DE69738637T2

DE69738637T2 - Leptinrezeptor db, den rezeptor kodierende nukleinsäuren und anwendungen desselben

Info

Publication number: DE69738637T2
Application number: DE69738637T
Authority: DE
Inventors: Jeffrey M. New York FRIEDMAN; Gwo-Hwa Lee; Ricardo Proenca; Ella New York IOFFE
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1996-01-16
Filing date: 1997-01-16
Publication date: 2009-05-28
Anticipated expiration: 2017-01-17
Also published as: AU2244797A; JP4285771B2; CA2243446A1; IL125353A; MX9805814A; IL208750A0; ATE392473T1; IL195948A; EP0879286B1; JP2000504938A; DE69738637D1; WO1997026335A1; NZ511840A; ES2306456T3; IL125353A0; EP0879286A1; US7063958B1

Description

Die Forschung, welche zur vorliegenden Erfindung führte, wurde teilweise durch Fördermittel der National Institutes of Health, RO1 DK41096-07 unterstützt. Folglich hat die Regierung der Vereinigten Staaten bestimmte Rechte an der Erfindung.
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation eines Rezeptors für einen Sättigungsfaktor, welcher an der Körpergewichtshomeostase beteiligt ist. Mutationen in diesem Rezeptor sind mit fettleibigen Phänotypen verbunden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Identifikation und Charakterisierung des Rezeptors für Leptin, einschließlich einer natürlich vorkommenden löslichen Form des Rezeptors, von welcher erwartet wird, dass sie die Leptinaktivität moduliert, insbesondere um die Leptinaktivität zu fördern. Die Erfindung betrifft weiterhin die Nukleinsäuren, welche den Rezeptor kodieren, und Verfahren zur Verwendung des Rezeptors z. B., um die Leptin-Analoga zu identifizieren, therapeutisch oder diagnostisch.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Fettleibigkeit, als ein Überschuss an Körperfett im Vergleich zu magerer Körpermasse definiert, ist mit wichtigen physiologischen und medizinischen Krankheiten verbunden, wobei letztere Bluthochdruck, erhöhte Blutfettwerte und Typ II- oder nicht Insulin abhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) einschließen. Es gibt 6–10 Milionen Personen mit NIDDM in den Vereinigten Staaten, einschließlich von 18% der Bevölkerung bzw. Population mit einem Alter von 65 Jahren [Harris et al., Int. J. Obes., 11: 275–283 (1987)]. Ungefähr 45% der Männer und 70% der Frauen mit NIDDM sind fettleibig, und ihr Diabetes wird erheblich durch Gewichtsreduktion verbessert oder beseitigt [Harris, Diabetes Care, 14(3): 639–648 (1991)]. Wie unten beschrieben, sind sowohl Fettleibigkeit, als auch NIDDM stark erblich.
Die Assimilation, Lagerung und Verwendung von Nährstoffenergie stellt ein komplexes homeostatisches System dar, welches zentral für das Überleben der Metazoen ist. Für landlebende Säugetiere ist die Lagerung von großen Mengen metabolischen Brennstoffs als Triglyceride im Fettgewebe entscheidend für ein Überleben von Zeiträumen des Nahrungsmangels. Das Erfordernis, eine festgelegte Menge von Energiespeichern ohne dauerhafte Änderungen in der Größe und der Form des Organismus aufrecht zu erhalten, erfordert das Erreichen eines Gleichgewichts zwischen der Energieaufnahme und dem Verbrauch.
Der Grad der Adiposität einer Person ist in einem großen Ausmaß genetisch bestimmt. Eine Untersuchung der Übereinstimmungsraten des Körpergewichts und der Adiposität unter mono- und dizygoten Zwillingen oder Adoptivkindern und ihren biologischen Eltern hat nahegelegt, dass die Erblichkeit der Fettleibigkeit (0,4–0,8) die von vielen anderen Eigenschaften übersteigt, von welchen gängigerweise angenommen wurde, dass sie eine erhebliche genetische Komponente aufweisen, wie Schizophrenie, Alkoholismus und Arteriosklerose [Stunkard et al., N. Engl. J. Med., 322: 1483–1487 (1990)]. Es wurde ebenfalls von familiären Ähnlichkeiten in den Geschwindigkeiten des Energieverbrauchs berichtet [Bogardus et al., Diabetes, 35: 1–5 (1986)]. Eine genetische Analyse von geographisch begrenzten Populationen hat nahegelegt, dass eine relativ kleine Anzahl von Genen für 30–50% der Varianz der Körperzusammensetzung verantwortlich sein kann [Moll et al., Am. J. Hum. Genet., 49: 1243–1255 1991)].
Nagetiermodelle für Fettleibigkeit schließen sieben eindeutige Einzelgenmutationen ein. Die am intensivsten untersuchten Maus-Fettleibkeitsmutationen sind die ob-(Fettleibkeit) und db-(Diabetes) Gene. Wenn sie mit dem Hintergrund derselben genetischen Linie vorliegen, führen ob und db zu nicht unterscheidbaren me tabolischen und Verhaltensphänotypen, was nahe legt, dass diese Gene im selben physiologischen Stoffwechselweg wriken können [Coleman et al., Diabetologia, 14: 141–148 (1978)]. Mäuse, welche für beide Mutationen homozygot sind, sind hyperphag und hypometabolisch, was zu einem fettleibigen Phänotyp führt, welcher im Alter von einem Monat erkennbar wird. Das Gewicht dieser Tiere scheint sich bei 60–70 g zu stabilisieren (verglichen mit 30–35 g in Kontrollmäusen). ob- und db-Tiere zeigen eine Unzahl von anderen hormonalen und metabolischen Veränderungen, die es schwierig gemacht haben, den Primärdefekt zu identifizieren, welcher der Mutation zuzuschreiben ist [Brav et al., Am. J. Clin. Nutr., 50: 891–902 (1989)]. Wie unten. erwähnt, führte die Identifizierung des OB-Gens zum Verstehen eines molekularen Elements.
Jedes der Nagetier-Fettleibigkeitsmodelle wird durch Änderungen im Kohlenhydratmetabolismus begleitet, welche jenen im Typ II-Diabetes des Menschen ähneln. In einigen Fällen hängt die Schwere des Diabetes teilweise vom Hintergrund-Mäusestamm ab [Leiter, Endocrinology, 124: 912–922 (1989)]. Sowohl für ob, als auch db entwickeln kongenische C57BL/Ks-Mäuse einen schweren Diabetes mit ultimativer β-Zellnekrose und Atrophie der Langerhans'schen Inseln, was zu einer relativen Insulinopenie führt. Umgekehrt entwickeln kongenische C57BL/6J-ob- und -db-Mäuse einen vorübergehenden insulinresistenten Diabetes, welcher schließlich durch eine β-Zell-Hypertrophie kompensiert wird, was dem humanen Typ II-Diabetes ähnelt.
Der Phänotyp der ob- und db-Mäuse ähnelt der menschlichen Fettleibigkeit in anderer Hinsicht als die Entwicklung des Diabetes – die mutierten Mäuse fressen mehr und verbrauchen weniger Energie, als es magere Kontrollen tun (wie es fettleibige Menschen tun). Dieser Phänotyp ist ebenfalls recht ähnlich zu jenem, welcher bei Tieren mit Läsionen des ventromedialen Hypothalamus beobachtet wird, was nahe legt, dass beide Mutationen mit der Fähigkeit interferieren können, Ernährungsinformation innerhalb des zentralen Nervensystems richtig zu integrieren oder darauf zu antworten. Eine Unterstützung dieser Hypothese kommt aus den Ergebnissen von Parabiose-Experimenten [Coleman, Diabetologia, 9: 294–298 (1973)], welche nahe legen, dass ob-Mäuse einen Mangel eines zirkulierenden Sättigungsfaktors aufweisen, und dass db-Mäuse resistent gegen die Wirkungen des ob-Faktors sind (möglicherweise aufgrund eines ob-Rezeptordefekts). Diese Experimente haben zu der Schlussfolgerung geführt, dass die Fettleibigkeit sich in diesen mutierten Mäusen aus verschiedenen Defekten in einer afferenten Schleife und/oder einem integrativen Zentrum des postulierten Rückkopplungsmechanismus ergeben kann, welcher die Körperzusammensetzung kontrolliert.
Unter Verwendung molekularer und klassischer genetischer Marker wurden die ob- und db-Gene jeweils für das proximale Chromosom 6 und das Mittelchromosom 4 kartiert [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87: 8642–8646 (1990), Friedman et al., Genomics, 11: 1054–1062 (1991)]. In beiden Fällen liegen die Mutationen in Regionen des Mäusegenoms, welche syntenisch zum Menschen sind, was nahe legt, dass, wenn es menschliche Homologe von ob und db gibt, sie wahrscheinlich jeweils auf den menschlichen Chromosomen 7q und 1p liegen. Defekte im db-Gen können zu Fettleibigkeit in anderen Säugetierarten führen: in genetischen Kreuzungen zwischen Zucker-fa/fa-Ratten und Brown Norway +/+-Ratten wird die fa-Mutation (Rattenchromosom 5) durch dieselben Loci flankiert, welche db in der Maus flankieren [Truett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806–7809 (1991)].
Ein Hauptfortschritt beim Verstehen der molekularen Grundlage der Fettleibigkeit fand mit dem Klonieren des ob-Gens statt. Das Mäuse-Fettleibigkeits-(ob)-Gen kodiert einen aus Fettgewebe abgeleiteten Signalfaktor für die Körpergewichtshomeostase [Zhang et al., Nature, 372: 425 (1994), U.S. Patentanmeldung Nr. 08/292,345, eingereicht am 17. August 1994, U.S. Patentanmeldung Nr. 08/483,211, eingereicht am 7. Juni 1995, internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 96/05309 , veröffentlicht am 22. Februar 1996]. Mehrere aktuelle Studien haben gezeigt, dass rekombinantes OB-Protein (Leptin), welches aus Escherichia coli gereinigt wurde, die mit Fettleibigkeit verwandten Phänotypen in ob/ob-Mäusen korrigieren kann, wenn es exogen verabreicht wird [Campfield et al., Science, 269: 546 (1995); Tartaglia et al. (Cell, 83: 1263, 1995) offenbart einen Leptinrezeptor. Die WO 97/25424 , die WO 97/25425 und die WO 97/19952 offenbaren jeweils einen löslichen Leptinrezeptor.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein lösliches Leptinrezeptor-(OB-R)-Polypeptid gerichtet, wie es in den Ansprüchen definiert ist. Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Derivat des beanspruchten Leptinrezeptors gerichtet, welches an einen chemischen Rest angeheftet ist. Die Erfindung ist ebenfalls auf eine isolierte Nukleinsäure gerichtet, welche den beanspruchten Leptinrezeptor kodiert.
Die Erfindung ist ebenfalls auf eine isolierte Nukleinsäure gerichtet, welche bei Expression ein lösliches Leptinrezeptor-Polypeptid kodiert, welches die Fähigkeit aufweist, Leptin zu binden, welche:

a) ein DNA-Molekül nach SEQ ID NR: 9,
b) die komplementäre Sequenz des in (a) definierten DNA-Moleküls,
c) ein DNA-Molekül, das bei Expression das Polypeptid kodiert, das von einem beliebigen der vorstehenden DNA-Moleküle kodiert wird, ist.

Die Erfindung ist ebenfalls auf einen Vektor, welcher eine solche DNA umfasst, gerichtet.
Die Erfindung ist ebenfalls auf einen einzelligen Wirt gerichtet, welcher mit einem solchen DNA-Molekül oder Vektor transformiert oder transfiziert wurde.
Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zum Herstellen eines Leptinrezeptor-Polypeptids gerichtet, umfassend:

a) das Kultivieren der oben erwähnten transformierten oder transfizierten Zelle unter Bedingungen, welche die Expression des Leptinrezeptor-Polypeptids bewirken, und
b) das Gewinnen des exprimierten Polypeptids.

Die Erfindung ist ebenfalls auf einen Antikörper gerichtet, welcher spezifisch für den beanspruchten Leptinrezeptor ist.
Die Erfindung ist ebenfalls auf eine immortale Zelllinie gerichtet, welche einen monoklonalen Antikörper herstellt, der spezifisch für den beanspruchten Leptinrezeptor ist.
Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers gerichtet, welcher spezifisch für den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor ist, umfassend:

a) das Immunisieren eines Wirtstieres mit dem beanspruchten Leptinrezeptor, dem ein Adjuvans beigemischt ist und/oder der an ein Trägerprotein gekoppelt ist, und
b) das Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier.

Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zum Messen des Vorhandenseins des beanspruchten löslichen Leptinrezeptors in einer Probe gerichtet, umfassend:

a) das Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie einen Leptinrezeptor enthält, mit einem Antikörper, der spezifisch an den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor bindet, wobei der Antikörper optional an einen Festphasenträger gebunden ist, unter Bedingungen, welche die Bildung eines Reaktionskomplexes, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, erlauben, und
b) das Nachweisen der Bildung von Reaktionskomplexen, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, in der Probe,

Die Erfindung ist ebenfalls auf eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung in der Medizin gerichtet, welche den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Die Erfindung ist ebenfalls auf die Verwendung des beanspruchten löslichen Leptinrezeptors in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fettleibigkeit in einem Individuum gerichtet.
Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Kit gerichtet, welches die oben erwähnte pharmazeutische Zusammensetzung und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes, Bluthochdruck und erhöhtem Cholesterinspiegel umfasst.
Die Erfindung ist ebenfalls auf eine die körperliche Erscheinung verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Reduktion des Körpergewichts eines Individuums gerichtet, welche den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor und einen verträglichen Träger umfasst.
Die Erfindung ist ebenfalls auf ein Verfahren zur kosmetischen Behandlung zur Verbesserung der körperlichen Erscheinung gerichtet, welches das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend den beanspruchten löslichen Leptinrezeptor und einen verträglichen Träger, an ein Individuum umfasst.
Aspekte und Ausführungsformen der folgenden Beschreibung, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.
Es werden hier ebenfalls ein Leptinrezeptor(OB-R)-Polypeptid, Nukleinsäuren, welche ein solches Polypeptid kodieren, nicht kodierende Nukleinsäuren, welche die kodierenden Sequenzen des Gens flankieren, Oligonukleotide, welche mit solchen Nukleinsäuren hybridisieren, Antikörper gegen das Polypeptid und diagnosti sche, therapeutische und kosmetische Zusammensetzungen und Verfahren zum Verwenden des Polypeptids, der Nukleinsäuren oder der Antikörper oder Kombinationen davon offenbart.
Daher wird der Leptinrezeptor (hier ebenfalls OB-Rezeptor oder OB-R genannt) in einem ersten Aspekt dieser Offenbarung durch spezifisches Binden an Leptin unter physiologischen Bedingungen, eine Expression in hohen Mengen in Zellen des Hypothalamus und eine Expression in niedrigeren Mengen im Fettgewebe, den Hoden, dem Herz und dem Gehirn und durch Aufweisen einer Sequenzähnlichkeit mit gp130-Cytokinrezeptoren gekennzeichnet.
In spezifischen Beispielen, infra, wird der Leptinrezeptor aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra (SEQ ID NR: 2), OB-Rb (SEQ ID NR: 4), OB-Rc (SEQ ID NR: 6), OB-Rd (SEQ ID NR: 8) und OB-Re (SEQ ID NR: 10) oder Allelvarianten davon, ausgewählt. Alternativ kann der Leptinrezeptor eine Sequenz aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
dem N-Terminus, welcher OB-Ra bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und dem C-Terminus, welcher einem C-Terminus entspricht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd nach Lys⁸⁸⁹,
dem N-Terminus, welcher OB-Rb oder OB-Rc bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra oder OB-Rd nach Lys⁸⁸⁹ entspricht,
dem N-Terminus, welcher OB-Rd bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb oder OB-Rc entspricht,
dem N-Terminus, welcher OB-R von Pro⁶⁶⁴ bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
dem N-Terminus, welcher OB-R von Met⁷³³ bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und dem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
dem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro⁶⁶⁴ bis His⁷⁹⁶ und OB-Re von His⁷⁹⁶,
dem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Met⁷³³ bis His⁷⁹⁶ und OB-Re von His⁷⁹⁶ oder Allelvarianten davon.
In einer anderen Ausführungsform kann der Leptinrezeptor eine N-terminale Sequenz aufweisen, welche aus der Gruppe, bestehend aus den
Aminosäureresten 1–889,
Aminosäureresten 23–889,
Aminosäureresten 28–889,
Aminosäureresten 133–889,
Aminosäureresten 733–889,
Aminosäureresten 1–796,
Aminosäureresten 23–796,
Aminosäureresten 28–796,
Aminosäureresten 133–796, und
Aminosäureresten 733–796,
ausgewählt ist, und eine C-terminale Sequenz, welche aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14 und SEQ ID NR: 15 ausgewählt ist, wobei die Nummerierung auf der Aminosäuresequenz des vollständig transkribierten Mäuse-Leptinrezeptors, einschließlich des Signalpeptids, oder Allelvarianten davon basiert.
In einer spezifischen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein löslicher Rezeptor. Ein solcher löslicher Rezeptor kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus OB-Re, einer N-terminalen Sequenz, welche aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro⁶⁶⁴ bis His⁷⁹⁶, und einer C-terminalen Sequenz, welche OB-Re von His⁷⁹⁶ und OB-R von Met⁷³³ bis His⁷⁹⁶ ist, und einer C-terminalen Sequenz, welche OB-Re von His⁷⁹⁶ ist, einer N-terminalen Sequenz, welche ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den
Aminosäureresten 1–796,
Aminosäureresten 23–796,
Aminosäureresten 28–796,
Aminosäureresten 133–796, und
Aminosäureresten 733–796, und
einer C-terminalen Sequenz, welche SEQ ID NR: 15 ist, wobei die Nummerierung auf der Aminosäuresequenz des vollständig transkribierten Mäuse-Leptinrezeptors, einschließlich des Signalpeptids, oder Allelvarianten davon basiert. In einer spezifischen Ausführungsform wird löslicher OB-R in einem rekombinanten Baculovirus-Expressionssystem hergestellt.
Die voranstehenden Ausführungsformen schließen jene ein, in welchen der N-Terminus oder der C-Terminus oder beide nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste einschließen, wie heterogene Signalpeptide oder Spaltstellenreste von Signalpeptiden. Zum Beispiel werden hier in spezifischen Ausführungsformen die folgenden löslichen Formen von OB-R offenbart:
Asp-Pro-Ile28 → Phe-Tyr-Ile-His796-Gly-Met-Cys-Thr-Val-Leu-Phe-Met-Asp805 (SEQ ID NR: 15)
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420 (SEQ ID NR: 77) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118 (SEQ ID NR: 78) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123 (SEQ ID NR: 79) → Val331.
Die vorliegende Offenbarung umfasst weiterhin verschiedene Mutationen und Substitutionen. Zum Beispiel kann der entsprechende Rest in einer anderen Art (z. B. Mensch) durch hoch divergente Aminosäurereste aus einer Art (z. B. Maus) substituiert werden, um einen biologisch oder funktionell aktiven Leptinrezeptor oder ein Fragment davon zu erhalten. Alternativ können bestimmte Struktur- oder mögliche Strukturreste mit Resten substituiert werden, welche die Neigung zur Strukturbildung erhöhen oder vermindern. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, können Cystein-Reste oder Cystein-Paare mit Serin (oder einem anderen vergleichbaren Aminosäurerest, wie Threonin, Methionin, Alanin, usw.) substituiert werden, um Disulfidbindungen zu entfernen. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, werden ein oder mehrere von Cys 188 und 193, 471 und 602, 471 und 526 und 602 und 611 zu Ser mutiert, wodurch ein Protein erhalten wird, welches keine Disulfide bildet. Solche Substitutionen können die Bildung von falschen Disulfidvernetzungen während der Expression in einem gentechnisch veränderten System verhindern und werden ebenfalls für eine Kristallisation bevorzugt.
Alternativ umfasst der Leptinrezeptor eine Transmembrandomäne und stellt ein integrales Membranprotein dar. In dieser Ausführungsform kann der Leptinrezeptor weiterhin ein JAK-Bindungsmotiv, ausgewählt aus "Box 1", "Box 2" und "Box 1" und "Box 2" umfassen, wobei das Motiv strangabwärts von der Transmembrandomäne liegt.
In einer spezifischen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein humaner Leptinrezeptor. In einer anderen spezifischen Ausführungsform, welche infra beispielhaft dargestellt wird, ist der Leptinrezeptor ein Mäuse-Leptinrezeptor. In einer weiteren spezifischen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein humaner Leptinrezeptor, welcher eine divergente Aminosäurersubstitution von der entsprechenden Position des Mäuse-Leptinrezeptors umfasst. In einer anderen Ausführungsform ist der Leptinrezeptor ein humaner Leptinrezeptor, welcher konservative Aminosäureresubstitutionen umfasst. In einer spezifischen Ausführungsform werden konservative Aminosäuresubstitutionen aus einem Mäuse-Leptinrezeptor in einem humanen Leptinrezeptor vorgenommen. In noch einer anderen Ausführungsform werden konservative Aminosäuresubstitutionen vorgenommen, welche die Sekundärstruktur verstärken, z. B. die Neigung zur Bildung von α-Helices.
Es wird ebenfalls ein antigenes Fragment des Leptinrezeptors offenbart. In einer spezifischen Ausführungsform wird das antigene Fragment aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33 und SEQ ID NR: 34, ausgewählt.
Die Offenbarung betrifft weiterhin ein Derivat der löslichen Form des Leptinrezeptors, welches an einen chemischen Rest angeheftet ist. Vorzugsweise stellt der chemische Rest ein wasserlösliches Polymer dar. Weiter bevorzugt ist das wasserlösliche Polymer Polyethylenglykol.
In einem anderen Aspekt wird eine isolierte Nukleinsäure offenbart, welche den Leptinrezeptor kodiert, insbesondere wie oben dargestellt wird. In spezifischen Beispielen, infra, wird cDNA offenbart, welche verschiedene Splice-Formen des Mäuse-Leptinrezeptors kodiert. Insbesondere werden Nukleinsäuren offenbart, welche Sequenzen aufweisen, die den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9 entsprechen oder komplementär dazu sind.
Insbesondere wird ein isoliertes DNA-Molekül offenbart, welches bei Expression ein Leptinrezeptor-Polypeptid kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: einer Polypeptid kodierenden Sequenz eines DNA-Moleküls aus SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 oder 9,
einem DNA-Molekül, welches komplementär zu dem in (a) definierten DNA-Molekül ist,
einem DNA-Molekül, welches mit dem DNA-Molekül aus (a) oder (b) oder einem hybridisierbaren Fragment davon hybridisiert,
einem DNA-Molekül, welches mit einer Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Sonde identifizierbar ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Sonde für Klon 7 (vorwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 42 und rückwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 43), einer Sonde für Klon 11 (vorwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 44 und rückwärts gerichteter Primer SEQ ID NR: 45) und sowohl Klon 7, als auch Klon 11, und
einem DNA-Molekül, welches bei Expression für das Polypeptid kodiert, das von einem beliebigen der vorstehenden DNA-Moleküle kodiert wird.
Das DNA-Molekül stammt vorzugsweise aus dem Menschen. In spezifischen Beispielen, infra, stammt das DNA-Molekül aus der Maus. In spezifischen Ausführungsformen kodiert das DNA-Molekül bei Expression für ein Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Leptinrezeptor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc, OB-Rd und OB-Re oder Allelvarianten davon, einem Leptinrezeptor, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
einem N-Terminus, welcher OB-Ra bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und einem C-Terminus, welcher einem C-Terminus entspricht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd nach Lys⁸⁸⁹,
einem N-Terminus, welcher OB-Rb oder OB-Rc bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra oder OB-Rd nach Lys⁸⁸⁹ entspricht,
einem N-Terminus, welcher OB-Rd bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb oder OB-Rc entspricht,
einem N-Terminus, welcher OB-R von Pro⁶⁶⁴ bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
einem N-Terminus, welcher OB-R von Met⁷³³ bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und einem C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht, und
einem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro⁶⁶⁴ bis His⁷⁹⁶ und OB-Re von His⁷⁹⁶,
einem N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Met⁷³³ bis His⁷⁹⁶ und OB-Re von His⁷⁹⁶ oder Allelvarianten davon,
einem Leptinrezeptor, wobei die N-terminale Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus den
Aminosäureresten 1–889,
Aminosäureresten 23–889,
Aminosäureresten 28–889,
Aminosäureresten 133–889,
Aminosäureresten 733–889,
Aminosäureresten 1–796,
Aminosäureresten 23–796,
Aminosäureresten 28–796,
Aminosäureresten 133–796, und
Aminosäureresten 733–796,
und die C-terminale Sequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus SEQ ID NR: 11, SEQ ID NR: 12, SEQ ID NR: 13, SEQ ID NR: 14 und SEQ ID NR: 15 (nach His796), wobei die Nummerierung auf der Aminosäuresequenz des vollständig transkribierten Mäuse-Leptinrezeptors, einschließlich des Signalpeptids, oder Allelvarianten davon basiert.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine isolierte Nukleinsäure offenbart, insbesondere ein DNA-Molekül, welches bei Expression einen löslichen Leptinrezeptor kodiert, in welchem der N-Terminus oder C-Terminus oder beide nicht natürlich vorkommende Aminosäurereste einschließen, wie heterogene Signalpeptide oder Spaltstellenreste für Signalpeptide. In spezifischen Ausführungsformen wird zum Beispiel DNA offenbart, welche die folgenden löslichen Formen von OB-R kodiert:
Asp-Pro-Ile28 → Phe-Tyr-Ile-His796-Gly-Met-Cys-Thr-Val-Leu-Phe-Met-Asp805 (SEQ ID NR: 15)
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr420 (SEQ ID NR: 77) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser118 (SEQ ID NR: 78) → Pro641,
Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu123 (SEQ ID NR: 79) → Val331.
Die vorliegende Offenbarung umfasst weiterhin DNA, welche einen Leptinrezeptor kodiert, der die verschiedenen oben diskutierten Mutationen und Substitutionen aufweist. Zum Beispiel können Cystein-Reste oder Cystein-Paare mit Serin (oder Threonin, Methionin oder Alanin) substituiert werden, um Disulfidbindungen zu entfernen. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, werden DNA-Moleküle offenbart, welche löslichen OB-R kodieren, in welchem ein oder mehrere aus Cys 188 und 193, 471 und 602, 471 und 526 und 602 und 611 zu Ser mutiert sind, wodurch ein Protein erhalten wird, welches keine Disulfide bildet.
Diese Offenbarung umfasst weiterhin als eine Folge der oben beschriebenen kodierenden Nukleinsäuren ein Oligonukleotid, welches unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisierbar ist, insbesondere dem DNA-Molekül, welches den Leptinrezeptor kodiert. In spezifischen Ausführungsformen, welche infra beispielhaft dargestellt werden, ist das Oligonukleotid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 20, SEQ ID NR: 21, SEQ ID NR: 22, SEQ ID NR: 23, SEQ ID NR: 24, SEQ ID NR: 25, SEQ ID NR: 26, SEQ ID NR: 27, SEQ ID NR: 28, SEQ ID NR: 29, SEQ ID NR: 30, SEQ ID NR: 31, SEQ ID NR: 35, SEQ ID NR: 36, SEQ ID NR: 37, SEQ ID NR: 38, SEQ ID NR: 39, SEQ ID NR: 40, SEQ ID NR: 41, SEQ ID NR: 42, SEQ ID NR: 43, SEQ ID NR: 44, SEQ ID NR: 45, SEQ ID NR: 46, SEQ ID NR: 47, SEQ ID NR: 48, SEQ ID NR: 49, SEQ ID NR: 50, SEQ ID NR: 51, SEQ ID NR: 52, SEQ ID NR: 53 und SEQ ID NR: 54. Das Oligonukleotid kann markiert sein.
Zusätzlich zu der kodierenden DNA werden hier Vektoren offenbart, welche eine solche DNA umfassen. Ein hier offenbarter Vektor kann ein Klonierungsvektor sein, oder er kann ein Expressionsvektor sein, welcher die DNA, die den Leptinrezeptor kodiert, operabel verbunden mit einer Expressions-Kontrollsequenz umfasst. Normalerweise erstreckt sich diese Offenbarung auf einen einzelligen Wirt, welcher mit einem DNA-Molekül, einem Klonierungsvektor oder einem Expressionsvektor, wie hier offenbart, transformiert oder transfiziert ist. Ein solcher einzelliger Wirt kann aus der Gruppe ausgewählt sein, bestehend aus Bakterien, Hefe, Säugetierzellen, Pflanzenzellen und Insektenzellen in Gewebekultur. In spezifischen Ausführungsformen kann der Wirt aus der Gruppe, bestehend aus Pseudomonas-, Bacillus-, Streptomyces-, Saccharomyces-, Pichia-, Candida-, Hansenula-, Torulopsis-, CHO-, R1.1-, B-W-, LM-, COS 1-, COS 7-, BSC1-, BSC40-, BMT10- und Sf9-Zellen, ausgewählt sein.
Diese Offenbarung betrifft weiterhin ein rekombinantes Verfahren zur Herstellung eines Leptinrezeptor-Polypeptids, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, welche einen wie offenbarten Expressionsvektor umfasst, unter Bedingungen, welche die Expression des Leptinrezeptor-Polypeptids bewirken, und das Gewinnen des exprimierten Polypeptids umfasst.
Es wird hier ebenfalls eine Antisense-Nukleinsäure, welche mit einer mRNA hybridisiert, die einen Leptinrezeptor kodiert, und ein Ribozym, welches eine mRNA spaltet, die ein Leptinrezeptor kodiert, offenbart.
In einer anderen Ausführungsform werden ein transgener Vektor, welcher ein DNA-Molekül umfasst, das einen Leptinrezeptor kodiert, oder ein wie hier offenbarter Expressionsvektor offenbart.
In einem anderen Aspekt wird ein Antikörper offenbart, welcher spezifisch für einen Leptinrezeptor ist. Der Antikörper kann ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper sein. Solche Antikörper schließen Antikörper ein, welche gegen antigene Fragmente des Leptinrezeptors erzeugt wurden, einschließlich synthetischer Polypeptidfragmente aus ungefähr 10 bis 30 Aminosäureresten. In einer spezifischen Ausführungsform kann der Antikörper mit einer nachweisbaren Markierung markiert sein. Normalerweise erstreckt sich diese Offenbarung auf eine immortale Zelllinie, welche einen monoklonalen Antikörper herstellt.
In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers offenbart, welcher spezifisch für einen Leptinrezeptor ist, umfassend: Immunisieren eines Wirtstiers mit dem Leptinrezeptor oder einem immunogenen Fragment davon, dem ein Adjuvans beigemischt ist, und Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier. In einer andren spezifischen Ausführungsform, welche infra beispielhaft dargestellt wird, umfasst das Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, welcher spezifisch für einen Leptinrezeptor ist, das Konjugieren eines Peptids mit einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SEQ ID NR: 32, SEQ ID NR: 33 und SEQ ID NR: 34 an ein Trägerprotein, das Immunisieren eines Wirtstiers mit dem Peptid-Trägerprotein-Konjugat aus Schritt (a), dem ein Adjuvans beigemischt wird, und das Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier.
Zusammen mit den hier offenbarten Antikörpern wird ein Verfahren zum Messen des Vorhandenseins eines Leptinrezeptors in einer Probe offenbart, umfassend das Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie einen Leptinrezeptor enthält, mit einem Antikörper, welcher spezifisch an den Leptinrezeptor unter Bedingungen bindet, welche die Bildung von Reaktionskomplexen, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, erlauben, und das Nachweisen der Bildung der Reaktionskomplexe, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor in der Probe, wobei der Nachweis der Bildung von Reaktionskomplexen das Vorhandensein von Leptinrezeptor in der Probe anzeigt. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Antikörper an einen Festphasenträger gebunden. Als eine Folge des Verfahrens zum Messen des Vorhandenseins des Leptinrezeptors in einer Probe wird eine in vitro Verfahren zum Bestimmen der Menge des Leptinrezeptors in einer biologischen Probe offenbart, umfassend das Nachweisen der Bildung von Reaktionskomplexen in einer biologischen Probe, wie beschrieben, und das Bestimmen der Menge der gebildeten Reaktionskomplexe, wobei die Menge der Reaktionskomplexe der Menge des Leptinrezeptors in der biologischen Probe entspricht. Diese Offenbarung betrifft weiterhin ein in vitro Verfahren zum Nachweisen oder Diagnostizieren des Vorhandenseins einer Krankheit, welche mit erhöhten oder verminderten Mengen des Leptinrezeptors in einem Individuum verbunden ist, umfassend das Bestimmen der Menge des Leptinrezeptors in einer biologischen Probe aus einem Individuum, wie beschrieben, und das Vergleichen der im Schritt (a) nachgewiesenen Menge mit einer Menge Leptinrezeptor, welche in normalen Individuen oder in dem Individuum zu einem früheren Zeitpunkt vorliegt/vorlag, wobei ein Anstieg der Menge des Leptinrezeptors verglichen mit normalen Mengen eine Krankheit anzeigt, welche mit erhöhten Mengen des Leptinrezeptors verbunden ist, und eine verminderte Menge des Leptinrezeptors verglichen mit normalen Mengen eine Krankheit anzeigt, welche mit verminderten Mengen des Leptinrezeptors verbunden ist.
Es wird hier ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung offenbart, welche einen löslichen Leptinrezeptor und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst. Alternativ kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, wie hier offenbart, einen transgenen Vektor, z. B. einen viralen Vektor oder nackte DNA, zur Verabreichung an ein Individuum zur Gentherapie umfassen. Vorzugsweise ist ein solcher Vektor auf das Gehirn, weiter bevorzugt auf den Hypothalamus zielgerichtet. Es wird hier ebenfalls ein Verfahren zum Behandeln von Fettleibigkeit in einem Individuum offenbart, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung. Das Verfahren zur Behandlung kann weiterhin das Verabreichen einer Behandlung von Diabetes, Bluthochdruck und erhöhtem Cholesterinspiegel umfassen.
In einer anderen Ausführungsform wird eine die körperliche Erscheinung verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Reduktion des Körpergewichts eines Individuums offenbart, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor und einen verträglichen Träger. Es wird ebenfalls ein Verfahren zum Verbessern der körperli chen Erscheinung eines Individuums offenbart, umfassend das Verabreichen der kosmetischen Zusammensetzung.
Folglich ist es ein Hauptziel der vorliegenden Offenbarung, Modulatoren des Körpergewichts, wie hier definiert, in gereinigter Form bereitzustellen, welche bestimmte Eigenschaften und Aktivitäten aufweisen, die mit der Kontrolle und Variation der Adiposität und dem Fettgehalt von Säugetieren verbunden sind.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, Verfahren zum Nachweis und zur Messung der Modulatoren der Gewichtskontrolle, wie hier dargestellt, als ein Hilfsmittel der wirksamen Diagnose und der Überwachung von pathologischen Zuständen bereitzustellen, wobei die Variation in der Menge solcher Modulatoren eine charakterisierende Eigenschaft ist oder sein kann.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren und ein damit verbundenes Assaysystem zum Screenen von Substanzen, wie Arzneimitteln, Mitteln und desgleichen, bereitzustellen, welche möglicherweise entweder beim Nachahmen oder Inhibieren der Aktivität der Leptinbindung an seinen Rezeptor wirksam sind, z. B. Agonisten und Antagonisten der hier offenbarten Modulatoren in Säugetieren.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Behandlung von Säugetieren bereitzustellen, um das Körpergewicht und den Fettgehalt in Säugetieren zu kontrollieren und/oder bestimmte pathologische Zustände zu behandeln, bei denen ein abnormaler Abfall oder eine Erhöhung des Körpergewichts eine charakterisierende Eigenschaft darstellt.
Es ist noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Offenbarung, genetische Konstrukte zur Verwendung in genetisch therapeutischen Protokollen und/oder pharmazeutischen Zusammensetzungen für vergleichbare therapeutische Verfahren herzustellen, welche einen oder mehrere der Modulatoren, Bindungspartner oder Mittel um fassen oder auf ihnen basieren, welche ihre Herstellung kontrollieren können, oder welche ihre Aktivitäten nachahmen oder ihnen entgegenwirken.
Andere Ziele und Vorteile werden dem Fachmann aus einem Überblick der folgenden Beschreibung deutlich werden, welche unter Bezugnahme auf die folgenden darstellenden Zeichnungen fortfährt.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Aspekte der Figuren, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.
1. Lokalisation des Leptinrezeptors in der Region des db-Gens. Die db-Mutation wurde in zwei Kreuzungen, welche insgesamt 750 Meiosen umfassten, aufgespalten. Eine genetische Karte wurde durch Genotypisierung der Nachkommen dieser Kreuzungen mit den in der Karte angegebenen Markern erstellt. Rekombinante Schlüsseltiere sind auf der Karte als Zahlen über der Linie angegeben. Ein "Chromsomen-Walk" wurde mit dem Mikrodissektionsklon D4Rck22 begonnen. Der "Walk" deckte 2,7 Megabasen ab und war aus YACs (fette Linien), BACs (kursiv) und P1-Bakteriophagen (Nummern) aufgebaut. Die Genotypisierung der rekombinanten Tiere mit zwei SSLP-Markern, D4Rck6 und D4Rck7, von den Enden dieser genomischen Klone lokalisierte das db-Gen auf das ungefähr 300 Kb große Intervall zwischen den Rekombinationsereignissen in den Tieren 324 und 1028. Dieses Intervall wurde von den BACs 242 und 43 abgedeckt. Southern-Blots und eine PCR zeigten, dass die 5'-Enden des Leptinrezeptors bei BAC 150A lagen und das 3'-Ende bei BAC 19, was darauf hinweist, dass das Gen in Richtung auf die Telomere transkribiert wird.
2A–B. Verschiedene Spleißvarianten des Leptinrezeptors sind vorhanden. (A) Eine schematische Zeichnung des Leptinrezeptors mit möglichen Motiven für eine JAK-Bindung und -Signaltransduktion, "Box 1" und "Box 2" (schattierte Flächen). "TM" weist eine mögliche Transmembrandomäne aus. Insgesamt 8 cDNA-Klone wurden aus Mäusegehirn isoliert. Für diese cDNAs wurde gefunden, dass sie fünf verschiedenen Spleißvarianten des Leptinrezeptors entsprechen. (B) Sechs der Klone wiesen teilweise identische Sequenzen strangaufwärts von Lysin 889 des Leptinrezeptors (OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd) auf, an welchem Punkt die vorausgesagten Proteine divergierten. Die vorausgesagten C-terminalen Aminosäuresequenzen dieser Klone sind gezeigt (jeweils SEQ ID NR: 11–14). OB-Ra, b, c und d sagen alle ein Box 1-Motiv voraus, OB-Rb sagt ebenfalls eine Peptidsequenz voraus, welche möglicherweise homolog zu Box 2 ist (unterstrichen). Zwei unabhängige cDNA-Klone waren identisch zum Leptinrezeptor strangaufwärts von Histidin 796, an welchem Punkt die Sequenzen divergierten (OB-Re) (SEQ ID NR: 15). Die Nukleotidsequenz sagt einen löslichen Rezeptor voraus.
3A–C. Die db-Mutation führt zu einem abnormalen RNA-Spleißing und einer Umwandlung der Spleißvariante OB-Rb zu OB-Ra. (A) RT-PCR-Produkte von C57BL/Ks db/db- und Wildtyp-Mäusen wurden unter Verwendung eines für OB-Rb-RNA spezifischen Primerpaares (F1 und R₃) amplifiziert. Eine Elektrophorese ergab, dass das amplifizierte Fragment von diesen db-Mäusen größer war, als von den Wildtyp-Tieren. Die PCR-Produkte der genomischen DNA, welche den OB-Rb-Spleißakzeptor an Pro⁸⁹⁰ abdeckten, waren von identischer Größe in C57 BL/Ks db/db-Mäusen und Kontrollen aus dem gleichen Wurf. (B) Die Primer F2 und R wurden verwendet, um die genomische DNA zu amplifizieren. Der F2-Primer wurde nach der Verwendung einer Vectorette-PCR und BAC 242 ausgewählt, um die Sequenz der genomischen DNA strangaufwärts des Spleißakzeptors an P⁸⁹⁰ zu erhalten. (C) Lokalisierung der Primer für die RT-PCR und die genomische PCR-Amplifikation.
4A–D. RNA aus dem Hypothalamus von Wildtyp-Mäusen. Die RT-PCR-Produkte des Hypothalamus für die C-terminale kodierende Region von (A) OB-Ra, (B) OB-Re, (C) OB-Rd und (D) OB-Re waren von normaler Größe in db-Mäusen. Die über die Spleiß-Verbindung reichende DNA-Sequenz war in jedem dieser RT-PCR-Produkte normal. Dies weist darauf hin, dass der Spleißdonor an Lys⁸⁸⁹ Wildtyp ist.
5A–C. Identifikation von Spleißmutationen in db-Mäusen. (A) Eine DNA-Sequenzierung identifizierte eine 106 bp lange Insertion in der mutierten OB-Rb-RNA an der Spleiß-Verbindung zwischen Lys⁸⁸⁹ und Pro⁸⁹⁰ (SEQ ID NR: 16). Die Sequenz der Insertion war identisch mit den ersten 106 bp des C-terminalen Exons von OB-RA. Die Insertion sagt ein unreifes Stopcodon voraus und ändert die Aminosäuresequenz von OB-Rb (SEQ ID NR: 17) zu OB-Ra. (B, C) Die angenommene genomische Organisation der OB-Ra- und OB-Rb-3'-Enden sind gezeigt. Eine DNA-Sequenzierung des OB-Ra-Exons aus den C57 BL/K⁹ db/db-Mäusen (SEQ ID NR: 18) und den Kontrollen aus dem gleichen Wurf (SEQ ID NR: 19) ergab eine G zu T-Mutation 106 Basenpaare nach dem Spleißakzeptor an R⁸⁹⁰. Diese Mutation führt zu dem Erscheinen einer Konsensus-Spleißdonorstelle, AGGTAAA, welche zur Insertion von 106 bp des C-terminalen Exons von OB-Ra in das von OB-Rb führt.
6A–F. Gewebeverteilung des alternativ gespleißten Leptinrezeptors. Eine RT-PCR wurde von den angegebenen Gewebequellen durchgeführt. In jedem Fall wurde ein Primer aus einer Region mit einer gemeinsamen Nukleotidsequenz in Kombination mit einem Primer, welcher spezifisch für das alternativ gespleißte Exon war, verwendet, Aktin-mRNA diente als Kontrolle. (B) Gehirn, (H) Hypothalamus, (L) Leber, (H) Herz, (K) Niere, (S) Milz, (T) Hoden, (F) Fettgewebe, (S) Milz.
7. Die NIH-Corpulent-Ratten-(cp/cp)-Mutation. Eine DNA-Sequenz von Lepr von fettleibigen NIH fa^cp/fa^cp und mageren Ratten ist gezeigt. Die cDNA wurde aus RNA synthetisiert, die aus dem Gehirn von fettleibigen cp/cp-Ratten und mageren Geschwistern des gleichen Wurfs isoliert wurde. Die PCR-Produkte wurden gelgereinigt und mit den oben erwähnten Primern auf einem Sequenzierautomaten sequenziert. Die cp/cp-Ratte wies eine Basenänderung von T → A an Nukleotid 2289 auf, die zu einem Stopcodon an Tyr763 führte.
8. PCR von Lepr von Wildtyp- und db^3J/db^3J-Mäusen. Sowohl cDNA, als auch genomische DNA aus der extrazellulären Region von Lepr wurde unter Verwendung von DNA von 129 db^3J/db^3J- und Wildtyp-Mäusen PCR amplifiziert. In beiden Fällen war das PCR-Produkt in den mutierten Mäusen kürzer. Alle Primer sind aus der OB-R kodierenden Region, außer 3JR2, welcher intronisch ist, so dass das amplifizierte Produkt aus der genomischen DNA auf einem Agarosegel getrennt werden kann.
9. Das PCR-Produkt von db^3J/db^3J-Mäusen wurde sequenziert. Eine Deletion von 17 bp wurde in dieser Mutante identifiziert. Dieselbe Deletion wurde sowohl in der genomischen DNA, als auch in der cDNA identifiziert.
10. Schema der Leptinrezeptor-Mutationen. Das vorausgesagte Protein von jedem der Lepr-Allele ist gezeigt. Die Nummern am Ende von jedem Rezeptor stellen den Aminosäurerest am Carboxylterminus dar. Die kurze gerade Linie am Ende des db^3J/db^3J-Diagramms stellt die 11 zusätzlichen Reste dar, welche der Aminosäure 625 folgen, welche durch eine Leserahmenverschiebung verursacht werden.
11. PCR-Primer und Strategien zur Amplifikation von OB-Re und OB-Re-Mutanten. Die Pfeile stellen PCR-Primer dar (Tabelle 2, infra), welche mit Nummern markiert sind, alle 1°-PCR-Reaktionen wurden mit einer OB-Re-cDNA-Matrize durchgeführt, alle 2°-PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von Gemischen gleicher Mengen der entsprechenden 1°-PCR-Produkte als Matrize durchgeführt.
12. Schema des Leptinbindungs-Experiments. Das Schema zeigt eine kompetitive Hemmung von rekombinantem OB-Re, welcher an Leptin-SEPHAROSE bindet, mit einem freien Leptin.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Aspekte und Ausführungsformen der folgenden detaillierten Beschreibung, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.
Die vorliegende Offenbarung betrifft die Aufklärung und Entdeckung eines Proteins, welches hier OB-Rezeptor (OB-R) oder Leptinrezeptor genannt wird, von Nukleinsäuren, welche das Protein kodieren, einschließlich des OB-R-Gens (hier auch DB genannt – es sollte erwähnt werden, dass, wenn nur Großbuchstaben verwendet werden, ein natürliches Protein oder Gen bezeichnet wird, alle Kleinbuchstaben ein mutiertes Protein oder Gen bezeichnen, kursive Buchstaben ein Gen oder ein Nukleinsäuremolekül anzeigen und normale Buchstaben ein Protein oder ein Polypeptid anzeigen), einschließlich degenerierter Variationen davon, z. B., welche optimale Codons zur Expression in einem bestimmten Expressionssystem einschließen, wobei das Protein die Fähigkeit zeigt, an der Kontrolle des Säugetier-Körpergewichts teilzunehmen. Insbesondere zeigt das Protein die Fähigkeit, Leptin zu binden. In einer spezifischen Ausführungsform vermittelt das Protein eine Signaltransduktion bei der Bindung an Leptin.
Der OB-Rezeptor, so wie hier offenbart, kann drei wichtige strukturelle Domänen enthalten: eine extrazelluläre (oder extracytoplasmatische) Domäne, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne. Von der extrazellulären Domäne wird angenommen, dass sie Leptin, Leptin-Proteinkomplexe (wie Leptin, welches an einen löslichen Leptinrezeptor gebunden ist) bindet, und möglicherweise andere Proteine oder Liganden binden kann. In der Tat bindet die extracytoplasmatische Domäne, so wie hier gezeigt, Leptin mit sehr hoher Affinität und schließt zwei Leptin-Bindungsstellen ein. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst ein Rezeptor, so wie hier offenbart, nur eine extrazelluläre Domäne, d. h. es ist ein löslicher Rezeptor. Die Transmembrandomäne umfasst einen Abschnitt von stark nicht polaren Aminosäureresten, welcher in der hydrophoben Region der Zellmembran liegt. In dieser Hinsicht hat der Begriff Transmembrandomäne seine gebräuchliche Bedeutung in der Molekular- und Zellbiologie. Schließlich kann die cytoplasmatische Domäne eines OB-Rezeptors, so wie hier offennbart, keine, eine oder zwei JAK-bindende Konsensussequenzen enthalten, welche "Box 1" und "Box 2" genannt werden. Für einen Rezeptor, welcher "Box 1" und "Box 2" aufweist, wird angenommen, dass er kompetent für eine Signaltransduktion über den JAK-Stat-Weg beim Binden eines Liganden, z. B. Leptin, ist.
Weiterhin wurde identifiziert, dass das Protein mehrere Spleißformen aufweist. In einem Aspekt führen die Spleiß-Variationen zu einer Divergenz der C-terminalen Sequenzen. Daher kann das Protein in einer sezernierten Form gefunden werden, von der angenommen wird, dass sie die Leptinaktivität fördert, es kann als ein integraler Membranrezeptor gefunden werden, welcher den Leptintransfer über die Blut-Hirn-Schranke unterstützen kann, dem aber Domänen fehlen, welche an der Signaltransduktion beteiligt sind, und es kann als ein integraler Membranrezeptor gefunden werden, welcher Domänen enthält, die an der Signaltransduktion beteiligt sind. In einem anderen Aspekt führen die Spleißvariationen zu einer Divergenz der N-terminalen Polypeptidsequenz.
Die betrachteten Nukleinsäuren stellen die kodierenden Sequenzen dar, welche dem tierischen, insbesondere dem Mäuse- und humanen OB-R-Polypeptid entsprechen, von welchem durch Vermitteln (oder das Versagen zu vermitteln) der Signaltransduktion beim Binden von Leptin angenommen wird, dass es eine wichtige Rolle bei der Regulation des Körpergewichts und der Adiposität spielt. Die hier dargestellten Daten weisen darauf hin, dass eine Spleißvariante des Polypeptidprodukts einer Nukleinsäure, so wie hier offenbart, durch die Zellen sezerniert werden kann, welche es exprimieren, oder es kann als ein integrales Membranprotein exprimiert werden. In beiden Fällen wirkt das Polypeptid als ein Leptinrezeptor durch das Binden an Leptin. Zusätzliche experimentelle Daten legen nahe, dass die natürlich vorkommende Spleißform des OB-R-Polypeptids sehr wirksam beim Behandeln von Fettleibigkeit in Mäusen ist, welche eine Mutation des ob-Gens tragen.
Zusätzlich zeigen die Beispiele hier, dass mRNA, welche das OB-R-Polypeptid kodiert, welches hier alternativ "Leptinrezeptor" genannt wird, im Hypothalamus, den Hoden und den Fettzellen exprimiert wird. Die Daten zeigen ebenfalls eine Expression des Proteins im Plexus Choroideus.
In einem weiteren Aspekt ist das OB-R-Polypeptid einer Art eng verwandt (homolog) mit dem OB-R einer anderen Art. Insbesondere ist das humane OB-R-Polypeptid hoch homolog zu dem Mäuse-OB-R-Polypeptid. Diese Beobachtung stimmt mit den Daten überein, welche zeigen, dass humanes Leptin in Mäusen aktiv ist: wenn das Hormon zwischen den Arten aktiv ist, würde man ebenfalls einen hohen Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen den Rezeptoren von verschiedenen Arten erwarten.
In seinem ersten Aspekt ist die vorliegende Offenbarung auf die Identifikation von Materialien gerichtet, welche als Modulatoren des Säugetier-Körpergewichts wirken. Insbesondere betrifft diese Offenbarung die Isolierung, Reinigung und Sequenzierung bestimmter Nukleinsäuren, welche dem OB-R-Gen (hier und in der Literatur. alternativ als DB bezeichnet) oder seiner kodierenden Region sowohl in Mäusen, als auch in Menschen entsprechen, sowie der entsprechenden Polypeptide, welche durch diese Nukleinsäuren exprimiert werden. Diese Offenbarung umfasst daher die Entdeckung von Nukleinsäuren, welche die Nukleotidsequenzen aufweisen, die in den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9 dargelegt sind, und die degenerierten Varianten, Allele und Fragmente davon, welche alle die Aktivität besitzen, das Körpergewicht und die Adiposität zu modulieren. Die Entsprechung der vorliegenden Nukleinsäuren mit dem OB-R-Gen weist auf ihren erheblichen Einfluss auf Zustände, wie Fettleibigkeit, sowie andere Krankheiten und Fehlfunktionen, in denen Abnormalitäten im Körpergewicht einen beitragenden Faktor darstellen, hin. Diese Offenbarung erstreckt sich auf die Proteine, welche durch die hier offenbarten Nukleinsäuren exprimiert werden, und insbesondere auf jene Proteine, welche in den SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10 dargelegt sind, sowie auf die konservierten Varianten und aktiven Fragmente.
Von besonderem Interesse sind verschiedene Spleißvarianten von OB-R, z. B. wie durch OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc, OB-Rd und OB-Re dargestellt. Die vorliegende Offenbarung nimmt ebenfalls andere OB-R-Spleißvarianten vorweg.
Daher betrifft in spezifischen Ausführungsformen der Begriff OB-R Spleißvarianten wie folgt (die Aminosäuren-Nummerierung entspricht der Nummerierung, die für Mäuse-OB-R angewendet wurde [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)], welche hier angewendet wurde):
ein N-Terminus, welcher OB-Ra bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und ein C-Terminus, welcher einem C-Terminus entspricht, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd nach Lys⁸⁸⁹,
ein N-Terminus, welcher OB-Rb oder OB-Rc bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra oder OB-Rd nach Lys⁸⁸⁹ entspricht,
ein N-Terminus, welcher OB-Rd bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb oder OB-Rc entspricht,
ein N-Terminus, welcher OB-R von Pro⁶⁶⁴ bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht,
ein N-Terminus, welcher OB-R von Met⁷³³ bis Lys⁸⁸⁹ entspricht, und ein C-Terminus, welcher OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd entspricht,
ein N-Terminus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus OB-Ra, OB-Rb, OB-Rd und OB-R von Pro⁶⁶⁴ bis His⁷⁹⁶ und OB-Re von His⁷⁹⁶, und
ein N-Terminus, welcher OB-R von Met⁷³³ bis His⁷⁹⁶ entspricht, und OB-Re von His⁷⁹⁶.
Verschiedene Formen des OB-R, welche als Agonisten (z. B. die natürlich vorkommende, sezernierte Form des OB-R) oder Antagonisten (z. B. eine verkürzte Form des OB-R, welche nur Leptin bindet) wirken können, können in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem geeigneten Träger und in einer Stärke, welche wirksam zur Verabreichung durch verschiedene Hilfsmittel an einen Patienten ist, welcher abnormale Fluktuationen im Körpergewicht oder der Adiposität durchmacht, entweder alleine oder als Teil eines nachteiligen medizinischen Zu stands, wie Krebs oder AIDS, zur Behandlung davon hergestellt werden. Eine Vielzahl von Verabreichungstechniken kann verwendet werden, unter ihnen orale Verabreichung, nasal und andere Formen der transmukosalen Verabreichung, parenterale Techniken, wie subkutane, intravenöse und intraperitoneale Injektionen, Katheterisierungen und desgleichen. Geeignete Mengen der löslichen OB-R-Moleküle können variieren und sollten insbesondere auf den Empfehlungen und der Verschreibung eines qualifizierten Arztes oder Tierarztes basieren.
Gemäß dem oben Genannten kann ein Assaysystem zum Screenen möglicher Arzneimittel, welche wirksam sind, um die Aktivität von Leptin nachzuahmen oder ihr entgegenzuwirken, hergestellt werden. Das zukünftige Arzneimittel kann mit einer löslichen Form des OB-R in Kontakt gebracht werden oder kann alternativ mit Zellen verwendet werden, welche eine Rezeptorform von OB-R exprimieren, um zu bestimmen, ob es an OB-R bindet oder ihn aktiviert (oder ihm entgegenwirkt). Zum Beispiel kann in einem Expressions-Assaysystem die Kultur untersucht werden, um irgendwelche Änderungen in der Aktivität der Zellen zu beobachten, entweder aufgrund des Hinzufügens des zukünftigen Arzneimittels alleine oder aufgrund der Wirkung von hinzugefügten Mengen des bekannten Gewichtsmodulators Leptin.
Wie zuvor festgestellt hat die molekulare Klonierung des hier beschriebenen OB-R-Gens zur Identifikation einer Klasse von Materialien geführt, welche auf der molekularen Ebene wirken, um das Säugetier-Körpergewicht zu modulieren. Die Entdeckung der wie hier offenbarten Modulatoren hat wichtige Folgen für die Diagnose und Behandlung von Ernährungsstörungen, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf, Fettleibigkeit, Gewichtsverlust, welcher mit Krebs verbunden ist, und der Behandlung von Krankheiten, die mit Fettleibigkeit verbunden sind, wie Bluthochdruck, Herzkrankheit und Typ II-Diabetes. Zusätzlich gibt es mögliche landwirtschaftliche Verwendungen für das Genprodukt in Fällen, in denen gewünscht werden könnte, das Körpergewicht von Tieren zu modulieren. Die Diskussion, die mit spezifischer Bezugnahme auf das OB-R-Gen folgt, hat allgemeine Anwendbarkeit auf die Klasse der Modulatoren, welche einen Teil der vorliegenden Offen barung umfassen, und es sollte ihr daher eine solche Breite und ein Umfang der Interpretation gewährt werden.
In einer bestimmten Ausführungsform kann die funktionelle Aktivität des OB-R-Polypeptids transgen überprüft werden. Das OB-R-Gen kann in Komplementationsstudien verwendet werden, welche transgene Mäuse einsetzen. Transgene Vektoren, einschließlich viraler Vektoren, oder Kosmid-Klone (oder Phagen-Klone), welche dem Wildtyp-Locus des Kandidatengens entsprechen, können unter Verwendung des isolierten OB-R-Gens konstruiert werden. Kosmide können unter Verwendung veröffentlichter Verfahren in transgene Mäuse eingeführt werden [Jaenisch, Science, 240: 1468–1474 (1988)]. Die Konstrukte werden in befruchtete Eier eingeführt, welche aus einer untereinander durchgeführten Kreuzung (engl.: intercross) zwischen F1-Nachkommen eines C57BL/6J db/db X DBA intercross abgeleitet wurden. Der Genotyp an den db-Loci in transgenen Kosmid-Tieren kann durch Typisieren von Tieren mit eng verbundenen RFLPs oder Mikrosatelliten bestimmt werden, welche die Mutation flankieren und welche zwischen den Vorläuferstämmen polymorph sind. Eine Komplementation wird gezeigt werden, wenn ein bestimmtes Konstrukt ein genetisch fettleibiges F2-Tier (wie durch die RFLP-Analyse gezeigt) mager und nicht diabetisch macht. Unter diesen Umständen wird ein endgültiger Beleg der Komplementation erfordern, dass das db/db-Tier, welches das Transgen trägt, mit den db/db-Ovartransplantaten gepaart wird. In dieser Kreuzung werden alle N2-Tiere, welche das Transgen nicht tragen, fettleibig und insulinresistent/diabetisch sein, während jene, welche das Transgen tragen, mager sein werden und normale Glucose- und Insulinkonzentrationen im Plasma aufweisen werden. In einem genetischen Sinn wirkt das Transgen als eine Suppressormutation.
Alternativ können OB-R-Gene durch Überprüfen ihrer phänotypischen Wirkungen getestet werden, wenn sie in Antisense-Orientierung in Wildtyp-Tieren exprimiert werden. In diesem Ansatz wird die Expression des Wildtyp-Allels unterdrückt, was zu einem mutierten Phänotyp führt. Die RNA-RNA-Doppelhelixbildung (antisensesense) verhindert eine normale Handhabung der mRNA, was zu einer teilweisen oder vollständigen Beseitigung der Wildtyp-Genwirkung führt. Diese Technik wurde verwendet, um die TK-Synthese in Gewebekultur zu inhibieren, und um Phänotypen der Krüppel-Mutation in Drosophila und die Shiverer-Mutation in Mäusen herzustellen [Izant et al., Cell, 36: 1007–1015 (1984), Green et al., Annu. Rev. Biochem., 55: 569–597 (1986), Katsuki, et al., Science, 241: 593–595 (1988)]. Ein wichtiger Vorteil dieses Ansatzes ist, dass nur ein kleiner Abschnitt des Gens für eine wirksame Inhibition der Expression der gesamten verwandten mRNA exprimiert zu werden braucht. Das Antisense-Transgen wird unter die Kontrolle seines eigenen Promotors oder eines anderen Promotors gebracht, welcher in dem richtigen Zelltyp exprimiert wird, und wird strangaufwärts von der SV40-polyA-Stelle platziert. Dieses Transgen kann verwendet werden, um transgene Mäuse zu erzeugen. Transgene Mäuse können ebenfalls gepaarte Ovartransplantate sein, um zu testen, ob ob-Heterozygote sensibler auf die Wirkungen des Antisense-Konstrukts sind.
Langfristig ist das OB-R-Genprodukt (das OB-R-Polypeptid oder -Protein) zum Identifizieren kleiner Molekülagonisten und -antagonisten geeignet, welche seine Aktivität beeinflussen.
Verschiedene Begriffe, welche innerhalb dieser Spezifikation verwendet werden, sollen die hier, zum Beispiel unten, dargelegten Definitionen aufweisen.
Der Begriff "Körpergewichtsmodulator", "Modulator", "Modulatoren" und irgendwelche Varianten, welche nicht spezifisch ausgeführt sind, können hier austauschbar verwendet werden und betreffen, wie sie innerhalb der vorliegenden Anmeldung und den Ansprüchen verwendet werden, in einem Fall sowohl Nukleotide, als auch proteinartiges Material, wobei letzteres sowohl einzelne als auch mehrere Proteine einschließt. Spezifischer erstrecken sich die zuvor erwähnten Begriffe auf die Nukleotide und die DNA, welche die hier beschriebenen Sequenzen aufweist und in den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9 dargestellt sind. Ebenso sind die Proteine, welche die hier beschriebenen Aminosäure-Sequenzdaten aufweisen und in den SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10 dargestellt werden, ebenso eingeschlos sen, wie es das Aktivitätsprofil ist, welches bezüglich aller Materialien, sowohl hier, als auch in den Ansprüchen, dargestellt ist.
Eine spezifische Bindung an Leptin bedeutet, dass Leptin ein Ligand für OB-R ist, da dieser Begriff verwendet wird, um die Liganden-Rezeptor-Bindung zu beschreiben. Im Allgemeinen wird eine solche Bindung eine Affinität aufweisen, die durch eine Assoziationskonstante von größer als 1 × 10⁷M^–1, vorzugsweise größer als 1 × 10⁸M^–1 und weiter bevorzugt größer als 1 × 10⁹M^–1 dargestellt ist. Die genaue Assoziationskonstante kann jedoch variieren.
Eine Homologie mit gp130 betrifft die Konservierung von Resten, insbesondere von Cysteinresten, Motiven und anderen wichtigen Resten. Der Begriff "gp130" wird hier verwendet, um im Allgemeinen die Klasse 1-Cytokinrezeptor-Familie zu bezeichnen, insbesondere den Interleukin-6(IL-6)-Rezeptor, den Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor(G-CSF)-Rezeptor, den ziliären neurotrophen Faktor(CNTF)-Rezeptor und den Leukämie inhibierenden Faktor(LIF)-Rezeptor.
Zusätzlich werden Nukleotide, welche eine im Wesentlichen äquivalente oder veränderte Aktivität zeigen, ebenso eingeschlossen, einschließlich von im Wesentlichen ähnlichen Analoga und allelischen Variationen. Ebenso werden Proteine, welche eine im Wesentlichen äquivalente oder veränderte Aktivität zeigen, einschließlich von Proteinen, welche absichtlich modifiziert wurden, wie zum Beispiel durch stellengerichtete Mutagenese oder unbeabsichtigt durch Mutationen in Wirten, welche die Modulatoren herstellen, ebenso eingeschlossen.
Der Begriff "Allelvarianten" betrifft das entsprechende Gen in verschiedenen Individuen, das Punktmutationen aufweisen kann. Zum Beispiel stellen die verschiedenen ob-Mutationen Allelvarianten von OB-R dar.
Der Begriff "homolog" oder "Homologa" in all seinen grammatikalischen Formen schließt spezifisch das entsprechende Gen oder Protein aus einer anderen Art ein. In einer spezifischen Ausführungsform ist ein Homolog des Mäuse-OB-R humaner OB-R. Der Begriff kann ebenfalls Gene oder Proteine einschließen, welche mutiert oder verändert sind, z. B. durch Substitution von Aminosäurerest-Varianten von einer Art in das Polypeptid einer anderen, um einem analogen Gen oder Protein zu entsprechen, als ob es von einer anderen Art ist. Wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, können homologe Gene einfach durch Sequenzähnlichkeit, Hybridisierung mit Sonden, welche spezifisch für das Gen in einer anderen Art sind, Nachweis durch eine PCR-Analyse unter Verwendung von Primern für eine andere Art oder durch Kartieren auf eine syntenische Lage auf dem Chromosom identifiziert werden, um nur einige solcher Verfahren zu erwähnen. Eine Proteinhomologie kann durch Antikörper-Kreuzreaktivität, ein ähnliches Protease-Spaltprofil, vergleichbare/s Molekulargewicht und isoelektrische Punkte und eine ähnliche Sekundär- oder Tertiärstruktur nachgewiesen werden, um einige der gut bekannten Tests für homologe Proteine zu erwähnen.
Der Begriff "im Wesentlichen ähnlich", so wie hier in Bezug auf Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen verwendet, bedeutet mindestens 50% Sequenzähnlichkeit, vorzugsweise mindestens 60% Sequenzähnlichkeit, weiter bevorzugt mindestens 70% Sequenzähnlichkeit, noch weiter bevorzugt mindestens 80% Sequenzähnlichkeit und am meisten bevorzugt mindestens 90% Sequenzähnlichkeit.
Der Begriff "Gen", so wie hier verwendet, betrifft eine Nukleinsäure, wie DNA, welche bei Expression für ein Protein kodiert. Wenn es nicht anders angegeben ist, kann Gen mRNA, cDNA oder genomische DNA einschließen.
Eine Zusammensetzung, welche "A" umfasst (wobei "A" ein einzelnes Protein, DNA-Molekül, ein Vektor, eine rekombinante Wirtszelle, usw. ist), ist im Wesentlichen frei von "B" (wobei "B" ein oder mehrere kontaminierende Proteine, DNA-Moleküle, Vektoren, usw. umfasst, aber racemische Formen von A ausschließt), wenn mindestens 75 Gew.-% der Proteine, DNA, Vektoren (abhängig von der Kategorie der Spezies, zu welcher A und B gehören) in der Zusammensetzung "A" sind. Vorzugsweise umfasst "A" mindestens ungefähr 90 Gew.-% der A + B- Spezies in der Zusammensetzung, am meisten bevorzugt mindestens ungefähr 99 Gew.-%. Es ist ebenfalls bevorzugt, dass eine Zusammensetzung, welche im Wesentlichen frei von einer Kontamination ist, nur eine einzelne Molekulargewichtsspezies enthält, welche die Aktivität oder die Eigenschaft der Spezies von Interesse aufweist.
Ei "BAC" ist ein künstliches bakterielles Chromosom (für engl.: bacterial artificial chromsome), "STS" betrifft eine sequenzmarkierte Stelle (für engl.: sequence tagged site), ein "YAC" ist ein künstliches Hefechromosom (für engl.: yeast artificial chromsome). Andere Begriffe haben die Standardbedeutungen welche gewöhnlich im Stand der Technik vorgesehen sind.
Die OB-R-Polypeptide
Die Begriffe "Protein", was das natürlich vorkommende Polypeptid betrifft, und "Polypeptid" werden hier bezüglich des OB-R-Genprodukts und Varianten davon austauschbar verwendet. Insbesondere betrifft OB-R irgendwelche der Spleißformen des OB-R(DB)-Genprodukts, wie das Produkt mit zwei JAK-Bindungsboxen in der cytoplasmatischen Domäne, das Produkt mit nur einer JAK-Bindungsbox in der cytoplasmatischen Domäne, das Produkt ohne Boxen und das sezernierte (lösliche) Produkt, ist aber nicht darauf beschränkt. Der Begriff OB-R betrifft ebenfalls verschiedene Spleißformen mit divergenten N-terminalen Aminosäuresequenzen.

Der Begriff OB-R umfasst spezifisch verschiedene Spleißformen des Polypeptids, einschließlich der Folgenden, aber nicht darauf beschränkt:

Spleißform	Eigenschaften	Spezifische Ausführungsform
OB-Ra	Transmembranprotein mit einer "Box 1", aber ohne "Box 2", von welchem erwartet wird, dass es Leptin bindet, aber nicht direkt die Signaltransduktion über JAKs vermittelt. Aufgebaut aus einer extrazellulären Domäne und einer verkürzten cytoplasmatischen Domäne. Der N-Terminus divergiert von der veröffentlichten OB-R-Sequenz strangaufwärts von Cys⁸⁸.	SEQ ID NR: 2
OB-Rb	Transmembranprotein, von welchen erwartet wird, dass es einen Leptin-Signalweg im Hypothalamus und anderen Zellen vermittelt, es enthält eine größere cytoplasmatische Domäne, welche sowohl eine "Box 1"-, als auch eine "Box 2"-Stelle enthält. Der N-terminale Abschnitt scheint verkürzt zu sein und divergiert von der veröffentlichten OB-R-Sequenz strangaufwärts von Pro⁶⁶⁴	SEQ ID NR: 4
OB-Rc	Entspricht OB-Rb mit einem Tripeptidrest C-terminal zu Lys⁸⁸⁹, eher als der längeren Sequenz, keine "Box 2"-Stelle.	SEQ ID NR: 6
OB-Rd	Entspricht dem veröffentlichten OB-R mit einer unterschiedlichen elf Aminosäuren langen Sequenz C-terminal von Lys⁸⁸⁹.	SEQ ID NR: 8
OB-Re	Löslicher/sezernierter Rezeptor mit einer Leptin-Bindungsdomäne. Ihm fehlt eine Transmembran- oder cytoplasmatische Domäne, aber er umfasst eine große extrazelluläre Domäne. Entspricht dem veröffentlichten OB-R bis His⁷⁹⁶, wo er divergiert.	SEQ ID NR: 10

Der Begriff OB-R umfasst spezifisch Spleißvarianten, welche verschiedene Elemente aus den oben erwähnten Varianten einschließen, z. B., wie oben beschrieben.
Insbesondere ist die vorliegende Offenbarung auf OB-R gerichtet, bei dem die N-terminale Signalsequenz gespalten ist. In einer Ausführungsform sind die Aminosäurereste 1–22 abgespalten. In einer anderen Ausführungsform sind die Aminosäurereste 1–27 abgespalten.
Wie oben erwähnt schließen in spezifischen Ausführungsformen die Polypeptide, wie sie hier offenbart werden, jene ein, welche die Aminosäuresequenzen aufweisen, die hier dargelegt sind, z. B. die SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10. Der Begriff schließt weiterhin Polypeptide ein, welche mit konservativen Aminosäuresubstitutionen modifiziert sind, sowie biologisch aktive Fragmente, Analoga und Derivate davon. In noch einer anderen Ausführungsform schließt der Begriff Polypeptide ein, in welchem ein oder mehrere Cystein-Rest/e oder Cystein-Paar/e mit Serin oder einem ähnlichen polaren oder neutralen Aminosäurerest, wie, aber nicht nötigerweise beschränkt auf, Threonin, Methionin oder Alanin ersetzt ist/sind.
Der Begriff "biologisch aktiv" wird hier verwendet, um eine spezifische Wirkung des Polypeptids zu betreffen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die spezifische Bindung, z. B. an Leptin, einen Anti-OB-R-Antikörper oder ein anderes Erkennungsmolekül, die Aktivierung von Signaltransduktionswegen auf einer molekularen Ebene und/oder die Induktion (oder Inhibition durch Antagonisten) von physiologischen Wirkungen, welche durch das native Leptin in vivo vermittelt werden. OB-R-Polypeptide, einschließlich von Fragmenten, Analoga und Derivaten können synthetisch hergestellt werden, z. B. unter Verwendung der gut bekannten Techniken der Festphasen- oder Lösungsphasen-Peptidsynthese. Vorzugsweise werden synthetische Festphasentechniken eingesetzt. Alternativ können OB-R-Polypeptide, wie hier offenbart, unter Verwendung gut bekannter gentechnischer Techniken, wie infra beschrieben, hergestellt werden. In noch einer anderen Ausführungsform kann die lösliche Form des OB-R-Polypeptids gereinigt werden, z. B. durch eine Immunaffinitätsreinigung, aus einer biologischen Flüssigkeit, wie, aber nicht beschränkt auf, Plasma, Serum oder Urin, vorzugsweise humanes Plasma, Serum oder Urin und weiter bevorzugt von einem Individuum, welches das Polypeptid überexprimiert.
Die Struktur des OB-R-Polypeptids, vorzugsweise des humanen OB-R-Polypeptids kann durch verschiedene Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, analysiert werden. Die Proteinsequenz kann durch eine Hydrophilizitätsanalyse charakterisiert werden (z. B. Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 3824 (1981)]. Ein Hydrophilizitätsprofil kann verwendet werden, um die hydrophoben und hydrophilen Regionen des OB-R-Polypeptids zu identifizieren, welche Regionen, die im Inneren des gefalteten Polypeptids verborgen sind, die Transmembrandomäne und Regionen, welche auf der Außenseite des Polypeptids zugänglich sind, anzeigen können. Zusätzlich kann ebenfalls eine Sekundärstrukturanalyse (z. B. Chou et al., Biochem., 13: 222 (1974)] durchgeführt werden, um Regionen des OB-R-Polypeptids zu identifizieren, welche spezifische Sekundärstrukturen annehmen. Eine Manipulation der vorhergesagten oder bestimmten Struktur, einschließlich der Sekundärstrukturvorhersage, kann unter Verwendung von Computer-Softwareprogrammen erreicht werden, welche im Stand der Technik verfügbar sind.
Durch Bereitstellen einer häufigen Quelle des rekombinanten OB-R-Polypeptids ermöglicht die vorliegende Offenbarung eine quantitative strukturelle Bestimmung des Polypeptids. Insbesondere wird ausreichend Material für eine kernmagnetische Resonanz(NMR)-, Infrarot(IR)-, Raman- und Ultraviolett(UV)-, insbesondere eine zirkulare Dichroismus(CD)-, spektroskopische Analyse bereitgestellt. Insbesondere eine NMR stellt eine sehr leistungsstarke Strukturanalyse von Molekülen in Lösung bereit, was ihrer nativen Umgebung stärker näher kommt [Marion et al., Biochim. Biophys. Res. Comm. 113: 967–974 (1983), Bar et al., J. Magn. Reson., 65: 355–360 (1985), Kimura et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 77: 1681–1685 (1980)]. Andere Verfahren der Strukturanalyse können ebenfalls eingesetzt werden. Diese schließen Röntgenkristallographie ein, sind aber nicht darauf beschränkt [Engstom, Biochem. Exp. Biol., 11: 7–13 (1974)]. In einem bevorzugten Aspekt wird entweder eine lösliche Form oder eine membranbindende Form von OB-R mit Leptin kokristallisiert, um strukturelle Information über beide Moleküle bereitzustellen. In einem weiter bevorzugten Ausführungsform wird OB-R oder lösliches OB-R, welchem eine oder mehrere Cystein-Vernetzung/en fehlt/en, verwendet, um Kristalle oder Kokristalle mit Leptin zu bilden.
In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein Analogon des OB-R-Polypeptids getestet werden, um zu bestimmen, ob es mit einem Antikörper, welcher spezifisch für das native OB-R-Polypeptid oder spezifisch für Fragmente davon ist, kreuzreagiert. Der Grad der Kreuzreaktivität stellt Information über strukturelle Homologie oder Ähnlichkeit der Proteine bereit, oder über die Zugänglichkeit von Regionen, welche Abschnitten des Polypeptids entsprechen, die verwendet wurden, um Fragment spezifische Antikörper zu erzeugen.
Fragmente des OB-R-Polypeptids
In einer besonderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Offenbarung, dass natürlich vorkommende Fragmente oder verkürzte Formen des OB-R-Polypeptids wichtig sein können. Wie oben erwähnt wurde, wurde eine große Anzahl von Spleißformen von OB-R gefunden. Daher umfasst die vorliegende Offenbarung eine natürlich vorkommende lösliche Form des OB-R, sowie integrale Membranformen, welche 0, 1 oder 2 JAK-Box-Konsensusstellen aufweisen. Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Spleißisoformen des Polypeptids sieht die vorliegende Offenbarung weiterhin rekombinant modifizierte Isoformen vor, z. B. durch Deletion von einer oder mehreren der cytoplasmatischen Domäne, der cytoplasmatischen Konsensusdomäne von der Transmembrandomäne bis zu Lysin 889, der Box 1 oder Box 2 oder von beiden Regionen, der cytoplasmatischen Domäne C-terminal von Lysin 889, der Transmembrandomäne, der Liganden-Bindungsdomäne, der extracytoplasmatischen Domäne oder Abschnitten davon.
Die vorliegende Offenbarung umfasst spezifisch lösliche verkürzte Formen von OB-R, welchen eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne fehlen. In einer spezifischen Ausführungsform ist das OB-R-Fragment OB-Re. In noch weiteren Ausführungsformen entspricht ein OB-R-Fragment, wie hier offenbart, dem N-terminalen Abschnitt von OB-Re, welcher Leptin bindet, z. B. OB-R von ungefähr Leu123 bis ungefähr Val331, dem C-terminalen Abschnitt von OB-Re, welcher Leptin bindet, z. B. OB-R von ungefähr Tyr420 bis ungefähr Pro641, einem Protein, welches den N- und C-terminalen Abschnitt von OB-Re aufweist, welcher Leptin mit sehr hoher Affinität bindet, z. B. OB-R von ungefähr Ser118 oder Leu123 bis ungefähr Pro641.
OB-R-Polypeptidchimären
Eine oder mehrere der Spleißformen der cytoplasmatischen Domäne können in einem chimären Konstrukt mit einer anderen Liganden bindenden Domäne verwendet werden, um eine Leptinbindung künstlich zu signalisieren [z. B. Capon et al., U.S. Patent Nr. 5,359,064 , erteilt am 25. Oktober 1994, Sanchez et al., J. Exp. Med., 178, 1049 (1993), Burkhardt et al., Mol. Cell. Biol., 14: 1095, Internationale Patentpublikationen WO 96/23814 , WO 96/23881 und WO 96/24671 , Kotenko et al., J. Biol. Chem. 271: 17174 (1996)]. In einer anderen Ausführungsform kann die extracytoplasmatische (Leptin bindende) Domäne mit einer unterschiedlichen cytoplasmatischen Signaltransduktionsdomäne verbunden werden oder alternativ mit einer Glykosyl-Phospatidylinositol-Linkerdomäne, um eine Aktivierung der Zellen über gp130 bereitzustellen.
Analoge des OB-R-Polypeptids
Die vorliegende Offenbarung umfasst spezifisch eine Präparation von Analoge des OB-R-Polypeptids, welche dadurch gekennzeichnet sind, dass sie zu einer biologischen Aktivität des OB-R-Polypeptids in der Lage sind, z. B. zum Binden an Leptin oder an einen Anti-OB-R-Antikörper. In einer Ausführungsform fördert das Analogon die OB-R-Aktivität. Vorzugsweise ist ein OB-R-Agonist wirksamer als das native Protein. Zum Beispiel kann ein OB-R-Agonistenanalogon mit größerer Affinität an Leptin binden, was das Signal verstärkt. Ein solches Analogon kann insbesondere für eine Gentherapie gewünscht sein, wo eine erhöhte Signaltransduktionswirksamkeit irgendeinen Mangel in der Menge der Rezeptorexpression kompensieren kann. In einer anderen Ausführungsform wirkt das Analogon der OB-R- Aktivität entgegen. Zum Beispiel kann ein OB-R-Analogon, welches an Leptin bindet und die Leptinbindung an einen signaltransduktionskompetenten OB-R inhibiert, kompetitiv die Bindung von nativem OB an den Rezeptor inhibieren, was die Leptinaktivität in vivo vermindert. Ein solches OB-R-Antagonistenanalogon ist vorzugsweise eine lösliche Form des OB-R.
In einer Ausführungsform ist ein Analogon des OB-R-Polypeptids das OB-R-Polypeptid, welches durch Substitution von Aminosäuren an Positionen des Polypeptids verändert ist, welche nicht essenziell für die Struktur oder Funktion sind. Da erwartet wird, dass das humane OB-R-Polypeptid in der Maus biologisch aktiv ist, wird zum Beispiel eine Substitution von divergenten Aminosäureresten in der humanen Sequenz, verglichen mit der Mäuse-Aminosäuresequenz wahrscheinlich geeignete Analoga des OB-R-Polypeptids ergeben. Zum Beispiel könnten die folgenden Reste im humanen OB-R [die Nummerierung der humanen OB-R-Aminosäuren verwendet die Nummerierungskonvention, welche in Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995) angewendet wird] mit einem divergenten Mäuserest substituiert werden, welcher an dieser Position gefunden wird, oder mit einer nicht konservativen Aminosäuresubstitution, wie eine oder mehrere von: Phe für Ser³⁶, Asp für Tyr⁴⁴, Ser für Leu⁴⁹, Pro für Ser⁵⁴, Leu für Ser⁶⁰, Ala für His⁶³, Ala für Thr⁶⁶, Ala für Pro⁷⁰, Ile für Thr⁷⁷, Tyr für His⁷⁸, Pro für Ser⁸⁰, Gly für Arg⁹², Gly für Asp⁹⁶, Thr für Ala¹⁰³ oder Ile¹⁰⁶, Ser für Leu¹¹⁸, Gly für Asp¹²⁴, Thr für Lys¹³⁸, Pro für Ser¹⁴⁶, Asp für Val¹⁶⁴, Leu für Gln¹⁷⁷, Asp für Gly¹⁷⁹, Gly für Glu¹⁹², Deletion für Cys¹⁹³, His für Leu¹⁹⁷, Ser für Ile²²¹, Leu für Asn²³³, Leu für Ser²⁷³, Deletion für Thr²⁷⁸, Ala für Asp²⁸⁵, Glu für Lys²⁸⁶, Ser für Gly³¹⁰, Arg für Met³⁷⁰, Ile für Ser³⁷⁹, Ser für Phe³⁹⁴ Ala für Glu⁴¹⁷, Gly für Glu⁴⁵⁹, Ser für Ile⁴⁷⁶, Thr für Ile⁴⁸², Thr für Ile⁵⁵¹, His für Tyr⁵⁸⁶, Lys für Ile⁶⁴⁸, Ala für Ser⁶⁸⁶, His für Cys⁶⁸⁷, Thr für Ile⁷⁵⁹, Ile für Asn⁷⁷⁶, Asp für Gly⁷⁸¹, Gly für Glu⁷⁸², Gly für Ser⁸²⁷, Ala für Asp⁸³², Arg für Pro⁸⁹², Thr für Glu⁸⁹³, Asp für Thr⁸⁹⁴ oder Leu für Glu⁸⁹⁶.
Ebenfalls durch die vorliegende Offenbarung eingeschlossen sind Analoga, welche konservative Aminosäuresubstitutionen umfassen. Zum Beispiel können eine oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Amino säure mit einer ähnlichen Polarität, welche als ein funktionelles Äquivalent wirkt, substituiert werden, was zu einer stillen Veränderung führt. Substituenten für eine Aminosäure innerhalb der Sequenz können aus anderen Mitgliedern der Klasse ausgewählt werden, zu welcher die Aminosäure gehört. Zum Beispiel schließen die nicht polaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin ein. Die polaren neutralen Aminosäuren schließen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin ein. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren schließen Arginin, Lysin und Histidin ein. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren schließen Asparaginsäure und Glutaminsäure ein. In einigen Fällen kann eine polare Aminosäure mit einer anderen substituiert werden, um die lokale Hydrophilizität zu erhalten, wahrscheinlicher wird eine Substitution benötigt, welche die Ladung erhält oder wenigstens nicht die entgegengesetzte Ladung einführt. Von solchen Veränderungen wird nicht erwartet, dass sie das sichtbare Molekulargewicht, wie durch eine Polyacrylamid-Gelelektrophose bestimmt, oder den isoelektrischen Punkt beeinflussen.
In noch einer anderen Ausführungsform können Aminosäurereste mit Resten substituiert werden, um Analoga des OB-R-Polypeptids zu bilden, welche eine verstärkte Neigung zum Bilden von Sekundärstrukturen zeigen, oder welche stabilere Sekundärstrukturen bilden. Zum Beispiel würde eine α-Helix-Struktur bevorzugt werden, wenn Glu, Ala, Leu, His, Trp als Substituenten für Aminosäurereste eingeführt werden, die im nativen OB-Polypeptid gefunden werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen eingesetzt, z. B. Substituieren von Asparaginsäure mit Glutaminsäure/n (Glu), Substituieren von Isoleucin/en mit Leucin, Substituieren von Glycin oder Valin oder irgendeiner divergenten Aminosäure (d. h. einer Aminosäure, welche nicht zwischen OB-R von verschiedenen Arten konserviert ist) mit Alanin (z. B. Serin an Position 273 des humanen OB-R-Polypeptids mit Alanin), Substituieren von Arginin oder Lysin mit Histidin und Substituieren von Tyrosin und/oder Phenylalanin mit Tryptophan. Erhöhen des Grads oder wichtiger der Stabilität der α-Helix-Struktur kann ein OB-R-Analogon mit größerer Aktivität, erhöhter Bindungsaffinität oder längerer Halbwertszeit ergeben.
Ebenfalls eingeschlossen sind verkürzte OB-R-Polypeptid-Analoga, welche Struktur bildende, z. B. Helix bildende, Aminosäurereste umfassen, um die größere Neigung von Polypeptidfragmenten zu kompensieren, keine stabile Struktur auszubilden.
In einer anderen Ausführungsform ist ein Analogon des OB-R-Polypeptids, vorzugsweise das humane OB-R-Polypeptid, eine verkürzte Form des Polypeptids. Zum Beispiel wurde bereits gezeigt, dass die Transmembrandomäne nicht essenziell ist, da eine natürlich vorkommende Isoform des Polypeptids durch eine cDNA kodiert wird, welche ein lösliches Protein exprimiert. Ähnlich kann es möglich sein, einige oder alle der divergenten Aminosäurereste in humanem OB-R (verglichen mit dem Mäuse-OB-R) zu deletieren. Zusätzlich umfasst diese Offenbarung das Bereitstellen eines OB-R-Analogons mit der minimalen Aminosäuresequenz, welche für eine biologische Aktivität nötig ist. Diese kann einfach bestimmt werden, z. B. durch Testen der Aktivität von Fragmenten des OB-R auf die Fähigkeit, an OB-R spezifische Antikörper zu binden, die Aktivität des nativen Leptins (durch kompetitive Bindung) zu inhibieren oder die Aktivität von nativem Leptin zu fördern.
Die vorliegende Offenbarung umfasst spezifisch das Bereitstellen einer löslichen Spleißform von OB-R, von der angenommen wird, dass sie die Leptinaktivität fördert. Insbesondere wird angenommen, dass OB-Rd (wie es hier bezeichnet wird) Leptin bindet und die Leptinbindung an OB-Rb vereinfacht (von welchem angenommen wird, dass es kompetent für eine Signaltransduktion ist). Daher scheint sich in dieser Ausführungsform OB-R analog zu anderen Rezeptorsystemen zu verhalten [Kishimoto et al., Cell, 76: 253 (1994), Davis et al., Science, 260: 1805 (1993), Davis et al., Science, 259: 1736 (1993)].
Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass die voranstehenden Fragmentgrößen angenähert sind, und dass zusätzliche Aminosäuren, z. B. von eins bis ungefähr fünf, an jedem oder an beiden Enden der zitierten verkürzten Analoga oder in das/aus dem Innere/n des Polypeptids oder von Fragmenten davon eingeschlossen oder deletiert werden können.
Analoga, wie Fragmente, können zum Beispiel durch Spaltung des OB-R hergestellt werden, z. B. mit Trypsin, Chymotrypsin, Pepsin, Papain, thrombolytischen Proteasen, Carboxypeptidase A, Proteinase K, usw. Andere Analoga, wie Muteine, können durch Standard-stellengerichtete Mutagenese von Gewichtsmodulator-Peptid kodierenden Sequenzen hergestellt werden.
Screening auf Leptinanaloga
Verschiedene Screeningtechniken sind im Stand der Technik zum Screenen auf Analoga von Polypeptiden bekannt. Verschiedene Chemikalien-Bibliotheken sind verfügbar. Folglich umfasst die vorliegende Offenbarung das Screenen solche Bibliotheken, z. B. Bibliotheken synthetischer Verbindungen, welche über die Jahre der Forschung erzeugt wurden, Bibliotheken natürlicher Verbindungen und kombinatorische Bibliotheken, wie sie detaillierter infra beschrieben werden, auf Analoga von Leptin. Diese Offenbarung umfasst das Screenen solcher Bibliotheken auf Verbindungen, die an OB-R binden, entweder in löslichen oder Transmembranformen. Vorzugsweise fördern solche Moleküle die Signaltransduktion durch OB-R oder wirken ihr entgegen. Daher umfasst die vorliegende Offenbarung Screens auf kleine Molekülliganden oder Ligandenanaloga und Imitatoren, sowie Screens auf natürliche Liganden, welche an aktivierten OB-Rezeptor in vivo binden und ihn fördern oder ihm entgegenwirken.
Kenntnis der Primärsequenz des Rezeptors und die Ähnlichkeit dieser Sequenz mit Proteinen bekannter Funktion kann einen anfänglichen Hinweis auf die Agonisten oder Antagonisten des Proteins bereitstellen. Die Identifikation und das Screening von Antagonisten werden weiterhin durch Bestimmen struktureller Eigenschaften des Proteins vereinfacht, z. B. unter Verwendung von Röntgenkristallographie, Neutronenbeugung, kernmagnetischer Resonanzspektrometrie und an deren Techniken zur Strukturbestimmung. Diese Techniken stellen das vernünftige Design oder die Identifikation von Agonisten und Antagonisten bereit.
Ein anderer Ansatz verwendet rekombinante Bakteriophagen, um große Bibliotheken herzustellen. Unter Verwendung des "Phagenverfahrens" [Scott et al., Science, 249: 386–390 (1990), Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6378–6382 (1990), Devlin et al., Science, 249: 404–406 (1990)] können sehr große Bibliotheken konstruiert werden (10⁶–10⁸ chemische Einheiten). Ein zweiter Ansatz verwendet hauptsächlich chemische Verfahren, von welchen das Geysen-Verfahren [Geysen et al., Molecular Immunology, 23: 709–715 (1986), Geysen et al., J. Immunologic Method, 102: 259–274 (1987)] und das derzeitige Verfahren von Fodor et al., Science, 251: 767–773 (1991) Beispiele darstellen. Andere Referenzen [Furka et al., 14. International Congress of Biochemistry, Volume 5, Abstract FR: 013 (1988), Furka, Int. J. Peptide Protein Res., 37: 487–493 (1991), Houghton ( U.S. Patent Nr. 4,631,211 , erteilt im Dezember 1986) und Rutter et al. ( U.S. Patent Nr. 5,010,175 , erteilt am 23. April 1991)] beschreiben Verfahren, um ein Gemisch aus Peptiden, welche als Agonisten oder Antagonisten getestet werden können, herzustellen.
In einem anderen Aspekt können synthetische Bibliotheken [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 10700–10704 (1993), Lam et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 92/00252 , Kocis et al., Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 94/28028 ] und desgleichen verwendet werden, um auf OB-Rezeptor-Liganden, wie hier offenbart, zu screenen.
Insbesondere können Assays für das Binden eines löslichen Liganden an Zellen, welche rekombinante Formen der OB-Rezeptor-Ligandenbindungsdomäne exprimieren, durchgeführt werden. Die löslichen Liganden können einfach als rekombinantes oder synthetisches Leptin-Polypeptid bereitgestellt werden.
Das Screening kann mit rekombinanten Zellen durchgeführt werden, welche den OB-Rezeptor exprimieren oder alternativ unter Verwendung von gereinigtem Re zeptorprotein, welches z. B. rekombinant hergestellt wurde, wie oben beschrieben. Zum Beispiel kann die Fähigkeit von markiertem, löslichem oder gelöstem OB-Rezeptor, welcher den Liganden-Bindungsabschnitt des Moleküls einschließt, einen Liganden zu binden, verwendet werden, um Bibliotheken zu screenen, wie in den voranstehenden Referenzen beschrieben wurde.
Derivate von OB-Polypeptiden
Im Allgemeinen kann eine lösliche Form des vorliegenden Polypeptids durch das Anheften von einem oder mehreren chemischen Resten an den Polypeptidrest derivatisiert werden. Die chemisch modifizierten Derivate können weiterhin für eine intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intravenöse, orale, nasale, rektale, buccale, sublinguale, pulmonale, topische, transdermale oder andere Wege der Verabreichung formuliert werden. Für eine chemische Modifikation von biologisch aktiven Proteinen wurde gefunden, dass sie unter bestimmten Umständen zusätzliche Vorteile bereitstellen, wie ein Erhöhen der Stabilität und Zirkulationszeit des therapeutischen Proteins und ein Vermindern der Immunogenizität [siehe das U.S. Patent Nr. 4,179,337 , Davis et al., erteilt am 18. Dezember 1979, für einen Überblick siehe Abuchowski et al., "Soluble Polymer-Enzyme Adducts", in Enzymes as Drugs, S. 367–383, Holcenberg und Roberts, Hrsg., Wiley-Interscience, New York, NY (1981)]. Ein Übersichtsartikel, welcher Proteinmodifikation und Fusionsproteine beschreibt, stellt Francis, Focus on Growth Factors, 3: 4–10 (1992) dar.
Chemische Reste zur Derivatisierung
Die chemischen Reste, welche zur Derivatisierung geeignet sind, können aus verschiedenen Polymeren, insbesondere wasserlöslichen Polymeren, ausgewählt werden. Das ausgewählte Polymer ist vorzugsweise wasserlöslich, so dass das Protein, an welches es angeheftet ist, in einer wässrigen Umgebung, wie einer physiologischen Umgebung, nicht präzipitiert. Apolare Polymere können jedoch ebenfalls verwendet werden, wenn eine bestimmte Anwendung von ihrer Verwen dung profitiert, z. B. in einer kontrollierten Freisetzungsmatrix, in welcher die Zugänglichkeit für Wasser beschränkt ist. Für eine therapeutische Verwendung der Endprodukt-Präparation wird das Polymer vorzugsweise pharmazeutisch verträglich sein. Der Fachmann wird in der Lage sein, das gewünschte Polymer, basierend auf solchen Überlegungen, ob das Polymer/Protein-Konjugat therapeutisch verwendet werden wird und wenn, die gewünschte Dosierung, Zirkulationszeit, Resistenz gegen Proteolyse und andere Überlegungen, auszuwählen. Für die vorliegenden Proteine und Peptide können diese unter Verwendung der hier bereitgestellten Assays nachgeprüft werden.
Polymermoleküle
Das wasserlösliche Polymer kann aus der Gruppe, bestehend aus zum Beispiel Polyethylenglykol, Copolymeren aus Ethylenglykol/Propylenglykol, Carboxymethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Poly-1,3-Dioxolan, Poly-1,3,6-trioxan, Ethylen/Maleinsäureanhydrid-Copolymeren, Polyaminosäuren (entweder Homopolymere oder zufällige Copolymere) und Dextran oder Poly(n-vinylpyrrolidon)polyethylenglykol, Propylenglykolhomopolymeren, Polypropylenoxid/Ethylenoxid-Copolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol, ausgewählt werden. Polyethylenglykolpropionaldehyd kann beim Herstellen aufgrund seiner Stabilität in Wasser Vorteile bereitstellen.
Das Polymer kann irgendein Molekulargewicht aufweisen und kann verzweigt oder unverzweigt sein. Für Polyethylenglykol liegt das bevorzugte Molekulargewicht zwischen ungefähr 2 kDa und ungefähr 100 kDa (wobei der Begriff "ungefähr" darauf hinweist, dass in Präparationen von Polyethylenglykol einige Moleküle mehr, einige weniger wiegen werden, als das angegebene Molekulargewicht) zur Einfachheit in der Handhabung und bei der Herstellung. Andere Größen können verwendet werden, abhängig von dem gewünschten therapeutischen Profil (z. B. der Dauer der gewünschten retardierten Freisetzung, der Wirkungen, wenn irgendwelche vorhanden sind, auf die biologische Aktivität, der Einfachheit in der Handha bung, des Grades oder des Fehlens der Antigenizität und anderer bekannter Wirkungen des Polyethylenglykols auf ein therapeutisches Protein oder Analogon).
Polymer/Protein-Verhältnis
Die Anzahl der Polypetid-Moleküle, welche an jedes Polymer angeheftet sind, kann variieren, und der Fachmann wird in der Lage sein, die Wirkung auf die Funktion festzustellen. Es kann monoderivatisiert werden, oder es kann eine di-, tri-, tetra- oder eine Kombination der Derivatisierung bereitgestellt werden, mit demselben oder verschiedenen chemischen Resten (z. B. Polymere, wie verschiedene Gewichte von Polyethylenglykolen). Das Verhältnis von Polymer-Molekülen zu Protein-(oder Peptid-)Molekülen wird variieren, wie ihre Konzentrationen im Reaktionsgemisch. Im Allgemeinen wird das optimale Verhältnis (im Sinne der Wirksamkeit der Reaktion, so dass es keinen Überschuss an nicht umgesetztem Protein oder Polymer gibt) durch Faktoren, wie dem gewünschten Grad der Derivatisierung (z. B. mono-, di-, tri-, usw.), dem Molekulargewicht des ausgewählten Polymers, ob das Polymer verzweigt oder unverzweigt ist und den Reaktionsbedingungen bestimmt.
Anheftung des chemischen Restes an das Protein
Die Polyethylenglykol-Moleküle (oder anderen chemischen Reste) sollten an das Protein unter Berücksichtigung von Wirkungen auf funktionelle oder antigene Domänen des Proteins angeheftet werden. Es gibt eine Anzahl von Anheftungsverfahren, welche dem Fachmann zur Verfügung stehen, z. B. die EP 0 401 384 (Koppeln von PEG an G-CSF). Siehe auch Malik et al., Exp. Hematol., 20: 1028–1035 (1992) (welche von der Pegylierung von GM-CSF unter Verwendung von Tresylchlorid berichtet). Zum Beispiel kann Polyethylenglykol kovalent über Aminosäurereste über eine reaktive Gruppe, wie eine freie Amino- oder Carboxylgruppe gebunden werden. Reaktive Gruppen sind jene, an welche ein aktiviertes Polyethylenglykol-Molekül gebunden werden kann. Die Aminosäurereste, welche eine freie Aminogruppe aufweisen, können Lysinreste und die N-terminalen Aminosäurereste einschließen, jene, welche eine freie Carboxylgruppe aufweisen, können Asparaginsäurereste, Glutaminsäurereste und den C-terminalen Aminosäurerest einschließen. Sulfhydrylgruppen können ebenfalls als reaktive Gruppe zur Anheftung des/der Polyethylenglykol-Moleküls/e verwendet werden. Bevorzugt für therapeutische Zwecke ist ein Anheften an eine Aminogruppe, wie ein Anheften an den N-Terminus oder eine Lysingruppe. Ein Anheften an Resten, welche wichtig für die Rezeptorbindung sind, sollte vermieden werden, wenn die Rezeptorbindung gewünscht ist.
N-terminal chemisch modifizierte Proteine
Es können spezifisch N-terminal chemisch modifizierte Proteine gewünscht werden. Unter Verwendung von Polyethylenglykol als Darstellung der vorliegenden Zusammensetzungen kann aus einer Vielzahl von Polyethylenglykol-Molekülen (nach Molekulargewicht, Verzweigung, usw.), dem Verhältnis von Polyethylenglykol-Molekülen zu Protein-(oder Peptid-)Molekülen im Reaktionsgemisch, dem Typ der durchzuführenden Pegylierungsreaktion und dem Verfahren zum Erhalten des ausgewählten N-terminal pegylierten Proteins ausgewählt werden. Das Verfahren zum Erhalten der N-terminal pegylierten Präparation (d. h. das Trennen dieses Restes von anderen monopegylierten Resten, wenn nötig) kann durch eine Reinigung des N-terminal pegylierten Materials aus einer Population von pegylierten Proteinmolekülen stattfinden. Eine selektive N-terminale chemische Modifikation kann durch eine reduktive Alkylierung erreicht werden, welche eine differenzielle Reaktivität von verschiedenen Typen primärer Aminogruppen (Lysin gegenüber dem N-Terminus) ausnutzt, die zur Derivatisierung in einem bestimmten Protein zur Verfügung stehen. Unter den geeigneten Reaktionsbedingungen wird eine im Wesentlichen selektive Derivatisierung des Proteins am N-Terminus mit einem Carbonylgruppe enthaltenden Polymer erreicht. Zum Beispiel kann das Protein selektiv N-terminal durch Durchführen der Reaktion bei einem pH-Wert pegyliert werden, welcher es erlaubt, den Vorteil der pK_s-Unterschiede zwischen den E-Aminogruppen der Lysinreste und dem der α-Aminogruppe des N-terminalen Restes des Proteins auszunutzen. Durch eine selektive Derivatisierung wird die Anhef tung eines wasserlöslichen Polymers an ein Protein kontrolliert: die Konjugation mit dem Polymer findet hauptsächlich am N-Terminus des Proteins statt, und es tritt keine erhebliche Modifikation von anderen reaktiven Gruppen, wie den Lysin-Aminogruppen der Seitenkette, auf. Bei einer Verwendung der reduktiven Alkylierung kann das wasserlösliche Polymer vom oben beschriebenen Typ sein und sollte ein einzelnes reaktives Aldehyd zum Koppeln an das Protein aufweisen. Polyethylenglykolpropionaldehyd, welches ein einzelnes reaktives Aldehyd enthält, kann verwendet werden.
Nukleinsäuren, die mit OB-R-Polypeptid verbunden sind
Wie oben erwähnt, ist die vorliegende Offenbarung auf Nukleinsäuren gerichtet, welche OB-R-Polypeptide kodieren, sowie auf damit verbundene genomische nicht kodierende Sequenzen 5', 3' und intronisch vom OB-R-Gen. Daher können gemäß der vorliegenden Offenbarung gängige Molekularbiologie-, Mikrobiologie- und rekombinante DNA-Techniken des Standes der Technik eingesetzt werden. Solche Techniken sind vollständig in der Literatur erklärt [siehe z. B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), Glover Hrsg., DNA Cloning: A Practical Approach, Band I und II, MRL Press, Ltd., Oxford, U.K. (1985), Gait Hrsg., Oligonucleotide Synthesis, Oxford University Press (1984), Harnes et al., Hrsg., Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag (1985), Harnes et al., Hrsg., Transcription and Translation, Oxford University Press (1984), Freshney, Hrsg., Animal Cell Culture, Oxford University Press (1986), Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press (1986), Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, Wiley, New York (1984)]. Von besonderer Bedeutung für die vorliegende Offenbarung sind Strategien zum Isolieren, Klonieren, Sequenzieren, Analysieren und Charakterisieren eines Gens oder einer Nukleinsäure, basierend auf den gut bekannten Techniken der Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Ein "Replikon" ist irgendein genetisches Element (z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus), welches als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo wirkt, d. h. in der Lage zur Replikation unter seiner eigenen Kontrolle ist.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, wie ein Plasmid, Phage oder Kosmid, an welches ein anderes DNA-Segment angeheftet sein kann, um die Replikation des angehefteten Segments zu bewirken.
Eine "Kassette" betrifft ein DNA-Segment, welches in einen Vektor an spezifischen Restriktionsstellen inseriert werden kann. Das DNA-Segment kodiert ein Polypeptid von Interesse, und die Kassette und die Restriktionsstellen werden entworfen, um eine Insertion der Kassette im richtigen Leserahmen zur Transkription und Translation sicherzustellen.
"Heterologe" DNA betrifft DNA, welche nicht natürlich in der Zelle oder in einer chromosomalen Stelle der Zelle vorliegt. Vorzugsweise schließt die heterologe DNA ein Gen ein, welches für die Zelle fremd ist.
Eine Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA "transfiziert", wenn eine solche DNA in das Innere der Zelle eingeführt wurde. Eine Zelle wurde mit exogener oder heterologer DNA "transformiert", wenn die transfizierte DNA eine phänotypische Veränderung bewirkt. Vorzugsweise sollte die transformierende DNA in chromosomale DNA integriert (kovalent verbunden) werden, welche das Genom der Zelle bildet.
Ein "Klon" ist eine Population von Zellen, welche von einer Einzelzelle oder einem gemeinsamen Vorfahren durch Mitose abgeleitet wurde.
Ein "Nukleinsäuremolekül" betrifft die polymere Phosphatesterform von Ribonukleosiden (Adenosin, Guanosin, Uridin oder Cytidin, "RNA-Moleküle") oder Desoxyribonukleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxythymidin oder Desoxycytidin, "DNA-Moleküle"), entweder in einzelsträngiger Form oder als dop pelsträngige Helix. Doppelsträngige DNA-DNA-, DNA-RNA- und RNA-RNA-Helices sind möglich. Der Begriff Nukleinsäuremolekül, und insbesondere DNA- oder RNA-Molekül, betrifft nur die Primär- und Sekundär-Struktur des Moleküls und beschränkt ihn nicht auf irgendwelche Tertiär- oder Quartärformen. Daher schließt dieser Begriff doppelsträngige DNA ein, welche inter alia in linearen oder zirkulären DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Plasmiden und Chromosomen gefunden wird. Beim Diskutieren der Struktur von bestimmten doppelsträngigen DNA-Molekülen können Sequenzen hier gemäß der normalen Konvention des Angebens nur der Sequenz in der 5'- zur 3'-Richtung entlang des nicht transkribierten Strangs der DNA (d. h. des Strangs mit einer Sequenz, die homolog zur mRNA ist) beschrieben werden. Ein "rekombinantes DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül, welches einer molekularbiologischen Manipulation unterzogen wurde.
Ein Nukleinsäuremolekül ist "hybridisierbar" mit einem anderen Nukleinsäuremolekül, wie einer cDNA, genomischen DNA oder RNA, wenn eine einzelsträngige Form des Nukleinsäuremoleküls sich an das andere Nukleinsäuremolekül unter den geeigneten Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke der Lösung anlagern kann (siehe Sambrook et al., 1989, supra). Die Bedingungen der Temperatur und der Ionenstärke bestimmen die "Stringenz" der Hybridisierung. Für ein vorläufiges Screenen auf homologe Nukleinsäuren können Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz, welche einer T_m von 55°C entsprechen, verwendet werden, z. B. 5 × SSC, 0,1% SDS, 0,25% Milch und kein Formamid oder 30% Formamid, 5 × SSC, 0,5% SDS. Hybridisierungsbedingungen moderater Stringenz entsprechen einer höheren T_m, z. B. 40% Formamid mit 5 × oder 6 × SSC. Hybridisierungsbedingungen hoher Stringenz entsprechen der höchsten T_m, z. B. 50% Formamid, 5 × oder 6 SSC. Eine Hybridisierung erfordert, dass die zwei Nukleinsäuren komplementäre Sequenzen enthalten, obwohl, abhängig von der Stringenz der Hybridisierung Fehlpaarungen zwischen Basen möglich sind. Die geeignete Stringenz zum Hybridisieren von Nukleinsäuren hängt von der Länge der Nukleinsäuren und dem Grad der Komplementarität ab, Variablen, welche im Stand der Technik gut bekannt sind. Je größer der Grad der Ähnlichkeit oder Homologie zwischen zwei Nukleotidsequenzen ist, desto größer ist der Wert der T_m für Hybride der Nukleinsäuren, welche jene Sequenzen aufweisen. Die relative Stabilität (was einer höheren T_m entspricht) von Nukleinsäurehybridisierungen nimmt in der folgenden Reihenfolge ab: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Für Hybride mit mehr als 100 Nukleotiden Länge wurden Gleichungen zum Berechnen der T_m abgeleitet (siehe Sambrook et al., 1989, supra, 9.50–0.51). Für eine Hybridisierung mit kürzeren Nukleinsäuren, d. h. Oligonukleotiden, wird die Position der Fehlpaarungen wichtiger, und die Länge des Oligonukleotids bestimmt seine Spezifität (siehe Sambrook et al., 1989, supra, 11.7–11.8). Eine minimale Länge für eine hybridisierbare Nukleinsäure beträgt vorzugsweise mindestens ungefähr 10 Nukleotide, weiter bevorzugt mindestens ungefähr 15 Nukleotide, am meisten bevorzugt beträgt die Länge mindestens ungefähr 20 Nukleotide.
In einer spezifischen Ausführungsform betrifft der Begriff "Standard-Hybridisierungsbedingungen" eine T_m von 55°C unter Verwendung von oben dargelegten Bedingungen. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 60°C, in einer weiter bevorzugten Ausführungsform beträgt die T_m 60°C.
Eine "homologe Rekombination" betrifft die Insertion einer fremden DNA-Sequenz eines Vektors in ein Chromosom. Vorzugsweise zielt der Vektor auf eine spezifische chromosomale Stelle für die homologe Rekombination ab. Für eine spezifische homologe Rekombination wird der Vektor ausreichend lange Regionen der Homologie zu Sequenzen des Chromosoms enthalten, um eine komplementäre Bindung und Aufnahme des Vektors in das Chromosom zu erlauben. Längere Regionen der Homologie und größere Grade der Sequenzähnlichkeit können die Wirksamkeit der homologen Rekombination erhöhen.
Eine DNA "kodierende Sequenz" ist eine doppelsträngige DNA-Sequenz, welche in ein Polypeptid in einer Zelle in vitro oder in vivo transkribiert und translatiert wird, wenn sie unter die Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen gebracht wird. Die Grenzen der kodierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'(Amino)-Terminus und ein Translations-Stopcodon am 3'(Carboxyl)-Terminus bestimmt. Eine kodierende Sequenz kann prokaryotische Sequenzen, cDNA aus eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen aus eukaryotischer (z. B. Säugetier-) DNA und sogar synthetische DNA-Sequenzen einschließen, ist aber nicht darauf beschränkt. Wenn die kodierende Sequenz für eine Expression in einer eukaryotischen Zelle vorgesehen ist, werden gewöhnlich ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz 3' von der kodierenden Sequenz platziert.
Isolierung von OB-R kodierenden und flankierenden Sequenzen
Die von der vorliegenden Offenbarung umfassten Nukleinsäuren schließen Nukleinsäuren ein, welche bei der Expression Peptide kodieren, wie jene, die in den SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8 und 10 dargelegt sind. Folglich kann, obwohl spezifische DNA in Bezug auf das OB-R-Gen isoliert und sequenziert wurde, irgendeine Tierzelle möglicherweise als Nukleinsäurequelle für die molekulare Klonierung eines Gens dienen, welches das Polypeptid, wie hier offenbart, kodiert. Die DNA kann durch Standardverfahren, welche im Stand der Technik für klonierte DNA bekannt sind (z. B. eine DNA "Bibliothek"), durch chemische Synthese, durch cDNA-Klonierung oder durch die Klonierung von genomischer DNA oder von Fragmenten davon, aufgereinigt aus der gewünschten Zelle erhalten werden [siehe zum Beispiel Sambrook et al., 1989, supra, Glover, 1985, supra]. Aus genomischer DNA abgeleitete Klone können regulatorische und intronische DNA-Regionen zusätzlich zu den kodierenden Regionen enthalten, aus cDNA abgeleitete Klone werden keine Intronsequenzen enthalten. Was auch immer die Quelle ist, das Gen sollte molekular in einen geeigneten Vektor zur Vermehrung des Gens kloniert werden.
Beim molekularen Klonieren des Gens aus genomischer DNA kann die genomische DNA unter Verwendung von Primern amplifiziert werden, welche aus den cDNA-Sequenzen ausgewählt wurden. Alternativ werden DNA-Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen kodieren werden. Die DNA kann an spezifischen Stellen unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme gespalten werden. Es kann ebenfalls DNase in der Anwesenheit von Mangan verwendet werden, um die DNA zu fragmentieren, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, zum Beispiel durch Ultraschallbehandlung. Die linearen DNA-Fragmente können anschließend gemäß der Größe durch Standardtechniken getrennt werden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Agarose- und Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Säulenchromatographie.
Sobald die DNA-Fragmente erzeugt sind, kann eine Identifikation des spezifischen DNA-Fragments, welches das gewünschte OB-R-Gen enthält, in einer Anzahl von Wegen erreicht werden. Wenn zum Beispiel eine Menge eines Abschnitts eines OB-R-Gens oder seine spezifische RNA oder ein Fragment davon verfügbar ist und gereinigt und markiert werden kann, können die erzeugten DNA-Fragmente durch eine Nukleinsäure-Hybridisierung mit einer markierten Sonde gescreent werden [Benton et al., Science, 196: 180 (1977), Grunstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72: 3961 (1975)]. Die vorliegende Offenbarung stellt solche Nukleinsäuresonden bereit, welche einfach aus den spezifischen hier offenbarten Sequenzen hergestellt werden können, z. B. eine hybridisierbare Sonde mit einer Nukleotidsequenz, welche mindestens einem 10, vorzugsweise einem 15 und weiter bevorzugt mindestens einem 20 Nukleotid langen Fragment der Sequenzen entspricht, welche in den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9 dargestellt sind. Vorzugsweise wird ein Fragment ausgewählt, welches hoch spezifisch für die hier offenbarten Nukleinsäuren ist. Jene DNA-Fragmente mit einer erheblichen Sequenzähnlichkeit zu der Sonde, z. B. eine homologe DNA, werden hybridisieren. Wie oben erwähnt wurde, je größer der Grad der Sequenzähnlichkeit ist, desto stringenter sind die Hybridisierungsbedingungen, die verwendet werden können. In einer Ausführungsform werden Hybridisierungsbedingungen niedriger Stringenz verwendet, um eine homologe Leptinrezeptor-Nukleinsäure zu identifizieren. In einem bevorzugten Aspekt und wie hier experimentell gezeigt, wird jedoch eine Nukleinsäure, welche ein wie hier offenbartes Polypeptid kodiert, mit einer Nukleinsäure, welche eine Nukleotidsequenz, wie in (SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7 und 9) dargestellt, oder ein hybridisierbares Fragment davon aufweist, unter Bedingungen moderater Stringenz hybridisieren, weiter bevorzugt wird sie unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisieren.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform kann die hier offenbarte DNA unter Verwendung von einer der PCR-Sonden identifiziert werden, welche durch Exon-Trapping und cDNA-Selektion erhalten wurden. Zum Beispiel können die Primerpaare, welche in Beispiel 3 beschrieben werden, verwendet werden, um eine DNA zu amplifizieren.
Vorzugsweise werden diese Primer DNA unter Bedingungen moderater bis hoher Stringenz amplifizieren, z. B. unter Verwendung einer Prähybridisierung bei 65°, unter Verwendung von Rapid-hyb-Puffer (Amersham Life Sciences), gefolgt von einer Hybridisierung für 6 Stunden bei 65°C, gefolgt vom Waschen zuerst mit 2 × SSC/0,1% SDS für 30 min bei Raumtemperatur (RT) und einem zweiten Waschschritt bei höherer Stringenz mit 0,3 × SSC/0,1% SDS, RT für 30 min. Wie vom Fachmann erkannt werden wird, ist die Stringenz des zweiten Waschschritts flexibel und hängt von der Länge der Sonde und dem Grad der Sequenzähnlichkeit von jeder Sonde ab. Da zum Beispiel die humanen und Mäuse-kodierenden Regionen zu ungefähr 78% homolog sind, können dieselben Hybridisierungsbedingungen mit einem zweiten Waschschritt mit niedrigerer Stringenz eingesetzt werden (z. B. zweimal mit 2 × SSC/0,1% SDS, RT). Wenn dies zu keinem Signal mit keinem Hintergrund führt, kann eine Hybridisierung bei einer niedrigeren Temperatur (niedrigeren Stringenz) versucht werden, z. B. 42°C. Wenn zu viel Hintergrund auftritt, kann die Stringenz des zweiten Waschschritts erhöht werden (z. B. 0,5 oder 0,3 × SSC, 0,1% SDS, RT). Gemäß dieser Offenbarung werden die oben erwähnten PCR-Sonden ein Nukleinsäuremolekül definieren, z. B. eine DNA, welche OB-R kodiert, aus humanen, sowie Mäuse-DNA-Bibliotheken unter ähnlichen Hybridisierungsbedingungen.
Alternativ kann die Anwesenheit des Gens durch Assays nachgewiesen werden, welche auf den physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts beruhen. Zum Beispiel können cDNA-Klone oder DNA-Klone, welche die richtigen mRNAs Hybrid-selektieren, ausgewählt werden, welche ein Protein herstellen, das z. B. ähnliche oder identische elektrophoretische Wandereigenschaften, isoelektrisches Fokussierungsverhalten, proteolytische Spaltkarten, Leptinbindungsaktivität oder antigene Eigenschaften aufweist, wie sie für den vorliegenden OB-R bekannt sind. Zum Beispiel können wie hier offenbarte Antikörper einfach verwendet werden, um auf Homologa von OB-R aus anderen Quellen zu screenen. Proteine von Kandidatengenen werden vorzugsweise auf die Leptinbindung getestet.
Ein Gen, welches ein Polypeptid, wie hier offenbart, kodiert, kann ebenfalls durch eine mRNA-Selektion identifiziert werden, d. h. durch eine Nukleinsäure-Hybridisierung, gefolgt von einer in vitro Translation. In diesem Verfahren werden Fragmente verwendet, um komplementäre mRNAs durch Hybridisierung zu isolieren. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte Modulator-DNA darstellen. Eine Immunpräzipitationsanalyse oder funktionelle Assays (z. B. Leptinbindungsaktivität) des in vitro Translationsprodukts der Produkte der isolierten mRNAs identifiziert die mRNA und daher die komplementären DNA-Fragmente, welche die gewünschten Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezifische mRNAs durch Adsorption von Polysomen, welche aus Zellen isoliert wurden, an immobilisierte Antikörper, welche spezifisch gegen ein Modulatorpeptid gerichtet sind, ausgewählt werden.
Eine radioaktiv markierte Modulatorpeptid-cDNA kann unter Verwendung der ausgewählten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als Matrize synthetisiert werden. Die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA kann anschließend als eine Sonde verwendet werden, um homologe Modulatorpeptid-DNA-Fragmente aus anderen genomischen DNA-Fragmenten zu identifizieren.
Wie oben erwähnt wurde, kann eine DNA-Sequenz, welche Gewichtsmodulator-Peptide, wie hier offenbart, kodiert, eher synthetisch hergestellt, als kloniert zu werden. Die DNA-Sequenz kann mit den geeigneten Codons für die OB-R-Aminosäuresequenzen entworfen werden. Im Allgemeinen wird man bevorzugte Codons für den beabsichtigten Wirt auswählen, wenn die Sequenz zur Expression verwendet werden wird. Die vollständige Sequenz kann aus überlappenden Oligo nukieotiden zusammengesetzt werden, welche durch Standardverfahren hergestellt wurden und zu einer volkständigen kodierenden Sequenz zusammengesetzt werden [siehe z. B. Edge, Nature, 292: 756 (1981), Nambair et al., Science, 223: 1299 (1984), Jay et al., J. Biol. Chem., 259: 6311 (1984)].
Synthetische DNA-Sequenzen, erlauben eine einfache Konstruktion von Genen, welche OB-R-Analoga exprimieren werden, wie oben beschrieben. Alternativ können DNA-kodierende Analoga durch stellengerichtete Mutagenese des nativen OB-R-Gens oder der cDNAs hergestellt werden, und Analoga können direkt unter Verwendung gängiger Polypeptidsynthese hergestellt werden.
Ein allgemeines Verfahren zur stellenspezifischen Aufnahme von unnatürlichen Aminosäuren in Proteine wird in Noren et al., Science, 244: 182–188 (1989) beschrieben. Dieses Verfahren kann verwendet werden, um Analoga des OB-R-Polypeptids mit unnatürlichen Aminosäuren zu erzeugen.
Aufgrund der Degeneriertheit kodierender Nukleotidsequenzen können andere DNA-Sequenzen, welche im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie ein OB-R-Gen kodieren, in der Ausführung der vorliegenden Offenbarung verwendet werden. Diese schließen allelische Gene, homologe Gene aus anderen Arten und Nukleotidsequenzen, welche alle oder Abschnitte der OB-R-Gene umfassen, welche durch die Substitution von verschiedenen Codons verändert sind, welche denselben Aminosäurerest innerhalb der Sequenz kodieren, wobei sie eine stille Veränderung hervorbringen, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Ebenso schließen die hier offenbarten OB-R-Derivate jene ein, welche als primäre Aminosäuresequenz die Gesamtheit oder einen Teil der Aminosäuresequenz eines OB-R-Proteins enthalten, einschließlich veränderter Sequenzen, in welchen Reste innerhalb der Sequenz durch funktionell äquivalente Aminosäurereste substituiert werden, was zu einer konservativen Aminosäuresubstitution führt, wie oben in Verbindung mit den OB-R-Analoga beschrieben wurde, sind aber nicht darauf beschränkt.
Nicht kodierende Nukleinsäuren
Die vorliegende Offenbarung erstreckt sich auf die Herstellung von Antisense-Nukleotiden und Ribozymen, welche verwendet werden können, um mit der Expression der Proteine auf der translationalen Ebene zu interferieren. Dieser Ansatz verwendet Antisense-Nukleinsäure und Ribozyme, um die Translation einer spezifischen mRNA zu blockieren, entweder durch Maskieren der mRNA mit einer Antisense-Nukleinsäure oder durch Spalten derselben mit einem Ribozym.
Antisense-Nukleinsäuren sind DNA- oder RNA-Moleküle, welche mindestens zu einem Abschnitt eines spezifischen mRNA-Moleküls komplementär sind [siehe Weintraub, Sci. Am., 262: 40–46 (1990), Marcus-Sekura, Anal. Biochem. 172: 289–295 (1988)]. In der Zelle hybridisieren sie mit dieser mRNA, wobei sie ein doppelsträngiges Molekül bilden. Die Zelle translatiert keine mRNA, welche in dieser doppelsträngigen Form komplex gebunden ist. Daher interferieren Antisense-Nukleinsäuren mit der Expression von mRNA in Protein. Oligomere von ungefähr 15 Nukleotiden und Moleküle, welche mit dem AUG-Initiationscodon hybridisieren, werden insbesondere wirksam sein, da sie einfach zu synthetisieren sind und wahrscheinlich weniger Probleme hervorbringen, als größere Moleküle, wenn sie in Gewichtsmodulator-Peptid herstellende Zellen eingeführt werden. Antisense-Verfahren wurden verwendet, um die Expression von vielen Genen in vitro zu inhibieren [Marcus-Sekura, 1988, supra, Harnbor et al., J. Exp. Med., 168: 1237–1245 (1988)].
Ribozyme sind RNA-Moleküle, welche die Fähigkeit besitzen, andere einzelsträngige RNA-Moleküle spezifisch zu spalten, in einer Weise, die in etwa analog zu DNA-Restriktionsendonukleasen ist. Ribozyme wurden durch die Beobachtung entdeckt, dass bestimmte mRNAs die Fähigkeit aufweisen, ihre eigenen Introns herauszuschneiden. Durch Modifizieren der Nukleotidsequenz dieser RNAs waren Forscher in der Lage, Moleküle gentechnisch herzustellen, welche spezifische Nukleotidsequenzen in einem RNA-Molekül erkennen und es spalten [Cech, J. Am. Med. Assoc., 260: 3030–3034 (1988)]. Da Ribozyme sequenzspezifisch sind, werden nur mRNAs mit bestimmten Sequenzen inaktiviert.
Forscher haben zwei Typen von Ribozymen identifiziert, den Tetrahymena-Typ und den "Hammerkopf"-Typ. Tetrahymena-Typ-Ribozyme erkennen Sequenzen mit vier Basen, während "Hammerkopf"-Typ Sequenzen mit elf bis achtzehn Basen erkennen. Je länger die Erkennungssequenz ist, desto wahrscheinlicher tritt sie ausschließlich in der Ziel-mRNA-Spezies auf. Daher sind Hammerkopf-Typ-Ribozyme gegenüber Tetrahymena-Typ-Ribozemen zum Inaktivieren einer spezifischen mRNA-Spezies vorzuziehen, und Erkennungssequenzen mit achtzehn Basen sind gegenüber kürzeren Erkennungssequenzen vorzuziehen.
Die hier beschriebenen DNA-Sequenzen können daher verwendet werden, um Antisense-Moleküle gegen mRNAs für Gewichtsmodulator-Proteine und ihre Liganden und Ribozyme, welche diese spalten, herzustellen, wodurch die Expression des OB-R-Gens inhibiert wird und was zu einer erhöhten Gewichtszunahme und zur Adiposität führt.
In einer anderen Ausführungsform werden hier kurze Oligonukleotide, welche komplementär zu den kodierenden und komplementären Strängen der OB-R-Nukleinsäure oder zu nicht kodierenden Regionen des OB-R-Gens 5', 3' oder intern (intronisch) der kodierenden Region sind, offenbart. Solche Nukleinsäuren sind als Sonden geeignet, entweder als direkt markierte Oligonukleotid-Sonden oder als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion zum Überprüfen der Anwesenheit von Mutationen im ob-r-Gen oder der Menge der Expression der OB-R-mRNA. Die nicht kodierenden Nukleinsäuren sind vorzugsweise aus dem humanen OB-R-Gen.
In einer spezifischen Ausführungsform stellen die nicht kodierenden Nukleinsäuren eine homologe Rekombination zur Integration eines amplifizierbaren Gens und/oder anderer regulatorischer Sequenzen in der Nähe des OB-R-Gens bereit, z. B. um größere Mengen der Expression des OB-R-Polypeptids bereitzustellen, oder um eine Mutation in den regulatorischen Sequenzen des ob-r-Gens zu überwinden, welche geeignete Mengen der Expression des OB-R-Polypeptids verhindert [siehe die internationale Patentveröffentlichung WO 91/06666 , veröffentlicht am 16. Mai 1991 von Skoultchi, internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 91/09955 , veröffentlicht am 11. Juli 1991 von Chappel, siehe ebenfalls die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 90/14092 , veröffentlicht am 29. November 1990 von Kucherlapati und Campbell].
Herstellung des OB-R-Polypeptids: Expression und Synthese
Transkriptionelle und translationelle Kontrollsequenzen sind regulatorische DNA-Sequenzen, wie Promotoren, Enhancer, Terminatoren und desgleichen, welche die Expression einer kodierenden Sequenz in einer Wirtszelle bewirken. In eukaryotischen Zellen sind Polyadenylierungssignale Kontrollsequenzen.
Eine kodierende Sequenz steht "unter der Kontrolle" von transkriptionellen und translationellen Kontrollsequenzen in einer Zelle, wenn eine RNA-Polymerase die kodierende Sequenz in mRNA transkribiert, welche anschließend trans-RNA gespleißt und in das Protein translatiert wird, welches durch die kodierende Sequenz kodiert wird.
Eine "Signalsequenz" wird am Anfang der kodierenden Sequenz eines Proteins eingeschlossen, um auf der Oberfläche einer Zelle exprimiert zu werden. Diese Sequenz kodiert ein Signalpeptid, N-terminal zum reifen Polypeptid, welches die Wirtszelle steuert, das Polypeptid zu translozieren. Der Begriff "Translokations-Signalsequenz" wird hier ebenfalls verwendet, um diese Art der Signalsequenz zu bezeichnen. Translokations-Signalsequenzen können mit einer Vielzahl von Proteinen verbunden gefunden werden, welche nativ für Eukaryoten und Prokaryoten sind und häufig in beiden Typen von Organismen funktionsfähig sind. Gemäß der vorliegenden Offenbarung umfassen die Aminosäurereste 1–27 der Mäuse- und humanen OB-R-Polypeptide (siehe SEQ ID NR: 8, 10) das Signalpeptid. In einer anderen Ausführungsform umfassen die Aminosäurereste 1–22 das Signalpeptid [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)].
Eine DNA-Sequenz ist mit einer Expressions-Kontrollsequenz "operativ verbunden", wenn die Expressions-Kontrollsequenz die Transkription und Translation dieser DNA-Sequenz kontrolliert und reguliert. Der Begriff "operativ verbunden" schließt das Aufweisen eines geeigneten Startsignals (z. B. ATG) vor der DNA-Sequenz ein, die exprimiert werden soll, und das Beibehalten des richtigen Leserahmens, um eine Expression der DNA-Sequenz unter der Kontrolle der Expressions-Kontrollsequenz und eine Herstellung des gewünschten Produkts, welches durch die DNA-Sequenz kodiert wird, zu erlauben. Wenn ein Gen, von dem gewünscht wird, dass es in ein rekombinantes DNA-Molekül inseriert wird, kein geeignetes Startsignal enthält, kann ein solches Startsignal strangaufwärts (5') und im Leserahmen des Gens inseriert werden.
Eine "Promotorsequenz" ist eine regulatorische DNA-Region, welche in der Lage zum Binden einer RNA-Polymerase in einer Zelle und zum Initiieren einer Transkription einer strangabwärts (3'-Richtung) gelegenen kodierenden Sequenz ist. Für Zwecke der Definition der vorliegenden Offenbarung ist die Promotorsequenz an ihrem 3'-Terminus durch die Transkriptions-Initiationsstelle begrenzt und erstreckt sich strangaufwärts (5'-Richtung), um die minimale Anzahl von Basen oder Elementen einzuschließen, welche nötig sind, um die Transkription in Mengen, welche über dem Hintergrund nachweisbar sind, zu initiieren. Innerhalb der Promotorsequenz werden eine Transkriptions-Initiationsstelle (einfach definiert zum Beispiel durch Kartierung mit Nuklease S1), sowie Protein-Bindungsdomänen (Konsensussequenzen), welche verantwortlich für das Binden von RNA-Polymerase sind, gefunden werden.
Eine andere Eigenschaft dieser Offenbarung ist die Expression der hier offenbarten DNA-Sequenzen. Wie es im Stand der Technik gut bekannt ist, können DNA-Sequenzen exprimiert werden, indem sie operativ mit einer Expressions-Kontrollsequenz in einem geeigneten Expressionsvektor verbunden werden, und indem dieser Expressionsvektor eingesetzt wird, um einen geeigneten einzelligen Wirt zu transformieren.
Ein solches operatives Verbinden einer DNA-Sequenz, wie hier offenbart mit einer Expressions-Kontrollsequenz schließt natürlich, wenn nicht bereits Teil der DNA-Sequenz, das Bereitstellen eines Initiationscodons, ATG, im richtigen Leserahmen strangaufwärts von der DNA-Sequenz ein.
Eine weite Vielzahl von Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen kann beim Exprimieren der hier offenbarten DNA-Sequenzen eingesetzt werden. Geeignete Expressionsvektoren können zum Beispiel aus Segmenten chromosomaler, nicht chromosomaler und synthetischer DNA-Sequenzen bestehen. Geeignete Vektoren schließen Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide ein, z. B. E. coli-Plasmide, col E1, pCR1, pBR322, pMB9, pUC oder pUC-Plasmidderivate, z. B. pGEX-Vektoren, pET-Vektoren, pmal-c, pFLAG, usw. und ihre Derivate, Plasmide, wie RP4, Pagen-DNAs, z. B. die vielen Derivate von Phage λ, wie NM989 und andere Phagen-DNA, z. B. M13- und filamentöse einzelsträngige Phagen-DNA, Hefe-Plasmide, wie das 2μ-Plasmid oder Derivate davon, Vektoren, die in eukaryotischen Zellen geeignet sind, wie Vektoren, die in Insekten- oder Säugetierzellen geeignet sind, Vektoren, die von Kombinationen aus Plasmiden und Phagen-DNAs abgeleitet sind, wie Plasmide, die modifiziert wurden, um Phagen-DNA oder andere Expressions-Kontrollsequenzen einzusetzen, und desgleichen.
Irgendeine aus der breiten Vielzahl der Expressions-Kontrollsequenzen – Sequenzen, welche die Expression einer DNA-Sequenz, die operativ mit ihr verbunden ist, kontrollieren – kann in diesen Vektoren verwendet werden, um die hier offenbarten DNA-Sequenzen zu exprimieren. Solche geeigneten Expressions-Kontrollsequenzen schließen zum Beispiel die frühen oder späten Promotoren von SV40, CMV, Vaccinia, Polyoma oder Adenovirus, das lac-System, das trp-System, das TAC-System, das TRC-System, das LTR-System, die Haupt-Operator- und -Promotor-Regionen des Phagen λ, die Kontrollregionen des fd-Hüllproteins, den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase oder andere glykolytische Enzyme, die Promotoren der sauren Phosphatase (z. B. Pho5), den AOX 1-Promotor von methylotropher Hefe, die Promotoren des α-Mating-Faktors der Hefe und andere Sequenzen ein, von welchem bekannt ist, dass sie die Expression von Genen prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen oder ihrer Viren und verschiedene Kombinationen davon kontrollieren.
Eine breite Vielzahl von einzelligen Wirtszellen ist ebenfalls beim Exprimieren der hier offenbarten DNA-Sequenzen geeignet. Die Wirte können gut bekannte eukaryotische und prokaryotische Wirte einschließen, wie Stämme von E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, Pilze, wie Hefen (Saccharomyces und methylotrophe Hefe, wie Pichia, Candida, Hansenula und Torulopsis) und Tierzellen, wie CHO-, R1.1-, B-W- und LM-Zellen, afrikanische grüne Meerkatzen-Nierenzellen (z. B. COS 1, COS 7, BSC1, BSC40 und BMT10), Insektenzellen (z. B. Sf9) und humane Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekultur. Insbesondere bevorzugt ist eine Expression in Baculovirus mit einem Insekten-Signalpeptid, welches das OB-R-Signalpeptid ersetzt, zum Beispiel im Vektor pMelBac (Invitrogen, Katalog Nr. V1950-20).
Es wird verstanden werden, dass nicht alle Vektoren, Expressions-Kontrollsequenzen und Wirte gleich gut funktionieren werden, um die hier offenbarten DNA-Sequenzen zu exprimieren. Weder werden alle Wirte gleich gut mit demselben Expressionssystem funktionieren. Der Fachmann wird jedoch in der Lage sein, die richtigen Vektoren, Expressions-Kontrollsequenzen und Wirte ohne überflüssiges Experimentieren auszuwählen, um die gewünschte Expression zu erreichen, ohne vom Schutzumfang dieser Offenbarung abzuweichen. Zum Beispiel muss beim Auswählen eines Vektors der Wirt berücksichtigt werden, da der Vektor in ihm funktionieren muss. Die Kopienanzahl des Vektors, die Fähigkeit, die Kopienzahl zu kontrollieren und die Expression von irgendwelchen anderen Proteinen, welche durch den Vektor kodiert werden, wie antibiotische Marker, werden ebenfalls berücksichtigt werden.
Beim Auswählen einer Expressions-Kontrollsequenz wird normalerweise eine Vielzahl von Faktoren berücksichtigt. Diese schließen zum Beispiel die relative Stärke des Systems, seine Kontrollierbarkeit und seine Kompatibilität mit der bestimmten DNA-Sequenz oder dem Gen, welche/s exprimiert werden soll, insbesondere bezüglich möglicher Sekundärstrukturen, ein. Geeignete einzellige Wirte werden unter Berücksichtigung von z. B. ihrer Kompatibilität mit dem gewählten Vektor, ihren Sekretionseigenschaften, ihrer Fähigkeit, Proteine richtig zu falten und ihren Fermentationserfordernissen, sowie der Toxizität des durch die zu exprimierenden DNA-Sequenzen kodierten Produkts für den Wirt und die Einfachheit der Reinigung der Expressionsprodukte ausgewählt werden.
Unter Berücksichtigung dieser und anderer Faktoren wird der Fachmann in der Lage sein, eine Vielzahl von Vektor/Expressions-Kontrollsequenz/Wirt-Kombinationen zu konstruieren, welche die hier offenbarten DNA-Sequenzen bei Fermentation oder in einer Tierkultur im großen Maßstab zu exprimieren.
In einer spezifischen Ausführungsform kann ein OB-R-Fusionsprotein exprimiert werden. Ein OB-R-Fusionsprotein umfasst mindestens einen funktionell aktiven Abschnitt eines nicht OB-R-Proteins, welches über eine Peptidbindung mit mindestens einem funktionell aktiven Abschnitt eines OB-Polypeptids verbunden ist. Die nicht OB-R-Sequenzen können amino- oder carboxylterminal zu den OB-R-Sequenzen liegen. Zum Beispiel wird beim Herstellen "künstlicher" Rezeptoren das Verbinden der OB-R-kodierten, kodierenden Domäne für den Leptin-Bindungs-(extracytoplasmatischen)-Abschnitt an der 5'-Position ein Protein ergeben, welches Leptin bindet und einige andere Wirkungen basierend auf der Aktivität des nicht OB-R-Proteins vermittelt. Umgekehrt wird ein Verbinden eines unterschiedlichen Proteins (wie eines Wachstumsfaktors, Cytokins oder einer kodierenden Domäne einer Hormonrezeptor-Bindung) 5' mit einer cytoplasmatischen kodierenden OB-R-Domäne (welche "Box 1" und "Box 2" enthält) eine Aktivierung über OB-R beim Binden eines anderen Liganden als Leptin erlauben. In einer anderen Ausführungsform kann ein chimäres Konstrukt einfach die Expression von OB-R unterstützen. In einer spezifischen Ausführungsform, infra, werden OB-Re und Fragmente davon mit einem N-terminalen Melittin-Signalpeptid exprimiert.
In einem anderen Aspekt kann der pGEX-Vektor [Smith et al., Gene 67: 31–40 (1988)] verwendet werden. Dieser Vektor fusioniert die Schistosoma japonicum-Glutathion-S-Transferase-cDNA mit der Sequenz von Interesse. Bakterielle Proteine werden geerntet, und rekombinante Proteine können schnell auf einer reduzierten Glutathion-Affinitätssäule gereinigt werden. Der GST-Träger kann nachfolgend von den Fusionsproteinen durch Spaltung mit stellenspezifischen Proteasen gespalten werden. Nach der Spaltung können der Träger und das ungespaltene Fusionsprotein durch Absorption an Glutathionagarose entfernt werden. Schwierigkeiten mit dem System treten manchmal auf, wenn das kodierte Protein in wässrigen Lösungen unlöslich ist.
Eine Expression von rekombinanten Proteinen in bakteriellen Systemen kann zu einer falschen Faltung des exprimierten Proteins führen, was eine Rückfaltung erfordert. Das rekombinante Protein kann vor oder nach der Spaltung rückgefaltet werden, um eine funktionell aktives OB-Polypeptid zu bilden. Das OB-Polypeptid kann durch die Schritte des (i) Inkubierens des Proteins in einem denaturierenden Puffer, welcher ein Reduktionsmittel enthält, und anschließend (ii) des Inkubierens des Proteins in einem Puffer, welcher ein Oxidationsmittel enthält und vorzugsweise ebenfalls ein Protein-Stabilisierungsmittel oder ein chaotropisches Mittel oder beides enthält, rückgefaltet werden. Geeignete Redox (Reduktions/Oxidations)-Mittelpaare schließen reduziertes Glutathion/Glutathiondisulfid, Cystin/Cystein, Cystamin/Cysteamin und 2-Mercaptoethanol/2-Hydroxyethyldisulfid ein, sind aber nicht darauf beschränkt. In einem bestimmten Aspekt kann das Fusionsprotein in einem Denaturierungsmittel, wie Harnstoff, vor dem Wechsel in den Reduktionspuffer gelöst werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Protein ebenfalls gereinigt, z. B. durch Ionenaustausch- oder Ni-Chelatbildungs-Chromatographie, vor dem Wechsel in den Reduktionspuffer. Denaturierungsmittel schließen Harnstoff und Guanidin-HCl ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Das rekombinante Protein wird anschließend ungefähr mindestens 10-fach, weiter bevorzugt ungefähr 100-fach in einem Oxidationspuffer verdünnt, welcher ein Oxidationsmittel enthält, wie, aber nicht beschränkt auf 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl, 0,3 M oxidiertes Glutathion. Das Fusionsprotein wird anschließend für ungefähr 1 bis ungefähr 24 Stunden, vorzugsweise ungefähr 2 bis ungefähr 16 Stunden bei Raumtemperatur im Oxidationspuffer inkubiert. Der Oxidationspuffer kann ein Protein-Stabilisierungsmittel umfassen, z. B. einen Zucker, einen Alkohol oder Ammoniumsulfat. Der Oxidationspuffer kann weiterhin ein chaotropes Mittel in niedriger Konzentration umfassen, um falsche intermolekulare Interaktionen zu destabilisieren und daher eine richtige Faltung zu fördern. Geeignete chaotrope Mittel schließen ein Detergens, ein Polyol, L-Arginin, Guanidin-HCl und Polyethylenglykol (PEG) ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Es ist wichtig, eine ausreichend niedrige Konzentration des chaotropen Mittels zu verwenden, um eine Denaturierung des Proteins zu vermeiden. Das rückgefaltete Protein kann mindestens ungefähr 10-fach, weiter bevorzugt in der Menge, in der es im Oxidationspuffer verdünnt wurde, konzentriert werden.
Alternativ umfasst diese Offenbarung eine periplasmatische Expression eines Proteins, wie hier offenbart.
Bakterielle Fermentationsverfahren können ebenfalls zu einer rekombinanten Proteinpräparation führen, welche unverträgliche Mengen von Endotoxinen enthält. Daher umfasst diese Offenbarung die Entfernung solcher Endotoxine, z. B. durch die Verwendung Endotoxin spezifischer Antikörper oder anderer Endotoxin bindender Moleküle. Die Anwesenheit von Endotoxinen kann durch Standardtechniken bestimmt werden, wie durch den Einsatz von E-TOXATE-Reagenzien (Sigma, St. Louis, Missouri) oder mit Bioassays.
Zusätzlich zu dem spezifischen Beispiel schlagen die vorliegenden Erfinder die Verwendung von Baculovirus-, Säugetier- und Hefe-Expressionssystemen vor, um das ob-Protein zu exprimieren. Zum Beispiel in Baculovirus-Expressionssystemen sowohl nicht Fusions-Transfervektoren, wie, aber nicht beschränkt auf, pVL941 (BamHI-Klonierungsstelle, Summers), pVL1393 (BamHI-, SmaI-, XbaI-, EcoRI-, NotI-, XmaIII-, BglII- und PstI-Klonierungsstelle, Invitrogen), pVL1392 (BglII-, PstI-, NotI-, XmaIII-, EcoRI-, XbaI-, SmaI- und BamHI-Klonierungsstelle, Summers und Invitrogen) und pBlueBacIII (BamHI-, BglII-, PstI-, NcoI- und HindIII-Klonierungsstelle, wobei blau/weiß Rekombinanten-Screening der möglich ist, Invitrogen), als auch Fusions-Transfervektoren, wie, aber nicht beschränkt auf, pAc700 (BamHI- und KpnI-Klonierungsstelle, wobei die BamHI-Erkennungsstelle mit dem Initiationscodon beginnt, Summers), pAc701 und pAc702 (dieselben wie pAc700 mit unterschiedlichen Leserahmen), pAc360 (BamHI-Klonierungsstelle 36 Basenpaare strangabwärts eines Polyhedrin-Initiationscodons, Invitrogen(195)) und pBlueBacHisA, B, C (drei verschiedene Leserahmen mit BamHI-, BglII-, PstI-, NcoI- und HindIII-Klonierungsstelle, einem N-terminalen Peptid für eine ProBond-Reinigung und blau/weiß Rekombinanten-Screening der Plaques, Invitrogen (220)). In einer spezifischen Ausführungsform, infra, wird der pMel Bac-Expressionsvektor (Invitrogen) eingesetzt.
Säugetier-Expressionsvektoren, welche für die Verwendung in dieser Offenbarung vorgesehen sind, schließen Vektoren mit induzierbaren Promotoren, wie den Dihydrofolatreduktase-(DHFR)-Promotor, z. B. irgendeinen Expresionsvektor mit einem DHFR-Expressionsvektor oder einen DHFR/Methotrexat-Koamplifikationsvektor, wie pED (PstI-, SalI-, SbaI, SmaI- und EcoRI-Klonierungsstelle, wobei der Vektor sowohl das klonierte Gen, als auch DHFR exprimiert [siehe Kaufman, Current Protocols in Molecular Biology, 16.12 (1991)]) ein. Alternativ ein Glutaminsynthetase/Methioninsulfoximin-Koamplifikationsvektor, wie pEE14 (HindIII-, XbaI-, SmaI-, SbaI-, EcoRI- und BclI-Klonierungsstelle, in welcher der Vektor Glutaminsynthase und das klonierte Gen exprimiert, Celltech). In einer anderen Ausführungsform kann ein Vektor, welcher die episomale Expression unter Kontrolle des Epstein Barr Virus (EBV) steuert, verwendet werden, wie pREP4 (BamHI-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII- und KpnI-Klonierungsstelle, konstitutiver RSV-LTR-Promotor, selektierbarer Hygromycin-Marker, Invitrogen), pCEP4 (BamHI-, SfiI-, XhoI-, NotI-, NheI-, HindIII-, NheI-, PvuII- und KpnI-Klonierungsstelle, konstitutives hCMV Immediate Early-Gen, selektierbarer Hygromycin-Marker, Invitrogen), pMEP4 (KpnI-, PvuI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI-, BamHI-Klonierungsstelle, induzierbarer Metallothionein IIa-Genpromotor, selektierbarer Hygromycin-Marker, Invitrogen), pREP8 (BamHI-, XhoI-, NotI-, HindIII-, NheI- und KpnI-Klonierungsstelle, RSV-LTR-Promotor, selektierbarer Histidinolmarker, Invitrogen), pREP9 (KpnI-, NheI-, HindIII-, NotI-, XhoI-, SfiI- und BamHI-Klonierungsstelle, RSV-LTR-Promotor, selektierbarer G418-Marker, Invitrogen) und pEBVHis (RSV-LTR-Promotor, selektierbarer Hygromycin-Marker, N-terminales Peptid, welches über ProBond-Harz reinigbar ist und durch Enterokinase gespalten wird, Invitrogen). Selektierbare Säugetier-Expressionsvektoren zur Verwendung in dieser Offenbarung schließen pRc/CMV (HindIII-, BstXI-, NotI-, SbaI- und ApaI-Klonierungsstelle, G418-Selektion, Invitrogen), pRc/RSV (HindIII-, SpeI-, BstXI-, NotI-, XbaI-Klonierungsstelle, G418-Selektion, Invitrogen) und andere ein. Vaccinia Virus-Säugetier-Expressionsvektoren [siehe Kaufman, 1991, supra] zur Verwendung gemäß dieser Offenbarung schließen pSCI1 (SmaI-Klonierungsstelle, TK- und β-gal-Selektion), pMJ601 (SalI-, SmaI-, AflI-, NarI-, BspMII-, BamHI-, ApaI-, NheI-, SacII-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle, TK- und β-gal-Selektion) und pTKgptF1S (EcoRI-, PstI-, SalI-, AccI-, HindII-, SbaI-, BamHI- und Hpa-Klonierungsstelle, TK- oder XPRT-Selektion) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Hefe-Expressionssysteme können ebenfalls gemäß dieser Offenbarung verwendet werden, um OB-Polypeptid zu exprimieren. Zum Beispiel kann der Nichffusions-pYES2-Vektor (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, GstXI-, EcoRI-, BstXI-, BamHI-, SacI-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle, Invitrogen) oder der Fusions-pYESHisA, B, C (XbaI-, SphI-, ShoI-, NotI-, BstXI-, EcoRI-, BamHI-, SacI-, KpnI- und HindIII-Klonierungsstelle, N-terminales Peptid, welches mit ProBond-Harz gereinigt und mit Enterokinase gespalten wird, Invitrogen), um nur zwei zu erwähnen, eingesetzt werden.
Es ist weiter beabsichtigt, das Körpergewichtsmodulator-Polypeptide und Analoga aus Nukleotidsequenzen hergestellt werden können, welche innerhalb des Schutzumfangs dieser Offenbarung abgeleitet wurden.
Zusätzlich zur rekombinanten Expression des OB-R-Polypeptids, sieht die vorliegende Offenbarung die Herstellung des OB-R-Polypeptids oder von Fragmenten davon unter Verwendung der gut bekannten und hochentwickelten Techniken der Festphasen-Peptidsynthese vor und ermöglicht diese vollständig. Die Offenbarung umfasst die Verwendung sowohl von gängigen Boc, als auch Fmoc, sowie anderen Schutzgruppen-Strategien zur Herstellung des OB-Polypeptids oder Fragmenten davon. Verschiedene Techniken zur Rückfaltung und zum Oxidieren der Cystein-Seitenketten, um eine Disulfidbindung zu bilden, sind ebenfalls im Stand der Technik gut bekannt.
Antikörper gegen das OB-R-Polypeptid
Gemäß dieser Offenbarung können das OB-R-Polypeptid, welches rekombinant oder durch chemische Synthese hergestellt wurde, und Fragmente oder Derivate oder Analoga davon, einschließlich von Fusionsproteinen, als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, welche das OB-R-Polypeptid erkennen. Solche Antikörper schließen polyklonale, monoklonale, chimäre, Einzelketten-, Fab-Fragmente und eine Fab-Expressionsbibliothek ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Ein Molekül ist "antigen", wenn es in der Lage ist, spezifisch mit einem Antigen-Erkennungsmolekül des Immunsystems, wie einem Immunglobulin (Antikörper) oder einem T-Zell-Antigenrezeptor zu interagieren. Ein antigenes Polypeptid enthält mindestens ungefähr 5 und vorzugsweise mindestens ungefähr 10 Aminosäuren. Ein antigener Abschnitt eines Moleküls kann der Abschnitt sein, welcher immundominant für die Antikörper- oder T-Zellrezeptor-Erkennung ist, oder er kann ein Abschnitt sein, welcher verwendet wird, um einen Antikörper gegen das Molekül durch Konjugieren des antigenen Abschnitts an ein Trägermolekül zur Immunisierung zu erzeugen. Ein Molekül, welches antigen ist, braucht selber nicht immunogen zu sein, d. h. in der Lage, eine Immunantwort ohne einen Träger auszulösen.
Ein "Antikörper" ist irgendein Immunglobulin, einschließlich von Antikörpern und Fragmenten davon, welches ein spezifisches Epitop bindet. Der Begriff umfasst polyklonale, monoklonale und chimäre Antiköper, wobei die zuletzt erwähnten detaillierter in den U.S. Patenten Nr. 4,816,397 und 4,816,567 beschrieben werden, sowie Antigen bindende Abschnitte von Antikörpern, einschließlich von Fab, F(ab')₂ und F(v) (einschließlich von Einzelketten-Antikörpern). Folglich umfasst der Begriff "Antikörpermolekül" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen, so wie hier verwendet, sowohl ein intaktes Immunglobulin-Molekül, als auch einen immunologisch aktiven Abschnitt eines Immunglobulin-Moleküls, welches die Antikörper-Kombinationsstelle enthält. Eine "Antikörper-Kombinationsstelle" ist der strukturelle Abschnitt eines Antikörpermoleküls, welcher aus schwerer und leichter Kette der variablen und hypervariablen Regionen aufgebaut ist, welcher spezifisch das Antigen bindet.
Beispielhafte Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulin-Moleküle, im Wesentlichen intakte Immunglobulin-Moleküle und jene Abschnitte eines Immunglobulin-Moleküls, welche das Paratop enthalten, einschließlich jener Abschnitte, welche im Stand der Technik als Fab, Fab', F(ab')₂ und F(v) bekannt sind, wobei diese Abschnitte für die Verwendung in den hier beschriebenen therapeutischen Verfahren bevorzugt sind.
Fab- und F(ab')₂-Abschnitte von Antikörpermolekülen werden durch die proteolytische Reaktion von jeweils Papain und Pepsin mit im Wesentlichen intakten Antikörpermolekülen durch Verfahren hergestellt, welche gut bekannt sind. Siehe zum Beispiel das U.S. Patent Nr. 4,342,566 an Theofilopolous et al. Fab'-Antikörpermolekül-Abschnitte sind ebenfalls gut bekannt und werden aus F(ab')₂-Abschnitten hergestellt, gefolgt von einer Reduktion der Disulfidbindungen, welche die zwei schwere Ketten-Abschnitte verbinden, wie mit Mercaptoethanol, und gefolgt von einer Alkylierung des sich ergebenden Proteinmercaptans mit einem Reagens, wie Iodacetamid. Ein Antikörper, welcher intakte Antikörpermoleküle enthält, ist hier bevorzugt.
Der Begriff "monoklonaler Antikörper" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen betrifft einen Antikörper, welcher nur eine Art der Antikörper-Kombinationsstelle aufweist, welche in der Lage zur Immunreaktion mit einem bestimmten Antigen ist. Eine monoklonaler Antikörper zeigt daher typischerweise eine einzige Bindungsaffinität für irgendein Antigen mit welchem er immunreagiert. Ein monoklonaler Antikörper kann daher ein Antikörpermolekül enthalten, welches eine Vielzahl von Antikörper-Kombinationsstellen aufweist, wobei jede immunspezifisch für ein anderes Antigen ist, z. B. ein bispezifischer (chimärer) monoklonaler Antikörper.
Der Begriff "Adjuvans" betrifft eine Verbindung oder ein Gemisch, welche/s die Immunantwort auf ein Antigen verstärkt. Ein Adjuvans kann als ein Gewebespeicher dienen, welcher das Antigen langsam freisetzt und ebenfalls als ein Lymphsystem-Aktivierungsmittel, welches die Immunantwort nicht spezifisch verstärkt [Hood et al., Immunology, S. 384, zweite Aufl., Benjamin/Cummings, Menlo Park, Kalifornien (1984)]. Häufig wird ein erstes Kontaktieren mit einem Antigen alleine in der Abwesenheit eines Adjuvans versagen, eine humorale oder zelluläre Immunantwort auszulösen. Adjuvantien schließen vollständiges Freund'sches Adjuvans, unvollständiges Freund'sches Adjuvans, Saponin, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Öl- oder Kohlenwasserstoffemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise geeignete humane Adjuvantien, wie BCG (Bacille Clamette-Guerin) und Corynebacterium parvum ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise ist das Adjuvans pharmazeutisch verträglich.
Verschiedene Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, können zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen das OB-R-Polypeptid oder ein Fragment, Derivat oder Analogon davon verwendet werden. Für die Herstellung des Antikörpers können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem OB-R-Polypeptid oder einem Derivat davon (z. B. einem Fragment oder Fusionsprotein) immunisiert werden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten, Schafe, Ziegen, usw. In einer Ausführungsform kann das OB-R-Polypeptid oder Fragment davon an einen immunogenen Träger konjugiert werden, z. B. an bovines Serumalbumin (BSA) der Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH). Spezifische antigene OB-R-Fragmente (SEQ ID NR: 32, 33, 34) werden in Beispiel 2, infra, offenbart. In einer anderen Ausführungsform wird ein Antikörper gegen den C-terminalen Abschnitt der OB-Re-Form des OB-R erzeugt, z. B. ein Polypeptid, welches ungefähr den Aminosäureresten 420–461 der SEQ ID NR: 10 entspricht. Verschiedene Adjuvantien können verwendet werden, um die immunologische Antwort zu verstärken, abhängig vom Wirtstier, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Freund'sches (vollständig und unvollständig), Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanine, Dinitrophenol und möglicherweise geeignete humane Adjuvantien, wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Für die Herstellung von monoklonalen Antikörpern, welche gegen das OB-R-Polypeptid oder ein Fragment, Analogon oder Derivat davon gerichtet sind, kann irgendeine Technik, welche die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur bewirkt, verwendet werden. Diese schließen die Hybridom-Technik, welche ursprünglich von Kohler et al., Nature 256: 495–497 (1975) entwickelt wurde, sowie die Triom-Technik, die humane B-Zell-Hybridomtechnik [Kozbor et al., Immunology Today, 4: 72 (1983)] und die EBV-Hybridomtechnik, um humane monoklonale Antikörper herzustellen [Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, S. 77–96, Alan R. Liss, Inc. (1985)] ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Immortale, Antikörper herstellende Zelllinien können durch andere Techniken als Fusion erzeugt werden, wie direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein-Barr Virus [siehe z. B. M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980), Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas" (1981), Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980), siehe ebenfalls U.S. Patente Nr. 4,341,761 , 4,399,121 , 4,427,783 , 4,444,887 , 4,451,570 , 4,466,917 , 4,472,500 , 4,491,632 und 4,493,890 ].
In einer zusätzlichen Ausführungsform dieser Offenbarung können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren hergestellt werden [die internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 89/12690 , veröffentlicht am 28. Dezember 1989]. Gemäß dieser Offenbarung können humane Antikörper verwendet werden und können durch Verwendung humaner Hybridome [Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 2026–2030 (1983)] oder durch Transformieren humaner B-Zellen mit dem EBV-Virus in vitro (Cole et al., 1985, supra) erhalten werden. In der Tat können gemäß dieser Offenbarung Techniken, welche für die Herstellung von "chimären Antikörpern" entwickelt wurden [Morrison et al., J. Bacteriol., 159–870 (1984), Neuberger et al., Nature, 312: 604–608 (1984), Takeda et al., Nature, 314: 452–454 (1985)] durch Spleißen der Gene aus einem Mäuse-Antikörpermolekül, welches spezifisch für ein ob-Polypeptid ist, zusammen mit Genen aus einem humanen Antikörpermolekül mit geeigneter biologischer Aktivität verwendet werden, solche Antikörper liegen im Schutzumfang dieser Offenbarung. Solche humanen oder humanisierten chimären Antikörper sind für die Verwendung in der Therapie von Humankrankheiten oder Störungen (infra beschrieben) bevorzugt, da die humanen oder humanisierten Antikörper selber viel weniger wahrscheinlich als xenogene Antikörper eine Immunantwort, insbesondere eine allergische Antwort, induzieren.
Gemäß dieser Offenbarung können Techniken, welche für die Herstellung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden ( U.S. Patente Nr. 5,476,786 und 5,132,405 an Huston, Patent Nr. 4,946,778 ) angewandt werden, um OB-R-Polypeptid spezifische Einzelketten-Antikörper herzustellen. Eine zusätzliche Ausführungsform dieser Offenbarung verwendet die für die Konstruktion von Fab-Expressionsbibliotheken beschriebenen Techniken [Huse et al., Science, 246: 1275–1281 (1989)], um eine schnelle und einfache Identifikation von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifität für ein ob-Polypeptid oder seine Derivate oder Analoga zu erlauben.
Antikörperfragmente, welche den Idiotyp des Antikörpermoleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen solche Fragmente: das F(ab')₂-Fragment, welches durch Pepsinspaltung des Antikörpermoleküls hergestellt werden kann, die Fab'-Fragmente, welche durch Reduzieren der Disulfidbrücken des F(ab')₂-Fragments erzeugt werden können und die Fab-Fragmente, welche durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Bei der Herstelllung von Antikörpern kann ein Screening auf den gewünschten Antikörper durch Techniken erreicht werden, welche im Stand der Technik bekannt sind, z. B. Radioimmunassay, ELISA (enzymgekoppelter Immunadsorptionsassay), "Sandwich"-Immunassays, immunradiometrische Assays, Geldiffusions-Präzipitin-Reaktionen, Immundiffusions-Assays, in situ Immunassays (zum Beispiel unter Verwendung von kolloidalen Gold,- Enzym- oder Radioisotop-Markierungen), Western Blots, Präzipiationsreaktionen, Agglutinationsassays (z. B. Gel-Agglutinationsassays, Hämagglutinationsassays), Komplement-Fixierungsassays, Immunfluoreszenz-Assays, Protein A-Assays und Immunelektrophorese-Assays, usw. In einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung durch Nachweisen einer Markierung auf dem primären Antikörper nachgewiesen. In einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch Nachweisen des Bindens eines zweiten Antikörpers oder Reagens an den primären Antikörper nachgewiesen. In einer weiteren Ausführungsform ist der sekundäre Antikörper markiert. Viele Hilfsmittel sind im Stand der Technik zum Nachweisen einer Bindung in einem Immunassay bekannt und liegen innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Offenbarung. Zum Beispiel kann man, um Antikörper auszuwählen, welche ein spezifisches Epitop eines OB-Polypeptids erkennen, erzeugte Hybridome für ein Produkt, welches an ein OB-Polypeptid-Fragment, welches ein solches Epitop enthält, bindet, untersuchen. Zur Auswahl eines Antikörpers, welcher spezifisch für ein OB-Polypeptid aus einer bestimmten Art von Tier ist, kann auf der Grundlage der positiven Bindung mit OB-Polypeptid, welches von Zellen dieser Art von Tier exprimiert oder aus ihnen isoliert wurde, ausgewählt werden.
Die zuvor genannten Antikörper können in Verfahren verwendet werden, welche im Stand der Technik bezüglich der Lokalisation und Aktivität des OB-R-Polypeptids bekannt sind, z. B. für Western-Blots, zum Sichtbarmachen des OB-R-Polypeptids in situ, zum Messen der Mengen davon in geeigneten physiologischen Proben, zum Nachweisen der Expression von OB-R, usw.
In einer spezifischen Ausführungsform können Antikörper, welche die Aktivität des OB-R-Polypeptids fördern oder ihr entgegenwirken, erzeugt werden. Solche Antikörper können unter Verwendung der infra beschriebenen Assays zum Identifizieren von Liganden getestet werden.
In einem besonderen Aspekt werden Antikörper durch Immunisieren von Kaninchen mit synthetischen Peptiden, welche durch die Proteinsequenz vorhergesagt wurden, oder mit rekombinanten Proteinen, welche unter Verwendung von bakteriellen Expressionsvektoren hergestellt wurden, entwickelt. Die Wahl der synthetischen Peptide wird nach einer sorgfältigen Analyse der vorhergesagten Proteinstruktur, wie oben beschrieben, durchgeführt. Insbesondere werden Peptidsequenzen zwischen möglichen Spaltstellen gewählt. Synthetische Peptide werden an einen Träger, wie KLH-Hämocyanin oder BSA unter Verwendung von Carbodiimid konjugiert und in Freund'schem Adjuvans verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Um das rekombinante Protein herzustellen, kann der pGEX-Vektor verwendet werden, um das Polypeptid zu exprimieren [Smith et al., 1988, supra]. Alternativ kann man nur hydrophile Domänen verwenden, um das Fusionsprotein zu erzeugen. Das exprimierte Protein wird in Menge hergestellt und verwendet werden, um Kaninchen in Freund'schem Adjuvans zu immunisieren.
In einer spezifischen Ausführungsform, infra, können Peptide, welche den Aminosäureresten 145–158, 465–484, 863–881 und 420–641 entsprechen (aus dem Mäuse-OB-R-Polypeptid, in irgendeiner der SEQ ID NR: 8, 10 dargestellt), durch eine Festphasen-Peptidsynthese oder durch Expression, gegebenenfalls an einen Träger, wie KLH, konjugiert, erzeugt werden und verwendet werden, um Kaninchen, Ratten, Ziegen, Hühner, usw. zu immunisieren.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform wird rekombinantes OB-R-Polypeptid verwendet, um Hühner zu immunisieren, und die Hühner-Anti-OB-R-Antikörper werden aus dem Eidotter gewonnen, z. B. durch Affinitätsreinigung auf einer OB-R-Säule. Vorzugsweise werden Hühner, welche zur Immunisierung verwendet werden, unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten.
In noch einer anderen Ausführungsform wird rekombinantes OB-R-Polypeptid verwendet, um Kaninchen zu immunisieren, und die polyklonalen Antikörper werden vor der weiteren Verwendung immungereinigt. Die gereinigten Antikörper sind insbesondere für semiquantitative Assays geeignet, insbesondere zum Nachweisen der Anwesenheit der zirkulierenden (löslichen) Spleißform/en des OB-R-Polypeptids in Serum oder Plasma.
Gruppen von monoklonalen Antikörpern, welche gegen Modulatorpeptide hergestellt wurden, können auf verschiedene Eigenschaften gescreent werden, d. h. Isotyp, Epitop, Affinität, usw. Von besonderem Interesse sind monoklonale Antikörper, welche die Aktivität des Modulatorpeptids neutralisieren. Solche Monoklonalen können einfach in Aktivitätsassays für die Gewichtsmodulatoren identifiziert werden. Antikörper mit hoher Affinität sind ebenfalls geeignet, wenn eine Immunaffinitätsreinigung von nativem oder rekombinantem Polypeptid gewünscht ist.
Vorzugsweise ist der Anti-Modulator-Antikörper, welcher in den hier offenbarten diagnostischen und therapeutischen Verfahren verwendet wird, ein affinitätsgereinigter polyklonaler Antikörper. Weiter bevorzugt ist der Antikörper ein monoklonaler Antikörper (mAb). Zusätzlich ist es für die Anti-Modulator-Antikörpermoleküle, welche hier verwendet werden, vorzuziehen, dass sie in Form von Fab-, Fab'-F(ab')₂- oder F(v)-Abschnitten der vollständigen Antikörpermoleküle vorliegen.
Diagnostik
Die vorliegende Offenbarung betrifft ebenfalls eine Vielzahl von diagnostischen Anwendungen, einschließlich von Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von Bedingungen und/oder Stimuli, welche Abnormalitäten im Körpergewicht oder der Adiposität beeinflussen, bezüglich ihrer Fähigkeit, die Aktivitäten auszulösen, welche durch die vorliegenden OB-R-Polypeptide vermittelt werden. Wie früher erwähnt wurde, können die Peptide verwendet werden, um Antikörper gegen sich selber durch eine Vielzahl von bekannten Techniken herzustellen, und solche Antikörper könnten anschließend isoliert werden und in Tests für die Anwesenheit einer bestimmten transkriptionellen Aktivität in verdächtigen Zielzellen verwendet werden. Alternativ können die hier offenbarten Nukleinsäuren in der Diagnose eingesetzt werden.
Antikörperbasierte Diagnostik
Wie früher erwähnt, umfasst ein diagnostisches Verfahren, welches in der vorliegenden Offenbarung geeignet ist, das Untersuchen einer zellulären Probe oder eines Mediums mit Hilfsmitteln eines Assays, einschließlich einer effektiven Menge eines OB-R-Bindungspartners, wie eines Anti-Modulator-Antikörpers oder Leptin, vorzugsweise eines affinitätsgereinigten polyklonalen Antikörpers und weiter bevorzugt eines mAb. Zusätzlich ist es vorzuziehen, dass die hier verwendeten Antikörpermoleküle in Form von Fab-, Fab'-, F(ab')₂- oder F(v)-Abschnitten oder als vollständige Antikörpermoleküle vorliegen. Wie zuvor diskutiert, schließen Patienten, welche in der Lage sind, von diesen Verfahren zu profitieren, jene ein, die an Krebs, AIDS, Fettleibigkeit oder anderen Zuständen leiden, in denen ein abnormales Körpergewicht ein Bestandteil des Zustands darstellt.
Ebenfalls können Antikörper, einschließlich von sowohl polyklonalen, als auch monoklonalen Antikörpern, bestimmte diagnostische Anwendungen besitzen und können zum Beispiel für den Zweck des Nachweisens und/oder des Messens von Zuständen verwendet werden, in denen sich wahrscheinlich Abnormalitäten im Körpergewicht entwickeln oder entwickeln können.
Die diagnostischen Verfahren können verwendet werden, um OB-R in einer biologischen Probe aus einem Individuum nachzuweisen. Die biologische Probe kann eine biologische Flüssigkeit sein, wie Blut, Serum, Plasma, interstitielle Flüssigkeit, mehrfache Ergüsse, Urin, Cerebrospinalflüssigkeit und desgleichen, ist aber nicht darauf beschränkt. Vorzugsweise wird löslicher OB-R in Serum oder Urin nachgewiesen, welche beide einfach erhalten werden. Alternativ kann OB-R aus zellulären Quellen nachgewiesen werden, wie, aber nicht beschränkt auf, Hirngewebe-Biopsien, Fettzellen, Hoden, Herz und desgleichen. Zum Beispiel können Zellen von einem Individuum durch Biopsie erhalten werden und lysiert werden, z. B. durch zyklisches Gefrieren-Auftauen oder eine Behandlung mit einem milden cytolytischen Detergens, wie, aber nicht beschränkt auf TRITON-X-100^®, Polyoxyethylenester, Digitonin, IGEPAL/NONIDET P (NP)-40^® (Octylphenoxy)polyethoxyethanol, Saponin und desgleichen oder Kombinationen davon (siehe z. B. die internationale Patentveröffentlichung WO 92/08981 , veröffentlicht am 29. Mai 1992). In noch einer anderen Ausführungsform können Proben verwendet werden, welche sowohl Zellen, als auch Körperflüssigkeiten enthalten (siehe ibid.).
Die Anwesenheit von OB-R in Zellen oder in einer biologischen Flüssigkeit kann durch die üblichen immunologischen Verfahren festgestellt werden, welche für solche Bestimmungen anwendbar sind. Eine Anzahl von geeigneten Verfahren ist bekannt. Drei solcher Verfahren, welche insbesondere geeignet sind, verwenden entweder den OB-R (insbesondere die sezernierte Spleiß-Form), der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, Antikörper AB₁, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist, oder Antikörper Ab₂, der mit einer nachweisbaren Markierung markiert ist.
Die Verfahren und ihre Anwendung sind dem Fachmann alle geläufig und können folglich innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Offenbarung verwendet werden. Zum Beispiel wird ein "kompetitives" Verfahren in den U.S. Patenten Nr. 3,654,090 und 3,850,752 beschrieben. Ein "Sandwich"-Verfahren wird in den U.S. Patenten Nr. RE 31,006 und 4,016,043 beschrieben. Noch andere Verfahren sind bekannt, wie das "Doppelantikörper"- oder "DASP"-Verfahren.
Die für diese Studien am häufigsten eingesetzten Markierungen sind radioaktive Elemente, Enzyme, Chemikalien, welche fluoreszieren, wenn sie ultraviolettem Licht ausgesetzt werden, und andere.
Eine Anzahl von fluoreszenten Materialien ist bekannt und kann als Markierungen verwendet werden. Diese schließen zum Beispiel Fluoreszein, Rhodamin und Auramin ein. Ein besonderes Nachweismaterial ist ein Anti-Kaninchen-Antikörper, welcher in Ziegen hergestellt und mit Fluoreszein über ein Isothiocyanat konjugiert wurde.
Die radioaktive Markierung kann durch irgendeines der derzeitig verfügbaren Zählverfahren nachgewiesen werden. Das bevorzugte Isotop kann aus ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹²⁵I, ¹³¹I und ¹⁸⁶Re ausgewählt werden.
Enzymmarkierungen sind ebenfalls geeignet und können durch irgendeine der derzeit verwendeten kolorimetrischen, spektrophotometrischen, fluorospektrophotometrischen, amperometrischen und gasometrischen Techniken bestimmt werden. Das Enzym wird durch eine Reaktion mit Brückenmolekülen, wie Carbodiimiden, Diisocyanaten, Glutaraldehyd und desgleichen konjugiert. Viele Enzyme, welche in diesen Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und können verwendet werden. Die bevorzugten sind Peroxidase, β-Glucuronidase, β-D-Glucosidase, β-D-Galactosidase, Uresse, Glucoseoxidase plus Peroxidase und alkalische Phosphatase. Auf die U.S. Patente Nr. 3,654,090 , 3,850,752 und 4,016,043 wird sich exemplarisch für diese Offenbarung für alternatives Markierungsmaterial und Verfahren bezogen.
In einer weiteren Ausführungsform dieser Offenbarung können Testkits hergestellt werden, die zur Verwendung durch einen medizinischen Spezialisten geeignet sind, um die Anwesenheit oder Abwesenheit von OB-R in verdächtigen Zielzellen oder biologischen Flüssigkeiten zu bestimmen. Gemäß den oben diskutierten Testtechniken wird eine Klasse solcher Kits mindestens das markierte OB-R-Polypeptid oder seine Bindungspartner, zum Beispiel einen dafür spezifischen Antikörper, und Anleitungen, natürlich abhängig von dem ausgewählten Verfahren, enthalten, z. B. "kompetitiv", "Sandwich", "DASP" und desgleichen. Die Kits können ebenfalls periphere Reagenzien, wie Puffer, Stabilisatoren, usw. enthalten.
Nukleinsäure basierte Diagnostik
Wie in den Beispielen, infra, gezeigt wurde, können wie hier offenbarte Nukleinsäuren verwendet werden, um Defekte nachzuweisen, welche mit Defekten im OB-R-Polypeptid verbunden sind, welches mit einem fettleibigen Phänotyp verbunden ist. Zum Beispiel können Nukleinsäure-Sonden (z. B. in einer Northern-Analyse oder einer RT-PCR-Analyse) verwendet werden, um zu bestimmen, ob ein fettleibiger Phänotyp mit dem Fehlen der Expression von OB-R-mRNA oder der Expression von nicht funktionsfähiger OB-R-mRNA verbunden ist, z. B. wie in db/db-Mäusen (wo sich der Mangel aus einem Fehlen eines wirksamen Leptinrezeptors ergibt) oder wo eine Mutation eine nicht transkribierte mRNA ergibt. Außerdem können die hier offenbarten Nukleinsäure basierten Diagnosetechniken zusammen mit Antikörper basierten Techniken verwendet werden, um weiterhin ein molekulares Verstehen von fettleibigen oder anroektischen Phänotypen zu entwickeln.
Humane cDNA-Klone können sequenziert werden. Dies vereinfacht die Bestimmung der vollständigen Sequenz des humanen Gens. DNA-Sequenzen aus den Introns des humanen OB-R-Gens können so erhalten werden, und diese können verwendet werden, um PCR-Primer herzustellen, um die kodierende Sequenz des OB-R-Gens aus humaner genomischer DNA mit einer PCR zu amplifizieren, um Mutationen oder Allelvarianten des OB-R-Gens zu identifizieren, alles in Übereinstimmung mit den Protokollen, welche hier zuvor detailliert beschrieben wurden.
Die derzeitige Hypothese ist, dass heterozygote Mutationen im DB-Gen mit einer milden/moderaten Fettleibigkeit verbunden sein werden, während homozygote Mutationen mit einer schweren Fettleibigkeit verbunden sein würden. Dies würde die Feststellung von Personen mit einem Risiko für die Entwicklung von Fettleibigkeit erlauben und die Anwendung einer Arzneimittelbehandlung und/oder von Änderungen des Lebensstils möglich machen, bevor ein erhöhtes Körpergewicht vollständig entwickelt ist.
Alternativ kann die Anwesenheit von Mikrosatelliten, welche mit mutierten Formen des humanen ob-r segregieren, für eine Diagnose verwendet werden. Verschiedene PCR-Primer können diesbezüglich verwendet werden.
Das OB-R-Gen kann ebenfalls diagnostisch für Messungen seiner kodierten RNA und seines Proteins bei Ernährungsstörungen geeignet sein. Es wird in einer bestimmten Ernährungsstörung von Wichtigkeit sein, zu wissen, ob OB-R-RNA und/oder sein kodiertes Protein hochreguliert oder herunterreguliert ist. Wenn eine fettleibige Person erhöhte Mengen OB-R aufweist, würde es daher sichtbar werden, dass das Problem strangabwärts von OB-R liegt, während, wenn die OB-R-Expression reduziert ist, es sichtbar werden würde, das unangemessen niedrige Mengen von OB-R die Ursache der Fettleibigkeit sein kann (egal, ob der Defekt im OB-R-Gen liegt, oder nicht). Wenn ein Krebs- oder AIDS-Patient, welcher Gewicht verloren hat, erhöhte Mengen OB-R aufweist, kann umgekehrt geschlossen werden, dass eine unangemessen hohe Expression von OB-R für den Gewichtsverlust verantwortlich ist.
Die vorliegende Offenbarung befasst sich nicht nur mit unangemessenen Mengen der Expression von OB-R, sondern auch mit der Expression von nicht funktionsfähigen oder dysfunktionellen Spleißformen. Die hier offenbarte Nukleinsäure-Diagnostik stellt ein Bestimmen bereit, ob die hauptsächlich exprimierte Form dysfunktional ist, z. B. für eine Signaltransduktion. Wie in den Beispielen, infra, gezeigt wurde, exprimieren db mutierte Mäuse (C57BL/Ks db/db) eine längere OB-R-mRNA (wie durch RT-PCR bestimmt wurde).
Therapeutika
Die hier offenbarten Polypeptide, Nukleinsäuren und Antikörper weisen ein erhebliches therapeutisches Potenzial auf. Vorzugsweise wird eine therapeutisch wirksame Menge eines solchen Mittels (z. B. die lösliche Form des Proteins oder DNA für eine Gentherapie oder eine Antisense-Nukleinsäure, um der Leptinaktivität entgegenzuwirken) in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, Verdünnungsmittel oder Bindemittel verabreicht.
Der Begriff "pharmazeutisch verträglich" betrifft molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, welche physiologisch tolerierbar sind und nicht typischerweise eine allergische oder ähnlich unpassende Reaktion hervorrufen, wie Magenstörung, Schwindel und desgleichen, wenn sie an einen Menschen verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann der Begriff "pharmazeutisch verträglich", so wie hier verwendet, bedeuten, von einer Aufsichtsbehörde der Bundes- oder einer Staats-Regierung genehmigt zu sein oder in der U.S. Pharmacopeia oder anderen allgemein bekannten Arzneimittelbüchern für die Verwendung in Tieren und insbesondere in Menschen aufgeführt zu sein. Der Begriff "Träger" betrifft ein Verdünnungsmittel, Adjuvans, Bindemittel oder Träger, mit welchem die Verbindung verabreicht wird. Solche pharmazeutischen Träger können sterile Flüssigkeiten sein, wie Wasser und Öle, einschließlich von jenen mit Erdöl-, tierischem, pflanzlichem oder synthetischem Ursprung, wie Erdnussöl, Sojabohnenöl, Mineralöl, Sesamöl und desgleichen. Wasser oder Salzlösungs-Lösungen und wässrige Dextrose- und Glycerollösungen werden vorzugsweise als Träger eingesetzt, insbesondere für injizierbare Lösungen. Geeignete pharmazeutische Träger werden in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., Mack Publishing Co., Esston, PA (1990) beschrieben.
Der Begriff "therapeutisch wirksame Menge" wird hier verwendet, um eine Menge zu bezeichnen, welche ausreicht, um einen klinisch erheblichen Mangel der Aktivität, Funktion und Antwort des Wirts um mindestens 15%, vorzugsweise um min destens 50%, weiter bevorzugt um mindestens 90% zu reduzieren und am meisten bevorzugt, um ihn zu verhindern. Alternativ ist eine therapeutisch wirksame Menge ausreichend, um eine Verbesserung in einem klinisch erheblichen Zustand im Wirt zu verursachen. Eine Modulation der OB-R-Aktivität kann zum Reduzieren des Körpergewichts (durch Erhöhen seiner Aktivität) oder Erhöhen des Körpergewichts (durch Vermindern seiner Aktivität) geeignet sein.
Von einer Verabreichung von rekombinantem löslichem OB-R-Polypeptid, welches OB-Re entspricht, wird erwartet, dass es zu einem Gewichtsverlust, insbesondere einer Abnahme des Fettgewebes führt. Der lösliche Typ des OB-Re-Polypeptids kann unter Verwendung von bakteriellen und/oder Säugetier-Standard-Expressionsvektoren, synthetisch oder aus Plasma oder Serum aufgereinigt hergestellt werden, alles wie hier zuvor detailliert beschrieben. Alternativ kann eine erhöhte Expression von nativem löslichen OB-R-Polypeptid durch homologe Rekombinationstechniken, wie supra beschrieben, induziert werden.
Eine Reduktion der Leptinaktivität (durch Entwickeln von Antagonisten, Inhibitoren, der Verwendung von neutralisierenden Antikörpern oder Antisense-Molekülen) sollte zu einer Gewichtszunahme führen, wie sie für die Behandlung des Gewichtsverlustes gewünscht sein könnte, welcher mit Krebs, AIDS oder Magersucht verbunden ist. In einer Ausführungsform kann eine Leptin bindende Form des löslichen OB-R eingesetzt werden, welcher Abschnitte fehlen, die für eine Signaltransduktion oder Verstärkung nötig sind.
Polypeptid basierte therapeutische Behandlung
In der einfachsten Analyse ist das OB-R-Gen eng mit der Bestimmung des Körpergewichts in Tieren, insbesondere in Mäusen, Ratten, Hunden und Menschen verbunden. Das OB-R-Genprodukt und entsprechend verwandte Moleküle scheinen einen Teil eines Signalweges darzustellen, mit welchem das Fettgewebe mit dem Gehirn und den anderen Organen kommuniziert. Es wird angenommen, dass mindestens eine Spleißform des OB-R-Polypeptids (z. B. OB-Rb) selber ein Signalmolekül darstellt, d. h. einen Rezeptor für das Hormon Leptin.
Das lösliche OB-R-Polypeptid oder funktionell aktive Fragmente davon oder ein Antagonist davon können oral oder parenteral, vorzugsweise parenteral verabreicht werden. Da die metabolische Homeostase ein kontinuierlicher Vorgang ist, wird eine Verabreichung mit kontrollierter Freisetzung des löslichen OB-R-Polypeptids (OB-Re) bevorzugt. Zum Beispiel kann das Polypeptid unter Verwendung einer intravenösen Infusion, einer implantierbaren osmotischen Pumpe, eines transdermalen Pflasters, von Liposomen oder auf andere Arten der Verabreichung verabreicht werden. In einer Ausführungsform kann eine Pumpe verwendet werden [Langer et al., Hrsg., Medical Applications of Controlled Relase, CRC Press, Boca Raton, Florida (1974), Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng., 14: 201 (1987), Buchwald et al., Surgery, 88: 507 (1980), Saudek et al., N. Engl. J. Med., 321: 574 (1989)]. In einer anderen Ausführungsform können polymere Materialien verwendet werden [Langer, 1974, supra, Sefton, 1987, supra, Smolen et al., Hrsg., Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Wiley, New York (1984), Ranger et al., J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem., 23: 61 (1983), siehe ebenfalls Levy et al., Science, 228: 190 (1985), During et al., Ann. Neurot., 25: 351 (1989), Howard et al., J. Neurosurg., 71: 105 (1989)]. In noch einer anderen Ausführungsform kann ein kontrolliertes Freisetzungssystem in die Nähe des therapeutischen Ziels gebracht werden, d. h. des Gehirns, so dass nur ein Anteil der systemischen Dosis benötigt wird [siehe z. B. Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, Band 2, S. 115–138 (1984)]. Andere kontrollierte Freisetzungssysteme werden im Überblick von Langer, Science, 249: 1527–1533 (1990) diskutiert. In einer anderen Ausführungsform kann die therapeutische Verbindung in einem Vesikel abgegeben werden, insbesondere einem Liposom [siehe Langer, 1990, supra, Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein und Fidler (Hrsg.), Liss, New York, S. 353–365 (1989), Lopez-Berestein, ibid, S. 317–327, siehe allgemein ibid.].
In einem weiteren Aspekt können rekombinante Zellen, welche mit der löslichen Spleißform der OB-R-cDNA transformiert wurden (z. B. OB-Re, welches hier verwendet werden wird, um einen löslichen OB-R-Agonisten des Leptins zu bezeichnen), und welche hohe Mengen des Polypeptids exprimieren, in ein Individuum transplantiert werden, welches eine Verstärkung der Leptinaktivität benötigt. Vorzugsweise werden autologe Zellen, welche mit OB-Re transformiert wurden, transplantiert, um eine Abstoßung zu verhindern, alternativ ist eine Technologie verfügbar, um nicht autologe Zellen abzuschirmen, welche lösliche Faktoren innerhalb einer Polymermatrix herstellen, welche eine Immunerkennung und Abstoßung verhindert.
Das OB-Re-Polypeptid kann durch intravenöse, intraarterielle, intraperitoneale, intramuskuläre oder subkutane Wege der Verabreichung abgegeben werden. Alternativ kann das OB-Re-Polypeptid, richtig formuliert, durch nasale oder orale Verabreichung verabreicht werden. Eine dauerhafte Versorgung mit OB-Re kann durch Bereistellen einer therapeutisch wirksamen Dosis (d. h. einer Dosis, welche wirksam ist, um metabolische Veränderungen in einem Individuum zu induzieren) in den nötigen Intervallen, z. B. täglich, alle 12 Stunden, usw. sichergestellt werden. Diese Parameter werden von der Schwere des zu behandelnden Krankheitszustands, anderen Aktivitäten, wie eine Diätmodifikation, welche ausgeführt werden, vom Gewicht, Alter und dem Geschlecht des Individuums und von anderen Kriterien abhängen, welche einfach gemäß der guten medizinischen Standardpraxis vom Fachmann bestimmt werden können.
Es kann einfach vom Fachmann erkannt werden, dass irgendein lösliches OB-R-Polypeptid, z. B. ein Leptinantagonist, ebenfalls wie oben für OB-Re beschrieben wurde, verabreicht werden kann.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung werden pharmazeutische Zusammensetzungen des oben erwähnten bereitgestellt. Solche pharma zeutischen Zusammensetzungen können für eine Verabreichung durch Injektion, oder für eine orale, pulmonale, nasale oder andere Formen der Verabreichung sein. Im Allgemeinen werden von dieser Offenbarung pharmazeutische Zusammensetzungen eingeschlossen, welche wirksame Mengen des Proteins oder Derivatprodukte zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsvermittlern, Emulgatoren, Adjuavantien und/oder Trägern umfassen. Solche Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit unterschiedlichem/r Puffergehalt (z. B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und Ionenstärke, Zusatzstoffe, wie Detergenzien und lösungsvermittelnde Mittel (z. B. Tween 80, Polysorbat 80), Antioxidantien (z. B. Ascorbinsäure, Natirummetabisulfit), Konservierungsstoffe (z. B. Thimerosal, Benzylalkohol) und Füllsubstanzen (z. B. Lactose, Mannitol), den Einschluss des Materials in Teilchenpräparationen polymerer Verbindungen, wie Polymilchsäure, Polyglykolsäure, usw. oder in Liposomen, ein. Hyaluronsäure oder andere anionische Polymere können ebenfalls verwendet werden. Solche Zusammensetzungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in vivo Freisetzung und die Geschwindigkeit der in vivo Clearance des vorliegenden Proteins und der Derivate beeinflussen [siehe z. B. Martin, Remginton's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., (1990, Mack Publishing Co., Esston, PA 18042) Seiten 1435–1712]. Die Zusammensetzungen können in flüssiger Form hergestellt werden oder können in Form von getrocknetem Pulver, wie in lyophilisierter Form, vorliegen.
Orale Abgabe
Für die Verwendung hier sind orale feste Dosierungsformen eingeschlossen, welche im Allgemeinen in Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Aufl., (1990 Mack Publishing Co. Esston PA 18042) in Kapitel 89 beschrieben werden. Feste Dosierungsformen schließen Tabletten, Kapseln, Pillen, Pastillen oder Lutschpastillen, Stärkekapseln oder Kügelchen ein. Liposomale oder proteinoide Einkapselungen können ebenfalls verwendet werden, um die vorliegenden Zusammensetzungen zu formulieren (wie zum Beispiel proteinoide Mikrokugeln [ U.S. Patent Nr. 4,925,673 ]). Eine liposomale Einkapselung kann verwendet werden, und die Liposomen können mit verschiedenen Polymeren derivatisiert werden [z. B. U.S. Patent Nr. 5,013,556 ]. Eine Beschreibung von möglichen festen Dosierungsformen für die Therapeutik wird von Marshall in Modem Pharmaceutics, Kapitel 10, Banker und Rhodes, Hrsg. (1979) gegeben, die Formulierung wird das Protein (oder das chemisch modifizierte Protein) und inerte Inhaltsstoffe einschließen, welche einen Schutz gegen die Magenumgebung und eine Freisetzung des biologisch aktiven Materials im Darm zulassen.
Ebenfalls spezifisch eingeschlossen sind orale Dosierungsformen der oben erwähnten derivatisierten Proteine. Das Protein kann chemisch modifiziert werden, so dass eine orale Abgabe des Derivats wirksam ist. Im Allgemeinen stellt die eingeschlossene chemische Modifikation eine Anheftung von mindestens einem Rest an das Protein-(oder Peptid-)Molekül selber dar, wobei der Rest (a) eine Inhibition der Proteolyse und (b) eine Aufnahme in dem Blutstrom aus dem Magen oder Darm ermöglicht. Ebenfalls gewünscht ist die Zunahme der Gesamtstabilität des Proteins und die Zunahme der Zirkulationszeit im Körper. Beispiele solcher Reste schließen: Polyethylenglykol, Copolymere aus Ethylenglykol, und Propylenglykol, Carboxyxmethylcellulose, Dextran, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon und Polyprolin ein [Abuchowski et al., 1981, supra, Newmark et al., J. Appl. Biochem., 4: 185–189 (1982)]. Andere Polymere, welche verwendet werden könnten, sind Poly-1,3-dioxolan und Poly-1,3,6-trioxocan. Bevorzugt für die pharmazeutische Verwendung sind, wie oben angegeben, Polyethylenglykolreste.
Für das Protein (oder Derivat) kann der Ort der Freisetzung der Magen, der Dünndarm (das Duodenum, das Jejunum oder das Ileum) oder der Dickdarm sein. Der Fachmann hat Formulierungen verfügbar, welche sich im Magen nicht auflösen, aber das Material im Duodenum oder irgendwo anders im Darm freisetzen werden. Vorzugsweise wird die Freisetzung die schädlichen Wirkungen der Magenumgebung vermeiden, entweder durch Schutz des Proteins (oder Derivats) oder durch Freisetzung des biologisch aktiven Materials außerhalb der Magenumgebung, wie im Darm.
Um eine vollständige Magenresistenz sicherzustellen, ist eine Beschichtung erforderlich, welche bis mindestens pH-Wert 5,0 impermeabel ist. Beispiele für gängigere inerte Inhaltsstoffe, welche als enterische Beschichtungen verwendet werden, sind Zelluloseacetattrimellitat (CAT), Hydroxypropylmethylzellulosephthalat (HPMCP), HPMCP 50, HPMCP 55, Polyvinylacetatphthalat (PVAP), Eudragit L30D, Aquateric, Zelluloseacetatphthalat (CAP), Eudragit L, Eudragit S und Schellack. Diese Beschichtungen können als gemischte Filme verwendet werden.
Eine Beschichtung oder ein Gemisch aus Beschichtungen kann ebenfalls auf Tabletten verwendet werden, welche nicht für einen Schutz gegen den Magen gedacht sind. Dieses kann Zuckerbeschichtungen einschließen, oder Beschichtungen, welche es einfacher machen, die Tablette zu schlucken. Kapseln können aus einer harten Hülle (wie Gelatine) zur Abgabe eines trockenen Therapeutikums bestehen, z. B. eines Pulvers, für flüssige Formen kann eine weiche Gelatinehülle verwendet werden. Das Hüllmaterial von Stärkekapseln könnte dicke Stärke oder ein anderes essbares Papier sein. Für Pillen, Lutschpastillen, gepresste Tabletten oder Tablettenpulver können feuchtigkeitskonzentrierende Techniken verwendet werden.
Das Therapeutikum kann in die Formulierung als feine Mikropartikel in Form von Granula oder Kügelchen mit einer Partikelgröße von ungefähr 1 mm eingeschlossen werden. Die Formulierung des Materials zur Kapselverabreichung könnte ebenfalls als Pulver, leicht komprimierte Pfropfen oder sogar als Tabletten stattfinden. Das Therapeutikum könnte durch Kompression hergestellt werden.
Farbstoffe und Aromastoffe können alle eingeschlossen werden. Zum Beispiel kann das Protein (oder Derivat) formuliert werden (wie durch Liposomen- oder Mikrokugeleinkapselung) und anschließend weiter in ein essbares Produkt, wie ein gekühltes Getränk, aufgenommen werden, welches Farbstoffe und Aromastoffe enthält.
Das Therapeutikum kann mit einem inerten Material verdünnt werden oder sein Volumen kann damit erhöht werden. Diese Verdünnungsmittel könnten Kohlenhydrate, insbesondere Mannitol, α-Lactose, wasserfreie Lactose, Zellulose, Saccharose, modifizierte Dextrane und Stärke einschließen. Bestimmte anorganische Salze können ebenfalls als Füllstoffe verwendet werden, einschließlich von Calciumtriphosphat, Magnesiumcarbonat und Natriumchlorid. Einige kommerziell verfügbare Verdünnungsmittel sind Fast-Flo, Emdex, STA-Rx 1500, Emcompress und Avicell.
Disintegrantien können in die Formulierung des Therapeutikums in eine feste Dosierungsform eingeschlossen werden. Materialien, welche als Disintegrantien verwendet werden, schließen Stärke, einschließlich des komerziellen, auf Stärke basierenden Disintegrans Explotab, ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Natriumstärkeglykolat, Amberlit, Natriumcarboxymethylzellulose, Ultramylopektin, Natriumalginat, Gelatine, Orangenschale, saure Carboxymethylzellulose, natürlicher Schwamm und Bentonit können alle verwendet werden. Eine andere Form der Disintegrantien sind die unlöslichen kationischen Austauschharze. Pulverisierte Gummis können als Desintegrantien und als Bindemittel verwendet werden, und diese können pulverisierte Gummis, wie Agar, Karaya und Tragacanth einschließen. Alginsäure und seine Natriumsalze sind ebenfalls als Disintegrantien geeignet.
Bindemittel können verwendet werden, um das therapeutische Mittel zusammenzuhalten, um einen feste Tablette zu bilden, und schließen Materialen aus natürlichen Produkten, wie Akazie, Tragacanth, Stärke und Gelatine ein. Andere schließen Methylzellulose (MC), Ethylzellulose (EC) und Carboxymethylzellulose (CMC) ein. Polyvinylpyrrolidon (PVP) und Hydroxypropylmethylzellulose (HPMC) könnten beide in alkoholischen Lösungen verwendet werden, um das Therapeutikum zu granulieren.
Ein Anti-Abriebmittel kann in die Formulierung des Therapeutikums eingeschlossen werden, um ein Haftenbleiben während des Formulierungsverfahrens zu ver hindern. Gleitmittel können als Schicht zwischen dem Therapeutikum und der Pressformwand verwendet werden, und diese können: Stearinsäure, einschließlich seiner Magnesium- und Calciumsalze, Polytetrafluorethylen (PTFE), Paraffinöl, Pflanzenöle und Wachse einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. Lösliche Gleitmittel können ebenfalls verwendet werden, wie Natriumlaurylsulfat, Magnesiumlaurylsulfat, Polyethylenglykol mit verschiedenen Molekulargewichten und Carbowax 4000 und 6000.
Flussregulierungsmittel, welche die Fließeigenschaften des Arzneimittels während der Formulierung verbessern könnten und um eine Wiederanordnung während der Kompression zu unterstützen, könnten hinzugefügt werden. Die Flussregulierungsmittel können Stärke, Talk, pyrogenes Silika und hydriertes Silikoaluminat einschließen.
Um die Lösung des Therapeutikums in der wässrigen Umgebung zu unterstützen, könnte ein oberflächenaktives Mittel als Benetzungsmittel hinzugefügt werden. Oberflächenaktive Mittel können anionische Detergenzien einschließen, wie Natriumlaurylsulfat, Dioctylnatriumsulfosuccinat und Dioctylnatriumsulfonat. Kationische Detergenzien könnten verwendet werden und könnten Benzalkoniumchlorid und Benzethomiumchlorid einschließen. Die Liste von möglichen nichtionischen Detergenzien, welche in die Formulierung als oberflächenaktive Mittel eingeschlossen werden könnten, ist Lauromacrogol 400, Polyoxyl 40-Stearat, Polyoxyethylen, hydriertes Rizinusöl 10, 50 und 60, Glycerinmonostearat, Polysorbat 40, 60, 65 und 80, Saccharosefettsäureester, Methylzellulose und Carboxymethylcellulose. Diese oberflächenaktiven Mittel könnten in der Formulierung des Proteins oder Derivats entweder alleine oder als ein Gemisch mit verschiedenen Verhältnissen anwesend sein.
Zusatzstoffe, welche möglicherweise die Aufnahme des Proteins (oder Derivats) verstärken, sind zum Beispiel die Fettsäuren Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.
Eine Formulierung mit kontrollierter Freisetzung kann gewünscht sein. Das Arzneimittel könnte in eine inerte Matrix eingeschlossen werden, welche eine Freisetzung entweder durch Diffusions- oder Auslaug-Mechanismen erlaubt, z. B. Kaugummis. Langsam degenerierende Matrices können ebenfalls in die Formulierung eingeschlossen werden. Eine andere Form einer kontrollierten Freisetzung dieses Therapeutikums ist durch ein Verfahren, welches auf dem therapeutischen Oros-System basiert (Alza Corp.), d. h. das Arzneimittel wird in eine semipermeable Membran eingeschlossen, welche es Wasser erlaubt einzutreten und das Arzneimittel durch eine einzige kleine Öffnung aufgrund von osmotischen Wirkungen herauszudrücken. Einige enterische Beschichtungen weisen ebenfalls eine verzögerte Freisetzungswirkung auf.
Andere Beschichtungen können für die Formulierung verwendet werden. Diese schließen eine Vielzahl von Zuckern ein, welche in einem Beschichtungstiegel aufgebracht werden könnten. Das therapeutische Mittel könnte ebenfalls in einer filmbeschichteten Tablette gegeben werden. Die Materialien, welche in diesem Fall verwendet werden, sind in zwei Gruppen aufgeteilt. Die ersten sind die nicht enterischen Materialien und schließen Methylzellulose, Ethylzellulose, Hydroxyethylzellulose, Methylhydroxy-Ethylzellulose, Hydroxypropylzellulose, Hydroxypropyl-Methylzellulose, Natriumcarboxymethylzellulose, Providon und Polyethylenglykole ein. Die zweite Gruppe besteht aus den enterischen Materialien, welche gewöhnlich Ester der Phthalsäure sind.
Ein Gemisch aus Materialien könnte verwendet werden, um die optimale Filmbeschichtung bereitzustellen. Eine Filmbeschichtung kann in einem Tiegelbeschichter oder in einem Fließbett oder durch Kompressionsbeschichtung durchgeführt werden.
Pulmonale Abgabe
Ebenfalls hier eingeschlossen ist die pulmonale Abgabe des vorliegenden löslichen Proteins (oder der Derivate davon). Das Protein (oder Derivat) wird an die Lungen eines Säugetiers beim Einatmen abgegeben und durchdringt die epitheliale Auskleidung der Lunge in den Blutstrom. Andere Berichte davon schließen Adjei et al., Pharmaceutical Research, 7(6): 565–569 (1990), Adjei et al., International Journal of Pharmaceutics, 63: 135–144 (1990) (Leuprolidacetat), Braquet et al., Journal of Cardiovascular Pharmacology, 13 (Suppl. 5): 143–146 (1989) (Endothelin-1), Hubbard et al., Annals of Intemal Medicine, 3(3): 206–212 (1989) (α1-Antitrypsin), Smith et al., J. Clin. Invest., 84: 1145–1146 (1989) (α1-Proteinase), Oswein et al., "Aerosolization of Proteins", Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II, Keystone, Colorado, (März 1990), (rekombinantes humanes Wachstumshormon), Debs et al., J. Immunol., 140: 3482–3488 (1988) und Platz et al., U.S. Patent Nr. 5,284,656 (Granulozytenkolonie stimulierender Faktor) ein. Vorgesehen für die Verwendung in der Ausführung dieser Offenbarung ist ein weiter Bereich von mechanischen Geräten, welche für eine pulmonale Abgabe von therapeutischen Produkten entworfen wurden, einschließlich von, aber nicht beschränkt auf Zerstäuber, Dosierinhalatoren und Pulverinhalatoren, welche dem Fachmann alle geläufig sind.
Einige spezifische Beispiele für kommerziell verfügbare Geräte, welche für die Ausführung dieser Offenbarung geeignet sind, sind der Ultravent-Zerstäuber, hergestellt von Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri, der Acorn II-Zerstäuber, hergestellt von Marquest Medical Products, Englewood, Colorado, der Ventolin-Dosierinhalator, hergestellt von Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina und der Spinhaler-Pulverinhalator, hergestellt von Fisons Corp., Redford, Massachusetts.
Alle solche Geräte erfordern die Verwendung von Formulierungen, welche zum Verteilen des Proteins (oder Derivats) geeignet sind. Typischerweise ist jede Formulierung spezifisch für den Typ des eingesetzten Geräts und kann die Verwendung eines geeigneten Treibmittelmaterials einschließen, zusätzlich zu den üblichen Verdünnungsmitteln, Adjuvantien und/oder Trägern, welche für die Therapie geeignet sind. Die Verwendung von Liposomen, Mikrokapseln oder Mikrokugeln, Inklusionskomplexen oder anderen Typen von Trägern ist ebenfalls eingeschlos sen. Chemisch modifiziertes Protein kann ebenfalls in verschiedenen Formulierungen hergestellt werden, abhängig vom Typ der chemischen Modifikation oder vom Typ des eingesetzten Geräts.
Formulierungen, welche für eine Verwendung in einem Zerstäuber, entweder einem Düsen- oder einem Ultraschall-Zerstäuber, geeignet sind, werden typischerweise ein Protein (oder Derivat) gelöst in Wasser in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 25 mg biologisch aktives Protein pro ml Lösung umfassen. Die Formulierung kann ebenfalls einen Puffer und einen einfachen Zucker einschließen (z. B. zur Proteinstabilisierung und Regulierung des osmotischen Drucks). Die Zerstäuberformulierung kann ebenfalls ein oberflächenaktives Mittel enthalten, um eine oberflächeninduzierte Aggregation des Proteins zu reduzieren oder zu verhindern, welche durch die Zerstäubung der Lösung beim Bilden des Aerosols verursacht wird.
Formulierungen zur Verwendung in einem Dosierinhalatorgerät werden im Allgemeinen ein fein zerteiltes Pulver enthalten, welches das Protein (oder Derivat) enthält, welches mit Hilfe eines oberflächenaktiven Mittels in einem Treibmittel suspendiert ist. Das Treibmittel kann irgendein gängiges Material sein, welches für diesen Zweck eingesetzt wird, wie ein Chlorfluorkohlenstoff, ein Chlorfluorkohlenwasserstoff, ein Fluorkohlenwasserstoff oder ein Kohlenwasserstoff, einschließlich von Trichlorfluormethan, Dichlordifluormethan, Dichlortetrafluorethanol und 1,1,1,2-Tetrafluorethan oder Kombinationen davon. Geeignete oberflächenaktive Mittel schließen Sorbitantrioleat und Sojalecithin ein. Ölsäure kann ebenfalls als ein oberflächenaktives Mittel geeignet sein.
Formulierungen zum Verteilen aus einem Pulverinhalatorgerät werden ein fein zerteiltes Trockenpulver umfassen, welches das Protein (oder Derivat) enthält, und können ebenfalls ein Füllmittel, wie Lactose, Sorbitol, Saccharose oder Mannitol in Mengen einschließen, welche eine Verteilung des Pulvers aus dem Gerät unterstützen, z. B. 50 bis 90 Gew.-% der Formulierung. Das Protein (oder Derivat) sollte am vorteilhaftesten in Teilchenform mit einer durchschnittlichen Teilchen größe von weniger als 10 μm (oder Mikrometer), am meisten bevorzugt 0,5 bis 5 μm, für die wirksamste Abgabe an die distale Lunge hergestellt werden.
Nasale Abgabe
Eine nasale Abgabe des Proteins (oder Derivats) ist ebenfalls eingeschlossen. Eine nasale Abgabe erlaubt die Passage des Proteins in den Blutstrom direkt nach der Verabreichung des therapeutischen Produkts an die Nase, ohne die Notwendigkeit der Ablagerung des Produkts in der Lunge. Formulierungen für eine nasale Abgabe schließen jene mit Dextran oder Cyclodextran ein.
Verfahren der Behandlung, Verfahren des Herstellens eines Medikaments
In noch einem anderen Aspekt der vorliegenden Offenbarung werden Verfahren der Behandlung und Herstellung eines Medikaments bereitgestellt. Die Zustände, die durch die Verabreichung der vorliegenden Derivate gelindert oder moduliert werden, sind jene, welche oben angegeben sind.
Dosierungen
Für alle der oben erwähnten Moleküle werden Informationen bezüglich der geeigneten Dosierungsmengen zur Behandlung verschiedener Zustände in verschiedenen Patienten bekannt werden, wenn weitere Studien durchgeführt werden, und der Fachmann wird unter Berücksichtigung des therapeutischen Zusammenhangs, des Alters und der allgemeinen Gesundheit des Empfängers in der Lage sein, die richtige Dosierung festzulegen. Im Allgemeinen wird die Dosierung für eine Injektion oder Infusion zwischen 0,01 μg biologisch aktives Protein/kg Körpergewicht (wobei die Masse des Proteins alleine ohne chemische Modifikation berechnet wird) und 10 mg/kg (auf derselben Grundlage) liegen. Der Dosierungsplan kann abhängig von der Zirkulationshalbwertszeit des verwendeten Proteins oder Derivats, ob das Polypeptid durch eine Bolusdosis oder kontinuierliche Infusion abgegeben wird, und der verwendeten Formulierung variieren.
Verabreichung mit anderen Verbindungen
Für eine mit Fettleibigkeit verbundene Therapie kann das vorliegende lösliche Protein (oder die Derivate) zusammen mit einer oder mehreren pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, die zum Behandeln anderer klinischer Komplikationen der Fettleibigkeit verwendet werden, wie jene, welche zur Behandlung von Diabetes (z. B. Insulin), Bluthochdruck, hohem Cholesterinspiegel und anderen nachteiligen Zuständen, welche als Nebenwirkung der Fettleibigkeit auftreten, verwendet werden. Ebenfalls können andere Appetitunterdrücker gleichzeitig verabreicht werden, z. B. Amphetamine. Die Verabreichung kann gleichzeitig (zum Beispiel eine Verabreichung eines Gemisches des vorliegenden Proteins und Insulin) oder in seriatim stattfinden.
Nukleinsäure basierte therapeutische Behandlung
Ein OB-R-Gen, welches in der Lage zum Vermitteln einer Signaltransduktion ist, z. B. OB-Rb, könnte in humane Hypothalamuszellen eingeführt werden, um eine Gentherapie für Fettleibigkeit zu entwickeln. Von einer solchen Therapie würde erwartet werden, dass sie das Körpergewicht vermindert. Umgekehrt würde ein Einführen von Antisense-Konstrukten in Hirnzellen, insbesondere den Hypothalamus, aber ebenfalls einschließlich des Plexus choroideus oder anderer Zellen, in denen OB-R exprimiert wird, die Mengen des aktiven OB-R-Polypeptids reduzieren, und es würde vorausgesagt werden, dass es die Körperadiposität erhöht.
In einer Ausführungsform wird ein Gen, welches ein OB-R-Polypeptid kodiert, in vivo in einem viralen Vektor eingeführt. Solche Vektoren schließen ein attenuiertes oder defektes DNA-Virus ein, wie das Herpes simplex Virus (HSV), das Papillomavirus, das Epstein Barr-Virus (EBV), das Adenovirus, das Adeno-assoziierte Virus (AAV) und desgleichen, sind aber nicht darauf beschränkt. Defekte Viren, denen die viralen Gene vollständig oder fast vollständig fehlen, sind bevorzugt. Ein defektes Virus ist nach dem Einführen in eine Zelle nicht infektiös. Die Verwen dung von defekten viralen Vektoren erlaubt eine Verabreichung an Zellen in ein spezifisches lokalisiertes Gebiet, ohne Bedenken, dass der Vektor andere Zellen infizieren kann. Daher kann spezifisch auf Hirngewebe abgezielt werden. Beispiele für bestimmte Vektoren schließen einen defekten Herpes Virus 1(HSV1)-Vektor [Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci., 2: 320–330 (1991)], einen attenuierten Adenovirus-Vektor, wie den Vektor, welcher von Strafford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest., 90: 626–630 (1992) beschrieben wurde, und einen defekten Adeno-assoziierten Virus-Vektor [Samulski et al., J. Virol., 61: 3096–3101 (1987), Samulski et al., J. Virol., 63: 3822–3828 (1989)] ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
In einer anderen Ausführungsform kann das Gen in einem retroviralen Vektor eingeführt werden [z. B. Anderson et al., U.S. Patent Nr. 5,399,346 , Mann et al., Cell, 33: 153 (1983), Temin et al., U.S. Patent Nr. 4,650,764 , Temin et al., U.S. Patent Nr. 4,980,289 , Markowitz et al., J. Virol., 62: 1120 (1988), Temin et al., U.S. Patent Nr. 5,124,263 , internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 95/07358 , veröffentlicht am 16. März 1995, von Dougherty et al., und Kuo et al., Blood, 82: 845 (1993)].
Alternativ kann der Vektor in vivo durch Lipofektion eingeführt werden. Im letzten Jahrzehnt gab es eine steigende Verwendung von Liposomen zur Einkapselung und Transfektion von Nukleinsäuren in vitro. Synthetische kationische Lipide, welche entworfen wurden, um die Schwierigkeiten und Gefahren zu beschränken, welche bei einer Liposomen vermittelten Transfektion auftreten, können verwendet werden, um Liposomen für eine in vivo Transfektion eines Gens herzustellen, welches einen Marker kodiert [Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7417 (1987), siehe Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 8027–8031 (1988)]. Die Verwendung von kationischen Lipiden kann die Einkapselung von negativ geladenen Nukleinsäuren fördern und ebenfalls die Fusion mit negativ geladenen Zellmembranen fördern [Felgner et al., Science, 337: 387–388 (1989)]. Die Verwendung der Lipofektion, um exogene Gene in spezifische Organe in vivo einzuführen, hat bestimmte praktische Vorteile. Die molekulare Ausrichtung von Liposomen auf spezifische Zellen stellt ein Gebiet des Nutzens dar. Es ist eindeutig, dass das Ausrichten der Transfektion auf bestimmte Zelltypen insbesondere vorteilhaft in einem Gewebe mit zellulärer Heterogenität sein würde, wie der Bauchspeicheldrüse, der Leber, der Niere und dem Gehirn. Lipide können chemisch an andere Moleküle für den Zweck der Ausrichtung gekoppelt werden (siehe Mackey et al., 1988, supra). Zielgerichtete Peptide, z. B. Hormone oder Neurotransmitter und Proteine, wie Antikörper, oder Nicht-Peptid-Moleküle könnten chemisch an Liposomen gekoppelt werden.
Es ist ebenfalls möglich, den Vektor in vivo als ein nacktes DNA-Plasmid einzuführen. Nackte DNA-Vektoren zur Gentherapie können in die gewünschte Wirtszelle durch Verfahren eingeführt werden, welche im Stand der Technik bekannt sind, z. B. Transfektion, Elektroporation, Mikroinjektion, Transduktion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Präzipitation, Verwendung einer Genpistole oder Verwendung eines DNA-Vektor-Transporters [siehe z. B. Wu et al., J. Biol. Chem., 267: 963–967 (1992), Wu et al., J. Biol. Chem., 263: 14621–14624 (1988), Hartmut et al., kanadische Patentanmeldung Nr. 2,012,311 , eingereicht am 15. März 1990)].
Landwirtschaftliche Anwendungen
Das OB-R-Gen kann ebenfalls aus Haustieren isoliert werden, und das entsprechende OB-R-Polypeptid kann dadurch erhalten werden. Es wird erwartet, dass die aus dem Mäuse-OB-R-Gen abgeleitete Sonde mit entsprechenden homologen kodierenden Sequenzen aus einer großen Anzahl von Tierarten hybridisiert. Wie für Humantherapien diskutiert, können die rekombinanten Proteine ebenfalls für Haustiere hergestellt und ihnen verabreicht werden. Die Verabreichung des löslichen Polypeptids kann angewandt werden, um magerere Nahrungstiere herzustellen, wie Fleischrinder, Schweine, Geflügel, Schafe, usw. Vorzugsweise wird ein autologes OB-Polypeptid verabreicht, obwohl die Offenbarung hier ebenfalls eine Verabreichung von nicht autologem Polypeptid umfasst. Da das lösliche OB-R-Polypeptid aus ungefähr 800 Aminosäureresten besteht, kann es hoch immunogen sein. Daher ist die Verabreichung von autologem Polypeptid bevorzugt.
Alternativ würde es die Einführung der klonierten Gene in transgene Haustiere erlauben, das Körpergewicht und die Adiposität durch Überexprimieren eines OB-R-Transgens möglicherweise zu vermindern. Das einfachste Hilfsmittel dies zu erreichen würde sein, mit einem OB-R-Transgen auf das Gehirn unter Verwendung seines eigenen oder eines anderen gehirnspezifischen Promotors abzuzielen.
Umgekehrt könnten Anstiege des Körperfetts unter anderen Umständen gewünscht sein, wie für die Entwicklung von Kobe-Rindfleisch oder Fettleber, um Gänseleberpastete herzustellen. Dies könnte durch Abzielen eines Antisense-OB-R-Transgens auf das Gehirn oder durch Verwenden der Gen-Knockout-Technologie erreicht werden. Alternativ kann, wenn ein Anstieg des Körpergewichts als prozentualer Anteil des Fetts gewünscht ist, ein Inhibitor oder Antagonist des OB-R-Polypeptids verabreicht werden. Solche Inhibitoren oder Antagonisten schließen Antikörper, welche mit dem Polypeptid reaktiv sind, und Fragmente des Polypeptids, welche den OB-Rezeptor binden, aber nicht aktivieren, d. h. Antagonisten von Leptin, ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
Kosmetische Implikationen
Das OB-R-Polypeptid hat zusätzlich zu den Gesundheitsnutzen einen erheblichen Wert für die kosmetische Verwendung. Da die hier offenbarten OB-R-Polypeptide, einschließlich der Derivate und Agonisten-Analoga davon, insbesondere für eine Modulation der Geschwindigkeit und Menge der Fettzellablagerung in einem Tier geeignet sind, sind sie zum Reduzieren von unansehnlichem Fettgewebe geeignet, z. B. Fettablagerungen im Bauch, den Hüften, den Oberschenkeln, am Hals und Kinn, welche nicht nötigerweise auf einen fettleibigen Zustand hinauslaufen, aber welche dennoch die Erscheinung eines Individuums beeinträchtigen. Es wird angenommen, dass die Fettreduktionswirkung zum Teil durch eine Reduktion des Appetits, d. h. eine Reduktion der Nahrungsmittelaufnahme, durch einen Anstieg des basalen Metabolismus oder durch beides erreicht wird. Daher ist das vorlie gende lösliche OB-Re-Polypeptid oder seine Derivate oder Agonisten-Analoga zur Verabreichung an ein Individuum geeignet, um kosmetische Änderungen in Fettgewebeablagerungen zu bewirken, ob durch Modulieren der Fettablagerung, durch Reduzieren des Appetits oder durch beides.
Zusätzlich können die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren zusammen mit verschiedenen Verfahren verwendet werden, wie kosmetischen Operationen, welche entworfen sind, um die Gesamterscheinung eines Körpers zu ändern (z. B. Liposuktion oder Laseroperationen, welche entworfen sind, um Körpermasse durch Absaugen oder Abtragen von Fettgewebe zu reduzieren), Bewegung (insbesondere Laufen und Gewichtstraining), Niedrigfettdiät, Hypnose, Biofeedback, als Beispiele der Wege, die versucht werden können, um den prozentualen Anteil des Fettgewebes zu vermindern und die Körpererscheinung zu verbessern.
Folglich betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Bewirken einer kosmetischen Fettgewebemodulation in einem Individuum, umfassend das Verabreichen einer fettmodulierenden Menge eines löslichen OB-R-Polypeptids oder Derivats oder Agonisten-Analogons davon, an ein Individuum, welches eine kosmetische Fettgewebemodulation wünscht, um die Gesamtkörpererscheinung zu verbessern. In einem bestimmten Aspekt ist die Fettgewebemodulation eine Folge der Appetitunterdrückung. Vorzugsweise ist die Fettgewebemodulation eine Reduktion des Fettgewebes.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft diese Offenbarung ein Verfahren zum Bewirken eines kosmetischen Fettgewebeverlustes, umfassend das Kombinieren eines Verfahrens zum Ändern der Körpererscheinung mit der Verabreichung einer fettmodulierenden Menge eines löslichen OB-R-Polypeptids oder Derivats oder Agonisten-Analogons davon, an ein Individuum, welches eine kosmetische Fettgewebemodulation wünscht, um die Gesamtkörpererscheinung zu verbessern.
Diese Offenbarung kann unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, welche beabsichtigen, exemplarisch und nicht beschränkend zu sein, besser verstanden werden. Aspekte der Beispiele, welche nicht spezifisch die beanspruchte Erfindung betreffen, sind nur zur Darstellung und zum Vergleich eingeschlossen.
BEISPIEL 1: ISOLIERUNG DER DB-cDNA-KLONE
Mutationen im Maus-db-Gen führen zu schwerer Fettleibigkeit und Diabetes mit einem Syndrom, welches krankhafter humaner Fettleibigkeit ähnelt. [Hummel et al., Science, 153: 1127 (1966)]. Frühere Daten legten nahe, dass das db-Gen den Rezeptor für das Genprodukt des ob-Locus kodiert, welches als Leptin bekannt ist [Coleman, Diabetologia, 14: 141 (1978), Zhang et al., Nature, 372: 425 (1994)]. Kürzlich erschien ein Bericht, dass der Leptinrezeptor aus dem Plexus choroideus kloniert wurde, für diesen Klon wurde gezeigt, dass er in derselben Region von Chromosom 4 liegt, wie db [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)]. Dieser Rezeptor ist ein Mitglied der Familie der Rezeptoren, welche sich mit den JAK-Tyrosinkinasen verbinden. Es wurden jedoch in diesem Rezeptor keine Mutationen in C57BL/6J db/db-Mäusen identifiziert, was nahe legt, dass die Mutation in diesen Tieren eine Spleißvariante dieses Gens darstellen könnte [Tartaglia et al., supra].
Das vorliegende Beispiel zeigt, dass der Leptinrezeptor auf demselben 300 kb Intervall auf dem Mäusechromosom 4 liegt, wie db. Eine cDNA-Selektion und ein Exon-Trapping aus dieser Region identifizierten mehrere ESTs mit Sequenzen, welche identisch zum Leptinrezeptor sind. Eine Charakterisierung der entsprechenden cDNA-Klone, welche aus einer Mäusegehirn-cDNA-Bibliothek isoliert wurden, ergab, dass es mindestens fünf alternative gespleißte Formen des Leptinrezeptors gibt, jede mit Unterschieden an ihrem Amino- und/oder Carboxylterminus. Eine der Spleißvarianten wird in einer großen Menge im Hypothalamus und in niedrigerer Menge in anderen Geweben exprimiert. Dieses Transkript ist in C57BL/Ks db/db-Mäusen mutiert. Diese Mutation ist das Ergebnis eines abnormalen Spleißings, was zu einer 106 bp Insertion in das 3'-Ende der RNA führt, was zu einer verkürzten cytoplasmatischen Region führt, welche "Box 2" deletiert, eine Proteinstelle, von welcher bekannt ist, dass sie mit JAK-Proteinen interagiert [Mu rakami et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11349 (1991), Fukunaga, et al., EMBO, 10: 2855 (1991)], sie ist wahrscheinlich in der Signaltransduktion defekt [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8642 (1990), Modl et al., Cytogenetics Cell Genetics, 67: 232 (1995)]. Diese Daten legen nahe, dass die gewichtsreduzierenden Wirkungen von Leptin durch Interaktionen mit einem Rezeptor im Hypothalamus und vielleicht in anderen Geweben vermittelt werden.
Material und Methoden
Isolierung von genomischen Klonen. YAC-Klone wurden durch PCR-Screening isoliert und auf einem CHEF MAPPER (Bio-Rad) ausgemessen [Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1213 (1996), Kasumi et al., Mammalian Genome, 4: 391 (1993)]. Die YAC-Enden wurden unter Verwendung einer Vectorette-PCR und eines Plasmid-Rescues gewonnen [Riley et al., Nucl. Acids Res., 18: 2887 (1990), Hermanson et al., Nucl. Acids Res., 19: 4943 (1991)]. P1-Klone wurden durch Schicken spezifischer Paare von PCR-Primern an Genome Systems Inc. (St. Louis, MO) isoliert, welche Einzelauswahlen von einzelnen Mäuse-P1-Klonen bereitstellten [Sternsberg, Trends Genet., 8: 11 (1992)]. Die P1-Enden wurden unter Verwendung einer Vectorette-PCR gewonnen [Hart) et al., Bio Techniques, 15: 201 (1993)]. BACs wurden wie beschrieben isoliert [Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794 (1992)]. Die Primerauswahl und die PCR-Amplifikation wurden wie beschrieben durchgeführt: eine anfängliche Denaturierung bei 94°C für 3 min, 25 Zyklen mit 94° für 1 min, 55° für 2 min und 72° für 3 min [Zhang, 1994, supra]. Die Primer waren:
Isolierung der db-Klone. Eine cDNA-Auswahl wurde wie beschrieben unter Verwendung von Mäusegehirn-RNA aus dem Hypothalamus als Ausgangsmaterial durchgeführt [Morgan et al., Nucl. Acids. Res., 20: 5173 (1992)]. Bibliotheken screening, Exon-Trapping und DNA-Sequenzierung wurden wie beschrieben durchgeführt [Zhang et al., 1994, supra (siehe Beispiel 3)]. Die C-terminalen Sequenzen von OB-Ra, OB-Re, OB-Rd und OB-Re wurden in verschiedenen cDNA-Klonen gefunden. Die C-terminale Sequenz von OB-Rb war nicht vollständig. Die Sequenz des C-Terminus dieser Variante wurde schließlich durch Sequenzieren genomischer DNA vervollständigt. Die Matrize wurde unter Verwendung einer Vectorette-PCR von BAC 242 mit Primern aus der cDNA²⁹ hergestellt [Riley et al., Nucl. Acids Res., 18: 2887 (1990)]. Die Sequenz wurde durch Sequenzieren von RT-PCR-Produkten bestätigt.
Identifikation von Mutationen in db. RT-PCR und Sequenzierung wurden wie beschrieben durchgeführt. Die genomischen Sequenzen am Spleißakzeptor von OB-Rb wurden durch eine Vectorette-PCR von BAC 242 mit dem rückwärts gerichteten OB-Rb-Primer erhalten. Für die RT-PCR von OB-Ra, OB-Rb, OB-Re und OB-Rd war der vorwärts gerichtete Primer derselbe
5' ACACTGTTAATTTCACACCAGAG 3' (SEQ ID NR: 24) (ebenfalls als F1 in 3C markiert). Die rückwärts gerichteten (r) Primer waren:
OB-Ra 5' AGTCATTCAAACCATTAGTTTAGG 3' (SEQ ID NR: 25),
OB-Rb 5' TGGATAAACCCTTGCTCTTCA 3' (SEQ ID NR: 26)
OB-Rc 5' TGAACACAACAACATAAAGCCC 3' (SEQ ID NR: 27)
OB-Rd 5' AGGCTCCCTCAGGGCCAC 3' (SEQ ID NR: 28). Der Intron-Primer für OB-Rb (in 3C F2 markiert) war
5' GTGACTGAATGAAGATGTAATATAC 3' (SEQ ID NR: 29).
Gewebeverteilung des alternativ gespleißten Leptinrezeptors. Die RT-PCR wurde wie beschrieben durchgeführt. Die Primersequenzen für OB-Ra, OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd sind oben gezeigt. Die Primer für OB-Re waren:
f 5' TGTTATATCTGGTTATTGAATGG (SEQ ID NR: 30),
r 5' CATTAAATGATTTATTATCAGAATTGC 3' (SEQ ID NR: 31).
Ergebnisse und Diskussion
Eine Reihe von genetischen Kreuzungen, welche db aufspalten, wurde etabliert. Diese schlossen 50 fettleibige (db/db) Nachkommen einer C57BL/Ks db/db x Mus spretus-Kreuzung und 350 fettleibige (db/db) Nachkommen einer C57BL/Ks db/db x Mus castaneus-Kreuzung ein. Die Zuordnung des Genotyps als der db-Locus wurde wie zuvor beschrieben vorgenommen [Bahary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 37: 8642 (1990)].
Mehrere Mikrosatellitenmarker, welche db flankieren, wurden verwendet, um die DNA von jedem Tier zu typisieren. Diese schlossen einen distalen Marker, D4Mit31, und einen proximalen Marker, Ifnα, ein. Eine genetische Karte in der Region von db wurde unter Verwendung dieser und anderer Loci erstellt (1). Die Maus-Homologa von zwei zuvor klonierten humanen Genen wurden in der Region von db gefunden: JAK1 und PDE4B. Beide diese Gene liegen auf dem humanen Chromosom 1p31, was nahe legt, dass das humane db-Gen in der chromosomalen Region liegt [Modi et al., Cytogenetics Cell Genetics, 69: 232 (1995), Milatovich et al., Somatic Cell Mol. Gen., 20: 75 (1994)].
Für einen Mikrodissektionsklon, D4Rck22 wurde gefunden, dass er distal von db liegt und in drei Tieren rekombinant ist [Bahary et al., Mammalian Genome, 4: 411–515 (1993)]. D6Rck22 wurde als Ausgangspunkt eines Chromosomen-Walks unter Verwendung von künstlichen Hefechromosomen (YACs), künstlichen bakteriellen Chromosomen (BACs) und P1-Bakteriophagen-Klonen verwendet [Zhang et al., 1994, supra, Steinberg, Trends Genet., 8: 11 (1994), Shizuya, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 8794 (1992)]. Ein 2,7 mB Kontig wurde durch Chromosomen-Walking aus diesem Marker zusammengebaut. Es sei angemerkt, dass eine ungefähr 200 kB-Region in keiner verfügbaren Mäuse-YAC-Bibliothek identifiziert wurde (~12 Genomäquivalente wurden gescreent). Diese Lücke im Kontig wurde nach einem Chromosomen-Walking mit einer Reihe von BAC- und P1-Klonen, gefolgt von der Isolierung eines zusätzlichen YAC geschlossen, welcher sich auf zusätzliche 500 kB proximal zu dieser Region erstreckte. Rekombinante Tiere wurden mit genetischen Markern (sowohl RFLPs und SSLPs) typisiert, welche von den Enden der einzelnen genomischen Klone abgeleitet waren. Die db-Mutation wurde zwischen dem distalen Rekombinationsereignis in Tier 324 und den proximalen Rekombinationsereignissen in Tier 1028 lokalisiert. Sieben andere proximale Rekombinationen mit 50 kB wurden beobachtet, was nahe legt, dass dies ein Hot Spot für die Rekombination darstellt. Das gesamte nicht rekombinante Intervall entspricht ~300 kB der DNA und wurde von zwei BACs, 43 und 242, abgedeckt (1).
Kandidatengene für db wurden aus den BACs 43 und 242 unter Verwendung von Exon-Trapping und cDNA-Selektion aus Mäuse-Hypothalamus isoliert [Church et al., Nature Genetics, 6: 98 (1994), Morgan et al., Nucl. Acids Res., 20: 5173 (1992)]. Eine Mäusegehirn-cDNA-Bibliothek wurde mit vermeintlichen Genfragmenten gescreent. Eine Analyse von acht Gehirn-cDNA-Klonen wies darauf hin, dass sechs unabhängige Produkte der cDNA-Selektion und zwei cDNAs, welche unter Verwendung des Exon-Trapping identifiziert wurden, auf überlappenden Transkripten anwesend waren. Die Nukleotidsequenz von jedem cDNA-Klon sagte N-terminale Sequenzen voraus, welche mindestens teilweise identisch zum Mäuse-Leptinrezeptor (OB-R) waren. Die Position der Sequenzen vom 5'- und 3'-Ende der OB-R-RNA wurde durch den STS-Gehalt von jedem BAC bestimmt und ist auf der physikalischen Karte gezeigt (1). Diese Daten weisen darauf hin, dass das Gen ~100 kB abdeckt und in Richtung auf das Telomer transkribiert wird.
Diese cDNA-Klone divergieren am Carboxylterminus. In vier Fällen waren die vorausgesagten Sequenzen mindestens teilweise bis zu Lysin 889 des Leptinrezeptors identisch, was die Transmembrandomäne einschließt. Nach diesem Punkt sagen die cDNAs Proteine mit Unterschieden in der cytoplasmatischen Domäne voraus, welche OB-Ra (SEQ ID NR: 11), OB-Rb (SEQ ID NR: 12), OB-Rc (SEQ ID NR: 13) und OB-Rd (SEQ ID NR: 14) bezeichnet wurden (2B). OB-Re sagte eine unterschiedliche Aminosäuresequenz nach His⁷⁹⁶ voraus (SEQ ID NR: 15), welche einen löslichen Rezeptor zu kodieren scheint (2B). Die Klone für OB-Ra, OB-Rb und OB-Re divergierten an ihrem N-Terminus. In allen Fällen lag die divergierende Sequenz ebenfalls auf dem BAC-Kontig. OB-Ra entspricht im Allgemeinen dem Mäuse-OB-R [Tartaglia et al., Cell, 83: 1263 (1995)].
Der C-Terminus von OB-Rb war zu 78 Prozent identisch mit dem humanen OB-Rezeptor, was nahe legt, dass er das Maus-Homologon darstellt [Tartaglia et al, supra]. Der Leptinrezeptor ist ein Mitglied der gp-130-Familie der Rezeptoren, welche mit JAK-Proteinkinase interagieren. Die cytoplasmatischen Domänen der gp-130-Rezeptoren werden im Allgemeinen für die Bindung von JAKs und die Signaltransduktion benötigt [Kishimoto et al., Cell, 76: 253 (1994)]. Die OB-Rb-cDNA-Sequenz sagt eine mögliche "Box 2"-Sequenz (in 2B unterstrichen) voraus, ein Proteinmotiv, welches zum Binden mit JAK-Proteinkinasen benötigt wird [Kishimoto, supra]. "Box 2" ist unter vielen Mitgliedern dieser Rezeptorfamilie konserviert und wird zur Signaltransduktion der GCSF- und IL6-Rezeptoren benötigt [Murakami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 11349 (1991); Fukunaga et al., EMBO J., 10: 2855 (1991)]. Keines der anderen Transkripte sagt eine "Box 2"-Sequenz voraus. Von den acht charakterisierten cDNA-Klonen wurde OB-Ra dreimal und OB-Re zweimal isoliert. OB-Rb, OB-Rc und OB-Rd wurde jeweils einmal isoliert. Es ist wahrscheinlich, dass zusätzliche Spleißvarianten identifiziert werden.
C57BL/Ks db/db-Mäuse weisen eine längere Fragmentlänge von OB-Rb spezifischen RT-PCR-Produkten (es sollte erwähnt werden, dass diese PCR 3'-Nukleinsäuren amplifizierte, und daher spezifisch für alle Spleißvarianten ist, welche Eigenschaften einer cytoplasmatischen Domäne von OB-OB-Rb aufweisen, aber keine Daten über die extrazelluläre Domäne bereitstellt) aus RNA aus dem Hypothalamus auf, als Wildtyp-Wurfgeschwister (3A). Die PCR-amplifizierte genomische DNA, welche den Spleißakzeptor an Pro⁸⁹⁰ abdeckt, war jedoch von normaler Größe in C57BL/Ks db/db verglichen mit dem Wildtyp (3B). Eine DNA-Sequenzierung dieses Fragments bestätigte, dass die genomischen Sequenzen am Spleißakzeptor in db-Mäusen Wildtyp sind. Zusätzlich waren sowohl die Größe, als auch die Nukleotidsequenz der RT-PCR-Produkte, welche anderen 3'-Enden entsprachen, in den db-Mäusen normal, was nahe legt, dass der Spleißdonor an Lys⁸⁸⁹ ebenfalls normal ist (4). Diese Daten legen nahe, dass das längere OB-Rb spezifische Fragment aus C57BL/Ks db/db-Mäusen das Ergebnis eines abnormalen Spleißings war.
Eine Sequenzierung der RT-PCR-Produkte von OB-Rb aus den mutierten Mäusen ergab eine 106 bp Insertion zwischen dem Spleißdonor an Lys⁸⁸⁹ und dem Spleißakzeptor an Pro⁸⁹⁰. Die Sequenz der inserierten DNA war identisch mit den ersten 106 bp des einzigartigen OB-Ra-Exons, strangabwärts von seinem Spleißakzeptor an Arg⁸⁹⁰ (5A). Eine Sequenzierung der genomischen DNA und der RT-PCR-Produkte der nicht translatierten 3'-Region von OB-Ra aus C57BL/Ks db/db-Mäusen identifizierte eine g→t Mutation 106 bp nach dem Spleißakzeptor (vergleiche 5B und 5C). Diese Mutation führt zu dem Auftreten einer Spleißdonor-Konsensusstelle, AGGTAAA (5C) [Lodish et al., Mol. Cell. Biol., Scientific American Books: New York, S. 1–1344 (1986)]. Dieser mutierte Spleißdonor führt zum Spleißen von 106 bp des terminalen OB-Ra-Exons in den Spleißakzeptor an Pro⁸⁹⁰ in der OB-Rb-RNA. Das sich ergebende mutierte OB-Rb-Protein weist ein Terminationscodon fünf Aminosäuren nach dem Spleiß und eine identische Aminosäuresequenz zu OB-Ra auf. Dem mutierten Rezeptor fehlt ein Großteil der cytoplasmatischen Region, einschließlich des möglichen "Box 2"-Motivs. Während die RT-PCR zeigte, dass die Größen der anderen 3'-Enden in C57BL/K⁹ db/db-Mäusen normal waren, ist es möglich, dass dieses alternative Exon ebenso in andere Transkripte inseriert wird.
Der OB-Rb-Leptinrezeptor wird in einer großen Menge im Hypothalamus verglichen mit anderen Geweben exprimiert (6). Eine Expression mit niedrigerer Menge wird in den Hoden, mit einer noch niedrigeren Menge im Fettgewebe beobachtet. Die anderen alternativ gespleißten mRNAs werden in mehreren Geweben exprimiert, in einigen Fällen einschließlich des Hypothalamus (6). OB-Re, welcher einen möglichen löslichen Rezeptor kodiert, wird in Fettgewebe stark exprimiert und wird in einer niedrigeren Menge im Gehirn, Herz und den Hoden exprimiert (6E).
Die C57BL/Ks db/db-Mutation ist koisogen und führt zur funktionellen Ersetzung der cytoplasmatischen Domäne, welche OB-Rb entspricht, durch die von OB-Ra. Diese Daten, vereinigt mit der Lokalisation des Leptinrezeptors an genau derselben chromosomalen Region wie db, bestätigt stark, dass OB-Rb allelisch mit db ist. Die Identifikation von Mutationen in den zwei anderen verfügbaren Allelen von db wird zusätzliche Information über die Struktur-Funktions-Beziehung des Proteins bereitstellen. Die Tatsache, dass die C57BL/Ks db/db-Mutation in dem einzigartigen C-Terminus von OB-Rb gefunden wird, erklärt, warum die Sequenz von OB-Ra in C57BL/Ks db/db-Mäusen unverändert war, und dass das Binden von Leptin an den Plexus choroideus in diesen Tieren normal war. Die Leptinbindung in C57BL/Ks db/db-Mäusen ist wahrscheinlich an allen Orten normal. Der fettleibige Phänotyp scheint sich eher aus der Unfähigkeit des OB-Ra C-Terminus zu ergeben, eine Signaltransduktion auszulösen, wenn er anstelle des C-Terminus von OB-Rb exprimiert wird. Eine Aufklärung des Signaltransduktionsweges und eine Identifikation von möglichen Stellen der JAK-Bindung an die cytoplasmatische Region dieses Rezeptors werden in Erwägung gezogen.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die gewichtsreduzierenden Wirkungen von Leptin zumindest teilweise durch Interaktionen mit dem OB-Rb-Rezeptor vermittelt werden, welcher eine C-terminale (cytoplasmatische) Domäne aufweist, welche charakteristisch für OB-Rb im Hypothalamus ist, einer Gehirnregion, von welcher bekannt ist, dass sie eine wichtige Rolle beim Regulieren des Körpergewichts spielt. Dies wird durch die gesteigerte Wirksamkeit von Leptin, wenn es direkt in die CSF verabreicht wird, und die Wirkungen von Leptin auf die elektrische Aktivität der Neuronen des Hypothalamus unterstützt. Leptin kann die Aktivität von NPY, GLP-1 und anderen Peptiden modulieren, von welchen bekannt ist, dass sie das Ernährungsverhalten im Hypothalamus und Gehirn beeinflussen [Stephens et al, supra, Tarton et al., Nature, 379: 69 (1996)]. Es kann ebenfalls Wirkungen auf andere Gewebe aufweisen, welche den Leptinrezeptor exprimieren, einschließlich von Fett. Der Rezeptor, welcher im Plexus choroideus exprimiert wird, wahrscheinlich OB-Ra oder eine Spleißvariante, welche einen ähnlichen C-Terminus teilt, kann wirken, um das Protein zur CSF zu transportieren, ein Mechanismus, welcher ähnlich zu dem ist, der für den Transport von Insulin durch den Insulinrezeptor vorgeschlagen wird [Bahary et al., 1990, supra, Partridge et al., Neurochem., 44: 1771 (1985), Van Routen und Posner, Nature, 282: 623 (1979), Wood und Park, Am. J. Physiol., 233: E331–E334 (1979)].
Von OB-Re, dem vermeintlich löslichen Rezeptor wird angenommen, dass er im Kreislauf an Leptin bindet. Er könnte als Transportprotein wirken, um die Leptinaktivität zu fördern [siehe z. B. Davis et al., Science, 259: 1736 (1993), Kishimoto et al, supra; Davis et al., Science, 260: 1805 (1993)].
BEISPIEL 2: HERSTELLUNG VON ANTIKÖRPERN GEGEN DAS OB-POLYPEPTID
Zusätzlich zur Verwendung des rekombinanten Proteins, um polyklonale Antikörper zu erzeugen, wurde ein Satz von drei Peptidsequenzen aus der abgeleiteten vollständigen Mäuse-OB-R-Sequenz identifiziert (d. h. SEQ ID NR: 2, 4, 6, 8, 10). Die vier internen Peptidfragmente sind:
Peptid A (Aminosäurenummern 145–158) (SEQ ID NR: 32):
Glu-Pro-Leu-Pro-Lys-Asn-Pro-Phe-Lys-Asn-Tyr-Asp-Ser-Lys
Peptid B (Aminosäurenummern 465–484) (SEQ ID NR: 33):
His-Arg-Arg-Ser-Leu-Tyr-Cys-Pro-Asp-Ser-Pro-Ser-IIe-His-Pro-Thr-Ser-Glu-Pro-Lys
Peptid C (Aminosäurenummern 863–881) (SEQ ID NR: 34):
Gln-Arg-Met-Lys-Lys-Leu-Phe-Trp-Asp-Asp-Val-Pro-Asn-Pro-Lys-Asn-Cys-Ser-Trp
Diese Peptide wurden unter Verwendung einer Standard-Festphasen-Peptidsynthese hergestellt. Die gereinigten synthetischen Peptide werden an KLH konjugiert, und die Peptid-KLH-Konjugate werden verwendet, um Kaninchen unter Verwendung von Standardtechniken zu immunisieren. Polyklonale Antiseren, welche spezifisch für jedes Peptid sind, werden aus den Kaninchen gewonnen.
BEISPIEL 3: HERSTELLUNG VON PCR-SONDEN AUS cDNA-SELEKTIONS- UND EXON-TRAPPING-KLONEN
Dieses Beispiel beschreibt die cDNA-Selektions-Klone, welche identifiziert wurden, um OB-R zu entsprechen. Die PCR-Primer von diesen Klonen wurden als Sonden für OB-R-cDNA und genomische Klone verwendet und sind zum Identifizieren von OB-R-DNA, sowie zum Charakterisieren verschiedener OB-R-Spleißvarianten geeignet.
Für fünf cDNA-Selektions-Klone wurde gefunden, dass sie als Sonden geeignet sind: die Klone 7 (SEQ ID NR: 35), 11 (SEQ ID NR: 36), 42 (SEQ ID NR: 37), 46 (SEQ ID NR: 38) und 58 (SEQ ID NR: 39). Für zwei cDNA-Selektions-Klone, welche durch eine Hybridisierung mit Exon-Trapping-Klonen identifiziert wurden, wurde ebenfalls gefunden, dass sie geeignete Sonden sind: die Klone S3 (SEQ ID NR: 40) und S14 (SEQ ID NR: 41).
Die PCR-Primer wurden von jedem der oben genannten Klone zur Verwendung als Sonden beim Identifizieren von OB-R-DNA hergestellt. Tabelle 1 zeigt die vorwärts gerichteten und rückwärts gerichteten Primer für jeden der Klone und gibt an, welche Spleißvarianten von OB-R, sowie welche vorausgesagte kodierende Region jede Sonde markiert. Tabelle 1. PCR-Primer-Sonden für OB-R-DNA
Wie in der Tabelle angegeben, waren die Sonden aus den Klonen 7 und 11 beim Identifizieren aller Spleißformen von OB-R, welche bis heute identifiziert sind, geeignet. Sonde 42 ist geeignet, um eine Spleißvariante mit einer cytoplasmatischen Domäne, welche OB-Rb entspricht, zu identifizieren, d. h. welche möglicherweise signaltransduktionskompetent ist. Die Sonden 46 und S14 sind geeignet, um Spleißvarianten zu identifizieren, welche eine N-terminale Aminosäuresequenz aufweisen, die OB-Rd und OB-Re entspricht (was identisch zu der N-terminalen Sequenz des veröffentlichten Mäuse-OB-R bis zu den C-terminalen Spleißstellen ist, die für diese Proteine identifiziert wurden, siehe 2B). Sonde 58 ist geeignet, um ein OB-R zu identifizieren, welches eine einzigartige 5'-Region enthält, die in der cDNA der OB-Rb-Spleißvariante gefunden wurde, was eine nicht kodieren de Region sein kann. S3 identifiziert Nukleinsäuren, welche extrazelluläre Domänen kodieren, die in den Varianten a, d und e gefunden werden (entsprechend der veröffentlichten extrazellulären Mäuse-OB-R-Domäne).
Die Hybridisierungsbedingungen zum Screenen der Mäusegehirn-cDNA-Bibliothek waren wie folgt: die Sonden mit einer Länge von ungefähr 150–300 bp Länge wurden mit ³²P-dCTP unter Verwendung einer Hot-PCR markiert. Die Filter wurden zuerst für mindestens eine Stunde bei 65°C unter Verwendung von RAPID-HYB-Puffer (Amersham LIFE SCIENCES) prähybridisiert. Die markierte Sonde wurde bis zu einer Endkonzentration von 10⁶ cpm/ml RAPID-HYB-Lösung hinzugefügt, und die Hybridisierung wurde für mindestens 6 Stunden bei 65°C durchgeführt. Die Filter wurden mit 2 × SSC/0,1% SDS, RT für 30 min gewaschen, gefolgt von einem stringenteren Waschschritt mit 0,3 × SSC/0,1% SDS, RT, für 1/2 Stunden.
So sind die in diesem Beispiel beschriebenen Sonden zum Identifizieren von OB-R, sowie zum Identifizieren von einzigartigen Spleißvarianten geeignet. Es wird zum Beispiel angenommen, dass eine Spleißvariante mit einer extrazellulären Domäne, welche OB-Ra oder OB-Rc/d/e entspricht, mit einer cytoplasmatischen Domäne, welche OB-Rb entspricht, verbunden werden kann.
BEISPIEL 4: LEPTINREZEPTOR-MUTATIONEN IN 129 DB^3J/DB^3J-MÄUSEN UND NIH FA^CP/FA^CP-RATTEN
Mutationen im Mäuse-db-Gen und seinem Rattenhomologon fa führen zu Fettleibigkeit und Diabetes als Teil eines Syndroms, welches krankhafter humaner Fettleibigkeit ähnelt. Bis heute wurde von Mutationen im Leptinrezeptor (Lepr) in C57BL/Ks db/db-Mäusen und 13 M fa/fa-Ratten berichtet. Dieses Beispiel zeigt, dass NIH fa^cp/fa^cp-Ratten eine Nonsens-Mutation an Aminosäure Tyr763 aufweisen, und dass 129 db^3J/db^3J-Mäuse eine 17 Basenpaar lange Deletion und eine Leserahmenverschiebung aufweisen, welche zu einem verkürzten Protein mit 636 Aminosäuren führt. Diese Daten bestätigen die Tatsache, dass das db-Gen und Lepr allelisch sind. Zusätzlich ist der Phänotyp von 129 db^3J/db^3J-Mäusen, welche Defekte in allen Formen von Lept aufweisen, und von C57BL/6J db/db-Mäusen, welchen nur der OB-Rb fehlt, identisch. Diese Daten legen nahe, dass die anderen alternativ gespleißten Formen des Leptinrezeptors (OB-Ra, c, d, e) wahrscheinlich nicht Funktionen dienen, die unabhängig von OB-Rb sind.
Die Klonierung von Leptin und seinem Rezeptor hat zur Identifikation eines neuen Signaltransduktionswegs geführt, welcher wichtig für die Körpergewichtsregulation ist. Die Daten aus Beispiel 1 weisen darauf hin, dass das db-Gen mehrere alternativ gespleißte Formen des Rezeptors für das ob-Genprodukt Leptin kodiert. Von diesen Spleiß-Formen enthält nur eine, OB-Rb, eine lange cytoplasmatische Domäne, welche Motive einschließt, die mit der Signaltransduktion in Verbindung gebracht werden. OB-Rb wird im Hypothalamus stark exprimiert und wird in C57BL/Ks db/db-Mäusen abnormal gespleißt, was zu der Verkürzung der OB-Rb-Isoform führt und zum Verlust seiner signaltransduzierenden Fähigkeit [Beispiel 1, supra, Ghitardi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 632–635 (1996), Vaisse et al., Nature Genetics, 14: 95–97 (1996)]. Kürzlich wurde eine Missense-Mutation in fatty-Ratten (welche allelisch mit db ist) in der fatty(fa/fa)-Zucker-Ratte identifiziert [Chua et al., Diabetes 45: 1141–1143 (1996)]. Diese Mutation verändert wahrscheinlich die Bindung von Leptin an der Zelloberfläche [Chua et al., (1996) supra, Philips et al., Nature Genetics 13: 18–19 (1996)].
Mutationen im Mäuse-db-Locus und in seinem Rattenhomologon fatty sind mehrmals unabhängig aufgetreten [Truett et et., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7806–7809 (1991), Hummel et al., Science, 153: 1127–1128 (1966), Hubert et al., Journal of Nutrition 115: 327–333, (1985), Koletsky, Experimental & Molecular Pathology 19: 53–60 (1973), Leiter et al., Diabetologia 19: 58–65 (1980)]. Die molekulare Grundlage der Mutationen in diesen anderen mutierten Stämmen könnte Information über die Struktur-Funktions-Beziehung von Leptin und Lepr bereitstellen. Dieses Beispiel zeigt die molekulare Grundlage der Mutationen in den kodierenden Regionen von Lepr aus mutierten 129 db^3J/db^3J-Ratten und NIH fa^cp/fa^cp-Ratten.
Material und Methoden
Sequenzbestimmung von Mäuse- und Ratten-Lepr (OB-R). Gehirn- und Hypothalamus-RNA wurde durch ein modifiziertes Guanidin-HCl-Verfahren isoliert [Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294–5299 (1979)]. Zehn Mikrogramm Gesamt-RNA wurden als Matrize verwendet, um cDNA mit Mo-MuLV reverser Transkriptase gemäß den Empfehlungen des Herstellers zu synthetisieren [Lee et al., (1996) supra]. Lepr-DNA-Fragmente wurden unter Verwendung von cDNA oder genomischer DNA aus mutierten und Wildtyp-Tieren mit Taq-DNA-Polymerase und Primern amplifiziert, welche auf der Mäuse- oder Ratten-Lepr-cDNA-Sequenz basierten. Die Proben wurden mit den Primer n 43 M137R 5'CTCACTGTGTAGTGTGAGGAGG-3' (SEQ ID NR: 43) und A83'R 5'CCTTGTGCCCAGGAACAATTC-3' (SEQ ID NR: 55) amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente wurden aus Agarosegelen gereinigt und unter Verwendung eines ABI DNA-Sequenzierers wie beschrieben sequenziert [Zhang et al., Nature 372: 425– 432 (1994)]. Die Agarosegele wurden wie beschrieben laufen gelassen [Zhang et al., (1994) supra].
PCR von cDNA und genomischer DNA. Sowohl cDNA, als auch genomische DNA aus der extrazellulären Region von Lepr wurden PCR-amplifiziert. Die DNA wurde von 129 db^3J/db^3J- und Wildtyp-Mäusen erhalten. Die Primersequenzen waren wie folgt: für die cDNA war der vorwärts gerichtete Primer 3JF1 5'GAGAATAACCTTCAATTCCAGATTC3' (SEQ ID NR: 56) und der rückwärts gerichtete Primer war 3JR1 5'CCCAAGCTTAAGGCCCTCTCATAGGAAC3' (SEQ ID NR: 57), für die genomische DNA war der vorwärts gerichtete Primer 3JF2 5'GACCTCTCTGCAGTCTATGTGGTCCA3' (SEQ ID NR: 58) und der rückwärts gerichtete Primer war 3JR2 5'GAAAGGTTTTCAGTCACGCTTGAAG3' (SEQ ID NR: 59).
Ergebnisse und Diskussion
Die fettleibige NIH-Corpulent-Ratte (cp/cp) ist genetisches Inzuchtmodell des nicht Insulin abhängigen Diabetes, welche durch progressiv ansteigende Fettleibigkeit und Hyperinsulinämie vor dem Auftreten einer anhaltenden Hyperglykämie gekennzeichnet ist [Koletsky (1973) supra]. Für die cp-Mutation wurde zuvor gezeigt, dass sie ein fa-Allel ist (fa^cp)/fa^cp), da Kreuzungen von Ratten, welche die fa-Mutation tragen, mit Ratten, welche die cp-Mutation tragen, fettleibige Nachkommen ergaben [Yen et al., Heredity 38 (1977)]. cDNA wurde aus dem Hypothalamus von mageren und fettleibigen Ratten hergestellt, und die Sequenz der vollständigen kodierenden Region für Lepr wurde verglichen. Eine einzelne Basenänderung von T zu A an Nukleotid 2289 wurde in der fettleibigen Corpulent-Ratte identifiziert, welche zur Umwandlung von Tyr763 in ein Stopcodon führt (7). Um dies zu bestätigen, wurden spezifische Primer, welche die Mutation eng flankieren, corp-F und corp-R, verwendet, um genomische DNA von sowohl mageren, als auch fettleibigen Ratten zu amplifizieren. Die Sequenzierung der genomischen DNA bestätigte die T zu A-Änderung. Diese Nonsense-Mutation führt zur Termination der Translation aminoterminal der Transmembrandomäne. Als eine Folge enthält keine der Lepr-Isoformen in cp/cp-Ratten eine Transmembrandomäne, noch irgendeines der Motive, welche für die Signaltransduktion nötig sind.
Die db^3J-Mutation trat spontan in dem 129/J-Stamm im Jackson Laborstory auf. Die mutierten Tiere weisen schwere Fettleibigkeit und Hypoglykämie, eher als Hyperglykämie auf, gekoppelt mit merklicher Hyperinsulinämie und stark vergrößerten Langerhans'schen Inseln [Leiter et al., (1980) supra]. Um die db^3J-Mutation zu identifizieren, wurde RNA aus dem Hypothalamus von db^3J- und Wildtyp-Mäusen hergestellt. Eine Agarosegel-Elektrophorese ergab, dass ein RT-PCR-Produkt vom Aminoterminus der db^3J-Rezeptor-Mäuse kleiner ist, als das von 129 +/+-Mäusen. Das PCR-Produkt der genomischen DNA aus dieser Region des Rezeptors war in den mutierten Mäusen ebenfalls kürzer (8). Eine Sequenzierung der PCR-Produkte identifizierte eine 17 Nukleotide lange Deletion, welche an Base G¹⁸⁷⁴ (Ser625) in mutierten Mäusen beginnt, was eine Leserahmenverschiebung verursacht (9). In den db^3J/db^3J-Mäusen stoppt die Translation von OB-R an der 11. Aminosäure nach der Deletionsstelle. Das Ergebnis ist die Synthese eines verkürzten Proteins ohne Transmembrandomäne. Immunblots bestätigen, dass die Rezeptorprotein-Bande in dieser Mutante fehlt. Daher führt diese Mutation zu einem verkürzten Rezeptor, welcher alle Lepr-Spleißvarianten beeinflusst.
Die Nonsense-Mutation in der Corpulent-(cp/cp)-Ratte und die Leserahmenverschiebungs-db-Mutation in 129J-(db/db)-Mäusen bestätigt, dass Defekte im Leptinrezeptor zu Abnormalitäten im Leptin-Lepr-Weg und zu einem fettleibigen Phänotyp führen. Zusätzlich ist der Phänotyp von 129 db^3J/db^3J-Mäusen, welche Defekte in allen Formen von Lepr aufweisen, und von C57BL/6J db/db-Mäusen, welchen nur OB-Rb fehlt, identisch (10). Diese Daten legen nahe, dass die anderen alternativ gespleißten Formen des Leptinrezeptors (OB-Ra, c, d, e) wahrscheinlich nicht Funktionen dienen, die unabhängig von OB-Rb sind.
BEISPIEL 5: EXPRESSION VON LÖSLICHEM MAUSE-OB-REZEPTOR UND OB-REZEPTOR-MUTANTEN UNTER VERWENDUNG EINES BACULOVIRUS-SYSTEMS
Erzeugung von Baculovirus- Transferkonstrukten. Alle Konstrukte zur Expression des löslichen OB-Rezeptors (OB-Re) und der OB-Re-Mutanten wurden auf der Grundlage eines Baculovirus-Polyhedrinpromotor basierten Transfer-Klonierungsvektors erzeugt, welcher pMelBac genannt wird (Invitrogen, Kat.Nr. V1950-20). Dieser Vektor ist entworfen, um die Expression von rekombinanten Proteinen über den sekretorischen Weg in das extrazellulare Medium zu steuern. Der Vektor enthält eine Signalsequenz für Honigbienen-Melittin (HBM), welches stark exprimiert und effizient von SF9-Zellen, einer Insekten-Zelllinie, sezerniert wird. Die HBM-Signalsequenz in pMelBac ersetzt die endogene Signalsequenz des rekombinanten Proteins. Eine PCR wurde während des anfänglichen Klonierungsschrittes verwendet, um Inserts für die Ligation zu erzeugen. OB-Re-cDNA diente als PCR-Matrize (SEQ ID NR: 10). Primer-Oligonukleotide für die PCR wurden entworfen, um die benötigte Region der OB-Re-cDNA zu amplifizieren, um die gewünschte/n Punktmutation/en und das Stopcodon, wenn nötig, einzuführen, sowie, um Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen zu erzeugen, welche für die Klonierung in den pMelBac-Vektor benötigt wurden (11, Tabelle 2).
Die Wahl zwischen pMelBac A-, B- oder C-Klonierungsvektoren basierte auf ihren offenen Leserahmen, welche eine Insertion des rekombinanten Gens im Leserahmen mit der Melittin-Signalsequenz zur Sekretion des rekombinanten Proteins erlauben. Die PCR-Produkte und Klonierungsvektoren wurden mit den entsprechenden Restriktionsenzymen (New England Biolabs) vor der Ligation, welche über Nacht bei 16°C unter Verwendung von T4-Ligase (Gibco BRL) durchgeführt wurde, gespalten. Die Ligationsgemische wurden in DH5a-Zellen transformiert, welche über Nacht auf LB-Platten, die 50 μg/ml Ampicillin enthielten, gezogen. Die Klone wurden durch eine PCR unter Verwendung der rekombinanten Baculovirus PCR-Primer von Invitrogen (Kat. N610-04) auf die Anwesenheit des Inserts analysiert. Die positiven Klone, welche durch die PCR identifiziert wurden, wurden mit den vorwärts gerichteten Polyhedrin (Kat. N598-02) und rückwärts gerichteten Baculovirus (+15) (Kat. N615-02) Sequenzierungsprimern von Invitrogen sequenziert, um zu bestätigen, dass das rekombinante Gen richtig orientiert und mit dem Melittin-Sekretionssignal fusioniert war.
Herstellung des rekombinanten Virus. SF9-Insektenzellen wurden zur Herstellung und Amplifikation von rekombinantem Virus verwendet. Grace-Insektenwachstumsmedium wurde von Gibco BRL (Kat. 11605) erhalten und mit 10% fötalem bovinem Serum (Gibco BRL, Kat. 26140), 1 μg/ml Gentamicin (Gibco BRL, Kat. 15710) und 625 ng/ml Fungizon (Gibco BRL, Kat. 15295) ergänzt. Pluronic F-68-Säure (Sigma, Kat. P-1300) wurde zu Suspensionszellkulturen mit 0,2% (Gew./Vol.) hinzugefügt. Die rekombinanten Konstrukte wurden zusammen mit der linearisierten Bac-N-Blue-DNA in SF9-Zellen unter Verwendung des Bac-N-Blue-Transfektionskits von Invitrogen (Kat. BK855-01) gemäß den Herstellerangaben transifiziert. Wachstumsmedium, welches ein Gemisch aus rekombinanten und Wildtyp-Viruspartikeln enthielt, wurde 72 Std. und 120 Std. nach der Transfektion gesammelt. Mögliche rekombinante Virusisolate wurden durch Infizieren von SF9-Zellen mit Verdünnungen der Transfektionsstammlösung und Isolieren von Fokuspunkten der Infektion (Plaques) aus einem Agarose-Overlay (Plaque-Assay) gereinigt. Rekombinante Viren wurden durch ihre Fähigkeit, blaue Plaques auf X-gal aufgrund der Anwesenheit des lacZ-Gens in einem pMelBac-Transfervektor zu bilden, identifiziert. Mögliche rekombinante Plaques wurden zu viralen P1-Stammlösungen mit niedrigem Titer in niedrigem Maßstab durch Infizieren von ungefähr 2 × 106 SF9-Zellen und Sammeln des Wachstumsmediums 5–7 Tage nach der Infektion amplifiziert. Die Anwesenheit eines rekombinanten Geninserts in einem möglichen rekombinanten Virus und die Reinheit des rekombinanten Plaques wurde durch eine PCR-Analyse der Virus-DNA unter Verwendung der rekombinanten Baculovirus PCR-Primer, welche oben beschrieben wurden, bestätigt.
Die Expression von rekombinantem Protein wurde durch eine Western Blot-Analyse des Wachstumsmediums unter Verwendung von polyklonalen Kaninchen-Antikörpern, welche gegen Peptide entwickelt wurden, die von der OB-Re-Aminosäuresequenz abgeleitet waren (Beispiel 2, supra), bestätigt. Zusätzlich wurde der C-terminale OB-Re-Abschnitt (Aminosäuren 420–641) verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. PCR- und Western-Analysen-positive virale P1-Stammlösungen wurden weiterhin zu P2-Stammlösungen mit hohem Titer und niedrigem Maßstab durch Infizieren einer Suspensionskultur aus ungefähr 2 × 10⁸ SF9-Zellen und Sammeln des Wachstumsmediums 5–7 Tage nach der Infektion amplifiziert. Der Virustiter der P2-Stammlösungen wurde durch Durchführen eines Plaque-Assays mit Reihenverdünnungen der Virusstammlösungen und Zählen der Anzahl der Plaques bestimmt. Die Viren wurden weiterhin zu Master-Stammlösungen mit hohem Titer im hohen Maßstab durch Infizieren von Suspensionskulturen aus SF9-Zellen mit den P2-Stammlösungen mit bekanntem Virustiter mit einer Multiplizität der Infektion (MOI) gleich 0,5 (0,5 infektiöse Viruspartikel pro SF9-Zelle) amplifiziert. Die sich ergebenden Master-Stammlösungen wurden getitert und für Expressionsstudien des rekombinanten Proteins verwendet.
Expression des rekombinanten Proteins. Die Expressionsmengen der rekombinanten Proteine wurden durch Testen verschiedener Zelllinien, verschiedener MOI und durch Optimieren der Zeitpunkte der Proteinernte optimiert. Typischerweise wurden alle OB-R abgeleiteten rekombinanten Proteine in erheblich höheren Mengen in High Five-Zellen (Kat. B855-02, Invitrogen) verglichen mit den Expres sionsmengen in SF9-Zellen exprimiert. EX-CELL 405 Wachstumsmedium (JRH Biosciences, Kat. 14405-79P), ergänzt mit 3 μg/ml Gentamicin und 1,25 μg/ml Fungizon wurden für das serumfreie Wachstum der High Five-Zellen verwendet, um die Reinigung der sezernierten rekombinanten Proteine zu vereinfachen. Die optimale MOI reichte von 5 bis 10. Die optimale Protein-Sammelzeit lag gewöhnlich ungefähr 72 Std. nach der Infektion.
Für eine Expression des rekombinanten Proteins in großem Maßstab wurde eine Suspensionskultur aus High Five-Zellen auf einem Schüttler bei 27°C mit ungefähr 100–120 rpm bis zu einer Dichte von ungefähr 2 × 10⁶ Zellen/ml (Log-Stadium des Wachstums) gezogen. Die Zellen wurden mit einer rekombinanten Virus-Masterstammlösung mit der optimalen MOI infiziert, und. das Wachstumsmedium wurde zum optimalen Zeitpunkt gesammelt. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 5000 g für 10 Minuten entfernt, und die sezernierten Proteine wurden durch das Hinzufügen von Ammoniumsulfat präzipitiert. FPLC basierte Protokolle wurden für eine weitere Reinigung der rekombinanten Proteine eingesetzt.
Assay auf die biologische Aktivität (Leptinbindung). Die biologische Aktivität des rekombinanten OB-Re und der OB-Re-Mutanten wurde durch ihre Fähigkeit getestet, Leptin, welches an SEPHAROSE-Kügelchen konjugiert war, zu binden. Wachstumsmedium, welches sezerniertes rekombinantes Protein enthielt, wurde über Nacht mit Leptin-SEPHAROSE-Kügelchen inkubiert. Die Kügelchen wurden gewaschen, mit SDS gekocht und die gebundenen Proteine wurden durch einen Western-Blot analysiert. Alle analysierten rekombinanten Proteine waren in der Lage, Leptin zu binden. Die Bindung des rekombinanten vollständigen OB-Re an Leptin ist sehr stark, da OB-Re bei Raumtemperatur mit starken chaotropischen Mitteln, wie SDS, Harnstoff oder Guanidiniumhydrochlorid nicht von der Leptin-SEPHAROSE-Säule eluiert werden konnte. Die Spezifität der rekombinantes Protein-Leptin-Interaktion wurde durch einen kompetitiven Inhibitionsassay überprüft (12). Medium, welches rekombinante Proteine enthielt, wurde mit löslichem Leptin vor der Inkubation mit Leptin-Sepharose präinkubiert. Für lösliches Leptin wurde gefunden, dass es die Bindung der rekombinanten OB-Re-Proteine an Lep tin-Sepharose-Kügelchen in einer konzentrationsabhängigen Weise inhibiert (Tabelle 3).
Die vorliegende Erfindung soll durch die hier beschriebenen spezifischen Ausführungsformen in ihrem Schutzumfang nicht beschränkt werden. In der Tat werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, welche hier beschrieben wurden, dem Fachmann aus der vorangehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren offensichtlich werden. Es ist beabsichtigt, dass solche Modifikationen in den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche fallen.
Wo Nukleotid- oder Aminosäuresequenzlängen bereitgestellt werden oder Molekulargewichtswerte angegeben werden, sind sie ungefähre Angaben. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Lösliches Leptinrezeptor(OB-R)-Polypeptid, welches a) OB-Re nach Definition von SEQ ID NR: 10 ist; b) ein Polypeptid ist, das den N-Terminus von OB-Re SEQ ID NR: 10 von Pro⁶⁶⁴ bis His⁷⁹⁶ und den C-Terminus von OB-Re SEQ ID NR: 10 nach His⁷⁹⁶ aufweist; c) ein Leptinrezeptor ist, bei dem a) die N-terminale Sequenz i) die Aminosäurereste 1 bis 796 von SEQ ID NR: 10, ii) die Aminosäurereste 23 bis 796 von SEQ ID NR: 10, iii) die Aminosäurereste 28 bis 796 von SEQ ID NR: 10, iv) die Aminosäurereste 133 bis 796 von SEQ ID NR: 10 oder v) die Aminosäurereste 733 bis 796 von SEQ ID NR: 10 ist und b) die C-terminale Sequenz SEQ ID NR: 15 nach His⁷⁹⁶ ist; d) ein Leptinrezeptor ist, der eine N-terminale Sequenz aufweist, die Aminosäurereste 28 bis 796 von SEQ ID NR: 10 und ein vorausgehendes N-terminales Asp-Pro Dipeptid ist und eine C-terminale Sequenz, die SEQ ID NR: 15 nach His⁷⁹⁶ ist; e) ein Leptinrezeptor ist, der die Sequenz i) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Tyr⁴²⁰ (SEQ ID NR: 77) gefolgt von Ala⁴²¹ bis Pro⁶⁴¹ von SEQ ID NR: 10, ii) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Ser¹¹⁸ (SEQ ID NR: 78) gefolgt von Ala⁴²¹ bis Pro⁶⁴¹ von SEQ ID NR: 10 oder iii) Asp-Arg-Trp-Gly-Ser-Leu¹²³ (SEQ ID NR: 79) gefolgt von Ala⁴²¹ bis Pro⁶⁴¹ von SEQ ID NR: 10 aufweist; f) ein Leptinrezeptor ist, der aus der Sequenz i) Tyr⁴²⁰ bis Pro⁶⁴¹ von SEQ ID NR: 10, ii) Ser¹¹⁸ bis Pro⁶⁴¹ von SEQ ID NR: 10, oder iii) Leu¹²³ bis Val³³¹ von SEQ ID NR: 10 besteht; oder g) ein Leptinrezeptor ist, der eines der vorstehenden Peptide ist und bei dem ein Cystein durch ein Serin, Threonin, Methionin oder Alanin ersetzt ist.
Leptinrezeptor nach Anspruch 1, der ein natürlich vorkommender muriner Lep tinrezeptor ist.
Derivat, das aus dem Leptinrezeptor gemäß einem der vorstehenden Ansprüche und einer daran gekoppelten chemischen Einheit besteht.
Derivat nach Anspruch 3, bei dem die chemische Einheit ein wasserlösliches Polymer wie beispielsweise Polyethylenglycol ist.
Isolierte Nukleinsäure, die den Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.
Isolierte Nukleinsäure, die bei Expression ein lösliches Leptinrezeptor-Polypeptid, das die Fähigkeit, Leptin zu binden, aufweist, kodiert, welche a) ein DNA-Molekül nach SEQ ID NR: 9, b) die komplementäre Sequenz des in a) definierten DNA-Moleküls oder c) ein DNA-Molekül, das bei Expression ein Polypeptid kodiert, das von einem beliebigen der vorstehenden DNA-Molekül kodiert wird, ist.
Vektor, umfassend die DNA nach Anspruch 6, der vorzugsweise ein Expressionsvektor, umfassend die DNA nach Anspruch 6, die operativ mit einer Expressionskontrollsequenz verbunden ist, oder ein transgener Vektor ist.
Einzelliger Wirt, der mit einem DNA-Molekül nach Anspruch 6 oder einem Vektor nach Anspruch 7 transformiert oder transfiziert ist, wobei die Wirtszelle vorzugsweise eine Bakterien-, Hefe-, Säuger-, Pflanzen- oder Insektenzelle in Gewebekultur ist.
Einzelliger Wirt nach Anspruch 8, wobei der einzellige Wirt eine E. coli-, Pseudomonas-, Bacillus-, Streptomyces-, Saccharomyces-, Pichia-, Candida-, Hansenula-, Torulopsis-, CHO-, R1.1-, B-W-, LM-, COS 1-, COS 7-, BSC1-, BSC40-, BMT10- oder Sf9-Zelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines Leptinrezeptor-Polypeptids umfassend: a) das Kultivieren einer Zelle nach Anspruch 8 oder Anspruch 9 unter Bedingungen, welche die Expression des Leptinrezeptor-Poylpeptids bewirken; und b) das Gewinnen des exprimierten Polypeptids.
Antikörper, der spezifisch für den Leptinrezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
Antikörper nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist.
Antikörper nach Anspruch 12, der mit einer detektierbaren Markierung markiert ist.
Immortale Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper nach Anspruch 12 herstellt.
Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers, der spezifisch für einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 bis 4 ist, umfassend a) das Immunisieren eines Wirtstieres mit den Leptinrezeptor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dem ein Adjuvans beigemischt ist und/oder der an ein Trägerprotein gekoppelt ist, und b) das Erhalten des Antikörpers aus dem immunisierten Wirtstier.
Verfahren zum Messen des Vorhandenseins eines löslichen Leptinrezeptors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 in einer Probe, umfassend: a) das Inkontaktbringen einer Probe, von der vermutet wird, daß sie einen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 bis 4 enthält, mit einem Antikörper, der spezifisch an einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 bis 4 bindet, wobei der Antikörper optional an einen Festphasenträger gebunden ist, unter Bedingungen, welche die Bildung eines Reaktionskomplexes umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, erlauben und b) das Nachweisen der Bildung von Reaktionskomplexen, umfassend den Antikörper und den Leptinrezeptor, in der Probe, wobei der Nachweis der Bildung von Reaktionskomplexen das Vorhandensein von Leptinrezeptor in der Probe anzeigt und wobei das Verfahren optional c) das Bestimmen der Menge der gebildeten Reaktionskomplexe einschließt, wobei die Menge an Reaktionskomplexen mit der Menge an Leptinrezeptor der biologischen Probe entspricht, und wobei das Verfahren weiter optional den Schritt des Vergleichens des Niveaus, die in diesem Schritt bestimmt wird, mit dem Niveau des Leptinrezeptors, der in normalen Individuen oder in dem Individuum zu einem früheren Zeitpunkt vorhanden ist bzw. war, enthält, wobei ein Anstieg des Leptinrezeptorniveaus, verglichen mit normalen Leveln eine Krankheit, die mit erhöhten Leptinrezeptorniveaus einher geht, anzeigt, und eine Abnahme des Leptinrezeptorniveaus verglichen mit normalen Niveaus eine Krankheit, die mit erniedrigten Leptinrezeptorniveaus einher geht, anzeigt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, zur Verwendung in der Medizin.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 zur Verwendung bei der Behandlung von Fettleibigkeit in einem Individuum.
Verwendung eines löslichen Leptinrezeptors nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 in der Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von Fettleibigkeit in einem Individuum.
Kit, umfassend die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 17 und eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Diabetes, Bluthochdruck oder erhöhtem Cholesterinspiegel.
Die körperliche Erscheinung verbessernde kosmetische Zusammensetzung zur Reduktion des Körpergewichtes eines Individuums, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen verträglichen Träger.
Verfahren zur kosmetischen Behandlung zur Verbesserung der körperlichen Erscheinung, umfassend das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend einen löslichen Leptinrezeptor nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 und einen verträglichen Träger, an ein Individuum.