DE19531931A1 - Modulatoren des Körpergewichts, korrespondierende Nukleinsäuren und Proteine, und diagnostische und therapeutische Verwendungen derselben - Google Patents

Description

Technisches Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Kontrolle des Körpergewichts von Säugetieren einschließlich Tieren und Men­ schen, und insbesondere die vorliegend als Gewichtsmodulatoren identifizierten Materialien, sowie diagnostische und therapeuti­ sche Verwendungen, für die derartige Modulatoren eingesetzt werden können.

Hintergrund der Erfindung

Die Obesität, definiert als ein Übermaß an Körperfett gegenüber der fettfreien Masse des Körpers, ist mit wichtigen psycholo­ gischen und medizinischen Morbiditäten assoziiert, wobei letzte­ re Hypertonie, erhöhte Blutfettwerte und Typ II- oder insulin­ unabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) einschließen. In den USA gibt es 6 bis 10 Millionen Individuen mit NIDDM einschließlich 18% der Bevölkerung im Alter von 65 Jahren [Harris et al., Int. J. Obes., 11: 275-283 (1987)]. Ungefähr 45% der Männer und 70% der Frauen mit NIDDM sind adipös (fettleibig), und ihre Diabetes wird durch Gewichtsreduktion wesentlich gebessert oder elimi­ niert [Harris, Diabetes Care, 14(3): 639-648 (1991)]. Wie nach­ folgend beschrieben wird, sind sowohl die Obesität als auch der NIDDM in starkem Maße erblich, obgleich die prädisponierenden Gene nicht identifiziert worden sind. Die molekulargenetische Grundlage dieser metabolisch verwandten Störungen ist ein wich­ tiges aber nur in Ansätzen verstandenes Problem.

Die Assimilation, Speicherung und Verwertung von Nährstoff­ energie bilden ein für das Überleben von Metazoen zentrales komplexes homöostatisches System. Bei auf dem Land lebenden Säugetieren ist die Speicherung großer Mengen metabolischen Brennstoffs wie Triglyceriden im Fettgewebe entscheidend für das Überleben in Phasen des Nahrungsmangels. Die Notwendigkeit, ein bestimmtes Niveau an gespeicherter Energie ohne ständige Ver­ änderungen der Größe und Form des Organismus aufrechtzuerhalten, erfordert das Erreichen eines Gleichgewichts zwischen Energie­ aufnahme und -verbrauch. Die molekularen Mechanismen, welche das Energiegleichgewicht regulieren, bleiben jedoch noch aufzuklä­ ren. Die Isolierung von Molekülen, die alimentäre Informationen transduzieren und das Energiegleichgewicht kontrollieren, wird für ein Verständnis der Regulierung des Körpergewichts bei ge­ sunden und kranken Menschen entscheidend sein.

Das Ausmaß an Obesität bei einem Individuum ist zu einem großen Teil genetisch festgelegt. Eine Untersuchung der Übereinstim­ mungsraten des Körpergewichts und der Obesität unter eineiigen und zweieiigen Zwillingen oder adoptierten Kindern und ihren biologischen Eltern hat zu der Annahme geführt, daß die Vererb­ barkeit der Obesität (0,4-0,8) diejenige vieler anderer Eigen­ schaften übersteigt, von denen gewöhnlich angenommen wird, daß sie eine wesentliche genetische Komponente aufweisen, wie Schi­ zophrenie, Alkoholismus und Arteriosklerose [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 322: 1483-1487 (1990)]. Über die familiären Ähn­ lichkeiten der Energieverbrauchsraten ist ebenfalls berichtet worden [Bogardus et al., Diabetes, 35: 1-5 (1986)]. Eine ge­ netische Analyse unter geographisch begrenzten Populationen hat zu der Annahme geführt, daß eine relativ kleine Anzahl von Genen für die 30-50%ige Varianz der Körperzusammensetzung verantwort­ lich sein kann [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49: 1243-1255 (1991)]. Keines der in der allgemeinen Bevölkerung für Obesität verantwortlichen Gene ist jedoch hinsichtlich einer definitiven chromosomalen Lokalisierung genetisch kartiert worden.

Modelle zur Obesität bei Nagetieren schließen sieben Mutationen ein, die offensichtlich ein einziges Gen betreffen. Die am in­ tensivsten untersuchten Obesitäts-Mutationen der Maus betreffen die ob (Obesität)- und db (Diabetes)-Gene. Im Falle des Vorhan­ denseins vor dem Hintergrund derselben genetischen Abstammung führen ob und db zu nicht voneinander unterscheidbaren metabo­ lischen und verhaltensbedingten Phänotypen, was darauf hindeu­ tet, daß diese Gene ihre Funktion in demselben physiologischen Stoffwechselweg ausüben können [Coleman et al., Diabetoiogia, 14: 141-148 (1978)]. Mäuse, die hinsichtlich einer der beiden Mutationen homozygot sind, neigen zu übermäßiger Nahrungsauf­ nahme und leiden unter Stoffwechselschwäche, was zu einem adipö­ sen Phänotyp führt, welcher im Alter von 1 Monat feststellbar ist. Das Gewicht dieser Tiere tendiert dazu, sich bei 60-70 g zu stabilisieren (verglichen mit 30-35 g von Kontrollmäusen). ob- und db-Tiere manifestieren eine Unzahl von anderen hormonalen und metabolischen Veränderungen, wodurch es schwierig gewesen ist, den primären Defekt zu identifizieren, der der Mutation zuzuschreiben ist [Bray et al., Am. J. Clin. Nutr., 50: 891-902 (1989)].

Jedes der Obesitäts-Modelle der Nagetiere wird begleitet von Veränderungen im Kohlehydratstoffwechsel, die denjenigen des Typ II-Diabetes beim Menschen ähneln. In einigen Fällen hängt die Schwere des Diabetes zum Teil von der Abstammung der Maus ab [Leiter Endocrinology, 124: 912-922 (1989)]. Sowohl bei ob als auch bei db entwickeln kongenetische CS7BL/Ks-Mäuse einen schwe­ ren Diabetes mit letztendlicher β-Zell-Nekrose und Inselatro­ phie, was zu einem relativen Insulinmangel führt. Umgekehrt entwickeln kongenetische CS7BL/6J ob- und db-Mäuse einen tran­ sienten insulinresistenten Diabetes, welcher schließlich durch eine β-Zell-Hypertrophie kompensiert wird, die dem menschlichen Typ II-Diabetes ähnelt.

Der Phänotyp von ob- und db-Mäusen ähnelt der menschlichen Obe­ sität in einer Weise, die von der Entwicklung von Diabetes ver­ schieden ist - die mutierten Mäuse fressen mehr und verbrauchen weniger Energie als es bei mageren Kontrolltieren der Fall ist (wie bei adipösen Menschen). Dieser Phänotyp ist ebenfalls dem­ jenigen recht ähnlich, der bei Tieren mit Läsionen des ventrome­ dialen Hypothalamus beobachtet wird, wodurch nahegelegt wird, daß beide Mutationen die Fähigkeit beeinträchtigen können, ali­ mentäre Informationen innerhalb des zentralen Nervensystems ordnungsgemäß zu integrieren oder darauf anzusprechen. Diese Hypothese wird gestützt durch die Ergebnisse aus Parabiose-Expe­ rimenten [Coleman, Diabetoiogia, 9: 294-298 (1973)], welche na­ helegen, daß ob-Mäuse hinsichtlich eines zirkulierenden Satt­ heitsfaktors defizient sind, und daß db-Mäuse gegenüber den Wirkungen des ob-Faktors resistent sind (möglicherweise aufgrund eines Defekts des ob-Rezeptors). Diese Experimente haben zu der Schlußfolgerung geführt, daß die Obesität in diesen mutierten Mäusen aus unterschiedlichen Defekten in einer afferenten Schleife und/oder einem integrativen Zentrum der für die Kon­ trolle der Körperzusammensetzung postulierten Feedback-Mecha­ nismen resultieren kann.

Unter Verwendung von molekularen und klassischen genetischen Markern sind die ob- und db-Gene auf dem proximalen Teil des Chromosoms 6 bzw. dem mittleren Bereich des Chromosoms 4 kar­ tiert worden [Bahary et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 8642- 8646 (1990); Friedman et al., Genomics 11: 1054-1062 (1991)]. In beiden Fällen entfallen die Mutationen auf Regionen des Mäusege­ noms, die mit menschlichen synten sind, was darauf hindeutet, daß im Falle des Vorhandenseins menschlicher Homologa von ob und db wahrscheinlich die menschlichen Chromosomen 7q bzw. 1p be­ troffen sind. Defekte im db-Gen können bei anderen Säugerspezies zur Obesität führen: bei genetischen Kreuzungen zwischen Zucker- fa/fa-Ratten und Brown Norway +/+-Ratten wird die fa-Mutation (Rattenchromosom 5) von denselben Loci flankiert, die db bei der Maus flankieren [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806-7809 (1991)].

Aufgrund der unzähligen Faktoren, die das Körpergewicht zu be­ einflussen scheinen, ist es nicht möglich gewesen vorherzusagen, welche Faktoren, und insbesondere welcher homöostatische Mecha­ nismus in erster Linie für das Körpergewicht bestimmend sind. Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Hauptaufgabe liegt demgemäß in der Bereitstellung von Modulatoren des Körper­ gewichtes, die die Kontrolle der Adipositas und des Fettgehaltes von Säugern erlauben.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß ist die Aufgabe der Kontrolle der Adipositas und des Fettgehaltes von Tieren, insbesondere Säugern, gelöst worden durch Bereitstellung von Obesitäts(OB)-Polypeptiden und Nuklein­ säuremolekülen, die für die hier offenbarten Polypeptide kodie­ ren. Durch die vorliegende Erfindung werden erstmalig isolierte Polypeptide, die zur Modulation, d. h. zur Kontrolle und Regulie­ rung des Körpergewichtes und der Adipositas geeignet sind, sowie Nukleinsäuresequenzen bereitgestellt, die für derartige Polypep­ tide kodieren und nicht nur eine rekombinante Herstellung der OB-Polypeptide ermöglichen, sondern ihrerseits zur Modulation des Körpergewichtes geeignet sind.

Die erfindungsgemäßen Obesitäts(OB)-Polypeptide weisen etwa 145 bis etwa 167 Aminosäuren auf und sind in der Lage, das Körperge­ wicht eines Tieres, insbesondere eines Säugers, zu modulieren, und schließen allelische Varianten oder Analoga, einschließlich Fragmente derselben mit gleicher biologischer Aktivität ein. Die Polypeptide können mittels rekombinanter oder chemisch-syntheti­ scher Verfahren hergestellt werden. Derzeit bevorzugte OB-Poly­ peptide schließen solche ein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOS: 2, 4, 5 oder 6, oder allelische Varianten oder Analoga, einschließlich Fragmenten, derselben.

Immunogene Fragmente der erfindungsgemäßen OB-Polypeptide schließen ein: Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr- Leu-Ile-Lys-Thr (SEQ ID NO: 18); Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu- Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO: 19); Ser-Lys-Ser- Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO: 20); und Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile- Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO: 21).

Humane OB-Polypeptid-Analoga schließen solche ein mit den huma­ nen Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NOS: 4 und 6, bei denen eine oder mehrere der Aminosäuren 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 und 166 (gemäß Numerierung der SEQ ID NO: 4) durch eine andere Aminosäure wie der abweichenden Aminosäure des in SEQ ID NO: 2 dargestellten OB-Polypeptids der Maus, oder ein Alanin substituiert sind. Derartige Analoga schließen ebenfalls solche ein, bei denen: (a) der Serinrest an der Position 53 durch Gly­ cin, Alanin, Valin, Cystein, Methionin oder Threonin substitu­ iert ist; (b) der Serinrest an der Position 98 durch Glycin, Alanin, Valin, Cystein, Methionin oder Threonin substituiert ist; und (c) der Argininrest an der Positionsnummer 92 durch Asparagin, Lysin, Histidin, Glutamin, Glutaminsäure, Asparagin­ säure, Serin, Threonin, Methionin oder Cystein substituiert ist. Ein erfindungsgemäßes OB-Polypeptid-Analogon weist zu der in SEQ ID NO: 2, 4, 5 oder 6 dargestellten humanen OB-Polypeptid-Amino­ säuresequenz vorzugsweise eine Aminosäuresequenz-Homologie von 83% oder mehr auf.

Zusätzliche erfindungsgemäße humane OB-Polypeptid-Analoga besit­ zen die Aminosäuresequenz der SEQ ID NOS: 4 und 6 und weisen auf: (a) ein oder mehrere Asparaginsäurereste sind durch Gluta­ minsäure substituiert; (b) ein oder mehrere Isoleucinreste sind durch Leucin substituiert; (c) ein oder mehrere Glycin- oder Valinreste sind durch Alanin substituiert; (d) ein oder mehrere Argininreste sind durch Histidin substituiert; (e) ein oder mehrere Tyrosin- oder Phenylalaninreste sind durch Tryptophan substituiert; (f) ein oder mehrere der Reste 121 bis 128 (gemäß Numerierung der SEQ ID NO: 4) sind durch Glycin oder Alanin substituiert; und (g) ein oder mehrere Reste an den Positionen 54 bis 60 oder 118 bis 166 (gemäß Numerierung der SEQ ID NO: 4) sind durch Lysin, Glutaminsäure, Cystein oder Prolin substitu­ iert.

Derzeit erfindungsgemäß bevorzugte trunkierte humane OB-Polypep­ tid-Analoga schließen solche ein, bei denen (gemäß Numerierung der SEQ ID NO: 4): (a) ein oder mehrere Reste an den Positionen 121 bis 128 deletiert sind; (b) die Reste 1-116 deletiert sind; (c) die Reste 1-21 und 54 bis 167 deletiert sind; (d) die Reste 51-60 und 117 bis 167 deletiert sind; (e) die Reste 1-60 dele­ tiert sind; (f) die Reste 1-53 deletiert sind; sowie (g) ein Analogon der Untergruppe (a), bei dem die Reste 1-21 deletiert sind. Die erfindungsgemäßen OB-Polypeptide und OB-Polypeptid- Analoga ohne die 21 Aminosäuren umfassende "Signal"-Sequenz (z. B. Aminosäuren 1 bis 21 der SEQ ID NO: 4) können eine N-ter­ minale Aminosäure oder Aminosäuresequenz aufweisen, wie (1) Methionin, (2) eine Glycin-Serin-Histidin-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 38), (3) eine Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin-His­ tidin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Serin-Serin-Glycin- Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin-Serin-Histidin-Methionin-Se­ quenz (SEQ ID NO: 98), (4) eine Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Argi­ nin-Glutaminsäure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin-Sequenz (SEQ ID NO: 26), (5) eine Glutaminsäure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin- Sequenz (SEQ ID NO: 27), (6) eine Leucin-Glutaminsäure-Lysin- Arginin-Sequenz (SEQ ID NO: 28); (7) eine Methionin-Glycin-Se­ rin-Serin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin- Serin-Serin-Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin-Serin-Pro­ lin-Sequenz (SEQ ID NO: 99), und (8) eine Glycin-Serin-Prolin- Sequenz.

Die erfindungsgemäßen Derivate eines OB-Polypeptids weisen einen oder mehrere chemische Reste daran angeheftet auf, einschließ­ lich wasserlösliche Polymere wie Polyethylenglykol. Mit Poly­ ethylenglykol derivatisierte Derivate können mono-, di-, tri- oder tetrapegyliert, z. B. N-terminal monopegyliert sein. Bevor­ zugte N-terminal monopegylierte Derivate der erfindungsgemäßen OB-Polypeptide schließen OB-Polypeptide ein, welche die Amino­ säurereste 22 bis 167 der SEQ ID NO: 4 oder die Reste 22 bis 166 der SEQ ID NO: 6 umfassen, und die gegebenenfalls an der Posi­ tion 21 ein (pegyliertes) Methionin aufweisen.

Das erfindungsgemäß bereitgestellte isolierte Nukleinsäuremole­ kül kodiert für ein OB-Polypeptid, eine allelische Variante oder ein Analogon, einschließlich Fragmenten, wie oben beschrieben worden ist. Insbesondere werden DNA-Moleküle bereitgestellt zur Verwendung bei der Sicherstellung der Expression eines OB-Poly­ peptids mit der biologischen Aktivität der Modulation des Kör­ pergewichtes in einem Säuger, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: (a) den DNA-Molekülen gemäß Darstellung in SEQ ID NOS: 1 und 3 oder Fragmenten davon; (b) DNA-Molekülen, die mit den unter (a) definierten DNA-Molekülen oder hybridisierbaren Fragmenten davon hybridisieren; und (c) DNA-Molekülen, die bei der Expression für die Aminosäuresequenz kodieren, für die ir­ gendeines der vorhergehenden DNA-Moleküle kodiert. Beispiele für derartige Moleküle sind die humanen genomischen DNA-Moleküle der SEQ ID NOS: 22 und 24.

Die erfindungsgemäß bevorzugten DNA-Moleküle kodieren für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß: (a) SEQ ID NO: 2; (b) Aminosäuren 22 bis 167 der SEQ ID NO: 2; (c) SEQ ID NO: 4; (d) Aminosäuren 22 bis 167 der SEQ ID NO: 4; (e) SEQ ID NO: 5; (f) Aminosäuren 22 bis 166 der SEQ ID NO: 5; und (g) SEQ ID NO: 6; und (h) Aminosäuren 22 bis 166 der SEQ ID NO: 6, sowie für Polypeptide, die eine zuvor dargelegte N-terminale Aminosäure oder Aminosäuresequenz aufweisen. Zum Zwecke der Veranschauli­ chung besitzt ein bevorzugtes DNA-Molekül die in SEQ ID NO: 3 als Protein-kodierende Sequenz ausgewiesene Sequenz und weist insbesondere die Sequenz auf, wie sie als für die Aminosäuren 22 bis 167 kodierende Sequenz angegeben ist.

Nachweisbar markierte Nukleinsäuremoleküle, die mit einem erfin­ dungsgemäßen DNA-Molekül hybridisierbar sind, werden ebenfalls bereitgestellt und schließen Nukleinsäuremoleküle ein, die mit einer nicht-kodierenden Region einer OB-Nukleinsäure hybridi­ sierbar sind, wobei die nicht-kodierende Region ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Intron, einer 5′-nicht-kodie­ renden Region und einer 3′-nicht-kodierenden Region. Durch die vorliegende Erfindung werden ferner Oligonukleotid-Primer be­ reitgestellt zum-Amplifizieren von humaner genomischer DNA, die für ein OB-Polypeptid kodiert, wie die Oligonukleotide gemäß SEQ ID NOS: 29 bis 32.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Vektoren umfassen ein zuvor beschriebenes erfindungsgemäßes DNA-Molekül und weisen vorzugs­ weise die Form eines Expressionsvektors auf, der das DNA-Molekül operativ assoziiert mit einer Expressionskontrollsequenz umfaßt. Die erfindungsgemäßen einzelligen Wirtszellen werden mit einem erfindungsgemäßen DNA-Molekül oder mit einem oben beschriebenen Vektor transformiert oder transfiziert. Die bevorzugten Wirts­ zellen schließen Bakterien, Hefe, Säugerzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und humane Zellen in Gewebekultur ein. Beispiels­ weise werden derartige Wirtszellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Hefe, CHO-, R1.1-, B-W-, L-M-, COS 1-, COS 7-, BSC1-, BSC40-, BMT10- und Sf9-Zellen. Vorliegend bevorzugte Hefewirte schließen Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula und Torulopsis ein. Ebenfalls bereitgestellt werden Säugerzellen, die eine für ein OB-Polypeptid kodierende DNA-Sequenz enthalten und in vitro modifiziert worden sind, um eine höhere Expression des OB-Poly­ peptids mittels eines homologen Rekombinationsereignisses beste­ hend aus der Insertion einer die Expression regulierenden Se­ quenz in funktionelle Nähe der für das OB-Polypeptid kodierenden Sequenz zu erlauben. Die die Expression regulierende Sequenz kann eine die Expression eines OB-Polypeptids regulierende Se­ quenz sein oder nicht und kann eine mutante OB-Polypeptid-regu­ latorische Sequenz in der Zelle ersetzen.

Durch die vorliegende Erfindung werden Verfahren zur Herstellung eines OB-Polypeptids bereitgestellt, bei dem: (a) eine Zelle wie oben beschrieben unter Bedingungen kultiviert wird, die eine Expression des OB-Polypeptids sicherstellen; und (b) das expri­ mierte OB-Polypeptid gewonnen wird. Diese Vorgehensweise kann ebenfalls von den folgenden Schritten begleitet werden: (c) Chro­ matographieren des Polypeptids auf einer Ni-Chelationen-Säule; und (d) Reinigen des Polypeptids mittels Gelfiltration. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das OB-Polypeptid nach dem Schritt (c) und vor dem Schritt (d) auf einer starken Katio­ nenaustauschersäule chromatographiert.

Durch die vorliegende Erfindung werden ferner markierte und unmarkierte monoklonale und polyklonale Antikörper, die für die erfindungsgemäßen OB-Polypeptide spezifisch sind, sowie immorta­ lisierte Zellinien bereitgestellt, die einen erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörper produzieren. Eine erfindungsgemäße Anti­ körper-Präparation beinhaltet: (a) Konjugieren eines OB-Polypep­ tids mit einem Trägerprotein; (b) Immunisieren eines Wirtstieres mit dem OB-Polypeptid-Fragment/Trägerprotein-Konjugat des Schrittes (a), vermischt mit einem Adjuvans; und (c) Gewinnen des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier.

Durch die Erfindung werden Verfahren zur Messung der Anwesenheit eines OB-Polypeptids in einer Probe bereitgestellt, bei denen: (a) eine Probe, die unter Verdacht steht, ein OB-Polypeptid zu enthalten, mit einem Antikörper (vorzugsweise gebunden an einen festen Träger) kontaktiert, der spezifisch an das OB-Polypeptid unter Bedingungen bindet, die die Bildung von Reaktionskomplexen umfassend den Antikörper und das OB-Polypeptid erlauben; und (b) die Bildung von Reaktionskomplexen umfassend den Antikörper und das OB-Polypeptid in der Probe nachgewiesen wird, wobei der Nachweis der Bildung von Reaktionskomplexen die Anwesenheit von OB-Polypeptid in der Probe anzeigt. In entsprechender Weise werden in vitro-Verfahren zur Ermittlung der Menge an OB-Poly­ peptid in einer biologischen Probe bereitgestellt, bei denen: (a) die Bildung von Reaktionskomplexen in einer biologischen Probe nach dem obigen Verfahren nachgewiesen wird; und (b) die Menge an gebildeten Reaktionskomplexen ermittelt wird, wobei die Menge an Reaktionskomplexen mit der Menge an OB-Polypeptid in der biologischen Probe korrespondiert. Bei dem Nachweisen oder Diagnostizieren des Vorliegens einer Erkrankung, die mit erhöh­ ten oder verminderten Mengen an dem erfindungsgemäßen OB-Poly­ peptid assoziiert ist, erfolgt eine Ermittlung wie oben darge­ legt, und die nachgewiesene Menge wird mit einer in normalen Individuen oder in dem Individuum zu einem früheren Zeitpunkt vorhandenen Menge an OB-Polypeptid verglichen. Ein Anstieg in der Menge an OB-Polypeptid im Vergleich mit normalen oder vorhe­ rigen Werten zeigt eine Erkrankung an, die mit erhöhten Mengen an OB-Polypeptid assoziiert ist, während eine verminderte Menge an OB-Polypeptid verglichen mit normalen Mengen eine Erkrankung anzeigt, die mit verminderten Mengen an OB-Polypeptid assoziiert ist. Dementsprechend werden in vitro-Verfahren bereitgestellt zur Überwachung einer therapeutischen Behandlung einer Erkran­ kung, die mit erhöhten oder verminderten Mengen an OB-Polypeptid in einem Säuger assoziiert ist, umfassend das oben dargelegte Ermitteln der Mengen an OB-Polypeptid in einer Reihe von biolo­ gischen Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten von einem Säu­ ger erhalten worden sind, welcher eine derartige therapeutische Behandlung durchläuft.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen umfas­ sen ein OB-Polypeptid gemäß obiger Beschreibung zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger, und sie sind geeignet für therapeutische Verfahren zur Reduzierung des Körpergewichtes eines Tieres. Zusätzliche erfindungsgemäße pharmazeutische Zu­ sammensetzungen zur Verwendung bei therapeutischen Verfahren zur Steigerung des Körpergewichtes eines Tieres umfassen einen An­ tagonisten eines OB-Polypeptids, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, der an das OB-Polypeptid bindet und dessen Aktivität neutralisiert, einem Fragment des OB-Polypeptids, welches an den OB-Polypeptid-Rezeptor bindet, diesen aber nicht aktiviert, und einem Antagonisten des OB-Poly­ peptids in Form eines kleinen Moleküls. Durch die vorliegende Erfindung werden ferner entsprechende kosmetische Zusammenset­ zungen zur Verbesserung des körperlichen Erscheinungsbildes zur Reduzierung oder Steigerung des Körpergewichtes eines Individu­ ums bereitgestellt, die für kosmetische Verfahren zur Verbes­ serung des körperlichen Erscheinungsbildes eines Individuums geeignet sind. Derartige kosmetische Zusammensetzungen werden dem Individuum in einer Dosismenge verabreicht, die ausreichend ist, um das Körpergewicht des Individuums in gewünschter Weise zu modulieren.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, sowie von Antisense- Nukleinsäuremolekülen, die mit einer Nukleinsäure hybridisierbar sind, welche für ein erfindungsgemäßes OB-Polypeptid kodiert, zur Herstellung eines Medikamentes zur (z. B. gentherapeutischen) Modifizierung des Körpergewichtes eines Tieres. Ebenfalls be­ reitgestellt wird die Verwendung eines erfindungsgemäßen OB- Polypeptids oder Antagonisten zur Herstellung eines Medikamentes zur Modifizierung des Körpergewichtes eines Tieres. Auf diese Weise entwickelte Medikamente können zur Modifizierung des Kör­ pergewichtes eines Säugers bei der Behandlung einer Störung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Diabetes, hohem Blut­ druck und hohen Cholesterinwerten, und als Teil einer Kombina­ tionstherapie mit einem Medikament zur Behandlung derartiger Störungen eingesetzt werden. Derartige Medikamente können bei therapeutischen Verfahren eingesetzt werden, die intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, nasale, orale oder pulmonale Darreichungssysteme beinhalten.

Die vorliegend dargestellten Daten zeigen, daß die erfindungs­ gemäßen OB-Polypeptide in ihrer natürlichen Form primär von Säuger-Adipozyten sezerniert werden, und daß die Polypeptide als Hormone wirken.

Ferner zeigen die vorliegenden Beispiele, daß das Ob-Polypeptid, alternativ vorliegend mit "Leptin" bezeichnet, im Plasma der Maus, der Ratte und des Menschen zirkuliert. Das Leptin ist im Plasma von ob/ob-Mäusen abwesend, es ist aber im Plasma von db/db-Mäusen in 10fach höheren Konzentrationen und im Plasma von fa/fa-Ratten in 20fach höheren Konzentrationen vorhanden. In äußerst signifikanter Weise führen tägliche Injektionen von rekombinantem Leptin zu dramatischen Reduktionen der Körpermasse von ob/ob-Mäusen und zu einer signifikanten Wirkung auf das Körpergewicht von Wildtypmäusen, wobei sie keine Wirkung auf db/db-Mäuse aufweisen.

Nach einem weiteren Aspekt ist das OB-Polypeptid von einer Spe­ zies in einer anderen Spezies biologisch aktiv. Insbesondere ist das humane OB-Polypeptid in Mäusen aktiv.

In einer ersten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Modulatoren Nukleinsäuremoleküle, einschließlich rekombinante DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder einen Vektor, der die cDNA oder isolierte genomische DNA enthält) oder klonierte Gene (d. h. iso­ lierte genomische DNA) oder degenerierte Varianten derselben, die für Polypeptide kodieren, welche selbst als die nachfolgend definierten Modulatoren der Gewichtskontrolle wirken, oder kon­ servierte Varianten oder Fragmente derselben, insbesondere sol­ che Fragmente, denen das Signalpeptid fehlt (vorliegend alter­ nativ bezeichnet als reifes OB-Polypeptid), wobei die Polypepti­ de Aminosäuresequenzen aufweisen, wie sie in Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 2), Fig. 3 (SEQ ID NO: 4), Fig. 5 (SEQ ID NO: 5) und Fig. 6 (SEQ ID NO: 6) dargelegt sind. In spezifischen Ausführungsfor­ men werden Aminosäuresequenzen für zwei Varianten von murinen und menschlichen OB-Polypeptiden bereitgestellt. Beide Polypep­ tide werden in einer Form gefunden, bei der das Glutamin an Position 49 deletiert ist, was aus einer Anomalie beim mRNA- Spleißen resultieren kann. Die OB-Polypeptide von verschiedenen Spezies können in hohem Maße homolog sein; wie in Fig. 4 darge­ stellt, weisen die murinen und humanen OB-Polypeptide einen Homologiegrad von mehr als 80% auf.

Die Nukleinsäuremoleküle, rekombinanten DNA-Moleküle, oder klo­ nierten Gene können Nukleotidsequenzen aufweisen oder zu den DNA-kodierenden Sequenzen komplementär sein, die in Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 1) und Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) dargestellt sind. Insbesondere können derartige DNA-Moleküle cDNA oder aus dem Chromosom isolierte genomische DNA sein. Die erfindungsgemä­ ßen Nukleinsäuremoleküle können ebenfalls mit 5′- und 3′-flan­ kierenden Sequenzen der DNA und DNA-Intronsequenzen korrespon­ dieren. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung auch die Identifizierung einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus den Sequenzen der Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 1) und Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3), und degenerierte Varianten, allelische Varianten und ähnliche verwandte Moleküle.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann DNA oder RNA sein, einschließlich synthetischer Varianten davon mit Phos­ phat- oder Phosphatanalogen, z. B. Thiophosphat-Bindungen. Sowohl einzelsträngige als auch doppelsträngige Sequenzen werden vor­ liegend in Betracht gezogen.

Die vorliegende Erfindung liefert ferner Nukleinsäuremoleküle zur Verwendung als molekulare Sonden oder als Primer zur Ampli­ fizierung durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), d. h. syn­ thetische oder natürliche Oligonukleotide mit einer Sequenz, die mit einem Bereich der Sequenzen korrespondiert, wie sie in Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 1), Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) und Fig. 20A bis C (SEQ ID NOS: 22 und 24) dargestellt sind; oder die 5′- und 3′-flankierenden Sequenzen der kodierenden Sequenzen; oder Intronsequenzen der genomischen DNA. Insbesondere wird von der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül mit mindestens etwa 10 Nu­ kleotiden in Betracht gezogen, wobei eine Sequenz des Nuklein­ säuremoleküls mit einer Nukleotidsequenz derselben Anzahl von Nukleotiden in den Nukleotidsequenzen der Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 1), Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) und Fig. 20A bis C (SEQ ID NO: 22) oder mit einer dazu komplementären Sequenz korrespon­ diert. Die Nukleinsäuresequenz des Moleküls weist vorzugsweise mindestens 15 Nukleotide auf. Noch bevorzugter weist die Nu­ kleinsäuresequenz mindestens 20 Nukleotide auf. Bei einer Aus­ führungsform der Erfindung, bei der das Oligonukleotid eine Sonde ist, wird das Oligonukleotid nachweisbar markiert, z. B. mit einem Radionuklid (wie ³²P) oder einem Enzym.

Desweiteren werden durch die vorliegende Erfindung ein Klonie­ rungsvektor, der die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren umfaßt, welche für das OB-Polypeptid kodieren, sowie ein bakterieller, Insekten- oder ein Säuger-Expressionsvektor bereitgestellt, der die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, welche für das OB- Polypeptid kodieren, operativ in Assoziation mit einer Expres­ sionskontrollsequenz umfaßt. Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ferner eine Wirtszelle, wie eine Bakterienzelle, Hefe­ zelle, Insektenzelle, oder eine Säugerzelle, die mit einem ge­ eigneten Expressionsvektor transfiziert oder transformiert wor­ den ist, und demgemäß die Verwendung der oben genannten Kon­ strukte bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Modulatoren.

Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Antikörper, die an das OB-Polypeptid binden. Derartige Antikör­ per können gegen das Polypeptid vollständiger Länge oder gegen antigene Fragmente desselben gerichtet sein. Nach einem Aspekt inhibieren derartige Antikörper die funktionelle (d. h. die das Körpergewicht und die Fettzusammensetzung modulierende) Aktivi­ tät des OB-Polypeptids. Nach einem anderen Aspekt können Anti­ körper zur Bestimmung der Menge des im Plasma oder Serum zirku­ lierenden OB-Polypeptids verwendet werden. Nach einem weiteren Aspekt können Regio-spezifische Antikörper, insbesondere mono­ klonale Antikörper, als Sonden für die Struktur des OB-Polypep­ tids verwendet werden.

Sämtliche der vorstehend genannten Materialien werden vorliegend als Modulatoren des Körpergewichts und der Fettzusammensetzung betrachtet, und sie können als solche auf vielfältige Weise verwendet werden. Von der Erfindung werden insbesondere sowohl diagnostische als auch therapeutische Anwendungen sowie bestimm­ te landwirtschaftliche Anwendungen in Betracht gezogen, die von der Verwendung der vorliegend definierten Modulatoren, ein­ schließlich Nukleinsäuremolekülen und Peptiden, abhängig sind.

Darüber hinaus weist die Modulation des Körpergewichts spezifi­ sche therapeutische Implikationen und Vorteile auf, so daß Zu­ stände, bei denen entweder die Obesität oder, umgekehrt, eine Kachexie zu unerwünschten körperlichen Zuständen führt, durch Verabreichung eines oder mehrerer der erfindungsgemäßen Modula­ toren gemildert werden können.

Demgemäß wird ein Verfahren zur Modulation des Körpergewichts eines Säugers vorgeschlagen, welches das Kontrollieren der Ex­ pression des Proteins umfaßt, das von einer Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Sequenz von Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 1), der Sequenz von Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) und degenerierten und allelischen Varianten derselben, kodiert ist. Eine derartige Kontrolle kann erfolgen, indem man die fraglichen Nukleotide mittels Gentherapie in Fettzellen des Patienten oder Wirtes einführt, um die Obesität zu kontrollieren oder zu reduzieren. Umgekehrt wäre die Herstellung und Verabrei­ chung von Antagonisten der Nukleotide, wie Antisense-Molekülen, in den Fällen angezeigt und würde weiterverfolgt werden, bei denen Zustände vorliegen und unter Behandlung stehen, die mit übermäßigem Gewichtsverlust einhergehen, wie bei der Anorexia nervosa, bei Krebs, oder bei AIDS. Derartige Konstrukte würden in einer ähnlichen Weise wie die Nukleotide direkt in Fettzellen eingeführt werden, um solcherlei Veränderungen herbeizuführen.

Demgemäß könnten die durch die Fig. 1A bis E, 3, 5 und 6 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6) definierten Proteine, konservierte Varianten, und aktive Fragmente derselben sowie verwandte kleine Moleküle zur direkten Verabreichung für therapeutische Zwecke formuliert werden, um eine Reduktion oder Kontrolle von übermäßigem Körperfett oder der Gewichtszunahme herbeizuführen. Dementsprechend könnten Antikörper und andere Antagonisten der genannten Proteinmaterialien, wie Fragmente derselben, hergestellt und in ähnlicher Weise verabreicht wer­ den, um den gegensätzlichen Effekt zu erzielen. Demgemäß ist die Erfindung vorteilhafterweise auf eine pharmazeutische Zusammen­ setzung gerichtet, die ein erfindungsgemäßes OB-Polypeptid oder, alternativ, einen Antagonisten davon, in einer Mischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfs- oder Trägerstoff um­ faßt.

Zusätzlich kann das erfindungsgemäße OB-Polypeptid aufgrund seiner kosmetischen Wirkungen verabreicht werden, z. B. um das Erscheinungsbild des Körpers durch Verminderung von Fettablage­ rungen zu verbessern. Das OB-Polypeptid kann aufgrund seiner kosmetischen Wirkungen unabhängig oder in Verbindung mit anderen kosmetischen Strategien, wie z. B. einem operativen Eingriff, angewendet werden.

Die diagnostischen Verwendungen der vorliegenden Nukleotide und korrespondierenden Peptide erstrecken sich auf die Verwendung der Nukleinsäuren zur Identifizierung weiterer Mutationen von allelischen Varianten derselben, um ein Spektrum an aktiven Nukleotidmaterialien zu entwickeln, die sowohl für diagnostische als auch therapeutische Anwendungen geeignet sind. Insbesondere können sowohl homozygote als auch heterozygote Mutationen der fraglichen Nukleotide identifiziert werden, die man braucht, um den Zustand von Patienten genauer zu quantifizieren, um das Risikopotential von Individuen im Hinblick auf die Obesität zu ermitteln. Genauer gesagt, werden derzeit heterozygote Mutatio­ nen als mit milder bis moderater Obesität assoziiert angesehen, während homozygote Mutationen mit einer eher deutlichen und schweren Form von Obesität in Zusammenhang gebracht werden wür­ den. Man kann dann entsprechende DNA-Untersuchungen unter An­ wendung der zuvor genannten ermittelten Materialien als Maßstab durchführen, um eine genaue langfristige Prognose hinsichtlich einzelner Tendenzen zu erleichtern, um in der Lage zu sein, Veränderungen im Zusammenhang mit diätetischen oder anderen persönlichen Gepflogenheiten vorzuschreiben, oder zu einer di­ rekten therapeutischen Maßnahme zu raten, um solcherlei Zustände abzustellen.

Die diagnostische Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung er­ streckt sich auf Verfahren zur Messung der Anwesenheit und der Menge der erfindungsgemäßen Modulatoren in zellulären Proben oder biologischen Extrakten (oder Proben), die von zu untersu­ chenden Individuen stammen, so daß sowohl die Nukleinsäuren (genomische DNA oder mRNA) als auch die Proteinspiegel in der­ artigen Testproben festgestellt werden können. Unter der Annah­ me, daß die gesteigerte Aktivität des Nukleotids und die Anwe­ senheit des resultierenden Proteins die Fähigkeit des Individu­ ums zur Hemmung der Obesität reflektieren, würde der diese Er­ gebnisse eines Obesitäts-Patienten studierende Arzt feststellen, daß hinsichtlich der Anwesenheit und Aktivität der erfindungs­ gemäßen Nukleotide ein anderer Faktor als eine Dysfunktion eine Ursache des adipösen Zustandes ist. Umgekehrt legen abgesenkte Werte des Nukleotids und/oder des exprimierten Proteins den Schluß nahe, daß derartige Werte zur Behandlung eines derartigen adipösen Zustandes angehoben werden müssen, und es kann sodann ein geeigneter Therapieplan erstellt werden.

Ferner repräsentieren die aufgefundenen und in den Fig. 1A bis E und 2A und B dargestellten Nukleotide cDNA, die, wie be­ reits kurz ausgeführt worden ist, zur Messung von korrespondie­ render RNA geeignet ist. In gleicher Weise kann mit den Polypep­ tiden der Fig. 1A bis E und 3 korrespondierendes rekombinan­ tes Proteinmaterial hergestellt und in geeigneter Weise markiert werden, um es z. B. in Radioimmunoassays oder zum Zwecke der Messung von Fett und/oder von Plasmawerten des OB-Proteins, oder zum Nachweis des Vorhandenseins und der Menge eines Rezeptors für OB auf Geweben, wie dem Hypothalamus, zu verwenden.

Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung nicht nur das Identifizieren der vorliegend offenbarten Nukleotide und korre­ spondierender Proteine wie hier dargelegt, sondern auch die Aufklärung des Rezeptors für derartige Materialien. In diesem Zusammenhang könnten die Polypeptide der Fig. 1A bis E, 3, 5 und/oder 6 hergestellt und verwendet werden, um eine geeignete Expressionsbibliothek zur Isolierung aktiver Rezeptoren abzusu­ chen. Der Rezeptor kann anschließend kloniert werden, und der Rezeptor allein oder in Verbindung mit dem Liganden kann an­ schließend verwendet werden, um ein Screening nach kleinen Mole­ külen durchzuführen, die eine den vorliegenden Modulatoren ähn­ liche Aktivität besitzen.

Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen, die bestimmte dieser Modulatoren einschlie­ ßen, vorzugsweise die Polypeptide, deren Sequenzen in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 dargestellt sind, deren Antikörper, korrespondierende Agonisten oder Antagonisten davon in Form kleiner Moleküle, oder aktive Fragmente, herge­ stellt zu Formulierungen für eine Vielzahl von Verabreichungs­ arten, wenn eine derartige Therapie angezeigt ist. Derartige Formulierungen können pharmazeutisch verträgliche Träger oder erforderlichenfalls andere Adjuvanzien einschließen und werden in effektiven Dosismengen hergestellt, die von dem behandelnden Arzt für jeden Fall bestimmt werden.

Demgemäß ist es ein Hauptziel der vorliegenden Erfindung, die vorliegend definierten Modulatoren des Körpergewichts, die be­ stimmte Eigenschaften und Aktivitäten aufweisen, welche mit der Kontrolle und der Variation von Adipositas und dem Fettgehalt von Säugern assoziiert sind, in gereinigter Form bereitzustel­ len.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Be­ reitstellung von Verfahren zum Nachweis und zur Messung der vorliegend offenbarten Modulatoren der Gewichtskontrolle als Mittel zur effektiven Diagnose und zur Überwachung von patholo­ gischen Zuständen, bei denen die Variation in der Menge derarti­ ger Modulatoren ein charakterisierendes Merkmal ist oder sein kann.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Be­ reitstellung eines Verfahrens und eines damit im Zusammenhang stehenden Assaysystems zum Screening nach Substanzen, wie Arz­ neimitteln, Agenzien und dergleichen, welche potentiell wirksam sind bei der Nachahmung oder Hemmung der Aktivität der erfin­ dungsgemäßen Modulatoren in Säugern.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Be­ reitstellung eines Verfahrens für die Behandlung von Säugern zur Kontrolle des Körpergewichts und des Fettgehaltes von Säugern, und/oder zur Behandlung bestimmter pathologischer Zustände, bei denen anomale Ab- oder Zunahme des Körpergewichts ein charak­ terisierendes Merkmal sind.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung liegt in der Her­ stellung genetischer Konstrukte zur Verwendung in der Genthera­ pie und/oder pharmazeutischer Zusammensetzungen für vergleich­ bare therapeutische Verfahren, die die Modulatoren, Bindungs­ partner, oder Agenzien, die deren Produktion kontrollieren kön­ nen, oder die deren Aktivitäten nachahmen oder ihnen entgegen­ wirken können, umfassen oder auf ihnen basieren.

Andere Ziele und Vorteile ergeben sich für den Fachmann beim Studium der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die folgenden, der Veranschaulichung dienenden Zeichnungen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

In Fig. 1(A bis E) sind die aus der murinen OB-cDNA hergeleite­ te Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 1) und die abgeleitete Amino­ säuresequenz (SEQ ID NO: 2) angegeben. Eine 39 Basenpaare lange 5′-Leader-Sequenz wird gefolgt von einem vorhergesagten offenen Leserahmen für 167 Aminosäuren und einer ungefähr 3,7 kB langen 3′-nicht-translatierten Sequenz. (In den zuvor eingereichten Anmeldungen Nr. 08/347 563, eingereicht am 30. November 1994, und Nr. 08/438 431, eingereicht am 10. Mai 1995, wurde anschlie­ ßend eine zusätzliche 58 Basen lange 5′-nicht-kodierende Sequenz als Klonierungsartefakt ermittelt. Dieses Artefakt hat keine Auswirkung auf die kodierende Region, die 39 Basen lange 5′- nicht-kodierende Region gemäß Darstellung in Fig. 1, oder die 3′-nicht-kodierende Region des Gens.) Insgesamt etwa 2500 Basen­ paare der 3′-nicht-translatierten Sequenz sind dargestellt. Eine Analyse der vorhergesagten Proteinsequenz durch Beobachtung und Anwendung des SigSeq-Computerprogramms zeigt die Anwesenheit einer Signalsequenz (unterstrichen). Eine Mikroheterogenität der cDNA wurde festgestellt, da ungefähr 70% der cDNAs am Kodon 49 ein Glutaminkodon aufwiesen, 30% jedoch nicht (s. Fig. 5 und 6, unten). Diese Aminosäure ist unterstrichen wie auch das Argi­ ninkodon, welches in CS7BL/6J ob/ob-Mäusen (1J-Mäusen) mutiert ist.

In Fig. 2(A und B) ist die von der menschlichen OB-cDNA abge­ leitete Nukleinsäuresequenz dargestellt (SEQ ID NO: 3). Die Nu­ kleotide sind von 1 bis 701 mit einer Startstelle am Nukleotid 46 und einer Termination am Nukleotid 550 numeriert.

In Fig. 3 ist die von dem mit der Nukleinsäuresequenz der Fig. 2A und B korrespondierenden humanen OB-Gen abgeleitete voll­ ständige Aminosäuresequenz angegeben (SEQ ID NO: 4). Die Amino­ säuren sind von 1 bis 167 numeriert. Eine Spaltstelle für die Signalsequenz ist nach der Aminosäure 21 (Ala) lokalisiert, so daß sich das reife Protein von der Aminosäure 22 (Val) bis zur Aminosäure 167 (Cys) erstreckt.

In Fig. 4 ist ein Vergleich der murinen (SEQ ID NO: 2) und der humanen (SEQ ID NO: 4) abgeleiteten Aminosäuresequenzen darge­ stellt. Die Sequenz der von dem humanen OB abgeleiteten Amino­ säuresequenz war zu derjenigen der Maus in hohem Maße homolog. Konservierte Veränderungen sind durch Unterstreichung und nicht­ konservierte Veränderung durch ein Sternchen gekennzeichnet. Das variable Glutaminkodon ist unterstrichen, wie auch die Position der Nonsense-Mutation in CS7BL/6J ob/ob (1J)-Mäusen. Insgesamt gibt es eine 83%-ige Identität auf der Aminosäureebene, obgleich lediglich 8 Substitutionen zwischen dem Valin am Kodon 22 (un­ mittelbar stromabwärts des Beginns der Signalsequenz) und dem Cystein an der Position 117 gefunden wurden.

In Fig. 5 ist die von dem murinen OB-Gen gemäß Fig. 3 abge­ leitete vollständige Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5) angegeben, der jedoch das Glutamin an der Position 49 fehlt. Die Aminosäu­ ren sind von 1 bis 166 numeriert. Eine Spaltstelle für die Sig­ nalsequenz ist nach der Aminosäure 21 (Ala) (und daher vor der Deletion des Glutamins an Position 49) lokalisiert, so daß sich das reife Protein von der Aminosäure 22 (Val) bis zur Aminosäure 166 (Cys) erstreckt.

In Fig. 6 ist die von dem in Fig. 4 dargestellten humanen OB- Gen abgeleitete vollständige Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 6) dargestellt, der jedoch das Glutamin an der Position 49 fehlt. Die Aminosäuren sind von 1 bis 166 numeriert. Eine Spaltstelle für die Signalsequenz ist hinter der Aminosäure 21 (Ala) (und demgemäß vor der Deletion des Glutamins an Position 49) lokali­ siert, so daß sich das reife Protein von der Aminosäure 22 (Val) bis zur Aminosäure 166 (Cys) erstreckt.

Fig. 7. (A) Physikalische Kartierung der Lokalisierung von ob im murinen Chromosom, und die YAC- und P1-Klonierungskarten. "M und N" entsprechen MulI- und NotI-Restriktionsstellen. Die Zif­ fern entsprechen einzelnen Tieren, welche hinsichtlich der ob- Region bei den untersuchten 1606 Meiosen rekombinant waren. Met, Pax 4, D6Rck39, D6Rck13 und Cpa beziehen sich auf Bereiche in der ob-Region, die an die DNA-Sonden binden. YACs wurden iso­ liert unter Verwendung von D6Rck13 und Pax4 als Sonden, und die Enden wurden rekonstituiert unter Anwendung von Vectorette-PCR und/oder Plasmidendgewinnung und wiederum zur Isolierung neuer YACs verwendet. (B) Das resultierende YAC-Contig. Eines der YACs in diesem Contig, Y902A0925, war chimär. Jede der zur Bestimmung des Genotyps der rekombinanten Tiere eingesetzten Sonden ist in Klammern angegeben. (6) korrespondiert mit YAC 107; (5) korres­ pondiert mit M16(+) (oder M16(pLUS)); (4) korrespondiert mit adu(+); (3) korrespondiert mit aad(pICL); (2) korrespondiert mit 53(pICL); und (1) korrespondiert mit 53(+). (C) Das P1-Con­ tig der Klone des Bacteriophagen P1, isoliert mit ausgewählten YAC-Endsonden. Das ob-Gen wurde isoliert in einem P1-Klon, wel­ cher unter Verwendung des distalen Endes von YAC YB6S2F12 iso­ liert wurde (Ende (4))(vorliegend alternativ bezeichnet mit adu(+)).

In Fig. 8 ist eine Photographie einer Ethidiumbromidfärbung von 192 unabhängigen Isolaten aus dem vierten Exon-Trapping-Expe­ riment dargestellt, die mittels PCR amplifiziert und charakteri­ siert wurden.

Die Fig. 9 ist eine Photographie einer Ethidiumbromidfärbung von PCR-amplifizierten Klonen, von denen erwartet wird, daß sie ob aufweisen. Jeder der 7 Klone, welcher das Artefakt nicht aufwies, wurde unter Anwendung von PCR reamplifiziert und in einem 1%igen Agarosegel in TBE elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Größenmarker (die nicht bezif­ ferte Spur ganz links) ist die handelsüblich erhältliche "1kB- Leiter". Spur 1 - Klon 1D12, enthaltend eine "HIV-Sequenz". Spur 2 - Klon 1F1, ein neuer Klon außerhalb der ob-Region. Spur 3 - Klon 1H3. Spur 4 - Klon 2B2, welcher identisch ist mit 1F1. Spur 5 - Klon 2G7, welcher ein ob-Exon enthält. Spur 6 - Klon 2G11, welcher identisch ist mit 1F1. Spur 7 - Klone 2H1, welcher kein Insert enthält.

In Fig. 10 ist die Sequenz des Klons 2G7 (SEQ ID NO: 7) darge­ stellt, welche ein Exon einschließt, das für einen Teil des OB- Gens kodiert. Die zur Amplifizierung dieses Exons verwendeten Primersequenzen sind in der Figur eingerahmt (SEQ ID NOS: 8 und 9).

Fig. 11. (A) Reverse Transkriptions-PCR-Analyse von mRNA aus verschiedenen Geweben derselben Maus mit den 2G7-Primern und Actin-Primern. Die Reaktionen zur RT-PCR erfolgten unter Verwen­ dung von 100 ng Gesamt-RNA, reverse transkribiert mit oligo-(dT) als Primer für die Synthese des cDNA-Erststranges. Eine PCR-Am­ plifikation wurde durchgeführt über 35 Zyklen mit 94°C Denatu­ rierung für 1′; 55°C Hybridisierung für 1′; und 72°C Extensio­ nen für 2′ mit einer 1′ zweiten Autoextension pro Zyklus. Die Produkte der RT-PCR wurden in einem 2%igen Agarosegel mit nied­ rigem Schmelzpunkt in 1× TBE-Puffer aufgetrennt. (B) Northern- Blot von mRNA aus verschiedenen Organen der Maus unter Verwen­ dung von mittels PCR markiertem 2G7 als Sonde. Aus jedem der Gewebe wurden 10 µg Gesamt-RNA in einem Agarosegel mit Formalde­ hyd elektrophoretisch aufgetrennt. Die Sonde wurde hybridisiert bei 65°C in Rapid Hybe (Amersham). Die autoradiographischen Signale wurden nach einer Expositionsdauer von 1 Stunde sicht­ bar; das dargestellte Experiment war das Ergebnis einer Expo­ sitionsdauer von 24 Stunden.

Fig. 12. (A) Eine Ethidiumbromidfärbung einer RT-PCR-Reaktion mit RNA von Fettzellen (weißes Fettgewebe) aus jedem der aufge­ führten Mäusestämme. Für jede Probe wurde die Gesamt-RNA (100 ng) unter Verwendung von Oligo(dT) und reverser Transkriptase revers transkribiert, und die resultierende einzelsträngige cDNA wurde mittels PCR amplifiziert mit den 2G7-Primern (untere Ban­ den) oder Actin-Primern (obere Banden). Sowohl die 2G7- als auch die Actin-Primer wurden in derselben PCR-Reaktion eingesetzt. Die Produkte wurden auf ein 1%iges Agarose-TBE-Gel geladen. (B) Northern-Analyse korrespondierend mit (A). 10 µg Fettzellen (weißes Fettgewebe)-RNA aus jedem der angegebenen Stämme wurden aufgetrennt und mit der PCR-markierten 2G7-Sonde wie in der obigen Fig. 11B sondiert. Im Vergleich zu mageren Vertretern desselben Wurfes war bei der RNA des weißen Fettgewebes vom CS7BL/6J ob/ob (1J)-Stamm ein ungefähr 20facher Anstieg der Menge an 2G7-mRNA vorhanden. Sowohl bei den RT-PCR- als auch bei den Northern-Experimenten gab es selbst nach einer Expositions­ dauer von 2 Wochen kein nachweisbares Signal bei der 2G7-RNA aus den SM/Ckc-+^Dacob^2J/ob^2J (2J)-Mäusen. Eine Autoradiographie nach Expositionsdauer von 24 Stunden ist dargestellt. Derselbe Filter wurde zu einer Actinsonde hybridisiert (unterer Teil der Dar­ stellung).

Die Fig. 13 ist eine Northern-Analyse von zusätzlichen 2J-Tie­ ren und Kontrolltieren, die das Fehlen der ob-mRNA bei 2J-Tieren bestätigt. Die Northern-Analyse wurde wie in den Fig. 11 und 12 durchgeführt. In diesem Fall war die Kontroll-RNA ap2, ein fettspezifisches Transkript. Die variierende Dichte der ap2- Banden ist nicht signifikant.

In Fig. 14 werden die DNA-Sequenzen der CS7BL/6J (normalen)- und der CS7BL/6J ob/ob (1J)-Mäuse im Bereich der Punktmutation verglichen, welche zur Einführung eines prämaturen Stopkodons (Nonsense-Mutation) in der cDNA des mutanten Stammes führt. Die ob/ob-Mäuse wiesen eine C→T-Mutation auf, wodurch ein Argi­ ninrest an der Position 105 verändert wurde. Dieser Basenaus­ tausch ist in Form eines Ausdruckes des automatisierten DNA- Sequenziergerätes dargestellt. Die RT-PCR erfolgte unter Verwen­ dung von RNA aus weißem Fettgewebe von beiden Stämmen (+/+ und ob/ob) unter Verwendung von Primern von den 5′- und 3′-nicht translatierten Regionen. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden mit­ tels Gel gereinigt und direkt manuell und unter Verwendung eines automatisierten Sequenziergerätes 373A von Applied Biosystems, Inc. mit Primern entlang beiden Strängen der kodierenden Sequenz sequenziert.

Fig. 15. (A) Southern-Blot von genomischer DNA von jedem der aufgeführten Mäusestämme. Ungefähr 5 µg DNA (abgeleitet von ge­ nomischer DNA, hergestellt aus Leber, Niere oder Milz) wurden einem Restriktionsverdau mit dem angegebenen Restriktionsenzym unterworfen. Die DNA wurde anschließend in einem 1%igen Agarose- TBE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und mit PCR-markiertem 2G7 sondiert. Der Restriktionsverdau mit BglII ergab eine Zunahme in der Größe eines ungefähr 9 kB (das größte) BglII-Fragments in der SM/Ckc-+^Dacob^2J/ob^2J (2J)-DNA. RFLPs waren mit keinen anderen Restriktionsenzymen nachweisbar. Eine vorläufige Restriktions­ kartierung von genomischer DNA ergab, daß die polymorphe BglII- Stelle etwa 7 kB stromaufwärts der Transkriptionsstartstelle liegt. Keines der anderen untersuchten Enzyme erstreckt sich bis hinter die mRNA-Startstelle. (B) Segregation eines BglII-Poly­ morphismus im SM/Ckc-+^Dacob^2J/ob^2J (2J)-Stamm. Der Genotyp von sechs adipösen und fünf mageren Nachkommen derselben Generation der kongenetischen SM/Ckc-+^Dacob^2J/ob^2J (2J)-Kolonie wurde durch Ermittlung der BglII-Polymorphismen wie in (A) dargestellt, bestimmt. Sämtliche der phänotypisch adipösen Tiere waren hin­ sichtlich des größeren Allels des polymorphen BglII-Fragments homozygot. Die DNA in der "Kontroll"-Spur wurde hergestellt aus einer nicht-verwandten SM/Ckc-+^Dac+/+-Maus, die getrennt von der SM/Ckc-+^Dacob^2J/ob^2J-Kolonie gezogen wurde.

Die Fig. 16 ist ein Southern-Blot von mit EcoRI gespaltener genomischer DNA der aufgeführten Spezies unter Verwendung einer OB-cDNA als Sonde (d. h. ein Zooblot). Hybridisierungssignale waren in jeder Wirbeltierprobe nachweisbar, selbst nach einer Hybridisierung unter moderater Stringenz. Die Katzen-DNA war in diesem Experiment leicht degradiert. Die restringierte DNA wurde in einem 1%igen Agarose-TBE-Gel aufgetrennt und zum Sondieren auf eine Imobilon-Membran überführt. Der Filter wurde bei 65°C hybridisiert und 2× SSC/0,2% SDS bei 65°C zweimal für 20 Minuten lang gewaschen und 3 Tage lang unter Verwendung eines Kodak (Rochester, N.Y.) X-OMAT-Films exponiert.

Die Fig. 17 zeigt die Expressionsklonierungsregion des Vektors pET-15b (Novagen) (SEQ ID NOS.: 11 und 12).

Die Fig. 18 zeigt eine Analyse des Eluats aus einer His-binden­ den Harz (Ni)-Säule für eine Fusion des rekombinanten reifen murinen OB mit einem His-Tag (A) und eine Fusion des reifen humanen OB mit einem His-Tag (B). Bakterien wurden transformiert mit den Vektoren pETM9 bzw. pETH14. Bei Induktion mit 1 mM IPTG unter optimalen Bedingungen waren transformierte Bakterien in der Lage, 100-300 µm/ml OB-Fusionsprotein zu bilden, und zwar primär in den Einschlußkörpern. Die Einschlußkörper wurden mit 6M Guanidin-HCl oder Harnstoff löslich gemacht, und das Fusions­ protein (im Überstand der Lyse vorhanden) wurde auf eine His- bindende Harz (Ni)-Säule in 10 ml 1× Bindungspuffer mit Harn­ stoff geladen. Die Säule wurde stufenweise mit 5 ml Aliquots von 20 µM, 60 µM und 300 µM Imidazol und schließlich mit Strip-Puf­ fer eluiert. Die Aliquots wurden auf Anwesenheit des OB-Fusions­ polypeptids auf einem 15%igen Acrylamidgel analysiert. Jede Spur enthält das Äquivalent von 100 µl bakteriellem Extrakt.

Fig. 19. (A) In vitro-Translation von OB-RNA. Eine humane OB- cDNA wurde in dem Vektor pGEM subkloniert. Das Plasmid wurde linearisiert und der RNA-Plus-Strang wurde unter Verwendung der Polymerase Sp6 synthetisiert. Die in vitro synthetisierte RNA wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von mikrosomalen Membranen der Bauchspeicheldrüse des Hundes translatiert. Nach in vitro- Translation wurde ein Translationsprodukt von ungefähr 18 kD festgestellt. Die Zugabe von mikrosomalen Membranen zu der Reak­ tion führte zum Auftauchen eines zweiten Translationsprodukts, welches etwa 2 kD kleiner als das primäre Translationsprodukt war. Die Größe des Translationsprodukts von Interleukin-1α-RNA, welchem eine kodierte Signalsequenz fehlt, wurde durch die Zu­ gabe von mikrosomalen Membranen nicht verändert. Diese Daten zeigten die Anwesenheit einer funktionellen Signalsequenz. (B) In vitro-Translation in Gegenwart oder Abwesenheit von Proteina­ se K. Die Behandlung mit Protease führte zu einer vollständigen Proteolyse des primären Translationsprodukts von 18 kD, während die prozessierte Form von 16 kD nicht beeinflußt wurde. Durch Permeabilisierung des Mikrosoms mit 0,1% TRITON-X100 wurde die prozessierte Form gegenüber Protease sensitiv. Diese Ergebnisse zeigen, daß das Produkt in das Lumen des Mikrosoms translatiert worden war.

Fig. 20. (A bis E) Die Sequenz des humanen OB-Gens (SEQ ID NOS: 22 und 24). (F) Eine schematische Darstellung des murinen OB-Gens. (G) Eine schematische Darstellung des humanen OB-Gens.

In (F) und (G) sind die Start- und Stopkodons unterstrichen. Es gibt keinen Hinweis darauf, daß das humane Gen über ein zum ersten Intron der Maus homologes erstes Intron verfügt, aber dessen Existenz kann nicht ausgeschlossen werden.

Fig. 21 zeigt eine schematische Darstellung einer der zur Her­ beiführung einer rekombinanten Expression von OB in Pichia-Hefe angewendeten Klonierungstrategien. (A) Der Expressionsvektor von OB mit einer Signalsequenz für den α-Mating-Faktor. (B) Schema­ tische Darstellung der Struktur des rekombinanten Fusionspro­ teins, einschließlich der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 26), welche die XhoI-Stelle und putative KEX-2- und STE-13-Spaltstel­ len sowie die überschüssigen N-terminalen Aminosäuren zeigt, die nach Spaltung mit KEX-2 vorliegen (SEQ ID NO: 27). (C) Eine al­ ternative Strategie zur Herstellung eines reifen OB beinhaltet die Herstellung eines Konstrukts mit einer Aminosäuresequenz, die mit einer XhoI-Spaltstelle und einer KEX-2-Spaltstelle un­ mittelbar stromaufwärts der reifen OB-Polypeptidsequenz (SEQ ID NO: 28) korrespondiert.

Fig. 22. Alternative Expressionsstrategie in Pichia. (A) Ex­ pressionsvektor einer von dem pET-Expressionssystem übernommenen OB-Fusion mit einem His-Tag unter Kontrolle der Signalsequenz für den α-Mating-Faktor (SEQ ID NO: 33). (B) Schematische Dar­ stellung der Struktur des rekombinanten OB-Fusionsproteins, welches einen His-Tag enthält, und die Signalsequenz für den α- Mating-Faktor, putative KEX-2- und STE-13-Schnittstellen, den His-Tag, und eine Thrombin-Spaltstelle einschließt, und OB mit drei überschüssigen N-terminalen Aminosäureresten ergeben würde.

Fig. 23. (A) PAGE-Analyse der Expression von murinem OB (beide mikroheterogene Formen, d. h. mit und ohne Gln 49) in transfor­ mierter Pichia-Hefe. Die erwartete Bande von ungefähr 16 kD ist in der Kulturflüssigkeit der transformierten Hefe (zweite und dritte Spur) sichtbar, nicht aber in der Kulturflüssigkeit von nicht-transformierter Hefe (erste Spur). (B) PAGE-Analyse von partiell über Carboxymethylcellulose, einem schwachen Kationen­ austauscher, gereinigtem rekombinanten OB-Polypeptid. Eine Bande von etwa 16 kD ist sehr deutlich sichtbar in den Fraktionen 3 und 4 der Säule, welche mit 250 mM NaCl eluiert wurde. Spur 1 - geladene Probe; Spur 2 - Durchfluß; Spuren 3-5 - mit 250 mM NaCl eluierte Fraktionen.

Die Fig. 24 zeigt, daß das OB-Protein im Plasma der Maus zirku­ liert. (A) Immunpräzipitationen von Mäuseblut. 0,5 ml Plasma der Maus wurden mit unkonjugierter Sepharose vorgeklärt und über Nacht mit immungereinigten Anti-OB-Antikörpern, konjugiert an Sepharose 4B-Kügelchen, inkubiert. Das Immunpräzipitat wurde auf einem 15%igen SDS-PAGE-Gel aufgetrennt, übertragen und einem WesternBlot mit einem Anti-OB-Antikörper unterworfen. Das Pro­ tein migrierte mit einem Molekulargewicht von ungefähr 16 kD bis zur selben Position wie das in Hefe exprimierte reife OB-Protein der Maus. Das Protein war im Plasma von CS7BL/6J ob/ob-Mäusen nicht vorhanden und die Menge stieg im Plasma von CS7BLB/Ks db/db-Mäusen im Vergleich zu Wildtyp-Mäusen 10fach an. Von den db-Mäusen ist angenommen worden, daß sie das OB-Protein sekundär zur Resistenz gegenüber seinen Wirkungen überproduzieren. (B) Erhöhte Mengen an OB in fetten Ratten. Die fette Ratte ist als Ergebnis einer rezessiven Mutation auf dem Chromosom 5 der Ratte adipös. Die genetischen Daten deuten auf einen Defekt in demsel­ ben Gen hin, welches bei db-Mäusen mutiert ist. Das Plasma von fetten Ratten und mageren Vertretern desselben Wurfes wurde mittels Western-Blot aufgetrennt und immunpräzipitiert. Ein 20facher Anstieg der zirkulierenden Menge an OB wird in den mu­ tierten Tieren festgestellt. (C). Quantifizierung des OB-Pro­ teins im Plasma der Maus. Steigende Menge des rekombinanten Mäuseproteins wurden 100 µl Plasma von ob-Mäusen zugegeben und immunpräzipitiert. Die Signalstärke auf Western-Blots wurde mit derjenigen von 100 µl Plasma von Wildtyp-Mäusen verglichen. Eine lineare Zunahme der Signalstärke wurde mit steigenden Mengen an rekombinantem Protein beobachtet, wodurch gezeigt wird, daß die Immunpräzipitationen unter Bedingungen eines Antikörperüber­ schusses durchgeführt wurden. Ähnliche Signale wurden in der Plasmaprobe des Wildtyps und der Probe mit 2 ng rekombinantem Protein beobachtet, wodurch gezeigt wird, daß die im Plasma der Maus zirkulierende Menge ungefähr 20 ng/ml beträgt. (D) OB-Pro­ tein in Fettgewebeextrakten. Zytoplasmatische Extrakte aus Fett­ gewebe der Maus wurden von db- und Wildtyp-Mäusen hergestellt. Western-Blots zeigten erhöhte Mengen des Proteins von 16 kD in Extrakten, die von db-Mäusen hergestellt worden waren.

Die Fig. 25 zeigt, daß das OB-Protein im menschlichen Plasma in variablen Mengen zirkuliert. (A) Western-Blots von menschlichem Plasma. Die Plasmaproben wurden von 6 mageren Freiwilligen er­ halten. Durch Immunpräzipitation und Western-Blotting wurde die Anwesenheit eines immunreaktiven Proteins von 16 kD ermittelt, welches hinsichtlich seiner Größe identisch mit einem rekombi­ nanten, in Hefe exprimierten humanen Protein von 146 Aminosäuren ist. Variable Mengen des Proteins wurden in jeder der 6 Proben beobachtet. (B) Ein ELISA (Enzym-gekoppelter Immunoassay) für das humane OB. Mikrotiterplatten wurden mit immungereinigten Anti-Human-OB-Antikörpern beschichtet. Bekannte Mengen des re­ kombinanten Proteins wurden den Platten zugegeben und nachgewie­ sen unter Verwendung von immungereinigten, biotinylierten Anti- OB-Antikörpern. Die Absorption bei 414 nm wurde gegen bekannte Konzentrationen von OB aufgetragen, um eine Standardkurve zu erhalten. Die resultierende Standardkurve zeigte, daß der Assay in der Lage war, 1 ng/ml oder mehr des humanen OB-Proteins nach­ zuweisen. (C) Quantifizierung des OB-Proteins in menschlichem Plasma. Ein ELISA-Immunoassay wurde durchgeführt unter Verwen­ dung von 100 µl Plasma von den 6 mageren Freiwilligen und den in Abbildung B verwendeten Standards. Die Mengen des OB-Proteins lagen im Bereich zwischen 2 ng/ml in HP1 bis 15 ng/ml in HP6.

Diese Daten korrelierten mit den Daten des Western-Blots gemäß Abbildung A.

Die Fig. 26 zeigt, daß das OB-Protein inter- oder intramoleku­ lare Disulfidbrücken ausbildet. (A) Western-Blots unter reduzie­ renden und nicht-reduzierenden Bedingungen. Die Western-Blots von Plasma der Maus und des Menschen wurden wiederholt mit und ohne Zugabe von Reduktionsmitteln zum Probenpuffer. Wenn dem Probenpuffer kein β-Mercaptoethanol zugegeben wird, migrieren Immunpräzipitate von db-Plasma mit einem geschätzten Molekular­ gewicht von 16 kD und 32 kD. Die Zugabe von β-Mercaptoethanol zum Puffer führt zum Verschwinden des 32 kD-Anteils (s. Fig. 24). Dieses Ergebnis wiederholt sich, wenn das Protein der Maus in der Hefe Pichia pastoris exprimiert wird. In diesem Fall migriert das OB-Protein der Maus in der Position eines Dimers. Unter reduzierenden Bedingungen migriert das gereinigte rekom­ binante Protein der Maus mit einem geschätzten Molekulargewicht von 16 kD, was darauf hindeutet, daß die molekulare Form von 32 kD das Ergebnis einer oder zweier intermolekularer Disulfid­ bindungen ist. Das in vivo und in Pichia pastoris exprimierte humane Protein migriert sowohl unter reduzierenden als auch unter nicht-reduzierenden Bedingungen mit einem Molekulargewicht von 16 kD (Daten nicht gezeigt). (B) Das in Hefe exprimierte humane Protein enthält eine intramolekulare Disulfidbindung. Im Falle der Expression im Expressionssystem von Pichia pastoris verfügen sekretierte Proteine im allgemeinen über ihre korrekte Konformation. Das reife humane Protein von 146 Aminosäuren wurde in Pichia pastoris exprimiert und aus dem Hefemedium mittels eines zweistufigen Reinigungsverfahrens unter Anwendung von IMAC und Gelfiltration gereinigt. Das gereinigte rekombinante Protein wurde vor und nach Spaltung mit Bromcyan einer Massenspektro­ metrie zugeführt. Bromcyan spaltet am Carboxyterminus von Met­ hioninresten. Das Molekulargewicht des rekombinanten Hefepro­ teins betrug 16 024 ± 3 Da (berechnetes Molekulargewicht = 16 024 Da). Bromcyan spaltet nach den 3 Methioninen in der Pro­ teinsequenz bei den Aminosäuren 75, 89 und 157. Das Bromcyan- Fragment, welches mit einer Masse von 8435,6 Da gemessen wurde, korrespondiert mit den Aminosäuren 90-157 und 158-167, verbunden durch eine Disulfidbindung zwischen Cys-117 und Cys-167 (berech­ netes Molekulargewicht = 8434,5 Da) N.D. = nicht nachgewiesen.

Die Fig. 27 zeigt die Herstellung des bioaktiven rekombinanten Proteins. Die mit den 145 Aminosäuren des reifen OB-Proteins der Maus korrespondierende Nukleotidsequenz wurde in den Expres­ sionsvektor pET 15b kloniert. Dieser pET-Vektor insertiert einen Polyhistidintrakt (His-Tag) stromaufwärts der klonierten Se­ quenz, wodurch eine wirksame Reinigung unter Anwendung der immo­ bilisierten Metall-Affinitäts-Chromatographie (IMAC) ermöglicht wird. Das rekombinante bakterielle Protein war nach bakterieller Lyse anfänglich in der unlöslichen Membranfraktion enthalten. Die Membranfraktion wurde unter Verwendung von Guanidinhydro­ chlorid löslich gemacht und auf eine IMAC-Säule geladen. Das Protein wurde stufenweise mit steigenden Konzentrationen an Imidazol wie dargestellt eluiert. Das eluierte Protein wurde renaturiert und mit Thrombin behandelt, um den His-Tag zu ent­ fernen, wie unten ausgeführt wird. Die endgültige Ausbeute an löslichem Protein betrug 45 ng/ml Bakterienkultur.

In Fig. 28 sind die biologischen Effekte des OB-Proteins darge­ stellt. Zeitverlauf der Nahrungsaufnahme (Abbildungen A-C) und des Körpergewichts (Abbildungen D-F). Gruppen von 10 Tieren erhielten täglich entweder intraperitoneale Injektionen des OB- Proteins in einer Dosis von 5 mg/kg/Tag (schwarze Kästchen), tägliche Injektionen von PBS (schwarze Kreise) oder keine Be­ handlung (schwarze Dreiecke). Die Behandlungsgruppen schlossen CS7BL/6J ob/ob-Mäuse (Abbildungen A und D), CS7BL/Ks db/db-Mäuse (Abbildungen B und E) und CBA/J+/+-Mäuse (Abbildungen C und F) ein. Die Nahrungsaufnahme der Mäuse wurde täglich gemessen und das Körpergewicht wurde in Zeitabständen von 3 bis 4 Tagen wie angegeben aufgezeichnet. (Die Skala des Körpergewichts in Gramm ist zwischen den Wildtyp-Mäusen einerseits und den ob- und db- Mäusen andererseits verschieden). Die Nahrungsaufnahme der ob- Mäuse, die das Protein erhalten hatten, war nach der ersten Injektion reduziert und stabilisierte sich nach dem vierten Tag bei einem Wert entsprechend etwa 40% des Wertes, der bei der schein-injizierten Gruppe beobachtet worden war (p<0,001). Das Körpergewicht dieser Tiere nahm durchschnittlich 1,3 g/Tag ab und stabilisierte sich nach 3 Wochen auf einen Wert, der unge­ fähr 60% des Ausgangsgewichts betrug (p<0,0001). Bei db-Mäusen ließ sich keine Wirkung des Proteins nachweisen. An zwei früh­ zeitigen Zeitpunkten wurden in CBA/J-Mäusen kleine aber signifi­ kante Auswirkungen auf das Körpergewicht beobachtet (p<0,02). Der Standardfehler einer jeden Messung wird durch einen Quer­ strich angezeigt und die statistische Signifikanz dieser Ergeb­ nisse ist in Tabelle 1 dargestellt.

In Fig. 29 sind die Ergebnisse der Paarfütterung von ob-Mäusen dargestellt. (A) Eine Gruppe von vier CS7BL/6J ob/ob-Mäusen wurde mit einer Nahrungsmenge gefüttert, die derjenigen ent­ sprach, welche von der Gruppe der ob-Mäuse, die rekombinantes Protein erhielten, aufgenommen wurde. Der Gewichtsverlust wurde für beide Gruppen nach 5, 8 und 12 Tagen berechnet. Die unter Futterbeschränkung gehaltenen Mäuse verloren weniger Gewicht (schraffierte Säule) als die ob-Mäuse, die Protein erhielten (schwarze Säule) (p<0,02). Dieses Ergebnis zeigt, daß der ge­ wichtsreduzierende Effekt des OB-Proteins das Ergebnis von Wir­ kungen auf sowohl die Nahrungsaufnahme als auch auf den Ener­ gieverbrauch ist. (B) Photographie einer behandelten ob-Maus. Dargestellt sind zwei CS7BL/6J ob/ob-Mäuse. Die Maus auf der linken Seite erhielt PBS und wog 65 g, was dem Anfangsgewicht entsprach. Die Maus auf der rechten Seite erhielt tägliche In­ jektionen des rekombinanten OB-Proteins. Das Ausgangsgewicht dieses Tieres war ebenfalls 65 g, und das Gewicht nach einer dreiwöchigen Proteinbehandlung betrug 38 g. (C) Lebern von be­ handelten und unbehandelten ob-Mäusen. Dargestellt sind Lebern von behandelten und unbehandelten CS7BL/6J ob/ob-Mäusen. Die Leber von der Maus, die PBS erhalten hatte, wies das grobe Er­ scheinungsbild einer Fettleber auf und wog 5,04 g. Die Leber der Maus, die das rekombinante OB-Protein erhalten hatte, besaß ein normales Erscheinungsbild und wog 2,23 g.

Die Fig. 30 zeigt die in situ-Hybridisierung von ob an Fett­ gewebe. Sense- und Antisense-ob-RNA wurde in vitro markiert unter Verwendung von Sp6- und T7-Polymerase und Digoxigenin. Die markierten RNAs wurden mit in Paraffin eingebetteten Abschnitten von Fettgewebe aus epididymalen Fettpolstern von 8 Wochen alten C57BL/Ks-Mäusen (markierter Wildtyp) und CS7BL/Ks db/db-Mäusen (markiertes db) hybridisiert. In der Figur erscheinen die Lipid­ tröpfchen als ungefärbte Vakuolen innerhalb von Zellen. Das Cytoplasma ist eine dünne Linie an der Peripherie der Zellen und ist von der Zellmembran nicht unterscheidbar. Eine Hybridisie­ rung mit allen Adipozyten in dem Feld wurde in Wildtyp-Abschnit­ ten nur unter Verwendung der Antisense-Sonde nachgewiesen, und stark erhöhte Werte wurden in den Gewebeabschnitten von den db/db-Tieren beobachtet.

Die Fig. 31 zeigt, daß die OB-RNA in Adipozyten in vivo und in vitro exprimiert wird. Gesamt-RNA (10 µg) aus mehreren verschie­ denen Quellen wurde elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einer ob-Sonde hybridisiert. Zunächst wurden Unterschiede des Zellauftriebs nach Kollagenaseverdau zur Reinigung von Adi­ pozyten ausgenutzt. Die OB-RNA war lediglich in der Adipozyten­ fraktion vorhanden. Die Spur S zeigt die stromavaskuläre Frak­ tion und A zeigt die Adipozytenfraktion. Ferner zeigt die Spur U, daß OB-RNA in den undifferenzierten 3T3-442 Präadipozytenzel­ len nicht exprimiert wurde. Differenzierte Adipozyten von diesen Zellinien exprimierten deutlich nachweisbare Mengen an OB-mRNA (Spur D).

Die Fig. 32 zeigt, daß OB-RNA in sämtlichen Fettgewebedepots exprimiert wird. Sämtliche der untersuchten Fettgewebedepots exprimierten ob-RNA. Das inguinale Fettpolster exprimierte in gewisser Weise geringere RNA-Mengen, obgleich es bei verschiede­ nen Experimenten eine Variabilität hinsichtlich der Signalstär­ ken gab. (Fig. 31A) Spuren: (1) epididymale, (2) inguinale, (3) abdominale, (4) parametrane Fettpolster. Braunes Fettgewebe exprimierte ebenfalls eine geringe Menge an OB-RNA. (Fig. 31B) Die Rate der Expression von OB in braunem Fettgewebe war bei Tieren, die eine Woche lang bei 4°C gehalten wurden, unverän­ dert, während der Überfluß der für braunes Fettgewebe spezifi­ schen UCP-RNA, bekannt als kälteinduzierbar, 5fach anstieg.

Die Fig. 33 zeigt die Expression von OB-RNA in db/db- und mit Gold-Thioglukose behandelten Mäusen. Gesamt-RNA von den parame­ tranen Fettpolstern von mit Gold-Thioglukose (GTG) und db/db­ behandelten Mäusen wurde elektrophoretisch aufgetrennt und einem Northern-Blot zugeführt. Es ist bekannt, daß die Verabreichung von GTG in einer Einzeldosis durch Induktion spezifischer hy­ pothalamischer Läsionen Obesität verursacht. (A) Weibliche CBA- Mäuse wurden im Alter von 1 Monat mit GTG (0,2 mg/g) behandelt, was bei behandelten Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren (<5 g) zu einer Zunahme von < 20 g führte. (B) Hybridisierung einer OB-Sonde mit RNA von db/db- und von mit GTG behandelten Mäusen ergab einen 20fachen Anstieg des Überflusses an ob-RNA im Vergleich zu Kontroll-RNA (Actin oder GAPDH).

Die Fig. 34 zeigt eine Northern-Blot-Analyse von menschlicher RNA. Die 10 mg Gesamt-RNA von menschlichem Fettgewebe (FAT, Abbildung A) und 2 mg poly(A)⁺-RNA von anderen menschlichen Gewe­ ben (Abbildung B) enthaltenden Northern-Blots wurden mit humanen ob- oder humanen β-Actin-Sonden wie angegeben hybridisiert. Bei der Gesamt-RNA des Fettgewebes wurde ein intensives Signal bei ungefähr 4,5 kB beobachtet. Die Hybridisierung mit der poly(A)⁺- RNA ergab nachweisbare Signale im Herzen (HE) und der Plazenta (PL), wohingegen OB-RNA im Gehirn (BR), der Lunge (LU), der Leber (LI), den Skelettmuskeln (SM), der Niere (KI) und dem Pankreas (PA) nicht nachgewiesen wurde. Für jeden Fall ist die Dauer der autoradiographischen Exposition angegeben. Es wird darauf hingewiesen, daß die Entstehung der bei plazentaler RNA beobachteten niedermolekularen Banden (z. B. alternatives Spleißen, RNA-Abbau) nicht bekannt ist.

In Fig. 35 ist das YAC-Contig dargestellt, welches das humane OB-Gen und 8 Mikrosatellitenmarker enthält. Die auf YAC basie­ rende STS-Gehaltskartierung der Region des Chromosoms 7, welches das humane OB-Gen enthält, ist dargestellt, gemäß Ableitung durch SEGMAP/Version 3.29 [Green et al., PCR Methods Applic., 1: 77-90 (1991)]. Die 19 in einzigartiger Weise geordneten STSs (s. Tabelle 3) sind oben angegeben. Die 8 Mikrosatelliten-spezi­ fischen STSs sind mit Sternchen gekennzeichnet (s. Tabelle 4). Ebenfalls angegeben sind die mit den Pax4- und OB-Genen korre­ spondierenden STSs wie auch die vorhergesagten Positionen des Centromers (CEN) und des 7q-Telomers (TEL) im bezug auf das Contig. Jeder der 43 YAC-Klone ist mittels einer waagerechten Linie gekennzeichnet, wobei ihre Bezeichnungen links und ihre geschätzten YAC-Größen (in kB, gemessen durch Pulsfeld-Gelelek­ trophorese) in Klammer angegeben sind. Die Anwesenheit eines STS in einem YAC ist an der entsprechenden Position durch einen dunklen Kreis hervorgehoben. Wenn ein STS mit dem Insertende eines YACs korrespondiert, ist der entsprechende Kreis sowohl oben (nahe der STS-Bezeichnung) als auch am Ende des YACs, von dem es abgeleitet wurde, von einem Quadrat umgeben. Bei den 5 unten dargestellten YACs (unterhalb der waagerechten unterbro­ chenen Linie) wurden eine oder mehrere der erwarteten STSs (auf der Grundlage der etablierten STS-Reihenfolge) nicht nachgewie­ sen (gemäß Feststellung durch mindestens zweimalige Untersuchung der einzelnen YACs mit den entsprechenden STS-spezifischen PCR- Assays), und diese sind an den ent 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019531931 00004 99880sprechenden Positionen in Form offener Kreise gekennzeichnet. Die meisten YACs wurden aus einer hybriden, von Mensch- und Hamsterzellen abgeleiteten Bibliothek isoliert [Green et al., Genomics 25: 170-183 (1995)], wobei ihre ursprünglichen Bezeichnungen angegeben sind. Die übrigen YACs wurden aus vollständigen humanen, genomischen Bibliotheken iso­ liert, und ihre ursprünglichen Positionen innerhalb der Biblio­ thek sind in Tabelle 3 dargestellt. Die Bezeichnungen der 3 YACs (yWSS691, yWSS999 und yWSS2935), deren Kartierung gemäß FISH- Analyse 7q31.3 ergab, sind in Kästchen eingerahmt. Das Contig ist in seiner ′nicht-computerisierten′ Form dargestellt, in der die YAC-Größen nicht zur Abschätzung der Überlappungen oder der STS-Spacings von Klonen verwendet werden, und sämtliche der STSs sind daher in gleichem Abstand zueinander angeordnet. In der ′computerisierten′ Form, bei der die YAC-Größen verwendet wer­ den, um den relativen Abstand, welcher jedes Paar von benach­ barten STSs trennt, sowie das Ausmaß von Klonüberlappungen ab­ zuschätzen, scheint sich das gesamte YAC-Contig genau über 2 Mb zu erstrecken.

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Aufklärung und das Auf­ finden eines Proteins, welches vorliegend mit OB-Polypeptid oder Leptin bezeichnet wird, sowie von Nukleinsäuren, die für das Protein kodieren, einschließlich degenerierter Varianten der­ selben, z. B. solchen, die optimale Kodons für die Expression in einem bestimmten Expressionssystem einschließen, wobei das Pro­ tein die Fähigkeit zur Mitwirkung bei der Kontrolle des Körper­ gewichts von Säugern aufweist. Die betreffenden Nukleinsäuren repräsentieren die Kodierungssequenzen, die mit dem murinen und humanen OB-Polypeptid korrespondieren, von dem angenommen wird, daß es bei der Regulierung des Körpergewichts und der Adipositas eine entscheidende Rolle spielt. Die vorliegend vorgestellten Daten zeigen, daß das Polypeptidprodukt einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure von den Zellen sezerniert wird, welche diese ex­ primieren, und daß das Polypeptid als ein Hormon wirkt. Zusätz­ liche experimentelle Daten zeigen, daß das OB-Polypeptid bei der Behandlung der Obesität in Mäusen, die eine Mutation des ob-Gens aufweisen, sehr wirksam ist. Ferner bewirken hohe Bolusdosierun­ gen oder moderate kontinuierliche Dosierungen des OB-Polypeptids eine Gewichtsreduktion bei normalen (Wildtyp-) Mäusen.

Ferner zeigen die vorliegenden Beispiele, daß das OB-Polypeptid, alternativ bezeichnet mit "Leptin", im Plasma der Maus, der Ratte und des Menschen zirkuliert. Das Leptin fehlt im Plasma von ob/ob-Mäusen und ist in dem Plasma von db/db-Mäusen in 10fach höherer Konzentration, und im Plasma von fa/fa-Ratten in 20fach höherer Konzentration vorhanden. In äußerst signifikanter Weise führen tägliche Injektionen von rekombinantem Leptin zu einer dramatischen Verminderung der Körpermasse von ob/ob-Mäusen und zu einer signifikanten Beeinflussung des Körpergewichts von Wildtyp-Mäusen, jedoch zu keinen Auswirkungen auf db/db-Mäuse.

Nach einem weiteren Aspekt ist das OB-Polypeptid von einer Spe­ zies in anderen Spezies biologisch aktiv. Insbesondere ist das humane OB-Polypeptid in Mäusen aktiv.

Die vorliegende Erfindung betrifft primär die Identifizierung von Materialien, die als Modulatoren des Körpergewichts von Säugern wirken. Insbesondere betrifft die Erfindung die Isolie­ rung, Reinigung und Sequenzierung von bestimmten Nukleinsäuren, die mit dem OB-Gen oder seiner kodierenden Bereiche von sowohl Mäusen als auch Menschen korrespondieren, wie auch die entspre­ chenden Polypeptide, die von diesen Nukleinsäuren exprimiert werden. Die Erfindung umfaßt demgemäß das Auffinden von Nuklein­ säuren mit den in Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 1) und Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) dargelegten Nukleotidsequenzen, und degenerierte Varianten, Allele und Fragmente derselben, die alle die Akti­ vität zur Modulation des Körpergewichts und der Adipositas be­ sitzen. Das Korrespondieren der vorliegenden Nukleinsäuren mit dem OB-Gen deutet auf ihre signifikante Beteiligung an Zuständen wie der Obesität wie auch anderen Erkrankungen und Dysfunktionen hin, bei denen Anomalitäten des Körpergewichts ein beitragender Faktor sind. Die Erfindung erstreckt sich auf Proteine, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren exprimiert werden, und ins­ besondere auf solche Proteine, die in Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 2), Fig. 3 (SEQ ID NO: 4), Fig. 5 (SEQ ID NO: 5) und Fig. 6 (SEQ ID NO: 6) dargestellt sind, sowie auf konservierte Varian­ ten, aktive Fragmente und verwandte kleine Moleküle.

Wie bereits zuvor dargelegt worden ist, können die Peptide zur Modulation der Gewichtskontrolle oder ihre Bindungspartner oder andere Liganden oder Agenzien, die sie entweder nachahmen, oder die als Antagonisten zu ihnen wirken, oder die ihre Produktion kontrollieren, zu pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem geeigneten Träger und in einer Dosierung hergestellt werden, die zur Verabreichung auf vielfältige Weise an einen Patienten zur Behandlung wirksam sind, der unter anomalen Fluktuationen des Körpergewichts oder der Adipositas entweder allein oder als Teil eines schädlichen medizinischen Zustandes wie Krebs oder AIDS leidet. Es können eine Vielzahl von Verabreichungsformen zur Anwendung kommen, unter denen die orale Verabreichung, die nasa­ le oder andere Formen der Verabreichung durch die Schleimhaut, sowie parenterale Techniken wie subkutane, intravenöse und in­ traperitoneale Injektionen, Katheterisierungen und dergleichen in Betracht kommen. Die durchschnittlichen Mengen der Erken­ nungsfaktoren oder ihrer Untereinheiten können variieren und sollten insbesondere auf der Grundlage der Empfehlungen und Verschreibungen eines qualifizierten Arztes oder Tierarztes basieren.

In Übereinstimmung mit dem oben gesagten kann ein Assaysystem zum Screening von potentiellen Arzneimitteln hergestellt werden, welche die Aktivität des Gewichtsmodulators nachahmen oder als Antagonisten desselben wirksam sind. Der Gewichtsmodulator kann in ein Testsystem eingeführt werden, und das mögliche Medikament kann ebenfalls in die resultierende Zellkultur eingeführt wer­ den, und die Kultur kann anschließend zur Beobachtung irgendwel­ cher Veränderungen hinsichtlich der Aktivität der Zellen unter­ sucht werden, die entweder auf die Zugabe des möglichen Arznei­ mittels allein oder auf den Effekt zugegebener Mengen des be­ kannten Gewichtsmodulators zurückzuführen sind.

Wie bereits zuvor ausgeführt, hat das molekulare Klonieren des vorliegend beschriebenen OB-Gens zur Identifizierung einer Klas­ se von Materialien geführt, die auf molekularer Ebene als Modu­ latoren des Körpergewichts von Säugern wirken. Das Auffinden der erfindungsgemäßen Modulatoren besitzt wichtige Implikationen für die Diagnose und Behandlung von Ernährungsstörungen, einschließ­ lich, aber nicht beschränkt auf, Obesität, mit Krebs zusammen­ hängendem Gewichtsverlust, und die Behandlung von Erkrankungen, die mit Obesität zusammenhängen, wie Hypertension, Herzerkran­ kungen und Typ II-Diabetes. Zusätzlich gibt es potentielle land­ wirtschaftliche Anwendungen für das Genprodukt in Fällen, bei denen es erwünscht ist, das Körpergewicht von Haustieren zu modulieren. Schließlich können ein oder mehrere der erfindungs­ gemäßen Modulatoren in dem Umfang, in dem es sich um sekretierte Moleküle handelt, biochemisch verwendet werden, um ihren Rezep­ tor unter Anwendung der Technologie der Expressionsklonierung zu isolieren. Die Diskussion, die sich unter spezifischer Bezugnah­ me auf das OB-Gen anschließt, zeigt eine allgemeine Anwendbar­ keit auf die Klasse von Modulatoren als Teil der vorliegenden Erfindung, und ist daher in ihrer Breite und in ihrem Inter­ pretationsspielraum eingeschlossen.

Wie zuvor ausgeführt worden ist, kann die funktionelle Aktivität des OB-Polypeptids transgenisch ermittelt werden. In diesem Zusammenhang kann das Modell einer transgenen Maus angewendet werden. Das OB-Gen kann in Komplementationsstudien unter Ver­ wendung von transgenen Mäusen eingesetzt werden. Transgene Vek­ toren einschließlich virale Vektoren oder Cosmidklone (oder Phagenklone), die mit dem Wildtyp-Locus des fraglichen Gens korrespondieren, können unter Verwendung des isolierten OB-Gens hergestellt werden. Die Cosmide können in transgene Mäuse unter Anwendung veröffentlichter Verfahren eingeführt werden (Jae­ nisch, Science 240, 1468-1474, 1988). Die Konstrukte werden in befruchtete Eier eingeführt, die aus einer Kreuzung zwischen F1- Nachkommen einer CS7BL/6J ob/ob DBA-Kreuzung stammen. Diese Kreuzungen erfordern die Verwendung von ovariellen C57B/6J ob/ob-Transplantaten, um die F1-Tiere zu generieren. DBA/2J- Mäuse werden als Gegenstamm verwendet, da sie eine Nonaguoti- Farbe des Fells aufweisen, welche wichtig ist, wenn man die ovariellen Transplantate verwendet. Der Genotyp am ob-Locus im Cosmid transgener Tiere kann bestimmt werden durch Typisieren von Tieren mit engverknüpften RFLPs oder Mikrosatelliten, die die Mutation flankieren, und welche im Hinblick auf die Stämme der Vorfahren polymorph sind. Eine Komplementation wird ange­ zeigt, wenn ein bestimmtes Konstrukt ein genetisch adipöses F2- Tier (wie durch RFLP-Analyse ermittelt) mager und nicht-diabe­ tisch macht. Unter diesen Umständen erfordert ein endgültiger Beweis der Komplementation, daß das ob/ob- oder db/db-Tier, wel­ ches das Transgen trägt, mit den ob/ob- oder db/db-ovariellen Transplantaten gekreuzt wird. Bei dieser Kreuzung werden sämtli­ che N2-Tiere, die nicht das Transgen aufweisen, adipös und insu­ linresistent/diabetisch sein, während diejenigen, die das Trans­ gen aufweisen, mager sein und über normale Glukose- und Insulin­ konzentrationen im Plasma verfügen werden. In genetischem Sinne wirkt das Transgen als Suppressormutation.

Alternativ können die OB-Gene untersucht werden durch Überprü­ fung ihrer phänotypischen Effekte bei Expression in Antisense- Orientierung in Wildtyp-Tieren. Bei diesem Ansatz wird die Ex­ pression des Wildtyp-Allels supprimiert, was zu einem mutierten Phänotyp führt. Eine RNA/RNA-Duplexbildung (Antisense-Sense) verhindert eine normale Verwendung der mRNA und führt zu einer partiellen oder vollständigen Eliminierung des Effekts des Wild­ typ-Gens. Diese Technik ist angewendet worden, um die Tk-Syn­ these in der Gewebekultur zu inhibieren und um Phänotypen der Kruppel-Mutation in Drosophila und der Shiverer-Mutation in Mäusen auszulösen [Izant et al., Cell 36: 1007-1015 (1984); Green et al., Annu. Rev. Biochem. 55: 569-597 (1986); Katsuki et al., Science 241: 593-595 (1988)]. Ein wichtiger Vorteil dieses Ansatzes liegt darin, daß lediglich die Expression eines kleinen Bereichs des Gens für eine effektive Inhibierung der Expression der gesamten verwandten mRNA erforderlich ist. Das Antisense- Transgen wird unter Kontrolle seines eigenen Promotors oder eines anderen in dem korrekten Zelltyp exprimierten Promotors gestellt und stromaufwärts der poly(A)-Stelle von SV40 plaziert. Dieses Transgen wird zur Herstellung von transgenen Mäusen ver­ wendet. Die transgenen Mäuse werden ebenfalls mit ovariellen Transplantaten gekreuzt, um nachzuprüfen, ob ob-Heterozygote sensitiver auf die Effekte des Antisense-Konstrukts reagieren.

Langfristig ist die Aufklärung der biochemischen Funktion des OB-Genprodukts (des OB-Polypeptids oder -Proteins) nützlich zur Identifizierung von Agonisten und Antagonisten in Form kleiner Moleküle, welche dessen Aktivität beeinflussen.

Zahlreiche im Rahmen der vorliegenden Beschreibung verwendete Begriffe sollen z. B. die nachfolgend dargelegten Definitionen haben.

Die Begriffe "Modulator des Körpergewichts", "Modulator", "Modu­ latoren" und jegliche nicht in spezifischer Weise aufgeführten Varianten können vorliegend als Synonyme verwendet werden und betreffen im Rahmen ihrer Verwendung in der vorliegenden Anmel­ dung und den Ansprüchen gleichzeitig sowohl Nukleotide als auch proteinöses Material, wobei letzteres sowohl einzelne als auch multiple Proteine einschließt. Insbesondere erstrecken sich die zuvor genannten Begriffe auf die Nukleotide und die DNA mit den vorliegend beschriebenen und in Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 1) und Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) dargestellten Sequenzen. Gleicher­ maßen werden die Proteine mit den Aminosäuresequenzdaten, wie sie vorliegend beschrieben und in Fig. 1A bis E (SEQ ID NO: 2) und Fig. 3 (SEQ ID NO: 4) dargestellt sind, gleichermaßen in Betracht gezogen, wie auch die im Hinblick auf sämtliche Mate­ rialien, die vorliegend oder in den Patentansprüchen dargelegt sind, offenbarten Aktivitätsprofile. Demgemäß sind Nukleotide, die eine im wesentlichen äquivalente oder veränderte Aktivität aufweisen, einschließlich im wesentlichen homologe Analoga und allelische Varianten, eingeschlossen. Gleichermaßen sind Pro­ teine eingeschlossen, die eine im wesentlichen äquivalente oder veränderte Aktivität aufweisen, einschließlich Proteine, die absichtlich, wie z. B. durch ortsspezifische Mutagenese, oder zufällig durch Mutationen in Wirten, die die Modulatoren produ­ zieren, modifiziert sind.

Eine Zusammensetzung, die "A" umfaßt (wobei "A" ein einzelnes Protein, ein DNA-Molekül, ein Vektor, eine rekombinante Wirts­ zelle usw. ist), ist im wesentlichen frei von "B" (wobei "B" ein oder mehrere kontaminierende Proteine, DNA-Moleküle, Vektoren usw. umfaßt, aber razemische Formen von A ausschließt), wenn mindestens etwa 75 Gew.-% der Proteine, DNA, Vektoren (abhängig davon, zu welcher Kategorie an Spezies A und B gehören) in der Zusammensetzung "A" sind. Vorzugsweise umfaßt "A" mindestens etwa 90 Gew.-% der A+B-Spezies in der Zusammensetzung, wobei mindestens etwa 99 Gew.-% am meisten bevorzugt sind. Es ist ebenfalls bevorzugt, daß eine Zusammensetzung, welche im wesent­ lichen frei von Kontamination ist, lediglich eine einzige Mole­ kulargewichts-Spezies enthält, die die Aktivität oder die Eigen­ schaften der interessierenden Spezies aufweist.

Die OB-Polypeptide

Die Begriffe "Protein", bezieht sich auf in natürlicherweise vorkommendes Polypeptid, und "Polypeptid" werden vorliegend im Hinblick auf das OB-Genprodukt und Varianten desselben als Syn­ onyme verwendet. Der Begriff "reifes Protein" oder "reifes Poly­ peptid" bezieht sich insbesondere auf das OB-Genprodukt, bei dem die Signalsequenz (oder ein Fusionsproteinpartner) entfernt ist.

Wie zuvor ausgeführt, schließen besondere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen OB-Polypeptide diejenigen ein, die die vor­ liegend dargelegten Aminosäuresequenzen aufweisen, z. B. SEQ ID NOS: 2, 4, 5, 6, usw., einschließlich des durch konservative Aminosäuresubstitutionen modifizierten OB-Polypeptids, wie auch biologisch aktiver Fragmente, Analoga und Derivate davon. Der Begriff "biologisch aktiv" bezieht sich gemäß seiner vorliegen­ den Verwendung auf einen spezifischen Effekt des Polypeptids, einschließlich, aber nicht begrenzt auf spezifisches Binden, z. B. an einem Rezeptor, Antikörper oder ein anderes Erkennungs­ molekül; Aktivierung der Synthesewege zur Signaltransduktion auf molekularer Ebene; und/oder Induktion (oder Inhibierung durch Antagonisten) von physiologischen Effekten, die durch das native OB-Polypeptid in vivo vermittelt werden. OB-Polypeptide, ein­ schließlich Fragmente, Analoga und Derivate, können synthetisch hergestellt werden, z. B. unter Anwendung der bekannten Verfahren zur Festphasen- oder Lösungsmittelphasen-Peptidsynthese. Vor­ zugsweise werden Festphasen-Syntheseverfahren angewendet. Alter­ nativ können die erfindungsgemäßen OB-Polypeptide unter Anwen­ dung gut bekannter gentechnischer Verfahren hergestellt werden, wie sie nachfolgend beschrieben werden. Nach einer weiteren Ausführungsform kann das OB-Polypeptid gereinigt werden, z. B. durch Immunaffinitätsreinigung, aus einer biologischen Flüssig­ keit wie Plasma, Serum oder Urin, vorzugsweise aus menschlichem Plasma, Serum oder Urin, und am meisten bevorzugt von einem Individuum, welches das Polypeptid überexprimiert, wie bei einer adipösen Person, die an einer Mutation im OB-Rezeptor oder an Obesität leidet, die mit einer Mutation im Zusammenhang steht, welche mit "fett" korrespondiert, wobei die Möglichkeiten nicht hierauf beschränkt sind.

Fragmente des OB-Polypeptids

Nach einer besonderen Ausführungsform zieht die vorliegende Erfindung in Betracht, daß natürlicherweise auftauchende Frag­ mente des OB-Polypeptids wichtig sein können. Die Peptidsequenz schließt eine Reihe von Stellen ein, die häufig das Ziel für proteolytische Spaltungen sind, z. B. Argininreste. Es ist mög­ lich, daß das Polypeptid vollständiger Länge an einer oder meh­ reren derartigen Stellen gespalten werden kann, um biologisch aktive Fragmente zu bilden. Derartige biologisch aktive Frag­ mente können gegenüber der funktionellen Aktivität des OB-Poly­ peptids zur Reduktion des Körpergewichts entweder als Agonisten oder als Antagonisten wirken.

Analoga des OB-Polypeptids

Die vorliegende Erfindung umfaßt in spezifischer Weise die Her­ stellung von Analoga des OB-Peptids, welche gekennzeichnet sind durch ihre Fähigkeit einer biologischen Aktivität des OB-Poly­ peptids, z. B. durch Bindung an einen spezifischen Bindungspart­ ner des OB-Peptids, wie den OB-Rezeptor. In einer Ausführungs­ form wirkt das Analogon als Agonist der OB-Aktivität, d. h. es wirkt in einer dem OB-Peptid ähnlichen Weise. Vorzugsweise ist ein OB-Agonist effektiver als das native Protein. Beispielsweise kann ein OB-Agonist-Analogon an den OB-Rezeptor mit höherer Affinität binden, oder eine längere Halbwertszeit in vivo auf­ weisen, oder beides. Nichtsdestoweniger werden OB-Peptid-Ago­ nist-Analogons, die weniger effektiv als das native Protein sind, ebenfalls in Betracht gezogen. Nach einer anderen Ausfüh­ rungsform wirkt das Analogon als Antagonist der OB-Aktivität. Beispielsweise kann ein OB-Analogon, welches an den OB-Rezeptor bindet, aber keine Signaltransduktion induziert, die Bindung von nativem OB an den Rezeptor kompetitiv inhibieren, wodurch die OB-Aktivität in vivo abgesenkt wird. Ein derartiges OB-Antago­ nist-Analogon kann ebenfalls im Vergleich zum OB-Peptid unter­ schiedliche Eigenschaften aufweisen, z. B. längere (oder kürzere) Halbwertszeit in vivo, größere (oder geringere) Bindungsaffini­ tät für den OB-Rezeptor, oder beides.

Nach einer Ausführungsform ist ein Analogon des OB-Peptids das OB-Peptid, modifiziert durch Substitution von Aminosäuren an Positionen auf dem Polypeptid, die für die Struktur oder Funk­ tion nicht wesentlich sind. Da es bekannt ist, daß das humane OB-Peptid in der Maus biologisch aktiv ist, werden beispiels­ weise Substitutionen von Aminosäureresten der humanen Sequenz, die von denjenigen der murinen Aminosäuresequenz abweichen, wahrscheinlich brauchbare Analoga des OB-Peptids ergeben. Bei­ spielsweise können der Serinrest an Position 53 oder Position 98 oder beide (in der unprozessierten Peptidsequenz gemäß Fig. 4) des Menschen substituiert werden, z. B. durch Glycin, Alanin, Valin, Cystein, Methionin oder Threonin. In ähnlicher Weise kann der Argininrest an der Position 92 (Fig. 4) substituiert werden, z. B. durch Asparagin, Lysin, Histidin, Glutamin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Serin, Threonin, Methionin oder Cystein. Unter weiterer Bezugnahme auf Fig. 4 sind weitere Aminosäuren in dem humanen OB-Peptid, die substituierbar erscheinen, Histidin an Position 118, Tryptophan an Position 121, Alanin an Position 122, Glutaminsäure an Position 126, Threonin an Position 127, Leucin an Position 128, Glycin an Position 132, Glycin an Posi­ tion 139, Tryptophan an Position 159, und Glycin an Position 166. Nach einer weiteren Ausführungsform ist es möglich, einen oder mehrere der Reste 121 bis 128 (gemäß Darstellung in Fig. 4) zu substituieren, z. B. durch Glycin oder Alanin, oder einige der Reste mit Ausnahme des Serins an Position 123 oder des Leu­ cins an Position 125 zu substituieren.

Nach einer anderen Ausführungsform ist ein Analogon des OB-Poly­ peptids, vorzugsweise des humanen OB-Polypeptids, eine trunkier­ te Form des Polypeptids. Beispielsweise ist bereits gezeigt worden, daß das Glutamin am Rest 49 nicht essentiell ist und von dem Peptid deletiert werden kann. In ähnlicher Weise ist es möglich, einige oder sämtliche der abweichenden Aminosäurereste an den Positionen 121-128 zu deletieren. Zusätzlich zieht die Erfindung die Bereitstellung eines OB-Analogons in Betracht, welches die für eine biologische Aktivität erforderliche minima­ le Aminosäuresequenz aufweist. Dies kann leicht bestimmt werden, indem z. B. die Aktivität von Fragmenten von OB hinsichtlich der Fähigkeit untersucht werden, an OB-spezifische Antikörper zu binden, die Aktivität des nativen OB-Polypeptids zu inhibieren, oder gegenüber der Aktivität des nativen OB-Polypeptids als Agonist zu wirken. Nach einer Ausführungsform wird durch die Erfindung ein trunkiertes OB-Peptid bereitgestellt, welches aus der Schleifenstruktur besteht, die von der Disulfidbrücke ausge­ bildet wird, welche sich zwischen den Cysteinresten 117 und 167 ausbildet (wie in Fig. 4 dargestellt). Nach einer anderen Aus­ führungsform korrespondiert das trunkierte Analogon mit den Aminosäuren von Resp 22 (welcher der putativen Spaltstelle für das Signalpeptid folgt) bis 53 (demjenigen Aminosäurerest, der unmittelbar vor einer flexiblen Schleifenregion liegt, welche durch limitierte Proteolyse und anschließende massenspektrome­ trische Analyse des OB-Polypeptids nachgewiesen wurde; s. Cohen et al., Protein Science, 4: 1088 (1995). Nach einer anderen Aus­ führungsform korrespondiert das trunkierte Analogon mit den Aminosäuren von Rest 61 (der Rest, welcher der flexiblen Schlei­ fenregion folgt, die mit der limitierten Proteolyse/massenspek­ trometrischen Analyse des OB-Polypeptids nachgewiesen wurde). Bis zum Aminosäurerest 116 (der unmittelbar vor dem ersten Cy­ steinrest gelegene Rest). Nach noch einer anderen Ausführungs­ form korrespondiert das trunkierte Analogon mit den Aminosäuren von Rest 61 bis zum Aminosäurerest 167.

Ferner sind einer oder mehrere der Reste der putativen flexiblen Schleife an den Resten 54 bis 60 substituiert. Beispielsweise können einer oder mehrere der Reste substituiert sein durch Lysin, Glutaminsäure oder Cystein, (vorzugsweise Lysin), zur Vernetzung, z. B. mit einem Polymer, da flexible Schleifenstruk­ turen bevorzugte Stellen zur Derivatisierung eines Proteins sind. Alternativ können die Reste an den Positionen der flexi­ blen Schleife durch Aminosäurereste substituiert werden, die resistenter gegenüber einer Proteolyse sind, aber eine flexible Struktur beibehalten, z. B. ein oder mehrere Proline. In noch einer anderen Ausführungsform werden Substitutionen durch Amino­ säurereste in Betracht gezogen, die weiter derivatisiert werden können, um sie resistenter gegenüber einem Abbau, z. B. Proteoly­ se, zu machen.

Ein durchschnittlicher Fachmann auf dem Gebiet wird erkennen, daß die vorstehend angegebenen Fragmentgrößen ungefähre Angaben sind, und daß eine bis etwa fünf Aminosäuren von jedem oder beiden Enden oder vom Inneren des Polypeptids oder der Fragmente desselben, der genannten trunkierten Analoga, eingeschlossen oder deletiert sein können, mit der Ausnahme, daß die Cysteinre­ ste in den Schleifenanaloga mit Disulfidbrücken beibehalten werden müssen.

Es ist gefunden worden, daß das murine OB-Peptid einen α-Helix­ gehalt von 50% aufweist, und daß das humane OB-Polypeptid einen α-Helixgehalt von etwa 60% aufweist, wie durch zirkulären Dichroismus der rekombinanten Peptide unter nahezu physiologi­ schen Bedingungen nachgewiesen wurde. Demgemäß können die Ami­ nosäurereste nach einer anderen Ausführungsform durch Reste substituiert werden, um Analoga des OB-Polypeptids zu bilden, die eine gesteigerte Neigung zur Ausbildung von α-Helixstruktu­ ren aufweisen oder stabilere Formen davon bilden. Beispielsweise wäre eine α-Helixstruktur bevorzugt, wenn Glu, Ala, Leu, His, Trp als Substituenten für im nativen OB-Polypeptid gefundene Aminosäurereste eingeführt werden. Vorzugsweise werden konserva­ tive Aminosäuresubstitutionen durchgeführt, z. B. Substitution der Asparginsäure am Rest bzw. an den Resten 29, 30, 44, 61, 76, 100 und/oder 106 (gemäß Darstellung in Fig. 4) durch Glutamin­ säure(n) (Glu); Substitution von Isoleucin(en) durch Leucine; Substitution von Glycin oder Valin oder irgendeiner divergieren­ den Aminosäure durch Alanin (z. B. Serin an Position 53 des huma­ nen OB-Polypeptids durch Alanin); Substitution von Arginin oder Lysin durch Histidin; und Substitution von Tyrosin und/oder Phenylalanin durch Tryptophan. Durch Steigerung des Ausmaßes, oder noch wichtiger, der Stabilität einer α-Helixstruktur kann ein OB-Analogon mit größerer Aktivität, erhöhter Bin­ dungsaffinität, oder längerer Halbwertszeit erhalten werden. Nach einer spezifischen Ausführungsform wird das Helix-ausbil­ dende Potential des Bereichs des OB-Peptids erhöht, welcher mit den Aminosäureresten 22 bis 53 korrespondiert. Nach einer ande­ ren Ausführungsform wird das Helix-ausbildende Potential oder die Stabilität der Aminosäurereste 61-116 erhöht. In noch einer anderen Ausführungsform wird das Helix-ausbildende Potential der mit den Aminosäuren 117 bis 167 korrespondierenden Disulfid- Schleifenstruktur erhöht. OB-Analoga, die ein erhöhtes α-helika­ les Potential oder eine gesteigerte Stabilität bei mehr als einem der vorstehend genannten Domäne aufweisen, werden eben­ falls in Betracht gezogen. Nach einer weiteren Ausführungsform werden trunkierte OB-Polypeptid-Analoga hergestellt, welche Ami­ nosäurereste einschließen, die an der Ausbildung der Struktur, z. B. der Ausbildung einer Helix, beteiligt sind, um die stärkere Neigung von Polypeptidfragmenten, keine stabile Struktur auf­ zuweisen, zu kompensieren.

Analoga wie Fragmente können z. B. hergestellt werden durch Pep­ sinspaltung des Peptidmaterials zur Gewichtsmodulation. Andere Analoga, wie Muteine, können hergestellt werden durch gewöhn­ liche ortsspezifische Mutagenese von Sequenzen, die für das Peptid zur Gewichtsmodulation kodieren. Analoga, die "gewichts­ modulatorische Aktivität" aufweisen, wie kleine Moleküle, ob sie nun als Promotoren oder Inhibitoren wirken, können durch bekann­ te in vivo- und/oder in vitro-Assays identifiziert werden.

Analoga und Peptidomimetika des OB-Polypeptids in Form kleiner Moleküle

Die Struktur des OB-Polypeptids, vorzugsweise des humanen OB- Polypeptids, kann durch zahlreiche im Stand der Technik bekannte Verfahren analysiert werden. Die Proteinsequenz kann durch eine Hydrophilizitätsanalyse charakterisiert werden (z. B. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824 (1981). Ein Hydrophi­ lizitätsprofil kann verwendet werden zur Identifizierung der hydrophoben und hydrophilen Regionen des OB-Polypeptids, welche auf Regionen, die im Inneren des gefalteten Polypeptids verbor­ gen sind, und auf Regionen hinweisen können, die auf dem Äußeren des Polypeptids zugänglich sind. Zusätzlich kann eine Analyse der Sekundärstruktur durchgeführt werden [z. B. Chou et al., Bio­ cheinistry, 13: 222 (1974)], um Regionen des OB-Polypeptids zu identifizieren, von denen spezifische Sekundärstrukturen anzu­ nehmen sind. Die Manipulation der vorhergesagten oder bestimmten Struktur, einschließlich der Vorhersage der Sekundärstruktur, kann unter Anwendung von auf dem Gebiet zur Verfügung stehenden Computersoftwareprogrammen erfolgen.

Durch Bereitstellung einer Überschußquelle für rekombinantes OB- Polypeptid ermöglicht die vorliegende Erfindung die quantitative strukturelle Bestimmung des Polypeptids. Insbesondere wird aus­ reichend Material bereitgestellt für magnetische Kernresonanz (NMR)-, Infrarot (IR)-, Raman-, und ultraviolette (UV)-, insbe­ sondere zirkuläre Dichroismus (CD)-, und spektroskopische Analy­ sen. Insbesondere liefert die NMR eine sehr leistungsstarke strukturelle Analyse von Molekülen in Lösung, was eher ihrer nativen Umgebung entspricht [Marion et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 113: 967-974 (1983); Bar et al., J. Magn. Reson. 65: 355-360 (1985); Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 1681-1685 (1980)]. Andere Verfahren zur strukturellen Analyse können ebenfalls angewendet werden. Diese schließen Röntgenkri­ stallographie ein, sind aber nicht darauf beschränkt [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11: 7-13 (1974)].

Nach einer weiteren Ausführungsform kann ein Analogon des OB- Polypeptids untersucht werden, um festzustellen, ob es mit einem für das native OB-Polypeptid oder speziellen Fragmenten dessel­ ben spezifischen Antikörpers kreuzreagiert. Das Ausmaß der Kreuzreaktivität liefert Informationen über strukturelle Homolo­ gie oder Ähnlichkeit von Proteinen oder über die Zugänglichkeit von Regionen, die mit Bereichen des Polypeptids korrespondieren, welche verwendet wurden, um Fragment-spezifische Antikörper zu generieren.

Screening nach OB-Analoga

Im Stand der Technik sind zahlreiche Screeningverfahren zum Screening nach Analoga von Polypeptiden bekannt. Zahlreiche Bibliotheken von chemischen Verbindungen stehen zur Verfügung. Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung das Screening derartiger Bibliotheken, z. B. Bibliotheken von synthetischen Verbindungen, die über mehrere Forschungsjahre generiert wurden, Bibliotheken von natürlichen Verbindungen und kombinatorische Bibliotheken, wie nachfolgend detaillierter beschrieben, hin­ sichtlich Analoga des OB-Polypeptids in Betracht gezogen. Nach einer Ausführungsform umfaßt die Erfindung das Screening der­ artiger Bibliotheken nach Verbindungen, die an Anti-OB-Polypep­ tid-Antikörper, vorzugsweise Anti-humane OB-Polypetid-Antikörper binden. Nach einem anderen Aspekt kann jedwedes im Stand der Technik bekanntes Screeningverfahren zum Screening nach OB-Re­ zeptor-Agonisten oder -Antagonisten angewendet werden, sobald der OB-Rezeptor identifiziert ist (s. unten). Die vorliegende Erfindung zieht das Screening nach Liganden oder Liganden-Analo­ ga und -Mimetika wie auch das Screening nach natürlichen Ligan­ den in Betracht, welche an aktivierte OB-Rezeptoren in vivo binden und als Agonisten oder Antagonisten wirken.

Die Kenntnis der Primärsequenz des Rezeptors und die Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen bekannter Funktion kann hin­ sichtlich der Wirkung als Agonist oder Antagonist des Proteins eine erste Erkenntnis sein. Die Identifizierung und das Scree­ ning von Antagonisten wird weiter erleichtert durch Bestimmung struktureller Merkmale des Proteins, z. B. unter Anwendung von Röntgenkristallographie, Neutronendiffraktion, kernmagnetische Resonanzspektrometrie und anderen Verfahren zur Strukturbestim­ mung. Diese Techniken dienen dem rationalen Design oder der Identifizierung von Agonisten und Antagonisten.

Bei einem anderen Ansatz werden rekombinante Bakteriophagen zur Herstellung großer Bibliotheken verwendet. Unter Anwendung der "Phagen-Methode" [Scott et al., Science, 249: 386-390 (1990); Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 6378-6382 (1990); Devlin et al., Science, 249: 404-406 (1990)], können sehr große Bibliotheken hergestellt werden (10⁶-10⁸ chemische Einheiten). Bei einem zweiten Ansatz werden in erster Linie chemische Ver­ fahren angewendet, von denen das Geysen-Verfahren [Geysen et al., Molecular Immunology 23: 709-715 (1986); Geysen et al., J. Immunologic Method, 102: 259-274 (1987)] und das kürzlich veröf­ fentlichte Verfahren von Fodor et al., Science 251, 767-773 (1991) Beispiele sind. Furka et al. (14th International Congress of Biochemistry, Bd. 5, Abstract FR:013 (1988); Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487-493 (1991); Houghton (U.S.-Patent Nr. 4 631 211, erteilt im Dezember 1986) und Rutter et al. (U.S.-Patent Nr. 5 010 175, erteilt am 23. April 1991) beschrei­ ben Verfahren zur Herstellung einer Mischung von Peptiden, die als Agonisten oder Antagonisten untersucht werden können.

Nach einem anderen Aspekt können synthetische Bibliotheken [Nee­ dels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10700-10704 (1993); Lam et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00252, wobei beide Veröffentlichungen durch Bezugnahme voll­ ständig eingeschlossen werden] und dergleichen angewendet wer­ den, um erfindungsgemäß nach OB-Rezeptor-Liganden zu suchen. Mit Hilfe derartiger Bibliotheken können Rezeptor-Antagonisten unter Verwendung von Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren, nach­ gewiesen werden, ohne den OB-Rezeptor tatsächlich zu klonieren.

Alternativ können Assays über die Bindung von löslichen Liganden an Zellen, die rekombinante Formen der Liganden-bindenden Domäne des OB-Rezeptors exprimieren, durchgeführt werden. Die löslichen Liganden können so leicht wie das rekombinante oder synthetische OB-Polypeptid bereitgestellt werden.

Das Screening kann mit rekombinanten Zellen erfolgen, welche den OB-Rezeptor exprimieren, oder alternativ unter Verwendung des gereinigten Rezeptor-Proteins, z. B. rekombinant hergestellt, wie oben beschrieben. Beispielsweise kann die Fähigkeit eines mar­ kierten, löslichen oder löslich gemachten OB-Rezeptors, welcher den Liganden-bindenden Bereich des Moleküls einschließt, zur Bindung eines Liganden angewendet werden, um Bibliotheken gemäß nachfolgender Schilderung abzusuchen.

Derivate von OB-Polypeptiden

Im allgemeinen kann das vorliegende Protein (vorliegend wird der Begriff "Protein" verwendet, um "Polypeptid" - sofern nicht anders angegeben - einzuschließen) durch Anheftung eines oder mehrerer chemischer Reste an den Proteinanteil zu derivatisie­ ren. Die chemisch modifizierten Derivate können weiter zur in­ traarteriellen, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, intravenösen, oralen, nasalen, rektalen, bukkalen, sublingualen, pulmonalen, topischen, transdermalen oder für andere Wege der Verabreichung formuliert werden. Es ist gefunden worden, daß eine chemische Modifikation von biologisch aktiven Proteinen unter bestimmten Umständen zu zusätzlichen Vorteilen führt, wie zur Erhöhung der Stabilität und Zirkulationsdauer des therapeu­ tischen Proteins und zu einer Verminderung der Immunogenität). Vgl. US-Patent Nr. 4 179 337, Davis et al., erteilt am 18. De­ zember 1979. Für einen Überblick, vgl. Abuchowski et al., in "Soluble Polymer-Enzyme Adducts" Enzymes as Drugs, S. 367-383, Holcenberg and Roberts, Hrsg., Wiley-Interscience, New York, N.Y., (1981)]. Ein Übersichtsartikel, in dem die Modifikation von Proteinen und Fusionsproteinen beschrieben werden, stammt von Francis, Focus on Growth Factors 3: 4-10 (1992).

Chemische Reste zur Derivatisierung

Die zur Derivatisierung geeigneten chemischen Reste können unter wasserlöslichen Polymeren ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer sollte wasserlöslich sein, so daß das Protein, an das es angeheftet wird, in einer wäßrigen Umgebung wie einer physiolo­ gischen Umgebung nicht ausfällt. Vorzugsweise ist das Polymer bei beabsichtigter therapeutischer Verwendung des Endprodukts pharmazeutisch verträglich. Ein Fachmann auf dem Gebiet wird in der Lage sein, ein gewünschtes Polymer auf der Grundlage der­ artiger Überlegungen hinsichtlich der therapeutischen Verwendung des Polymer/Protein-Konjugats auszuwählen, und kann anschließend die gewünschte Dosierung, die Zirkulationsdauer, die Resistenz gegenüber Proteolyse und andere Betrachtungen einfließen lassen. Für die vorliegenden Proteine und Peptide können diese Variablen unter Anwendung der vorliegend dargestellten Assays ermittelt werden.

Polymermoleküle

Das wasserlösliche Polymer kann ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus z. B. Polyethylenglykol, Copolymeren aus Ethylen­ glykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvi­ nylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-dioxolan, Poly-1,3,6- trioxan, Ethylen/Maleinanhydrid-Copolymer, Polyaminosäuren (ent­ weder Homopolymere oder randomisierte Copolymere), und Dextran- oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykol- Homopolymeren, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymeren, poly­ oxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol. Polyethylenglykol- Propionaldehyd kann bei der Herstellung aufgrund seiner Stabili­ tät in Wasser vorteilhaft sein.

Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht aufweisen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Im Fall von Polyethylenglykol liegt das für eine einfache Handhabung bei der Herstellung bevorzugte Molekulargewicht zwischen etwa 2 kD und etwa 100 kD (der Begriff "etwa" weist darauf hin, daß einige Moleküle in Präparationen von Polyethylenglykol mehr und andere weniger wiegen als das angegebene Molekulargewicht). Andere Größen kön­ nen in Abhängigkeit des erwünschten therapeutischen Profils verwendet werden (z. B. die erwünschte Dauer einer anhaltenden Freisetzung, die Wirkungen, sofern vorhanden, auf die biologi­ sche Aktivität, die einfache Handhabbarkeit, das Ausmaß oder das Fehlen an Antigenität und anderen bekannten Effekten des Poly­ ethylenglykols auf ein therapeutisches Protein oder Analogon).

Polymer/Protein-Verhältnis

Die Anzahl der auf diese Weise angehefteten Polymermoleküle kann variieren, und ein Fachmann auf dem betreffenden Gebiet wird in der Lage sein, die Auswirkung auf die Funktion zu ermitteln. Man kann Mono-Derivate herstellen oder man kann Di-, Tri- oder Te­ tra- oder irgendein Kombinations-Derivat herstellen, wobei die­ selben oder verschiedene chemische Reste verwendet werden können (z. B. Polymere mit verschiedenen Gewichten an Polyethylenglyko­ len). Das Verhältnis zwischen Polymermolekülen und Protein (oder Peptid-)-Molekülen wie auch deren Konzentrationen in der Reak­ tionsmischung werden variieren. Im allgemeinen wird das optimale Verhältnis (in Bezug auf die Wirksamkeit der Reaktion im Hin­ blick darauf, daß es kein überschüssiges, nicht-umgesetztes Protein oder Polymer gibt) bestimmt werden durch Faktoren wie dem erwünschten Ausmaß an Derivatisierung (z. B. Mono-, Di-, Tri-, usw.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, dem Vorliegen des Polymers in verzweigter oder unverzweigter Form, und den Reaktionsbedingungen.

Anheftung des chemischen Restes an das Protein

Die Polyethylenglykol-Moleküle (oder andere chemische Reste) sollten an das Protein unter Berücksichtigung der Auswirkungen auf die funktionellen oder antigenen Domänen des Proteins ange­ heftet werden. Dem Fachmann auf dem betreffenden Gebiet stehen eine Reihe von Verfahren zur Anheftung zur Verfügung, z. B. EP 0 401 384, hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen (Kopplung von PEG an G-CSF), s. auch Malik et al., Exp. Hematol., 20: 1028- 1035 (1992) (Bericht über Pegylierung von GM-CSF unter Verwen­ dung von Tresylchlorid). Beispielsweise kann Polyethylenglykol über eine reaktive Gruppe, wie eine freie Amino- oder Carb­ oxylgruppe über Aminosäurereste kovalent gebunden werden. Reak­ tive Gruppen sind solche, an die ein aktiviertes Polyethylengly­ kol-Molekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste mit einer freien Aminogruppe können Lysinreste und die N-terminalen Ami­ nosäurereste einschließen; diejenigen mit einer freien Carboxyl­ gruppe können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und die C- terminalen Aminosäurereste einschließen. Als reaktive Gruppe zur Anheftung des/der Polyethylenglykolmoleküle können auch Sulfhy­ drylgruppen verwendet werden. Für therapeutische Zwecke ist die Anheftung an einer Aminogruppe wie die Anheftung am N-Terminus oder an der Lysin-Gruppe bevorzugt. Eine Anheftung an Reste, die für die Bindung des Rezeptors wichtig sind, sollte vermieden werden, wenn eine Rezeptorbindung erwünscht ist.

N-terminal chemisch modifizierte Proteine

Ein N-terminal chemisch modifiziertes Protein kann speziell erwünscht sein. Unter Verwendung von Polyethylenglykol als ver­ anschaulichendes Beispiel der vorliegenden Zusammensetzungen können aus einer Vielzahl von Polyethylenglykol-Molekülen (durch Molekulargewicht, Verzweigung, usw.) das Verhältnis zwischen Polyethylenglykol-Molekülen und Protein (oder Peptid)-Molekülen in der Reaktionsmischung, der durchzuführende Reaktionstyp zur Pegylierung, und das Verfahren zum Erhalt des ausgewählten N- terminal pegylierten Proteins ausgewählt werden. Das Verfahren zum Erhalt der N-terminal pegylierten Präparation (d. h. Abtren­ nung dieses Rests von anderen monopegylierten Resten, sofern erforderlich) kann erfolgen durch Reinigung des N-terminal pegy­ lierten Materials aus einer Population von pegylierten Protein­ molekülen. Eine selektive, N-terminale chemische Modifikation kann erfolgen durch reduktive Alkylierung unter Ausnutzung un­ terschiedlicher Reaktivität verschiedener Typen von primären Aminogruppen (Lysin gegenüber dem N-Terminus), die zur Deriva­ tisierung eines bestimmten Proteins zur Verfügung stehen. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem eine Carbonylgruppe enthaltenden Polymer erreicht. Beispiels­ weise kann man das Protein selektiv N-terminal pegylieren, indem man die Umsetzung bei einem pH-Wert durchführt, welcher es er­ möglicht, die Vorteile der Unterschiede im pK_a-Wert zwischen den ε-Aminogruppen des Lysinrestes und der α-Aminogruppe des N-ter­ minalen Restes des Proteins auszunutzen. Durch eine derartige selektive Derivatisierung wird die Anheftung eines wasserlösli­ chen Polymers an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer erfolgt hauptsächlich am N-Terminus des Proteins, und es treten keine signifikanten Veränderungen anderer reakti­ ver Gruppen, wie der Lysin-Aminogruppen der Seitenkette, auf. Unter Anwendung reduktiver Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer dem oben beschriebenen Typ angehören und sollte ein einzelnes reaktives Aldehyd zur Kopplung an das Protein aufwei­ sen. Polyethylenglykolpropionaldehyd, welches ein einzelnes reaktives Aldehyd enthält, kann verwendet werden.

Mit dem OB-Polypeptid im Zusammenhang stehende Nukleinsäuren

Wie zuvor ausgeführt, betrifft die vorliegende Erfindung Nu­ kleinsäuren, die für OB-Polypeptide kodieren, sowie assoziierte genomische nicht-kodierende Sequenzen, die 5′, 3′ und in Intron­ bereichen des OB-Gens liegen. Demgemäß können in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung übliche, im Stand der Technik bekannte molekularbiologische, mikrobiologische und rekombinante DNA-Techniken angewendet werden. Derartige Techniken sind in der Literatur vollständig beschrieben. Vgl. z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Glover Hrsg., DNA Cloning: A Practical Approach, Bände I und II, MRL Press, Ltd., Oxford, GB (1985); Gait, Hrsg., Oli­ gonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984); Hames et al., Hrsg., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985); Hames et al., Hrsg., Transcription And Translation, Oxford University Press (1984); Freshney, Hrsg., Animals Cell Culture, Oxford University Press, (1986); Immobilized Cells And Enzymes, IRL Press (1986); Perbal, A Practical Guide To Molecular Clo­ ning, Wiley, New York (1984). Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Erfindung sind Strategien zur Isolierung, Klonie­ rung, Sequenzierung, sowie zur Analyse und Charakterisierung eines Gens oder einer Nukleinsäure auf der Grundlage der gut bekannten Verfahren zur Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Ein "Replikon" ist jedes genetische Element (z. B. Plasmid, Chro­ mosom, Virus), welches in vivo als autonome Einheit der DNA- Replikation fungiert, d. h. welches zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle befähigt ist.

Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Cos­ mid, an das ein anderes DNA-Segment angeheftet werden kann, um die Replikation des angehefteten Segments zu bewirken.

Eine "Kassette" betrifft ein DNA-Segment, welches in einen Vek­ tor an spezifischen Restriktionsstellen eingeführt werden kann. Das DNA-Segment kodiert für ein interessierendes Polypeptid, und die Kassette und die Restriktionsstellen sind so gestaltet, daß eine Insertion der Kassette in den zur Transkription und Trans­ lation richtigen Leserahmen sichergestellt wird.

"Heterologe" DNA bezieht sich auf DNA, die natürlicherweise nicht in der Zelle oder in einer chromosomalen Stelle der Zelle lokalisiert ist. Vorzugsweise schließt die heterologe DNA ein für die Zelle fremdes Gen ein.

Eine Zelle ist mit exogener oder heterologer DNA "transfiziert", wenn eine solche DNA in die Zelle eingeführt worden ist. Eine Zelle ist durch exogene oder heterologe DNA "transformiert" worden, wenn die transfizierte DNA eine phänotypische Verände­ rung bewirkt. Vorzugsweise sollte die transformierende DNA in die chromosomale DNA integriert (kovalent verknüpft) werden, aus der das Genom der Zelle besteht.

Ein "Klon" ist eine Population von Zellen, die aus einer einzi­ gen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahren durch Mitose hervor­ gegangen ist.

Ein "Nukleinsäuremolekül" bezieht sich auf die polymere Phosphoresterform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uri­ din oder Cytidin; "RNA-Moleküle") oder auf Desoxyribonukleoside (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycyti­ din; "DNA-Moleküle") in entweder einzelsträngiger Form oder in Form einer doppelsträngigen Helix. Doppelsträngige DNA/DNA-, DNA/RNA- und RNA/RNA-Helices sind möglich. Der Begriff Nuklein­ säuremolekül und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül bezieht sich lediglich auf die primäre und sekundäre Struktur des Moleküls und führt zu keiner Beschränkung desselben auf irgendeine be­ sondere tertiäre oder quaternäre Form. Demgemäß schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA ein, die u. a. in linearen oder zir­ kulären DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Plasmiden und Chromosomen gefunden werden. Bei der Diskussion über die Struktur von bestimmten doppelsträngigen DNA-Molekülen können die Sequenzen vorliegend entsprechend der üblichen Weise be­ schrieben werden, wonach lediglich die Sequenz in Richtung 5′ zu 3′ entlang des nicht-transkribierten Stranges der DNA angegeben wird (d. h. der Strang mit einer Sequenz, die zur mRNA homolog ist). Ein "rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, wel­ ches einer molekularbiologischen Manipulation unterzogen worden ist.

Ein Nukleinsäuremolekül ist "hybridisierbar" mit einem anderen Nukleinsäuremolekül, wie einer cDNA, einer genomischen DNA oder einer RNA, wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremole­ küls sich an dem anderen Nukleinsäuremolekül unter geeigneten Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke der Lösung anne­ lieren läßt (Vgl. Sambrook et al., 1989, oben). Die Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke bestimmen die "Stringenz" der Hybridisierung. Für ein vorläufiges Screening nach homologen Nu­ kleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen niedriger Strin­ genz, entsprechend einem T_m von 55°C, angewendet werden, z. B. 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,25% Milch, und kein Formamid; oder 30% Formamid, 5× SSC, 0,5% SDS. Hybridisierungsbedingungen mit moderater Stringenz korrespondieren mit einem höheren T_m, z. B. 40% Formamid, mit 5× oder 6× SCC. Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz korrespondieren mit dem höchsten T_m, z. B. 50% Formamid, 5× oder 6× SCC. Die Hybridisierung erfordert, daß die beiden Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obgleich es in Abhängigkeit von der Stringenz der Hybridisierung möglich ist, daß es zu Mismatch-Paarungen zwischen Basen kommt. Die geeignete Stringenz zur Hybridisierung von Nukleinsäuren ist abhängig von der Länge der Nukleinsäuren und des Ausmaßes der Komplementation, wobei die Variablen auf dem betreffenden Gebiet gut bekannt sind. Je größer das Ausmaß der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nukleotidsequenzen, um so größer ist der T_m-Wert für Hybride von Nukleinsäuren mit solchen Sequenzen. Die relative Stabilität (entsprechend einem höheren T_m) von Nuklein­ säure-Hybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybride mit einer Länge von mehr als 100 Nukleotiden sind Gleichungen zur Berechnung des T_m-Wertes aufgestellt worden (s. Sambrook et al., 1989, oben, 9.50-9.51). Für die Hybridisierung mit kürzeren Nukleinsäuren, d. h. Oligonu­ kleotiden, bekommt die Position von Mismatch-Paarungen eine stärkere Bedeutung, und die Länge des Oligonukleotids bestimmt seine Spezifität (s. Sambrook et al., 1989, oben, 11.7-11.8). Vorzugsweise beträgt eine minimale Länge für eine hybridisier­ bare Nukleinsäure mindestens etwa 10 Nukleotide; bevorzugter sind mindestens etwa 15 Nukleotide, wobei die Länge am meisten bevorzugt mindestens etwa 20 Nukleotide beträgt.

"Homologe Rekombination" bezieht sich auf die Insertion einer fremden DNA-Sequenz eines Vektors in ein Chromosom. Vorzugsweise steuert der Vektor für die homologe Rekombination eine spezifi­ sche chromosomale Stelle an. Für eine spezifische homologe Re­ kombination wird der Vektor ausreichend lange Regionen mit Homo­ logie zu Sequenzen des Chromosoms enthalten, um eine komplemen­ täre Bindung und eine Eingliederung des Vektors in das Chromosom zu erlauben. Durch längere Homologiebereiche und ein größeres Ausmaß an Sequenzähnlichkeit kann die Effizienz der homologen Rekombination erhöht werden.

Eine "kodierende DNA-Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Se­ quenz, welche in einer Zelle in vitro oder in vivo transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird, wenn sie unter der Kon­ trolle geeigneter regulatorischer Sequenzen steht. Die Grenzen der kodierenden Sequenz sind festgelegt durch ein Startkodon am 5′ (Amino)-Terminus und ein Translationsstopkodon am 3′ (Car­ boxy)-Terminus. Eine kodierende Sequenz kann prokaryontische Se­ quenzen, cDNA von eukaryontischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryontischer (z. B. Säuger-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Wenn die kodierende Sequenz zur Expression in einer eukaryonti­ schen Zelle vorgesehen ist, sind ein Polyadenylierungssignal und eine Sequenz zur Termination der Transkription gewöhnlich 3′ von der kodierenden Sequenz angeordnet.

Isolierung von OB-kodierenden und -flankierenden Sequenzen

Die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen Nu­ kleinsäuren schließen, wie angegeben, andere Nukleinsäuren ein, die für die Expression von Peptiden wie solchen kodieren, die vorliegend in Fig. 1A bis D (SEQ ID NO: 2), Fig. 3 (SEQ ID NO: 4), Fig. 5 (SEQ ID NO: 5) und Fig. 6 (SEQ ID NO: 6) dargelegt sind. Demgemäß kann, während spezifische DNA in Beziehung zum ob-Gen isoliert und sequenziert worden ist, jede tierische Zelle potentiell als Nukleinsäurequelle für das molekulare Klonieren eines Gens dienen, welches für die erfindungsgemäßen Peptide kodiert. Die DNA kann mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren aus klonierter DNA (z. B. einer DNA-"Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung oder durch Klo­ nierung genomischer DNA oder Fragmenten derselben, gereinigt aus der gewünschten Zelle, erhalten werden (s. z. B. Sambrook et al., 1989, oben; Glover, 1985, oben). Aus genomischer DNA abgeleitete Klone können zusätzlich zu kodierenden Regionen regulatorische und Intron-DNA-Regionen enthalten; von cDNA abgeleitete Klone werden keine Intron-Sequenzen enthalten. Unabhängig von der Quelle sollte das Gen zu seiner Vermehrung molekular in einen geeigneten Vektor kloniert werden.

Bei der molekularen Klonierung des Gens von genomischer DNA kann die genomische DNA unter Verwendung von Primern amplifiziert werden, die von den cDNA-Sequenzen ausgewählt worden sind. Al­ ternativ werden DNA-Fragmente generiert, von denen einige für das gewünschte Gen kodieren werden. Die DNA kann unter Verwen­ dung zahlreicher Restriktionsenzyme an spezifischen Stellen gespalten werden. Man kann DNase in Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA verwenden, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie z. B. durch Ultraschall. Die linearen DNA- Fragmente können anschließend nach ihrer Größe aufgetrennt wer­ den mittels Standardverfahren, welche Agarose- und Polyacryl­ amid-Gelelektrophorese und Säulenchromatographie einschließen, aber nicht darauf beschränkt sind.

Sobald die DNA-Fragmente hergestellt sind, kann die Identifizie­ rung des spezifischen DNA-Fragments, welches das gewünschte ob- oder ob-ähnliche Gen enthält, auf einer Reihe von Wegen durch­ geführt werden. Wenn z. B. eine Menge eines Bereichs eines ob- oder ob-ähnlichen Gens oder seiner spezifischen RNA, oder eines Fragments davon, zur Verfügung steht und gereinigt und markiert werden kann, können die generierten DNA-Fragmente mittels Nu­ kleinsäure-Hybridisierung mit der markierten Sonde einem Scree­ ning unterzogen werden [Benton et al., Science 196: 180 (1977); Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961 (1975)]. Die vorliegende Erfindung stellt derartige Nukleinsäuresonden zur Verfügung, welche ausgehend von den vorliegend offenbarten spezifischen Sequenzen in üblicher Weise hergestellt werden können, z. B. eine hybridisierbare Sonde mit einer Nukleotidse­ quenz, die mit einem mindestens 10, vorzugsweise einem 15 Nu­ kleotide langen Fragment der in Fig. 1 A bis E (SEQ ID NO: 1) oder Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) dargelegten Sequenzen korre­ spondiert. Vorzugsweise wird ein Fragment ausgewählt, welches für die erfindungsgemäßen Modulatorpeptide in hohem Maße einzig­ artig ist. Diejenigen DNA-Fragmente mit wesentlicher Homologie zur Sonde werden hybridisieren. Wie zuvor ausgeführt, können die Hybridisierungsbedingungen um so stringenter sein, je größer das Ausmaß an Homologie ist. In einer Ausführungsform werden Hybri­ disierungsbedingungen niedriger Stringenz angewendet, um ein homologes Modulatorpeptid zu identifizieren. Nach einem bevor­ zugten Aspekt und wie vorliegend experimentell dargelegt, wird eine für ein erfindungsgemäßes Modulatorpeptid kodierende Nu­ kleinsäure jedoch unter moderat stringenten Bedingungen mit einer Nukleinsäure, welche eine Nukleotidsequenz wie in Fig. 1 A bis E (SEQ ID NO: 1) oder Fig. 2A und B (SEQ ID NO: 3) ange­ geben aufweist, oder mit einem hybridisierbaren Fragment davon, hybridisiert; noch bevorzugter wird sie unter hochstringenten Bedingungen hybridisieren.

Alternativ kann die Anwesenheit des Gens durch Assays auf der Grundlage von physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts nachgewiesen werden. Beispielsweise können cDNA-Klone oder DNA-Klone, die die richti­ gen mRNAs im Wege der Hybridbildung selektieren, ausgewählt werden, die ein Protein bilden, welches z. B. im Hinblick auf seine elektrophoretische Migration, sein isoelektrisches Fokus­ sierungsverhalten, sein proteolytisches Spaltungsmuster, seine Tyrosinphosphatase-Aktivität oder seine antigenen Eigenschaften, die für die vorliegenden Modulatorpeptide bekannt sind, ähnlich oder identisch ist. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Antikörper in herkömmlicher Weise verwendet werden, um nach Homologen der Modulatorpeptide aus anderen Quellen zu screenen.

Ein für ein erfindungsgemäßes Modulatorpeptid kodierendes Gen kann ebenfalls identifiziert werden durch mRNA-Selektion, d. h. durch Nukleinsäure-Hybridisierung und anschließender in vitro- Translation. Bei diesem Vorgehen werden Fragmente verwendet, um komplementäre mRNAs durch Hybridisierung zu isolieren. Derartige DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte Modulator-DNA re­ präsentieren. Durch Immunpräzipitationsanalyse oder funktionel­ le Assays (z. B. Tyrosinphosphatase-Aktivität) der in vitro- Translationsprodukte der Produkte der isolierten mRNAs werden die mRNA und demgemäß die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten, identifiziert. Zusätzlich kön­ nen spezifische mRNAs ausgewählt werden durch Adsorption von aus Zellen isolierten Polysomen an immobilisierte Antikörper, die spezifisch gegen ein Modulatorpeptid gerichtet sind.

Eine radioaktiv markierte Modulatorpeptid-cDNA kann syntheti­ siert werden unter Verwendung der selektierten mRNA (von den adsorbierten Polysomen) als Template. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann anschließend als Sonde zur Identifizierung homologer Modulatorpeptid-DNA-Fragmente aus anderen genomischen DNA-Fragmenten verwendet werden.

Wie zuvor ausgeführt wurde, kann eine für die vorliegend offen­ barten Peptide zur Gewichtsmodulation kodierende DNA-Sequenz eher synthetisch hergestellt als kloniert werden. Die DNA-Se­ quenz kann mit den geeigneten Kodons für die Aminosäuresequenzen des Gewichtsmodulatorpeptids ausgestattet sein. Im allgemeinen wird man bevorzugte Kodons für den beabsichtigten Wirt auswäh­ len, wenn die Sequenz zur Expression verwendet werden soll. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonukleotiden zusammengefügt, die mittels Standardverfahren hergestellt und zu einer vollständigen kodierenden Sequenz zusammengefügt wurden. Vgl. z. B. Edge, Nature, 292: 756 (1981); Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984); Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984).

Synthetische DNA-Sequenzen erlauben eine praktische Konstruktion von Genen, die, wie oben beschrieben, Analoga der Gewichtsmodu­ latoren exprimieren werden. Alternativ kann für Analoga kodie­ rende DNA hergestellt werden durch ortsspezifische Mutagenese von nativen OB-Genen oder -cDNAs, und Analoga können unter di­ rekter Anwendung herkömmlicher Polypeptidsynthese hergestellt werden.

Ein allgemeines Verfahren zum ortsspezifischen Einbau von unna­ türlichen Aminosäuren in Proteine ist beschrieben von Noren et al., Science, 244: 182-188 (1989). Dieses Verfahren kann ange­ wendet werden, um Analoga des Ob-Polypeptids mit unnatürlichen Aminosäuren herzustellen.

Nicht-kodierende Nukleinsäuren

Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf die Herstellung von Antisense-Nukleotiden und Ribozymen, die verwendet werden kön­ nen, um mit der Expression der Proteine zur Gewichtsmodulation auf der translationalen Ebene zu interferieren. Bei diesem An­ satz werden Antisense-Nukleinsäure und Ribozyme verwendet, um die Translation einer spezifischen mRNA zu blockieren, entweder durch Maskieren dieser mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder durch Spaltung derselben mit einem Ribozym.

Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, die zu mindestens einem Bereich eines spezifischen mRNA-Moleküls kom­ plementär sind [Vgl. Weintraub, Sci. Am., 262: 40-46 (1990); Mar­ cus-Sekura, Anal. Biochem., 172: 289-295 (1988)]. In der Zelle hybridisieren sie mit dieser mRNA unter Bildung eines doppel­ strängigen Moleküls. Die Zelle wird eine in dieser doppelsträn­ gigen Form komplexierte mRNA nicht translatieren. Daher inter­ ferieren Antisense-Nukleinsäuren mit der Expression von mRNA in ein Protein. Oligomere von etwa 15 Nukleotiden und Moleküle, die mit dem Initiationskodon AUG hybridisieren, werden besonders wirksam sein, da sie leicht zu synthetisieren sind und wahr­ scheinlich weniger Probleme aufwerfen werden als größere Molekü­ le, wenn sie in die das Peptid zur Gewichtsmodulation produzie­ renden Zellen eingeführt werden. Antisense-Verfahren sind ange­ wendet worden, um die Expression vieler Gene in vitro zu inhi­ bieren [Marcus-Sekura, 1988, oben; Hambor et al., J. Exp. Med., 168: 1237-1245 (1988)].

Ribozyme sind RNA-Moleküle, die die Fähigkeit besitzen, andere einzelsträngige RNA-Moleküle spezifisch in einer Weise zu spal­ ten, die den DNA-Restriktionsendonukleasen in gewisser Weise analog ist. Ribozyme sind durch die Beobachtung entdeckt worden, daß bestimmte mRNAs die Fähigkeit aufweisen, ihre eigenen In­ trons herauszuschneiden. Durch Modifikation der Nukleotidsequenz dieser RNAs sind Forscher in der Lage gewesen, Moleküle herzu­ stellen, die spezifische Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und spalten können [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260: 3030- 3034 (1988)]. Da sie sequenzspezifisch sind, werden lediglich mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert.

Forscher haben zwei Typen von Ribozymen identifiziert, den Te­ trahymena-Typ und den "Hammerkopf"-Typ. Ribozyme des Tetrahyme­ na-Typs erkennen Sequenzen von vier Basen, während solche des "Hammerkopf"-Typs Sequenzen von 11 bis 18 Basen erkennen. Je länger die Erkennungssequenz, um so wahrscheinlicher ist es, daß sie ausschließlich in der Target-mRNA-Spezies auftritt. Daher sind Ribozyme des Hammerkopf-Typs gegenüber Ribozymen des Tetra­ hymena-Typs zur Inaktivierung einer spezifischen mRNA-Spezies bevorzugt, und Erkennungssequenzen von 18 Basen werden kürzeren Erkennungssequenzen vorgezogen.

Die vorliegend beschriebenen DNA-Sequenzen können demgemäß ver­ wendet werden zur Herstellung von Ribozymen, die mRNAs für Pro­ teine zur Gewichtsmodulation und deren Liganden spalten, und von Antisense-Molekülen gegen solche mRNAs, wodurch die Expression des ob-Gens inhibiert wird und erhöhte Gewichtszunahme und Adi­ positas herbeigeführt wird.

Nach einer anderen Ausführungsform werden durch die vorliegende Erfindung kurze Oligonukleotide bereitgestellt, die zu den ko­ dierenden und komplementären Strängen der OB-Nukleinsäure, oder zu den nicht-kodierenden Regionen des OB-Gens im 5′-, 3′-, oder im inneren (intronischen) Bereich der kodierenden Region kom­ plementär sind. Derartige Nukleinsäuren sind geeignet als Son­ den, entweder als direkt markierte Oligonukleotidsonden oder als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion, zur Ermittlung des Vorliegens von Mutationen in dem ob-Gen, oder der Expressions­ rate von OB-mRNA. Vorzugsweise stammen die erfindungsgemäßen nicht-kodierenden Nukleinsäuren von dem humanen OB-Gen.

Nach einer spezifischen Ausführungsform wird durch die nicht­ kodierenden Nukleinsäuren eine homologe Rekombination zur Inte­ gration eines amplifizierbaren Gens und/oder anderer regulatori­ scher Sequenzen in unmittelbarer Nähe zu dem OB-Gen ermöglicht, z. B. zur Erzielung höherer Expressionsraten des OB-Polypeptids, oder zur Kompensation einer Mutation in den regulatorischen Sequenzen des OB-Gens, die vernünftige Expressionsraten des OB- Polypeptids verhindern (s. Internationale Patent-Veröffentli­ chung WO 91/06666, veröffentlicht am 16. Mai 1991 von Skoultchi, Internationale Patent-Veröffentlichung WO 91/09955, veröffent­ licht am 11. Juni 1991 von Chappel; vgl. auch Internationale Patent-Veröffentlichung WO 91/14092, veröffentlicht am 29. No­ vember 1990 von Kucherlaptati und Campbell).

Herstellung des OB-Polypeptids: Expression und Synthese

Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen sind regu­ latorische DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und dergleichen, die die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle sicherstellen. In eukaryontischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.

Eine kodierende Sequenz steht "unter der Kontrolle" von trans­ kriptionalen und translationalen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn die RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche anschließend gespleißt und in das Protein translatiert wird, welches von der kodierenden Sequenz kodiert wird.

Eine "Signalsequenz" ist am Beginn der kodierenden Sequenz für ein auf der Oberfläche einer Zelle zu exprimierendes Protein vorhanden. Diese Sequenz kodiert für ein Signalpeptid, N-termi­ nal beim reifen Polypeptid, welches die Wirtszelle zur Trans­ lokation des Polypeptids steuert. Der Begriff "Translokations- Signalsequenz" wird vorliegend ebenfalls verwendet, um auf diese Art von Signalsequenz zu verweisen. Translokations-Signalsequen­ zen können in Assoziation mit einer Vielzahl von für Eukaryonten und Prokaryonten nativen Proteinen gefunden werden und sind häufig in beiden Typen von Organismen funktionell.

Eine DNA-Sequenz ist mit einer Expressionskontrollsequenz "ope­ rativ verknüpft", wenn die Expressionkontrollsequenz die Trans­ kription und Translation dieser DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Der Begriff "operativ verknüpft" beinhaltet das Vor­ handensein eines geeigneten Startsignals (z. B. ATG) vor der zu exprimierenden DNA-Sequenz und das Beibehalten des richtigen Leserahmens, um die Expression der DNA-Sequenz unter der Kon­ trolle der Expressionskontrollsequenz und die Produktion des gewünschten, von der DNA-Sequenz kodierten Produkts zu ermögli­ chen. Wenn ein Gen, das in ein rekombinantes DNA-Molekül inser­ tiert werden soll, kein geeignetes Startsignal enthält, kann ein solches Startsignal stromaufwärts (5′) von und in dem Leserahmen des Gens insertiert werden.

Eine "Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, wel­ che in der Lage ist, die RNA-Polymerase in einer Zelle zu binden und die Transkription einer stromabwärts (3′-Richtung) gelegenen kodierenden Sequenz zu initiieren. Zum Zwecke der Definition der vorliegenden Erfindung ist die Promotorsequenz an ihrem 3′-Ter­ minus durch die Transkriptionsinitiationsstelle abgegrenzt und erstreckt sich stromaufwärts (5′-Richtung), um die zur Initia­ tion der Transkription von Mengen, die über dem Hintergrund nachweisbar sind, minimale Anzahl von Basen oder Elementen ein­ zuschließen. Innerhalb der Promotorsequenz befindet sich eine Transkriptionsinitiationsstelle (praktischerweise definiert z. B. durch Kartierung mit Nuklease S1) wie auch proteinbindende Domä­ nen (Konsensussequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind.

Ein weiteres Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Expres­ sion der vorliegend offenbarten DNA-Sequenzen. Wie im Stand der Technik bekannt ist, können DNA-Sequenzen exprimiert werden, indem man sie mit einer Expressionskontrollsequenz in einem geeigneten Expressionsvektor operativ verknüpft und diesen Ex­ pressionsvektor zur Transformation eines geeigneten einzelligen Wirtes verwendet.

Ein derartiges operatives Verknüpfen einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz mit einer Expressionskontrollsequenz schließt natür­ lich die Bereitstellung eines Initiationskodons, ATG, in dem korrekten Leserahmen stromaufwärts der DNA-Sequenz ein, sofern dieses nicht bereits Teil der DNA-Sequenz ist.

Eine große Bandbreite an Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen kann zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen angewen­ det werden. Geeignete Expressionsvektoren können z. B. aus Seg­ menten von chromosomalen, nicht-chromosomalen und synthetischen DNA-Sequenzen bestehen. Geeignete Vektoren schließen Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z. B. E. coli-Plasmi­ de col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC oder pUC-Plasmidderivate, z. B. pGEX-Vektoren, pET-Vektoren, pmal-c, pFLAG, usw., und deren Derivate, Plasmide wie RP4; Phagen-DNAs, z. B. die zahlreichen Derivate des Phagen λ, z. B. NM989, und andere Phagen-DNA, z. B. M13 und filamentöse einzelsträngige Phagen-DNA; Hefeplasmide wie das 2µ-Plasmid oder Derivate davon; für eukaryontische Zellen geeignete Vektoren wie Vektoren, die in Insekten- oder Säuger­ zellen brauchbar sind; Vektoren, abgeleitet aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs, wie Plasmide, die modifiziert worden sind, um Phagen-DNA oder andere Expressionskontrollse­ quenzen zu verwenden; und dergleichen ein. Nach einer bevorzug­ ten Ausführungsform wird die Expression von ob in methylotropher Hefe, z. B. Pichia pastoris-Hefe erreicht (vgl. z. B. Internatio­ nale Patent-Veröffentlichung Nr. WO 90/03431, veröffentlicht am 5. April 1990 von Brierley et al.; Internationale Patent-Veröf­ fentlichung Nr. WO 90/10697, veröffentlicht am 20. September 1990 von Siegel et al.). Nach einer spezifischen, unten darge­ legten Ausführungsform wird ein Expressionsvektor hergestellt zur Expression von ob unter Kontrolle der Signalsequenz für den α-Mating-Faktor.

Jede einer großen Anzahl von Expressionkontrollsequenzen - Sequenzen, die die Expression einer damit operativ verknüpften DNA-Sequenz kontrollieren - können in diesen Vektoren zur Ex­ pression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen verwendet werden. Derartige geeignete Expressionskontrollsequenzen schließen z. B. die frühen oder späten Promotoren von SV40, CMV, Vaccinia-, Polyoma- oder Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, das LTR-System, den major operator und Promotorregionen des Phagen λ, die Kontrollregionen des fd Coat-Proteins, den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase oder für andere glykolytische Enzyme, die Promotoren von saurer Phosphatase (z. B. Phos), den AOX 1-Promotor von methylotropher Hefe, die Promotoren der α-Mating-Faktoren von Hefe, und andere Sequenzen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen von prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen oder ihren Viren kontrollieren, sowie verschiedene Kombinationen derselben ein.

Eine große Bandbreite an einzelligen Wirtszellen ist ebenfalls zur Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen geeignet. Diese Wirte können bekannte eukaryontische und prokaryontische Wirte, wie die Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Strep­ tomyces; Pilze wie Hefen (Saccharomyces, und methylotrophe Hefe wie Pichia, Candida, Hansenula und Torulopsis); und tierische Zellen, wie CHO-, R1.1-, B-W- und L-M-Zellen, Nierenzellen des afrikanischen Green Monkey (z. B. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 und BMT10), Insektenzellen (z. B. Sf9) sowie menschliche Zellen und pflanzliche Zellen in Gewebekultur einschließen.

Es ist ersichtlich, daß nicht sämtliche Vektoren, Expressions­ kontrollsequenzen und Wirte gleichermaßen gut bei der Expression der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen funktionieren werden. Auch werden nicht sämtliche Wirte in gleicher Weise mit demselben Expressionssystem funktionieren. Ein Fachmann auf dem betreffen­ den Gebiet wird jedoch ohne unzumutbaren Aufwand in der Lage sein, die richtigen Vektoren, Expressionskontrollsequenzen und Wirte auszuwählen, um die erwünschte Expression zu erreichen, ohne den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung zu verlassen. Beispielsweise muß bei der Auswahl eines Vektors der Wirt be­ rücksichtigt werden, denn der Vektor muß in ihm funktionieren. Die Anzahl der Kopien des Vektors, die Fähigkeit, diese Kopien­ zahl zu kontrollieren, und die Expression irgendwelcher anderer, von dem Vektor kodierter Proteine, wie Antibiotikamarker, werden ebenfalls Berücksichtigung finden.

Bei der Auswahl einer Expressionskontrollsequenz wird normaler­ weise eine Vielzahl von Faktoren in Betracht gezogen. Diese schließen beispielsweise die relative Stärke des Systems, seine Kontrollierbarkeit, und seine Kompatibilität mit der oder dem zu exprimierenden besonderen DNA-Sequenz oder Gen ein, insbesondere im Hinblick auf potentielle Sekundärstrukturen. Geeignete ein­ zellige Wirte werden unter Berücksichtigung z. B. ihrer Kompati­ bilität mit dem ausgewählten Vektor, ihren Sekretionseigenschaf­ ten, ihrer Fähigkeit zur korrekten Proteinfaltung, und ihrer Fermentationserfordernisse, wie auch der Toxizität des von den zu exprimierenden DNA-Sequenzen kodierten Produkts für den Wirt, und der Einfachheit der Reinigung der Expressionsprodukte ausge­ wählt.

Unter Berücksichtigung dieser und anderer Faktoren wird ein durchschnittlicher Fachmann auf dem betreffenden Gebiet in der Lage sein, eine Vielzahl von Vektor/Expressionskontrollsequenz/ Wirt-Kombinationen herzustellen, welche die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen im Wege der Fermentation oder in der Tierkultur im Industriemaßstab exprimieren werden.

Nach einer spezifischen Ausführungsform kann ein OB-Fusionspro­ tein exprimiert werden. Ein OB-Fusionsprotein umfaßt mindestens einen funktionell aktiven Bereich eines Nicht-OB-Proteins, wel­ cher über eine Peptidbindung mit mindestens einem funktionell aktiven Bereich eines OB-Polypeptids verbunden ist. Die Nicht- OB-Sequenzen können amino- oder carboxyterminal zu den OB-Se­ quenzen gelegen sein. Für eine stabile Expression eines proteo­ lytisch inaktiven OB-Fusionsproteins wird der Bereich des Nicht- OB-Fusionsproteins bevorzugt über eine Peptidbindung mit dem Aminoterminus des OB-Proteins verbunden. Ein für ein derartiges Fusionsprotein kodierendes rekombinantes DNA-Molekül umfaßt eine Sequenz, die für mindestens einen funktionell aktiven Bereich eines Nicht-OB-Proteins, verknüpft in Leserichtung mit der für OB kodierenden Sequenz, und vorzugsweise für eine Spaltstelle für eine spezifische Protease kodiert, z. B. Thrombin oder Faktor Xa, vorzugsweise an der OB-Nicht-OB-Verbindungsstelle. Nach einer spezifischen Ausführungsform wird das Fusionsprotein in Escherichia coli oder in P. pastoris exprimiert.

Nach einer nachfolgend dargelegten spezifischen Ausführungsform wurden Vektoren hergestellt zur Expression der murinen und huma­ nen ob-Gene, mit und ohne das Kodon für Gln-49, in bakteriellen Expressionssystemen und Hefe (Pichia)-Expressionssystemen als Fusionsproteine. Das ob-Gen wird hergestellt mit einer Endonu­ kleaseschnittstelle, z. B. unter Anwendung von PCR und neuen Primern. Es ist wünschenswert, die durch PCR generierten Sequen­ zen zu bestätigen, da die Wahrscheinlichkeit für das Einschlie­ ßen einer Punktmutation mit dieser Technik höher ist. Es wird ein Plasmid verwendet, welches einen Histidin-Tag (His-Tag) und eine proteolytische Spaltstelle enthält. Die Anwesenheit von Histidin ermöglicht die selektive Isolierung von rekombinanten Proteinen über eine Ni-Chelationensäule, oder durch Affinitäts­ reinigung. Die proteolytische Spaltstelle, nach einer nachfol­ gend dargelegten spezifischen Ausführungsform eine Thrombin- Spaltstelle, wird derart geschaffen, daß eine Behandlung mit der Protease, z. B. Thrombin, zur Freisetzung des reifen (d. h. ohne Signalsequenz) OB-Polypeptids in vollständiger Länge führen wird.

Nach einem anderen Aspekt kann der Vektor pGEX [Smith et al., Gene 67: 31-40 (1988)] verwendet werden. Dieser Vektor fusioniert die cDNA für die Glutathionin S-Transferase Schistosoma japoni­ cum mit der interessierenden Sequenz. Die bakteriellen Proteine werden geerntet und rekombinante Proteine können über eine redu­ zierte Glutathion-Affinitätssäule schnell gereinigt werden. Der GST-Träger kann nachfolgend von den Fusionsproteinen durch Ver­ dau mit stellenspezifischen Proteasen abgespalten werden. Nach der Spaltung können der Träger und ungespaltenes Fusionsprotein durch Absorption von Glutathion-Agarose entfernt werden. Eine Schwierigkeit bei diesem System tritt gelegentlich auf, wenn das kodierte Protein in wäßrigen Lösungen unlöslich ist.

Die Expression von rekombinanten Proteinen in bakteriellen Sy­ stemen kann zu einer inkorrekten Faltung des exprimierten Pro­ teins führen, wodurch eine erneute Faltung erforderlich wird. Das rekombinante Protein kann vor oder nach der Spaltung zur Bildung eines funktionell aktiven OB-Polypeptids zurückgefaltet werden. Das OB-Polypeptid kann erneut gefaltet werden durch (i) Inkubation des Proteins in einem denaturierenden Puffer, welcher ein Reduktionsmittel enthält, und anschließende (ii) Inkubation des Proteins in einem Puffer, welcher ein Oxidationsmittel und vorzugsweise auch ein Protein-stabilisierendes Mittel oder ein chaotropes Mittel oder beide enthält. Geeignete Redox (reduzie­ rend/oxidierend)-Paare schließen reduziertes Glutathion/Gluta­ thiondisulfid, Cystin/Cystein, Cystamin/Cysteamin und 2-Mercap­ toethanol/2-Hydroxyethyldisulfid ein, sind aber nicht darauf be­ schränkt. Nach einem besonderen Aspekt kann das Fusionsprotein vor der Überführung in den reduzierenden Puffer in einem Dena­ turierungsmittel wie Harnstoff löslich gemacht werden. Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein vor der Über­ führung in den reduzierenden Puffer auch gereinigt, z. B. durch Ionenaustausch- oder Ni-Chelationen-Chromatographie. Denaturier­ ungsmittel schließen Harnstoff und Guanidin-HCl ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Das rekombinante Protein wird anschlie­ ßend etwa mindestens 10fach, vorzugsweise etwa 100fach, in einem Oxidationspuffer verdünnt, der ein Oxidationsmittel enthält, wie - aber nicht beschränkt auf - 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,3 M oxidiertes Glutathion. Das Fusionspro­ tein wird anschließend etwa 1 bis etwa 24 Stunden lang, vorzugs­ weise etwa 2 bis etwa 16 Stunden lang bei Raumtemperatur in dem Oxidationspuffer inkubiert. Der Oxidationspuffer kann ein Pro­ tein-stabilisierendes Mittel, z. B. einen Zucker, einen Alkohol, oder Ammoniumsulfat umfassen. Der Oxidationspuffer kann ferner ein chaotropes Mittel in niedriger Konzentration umfassen, um inkorrekte intermolekulare Interaktionen zu destabilisieren und damit eine korrekte Faltung zu fördern. Geeignete chaotrope Mit­ tel schließen ein Detergens, ein Polyol, L-Arginin, Guanidin-HCl und Polyethylenglykol (PEG) ein, sind aber nicht darauf be­ schränkt. Es ist wichtig, eine ausreichend niedrige Konzentra­ tion des chaotropen Mittels anzuwenden, um eine Denaturierung des Proteins zu vermeiden. Das zurückgefaltete Protein kann mindestens etwa 10fach, vorzugsweise aber entsprechend seiner Verdünnung in dem Oxidationspuffer konzentriert werden.

Bakterielle Fermentationsverfahren können ebenfalls zu einer rekombinanten Proteinpräparation führen, die unakzeptable Mengen an Endotoxinen enthält. Daher zieht die Erfindung eine Entfer­ nung derartiger Endotoxine in Betracht, z. B. durch Verwendung Endotoxin-spezifischer Antikörper oder anderer Endotoxin-binden­ der Moleküle. Die Anwesenheit von Endotoxinen kann mittels Stan­ dardverfahren ermittelt werden, wie durch Anwendung von E-TOXATE Reagents (Sigma, St. Louis. Missouri), oder mit Bioassays.

Zusätzlich zu dem spezifischen Beispiel ziehen die vorliegenden Erfinder zur Expression des OB-Proteins die Verwendung von Bacu­ lovirus-, Säuger- und Hefe-Expressionssystemen in Betracht. Für Baculovirus-Expressionssysteme beispielsweise sowohl Nicht-Fu­ sions-Transfervektoren, wie pVL941 (BamH1-Klonierungsstelle; Summers), pVL1393 (BamH1-, SmaI-, XbaI-, EcoR1-, NotI-, XmaIII-, BglII- und PstI-Klonierungsstelle; Invitrogen), pVL1392 (BglII-, PstI-, NotI-, XmaIII-, EcoRI-, XbaI-, SmaI- und BamH1-Klonie­ rungsstelle; Summers und Invitrogen), und pBlueBacIII (BamH1-, BglII-, PstI-, NcoI- und HindIII-Klonierungsstelle, mit mögli­ chem rekombinanten Screening nach blau-weiß; Invitrogen), als auch Fusions-Transfervektoren, wie pAc700 (BamH1- und KpnI-Klo­ nierungsstelle, in dem die BamH1-Erkennungsstelle mit dem Ini­ tiationskodon beginnt; Summers), pAc701 und pAc702 (wie pAc700, jedoch mit unterschiedlichen Leserahmen), pAc360 (BamH1-Klonie­ rungsstelle 36 Basenpaare stromabwärts eines Polyhedrin-Initia­ tionskodons; Invitrogen (195)), und pBlueBacHisA, B, C (drei verschiedene Leserahmen, mit BamH1-, BglII-, PstI-, NcoI-, und HindIII-Klonierungsstelle, einem N-terminalen Peptid für Pro- Bond-Reinigung, und rekombinantem Screening von Plaques nach blau/weiß; Invitrogen (220)), wobei die jeweilige Auswahl nicht auf die genannten Beispiele beschränkt ist.

Säuger-Expressionsvektoren, die zur Verwendung im Rahmen der Erfindung in Betracht gezogen werden, schließen Vektoren mit induzierbaren Promotoren, wie den Dihydrofolatreduktase (DHFR)- Promotor, z. B. irgendeinen Expressionsvektor mit einem DHFR-Ex­ pressionsvektor, oder einem DHFR/Methotrexat Co-Amplifikations- Vektor, wie pED (PstI-, SalI-, SbaI-, SmaI- und EcoRI-Klonie­ rungsstelle, wobei der Vektor sowohl das klonierte Gen als auch DHFR exprimiert; vgl. Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12, 1991), ein. Alternativ kann ein Glutaminsynthe­ tase/Methioninsulfoximin Co-Amplifikationsvektor, wie pEE14 (HindIII-, XbaI-, SmaI-, SbaI-, EcoRI- und BclI-Klonierungsstel­ le, in welcher der Vektor Glutaminsynthase und das klonierte Gen exprimiert; Celltech), verwendet werden. Nach einer anderen Ausführungsform kann ein Vektor verwendet werden, welcher die episomale Expression unter Kontrolle des Epstein-Barr-Virus (EBV) steuert, wie pREP4 (BamH1-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII- und KpnI-Klonierungsstelle, konstituti­ ver RSV-LTR-Promotor, Hygromycin-selektierbarer Marker; Invitro­ gen), pCEP4 (BamH1-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII- und KpnI-Klonierungsstelle, konstitutives frühes hCMV- Gen, Hygromycin-selektierbarer Marker; Invitrogen), pMEP4 (KpnI, PvuI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI-, BamH1-Klonie­ rungsstelle, induzierbarer Metallothionein IIa-Genpromotor, Hygromycin-selektierbarer Marker; Invitrogen), pREP8 (BamH1-, XhoI-, NotI-, HindIII-, NheI- und KpnI-Klonierungsstelle, RSV- LTR-Promotor, Histidinol-selektierbarer Marker; Invitrogen), pREP9 (KpnI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI- und BamH1- Klonierungsstelle, RSV-LTR-Promotor, G418-selektierbarer Marker; Invitrogen), und pEBVHis (RSV-LTR-Promotor, Hygromycin-selek­ tierbarer Marker, N-terminales Peptid, zu reinigen über ProBond- Harz und gespalten durch Enterokinase; Invitrogen). Selektier­ bare Säuger-Expressionsvektoren zur Verwendung im Rahmen der vorliegenden Erfindung schließen pRc/CMV (HindIII-, BstXI-, NotI-, SbaI- und ApaI-Klonierungsstelle, G418-Selektion; Invi­ trogen), pRc/RSV (HindIII-, SpeI-, BstXI-, NotI-, XbaI-Klonie­ rungsstelle, G418-Selektion; Invitrogen), und andere ein. Säu­ ger-Expressionsvektoren auf der Grundlage des Vaccinia-Virus (vgl. Kaufman, 1991, oben) zur erfindungsgemäßen Verwendung schließen pSC11 (Smal-Klonierungsstelle, TK- und β-gal-Selek­ tion), pMJ601 (SalI-, SmaI-, AflI-, NarI-, BspMII-, BamHI-, ApaI-, NheI-, SacII-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle; TK- und β-gal-Selektion) und pTKgptF1S (EcoRI-, PstI-, SalI-, AccI-, HindII-, SbaI-, BamHI- und Hpa-Klonierungsstelle, TK- oder XPRT- Selektion) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.

Zur Expression des OB-Polypeptids können erfindungsgemäß eben­ falls Hefe-Expressionssysteme verwendet werden. Beispielsweise können der Nicht-Fusions-Vektor pYES2 (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, GstXI-, EcoRI-, BstXI-, BamH1-, SacI-, KpnI- und HindIII- Klonierungsstelle; Invitrogen) oder der Fusionsvektor pYESHisA, B, C (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, BstXI-, EcoRI-, BamH1-, SacI-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle, N-terminales Peptid, gerei­ nigt mit ProBond-Harz und gespalten mit Enterokinase; Invitro­ gen), um nur zwei zu nennen, erfindungsgemäß eingesetzt werden. Es ist ferner beabsichtigt, daß die Peptidanaloga zur Modulation des Körpergewichts ausgehend von Nukleotidsequenzen hergestellt werden können, die aus dem Rahmen der vorliegenden Erfindung abgeleitet worden sind.

Zusätzlich zur rekombinanten Expression des OB-Polypeptids stellt die vorliegende Erfindung die Herstellung des OB-Polypep­ tids, oder Fragmenten desselben, in Aussicht und versetzt den Fachmann in jeder Hinsicht in die Lage, unter Anwendung der gut bekannten und hoch entwickelten Techniken der Festphasen-Peptid­ synthese diese herzustellen. Erfindungsgemäß sind zur Herstel­ lung des OB-Polypeptids oder Fragmenten desselben sowohl die populären Boc- und Fmoc- als auch die anderen Schutzgruppenstra­ tegien in Betracht zu ziehen. Verschiedene Techniken zur erneu­ ten Re-Faltung und Oxidation der Cystein-Seitenketten zur Aus­ bildung einer Disulfidbindung sind auf dem Gebiet ebenfalls gut bekannt.

Antikörper gegen das OB-Polypeptid

Erfindungsgemäß können das rekombinant oder mittels chemischer Synthese hergestellte OB-Polypeptid und Fragmente oder andere Derivate oder Analoga davon, einschließlich Fusionsproteine als Immunogen zur Bildung von Antikörpern verwendet werden, die das OB-Polypeptid erkennen. Derartige Antikörper schließen polyklo­ nale, monoklonale, chimäre, einzelkettige, Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek ein, sind aber nicht darauf be­ schränkt.

Ein Molekül ist "antigen", wenn es in der Lage ist, in spezifi­ scher Weise mit einem Antigen-Erkennungsmolekül des Immunsystems wie einem Immunglobulin (Antikörper) oder einem T-Zell-Antigen- Rezeptor zu interagieren. Ein antigenes Polypeptid enthält min­ destens etwa 5 und vorzugsweise mindestens etwa 10 Aminosäuren. Ein antigener Bereich eines Moleküls kann derjenige Bereich sein, welcher hinsichtlich der Erkennung durch einen Antikörper oder T-Zell-Rezeptor immundominant ist, oder es kann ein Bereich sein, welcher zur Herstellung eines Antikörpers gegen das Mole­ kül durch Konjugation des antigenen Bereichs mit einem Trägermo­ lekül zur Immunisierung verwendet worden ist. Ein Molekül, wel­ ches antigen ist, muß selbst nicht immunogen sein, d. h. in der Lage sein, eine Immunantwort ohne einen Träger auszulösen.

Ein "Antikörper" ist jedes Immunglobulin, einschließlich Anti­ körper und Fragmente davon, welches an ein spezifisches Epitop bindet. Mit dem Begriff sind polyklonale, monoklonale und chimä­ re Antikörper, wobei letztere detailliert in den US-Patenten Nrn. 4 816 397 und 4 816 567 beschrieben sind, sowie Antigen­ bindende Bereiche von Antikörpern, einschließlich Fab, F(ab′)₂ und F(v) (einschließlich einzelkettiger Antikörper), umfaßt. Demgemäß bezieht sich der Ausdruck "Antikörpermolekül" in seinen vorliegend verwendeten vielfältigen grammatikalischen Formen so­ wohl auf ein intaktes Immunglobulinmolekül als auch auf einen immunologisch aktiven Bereich eines Immunglobulinmoleküls, wel­ cher die Antikörper-kombinierende Stelle enthält. Eine "Antikör­ per-kombinierende Stelle" ist derjenige strukturelle Bereich eines Antikörpermoleküls, bestehend aus variablen und hyperva­ riablen Regionen der schweren und leichten Kette, welcher in spezifischer Weise Antigene bindet.

Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulin­ moleküle, im wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und solche Bereiche eines Immunglobulinmoleküls, die das Paratop einschließlich derjenigen Bereiche, die auf dem Gebiet als Fab, Fab′, F(ab′)₂ und F(v) bekannt sind, einschließen, wobei diese Bereiche zur Verwendung bei den vorliegend beschriebenen thera­ peutischen Verfahren bevorzugt sind.

Die Fab- und F(ab′)₂-Bereiche von Antikörpermolekülen werden durch proteolytische Reaktion von Papain bzw. Pepsin mit im wesentlichen intakten Antikörpermolekülen unter Anwendung gut bekannter Verfahren hergestellt. Vgl. z. B. US-Patent Nr. 4 342 566 von Theofilopolous et al. Die Bereiche des Fab′-Anti­ körpermoleküls sind ebenfalls gut bekannt und werden herge­ stellt von F(ab′)₂-Bereichen und anschließender Reduktion der Disulfidbindungen, welche die beiden Bereiche der schweren Kette verbinden, wie mit Mercaptoethanol, und anschließender Alkylie­ rung des resultierenden Proteinmercaptans mit einem Reagens wie Iodacetamin. Ein Antikörper, der intakte Antikörpermoleküle enthält, ist vorliegend bevorzugt.

Der Ausdruck "monoklonaler Antikörper" in seinen vielfältigen grammatikalischen Formen bezieht sich auf einen Antikörper mit lediglich einer Spezies einer Antikörper-kombinierenden Stelle, welche zur Immunreaktion mit einem bestimmten Antigen in der Lage ist. Ein monoklonaler Antikörper besitzt daher typischer­ weise eine einzige Bindungsaffinität für jedes Antigen, mit dem es immunreagiert. Ein monoklonaler Antikörper kann daher ein Antikörpermolekül mit einer Vielzahl von Antikörper-kombinieren­ den Stellen enthalten, wobei jede für ein unterschiedliches Antigen immunspezifisch ist; z. B. ein bispezifischer (chimärer) monoklonaler Antikörper.

Der Begriff "Adjuvans" bezieht sich auf eine Verbindung oder Mischung, welche die Immunantwort auf ein Antigen verstärkt. Ein Adjuvans kann als Gewebedepot, welches das Antigen langsam frei­ setzt, und ebenfalls als lymphoider Systemaktivator dienen, der die Immunantwort unspezifisch verstärkt [Hood et al., Immunolo­ gy, S. 384, Zweite Auflage, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Kali­ fornien, (1984)]. Häufig wird eine primäre Provokation mit einem Antigen allein in Abwesenheit eines Adjuvans nicht zur Auslösung einer humoralen oder zellulären Immunantwort führen. Adjuvanzien schließen vollständiges Freund′s-Adjuvans, unvollständiges Freund′s-Adjuvans, Saponin, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Po­ lyole, Polyanione, Peptide, Öl- oder Kohlenwasserstoffemulsio­ nen, Hämocyanine der Schlüsselloch-Napfschnecke, Dinitrophenol und potentiell geeignete humane Adjuvanzien wie BCG (Bacille Calmette-Gu´rin) und Corynebacterium parvum ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise ist das Adjuvans pharmazeutisch verträglich.

Zahlreiche im Stand der Technik bekannte Verfahren können zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen das OB-Polypep­ tid, oder ein Fragment, Derivat oder Analogon davon verwendet werden. Zur Herstellung eines Antikörpers kann eine Vielzahl von Wirtstieren durch Injektion mit dem OB-Polypeptid, oder einem Derivat (z. B. Fragment oder Fusionsprotein) davon, immunisiert werden, einschließlich Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen, usw., wobei die Auswahl nicht hierauf beschränkt ist. Nach einer Ausführungsform kann das OB-Polypeptid oder ein Fragment des­ selben mit einem immunogenen Träger, z. B. bovinem Serumalbumin (BSA) oder keyhole limpet hemocyanin (KLH) konjugiert werden. Zahlreiche Adjuvanzien können verwendet werden, um die immunolo­ gische Antwort zu steigern, was abhängig von der Wirtsspezies ist, einschließlich Freund′s (vollständiges und unvollständi­ ges), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanione, Peptide, Ölemulsionen, Hämocyanine der Schlüsselloch-Napfschnek­ ke, Dinitrophenol und potentiell geeignete humane Adjuvanzien wie BCG (Bacille Calmette-Gu´rin) und Corynebacterium parvum, wobei die Auswahl nicht hierauf beschränkt ist.

Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen das OB- Polypeptid oder gegen ein Fragment, Analogon, oder Derivat davon gerichtet sind, kann jede Technik angewendet werden, die durch kontinuierliche Kultivierung von Zellinien zur Herstellung von Antikörpermolekülen führt. Diese schließen die ursprünglich von Köhler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) entwickelte Hybridom­ technik wie auch die Trioma-Technik, die humane B-Zell-Hybrido­ mtechnik [Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983)] und die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung humaner monoklonaler Anti­ körper [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, S. 77-96, Alan R. Liss, Inc., (1985) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Immortalisierte, Antikörper-produzierende Zellinien können durch andere Techniken als Fusion hergestellt werden, wie durch direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA, oder durch Transfektion mit dem Epstein-Barr-Virus. Vgl. z. B. M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980); Ham­ merling et al., "Monoclonal Antibodies And T-cell Hybridomas" (1981); Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980); vgl. auch US-Patent Nrn. 4 341 761, 4 399 121, 4 427 783, 4 444 887, 4 451 570, 4 466 917, 4 472 500, 4 491 632, 4 493 890.

Nach einer zusätzlichen Ausführungsform der Erfindung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Anwendung neuerer Technologie hergestellt werden (PCT/US90/02545). Erfin­ dungsgemäß können humane Antikörper verwendet und durch Verwen­ dung humaner Hybridome [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026-2030 (1983]) oder durch Transformation humaner B-Zellen in vitro mit EBV-Virus (Cole et al., 1985, oben) erhalten wer­ den. Tatsächlich können erfindungsgemäß Techniken angewendet werden, die zur Bildung von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden [Morrison et al., J. Bacteriol. 159-870 (1984); Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984); Takeda et al., Nature 314: 452-454 (1985)], wonach die Gene von einem für ein OB-Poly­ peptid spezifisches Mäuse-Antikörpermolekül zusammen mit Genen von einem humanen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität verspleißt werden; derartige Antikörper liegen inner­ halb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Derartige humane oder humanisierte chimäre Antikörper werden zur Verwen­ dung bei der Therapie von menschlichen Erkrankungen oder Störun­ gen (nachfolgende beschrieben) bevorzugt, da die humanen oder humanisierten Antikörper im Vergleich zu xenogenen Antikörpern sehr viel weniger wahrscheinlich selber eine Immunantwort, ins­ besondere eine allergische Antwort induzieren.

Erfindungsgemäß können die zur Herstellung von einzelkettigen Antikörpern beschriebenen Verfahren (US-Patent 4 946 778) zur Herstellung OB-Polypeptid-spezifischer einzelkettiger Antikörper adaptiert werden. Eine zusätzliche Ausführungsform der Erfindung macht von den zur Herstellung von Fab-Expressionsbibliotheken beschriebenen Verfahren [Huse et al., Science, 246: 1275-1281 (1989)] Gebrauch, um eine rasche und leichte Identifizierung von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein OB-Polypeptid oder seiner Derivate oder Analoga zu ermögli­ chen.

Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Antikörpermoleküls enthalten, können mittels bekannter Techniken hergestellt wer­ den. Beispielsweise schließen derartige Fragmente das F(ab′)₂- Fragment, welches durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann, die Fab′-Fragmente, welche durch Re­ duktion der Disulfidbrücken des F(ab′)₂-Fragments hergestellt werden können, und die Fab-Fragmente ein, welche durch Behand­ lung des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmit­ tel hergestellt werden können, wobei die Auswahl nicht auf die genannten Fragmente beschränkt ist.

Bei der Herstellung von Antikörpern kann das Screening nach dem gewünschten Antikörper durch bekannte Techniken erfolgen, z. B. durch Radioimmunoassay, ELISA (Enzym-gekoppelter Immunoassay), "Sandwich"-Immunoassays, immunradiometrische Assays, Geldiffu­ sions-Präzipitin-Reaktionen, Immundiffusionsassays, in situ- Immunoassays (zum Beispiel unter Verwendung von kolloidalem Gold, Enzym oder radioaktiv markierten Markern), Western-Blots, Präzipitationsreaktionen, Agglutinationsassays (z. B. Gelagglu­ tinationsassays, Hämagglutinationsassays), Komplementfixie­ rungsassays, Immunfluoreszenzassays, Protein A-Assays, und Im­ munelektrophorese-Assays, usw. Nach einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung durch Nachweis eines Markers auf dem pri­ mären Antikörper nachgewiesen. Nach einer anderen Ausführungs­ form wird der primäre Antikörper nachgewiesen durch Nachweis der Bindung eines sekundären Antikörpers oder Reagens an den primä­ ren Antikörper. Nach einer weiteren Ausführungsform wird der sekundäre Antikörper markiert. Viele Wege zum Nachweis der Bin­ dung in einem Immunoassay sind bekannt und liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung. Beispielsweise kann man zur Selektion von Antikörpern, die ein spezifisches Epitop eines OB-Polypeptids erkennen, hergestellte Hybridome einem Assay bezüglich eines Produkts unterziehen, welches an ein OB- Polypeptidfragment bindet, das ein derartiges Epitop enthält. Zur Selektion eines für ein OB-Polypeptid spezifischen Antikör­ pers aus einer bestimmten Tierspezies kann man auf der Grundlage einer positiven Bindung mit dem OB-Polypeptid selektieren, wel­ ches von Zellen dieser Tierspezies exprimiert oder isoliert worden ist.

Die vorstehenden Antikörper können in bekannten Verfahren einge­ setzt werden, die mit der Lokalisierung und Aktivität des OB- Polypeptids in Beziehung stehen, z. B. für Western-Blotting, Ima­ ging von OB-Polypeptid in situ, Messung der Mengen davon in geeigneten physiologischen Proben, usw.

Nach einer spezifischen Ausführungsform können Antikörper herge­ stellt werden, die gegenüber der Aktivität des OB-Polypeptids als Agonist oder Antagonist wirken. Derartige Antikörper können unter Anwendung der nachfolgend beschriebenen Assays zur Identi­ fizierung von Liganden untersucht werden.

Nach einer spezifischen Ausführungsform werden Antikörper gezo­ gen durch Immunisierung von Kaninchen mit aufgrund der Protein­ sequenz vorhergesagten synthetischen Peptiden oder mit rekom­ binanten Proteinen, die unter Verwendung bakterieller Expres­ sionsvektoren hergestellt worden sind. Die Auswahl der syntheti­ schen Peptide erfolgt nach sorgfältiger Analyse der vorhergesag­ ten Proteinstruktur, wie oben beschrieben ist. Insbesondere werden Peptidsequenzen zwischen putativen Spaltstellen ausge­ wählt. Synthetische Peptide werden mit einem Träger wie KLH- Hämocyanin oder BSA unter Verwendung von Carbodiimid konjugiert und zur Immunisierung von Kaninchen in Freund′s-Adjuvans ver­ wendet. Um rekombinantes Protein herzustellen, kann der pGEX- Vektor zur Expression des Polypeptids verwendet werden (Smith et al., oben). Alternativ kann man lediglich hydrophile Domänen verwenden, um das Fusionsprotein herzustellen. Das exprimierte Protein wird in Mengen hergestellt und zur Immunisierung von Kaninchen in Freund′s-Adjuvans verwendet.

Nach einer anderen spezifischen Ausführungsform wird das rekom­ binante OB-Polypeptid zur Immunisierung von Hühnern verwendet, und die Anti-OB-Antikörper der Hühner werden aus dem Eigelb z. B. durch Affinitätsreinigung über eine OB-Säule gewonnen. Vorzugs­ weise werden die zur Immunisierung verwendeten Hühner unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten.

Nach einer anderen Ausführungsform werde 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019531931 00004 99880n Antikörper gegen Lep­ tin in ob/ob-Mäusen, die über kein zirkulierendes OB-Protein verfügen, und von denen demgemäß erwartet wird, daß sie eine Anti-OB-Polypeptid-Antwort generieren, da sie keine Toleranz gegenüber dem Polypeptid aufgebaut haben, und in Wildtyp-Mäusen generiert. Milzzellen von beiden Mäusegruppen können mit Myelom­ zellen fusioniert werden, um Hybridome für monoklonale Antikör­ per herzustellen.

Nach noch einer anderen Ausführungsform wird das rekombinante OB-Polypeptid verwendet zur Immunisierung von Kaninchen, und die polyklonalen Antikörper werden vor der weiteren Verwendung im­ mungereinigt. Die gereinigten Antikörper sind besonders geeignet für semi-quantitative Assays, insbesondere zum Nachweis des Vorhandenseins von zirkulierendem OB-Polypeptid im Serum oder Plasma.

Sammlungen von monoklonalen Antikörpern, die gegen Modulatorpep­ tide gebildet worden sind, können hinsichtlich zahlreicher Ei­ genschaften einem Screening zugeführt werden; d. h. hinsichtlich des Isotyps, Epitops, der Affinität, usw. Von besonderem Inter­ esse sind monoklonale Antikörper, die die Aktivität der Modula­ torpeptide neutralisieren. Derartige monoklonale Antikörper können leicht über Aktivitäts-Assays für die Gewichtsmodulatoren identifiziert werden. Antikörper mit hoher Affinität sind eben­ falls geeignet, wenn eine Immunaffinitätsreinigung von nativem oder rekombinantem Modulator möglich ist.

Vorzugsweise ist der bei den erfindungsgemäßen diagnostischen und therapeutischen Verfahren verwendete Anti-Modulator-Antikör­ per ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper. Noch bevorzugter ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper (MAK). Ferner ist es bevorzugt, daß die vorliegend verwendeten Anti-Modulator-Antikörpermoleküle in Form von Fab-, Fab′-, F(ab′)₂- oder F(v)-Bereichen von vollständigen Antikörpermolekü­ len vorliegen.

Diagnostische Implikationen

Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine Vielzahl von diagnostischen Anwendungen einschließlich Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Zuständen und/oder Stimuli, die sich auf Anomalitäten des Körpergewichts oder auf die Adipositas aufgrund ihrer Fähigkeit auswirken, die durch die vorliegenden Gewichts­ modulatoren vermittelten Aktivitäten auszulösen. Wie zuvor be­ reits erwähnt worden ist, können die Peptide zur Ge­ wichtsmodulation zur Herstellung von Antikörpern gegen sich selbst anhand einer Vielzahl von bekannten Techniken verwendet werden, und derartige Antikörper können dann isoliert und zur Untersuchung des Vorliegens einer besonderen transkriptionalen Aktivität in vermuteten Target-Zellen verwendet werden. Alterna­ tiv können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bei der Diagnose eingesetzt werden.

Auf Antikörpern basierende Diagnostika

Wie bereits vorgeschlagen worden ist, beinhaltet ein im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignetes diagnostisches Verfahren die Untersuchung einer zellulären Probe oder eines Mediums mit Hilfe eines Assays, welcher eine wirksame Menge eines Antagoni­ sten zu einem Modulatorprotein, wie eines Anti-Modulator-Anti­ körpers, vorzugsweise eines affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpers, und noch bevorzugter eines MAK einschließt. Ferner ist es bevorzugt, daß die vorliegend verwendeten Anti-Modulator- Antikörpermoleküle in Form von Fab-, Fab′-, F(ab′)₂- oder F(v)- Bereichen von vollständigen Antikörpermolekülen vorliegen. Wie zuvor ausgeführt worden ist, schließen die Patienten, denen mit diesem Verfahren geholfen werden kann, solche ein, die an Krebs, AIDS, Obesität oder anderen Zuständen leiden, bei denen ein anomales Körpergewicht ein Merkmal oder ein Faktor ist. Verfah­ ren zur Isolierung des Modulators und zur Induktion von Anti- Modulator-Antikörpern sowie zur Bestimmung und Optimierung der Fähigkeit von Anti-Modulator-Antikörpern, die Untersuchung der Target-Zellen zu unterstützen, sind auf dem technischen Gebiet gut bekannt.

Ferner können Antikörper einschließlich polyklonaler und mono­ klonaler Antikörper sowie Arzneimittel, die die Produktion oder Aktivität der Modulatoren zur Gewichtskontrolle und anderer Erkennungsfaktoren und/oder deren Untereinheiten modulieren, für bestimmte diagnostische Anwendungsformen geeignet sein, und sie können z. B. zum Zwecke des Nachweises und/oder der Messung von Zuständen verwendet werden, bei denen sich Anomalitäten des Körpergewichts entwickeln oder sich wahrscheinlich entwickeln werden. Beispielsweise können die Modulatorpeptide oder deren aktive Fragmente verwendet werden, um sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper gegen sich selbst in einer Vielzahl von zellulären Medien mittels bekannter Techniken wie der Hy­ bridomtechnik herzustellen, z. B. unter Verwendung von mit Mye­ lomzellen fusionierter Lymphozyten aus der Milz der Maus. Diese Techniken werden nachfolgend detailliert beschrieben. Gleicher­ maßen können kleine Moleküle, die die Aktivität(en) der erfin­ dungsgemäßen Rezeptor-Erkennungsfaktoren nachahmen oder die ihnen gegenüber als Antagonist wirken, aufgefunden oder synthe­ tisiert und im Rahmen diagnostischer und/oder therapeutischer Maßnahmen verwendet werden.

Die Anwesenheit von Gewichtsmodulatoren in Zellen kann durch gewöhnliche immunologische Vorgehensweisen festgestellt werden, die auf derartige Bestimmungen anwendbar sind. Es sind eine Reihe von geeigneten Verfahren bekannt. Drei solcher Verfahren, die besonders geeignet sind, machen entweder Gebrauch von dem mit einem nachweisbaren Marker markierten Rezeptor-Erkennungs­ faktor, Antikörper Ak₁, markiert mit einem nachweisbaren Marker, oder dem Antikörper Ak₂, markiert mit einem nachweisbaren Marker. Die Verfahren können durch die folgenden Gleichungen zusammen­ gefaßt werden, wobei das Sternchen auf eine Markierung des Par­ tikels hinweist und "WM" den Gewichtsmodulator angibt:

• A. WM* + Ak₁ = WM*Ak₁
• B. WM + Ak*₁ = WMAk₁*
• C. WM + Ak₁ + Ak₂* = Ak₁WMAk₂*.

Die Verfahren und ihre Anwendung sind dem Fachmann auf dem tech­ nischen Gebiet gut bekannt und können demgemäß im Rahmen der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Das "kompetitive" Verfahren, Verfahren A, ist in den US-Patenten Nrn. 3 654 090 und 3 850 752 beschrieben. Das Verfahren B ist repräsentativ für die gut bekannten kompetitiven Assayverfahren. Das Verfahren C, das "Sandwich"-Verfahren, ist in den US-Patent Nrn. RE 31 006 und 4 016 043 beschrieben. Es sind noch weitere Verfahren be­ kannt, wie das "doppelte Antikörper"-, oder das "DASP"-Verfah­ ren.

In jedem Fall bilden die Gewichtsmodulatoren Komplexe mit einem oder mehreren Antikörpern oder Bindungspartnern, und ein Mit­ glied des Komplexes wird mit einem nachweisbaren Marker mar­ kiert. Die Tatsache, daß sich ein Komplex gebildet hat und ge­ wünschtenfalls seine Menge können anhand von bekannten Verfah­ ren, die auf den Nachweis von Markern anwendbar sind, ermittelt werden. Aus dem obigen wird ersichtlich, daß eine charakteri­ stische Eigenschaft von Ak₂ darin liegt, daß er mit Ak₁ reagiert. Dies liegt daran, daß Ak₁, der in einer Säugerspezies gezogen wurde, in einer anderen Spezies als Antigen verwendet worden ist, um den Antikörper Ak₂ zu bilden. Beispielsweise kann Ak₂ unter Verwendung von Antikörpern des Kaninchens als Antigen in Ziegen gezogen werden. Der Ak₂ wäre demnach ein in Ziegen gezoge­ ner Anti-Kaninchen-Antikörper. Für die Zwecke der vorliegenden Beschreibung und Ansprüche bezieht sich Ak₁ auf einen primären oder Anti-Gewichtsmodulator-Antikörper, und Ak₂ bezieht sich auf einen sekundären oder Anti-Ak₁-Antikörper.

Die für diese Studien gewöhnlich verwendeten Marker sind radio­ aktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, die bei Exposition mit ultraviolettem Licht fluoreszieren, und andere.

Eine Reihe von fluoreszierenden Materialien sind bekannt und können als Marker verwendet werden. Diese schließen z. B. Fluo­ rescein, Rhodamin und Auramin ein. Ein besonderes Material zum Nachweisen ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, welcher in Ziegen hergestellt und über ein Isothiocyanat mit Fluorescein konju­ giert ist.

Die Gewichtsmodulatoren oder deren Bindungspartner können eben­ falls mit einem radioaktiven Element oder mit einem Enzym mar­ kiert werden. Der radioaktive Marker kann durch jedes der gegen­ wärtig zur Verfügung stehenden Counting-Verfahren nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann ausgewählt werden aus ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I und ¹⁸⁶Re.

Enzymmarker sind gleichermaßen geeignet und können nachgewiesen werden durch jede der gegenwärtig angewendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, amperome­ trischen oder gasometrischen Techniken. Das Enzym wird mit dem ausgewählten Partikel konjugiert durch Umsetzung mit brückenbil­ denden Molekülen wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und dergleichen. Viele der bei diesen Verfahren verwendbaren Enzyme sind bekannt und können eingesetzt werden. Bevorzugt sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Urease, Glukoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphata­ se. Auf die US-Patente Nrn. 3 654 090, 3 850 752 und 4 016 043 wird im Umfang ihrer Offenbarung von alternativen Markierungs­ materialien und -Verfahren beispielhaft Bezug genommen.

Nach einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können zur Verwendung durch einen Mediziner brauchbare Testkits hergestellt werden, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer vorbestimmten transkriptionalen Aktivität oder einer vorbestimm­ ten Fähigkeit zur transkriptionalen Aktivität in vermuteten Target-Zellen zu bestimmen. In Übereinstimmung mit den oben dargelegten Untersuchungsverfahren wird eine Klasse derartiger Kits mindestens den markierten Gewichtsmodulator oder seinen Bindungspartner, zum Beispiel einen dafür spezifischen Antikör­ per, und selbstverständlich Anleitungen in Abhängigkeit des ausgewählten Verfahrens enthalten, z. B. "kompetitiv", "Sand­ wich", "DASP" und dergleichen. Die Kits können ferner periphere Reagenzien wie Puffer, Stabilisatoren usw. enthalten.

Folglich kann ein Testkit hergestellt werden zur Feststellung der Anwesenheit oder der Fähigkeit von Zellen zu einer vorbe­ stimmten transkriptionalen Aktivität, umfassend:

• (a) eine vorbestimmte Menge von mindestens einer markier­ ten, immunochemisch reaktiven Komponente, erhalten durch direkte oder indirekte Anheftung des vorliegenden Gewichtsmodulators oder eines spezifischen Bindungspartners dafür an einen nach­ weisbaren Marker,
• (b) andere Reagenzien, und
• (c) Anweisungen zur Verwendung des Kits.

Genauer ausgedrückt, kann der diagnostische Testkit umfassen:

• (a) eine bekannte Menge des zuvor beschriebenen Gewichts­ modulators (oder eines Bindungspartners), der allgemein zur Bildung eines Immunosorbens an eine Festphase, oder alternativ, an einen geeigneten Tag oder mehrere solcher Endprodukte, usw. (oder deren Bindungspartner) gebunden ist,
• (b) erforderlichenfalls andere Reagenzien, und
• (c) Anweisungen zur Verwendung des Testkits.

Nach einer weiteren Variation kann der Testkit für die oben dargelegten Zwecke hergestellt und verwendet werden, und er funktioniert und umfaßt entsprechend einem vorher festgelegten Protokoll (z. B. "kompetitiv", "Sandwich", "doppelter Antikör­ per", usw.):

• (a) eine markierte Komponente, welche erhalten worden ist durch Kopplung des Gewichtsmodulators an einen nachweisbaren Marker,
• (b) ein oder mehrere zusätzliche immunchemische Reagenzien, von denen mindestens ein Reagens ein Ligand oder ein immubili­ sierter Ligand ist, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
• (i) einem Liganden, der in der Lage ist, an die mar­ kierte Komponente (a) zu binden,
• (ii) einem Liganden, der in der Lage ist, an einen Bindungspartner der markierten Komponente (a) zu binden,
• (iii) einem Liganden, der in der Lage ist, an mindestens eine der nachzuweisenden Komponenten zu binden, und
• (iv) einem Liganden, der in der Lage ist, an mindestens einen der Bindungspartner von mindestens einem der nachzuweisen­ den Komponenten zu binden, und
• (c) Anweisungen zur Durchführung eines Protokolls zum Nach­ weis und/oder zur Bestimmung von einer oder mehrerer Komponenten einer immunchemischen Reaktion zwischen dem Gewichtsmodulator und einem spezifischen Bindungspartner dafür.

Auf Nukleinsäuren basierende Diagnostika

Wie in den nachfolgend dargelegten Beispielen gezeigt wird, können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren zum Nachweis von Defekten verwendet werden, die mit Defekten des OB-Polypeptids assoziiert sind, welche zu adipösen Phänotypen führen. Bei­ spielsweise können Nukleinsäuresonden (z. B. bei der Northern- Analyse oder RT-PCR-Analyse) verwendet werden, um festzustellen, ob ein adipöser Phänotyp mit fehlender Expression von OB-mRNA oder der Expression von nicht-funktionaler OB-mRNA, z. B. wie in db/db-Mäusen (bei denen die Defizienz aus dem Fehlen eines OB- Rezeptors resultiert), assoziiert ist, oder wo eine Mutation zu nicht-transkribierter mRNA führt. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen, auf Nukleinsäuren basierenden diagnostischen Verfahren in Verbindung mit auf Antikörper basierenden Verfahren angewendet werden, um adipöse oder anorexische Phänotypen mole­ kular besser zu verstehen.

Die humanen cDNA-Klone, die kürzlich isoliert worden sind, sind gemäß vorliegender Darstellung sequenziert worden. Hierdurch wird die Bestimmung der vollständigen Sequenz des humanen Gens erleichtert (s. Fig. 20A bis C; SEQ ID NO: 22). Es sind DNA- Sequenzen von den Introns des humanen OB-Gens erhalten worden (Fig. 20), die zur Herstellung von PCR-Primern zur Amplifika­ tion der kodierenden Sequenz des OB-Gens von humaner genomischer DNA mittels PCR verwendet worden sind, um Mutationen oder alle­ lische Varianten des OB-Gens zu identifizieren, wobei diese Ar­ beiten in Übereinstimmung mit den zuvor eingehend dargelegten Verfahrensweisen erfolgten. In einem nachfolgenden spezifischen Beispiel werden spezifische PCR-Primer zur Amplifikation von humanem genomischen OB beschrieben.

Die derzeitige Hypothese ist, daß heterozygote Mutationen im ob- Gen mit milder/moderater Obesität assoziiert sind, während homo­ zygote Mutationen mit verschiedenen, auf der DNA-Sequenz basie­ renden diagnostischen Obesitäts-Tests assoziiert sein werden.

Wenn dies zutrifft, würde es die Ermittlung von Risikopersonen hinsichtlich der Entwicklung einer Obesität erlauben und die An­ wendung einer medikamentösen Behandlung und/oder Veränderungen des Lebensstiles ermöglichen, bevor sich ein erhöhtes Körperge­ wicht vollständig ausgebildet hat.

Alternativ kann auf das Vorliegen von Mikrosatelliten, die mit mutanten Formen des humanen OB segregieren, für eine Diagnose zurückgegriffen werden. Verschiedene PCR-Primer einschließlich solcher, die auf der in Fig. 20 A bis C dargestellten Nukleo­ tidsequenz basieren, können diesbezüglich verwendet werden.

Das OB-Gen kann ferner bei Ernährungsstörungen diagnostisch geeignet sein für Messungen der von ihm kodierten RNA und des Proteins. Bei einer bestimmten Ernährungsstörung ist es wichtig zu wissen, ob die OB-RNA und/oder das von ihr kodierte Protein nicht reguliert oder herunterreguliert wird. Demgemäß würde man, wenn eine adipöse Person erhöhte Mengen von OB aufweist, vermu­ ten, daß das Problem stromabwärts von OB liegt, während es im Falle der Reduktion von OB so scheinen würde, daß unangemessen geringe Mengen an OB eine Ursache der Obesität sein könnte (un­ abhängig davon, ob der Defekt im OB-Gen vorliegt). Umgekehrt kann, wenn ein Krebs- oder AIDS-Patient, der Gewicht verloren hat, erhöhte Werte von OB aufweist, die Schlußfolgerung gezogen werden, daß eine unangemessen hohe Expression von OB für den Ge­ wichtsverlust verantwortlich ist.

Die klonierte humane cDNA wird zur Messung der Mengen an humaner OB-RNA geeignet sein. Zusätzlich wird rekombinantes humanes Protein hergestellt und verwendet werden zur Entwicklung von Immunoassays, um eine Messung der Werte des OB-Proteins im Fett und möglicherweise im Plasma zu ermöglichen.

Therapeutische Implikationen

Die erfindungsgemäßen Polypeptide, Nukleinsäuren und Antikörper weisen ein signifikantes therapeutisches Potential auf. Vorzugs­ weise wird eine therapeutisch wirksame Menge eines solchen Agens in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff verabreicht.

Der Ausdruck "pharmazeutisch verträglich" bezieht sich auf mole­ kulare Einheiten und Zusammensetzungen, die physiologisch tole­ rierbar sind und bei Verabreichung an einen Menschen nicht typi­ scherweise eine allergische oder eine ähnliche ungünstige Reak­ tion, wie Magenverstimmung, Schwindel und dergleichen auslösen. Vorzugsweise bedeutet der Ausdruck "pharmazeutisch verträglich", wie er vorliegend verwendet wird, daß eine Genehmigung von einer Prüfungsstelle der Bundes- oder einer Landesregierung vorliegt, oder daß die Substanz im US-Pharmacopeia oder anderen allgemein anerkannten Pharmacopeia zur Anwendung bei Tieren und besonders bei Menschen aufgeführt ist. Der Begriff "Träger" bezieht sich auf ein Verdünnungsmittel, ein Adjuvans, einen Hilfsstoff oder ein Vehikel, mit welchem die Verbindung verabreicht wird. Der­ artige pharmazeutische Träger können sterile Flüssigkeiten, wie Wasser und Öle, einschließlich solcher aus Petroleum, tieri­ schem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie Erdnußöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und dergleichen sein. Wasser oder wäßrige Salinelösungen und wäßrige Dextrose- und Glycerin­ lösungen werden bevorzugt als Träger verwendet, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Träger sind beschrieben von Martin, Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990).

Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", wie er vorliegend verwendet wird, bedeutet eine Menge, die ausreichend ist, um ein klinisch signifikantes Defizit hinsichtlich der Aktivität, der Funktion und der Reaktion des Wirtes um mindestens etwa 15%, vorzugsweise um mindestens 50%, noch bevorzugter um mindestens 90% zu reduzieren, wobei die Verhinderung am meisten bevorzugt ist. Alternativ ist eine therapeutisch wirksame Menge ausrei­ chend, um eine Verbesserung eines klinisch signifikanten Zustan­ des in dem Wirt herbeizuführen.

Die Verabreichung des rekombinanten OB-Polypeptids führt zum Gewichtsverlust und insbesondere zu einer Verminderung des Fett­ gewebes. Das OB-Polypeptid kann unter Verwendung von gewöhnli­ chen bakteriellen und/oder Säuger-Expressionsvektoren synthe­ tisch oder durch Reinigung aus Plasma oder Serum hergestellt werden, was bereits zuvor eingehend dargelegt worden ist. Alter­ nativ kann die erhöhte Expression des nativen OB-Polypeptids durch homologe Rekombinationstechniken induziert werden, wie sie oben beschrieben sind.

Eine Verminderung der Aktivität des OB-Polypeptids (durch Ent­ wicklung von Antagonisten, Inhibitoren, Verwendung von neutrali­ sierenden Antikörpern oder Antisense-Molekülen) sollte zu einer Gewichtszunahme führen, wie sie zur Behandlung des mit Krebs, AIDS oder der Anorexia nervosa Gewichtsverlustes erwünscht sein kann. Eine Modulation der OB-Aktivität kann zur Reduktion des Körpergewichts (durch Steigerung seiner Aktivität) oder zur Steigerung des Körpergewichts (durch Verminderung seiner Aktivi­ tät) geeignet sein.

Auf Polypeptiden basierende therapeutische Behandlung

Im Wege der einfachsten Analyse bestimmt das OB-Gen das Körper­ gewicht von Säugern, insbesondere von Mäusen und Menschen. Das OB-Genprodukt und, in entsprechender Weise, verwandte Moleküle scheinen Teil eines Signalweges zu sein, über den das Fettgewebe mit dem Gehirn und anderen Organen kommuniziert. Es wird davon ausgegangen, daß das OB-Polypeptid selbst ein Signalmolekül, d. h. ein Hormon ist.

Das OB-Polypeptid oder ein funktionell aktives Fragment dessel­ ben oder ein Antagonist davon können oral oder parenteral, vor­ zugsweise parenteral verabreicht werden. Da die metabolische Homöostase ein kontinuierlicher Prozeß ist, wird eine Verabrei­ chung des OB-Polypeptids mit kontrollierter Freisetzung bevor­ zugt. Beispielsweise kann das Polypeptid unter Anwendung einer intravenösen Infusion, einer implantierbaren osmotischen Pumpe, einem transdermalen Pflaster, mittels Liposomen oder anderer Arten der Verabreichung dargereicht werden. Nach einer Ausfüh­ rungsform kann eine Pumpe verwendet werden [Langer et al., Hrsg., Medical Applications of Controlled Release CRC Press., Boca Rabon, Florida (1974); Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery, 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574 (1989)]. Nach einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden [Langer, 1974, oben; Sefton, 1987, oben; Smolen et al., Hrsg., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Perfor­ mance, Wiley, New York (1984); Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23: 61 (1983); vgl. auch Levy et al., Science, 228: 190 (1985); During et al., Ann. Neurol., 25: 351 (1989); Howard et al., J. Neurosurg., 71: 105 (1989)]. Nach einer weiteren Ausführungsform kann ein System zur kontrollierten Freisetzung in unmittelbare Nähe des therapeutischen Zieles, d. h. dem Gehirn, plaziert werden, wodurch lediglich ein Bruch­ teil der systemischen Dosis erforderlich ist [vgl. z. B. Goodson, Medical Applications of Controlled Release, Bd. 2, S. 115-138 (1984)]. Andere Systeme zur kontrollierten Freisetzung werden im Übersichtsartikel von Langer, Science, 249: 1527-1533 (1990) diskutiert. Nach einer anderen Ausführungsform kann die thera­ peutische Verbindung in einem Vesikel, insbesondere einem Lipo­ som appliziert werden [vgl. Langer, 1990 oben; Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lo­ pez-Berestein und Fidler (Hrsg.), Liss, New York, S. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ebd., S. 317-327; vgl. allgemein ebd].

Nach einem weiteren Aspekt können rekombinante Zellen, die mit dem OB-Gen transformiert worden sind und große Mengen des Poly­ peptids exprimieren, in ein Individuum transplantiert werden, welches das OB-Polypeptid benötigt. Vorzugsweise werden mit OB transformierte autologe Zellen transplantiert, um eine Abstoßung zu vermeiden; alternativ steht Technologie zur Verfügung, um nicht-autologe Zellen, die lösliche Faktoren bilden, innerhalb einer polymeren Matrix abzuschirmen, welche eine Immunerkennung und -abstoßung verhindert.

Das OB-Polypeptid kann auf intravenösem, intraarteriellem, in­ traperitonealem, intramuskulärem oder subkutanem Wege der Ver­ abreichung dargereicht werden. Alternativ kann das OB-Polypeptid in ordnungsgemäßer Formulierung durch nasale oder orale Applika­ tion verabreicht werden. Eine konstante Versorgung mit OB kann sichergestellt werden durch Bereitstellung einer therapeutisch wirksamen Dosis (d. h. eine Dosis, die wirksam ist zur Induktion metabolischer Veränderungen in einem Individuum) in den erfor­ derlichen Zeitabständen, z. B. täglich, alle 12 Stunden, usw. Diese Parameter werden abhängig sein von der Schwere des zu behandelnden Krankheitszustandes, sowie von anderen Eingriffen wie einer Veränderung der Diät, die vollzogen werden, dem Ge­ wicht, dem Alter und dem Geschlecht des Individuums, sowie von anderen Kriterien, die von einem Fachmann auf dem betreffenden Gebiet aufgrund guter medizinischer Standard-Erfahrung leicht ermittelt werden können.

Pharmazeutische Zusammensetzungen

Nach noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen der zuvor genannten Substanzen bereitgestellt. Derartige pharmazeutische Zusammensetzungen können für die Verabreichung durch Injektion, oder für orale, pulmonale, nasale oder andere Formen der Verabreichung vorgese­ hen sein. Im allgemeinen werden von der Erfindung pharmazeuti­ sche Zusammensetzungen in Betracht gezogen, welche wirksame Mengen an Protein oder Derivaten der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Konservierungs­ mitteln, Lösungsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvanzien und/oder Trägern umfassen. Derartige Zusammensetzungen schließen Verdün­ nungsmittel mit unterschiedlichem Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und Ionenstärke, Additive wie Deter­ genzien und Lösungsvermittler (z. B. Tween 80, Polysorbate 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Kon­ servierungsmittel (z. B. Thimersol, Benzylalkohol) und Füllmittel (z. B. Laktose, Mannit), sowie das Einarbeiten des Materials in partikuläre Zubereitungen aus polymeren Verbindungen wie Poly­ milchsäure, Polyglykolsäure, usw. oder in Liposomen ein. Hyalu­ ronsäure kann ebenfalls verwendet werden. Solche Zusammensetzun­ gen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Rate einer in vivo-Freisetzung sowie die Rate einer in vivo-Clearance der vorliegenden Proteine und Derivate beeinflussen. Vgl. z. B. Martin, Remington′s Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), S. 1435-1712, worauf hiermit Bezug genommen wird. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form oder in Form eines getrockneten Pulvers wie einer lyophilisierten Form hergestellt werden.

Orale Applikation

Zur vorliegenden Verwendung können orale, feste Dosierungsformen in Erwägung gezogen werden, welche allgemein von Martin in Re­ mington′s Pharmaceutical Sciences, 18. Ausg. 1990 (Mack Publi­ shing Co., Easton, PA 18042) im Kapitel 89 beschrieben werden, worauf hiermit Bezug genommen wird. Feste Dosierungsformen schließen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Rhomben, Kachets oder Pellets ein. Ferner kann eine liposomale oder pro­ teinoide Verkapselung angewendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (wie z. B. proteinoide Mikrokü­ gelchen gemäß der Offenbarung in dem US-Patent Nr. 4 925 673). Eine liposomale Verkapselung kann angewendet werden, und die Liposomen können mit zahlreichen Polymeren derivatisiert werden (z. B. US-Patent Nr. 5 013 556). Eine Beschreibung möglicher fester Dosierungsformen für das Heilmittel findet sich bei Mars­ hall in Modern Pharmaceutics, Kapitel 10, Banker und Rhodes, Hrsg., (1979), worauf hiermit Bezug genommen wird. Im allgemei­ nen wird die Formulierung das Protein (oder das chemisch modifi­ zierte Protein) und inerte Inhaltsstoffe einschließen, die einen Schutz gegen die Magenumgebung und eine Freisetzung des biolo­ gisch aktiven Materials im Darm ermöglichen.

Ferner werden in spezifischer Weise orale Dosierungsformen der obigen derivatisierten Proteine in Betracht gezogen. Ein Protein kann chemisch modifiziert werden, so daß die orale Applikation des Derivats wirkungsvoll ist. Allgemein betrifft die in Erwä­ gung gezogene chemische Modifikation das Anheften mindestens eines Restes an das Protein (oder Peptid)-Molekül selbst, wobei der Rest (a) die Inhibierung der Proteolyse, und (b) die Auf­ nahme vom Magen oder Darm in den Blutstrom erlaubt. Die Steige­ rung der Gesamtstabilität des Proteins und die Verlängerung der Zirkulationsdauer im Körper sind ebenfalls erwünscht. Beispiele für derartige Reste schließen ein: Polyethylenglykol, Copolymere von Ethylenglykol und Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin. Abuchowski et al., 1981, oben; Newmark et al., J. Appl. Bio­ chem., 4: 185-189 (1982). Andere Polymere, die verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-tioxocan. Wie zuvor ausgeführt worden ist, sind für die pharmazeutische Ver­ wendung Polyethylenglykolreste bevorzugt.

Im Falle des Proteins (oder Derivats) kann der Ort der Freiset­ zung der Magen, der Dünndarm (der Zwölffingerdarm, der Leerdarm oder der Krummdarm) oder der Dickdarm sein. Einem Fachmann ste­ hen Formulierungen zur Verfügung, die sich im Magen nicht auflö­ sen, die aber das Material im Zwölffingerdarm oder an einer anderen Stelle des Darmes freisetzen werden. Vorzugsweise wird sich die Freisetzung den schädigenden Effekten der Magenumgebung entziehen, was entweder durch Schutz des Proteins (oder Deri­ vats) oder durch Freisetzung des biologisch aktiven Materials jenseits der Magenumgebung, wie im Darm, erfolgen kann.

Um eine vollständige gastrische Resistenz sicherzustellen, ist eine Beschichtung erforderlich, die bis zu einem pH-Wert von mindestens 5,0 undurchlässig ist. Beispiele für die gewöhnli­ chen, als enterale Beschichtungen verwendeten inerten Inhalts­ stoffe sind Celluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylme­ thylcellulosephthalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylace­ tatphthalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, Celluloseace­ tatphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S und Shellac. Diese Beschichtungen können als gemischte Filme verwendet werden.

Eine Beschichtung oder eine Mischung von Beschichtungen kann ebenfalls für Tabletten verwendet werden, welche nicht gegenüber dem Magen geschützt werden sollen. Dies kann Zucker-Coatings oder Coatings einschließen, durch die die Tablette leichter geschluckt werden kann. Kapseln können zur Applikation eines trockenen Therapeutikums, d. h. Pulvers aus einer harten Schale (wie Gelatine) bestehen, wohingegen im Falle flüssiger Formen eine weiche Gelatineummantelung verwendet werden kann. Das um­ hüllende Material von Kachets könnte dicke Stärke oder anderes eßbares Papier sein. Für Pillen, Rhomben, geformte Tabletten oder Tablettentriturate können Verfahren zur Feuchtmassierung angewendet werden.

Das Therapeutikum kann in die Formulierung in Form feiner mul­ tipartikulärer Stoffe in Form von Granula oder Pellets mit einer Partikelgröße von etwa 1 mm eingeschlossen werden. Die Formulie­ rung des Materials zur Kapselverabreichung könnte auch als Pul­ ver, leicht komprimierte Pfropfen oder sogar als Tabletten vor­ genommen werden. Das Therapeutikum könnte mittels Kompression hergestellt werden.

Farbstoffe und Aromastoffe können ebenfalls eingeschlossen wer­ den. Beispielsweise kann das Protein (oder Derivat) formuliert (wie durch Liposomen- oder Mikrokügelchen-Verkapselung) und anschließend weiter in ein Nahrungsmittel wie in ein gekühltes Erfrischungsgetränk, welches Farbstoffe und Aromastoffe enthält, eingeschlossen werden.

Man kann das Volumen des Therapeutikums mit einem inerten Mate­ rial verdünnen oder erhöhen. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannit, α-Lactose, wasserfreie Lac­ tose, Cellulose, Sucrose, modifizierte Dextrane und Stärke ein­ schließen. Bestimmte anorganische Salze können ferner als Füll­ stoffe verwendet werden, einschließlich Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige im Handel erhältli­ che Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcom­ press und Avicell.

Bei der Formulierung des Therapeutikums zu einer festen Dosie­ rungsform können Sprengmittel eingeschlossen werden. Als Spreng­ mittel verwendete Materialien schließen Stärke einschließlich das handelsübliche, auf Stärke basierende Sprengmittel Explotab ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Natriumstärkeglykolat, Amberlit, Natriumcarboxymethylcellulose, Ultramylopektin, Na­ triumalginat, Gelatine, Orangenschale, saure Carboxymethylcellu­ lose, natürlicher Schwamm und Bentonit können ebenfalls verwen­ det werden. Eine andere Form der Sprengmittel betrifft die un­ löslichen Kationenaustauscherharze. Pulverisierte Gumme können als Sprengmittel und als Binder verwendet werden, und diese kön­ nen pulverisierte Gumme wie Agar, Karaya oder Tragant einschlie­ ßen. Alginsäure und ihr Natriumsalz sind ebenfalls als Spreng­ mittel geeignet.

Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Mit­ tel zusammenzuhalten, um eine harte Tablette zu formen, und sie schließen Materialien aus natürlichen Produkten wie Akazie, Tragant, Stärke und Gelatine ein. Andere schließen Methylcel­ lulose (MC), Ethylcellulose (EC) und Carboxymethylcellulose (CMC) ein. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylcel­ lulose (HPMC) können beide in alkoholischen Lösungen zum Granu­ lieren des Therapeutikums verwendet werden.

Bei der Formulierung des Therapeutikums kann ein Antifriktions­ mittel eingeschlossen werden, um ein Verkleben während der For­ mulierung zu verhindern. Gleitmittel können als Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Wandung des Stempels oder der Preßform verwendet werden, und diese können Stearinsäure einschließlich ihrer Magnesium- und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), flüssiges Paraffin, Pflanzenöle und Wachse einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Lösliche Gleitmittel wie Natri­ umlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglykol ver­ schiedenen Molekulargewichts sowie Carbowax 4000 und 6000 können ebenfalls verwendet werden.

Gleitmittel, die die Fließeigenschaften des Arzneimittels wäh­ rend der Formulierung verbessern und beim Rearrangement während der Kompression hilfreich sein können, können zugegeben werden. Die Gleitmittel können Stärke, Talkum, pyrogenes Siliciumdioxid und hydratatisiertes Silicoaluminat einschließen.

Um die Auflösung des Therapeutikums in der wäßrigen Umgebung zu unterstützen, kann ein Tensid als Benetzungsmittel hinzugegeben werden. Tenside können anionische Detergenzien wie Natriumlau­ rylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsul­ fonat einschließen. Kationische Tenside können verwendet werden und würden Benzalkoniumchlorid oder Benzethomiumchlorid ein­ schließen. Die Liste der potentiell nicht-ionischen Tenside, die bei der Formulierung als Tenside eingeschlossen werden können, schließen Lauromacrogol 400, Polyoxyl-40-Stearat, Polyoxyethy­ len-hydriertes Castoröl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Sucrosefettsäureester, Methylcel­ lulose und Carboxymethylcellulose ein. Diese oberflächenaktiven Mittel können bei der Formulierung des Proteins oder Derivats entweder allein oder als Mischung in unterschiedlichen Mengen­ verhältnissen vorhanden sein.

Additive, die die Aufnahme des Proteins (oder Derivats) poten­ tiell unterstützen, sind beispielsweise die Fettsäuren Oleinsäu­ re, Linolsäure und Linolensäure.

Eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung kann erwünscht sein. Das Arzneimittel kann in eine inerte Matrix eingearbeitet werden, die eine Freisetzung entweder durch Diffisions- oder Leachingmechanismen ermöglicht, d. h. Gumme. In die Formulierung können ebenfalls Matrizes eingearbeitet werden, die langsam abgebaut werden. Eine andere Form einer kontrollierten Freiset­ zung dieses Therapeutikums erfolgt nach einem Verfahren auf der Grundlage des Oros-therapeutischen Systems (Alza Corp.), d. h. das Arzneimittel wird in eine semipermeable Membran einge­ schlossen, die das Eintreten von Wasser erlaubt und dadurch das Arzneimittel aufgrund osmotischer Wirkungen durch eine einzige kleine Öffnung herausdrückt. Einige enterale Coatings weisen ebenfalls einen Effekt der verzögerten Freisetzung auf.

Andere Coatings können zur Formulierung verwendet werden. Diese schließen eine Vielzahl von Zuckern ein, die in eine Coating- Pfanne gegeben werden können. Das therapeutische Mittel kann ebenfalls in einer Tablette mit dünner Beschichtung verabreicht werden, und die Materialien, die hierbei verwendet werden, wer­ den in zwei Gruppen aufgeteilt. Die erste betrifft die nicht­ enteralen Materialien und schließt Methylcellulose, Ethylcellu­ lose, Hydroxethylcellulose, Methylhydroxyethylcellulose, Hy­ droxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Natriumcarb­ oxymethylcellulose, Providon und die Polyethylenglykole ein. Die zweite Gruppe besteht aus den enteralen Materialien, die gewöhn­ lich Ester der Phthalsäure sind.

Eine Mischung von Materialien könnte verwendet werden, um eine optimale Beschichtung bereitzustellen. Das Filmen kann in einer Beschichtungsschale oder in einem Fließbett oder durch Kompres­ sionsbeschichtung erfolgen.

Pulmonale Applikation

Ebenfalls in Betracht gezogen wird die pulmonale Anwendung des vorliegenden Proteins (oder Derivats desselben). Das Protein (oder Derivat) gelangt durch Inhalation in die Lungen eines Säugers und tritt über die Auskleidung des Lungenepithels in den Blutstrom über. Weitere Berichte hierüber schließen ein Adjey et al., Pharmaceutical Research, 1 (6), S. 565-569 (1990); Adjey et al., International Journal of Pharmaceutics, 63: 135-144 (1990) (Leuprolidacetat); Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (Erg. 5): 143-146 (1989) (Endothelin-1); Hubbard et al., Annals of Internal Medicine, 3 (3): 206-212 (1989) (α1- Antitrypsin); Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (1989) (α1-Proteinase); Oswein et al., "Aerosolization of Pro­ teins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery 11, Keystone, Colorado, (März 1990) (rekombinantes humanes Wachstumshormon); Debs et al., J. Immunol., 140: 3482-3488 (1988) und Platz et al., US-Patent Nr. 5 284 656 (Granulozyten-Kolonie- stimulierender Faktor). Zur Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung bietet sich eine große Bandbreite an mechanischen Vorrichtungen an, die für die pulmonale Applikation von therapeutischen Produkten entwickelt worden sind, ein­ schließlich - aber nicht beschränkt auf - Vernebler, Inhalatoren mit Dosiereinrichtung und Inhalatoren für Pulver, die dem Fach­ mann auf dem einschlägigen Gebiet bekannt sind.

Einige spezifische Beispiele für im Handel erhältliche Vorrich­ tungen, die zur Ausführung der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind der Ultravent-Vernebler, hergestellt von Mallinck­ rodt, Inc., St. Louis, Missouri; der Acorn II-Vernebler, herge­ stellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado; der Ventolin-Inhalator mit Dosiereinrichtung, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina; und der Spinhaler- Inhalator für Pulver, hergestellt von Fisons Corp., Bedford, Massachusetts.

Sämtliche dieser Vorrichtungen erfordern die Verwendung von Formulierungen, die zur Arzneizubereitung des Proteins (oder Derivats) geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung spezifisch für den angewendeten Vorrichtungstyp und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmittels zusätzlich zu den ge­ wöhnlichen Verdünnungsmitteln, Adjuvanzien und/oder Trägern, die zur Therapie geeignet sind, beinhalten. Ebenfalls wird die Ver­ wendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrokügelchen, Ein­ schlußkomplexen oder anderen Trägertypen in Betracht gezogen. Ein chemisch modifiziertes Protein kann in Abhängigkeit des angewendeten Typs der chemischen Modifizierung oder des angewen­ deten Vorrichtungstyps auch in unterschiedlichen Formulierungen hergestellt werden.

Die Formulierungen, die zur Verwendung mit einem Vernebler entweder mittels Düse oder Ultraschall geeignet sind, werden typischerweise das Protein (oder Derivat), gelöst in Wasser in einer Konzentration von etwa 0,1 bis 25 mg biologisch aktivem Protein pro ml Lösung, umfassen. Die Formulierung kann ferner einen Puffer und einen einfachen Zucker einschließen (z. B. zur Stabilisierung des Proteins und Regulierung des osmotischen Druckes). Die Vernebler-Formulierung kann ferner ein Tensid enthalten, um eine Oberflächen-induzierte Aggregation des Pro­ teins, ausgelöst durch Zerstäubung der Lösung bei Bildung des Aerosols, zu reduzieren oder zu verhindern.

Formulierungen zur Verwendung mit einem Inhalator mit Dosisein­ richtung werden im allgemeinen ein feinverteiltes Pulver umfas­ sen, welches das Protein (oder Derivat) enthält, das mit Hilfe eines Tensids in einem Treibmittel suspendiert ist. Das Treib­ mittel kann jedes herkömmliche, für diesen Zweck eingesetzte Material sein, wie ein Fluorchlorkohlenstoff, ein Fluorchlorkoh­ lenwasserstoff, ein Fluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwas­ serstoff, einschließlich Trichlorfluormethan, Trichlordifluorme­ than, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan, oder Kombinationen derselben. Geeignete Tenside schließen Sorbitan­ trioleat und Sojalecithin ein. Oleinsäure kann ebenfalls als Tensid geeignet sein.

Formulierungen zum Dispensieren aus einer Inhalationsvorrichtung für Pulver werden ein feinverteiltes trockenes Pulver umfassen, welches das Protein (oder Derivat) enthält und ferner ein Füll­ mittel wie Lactose, Sorbit, Sucrose oder Mannit in Mengen ein­ schließt, durch die das Dispersal des Pulvers aus der Vorrich­ tung erleichtert wird, z. B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung. Das Protein (oder Derivat) sollte vorteilhafterweise in parti­ kulärer Form hergestellt werden mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von weniger als 10 µm, am meisten bevorzugt 0,5 bis 5 µm, um den distalen Lungenbereich in wirksamster Weise erreichen zu können.

Nasale Applikation

Eine nasale Applikation des Proteins (oder Derivats) ist eben­ falls möglich. Eine nasale Applikation erlaubt die Passage des Proteins in den Blutstrom direkt nach Verabreichung des thera­ peutischen Produkts in die Nase, ohne das Produkt in die Lunge befördern zu müssen. Formulierungen für eine nasale Applikation schließen solche mit Dextran oder Cyclodextran ein.

Verfahren zur Behandlung, Verfahren zur Herstellung eines Medikaments

Nach noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden Verfahren zur Behandlung und zur Herstellung eines Medikaments bereitgestellt. Die Zustände, die durch die Verabreichung der vorliegenden Derivate gelindert oder moduliert werden können, sind die oben angegebenen.

Dosierungen

Für sämtliche der oben genannten Moleküle können durch weitere Studien Informationen im Hinblick auf geeignete Dosierungen zur Behandlung verschiedener Zustände von zahlreichen Patienten erhalten werden, und der durchschnittliche Fachmann ist unter Berücksichtigung des therapeutischen Kontextes, des Alters und des allgemeinen Gesundheitszustandes des Rezipienten in der Lage, die korrekte Dosierung zu ermitteln. Im allgemeinen wird die Dosierung für eine Injektion oder Infusion zwischen 0,01 µg biologisch aktivem Protein/kg Körpergewicht (bei alleiniger Be­ rechnung der Proteinmasse, ohne chemische Modifizierung) und 10 mg/kg (auf der gleichen Grundlage) betragen. Der Dosierungs­ plan kann in Abhängigkeit von der Zirkulations-Halbwertszeit des verwendeten Proteins oder Derivats und dem Umstand, ob das Poly­ peptid mittels Bolusdosis oder Dauerinfusion verabreicht wird, sowie der verwendeten Formulierung variieren.

Verabreichung mit anderen Verbindungen

Für eine Therapie im Zusammenhang mit der Obesität kann man das vorliegende Protein (oder Derivate) in Verbindung mit einer oder mehreren pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreichen, die zur Behandlung anderer klinischer Komplikationen der Obesität, wie solchen, die zur Behandlung von Diabetes (z. B. Insulin), hohem Blutdruck, hohen Cholesterinwerten, und bei anderen nach­ teiligen Zuständen, die mit der Obesität zusammenhängen, ver­ wendet werden. Ferner können andere Appetitzügler wie z. B. Am­ phetamine mitverabreicht werden. Eine Verabreichung kann simul­ tan (z. B. Verabreichung einer Mischung des vorliegenden Proteins mit Insulin) oder in seriatim erfolgen.

Auf Nukleinsäuren basierende therapeutische Behandlung

Das OB-Gen kann in menschliche Fettzellen eingeführt werden, um eine Gentherapie für die Obesität zu entwickeln. Von einer der­ artigen Therapie ist zu erwarten, daß sie zur Senkung des Kör­ pergewichts führt. Umgekehrt führt das Einbringen von Antisense- Konstrukten in menschliche Fettzellen zur Abnahme der Mengen an aktivem OB-Polypeptid und zu einer Zunahme der Adipositas des Körpers.

Nach einer Ausführungsform wird ein für ein OB-Polypeptid kodie­ rendes Gen in vivo in einen viralen Vektor eingeführt. Derartige Vektoren schließen ein attenuiertes oder defektes DNA-Virus wie Herpes-simplex Virus (HSV), Papillomavirus, Epstein-Barr-Virus (EBV), Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus (AAV) und derglei­ chen ein, wobei die Auswahl nicht hierauf beschränkt ist. Defek­ te Viren, denen virale Gene vollständig oder nahezu vollständig fehlen, werden bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach Einführung in eine Zelle nicht infektiös. Die Verwendung von defekten vira­ len Vektoren ermöglicht die Verabreichung an Zellen in einem bestimmten lokalisierten Bereich, ohne befürchten zu müssen, daß der Vektor andere Zellen infizieren kann. Demgemäß kann Fett­ gewebe in spezifischer Weise zielgerichtet angesteuert werden. Beispiele für bestimmte Vektoren schließen einen defekten Her­ pes-Virus I (HSVI)-Vektor [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neuro­ sci., 2: 320-330 (1992)], einen attenuierten Adenovirus-Vektor, wie der von Stratford-Perricaudet et al. beschriebene J. Clin. Invest., 90: 626-630 (1992), und einen defekten Adeno-assoziier­ ten Virus-Vektor ein [Samulski et al., J. Virol., 61: 3096-3101 (1987); Samulski et al., J. Virol., 63: 3822-3828 (1989)].

Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Gen in einen retroviralen Vektor eingeführt werden, wie z. B. be­ schrieben von Anderson et al., US-Patent Nr. 5 399 346; Mann et al., Cell, 33: 153 (1983); Temin et al., US-Patent Nr. 4 650 764; Temin et al., US-Patent Nr. 4 980 289; Markowitz et al., J. Virol., 62: 1120 (1988); Temin et al., US-Patent Nr. 5 124 263; Internationale Patent-Veröffentlichung Nr. WO 95/07358, ver­ öffentlicht am 16. März 1995 von Dougherty et al.; und Kuo et al., Blood, 82: 845 (1993).

Alternativ kann der Vektor in vivo durch Lipofektion eingeführt werden. Innerhalb des letzten Jahrzehnts sind Liposome zur Ver­ kapselung und Transfektion von Nukleinsäuren in vitro immer häufiger angewendet worden. Synthetische kationische Lipide, die zur Begrenzung der Schwierigkeiten und Gefahren im Zusammenhang mit Liposomen-vermittelter Transfektion entwickelt worden sind, können zur Herstellung von Liposomen für eine in vivo-Transfek­ tion eines für einen Marker kodierenden Gens verwendet werden [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413-7417 (1987); vgl. Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027- 8031 (1988)]. Die Verwendung von kationischen Lipiden kann die Verkapselung von negativ geladenen Nukleinsäuren fördern, und sie kann ebenfalls die Fusion mit negativ geladenen Zellmembra­ nen fördern [Felgner et al., Science, 337: 387-388 (1989)]. Die Anwendung einer Lipofektion zur Einführung exogener Gene in spezifische Organe in vivo weist bestimmte praktische Vorteile auf. Das molekulare Targeting von Liposomen zu spezifischen Zellen stellt ein vorteilhaftes Gebiet dar. Es ist klar, daß eine auf bestimmte Zelltypen gerichtete Transfektion besonders vorteilhaft bei einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität ist, wie bei dem Pankreas, der Leber, der Niere und dem Gehirn. Lipi­ de können zum Zwecke des Targetings chemisch mit anderen Molekü­ len gekoppelt werden (vgl. Mackey et al., 1988, oben). Zielge­ richtete Peptide wie z. B. Hormone oder Neurotransmitter, und Proteine wie Antikörper, oder nicht-peptidartige Moleküle könn­ ten chemisch mit Liposomen gekoppelt werden.

Es ist ebenfalls möglich, den Vektor in vivo als nacktes DNA- Plasmid einzuführen. Nackte DNA-Vektoren zur Gentherapie können in die gewünschten Wirtszellen mittels bekannter Verfahren ein­ geführt werden, wie z. B. durch Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calcium­ phosphatpräzipitation, unter Anwendung einer Gen-Kanone oder unter Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters (vgl. z. B. Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 963-967 (1992); Wu et al., J. Biol. Chem., 263: 14621-14624 (1988); Hartmut et al., Kanadische Patent­ anmeldung Nr. 2 012 311, eingereicht am 15. März 1990).

Landwirtschaftliche Anwendungen

Das OB-Gen kann auch aus Haustieren isoliert werden, und das korrespondierende OB-Polypeptid kann auf diese Weise erhalten werden. Nach einem nachfolgend dargelegten spezifischen Beispiel hybridisiert die von dem murinen OB-Gen abgeleitete Sonde mit korrespondierenden homologen kodierenden Sequenzen einer großen Anzahl von Tierspezies. Wie im Zusammenhang mit Humantherapien diskutiert worden ist, können rekombinante Proteine ebenfalls für Haustiere hergestellt und an diese verabreicht werden. Eine Verabreichung des Polypeptids kann in Erwägung gezogen werden, um magerere Tiere als Fleischproduzenten, wie Mastrinder, -schweine, -geflügel, -schafe usw. zu schaffen. Vorzugsweise wird ein autologes OB-Polypeptid verabreicht, obgleich durch die Erfindung die Verabreichung von anti-autologem Polypeptid glei­ chermaßen in Betracht gezogen wird. Da das OB-Polypeptid aus ungefähr 160 Aminosäureresten besteht, kann es nicht stark immu­ nogen sein. Demgemäß muß die Verabreichung eines nicht-autologen Polypeptids nicht zwangsläufig zu einer Immunantwort führen.

Alternativ erlaubt die Einführung der klonierten Gene in trans­ gene Haustiere, das Körpergewicht und die Adipositas durch Über­ expression eines OB-Transgens zu verringern. Die einfachste Weise zur Erreichung dieses Ziels ist es, ein OB-Transgen unter Verwendung seines eigenen oder eines anderen Fett-spezifischen Promotors zielgerichtet zum Fett zu steuern.

Umgekehrt kann unter anderen Umständen eine Zunahme des Körper­ fettes erwünscht sein, wie zur Entwicklung von Kobe-Rindfleisch oder fetter Leber zur Herstellung von Leberpastete. Dies kann durch zielgerichtete Steuerung eines Antisense-OB-Transgens zum Fett oder durch Anwendung der genbezogenen "Knockout"-Technolo­ gie erreicht werden. Alternativ kann, wenn eine Zunahme des Körpergewichts hinsichtlich des Fettgehaltes erwünscht ist, ein Inhibitor oder Antagonist des OB-Polypeptids verabreicht werden. Derartige Inhibitoren oder Antagonisten schließen gegenüber dem Polypeptid reaktive Antikörper und Fragmente des Polypeptids ein, die an den OB-Rezeptor binden, diesen aber nicht aktivie­ ren, d. h. Antagonisten des OB-Polypeptids, wobei die Auswahl nicht auf die genannten Substanzen beschränkt ist.

Kosmetische Implikationen

Das OB-Polypeptid weist zusätzlich zu seinen gesundheitsbezoge­ nen Vorteilen eine signifikante Bedeutung für die kosmetische Anwendung auf. Da die erfindungsgemäßen OB-Polypeptide ein­ schließlich Derivate und Agonisten-Analoga derselben zur Modula­ tion der Rate und Quantität von Fettzellablagerungen in einem Tier geeignet sind, sind sie insbesondere geeignet zur Verminde­ rung unschönen Fettgewebes, z. B. Fettablagerungen am Bauch, den Hüften, den Oberschenkeln, dem Nacken und dem Kinn, die sich nicht notwendigerweise zu einem adipösen Zustand entwickeln, die aber trotzdem das Erscheinungsbild eines Individuums beeinträch­ tigen. Der Effekt der Fettreduktion wird teilweise auf eine Zügelung des Appetits, d. h. eine Reduktion in der Nahrungsauf­ nahme, und/oder auf eine Anhebung der Grundumsatzes oder auf beides zurückgeführt. Demgemäß sind das vorliegende OB-Polypep­ tid oder seine Derivate oder Agonisten-Analoga geeignet zur Verabreichung an ein Individuum, um kosmetische Veränderungen im Bereich der Fettgewebeablagerungen durch Modulation der Fett­ ablagerung und/ oder durch Zügelung des Appetits herbeizuführen.

Zusätzlich können die vorliegenden Zusammensetzungen und Ver­ fahren in Verbindung mit verschiedenen Vorgehensweisen angewen­ det werden, wie kosmetischen operativen Eingriffen, die entwic­ kelt worden sind, um das gesamte Erscheinungsbild eines Körpers zu verändern (z. B. Fettabsaugung oder lasergestützte operative Eingriffe, die entwickelt worden sind, um die Körpermasse durch Absaugung oder Abtragung von Fettgewebe zu vermindern), Bewegung (insbesondere Laufen und Gewichtstraining), fettarme Diät, Hyp­ nose, Biofeedback, um nur einige der Möglichkeiten zu nennen, die man in Betracht ziehen kann, um den Gehalt an Fettgewebe zu vermindern und das Erscheinungsbild des Körpers zu verbessern.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herbeiführung einer kosmetischen Modulation des Fettgewebes bei einem Individuum, welches das Verabreichen einer Fett-modulie­ renden Menge eines OB-Polypeptids oder Derivats oder Agonisten- Analogons davon an ein Individuum umfaßt, das eine kosmetische Modulation des Fettgewebes wünscht, um das Gesamterscheinungs­ bild des Körpers zu verbessern. Nach einem besonderen Aspekt ist die Modulation des Fettgewebes eine Folge der Unterdrückung des Appetits. Vorzugsweise ist die Modulation des Fettgewebes eine Reduktion des Fettgewebes.

Nach einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herbeiführung von kosmetischem Verlust an Fett­ gewebe, bei dem ein Verfahren zur Veränderung des Erscheinungs­ bildes des Körpers mit der Verabreichung einer Fett-modulieren­ den Menge eines OB-Polypeptids oder Derivats oder Agonisten- Analogons davon an ein Individuum kombiniert wird, das eine kos­ metische Modulation des Fettgewebes wünscht, um das Gesamter­ scheinungsbild des Körpers zu verbessern.

Der OB-Rezeptor

Die Entwicklung von Agonisten und Antagonisten des OB-Faktors in Form kleiner Moleküle wird durch Isolierung ihres Rezeptors stark vereinfacht. Dies kann erfolgen, indem das aktive OB-Poly­ peptid hergestellt und verwendet wird, um eine Expressionsbib­ liothek unter Anwendung üblicher Verfahren abzusuchen. Die Re­ zeptorbindung in der Expressionsbibliothek kann untersucht wer­ den, indem man ein rekombinantes Polypeptid, hergestellt entwe­ der unter Verwendung eines bakteriellen oder eines Säuger-Ex­ pressionsvektors, appliziert und die Wirkungen einer kurzzei­ tigen und kontinuierlichen Applikation des rekombinanten Poly­ peptids auf die Zellen der Expressionsbibliothek beobachtet, oder indem man die Bindung des OB-Polypeptids an die Zellen direkt nachweist.

Da gegenwärtig davon ausgegangen wird, daß sich der OB-Rezeptor wahrscheinlich im Hypothalamus und möglicherweise in der Leber befindet, werden vorzugsweise cDNA-Bibliotheken aus diesen Gewe­ ben in gewöhnlichen Expressions-Klonierungsvektoren hergestellt werden. Diese cDNA-Klone würden anschließend in COS-Zellen als Pools eingeführt werden, und die resultierenden Transformanten würden mit einem aktiven Liganden abgesucht werden, um COS-Zel­ len zu identifizieren, die den OB-Rezeptor exprimieren. An­ schließend können positive Klone isoliert werden, um den klo­ nierten Rezeptor aufzudecken. Der klonierte Rezeptor würde in Verbindung mit dem OB-Liganden (unter der Annahme, daß dieser ein Hormon ist) verwendet werden, um die zum Screening nach Modulatoren von OB in Form kleiner Moleküle erforderlichen Kom­ ponenten zu entwickeln.

Ein besonderes Assay-System, das erfindungsgemäß einsetzbar ist, ist als Rezeptor-Assay bekannt. Bei einem Rezeptor-Assay wird das zu überprüfende Material in angemessener Weise markiert und anschließend werden bestimmte zelluläre Test-Kolonien mit Mengen von sowohl dem markierten als auch dem unmarkierten Material inokuliert, wonach Bindungsstudien durchgeführt werden, um das Ausmaß zu bestimmen, in dem das markierte Material an die Zell- Rezeptoren bindet. Auf diese Weise können Unterschiede in der Affinität zwischen Materialien festgestellt werden.

Demgemäß kann eine gereinigte Charge des Gewichtsmodulators ra­ dioaktiv markiert und z. B. mit Antikörpern oder anderen Inhibi­ toren davon kombiniert werden, woran sich die Durchführung von Bindungsstudien anschließt. Im Anschluß daran werden Lösungen hergestellt, die verschiedene Mengen von markiertem und unmar­ kiertem, nicht-kombiniertem Gewichtsmodulator enthalten, und es werden dann Zellproben inokuliert und anschließend inkubiert.

Die resultierenden Zell-Monolayer werden anschließend gewaschen, löslich gemacht und in einem Gammazähler für eine Zeitdauer gezählt, die ausreichend ist, um einen Standardfehler von < 5% zu erreichen. Diese Daten werden dann einer Scatchard-Analyse zugeführt, wonach Beobachtungen und Rückschlüsse im Hinblick auf die Aktivität des Materials vorgenommen werden können. Obgleich die vorstehenden Erläuterungen beispielhaft sind, wird die Art und Weise veranschaulicht, in der ein Rezeptor-Assay in den Fällen durchgeführt und angewendet werden kann, in denen die zelluläre Bindungsfähigkeit des untersuchten Materials als un­ terscheidendes Merkmal dienen kann. Ein Rezeptor-Assay ist wie­ derum insbesondere bei der Identifizierung der spezifischen Rezeptoren für die vorliegenden Modulatoren, wie dem db-Rezeptor geeignet.

Ein weiterer Assay, der im Rahmen der vorliegenden Erfindung geeignet ist und erfindungsgemäß einbezogen ist, ist als "cis/­ trans"-Assay bekannt. Kurz gesagt, werden bei diesem Assay zwei genetische Konstrukte eingesetzt, wobei eines typischerweise ein Plasmid ist, welches im Falle der Transfektion einer geeigneten Zellinie einen bestimmten interessierenden Rezeptor kontinuier­ lich exprimiert, und wobei das zweite ein Plasmid ist, welches unter der Kontrolle eines Rezeptor/Liganden-Komplexes einen Reporter wie Luciferase exprimiert. Wenn es erwünscht ist, eine Verbindung als Liganden für einen bestimmten Rezeptor zu bewer­ ten, ist eins der Plasmide ein Konstrukt, welches zur Expression des Rezeptors in der ausgewählten Zellinie führt, während das zweite Plasmid einen Promotor besitzt, der mit dem Luciferase- Gen verknüpft ist, in welchem das antwortspezifische Element des bestimmten Rezeptors insertiert ist. Falls die zu untersuchende Verbindung ein Agonist des Rezeptors ist, wird der Ligand mit dem Rezeptor einen Komplex ausbilden, und der resultierende Komplex wird das antwortspezifische Element binden und die Transkription des Luciferase-Gens auslösen. Die resultierende Chemilumineszenz wird anschließend photometrisch gemessen, und es werden Dosiswirkungskurven erhalten und mit denjenigen be­ kannter Liganden verglichen. Die vorstehende Vorgehensweise ist eingehend im US-Patent Nr. 4 981 784 und der Internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/03168, worauf hiermit Bezug ge­ nommen wird, beschrieben.

Sobald ein rekombinanter Organismus, der die Gensequenz für den OB-Rezeptor exprimiert, identifiziert ist, kann der rekombinante OB-Rezeptor analysiert werden. Dies erfolgt mit Hilfe von As­ says, die auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaf­ ten des OB-Rezeptors basieren, einschließlich radioaktiver Mar­ kierung des Rezeptors und anschließender Analyse mittels Gel­ elektrophorese, Immunoassay, Ligandenbindung, usw. Ferner können Antikörper gegen den OB-Rezeptor wie oben beschrieben herge­ stellt werden.

Die Struktur des OB-Rezeptors kann durch verschiedene im Stand der Technik bekannte Verfahren analysiert werden. Vorzugsweise wird die Struktur der verschiedenen Domänen, insbesondere der OB-Bindungsstelle analysiert. Es kann eine strukturelle Analyse durchgeführt werden, indem man die Ähnlichkeit der Sequenz mit anderen bekannten Proteinen, insbesondere Hormon- und Protein- Rezeptoren bestimmt. Der Ähnlichkeitsgrad (oder die Homologie) kann eine Grundlage für die Vorhersage der Struktur und Funktion des OB-Rezeptors oder einer Domäne desselben darstellen. Nach einer spezifischen Ausführungsform können Sequenzvergleiche mit Sequenzen der GenBank durchgeführt werden, wobei z. B. die Pro­ gramme FASTA UND FASTP angewendet werden [Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-48 (1988)].

Die Proteinsequenz kann weiter charakterisiert werden durch eine Hydrophilizitätsanalyse (z. B. Hopp et al., 1981, oben). Ein Hy­ drophilizitätsprofil kann verwendet werden, um die hydrophoben und hydrophilen Regionen des OB-Rezeptorproteins zu identifizie­ ren, welche ihrerseits auf extrazotyplasmatische, Membran-bin­ dende, und intrazytoplasmatische Regionen hinweisen können.

Eine Analyse der Sekundärstruktur (z. B. Chou et al., 1974, oben) kann ebenfalls erfolgen, um Regionen des OB-Rezeptors zu identi­ fizieren, die auf spezifische Sekundärstrukturen schließen las­ sen.

Unter Anwendung auf dem technischen Gebiet verfügbarer Computer- Softwareprogramme können ferner eine Manipulation, eine Trans­ lation und eine Vorhersage der Sekundärstruktur sowie eine Vor­ hersage des Leserahmens und eine Aufzeichnung desselben durch­ geführt werden.

Durch Bereitstellung einer Quelle für große Mengen an rekombi­ nantem OB-Polypeptid und der Möglichkeit der Isolierung des OB- Rezeptors (d. h. des db-Genprodukts) wird durch die vorliegende Erfindung eine quantitative strukturelle Bestimmung der aktiven Konformation des OB-Polypeptids und des OB-Rezeptors oder Domä­ nen davon ermöglicht. Insbesondere wird ausreichend Material bereitgestellt für eine kernmagnetische Resonanz (NMR)-, Infra­ rot (IR)-, Raman-, und ultraviolette (UV), insbesondere zirkulä­ re Dichroismus (CD)- und spektroskopische Analyse. Insbesondere liefert die NMR eine äußerst leistungsstarke strukturelle Analy­ se von Molekülen in Lösung, die sehr viel eher ihrer nativen Umgebung entspricht (Marion et al., 1983, oben; Bar et al., 1985, oben; Kimura et al., 1980, oben). Andere Verfahren zur strukturellen Analyse können ebenfalls angewendet werden. Diese schließen Röntgenkristallographie (Engstom, 1974, oben) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.

In bevorzugter Weise können Co-Kristalle des OB-Polypeptids und des OB-Rezeptors untersucht werden. Durch Analyse von Co-Kri­ stallen können detaillierte Informationen über die Bindung er­ halten werden, wodurch wiederum ein rationales Design von Ligan­ den-Agonisten und -Antagonisten ermöglicht wird. Computer- Modelling kann ebenfalls eingesetzt werden, insbesondere in Verbindung mit NMR- oder Röntgenverfahren [Fletterick et al., (Hrsg.), Computer Graphics and Molecular Modeling, in Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Labora­ tory, Cold Spring Harbor, New York (1986)).

Die Identifizierung und Isolierung eines für einen erfindungs­ gemäßen OB-Rezeptor kodierenden Gens ermöglicht die Expression des Rezeptors in Mengen, die diejenigen übersteigen, welche aus natürlichen Quellen isoliert werden können, oder in Indikator­ zellen, die eigens konstruiert werden, um die Aktivität eines Rezeptors anzuzeigen, der nach Transfektion oder Transformation der Zellen exprimiert wird. Demgemäß wird durch die vorliegende Erfindung zusätzlich zum rationalen Design von Agonisten und Antagonisten auf der Grundlage der Struktur des OB-Polypeptids ein alternatives Verfahren zum Identifizieren spezifischer Li­ ganden des OB-Rezeptors unter Anwendung verschiedener bekannter Screening-Assays zur Verfügung gestellt.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche die Erfindung erläutern, nicht aber beschränken sollen, besser verständlich.

Beispiele

Nachfolgend wird das zur Identifizierung des für die vorliegende Erfindung beispielhaften genetischen Materials angewendete Ver­ fahren dargelegt. Dieses Vorgehen umfaßt vier aufeinanderfol­ gende Schritte: A) genetische Kartierung, B) physikalische Kar­ tierung, C) Isolierung des Kandidatengens, und D) Mutationsnach­ weis. Nach der Bestätigung, daß das fragliche murine Gen iso­ liert war (Stufe D), suchte man nach dem homologen humanen Gen, und sowohl das murine als auch das humane Gen sowie die puta­ tiven Proteine wurden charakterisiert. Die Schritte sind nach­ folgend detailliert zusammengefaßt.

A. Genetische Kartierung

Die ob-Mutation wurde bei genetischen Kreuzungen segregiert, und es wurden übliche Verknüpfungsanalysen angewendet, um die Posi­ tion der Mutation in Relation zu RFLPs (Restriktions-Fragment- Längen-Polymorphismen) zu bestimmen. Diesen Daten zufolge wurde das OB-Gen einem ∼5cM-Intervall auf dem proximalen Teil des Mäusechromosoms 6 zugeordnet. (5cM ist eine Maßangabe der gene­ tischen Distanz und entspricht 5 genetischen Crossing over pro 100 Tiere.) Insgesamt wurden 771 informative Meiosen generiert und bei der nachfolgenden genetischen Kartierung eingesetzt (Friedman et al., (1991), oben. Die genetischen Loci, die in Relation zu OB kartiert wurden, waren alle zuvor veröffentlicht. Die beiden beschriebenen nächsten RFLPs wurden definiert durch Sonden, die von dem Carboxypeptidase- und dem onkogenen met-Gen abgeleitet wurden.

Die genetische Auflösung der oben beschriebenen Experimente war für die Klonierung von ob unzureichend, was in erster Linie darauf zurückzuführen ist, daß keiner der genetischen Marker eng verkoppelt war. Um die erforderlichen eng verknüpften RFLPs zu identifizieren, wurden zusätzliche Sonden isoliert, und die genetische Kreuzung wurde ausgedehnt. Ein als Chromosomenmikro­ dissektion bekanntes Verfahren wurde angewendet, um randomisier­ te DNA-Stücke vom proximalen Teil des Mäusechromosoms 6 zu iso­ lieren [Bahary et al., Mammalian Genome, 4: 511-515 (1993)]. Zur Untersuchung auf enge Kopplung mit ob wurden individuell klo­ nierte Sonden eingesetzt. Auf der Grundlage dieser Studien wurde eine Sonde D6Rck13, auch mit psd3 bezeichnet, aufgrund ihrer genetischen Nähe zu OB zur weiteren Analyse ausgewählt.

Diese Sonde wurde eingesetzt, um den Genotyp von 835 ob-Nachkom­ men aus interspezifischen und intersubspezifischen Kreuzungen zu ermitteln, und es zeigte sich, daß D6Rck13 bei allen 835 Tieren nicht-rekombinant ist, wie von Bahary et al. berichtet wurde. Bei der physikalischen Kartierung wurde ein neuer polymorpher Marker aus einem Cosmid-Subklon identifiziert, der vom YAC 53A6 abgeleitet worden war. Dieser neue Marker wurde zwischen D6Rck13 und dem OB-Gen positioniert und verwendet, um die zusätzlichen 771 informativen Meiosen von intraspezifischen Kreuzungen und Rückkreuzungen zu erfassen. Bei einem einzigen Tier #167 wurde ein Rekombinations-Crossing over zwischen ob und D6Rck39 festge­ stellt. Diese Studien zeigten, daß D6Rck39/D6Rck13 0,06 cM von ob entfernt ist. Eine zusätzliche Probe, Pax4, wurde identifi­ ziert und lag 0,12 cM proximal von ob. Pax4 war in zwei Tieren, nämlich #111 und #420, rekombinant. Pax4 ist ein Pseudogen, wel­ ches zuvor von Gruss und Mitarbeitern dem proximalen Teil des Mäusechromosoms 6 zugeordnet worden war [Gruss et al., Genomics, 11: 424-434 (1991)]. Auf dieser Grundlage wurde festgestellt, daß das OB-Gen im 0,2 cM-Intervall zwischen Pax4 und D6Rck13 liegt. Dies führte zur Klonierung der dazwischenliegenden DNA, um OB zu isolieren.

B. Physikalische Kartierung

Zum Klonieren der DNA dieses Zwischenraumes wurden artifizielle Hefechromosomen (YACs) verwendet, die einen relativ neuen Klo­ nierungsvektor darstellen, welcher das Klonieren von langen Abschnitten zusammenhängender DNA mit einer Länge von häufig mehr als eine Million Basenpaaren erlaubt.

Unter Verwendung von D6Rck13 und Pax4 wurden arterielle Chromo­ somen isoliert. Dies erfolgte durch Herstellung gereinigter DNA- Sonden und ihrer Verwendung zur Isolierung der korrespondieren­ den YACs. Diese YACs (#8, #16, #107 und #24) wurden isoliert und anfänglich charakterisiert, und auf der Grundlage der resultie­ renden Analysen wurde geschlossen, daß YAC 16 dasjenige YAC war, das sich am weitesten distal erstreckte, d. h. ob am dichtesten kam. Das Schlüsselende von YAC # 16 wurde anschließend rekon­ stituiert, und es wurde ermittelt, daß dieses Ende dichter an ob lag als Pax4. Dieses Ende wurde mit 16M(+) bezeichnet. Diese Schlußfolgerung wurde gezogen, da gezeigt worden war, daß diese Sonde im Tier # 420 nicht rekombinant war (wie Pax4). Dieses Ende wurde sequenziert und zur Entwicklung eines PCR-Assays verwendet. Dieser PCR-Assay wurde angewendet, um eine YAC-Bi­ bliothek abzusuchen. Vier positive Klone wurden isoliert. Eine nachfolgende Charakterisierung dieser YACs durch Rekonstitution der Enden, Restriktionskartierung, Puls-Feld-Gelelektrophorese, und Southern-Blots mit den genetischen Kreuzungen ergaben, daß zwei dieser YACs mit der Bezeichnung adu und aad für nachfolgen­ de Studien entscheidend waren. Das YAC aad ist ein nicht-chimä­ res YAC von 550 kB, welches sich am weitesten distal erstreckt. Daher wurde das distale Ende dieses YACs mit der Bezeichnung aad(pICL) verwendet, um die physikalische Karte zu vervollstän­ digen. Das YAC mit der Bezeichnung adu ist ein nicht-chimäres YAC von 370 kB, und sein distales Ende, adu(+), erwies sich bei allen ob-Nachkommen der genetischen Kreuzungen einschließlich den Tieren #111 und #167 als nicht-rekombinant, was darauf hin­ deutet, daß das OB-Gen in diesem YAC liegen könnte.

Es wurde für diese beiden Enden aad(pICL) und adu(+) ein PCR- Assay entwickelt und zur Isolierung weiterer YACs und P1-Klone angewendet, um die physikalische Kartierung fortzusetzen. Die wichtigen auf diese Weise isolierten P1-Klone schlossen 498, 499, 500 (isoliert unter Verwendung einer von aad(pICL) abgelei­ teten Sonde) und 322, 323 und 324 (unter Verwendung einer Sonde von adu(+)) ein.

In der Zwischenzeit wurden durch D6Rck13 isolierte YACs (53A6, 25A8, 25A9, 25A10) charakterisiert. Diese Studien ergaben, daß sich 53A6 am weitesten proximal zum YAC aad erstreckte. Die ermittelte Größe der Lücke zwischen 53A6 und aad betrug 70 kB. Das Schlüsselende von 53A6, 53(pICL) wurde anschließend verwen­ det, um drei zur Verfügung stehende YAC-Bibliotheken und eine P1-Bibliothek abzusuchen. Ein entscheidender P1-Klon mit der Bezeichnung 325 wurde isoliert. Dieser P1-Klon überlappte mit den durch aad(pICL) wie oben beschrieben isolierten PI-Klonen und diente daher zur Schließung der Lücke zwischen 53(pICL) und aad(pICL). Als Ergebnis wurde das gesamt Contig, enthaltend YACs und P1-Klone, mit einer Länge von ∼2,5 Millionen Basenpaa­ ren, die Pax4, 16M(+), adu(+), aad(pICL), 53(pICL), D6Rck39 und D6Rck13 abdeckten, kloniert. Durch sorgfältiges Kartieren der bei den Tieren #111 und #167 offenbaren Rekombinationsstellen wurde geschlossen, daß OB in einem Intervall von 400 kB lag. Um eine DNA-Quelle als Arbeitsmaterial zur Isolierung des OB-Gens zu schaffen, wurden etwa 500 kB, die diese nicht-rekombinierende Region abdecken, in insgesamt 24 P1-Klonen isoliert. Diese P1- Klone, einschließlich 322 und 323, die sich nachfolgend als geeignete Klone erwiesen, wurden für das Exon-trapping verwen­ det.

Die physikalische Karte des Bereichs des OB tragenden Chromosoms ist in Fig. 7A dargestellt. In Fig. 7B ist das YAC-Contig veranschaulicht. Die Fig. 7C repräsentiert das P1-Contig.

C. Isolierung von Kandidatengenen

Das zur Isolierung von Genen in diesem Intervall angewendete Verfahren war Exon-trapping. Bei diesem Verfahren wurde ein handelsüblicher Vektor verwendet, um Exon-DNA (d. h. kodierende Sequenzen) zu identifizieren, indem bei genomischer DNA, die in ein Testkonstrukt eingeführt worden war, hinsichtlich funktio­ neller Spleiß-Akzeptor- und Donor-Sequenzen selektiert wurde. Die DNA von diesen P1-Klonen wurde kultiviert und in den Vektor zum Exon-trapping subkloniert. Diese Klone waren kurze Inserts, kloniert in einen Bluescript-Vektor. Jeder Klon wurde mittels PCR amplifiziert mit PCR-Primern, die mit Plasmidsequenzen kor­ respondierten, welche das Insert flankierten. Die Amplifikation­ mittels PCR wurde direkt mit den Bakterien durchgeführt, die das Plasmid trugen. Die Umsetzungen erfolgten unter Verwendung eines Biomek-Roboters. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Aga­ rosegel in TBE-Puffer, der Ethidiumbromid enthielt, elektropho­ retisch aufgetrennt. Das Verfahren des Exon-trapping wurde modi­ fiziert, um kontaminierende E. coli-DNA der P1-Klone zu elimi­ nieren und um die überreichlich vorhandenen Artefakt-Exons her­ auszulesen, die 80-99% der aufgefundenen putativen Exons aus­ machten. Der Vektor zum Exon-trapping enthält HIV-Sequenzen, und ein kurzes Segment dieser Vektorsequenzen korrespondiert mit diesem Artefakt.

Das Experiment des Exon-trapping erfolgte unter Verwendung ver­ schiedener P1-Klone. Die Produkte des Exon-trapping wurden an­ schließend mittels PCR amplifiziert, selektiert und sequenziert. Die Sequenzen von putativen "Exons" wurden unter Anwendung des Blast-Computerprogramms mit denjenigen in der Genbank vergli­ chen. Etwa fünfzehn Exons wurden zur weiteren Untersuchung des Vorhandenseins korrenspondierender RNA oder konservativer Se­ quenzen mittels RT-PCR, Northern-Analyse und Zooblot ausgewählt. Bei sieben der fünfzehn putativen Exons, 325-2, 323-9, 322-5, D1-F7, 1H3 und 2G7 zeigte sich, daß sie für ein RNA-Transkript kodieren. 325-2 ist ein Testis-spezifisches Gen; 323-8 und 323-9 sind wahrscheinlich zwei Exons von demselben, hauptsächlich im Gehirn und der Niere exprimierten Gen. 1H3 und 322-5 repräsen­ tieren zwei Transkripte des Gehirns mit niedriger Expressions­ rate. D1-F7 ist ein Exon des zuvor klonierten Gens Inosinmono­ phosphatdehydrogenase (IMPDH), welches ubiquitäre Expressions­ muster aufweist. Keines dieser Gene schien für OB zu kodieren. 2G7, welches das OB-Exon ist, wird nachfolgend diskutiert.

Nach drei erfolglosen Versuchen, daß OB-Gen im Wege des Exon­ trapping aufzufinden, wurde ein weiterer Versuch unternommen, bei dem die DNA sämtlicher P1-Klone der entscheidenden OB-Region vereinigt wurde. Diese P1-Klone schlossen 258, 259, 322, 323, 324, 325, 498, 499, 500, 653, 654 und andere ein. Anschließend wurden die P1-Klone 258, 260, 322, 498 und 499 in den Vektor zum Exon-trapping subkloniert, und nachfolgend wurden mehrere Plat­ ten mit bakteriellen Klonen hergestellt, von denen jeder ein putatives Exon beinhaltete. Ungefähr 192 Klone wurden erhalten, die putative OB-Kandidaten repräsentieren. Wie zuvor ausgeführt worden ist, wurde insoweit ein einheitliches Artefakt beobach­ tet, als viele der Isolate zwei aufgefundene Exons enthielten, die von dem Vektor stammten. Daher wurden Klone sowohl aufgrund ihrer Größe als auch anhand der Tatsache identifiziert, daß eine Hybridisierung von DNA-Sonden, die mit diesem Artefakt korre­ spondieren, mit den entsprechenden Banden auf einem Southern- Blot des Gels hybridisierten. Auf diese Weise wurden 185 von insgesamt 192 Klonen von der weiteren Untersuchung ausgeschlos­ sen. Ein Ausschluß der Artefakte anhand der Größe alleine war nicht möglich, da dies im Endeffekt zu einem Ausschluß des mit OB korrespondierenden Exons hätte führen können.

Demgemäß wurden von den 192 Exons insgesamt sieben Exons zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Es wurden Templates für das Sequenzieren der sieben Exons hergestellt, und die Sequenzierung wurde durchgeführt. Die Sequenzen der sieben Exons wurden analy­ siert, und es wurde gefunden, daß sieben identisch waren, und daß es sich bei einem um ein offenbares Artefakt handelte. Ins­ besondere enthielt der Klon 1D12 die "HIV-Sequenz", d. h. die Artefakt-Bande. Damit verblieben die drei Exons 1F1, 2G7 und 1H3 zur weiteren Analyse. 1F1 wurde von der weiteren Analyse ausge­ schlossen, da es außerhalb der entscheidenden Region lag. Sowohl für 1H3 als auch für 2G7 wurden PCR-Primer ausgewählt und syn­ thetisiert.

Die Sequenz des Exons 2G7 wurde bestimmt und ist in Fig. 10 dargestellt (SEQ ID NO: 7). PCR-Primer für 2G7 wurden ausgewählt und synthetisiert. Die Bereiche der Sequenz, die mit den PCR- Primern korrespondieren, sind unterstrichen. Die verwendeten Primer waren:

Diese Primer amplifizierten genomische DNA unter den folgenden PCR-Bedingungen: 25-30 Zyklen bei 55°C Annealing für 2′, 72°C zur Extension für 2′, 94°C Denaturierung für 1′ in gewöhnlichem PCR-Puffer. Diese Primer wurden ebenfalls zur Herstellung einer markierten Sonde verwendet, indem der PCR-Reaktion ³²P-dCTP bei entsprechender Verringerung der Menge an kaltem dCTP zugegeben wurde.

Mit einer Auswahl von Gewebe-RNAs wurde eine RT-PCR durchge­ führt, und es wurde festgestellt, daß 2G7 unter den untersuchten Geweben ausschließlich in weißem Fettgewebe exprimiert wurde (Fig. 11A). Anschließend wurde das mit ³²P markierte 2G7 mit einem Northern-Blot von Gewebe-RNAs hybridisiert (Fig. 11B), und es zeigte sich, daß seine RNA in Fettgewebe mit einer hohen Expressionsrate exprimiert wurde, in sämtlichen anderen Geweben jedoch entweder nicht oder nur mit einer sehr niedrigen Rate exprimiert wurde (wobei die Signale das Ergebnis von die Gewebe­ präparationen kontaminierendem Fett sein können). Jeweils zehn µg Gesamt-RNA von den aufgeführten Geweben wurden auf einem Agarosegel mit Formaldehyd elektrophoretisch aufgetrennt. Die Sonde wurde bei 65°C mit dem Blot hybridisiert in einem gewöhn­ lichen Hybridisierungspuffer, Rapid Hybe (Amersham). Die Größe der RNA betrug ungefähr 4,9 kB. Zu diesem Zeitpunkt betrachtete man 2G7 als einen erfolgversprechenden Kandidaten für das OB- Gen, und es wurde weiter analysiert.

D. Mutationsnachweis

Um zu bestätigen, daß 2G7 das OB-Gen kodierte, war es erforder­ lich, Unterschiede in den RNA-Expressionsraten der DNA-Sequenz dieses Gens zwischen Mutanten und Wildtyp-Tieren aufzuzeigen. Zwei getrennte Mutationen des ob-Gens stehen zur Untersuchung zur Verfügung, C57BL/6J ob/ob (1J) und Ckc/Smj ob/ob (2J). Diese werden nachfolgend mit 1J bzw. 2J bezeichnet. (Die informelle Nomenklatur bezieht sich auf die untersuchten Mausstämme. Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung und in den Zeichnungen be­ ziehen sich die Angaben C57BL/6J, CKC/smj und CKC/smj ob/ob auf C57BL/6J +/+, SM/Ckc- + ^Dac- +/+ bzw. SM/Ckc- +^Dac ob^2J/ob^2J). Aus dem von 1J-, 2J- und Kontrolltieren isolierten Fettgewebe wurde RNA präpariert. Die Gesamt-RNA für jede Probe wurde mit DNase behandelt und anschließend unter Verwendung von Oligo(dT) als Primer und reverser Transkriptase reverse transkribiert. Die resultierende einzelsträngige cDNA wurde anschließend mittels PCR amplifiziert, wobei entweder die 2G7-Primer (Bedingungen s. o.) für die niedrigere Bande oder handelsüblich erhältliche Actin-Primer für die obere Bande verwendet wurden. Die RT-PCR- Produkte wurden auf ein 1%-iges Agarose-TBE-Gel geladen, welches mit Ethidiumbromid gefärbt wurde (Fig. 12A). Bei der Durchfüh­ rung der RT-PCR wurde gefunden, daß 2G7-mRNA bei der 2J-Maus vollständig fehlte, während sie bei den 1J- und sämtlichen ande­ ren Kontrollmäusen exprimiert wurde. Nach 30 Amplifikationszy­ klen wurde kein Signal nachgewiesen. Diese Experiment lieferte den direkten Nachweis dafür, daß 2G7 mit einem Exon vom OB-Gen korrespondierte.

Da sich die 2J-Mutation erst vor relativ kurzer Zeit etabliert hat und als kongenetischer Stamm aufrechterhalten wird, war dieses Ergebnis der erste verfügbare Nachweis dafür, daß es sich bei 2G7 um ein Exon vom OB-Gen handelt. Die Mutation ist wahr­ scheinlich in der Promotorregion lokalisiert, was zu einem völ­ ligen Abbruch der mRNA-Synthese führt. Das Vorhandensein eines Signals bei einer 1J-Maus in diesem RT-PCR-Versuch deutete dar­ aufhin, daß 1J eine Punktmutation aufweisen könnte, die nicht zu einer starken Veränderung der Größe der RNA-Probe führt. Ferner wurde mittels RT-PCR festgestellt, daß 2G7-mRNA bei vier zusätz­ lichen 2J-Tieren nicht vorhanden war.

Dieses Ergebnis wurde mit Hilfe eines Northern-Blots bestätigt (Fig. 12B). Fettzellen-RNA wurde von jedem der Stämme herge­ stellt (C57Bl/6J, 1J, CKC/smj und 2J). Zehn µg dieser RNAs wur­ den aufgetrennt und geblottet. Der Blot wurde mit der 2G7-Sonde sondiert, welche mittels PCR durch Amplifikation des Materials, d. h. der Bande gemäß Fig. 11, unter Verwendung von ³²P-dCTP in der PCR-Reaktion markiert worden war. Actin ist eine Kontrolle für die Menge an geladener RNA. Das Actin-Signal ist bei sämtli­ chen Proben ziemlich ähnlich. Das OB-Signal ist im Gehirn nicht vorhanden, da die mRNA spezifisch für Fettzellen ist.

Die Ergebnisse aus der Northern-Analyse bestätigen, daß die 2G7- spezifische RNA den 2J-Mäusen fehlte. Die ob-RNA ist in den CKC/smj ob/ob-Mäusen nicht vorhanden, da das Gen in diesem adi­ pösen Mutantenstamm unterbrochen ist, so daß keine RNA gebildet wird. Zusätzlich war die Menge an 2G7-RNA sowohl bei 1J als auch bei db/db fat ∼10-20fach erhöht. Diese Ergebnisse sind mit der Hypothese vereinbar, daß OB entweder für ein zirkulierendes Hormon kodiert oder für die Entstehung eines Signals von Fett­ zellen verantwortlich ist, durch das das Körpergewicht modelliert wird. Diese Ergebnisse unterstützten die Schlußfolgerung, daß 2G7 das OB-Gen ist, und führten zu der Vorhersage, daß 1J-Mäuse eine Punktmutation aufweisen, wobei es sich wahrscheinlich um eine Nonsense-Mutation handelt, die zu einem frühzeitigem Ab­ bruch der Translation führt.

Diese Ergebnisse aus der Northern-Analyse sind wiederholt worden unter Verwendung von Fettzellen-RNA-Präparationen aus vier ver­ schiedenen 2J-Tieren (Fig. 13). Bei diesem Assay ist ap2 ein fettspezifisches Transkript, welches wie das Actin in Fig. 12B als Kontrolle verwendet wurde. Es besteht keine Signifikanz für die variierende Dichte der ap2-Bande. ap2 wurde markiert, indem PCR-Primer anhand der veröffentlichten ap2-Sequenz hergestellt wurden. Die RT-PCR-Produkte von Fettzellen-RNA wurden anschlie­ ßend unter Anwendung desselben Verfahrens, welches für die PCR- Markierung angewendet worden ist, erneut markiert. Diese Analyse zeigt die Anwesenheit von OB-mRNA in normalen homozygoten oder heterozygoten Tieren sowie ihre Abwesenheit bei mutierten 2J- Tieren.

Die Mutation ist in 1J-Mäusen identifiziert worden. Bei der Mutation handelt es sich um einen Basenaustausch von C zu T, durch den ein Arginin in ein offenbar vorzeitiges Stopkodon an der Aminosäure 108 überführt wird, und aller Wahrscheinlichkeit nach trotz der hohen Expressionsraten der ob-mRNA (s. Fig. 12 und 13, C57BL/6J ob/ob-Spuren) für die 1J-Mutation (Fig. 14) verantwortlich ist.

Kürzlich haben Southern-Blots zu der Schlußfolgerung Anlaß gege­ ben, daß die 2J-Mutation das Ergebnis einer nachweisbaren DNA- Veränderung am 5′-Ende von OB ist, welche die RNA-Expression vollständig zum Erliegen zu bringen scheint. Die genaue Beschaf­ fenheit dieses möglichen Rearrangements bleibt aufzuklären.

Ein genomischer Southern-Blot von DNA aus den CKC/smj (SM/Ckc- +^Dac)- und C57BL/6J-Mäusen unter Verwendung vier verschiedener Restriktionsendonukleasen erfolgte, um festzustellen, ob das mutierte ob ein einzigartiges Fragmentmuster ergibt (Fig. 15A). Ungefähr 10 µg DNA (abgeleitet von genomischer DNA, die aus Leber, Niere oder Milz präpariert worden war) wurden mit dem angegebenen Restriktionsenzym geschnitten. Die DNA wurde an­ schließend auf einem 1%-igen Agarose-TBE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA wurde auf eine Imobilon-Membran überführt und mit der mittels PCR markierten 2G7-Sonde hybridisiert. Die Schlüsselbande ist die oberste Bande im BglII-Verdau der CKC/smj ob/ob (SM/Ckc- +^Dacob^2J/ob^2J)-DNA. Diese Bande entspricht einem höheren Molekulargewicht als diejenige des anderes Stammes, was auf eine Mutation in diesem Stamm hindeutet.

Die Fig. 15B zeigt einen Southern-Blot eines Verdaus genom­ ischer DNA von den Nachkommen einer ob^2J/+ x ob^2J/+ -Kreuzung mit BglII. Einige der DNAs weisen lediglich die obere Bande auf, einige lediglich die untere Bande, und manche besitzen beide Banden. Die Tiere mit lediglich der oberen Bande sind allo-adi­ pös, d. h. ob^2J/ob^2J. Diese Daten zeigen, daß der in Fig. 15A dargestellte Polymorphismus (d. h. die Mutation) in genetischem Sinne segregiert wird.

Beispiel 1: cDNA-Klonierung und Bestimmung der Sequenz von OB

Unter Verwendung der markierten PCR-Sonde 2G7 wurden insgesamt fünfzig cDNA-Klone der Maus aus einer murinen cDNA-Bibliothek von Fettzellen in λgt11 (Clonetech 5′-STRETCH cDNA aus testiku­ laren Fettpolstern von Swiss-Mäusen, # ML3005b) sowie dreißig kreuzhybridisierende humane cDNA-Klone aus einer humanen cDNA- Bibliothek von Fettzellen in λgt10 (Clonetech 5′-STRETCH cDNA vom Abdomen # HL1108a) isoliert. Das Screening der Bibliothek erfolgte unter Anwendung des Plaque-Abhebeverfahrens. Die Filter von der Plaque-Abhebung wurden unter Anwendung des Autoklaven­ verfahrens denaturiert. Die Filter wurden doppelt mit der PCR- markierten 2G7-Sonde hybridisiert (Rapid Hybe-Puffer, 65°C, über Nacht). Nach einer 2-4 stündigen Prähybridisierung wurden die Filter zweimal 30 Minuten lang bei 65°C in 2× SSC, 2% SDS, gewaschen und mit Röntgenfilm exponiert. Positive Duplikate wurden Plaque-gereinigt. Plaque-gereinigte Phagen wurden mittels PCR amplifiziert unter Verwendung von im Handel erhältlichen Vektor-Primern, z. B. λgt10 und λgt11. Die resultierenden PCR- Produkte korrespondierten mit dem cDNA-Insert eines jeden Phagen mit einer kleinen Menge an Vektorsequenz an beiden Enden. Die Banden wurden mittels Gel gereinigt und unter Anwendung des automatischen ABI-Sequenziergerätes und der Vektor-Primer zum Sondieren der DNA-Polymerase sequenziert.

Die groben Sequenzdaten wurden anschließend Base für Base manu­ ell untersucht, um eine Fehlinterpretation der Computerdaten zu korrigieren. Als die korrekte Sequenz zur Verfügung stand, wur­ den die Stromabwärts-Primer synthetisiert und für die weitere Sequenzierung verwendet. Derartige Experimente wurden wieder­ holt, bis jeder erhältliche cDNA-Klon sequenziert und zu einem Contig synthetisiert worden war. Bis heute sind 3000 Basenpaare vom 5′-Ende der mRNA zusammengestellt worden. Einer der cDNA- Klone erstreckte sich bis zum 5′-Ende der mRNA, da seine Sequenz mit derjenigen des 5′-RACE-Produkts von Fettgewebe-RNA identisch war (Daten nicht gezeigt).

Die Sequenzdaten ergaben, daß es einen offenen Leserahmen von 167 Aminosäuren gibt (Fig. 1). Eine Kozak-Translationsinitia­ tions-Konsensussequenz war vorhanden mit einem Adenosinrest drei Basen stromaufwärts vom ATG. Es wurden zwei Klassen von cDNA gefunden, die sich voneinander durch Einschluß oder Ausschluß eines einzelnen Glutaminkodons unterschieden. Dieser Rest ist unmittelbar 3′ von dem Spleiß-Akzeptor des 2G7-Exons positio­ niert. Da das CAG-Kodon von Glutamin eine mögliche AG-Spleiß- Akzeptor-Sequenz einschließt, scheint es so, daß es in einer Unterklasse der cDNA an der Spleiß-Akzeptorstelle einen Schlupf mit einer offenbar 3 Basenpaare umfassenden Deletion gibt, wie unten dargestellt wird.

Das "ag" in den obigen Sequenzen korrespondiert mit der angenom­ menen Intron-Sequenz stromaufwärts des Glutamincodons, und AG ist die putative alternative Spleißstelle. Dieser Glutaminrest ist in einer hochkonservierten Region des Moleküls lokalisiert, und seine Bedeutung für die biologische Aktivität ist derzeit noch unbekannt.

Es wurde eine putative N-terminale Signalsequenz entdeckt, deren Signal-Spaltstelle gemäß Vorhersage carboxyterminal vom Alanin­ rest an der Aminosäureposition 21 liegt. Diese putative Signal­ sequenz wurde bestätigt durch Anwendung eines Computeralgorith­ mus auf das Verfahren von Heÿne. Unter Anwendung dieser Technik wurde die wahrscheinlichste Signalsequenz in der für das Poly­ peptid kodierenden Region identifiziert, die mit den Aminosäuren 1-23 korrespondiert, welche die folgende Sequenz aufweisen:

MCWRPLCRFLWLWSYLSYVQA ↑ VP (SEQ ID NO: 10),

bei der der Pfeil die putative Signalsequenz-Spaltstelle kenn­ zeichnet. Der Rest der Aminosäuresequenz war in großem Maße hydrophil und wies außer der N-terminalen Signalsequenz keiner­ lei bemerkenswerte strukturelle Motive oder membranständige Domä­ nen auf. Insbesondere fanden wir keine Konsensussequenzen für eine N-verknüpfte Glykosilierung oder dibasische Aminosäurese­ quenzen, die auf eine Proteinspaltung in dem vorhergesagten prozessierten Protein hindeuten (Sabatini et al., The metabolic basis of inherited disease, S. 177-223, C.V. Scriver et al., Hrsg., McGraw-Hill, New York). Datenbank-Recherchen unter Anwen­ dung von Blast- und Block-Programmen führten zu keiner Identifi­ zierung irgendwelcher homologer Sequenzen.

RNA aus humanem Fettgewebe wurde mit Hilfe von Northern-Blots analysiert, und es wurden RNA-Spezies nachgewiesen, die eine ähnliche Größe wie diejenigen vom ob-Gen der Maus aufwiesen. Ein Sequenzieren und Analysieren der cDNA-Klone ergab, daß das huma­ ne OB ebenfalls für ein Polypetid von 167 Aminosäuren kodiert (Fig. 2A und B sowie Fig. 3). Auch im Menschen wurden zwei Klassen von cDNA mit oder ohne eine Deletion im Umfang von drei Basenpaaren gefunden (Fig. 6). Die OB-Gene der Maus und des Menschen waren in der vorhergesagten kodierenden Region in hohem Maße homolog, wiesen aber in den zur Verfügung stehenden 3′- und 5′-nicht-translatierten Regionen eine Homologie von lediglich 30% auf. Bei dem humanen OB-Polypeptid war ebenfalls eine N-termi­ nale Signalsequenz vorhanden. Ein Vergleich der OB-Polypeptidse­ quenzen des Menschen und der Maus zeigte, daß die beiden Molekü­ le auf der Aminosäurenebene eine Identität von insgesamt 83% aufweisen (Fig. 4). Die N-Termini der reifen Proteine beider Spezies weisen sogar eine noch höhere Homologie zueinander auf, wobei es unter den 100 N-terminalen Aminosäureresten lediglich sechs konservative und drei nicht-konservative Aminosäuresubsti­ tutionen gibt.

Genomische DNA wurde isoliert aus Maus, Ratte, Kaninchen, Wühl­ maus, Katze, Kuh, Schaf, Schwein, dem Menschen, Huhn, Aal und Drosophila und mit EcoR1 restringiert. Die Spaltprodukte wurden auf einem 1%-igen Agarose-TBE-Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die DNA wurde anschließend auf eine Imobilon-Membran überführt und mit der mittels PCR markierten 2G7-Sonde sondiert. Der Fil­ ter wurde bei 65°C hybridisiert und zweimal jeweils 20 Minuten lang mit SSC, 0,2% SDS bei 65°C gewaschen, d. h. es gab zwei Pufferwechsel. Diese Daten zeigen, daß OB unter Vertebraten konserviert ist (Fig. 16). Es wird in diesem Zusammenhang dar­ auf hingewiesen, daß es bei der DNA des Aales ein 2+-Signal gibt; der Aal ist ein Fisch.

Zusammenfassend deuten die zur Verfügung stehenden Befunde dar­ aufhin, daß das Körpergewicht und die Adipositas physiologisch kontrolliert werden. Vor sieben Jahren wurden Anstrengungen unternommen, um zwei der Schlüsselkomponenten dieses Systems zu identifizieren, nämlich die OB- und DB-Gene. Wie in dem vorlie­ genden Beispiel gezeigt worden ist, ist das OB-Gen nunmehr als Fett-spezifisches Gen identifiziert worden, das bei der Regula­ tion des Körpergewichts eine Schlüsselrolle einnimmt. Das Pro­ dukt dieses Gens, welches höchstwahrscheinlich ein sezerniertes Hormon ist, wird wichtige Implikationen für die Diagnose und Behandlung von Ernährungsstörungen beim Menschen und bei anderen Tieren als dem Menschen aufweisen.

Beispiel 2: Expression von OB in Bakterien

Sowohl murine als auch humane cDNAs, die für ob kodieren, sind in einen Expressionsvektor pET-15b (Novagen) kloniert worden. Dieser Vektor enthält einen T7-Promoter in Verbindung mit einem lac-Operator und exprimiert ein Fusionsprotein, welches einen Histidin-Tag (His-Tag) und eine Thrombin-Spaltstelle unmittelbar stromaufwärts der Kodierungssequenz-Insertionsstelle enthält (Fig. 17) (SEQ ID NOS: 11 und 12).

Die cDNAs der Maus und des Menschen wurden modifiziert, so daß das Alanin am Ende der Signalsequenz wie auch eine andere Se­ quenz in der 3′-Region in eine NdeI-Stelle überführt wurde. Die Insertion der Ndel-Stelle erfolgte unter Anwendung von PCR mit neuen Primern:

Mnde-5′ (muriner 5′-Primer)

CTTATGTTCA TATGGTGCCG ATCCAGAAAG TC (SEQ ID NO: 13)

Mnde-3′ (muriner 3′-Primer)

TCCCTCTACA TATGTCTTGG GAGCCTGGTG GC (SEQ ID NO: 14)

Hnde-5′ (humaner 5′-Primer)

TCTATGTCCA TATGGTGCCG ATCCAAAAAG TC (SEQ ID NO: 15)

Hnde-3′ (humaner 3′-Primer)

TTCCTTCCCA TATGGTACTC CTTGCAGGAA GA (SEQ ID NO: 16).

Die Primer enthalten in ihrer Mitte eine 6 Basenpaare umfassende Fehlpaarungsregion, durch die NdeI-Restriktionsstellen an jedem Ende des PCR-Fragments eingeführt werden. Phagen, die entweder die cDNA der Maus oder des Menschen beinhalteten, wurden mittels PCR unter Verwendung dieser Primer amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde mit NdeI gespalten und mittels Gel gereinigt auf einem 1%­ igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt. Die gelgereinigten Banden wurden in dem pET-Vektor subkloniert. Die resultierenden Plasmide wurden sequenziert, um sicherzustellen, daß Mutationen während des Klonierungsschrittes der PCR-Amplifikation nicht eingeführt wurden. Es sind Konstrukte für die humane und murine cDNA hergestellt worden, die für das Glutamin an Position 49 kodieren oder bei denen diese Kodierung fehlt. Insbesondere sind unser Anwendung eines Verfahrens zum PCR-Klonieren pET 15b-Kon­ strukte hergestellt worden, die entweder die OB-Kodierungsse­ quenz des Menschen oder der Maus, minus Signalsequenz und fusio­ niert mit einem His-Tag, enthalten. Die Konstrukte sind sequen­ ziert worden, um sicherzustellen, daß keine Sequenzfehler in die kodierende Region des OB-Gens während des Schrittes der PCR-Am­ plifikation eingeführt wurden.

Zwei resultierende Plasmidkonstrukte pETM9 und pETH14 wurden für die Transformation eines bakteriellen Expressionswirtes ausge­ wählt. Bei Induktion mit 1 mM IPTG unter optimalen Bedingungen waren die transformierten Bakterien in der Lage, 100-300 µg/ml des OB-Fusionsproduktes zu bilden. Die überwiegende Menge der OB-Fusionsproteine wurde im Einschlußkörper gefunden. Nachdem das Fusionsprotein mit 6M Guanidin-HCl oder Harnstoff löslich gemacht worden war, wurde es über eine His-bindende (Ni-Chelat­ ion)-Harzsäule gereinigt. Die Bedingungen für die Säulenaufrei­ nigung des OB-Fusionsproteins (einschließlich Binden, Waschen und Eluieren) wurden experimentell ermittelt. Das OB-Fusionspro­ tein bindet an das Harz bei 5 mM Imidazol/6M Guanidin-HCl und bleibt bis zu etwa 20 mM Imidazol/6M Guanidin-HCl gebunden. Das Protein kann von dem Harz bei 60 mM Imidazol/6M Guanidin eluiert werden (Fig. 18A, B). Die gereinigten OB-Fusionsproteine des Menschen und der Maus wurden zum Entfernen von Guanidin-HCl aus der Präparation gegen PBS weiter dialysiert und zur Bildung von polyklonalen Antikörpern verwendet.

Um die biologische Aktivität der Fusionsproteinprodukte zu un­ tersuchen, wurden die Bedingungen für eine Zurückfaltung des gereinigten Proteins untersucht und entwickelt. Dieses Vorgehen erfordert eine anfängliche Dialyse des Fusionsproteins gegen eine 1 M Guanidinlösung und eine anschließende Verdünnung mit einer 0,4 M Argininlösung. Der His-Tag wurde von den Fusions­ proteinen vor der biologischen Funktionsanalyse entfernt. Die Entfernung des Tags erfolgte durch Behandlung des Fusions­ proteins mit Thrombin aus menschlicher Plazenta.

Ferner werden die Kodierungssequenzen des OB-Gens des Menschen und der Maus abzüglich der Signalsequenz unter Anwendung des PCR-Klonierungsverfahrens jeweils in einen pET 12c-Vektor inser­ tiert. Diese Konstrukte können die synthetisierten OB-Fusions­ proteine in den periplasmatischen Raum der bakteriellen Wirts­ zelle steuern. Das aus dem periplasmatischen Raum gewonnene OB- Fusionsprotein bedarf lediglich einer einfachen Gelfiltration, um von anderen Wirtsproteinen gereinigt zu werden, und es wird während eines derartigen Verfahrens nicht denaturiert.

Beispiel 3: Herstellung von Antikörpern gegen das OB-Polypeptid

Zusätzlich zur Verwendung des rekombinanten Proteins zur Her­ stellung polyklonaler Antikörper wurde von der abgeleiteten murinen OB-Sequenz unter Anwendung einer Immunogenitäts-Plot- Software (GCG Package) ein Set von vier Peptidsequenzen identi­ fiziert. Die vier carboxyterminalen Peptidfragmente sind:

(SEQ ID NO: 18)

Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys-Thr

(SEQ ID NO: 19)

Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala

(SEQ ID NO: 20)

Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro-Glu- Ser-Leu-Asp

(SEQ ID NO: 21)

Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp-Val- Ser-Pro-Glu-Cys.

Diese Peptide wurden mit KLH konjugiert, und die Peptid/KLH- Konjugate wurden zur Immunisierung von Kaninchen unter Anwendung standardisierter Techniken verwendet. Von den Kaninchen wurden für jedes Peptid spezifische polyklonale Antiseren gewonnen.

Beispiel 4: In Vitro-Translokation eines OB-Polypetids

Um die Anwesenheit einer funktionellen Signalsequenz zu bestäti­ gen, wurde eine humane cDNA, die den gesamten offenen Leserahmen einschloß, in den pGEM-Vektor subkloniert. In diesem Experiment wurde lediglich die humane cDNA verwendet, da geeignete Subklone der Maus nicht gewonnen wurden. Positivsträngige humane ob-RNA wurde unter Verwendung von Sp6-Polymerase transkribiert und in einer in vitro-Translationsreaktion mit und ohne mikrosomale Membranen der Bauchspeicheldrüse des Hundes verwendet. Das pri­ märe Translationsprodukt migrierte mit einem geschätzten Moleku­ largewicht von ∼18 kD, was mit der Vorhersage anhand der cDNA- Sequenz übereinstimmt. Die Anwesenheit von mikrosomalen Mem 99999 00070 552 001000280000000200012000285919988800040 0002019531931 00004 99880bra­ nen bei der Reaktion inhibierte die Gesamteffizienz der Trans­ lation ∼5-fach. Nichtsdestoweniger waren ungefähr 50-70% des primären OB-Translationsproduktes in Anwesenheit der Membran­ präparation auf ungefähr 2 kD trunkiert, was darauf hindeutet, daß die Signalsequenz funktionell ist (Fig. 19A). Die Größe des primären Translationsprodukts von Interleukin-1α-RNA, welche nicht für eine Signalsequenz kodiert, war bei Anwesenheit von mikrosomalen Membranen in der Reaktion unverändert. Um zu bestä­ tigen, daß eine Translokation des OB-Proteins stattgefunden hatte, wurden die in vitro-Translationsprodukte mit Proteinase-K behandelt. Die Behandlung mit Protease führte zu einer vollstän­ digen Proteolyse des primären Translationsproduktes von 18 kD, während die prozessierte Form von 16 kD durch die Enzymbehand­ lung nicht beeinflußt wurde, was darauf hindeutet, daß sie in das Lumen der Mikrosomen transloziert worden war (Fig. 19B). Diese Daten sind mit der Hypothese vereinbar, daß OB ein sekre­ tiertes Molekül ist.

Nach einer Abspaltung der Signalsequenz würden zwei Cysteinreste im vorhergesagten Protein verbleiben, wodurch die Möglichkeit geschaffen wäre, daß das Molekül die Disulfidbrückeneigenschaft anderer sekretierter Polypeptide aufweist [Shen et al., Science, 224: 168-171 (1984)].

Beispiel 5: Charakterisierung des OB-Gens

Um die Beziehung zwischen Obesität und genetischen Veränderungen im OB-Gen bei Menschen herzustellen, wurde die Sequenz des huma­ nen OB-Gens bestimmt (Fig. 20A bis C) (SEQ ID NOS: 22 und 24). Für das Screening einer humanen P1-Bibliothek wurden spezifische Primer von der humanen kodierenden Sequenz verwendet. Drei ver­ schiedene P1-Klone wurden erhalten, kultiviert und mittels PCR amplifiziert unter Verwendung von Primern, die die Spleißstelle zwischen dem ersten und zweitenkodierenden Exon flankieren. Die vollständige Intronregion mit einer Größe von ungefähr 2 kB wurde amplifiziert und partiell sequenziert (s. Fig. 20A; und ist in SEQ ID NOS: 22 und 24 dargestellt).

Die Genstruktur des murinen und humanen Gens wurde charakteri­ siert unter Anwendung von PCR-Assays und anderen Standardver­ fahren. Man fand heraus, daß das OB-Gen der Maus aus drei Exons besteht, wobei das Zweite und Dritte davon für die kodierende Sequenz verantwortlich sind (Fig. 20D). Die kodierende Region des humanen OB-Gens weist dieselbe Struktur auf, wobei dem huma­ nen Gen jedoch ein 5′-Exon und -Intron fehlt (Fig. 20E).

Aus den Intron-Sequenzen des humanen Gens sind zwei Sets von Primern hergestellt worden (Fig. 20 A bis C). Die Sequenzen der Primer sind wie folgt (F und R beziehen sich auf vorwärts bzw. rückwärts):

DNA-Proben sind aus verschiedenen Quellen erhalten worden, und diese Sets an Primern werden verwendet, um die humane genomische DNA von schwer adipösen Menschen zu amplifizieren. Die PCR-Pro­ dukte wurden in einem Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt auf­ getrennt, und die Banden wurden ausgeschnitten und mit Agarose gespalten. Die Sequenzen wurden erhalten unter Anwendung des DNA-Sequenziergerätes ABI 373A und des Taq Dideoxy Terminator Kits (ABI, Perkin-Elmer). Bis heute ist eine Punktmutation in einem ob-Gen einer Patientenprobe nachgewiesen worden. Diese Mutation liegt in dem ersten Exon und führt zu keiner Verände­ rung der Aminosäuresequenz. Erste Daten weisen darauf hin, daß in dem ersten Exon eines anderen Patienten eine Insertionsse­ quenz vorhanden sein kann.

Es kann ein abweichendes automatisches Sequenzierverfahren mit Sequenase anstelle von Taq DNA-Polymerase angewendet werden, um hinsichtlich des Nachweises einer Mutation leichter lesbare Sequenzen zu erhalten.

Beispiel 6: Expression von OB in Hefe

Nach dem positional cloning von OB war es wichtig, die physiolo­ gischen Mechanismen aufzudecken, durch die das OB-Protein die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht reduziert. Der erste Schritt in diese Richtung bestand darin, unter Anwendung eines Expressionssystems ein funktionelles Protein rekombinant herzu­ stellen. Zusätzlich zu dem erfolgreichen bakteriellen Expres­ sionssystem wurde ebenfalls ein Hefe-Expressionssystem ausge­ wählt. Die Expression in Hefe weist bei der Expression von OB einige attraktive Merkmale auf. Das wichtigste hiervon ist, daß es wahrscheinlicher ist, daß biologisch aktive eukaryontische Proteine gebildet werden. Das OB-Polypetid wird von Säugerzellen sekretiert. Die Proteinsekretion ist sehr ähnlich bei allen Eukaryonten, weshalb der sekretorische Apparat der Hefe dem sekretorischen Syntheseweg von Säugern sehr viel ähnlicher ist, als es bakterielle Synthesewege zur Sekretion sein würden. Ins­ besondere würden bei Säugerzellen beobachtete Modifikationen des OB-Proteins wahrscheinlich ebenfalls bei der Expression durch das sekretorische System der Hefe wahrscheinlich beobachtet werden. Ferner erfolgt die Proteinfaltung während der sekretori­ schen Prozesse, und daher ist es wahrscheinlich, daß die Aus­ schleusung von OB durch den sekretorischen Apparat der Hefe ein korrekt gefaltetes Protein mit nativer biologischer Aktivität ergibt. Dies ist wichtig für OB, da die beiden Cysteinreste eine Disulfidbrücke ausbilden können. Im Gegensatz zu den sekretori­ schen Prozessen verhindert die reduzierende Umgebung des Cyto­ plasmas der Zelle eine Ausbildung von Disulfidbrücken, und daher ist es wesentlich, daß OB den sekretorischen Prozeß durchläuft, damit sich diese Disulfidbindung in vivo ausbilden kann. Andere Vorteile betreffen die Einfachheit und Schnelligkeit einer Mani­ pulation von Hefe, die Verfügbarkeit von Vektoren und Stämmen sowie die überaus große Erfahrung auf dem Gebiet der rekombinan­ ten Hefe-Technologie.

Ein Pichia pastoris-Expressionssystem wurde aus vier Gründen ausgewählt: (1) es weist höhere Expressionsraten bei heterologen Proteinen auf als andere Hefesysteme, wie S. cerevisiae; (2) die Glykosilierung des Proteins ist dem Säugersystem in P. pastoris ähnlicher als bei S. cerevisiae (obgleich mit Hilfe von Compu­ terrecherchen bei OB keine Glykosilierungsstellen nachgewiesen wurden, bestand immer noch die Möglichkeit einer Glykosilierung an unerkannten Stellen); (3) P. pastoris sekretiert nativ sehr wenige Proteine und demgemäß ist es im allgemeinen sehr einfach, das exprimierte Fremdprotein zu reinigen; und (4) die Vektoren und Hefestämme sind im Handel erhältlich (von Invitrogen). Zwei Strategien für die Herstellung von Hefe-Expressionsvektoren sind in den Fig. 21 und 22 dargestellt.

Der ausgewählte Vektor war pPIC.9. Dieser Vektor enthält eine Klonierungsstelle unmittelbar stromabwärts der für den α-Mating- Faktor kodierenden Präpro-Sequenz, welche das von dem in die Klonierungsstelle klonierten Gen kodierte Protein steuert, das durch den sekretorischen Stoffwechselweg sekretiert werden soll. Das andere wichtige Merkmal des Vektors ist ein HIS4-Gen, wel­ ches eine Selektion hinsichtlich der Aufnahme des Vektors unter Verwendung eines auf einem Histidin-defizienten Medium kulti­ vierten auxotrophen Hefestammes und nachfolgender Transformation der Hefe mit dem Vektor ermöglicht. Die Klonierungsstrategie war wie folgt: PCR-Amplifikation von OB-cDNA unter Verwendung eines 5′-Primers, der an seinem 3′-Ende unmittelbar im Anschluß an die vorhergesagte Leaderpeptid-Spaltstelle eine zu der Sequenz von OB komplementäre Sequenz, und an seinem äußersten 5′-Ende eine Sequenz enthält, die zum 3′-Ende der Vektorsequenz für den α- Mating-Faktor komplementär ist. Der 5′-Primer enthält auch eine XhoI-Stelle. Der 3′-Primer wurde so hergestellt, daß er an sei­ nem 3′-Ende eine zu den letzten wenigen Aminosäuren von OB kom­ plementäre Sequenz und eine EcoRI-Stelle an seinem 5′-Ende auf­ weist. Nach der PCR-Amplifikation wurde das PCR-Produkt mit XhoI und EcoRI gespalten und in den auf ähnliche Weise gespaltene Vektor pPIC.9 kloniert. Im Anschluß an das Klonieren der cDNAs vom OB der Maus und des Menschen, wobei jede mit und ohne das Glutamin am Kodon 49 hergestellt wurde, wurden einzelne Klone für sämtliche vier Konstrukte isoliert und sequenziert, um si­ cherzustellen, daß die Konstrukte in der korrekten Orientierung und im Leserahmen kloniert wurden und keine Mutationen aus dem Schritt der PCR-Amplifizierung enthielten. Im Anschluß an die Identifizierung von Klonen mit der korrekten Sequenz wurden diese zur Transformation von dem P. pastoris-Stamm GS115, einem Histidin-auxotrophen Stamm, verwendet.

Hinsichtlich der beiden OB-Konstrukte der Maus wurden transfor­ mierte Hefeklone hinsichtlich einer Proteinexpression einem Screening unterzogen. Als Beweis dafür, daß die transformierte Hefe OB enthält, wurden ein DNA Dot-Blot-Assay und ein Kolonie- Hybridisierungs-Assay durchgeführt, welche OB-Sequenzen der transformierten Hefe, nicht aber in der untransformierten Hefe zeigten. Darüberhinaus sekretierte die transformierte Hefe nun­ mehr ein Protein von 16 kD in das Kulturmedium, wohingegen die untransformierte Hefe kein Protein dieser Größe sekretierte (Fig. 23A). Dies ist die vorhergesagte Größe von OB. Es sind ein­ zelne Klone für beide Maus-Konstrukte identifiziert worden, die OB mit hoher Rate exprimieren, und derzeit wird eine Strategie zur Aufreinigung entwickelt, um OB bis zur Homogenität zu reini­ gen. Nach einer Strategie ist das OB auf einer Kationenaus­ tauschsäule gereinigt worden (Fig. 23B); erste Daten deuten darauf hin, daß ein starker Kationenaustauscher geeignet sein kann. Nach einer Kationenaustausch-Chromatographie ist das puta­ tive OB-Produkt jedoch verloren. Dies deutet auf die Anwesenheit einer Protease in der Probe hin.

Eine Strategie zur Überwindung dieses Problems liegt in der Herstellung von ob-His-Tag-Fusionen zur Expression in Hefe (Fig. 22). Eine weitere Untersuchung hat gezeigt, daß sich OB ohne einen His-Tag eng mit einer Ni-Chelation-Säule assoziiert. Die Reinigung des OB-Polypetids mittels Ni-Chelation und anschlie­ ßender Gelfiltration ergab ein Produkt von ausreichender Rein­ heit für eine Massenspektrumanalyse. Das Massenspektrum bestä­ tigt, daß das Molekulargewicht des exprimierten Proteins mit dem erwarteten Molekulargewicht identisch ist, was eindeutig bestä­ tigt, daß OB in Pichia erfolgreich exprimiert worden ist.

Die Verfahrensweise der Ni-Chelation/Gelfiltrations-Reinigung ergibt jedoch kein OB-Polypeptid in ausreichend reiner Form. Zusätzliche kleine Moleküle sind vorhanden. Es scheint, daß die proteolytische Aktivität aus der Ni-Chelation-Säule im Todvolu­ men eluiert. Daher wurde ein dreistufiges Reinigungsverfahren vorgesehen: Ni-Chelation, gefolgt von Kationenaustausch (wodurch die Kontaminanten in Form kleiner Moleküle eliminiert werden) und anschließender Gelfiltration.

Eine Abschätzung der Expressionsrate durch Färbung von SDS-PAGE- Gelen mit Coomassie-Blau ergab im Falle der Kultivierung von Hefe in Schüttelflaschen ungefähr 10 mg/l. Es wird erwartet, daß sich diese Rate in Fermentationsbehältern erhöht, und wir sind dabei, eine Fermentation in der Hoffnung des Erhalts größerer Proteinmengen zu initiieren. In Bezug auf die humanen OB-Kon­ strukte sind transformierte Hefeklone identifiziert worden, die eine hohe Kopienzahl des OB-Gens enthalten, und von diesen wird erwartet, daß sie OB-Protein exprimieren. Sowie Antikörper ent­ wickelt worden sind, werden diese verwendet werden, um die Iden­ tität des sekretierten Proteins von 16 kD zu bestätigen.

Beispiel 7: Expression großer Mengen an OB-Fusionspeptid in Bakterien Herstellung von Freezer-Stocks

Jedem der beiden Aliquots von 4 ml sterilisiertem M9ZB-Medium ohne Kohlenstoffquelle wurden 40 µl Dextrose-Stammlösung (0,4 g/ml, Filter-sterilisiert), 10 µl Ampicillin-Stammlösung (200 mg/ml) und 5 µl Chloramphenicol-Stammlösung (34 mg/ml, in Etha­ nol) zugegeben. Zu ihrer Inokulation wurde jeweils eine einzelne Kolonie von E. coli mit in einem Novagen pET-14b-Vektor klonier­ ter OBI-DNA der Maus und des Menschen verwendet. Die Röhrchen wurden bei 37°C über Nacht inkubiert.

0,5 ml dieser Übernacht-Kulturen wurden zur Inokulation von 50 ml M9ZB-Medium mit Dextrose, Ampicillin und Chloramphenicol verwendet. Diese wurden bei 30°C inkubiert, und die Absorption bei 600 nm (A₆₀₀) wurde in regelmäßigen Zeitabständen aufgezeich­ net. Bei einem A₆₀₀-Wert von etwa 1-1,2 wurden 175 µl umfassende Aliquots der Kultur mit 25 µl 60% Glycerol in 2 ml fassenden Eppendorf-Röhrchen vermischt, in Flüssigstickstoff schockgefro­ ren und bei -80°C aufbewahrt.

Kulturwachstum

50 ml M9ZB-Medium mit 0,5 ml 40% Dextrose, 125 µl Ampicillin- Stammlösung und 50 µl Chloramphenicol-Stammlösung wurden mit 1 ml Freezer-Stock inokuliert und bei 30°C inkubiert. Bei einem A₆₀₀-Wert von 1-1,2 wurden 10 ml dieser Kultur zur Inokulation von vier 2 l Kolben mit 500 ml M9ZB-Medium mit Dextrose, Ampi­ cillin und Chloramphenicol verwendet. Diese wurden bei 30 °C inkubiert bis zu einem A₆₀₀-Wert von etwa 1-1,2 mit einer End­ konzentration an IPTG von 0,5 mM. Die Kulturen wurden über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 4000 Umdrehungen pro Minute (UpM) für eine Zeitdauer von 20 Minuten geerntet. Dieses Expressionssystem ergab ein rekombinantes OB- Polypeptid, welches einen ziemlich hohen Prozentsatz an Gesamt­ protein ausmacht; in der Größenordnung Gramm/Liter von E. coli.

Zell-Lyse und Resuspendieren von Einschlußkörpern

Die Zellpaste wurde in einem minimalen Volumen von 20 mM HEPES, pH-Wert 7,2, 10% Glycerol, 0,1 M KCl, 5 mM MgCl₂, 1% Aprotinin, 1 mM PMSF, 5 µg/ml Leupeptin und 50 µg/ml DNase 1 resuspendiert. Die Suspension wurde dreimal eingefroren und wieder aufgetaut unter Verwendung von Flüssigstickstoff und lauwarmen Wassers.

Die lysierten Zellen wurden 30 Minuten lang bei 18000 UpM zen­ trifugiert und in 20 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 0,1 M NaCl, resus­ pendiert. Die Suspension wurde mit Ultraschall behandelt, und es wurde Triton X100 bis zu einer Endkonzentration von 2% zugege­ ben. Dieser Ansatz wurde 15 Minuten lang bei 1800 UpM zentrifu­ giert. Nach zwei weiteren derartigen Zyklen erfolgten drei Wa­ schungen ohne Triton. Schließlich wurde das Pellet durch Ultra­ schall und anschließender Zentrifugation in 6 M GdHCl (Guanidin- HCl), 20 mM HEPES, pH-Wert 7,5, gelöst. Der Überstand wurde für die weitere Aufreinigung verwendet.

Das OB-Protein wurde im ungefalteten Zustand mittels immobili­ sierter Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) gereinigt. Die Lösung wurde aufgetragen auf eine 40 ml Säule des Typs Phar­ macia Chelating Fast Flow Sepharose, beladen mit 5 Säulenvolumen 50 mM NiSO₄ und equilibriert in 6 M GdHCl, 20 mM HEPES, pH-Wert 7,5. Die Säule wurde mit 6 M GdHCl, 30 mM Imidazol, 20 mM HEPES, pH-Wert 7,5 gewaschen. Schließlich wurde das Protein mit demsel­ ben Puffer enthaltend 0,2 M Imidazol eluiert. Das ungefaltete Protein in 6 M GdHCl wurde nach Zugabe von Natriumacetat (NaAc) auf 10 mM und Einstellung des pH-Wertes auf etwa 4,5 mit Essig­ säure bei 4°C aufbewahrt.

Erneute Faltung (Rückfaltung) und Reinigung des Proteins

Eine 100 mg Protein enthaltende 6 M GdHCl-Lösung wurde mit 67 µl 1 M Dithiothreitol (DTT) behandelt und auf etwa 67 ml mit 6 M GdHCl, 10 mM NaAc, pH-Wert 4,5, verdünnt. Man ließ den Ansatz bei Raumtemperatur etwa eine Stunde lang rühren. Anschließend wurde er mit 4 l eines Puffers mit 20% Glycerol, 2,5 mM CaCl₂, 20 mM Tris, pH-Wert 8,4, unter Rühren verdünnt. Nach sauberem Vermischen ließ man die Lösung etwa 8 Stunden lang ohne weiteres Rühren bei Raumtemperatur stehen. Anschließend wurden 2000 Ein­ heiten von gereinigtem bovinen Thrombin (von Trombostat, einem Produkt von Parker-Davis) zugegeben, und man ließ die Lösung unter sanftem Rühren stehen. Nach 2,5 Stunden wurden wiederum 2000 Einheiten Thrombin zugegeben, und die Abspaltung des Histi­ din-Tags wurde für weitere 3 Stunden fortgesetzt. Die Thrombin- Spaltung wurde durch Zugabe von PMSF zu einer Endkonzentration von 0,1 mM gestoppt. Die Lösung wurde filtriert und bei 4°C aufbewahrt.

Das abgespaltene Protein wurde weiter gereinigt auf derselben IMAC-Säule wie oben, equilibriert mit einem Puffer von 1 M KCl, 20% Glycerol, 20 mM HEPES, pH-Wert 8,4. Nach dem Aufgeben der Proteinlösung wurde sie mit demselben Puffer gewaschen, und das abgespaltene Protein wurde mit 1 M KCl, 20% Glycerol, 40 mM Imidazol, 20 mM HEPES, pH-Wert 8,4, eluiert. Ungespaltenes Pro­ tein eluierte bei 0,2 M Imidazol.

Das gereinigte abgespaltene Protein wurde konzentriert, mit 50- 100 mM EDTA und 10 mM Kaliumhexacyanoferrat(III) (um jedwede unvollständige Oxidation abzuschließen) behandelt und auf einer Superdex 75 16/60-Säule gelfiltriert. Die Ausbeuten unter Anwen­ dung dieser Vorgehensweise erreichten 50% der Menge an Aus­ gangspeptid.

Sobald das exprimierte Protein gereinigt war, ist es mit Hilfe verschiedener Verfahren charakterisiert worden. Eine physikali­ sche Charakterisierung schließt eine dynamische Lichtstreuung ein, um die Homogenität der Struktur zu bestimmen, und wird als Maß einer sauberen Faltung angewendet. Die Daten der Lichtstreu­ ung zeigen, daß das humane OB-Polypeptid überwiegend oder aus­ schließlich als Monomer exprimiert wird, während das murine OB- Polypeptid als Dimer wie auch als Monomer gefunden werden kann.

Assays mit Ellmann′s-Reagens und eine massenspektroskopische Analyse bestätigen, daß die Cysteinreste in dem Protein eine Disulfidbindung ausbilden. Diese oxidierte Form des Polypeptids wurde Mäusen wie oben beschrieben verabreicht und zeigte eine biologische Aktivität.

Der zirkuläre Dichroismus ist angewendet worden, um die struktu­ relle Geometrie des Proteins grob zu bestimmen. Die CD-Spektren in einem physiologischem Puffer (pH-Wert etwa 8, ungefähr phy­ siologische Ionenstärke) zeigen, daß das humane OB-Polypeptid zu etwa 60% eine α-helikale Struktur und zu etwa 40% eine rando­ misierte Coil-Struktur aufweist. Bei dem murinen OB-Polypeptid wurde mittels CD-Spektroskopie gefunden, daß es zu etwa 50% eine α-helikale und zu 50% eine randomisierte Coil-Struktur aufweist.

Eine limitierte Proteolyse und eine anschließende Massenspek­ trometrie (Cohen et al., 1995, oben) sind angewendet worden, um Bereiche des OB-Polypeptids zu identifizieren, die für eine Proteolyse zugänglich sind. Diese Analyse hat die Anwesenheit einer flexiblen Schleifenstruktur von den Aminosäureresten 54 bis 60 (gemäß Darstellung in Fig. 4) angezeigt. Es ist wahr­ scheinlich, daß diese flexible Schleife zwei Domänen definierter 2°-Struktur verbindet, z. B. α-Helix.

Bedeutsamerweise wurde, wie in den folgenden Beispielen darge­ legt wird, die Bioaktivität des gereinigten Proteins analysiert, indem das Protein sowohl mageren als auch adipösen Nagern über eine osmotische Pumpe (z. B. eine osmotische ALZET-Pumpe von Alza Corporation, Palo Alto, CA) oder durch tägliche intraperitoneale Bolus-Dosen über einen Zeitraum von mindestens 2 Wochen verab­ reicht und die Effekte auf das Verhalten der Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht beobachtet wurden.

Beispiel 8: Gewichtsreduzierende Effekte des OB-Polypeptids (Leptin)

Das Genprodukt des OB-Locus der Maus spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation des Körpergewichts. Das vorliegende Beispiel zeigt, daß das OB-Protein im Plasma der Maus, der Ratte und des Menschen zirkuliert. Die zirkulierende Form sämtlicher drei Spezies besitzt gegenüber der abgeleiteten Polypeptidsequenz ohne die Signalsequenz mittels SDS-PAGE ein identisches Moleku­ largewicht, was darauf hindeutet, daß das Protein in vivo nach Abspaltung der Signalsequenz nicht prozessiert wird. Das OB- Protein war im Plasma von C57/Bl6J ob/ob-Mäusen nicht vorhanden, während es im Vergleich zu Kontrollen im Plasma von db/db-Mäusen in zehnfach höherer Konzentration und im Plasma von fa/fa-Ratten in zwanzigfach höheren Mengen anwesend war. Es ist davon auszu­ gehen, daß diese adipösen Tiermutanten resistent gegenüber den Effekten von OB sind. Innerhalb einer Gruppe von sechs mageren menschlichen Individuen gab es siebenfache Unterschiede bei den Plasmawerten des OB-Proteins. Tägliche Injektionen des rekom­ binanten OB-Proteins der Maus führten bei ob/ob-Mäusen zu einer dramatischen Reduktion der Körpermasse und hatten signifikante Auswirkungen auf das Körpergewicht von Wildtyp-Mäusen, wohinge­ gen db/db-Mäuse keine Wirkung zeigten. Diese Daten legen nahe, daß das Genprodukt des OB-Locus eine endokrine Funktion zur Regulation des Körpergewichts ausübt.

Materialien und Methoden

Kaninchen wurden mit rekombinantem Protein in Freund′s Adjuvanz (HRP, Inc.) immunisiert. Immungereinigte Anti-Maus-OB-Antikörper wurden hergestellt durch Passage von Antiserum über eine Sepha­ rose-4B-Säule, die mit dem rekombinanten Protein wie beschrieben konjugiert war [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)]. Die Immunpräzipitation des Mäuseplasmas wurde wie folgt durchgeführt: 0,5 ml Plasma von der Maus, der Ratte und einem Menschen enthaltend ungefähr 2,5 mM EDTA wurden vorgeklärt mit unkonjugierter Sepharose-4B für eine Zeitdauer von 2 Stunden bei Raumtemperatur unter Schütteln. Die Sepharose wurde entfernt durch Zentrifugation und 50 ml einer 50%-igen Aufschlämmung von Antikörper-konjugierter Sepharose, die einen Affinitäts-gerei­ nigten Antikörper in einer Konzentration von 1 mg/ml gepackter Sepharose enthielt, wurden zugegeben. Ein halber ml 2 × RIPA- Puffer wurde zugegeben, um die nachfolgend dargelegten endgül­ tigen Bindungsbedingungen zu ergeben: 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5, 100 mM NaCl, 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,5% Natriumdesoxycho­ lat und 0,025% Natriumazid. Die Reaktion wurde unter Schütteln bei 4°C über Nacht durchgeführt. Die Antikörper-konjugierte Sepharose wurde achtmal unter Verwendung von RIPA-Puffer gewa­ schen, anschließend dreimal mit PBS gespült und auf einer 15%­ igen SDS-PAGE aufgetrennt. Die Proteine wurden auf Nitrozellulo­ se überführt und einem Western-Blotting mit einem biotinylierten immungereinigten Antikörper gegen das rekombinante Protein un­ terzogen. Der verwendete sekundäre Antikörper war HRP-Streptavi­ din, und ECL wurde für den Nachweis eingesetzt.

Um die Menge an OB im Mäuseserum zu quantifizieren, wurden stei­ gende Mengen des zurückgefalteten rekombinanten OB-Proteins der Maus (0,01, 0,1, 0,5, 2,0, 15,0 ng) zu 100 µl C57BL/6J ob/ob- Plasma gegeben und 3 Stunden lang bei 4°C mit dem Protein A Sepharose-konjugierten Antikörper inkubiert. Nach ausgiebigem Waschen mit Puffer A (10 mM Natriumphosphat-Puffer, pH-Wert 7,4; 100 mM NaCl; 1% Triton X-100, 5 mM EDTA, 1 mM PMSF) wurden die Proben in Probenpuffer resuspendiert, über eine 15%-ige SDS- PAGE aufgetrennt und auf eine Nitrozellulosemembran überführt. Ein Western-Blotting erfolgte unter Verwendung eines immungerei­ nigten biotinylierten Anti-Aminoterminus-Antikörpers als primä­ rer Antikörper und von HRP-Streptavidin als sekundärer Antikör­ per sowie nachfolgendem ECL-Nachweis.

Die cytoplasmatischen Extrakte wurden hergestellt, indem Fett­ gewebe in NDS-Puffer (10 mM Tris pH-Wert 7,5, 10 mM NaCl, 60 mM ICCI, 0,15 mM Spermin, 0,5 mM Spermidin, 14 mM β-Mercaptoetha­ nol, 0,5 m EGTA, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40) mittels Polytron- und Dounce-Homogenisierung homogenisiert wurde, und die Entfernung der Zellkerne erfolgte durch Zentrifugation bei 700 g.

Die Immunpräzipitationen wurden wie oben beschrieben durchge­ führt mit der Ausnahme, daß immungereinigte Anti-humane OB-Anti­ körper verwendet wurden. Für den ELISA wurden 100 ml einer 1 mg/ml Lösung von immungereinigtem Anti-human OB-Antikörper in einer mit Borat gepufferten PBS-Lösung gelöst und über Nacht auf Mikrotiter (Corning Kat. #2595)-Platten bei 4°C aufgebracht. Die Platten wurden anschließend viermal mit Borat-gepufferter Sali­ nelösung, enthaltend 0,05% Tween 20, gewaschen, und überschüs­ sige Flüssigkeit wurde entfernt. Die Platten wurden durch Inku­ bation für eine Zeitdauer von 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 240 ml pro Vertiefung mit Borat-gepuffertem Salinepuffer ent­ haltend 0,3% Gelatine blockiert und anschließend gewaschen und getrocknet. Sowohl bekannte Mengen eines zurückgefalteten huma­ nen OB-Proteins oder Plasmaproben in 100 ml Volumen wurden in einzelnen Vertiefungen über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Platten mit 100 ml eines biotinylierten im­ mungereinigten Anti-Human Antikörpers (0,1 mg/ml in einer Gela­ tine-Borat gepufferten Lösung) 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde Meerrettich-Peroxidase (HRP)- Streptavidin zu den Platten gegeben (0,1 mg/ml in Boratpuffer, 0,3% Gelatine). Die HRP-Substratlösung (ABTS, 0,3 mg/ml und H₂O₂, 0,01% in Zitronensäure) wurde anschließend zum Nachweis verwendet, und die Messung der OD bei 414 nm erfolgte zur Quan­ tifizierung der Antikörperbildung.

Die kodierenden Sequenzen des OB-Gens der Maus und des Menschen wurden mittels PCR aus Plasmiden amplifiziert, die OB-cDNA-Se­ quenzen enthielten, und sie wurden in das Plasmid pPIC.9 (Invi­ trogen) subkloniert. Der verwendete humane 5′-Primer war
5′ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAG 3′ (SEQ ID NO: 34),
und der 3′-Primer war
5′ GCGCGAATTCTCAGCACCCAGGGCTGAGGTC 3′ (SEQ ID NO: 35).
Für die Maus war der 5′-Primer
5′ GTATCTCTCGAGAAAAGAGTGCCTATCCAGAAAGTCCAGG 3′ (SEQ ID NO: 36),
und der 3′-Primer war
5′ GCGCGAATTCTCAGCATTCAGGGCTAACATC 3′ (SEQ ID NO: 37).

Der 5′-Primer für die Maus und den Menschen enthält am 5′-Ende eine XhoI-Stelle und kodierende Sequenzen für die letzten Amino­ säuren der im Vektor pPIC.9 vorhandenen Signalsequenz für den α- Mating-Faktor. Dieser Vektor steuert die Sekretion von heterolog exprimierten Genen von der Zelle in das Kulturmedium. Der 5′- PCR-Primer schließt ebenfalls die ersten 19 Nukleotide des offe­ nen Leserahmens des OB-Gens nach der Spaltstelle für die Signal­ sequenz vor dem Alanin an der Aminosäureposition 21 ein. Der 3′- Primer enthält an seinem 5′-Ende eine EcoRI-Stelle, welche un­ mittelbar gefolgt wird von Sequenzen, die zu dem putativen OB- Stopcodon komplementär sind. Die PCR-Bedingungen waren wie folgt: Denaturierung für 1 Minute bei 94°C, Annelierung für 1 Minute bei 55°C und Extension für 2,5 Minuten bei 72°C. Eine PCR mit wenigen Zyklen (15 Zyklen) und die Proof-Reading-Poly­ merase PFU (Stratagene) wurden angewendet, um die Anzahl an PCR- generierten Mutationen einzuschränken. Die PCR-Produkte wurden mit XhoI und EcoRI gespalten und in den gleichermaßen geschnit­ tenen Vektor pPIC.9 kloniert. Alle Konstrukte wurden hinsicht­ lich beider Stränge sequenziert, um das Fehlen jedweder PCR- generierter Mutationen sicherzustellen. Unter Anwendung der Sphäroplasten-Methode wurde Pichia pastoris (His) transformiert, und die Klone wurden auf Histidin-Mangelmedium selektiert. Unge­ fähr 200 Maus- und Mensch-spezifische Klone wurden hinsichtlich einer Integration einer hohen Kopienzahl einem Screening mittels eines Kolonie-Hybridisierungsassays unterzogen. Die Klone mit einer hohen Kopienzahl wurden anschließend anfänglich durch Coomassie-Färbung auf OB-Expression analysiert, wodurch die Anwesenheit eines neuen im Kulturmedium von transformierter Hefe vorhandenen Proteins von 16 kD gezeigt wurde. Die Bande von 16 kD entsprach OB, wie durch Verwendung von gegen das bakteriell exprimierte OB-Protein gezogenen Antikörpern bestätigt wurde. Die rekombinanten Proteine wurden gereinigt mittels eines zwei­ stufigen Reinigungsverfahrens, welches nachfolgend dargelegt ist. Die Massenspektrometrie und die Behandlung mit Bromcyan erfolgten gemäß Darlegung von Beavis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6873-6877 (1990).

Die gesamte OB-Kodierungssequenz der OB-Gene der Maus und des Menschen C-terminal von der Signalsequenz wurde in den Expres­ sionsvektor pET 15b (Novagen) subkloniert und in Escherichia coli [BL21(DE3)p1YsS] überexprimiert unter Anwendung des T7 RNA- Polymerasesystems [Studier et al., Meth. Enzymology, 185: 80-89 (1990)]. Die bei 30°C bis zu einer Absorption von 0,7 bei 595 nm kultivierte=n und über Nacht mit 0,5 mm Isopropyl-β-D- thiogalactopyranosid induzierten Zellen wurden mittels Zentri­ fugation bei geringer Geschwindigkeit gesammelt. Die Lyse er­ folgte durch dreimaliges Einfrieren und Auftauen, und ein DNA- Verdau wurde mit DNaseI durchgeführt. Die Membranextraktion erfolgte durch Behandlung mit Ultraschall und Löslichmachung mittels eines Detergens, und der endgültige Niederschlag aus Einschlußkörpern wurde in 6 M Guanidin-HCl, 20 mM HEPES, pH-Wert 8,4, gelöst. Rekombinante OB-Proteine wurden unter denaturieren­ den Bedingungen mittels IMAC unter Verwendung einer Ni-Ionen- Affinitätssäule und Waschen mit steigenden Mengen an Imidazol gereinigt. Das gereinigte denaturierte OB-Protein wurde an­ schließend in 6 M Guanidin-HCl, 10 mM Natriumacetat (NaAc), pH- Wert 5,0, aufbewahrt und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Verwendung von 1 mM DTT reduziert. Die Denaturierung erfolgte durch Verdünnung des reduzierten Proteins durch Vermischen mit 20% Glycerol, 5 mM CaCl₂, 5 mM NaAc, pH-Wert 5,0, und Inkubation bei Raumtemperatur für eine Zeitdauer von 8-12 Stunden. Nach der Denaturierung wurde der pH-Wert durch Zugabe von Tris bis 10 mM auf 8,4 eingestellt, und der Hexahistidin-Tag wurde mittels Thrombinspaltung entfernt. Das abgespaltene, renaturierte Pro­ tein wurde erneut mittels IMAC gereinigt, um das Produkt von Thrombin und ungespaltenem Fusionsprotein abzutrennen. Das ge­ spaltene, renaturierte Protein eluiert von der Ni-Ionen-Affini­ tätssäule bei 40 mM Imidazol, wohingegen Thrombin nicht zurück­ gehalten wird und das ungespaltene Fusionsprotein bei 0,2 mM Imidazol eluiert. Das Produkt wurde anschließend konzentriert, mit 100 mM EDTA und 10 mM Kaliumhexacyanoferrat(III) behandelt und weiter gereinigt durch Gelfiltration unter Verwendung einer Superdex 75 16/60-Säule von Pharmacia.

Ein Ellman-Assay wurde durchgeführt, wie von Ellman beschrieben, Arch. Biochem. Biophys., 82: 70-77 (1959). Das Ellman′s-Reagens wurde hergestellt durch Auflösung von 39,6 mg 5,5′-Dithio-bis(2- nitrobenzoesäure) (DTNB) in 10 ml 0,05 M Phosphat, pH-Wert 8,0. Eine Kalibrierungskurve wurde erstellt im Konzentrationsbereich von 10-120 mM freiem Sulfhydryl (unter Verwendung einer 1 mM Stammlösung von reduziertem DTT) bei 412 nm. Jeder Assay wurde durchgeführt unter Verwendung von 0,02 ml Ellman′s-Reagens und einer gesamten Reaktionsmischung von 0,5 ml. Der gemessene Ex­ tinktionskoeffizient betrug 12 974 M^-1cm^-1 für freie Sulfhydryl­ gruppen (Korrelationskoeffizient 0,99987) und lag damit inner­ halb einer 5%igen Streubreite des zuvor berichteten Wertes von 13 600 M^-1cm^-1.

Fünfzig ml von 2 mg/ml des reinen, gelfiltrierten Proteins, entsprechend einer möglichen Konzentration an freiem Sulfhydryl von etwa 24 mM in der endgültigen Reaktionsmischung, wurden dem Ellman-Assay zugeführt. Die resultierende Lösung ergab einen A₄₁₂-Wert von etwa 0,02, was darauf hinweist, daß die beiden Cysteinreste im Protein in einem oxidierten Zustand vorliegen und Cystin bilden, oder daß deren freie Sulfhydrylgruppen inner­ halb des unzugänglichen Kerns des gefalteten Proteins vollstän­ dig verborgen sind. Bei der Durchführung desselben Assays mit ungefaltetem Protein in Anwesenheit von 6 M Guanidin-HCl wurden identische Ergebnisse erhalten.

Die Mäuse wurden einzeln in Käfigen in einer pathogenfreien Umgebung gehalten und an eine Diät angepaßt, die 35% (Gew./ Gew.) Laboratory Rodent Diet 5001 (PMP Feeds, Inc.), 5,9% (Gew./Gew.) Tapioca-Puddingmix (General Foods) und 59,1% Wasser enthielt und einen Energiegehalt von 1,30 kcal/g aufweist. Die Diät wurde mittels Autoklav sterilisiert und in Kunststoffteller von 60 mm überführt, die oben auf Petrischalen von 100 mm fi­ xiert wurden. Die Diät erhält durch das Tapioca eine pastöse Konsistenz, wodurch es dem Tier erschwert wird, die Nahrung im Käfig auszubreiten. Der Deckel von 100 mm fängt die geringe Menge an Nahrung auf, die von dem Tier verteilt wird. Jeden Morgen wurde eine frische Schale mit Nahrung in den Käfig ge­ stellt, und die Schale des vorhergehenden Tages wurde entnommen und gewogen. Die Gewichtsunterschiede lieferten ein Maß der täglichen Nahrungsaufnahme. Die Effekte des rekombinanten Pro­ teins auf die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht wurden in drei Mäusestämmen gemessen: C57Bl/6J ob/ob, C57 Bl/Ks db/db und CBA/J +/+, bezogen vom Jackson Laboratory. Dreißig Mäuse von jedem Stamm wurden in Gruppen von jeweils 10 Mäusen unterteilt. Eine Gruppe eines jeden Stammes erhielt täglich intraperitoneale (i.p.) Injektionen des zurückgefalteten bakteriellen OB-Proteins in einer Dosis von 5 mg/g/Tag in 300 µl PBS. Eine zweite Gruppe erhielt i.p.-Injektionen desselben Volumens an PBS. Diese Kon­ trollmäuse erhielten Injektionen des PBS-Dialysats vom rekom­ binanten Protein. Das PBS wurde unter Verwendung einer Acticlean ETOX-Säule von Endotoxinen befreit. Eine dritte Gruppe von Tie­ ren erhielt keine Injektionen. Die Nahrungsaufnahme wurde täg­ lich aufgezeichnet, und die Messungen des Körpergewichts wurden in regelmäßigen Abständen über einen Zeitraum von 3 ½ Wochen aufgezeichnet. Für das Paarfütterungs-Experiment wurde die Nah­ rungsaufnahme einer getrennten Gruppe ob-Mäusen auf täglicher Basis mit derjenigen verglichen, die von den ob-Mäusen konsu­ miert wurde, welche Protein erhielten.

Ergebnisse Das OB-Protein zirkuliert im Plasma der Maus, der Ratte und des Menschen

Das rekombinante OB-Protein der Maus und des Menschen wurde hergestellt unter Verwendung des bakteriellen Expressionsvektors pET 15b (Novagen) und durch Klonierung in Pichia pastoris, einem Hefe-Expressionssystem, welches rekombinante Proteine direkt in das Kulturmedium sekretiert. Das in Hefe exprimierte OB-Protein schließt die carboxyterminal zur Signalsequenz gelegenen 146 Aminosäuren ein. Kaninchen wurden mit den bakteriellen Pro­ teinen immunisiert (HRP, Inc.). Die Antikörper wurden immunge­ reinigt (Research Genetics) und für Immunpräzipitationen und Western-Blots mit Protein aus Plasma und Fettgewebe verwendet.

Das OB-Protein aus dem Plasma der Maus migriert in der SDS-PAGE mit einem geschätzten Molekulargewicht von 16 kD. Die elektro­ phoretische Mobilität ist identisch mit derjenigen des nach Entfernung der Signalsequenz von der Hefe sekretierten rekom­ binanten OB-Proteins (Fig. 24A). Das Protein wurde im Plasma von C57BL/6J ob/ob-Mäusen, die eine Nonsense-Mutation am Kodon 105 aufweisen, nicht nachgewiesen. Mehrere verschiedene Antise­ ren konnten die von der cDNA-Sequenz vorhergesagte trunkierte Polypeptidkette von 105 Resten nicht identifizieren.

Ein 10facher Anstieg in der Menge an zirkulierendem Protein wurde bei db/db-Mäusen gegenüber Kontrolltieren beobachtet (Fig. 24A). Die Immunpräzipitation vom Plasma von Wildtyp- und fa/fa-Ratten ergab bei der mutanten Ratte im Vergleich zum Wild­ typ einen 20fachen Anstieg in der Menge an OB-Protein (Fig. 24B). Die db-Mutation führt zu einem adipösen Phänotyp, der mit dem bei ob-Mäusen beobachteten identisch ist (Bahary et al., 1990, oben). Fette Ratten sind aufgrund einer rezessiven Muta­ tion in einem zu db homologen Gen adipös (Truett et al., 1991, oben). Um die Menge an OB im Plasma der Maus zu quantifizieren, wurden dem Serum steigende Mengen an rekombinantem Protein zu­ gegeben und immunpräzipitiert (Fig. 24C). Ein linearer Anstieg der Signalstärke bei Western-Blots wurde mit steigenden Mengen an rekombinantem Protein beobachtet. Ein Vergleich der Signal­ stärke des nativen Proteins im Plasma der Maus mit den Standards zeigte, daß die zirkulierende Menge an OB-Protein in Wildtyp- Mäusen ungefähr 20 ng/ml beträgt. Diese Daten zeigen, daß die Immunpräzipitationen und Western-Blots unter Bedingungen eines Antikörperüberschusses durchgeführt wurden. Erhöhte Mengen an OB-Protein wurden ebenfalls in Proteinextrakten von Fettgewebe von db/db-Mäusen gegenüber Kontrollen festgestellt (Fig. 24D). Wie von einem sekretierten Protein erwartet wird, fraktionierte das Protein aus dem Fettgewebe mit der rohen Membranfraktion (Daten nicht gezeigt).

Plasmaproben von sechs mageren menschlichen Individuen mit einem Körpermassenindex von weniger als 25 (KMI = Gewicht/Länge²) wurden unter Verwendung von immungereinigten Antikörpern gegen das humane Protein immunpräzipitiert. Das immunpräzipitierte Material migrierte mit einer elektrophoretischen Mobilität, die mit derjenigen identisch war, welche für das in Hefe exprimierte humane Protein mit 146 Aminosäuren beobachtet worden war. Die Intensität der Signale variierte bei den 6 Proben in signifikan­ ter Weise (Fig. 25A). Eine Densitometrie der Autoradiographie ergab einen ungefähr 5fachen Unterschied in den Werten der Indi­ viduen HP1 und HP6, mit dazwischenliegenden Werten bei den ande­ ren Individuen. Ein Enzym-gekoppelter Immunoassay (ELISA) wurde entwickelt unter Verwendung des immungereinigten Antikörpers und des zurückgefalteten bakteriellen Proteins als Standard (siehe unten). Die resultierende Standardkurve ist in Fig. 25B darge­ stellt. Unter Anwendung dieses Assays variierten die Plasmawerte des OB-Proteins bei den 6 menschlichen Plasmaproben zwischen 2 und 15 ng/ml (Fig. 25C). Die Menge an OB-Protein im Plasma von HP 6 lag außerhalb des linearen Bereichs des Immunoassays und beträgt 15 ng/ml. Diese qantitativen Unterschiede korrelierten mit den bei Western-Blots beobachteten.

Erste Daten deuten daraufhin, daß Leptin, zumindest teilweise, mit einem oder mehreren anderen Proteinen komplexiert zirkulie­ ren kann. Diese Schlußfolgerung basierte auf der Heterogenität der Form der Titrationskurve für Serum verglichen mit rekombi­ nantem Standard. Eine Analyse einer großen Menge an Leptin, welches auf einer Kaninchen-Anti-OB-Säule durch HPLC-Gelfiltra­ tion unter denaturierenden und nicht-denaturierenden Bedingun­ gen unter Überwachung durch ELISA und SDS-PAGE immungereinigt wurde, legte nahe, daß das OB-Polypeptid sich wie ein hochmole­ kularer Komplex verhielt. Diese Daten sind jedoch nur vorläufig; das OB-bindende Protein, sofern vorhanden, muß immer noch cha­ rakterisiert werden.

Strukturelle Merkmale des OB-Proteins

Da das OB-Protein über zwei Cysteinreste verfügt, könnte es in vivo unter oxidierenden Bedingungen entweder intra- oder inter­ molekulare Disulfidbindungen ausbilden. Western-Blots wurden wiederholt mit und ohne Zugabe von Reduktionsmitteln zum Proben­ puffer. Unter beiden Bedingungen migrierte das OB-Protein in humanem Serum als Monomer (Daten nicht gezeigt). Unter nicht­ reduzierenden Bedingungen wurde das von db-Mäuseserum immunprä­ zipitierte Protein an Positionen nachgewiesen, die sowohl mit derjenigen eines Monomers von 16 kD als auch mit derjenigen eines Dimers von ungefähr 32 kD übereinstimmen (Fig. 26A). Der höhermolekulare Rest verschwand unter reduzierenden Bedingungen, was darauf hindeutet, daß eine Fraktion von OB der Maus durch Bildung einer intermolekularen Disulfidbindung als höhermoleku­ lare Spezies zirkuliert. Ungefähr 80% des OB der Maus zirkulie­ ren in Form des Proteins mit ungefähr 16 kD, während 20% die Form mit ungefähr 32 kD aufweisen.

Dieselben molekularen Formen werden beobachtet, wenn die Protei­ ne der Maus und des Menschen in Pichia pastoris exprimiert wer­ den [Abrams et al., Immunol. Rev.,: 5-24 (1992)]. Bei diesen Studien wurde die mit den 146 Aminosäuren des reifen OB-Proteins korrespondierende DNA-Sequenz stromabwärts der Signalsequenz für den α-Mating-Faktor der Hefe in den Vektor pPIC.9 (Invitrogen) kloniert. Das OB-Protein wurde aus dem Hefemedium von Stämmen, die die Proteine der Maus und des Menschen exprimieren, gerei­ nigt und unter reduzierenden und nicht-reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt (Fig. 26A). Das Mausprotein wurde in Hefe unter nicht-reduzierenden Bedingungen hauptsächlich als Dimer exprimiert, bei Anwesenheit von Reduktionsmitteln jedoch lediglich als Monomer. Das rekombinante humane Protein migrierte unter beiden Bedingungen in die Position eines Monomers (Daten nicht gezeigt).

Das in Pichia exprimierte gereinigte humane Protein besaß ein Molekulargewicht von 16 024 ± 3 D gemäß Bestimmung mittels Mas­ senspektrometrie (Beavis, 1990, oben). Dieser Wert stimmt über­ ein mit dem Molekulargewicht, welches von der Aminosäuresequenz des Proteins mit einer einzigen intramolekularen Disulfidbrücke berechnet wurde (16 024 D). Eine Matrix-unterstützte Laserde­ sorptions-Massenspektrometrie-Analyse von Bromcyan-Spaltproduk­ ten des Proteins zeigt, daß die Cysteine 117 und 167 über eine intramolekulare Disulfidbindung miteinander verbunden sind (Fig. 26B). Bromcyan spaltet carboxyterminal von Methioninresten.

Herstellung und Charakterisierung von biologisch aktivem rekombinanten Protein

Das OB-Protein der Maus wurde in E. coli von einem Plasmid pET 15b als unlösliches Fusionsprotein exprimiert und wies einen 20 Reste umfassenden, N-terminalen Hexa-Histidin-Tag auf, der eine Thrombin-Spaltstelle enthält. Bakterielle Einschlußkörper wurden löslich gemacht unter Verwendung von Guanidin-HCl und gereinigt unter denaturierenden Bedingungen unter Anwendung der immobilisierten Metallionen-Affinitätschromatographie (IMAC) (Fig. 27). Das gereinigte denaturierte Fusionsprotein wurde reduziert, verdünnt und konnte sich in wäßriger Lösung bei Raum­ temperatur zurückfalten. Im Anschluß an die Spaltung mit Throm­ bin wurde das renaturierte OB-Protein der Maus, das vier zu­ sätzliche N-terminale Reste (Gly-Ser-His-Met; SEQ ID NOS: 38) enthielt, mittels IMAC bis zur Homogenität von < 98% erneut gereinigt, wie durch SDS-PAGE und Massenspektrometrie nachgewie­ sen wurde. Die Matrix-unterstützte Laserdesorptions-Massenspek­ trometrie ergab ein gemessenes Molekulargewicht von 16 414 ± 3 D (vorhergesagtes Molekulargewicht = 16 415 D). Sowohl reduzieren­ de als auch nicht-reduzierende SDS-PAGE-Gele zeigten eine ein­ zige molekulare Spezies mit einem geschätzten Molekulargewicht von 16 kD (Daten nicht gezeigt).

Eine dynamische Lichtstreuung unter Anwendung eines DP801 Mole­ cular Size Detector (Protein Solutions, Inc.) zeigte, daß das renaturierte OB-Protein der Maus überwiegend monomer war mit einigen Aggregaten höherer Ordnung. Das Protein wurde mit EDTA behandelt und chemisch oxidiert. Höhermolekulare Spezies wurden anschließend mittels Gelfiltration entfernt. Durch weitere dyna­ mische Lichtstreuung wurde bestätigt, daß das gereinigte renatu­ rierte rekombinante OB-Protein der Maus monodispergiert war. Im Anschluß an eine Dialyse gegen Phosphat-gepufferte Saline (PBS) wurde bakterielles Endotoxin unter Verwendung einer Acticlean ETOX-Säule (Sterogene Bioseparations, Inc.) entfernt. Die end­ gültige Ausbeute an Protein betrug 45 mg/l.

Ein Ellman-Assay wurde durchgeführt mit dem gereinigten, renatu­ rierten rekombinanten OB-Protein der Maus, um dessen Oxidations­ zustand zu ermitteln (Ellman, 1959, oben). Sowohl das renatu­ rierte Protein als auch das mittels 6 M Guanidin-HCl ungefaltete Protein zeigten einen freien Sulfhydrylgehalt von < 0,5%, wo­ durch gezeigt wird, daß das monomere Produkt eine intramolekula­ re Disulfidbindung enthält. Dies wurde durch Massenspektrometrie der Bromcyan-Spaltprodukte des zurückgefalteten bakteriellen Proteins bestätigt (Daten nicht gezeigt).

Bioaktivität des OB-Proteins. Das gereinigte, renaturierte re­ kombinante OB-Protein der Maus wurde im Rahmen einer täglichen intraperitonealen Injektion von 5 mg/kg/Tag an Gruppen von 10 C57Bl/6J ob/ob (Alter 16 Wochen)-, C57Bl/Ks db/db (Alter 12 Wochen)- und CBA/J +/+ (Alter 8 Wochen)-Mäusen verabreicht. Eine gleiche Anzahl an Tieren erhielt eine tägliche Injektion mit PBS. Das für die Kontrollinjektionen verwendete PBS wurde aus dem Dialysat nach Equilibrierung des Proteins abgeleitet. Zehn zusätzliche Tiere von den drei Mausstämmen erhielten keine In­ jektionen. Die Nahrungsaufnahme einzelner Tiere wurde täglich überwacht, und die Gewichte der Tiere wurden im Abstand von 3 oder 4 Tagen aufgezeichnet. Die kumulativen Ergebnisse der Nah­ rungsaufnahme und des Körpergewichts von jeder der 9 Mausgruppen sind in Fig. 28A bis F dargestellt, und die statistische Signi­ fikanz der Daten ist in Tabelle 1 angegeben. Die Nahrungsauf­ nahme der C57Bl/6J ob/ob-Mäuse, denen Protein injiziert worden war, wurde nach der ersten Injektion signifikant verringert und verringerte sich weiter bis zum 5. Tag, als sie sich auf einer Menge stabilisierte, die ungefähr 40% der Aufnahme derjenigen Tiere entspricht, die PBS-Injektionen erhalten hatten (p < 0,001). Die zur Kontrolle injizierten OB-Mäuse verloren über die drei-wöchige Studiendauer kein Gewicht. Die C57Bl/6J ob/ob-Mäuse, die Protein bekamen, verloren nach 5 Tagen ungefähr 10% ihres Körpergewichts (p < 0,001). Diese Tiere verloren weiter an Gewicht im Verlauf der drei-wöchigen Behandlung, nach der das Gewicht der Protein erhaltenden ob-Tiere auf durch­ schnittlich 60% ihres anfänglichen Körpergewichts zurückgegan­ gen war (p < 0,0001). Eine andere Gruppe von ob-Mäusen wurde mit zu den Protein erhaltenden ob-Mäusen paargefüttert. Die Daten in der Fig. 29B zeigen, daß die paargefütterten Mäuse signifikant weniger Gewicht verloren als diejenigen Tiere, die rekombinantes Protein erhalten hatten (p < 0,02). Eine Photographie von zwei Mäusen, die Injektionen von entweder Protein oder Träger erhiel­ ten, zeigt den großen Unterschied im Erscheinungsbild infolge der Proteinbehandlung (Fig. 29B). Um die Effekte des Proteins weiter festzustellen, wurden Autopsien von zwei Mäusen einer jeden Gruppe durchgeführt. Eine grobe Untersuchung der Protein erhaltenden ob-Mäuse ergab eine dramatische Verringerung des Körperfettes wie auch der Größe der Leber. Die Lebergewichte der db- und Wildtyp-Mäuse blieben unter Behandlung unverändert. Die Lebern der PBS-Injektionen erhaltenden ob-Mäuse wogen 5,04 und 5,02 g gegenüber 2,23 und 2,03 g der Tiere, die rekombinantes Protein erhielten. Im Gegensatz zu der Leber von ob-Mäusen, die blaß und fett aussah, entwickelte die Leber von Protein erhal­ tenden ob-Mäusen eine dunklere Färbung, die für normale Leber charakteristisch ist (Fig. 29C). Histologische Schnitte der Leber deuteten daraufhin, daß die unbehandelten Tiere eine fette Leber hatten, die bei den mit Protein behandelten Tieren merk­ lich verbessert wurde (Daten nicht gezeigt).

Im Gegensatz zu den ob-Mäusen gab es keine signifikanten Unter­ schiede im Körpergewicht oder der Nahrungsaufnahme bei den Pro­ tein erhaltenden C57BL/Ks db/db-Mäusen im Vergleich zur Kon­ trollgruppe, die Trägerstoff erhielt (Fig. 28A bis F, Tabel­ le 1). Sämtliche db/db-Mäuse der drei Gruppen verloren während der Behandlungsdauer zwischen 2 und 5 g. Der durchschnittliche Blutglucose-Wert der db-Mäuse wurde unter Verwendung eines Glu­ cometers gemessen und betrug bei allen Mäusen 500 mg/dl, was darauf hinweist, daß diese Tiere sekundär zur Obesität eine Diabetes entwickelt hatten. Die Injektionen der db-Mäuse wurde nach zwei Wochen abgebrochen.

Bei den Wildtyp-Mäusen gab es nach Verabreichung des rekombinan­ ten OB-Proteins eine geringe aber signifikante Verringerung des Körpergewichts (Fig. 28A-F, Tabelle 1). Nach Injektion des Proteins über fünf Tage verloren die behandelten Mäuse durch­ schnittlich 0,5 g, während die Kontrollmäuse 0,4 g zunahmen (p < 0,02). An zwei nachfolgenden Zeitpunkten wogen die Protein erhaltenden Tiere signifikant weniger als die Mäuse, die tägli­ che Injektionen von PBS erhielten. Die Signifikanz der Gewichts­ veränderung wurde zu den späteren Zeitpunkten hin reduziert. Bei den Tieren, die Gewicht verloren hatten, war die Nahrungsauf­ nahme nicht signifikant von den Kontrolltieren verschieden. Die PBS-Injektionen hatten einen kleinen aber signifikanten Effekt auf die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht von ob-, db- und Wildtyp-Mäusen im Vergleich zu Mäusen, die Injektionen erhalten hatten (p < 0,05).

Tabelle 1

Diskussion

Eine endokrine Funktion des Proteinprodukts des OB-Locus wurde zuerst von Coleman vorgeschlagen, der zeigte, daß das Körperge­ wicht von Ob/Ob-Mäusen nach parabiotischer Vereinigung mit nor­ malen oder db-Mäusen reduziert wurde (Coleman et al., 1978, oben). Die oben dargelegten Ergebnisse unterstützen diese Hypo­ these, da gezeigt wird, daß das Ob-Protein im Blutstrom zirku­ liert, und daß Injektionen des rekombinanten Proteins das Kör­ pergewicht reduzieren. Das Molekulargewicht des von dem Ob-Gen kodierten Genprodukts beträgt ungefähr 16 kD und entspricht damit der carboxyterminal zur Signalsequenz gelegenen Sequenz von 146 Aminosäuren. Das rekombinante Ob-Protein wird bei der Expression in Pichia pastoris nicht modifiziert. Die Expression von Säugergenen in Pichia führt im allgemeinen zur Ausbildung der korrekten Proteinstruktur [Cregg et al., Bio/Technology, 11: 905-914 (1993)]. Diese Befunde deuten daraufhin, daß das Ob- Protein nicht glykosiliert ist und in vivo nicht posttranslatio­ nal prozessiert wird. Die Daten schließen die Möglichkeit nicht aus, daß das Ob-Protein mit sich selber oder anderen Proteinen im Plasma oder Fettgewebe nicht-kovalent gebunden ist. Obgleich eine proteolytische Spaltung des Proteins nicht ausgeschlossen worden ist, wurden niedermolekulare Formen des Ob-Proteins durch keines der verwendeten Antiseren einschließlich vier Anti-Pep­ tid-Antikörper nachgewiesen.

Das Ob-Protein besitzt zwei Cysteinreste und zirkuliert im Men­ schen als Monomer, während es in der Maus als Monomer und Dimer zirkuliert. Eine für sekretierte Moleküle typische intramoleku­ lare Disulfidbindung wird gefunden, wenn das humane Protein in Pichia pastoris exprimiert wird, was darauf hinweist, daß es in vivo wahrscheinlich vorhanden ist. Diese Annahme wird gestützt durch die biologische Aktivität des rekombinanten bakteriellen Proteins, welches über eine intramolekulare Disulfidbindung verfügt. Das Ob-Protein der Maus kann im Plasma als Monomer und als Dimer gefunden werden. Daß das Monomer und das Dimer gefun­ den werden, wenn das Ob-Protein der Maus in Hefe exprimiert wird, zeigt, daß die Neigung des Mausproteins zur Bildung eines Dimers das Ergebnis von Unterschieden in der Primärsequenz im Vergleich zum Menschen ist. Obgleich klar ist, daß das Monomer über eine biologische Aktivität verfügt, ist die funktionelle Aktivität des Dimers unbekannt.

Der Effekt des Ob-Proteins auf die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht von Ob-Mäusen ist dramatisch. Nach einer Behand­ lungsdauer von drei Wochen hatten die Ob-Mäuse, denen tägliche Injektionen von rekombinantem Protein verabreicht worden waren, 40% ihres Gewichts verloren und konsumierten 40% der von Kon­ trolltieren aufgenommenen Nahrungsmenge. Darüber hinaus hatte sich das Gewicht der behandelten Ob-Mäuse zum Zeitpunkt des Abbruches des Experiments noch nicht eingependelt. Die Ergeb­ nisse aus dem Experiment der Paarfütterung zeigen, daß der Ge­ wichtsverlust ein Ergebnis der Effekte sowohl auf die Nah­ rungsaufnahme als auch den Energieverbrauch ist. Demgemäß ver­ lor eine separate Gruppe von Ob-Mäusen, deren Kalorienaufnahme auf diejenige der Protein erhaltenden Ob-Mäuse reduziert wurde, signifikant weniger Gewicht als die Protein erhaltenden Tiere. Die Reduktion der Nahrungsaufnahme bei Ob/Ob-Mäusen auf einen Wert unterhalb desjenigen von Wildtyp-Mäusen innerhalb eines Tages der Verabreichung des Ob-Proteins zeigt, daß sie für des­ sen Effekte besonders sensitiv sind. Tatsächlich kann es sein, daß der Ob-Rezeptor bei diesen Tieren hochreguliert ist. Nach einer fünftägigen Behandlungsdauer wurde die Nahrungsaufnahme bei behandelten Ob-Mäusen relativ konstant. Wenn dies das Ergeb­ nis davon ist, daß das Protein steady state-Werte erreicht hat­ te, würde es darauf hindeuten, daß das Protein eine relativ lange Halbwertszeit besitzt [The Pharmacological Basis of The­ rapeutics, S. 19-45, Goodman and Gilman, Hrsg., Pergamon Press, New York (1990)]. Diese Schlußfolgerung stimmt mit den Daten aus den Parabiose-Experimenten überein [Coleman et al., 1978, oben; Weigle, Int. J. Obesity, 12: 567-578 (1988)].

Die Effekte des rekombinanten Proteins auf das Körpergewicht von Wildtyp-Mäusen waren während der ersten zwei Wochen der Studie gering aber statistisch signifikant. Während der Gewichtsun­ terschied zwischen Protein erhaltenden gegenüber PBS erhaltenden Wildtyp-Mäusen bei späteren Zeitpunkten fortdauerte, ging die statistische Signifikanz der Daten nach drei Wochen stark zu­ rück. Der frühe Gewichtsverlust konnte nicht auf einen Unter­ schied in der Nahrungsaufnahme zurückgeführt werden. Vermutlich war die Messung der Nahrungsaufnahme nicht präzise genug, um eine Reduktion im Umfang von 1 g Körpergewicht während der Be­ handlung nachzuweisen. Diese Beobachtungen weichen von den Er­ gebnissen vorheriger Experimente ab, bei denen Wildtyp-Nager mittels parabiotischer Vereinigung mit db-Mäusen, fa-Ratten, Ratten mit hypothalamischen Läsionen und Ratten, die durch eine kalorienhaltige Diät adipös gemacht wurden, vereinigt wurden [Coleman et al., 1978, oben; Harris et al., oben; Harris et al., "Physiological and metabolic changes in parabiotic partners of obese rats", Hormones, Thermogenesis and Obesity, Lardy und Straatman, Hrsg., Elsevier Science Publishing Co., New York (1989); Hervey, J. Physiol. 145: 336-352 (1959]. In jedem Fall werden die Wildtyp-Tiere anorexisch und verlieren deutliche Gewichtsmengen. Da die Mengen an Ob-Protein in db-Mäusen und fa- Ratten erhöht sind und die Menge an Ob-RNA in Mäusen mit hypot­ halamischen Läsionen erhöht ist, ist es wahrscheinlich, daß die Wildtyp-Mäuse auf Ob ansprechen können, wenn es im Plasma in ausreichend hoher Menge zirkuliert. Die vorliegend dargelegten Befunde sind mit der Möglichkeit vereinbar, daß die Mengen an verabreichtem Protein unterhalb der endogenen Werte lagen, was zu einer Gleichgewichtseinstellung auf dem Niveau eines gering­ fügig niedrigeren Körpergewichts führt. Die Quantifizierung der zirkulierenden Menge an dem Ob-Protein in den behandelten Mäusen wird diesen Punkt aufklären. Obgleich ein Immunoassay für das Protein der Maus noch nicht zur Verfügung steht, haben Immun­ präzipitationen darauf hingewiesen, daß die Mengen an zirkulie­ rendem Ob-Protein in den Protein erhaltenden Wildtyp-Mäusen nicht wesentlich erhöht wurden.

Der geringere Effekt des Proteins bei Wildtyp-Mäusen und das Ausbleiben eines Ansprechens von db-Mäusen macht es unwahr­ scheinlich, daß die Behandlung unspezifische oder aversive Ef­ fekte aufweist. Sämtliche db-Mäuse verloren während der Behand­ lungsdauer eine kleine Gewichtsmenge, und zwar unabhängig davon, ob sie das Ob-Protein erhielten oder nicht. Die db-Tiere waren deutlich hyperglykämisch und der Gewichtsverlust ist wahrschein­ lich auf Diabetes und nicht auf die experimentelle Vorgehens­ weise zurückzuführen. C57BL/Ks db/db-Mäuse entwickeln häufig Diabetes und beginnen, kleinere Gewichtsmengen zu verlieren, wenn sie das Alter der bei der vorliegenden Studie eingesetzten Tiere erreichen (Coleman et al., 1978, oben). C57Bl/6J Ob/Ob- Mäuse vergleichbaren Alters entwickeln keine signifikante Hyper­ glykämie. Es wird davon ausgegangen, daß diese phänotypischen Unterschiede auf genetische Unterschiede der Stämme (C57Bl6J gg. C57Bl/Ks) zurückzuführen sind, die die Mutationen tragen (Cole­ man et al., 1978, oben).

Der Umstand, daß das von der cDNA-Sequenz des Ob-Gens in C57Bl/6J Ob/Ob-Mäusen vorhergesagte trunkierte Protein mit 105 Aminosäuren nicht nachgewiesen wurde, deutet daraufhin, daß das mutierte Protein entweder degradiert oder nicht translatiert wird. Die Möglichkeit, daß das verwendete Antiserum dieses trun­ kierte Protein nicht nachweist, kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Der beobachtete zehnfache Anstieg der Menge an Ob-Pro­ tein in db-Mäusen im Vergleich zum Wildtyp deutet daraufhin, daß das Ob-Protein bei Vorliegen einer Resistenz gegenüber seinen Effekten übermäßig produziert wird. Diese Daten korrelieren mit den Studien im Zusammenhang mit der Ob-mRNA. Wie bereits ausge­ führt worden ist, haben vorhergehende Experimente gezeigt, daß Mutationen der Gene für db der Maus und für fa der Ratte, welche auf homologen chromosomalen Regionen liegen, zu einer Überpro­ duktion eines Plasma-Faktors führen, welcher das Körpergewicht supprimiert (Truett et al., 1991, oben; Coleman, 1978, oben; Hervey, 1959, oben). In beiden Fällen ist davon ausgegangen worden, daß die mutierten Tiere gegenüber den Effekten des Ob- Proteins resistent sind. Diese Möglichkeit wird bestätigt durch die Beobachtung, daß das Ob-Protein keinen Effekt auf das Kör­ pergewicht oder die Nahrungsaufnahme aufweist, wenn es db-Mäusen verabreicht wird.

Die Obesität von Menschen könnte mit erhöhten Mengen des Ob- Proteins im Plasma von Individuen assoziiert sein, die gegenüber dem Hormon relativ unanregbar sind. Andererseits könnte eine reduzierte Expression von Ob ebenfalls zur Obesität führen, wobei in diesem Falle "normale" (d. h. unangemessen niedrige) Werte des Proteins gefunden werden könnten. Daher könnte die Menge an Ob-Protein in menschlichem Plasma ein Marker für ver­ schiedene Formen der Obesität sein. Bei einer kleinen Gruppe von mageren Individuen mit KMI < 25 sind Mengen des zirkulierenden Ob-Proteins im Nanogrammbereich mittels ELISA nachweisbar. Be­ achtenswerterweise sind variable Konzentrationen festgestellt worden, was darauf hinweist, daß die Expressions- und/oder Sen­ sitivitätsrate gegenüber dem Protein eine Rolle bei der Bestim­ mung des Körpergewichts spielen kann.

Der Ort der Wirkung des Ob-Proteins ist unbekannt. Das Protein wirkt sich sowohl auf die Nahrungsaufnahme als auch den Energie­ verbrauch aus, wobei dieser Befund mit den klinischen Studien übereinstimmt, welche zeigen, daß Veränderungen beider Systeme der Regulierung des Körpergewichtes dienen [Leibel et al., N. Engl. J. Med. 332: 621-628 (1995); Keesy et al., "Metabolic de­ fense of the bodyweight set-point", Association for Research in Nervous and Mental Disease, S. 87-96, Stunkard und Stellar, Hrsg., Raven Press, New York (1984)]. Der Hypothalamus liegt auf dem Stoffwechselweg, der das Körpergewicht kontrolliert, wahr­ scheinlich stromabwärts von Ob, obgleich direkte Effekte auf eine Vielzahl von Organen möglich sind.

Beispiel 9: Erhöhte Expression von Ob-RNA in Adipozyten von Mäusen mit Läsionen des Hypothalamus und mit Mutationen im db- Locus

Das Genprodukt des kürzlich klonierten Obesitäts-Gens (ob) der Maus spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Fett­ gewebemasse. Die Ob-RNA wird in vivo in spezifischer Weise von Adipozyten der Maus in jeder der mehreren verschiedenen Fett­ zellablagerungen einschließlich braunem Fett exprimiert. Sie wird ebenfalls in kultivierten 3T3-442A-Präadipozytenzellen ex­ primiert, die zur Differenzierung induziert worden sind. Mäuse mit Läsionen des Hypothalamus sowie Mäuse, die hinsichtlich des db-Locus mutiert sind, exprimieren im Fettgewebe eine 20fach höhere Menge an Ob-RNA. Diese Daten deuten daraufhin, daß sowohl das db-Gen als auch der Hypothalamus im Stoffwechselweg, der die Fettgewebemasse reguliert, stromabwärts des Ob-Gens liegen, und stimmen überein mit vorhergehenden Experimenten, die darauf hindeuten, daß der db-Locus für den Ob-Rezeptor kodiert. Bei den db/db- und Läsions-Mäusen korrelierten die quantitativen Unter­ schiede in der Expressionsrate von Ob-RNA mit dem Lipidgehalt von Adipozyten. Die Moleküle, die die Expressionsrate des Ob- Gens in Adipozyten regulieren, spielen wahrscheinlich eine wich­ tige Rolle bei der Bestimmung des Körpergewichtes, wie auch die Moleküle, die die Effekte von Ob an seiner Wirkungsstelle ver­ mitteln.

Materialien und Methoden In Situ-Hybridisierung

Weiße Fettgewebe von identischen abdominalen Regionen von Wild­ typ (wt)- und db-Mäusen wurden gleichzeitig prozessiert nach dem modifizierten Verfahren gemäß Darlegung von Richardson et al., Growth, Development & Aging, 56: 149-157 (1992). Kurz gesagt, wurden die Gewebe 2 Stunden lang bei 4°C in Bouin′s-Lösung fi­ xiert. Anschließend wurden sie durch aufeinanderfolgende Behand­ lung mit steigenden Konzentrationen an Ethanol von 10% bis 100%, jeweils 5 Minuten lang bei 4°C, dehydratisiert. Weitere Inkubationen der Gewebe mit Xylen (1 Std.) und Paraffin (2 Std.) erfolgten bei 65°C. Eingebettete wt- und db/db-Fettgewebe wur­ den geschnitten und später denselben Bedingungen unterworfen. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang bei 65°C gebacken und mit Xylol und aufeinanderfolgenden Verdünnungen mit Ethanol von 100% bis 50%, jeweils für 3 Minuten bei Raumtemperatur, behan­ delt. Durch in vitro-Transkription der linearisierter Kodie­ rungssequenz des Ob-Gens stromaufwärts eines Sp6 RNA-Polymerase- Promotors wurde eine Antisense-RNA-Sonde des Ob-Gens syntheti­ siert. Die in situ-Hybridisierung erfolgte exakt nach Schaeren­ giemers et al., Histochemistry , 100: 431-440 (1993).

RNA-Präparation und Zellkultur

Gesamt-RNA und Northern-Blots wurden wie beschrieben herge­ stellt. Vaskuläre Stromazellen und Adipozyten wurden präpariert nach Rodbell, und RNA aus beiden Fraktionen wurde präpariert nach Dani et al., Mol. Cell. Endocrinol., 63: 199-208 (1989); Rodbell, J. Biol. Chem., 239: 375-380 (19). Nach der Subklonie­ rung wurden 3T3-F442-Zellen in Dulbecco′s modifiziertem Eagle- Medium enthaltend 10% fötales bovines Serum (definiert als Standardmedium) kultiviert [Dani et al., "Molecular biology techniques in the study of adipocyte differentiation", Obesity in Europe, Bd. 88, S. 371-376, Bjorntorp und Rossner, Hrsg., John Libbey Company Ltd., London, England (1989)]. Bei Vorliegen einer Konfluenz wurden die Zellen in Standardmedium behandelt, welches mit 2 nM Triiodthyronin (T3) und 17 nM Insulin ergänzt war. Zwölf Tage später wurde die RNA wie oben präpariert.

Behandlung mit Goldthioglucose (GTG)

Weibliche CBA/J-Mäuse wurden im Alter von zwei Monaten mit einer einzigen intraperitonealen Injektion von Aurothioglucose (Sigma Katalog-Nr. A0632) in einer Dosis von 0,2 mg/g in normaler Sali­ ne behandelt. Kontrolltiere erhielten Injektionen mit normaler Saline. Die Mäuse wurden einen Monat nach Behandlung gewogen. Fettgewebe-RNA wurde aus denjenigen behandelten Tieren isoliert, deren Gewicht nach der GTG-Behandlung um mehr als 20 g zugenom­ men hatte.

Ergebnisse

Kürzlich wurde gefunden, daß das Ob-Gen in Fettgewebe exprimiert wird [Zhang et al., Nature, 372: 425-432 (1994)]. Da das Fett­ gewebe aus vielen Zelltypen einschließlich Adipozyten, Präadipo­ zyten, Fibroblasten und Gefäßzellen zusammengesetzt ist, erfolg­ te eine in situ-Hybridisierung mit Schnitten von epididymalen Fettpolstern normaler Tiere an Sense- und Antisense-Ob-Riboson­ den [Richardson et al., 1992, oben; Wasserman, "The concept of the fat organ", in Rodahl, Issekutz, fat as a tissue", S. 22-92, McGraw Hill, New York (1964)]. Bei Verwendung der Antisense- Sonde wurden positive Signale in sämtlichen Adipozyten des Schnittes nachgewiesen (Fig. 30 - markierter Wt). Die Signale wurden nicht beobachtet, wenn die Antisense-Sonde mit Gehirn­ schnitten hybridisiert wurde (Daten nicht gezeigt). Die Hybri­ disierung der Antisense-Sonde mit Schnitten des Fettgewebes von C57Bl/Ks db/db-Mäusen war stark erhöht, wodurch die Adipozyten­ spezifische Expression von Ob-RNA bestätigt und ein starker Anstieg der Menge an Ob-RNA pro Adipozyte bei diesen Tieren gezeigt wurde (Fig. 30 - markierte db/db). Mäuse, die im Be­ reich des db-Locus mutiert sind, sind als Teil eines Syndroms, welches mit dem bei C57Bl/6J Ob/Ob-Mäusen beobachteten phänoty­ pisch identisch ist, massiv adipös (Bahary et al., 1990, oben).

Die Ob-RNA wurde nicht von Stromazellen des Fettgewebes synthe­ tisiert, die von Adipozyten getrennt waren. Wie erwartet, wurde die Expression der Ob-RNA in der Adipozytenfraktion unter Ver­ wendung von Northern-Blots nachgewiesen (Fig. 31). Dasselbe Ergebnis wurde erhalten unter Anwendung von RT-PCR (Daten nicht gezeigt). Diese Daten unterstützen die Feststellung, daß ledig­ lich Adipozyten das Ob-Gen exprimieren. Die Daten von kultivier­ ten Adipozyten bestätigen diese Schlußfolgerung. Bei diesen Studien wurden 3T3-F442A-Zellen unter Bedingungen kultiviert, die, als Teil eines zellulären Programmes zur Differenzierung zu Adipozyten, zur Akkumulation von Lipiden führen. Die Ob-RNA wurde weder in exponentiell wachsenden Zellen, noch in konfluen­ ten 3T3-F442A-Präadipozytenzellen, die frühzeitig Marker expri­ mieren, exprimiert, während die Differenzierung dieser Zellen zu Adipozyten zu einer Expression nachweisbarer Mengen an Ob-RNA führte (Fig. 31) [Dani et al., J. Biol. Chem., 264: 10119-10125 (1989)]. Die Menge an Ob-RNA ist gegenüber den Kulturbedingun­ gen extrem sensitiv, da keine Message in späten, post-konfluen­ ten Zellen beobachtet wurde, die Insulin nicht ausgesetzt waren.

Hybridisierungsstudien zeigten, daß die Ob-RNA in vivo in mehre­ ren verschiedenen Fettablagerungen einschließlich den epididyma­ len, parametranen, abdominalen, perirenalen und inguinalen Fett­ polstern exprimiert wird (Fig. 32A). Die präzise Expressions­ rate war in jeder der Ablagerungen in gewisser Weise variabel, wobei inguinales und parametranes Fett geringere Mengen an Ob- RNA exprimieren. Die Ob-RNA wird ebenfalls in braunem Fettgewebe exprimiert, obgleich die Expressionsrate in braunem Fett unge­ fähr 50fach niedriger ist als bei den anderen Fettgewebeablage­ rungen. Diese quantitativen Unterschiede korrelieren lose mit zuvor veröffentlichten Unterschieden in der Zellgröße bei den verschiedenen Fettzellablagerungen [Johnson et al., J. Lipid Res., 13: 2-11 (1972)]. Die Menge an Ob-RNA im braunen Fett wird durch die Kälteexposition nicht beeinflußt (Fig. 32B). In die­ sem Experiment stieg die Menge an unkoppelnder Protein-RNA (UCP) in braunem Fett nach Kälteexposition, während die Mengen an Ob- RNA sich nicht veränderte [Jacobson et al., J. Biol. Chem., 260: 16250-16254 (1985)]. Zusammengenommen bestätigen diese Da­ ten, daß sämtliche Adipozyten in der Lage sind, Ob-RNA zu produ­ zieren, und sie zeigen bei verschiedenen Fettablagerungen varia­ ble Expressionsraten. Diese Daten stützen die Möglichkeit, daß die Menge der kodierten Proteine mit der gesamten Fettgewebemas­ se korreliert.

Die Mengen an Ob-RNA in db/db-Mäusen und in Mäusen mit Läsionen des Hypothalamus wurden gemessen. Die Läsionen des ventromedia­ len Hypothalamus (VMH) führen als Teil eines Syndroms, welches dem in Ob/Ob- und db/db-Mäusen beobachteten ähnlich ist, zur Obesität [Bray et al., Metabolism, 24: 99-117 (1975)]. Die Para­ biose-Experimente deuten daraufhin, daß die Läsionen zu einer Überexpression eines im Blut gebildeten Faktors führen, welcher die Nahrungsaufnahme und das Körpergewicht supprimiert (Hervey, 1959, oben). Ähnliche Ergebnisse werden festgestellt, wenn Mäu­ se, die am db-Locus eine Mutation aufweisen, einer Parabiose mit normalen Mäusen unterzogen werden, was darauf hindeutet, daß der Ob-Rezeptor vom db-Locus kodiert sein kann (Coleman et al., 1978, oben). Daher kann die aus VMH-Läsionen und der db-Mutation resultierende Obesität das Ergebnis einer Resistenz gegenüber den Effekten des Ob-Proteins sein. Wenn dies so ist, wäre ein sekundärer Anstieg der Menge an Ob-RNA in Fettgewebe vorherge­ sagt.

Hypothalamische Läsionen wurden in weiblichen CBA-Mäusen indu­ ziert unter Verwendung der Chemikalie Goldthioglucose (GTG) [Debons et al., Fed. Proc., 36: 143-147 (1977)]. Diese Behandlung führt zu spezifischen hypothalamischen Läsionen, hauptsächlich im ventromedialen Hypothalamus (VMH), mit nachfolgender Entwick­ lung einer Obesität innerhalb mehrerer Wochen. Gewöhnlich führt eine einzige intraperitoneale Injektion von GTG von 0,2 mg/g Körpergewicht innerhalb von vier Wochen zur Entwicklung der Obesität. Einen Monat alte weibliche CBA/J-Mäuse (20-25 g) wur­ den mit GTG behandelt, und die nachfolgende Gewichtszunahme von behandelten und Kontrolltieren ist angegeben (Tabelle 2). RNA aus Fettgewebe wurde von db/db-Mäusen und von denjenigen mit GTG behandelten Tieren präpariert, die < 20 g zugenommen hatten. Northern-Blots zeigten bei 2 Monate alten db/db- und mit GTG behandelten Mäusen im Vergleich zu normalen Tieren einen 20fa­ chen Anstieg in der Menge an OB-RNA (Fig. 33).

Tabelle 2

Gewichtszunahme von mit Goldthioglucose behandel­ ten Mäusen

Zwei Monate alte weibliche CBA/J-Mäuse wurden mit Goldthioglu­ cose (GTG) behandelt. Goldthioglucose (Sigma A0632) wurde in normaler Salinelösung in einer Dosierung von 2,0 mg/g intraperi­ toneal verabreicht. Das Körpergewicht von Kontrolltieren und injizierten Tieren wurde vor und einen Monat nach der Injektion aufgezeichnet. Die Tiere wurden zu fünft in einem Käfig unterge­ bracht, und die Fütterung erfolgte ad libitum. Die einen Monat nach der Injektion zugenommene Gewichtsmenge ist in der Tabelle angegeben. Die Tiere, die einen Monat nach Injektion eine Zunah­ me des Körpergewichtes von mehr als 20 g aufwiesen, wurden für die weitere Studie ausgewählt.

Diskussion

Das Genprodukt des OB-Gens der Maus zirkuliert im Plasma der Maus und des Menschen, wo es der Regulation der Fettgewebemasse dienen kann. Weitere Studien über die Regulation der Expression und Wirkmechanismen von OB werden für das Verständnis des das Körpergewicht regulierenden physiologischen Stoffwechselweges große Bedeutung haben.

Die vorliegenden Beispiele zeigen, daß das OB-Genprodukt in sämtlichen Fettgewebeablagerungen ausschließlich von Adipozyten exprimiert wird. Dieses Ergebnis stimmt mit der Möglichkeit überein, daß das Proteinprodukt des OB-Gens mit der Lipideinla­ gerung im Körper korreliert. Darüber hinaus ist die OB-RNA in db-Mäusen und in Mäusen mit hypothalamischen Läsionen 20fach hochreguliert. Bei diesen Tieren liegt der tatsächliche Anstieg in der Menge an OB-RNA pro Zelle wahrscheinlich sogar höher als 20fach, da die Adipozytenzellen bei diesen Tieren ungefähr 5fach größer sind (s. Fig. 30) (Debons et al., 1977, oben). Diesen Daten zufolge befinden sich das db-Gen und der Hypothalamus hinsichtlich des das Körpergewicht kontrollierenden Stoffwech­ selweges stromabwärts von OB, was mit der Hypothese vereinbar ist, wonach der Ob-Rezeptor vom db-Locus kodiert wird [Coleman et al., Diabetologia, 14: 141-148 (1978)]. Dieser Punkt wird durch molekulare Klonierung des OB-Rezeptors und/oder des db­ Gens aufgeklärt werden. Der Anstieg in der Menge an OB-RNA in db/db- und GTG-behandelten Mäusen deutet ferner auf eine nicht- Zell-autonome Funktion des OB-Genprodukts in Fettzellen hin [Ashwell et al., Proc. R. Soc. Lond., 195: 343-353 (1977); Ashwell et al., Diabetologia, 15: 465-470]. Im Falle der direkten Wirkung des kodierten Proteins auf Fettzellen zur Hemmung des Wachstums oder der Differenzierung würde die Überexpression des Wildtyp-OB-Gens in GTG-behandelten Mäusen daher zu einem mageren Phänotyp führen.

Die einfachste Erklärung dieser Daten liegt darin, daß das OB- Protein als endokrines Signalmolekül wirkt, welches von Adipozy­ ten sekretiert wird, und direkt oder indirekt auf den Hypothala­ mus einwirkt. Direkte Effekte auf den Hypothalamus würden erfor­ dern, daß Mechanismen existieren, welche die Passage des OB- Genprodukts durch die Blut/Hirn-Schranke erlauben. Mechanismen, bei denen das periventrikuläre Organ und/oder spezifische Trans­ porter beteiligt sind, könnten einem Molekül von der Größe, wie sie von dem OB-Gen kodiert wird, den Zugang zum Gehirn ermögli­ chen [Johnson et al., FASEB J., 7: 678-686 (1983); Baura et al., J. Clin. Invest., 92: 1824-1830 (1983); Pardridge, Endocrine Re­ views, 7: 314-330 (1986)]. Diese Hypothese muß jedoch mit Vor­ sicht betrachtet werden, bis die Mittel, durch die das Protein die Blut/Hirn-Schranke überwinden könnte, identifiziert worden sind. Darüber hinaus wird es erforderlich sein, mögliche Effekte auf andere Zielorgane zu untersuchen.

Die Fettzellsignale, die für die quantitative Variation der Expressionsrate des OB-Gens verantwortlich sind, sind noch nicht bekannt, aber sie korrelieren mit den Unterschieden in der Größe der Adipozytenzelle. Die Adipozyten von db/db-Mäusen sind fünf­ mal größer als diejenigen normaler Mäuse, wobei die Zellgröße ungefähr 1,0 µg Lipid/Zelle beträgt (Johnson et al., 1972, oben). Vorhergehende Befunde haben gezeigt, daß der Lipidgehalt und/oder die Größe der Fettzelle ein wichtiger Parameter bei der Bestimmung des Körpergewichtes ist [Faust et al., Am. J. Phy­ siol., 235: 279-286 (1978); Faust et al., Science, 197: 393-396 (1977)]. Es könnte sein, daß jede Fettzelle eine geringe Menge an OB-RNA exprimiert, die sich im Verhältnis zur Zellgröße wei­ ter erhöht. Es ist ebenfalls möglich, daß die Zellgröße nicht der entscheidende Parameter ist, sondern lediglich mit dem in­ trazellulären Signal korreliert, durch das die Expression des OB-Gens in Adipozyten von db/db- und VMH-läsionierten Mäusen gesteigert wird. In jedem Fall sind die Komponenten des die Synthese von OB-RNA regulierenden Signaltransduktionsweges wahr­ scheinlich wichtig bei der Bestimmung des Körpergewichts. Gene­ tische und umweltbedingte Einflüsse, die die Expressionsrate von OB reduzieren, würden zur Steigerung des Körpergewichtes beitra­ gen, wie es auch bei Einflüssen der Fall wäre, die die Sensiti­ vität gegenüber dem kodierten Protein vermindern. Die spezifi­ schen Moleküle, die die Expressionsrate des OB-Gens regulieren, sind bis jetzt unbekannt und sehen einer Bestimmung des Ausmaßes der Genkontrolle entgegen, die zu einer quantitativen Verände­ rung in der Menge an OB-RNA und einer Untersuchung der regulato­ rischen Elemente des OB-Gens führen. Die Identifizierung der Moleküle, die die Expression des OB-Gens in Adipozyten regulie­ ren, und derjenigen, die die Effekte des kodierten Proteins an seiner Wirkungsstelle vermitteln, wird zum Verständnis der phy­ siologischen Mechanismen, durch die das Körpergewicht reguliert wird, im großem Umfang beitragen.

Beispiel 10: RNA-Expressionsmuster und Kartierung auf den phy­ sikalischen zytogenetischen und genetischen Karten von Chromo­ som 7

Die OB-RNA wird in humanem Fettgewebe in hohen Mengen, in der Plazenta und dem Herzen jedoch in wesentlich geringeren Mengen exprimiert. Das humane OB-Gen liegt auf einem großen artifiziel­ len Hefechromosom (YAC)-Contig, abgeleitet vom Chromosom 7q31.3. Zusätzlich zu der Bestätigung der relativen Lokalisierung des Gens auf der Grundlage von vergleichender Kartierung von Maus und Menschen sind durch diese Studie 8 etablierte Mikrosatelli­ tenmarker in enger physikalischer Nachbarschaft zum humanen OB- Gen identifiziert worden. Da Mutationen im OB der Maus zu einem Syndrom führen können, das einer morbiden Obesität von Menschen sehr ähnlich ist, stellen diese genetische Marker wichtige Werk­ zeuge dar zur Untersuchung der möglichen Rolle des OB-Gens bei vererbten Formen der menschlichen Obesität.

Materialien und Methoden Northern-Blot-Analyse

Gesamt-RNA wurde aus Fettgewebe präpariert nach dem Verfahren von Chirgwin et al. Biochem. 18: 5294-5299 (1979). Die Northern- Blots, das radioaktive Markieren und Hybridisierungen erfolgten wie beschrieben (Zhang et al., 1994, oben). Die Northern-Blots von poly(A)⁺-RNA (humanes MTN, humanes MTN II, und humanes föta­ les MTN II) wie auch PCR-Primer zur Herstellung der radioaktiv markierten humanen Actin-Sonde wurden von CLONETECH (Palo Alto, CA) erhalten.

STS-Entwicklung

Sequence tagged-site (STS)-spezifische PCR-Assays wurden im we­ sentlichen gemäß Darlegung entwickelt und optimiert [(Green et al., PCRMethodsApplic. (1991); Green et al., Genomics, 11: 548- 564 (1991); Green, "Physical mapping of human chromosomes: gene­ ration of chromosome-specific sequence-tagged sites", Methods in Molecular Genetics, Bd. 1 Gene and Chromosome Analysis (Teil A), S. 192-210, (Adolph, Hrsg., Academic Press, Inc., San Diego (1993); Green et al., Hum. Mol. Genet., 3: 489-501 (1994)]. Jede STS wird bezeichnet unter Verwendung des Präfixes ′sWSS′ und einer nachfolgenden einmaligen Ziffer. Die Details über die vorliegend dargelegten 19 STSs sind in Tabelle 3 angegeben mit zusätzlichen Informationen (z. B. PCR-Reaktionsbedingungen, voll­ ständige DNA-Sequenz), die bei der GenBank und/oder der Genome Data Base (GDB) zur Verfügung stehen. Bei den Mikrosatelliten­ spezifischen STSs korrespondierten die bei den PCR-Assays ver­ wendeten Oligonukleotidprimer (Tabelle 3) entweder mit denjeni­ gen, die zur Analyse des Genotyps verwendet wurden (Tabelle 4), oder mit denjenigen, die mit Hilfe der bei der GenBank erhältli­ chen DNA-Sequenz erstellt wurden (am häufigsten mit dem Compu­ terprogramm OSP) [Hillier et al., PCR Methods Applic., 1: 124-128 (1991)]. Die Tabelle 3 veranschaulicht die STSs in dem das huma­ ne OB-Gen enthaltenden YAC-Contig.

Die 19 für das Chromosom 7 spezifischen STSs, die auf dem das humane OB-Gen enthaltenden YAC-Contig liegen (Fig. 35), sind aufgeführt. Für jeden Fall sind die vergebenen ′sWSS′-Bezeich­ nungen, die relevanten Alias-Bezeichnungen, der von der GDB zugeordnete Name des Locus, die STS-Quelle, PCR-Primersequenzen, die STS-Größe und die Identifizierungsnummer der GDB angegeben. Die Quellen für STSs sind wie folgt: ′YAC-Ende′ (isoliertes Insert-Ende eines YAC) (Green, 1993, oben), ′Lambda-Klon′ (ran­ domisierter, für das Chromosom 7 spezifischer Lamdba-Klon) (Green et al., 1991, oben; Green, 1993, oben), ′Genetischer Marker′ (Mikrosatelliten-Marker, s. Tabelle 2) (Green et al., 1994, oben), ′YAC-Insert′ (randomisiertes Segment vom YAC-In­ sert) und ′Gen′ (Gen-spezifische STS). Es wird darauf hingewie­ sen, daß sich die zur Identifizierung der YACs verwendeten PCR- Primer (aufgeführt in der vorliegenden Tabelle) hinsichtlich einiger für genetische Marker spezifischer STSs von denjenigen unterscheiden, die zur Durchführung der Analyse des Genotyps (Tabelle 4) verwendet wurden, da der Nachweis von YACs, die einen genetischen Marker enthalten, keine Amplifikation des polymorphen Trakts selbst erfordert. Bei sämtlichen der angege­ benen PCR-Assays wurde eine Annelierungs-Temperatur von 55°C eingesetzt, mit Ausnahme von sWSS494, sWSS883, sWSS1529 und sWSS2619 (50°C), sWSS999 und sWSS1174 (60°C) und sWSS808 (65 °C). Weitere Einzelheiten im Hinblick auf STS-spezifische PCR-Assays sind in der GDB erhältlich.

Tabelle 4

Mikrosatelliten-Marker in dem das humane Ob-Gen enthaltenden YAC-Contig

Die 8 Mikrosatelliten-Marker, die auf dem das humane OB-Gen enthaltenden YAC-Contig liegen (Fig. 35), sind aufgelistet. In jedem Fall sind die Bezeichnung des Markers (in Tabelle 3 ange­ geben als Alias-Bezeichnung), der Typ des Mikrosatelliten-Motivs (Tetranukleotid-′Tetra′-Wiederholung oder (CA)_n-Wiederholung), die Bezeichnung der GDB für den Locus, die für die Analyse des Genotyps auf Grundlage der PCR verwendeten Primersequenzen sowie die Identifikationsnummer der GDB angegeben. Weitere Einzelhei­ ten im Hinblick auf die PCR-Assays und die Polymorphismen sind in der GDB erhältlich.

Die für das humane OB spezifische STS (sWSS2619) wurde unter Verwendung der von der 3′-nicht-translatierten Region der cDNA erhaltenen DNA-Sequenz erstellt. Die für das humane PA×4 spezi­ fische STS (sWSS808) wurde entwickelt unter Anwendung der fol­ genden Strategie. Die für das PAX4-Gen der Maus spezifischen Oligonukleotidprimer (GGCTGTGTGAGCAAGATCCTAGGA) (SEQ ID NO: 63) und (GGGAGCCTTGTCCTGGGTACAAAG) (SEQ ID NO: 93) [Walther et al., Genomics 11: 424-434 (1991)] wurden verwendet, um ein 204 Basen­ paare langes Fragment aus humaner genomischer DNA zu amplifizie­ ren (wobei das Produkt dieselbe Größe aufweist wie das aus der genomischen DNA der Maus generierte). Dieser PCR-Assay war für die Identifizierung korrespondierender YACs nicht geeignet, da ein Produkt ähnlicher Größe (200 bp) ebenfalls von der Hefe-DNA amplifiziert wurde. Eine DNA-Sequenzanalyse des von humaner DNA generierten PCR-Produkts ergab jedoch Substitutionen an 20 Posi­ tionen unter den 156 analysierten Basen (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung dieser human-spezifischen Sequenz wurde ein neuer Primer (TTGCCAGGCAAAGAGGGCTGGAC) (SEQ ID NO: 64) erstellt und mit den ersten der obigen für PAX4 der Maus spezifischen Primer verwendet (s. Tabelle 3). Der resultierende, für PAX4 des Menschen spezifische PCR-Assay führte zu keiner Amplifikation eines signifikanten Produkts von Hefe-DNA und wurde daher zur Identifizierung korrespondierender YACs eingesetzt.

Identifizierung von YACs durch Sreening auf Basis der PCR

Die meisten der in Fig. 35 angegebenen YACs stammten aus einer Sammlung von Klonen, die hinsichtlich der DNA des menschlichen Chromosoms 7 stark angereichert waren (die ′Chromosom 7 YAC-Res­ source′) (Green et al., 1995, oben), unter Anwendung eines Screening-Verfahrens auf Basis der PCR[ [Green et al., 1995, oben; Greena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1213-1217 (1990)]. In einigen Fällen wurden mittels auf PCR basierendem Screening (Greena et al., 1990, oben) Klone isoliert von erhält­ lichen humanen Gesamt-genomischen YAC-Bibliotheken, hergestellt bei CEPH [Dausset et al., Behring Inst. Mitt., 91: 13-20 (1992); Albertsen et al., [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 4256-4260 (1990)] oder ICI [Anand et al., Nucl. Acids Res., 17: 4325-3433 (1989); Anand et al., Nucl. Acids Res., 18: 1951-1956 (1990)]. Die Bezeichnung eines jeden YACs erfolgte unter Verwendung des Präfixes "yWSS" und einer nachfolgenden einmaligen Ziffer.

Ergebnisse und Diskussion

Die Untersuchung der Gewebeexpression des humanen OB-Gens mittels Northern-Blot-Analyse ergab, daß die OB-RNA in menschlichem Fettgewebe in hohen Mengen, in der Plazenta und dem Herzen jedoch in viel niedrigeren Mengen exprimiert wird (Fig. 34). Die Größe der RNA (ungefähr 4,5 kB) war sowohl bei Menschen als auch bei Mäusen wie in auch in jedem der exprimierenden Gewebe äquivalent. Bei diesen Studien wurden bei 10 µg Fettgewebe-Gesamt-RNA gegenüber 2 µg plazentaler poly(A)⁺-RNA fünffach stärkere Signale beobachtet. Bei der poly(A)⁺-RNA aus dem Herzen wurde im Vergleich zur Plazenta ein fünffach schwächeres Signal beobachtet. Es wird geschätzt, daß die Menge an OB-RNA in der Plazenta ungefähr 250fach geringer ist als im Fettgewebe. Bei diesem Experiment wurde OB-RNA in keinem der anderen analysierten Gewebe einschließlich Gehirn, Lunge, Leber, Skelettmuskel, Niere und Pankreas nachgewiesen. Zusätzliche Experimente ergaben keine OB-RNA in Milz, Thymus, Prostata, Testis, Eierstock, Dünndarm, Colon, peripheren Blutleukozyten, oder in fötalem Gehirn, Leber oder Nieren (Daten nicht gezeigt). Es ist möglich, daß OB in diesen letztgenannten Geweben oder in anderen Geweben, die nicht untersucht wurden, in einer Menge exprimiert wird, die unterhalb der Nachweisgrenze liegt (bei der Northern-Blot-Analyse). Die beobachteten Expressionsmuster beim Menschen weichen in gewisser Weise von denjenigen der Maus ab, bei der OB-RNA beinahe ausschließlich in Fettgewebe nachgewiesen wird.

Vergleichende Kartierung der OB-Genregion im Genom der Maus und des Menschen

Das OB-Gen der Maus liegt auf dem proximalen Teil des Chromo­ soms 6 in einer Region, die mit einem Bereich des menschlichen Chromosoms 7q homolog ist. Gene innerhalb dieses Segments schließen ein (von proximal zu distal): Met-Protoonkogen, den transmembranen Konduktanze-Regulator der zystischen Fibrose (Cftr), das eine gepaarte Box enthaltende Gen 4 (Pax4), OB, und Carboxypeptidase A (Cpa) (Zhang et al., 1994, oben; Friedman et al., 1991, oben). Bei der Maus wurde die genetische Kartierung angewendet, um zu zeigen, daß Pax4 eng mit ob verknüpft vorliegt [Walther et al., 1991, oben; Zhang et al., 1994, oben]. Der ge­ fundene physikalische Abstand zwischen OB und Pax4 betrug unge­ fähr ein Megabasenpaare (Mb) (Zhang et al., 1994, oben). Auf der Grundlage dieser vergleichenden Kartierungsstudien wurde erwar­ tet, daß das humane OB-Gen zwischen Pax4 und CPA auf dem Chro­ mosom 7q liegen würde. Desweiteren wäre die wahrscheinlichste zytogenetische Position des humanen OB-Gens die unmittelbare Nähe zur 7q31.3-q32-Grenze, da das humane CFTR [Heng et al., Cell Gent., 62: 108-109 (1993)] und Pax4 [Tamura et al., Cytoge­ net. Cell Genet., 66: 132-134 (1994)] durch Fluoreszenzhybridi­ sierung in situ (FISH) auf 7q31.3 bzw. 7q32 kartiert wurden.

Kartierung des OB-Gens auf dem humanen Chromosom 7

Eine ein kleines Segment der 3′-nicht-translatierten Region des humanen OB-Gens amplifizierende STS (sWSS2619) wurde verwendet, um eine Sammlung von YAC-Klonen abzusuchen, die hinsichtlich der DNA des menschlichen Chromosoms 7 stark angereichert ist (Green et al., 1995a, Genomics, 25: 170-183), und 9 YACs wurden identi­ fiziert (yWSS691, yWSS1332, yWSS1998, yWSS2087, yWSS3319, yWSS3512, yWSS4875, yWSS4970 und yWSS5004). Um sicherzustellen, daß diese YACs das authentische humane OB-Gen enthalten, wurden zwei zusätzliche Experimente durchgeführt. Erstens wurde jedes der YACs mittels eines zweiten, für das humane OB spezifischen PCR-Assays untersucht, und es zeigte sich, daß alle positiv waren (Daten nicht gezeigt). Zweitens wurde Hefe-DNA von jedem Klon mit EcoRI gespalten und mittels Gel-Transfer-Hybridisierung analysiert, wobei eine von der humanen OB-cDNA abgeleitete Sonde verwendet wurde. In allen Fällen wurde eine einzige hybridisie­ rende Bande beobachtet, und diese Bande wies dieselbe Größe wie in den YACs und einem P1-Klon auf, von denen man wußte, daß sie das humane OB-Gen enthält (Daten nicht gezeigt).

Unter Anwendung des Computerprogramms SEGMAP (Green und Green, 1991, oben) und anderer Daten auf der Basis von YAC über den STS-Gehalt, die wir für das Chromosom 7 erstellt haben (Green et al., 1991, oben; Green et al., 1994, oben; Green et al., 1995, oben), wurde gefunden, daß das humane OB-Gen innerhalb des in Fig. 35 dargestellten YAC-Contigs liegt. In spezifischer Weise besteht dieses Contig aus 43 überlappenden YACs und 19 in ein­ zigartiger Weise geordneten STSs. Einzelheiten über jede der 19 STSs sind in Tabelle 3 angegeben. Zusätzlich zur OB-spezifi­ schen STS enthält das Contig auch eine für das humane Pax4-Gen (Tamura et al., 1994, oben; Stapleton et al., 1993, Nature Ge­ net., 3: 292-298) spezifische STS (sWSS808), 7 von den für das Chromosom 7 spezifischen YACs abgeleitete STSs, 2 von den für das Chromosom 7 spezifischen Lambda-Klonen abgeleitete STSs, und, wichtig, 8 Mikrosatelliten-spezifische STSs. Zusätzliche Einzelheiten dieser 8 genetischen Marker, einschließlich Sequen­ zen der zur Analyse des Genotyps verwendeten Primer, sind in Tabelle 2 dargestellt. Bemerkenswert ist, daß es über das gesam­ te Contig hinweg eine auf YAC basierende redundante Konnektivi­ tät gibt (d. h., es gibt 2 oder mehrere YACs, die jedes benach­ barte Paar von STSs verbinden), wodurch die relative Reihenfolge der STSs gemäß Darstellung in Fig. 35 bekräftig wird.

Wie in Fig. 35 dargestellt ist, ist die vorhergesagte Orientie­ rung des das humane OB enthaltenden YAC-Contigs derart, daß sWSS1734 die am dichtesten zum Centromer gelegene STS ist (d. h. am nächsten zu CFTR), während sWSS2367 die am dichtesten zum Telomer gelegene STS ist (d. h. am nächsten zu CPA). Diese Orien­ tierung basiert hauptsächlich auf Daten der vergleichenden Kar­ tierung, wonach Pax4 proximal und OB distal innerhalb des in der DNA der Maus und des Menschen vorhandenen syntenen Blocks liegen (Zhang et al., 1994, oben). Das OB-Gen liegt auf der Grundlage der Plazierung der OB-spezifischen STS (sWSS2619) nahe dem telo­ meren Ende des Contigs.

Obgleich das in Fig. 35 dargestellte Contig mittels SEGMAP ohne Berücksichtigung der YAC-Größen abgeleitet wurde (wodurch die STSs jeweils in gleichem Abstand zueinander dargestellt sind), zeigte eine ähnliche Analyse der Daten mittels SEGMAP unter Berücksichtigung der YAC-Größen, daß die Gesamtgröße der durch das Contig abgedeckten Region gerade über 2 Mb beträgt (Daten nicht gezeigt). Während sämtliche 8 Mikrosatelliten-spezifische STSs (Tabelle 4) innerhalb eines genomischen Intervalls enthal­ ten sind, welches grob 2 Mb überspannt, liegen die drei dichte­ sten zum telomeren Ende des Contigs gelegenen (sWSS1392, sWSS1148 und sWSS2367) besonders nahe an dem OB-Gen selbst (mög­ licherweise innerhalb eines Intervalls, welches ungefähr 500 kB klein ist). Tatsächlich sind sämtliche drei der letztgenannten STSs in mindestens einem der das humane OB enthaltenden YACs vorhanden. Bemerkenswert ist, daß das Intervall zwischen humanem Pax4 (sWSS808) und ob (sWSS2619) auf ungefähr 400 kB geschätzt wird, wohingegen sich diese Region gemäß Vorhersage bei der Maus auf ungefähr 1 Mb erstreckt (Zhang et al., 1994, oben). Schließ­ lich sind drei der innerhalb des Contigs gelegenen YACs (yWSS691, yWSS999 und yWSS2935) ebenfalls mittels FISH analy­ siert worden, und es wurde gefunden, daß jedes ausschließlich mit 7q31.3 hybridisierte. Eines dieses YACs (yWSS691) enthält die OB-spezifische STS, während die anderen zwei Klone die Pax4- spezifische STS enthält. Die letztgenannten Ergebnisse stimmen im allgemeinen mit der vorhergehenden zytogenetischen Zuordnung des humanen Pax4 zu 7q32 überein (Tamura et al., 1994, oben). Aufgrund dieser Daten kann das humane OB-Gen der zytogenetischen Bande 7q31.3 zugeordnet werden.

Beispiel 11: Das humane OB-Polypeptid ist in Mäusen biologisch aktiv

Gruppen von 10 ob/Ob-Mäusen wurden behandelt durch i.p.-Injek­ tion mit 10 µg/g/Tag rekombinantem (bakteriellem) humanen und murinen OB-Polypeptid oder Saline. Nach vier Tagen nahm die Saline erhaltende Gruppe 0,3 g zu. Die murines OB erhaltende Gruppe verlor 3,2 g. Die humanes OB erhaltende Gruppe verlor 2 g (p < 0,01, verglichen mit Saline-Kontrollen). Diese Gruppen wurden ebenfalls auf ihre Nahrungsaufnahme untersucht. Die Daten der Nahrungsaufnahme sind in Tabelle 5 dargestellt; die Daten für die Körpermasse sind in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 5

Nahrungsaufnahme/Tag (g) von behandelten ob/Ob-Mäusen (Wert ± Stand.Abweichg.)

Tabelle 6

Körpergewicht und Gewichtsveränderung bei behandelten ob-/ob-Mäusen (Wert ± Stand.Abweichg.)

Diese Daten zeigen, daß das humane OB in Mäusen biologisch aktiv ist.

Beispiel 12: Eine hohe OB-Dosis affiziert Wildtyp-Mäuse

Wildtyp-Mäuse (C57Bl6J +/?) wurden mit 10 µg/g/Tag intraperito­ neal mit rekombinantem murinen OB behandelt, und die Körpermasse wurde alle vier Tage gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt.

Tabelle 7

Körpermasse (g) von normalen, OB erhaltenden Mäusen

Diese Daten zeigen, daß OB die Körpermasse von Wildtyp- als auch von adipösen (ob/Ob)-Mäusen affiziert, wenn auch in einem sehr viel kleineren Ausmaß.

Beispiel 13: OB-Polypeptid verabreicht mittels kontinuierli­ cher Pumpeninfusion

Dieses Beispiel zeigt, daß eine kontinuierliche Infusion des OB- Polypeptids bei normalen Mäusen zum Gewichtsverlust führt. Nor­ malen (nicht-adipösen) Mäusen wurde das murine ob-Polypeptid über eine osmotische Infusionspumpe verabreicht. Eine Dosierung von 0,5 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag führte am 6. Tag der Infusion gegenüber dem Grundgewicht zu einem Verlust von 4,62% (+/- 1,34%).

Materialien und Methoden Tiere

In diesem Beispiel wurden Wildtyp (+/+)-C57Bl6-Mäuse verwendet. Die Mäusen wurden einzeln und artgerecht gehalten. Das Alter der Mäuse zum anfänglichen Zeitpunkt betrug 8 Wochen, und das Ge­ wicht der Tiere wurde stabilisiert. Zehn Mäuse wurden für jede Gruppe eingesetzt (Träger gg. Protein).

Messung der Fütterung und des Gewichts

Den Mäusen wurde gemahlenes Nagerfutter (PMI Feeds, Inc.) in Pulver-Nahrungsspendern (Allentown Caging and Equipment) gege­ ben, wodurch ein saubereres und sensitiveres Messen der Nah­ rungsaufnahme ermöglicht wird, als es bei Verwendung von gewöhn­ lichem Blockfutter der Fall ist. Das Gewicht wurde für eine Dauer von 6 Tagen jeweils täglich zur selben Zeit gemessen (2.00 Uhr nachmittags). Das Körpergewicht am Tage vor der Infusion wurde als Grundgewicht definiert.

Klonierung von muriner OB-DNA

Das Klonieren der murinen OB-DNA zur Expression in E. coli wurde wie folgt durchgeführt. Die DNA-Sequenz, wie sie von der veröf­ fentlichten Peptidsequenz (Zhang et al., 1994, oben, d. h. Bei­ spiel 1, oben) abgeleitet wurde, wurde unter Verwendung von optimalen E. coli-Kodons reverse transkribiert. Die terminalen Klonierungsstellen waren XbaI bis BamHI. Ein Enhancer für die ribosomale Bindung und eine starke ribosomale Bindungsstelle wurden vor die kodierende Region eingeführt. Die Duplex-DNA- Sequenz wurde mittels standardisierter Verfahren synthetisiert. Die korrekten Klone wurden bestätigt, indem die Expression des rekombinanten Proteins und die Anwesenheit der korrekten OB-DNA- Sequenz im Plasmid gezeigt wurden. Die Aminosäuresequenz (und DNA-Sequenz) sind wie folgt:

Rekombinante murine met OB (doppelsträngig)-DNA und Aminosäure­ sequenz (SEQ ID NOS: 94 und 95)

Expressions-Vektor und Wirtsstamm

Der zur Bildung des Proteins verwendete Plasmid-Expressionsvek­ tor war pCFM1656, American Type Culture Collection (ATCC), Zu­ griffsnummer 69576. Die obige DNA wurde mit dem Expressionsvek­ tor pCFM1656, der mit XbaI und BamHI linearisiert worden war, ligiert und zur Transformation des E. coli-Wirtsstammes FM5 verwendet. E. coli FM5-Zellen wurden erhalten von Amgen Inc., Thousand Oaks, CA, von dem E. coli-Stamm K-12 [Bachmann et al., Bacteriol. Rev., 40: 116-167 (1976)] und enthalten das integrier­ te Repressorgen cI₈₅₇ des Phagen Lambda [Sussman et al., C.R. Acad. Sci., 254: 1517-1579 (1962)]. Die Herstellung des Vektors, die Zelltransformation und die Selektion der Kolonien erfolgten durch Standardverfahren. Z.B. Sambrook et al., 1989, oben. Die Wirtszellen wurden in LB-Medium kultiviert.

Verabreichung von Protein oder Träger

Für die vorliegenden Experimente wurde rekombinantes murines OB- Polypeptid eingesetzt, gewöhnlich in einer Konzentration von etwa 0,9 mg/ml Phosphat-gepufferter Saline, pH-Wert 7,4. Die eingesetzte Aminosäuresequenz (und DNA-Sequenz) ist oben angege­ ben. Das Protein oder der Träger (Phosphat-gepufferte Saline, pH-Wert 7,4) wurde verabreicht mittels osmotischer Infusions­ pumpe. Jeder Maus wurden osmotische Alzet-Minipumpen (Alza, Palo Alto, CA, Modell Nr. 1007D) chirurgisch in eine subkutane Tasche im subscapularen Bereich eingesetzt. Die Pumpen wurden so einge­ stellt, daß sie 0,5 ml Protein in Lösung pro Stunde für eine Dosierung von 0,5 mg Protein/kg Körpergewicht/Tag verabreichen. Die Kontrolltiere erhielten eine Infusion mit Phosphat-gepuffer­ ter Saline (pH-Wert 7,4) über eine osmotische Alzet-Minipumpe. Fermentationsverfahren. Für die Herstellung des Proteins wurde ein als ′fed-batch′-Verfahren bekanntes dreistufiges Fermenta­ tionsverfahren angewendet. Die Zusammensetzungen der Medien sind nachfolgend dargelegt.

Batch. Eine Stickstoff- und Phosphatquelle wurden (durch Anhe­ bung der Temperatur für 35 Minuten auf 122°C, 18-20 psi) im Fermentationsbehälter sterilisiert (Biolafitte, Kapazität von 12 Liter). Beim Abkühlen wurden Kohlenstoff-, Magnesium-, Vitamin- und Spurenmetallquellen aseptisch zugegeben. Dem Fermentations­ behälter wurde eine Übernachtkultur (16 Stunden oder mehr) der obigen rekombinanten, das murine Protein produzierenden Bakte­ rien von 500 ml (kultiviert in LB-Brühe) zugegeben.

Nahrung I. Bei einer OD₆₀₀ von 4,0-6,0 wurde den Kulturen die Nahrung I zugegeben. Die Glucose wurde in einer limitierenden Menge zugegeben, um die Wachstumsrate (µ) zu kontrollieren. Ein automatisches System (bezeichnet als Verteilungskontrollsyste 19378 00070 552 001000280000000200012000285911926700040 0002019531931 00004 19259m) wurde so programmiert, daß die Wachstumsrate 0,15 Generationen pro Stunde betrug.

Nahrung II. Wenn die OD einen Wert von 30 erreichte, wurde die Temperatur langsam auf 42°C erhöht, und die Fütterung wurde auf die nachfolgend beschriebene Nahrung II umgestellt. Die Fermen­ tation wurde anschließend für weitere 10 Stunden fortgeführt, wobei alle 2 Stunden eine Probe entnommen wurde. Nach 10 Stunden wurde der Inhalt des Fermentationsbehälters auf unter 20°C abgekühlt und durch Zentrifugation geerntet.

Medien-Zusammensetzung

Batch:
10 g/l Hefeextrakt
5,25 g/l (NH₄)₂SO₄
3,5 g/l K₂HPO₄
4,0 g/l KH₂PO₄
5,0 g/l Glucose
1,0 g/l MgSO₄·7H₂O
2,0 ml/l Vitaminlösung
2,0 ml/l Spurenmetall-Lösung
1,0 ml/l P2000 Antischaummittel.

Nahrung I:
50 g/l Bacto-Trypton
50 g/l Hefeextrakt
450 g/l Glucose
8,75 g/l MgSO₄·7H₂O
10 ml/l Vitaminlösung
10 ml/l Spurenmetall-Lösung

Nahrung II:
200 g/l Bacto-Trypton
100 g/l Hefeextrakt
110 g/l Glucose.

Vitaminlösung (Batch, Nahrung I): 0,5 g Biotin, 0,5 g Folsäure und 4,2 g Riboflavin wurden in 450 ml H₂O und 3 ml 10 N NaOH gelöst und mit H₂O auf ein Volumen von 500 ml gebracht. Vier­ zehn g Pyridoxin-HCl und 61 g Niacin wurden in 150 ml H₂O und 50 ml 10 N NaOH gelöst und mit H₂O auf ein Volumen von 250 ml gebracht. Vierundfünfzig g Pantothensäure wurden in 200 ml H₂O gelöst und auf ein Volumen von 250 ml eingestellt. Die drei Lösungen wurden kombiniert und auf ein Gesamtvolumen von 10 Li­ ter gebracht.

Spurenmetall-Lösung (Batch, Nahrung I):
Eisenchlorid (FeCl₃·6H₂O): 27 g/l
Zinkchlorid (ZnCl₂·4H₂O): 2 g/l
Cobaltdichlorid (CoCl₂·6H₂O): 2 g/l
Natriummolybdat (VI) (NaMoO₄·2H₂O): 2 g/l
Calciumchlorid (CaCl₂·2H₂O): 1 g/l
Kupfer(II)-sulfat-Pentahydrat (CuSO₄·5H₂O): 1,9 g/l
Borsäure (H₃BO₃): 0,5 g/l
Mangan(II)-chlorid: (MnCl₂·4H₂O): 1,6 g/l
Natriumcitratdihydrat: 73,5 g/l.

Reinigungsverfahren für das murine OB-Polypeptid

Die Aufreinigung erfolgte durch Anwendung der folgenden Schritte (sofern nicht anders angegeben, wurden die folgenden Schritte bei 4°C durchgeführt):

• 1. Zellpaste. E. coli-Zellpaste wurde in 5fachen Volumen 7 mM EDTA, pH-Wert 7,0, suspendiert. Die Zellen in EDTA wurden mit­ tels zweimaliger Passage durch einen Mikroverflüssiger aufgebro­ chen. Die aufgebrochenen Zellen wurden 1 Stunde lang bei 4200 UpM in einer JB-6 Zentrifuge von Beckman mit einem J5-4.2 Rotor zentrifugiert.
• 2. Einschlußkörper-Waschung #1. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde resuspendiert mit 5fachem Volumen an 7 mM EDTA, pH-Wert 7,0, und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Stufe 1 zentrifugiert.
• 3. Einschlußkörper-Waschung #2. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde in 10fachem Volumen an 20 mM Tris, pH-Wert 8,5, 10 mM DTT, und 1% Desoxycholat resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Stufe 1 zentrifu­ giert.
• 4. Einschlußkörper-Waschung #3. Der Überstand von oben wurde entfernt, und das Pellet wurde in 10fachem Volumen an destil­ liertem Wasser resuspendiert und homogenisiert. Diese Mischung wurde wie in Stufe 1 zentrifugiert.
• 5. Rückfaltung. Das Pellet wurde mit 15 Volumen an 10 mM HEPES, pH-Wert 8,5, 1% Natriumsarcosin (N-Laurylsarcosin) bei Raumtem­ peratur rückgefaltet. Nach 60 Minuten wurde die Lösung auf 60 mM Kupfersulfat eingestellt und anschließend über Nacht gerührt.
• 6. Entfernung von Sarcosin. Die Mischung zur Rückfaltung wurde mit 5 Volumen 10 mM Tris-Puffer. DH-Wert 7,5, verdünnt und wie in Stufe 1 zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und unter Rühren 1 Stunde lang mit Dowex 1-X4-Harz, 20-50 Maschen, Chloridform (bei 0,066% Gesamtvolumen an verdünnter Rückfal­ tungsmischung) vermischt. Diese Mischung wurde in eine Säule gegossen, und das Eluant wurde gesammelt. Die Entfernung von Sarcosin wurde mittels HPLC sichergestellt.
• 7. Säurefällung. Das Eluant aus dem vorherigen Schritt wurde gesammelt, und der pH-Wert wurde auf pH 5,5 eingestellt, und es wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Mi­ schung wurde wie in Stufe 1 zentrifugiert.
• 8. Kationenaustauschchromatographie. Der Überstand aus dem vorherigen Schritt wurde auf einen pH-Wert von 4,2 eingestellt und auf eine CM Sepharose Fast Flow geladen. Ein 20 Säulenvo­ lumen umfassender Salzgradient erfolgte bei 20 mM NaOAC, pH-Wert 4,2, 0 M bis 1,0 M NaCl.
• 9. HIC-Chromatographie. Die CM-Sepharose-Sammlung der Peakfrak­ tionen (abgesichert durch Ultraviolettanalyse) aus dem vorheri­ gen Schritt wurde auf 0,2 M Ammoniumsulfat eingestellt. Ein 20 Säulenvolumen umfassender reverser Salzgradient erfolgte bei 5 mM NaOAC, pH-Wert 4,2, mit 0,4 M bis 0 M Ammoniumsulfat. Die­ ses Material wurde konzentriert und in PBS diafiltriert.

Ergebnisse

Nachfolgend sind die Unterschiede in Prozent (%) zum Grundge­ wicht von C57Bl6J-Mäusen (8 Wochen alt) angegeben:

Tabelle 8

Gewichtsverlust bei kontinuierlicher Infusion

Aus der Tabelle geht hervor, daß die Tiere, die das OB-Polypep­ tid erhalten hatten, am Ende einer 6tägigen Behandlung mit kon­ tinuierlicher Infusion im Vergleich zum Grundgewicht über 4% ihres Körpergewichtes verloren hatten. Hier handelt es sich um einen wesentlich schnelleren Gewichtsverlust, als er bei intra­ peritonealer (i.p.) Injektion beobachtet worden ist. Der Ge­ wichtsverlust betrug bei Wildtyp (normalen)-Mäusen bei täglicher i.p.-Injektion des rekombinanten murinen OB-Polypeptids mit einer Dosis von 10 mg/kg am Ende einer 32tägigen Injektionsperi­ ode lediglich 2,6-3,0% und war zu keinem Zeitpunkt während des Dosierungsplans höher als 4% (Daten nicht gezeigt). Die vor­ liegenden Daten zeigen, daß unter kontinuierlicher Infusion einer 20fach geringeren Dosierung (0,5 mg/kg gg. 10 mg/kg) ein größerer Gewichtsverlust in kürzerer Zeitdauer erzielt wird.

Die vorgestellten Ergebnisse sind statistisch signifikant, z. B. -4,62% mit p < 0,0001.

Beispiel 14: Klonierung und Expression eines rekombinanten humanen OB-Polypeptid-Analogons

In diesem Beispiel werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung einer analogen rekombinanten humanen Version des OB- Polypeptids bereitgestellt.

Die humane Version der OB-DNA wurde aus der murinen OB-DNA gemäß obigem Beispiel 13 hergestellt, indem die Region zwischen den MluI- und BamHI-Stellen durch Duplex-DNA (hergestellt aus syn­ thetischen Oligonukleotiden), in die 20 Kodon-Substitutionen eingeführt worden waren, ersetzt wurde. Die Kodons für Arginin an Position 35 des reifen Mausproteins und Leucin an Position 74 des reifen Mausproteins waren unverändert. Die MluI-Stelle ist in der unten dargelegten Sequenz durch eine durchgezogene Linie oberhalb der Buchstaben gekennzeichnet. Diese DNA wurde in den Vektor pCFM 165 6 (ATCC-Zugriffsnr. 69576) in derselben Weise wie für das oben beschriebene rekombinante murine Protein einge­ führt.

Rekombinante humane met-OB (doppelsträngige)-DNA- und Aminosäu­ resequenz (SEQ. ID. NOS: 96 und 97)

Fermentation

Die Fermentation der obigen Wirtszellen zur Bildung des rekom­ binanten humanen OB-Polypeptids erfolgte unter Verwendung der oben für das rekombinante murine Material beschriebenen Bedin­ gungen und Zusammensetzungen. Die Ergebnisse wurden hinsichtlich der Ausbeute (g/l) und der Vorreinigung des rekombinanten huma­ nen OB-Materials (und kleineren Mengen an bakteriellem Protein) analysiert und korreliert, um die bakterielle Expression zu analysieren:

Tabelle 9

Analyse der Expression des humanen OB-Polypeptids

Reinigung des rekombinanten humanen ob-Polypeptids

Das rekombinante humane Protein kann unter Anwendung ähnlicher Verfahren gereinigt werden, wie sie zur Reinigung des rekombi­ nanten murinen Proteins im obigen Beispiel 13 angewendet worden sind. Für die Herstellung von rekombinantem humanen OB-Polypep­ tid erfolgte Schritt 8 durch Einstellung des pH-Wertes des Über­ standes aus Stufe 7 auf pH 5,0 und durch Aufladen desselben auf eine CM-Sepharose Fast Flow-Säule. Der 20 Säulenvolumen umfas­ sende Salzgradient erfolgte bei 20 mM NaOAC, pH-Wert 5,5, 0 M bis 0,5 M NaCl. Der Schritt 9 erfolgte durch vierfaches Verdün­ nen der CM-Sepharose-Sammlung mit Wasser und Einstellen des pH- Wertes auf 7,5. Diese Mischung wurde auf 0,7 M Ammoniumsulfat eingestellt. Ein 20 Säulenvolumen umfassender reverser Salzgra­ dient erfolgte bei 5 mM NaOAC, pH-Wert 5,5, 0,2 M bis 0 M Ammo­ niumsulfat. Im übrigen waren die obigen Schritte identisch.

Beispiel 15: Dosis/Wirkungs-Studien

Eine zusätzliche Studie zeigte, daß es auf die kontinuierliche Verabreichung des OB-Proteins eine Dosiswirkung gab. Bei dieser Studie wurde Wildtyp-Mäusen (nicht-adipös, CD-1-Mäuse, Gewicht 35-40 g) unter Anwendung ähnlicher Verfahren wie in den Beispie­ len 12 und 13 rekombinantes murines OB-Protein verabreicht. Die Ergebnisse waren wie folgt (in % verlorenem Körpergewicht gegen­ über Grundgewicht, wie oben gemessen):

Tabelle 10: Dosis-Wirkung bei kontinuierlicher Verabreichung

Wie der Tabelle entnommen werden kann, steigerte sich der Ge­ wichtsverlust durch Erhöhung der Dosis von 0,03 mg/kg/Tag auf 1 mg/kg/Tag von 3,5% auf 7,5%. Man sollte ebenfalls hervorhe­ ben, daß die Dosierung von 1 mg/kg/Tag am Tag 14 zu einer 14%­ igen Reduktion des Körpergewichtes führte.

Beispiel 16: Effekte von Leptin auf die Körperzusammensetzung von ob/ob-Mäusen

16 Wochen alte C57Bl/6J ob/ob-Mäuse wurden 33 Tage lang mit 5 µg/g/Tag murinem Leptin oder Träger behandelt oder erhielten keine Behandlung. In einem zweiten Experiment wurden 7 Wochen alte ob/ob-Mäuse 12 Tage lang mit 10 µg/g/Tag humanem Leptin, murinem Leptin oder Träger behandelt. Die Mäuse wurden einge­ schläfert, und das Gesamtkörpergewicht, die Körperzusammenset­ zung, die Insulinwerte und die Glucosewerte wurden ermittelt. Die Daten aus diesen Experimenten sind in Tabelle 11 darge­ stellt.

Die Daten der Körperzusammensetzung zeigen den Effekt von Leptin auf die drei Kompartimente des Körpers: Fettmasse, magere Kör­ permasse und Wassermasse. Die Daten zeigen, daß Leptin die Kör­ perfettmasse signifikant vermindert und einen marginalen Effekt auf die magere Körpermasse aufweist. Die Effekte auf die magere Körpermasse waren jedoch nicht statistisch signifikant.

Ein Vergleich der Insulin- und Glucosewerte in mit Leptin behan­ delten und Kontroll- (unbehandelten) Mäusen zeigt, daß Leptin die Blutzucker- und Insulinwerte verringert und damit diese Anzeichen von Diabetes lindert.

Beispiel 17: Effekte einer hohen Dosierung von Leptin auf Wild­ typ-Mäuse

Magere Kontrollen der ob/ob-Mäuse (C57Bl/6J +/?) erhielten ein­ mal täglich eine i.p.-Injektion von 10 µg/g murinem Leptin oder Träger (PBS), und das Körpergewicht und die Nahrungsaufnahme wurden über die nächsten zwei Wochen gemessen. Vom Tage 4 an gab es eine signifikante Verringerung des Körpergewichtes und eine signifikante Verminderung der Nahrungsaufnahme für die erste Woche. Nach einer Woche ließen sich die Werte der Nahrungsauf­ nahme jedoch zwischen beiden Mäusegruppen nicht mehr unterschei­ den. Die Tiere wurden am Ende der zwei Wochen eingeschläfert, und die Körperzusammensetzung wurde bestimmt. Die Ergebnisse der Analyse der Körperzusammensetzung sind in Tabelle 12 darge­ stellt. Die Daten zeigen eine Verringerung des Körperfettes der Tiere, die Leptin erhalten hatten, gegenüber den Tieren, die PBS erhielten.

Ein zweites Experiment zeigte die Auswirkungen von zweimal täg­ lich intraperitoneal verabreichten Injektionen von 12,5 µg/g murinem Leptin an C57Bl/6J-Wildtyp-Mäuse. Die zweimal täglich verabreichten Injektionen des Polypeptids gingen mit einer si­ gnifikanten Verminderung des Körpergewichtes und der Nahrungs­ aufnahme einher. Für dieses Experiment wurden die Tiere in meta­ bolische Kammern überführt. Die Nahrung bestand aus einer pulve­ risierten Purina #5001 Futterdiät. Diese Diät unterschied sich von früheren Experimenten, bei denen die Diät aus Futterdiät, Tapioca und Wasser bestand. Demgemäß wies das in den metaboli­ schen Kammern verwendete Futter einen höheren Kaloriengehalt auf, wodurch erklärt wird, warum die konsumierte Nahrungsmenge von derjenigen der Tiere abwich, die wasserhaltige Diät erhiel­ ten.

Nachfolgend sind die im Zusammenhang mit der obigen Beschreibung und insbesondere den experimentellen Vorgehensweisen und Diskus­ sionen stehenden Veröffentlichungen aufgeführt.
Bahary et al., Genomics, 11: 33-47 (1991).
Bahary et al., Genomics, 13: 761-769 (1992).
Bahary et al., Molecular mapping of mouse chromosoms 4 and 6: Use of a flow-sorted Robertsonian chromosome (1991).
Blank et al., Mainmalian Genome, 1: s51-s78 (1991).
Bogardus et al., Annals of the New York Academy of Science, 630: 100-115 (1991).
Friedman et al., Mammalian Genome, 1; 130-144 (1991).
Harris, FASEB J., 4: 3310-3318 (1990).
Iacobowitz et al., N. Engl. J. Med., 315: 96-100 (1986).
Kessey, in Obesity, S. 144-166, Stunkard, Hrsg., Philadelphia, W.B. Saundres Co. (1980).
Kessey et al., Ann. Rev. Psychol., 37: 109-133.22 (1986.
Leibel et al., "Genetics variation and nutrition in obesity: Ap
proaches to the molecular genetics of obesity", in Genetic Va­ riation and Nutrition, S. 90-101.1, Simopoulos and Childs, Hrsg., S. Karger, Basel (1990).
Siegel et al., Cytogenet. Cell Genet., 61: 184-185 (1992).

Die vorliegende Erfindung kann in anderen Ausführungsformen ver­ körpert oder auf anderen Wegen ausgeführt werden, ohne den Grundgedanken oder wesentliche Eigenschaften derselben zu ver­ lassen. Die vorliegende Offenbarung sollte daher in jedweder Beziehung nur als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung betrachtet werden, wobei der Schutzbereich der Erfindung durch die anhängenden Ansprüche aufgezeigt wird, und sämtliche Ver­ änderungen, die als äquivalent bezeichnet werden können, sind ebenfalls umfaßt.

Zahlreiche Veröffentlichungen sind in der vorliegenden Beschrei­ bung genannt, von denen jede einzelne vollständig durch Bezug­ nahme eingeschlossen ist.

Die beanspruchte Erfindung ist aufgrund der vorangehenden Be­ schreibung und den leicht zugänglichen Literaturstellen und Aus­ gangsmaterialien ohne weiteres ausführbar. Dennoch haben die Anmelder am 9. August 1995 bei der American Type Culture Collec­ tion, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. 20852-1178, USA, nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationa­ le Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren folgende Hinterlegungen durchgeführt: E. coli H14 mit Plasmid pETH14, Zugriffsnr. 69880; und E. coli M9 mit Plasmid pETM9, Zugriffsnr. 69879.

Sequenzprotokoll

Claims (77)

1. Obesitäts (OB)-Polypeptid mit etwa 145 bis etwa 167 Amino­ säuren, welches in der Lage ist, das Körpergewicht in einem Tier zu modulieren, oder allelische Varianten oder Analoga, einschließlich Fragmenten, desselben mit derselben biologi­ schen Aktivität.

2. OB-Polypeptid nach Anspruch 1, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NOS: 2, 4, 5 oder 6, oder allelische Varianten oder Analoga, einschließlich Fragmenten, desselben umfaßt.

3. Immunogenes Fragment eines OB-Polypeptids gemäß den An­ sprüchen 1 oder 2.

4. Immunogenes Fragment eines OB-Polypeptids, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
Val-Pro-Ile-Gln-Lys-Val-Gln-Asp-Asp-Thr-Lys-Thr-Leu-Ile-Lys- Thr (SEQ ID NO. 18);
Leu-His-Pro-Ile-Leu-Ser-Leu-Ser-Lys-Met-Asp-Gln-Thr-Leu-Ala (SEQ ID NO. 19);
Ser-Lys-Ser-Cys-Ser-Leu-Pro-Gln-Thr-Ser-Gly-Leu-Gln-Lys-Pro- Glu-Ser-Leu-Asp (SEQ ID NO. 20); und
Ser-Arg-Leu-Gln-Gly-Ser-Leu-Gln-Asp-Ile-Leu-Gln-Gln-Leu-Asp- Val-Ser-Pro-Glu-Cys (SEQ ID NO. 21).

5. Humanes OB-Polypeptid-Analogon nach Anspruch 2, bei dem eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe beste­ hend aus den Aminosäuren 53, 56, 71, 85, 89, 92, 95, 98, 110, 118, 121, 122, 126, 127, 128, 129, 132, 139, 157, 159, 163 und 166 (gemäß Numerierung der SEQ ID NO: 4), durch eine andere Aminosäure substituiert ist.

6. Humanes OB-Polypeptid-Analogon nach Anspruch 5, bei dem die Substitution mit der abweichenden Aminosäure des in SEQ ID NO: 2 dargestellten OB-Polypeptids der Maus erfolgt ist.

7. Humanes OB-Polypeptid-Analogon nach Anspruch 5, bei dem die Substitution mit einem Alanin erfolgt ist.

8. Humanes OB-Polypeptid-Analogon nach Anspruch 5, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, bei denen:

• (a) der Serinrest an der Position 53 durch Glycin, Alanin, Valin, Cystein, Methionin oder Threonin substituiert ist;
• (b) der Serinrest an der Position 98 durch Glycin, Alanin, Valin, Cystein, Methionin oder Threonin substituiert ist; und
• (c) der Argininrest an der Positionsnummer 92 durch Aspara­ gin, Lysin, Histidin, Glutamin, Glutaminsäure, Aspara­ ginsäure, Serin, Threonin, Methionin oder Cystein sub­ stituiert ist.

9. OB-Polypeptid-Analogon nach Anspruch 2 mit einer Aminosäure­ sequenz-Homologie zur Aminosäuresequenz des humanen OB-Poly­ peptids gemäß Darlegung in SEQ ID NOS: 2, 4, 5 oder 6, von 83% oder mehr.

10. Humanes OB-Polypeptid-Analogon nach Anspruch 2, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, bei denen:

• (a) ein oder mehrere Asparaginsäurereste durch Glutaminsäu­ re ersetzt sind;
• (b) ein oder mehrere Isoleucinreste durch Leucin substitu­ iert sind;
• (c) ein oder mehrere Glycin- oder Valinreste durch Alanin substituiert sind;
• (d) ein oder mehrere Argininreste durch Histidin substitu­ iert sind;
• (e) ein oder mehrere Tyrosin- oder Phenylalaninreste durch Tryptophan substituiert sind;
• (f) ein oder mehrere der Reste 121 bis 128 (gemäß Numerie­ rung der SEQ ID NO: 4) durch Glycin oder Alanin sub­ stituiert sind; und
• (g) ein oder mehrere Reste an den Positionen 54 bis 60 oder 118 bis 166 (gemäß Numerierung der SEQ ID NO: 4) durch Lysin, Glutaminsäure, Cystein oder Prolin substituiert sind.

11. OB-Polypeptid nach jeglichem der Ansprüche 1, 2, 3, 5, 6 oder 9, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypepti­ den:

• (a) bei denen die Reste 1 bis 21 deletiert sind; und
• (b) Polypeptiden der Untergruppe (a), die an der Position 21 ein Methionin aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Glycin-Serin-Histidin-Methionin-Sequenz SEQ ID NO: 38 aufweisen, oder die an den Positionen 1 bis 21 eine Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin-Hi­ stidin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Serin-Serin- Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin-Serin-Histi­ din-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 98) aufweisen.

12. OB-Polypeptid nach einem der Ansprüche 1, 2, 3, 5, 6 oder 9, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden:

• (a) bei denen die Reste 1 bis 21 deletiert sind; und
• (b) Polypeptiden der Untergruppe (a), die an den Positionen 14 bis 21 eine Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Arginin-Glu­ taminsäure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin-Sequenz (SEQ ID NO: 26) aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Glutaminsäure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin-Sequenz (SEQ ID NO: 27) aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Arginin-Se­ quenz (SEQ ID NO: 28) aufweisen, oder die an den Posi­ tionen 2 bis 21 eine Methionin-Glycin-Serin-Serin-Hi­ stidin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin- Serin-Serin-Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin- Serin-Prolin-Sequenz (SEQ ID NO: 99) aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Glycin-Serin-Pro­ lin-Sequenz aufweisen.

13. OB-Polypeptid nach einem der Ansprüche 7, 8, 9 oder 10, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden:

• (a) bei denen die Reste 1 bis 21 deletiert sind; und
• (b) Polypeptiden der Untergruppe (a), die an der Position 21 ein Methionin aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Glycin-Serin-Histidin-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 38) aufweisen, oder die an den Positionen 1 bis 21 eine Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin- Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Serin- Serin-Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin-Serin- Histidin-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 98) aufweisen, oder die an den Positionen 14 bis 21 eine Leucin-Gluta­ minsäure-Lysin-Arginin-Glutaminsäure-Alanin-Glutamin­ säure-Alanin-Sequenz (SEQ ID NO: 26) aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Glutaminsäure- Alanin-Glutaminsäure-Alanin-Sequenz (SEQ ID NO: 27) aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Arginin-Sequenz (SEQ ID NO: 28) aufweisen, oder die an den Positionen 2 bis 21 eine Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin-Histidin-Histi­ din-Histidin-Histidin-Histidin-Serin-Serin-Glycin-Leu­ cin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin-Serin-Prolin-Sequenz (SEQ ID NO: 99) aufweisen, oder die an den Positionen 18 bis 21 eine Glycin-Serin-Prolin-Sequenz aufweisen.

14. Trunkiertes humanes OB-Polypeptid-Analogon nach Anspruch 2, ausgewählt aus der Gruppe (gemäß Numerierung der SEQ ID NO: 4) bestehend aus Polypeptiden, bei denen:

• (a) ein oder mehrere Reste an den Positionen 121 bis 128 deletiert sind;
• (b) die Reste 1-116 deletiert sind;
• (c) die Reste 1-21 und 54 bis 167 deletiert sind;
• (d) die Reste 1-60 und 117 bis 167 deletiert sind;
• (e) die Reste 1-60 deletiert sind;
• (f) die Reste 1-53 deletiert sind;
• (g) einem Analogon der Untergruppe (a), bei dem die Reste 1-21 deletiert sind; und
• (h) einem Analogon der Untergruppen (a) bis (g) mit einer N-terminalen Aminosäure oder Aminosäuresequenz, ausge­ wählt aus der Gruppe bestehend aus:
• (1) Methionin,
• (2) einer Glycin-Serin-Histidin-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 38),
• (3) einer Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin-Histi­ din-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Serin- Serin-Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin- Serin-Histidin-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 98),
• (4) einer Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Arginin-Glutamin­ säure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin-Sequenz (SEQ ID NO: 26),
• (5) einer Glutaminsäure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin- Sequenz (SEQ ID NO: 27),
• (6) einer Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Arginin-Sequenz (SEQ ID NO: 28),
• (7) einer Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin-Histi­ din-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Serin- Serin-Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin- Serin-Prolin-Sequenz (SEQ ID NO: 99), und
• (8) einer Glycin-Serin-Prolin-Sequenz.

15. Rekombinantes OB-Polypeptid nach jeglichem der Ansprüche 1 bis 14.

16. Chemisch synthetisiertes OB-Polypeptid nach jeglichem der Ansprüche 1 bis 14.

17. Derivat eines OB-Polypeptids nach jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 mit einem oder mehreren daran angehefteten chemischen Resten.

18. Derivat nach Anspruch 17, bei dem der chemische Rest ein wasserlösliches Polymer ist.

19. Derivat nach Anspruch 18, bei dem das wasserlösliche Polymer Polyethylenglykol ist.

20. Derivat nach Anspruch 19, welches mono-, di-, tri- oder -tetrapegyliert ist.

21. Derivat nach Anspruch 20, welches N-terminal monopegyliert ist.

22. Derivat nach Anspruch 21, welches ein OB-Polypeptid ist, das die Aminosäurereste 22 bis 167 der SEQ ID NO: 4 oder die Reste 22 bis 166 der SEQ ID NO: 6 umfaßt.

23. Derivat nach Anspruch 21, welches ein OB-Polypeptid ist, das die Aminosäuresequenz der Reste 22 bis 167 der SEQ ID NO: 4 oder die Reste 22 bis 166 der SEQ ID NO: 6 umfaßt und an der Position 21 ein Methionin aufweist.

24. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein OB-Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 6, 9 oder 11 kodiert.

25. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein OB-Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 7, 8, 10, 12, 13 oder 14 ko­ diert.

26. DNA-Molekül zur Verwendung bei der Sicherstellung der Ex­ pression eines OB-Polypeptids mit der biologischen Aktivität der Modulation des Körpergewichtes in einem Säuger, wobei die DNA ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

• (a) den in den SEQ ID NOS: 1 und 3 angegebenen DNA-Molekü­ len oder Fragmenten derselben,
• (b) DNA-Molekülen, die mit den unter (a) definierten DNA- Molekülen oder hybridisierbaren Fragmenten derselben hybridisieren; und
• (c) DNA-Molekülen, die bei Expression für die Aminosäurese­ quenz kodieren, die von irgendeinem der vorstehend ge­ nannten DNA-Moleküle kodiert ist.

27. DNA-Molekül nach Anspruch 26, welches das humane genomische DNA-Molekül der SEQ ID NOS: 22 und 24 ist.

28. DNA-Molekül nach Anspruch 24, welches für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Aminosäuresequenzen gemäß:

• (a) SEQ ID NO: 2,
• (b) Aminosäuren 22 bis 167 der SEQ ID NO: 2,
• (c) SEQ ID NO: 4,
• (d) Aminosäuren 22 bis 167 der SEQ ID NO: 4,
• (e) SEQ ID NO: 5,
• (f) Aminosäuren 22 bis 166 der SEQ ID NO: 5,
• (g) SEQ ID NO: 6,
• (h) Aminosäuren 22 bis 166 der SEQ ID NO: 6, und
• (i) den Aminosäuresequenzen der Untergruppen (b), (d), (f) oder (h) mit einer N-terminalen Aminosäure oder Amino­ säuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
• (1) Methionin,
• (2) einer Glycin-Serin-Histidin-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 38), und
• (3) einer Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin-Histi­ din-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Serin- Serin-Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin- Serin-Histidin-Methionin-Sequenz (SEQ ID NO: 98).

29. DNA-Molekül nach Anspruch 28, welches für eine Aminosäure der Untergruppe (b), (d), (f) oder (h) mit einer N-termina­ len Aminosäuresequenz kodiert, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

• (1) einer Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Arginin-Glutamin­ säure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin-Sequenz (SEQ ID NO: 26),
• (2) einer Glutaminsäure-Alanin-Glutaminsäure-Alanin- Sequenz (SEQ ID NO: 27),
• (3) einer Leucin-Glutaminsäure-Lysin-Arginin-Sequenz (SEQ ID NO: 28),
• (4) einer Methionin-Glycin-Serin-Serin-Histidin-Histi­ din-Histidin-Histidin-Histidin-Histidin-Serin- Serin-Glycin-Leucin-Valin-Prolin-Arginin-Glycin- Serin-Prolin-Sequenz (SEQ ID NO: 99), und
• (5) einer Glycin-Serin-Prolin-Sequenz

30. DNA-Molekül nach Anspruch 24, welches die in SEQ ID NO: 3 als Protein-kodierende Sequenz ausgewiesene Sequenz umfaßt.

31. DNA-Molekül nach Anspruch 24, welches die in SEQ ID NO: 3 als für die Aminosäuren 22 bis 167 kodierend ausgewiesene Sequenz umfaßt.

32. Nachweisbar markiertes Nukleinsäure-Molekül, welches mit einem DNA-Molekül gemäß jeglichem der Ansprüche 24 bis 31 hybridisierbar ist.

33. Nukleinsäure, die mit einer nicht-kodierenden Region einer OB-Nukleinsäure hybridisierbar ist, wobei die nicht-kodie­ rende Region ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Intron, einer 5′- nicht-kodierenden Region und einer 3′- nicht-kodierenden Region.

34. Oligonukleotid-Primer zum Amplifizieren der für ein OB-Poly­ peptid kodierenden humanen genomischen DNA.

35. Oligonukleotid nach Anspruch 32, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
HOB 1gF 5′-CCCAAGAAGCCCATCCTG-3′ (SEQ ID NO: 29),
HOB 1gR 5′-GACTATCTGGGTCCAGTGCC-3′ (SEQ ID NO: 30),
HOB 2gF 5′-CCACATGCTGAGCACTTGTT-3′ (SEQ ID NO: 31), und
HOB 2gR 5′-CTTCAATCCTGGAGATACCTGG-3′ (SEQ ID NO: 32).

36. Vektor, welcher ein DNA-Molekül gemäß jeglichem der Ansprü­ che 24 bis 31 umfaßt.

37. Expressionsvektor, welcher ein DNA-Molekül gemäß jeglichem der Ansprüche 24, 26, 30 oder 31 operativ mit einer Expres­ sionskontrollsequenz assoziiert umfaßt.

38. Expressionsvektor, welcher ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 27 oder 29 operativ mit einer Expressionskontrollsequenz asso­ ziiert umfaßt.

39. Expressionsvektor, welcher ein DNA-Molekül gemäß Anspruch 25 operativ mit einer Expressionskontrollsequenz assoziiert umfaßt.

40. Einzelliger Wirt, der mit einem DNA-Molekül gemäß den An­ sprüchen 24 oder 25 oder einem Expressionsvektor gemäß jeg­ lichem der Ansprüche 36 bis 39 transformiert oder transfi­ ziert ist.

41. Einzelliger Wirt nach Anspruch 40, bei dem der einzellige Wirt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefe, Säugerzellen, Pflanzenzellen, Insektenzellen und menschlichen Zellen in Gewebekultur.

42. Einzelliger Wirt nach Anspruch 40, bei dem der einzellige Wirt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Hefe, CHO-, R1.1-, B- W-, L-M-, COS 1-, COS 7-, BSC1-, BSC40-, BMT10- und Sf9-Zel­ len.

43. Einzelliger Wirt nach Anspruch 40, wobei der einzellige Wirt ein Hefewirt ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Saccharomyces, Pichia, Candida, Hansenula und Torulopsis.

44. Säugerzelle, die eine für ein OB-Polypeptid kodierende DNA- Sequenz enthält und in vitro modifiziert ist durch ein homo­ loges Rekombinationsereignis bestehend aus dem Insertieren einer für die Expression regulatorischen Sequenz in funktio­ neller Nähe zu der für das OB-Polypeptid kodierenden Se­ quenz, um eine höhere Expression des OB-Polypeptids zu er­ möglichen.

45. Zelle nach Anspruch 44, bei der die für die Expression regu­ latorische Sequenz eine für die Expression des OB-Polypep­ tids regulatorische Sequenz ist und das homologe Rekombina­ tionsereignis eine mutierte, für die Expression des OB-Poly­ peptids regulatorische Sequenz ersetzt.

46. Zelle nach Anspruch 45, bei der das Insert der für die Ex­ pression regulatorischen Sequenz keine regulatorische Se­ quenz des OB-Polypeptids ist.

47. Verfahren zur Herstellung eines OB-Polypeptids, bei dem man:

• (a) eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 40 bis 46 unter Bedingungen kultiviert, die zur Expression des OB-Poly­ peptids führen, und
• (b) das exprimierte OB-Polypeptid gewinnt.

48. Verfahren nach Anspruch 47, bei dem die Zelle ein Bakterium oder eine Hefe ist.

49. Verfahren nach Anspruch 47 oder 48, bei dem man ferner:

• (c) das OB-Polypeptid auf einer Ni-Chelationen-Säule chro­ matographiert, und
• (d) das OB-Polypeptid mittels Gelfiltration reinigt.

50. Verfahren nach Anspruch 49, bei dem man das OB-Polypeptid ferner nach der Stufe (c) und vor der Stufe (d) auf einer starken Kationenaustauschersäule chromatographiert.

51. Antikörper, der für ein OB-Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder hergestellt nach den Verfahren der Ansprüche 47 bis 50 spezifisch ist.

52. Antikörper nach Anspruch 51, welcher ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.

53. Antikörper nach Anspruch 52, welcher mit einem nachweisbaren Marker markiert ist.

54. Immortalisierte Zellinie, welche einen monoklonalen Antikör­ per gemäß Anspruch 52 produziert.

55. Verfahren zur Herstellung eines für ein OB-Polypeptid spezi­ fischen Antikörpers, bei dem man:

• (a) ein OB-Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder hergestellt nach dem Verfahren der Ansprüche 47 bis 50 mit einem Trägerprotein konjugiert,
• (b) ein Wirtstier mit dem mit einem Adjuvans vermischten Konjugat des OB-Polypeptid-Fragments/Trägerproteins aus Stufe (a) immunisiert, und
• (c) den Antikörper von dem immunisierten Wirtstier gewinnt.

56. Verfahren zum Nachweis eines OB-Polypeptids in einer Probe, bei dem man:

• (a) eine Probe, die unter Verdacht steht, ein OB-Polypeptid zu enthalten, mit einem Antikörper kontaktiert, welcher in spezifischer Weise an das OB-Polypeptid unter Bedin­ gungen bindet, die die Bildung eines den Antikörper und das OB-Polypeptid umfassenden Reaktionskomplexes erlau­ ben, und
• (b) die Bildung des den Antikörper und das OB-Polypeptid umfassenden Reaktionskomplexes in der Probe nachweist, wobei der Nachweis der Bildung von Reaktionskomplexen die Anwesenheit von OB-Polypeptid in der Probe anzeigt.

57. Verfahren nach Anspruch 56, bei dem der Antikörper an einen Festphasenträger gebunden wird.

58. In vitro-Verfahren zur Ermittlung der Menge an OB-Polypeptid in einer biologischen Probe, bei dem man:

• (a) die Bildung von Reaktionskomplexen in einer biologi­ schen Probe gemäß dem Verfahren der Ansprüche 56 oder 57 nachweist, und
• (b) die Menge an gebildeten Reaktionskomplexen ermittelt, wobei die Menge der Reaktionskomplexe mit der Menge an OB-Polypeptid in der biologischen Probe korrespondiert.

59. In vitro-Verfahren zum Nachweis oder zur Diagnose des Vor­ liegens einer mit erhöhten oder verminderten Mengen an OB- Polypeptid in einem Säuger einhergehenden Erkrankung, bei dem man:

• (a) die Menge an OB-Polypeptid in einer biologischen Probe von einem Säuger gemäß Anspruch 58 ermittelt, und
• (b) die in Stufe (a) nachgewiesene Menge mit einer Menge an OB-Polypeptid vergleicht, die in normalen Individuen oder in dem betreffenden Individuum zu einem früheren Zeitpunkt vorhanden ist,

wobei ein Anstieg in der Menge an OB-Polypeptid im Vergleich zu normalen Mengen eine mit erhöhten Mengen an OB-Polypeptid einhergehende Erkrankung anzeigt, und eine im Vergleich zu normalen Werten verminderte Menge an OB-Polypeptid eine mit verminderten Mengen an OB-Polypeptid einhergehende Erkran­ kung anzeigt.

60. In vitro-Verfahren zum Überwachen der therapeutischen Be­ handlung einer Erkrankung, die mit erhöhten oder verminder­ ten Mengen an OB-Polypeptid in einem Säuger assoziiert ist, bei dem man die Mengen an OB-Polypeptid in einer Serie von biologischen Proben, die zu verschiedenen Zeitpunkten von dem Säuger, der eine therapeutische Behandlung einer Erkran­ kung durchläuft, die mit erhöhten oder verminderten Mengen an OB-Polypeptid assoziiert ist, erhalten worden sind, gemäß dem Verfahren des Anspruchs 58 ermittelt.

61. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche ein OB-Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren der Ansprüche 47 bis 50 und einen phar­ mazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

62. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 61 zur Redu­ zierung des Körpergewichtes eines Tieres.

63. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Steigerung des Körperge­ wichtes eines Tieres, welche einen Antagonisten eines OB- Polypeptids gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren gemäß den Ansprüchen 47 bis 50 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

64. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 63, wobei der Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, der an das OB-Polypeptid bindet und dessen Akti­ vität neutralisiert, einem Fragment des OB-Polypeptids, das an den OB-Polypeptid-Rezeptor bindet, diesen aber nicht aktiviert, und einem Antagonisten des OB-Polypeptids in Form eines kleinen Moleküls.

65. Das körperliche Erscheinungsbild verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Reduzierung des Körpergewichtes eines Individuums, welche ein OB-Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren der Ansprüche 47 bis 50 und einen verträglichen Träger umfaßt.

66. Das körperliche Erscheinungsbild verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Steigerung des Körpergewichtes eines Individuums, welche einen Antagonisten des OB-Polypeptids gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren der Ansprüche 47 bis 50 und einen ver­ träglichen Träger umfaßt.

67. Kosmetische Zusammensetzung nach Anspruch 66, wobei der Antagonist ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, der an das OB-Polypeptid bindet und dessen Akti­ vität neutralisiert, einem Fragment des OB-Polypeptids, das an den OB-Polypeptid-Rezeptor bindet, diesen aber nicht aktiviert, und einem Antagonisten des OB-Polypeptids in Form eines kleinen Moleküls.

68. Kosmetisches Verfahren zur Verbesserung des körperlichen Er­ scheinungsbildes eines Individuums, bei dem einem Individuum eine kosmetische Zusammensetzung gemäß jeglichem der Ansprü­ che 64 bis 67 in einer Dosismenge verabreicht wird, die ausreicht, um das Körpergewicht des Individuums auf einen erwünschten Wert zu modulieren.

69. Verwendung eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, welches mit einer für ein OB-Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 4 oder 9 kodierenden Nukleinsäure hybridisierbar ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Modifizierung des Körpergewichtes eines Säugers.

70. Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls, welches für ein OB- Polypeptid gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder her­ gestellt durch das Verfahren nach den Ansprüchen 47 bis 50 kodiert, zur Herstellung eines gentherapeutischen Medikamen­ tes zur Modifizierung des Körpergewichtes eines Tieres.

71. Verwendung eines OB-Polypeptids gemäß jeglichem der Ansprü­ che 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren der An­ sprüche 47 bis 50 zur Herstellung eines Medikamentes zur Modifizierung des Körpergewichts eines Tieres.

72. Verwendung eines OB-Polypeptids gemäß jeglichem der Ansprü­ che 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren der An­ sprüche 47 bis 50 zur Herstellung eines Medikamentes zur Modifizierung des Körpergewichtes eines Säugers bei der Behandlung eines Zustandes, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Diabetes, hohem Blutdruck und hohen Cholesterinwerten.

73. Verwendung eines OB-Polypeptids gemäß jeglichem der Ansprü­ che 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren der An­ sprüche 47 bis 50 zur Herstellung eines Medikamentes zur Modifizierung des Körpergewichtes eines Säugers zur kombina­ torischen Verwendung mit einem Medikament zur Behandlung von Diabetes, hohem Blutdruck und hohen Cholesterinwerten.

74. Verwendung eines Antagonisten eines OB-Polypeptids gemäß jeglichem der Ansprüche 1 bis 16 oder hergestellt durch das Verfahren der Ansprüche 47 bis 50 zur Herstellung eines Medikamentes zur Steigerung der Körpergewichtes eines Tie­ res.

75. Verwendung nach Anspruch 74, bei der der Antagonist ausge­ wählt wird aus der Gruppe bestehend aus einem Antikörper, der an das OB-Polypeptid bindet und dessen Aktivität neutra­ lisiert, einem Fragment des OB-Polypeptids, das an den OB- Rezeptor bindet, diesen aber nicht aktiviert, und einem Antagonisten des OB-Polypeptids in Form eines kleinen Mole­ küls.

76. Verwendung nach jeglichem der Ansprüche 71 bis 75 zur Her­ stellung eines Medikamentes zur intravenösen, intraarteriel­ len, intraperitonealen, intramuskulären, subkutanen, nasa­ len, oralen oder pulmonalen Darreichung.