursachte Hypertonie oder Diabetes-assoziierte Dyslipidämie, verwendbar.
  • Die obigen Peptide modulieren die GRK-assoziierte Signaltransduktion. Diese zwei Feststellungen führen zu der Realisierung, dass eine Modulation von GRK-assoziierte Signaltransduktion eine Vielzahl von metabolisch bedingte Störungen und Erkrankungen lindern kann.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die folgenden Verbindungen K024H003 (SEQ ID NO.: 2), K024H007 (SEQ ID NO.: 3), K024H101 (SEQ ID NO.: 4), K024H102 (SEQ ID NO.: 5), K024H103 (SEQ ID NO.: 6), K024H104 (SEQ ID NO.: 7), K024H105 (SEQ ID NO.: 8), K024H106 (SEQ ID NO.: 9), K024H107 (SEQ ID NO.: 10), K024H108 (SEQ ID NO.: 11), K024H109 (SEQ ID NO.: 12), K024H110 (SEQ ID NO.: 13), K024H111 (SEQ ID NO.: 14), K024H112 (SEQ ID NO.: 15), K024H113 (SEQ ID NO.: 16), K024H114 (SEQ ID NO.: 17), K024H901 (SEQ ID NO.: 18), K024H903 (SEQ ID NO.: 19) oder und SEQ ID NO.: 20 bis SEQ ID NO.: 38. Die genannten Verbindungen, die Inhibitorenen der GRK-assoziierten Signaltransduktion (GAST) sind, und insbesondere die Verbindung K024H107 (SEQ ID NO.: 10) sind als Medikamente und insbesondere für die Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Obesitas bzw. Fettleibigkeit, Dyslipidämie, Cholesterinämie, Koagulationsstörungen, Syndrom X, Diabetes, Hypertonie oder Arteriosklerose, insbesondere Diabetes-assoziierten Phänomenen, z.B. Diabetes Typ II, Diabetes-assoziierte Obesitas, durch Diabetes verursachte Hypertonie oder Diabetes-assoziierte Dyslipidämie verwendbar.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf einem Verfahren zur Herstellung eines Medikaments für die Modulation eines metabolischen Parameters bei einem Subjekt, wobei das Verfahren umfasst:
    Verabreichen an ein Subjekt, das einer solchen Behandlung bedarf, eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung, die eine Sequenz umfasst, die aus SEQ ID NO.: 2 bis 38 ausgewählt ist.
  • Der Ausdruck „Modulierung" bzw. „Modulation" bezieht sich auf eine Erhöhung oder Abnahme bzw. Senkung des getesteten metabolischen Parameters, z.B. Senkung der Blutglucose, Appetitabnahme, Gewichtsabnahme, Erhöhung der Melanogenese, Erhöhung beim Grundstoffwechsel usw.. Dieser Ausdruck bezieht sich auch auf eine Änderung der Reaktion des metabolischen Parameters auf Effektoren, z.B. Änderung beim Blutglucosespiegel (der metabolische Parameter) als Reaktion auf Effektoren (z.B. Insulinverabreichung, Stress, Glucosebeladung) im Vergleich zu einer Kontrolle.
  • Der Ausdruck „metabolischer Parameter" bezieht sich auf wenigstens ein messbares physiologisches Phänomen, das für die Aktivität eines Stoffwechselwegs indikativ sein kann. Die folgende Tabelle wird eine Liste von metabolischen Parametern anführen, die durch das Verfahren der Erfindung moduliert werden können, und die Krankheit angeben, die durch Modulation des Parameters behandelt werden kann.
  • Figure 00030001
  • Eine Modulierung bzw. Modulation des Metabolismus einer Person bezieht sich auf eine Inhibierung oder eine Verstärkung der metabolischen Prozesse, z.B. Glucoseaufnahme (Insulinabängig oder -unabhängig), Lipidabbau oder Synthese, Gluconeogenese, Glycogenolyse, cellulä re Aufnahme von freien Fettsäuren und Triglyceriden und Cholesterinmetabolismus, im Vergleich zu einem Basislinienlevel für die Person, wie er im Fachgebiet bekannt ist.
  • „Modulation eines metabolischen Parameters" bzw. „Modulierung eines metabolischen Parameters" bezieht sich auf eine verstärkte Melanogenese, eine Veränderung von Syndrom X, eine Korrektur von Diabetes mellitus-Typ II, eine Verbesserung der Herzfunktion, eine Linderung bei Hypertonie, ein verbessertes Blutlipidprofil und eine verringerte Neigung zu Obesitas. Verfahren zur Bestimmung von Änderungen in diesen Funktionen und Aktivitäten sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden später näher beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf die Verwendung einer Verbindung, die in den Ansprüchen definiert ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes und von Diabetes-assoziierten Phänomenen, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus den Sequenzen ID NO.: 2-38.
  • Der Ausdruck „Diabetes" bezieht sich im Kontext der vorliegenden Erfindung sowohl auf Diabetes mellitus-Typ II, verursacht durch Insulinresistenz, als auch auf Diabetes mellitus-Typ I, verursacht durch Verringerung der Insulinsekretion. Im zuletzt genannten Fall würde wenigstens eine gewisse intrinsische Insulinkonzentration im Serum der Person vorliegen (da die Verbindung durch den GPCR-Weg wirkt), entweder als Resultat einer Grundsekretion oder als Resultat einer externen Verabreichung. Somit können die Verbindungen der Erfindung zusammen mit Insulin verwendet werden, wodurch die erforderliche Dosierung gesenkt wird oder die Verabreichungsepisoden verringert werden.
  • Der Ausdruck „Behandlung von Diabetes-assoziierten Phänomenen" beinhaltet: Senkung der Blutglucosespiegel, verbesserte Reaktion (bezüglich Kontrollglucoseblutspiegel) auf Effektoren, z.B. Insulinverabreichung, Fasten oder Glucosebeladung, wie auch eine Verbesserung bei wenigstens einem der Diabetes-assoziierten Phänomene, wie sie oben beschrieben wurden, einschließlich Obesitas, Hypertonie, Dyslipidämie und dergleichen.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Verwendung einer Verbindung, die in den Ansprüchen definiert ist, die eine Sequenz umfasst, die aus SEQ ID NO.: 2-38 ausgewählt ist, für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus Diabetes, Hypertonie, Obesitas, Dyslipidämie, kongestiver Herzerkrankungen, Arteriosklerose, Cholesterinämie, Koagulationsstörungen und Syndrom X.
  • Die günstigen Verbindungen für die Modulierung eines metabolischen Parameters, die in den Ansprüchen definiert sind, sind aus den obigen Sequenzen (a) bis (i) ausgewählt.
  • Somit werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch ein Verfahren erhalten, das die Modulierung eines metabolischen Parameters beinhaltet, wobei das Verfahren umfasst:
    • (a) Identifizieren von Peptidregionen in GRK, die in Positionen sind, ausgewählt aus: 382-414 (HJ-Schleife bzw. HJ-Loop), 271-290 (A-Region), 257-265 (B4-B5-Region), 240-260 (αD-Region);
    • (b) Synthetisieren einer Vielzahl von Verbindungen, die eine Sequenz umfassen, ausgewählt aus:
    • (b1) einer Sequenz, die Sequenzen der HJ-Schleife, der A-Region, der B4-B5- oder αD-Region mit wenigstens fünf fortlaufenden Aminosäuren entspricht;
    • (b2) einer Variante einer Sequenz nach (b1), worin bis zu 40% der Aminosäuren der nativen Sequenz durch eine natürlich oder nicht-natürlich vorkommende Aminosäure oder durch eine peptidomimetische organische Gruppierung ersetzt wurden; und/oder bis zu 40% der Aminosäuren ihre Seitenketten chemisch modifiziert wurden; und/oder bis zu 20% der Aminosäuren deletiert wurden, mit der Maßgabe, dass die Variante wenigstens 50% der Aminosäuren, die in der Sequenz (b1) vorliegen, unverändert hat und dass die Variante die biologischen Eigenschaften der Stammaminosäuren von (b1) beibehält;
    • (b3) einer Sequenz von (b1) oder (b2), worin eine oder mehrere der Aminosäuren durch die entsprechende D-Aminosäure ersetzt wurde(n);
    • (b4) einer Sequenz von (b1), (b2) oder (b3), worin wenigstens eine peptidische Hauptkette in eine nicht-natürlich vorkommende peptische Hauptkette geändert wurden;
    • (b5) einer Sequenz, die die Sequenz von einer der (b1), (b2), (b3) oder (b4) in umgekehrter Reihenfolge ist; und
    • (b6) einer Kombination von zwei oder mehr Sequenzen von (b1)-(b5);
    • (c) Untersuchen der Modulationsaktivität der Verbindungen von (b) in einem Testassay zur Bestimmung des Spiegels bzw. der Konzentration wenigstens eines metabolischen Parameters;
    • (d) Auswählen aus den Verbindungen von (c) solche Verbindungen, die den metabolischen Parameter in dem Testassay im Vergleich zu der Modulierung in demselben Testassay in Abwesenheit der Verbindung modulierten; und
    • (e) Herstellen der Verbindungen von (d) und dadurch Erhalt von Verbindungen für die Modulierung des metabolischen Parameters.
  • Die Menge an Verbindungen der Erfindung, die dem Individuum verabreicht wird, wird vom Typ und der Schwere der Krankheit (z.B. dem Grad der Hyperinsulinämie) und von den Merkmalen der Person, z.B. allgemeiner Gesundheitszustand, Alter, Körpergewicht, Geschlecht und Toleranz gegenüber Medikamenten, wie auch vom Verabreichungsmodus abhängen. Der Fachmann wird fähig sein, in Abhängigkeit von diesen und anderen Faktoren geeignete Dosierungen zu bestimmen. Typischerweise kann eine therapeutisch wirksame Menge der Verbindung im Bereich von 1 mg pro Tag bis etwa 1000 mg pro Tag für einen Erwachsenen liegen. Vorzugsweise liegt die Dosierung im Bereich von etwa 1 mg pro Tag bis etwa 100 mg pro Tag.
  • Nach einem zweiten Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung der GAST-Inhibitoren, die in den Ansprüchen definiert sind, zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung eines Diabetes-assoziierten Phänomens.
  • Der Ausdruck „Diabetes-assoziiertes Phänomen" bezieht sich auf Diabetes selbst, insbesondere Diabetes Typ II, wie auch die direkten unerwünschten Manifestationen, die durch Diabetes verursacht werden, welche gemessen werden durch die Bestimmung von: Glucoseblutspiegeln, Diabesity (Diabetes-assoziierte Obesitas), Diabetes-bedingter Hypertonie und Diabetes-assoziierter Dyslipidämie.
  • Unter den GAST-Inhibitoren, die verwendet werden können, sind Verbindungen, die in den Ansprüchen definiert sind und umfassen: Sequenzen, die von GRK-Regionen abgeleitet sind, welche für die Wechselwirkung mit cellulären Komponenten verantwortlich sind, oder Varianten solcher Sequenzen, wie sie oben beschrieben wurden; Antikörper, die mit GRK immunreaktiv sind; Antisense-Nucleinsäuren, die die Expression von GRK blockieren; negativ-dominante GRK-Gene, die GRK-Proteine mit reduzierter oder nicht-existenter biologischer Aktivität exprimieren; Ribozyme, die fähig sind, spezifisch GRK-RNA zu spalten, und kleine organische Moleküle. Jeder dieser Inhibitoren von GAST wird fähig sein, das Diabetes-assoziierte Phänomen zu verbessern, und wird somit für die Behandlung einer Krankheit, wie sie oben beschrieben wurde, geeignet sein.
  • Vorzugsweise sind die GAST-Inhibitoren, die in den Ansprüchen definiert sind, Verbindungen, die Sequenzen umfassen, die von Regionen der GRK abgeleitet sind, welche für die Wechselwirkung mit anderen cellulären Komponenten, speziell mit dem GPCR-Substrat, verantwortlich sind. Wie oben angegeben wurde, wird angenommen, dass Peptide, die die genannten Regionen nachahmen, an die cellulären Komponenten (z.B. das GPCR-Substrat des GRK) binden und dadurch die Wechselwirkung der GRK-Kinase und dem Substrat unterbrechen, was zu einer Modulierung von GAST führt.
  • Spezifischer ausgedrückt, der GAST-Modulator ist ausgewählt aus:
    • (i) einer Verbindung, die eine Sequenz umfasst, die ausgewählt ist aus SEQ ID NO.: 2-38.
  • Spezifische Beispiele für die Verbindungen von (i) sind Verbindungen, die eine beliebige der Sequenzen, wie spezifiziert in: K024H003 (SEQ ID NO.: 2), K024H007 (SEQ ID NO.: 3), K024H101 (SEQ ID NO.: 4), K024H102 (SEQ ID NO.: 5), K024H103 (SEQ ID NO.: 6), K024H104 (SEQ ID NO.: 7), K024H105 (SEQ ID NO.: 8), K024H106 (SEQ ID NO.: 9), K024H107 (SEQ ID NO.: 10), K024H108 (SEQ ID NO.: 11), K024H109 (SEQ ID NO.: 12), K024H110 (SEQ ID NO.: 13), K024H111 (SEQ ID NO.: 14), K024H112 (SEQ ID NO.: 15), K024H113 (SEQ ID NO.: 16), K024H114 (SEQ ID NO.: 17), K024H901 (SEQ ID NO.: 18), K024H903 (SEQ ID NO.: 19), oder eine von SEQ ID NO.: 20 bis 38 umfassen.
  • Der Ausdruck „GRK-assoziierte Signaltransduktion (GAST)" bezieht sich auf den Grad der Signalgebung, die durch den GPCR vermittelt wird, der GRK2 oder GRK3 phosphoryliert. Typischerweise kann der Grad bestimmt werden, indem der Grad der Phosporylierung von wenigstens einem Substrat im GRK-Signalgebungsweg bestimmt wird, das ein direktes Substrat von GRK (GPCR-Rezeptoren, z.B. β2/1-adrenerger Rezeptor, α2-adrenerger Rezeptor, Acetylcholinrezeptor, Opioidrezeptoren, Rhodopsin, A(1,2,3)-purinerger Rezeptor, Synuclein, Angiotensin II 1a, DiA-Dopamin, N-Formylpeptid, Muscarinrezeptor, Thrombozytenaktivierungsfaktor, Thrombin usw. (Bunemann et al., J. of Physiology (1999) 517.1, 5-23) oder ein Substrat einer anderen Kinase weiter stromabwärts im GRK-Kinase-Signalgebungsweg sein kann.
  • Die Sequenzen, die in den Ansprüchen definiert sind, die Regionen von GRK entsprechen, sind zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, einen metabolischen Parameter zu modulieren, auch zur Erzeugung von Antikörpern, die eine GRK-assoziierte Signaltransduktion modulieren können, einsetzbar, wodurch sie den Metabolismus modulieren. Die Sequenzen wirken als antigene Agentien zur Erzeugung solcher Antikörper. Diese Antikörper wirken wiederum als Inhibitoren von GAST, wodurch der Metabolismus moduliert wird.
  • Um die Erfindung zu verstehen und zu sehen, wie sie in der Praxis durchgeführt werden kann, wird nun eine bevorzugte Ausführungsform lediglich durch ein nicht-limitierendes Beispiel anhand der beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
  • 1 eine Tabelle ist, die die Aminosäuresequenzen der HJ-Schleife von GRK2 und GRK3, hierin auch als βARK1 (oder βARK1) und βARK2 (oder βARK2) bezeichnet, zeigt.
  • 2 eine Tabelle ist, die die Peptidsequenzen, K024H001 (SEQ ID NO.: 1), K024H003 (SEQ ID NO.: 2), K024H007 (SEQ ID NO.: 3), K024H101 (SEQ ID NO.: 4), K024H102 (SEQ ID NO.: 5), K024H103 (SEQ ID NO.: 6), K024H104 (SEQ ID NO.: 7), K024H105 (SEQ ID NO.: 8), K024H106 (SEQ ID NO.: 9), K024H107 (SEQ ID NO.: 10), K024H108 (SEQ ID NO.: 11), K024H109 (SEQ ID NO.: 12), K024H110 (SEQ ID NO.: 13), K024H111 (SEQ ID NO.: 14), K024H112 (SEQ ID NO.: 15), K024H113 (SEQ ID NO.: 16), K024H114 (SEQ ID NO.: 17), K024H901 (SEQ ID NO.: 18) und K024H903 (SEQ ID NO.: 19) darstellt.
  • 3 ein Graph ist, der die Wirkungen einer einzelnen Injektion der Verbindung der Erfindung, die ein von GRK abgeleitetes Peptid umfasst, auf Blutglucose von Sandratten (psammomys obesus) zeigt.
  • 4 ein Graph ist, der die Blutglucose von unbehandelten Kontroll-Sandratten (psammomys obesus) zeigt.
  • 5A-5G Graphen sind, die die Wirkungen von Peptiden der Erfindung auf die Melanogenese durch murine B16-Melanomzellen darstellen.
  • 6 die Wirkung der Verbindung der Erfindung K024H107 auf die Produktion von cAMP, verabreicht vor oder nach Aktivierung durch Isoproteranol, zeigt.
  • 7A die Wirkung der Verbindung K024H107 der Erfindung, verabreicht an normale Mäuse, auf Gewichtsänderungen zeigt und 7B die Wirkung der Nahrungsaufnahme zeigt.
  • 8A die Wirkung der Verbindung K024H112, verabreicht an normale Mäuse n, auf das Gewicht zeigt und 8B die Wirkung auf die Nahrungsaufnahme von normalen Mäusen zeigt.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass eine Modulierung der Aktivität von GAST eine Vielzahl von Signaltransduktionswegen beeinflusst. Beispielsweise kann eine Inhibierung einer GAST, d.h. Eliminierung einer Agonist-abhängigen Desensibilisierungsaktivität, verursacht durch Phosphorylierung des GPCR durch GRK, in einem stärkeren oder längeren Signal durch den relevanten GPCR-Rezeptor resultieren, z.B. Verlängerung der Dauer hormonaler Wirkungen von z.B. Adrenalin oder einem beliebigen Liganden, der den Rezeptor aktiviert. Somit können Agentien, die die Aktivität von GAST modulieren, in der Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die aus einer geringeren Bioverfügbarkeit des entsprechenden GPCR-Liganden resultieren, z.B. geringe Verfügbarkeit von Epinephrin, Dopamin, Angiotensin oder einem anderen GPCR-Liganden.
  • Eine besonders interessante Situation bei dieser Erfindung ist die systemische Verabreichung eines GAST-Modulators. Unter solchen Umständen können viele Systeme gleichzeitig beeinträchtigt werden. Ohne eine Bindung an einem bestimmten Mechanismus zu wünschen, wird angenommen, dass, wenn alle Systeme, die die metabolische Aktivität des Körpers kontrollieren, durch denselben molekularen Mechanismus, nämlich GRK-Aktivität, eingestellt werden, dann eine systemische Inhibierung von GRK2, GRK3 oder seines assoziierten Signaltransduktionswegs ein einfaches phänotypisches Resultat haben wird: Erhöhung der gesamten Grundmetabolismusrate des Körpers infolge einer Eliminierung der GPCR-Desensibilisierung und Verlängerung seiner Aktivität. Ein solches Resultat ist bei dem Krankheitsbild, das derzeit als „Syndrom" bekannt ist, das durch Einsetzen von Diabetes mellitus-Typ II, Obesitas und anderen Zuständen, speziell Diabetes-assoziierten Phänomenen, typisiert ist, vorteilhaft. Eine Übersicht über Syndrom X siehe O. Timar et al., „Metabolic Syndrome X: A Review," Can. J. Cardiol., 16(6):779-789 (2000).
  • Im Rahmen dieser Erfindung ist die Inhibierung der Wirkungen von GRK-2, GRK-3, die als ein metabolischer Regulator angesehen werden, ein Verfahren zur Behandlung von Diabetes mellitus-Typ II (DM). Es hat den Anschein, dass Organismen, einschließlich Menschen, in spezifischen Umgebungen mit geringem Kaloriengehalt einen Mechanismus entwickelt haben, durch den ein maximaler Energiemetabolismus durch Herabregulierung metabolischer Prozesse erreicht wird. In dieser Erfindung wird postuliert, dass der Mechanismus für diese Herabregulierung die Phosphorylierung von β-adrenergen Rezeptoren (βAR) durch GRK-2 (β-adrenerge Rezeptorkinase) ist. Der abgeschwächte βAR führt zu einer verringerten Signalgebung für signifikante metabolische Prozesse, z.B. Glucoseaufnahme (über Insulinresistenz), Lipidabbau, Diabetes-assoziierte Obesitas, Diabetes-assoziierte Hypertonie usw. Dies ermöglicht dem Organismus, trotz niedriger exogener Kalorienaufnahme die Energiehomöostase aufrechtzuerhalten.
  • Ernährungsdiabetes kann durch eine pathologische Funktion der Wechselwirkung zwischen βAR und GRK-2 verursacht werden. Wenn Organismen, die an eine Niedrigenergieumgebung maximal angepasst sind, in eine Hochenergieumgebung transferiert werden, entwickeln sie ein metabolisches Syndrom, das durch Diabetes mellitus (DM)-Typ II, Hypertonie, Obesitas, Insulinresistenz und andere Diabetes-assoziierte Phänomene, wie sie oben beschrieben sind, charakterisiert ist. Dieses ist durch den Überschuss an Energie bedingt, der wegen der niedrigen metabolischen Rate ineffizient genutzt wird. Die überflüssige Energie wird in Fett umgewandelt und infolge der Insulinresistenz in Anbetracht der hohen Glucoselevel gibt es Hyperglykämie. Durch Senkung der Aktivität von GRK-2 wird die Aktivität von βAR erhöht und die metabolische Rate wird erhöht.
  • Das Konzept eines metabolischen Regulators stammt von einem Tiermodell für Ernährungs-DM. psammomys obesus, ein Wüsten-Gerbil, der bei einer Niedrigenergieernährung überlebt, entwickelt Insulinresistenz und DM Typ 2, wenn er auf Hochenergieernährung gebracht wird. Wie hierin gezeigt wird, wird Diabetes korrigiert, wenn die GRK-2-Aktivität inhibiert wird; dadurch wird das Konzept gestützt, dass eine Manipulation eines metabolischen Rheostats eine Behandlung für DM ist.
  • Die folgenden Informationen stützen das Konzept eines solchen metabolischen Rheostats: eine Hochregulierung von GRK verursacht verringerten βAR im Herzen, was Herzversagen verschlimmert. Eine Inhibierung von GAST durch einen Inhibitor, der lokal an das Herz abgegeben wird, kann seine Funktion verbessern. Hohe GRK-2-Spiegel sind mit Hypertonie assoziiert. GRK-2 spielt eine Rolle bei der Insulinsekretion. GRK spielt eine Rolle bei der ZNS-Signaltransduktion. GRK spielt eine Rolle bei der Hormonsekretion. GRK spielt eine Rolle bei der Olfaktion.
  • Somit wird jeder Modulator von GAST dazu dienen, die Level einer GRK-assoziierten Signaltransduktion zu verändern und wird somit unter Modulierung eines metabolischen Parameters wirken.
  • Kleine Moleküle als Inhibitoren
  • Organische Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht können direkt als Inhibitoren von GRK auf die Kinase wirken (durch Bindung) und dadurch GAST inhibieren. Solche organischen Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht sind auf dem Fachgebiet bekannt. Bevorzugte organische Moleküle mit niedrigem Molekulargewicht sind GRK2-Inhibitor H8, Tri-Fuorperazin, Polyanionen, z.B. Heparin und Dextransulfate.
  • Ribozyme, die spezifisch GRK-RNA spalten
  • Ein spezifischer Modulator von GAST ist ein Ribozym, das ein katalytisches Oligonucleotid ist (typischerweise RNA). Das katalytische Nucleotid kann maßgeschneidert sein, so dass es spezifisch über Hybridisierung eine spezifische mRNA-Region erkennt und diese spaltet und ihre Expression eliminiert. Die Ribozyme können als katalytische RNA-Moleküle oder als Ex pressionskonstrukte für die Expression der katalytischen RNA-Moleküle in die Zelle eingeführt werden.
  • Antisense-GAST-Inhibitoren
  • Ein anderer Inhibitor-Typ für GAST sind Antisense-Nucleinsäuren. Die Nucleinsäuren sind einzelsträngige Ribonucleinsäure- oder Desoxyribonucleinsäurestränge, die Nucleotide enthalten, die durch normale Zucker-Phosphat-Bindungen miteinander verknüpft sind. Antisense-Sequenzen können die Produktion von GRK-Protein durch einen von drei Mechanismen inhibieren. Durch einen ersten Mechanismus wechselwirken diese Antisense-Sequenzen mit der Transkription, da diese Antisense-Sequenzen innerhalb des Strukturgens oder in der regulatorischen Region des Gens, das für GRK codiert, hybridisieren. Diese Hybridisierung unterbricht die Transkription des GRK-Gens in mRNA. Da eine geeignete Transkription oder Expression durch die Hybridisierung der Antisense-Nucleinsäuren an DNA wirksam blockiert wird, wird die Kinaseproduktion verringert und als Resultat der Verarmung an Kinase wird die GAST inhibiert.
  • Ein zweiter Mechanismus ist die Bindung der Antisense-Sequenzen im Ctyoplasma an die mRNA, wodurch die Bildung eines geeigneten Translationskonstrukts gestört wird, was zu einer Inhibierung der Translation des mRNA zum Protein führt. Dies führt zu einer Abnahme bei der Menge an GRK-Protein, das produziert wird, und somit zu einer Inhibierung von GAST.
  • Ein dritter Mechanismus ist die Bildung eines mRNA-Antisense-Doppelstrangs, was schnell zu einem Abbau von mRNA-Doppelstrang durch RNasen führt (z.B. Rnase.H). Alle diese Mechanismen führen zur Produktion geringerer Mengen an GRK – produziert durch die Zellen – als ohne das Vorliegen dieser Antisense-Nucleinsäuren, was zu einer GAST-Inhibierung führt.
  • Die bestimmten Nucleotide, die unter Bildung der Antisense-Sequenz verknüpft sind, sind solche, die zu einer Region des GRK-Strukturgens komplementär sind oder komplementär zur regulatorischen Region des Gens sind, was ausreicht, um die Produktion von funktioneller GRK zu inhibieren. Diese Nucleotide der Antisense-Nucleinsäuren werden spezifisch durch die Nucleotide der Targetstelle bestimmt und können leicht vom Fachmann identifiziert werden, sobald die Sequenz der Targetstelle entwickelt wurde. Die Targetstelle ist zu einem gewissen Grad Material der Wahl. Sie liegt innerhalb der Region des Strukturgens, das für GRK codiert, oder in der regulatorischen codierenden Region der Struktur. Die Targetstellen-Nucleotidsequenz kann in einfacher Weise von einem Fachmann aus allgemein zugänglichen Informationen betreffend das GRK-Gen entwickelt werden oder kann durch Routineuntersuchungen der homologen Gene, verbunden mit molekularbiologischen Standardtechniken, erhalten werden.
  • Nach einer Option ist die Antisense-Sequenz ein Oligonucleotid aus mehreren bis mehreren zehn Nucleotiden, die in die Zellen insertiert werden. Dies ist das bevorzugte Oligonucleotid gemäß der Erfindung. Typischerweise besteht die Sequenz aus den ersten 20-25 Nucleotiden am 5'-Ende der GRK-cDNA (die zu der mRNA komplementär sind). Ein Beispiel für eine derartige Sequenz ist:
    für GRK2: ctcggcctcg ggcgcggccg agcgccgcgc
    und für GRK3: caagcttcat ctgtatttac agctgctcgc
    oder die RNA-Version der Obigen, worin T durch U ersetzt wurde.
  • Eine weitere Option ist die Verwendung von längeren Antisense-Sequenzen (bis zu mehreren hundert Nucleotiden) durch Insertion in einen Expressionsvektor, welcher dann durch verschiedene Gentransfertechniken in die Zelle transfiziert werden kann. In diesem Fall kann die volle Sequenz der GRK verwendet werden, um eine Sequenz zu konstruieren, die dazu komplementär ist, um eine lange Antisense-mRNA komplementär zu der nativen RNA zu produzieren. Ein Auffinden des Targets der Kinasesequenz, das für Antisense-Zwecke zu verwenden ist, kann durch Screening verschiedener überlappender Sequenzen oder durch Verwendung verschiedener bioinformativer Software, die Targets in einem gegebenen Gen wahrscheinlich lokalisieren kann und verschiedene alternative Sequenzen zur Herstellung von Antisense-Sequenzen geben kann, welche die Produktion eliminieren, können durchgeführt werden.
  • Negative dominante Kinasegene
  • Noch ein anderer Inhibitor-Typ für GAST sind negative dominante GRK-Gene. Das Vorliegen dieser Gene in Zellen erlaubt es, dass nicht-funktionelle GRK unter Ausschluss von funktioneller GRK exprimiert wird. Die negative Dominante in den Zellen ist für die GAST-Aktivität inhibitorisch, da diese Kinase nicht-funktionell ist. Nicht-funktionelle Kinasen haben per Definition keine Kinaseaktivität. Negative dominante GRK-Gene werden durch Gentransfertechniken in die Zellen eingeführt, die immer mehr Standard auf dem Fachgebiet werden (Calciumpräzipitation, elektrische Entladung, physikalische Injektion, Verwendung von Trägern, z.B. rekombinante Vektoren usw.). Das eingeführte negative dominante GRK-Gen wird in das Zellgenom eingebaut. Kopien davon werden an Nachkommenzellen weitergegeben. Da dieses GRK-Gen negativ dominant ist, wird es als Reaktion auf Signale, welche eine GRK-Expression induzieren, eher als die aktive Form von GRK exprimiert. Zellen, die das negative dominante GRK-Gen eingebaut haben, werden nicht fähig sein, GPCR mit denselben Leveln zu desensibilisieren wie eine Kontrolle, da das exprimierte GRK inaktiv ist. Die negativen dominanten GRK-Gene können auf dem Fachgebiet gefunden werden oder können durch Standard-Genmutationstechniken produziert werden, die dem Fachmann auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Diese Gene können geeigneterweise für transgene Vorgänge durch geeignete Methoden und Materialien, die dem Fachmann bekannt sind, verpackt werden.
  • Ein Beispiel eines Konstrukts für dominant-negative GRK2 ist der Expressionsvektor pEF-GRK2-K220W (www.pharmci.org/scientificjournals/pharmaci/journal/2.html).
  • Ein weiters Beispiel für dominant-negative GRK sind Sequenzen, die für GRK codieren, worin das Codon für Lyn pr Lys, das ATP in der katalytischen Einheit bindet, durch Codons ersetzt ist, die für Ala oder Met codieren.
  • Antikörper gegen GRK für GAST-Inhibitor
  • Ein weiterer Typ von Inhibitoren für GAST sind Antikörper, die mit GRK immunreaktiv sind. Diese Antikörper binden an die Kinase und beschränkten oder unterbinden ihre Kinaseaktivität oder unterbrechen ihre Wechselwirkung mit anderen cellulären Komponenten, was alles zu einer GAST-Inhibierung führt. Die Antikörper können zu einer beliebigen Klasse oder einem beliebigen Typ gehören. Die Bindungsstelle der Antikörper kann irgendwo an dem GRK-Molekül sein, vorausgesetzt die immunreaktive Bindung zwischen dem Antikörper und dem Kinasemolekül resultiert in einer starken Inhibierung von GAST. Die Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein und werden durch Techniken produziert, die dem Fachmann gut bekannt sind, indem die GRK oder immunogene Fragmente davon als antigener Stimulus verwendet wird/werden. Die Antikörper können an das Individuum abgegeben werden, indem geeignete klonale Zellen, welche die Antikörper produzieren, in dem Individuum abgelagert werden, dessen Metabolismus moduliert werden soll. Diese klonalen Zellen sekretieren die Antikörper in den Blutstrom, wo sie zu den Target-Krebszellen zur Immunreaktion mit den GRK-Proteinen getragen werden. Bindungsfragmente von Antikörpern sind ebenfalls geeignet, vorausgesetzt sie binden GRK mit ausreichender Affinität, so dass die Aktivität der Kinase wenigstens stark limitiert ist. Alternativ können die Antikörper oder geeignete Bindungsfragmente durch eine beliebige einer Vielzahl von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind (physikalische Injektion, Anheftung an Träger, die die Zellmembranen durchqueren, transgene Einführung in die Prostatakrebszellen für eine anschließende Induktion der Expression usw.) eingeführt werden. Die sezernierten, eingeführten oder exprimierten Antikörper oder geeignete Antikörperfragmente davon binden immunreaktiv an GRK, wodurch deren Aktivität und somit die GAST-Aktivität inhibiert wird. Im Handel sind Anti-GRK-Antikörper verfügbar.
  • Verbindungen, die von GRK-abgeleitete Peptide umfassen:
  • Ein weiterer Typ eines Inhibitors für GAST sind Verbindungen, die Peptide umfassen, welche hier als „von GRK-abgeleitete Peptide" bezeichnet werden. Diese Verbindungen, die die von GRK-abgeleiteten Peptide umfassen oder aus diesen bestehen, sind gemäß der Erfindung die bevorzugten Inhibitoren von GAST und sind somit die bevorzugten Agentien für die Modulierung eines metabolischen Parameters und für die Behandlung von metabolischen assoziierten Zuständen. Die Peptide ahmen anscheinend eine Region in der Kinase nach und binden so an andere celluläre Komponenten, mit denen die GRK wechselwirkt (z.B. die Kinasesubstrate GPCRs). Diese Bindung unterbricht die Kinasekomponenten-Wechselwirkung (speziell die Kinase-Substrat-Wechselwirkung) und inhibiert somit GAST.
  • Diese GAST-Modulierung führt zu einer Änderung bei der Desensibilisierungsaktivität von GPCR durch GRK, was zu einer Modulierung des Metabolismus führt.
  • Die Peptide gemäß der obigen nicht-limitierenden Theorie ahmen eine Region nach, in der die GRK-Kinase bei der Wechselwirkung der GRK mit anderen cellulären Komponenten involviert ist, die Teil der GRK-assoziierten Signaltransduktion sind. Vorzugsweise werden die se cellulären Komponenten ausgewählt aus: den Substraten von GRK, anderen Kinasen, Phosphatasen sowie Co-Faktoren und ATP. Demnach kann ein beliebiges Peptid, das einen Teil der GRK, die für die Wechselwirkung verantwortlich ist, nachahmt, an die celluläre Komponente binden und somit die GAST inhibieren.
  • Spezifische bevorzugte Regionen der GRK, die die von GRK-abgeleiteten Peptide nachahmen, sind die HJ-Schleife (HJ-Loop), die αD-Schleife, die A-Region und die B4-B5-Region, wie sie oben definiert sind, am bevorzugtesten die Region, die die HJ-Schleife nachahmt.
  • Es ist klar, dass es für eine Unterbrechung der Kinase-celluläre Komponente-Wechselwirkung keine Notwendigkeit gibt, eine Nachahmung der vollständigen spezifischen Region der Kinase zu erhalten, und eine Nachahmung einer Sequenz, die an das Substrat bindet, in einem Kompetitor kann ausreichend sein, um die genannte Wechselwirkung zu unterbrechen, z.B. durch sterische Hinderung. Es ist außerdem klar, dass die Unterbrechung verursacht werden kann, indem eine beliebige von mehreren kleineren Untersequenzen, die in der Region vorliegen, nachgeahmt wird, so dass es verschiedene alternative Untersequenzen geben kann. Es ist ferner klar, dass es zu Nachahmungszwecken nicht notwendig ist, eine Substanz zu erhalten, die identisch zu der einen ist, die in der nativen Kinase vorliegt, und es können Varianten jener Sequenz, die die genannte dreidimensionale Struktur der Region genau kopieren können (wenn in der vollständigen Kinase vorhanden) sowie die chemischen Merkmale solcher Seitenketten, die mit der Wechselwirkung zu dem Substrat involviert sind, vollständig kopieren, können ebenfalls als Mimetika zur Unterbrechung der Wechselwirkung eingesetzt werden. Manchmal haben solche Varianten bessere Nachahmungseigenschaften als die native Sequenz, da die Variation helfen kann, die Mimetikum-Aminosäuresequenz in einer günstigeren Konformation zu stabilisieren oder stärkere Bindungseigenschaften an das Substrat haben kann.
  • Die Peptidderivate sind kurze Untersequenzen von wenigstens fünf fortlaufenden Aminosäuren, die aus den obigen Sequenzen erhalten werden, wie auch Varianten der obigen Sequenzen, die durch Substitution von bis zu 40% der Aminosäuren durch natürliche und nicht-natürliche Aminosäuren oder durch peptidomimetische Gruppierungen erhalten werden, und/oder Varianten, die durch chemische Modifizierung von bis zu 40% der Aminosäuren erhalten werden, und/oder Deletionen von bis zu 20% der Aminosäuren erhalten werden, vorausgesetzt, dass wenigstens 50% der Aminosäuren mit der Sequenz des Elternproteins identisch sind, und vorausgesetzt, dass die Variante die biologischen Eigenschaften der Elternsequenz beibehält.
  • Am vorteilhaftesten ist die Sequenz wenigstens fünf fortlaufende Aminosäuren, erhalten aus der Region von Position 382 bis 414 der HJ-Schleife, bevorzugter von den Positionen 383 bis 396 in der HJ-Schleife. Die Aminosäuresequenz kann 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 und 20 Aminosäuren sein. Die Sequenz kann die Sequenz einer natürlich in der HJ-Schleife vorkommenden sein. Allerdings zeigen tatsächliche empirische Experimente, dass Sequenzen mit Substitutionen manchmal bessere GAST-inhibierende Eigenschaften als native Se quenzen haben. Daher sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Varianten der nativen Sequenz der wenigstens fünf fortlaufenden Aminosäuren aus der HJ-Schleife enthalten, in der bis zu 40% der Aminosäuren ersetzt wurden, bis zu 40% der Aminosäuren chemisch modifiziert wurden, und/oder bis zu 20% deletiert wurden, vorausgesetzt, dass die Variante wenigstens 50% ihrer Aminosäuren mit der nativen Sequenz zeigt. Im Allgemeinen sollten Aminosäuren in den Regionen, und insbesondere in der HJ-Schleifenregion, die für GAST essentiell ist, entweder identisch mit denen sein, die in der nativen Sequenz auftreten, sollten chemisch modifiziert sein oder sollten alternativ konservative Substitutionen enthalten (im Kontext der vorliegenden Erfindung beziehen sich konservative Substitutionen auch auf Substitutionen durch Aminosäuren, die dieselben sterischen Eigenschaften haben, aber wenn die ersetzte Aminosäure geladen ist, kann die eingesetzte Aminosäure auch polar oder hydrophob sein). Die anderen Positionen in der Sequenz können durch konservative, nicht-konservative Substitutionen sowohl durch natürlich als auch nicht-natürlich vorkommende Aminosäuren wie auch durch organische Peptidomimetika ersetzt sein; diese Positionen können deletiert oder chemisch modifiziert sein.
  • In dieser Erfindung sind die Peptide zur Inhibierung von GAST K024H001 (SEQ ID NO.: 1), K024H003 (SEQ ID NO.: 2), K024H007 (SEQ ID NO.: 3), K024H101 (SEQ ID NO.: 4), K024H102 (SEQ ID NO.: 5), K024H103 (SEQ ID NO.: 6), K024H104 (SEQ ID NO.: 7), K024H105 (SEQ ID NO.: 8), K024H106 (SEQ ID NO.: 9), K024H107 (SEQ ID NO.: 10), K024H108 (SEQ ID NO.: 11), K024H109 (SEQ ID NO.: 12), K024H110 (SEQ ID NO.: 13), K024H111 (SEQ ID NO.: 14), K024H112 (SEQ ID NO.: 15), K024H113 (SEQ ID NO.: 16), K024H114 (SEQ ID NO.: 17), K024H901 (SEQ ID NO.: 18) und K024H903 (SEQ ID NO.: 19), wie auch Verbindungen, die eine von SEQ ID NO.: 20 bis SEQ ID NO.: 38 umfassen.
  • 1. Addition von nicht-peptidischen Gruppen an ein oder beide Enden der von GRK-abgeleiteten Peptide
  • Wenn die Verbindung der Erfindung ein lineares Molekül ist, ist es möglich, verschiedene funktionelle Gruppen an einem ihrer Enden anzuordnen. Der Zweck einer solchen funktionellen Gruppe kann die Verbesserung der GAST-Inhibierung sein. Die funktionellen Gruppen können auch den Zweck einer Verbesserung der physiologischen Eigenschaften der Verbindung, die nicht direkt mit einer GAST-Inhibierung in Beziehung stehen, erfüllen, z.B.: Verbesserung der Stabilität, Penetration (durch celluläre Membranen oder Barrieren), Gewebelokalisierung, Wirksamkeit, verringerte Clearance, verringerte Toxizität, verbesserte Selektivität, verbesserte Resistenz gegenüber einer Überfüllung durch celluläre Pumpen und dergleichen. Die funktionellen Gruppen können auch detektierbare Markierungen sein, die für diagnostische Zwecke oder Forschungszwecke angefügt sind. Aus Gründen der Zweckdienlichkeit wird das freie N-Ende einer der Sequenzen, die in den Verbindungen der Erfindung enthalten sind, als das N-Ende der Verbindung bezeichnet und wird das freie C-Ende der Sequenz als das C-Ende der Verbindung bezeichnet (diese Ausdrücke werden aus Gründen der Zweckdienlichkeit eingesetzt). Eines, das C- Ende oder das N-Ende der Sequenzen, oder beide können an eine funktionelle Carbonsäuregruppe oder eine funktionelle Amingruppe gebunden sein.
  • Geeignete funktionelle Gruppen werden in Green and Wuts, „Protecting Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Kapitel 5 und 7, 1991, beschrieben, deren Lehren hier durch Referenz aufgenommen werden. Bevorzugte Schutzgruppen sind solche, die einen Transport der daran gebundenen Verbindung in eine Zelle erleichtern, z.B. durch Reduzieren der Hydrophilie und Erhöhen der Lipophilie der Verbindungen; diese sind ein spezifisches bevorzugtes Beispiel für „eine Gruppierung für einen Transport durch celluläre Membranen".
  • Diese Gruppierungen können in vivo entweder durch Hydrolyse oder enzymatisch in der Zelle abgespalten werden. (Ditter et al., J. Pharm. Sci. 57:783 (1968); Ditter et al., J. Pharm. Sci. 57:828 (1968); Ditter et al., J. Pharm. Sci. 58:557 (1969); King et al., Biochemistry 26:2294 (1987); Lindberg et al., Drug Metabolism and Disposition 17:311 (1989) und Tunek et al., Biochem. Pharm. 37:3867 (1988), Anderson et al., Arch. Biochem. Biophys. 239:538 (1985) und Singhal et al., FASEB J. 1:220 (1987)). Hydroxyl-Schutzgruppen umfassen Ester, Carbonate und Carbamat. Amin-Schutzgruppen umfassen Alkoxy- und Aryloxycarbonylgruppen, wie sie oben für das N-Ende schützende Gruppen beschrieben sind. Carbonsäure-Schutzgruppen umfassen aliphatische, benzylische und Arylester, wie sie oben für das C-Ende schützende Gruppen beschrieben wurden. In einer Ausführungsform ist die Carbonsäuregruppe in der Seitenkette einer oder mehrerer Glutaminsäure- oder Asparaginsäurereste in einer Verbindung der vorliegenden Erfindung geschützt, vorzugsweise mit einem Methyl-, Ethyl-, Benzyl- oder substituierten Benzylester, bevorzugter als ein Benzylester.
  • Zusätzlich kann ein modifizierter Lysinrest an das C-Ende der Verbindung angefügt werden, um die biologische Aktivität zu verstärken. Beispiele einer Lysinmodifikation umfassen die Addition eines aromatischen Ersatzstoffes, z.B. Benzoylbenzoesäure, Dansyllysin, verschiedene Derivate von Benzoesäuren (Difluor-, Trifluormethyl-, Acetamido-, Dimethyl-, Dimethylamino-, Methoxy-) oder verschiedene Carbonsäurederivate (Pyrazin-, Thiophen-, Pyridin-, Indol-, Naphthalin-, Biphenyl-) oder eine aliphatische Gruppe, z.B. Acyl-, oder eine Myristin- oder Stearinsäure, an der ε-Aminogruppe des Lysinrests.
  • Beispiele für das N-Ende schützende Gruppen bzw. N-terminale Schutzgruppen umfassen Acylgruppen (-CO-R1) und Alkoxycarbonyl- oder Aryloxycarbonylgruppen (-CO-O-R1), worin R1 eine aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, aromatische oder substituierte aromatische Gruppe ist. Spezifische Beispiele für Acylgruppen umfassen Acetyl, (Ethyl)-CO-, n-Propyl-CO-, Isopropyl-CO-, n-Butyl-CO-, sek.-Butyl-CO-, t-Butyl-Co-, Hexyl, Lauroyl, Palmitoyl, Myristoyl, Stearyl, Oleoyl-Phenyl-CO-, substituiertes Phenyl-CO-, Benzyl-CO- und (substituiertes Benzyl)-CO-. Beispiele für Alkoxycarbonyl- und Aryloxycarbonylgruppen umfassen CH3-O-CO-, (Ethyl)-O-CO-, n-Propyl-O-CO-, Isopropyl-O-CO-, n-Butyl-O-CO-, sek.-Butyl-O-CO-, t-Butyl-O-CO-, Phenyl-O-CO-, substituiertes Phenyl-O-CO- und Benzyl-O-CO-, (substituiertes Benzyl)-O-CO-, Adamantan, Naphthalin, Myristoleyl, Tuluen, Biphenyl, Cinnamoyl, Nitrobenzoyl, Toluoyl, Furoyl, Benzoyl, Cyclohexan, Norbornan, Z-Caproyl. Um eine N-Acylierung zu erleichtern, können ein bis vier Glycinreste am N-Ende des Moleküls vorliegen.
  • Die Carboxylgruppe am C-Ende der Verbindung kann, z.B. durch ein Amid (d.h. die Hydroxylgruppe am C-Ende wird durch -NH2, -NHR2 und -NR2R3 ersetzt) oder einen Ester (d.h. die Hydroxylgruppe am C-Ende wird durch -OR2 ersetzt) geschützt werden. R2 und R3 sind unabhängig eine aliphatische, substituierte aliphatische, Benzyl-, substituierte Benzyl-, Aryl- oder eine substituierte Arylgruppe. Außerdem können R2 und R3 zusammen mit dem Stickstoffatom einen heterocyclischen C4- bis C8-Ring mit etwa 0-2 zusätzlichen Heteroatomen, z.B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel, bilden. Beispiele für geeignete heterocyclische Ringe umfassen Piperidinyl, Pyrrolidinyl, Morpholino, Thiomorpholino oder Piperazinyl. Beispiele für C-terminale Schutzgruppen bzw. Schutzgruppen für das C-Ende umfassen -NH2, -NHCH3, -N(CH3)2, -NH(Ethyl), -N(Ethyl)2, -N(Methyl)(ethyl), -NH(Benzyl), -N(C1-C4-alkyl)(benzyl), -NH(Phenyl), -N(C1-C4-alkyl)(phenyl), -OCH3, -O-(Ethyl.), -O-(n-Propyl), -O-(n-Butyl), -O-(Isopropyl), -O-(sek.-Butyl), -O-(t-Butyl), -O-Benzyl und -O-Phenyl.
  • Vorzugsweise umfassen die Verbindungen am N-Ende einen Kohlenwasserstoff mit einer Länge von C4-C20, vorzugsweise C6-C18, am bevorzugtesten C8-C16. Beispiele für hydrophobe Gruppierungen sind: Aaystyl, Stearyl, Lauroyl, Palmitoyl und Acetyl etc.
  • 2. Auffindung kürzerer Untersequenzen von von GRK-abgeleiteten Peptiden
  • Wie angegeben wurde, werden von GRK-abgeleitete Peptide, die in den Verbindungen zur Inhibierung von GAST enthalten sind, erhalten, indem festgestellt wird, welche Sequenzen aus den obigen Regionen (HJ-Schleife, A-Region, αD-Region, B4-B5-Region) GAST inhibieren. Typischerweise ist es zur Einfachheit von Synthese und Verabreichung erwünscht, die kürzest mögliche Sequenz zu finden, die noch aktiv ist. Im Folgenden wird das Auffinden der kürzesten Sequenz in Verbindung mit der HJ-Schleife offenbart, allerdings ist diese Beschreibung auch auf die anderen Regionen anwendbar.
  • Eine kürzere Untersequenz der HJ-Schleife, die einen kontinuierlichen Abschnitt aus wenigstens fünf Aminosäuren umfasst, kann gefunden werden, indem eine Reihe von partiell überlappenden Peptiden, jedes mit 5-10 Aminosäuren und jedes durch Synthetisieren einer Sequenz, die eine Position von der vorherigen Sequenz entfernt ist, erhalten, hergestellt wird.
  • Beispielweise ist die HJ-Schleife in Position 382-414 und es wird gewünscht, 10 aa-Peptide herzustellen, dann werden die folgenden partiell überlappenden Peptide hergestellt, ein Peptid mit der Sequenz 382-391, 383-392, 384-393, ... ... 405-414. Die GAST-inhibierenden Aktivitäten der Untersequenzen werden dann in einem Testassay bestimmt. Das beste 10-aa-Peptid wird dann gewählt.
  • Um zu untersuchen, ob das 10 aa-Peptid in der Sequenz reduziert werden kann, ist es möglich, entweder das obige Verfahren (Herstellen einer Reihe partiell überlappender Peptide) unter Verwendung 5 aa-langer Peptide zu wiederholen, wobei die 5 aa langen Peptide die Länge des gewählten 10 aa-Peptids überspannen, oder das 10 aa-Peptid zu verkürzen, indem abwechselnd von jedem Ende eine Aminosäure deletiert wird und die GAST-inhibierende Aktivität der progressiv verkürzten Peptide getestet wird, bis die optimale Sequenz eines Peptids mit wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7, wenigstens 8, wenigstens 9 aa erhalten ist oder bis bestimmt ist, dass längere Sequenzen erforderlich sind. Da die HJ-Schleife (wie auch die anderen Regionen) relativ klein ist, ist typischerweise auch die Anzahl verschiedener Peptide, die zu testen sind, klein. Für eine HJ-Schleife, die eine Länge von etwa 20 aa hat, gibt es z.B. die Notwendigkeit, nur 12 Peptide herzustellen, um das optimale 8 aa-Peptid zu finden. Nachdem das beste 8 aa-Peptid erhalten ist, ist es möglich, sequentiell Aminosäuren von einem Ende oder von beiden Enden des 8 aa-Peptids zu deletieren, um die kürzeste Sequenz mit 5, 6 oder 7 aa zu erhalten, die noch aktiv ist. Für diese Schritte müssen nur 16 Sequenzen getestet werden, so dass es durch Testen von nur 24 Peptiden möglich ist, eine derartige kürzere Sequenz zu finden.
  • 3. Identifizierung essentieller und nicht-essentieller Aminosäuren in der gewählten Untersequenz
  • A. Ala-Scan
  • Sobald der kürzere fortlaufende Abschnitt aus wenigstens 5 (wenigstens 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 oder 13) Aminosäuren identifiziert ist, wie es oben erläutert wurde, ist es notwendig, zu realisieren, welche der Aminosäuren in dem Abschnitt essentiell sind (d.h. für die mit Kinase-assoziierte Signaltransduktionsmodulierung entscheidend) und welche nicht-essentiell sind. Ohne dass eine Bindung durch eine Theorie gewünscht wird, sind in fast jedem nativen Protein, das in der Wechselwirkung mit anderen cellulären Komponenten involviert ist, einige Aminosäuren in die Wechselwirkung involviert (essentielle Aminosäuren) und einige Aminosäuren sind nicht in die Wechselwirkung involviert (nicht-essentielle Aminosäuren), z.B. da sie kryptisch und unzugänglich sind. Ein kurzes Peptid, das eine Region des GRK-Proteins nachahmen soll, verhält sich ebenso wie die Region, wenn es in der vollständigen Kinase vorliegt: einige Aminosäuren wechselwirken tatsächlich mit dem Substrat (oder anderen wechselwirkenden Komponenten) und andere Aminosäuren dienen nur zur räumlichen Positionierung der wechselwirkenden Aminosäuren, sind aber nicht an der Wechselwirkung mit den anderen cellulären Komponenten beteiligt.
  • Essentielle Aminosäuren müssen aufrechterhalten werden (d.h. identisch zu solchen, die in der nativen Kinase auftreten, sein) oder durch konservative Substitutionen ersetzt sein (Definition siehe unten), um Varianten der Peptide zu erhalten, oder sie können chemisch modifiziert sein. Nicht-essentielle Aminosäuren können beibehalten werden, deletiert werden, chemisch modifiziert werden, durch einen Spacer ersetzt werden oder durch konservative oder nicht-konservative Substitutionen ersetzt sein.
  • Eine Identifizierung von essentiellen gegenüber nicht-essentiellen Aminosäuren im Peptid kann erreicht werden, indem mehrere Peptide hergestellt werden, die eine kürzere Sequenz als die volle Region haben (siehe 2 oben), wobei jede Aminosäure sequentiell durch die Amino säure Ala ersetzt wird („Ala-Scan") oder jede Aminosäure weggelassen wird („omission-scan"). Dies ermöglicht es, die Aminosäuren zu identifizieren, deren modulierende Aktivität durch den Ersatz/das Weglassen (omission) verringert wird („essentiell"), und die, deren Aktivität durch den Ersatz/das Weglassen (omission) nicht verringert wird („nicht-essentiell") (Morrison et al., Chemical Biology 5:302-307, 2001). Eine weitere Option zum Testen der Bedeutung verschiedener Peptide ist die durch Verwendung einer ortsspezifischen Mutagenese. Es können auch andere Struktur-Aktivität-Beziehungs(SAR)-Techniken verwendet werden.
  • B. 3-D-Analyse
  • Eine andere Strategie zur Auffindung essentieller vs. nicht-essentieller Aminosäuren ist die durch Bestimmung, welche aa der A-Region in der 3D-Analyse der vollständigen Kinase exponiert sind und welche kryptisch sind.
  • Typischerweise sind kryptische aa nicht-essentiell und bei exponierten oder partiell exponierten aa ist es wahrscheinlicher, dass sie essentiell sind. Wenn man jedoch theoretisch „abschätzen" möchte, welche „nicht-konservativen" Substitutionen in der kryptischen Region toleriert werden können, besteht eine gute Richtlinie darin, ein 3D-Computermodell der vollständigen Kinase dahingehend zu „untersuchen", ob diese Veränderungen die Gesamtgestalt der Regionen drastisch verändern, wenn das „veränderte" Peptid auf die vollständige Kinase gelegt wird.
  • 5. Die Verwendung der beanspruchten Verbindungen für die Herstellung von Medikamenten
  • Der Inhibitor von GAST der vorliegenden Erfindung oder die Verbindungen, die von GRK abgeleitete Peptide umfassen, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, können als aktive Ingredientien (zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger) verwendet werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu produzieren. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann einen GAST-Inhibitor der Erfindung oder ein Gemisch aus zwei oder mehreren der verschiedenen GAST-Inhibitoren der Erfindung in einem annehmbaren Träger umfassen.
  • Die pharmazeutische Zusammensetzung sollte für die Behandlung einer Erkrankung, einer Störung oder eines Zustandes verwendet werden, bei der/dem eine günstige therapeutische Wirkung durch die Modulierung wenigstens eines metabolischen Parameters deutlich werden kann, speziell für die Behandlung einer Krankheit, ausgewählt aus Diabetes, Obesitas, Dyslipidämie, Hypertonie, Syndrom X-assoziierten Phänomenen.
  • Die GAST-Modulatoren der vorliegenden Erfindung können parenteral verabreicht werden. Eine parenterale Verabreichung kann z.B. eine systemische Verabreichung, z.B. durch intramuskuläre, intravenöse, subkutane oder intraperitoneale Injektion, umfassen. Verbindungen, die eine Proteolyse aushalten, können oral, z.B. in Kapseln, Suspensionen oder Tabletten, verabreicht werden. Die Verbindung kann auch durch Inhalation oder Insufflationen oder über ein Nasenspray verabreicht werden.
  • Die GAST-Inhibitoren können in Verbindung mit einem annehmbaren pharmazeutischen Träger als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung der oben diskutierten Krankheiten an das Individuum verabreicht werden. Geeignete pharmazeutische Träger können inerte Ingredientien enthalten, die nicht mit den Verbindungen wechselwirken. Es können pharmazeutische Standardformulierungstechniken angewendet werden, z.B. die, die in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, beschrieben sind. Geeignete pharmazeutische Träger zur parenteralen Verabreichung umfassen z.B. steriles Wasser, physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatische Kochsalzlösung (Kochsalzlösung, die etwa 0,9% mg/ml Benzylalkohol enthält), Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Hanks-Lösung, Ringers-Lactat und dergleichen. Verfahren zur Einkapselung von Zusammensetzungen (z.B. in einem Überzug aus harter Gelatine oder Cyclodextran) sind auf dem Fachgebiet bekannt (Baker et al., Controlled Release of Biological Active Agents, John Wiley und Sons, 1986). Die Formulierung kann auch als Ressourcen zur Verabreichung an die Haut oder in Form einer Salbe, einer Lösung, einer Salbe usw. zur topischen Verabreichung sein.
  • Die Zusammensetzung kann lokal an die Aktivitätsstelle verabreicht werden, z.B. direkt in das Herz verabreicht werden.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in Verbindung mit anderen Modi einer metabolischen Therapie, z.B. mit anderen Verbindungen, die zur Behandlung metabolischer Krankheiten verwendet werden, z.B. Insulin, verabreicht werden, da sie synergistisch mit Insulin wirken können; dies verringert die erforderliche Insulinmenge oder verringert die Häufigkeit der Insulinverabreichung.
  • Eine „therapeutisch wirksame Menge" ist die Menge an Verbindung, die in einem verbesserten klinischen Ergebnis resultiert, und zwar als Resultat der Behandlung, verglichen mit einem typischen klinischen Ergebnis in Abwesenheit der Behandlung. Ein „verbessertes klinisches Ergebnis" resultiert in einem Individuum mit der Krankheit, das weniger Symptome oder Komplikationen der Krankheit erfährt, einschließlich einer längeren Lebenserwartung, als Resultat der Behandlung. Was Diabetes angeht, so bezieht sich ein „verbessertes klinisches Ergebnis" auf gesenkte Blutglucosespiegel, verbesserte Reaktionen auf Insulin, Fasten, Stress oder Glucosebeladung, in Gegenwart der Verbindung der Erfindung, eine längere Lebenserwartung, eine Verringerung bei den Komplikationen der Krankheit (z.B. Neuropathie, Retinopathie, Nephropathie und Degeneration von Blutgefäßen, assoziiert mit Diabetes) und eine verbesserte Lebensqualität, wie es oben beschrieben ist. Ein weiterer Aspekt eines verbesserten klinischen Ergebnisses ist die Verringerung bei der Medikationsdosierung (z.B. eine Verringerung bei Insulin oder anderem hypoglykämischem Agens, das benötigt wird, um adäquate Blutglucosespiegel aufrechtzuerhalten).
  • Was Obesitas angeht, so bezieht sich ein verbessertes klinisches Ergebnis auf eine erhöhte Gewichtsverringerung pro Kalorienaufnahme. Es bezieht sich auch auf eine Verringerung bei den Komplikationen, die eine Folge von Obesitas sind, z.B. Herzerkrankung, wie Arteriosklerose und hoher Blutdruck. Was Syndrom X angeht, so bezieht sich ein verbessertes klinisches Ergebnis auf eine längere Lebenserwartung, eine Verringerung beim Auftreten oder der Schwere der verschiedenen Mobilitäten, die in dem Syndrom enthalten sind (z.B. ischämische Herzerkrankung, Arteriosklerose, DM Typ-II und Obesitas) und eine verbesserte Lebensqualität. Was andere Manifestationen von Syndrom X angeht, so beinhaltet es (das Ergebnis) eine Senkung des Blutdrucks und eine Verbesserung beim Serumlipid- und Cholesterinprofil.
  • 6. Bestimmung der GAST-modulierenden Aktivität
  • Es sollte einzusehen sein, dass einige der Verbindungen, die die Sequenzen (a)-(i) oben umfassen, bessere GAST-Modulatoren sind als andere. Einige der konservativen Substitutionen in den essentiellen Positionen können die Modulierung vermindern, während eine andere derartige konservative Substitution in den essentiellen Positionen diese Modulierungsaktivitäten verbessern kann. Dasselbe gilt auch für Deletionen, Substitutionen (sowohl konservative als auch nicht-konservative) in nicht-essentiellen Positionen, wie auch für chemische Modifikationen (in einer beliebigen Position) oder Insertionen. Zusätzlich können der Typ und die Größe des nicht-Aminosäure-Teils der Verbindungen, z.B. eine hydrophobe Gruppierung an einem ihrer Enden, die GAST-modulierenden Aktivitäten verringern oder erhöhen. Die GAST-modulierenden Aktivitäten können z.B. unter Verwendung eines der unten festgesetzten Assays bestimmt werden.
  • 6.1 Celluläre Assays
  • Es kann in einfacher Weise bestimmt werden, ob eine Verbindung die Aktivität einer GAST moduliert, indem die Verbindung mit Zellen inkubiert wird, die eine oder mehrere celluläre Aktivitäten haben, die durch GAST kontrolliert werden. Beispiele für diese cellulären Aktivitäten umfassen Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Zellmorphologie, Zellüberleben oder Apoptose, Zellreaktion auf externe Stimuli, Genexpression, Lipidmetabolismus, Glycogen- oder Glucosemetabolismus und Mitose, Sekretion oder Produktion von Verbindungen durch die Zellen. Die Zellen werden mit der Kandidatenverbindung unter Herstellung eines Testgemisches unter Bedingungen, die zur Analyse des Grads der GAST geeignet sind, inkubiert. Die Aktivität der GAST wird analysiert und mit einer geeigneten Kontrolle verglichen, z.B. mit der Aktivität derselben Zellen, die unter denselben Bedingungen in Abwesenheit der Kandidatenverbindung (oder in Gegenwart einer Kontrollverbindung) inkubiert wurden. Eine geringere Aktivität der GAST im Testgemisch im Vergleich zu der Kontrolle zeigt an, dass die Kandidatenverbindung GAST moduliert.
  • Geeignete Zellen für den Assay umfassen normale Zellen, welche die GRK exprimieren, Zellen, die gentechnisch verändert wurden, so dass sie GRK exprimieren, maligne Zellen, die GRK exprimieren, oder immortalisierte Zellen, die die Kinase exprimieren.
  • Bedingungen, die zur Analyse der Aktivität geeignet sind, umfassen Bedingungen, die zur Analyse einer cellulären Aktivität oder Funktion unter Kontrolle des GAST-Wegs geeignet sind. Im Allgemeinen kann eine celluläre Aktivität oder Funktion analysiert werden, wenn die Zellen Bedingungen ausgesetzt werden, die für ein Zellwachstum geeignet sind, einschließlich einer geeigneten Temperatur (z.B. zwischen etwa 30°C und etwa 42°C) und des Vorliegens der geeigneten Nährstoffkonzentrationen im Medium (z.B. Aminosäuren, Vitamine, Wachstumsfaktoren oder spezifische Aktivatoren, z.B. Cytokine, Hormone und dergleichen).
  • Beispielsweise kann die Aktivität analysiert werden, indem die Melanogenese durch Melanocyten wie in Beispiel 3 unten gemessen wird. Ein anderer cellulärer Assay ist die Bestimmung von cAMP in C6-Glioblastomzellen, wie in Beispiel 4 unten angegeben ist.
  • 6.2 Phosphorylierung von Substanzen
  • Es ist möglich, die GAST-Aktivität und die Änderungen bei dieser GAST im Vergleich zur Kontrolle zu analysieren, indem der Phosphorylierungslevel der Substratproteine der GRK bestimmt wird. Beispiele für mögliche GRK-Substrate sind: Tubulin, β-adrenerger Rezeptor, α2-adrenerger Rezeptor, Acetylcholinrezeptor, d-Opioid-Rezeptor und μ-Opioid-Rezeptor als β2/1-adrenerger Rezeptor, α2-adrenerger Rezeptor, Acetylcholin-Rezeptor, d-Opioid-Rezeptor, Rhodopsin, A(1,2,3)-purinerger Rezeptor, Synuclein, Angiotensin II 1a, DA-Dopamin, N-Formylpeptid, Muscarin-Rezeptor, Thrombozytenaktivierungsfaktor, Thrombin (Bunemann et al., J. of Physiology (1999) 517.1, 5-23). Zellen, von denen bekannt ist, dass sie GRK exprimieren, werden z.B. mit einer Kandidatenverbindung zur Inhibierung der GAST inkubiert. Dann werden die Zellen lysiert, der Proteingehalt der Zellen wird erhalten und an einem Gel getrennt. Die Substrate können durch Verwendung von geeigneten Molekulargewichtsmarkern oder durch Verwendung geeigneter Antikörper, die gegen das spezifische verwendete GPCR reaktiv sind, identifiziert werden. Der Phosphorylierungsgrad des Substrats kann bestimmt werden, indem markierte Anti-Tyr-Antikörper verwendet werden. Alternativ kann das geeignete Substrat unter der Verwendung von Antikörpern immunpräzipitiert werden. Der Grad der Substratphosphorylierung in dem Immunpräzipitat kann durch Verwendung von Anti-Phosphotyrosin-Antikörpern bestimmt werden (siehe Fujimoto et al., Immunity, 13:47-57(2000)).
  • Nach einer anderen Option kann eine Phosphorylierung in einem zellfreien System bestimmt werden, indem ein Gemisch, umfassend GRK, das Substrat der Kinase (der geeignete GPCR) und Kandidatenmoleküle zur Inhibierung von GAST, in Gegenwart von ATP unter Bedingungen, die eine Phosphorylierung ermöglichen, inkubiert wird. Die Proteine werden dann einer Geltrennung unterzogen, auf Nitrocellulose transferiert, wo die Substratbande durch Antikörper oder Molekulargewichtsmarker identifiziert wird, gefolgt von einem Immunblotting durch Anti-Phosphotyrosin-Antikörper. Alternativ ist es möglich [γ-32P]ATP zu verwenden und die Radioaktivitätsmenge, die in das Substrat eingebaut ist, quantitativ zu bestimmen (siehe Fujimoto et al., The J. of Immunol. 7088-7094 (1999)).
  • 6.3. Gewebe- oder in vivo-Assay
  • Geeignete Assays zur Bestimmung der Inhibierung von GAST können durchgeführt werden: durch Induzieren von Diabetes in Tieren, z.B. durch Injektion von Streptozotoun, das einige der Insulin-sezernierenden Zellen zerstört (solange etwas Insulin aufrechterhalten wird) oder durch Verwendung von Tiermodellen, die die Tendenz haben, Diabetes, Obesitas, hohes Serumlipidprofil, Hypertonie, entweder natürlich (Sandratte, ob/ab-Mäuse usw.) oder durch genetische Manipulation, zu entwickeln und dann Bestimmung der (Glucosespiegeländerung im Blut des Tiers. Andere Beispiele sind eine Bestimmung der Gewichtsänderung oder des Appetits bei behandelten Tieren.
  • 7. Herstellung von Antikörpern
  • Die von GRK abgeleiteten Proteine der vorliegenden Erfindung können bei der Herstellung spezifischer Antikörper gegen GRK nützlich sein. Geeignete Antikörper können gegen ein GRK-Peptid erzeugt werden, indem das Peptid mit einem geeigneten Träger konjugiert wird, z.B. Napfschneckenhämocyanin oder Serumalbumin; die Produktion von polyklonalem und monoklonalem Antikörper kann unter Verwendung einer beliebigen geeigneten Technik durchgeführt werden. Es wurde eine Vielzahl von Verfahren beschrieben (siehe z.B. Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975) und Eur. J. Immunol. 6:511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266:550-552 (1977); Koprowski et al., U.S. Patent Nr. 4,172,124; Harlow, E. und D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology; Bd. 2 (Supplement 27, Sommer 1994), Ausubel, F. M. et al., Herausg., (John Wiley & Sons: New York, NY), Kapitel 11, (1991)). Im Allgemeinen kann ein Hybridom produziert werden, indem eine geeignete immortale Zelllinie (z.B. Myelom-Zelllinie, z.B. SP2/0) mit Antikörper-produzierenden Zellen fusioniert wird. Die Antikörperproduzierende Zelle, vorzugsweise solche der Milz oder der Lymphknoten, kann aus Tieren erhalten werden, die mit dem Antigen von Interesse immunisiert wurden. Die fusionierten Zellen (Hybridome) können unter Verwendung selektiver Kulturbedingungen isoliert und durch limitierende Verdünnung kloniert werden. Zellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität produzieren, können durch einen geeigneten Assay (z.B. ELISA) selektiert werden.
  • Die Antikörper können eingesetzt werden, um zu bestimmen, ob eine intracelluläre GRK in dem Cytoplasma der Zelle vorliegt. Es wird ein Lysat der Zelle erzeugt (z.B. durch Behandeln der Zellen mit Natriumhydroxid (0,2 N) und Natriumdodecylsulfat (1%) oder mit einem nichtionischen Detergens, wie NP-40, Zentrifugieren und Abtrennen des Überstands von dem Pellet) und mit einem Anti-GRK-Peptid-Antikörper, der für GRK spezifisch ist, behandelt. Das Lysat wird dann analysiert, z.B. durch Western-Blotting oder Immunpräzipitation für Komplexe zwischen GRK und Antikörper. Anti-GRK-Peptid-Antikörper können für die Studie der intracellulären Verteilung (Kompartimentalisierung) von GRK unter verschiedenen physiologischen Bedingungen über die Anwendung herkömmlicher Immuncytochemie, z.B. Immunfluoreszenz, Immunperoxidasetechnik und Immunelektronenmikroskopie, in Verbindung mit dem spezifischen Anti-GRK-Peptid-Antikörper verwendet werden.
  • Antikörper, die mit den GRK-Peptiden reaktionsfähig sind, sind ebenfalls nützlich, um die GRK in einer Probe zu detektieren und/oder quantitativ zu bestimmen oder um die GRK zu reinigen (z.B. durch Immunaffinitätsreinigung).
  • Die von GRK abgeleiteten Peptide der vorliegenden Erfindung können auch verwendet werden, um Liganden zu identifizieren, die mit GRK wechselwirken und die die Aktivität von GRK inhibieren. Beispielsweise kann eine Affinitätssäule hergestellt werden, an welche ein GRK-Peptid direkt oder über einen Linker kovalent gebunden ist. Diese Säule kann wiederum für die Isolierung und Identifizierung von spezifischen Liganden verwendet werden, welche das GRK-Peptid binden und welche wahrscheinlich auch die GRK binden. Der Ligand kann dann aus der Säule eluiert werden, charakterisiert werden und auf seine Fähigkeit, die GRK-Funktion zu inhibieren, getestet werden.
  • 8. Herstellung der Verbindungen
  • Peptidsequenzen zur Herstellung einer beliebigen der Reihe der Verbindungen der Erfindung können durch Festphasen-Peptidsynthese (z.B. t-BOC oder F-MOC)-Verfahren, durch Lösungsphasensynthese oder durch andere geeignete Techniken, einschließlich Kombinationen der vorangehenden Verfahren, synthetisiert werden. Das t-BOC- und F-MOC-Verfahren, die eingeführt sind und in großem Umfang verwendet werden, werden in Aarifield, J. Am. Chem. Soc., 88:2149 (1963); Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, C. H. Li, Hrsg., Academic Press, 1983, S. 48-267; und Barany und Aarifield, in The Peptides, E. Gross und J. Meienhofer, Hrsg., Academic Press, New York, 1980, S. 3-285 beschrieben. Verfahren der Festphasen-Peptidsynthese werden in Aarifield, R. B., Science, 232:341 (1986); Carpino, L. A. und Han, G. Y., J. Org. Chem., 37:3404 (1972); und Gauspohl, H. et al., Synthesis, 5:315 (1992)) beschrieben. Die Lehren dieser Referenzen werden hier durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Wie oben angegeben wurde, können die Verbindungen der Erfindung hergestellt werden, indem verschiedene peptidische Cyclisierungstechniken verwendet werden. Verfahren zur Cyclisierung von Verbindungen, die Peptidsequenzen haben, werden z.B. von Lobl et al., WO 92/00995 beschrieben, deren Lehren hier durch Bezugnahme eingearbeitet werden. Cyclisierte Moleküle können hergestellt werden, indem die Seitenketten der zwei Aminosäuren, die im Ringschluss zu verwenden sind, mit Gruppen geschützt werden, die selektiv entfernt werden können, während alle anderen Seitenketten-Schutzgruppen intakt bleiben. Eine selektive Entschützung wird am besten unter Verwendung orthogonaler Seitenketten-Schutzgruppen, z.B. Allyl-(OAI) (z.B. für die Carboxylgruppe in der Seitenkette von Glutaminsäure oder Asparaginsäure), Allyoxycarbonyl-(Aloc) (für den Aminostickstoff in der Seitenkette von Lysin oder Ornithin zum Beispiel) oder Acetamidomethyl-(Acm) (für das Sulfihydryl von Cystein) Schutzgruppen, erreicht. OAI und Aloc werden leicht durch Pd entfernt und Acm wird in einfacher Weise durch Iodbehandlung entfernt.
  • Andere Cyclisierungsmodi (neben N- zu C-terminaler Cyclisierung) können umfassen: N- zu Hauptkette-Cyclisierung, C- zu Hauptkette-Cyclisierung, N- zu Seitenkette-Cyclisierung, C- zu Seitenkette-Cyclisierung, Hauptkette zu Seitenkette-Cyclisierung, Hauptkette zu Hauptkette-Cyclisierung und Nebenkette zu Nebenkette-Cyclisierung.
  • Beispiel 1 – Herstellung von Verbindungen, die von GRK-abgeleitete Peptide umfassen
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines 430A Peptide Synthesizers von Applied Biosystems unter Verwendung der F-Moc-Technik nach Protokollen des Herstellers synthetisiert werden. Andere geeignete Methodologien zur Herstellung von Peptiden sind dem Fachmann bekannt. Siehe z.B. Merrifield, R. B., Science, 232:341 (1986); Carpino, L. A., Han, G. Y., J. Org. Chem., 37:3404 (1972); Gauspohl, H., et al., Synthesis, 5:315 (1992)). Die Lehren dieser werden hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Rink-Amid-Harz [4-(2',4'-Dimethoxyphenyl-FMOC-aminomethyl)phenoxyharz] wurde für die Synthese von C-amidierten Peptiden verwendet. Die alpha-Aminogruppe der Aminosäure wurde durch eine FMOC-Gruppe geschützt, die zu Beginn jedes Zyklus mit einer schwachen Base, 20% Piperidin in N-Methylpyrrolidon (NMP), entfernt wurde. Nach dem Entschützen wurde das Harz mit NMP gewaschen, um das Piperidin zu entfernen. Eine in situ-Aktivierung des Aminosäurederivats wurde durch FASTMOC-Chemie unter Verwendung von HBTU (2-(1-Benzotriazolyl-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium), gelöst in HOBt (1-Hydroxybenzotriazol) und DMF (Dimethylformamid), durchgeführt. Die Aminosäure wurde in dieser Lösung mit zusätzlichen NMP gelöst. DIEA (Diisopropylethylamin) wurde zugegeben, um eine Aktivierung zu initiieren. Alternativ wurde das Aktivierungsverfahren von DCC (Dicyclohexylcarbodiimid) und HOBL verwendet, um einen aktiven HOBt-Ester zu bilden. Eine Kupplung wurde in NMP durchgeführt. Nach Acetylierung des N-Endes (optional) wurde ein TFA (Trifluoressigsäure)-Spaltungsverfahren des Peptids von dem Harz durchgeführt, und die Seitenketten-Schutzgruppe wurde unter Verwendung von 0,75 g kristallinem Phenol; 0,25 ml EDT (1,2-Ethandithiol); 0,5 ml Thioanisol; 0,5 ml D. I. H2O; 10 ml TFA angefügt.
  • Beispiel 2 – Diabetes Typ II bei Sandratten (Psammomys)
  • Sandratten (Psammomys), die genetisch zur Entwicklung von Diabetes Typ II neigen, wurden in dieser Studie eingesetzt. Die genetisch ausgewählten Sandratten, 3 bis 6 Monate alt, wurden für etwa 3 bis 10 Tage mit energiereichem Futter (Weizman HE) gefüttert, bis sie diabetisch wurden, was durch ihren erhöhten Blutglucosespiegel beurteilt wurde (siehe R. Kalman et al., „The Efficiency of Sand Rat Metabolism is Responsible for Development of Obesity and Diabetes", J. of Basis & Clinical Physiology & Pharmacology (1993), Bd. 4, Nr. 1-2, S. 57-68, deren einschlägige Teile hier durch Bezugnahme als aufgenommen gelten).
  • Den diabetischen Sandratten wurden einmal pro Woche i.p. eine Verbindung, umfassend das von GRK abgeleitete Peptid K024H107 (SEQ ID NO.: 10), in einer Dosis von 10 mg/kg injiziert. Das Peptid wurde vorbereitet, indem eine 10 mM-Lösung des Peptids in 100% DMSO mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), zu einer Konzentration von 400 μM verdünnt wurde. Vierzig μM des 10 mM Peptids in DMSO-Lösung wurden mit 160 μl 1,6 M NH4HCO3 gemischt und für 40 Minuten auf 100°C erwärmt. Die resultierende Lösung wurde dann in 2 M Hepes-Puffer (pH 7,0) auf 400 μM verdünnt. Diese Peptid-Stammlösung wurde mit „tbi" markiert. Das Vehikel der Lösung zur Injektion enthielt 8% DMSO, 0,67 M Ammoniumbicarbonat und 2 M Hepes. Kontrolltiere erhielten eine i.p.- Injektion nur des Vehikels. Die Resultate für behandelte Tiere sind in 3 gezeigt und für Kontrolltiere sind sie in 4 gezeigt.
  • Wie aus den 3 und 4 gesehen werden kann, gab es nach einer einzigen Injektion der Verbindung, die das von GRK abgeleitete Peptid umfasste, eine dramatische Abnahme bei der Blutglucose zum normalen Spiegel (3), während keine Änderung bei den Kontrollen beobachtet wurde (4). Bei der behandelten Gruppe wurde zusätzlich bemerkt, dass vier Tiere bereits nach der ersten Injektion normoglykämisch wurden (Responder, 3) und der Rest der behandelten Tiere nach drei zusätzlichen wöchentlichen Injektionen normoglykämisch wurde („Nicht-Responder", 3).
  • Beispiel 3 – Messung der Melanogenese durch Melanocyten in Zellkultur
  • Murine B16-Melanomzellen wurden in DMEM + 10% FCS + 2 mM Glutamin + 100 Einheiten/ml Penicillin + 0,1 mg/ml Streptomycin wachsen gelassen. Die Zellen wurden unter kontrollierten Bedingungen (37°C, 5% CO2) inkubiert.
  • Die Melanomzellen wurden in Mikrotiterplatten mit 96 Wells, 5400 Zellen pro Well, plattiert und für 24 Stunden wachsen gelassen. Ausgewählte Verbindungen, umfassend von GRK abgeleitete Peptide, wurden in DMSO solubilisiert und dann in PBS + 0,1% BSA auf das 10fache der Endkonzentration verdünnt (siehe das Verfahren in Beispiel 2).
  • Sechs unterschiedliche Verbindungen, die verschiedene von GRK abgeleitete Peptide umfassen, wurden mit den angegebenen Endkonzentrationen in die entsprechenden Wells gegeben (siehe 5A-5F). Das Vehikel, das gleiche Konzentrationen an DMSO, PBS und BSA enthielt, wurde als die Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden dann für weitere 4 Tage inkubiert, wenn dunkles Melaminpigment in den Wells der behandelten Zellen akkumulierte.
  • Die Melanogenese wurde durch Zusatz von 70 μl 1 N NaOH pro Well zur Freisetzung des gesamten Melanins aus den Zellen analysiert, und die optische Dichte wurde bei 405 nm bestimmt, wobei ein ELX-800 ELISA-Plattenlesegerät verwendet wurde. Für jede Konzentration wurden sechs Wells verwendet.
  • Die Resultate sind in den 5A-5G gezeigt. Aus diesen Graphen kann gesehen werden, dass bei Peptidkonzentrationen von 0,6 μM und für einige Peptide so niedrig wie 0,15 μM signifikante Melanogenese auftrat. Aus diesen Graphen wird leicht klar, dass diese Peptide eine Verstärkung der Melanogenese aus Melanocyten bewirken und dass dieser Effekt durch die Verwendung von verschiedenen von GRK abgeleiteten Peptiden klar wird.
  • Beispiel 4 – Inhibierung der Produktion von cyclischem AMP
  • Es ist gut bekannt, dass es nach Aktivierung der verschiedenen GPCRs eine Aktivierung der Adenolatcyclase durch G-Proteine gibt. Dies erhöht die Spiegel an cyclischem AMP in der Zelle und diese Spiegel werden dann durch die Desensibilisierung der Rezeptoren durch GRK gesenkt. Somit wird erwartet, dass eine Inhibierung von GAST diese Verringerung bei den Spiegeln an cyclischem AMP eliminieren wird und eine konstitutive Zunahme bei den cAMP-Spiegeln bewirken wird.
  • Es wurden C6-Glioblastomzellen verwendet, von denen bekannt ist, dass sie den β-adrenergen Rezeptor (das Substrat von GRK) exprimieren.
  • Zu den Zellen wurden die folgenden Verbindungen gegeben:
    Gruppe I: Isoproteranol (ISO) (Agonist des μ-adrenergen Rezeptors) in Konzentrationen von 1 μM und 10 μM;
    Gruppe II: die Verbindung der Erfindung K024H107 (SEQ ID NO.: 10) in Konzentrationen von 1 μM und 10 μM;
    Gruppe III: eine Kombination des Peptids K024H107 mit einer Konzentration von 10 μM und eine Stunde später 1 μM Isoproterenol;
    Gruppe IV: eine erste Zugabe von 1 μM Isoproterenol und eine Stunde später 10 μM der Verbindung der Erfindung K024H107.
  • Die Menge der Aktivität wurde gemessen, indem die Zunahme der intracellulären cyclischen AMP-Spiegel gemessen wurde, welche unter Verwendung des im Handel verfügbaren Kits von Biotrack Cellular Communication Assay, nämlich das cyclische AMP-Enzym-Immunoassay (EIA)-System.
  • Die Resultate sind in 6 gezeigt. Wie erkannt werden kann, stiegen die cyclischen AMP-Spiegel deutlich an, wenn zunächst die Verbindung der Erfindung K024H107 zugesetzt wurde und eine Stunde später Isoproterenol (Aktivator des Rezeptors) zugesetzt wurde. Wenn die Reihenfolge der Zugabe umgekehrt wurde, war das Resultat deutlich anders, der Spiegel an cyclischem AMP änderte sich kaum, wahrscheinlich infolge der Tatsache, dass es ein Zurückbleiben bei der Aktivität der Verbindung der Erfindung infolge der Zeit gibt, die für eine Penetration durch celluläre Membranen erforderlich ist. Dieses Experiment zeigt deutlich, dass die Verbindungen der Erfindung fähig sind, das durch GPCR transduzierte Signal deutlich zu erhöhen.
  • Beispiel 5 – Aktivität von Verbindungen der Erfindung auf Gewichtsverringerung und Appetit von normalen Mäusen
  • 18 männliche Sabra-Mäuse, 8 Wochen alt, wurden verwendet und wurden wie folgt in vier Gruppen aufgeteilt:
    Gruppe I: (n = 5) dienten als Kontrolle und erhielten eine Injektion mit einem Vehikel, nämlich 1,1% Tween80, 0,1% BSA, in DDW;
    Gruppe II: (n = 4) erhielten eine Injektion von NDP-αMSH, einen bekannten Gewichtsregulator, in einer Konzentration von 0,9 μg/kg Körpergewicht;
    Gruppe III: (n = 5) erhielten eine Injektion mit der Verbindung der Erfindung K024H107 in einer Konzentration von 21 mg/kg Körpergewicht;
    Gruppe IV: (n = 4) erhielten eine Kombination von NDP-αMSH und K024H107 in derselben Konzentration wie oben.
  • Die Tiere wurden vor dem Versuch und periodisch während des Versuchs gewogen.
  • Gleichzeitig wurde das Futter gewogen, bevor es in die Käfige gegeben wurde, und auch am Ende jedes Testzeitraums. Von diesem Punkt an umfasste die Verlaufskontrolle sowohl das Wiegen der Mäuse und des Futters für den kurzen Zeitraum, alle zwei Stunden, bis zur Nacht und später für den langen Zeitraum, im 24 Stunden-Zyklus. Die Resultate sind in 7A und 7B gezeigt.
  • Die Resultate von 7A sind als der Prozentwert der Änderung des Körpergewichts, verglichen mit dem Anfangsgewicht der Mäuse jeweils und dann für jede Gruppe gemittelt. Die Errechnung des Futterverzehrs (7B) wurde in jeder Gruppe, bezogen auf das Gesamtgewicht aller Tiere (4 oder 5 Tiere) errechnet und getrennt für jede Gruppe gemittelt. Wie aus den Resultaten zu sehen ist, zeigten alle drei behandelten Gruppen eine Gewichtsabnahme und eine Abnahme der Futteraufnahme im Vergleich zur Kontrolle. Gruppe III, die mit der Verbindung der Erfindung allein behandelt worden war, zeigte die stärkste Wirkung.
  • Das obige Experiment wurde erneut mit einer anderen Verbindung, umfassend ein von GRK abgeleitetes Peptid K024H112 (SEQ ID NO.: 5) durchgeführt. 16 Tiere wurden wie folgt verwendet:
    Gruppe I: (n = 5) Vehikel wie oben;
    Gruppe II: (n = 6) K024H112 23,2 mg/kg;
    Gruppe III: K024H112 31,5 mg/kg.
  • Die Resultate für die Gewichtsänderung sind in 8A und für die Änderung der Futteraufnahme sind in 8B gezeigt. Wie gesehen werden kann, war auch diese Verbindung bei der Verringerung sowohl des Körpergewichts als auch der Futteraufnahme wirksam.
  • Die obigen Resultate zeigten, dass die zwei unterschiedlichen Verbindungen der Erfindungen, die zwei unterschiedliche von GRK abgeleitete Sequenzen umfassen, sowohl bei der Reduzierung des Körpergewichts als auch bei der Futteraufnahme wirksam sind. SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (7)

  1. Eine Verbindung, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung K024H003 (SEQ ID NO.: 2), K024H007 (SEQ ID NO.: 3), K024H101 (SEQ ID NO.: 4), K024H102 (SEQ ID NO.: 5), K024H103 (SEQ ID NO.: 6), K024H104 (SEQ ID NO.: 7), K024H105 (SEQ ID NO.: 8), K024H106 (SEQ ID NO.: 9), K024H107 (SEQ ID NO.: 10), K024H108 (SEQ ID NO.: 11), K024H109 (SEQ ID NO.: 12), K024H110 (SEQ ID NO.: 13), K024H111 (SEQ ID NO.: 14), K024H112 (SEQ ID NO.: 15), K024H113 (SEQ ID NO.: 16), K024H114 (SEQ ID NO.: 17), K024H901 (SEQ ID NO.: 18), K024H903 (SEQ ID NO.: 19) oder SEQ ID NO.: 20 bis SEQ ID NO.: 38 ist.
  2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung K024H107 (SEQ ID NO.: 10) ist.
  3. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikaments.
  4. Verwendung einer Verbindung nach Anspruch 3, wobei das Medikament für die Behandlung von Obesitas bzw. Fettleibigkeit, Dyslipidämie, Cholesterinämie, Koagulationsstörungen, Syndrom X bzw. metabolischem Syndrom, Diabetes, Hypertonie oder Ateriosklerose ist.
  5. Verwendung wenigstens eines Inhibitors GRK-assoziierter Signaltransduktion (GAST) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes-assoziierten Phänomenen, wobei der GAST-Inhibitor K024H003 (SEQ ID NO.: 2), K024H007 (SEQ ID NO.: 3), K024H101 (SEQ ID NO.: 4), K024H102 (SEQ ID NO.: 5), K024H103 (SEQ ID NO.: 6), K024H104 (SEQ ID NO.: 7), K024H105 (SEQ ID NO.: 8), K024H106 (SEQ ID NO.: 9), K024H107 (SEQ ID NO.: 10), K024H108 (SEQ ID NO.: 11), K024H109 (SEQ ID NO.: 12), K024H110 (SEQ ID NO.: 13), K024H111 (SEQ ID NO.: 14), K024H112 (SEQ ID NO.: 15), K024H113 (SEQ ID NO.: 16), K024H114 (SEQ ID NO.: 17), K024H901 (SEQ ID NO.: 18), K024H903 (SEQ ID NO.: 19) oder SEQ ID NO.: 20 bis SEQ ID NO.: 38 ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 4, wobei der GAST-Inhibitor K024H107 (SEQ ID NO.: 10) ist.
  7. Verwendung nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, wobei das Diabetes-assoziierte Phänomen Diabetes Typ II, Diabetes-assoziierte Obesität bzw. Fettleibigkeit, durch Diabetes verursachte Hypertonie oder Diabetes-assoziierte Dyslipidämie ist.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005114210A1 (en) * 2004-05-21 2005-12-01 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-dependent receptor kinase 3 (grk3)
US7749720B2 (en) * 2004-06-17 2010-07-06 The Regents Of The University Of California Methods of identifying compounds for producing insulin sensitization
CA2630461A1 (en) * 2005-11-30 2007-06-07 Axitare, Inc. Compositions and methods of modulating the taste and smell receptors and screening methods therefore

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6174993B1 (en) * 1997-05-21 2001-01-16 The Children's Medical Center Corp. Short peptides which selectively modulate the activity of serine/threonine kinases
US6723694B1 (en) * 1997-05-21 2004-04-20 The Children's Medical Center Corp. Short peptides which selectively modulate intracellular signalling
EP1115847A1 (de) * 1998-09-25 2001-07-18 Children's Medical Center Corporation Kurze peptide, welche die aktivität von proteinkinasen selektiv regulieren
WO2000073469A2 (en) * 1999-05-28 2000-12-07 Sugen, Inc. Protein kinases

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