CN112040980A - 用于治疗代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的瘦蛋白受体激动剂抗体 - Google Patents

用于治疗代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的瘦蛋白受体激动剂抗体 Download PDF

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Abstract

本文提供了使用激动剂瘦蛋白受体(LEPR)抗体、其抗原结合片段或者包含所述LEPR抗体或其抗原结合片段的组合物来进行治疗的治疗方法。此类治疗方法包括治疗与代谢功能障碍相关联的病症，所述病症包括例如脂肪营养不良、肥胖倾向或肥胖、体重减轻、非酒精性脂肪肝疾病、食欲过盛、高血糖、胰岛素抵抗、血脂异常、肝性脂肪变性和不孕。

Description

用于治疗代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的瘦蛋白受体激动剂 抗体
技术领域
本发明涉及使用结合人瘦蛋白受体(LEPR)的激动剂抗体和激动剂抗体的抗原结合片段来治疗瘦蛋白缺乏和脂肪营养不良中的代谢功能障碍以及恢复胰岛素敏感性的治疗方法。
序列表
序列表的正式副本以ASCII格式的序列表与说明书同时通过EFS-Web以电子方式提交，文件名为10436WO_SEQ_LIST_ST25，创建日期为2019年4月5日，大小为约105千字节。该ASCII格式的文档中含有的序列表是说明书的一部分，并且以引用的方式整体并入本文。
背景技术
瘦蛋白是一种主要由脂肪组织表达的多肽激素，它涉及代谢、神经内分泌功能、免疫力、能量平衡和食物摄入的调节。瘦蛋白活性通过与瘦蛋白受体的相互作用和通过瘦蛋白受体的信号传导来介导。瘦蛋白受体(也称为“LEPR”、“WSX”、“OB受体”、“OB-R”和“CD295”)是一种I类细胞因子受体家族的单次跨膜受体，具有较大(818个氨基酸)的胞外结构域。瘦蛋白缺乏、瘦蛋白抵抗和某些LEPR信号传导缺陷/信号传导受损突变与肥胖、2型糖尿病、血脂异常、脂肪营养不良、肝性脂肪变性、非酒精性和酒精性脂肪肝疾病、严重胰岛素抵抗、矮妖症/多诺霍(Donohue)综合征、罗伯森-门登霍尔(Rabson-Mendenhall)综合征和相关的并发症相关联。解决瘦蛋白抵抗、瘦蛋白缺乏和低瘦蛋白血症(例如，脂肪营养不良)的治疗方法主要集中于补充瘦蛋白或瘦蛋白类似物向受影响的个体的递送。然而，这些方法通常显示出有限的功效，尤其是在瘦蛋白抵抗个体中，并且常常与不良副作用相关联。因此，本领域中需要治疗瘦蛋白抵抗和与瘦蛋白缺乏或低瘦蛋白血症相关联的其他病症的替代方法。
发明内容
本发明提供了结合人瘦蛋白受体(LEPR)的抗体及其抗原结合片段。本发明的抗体是激动剂抗体；即，本发明的抗LEPR抗体与LEPR的结合会导致，尤其是细胞中的瘦蛋白受体信号传导的活化。在某些实施方案中，本发明的抗体不与瘦蛋白竞争LEPR的结合。本发明的抗体可用于例如在受试者中模拟、替代或补充瘦蛋白的正常生物学活性。因此，本发明的抗体和抗原结合片段可用于与瘦蛋白抵抗和瘦蛋白缺乏相关联的疾病和障碍的治疗性处理。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可以仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab')2或scFv片段)，并且可以被修饰以影响功能，例如消除残留的效应子功能(Reddy等人,2000,J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明的示例性抗LEPR抗体列于本文的表1和2中。表1列出了示例性抗LEPR抗体的重链可变区(HCVR)、轻链可变区(LCVR)、重链互补决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链互补决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)的氨基酸序列标识符。表2列出了示例性抗LEPR抗体的HCVR、LCVR、HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3的核酸序列标识符。
本发明提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR包含选自表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含LCVR，所述LCVR包含选自表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR和LCVR氨基酸序列对(HCVR/LCVR)，所述HCVR和LCVR氨基酸序列对包含与表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了包含表1中列出的示例性抗LEPR抗体中的任一者中所含有的HCVR/LCVR氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1(HCDR1)，所述HCDR1包含选自表1中列出的HCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2(HCDR2)，所述HCDR2包含选自表1中列出的HCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3(HCDR3)，所述HCDR3包含选自表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1(LCDR1)，所述LCDR1包含选自表1中列出的LCDR1氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2(LCDR2)，所述LCDR2包含选自表1中列出的LCDR2氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3(LCDR3)，所述LCDR3包含选自表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCDR3和LCDR3氨基酸序列对(HCDR3/LCDR3)，所述HCDR3和LCDR3氨基酸序列对包含与表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一者配对的表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一者。根据某些实施方案，本发明提供了包含表1中列出的示例性抗LEPR抗体中的任一者中所含有的HCDR3/LCDR3氨基酸序列对的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，HCDR3/LCDR3氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:8/16、24/16、32/16、40/16、48/16、56/16、64/72、80/72和88/72。
本发明还提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的示例性抗LEPR抗体中的任一者中所含有的一组六个CDR(即，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。在某些实施方案中，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列组选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:4、6、8、12、14、16；20、22、24、12、14、16；28、30、32、12、14、16；36、38、40、12、14、16；44、46、48、12、14、16；52、54、56、12、14、16；60、62、64、68、70、72；76、78、80、68、70、72；和84、86、88、68、70、72。
在一个相关实施方案中，本发明提供了特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含表1中列出的示例性抗LEPR抗体中的任一者所定义的HCVR/LCVR氨基酸序列对中所含有的一组六个CDR(即，HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3)。例如，本发明包括特异性结合LEPR的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含以下HCVR/LCVR氨基酸序列对中所含有的HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列组：HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:2/10、18/10、26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术是本领域熟知的，并且可以用于鉴定本文公开的指定HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。可以用于鉴定CDR的边界的示例性惯例包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。一般而言，Kabat定义基于序列差异，Chothia定义基于结构环区域的位置，AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折衷方案。参见例如，Kabat,"Sequences ofProteins of Immunological Interest,"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.273:927-948(1997)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:9268-9272(1989)。公共数据库也可用于鉴定抗体中的CDR序列。
本发明还提供了编码抗LEPR抗体或其部分的核酸分子。例如，本发明提供了编码表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的HCVR核酸序列中的任一者的多核苷酸序列，或者与它们具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的它们的基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的LCVR核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的HCDR1氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的HCDR1核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的HCDR2氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的HCDR2核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的HCDR3氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的HCDR3核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的LCDR1氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的LCDR1核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的LCDR2氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的LCDR2核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供编码表1中列出的LCDR3氨基酸序列中的任一个的核酸分子；在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的LCDR3核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。
本发明还提供了编码HCVR的核酸分子，其中所述HCVR包含一组三个CDR(即，HCDR1、HCDR2、HCDR3)，其中所述HCDR1、HCDR2、HCDR3氨基酸序列组如表1中列出的示例性抗LEPR抗体中的任一者所定义。
本发明还提供了编码LCVR的核酸分子，其中所述LCVR包含一组三个CDR(即，LCDR1、LCDR2、LCDR3)，其中所述LCDR1、LCDR2、LCDR3氨基酸序列组如表1中列出的示例性抗LEPR抗体中的任一者所定义。
本发明还提供了编码HCVR和LCVR二者的核酸分子，其中所述HCVR包含表1中列出的HCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列，并且其中所述LCVR包含表1中列出的LCVR氨基酸序列中的任一者的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述核酸分子包含选自表2中列出的HCVR核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列，以及选自表2中列出的LCVR核酸序列中的任一个的多核苷酸序列，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性的其基本上相似的序列。在根据本发明的该方面的某些实施方案中，所述核酸分子编码HCVR和LCVR，其中所述HCVR和LCVR二者均衍生自表1中列出的相同的抗LEPR抗体。
本发明还提供了能够表达包含抗LEPR抗体的重链可变区或轻链可变区的多肽的重组表达载体。例如，本发明包括重组表达载体，所述重组表达载体包含上述核酸分子中的任一者，即编码表1所示的HCVR、LCVR和/或CDR序列中的任一者的核酸分子。本发明的范围内还包括已经引入此类载体的宿主细胞，以及通过在允许产生抗体或抗体片段的条件下培养宿主细胞并且回收这样产生的抗体和抗体片段来产生抗体或其部分的方法。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含特异性结合LEPR的重组人抗体或其片段以及药学上可接受的载剂。在一个相关方面，本发明的特征在于一种组合物，所述组合物是抗LEPR抗体和第二治疗剂的组合。在一个实施方案中，第二治疗剂是有利地与抗LEPR抗体组合的任何药剂。
如在本公开全文中所用，术语“受试者”与术语“患者”是可互换的。受试者或患者可以是成人。儿童患者也被设想为受益于本文提供的方法和组合物。
在又一个方面，本发明提供了用于使用本发明的抗LEPR抗体或抗体的抗原结合部分来增强或刺激LEPR信号传导的治疗方法。根据本发明的该方面的治疗方法包括将治疗有效量的药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含本发明的抗体或抗体的抗原结合片段。所治疗的障碍是通过刺激或活化LEPR信号传导或者体外或体内模拟瘦蛋白的天然活性而得以改良、改善、抑制或预防的任何疾病或病症。
在一些方面，本文提供了用于治疗或预防代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的治疗方法。所述方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人瘦蛋白受体(LEPR)和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在一些方面，本文提供了用于治疗或预防代谢功能障碍或低瘦蛋白血症、或者与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的疾病或病症、或者所述疾病或病症的一个或多个症状的治疗方法。所述方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在一些实施方案中，所述病症选自由以下各项组成的组：非酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、女性不孕、闭经、激素周期异常、免疫功能受损、甲状腺机能减退、肥胖、单基因肥胖、I型糖尿病、II型糖尿病、脂肪营养不良、先天性脂肪营养不良、全身脂肪营养不良、获得性脂肪营养不良、局部脂肪营养不良、先天性局部脂肪营养不良、先天性全身脂肪营养不良、获得性局部脂肪营养不良和获得性全身脂肪营养不良。
在一些实施方案中、与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的疾病或病症的一个或多个症状选自由以下各项组成的组：肥胖倾向、肥胖、食欲过盛、高血糖、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、胰岛素抵抗、血脂异常、生长延迟、青春期骤长延迟、生长激素分泌异常、HbA1c升高、低骨矿物质密度(或低骨骼质量)、低骨矿物质含量和低瘦体重。在施用结合人LEPR的抗体或其抗原结合片段后，与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的疾病或病症的症状可以得到预防、改善、或严重度和/或持续时间减轻/缩短、或减少。
在另外其他方面，本文提供了用于治疗脂肪营养不良的代谢并发症的方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人瘦蛋白受体(LEPR)和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方案中，所述治疗在受试者中减轻了高血糖、减少了胰岛素抵抗、减少了高甘油三酯血症、降低了循环胆固醇水平、和/或降低了HbA1c水平。脂肪营养不良可包括获得性局部脂肪营养不良、获得性全身脂肪营养不良、先天性局部脂肪营养不良和先天性全身脂肪营养不良。
先天性瘦蛋白缺乏是一种罕见疾病，其特征在于LEPR或瘦蛋白的致病性变体。一些受试者具有循环的瘦蛋白，但是由于遗传突变(例如，p.N103K，它编码瘦蛋白的无生物活性形式)，所述蛋白质是无功能的。一些受试者的循环瘦蛋白很少或没有。涉及瘦蛋白信号传导受损的其他基因可以包括LMNA、PPARG、PLIN1、AKT2、CIDEC、LIPE和ADRA2A，并且本文提供的抗LEPR抗体及其抗原结合片段可用于减轻此类突变对瘦蛋白信号传导的影响。
在一些方面，本文提供了用于治疗先天性瘦蛋白缺乏的方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人瘦蛋白受体(LEPR)和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方案中，受试者患有脂肪营养不良并且美曲普汀治疗失败。在一些实施方案中，在施用结合人LEPR的抗体或其抗原结合片段后，与先天性脂肪营养不良相关联的症状可以得到预防、改善、或严重度和/或持续时间减轻/缩短、或减少。在一些实施方案中，治疗逆转或减轻受试者中的食欲过盛、肥胖、高胰岛素血症、血脂异常和肝脂肪变性中的一者或多者。在一些实施方案中，受试者的血糖得以降低，受试者的体重得以减轻，受试者表现出食物摄入量减少，受试者的脂肪质量得以减少，受试者的瘦体质量得以增加，以及/或者受试者的骨骼质量得以增加。
在一些方面，本文提供了用于治疗非酒精性脂肪肝疾病或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的治疗方法。在一些方面，受试者是患有低瘦蛋白血症的、脂肪营养不良的或瘦蛋白缺乏的。根据该方面，所述方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方案中，在治疗后受试者的肝脏重量减少。在一些实施方案中，在治疗后，受试者中的非酒精性脂肪肝疾病(包括非酒精性肝性脂肪变性)的症状得以减少。在一些实施方案中，受试者中的丙氨酸转氨酶(ALT)的血浆水平和/或天冬氨酸转氨酶(AST)的血浆水平得以降低。
在另外其他方面，本文提供了用于治疗女性不孕、闭经或者恢复与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的正常激素周期的方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些方面，结合人LEPR的抗体或其抗原结合片段的施用可以增加生育力和/或增加受孕的机会。在一些方面，受试者受孕。在一些方面，治疗可以恢复或启动正常月经周期。
在一些方面，本文提供了用于治疗与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的免疫功能受损的方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方案中，在施用结合人LEPR的抗体或其抗原结合片段后，CD4+T细胞计数增加。
在其他方面，本文提供了用于增加患有代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的受试者中的骨骼质量的治疗方法。所述方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在其他方面，本文提供了用于治疗肥胖倾向或肥胖或者减轻体重的治疗方法。根据该方面，所述方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方案中，治疗减轻脂肪质量，但是不减轻瘦体质量。
在一些实施方案中，有需要的受试者是患有低瘦蛋白血症的、脂肪营养不良的或瘦蛋白缺乏的。在一些实施方案中，有需要的受试者不是患有低瘦蛋白血症的或瘦蛋白缺乏的。在一些实施方案中，代谢功能障碍、肥胖倾向或肥胖与信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变不相关或者不是由信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变导致的。
在一些实施方案中，根据本文提供的方法的结合人LEPR和活化LEPR信号转导的抗体或其抗原结合片段的施用刺激了下丘脑STAT3信号转导或者增强了瘦蛋白诱导的或非瘦蛋白依赖性的STAT3信号转导。
在一些实施方案中，结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段的施用降低了循环血浆甘油三酯和/或降低了循环血浆总胆固醇。
在其他方面，本文提供了通过刺激下丘脑STAT3信号传导来治疗食欲过盛、高血糖、胰岛素抵抗、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝疾病的治疗方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人瘦蛋白受体(LEPR)和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。在一些实施方案中，治疗降低循环血浆甘油三酯。在一些实施方案中，治疗降低循环血浆总胆固醇。
在另外其他方面，本文提供了用于治疗与先天性瘦蛋白缺乏相关联的生长延迟、青春期骤长缺乏和/或生长激素分泌异常的方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在另外其他方面，本文提供了用于治疗与先天性瘦蛋白缺乏相关联的甲状腺机能减退的方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
在另外其他方面，本文提供了用于治疗与低瘦蛋白血症和/或瘦蛋白缺乏相关联的低骨矿物质密度和/或骨矿物质含量的方法。此类方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
一种或多种另外的治疗剂可以与结合人LEPR的抗体或其抗原结合片段一起施用于本文所述的受试者。第二治疗剂可以选自由以下各项组成的组：重组人瘦蛋白、PCSK9抑制剂、他汀类、依泽替米贝(ezetimibe)、胰岛素、胰岛素变体、胰岛素促分泌剂、二甲双胍、磺酰脲、钠葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂、GLP-1激动剂/类似物、胰高血糖素(GCG)抑制剂、胰高血糖素受体(GCGR)抑制剂、血管生成素样蛋白(ANGPTL)抑制剂、芬特明(phentermine)、奥利司他(Orlistat)、托吡酯(Topiramate)、安非他酮(bupropion)、托吡酯(Topiramate)/芬特明(phentermine)、安非他酮(bupropion)/那曲酮(naltrexone)、安非他酮(bupropion)/唑尼沙胺(zonisamide)、普兰林肽(Pramlintide)/美曲普汀(Metreleptin)、氯卡色林(Lorcaserin)、新利司他(Cetilistat)、特索芬辛(Tesofensine)、韦利贝特(Velneperit)抗惊厥药、地高辛、香豆素、维生素D、甲状腺素、甲状腺补充剂、维生素补充剂、钙补充剂、肉碱、辅酶Q10、抗便秘药物、抗过敏药物、加巴喷丁(gabapentin)、麻醉剂、氯胺酮、利多卡因(lidocaine)、或盐酸文拉法辛(venlafaxinehydrochloride)。
本发明还提供了一种用于治疗、预防或改善患者中的(i)脂肪营养不良(任何类型)和/或单基因肥胖；(ii)与脂肪营养不良和/或单基因肥胖相关联的病症；或者(iii)(i)或(ii)的症状的方法；所述方法包括将特异性结合至LEPR(例如，H4H17319P2)的激动剂抗体或其抗原结合片段施用于对其有需要的患者。例如，在本发明的一个实施方案中，与脂肪营养不良和/或单基因肥胖相关联的病症是极度早发性肥胖；食欲过盛和饱腹感受损；免疫功能受损(CD4+计数)；胰岛素抵抗；非酒精性脂肪肝疾病；NASH、血脂异常；糖尿病；生殖功能障碍；性腺功能减退；青春期骤长缺乏；甲状腺机能减退；甲状腺功能受损；低骨矿物质密度和/或低骨骼质量。在本发明的一个实施方案中，所述症状是肝脏肿大、肝酶升高、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血液水平升高、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血液水平升高、高肥胖倾向；针对年龄和性别的身体质量指数>第85个百分位；觅食行为异常；护食行为异常；反复和潜在致死感染；高胰岛素血症；肝脂肪变性；向NASH的进展(脂肪营养不良)；高甘油三酯血症；HbA1c升高；葡萄糖水平升高；葡萄糖耐量降低；青春期发育延迟；第二性征的表现减少；无月经或月经不调；不孕；身材矮小；生长激素分泌异常；T3改变；TSH改变；和/或游离甲状腺素水平改变。
在本发明的一个实施方案中，激动剂抗LEPR抗体或其抗原结合片段(例如，H4H17319P2；参见WO2017/66204)如下所述给予：(i)静脉内给予一个或多个约5mg/kg体重的剂量；然后(ii)每周皮下给予一个或多个约250-300mg，例如250mg或约300mg的剂量一次；然后(iii)任选地，每月或约28天皮下给予一个或多个约250mg或约300mg的剂量一次。例如，(i)静脉内给予一个或多个约5mg/kg体重的剂量；然后(ii)每周皮下给予一个或多个约250mg或约300mg的剂量一次。在本发明的一个实施方案中，抗体如下所述给予：(i)静脉内给予5mg/kg体重一次(在第1天)；然后(ii)每周皮下给予四个约250mg或约300mg的剂量一次(例如，在第4、11、18和25天)；然后(iii)每月或28天皮下给予一个或多个约250mg或约300mg的剂量一次(例如，在第53、81、109、137、165和193天等等)。例如，在本发明的一个实施方案中，第一皮下剂量出现在约第4天，即第1天给予静脉内剂量后约三天。
通过参阅接下来的详细说明，其他实施方案将变得显而易见。
附图说明
图1描绘了在存在浓度不断增加的测试抗LEPR抗体或对照分子的情况下二聚体人LEPR与人瘦蛋白的结合，如通过ELISA(在450nm处的吸光度)所测量。
图2A-2C展示了在表达野生型LEPR(圆圈)、信号传导缺陷型LEPR突变体(A409E，正方形)或信号传导受损型LEPR突变体(P316T，三角形)的HEK293细胞中的LEPR信号传导的程度。LEPR信号传导以pSTAT3-Y705/STAT3的比率表示，所述比率通过光密度法从用浓度不断增加的瘦蛋白(图2A)、H4H16650(图2B)或H4H16679(图2C)处理的细胞制备的蛋白质印迹来测量。
图3显示了给予3mg/kg同种型对照抗体或3mg/kg选自H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2的LEPR抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠的平均每日食物摄入量。
图4显示了给予3mg/kg同种型对照抗体或3mg/kg选自H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2的LEPR抗体的小鼠的平均体重变化百分比。
图5显示了每个抗体处理组中的动物的平均脂肪质量，所述脂肪质量通过在抗体处理之前1天(无阴影条柱)和在抗体处理之后6天(阴影条柱)的μCT来定量，以平均值±SEM表示。
图6显示了喂食30mg/kg选自H4H18482P2、H4H18487P2、H4H18492P2的抗体或同种型对照的小鼠的体重变化百分比。
图7A-7B.图7A显示了在给予抗LEPR抗体H4H18482P2、H4H18487P2或H4H18492P2前小鼠的脂肪质量。图7B显示了用30mg/kg H4H18482P2、H4H18487P2或H4H18492P2处理的小鼠的脂肪质量。
图8.图8显示，所测试的抗LEPR抗体在IMR-32/STAT3-luc/Mf LEPR细胞系中活化猴(Mf)LEPR。
图9A-9C.在第0天，通过在18周龄雄性Leprhu/hu小鼠中进行mLepr.ECD的HDD来诱导瘦蛋白缺乏。在HDD后七天，根据体重变化相对百分比将小鼠分层为2组，并且施用单个10mg/kg皮下剂量的对照单克隆抗体(灰色实心圆圈或条柱)或H4H17319P2(实心圆圈或条柱)。数据是平均值±SEM。*，在指定时间点，对于H4H17319P2与对照单克隆抗体，P<0.05。$，在相同的相应施用组中，HDD前(第-1天)和HDD后的任一天(第6或13天)之间的P<0.05。&，在相同的相应施用组中，单克隆抗体施用前(第6天)和单克隆抗体施用后(第13天)之间的P＜0.05。对于在指定日期以相应的文本颜色表示的组，相对于第0天基线无显著差异(ns)。图9A显示了在整个研究过程中Leprhu/hu小鼠的体重(左)和每日食物摄入量(右)，该图显示瘦蛋白缺乏的诱导导致体重快速增加和食欲过盛。每组N＝14。图9B显示了在HDD前1天(第-1天)、单克隆抗体施用前1天(HDD后第6天)和施用后6天(HDD后第13天)通过微型CT成像进行的身体组成分析。显示了针对对照单克隆抗体(N＝14)和H4H17319P2(N＝14)施用组(分别为灰色和黑色条柱)的脂肪质量(左)和瘦体质量(右)的定量。图9C.从用单剂量的对照单克隆抗体(灰色条柱，N＝14)或H4H17319P2(黑色条柱，N＝14)处理的诱导瘦蛋白缺乏型Leprhu/hu小鼠处理后6天(第13天)获得的血浆的化学分析。
图10A-10D.图10A.显示针对瘦蛋白受体胞外结构域人源化Leprhu/hu小鼠的产生而靶向的基因的示意图。图10B.雄性野生型(Lepr+/+，灰色条柱)和Leprhu/hu(黑色条柱)小鼠的体重(9周龄)和身体组成的微型CT定量(9至12周龄)。数据是平均值±SEM。每组N＝6-10。图10C.针对8至11周龄雄性Lepr+/+(灰色圆圈)和Leprhu/hu(黑色圆圈)小鼠的胰岛素耐量测试(0.75U/kg，腹腔)。数据是平均值±SEM。每组N＝8-9。图10D.9至13周龄雄性Lepr+/+(灰色条柱)和Leprhu/hu(黑色条柱)小鼠中的血清瘦蛋白水平。数据是平均值±SEM。每组N＝8-9。
图11A-11B.图11A.在第0天进行编码小鼠瘦蛋白受体胞外结构域的质粒(mLeprECD.hFc，黑色圆圈)或对照质粒(对照hFc，灰色圆圈)的流体动力学DNA递送(HDD)后，8周龄雄性C57BL/6N小鼠中的体重(左)、相对于第0天基线的体重变化百分比(中)和累积食物摄入量(右)。数据是平均值±SEM。每组N＝6。图11B.编码小鼠瘦蛋白受体胞外结构域的质粒(mLeprECD.hFc，黑色条柱)或对照质粒(对照hFc，灰色条柱)的HDD后7天身体组成的微型CT定量。数据是针对脂肪质量、瘦体质量、骨骼质量、骨矿物质含量和骨密度(从左到右)的平均值±SEM。每组N＝6。
图12A-12C.在第0天，通过在17至20周龄雌性或18周龄雄性Leprhu/hu小鼠中进行mLepr.ECD的HDD来诱导瘦蛋白缺乏。在HDD后七天，分别根据体重变化相对百分比将小鼠分层为2组动物，然后施用单个10mg/kg皮下剂量的对照单克隆抗体(灰色空心圆圈或条柱)或H4H17319P2(黑色空心圆圈或条柱)。数据是平均值±SEM。*，在指定时间点，对于H4H17319P2与对照单克隆抗体，P<0.05。$，在相同的相应施用组中，HDD前(第-1天)和HDD后的任一天(第6或13天)之间的P<0.05。&，在相同的相应施用组中，单克隆抗体施用前(第6天)和单克隆抗体施用后(第13天)之间的P＜0.05。对于在指定日期以相应的文本颜色表示的组，相对于第0天基线无显著差异(ns)。图12A.在整个研究过程中雌性小鼠的体重(左)和食物摄入量(右)，该图显示瘦蛋白缺乏的诱导导致体重快速增加和食欲过盛。在对照单克隆抗体施用后，体重继续增加(N＝14)。每组N＝10-11。图12B.在HDD前1天(第-1天)、单克隆抗体施用前1天(HDD后第6天)和施用后6天(HDD后第13天)通过微型CT成像对雌性小鼠进行身体组成分析。数据是针对脂肪质量、瘦体质量、骨骼质量、骨矿物质含量和骨密度(从左到右)的平均值±SEM。每组N＝10-11。图12C.在HDD前1天(第-1天)、单克隆抗体施用前1天(HDD后第6天)和施用后6天(HDD后第13天)通过微型CT成像对雄性小鼠进行身体组成分析。数据是针对骨骼质量、骨矿物质含量和骨密度(从左到右)的平均值±SEM。每组N＝14。
图13A-13D.在第0天，通过在17至20周龄雌性Leprhu/hu小鼠中进行mLepr.ECD的HDD来诱导瘦蛋白缺乏。对于比较，对一组小鼠进行对照载体的HDD。在HDD后七天，将接受mLepr.ECD的小鼠根据体重分层为3组，并且施用两个(第7和13天)3mg/kg皮下剂量的对照单克隆抗体(灰色实心圆圈或条柱)或H4H17319P2(深灰色实心圆圈或条柱)，或者以H4H17319P2处理的诱导瘦蛋白缺乏型小鼠所消耗的食物量成对喂食(浅灰色实心圆圈或条柱)。数据是平均值±SEM。*，相对于在指定时间点HDD mLeprECD施用对照单克隆抗体，对于以符号颜色或条柱表示的相应的组，P<0.05。#，表示H4H17319P2的HDD mLepr ECD处理与HDD mLeprECD成对喂食的动物的统计学显著性。$，相对于在指定时间点施用对照单克隆抗体的HDD对照小鼠，对于以符号颜色或条柱表示的相应的组，P＜0.05。图13A显示了小鼠相对于HDD前的体重变化(左)和累积食物摄入量(右)。每组N＝6-11。图13B展示了在HDD后第13天(处理后7天)之前Leprhu/hu小鼠的身体组成的微型CT定量。脂肪质量、瘦体质量、骨骼质量、骨矿物质含量和骨密度(从左到右)。每组N＝5-10。图13C显示了在0分钟胰岛素处理(1.0U/kg，腹腔)之前禁食4h的小鼠中在HDD后第10天(处理后3天)的胰岛素耐量测试。显示了胰岛素耐量测试的血糖水平和葡萄糖曲线下面积(AUC)(分别为左图和右图)。每组N＝6-11。图13D提供了在第16天或第17天获得的血浆脂质的化学分析。每组N＝6-11。
图14A-14G.每周给予27至30周龄雄性脂肪营养不良aP2-nSrebp1cTg/+；Leprhu/hu小鼠(Tg)以10mg/kg(皮下)对照单克隆抗体(灰色圆圈或条柱)或H4H17319P2(黑色圆圈或条柱)一次。作为参考，每周另外给予27至30周龄雄性非转基因Leprhu/hu小鼠(非Tg)以10mg/kg(皮下)对照单克隆抗体(空心菱形和白色条柱)一次。所有数据都是平均值±SEM。*，相对于在指定时间点给予对照单克隆抗体的非Tg小鼠，以符号颜色或条柱表示的相应的组的P＜0.05。#，相对于在指定时间点给予对照单克隆抗体的Tg小鼠，以符号颜色或条柱表示的相应的组的P＜0.05。$，相应的组的第27天与第-5天P<0.05。图14A的左图和右图分别显示了体重和累积食物摄入量。每组N＝8-9。图14B的左图和右图分别显示了瘦肉量和脂肪质量，它们在第-5天给予前和第27天处理后通过微型CT成像进行定量。每组N＝9。图14C提供了整个研究期间的血糖水平(左)和第28天的血红蛋白A1c水平百分比(右)。每组N＝9。图14D提供了来自第23天的胰岛素耐量测试(0.5U/kg腹腔)的血糖水平和葡萄糖曲线下面积(AUC)。每组N＝9。图14E和14F显示，在H4H17319P2处理的脂肪营养不良Leprhu/hu(Tg)小鼠中循环脂质(E)和肝酶水平(F)降低。第28天获得的血浆的脂质(甘油三酯、胆固醇、LDL-C和HDL-C)和肝酶水平(丙氨酸转氨酶ALT和天冬氨酸转氨酶AST)的化学分析。每组N＝9。图14G提供了来自第30天收获的肝脏的肝脏重量、甘油三酯含量和代表性苏木精和伊红染色的肝脏切片(分别为左图、中图和右图)。每组N＝5。
图15A-15C.在指定年龄的雄性非Tg Leprhu/hu(黑色空心圆圈或黑色条柱)和aP2-nSrebp1cTg/+Leprhu/hu小鼠(黑色空心圆圈或黑色条柱)的表型表征。数据是平均值±SEM。*在相应的时间点相对于Leprhu/hu小鼠的p<0.05。图15A.左图，在12至24周龄时的体重。中图，在大约15至20周龄时通过微型CT成像定量的脂肪质量。右图，在19至21周龄时测量的血浆瘦蛋白水平。每组N＝17-28。图15B.在18至20周龄时的胰岛素耐量测试期间的血糖水平(0.75U/kg胰岛素，腹腔)。每组N＝12-13。图15C.从左到右分别是在15至17周龄时的甘油三酯、胆固醇、LDL-C和HDL-C的血浆水平。每组N＝20至28。
图16A.每周给予27至30周龄雄性脂肪营养不良aP2-nSrebp1cTg/+；Leprhu/hu小鼠(Tg)以10mg/kg(皮下)对照单克隆抗体(灰色条柱)或H4H17319P2(黑色条柱)一次。作为参考，每周另外给予27至30周龄雄性非转基因Leprhu/hu小鼠(非Tg)以10mg/kg(皮下)对照单克隆抗体(白色条柱)一次。所有数据都是平均值±SEM。*，相对于在指定时间点给予对照单克隆抗体的非Tg小鼠，相应的组的P＜0.05。#，相对于在指定时间点给予对照单克隆抗体的Tg小鼠，相应的组的P＜0.05。$，相应的组的第27天与第-5天P<0.05。图16A.在第-5天给予前和第27天处理后通过微型CT成像定量的身体组成，该图显示了骨骼质量、骨矿物质含量和骨密度(从左到右)。每组N＝9。
图17A-17E：图17A中的数据是针对雄性脂肪营养不良aP2-nSrebp1cTg/+；Leprhu/hu小鼠(Tg)，即接受单剂量(10mg/kg皮下)的对照(灰色条柱)或H4H17319P2(深灰色条柱)或瘦蛋白输注(30g/日皮下；黑色条柱)的32至38周龄脂肪营养不良(Tg)小鼠。对于图17B-17E中的数据，每周给予27至30周龄雄性Tg小鼠以10mg/kg(皮下)对照单克隆抗体(灰色圆圈或条柱)或H4H17319P2(深灰色圆圈或条柱)一次或输注瘦蛋白(30g/日皮下；黑色条柱)。如图所示，每周另外给予27至30周龄雄性非转基因Leprhu/hu小鼠(非Tg)以10mg/kg(皮下)对照单克隆抗体(空心菱形和白色条柱)一次。所有数据都是平均值±SEM。*，相对于给予对照单克隆抗体的Tg小鼠，以符号颜色或条柱表示的相应的组的P＜0.05。#，相对于给予H4H17319P2的Tg小鼠，以符号颜色或条柱表示的相应的组的P＜0.05。图17A提供了距前囟大约-1.52mm处的弓状核(Arc)和腹内侧下丘脑(Vmh)中的pSTAT3 Y705的免疫组织化学染色，该图显示了雄性32至38周龄脂肪营养不良(Tg)小鼠中的pSTAT3 Y705+细胞的数量增加。大脑切片来自单剂量对照或H4H17319P2(10mg/kg皮下)或瘦蛋白输注(30g/日皮下)处理后3天收获的大脑。显示了代表性显微照片和Arc和Vmh中的pSTAT3 Y705+细胞数量的定量(分别为左图、中图和右图)。每组N＝4-5。图17B的左图提供了研究期间的血糖水平。中图和右图，第9天胰岛素耐量测试期间的血糖水平和葡萄糖水平的曲线下面积。每组N＝8-9。图17C提供了体重(左图)、体重变化(中图)和累积食物摄入量(右图)。每组Tg小鼠N＝8-9。对于非Tg小鼠，N＝5。图17D提供了第13天获得的血浆的甘油三酯、胆固醇、LDL-C和HDL-C的化学分析，该图显示了用H4H17319P2处理后血浆甘油三酯和胆固醇的减少。每组Tg小鼠N＝8-9。对于非Tg小鼠，N＝5。图17E提供了第14天获得的肝脏的肝脏质量(左图)和肝脏甘油三酯含量(右图)。每组Tg小鼠N＝6-9。对于非Tg小鼠，N＝5。
图18A-18D：图18A和18B中所示的数据是针对施用单剂量对照单克隆抗体(10mg/kg，皮下；灰色实心圆圈)、H4H17319P2(3mg/kg，皮下；空心圆圈)或H4H17319P2(10mg/kg；黑色实心圆圈)的32周龄雌性Leprhu/hu小鼠。图18C中所示的数据是针对施用单剂量对照(皮下；灰色实心圆圈)、H4H17319P2(3mg/kg，皮下；空心圆圈)或H4H17319P2(10mg/kg；黑色实心圆圈)的瘦雄性和雌性食蟹猴。图18D中所示的数据是针对施用两个剂量对照(静脉内；灰色实心圆圈)或H4H17319P2(30mg/kg，静脉内；黑色实心圆圈)的高体脂肪(约6.0kg)雄性和雌性食蟹猴。数据是平均值±SEM。*，在指定时间点，对于H4H17319P2(10mg/kg)与相应的对照，P<0.05。#，在指定时间点，对于H4H17319P2(3mg/kg)与相应的对照，P<0.05。*，在指定时间点，对于H4H17319P2(3mg/kg)与H4H17319P2(10mg/kg)，P<0.05。&，对于H4H17319P2(30mg/kg，静脉内)与相应的对照，P<0.05。图18A提供了在瘦雌性小鼠的研究期间第0天给予前的体重变化百分比(左图)和食物摄入量(右图)。每组N＝6-7。图18B展示了定量NMR分析，该图显示了在瘦雌性小鼠的研究期间，从第0天给予前的脂肪质量(左图)和瘦体质量(右图)变化百分比。每组N＝6-7。图18C展示了在瘦食蟹猴的研究期间第-1天给予前的体重变化百分比。每组N＝12。图18D展示了在高体脂肪食蟹猴的研究期间如通过DEXA(用于测量身体组成的双能X-射线吸收测定法)定量的第-14天、第-7天和第-1天给予前从平均值的体重变化百分比(左图)和脂肪质量变化百分比(中图)以及瘦体质量变化百分比(右图)。对于分别地对照组和H4H17319P2给予组，N＝4和8。
图19描述了在同情用药临床试验中采用的单患者方案。
图20A-20B是提供在处理期1(A)以及处理期2和延伸处理期(B)中接受H4H17319P2处理的患者的评估排程的表格。
图21A-21C展示了在先天性瘦蛋白缺乏的鼠科动物模型中H4H17319P2对血糖、体重和食物摄入量的影响。图21A提供了以mg/dL为单位的血糖，图21B提供了以克为单位的体重，并且图21C提供了以克为单位的累积食物摄入量。灰色圆圈，施用IgG4P对照的Leprhu/hu(N＝5)。黑色正方形，施用IgG4P对照的Leprhu/hu Lep-/-(N＝7)。白色正方形，施用H4H17319P2的Leprhu/hu Lep-/-(N＝8)。数据以平均值±SEM表示。*，对于通过采用图基(Tukey)事后检验的双因素ANOVA进行的Leprhu/hu Lep-/-+H4H17319P2组与Leprhu/hu、Lep-/-+IgG4P对照，P<.05。由于在笼中咬碎的食物过多，对于食物摄入量评估，两只小鼠被排除在Leprhu/hu Lep-/-+IgG4P对照组外，并且一只小鼠被排除在Leprhu/hu Lep-/-+H4H17319P2组外。
图22A-22C展示了在先天性瘦蛋白缺乏的小鼠模型中通过uCT身体组成分析定量的脂肪质量、骨骼质量和瘦体质量。图22A提供了脂肪质量，图22B提供了骨骼质量，并且图22C提供了以克为单位的瘦肉量。在研究开始之前，在D-5对小鼠进行基线扫描。在研究的第35天进行mAb后扫描。灰色条柱，施用IgG4P对照的Leprhu/hu(N＝5)。黑色条柱，施用IgG4P对照的Leprhu/hu Lep-/-(N＝7)。白色条柱，施用H4H17319P2的Leprhu/hu Lep-/-(N＝8)。每周给小鼠皮下注射10mg/kg H4H17319P2或同种型对照抗体。数据以平均值±SEM表示。*，相对于基线，P<.05；#，在相应的时间点，相对于Leprhu/hu+IgG4P对照，P<.05；+，在相应的时间点，相对于H4H17319P2组，P<.05。统计学分析通过采用图基事后检验的双因素ANOVA来进行。
图23A-23C展示了在先天性瘦蛋白受体缺乏的鼠科动物模型中H4H17319P2对血糖、体重和食物摄入量的影响。图23A提供了以mg/dL为单位的血糖，图23B提供了以克为单位的体重，并且图23C提供了以克为单位的累积食物摄入量。灰色圆圈，施用IgG4P对照的Leprhu/hu(N＝7-8)。黑色正方形，施用IgG4P对照的LeprA409E/A409E(N＝9-10)。白色正方形，施用H4H17319P2的LeprA409E/A409E(N＝10)。数据以平均值±SEM表示。*，对于采用西达克(Sidak)事后检验的混合效应模型进行的LeprA409E/A409E+H4H17319P2组与LeprA409E/A409E+IgG4P对照，P<.05。由于在研究期间死亡，对于食物摄入量评估，一只小鼠被排除在Leprhu/hu+IgG4P对照组外，并且一只小鼠被排除在LeprA409E/A409E+IgG4P对照组外。由于在研究期间咬碎的食物过多，对于食物摄入量评估，一只小鼠被排除在Leprhu/hu+IgG4P对照组外，并且三只小鼠被排除在LeprA409E/A409E+IgG4P对照组外。
图24A-24C展示了在先天性瘦蛋白受体缺乏的小鼠模型中通过uCT身体组成分析定量的脂肪质量、骨骼质量和瘦体质量。图24A提供了脂肪质量，图24B提供了骨骼质量，并且图24C提供了以克为单位的瘦肉量。在研究开始之前，在D-1对小鼠进行基线扫描。在研究的第41天进行mAb后扫描。灰色条柱，施用IgG4P对照的Leprhu/hu(N＝7-8)。黑色条柱，施用IgG4P对照的LeprA409E/A409E(N＝9-10)。白色条柱，施用H4H17319P2的LeprA409E/A409E(N＝10)。每周给小鼠皮下注射10mg/kg H4H17319P2或同种型对照(IgG4P)抗体。数据以平均值±SEM表示。*，相对于基线，P<.05；#，在相应的时间点，相对于Leprhu/hu+IgG4P对照，P<.05；+，在相应的时间点，相对于LeprA409E/A409E+H4H17319P2，P<.05。所有统计学分析均使用采用西达克事后检验的混合效应模型来进行。
图25描绘了首次人体临床试验的A部分队列的事件排程，并且包括每次访视都要进行的筛选、处理和随访访视程序。
图26描绘了首次人体临床试验的B部分队列的事件排程，并且包括每次访视都要进行的预筛选、筛选和基线确定程序。
图27描绘了首次人体临床试验的B部分队列的第二事件排程，并且包括每次访视都要进行的处理和随访程序。
具体实施方式
瘦蛋白是一种脂肪组织激素，它支配能量平衡以及代谢和神经内分泌功能(Flak和Myers,Mol Endocrinol.2016；30:3-12；Zhang等人,Nature.1994；372:425-432)。在能量不足的状态下，低循环瘦蛋白水平驱动适应性反应，包括通过神经内分泌通路的调节来增加饥饿感和节省能量。瘦蛋白通过接合瘦蛋白受体(LEPR)来调节能量和代谢平衡，所述瘦蛋白受体是I类细胞因子受体家族的成员(Tartaglia等人,1995)。LEPR由单个基因编码，并且可变剪接产生多种LEPR的剪接同种型，这些剪接同种型在C-末端序列上是不同的(Baumann等人,1996)。在这些剪接同种型中，LEPR-b是介导瘦蛋白作用的主要同种型，并且是刺激JAK-STAT信号传导的唯一同种型(Baumann等人,1996；Tartaglia等人,1995；White和Tartaglia,1996).。在大脑中表达LEPR-b的神经元是瘦蛋白对能量、代谢和神经内分泌稳态的作用的主要靶标和中介物。以下观察结果支持了这一点：Lepr-b在Leprdb/db小鼠中的选择性神经元表达挽救了肥胖、糖尿病和生殖表型(de Luca等人,2005)。另外，Lepr从神经元的遗传缺失表型模拟了Leprdb/db动物的肥胖和高血糖表型(Cohen等人,2001)。由于Lep基因中的遗传功能丧失突变，瘦蛋白缺乏在小鼠中导致食欲过盛、肥胖、胰岛素抵抗、血脂异常和神经内分泌功能受损，而瘦蛋白治疗可以逆转这些现象(Barash等人,1996；Campfield等人,1995；Chehab等人,1996；Halaas等人,1995；Pelleymounter等人,1995)。在临床上，瘦蛋白类似物美曲普汀逆转了由于瘦蛋白缺乏而导致的单基因肥胖患者中的肥胖以及代谢和生殖功能障碍(Farooqi等人,1999；Farooqi等人,2002)。与原发性瘦蛋白缺乏类似，继发性低瘦蛋白血症的疾病状与葡萄糖和脂质代谢功能障碍相关联，而瘦蛋白治疗可以逆转所述功能障碍。先天性和获得性全身脂肪营养不良是罕见和严重的疾病，所述疾病的特征在于脂肪组织储库的几乎完全丧失(Brown等人,2016；Patni和Garg,2015)。这些患者中的非常低的循环瘦蛋白水平会导致食欲过盛、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、肝性脂肪变性、胰岛素抵抗和糖尿病的状态(Brown等人,2016；Patni和Garg,2015)。高甘油三酯血症的严重并发症，尤其是当TG水平超过500mg/dL至1000mg/dL时，是急性和复发性胰腺炎(Yadav和Pitchumoni2003)，它可以危及生命并且死亡率超过40％，并且伴随有并发症，如感染或器官衰竭(UK Guidelines 2005)。肝脏中的异位脂质沉积(肝性脂肪变性)可以导致脂肪性肝炎，所述脂肪性肝炎的特征在于脂肪积聚、细胞损伤和肝脏炎症，并且是肝硬化的最常见的致因之一(El-Zayadi 2008,Federico 2006和Festi 2004)。
在发展为以全身脂肪营养不良为特征的脂肪储库的几乎完全丧失的Tg-aP2-nSrebp1c小鼠中，瘦蛋白治疗减少了食欲过盛，并且改善了血脂异常、肝性脂肪变性和血糖控制(Shimomura等人,1999；Shimomura等人,1998)。美曲普汀减轻全身脂肪营养不良患者中的代谢功能障碍(Oral等人,2002)，但是对于局部脂肪营养不良患者的治疗，未获批准(Ajluni等人,2016)。
脂肪营养不良患者通常会经历其他严重合并症，诸如慢性肾脏疾病、心血管并发症、自身免疫疾病、和外周T细胞淋巴瘤、急性淋巴性白血病和霍奇金淋巴瘤。
先天性瘦蛋白缺乏患者出现在生命的最初几个月，伴随有体重迅速增加和免疫异常，在生命的第一个和第二个十年内，死亡的风险显著增加(Funcke等人,Monogenic formsof childhood obesity due to mutations in the leptin gene.Mol CellPediatr.2014；1(1):3)；(Dubern等人,Leptin and leptin receptor-related monogenicobesity.Biochimie.2012；94(10):2111-5)；(Paz-Filho等人,Ten years of leptinreplacement therapy.Obesity reviews.2011；12:e315-e323.)。虽然针对先天性瘦蛋白缺乏的疗法未获批准，但是在患有由于瘦蛋白功能丧失突变而导致的单基因肥胖患者的若干小型开放标签研究中，瘦蛋白治疗显著降低了食欲、体重、肥胖倾向、代谢异常、骨龄和时序年龄之间的差距、激素异常和免疫异常(Wabitsch等人,Severe Early-Onset ObesityDue to Bioinactive Leptin Caused by a p.N103K Mutation in the Leptin Gene.JClin Endocrinol Metab.2015；100(9):3227-3230)；(Farooqi等人,Effects ofrecombinant leptin therapy in a child with congenital leptin deficiency.NEngl J Med.1999；341(12):879-84)；(Licinio等人,Phenotypic effects of leptinreplacement on morbid obesity,diabetes mellitus,hypogonadism,and behavior inleptin-deficient adults.Proc Natl Acad Sci USA.2004；101(13):4531-6)；(Gibson等人,Congenital Leptin Deficiency Due to Homozygosity for the Delta133Gmutation:report of another case and evaluation of response to four years ofleptin therapy.J Clin Endocrin.&Metab.2004；89(10):4821-4826)。其他人的报道表明，瘦蛋白疗法导致血浆甲状腺激素水平的快速和持续增加，促进适时青春期发育，并且改善循环CD4(+)T细胞的数量和T细胞增殖以及细胞因子释放(Farooqi等人,Beneficialeffects of leptin on obesity,T cell hyporesponsiveness,and neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency.J ClinInvest.2002；110(8):1093-1103)。然而，在一些情况下，具有中和活性的抗美曲普汀抗体的开发使患者不能进行任何靶向治疗选择(
Figure BDA0002715660290000171
等人,Early-onset severe obesity dueto complete deletion of the leptin gene in a boy.J Pediatr EndocrinolMetab.2017；30(11):1227-1230)。本文提供了使用瘦蛋白受体激动剂(诸如H4H17319P2(参见WO2017/66204))来治疗患有先天性瘦蛋白缺乏的患者的方法。
本文提供了激动剂单克隆抗体，所述激动剂单克隆抗体以与瘦蛋白类似的效力活化人LEPR。LEPR的单克隆抗体介导的活化在原发性和继发性瘦蛋白缺乏障碍的小鼠模型中能够有效逆转严重体重增加和代谢功能障碍。此外，LEPR激动剂单克隆抗体减少了正常体重小鼠以及正常和高体脂肪非人类灵长类动物中的肥胖倾向和体重，并且在存在循环瘦蛋白的情况下刺激了LEPR。
应当理解，本公开不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本公开的范围将仅由所附权利要求限定。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不大于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及它们之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本文中描述的那些方法和材料类似或等效的任何方法和材料均可用于本发明的实践或检验，但现在描述优选的方法和材料。
定义
如本文所用，表述“瘦蛋白受体”、“LEPR”等等是指人瘦蛋白受体，所述人瘦蛋白受体包含如SEQ ID NO:113所示的氨基酸序列(另外参见UniProtKB/Swiss-Prot登录号P48357)。科学文献中使用的LEPR的替代名称包括“OB受体”、“OB-R”和“CD295”。LEPR也称为“WSX”(参见例如美国专利号7,524,937)。表述“LEPR”包括单体LEPR分子和多聚体(例如，二聚体)LEPR分子二者。如本文所用，表述“单体人LEPR”意指不含有或不具有任何多聚化结构域并且在正常条件下作为单个LEPR分子(不与另一个LEPR分子直接物理连接)存在的LEPR蛋白或其部分。示例性单体LEPR分子是本文称为包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列的“hLEPR.mmh”(参见例如本文的实施例3)的分子。如本文所用，表述“二聚体人LEPR”意指包含两个LEPR分子的构建体，所述两个LEPR分子通过接头、共价键、非共价键或通过多聚化结构域(诸如抗体Fc结构域)彼此连接。示例性二聚体LEPR分子是本文称为包含SEQ ID NO:115的氨基酸序列的“hLEPR.mFc”(参见例如本文的实施例3)的分子，或所述分子在本文中称为包含SEQ ID NO:116的氨基酸序列的“hLEPR.hFc”。如本文所用，除非另外特别指明，否则诸如“抗LEPR抗体”、“特异性结合LEPR的抗体”、“LEPR特异性结合蛋白”等等的表述是指结合全长人LEPR、单体人LEPR、二聚体人LEPR或者包含LEPR胞外结构域或由LEPR胞外结构域组成的其他构建体的分子。
除非明确指出是来自非人物种，否则本文对蛋白质、多肽和蛋白质片段的所有提及均旨在指相应的蛋白质、多肽或蛋白质片段的人型式。因此，除非指出是来自非人物种，例如，“小鼠LEPR”、“猴LEPR”等，否则表述“LEPR”意指人LEPR。
如本文所用，表述“细胞表面表达的LEPR”意指在体外或体内细胞表面上表达，以使得LEPR蛋白的至少一部分暴露于细胞膜的胞外侧，并且可接近抗体的抗原结合部分的一种或多种LEPR蛋白或其胞外结构域。“细胞表面表达的LEPR”可以包括在通常(例如，在天然或野生型状态下)表达LEPR蛋白的细胞表面上表达的LEPR蛋白或由这种LEPR蛋白组成。或者，“细胞表面表达的LEPR”可以包括在通常在表面上不表达人LEPR、但是已经被人工工程化为在表面上表达LEPR的细胞表面上表达的LEPR蛋白或由这种LEPR蛋白组成。
如本文所用，诸如“抗LEPR抗体”或“结合人瘦蛋白受体的抗体”的表述包括具有单特异性的单价抗体，以及包含结合LEPR的第一臂和结合第二(靶标)抗原的第二臂的双特异性抗体二者，其中所述抗LEPR臂包含如本文表1中列出的HCVR/LCVR或CDR序列中的任一者。
如本文所用，术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如，LEPR)特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子或分子复合物。术语“抗体”包括包含四条多肽链(即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白分子，以及它们的多聚体(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域：CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH区和VL区可以进一步细分为高变区(称为互补性决定区(CDR))，所述高变区之间散布有更保守的区(称为框架区(FR))。每个VH和VL由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个CDR和四个FR组成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的不同实施方案中，抗LEPR抗体(或其抗原结合部分)的FR可以与人种系序列相同，或者可以是经天然或人工修饰的。可以根据两个或更多个CDR的并行分析来定义氨基酸共有序列。
如本文所用，术语“抗体”还包括全抗体分子的抗原结合片段。如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因工程化的多肽或糖蛋白。可以例如使用任何合适的标准技术(诸如蛋白水解消化或涉及编码抗体可变结构域和任选地抗体恒定结构域的DNA的操作和表达的重组基因工程技术)从全抗体分子衍生出抗体的抗原结合片段。这种DNA是已知的和/或可从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)容易地获得，或者可以是合成的。可以对所述DNA进行测序并且通过化学方式或通过使用分子生物学技术来操纵所述DNA，例如以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域布置成合适的构型，或者引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，分离的互补决定区(CDR)，诸如CDR3肽)，或约束性FR3-CDR3-FR4肽。如本文所用，表述“抗原结合片段”内部也涵盖其他工程化分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体抗体、三体抗体、四体抗体、微型抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小模块免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。
抗体的抗原结合片段通常将包含至少一个可变结构域。可变结构域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个框架序列毗邻或符合读框的至少一个CDR。在具与VL结构域相关的VH结构域的抗原结合片段中，VH结构域和VL结构域可以以任何合适的布置方式彼此相对定位。例如，可变区可以是二聚体并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方案中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定域共价连接的至少一个可变域。可以存在于本发明的抗体的抗原结合片段内的可变结构域和恒定结构域的非限制性示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL.在可变域和恒定域的任何配置中，包括上文所列的任何示例性配置，可变域和恒定域可以彼此直接连接或可以由完整或部分的铰链区或接头区连接。铰链区可以由在单个多肽分子中邻近的可变结构域和/或恒定结构域之间产生柔性或半柔性连接的至少2个(例如，5个、10个、15个、20个、40个、60个或更多个)氨基酸组成。此外，本发明的抗体的抗原结合片段可以包含彼此和/或与一个或多个单体VH结构域或VL结构域非共价缔合(例如，通过一个或多个二硫键)的上文列出的可变结构域和恒定结构域构型中的任一者的同源二聚体或异源二聚体(或其他多聚体)。
正如全抗体分子那样，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段通常将包含至少两个不同的可变结构域，其中每个可变结构域都能够特异性结合至单独的抗原或相同抗原上的不同表位。使用本领域可用的常规技术，可以使任何多特异性抗体形式，包括本文公开的示例性双特异性抗体形式，适用于本发明的抗体的抗原结合片段背景。
在本发明的某些实施方案中，本发明的抗LEPR抗体是人抗体。如本文所用，术语“人抗体”意图包括具有源自人生殖系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不由人生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)，例如在CDR特别是CDR3中。然而，如本文所用，术语“人抗体”不旨在包括已经将衍生自另一个哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列植入到人框架序列上的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体可以是重组人抗体。如本文所用，术语“重组人抗体”意在包括通过重组手段所制备、表达、产生或分离的全部人抗体，如使用转染至宿主细胞(在下文进一步描述)中的重组表达载体表达的抗体、从重组人抗体组合文库(在下文进一步描述)分离的抗体、从相对于人免疫球蛋白基因而言转基因的动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等人，(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列的任何其他手段所制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组人抗体具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，此类重组人抗体经历体外诱变(或，使用就人Ig序列而言为转基因的动物时，经历体内体细胞诱变)并且因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管源自人种系VH和VL序列并且与之相关，但可能在体内.人抗体种系库内部不天然存在的序列。
本发明涵盖在铰链、CH2或CH3区中具有一个或多个突变的抗体，这例如在产生中可以是所期望的，以提高所期望的抗体形式的收率。
本发明的抗体可以是分离的抗体。如本文所用，“分离的抗体”意指已经从天然环境的至少一种组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。例如，出于本发明的目的，已经从生物体的至少一种组分分离或移除，或者从抗体天然存在或天然产生的组织或细胞分离或移除的抗体是“分离的抗体”。分离的抗体还包括重组细胞内的原位抗体。分离的抗体是已经经历至少一个纯化或分离步骤的抗体。根据某些实施方案，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
本发明包括本文公开的抗LEPR抗体的变体，所述变体与衍生出抗体的对应种系序列相比，在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区域中包含一个或多个氨基酸置换、插入和/或缺失。通过将本文公开的氨基酸序列与可从例如公共抗体序列数据库获得的种系序列进行比较，可以容易地确定此类突变。本发明包括衍生自本文所公开的氨基酸序列中的任一个的抗体及其抗原结合片段，其中一个或多个框架和/或CDR区内的一个或多个氨基酸突变为衍生出所述抗体的生殖系序列的对应残基，或另一人类生殖系序列的对应残基，或对应生殖系残基的保守氨基酸取代(此类序列变化在本文中统称为“生殖系突变”)。本领域的普通技术人员从本文所公开的重链和轻链可变区序列开始，可以容易地产生多种抗体和抗原结合片段，其包含一个或多个个别生殖系突变或其组合。在某些实施方案中，VH和/或VL结构域内的所有框架和/或CDR残基被突变回存在于衍生出抗体的原始种系序列中的残基。在其他实施方案中，仅某些残基被突变回原始种系序列，例如，仅存在于FR1的前8个氨基酸内或FR4的后8个氨基酸内的突变残基，或者仅存在于CDR1、CDR2或CDR3内的突变残基。在其他实施方案中，一个或多个框架和/或CDR残基中的一者或多者被突变为不同的种系序列(即，不同于最初衍生出抗体的种系序列的种系序列)的一个或多个对应残基。此外，本发明的抗体可以在框架和/或CDR区内含有两个或更多个种系突变的任何组合，例如其中某些单独的残基被突变为特定种系序列的对应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基得以维持或被突变为不同种系序列的对应残基。在得到含有一个或多个生殖系突变的抗体和抗原结合片段后，可以容易地测试所述抗体和抗原结合片段的一种或多种所需特性，如结合特异性的改善、结合亲和力的增加、拮抗性或激动性生物特性(视具体情况而定)的改善或增强、免疫原性降低等。以这种通用方式获得的抗体和抗原结合片段涵盖在本发明内。
本发明包括抗LEPR抗体及其抗原结合片段，所述抗LEPR抗体及其抗原结合片段包含与本文公开的示例性抗LEPR抗体中的任一者中存在的一个或多个可变结构域或CDR氨基酸序列基本上相似或基本上相同的氨基酸序列。
当应用于多肽时，术语“基本上相似性”或“基本上相似”意指当两个肽序列诸如通过程序GAP或BESTFIT使用默认空位权重进行最佳比对时，共有至少95％序列同一性，甚至更优选地至少98％或99％序列同一性。优选地，不相同的残基位置的差异在于保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是氨基酸残基被含有具有相似的化学性质(例如，电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸残基置换的氨基酸置换。通常，保守氨基酸置换基本上不会改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列的保守置换彼此不同的情况下，可以向上调整序列同一性百分比或相似性程度以校正置换的保守性质。用于进行该调整的手段是本领域的技术人员熟知的。参见例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331。含有具有相似的化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括：(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链，即半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守替换是在Gonnet等人(1992)Science 256:1443-1445中公开的PAM250对数似然矩阵中具有正值的任何改变。“适度保守”替换是在PAM250对数似然矩阵中具有非负值的任何改变。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列相似性，所述序列相似性也称为序列同一性。蛋白质分析软件使用关于指定到包括保守氨基酸取代的各种取代、缺失和其他修饰的相似性量度来匹配相似序列。例如，GCG软件含有诸如Gap和Bestfit的程序，这些程序可以以默认参数使用，以确定紧密相关的多肽(诸如来自不同物种的生物体的同源多肽)之间，或野生型蛋白及其突变型蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参见例如，GCG 6.1版。还可以使用FASTA(GCG 6.1版中的程序)使用默认或推荐参数对多肽序列进行比较。FASTA(例如，FASTA2和FASTA3)提供查询与搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比(Pearson(2000)前述)。当将本发明的序列与含有大量来自不同生物体的序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是使用默认参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。参见例如，Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402。
如本文所用，术语“受试者”是指需要改善、预防和/或治疗与瘦蛋白缺乏相关联的疾病或障碍的动物，优选地哺乳动物，更优选地人。受试者可以是成人或儿童。受试者可以患有代谢功能障碍，诸如全身或局部脂肪营养不良。受试者可以患有先天性瘦蛋白缺乏或获得性瘦蛋白缺乏。患有先天性瘦蛋白缺乏的受试者包括具有基因突变的受试者，所述基因突变导致循环瘦蛋白水平或循环但无生物活性瘦蛋白水平低或甚至不存在。受试者可以具有与瘦蛋白缺乏相关联的一个或多个症状。如本文所用，术语“受试者”可与术语“患者”互换。在一些方面，受试者具有针对美曲普汀的中和抗体。
如本文所用，术语“治疗”是指由于治疗剂(诸如本发明的抗体)向有需要的受试者的施用而产生的瘦蛋白缺乏的至少一种症状的严重性的减少或改善。该术语包括相关疾病的进展或者与疾病相关联的病症或症状的恶化的抑制。该术语还包括疾病的积极预后，即受试者在施用治疗剂(诸如本发明的抗体)后可以没有症状。积极预后可以包括以下病症中的任一者的缓和：食欲过盛、高血糖、胰岛素抵抗、血脂异常或肝性脂肪变性。
术语“预防(prevent、preventing或prevention)”是指与瘦蛋白缺乏相关联的任何症状、病症或适应症的表现的抑制。
治疗剂可以治疗剂量施用于受试者。短语“治疗有效量”意指产生施用其所希望达成的作用的量。确切量将取决于治疗的目的，并且将由本领域的技术人员使用已知技术来确定(参见，例如Lloyd(1999)The Art,Science and Technology of PharmaceuticalCompounding)，并且在本文中更详细地讨论。
包含Fc变体的抗LEPR抗体
根据本发明的某些实施方案，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一个或多个突变，所述突变例如与中性pH相比在酸性pH下增强了或减少了抗体与FcRn受体的结合。例如，本发明包括抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体在Fc结构域的CH2或CH3区中包含突变，其中一个或多个突变在酸性环境下(例如，在pH范围为从约5.5至约6.0的胞内体中)增加了Fc结构域与FcRn的亲和力。当施用于动物时，此类突变可以导致抗体的血清半衰期增加。此类Fc修饰的非限制性实例包括例如，第250位(例如，E或Q)；第250和428位(例如，L或F)；第252位(例如，L/Y/F/W或T)，第254位(例如，S或T)和第256位(例如，S/R/Q/E/D或T)处的修饰；或者第428和/或433位(例如，H/L/R/S/P/Q或K)和/或第434位(例如，H/F或Y)处的修饰；或者第250和/或428位处的修饰；或者第307或308位(例如，308F、V308F)和第434位处的修饰。在一个实施方案中，修饰包括428L(例如，M428L)和434S(例如，N434S)修饰；428L、259I(例如，V259I)和308F(例如，V308F)修饰；433K(例如，H433K)和434(例如，434Y)修饰；252、254和256(例如，252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L的修饰(例如，T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如，308F或308P)。
例如，本发明包括抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体包含Fc结构域，所述Fc结构域包含一对或多对或者一组或多组选自由以下组成的组的突变：250Q和248L(例如，T250Q和M248L)；252Y、254T和256E(例如，M252Y、S254T和T256E)；428L和434S(例如，M428L和N434S)；以及433K和434F(例如，H433K和N434F)。在本发明的范围内设想了本文公开的抗体可变结构域内的前述Fc结构域突变和其他突变的所有可能的组合。
本发明的抗LEPR抗体可以包含具有减少的效应子功能的经修饰的Fc结构域。如本文所用，“具有减少的效应子功能的经修饰的Fc结构域”意指相对于野生型天然存在的Fc结构域已经被修饰、突变、截短等等的免疫球蛋白的任何Fc部分，以使得包含经修饰的Fc的分子，相对于包含Fc部分的野生型天然存在型式的比较分子表现出至少一种选自由以下各项组成的组的作用的严重性或程度的减少：细胞杀死(例如，ADCC和/或CDC)、补体活化、吞噬作用和调理作用。在某些实施方案中，“具有减少的效应子功能的经修饰的Fc结构域”是具有减少或减弱的与Fc受体(例如，FcγR)的结合的Fc结构域。
在本发明的某些实施方案中，经修饰的Fc结构域是在铰链区中包含置换的变体IgG1 Fc或变体IgG4 Fc。例如，用于本发明的上下文的经修饰的Fc可以包含变体IgG1Fc，其中IgG1 Fc铰链区的至少一个氨基酸被来自IgG2 Fc铰链区的对应氨基酸替换。或者，用于本发明的修饰的Fc可包含变体IgG4Fc，其中IgG4Fc铰链区的至少一个氨基酸被来自IgG2Fc铰链区的对应氨基酸替代。可以用于本发明的上下文的非限制性、示例性的经修饰的Fc区在美国专利申请公开号2014/0243504中有所阐述。
可以用于本发明的上下文的其他经修饰的Fc结构域和Fc修饰包括US2014/0171623；US 8,697,396；US 2014/0134162；WO 2014/043361所示的任何修饰。构建包含如本文所述的经修饰的Fc结构域的抗体或其他抗原结合融合蛋白的方法是本领域已知的。
抗体的生物学特征
本发明包括结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体及其抗原结合片段。此类抗体在本文中可以称为“激动剂抗体”。在本发明的上下文中，“LEPR信号转导的活化”意指对胞内作用的刺激，所述胞内作用在表达LEPR的细胞中通常由瘦蛋白与LEPR的相互作用产生。在某些实施方案中，“LEPR信号转导的活化”意指STAT3的转录活化，所述STAT3的转录活化可以使用任何方法来检测，所述方法可以例如使用在报告细胞系中表达的STAT3的标记型式直接或间接测量或鉴定STAT3活性。例如，本发明包括在基于细胞的报告测定法中活化LEPR信号传导的抗体及其抗原结合片段，所述测定法例如使用如本文的实施例7中定义的基于细胞的测定法形式，或基本上相似的测定法。检测LEPR活化的基于细胞的报告测定法，诸如本文的实施例7所示的测定法，可以产生可检测信号，所述可检测信号可以以EC50值(即，产生最大信号传导的一半所需的抗体浓度)和/或在存在瘦蛋白的情况下观察到的最大信号传导的百分比表示。在本发明的某些示例性实施方案中，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体在基于细胞的报告测定法中以小于约12.0nM的EC50值活化LEPR信号传导，所述基于细胞的报告测定法例如使用如本文的实施例7中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法。在本发明的某些示例性实施方案中，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体相对于基于细胞的报告测定法中的大于约65％的瘦蛋白信号传导，以最大活化百分比活化LEPR信号传导，所述基于细胞的报告测定法例如使用如本文的实施例7中定义的测定形式，或基本上相似的测定法。
本发明包括以高亲和力结合单体人LEPR的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体以小于约150nM的KD结合单体人LEPR(例如，hLEPR.mmh，SEQ ID NO:114)，所述KD如通过在25℃或37℃下的表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体在25℃下以小于约150nM、小于约140nM、小于约130nM、小于约120nM、小于约110nM、小于约100nM、小于约90nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、小于约10nM、小于约9nM、小于约8nM、小于约7nM、小于约6nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于约900pM、小于约800pM、小于约700pM、小于约600pM、小于约500pM、小于约400pM或小于约300pM的KD结合单体人LEPR，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。
本发明还包括抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段以大于约50分钟的解离半衰期(t1/2)结合单体人LEPR(例如，hLEPR.mmh,SEQ ID NO:114)，如通过在25℃或37℃下的表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体在25℃下以大于约50分钟、大于约55分钟、大于约60分钟、大于约65分钟或更长的t1/2结合单体人LEPR，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。
本发明还包括以高亲和力结合二聚体人LEPR(例如，hLEPR.mFc，SEQ ID NO:115)的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体以小于约1.5nM的KD结合二聚体人LEPR，所述KD如通过在25℃或37℃下的表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体在25℃下以小于约150nM、小于约130nM、小于约110nM、小于约80nM、小于约70nM、小于约60nM、小于约50nM、小于约40nM、小于约30nM、小于约20nM、或小于约10nM的KD结合二聚体人LEPR，所述KD如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。
本发明还包括抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段以大于约10分钟的解离半衰期(t1/2)结合二聚体人LEPR(例如，hLEPR.mFc,SEQ ID NO:115)，如通过在25℃或37℃下的表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。根据某些实施方案，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体在25℃下以大于约10分钟、大于约15分钟、大于约20分钟、大于约25分钟、大于约30分钟、大于约40分钟、大于约50分钟、大于约60分钟、大于约70分钟或更长的t1/2结合二聚体LEPR，如通过表面等离子共振，例如使用本文的实施例3中定义的测定法形式，或基本上相似的测定法所测量。
本发明还包括结合与人瘦蛋白复合的LEPR的抗体及其抗原结合片段(“与人瘦蛋白复合的LEPR”也可以以表达式“瘦蛋白:LEPR”表示)。例如，本发明包括能够结合至包含hLEPR和人瘦蛋白的预先形成的复合物的抗体及其抗原结合片段。也就是说，根据某些实施方案，与LEPR复合的瘦蛋白的存在不抑制抗LEPR抗体和LEPR之间的相互作用；同样，根据本发明的该方面，抗LEPR抗体的存在不抑制瘦蛋白和LEPR之间的相互作用。用于确定抗体或其抗原结合片段是否结合至与人瘦蛋白复合的LEPR的示例性测定法形式在本文的实施例4中有所阐述。
类似地，本发明还包括结合LEPR并且不阻断LEPR:瘦蛋白相互作用的抗体及其抗原结合片段。例如，本发明包括能够结合LEPR从而产生抗体:LEPR复合物的抗体及其抗原结合片段，其中所得的抗体:LEPR复合物能够与瘦蛋白相互作用以产生包含抗体、LEPR和瘦蛋白的三元复合物。用于确定抗体或其抗原结合片段是否能够以不阻断或干扰LEPR和瘦蛋白之间的相互作用的方式结合LEPR的示例性测定法形式在本文的实施例5中有所阐述。
本发明还包括在存在和/或不存在人瘦蛋白的情况下结合细胞表面表达的LEPR的抗体及其抗原结合片段。细胞表面表达的LEPR意指在天然的或工程化细胞系形式的细胞表面上表达的LEPR或其一部分(例如，LEPR的胞外部分)，以使得抗体或其抗原结合片段能够结合至LEPR分子。在某些实施方案中，细胞表面表达的LEPR包括重组复合物，所述重组复合物包含经由标签或锚(例如，如本文的实施例6中所展示的GPI锚)连接至细胞的LEPR的胞外结构域。根据本发明的该方面，提供了抗体，所述抗体能够在不存在瘦蛋白的情况下结合细胞表面表达的LEPR，并且还能够在存在瘦蛋白的情况下(即，在瘦蛋白能够结合至细胞表面表达的瘦蛋白的环境下)结合细胞表面表达的LEPR。也就是说，根据某些实施方案，与细胞表面表达的LEPR复合的瘦蛋白存在不抑制抗LEPR抗体和细胞表面表达的LEPR之间的相互作用。根据本发明的该方面的抗体能够在包含抗体、细胞表面表达的LEPR和瘦蛋白的细胞表面上形成三元复合物。用于确定抗体或其抗原结合片段是否能够在存在和不存在人瘦蛋白的情况下结合细胞表面表达的LEPR的示例性测定法形式在本文的实施例6中有所阐述。
本发明的抗体可以具有一种或多种前述生物学特征，或它们的任何组合。本发明的抗体的生物学特征的前述列表并非旨在是详尽的。通过对包括本文工作实例在内的本公开的回顾，本发明的抗体的其他生物特征将对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
表位作图和相关技术
本发明还包括抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体包含具有一个或多个保守置换的本文公开的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列中的任一者的变体。例如，本发明包括具有HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的抗LEPR抗体，相对于本文的表1所示的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列组中的任一者，所述HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有例如10个或更少、8个或更少、6个或更少、4个或更少等等的保守氨基酸置换。在某些实施方案中，本发明提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体包含相对于本文的表1所示的序列的变体HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列(例如，包含保守氨基酸置换)，其中所述变体抗体仍然表现出本文公开的示例性抗LEPR抗体的一个或多个功能和/或性质。
人LEPR的胞外结构域含有N-末端细胞因子受体同源结构域(CRH-1)、免疫球蛋白样(Ig)结构域和第二CRH结构域(CRH-2)(称为瘦蛋白结合结构域(LBD))。(Carpenter等人(2012)Structure 20:487-97)。此外，LEPR与粒细胞集落刺激因子(GCSF)和糖蛋白130(gp13)共有最大同源性和相似的胞外结构域大小和组织。(Haniu等人(1998)J Biol Chem273(44):28691-699)。
术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)发生相互作用的抗原决定簇。单个抗原可以具有多于一个表位。因此，不同抗体可以结合到抗原上的不同区域并且可以具有不同的生物效应。表位可以是构象的或线性的。构象表位由来自线性多肽链的不同区段的氨基酸在空间上并列而产生。线性表位由多肽链中的邻近氨基酸残基来产生。在某些情况下，表位可以包括抗原上的糖、磷酰基基团或磺酰基基团部分。
本发明包括与人LEPR的氨基酸M1-D839(SEQ ID NO:113)内存在的一个或多个表位发生相互作用的抗LEPR抗体。如实施例11所述，当结合至抗体H4H16650P2时，来自人LEPR的201种肽具有显著减少的氘化摄取。当结合至H4H16650P2时，对应于氨基酸162-169(人LEPR的氨基酸LYVLPEVL，SEQ ID NO:113)和170-191(人LEPR的氨基酸EDSPLVPQKGSF，SEQID NO:113)的肽具有较慢的氘化率，这表示该抗体结合至少两个具有序列LYVLPEVL或EDSPLVPQKGSF(分别为SEQ ID NO:113的氨基酸162-169或170-191)的人LEPR表位。
本发明的抗体结合的表位可以由3个或更多个(例如，3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个)LEPR蛋白的氨基酸的单个邻接序列组成。或者，表位可以由多个LEPR的非邻接氨基酸(或氨基酸序列)组成。在一些实施方案中，表位定位于LEPR的瘦蛋白结合结构域上或附近。在其他实施方案中，表位定位于不同于LEPR的瘦蛋白结合结构域的区域，例如在LEPR的表面上的抗体结合至这种表位时，不干扰瘦蛋白与LEPR的结合。
可以使用本领域的普通技术人员已知的各种技术来鉴定特定抗体识别的表位内的氨基酸。示例性技术包括例如丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析和肽切割分析。此外，可以采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(Tomer,2000,Protein Science9:487-496)。可以用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸的另一种方法是通过质谱法检测的氢/氘交换。大体上，氢/氘交换法涉及所关注的蛋白质的氘标记，然后是抗体与氘标记的蛋白质的结合。然后，将蛋白质/抗体复合物转移至水中，以允许氢-氘交换在除抗体保护的残基(仍然是氘标记的)之外的所有残基处发生。在抗体解离后，对靶蛋白进行蛋白酶裂解和质谱分析，从而揭示氘标记的残基，这些残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如，Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。与抗原复合的抗体的X射线晶体学分析也可以用于鉴定与抗体相互作用的多肽内的氨基酸。
本发明还包括结合至与本文所述的特定示例性抗体中的任一者相同的表位的抗LEPR抗体(例如，包含本文的表1中列出的氨基酸序列中的任一者的抗体)。同样，本发明还包括与本文所述的特定示例性抗体中的任一者(例如，包含本文的表1中列出的氨基酸序列中的任一者的抗体)竞争与LEPR结合的抗LEPR抗体。
通过使用本领域已知的和本文示例的常规方法，可以确定抗体是否结合至与参考抗LEPR抗体相同的表位，或者竞争与参考抗LEPR抗体的结合。例如，为了确定测试抗体是否结合至与本发明的参考抗LEPR抗体相同的表位，使参考抗体结合至LEPR蛋白。然后，评估测试抗体结合至LEPR分子的能力。如果测试抗体在与参考抗LEPR抗体饱和结合后能够结合至LEPR，则可以得出以下结论：测试抗体结合至与参考抗LEPR抗体不同的表位。在另一个方面，如果测试抗体在与参考抗LEPR抗体饱和结合后不能结合至LEPR分子，则测试抗体可以结合至与本发明的参考抗LEPR抗体所结合的表位相同的表位。然后可以进行另外的常规实验(例如，肽突变和结合分析)，以确认所观察到的测试抗体结合的缺乏事实上是否是由于结合至与参考抗体相同的表位，或者空间阻断(或另一个现象)是否是造成所观察的结合缺乏的原因。可以使用ELISA、RIA、Biacore、流式细胞术或者本领域可用的任何其他定量或定性抗体结合测定法来进行这类实验。根据本发明的某些实施方案，如果例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的一种抗体抑制另一种抗体的结合至少50％，但优选地75％、90％或甚至99％，如在竞争性结合测定法中所测量，则两种抗体结合至相同的(或重叠)表位(参见例如，Junghans等人,Cancer Res.1990:50:1495-1502)。或者，如果抗原中的减少或消除一种抗体的结合的基本上所有氨基酸突变都减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体结合至相同的表位。如果只有减少或消除一种抗体的结合的氨基酸突变的子集减少或消除另一种抗体的结合，则认为两种抗体具有“重叠表位”。
为了确定抗体是否与参考抗LEPR抗体竞争结合(或交叉竞争结合)，在两个方向上进行上述结合方法：在第一方向上，使参考抗体在饱和条件下结合至LEPR蛋白，然后评估测试抗体与LEPR分子的结合。在第二方向上，使测试抗体在饱和条件下结合至LEPR分子，然后评估参考抗体与LEPR分子的结合。如果在两个方向上只有第一(饱和)抗体能够结合至LEPR分子，则可以得出以下结论：测试抗体和参考抗体竞争LEPR的结合。如本领域的普通技术人员所理解，竞争与参考抗体的结合的抗体可能未必结合至与参考抗体相同的表位，但是可能通过重叠或邻近表位的结合来在空间上阻断参考抗体的结合。
人抗体的制备
本发明的抗LEPR抗体可以是完全人抗体。用于产生单克隆抗体(包括完全人单克隆抗体)的方法是本领域已知的。任何此类已知的方法均可用于本发明的背景中，以制备特异性结合至人LEPR的人抗体。
使用例如VELOCIMMUNETM技术，或用于产生完全人单克隆抗体的任何其他类似的已知方法，初始分离出具有人可变区和小鼠恒定区的针对LEPR的高亲和力嵌合抗体。如下文实验部分所述，表征和选择抗体的所期望的特征，包括亲和力、配体阻断活性、选择性、表位等。如果需要，用所期望的人恒定区(例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4)替换小鼠恒定区，以产生完全人抗LEPR抗体。虽然所选的恒定区可以根据特定用途而变化，但是高亲和力抗原结合和靶标特异性特征留在可变区中。在某些情况下，直接从抗原阳性的B细胞中分离出完全人抗LEPR抗体。
生物等效物
本发明的抗LEPR抗体和抗体片段涵盖具有不同于所述抗体的氨基酸序列但是保留了结合人LEPR的能力的蛋白质。当与亲本序列相比时，此类变体抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或置换，但是表现出基本上相当于所描述的抗体的生物学活性。同样，本发明的编码抗LEPR抗体的DNA序列涵盖这样的序列，所述序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或置换，但是编码与本发明的抗LEPR抗体或抗体片段基本上生物等效的抗LEPR抗体或抗体片段。上文讨论了此类变体氨基酸和DNA序列的实例。
如果两种抗原结合蛋白或抗体是药物等效物或药物替代物，并且当在相似的实验条件下以相同的摩尔剂量的单剂量和多剂量给药时，所述药物等效物或药物替代物未显示出吸收速率和程度的显著差异，则它们被视为生物等效物。如果某些抗体在吸收程度上是等效的，但是在吸收速率上不是等效的，则它们将被视为等效物或药物替代物，但是因为吸收速率的这种差异是有意的并且反映在标记中，所以可以被视为生物等效物，这些抗体对于例如在长期使用中达到有效体内药物浓度不是必需的，并且被认为对于所研究的特定药品不具有临床意义。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和效力方面不存在有临床意义的差异，则它们是生物等效物。
在一个实施方案中，如果与不进行参考产品和生物产品之间的切换的连续疗法相比，患者可以进行这种切换一次或多次，而没有预期的不良反应风险的增加，包括免疫原性的临床上显著的变化、或减少的有效性，则两种抗原结合蛋白是生物等效物。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白都通过针对一个或多个使用条件的一种或多种共同作用机制来发挥作用，以达到此类机制是已知的程度，则它们是生物等效物。
生物等效性可以通过体内和体外方法来展示。生物等效性度量包括，例如，(a)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中测量了随时间推移的血液、血浆、血清或其他生物流体中的抗体或其代谢物的浓度；(b)与人体内生物利用率数据相关联并且可以合理地预测人体内生物利用率数据的体外试验；(c)在人或其他哺乳动物中的体内试验，其中测量了随时间推移的抗体(或其靶标)的适当急性药理作用；以及(d)建立抗体的安全性、功效、或者生物利用率或生物等效性的良好对照的临床试验。
本发明的抗LEPR抗体的生物等效变体可以通过例如对残基或序列进行各种置换或者使生物学活性不需要的末端或内部残基或序列缺失来构建。举例来说，可以缺失不是生物活性必需的半胱氨酸残基或用其他氨基酸替换，以防止在复性时形成不必要的或不正确的分子内二硫桥键。在其他情况下，生物等效抗体可以包括抗LEPR抗体变体，所述抗LEPR抗体变体包含修饰抗体的糖基化特征的氨基酸改变，例如消除或除去糖基化的突变。
物种选择性和物种交叉反应性
根据某些实施方案，本发明提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体结合至人LEPR但是不结合至其他物种的LEPR。本发明还包括结合至人LEPR和一种或多种非人物种的LEPR的抗LEPR抗体。例如，本发明的抗LEPR抗体可以结合至人LEPR并且可以结合至或不结合至小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、猪、猫、狗、兔、山羊、绵羊、奶牛、马、骆驼、食蟹猴、狨猴、恒河猴或黑猩猩LEPR中的一者或多者，视情况而定。根据本发明的某些示例性实施方案，提供了抗LEPR抗体，所述抗LEPR抗体特异性结合人LEPR和食蟹猴(例如，食蟹猴(Macacafascicularis))LEPR。本发明的其他抗LEPR抗体结合人LEPR，但是不结合至或仅弱结合至食蟹猴LEPR。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性的或多特异性的(例如，双特异性的)。多特异性抗体可以对一种靶多肽的不同表位具有特异性，或者可以含有对多于一种靶多肽具有特异性的抗原结合结构域。参见例如Tutt等人,1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等人,2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗LEPR抗体可以连接至另一个功能分子(例如另一个肽或蛋白质)或者与另一个功能分子共表达。例如，抗体或其片段可以功能性连接(例如，通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或其他方式)至一个或多个其他分子实体(诸如另一个抗体或抗体片段)，以产生具有第二结合特异性的双特异性或多特异性抗体。
本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂结合人LEPR，而免疫球蛋白的另一个臂对第二抗原具有特异性。LEPR结合臂可以包含本文的表1中列出的HCVR/LCVR或CDR氨基酸序列中的任一者。
可以用于本发明的背景的示例性双特异性抗体形式涉及第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域的使用，其中所述第一和第二Ig CH3结构域的至少一个氨基酸彼此不同，并且其中至少一个氨基酸差异与缺乏氨基酸差异的双特异性抗体相比减少了双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方案中，Ig CH3结构域结合蛋白A，并且第二Ig CH3结构域含有减少或消除蛋白A结合的突变，诸如H95R修饰(按照IMGT外显子编号；按照EU编号为H435R)。第二CH3还可以包含Y96F修饰(按照IMGT编号；按照EU编号为Y436F)。可以存在于第二CH3中的另外的修饰包括：在IgG1抗体的情况下，D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(按照IMGT；按照EU的D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下，N44S、K52N和V82I(IMGT；按照EU的N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4抗体的情况下，Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(按照IMGT；按照EU的Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。在本发明的范围内设想了上文所述的双特异性抗体形式的变化。
可以在本发明的语境中使用的其他示例性双特异性形式包括但不限于例如基于scFv的或双体双特异性形式、IgG-scFv融合体、双可变结构域(DVD)-Ig、四源杂交瘤、钮入孔、共同轻链(例如，具有钮入孔的共同轻链等)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双重作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(关于前述形式的综述，参见例如，Klein等人,2012,mAbs 4:6,1-11，以及其中引用的参考文献)。双特异性抗体也可以使用肽/核酸缀合来构建，例如，其中具有正交化学反应性的非天然氨基酸被用于产生位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后所述缀合物自组装为具有确定的组成、化合价和几何形状的多聚体复合物。(参见例如，Kazane等人.,J.Am.Chem.Soc.[Epub:2012年12月4日]).
治疗制剂和施用
本发明提供了包含本发明的抗LEPR抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物用合适的载剂、赋形剂、和提供改善的转移、递送、耐受性等等的其他药剂来配制。众多的适当配制物可见于所有医药化学家已知的处方集中：Remington'sPharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA)。这些制剂包括例如粉末剂、糊剂、软膏剂、凝胶剂、蜡、油、脂质、含脂质(阳离子或阴离子)囊泡(诸如LIPOFECTINTM,Life Technologies,Carlsbad,CA)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳液、乳剂碳蜡(各种分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶剂和含有碳蜡的半固体混合物。还参见Powell等人"Compendium of excipients for parenteralformulations"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311。
施用于患者的抗体的剂量可以根据患者的年龄和大小、目标疾病、病症、给药途径等等而变化。优选的剂量通常根据体重或体表面积来计算。在成年患者中，通常以约0.01至约20mg/kg体重、更优选地约0.02至约7、约0.03至约5、或约0.05至约3mg/kg体重的单剂量静脉内施用本发明的抗体可以是有利的。根据病况的严重程度，可以调整治疗的频率和持续时间。可以凭经验确定抗LEPR抗体施用的有效剂量和排程；例如，可以通过定期评估来监测患者进展，并且相应地调整剂量。此外，可以使用本领域熟知的方法进行剂量的物种间按比例缩放(例如Mordenti等人,1991,Pharmaceut.Res.8:1351)。
在患者(例如儿童患者)中，例如以约5mg/kg体重、或约1mg/kg体重至约20mg/kg体重、或约1mg/kg体重至约15mg/kg体重、或约5mg/kg体重至约10mg/kg体重的治疗有效剂量静脉内施用抗体可以是有利的。例如，可以选择约5mg/kg的静脉内(IV)负荷剂量来实现等于或大于100mg/L的抗体血清浓度。以约250mg的剂量、或以约300mg的剂量、或以约100mg至约500mg、或约200mg至约300mg的剂量皮下施用抗体可以是另外有利的。例如，每周250mgH4H17319P2或300mg H4H17319P2的皮下(SC)维持剂量将使血清中的谷浓度维持等于或大于100mg/L。在一些方面，皮下给药方案在静脉内负荷剂量的施用后若干天开始，以最好地维持血清中的目标谷浓度。在一些方面，在负荷剂量后2至7天，例如在负荷剂量后2天、3天、4天、5天、6天或7天，施用第一皮下剂量。在一些方面，皮下剂量每3到14天施用一次，例如每3天施用一次、每4天施用一次、每5天施用一次、每6天施用一次、每周施用一次、每10天施用一次、或每2周施用一次，例如在第一皮下剂量后每周施用皮下剂量3次，然后施用每月(约每28天)剂量。在本发明的一个实施方案中，抗体(例如，H4H17319P2)的治疗有效剂量如本文的图19所示，但是任选地持续超过其中所示的最后每月剂量。
在一些方面，使血清中的谷浓度维持在约50mg/L至约200mg/L之间、或约100mg/L、或约150mg/L、或等于或大于50mg/L、或等于或大于100mg/L、或等于或大于150mg/L是所期望的。
各种递送系统是已知的，并且可以用于施用本发明的药物组合物，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达突变病毒的重组细胞、受体介导的内吞体中(参见例如Wu等人,1987,J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任何便利的途径，例如通过输注或快速注射、通过经上皮或粘膜皮肤内层(例如，口腔粘膜、直肠和肠道粘膜等)吸收施用，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身性或局部的。
本发明的药物组合物可以用标准针头和注射器皮下或静脉内递送。此外，对于皮下递送，笔式递送装置易于应用于递送本发明的药物组合物。这种笔式递送装置可重复使用或是一次性的。可重复使用的笔式递送装置一般利用含有药物组合物的可更换的筒。一旦筒内的所有药物组合物都已施用并且筒变空时，就可以容易地丢弃空筒并且更换为含有药物组合物的新筒。随后可以再使用笔式递送装置。在一次性笔式递送装置中，没有可更换的筒。实际上，一次性笔式递送装置在装置内的储集器中预填充有药物组合物。一旦排空储集器中的药物组合物，就丢弃整个装置。
多种可重复使用的笔式递送装置和自动注射器递送装置应用于皮下递送本发明的药物组合物。实例包括但不限于AUTOPENTM(Owen Mumford,Inc.,Woodstock,UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic Medical Systems,Bergdorf,Switzerland),HUMALOG MIX75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN70/30TM笔(Eli Lilly and Co.,Indianapolis,IN)、NOVOPENTMI、II和III(Novo Nordisk,Copenhagen,Denmark)、NOVOPEN JUNIORTM(NovoNordisk,Copenhagen,Denmark)、BDTM笔(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPEN STARLETTM和OPTICLIKTM(Sanofi-Aventis,Frankfurt,Germany)等等。可用于本发明的药物组合物的皮下递送的一次性笔递送装置的实例包括但不限于SOLOSTARTM笔(Sanofi-Aventis)、FLEXPENTM(Novo Nordisk)、和KWIKPENTM(EliLilly)、SURECLICKTM自动注射器(Amgen,Thousand Oaks,CA)、PENLETTM(Haselmeier,Stuttgart,Germany)、EPIPEN(Dey,L.P.)、和HUMIRATM笔(Abbott Labs,Abbott Park IL)等等。
在某些情形下，药物组合物可以在控制释放系统中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer,同上；Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料；参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编),1974,CRC Pres.,Boca Raton,Florida。在又一个实施方案中，可以将控释系统放置于组合物靶标附近，因此只需要全身剂量的一小部分(参见例如,Goodson,1984,载于Medical Applications of Controlled Release,同上,第2卷,第115-138页)。其他控释系统在Langer,1990,Science 249:1527-1533的综述中有所讨论。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴液输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过众所周知的方法制备。例如，可以例如通过将上文所述的抗体或其盐溶解、悬浮或乳化于常规用于注射的无菌水性介质或油性介质中来制备注射用制备物。作为用于注射的水性介质，有例如生理盐水、含有葡萄糖和其他辅助剂的等渗溶液等，它们可以与适当的增溶剂(诸如醇(例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如，聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50mol)加合物)]等)组合使用。作为油性介质，采用例如芝麻油、大豆油等，它们可以与增溶剂(诸如苯甲酸苄酯、苄醇等)组合使用。由此制备的注射剂优选地填充于适当安瓿中。
有利地，用于上述口服或不经肠使用的药物组合物制备成适合于符合活性成分剂量的单位剂量的剂型。这类呈单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。所含有的前述抗体的量通常为在单位剂量中每剂型约5至约500mg；尤其是在注射形式中，对于其他剂型，所含有的前述抗体的量为约5至约100mg和约10至约250mg是优选的。
抗体的治疗用途
本发明包括方法，所述方法包括将包含抗LEPR抗体(例如，包含本文的表1中列出的HCVR/LCVR或CDR序列中的任一者的抗LEPR抗体)的治疗组合物施用于对其有需要的受试者。治疗组合物可以包含本文公开的抗LEPR抗体或其抗原结合片段、以及药学上可接受的载剂或稀释剂中的任一者。
本文提供的抗体和抗原结合片段尤其可用于治疗、预防和/或改善与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联或由代谢功能障碍或低瘦蛋白血症介导的任何疾病或障碍，例如非酒精性脂肪肝疾病、NASH、女性不孕、闭经、激素周期异常、免疫功能受损、甲状腺机能减退、肥胖、单基因肥胖、I型糖尿病、II型糖尿病、脂肪营养不良、先天性脂肪营养不良、全身脂肪营养不良、获得性脂肪营养不良、局部脂肪营养不良、先天性局部脂肪营养不良、先天性全身脂肪营养不良、获得性局部脂肪营养不良和获得性全身脂肪营养不良，或者可通过体外或体内刺激或活化LEPR信号传导或模拟瘦蛋白的天然活性来治疗的任何疾病或障碍。例如，抗体及其抗原结合片段可用于治疗脂肪营养不良病症。可通过本发明的抗体和抗原结合片段治疗的示例性脂肪营养不良病症包括例如先天性全身脂肪营养不良、先天性局部脂肪营养不良、获得性全身脂肪营养不良、家族性局部脂肪营养不良、获得性局部脂肪营养不良、离心性腹部脂肪营养不良、环状脂肪萎缩、局部脂肪营养不良和HIV相关脂肪营养不良，以及与此类病症相关联的症状。
本文提供的抗LEPR抗体及其抗原结合片段可用于治疗、预防和/或改善单基因肥胖和/或脂肪营养不良。单基因肥胖和脂肪营养不良可以与很多病理相关联，所述病理包括例如：极度早发性肥胖，受试者的针对年龄和性别的BMI大于第85个百分位；食欲过盛和饱腹感受损，受试者表现出觅食行为和护食行为；免疫功能受损，伴有CD4+T细胞计数减少、反复(可能致死)感染；胰岛素抵抗和高胰岛素血症；非酒精性脂肪肝疾病、肝脂肪变性和脂肪营养不良的进展；血脂异常，导致高甘油三酯血症；糖尿病伴HbA1c和/或葡萄糖水平升高，和葡萄糖耐量降低；生殖功能障碍至性腺功能减退，青春期发育延迟；第二性征的表现减少，无月经或月经不调、以及不孕；青春期骤长缺乏，导致身材矮小，生长激素分泌异常；甲状腺机能减退或甲状腺功能受损，T3或TSH或者游离甲状腺素水平改变；以及可变的骨变化，包括骨密度和骨矿物质含量。考虑到潜在的致病基因，例如AGPAT2、LMNA、BSCL2等等，与单基因肥胖和/或脂肪营养不良相关联的病症和症状的范围可以有所不同。给定的突变可以导致具有不同内分泌严重度(例如月经不调与完全闭经)的瘦蛋白或LEPR功能丧失。
本文提供的抗体和抗原结合片段也可用于治疗、减轻或预防与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的疾病或病症的一个或多个症状。此类症状包括肥胖倾向、肥胖、食欲过盛、高血糖、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、胰岛素抵抗、血脂异常、生长延迟、青春期骤长延迟、生长激素分泌异常、HbA1c升高、低骨矿物质密度(或低骨骼质量)、低骨矿物质含量和低瘦体重。
本发明还包括抗LEPR抗体及其抗原结合片段，所述抗LEPR抗体及其抗原结合片段可用于恢复向表达一个或多个LEPR突变的细胞、组织和器官的瘦蛋白信号传导。此类突变可以与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症以及涉及代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的疾病或病症相关联，所述代谢功能障碍或低瘦蛋白血症例如肥胖、先天性脂肪营养不良、不孕和非酒精性脂肪肝疾病。例如，已经鉴定出某些LEPR突变体，所述LEPR突变体在存在瘦蛋白的情况下不表现出或表现出减少的信号传导，并且与肥胖和相关的障碍相关联。如本文所用，在存在瘦蛋白的情况下不表现出信号传导的LEPR突变体被称为“信号传导缺陷型LEPR突变体”。示例性信号传导缺陷型LEPR突变是LEPR-A409E(Farooqi等人,2007,N Engl J Med 356(3):237-247)。如本文所用，在存在瘦蛋白的情况下表现出减少的信号传导的LEPR突变体(与野生型LEPR相比)被称为“信号传导受损型LEPR突变体”。示例性信号传导受损型LEPR突变是LEPR-P316T(Mazen等人,2011,Mol Genet Metab 102:461-464)。因此，本发明包括抗LEPR抗体及其抗原结合片段，所述抗LEPR抗体及其抗原结合片段可用于治疗、预防和/或改善由一个或多个信号传导缺陷型(例如，A409E)和/或信号传导受损型(例如，P316T)LEPR突变体导致的或与所述信号传导缺陷型和/或信号传导受损型LEPR突变体相关的疾病和障碍。
本发明还包括抗LEPR抗体及其抗原结合片段，所述抗LEPR抗体及其抗原结合片段可用于通过缓解瘦蛋白基因中的突变来恢复瘦蛋白信号传导。一些受试者具有循环的瘦蛋白，但是由于遗传突变(例如，瘦蛋白基因中的p.N103K，它编码瘦蛋白的无生物活性形式)，所述蛋白质是无功能的。一些受试者的循环瘦蛋白很少或没有。涉及瘦蛋白信号传导受损的其他基因可以包括LMNA、PPARG、AGPAT2、BSCL2、PLIN1、AKT2、CIDEC、LIPE和ADRA2A，并且本文提供的抗LEPR抗体及其抗原结合片段可用于减轻此类突变对瘦蛋白信号传导的影响。
本发明的抗LEPR抗体及其抗原结合片段也可用于治疗或预防一种或多种选自由以下各项组成的组的病症、疾病或障碍：肥胖、单基因肥胖、代谢综合征、饮食引起的食物冲动、功能性下丘脑性闭经、1型糖尿病、2型糖尿病、女性不孕、闭经、免疫功能受损、甲状腺机能减退、胰岛素抵抗、严重胰岛素抵抗(包括由于胰岛素受体中的突变而导致的严重胰岛素抵抗、不由胰岛素受体中的突变导致的严重胰岛素抵抗、由下游信号传导通路中的突变导致的或由其他原因导致的严重胰岛素抵抗)、非酒精性和酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、阿尔茨海默病、瘦蛋白缺乏、瘦蛋白抵抗、脂肪营养不良、矮妖症/多诺霍综合征、罗伯森-门登霍尔综合征。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗代谢功能障碍。所述方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人瘦蛋白受体(LEPR)和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗肥胖倾向或肥胖，或者减轻体重。在一些实施方案中，治疗减轻所治疗的受试者中的脂肪质量，但是不减轻瘦体质量。在一些方面，治疗使受试者消耗的卡路里减少或使食物摄入量减少。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗女性不孕或恢复与瘦蛋白缺乏相关联的正常激素周期。在一些方面，治疗可以增加生育力和/或增加受孕的机会。在一些方面，治疗可以恢复正常月经周期。用于恢复至少部分由于瘦蛋白缺乏而中断的正常月经周期的方法也是本发明的一部分。
如本文所展示，当有需要的受试者是患有低瘦蛋白血症或瘦蛋白缺乏的受试者或者不患有低瘦蛋白血症或瘦蛋白缺乏的受试者时，所述方法是有用的。当代谢功能障碍、肥胖倾向或肥胖与信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变相关或不相关或者是或不是由信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变导致的时，所述方法是有用的。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗低瘦蛋白血症、脂肪营养不良或瘦蛋白缺乏患者中的非酒精性脂肪肝疾病或非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。治疗可以减少受试者中的非酒精性脂肪肝疾病(诸如肝性脂肪变性)的症状。在一些情况下，在接受治疗后受试者中的丙氨酸转氨酶(ALT)和/或天冬氨酸转氨酶(AST)的血浆水平降低。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于通过刺激下丘脑STAT3信号传导来治疗食欲过盛、高血糖、胰岛素抵抗、血脂异常、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)或非酒精性脂肪肝疾病。治疗可以降低循环血浆甘油三酯和/或循环血浆总胆固醇。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗脂肪营养不良。治疗减轻了接受治疗的受试者中的高血糖，减少了胰岛素抵抗，和/或降低了HbA1c水平。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗与代谢疾病或低瘦蛋白血症相关联的不孕和/或闭经。治疗调节激素周期，并且可以提高接受治疗的女性受试者中的受孕率。治疗可以恢复正常月经周期。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗免疫功能受损，诸如与低瘦蛋白血症和/或瘦蛋白缺乏相关联的CD4+T细胞计数减少。治疗可以改善免疫功能，例如可以增加CD4+T细胞计数。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗与先天性瘦蛋白缺乏相关联的生长延迟、青春期骤长缺乏和/或生长激素分泌异常。该治疗可以改善生长，可以促进青春期骤长，和/或可以改善生长激素分泌。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗与先天性瘦蛋白缺乏相关联的甲状腺机能减退。治疗可以改善与甲状腺机能减退相关联的症状。
本文提供的LEPR激动剂抗体可用于治疗与低瘦蛋白血症和/或瘦蛋白缺乏相关联的低骨矿物质密度和/或骨矿物质含量。治疗可以改善骨矿物质密度和/或可以改善骨矿物质含量。
在本文所述的治疗方法的背景下，可以将抗LEPR抗体作为单药疗法(即，作为唯一的治疗剂)或与一种或多种另外的治疗剂(所述治疗剂的实例在本文别处有所描述)组合施用。
组合疗法和制剂
本发明包括包含本文所述的抗LEPR抗体中的任一者与一种或多种另外的治疗活性组分组合的组合物和治疗制剂，以及包括将此类组合施用于对其有需要的受试者的治疗方法。
本发明的抗LEPR抗体可以与一种或多种另外的治疗活性组分(例如，用于治疗肥胖、高胆固醇血症、高脂血症、2型糖尿病、1型糖尿病、食欲控制、闭经、不孕等的处方药品)共配制和/或组合施用。此类另外的治疗活性组分的实例包括，例如重组人瘦蛋白(例如，美曲普汀[MYALEPT])、PCSK9抑制剂(例如，抗PCSK9抗体[阿利西尤单抗(alirocumab)、依洛尤单抗(evolocumab)、bococizumab、罗德西珠单抗(lodelcizumab)、拉潘西珠单抗(ralpancizumab)等])、他汀类药物(阿托伐他汀(atorvastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等)、依泽替米贝(ezetimibe)、胰岛素、胰岛素变体、胰岛素促分泌剂、二甲双胍、磺酰脲类、钠葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂(例如，达格列净(dapaglifozin)、卡纳格列净(canaglifozin)、恩格列净(empagliflozin)等)、GLP-1激动剂/类似物(例如，唾液素-4、艾塞那肽、利拉鲁肽、利西拉来、阿比鲁肽、杜拉鲁肽等)、胰高血糖素(GCG)抑制剂(例如，抗GCG抗体)、胰高血糖素受体(GCGR)抑制剂(例如，抗GCGR抗体、小分子GCGR拮抗剂、GCGR特异性反义寡核苷酸、抗GCGR适体[例如，Spiegelmers]等)、血管生成素样蛋白(ANGPTL)抑制剂(例如，抗ANGPTL3抗体、抗ANGPTL4抗体、抗ANGPTL8抗体等)、芬特明(phentermine)、奥利司他(Orlistat)、托吡酯(Topiramate)、安非他酮(bupropion)、托吡酯(Topiramate)/芬特明(phentermine)、安非他酮(bupropion)/那曲酮(naltrexone)、安非他酮(bupropion)/唑尼沙胺(zonisamide)、普兰林肽(Pramlintide)/美曲普汀(Metrelepin)、氯卡色林(Lorcaserin)、新利司他(Cetilistat)、特索芬辛(Tesofensine)、韦利贝特(Velneperit)等。另外的实例包括例如鱼油、匹格列酮、塞美拉肽、贝特类(例如非诺贝特)、泼尼松、烟酸、抗惊厥药、地高辛、香豆素、维生素D、甲状腺素、甲状腺补充剂、维生素补充剂、钙补充剂、肉碱、辅酶Q10、抗便秘药物、抗过敏药物、加巴喷丁、麻醉剂、氯胺酮、利多卡因和盐酸文拉法辛。在本发明的一个实施方案中，本发明的抗LEPR抗体不与厌食剂一起配制或施用。
一种或多种另外的治疗活性组分，例如上文列出的药剂中的任一者或其衍生物，可以在本发明的抗LEPR抗体的施用之前、同步或者之后立即施用；(出于本公开的目的，这种施用方案被视为抗LEPR抗体与另外的治疗活性组分“组合”施用)。本发明包括药物组合物，其中本发明的抗LEPR抗体与如本文别处所述的一种或多种另外的治疗活性组分共配制。
本发明还包括将包含本文所述的抗LEPR抗体中的任一者的组合物和治疗制剂与治疗程序(诸如血浆去除术)一起使用的方法。
施用方案
根据本发明的某些实施方案，可以将多剂量的抗LEPR抗体(或者包含抗LEPR抗体和本文提及的另外的治疗活性剂中的任一者的组合的药物组合物)在限定的时间范围内施用于受试者。根据本发明的该方面的方法包括将多剂量的本发明的抗LEPR抗体按顺序施用于受试者。如本文所用，“按顺序施用”意指每个剂量的抗LEPR抗体在不同的时间点，例如在以预定间隔(例如，小时、日、周或月)分开的不同日施用于受试者。本发明包括这样的方法：所述方法包括将单一初始剂量的抗LEPR抗体，然后是一个或多个第二剂量的抗LEPR抗体，以及任选地随后是一个或多个第三剂量的抗LEPR抗体按顺序施用于患者。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”是指本发明的抗LEPR抗体的施用的时间顺序。因此，“初始剂量”是在治疗方案开始时施用的剂量(也称为“基线剂量”、“负荷剂量”、“起始剂量”等等)；“第二剂量”是在初始剂量后施用的剂量；“第三剂量”是在第二剂量后施用的剂量。初始、第二和第三剂量都可以含有相同量的抗LEPR抗体，但是通常在施用频率方面可以彼此不同。然而，在某些实施方案中，在初始、第二和/或第三剂量中含有的抗LEPR抗体的量在治疗过程中彼此不同(例如，适当上调或下调)。在某些实施方案中，在治疗方案开始时以“负荷剂量”施用两个或更多个(例如，2个、3个、4个或5个)剂量，然后以较低频率施用后续剂量(例如，“维持剂量”)。
抗体的诊断和分析用途
本发明的抗LEPR抗体也可以用于检测和/或测量样品中的LEPR或表达LEPR的细胞，例如用于诊断目的。例如，抗LEPR抗体或其片段可以用于诊断以LEPR的异常表达(例如，过表达、表达不足、表达缺乏等)为特征的病症或疾病。针对LEPR的示例性诊断测定法可以包括例如使从患者获得的样品接触本发明的抗LEPR抗体，其中所述抗LEPR抗体用可检测标记或报告分子来标记。或者，未标记的抗LEPR抗体可以与本身被可检测标记的二抗组合用于诊断应用。可检测标记或报告分子可以是放射性同位素，诸如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分，诸如异硫氰酸荧光素或罗丹明；或者酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或萤光素酶。可以用于检测或测量样品中的LEPR的特定示例性测定法包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定法(RIA)、荧光活化细胞分选(FACS)和正电子发射断层扫描(PET)。
可以用于根据本发明的LEPR诊断测定法的样品包括在正常或病理条件下可从患者获得的任何组织或流体样品，所述样品含有可检测数量的LEPR蛋白或其片段。通常，将对从健康患者(例如，不患有与异常LEPR水平或活性相关联的疾病或病症的患者)获得的特定样品中的LEPR水平进行测量，以初步建立基线或标准LEPR水平。然后可以将该LEPR的基线水平与在从怀疑患有LEPR相关疾病或病症的个体获得的样品中测量的LEPR水平进行比较。
实施例
提供以下实施例是为了向本领域的普通技术人员提供完整公开内容和描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已努力确保有关所用的数字(例如，量、温度等)的准确性，但应考虑某些实验误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是平均分子量，温度是按摄氏度计并且压力是大气压或接近大气压。
实施例1.特异性结合瘦蛋白受体(LEPR)的抗原结合蛋白的产生
通过用包含LEPR的胞外结构域的免疫原免疫
Figure BDA0002715660290000392
小鼠(即，包含编码人免疫球蛋白重链和κ轻链可变区的DNA的经工程化的小鼠)来获得抗LEPR抗体。通过LEPR特异性免疫测定法来监测抗体免疫应答。使用此前描述的技术，分离和纯化了完全人抗LEPR抗体。
根据本实施例的方法产生的示例性抗LEPR抗体的某些生物学性质在下文所示的实施例中有所详细描述。
实施例2.重链和轻链可变区氨基酸和核酸序列
表1示出了本发明所选的抗LEPR抗体的重链和轻链可变区和CDR的氨基酸序列标识符。表2示出了相应的核酸序列标识符。
表1：氨基酸序列标识符
Figure BDA0002715660290000391
Figure BDA0002715660290000401
表2：核酸序列标识符
Figure BDA0002715660290000402
抗体在本文中通常根据以下命名法提及：Fc前缀(例如“H4H”、“H1M”、“H2M”等)，后跟数值标识符(例如“16650”、“16679”等)，后跟“P”或“N”后缀。因此，根据该命名法，抗体在本文中可以称为例如“H4H16650P2”、“H4H16679P2”等。本文使用的抗体名称上的Fc前缀(H4H、H1M和H2M)表示抗体的特定Fc区同种型。例如，“H4H”抗体具有人IgG4 Fc，而“H1M”抗体具有小鼠IgG1 Fc(所有可变区都是完全人的，如抗体名称中的第一个‘H’所示)。如本领域的普通技术人员所理解，可以将具有特定Fc同种型的抗体转化为具有不同的Fc同种型的抗体(例如，可以将具有小鼠IgG1 Fc的抗体转化为具有人IgG4等的抗体)，但无论如何，可变结构域(包括CDR)(以表1和2中示出的数字标识符表示)将保持相同，并且预期结合特性相同或基本上相似，无论Fc结构域的性质如何。
如本文的实施例中所用，“比较mAb”是指Fazeli等人(2006)J Immunol Methods312:190-200和Carpenter等人(2012)Structure 20(3):487-97所描述的Fab9F8。
参见国际专利申请公开号WO2017/66204。
实施例3：人单克隆抗LEPR抗体的表面等离子共振来源的结合亲和力和动力学常数
使用Biacore 4000仪器使用实时表面等离子共振生物传感器来确定LEPR与纯化的抗LEPR单克隆抗体结合的平衡解离常数(KD值)。所有结合研究均在25℃和37℃下的10mMHEPES、150mM NaCl、3mM EDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20pH7.4(HBS-ET)运行缓冲液中进行。Biacore传感器表面首先通过胺与单克隆小鼠抗人Fc抗体(GE,#Br-1008-39)的偶联来衍生化，以捕获抗LEPR单克隆抗体。对以下LEPR试剂进行结合研究：用C-末端myc-myc-六组氨酸标签表达的人LEPR胞外结构域(hLEPR.mmh；SEQ ID NO:114)、用C-末端myc-myc-六组氨酸标签表达的食蟹猴LEPR胞外结构域(mfLEPR.mmh；SEQ ID NO:117)、用C-末端小鼠IgG2a Fc标签表达的人LEPR胞外结构域(hLEPR.mFc；SEQ ID NO:115)、用C-末端myc-myc-六组氨酸标签表达的小鼠LEPR胞外结构域(mLEPR.mmh；SEQ ID NO:118)以及用C-末端myc-myc-六组氨酸标签表达的大鼠LEPR胞外结构域(rLEPR.mmh；SEQ ID NO:119)。首先在HBS-ET运行缓冲液(100nM–3.7nM；3倍系列稀释液)中制备不同浓度的LEPR试剂，并在抗人Fc捕获的抗LEPR单克隆抗体表面上注射4分钟,流速为30μL/min，同时在HBS-ET运行缓冲液中监测与单克隆抗体结合的LEPR试剂的解离10分钟。使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件将实时结合传感图拟合为具有质量传递限制的1:1结合模型，从而确定动力学缔合速率(ka)和解离速率(kd)常数。从动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解生活(t1/2)的计算公式恒定为：
Figure BDA0002715660290000413
和
Figure BDA0002715660290000411
表3至8显示了hLEPR.mmh、mfLEPR.MMH或hLEPR.mFc在25℃和37℃下与本发明的不同抗LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
表3：hLEPR-MMH在25℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
Figure BDA0002715660290000412
Figure BDA0002715660290000421
*NB表示在目前实验条件下未观察到结合。
表4：hLEPR-MMH在37℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
Figure BDA0002715660290000422
*NB表示在目前实验条件下未观察到结合。
表5：mfLEPR.MMH在25℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
Figure BDA0002715660290000423
Figure BDA0002715660290000431
*NB表示在目前实验条件下未观察到结合。
*IC表示所观察的结合包括端值在内，并且
在目前实验条件下不能拟合实时结合数据。
表6：mfLEPR.MMH在37℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
Figure BDA0002715660290000432
*NB表示在目前实验条件下未观察到结合。
*IC表示所观察的结合包括端值在内，并且在目前实验条件下不能拟合实时结合数据表示所观察的结合包括端值在内，并且在目前实验条件下不能拟合实时结合数据。
表7：hLEPR.mFc在25℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
Figure BDA0002715660290000441
*NB表示在目前实验条件下未观察到结合。
表8：hLEPR.mFc在37℃下与LEPR单克隆抗体结合的结合动力学参数。
Figure BDA0002715660290000442
Figure BDA0002715660290000451
*NB表示在目前实验条件下未观察到结合。
在25℃下，抗LEPR单克隆抗体与hLEPR-MMH结合，KD值范围为从7.93nM至148nM，如表5所示。在37℃下，抗LEPR单克隆抗体与hLEPR-MMH结合，KD值范围为从14.8nM至326nM，如表4所示。
本发明的12种抗LEPR单克隆抗体中的十种与mfLEPR.MMH结合。在25℃下，抗LEPR单克隆抗体与mfLEPR.MMH结合，KD值范围为从2.27nM至139nM，如表7所示。在37℃下，抗LEPR单克隆抗体与mfLEPR.MMH结合，KD值范围为从5.18nM至264nM，如表8所示。
在25℃下，抗LEPR单克隆抗体与hLEPR-mFc结合，KD值范围为从613pM至5.7nM，如表7所示。在37℃下，抗LEPR单克隆抗体与hLEPR-mFc结合，KD值范围为从1.16nM至12.8nM，如表8所示。
在25℃或37℃下，本发明的抗LEPR单克隆抗体均不结合至mLEPR.MMH或rLEPR.MMH(数据未显示)。
实施例4.本发明的抗LEPR抗体在存在瘦蛋白:LEPR结合的情况下结合LEPR
使用Biacore T200仪器上的实时表面等离子共振生物传感器来评估人瘦蛋白对抗LRPR抗体与LEPR结合的抑制。整个研究在25℃下的10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3mMEDTA和0.05％v/v表面活性剂Tween-20(HBS-ET运行缓冲液)中进行。首先通过使用标准EDC/NHS表面化学方法胺偶联人瘦蛋白(R&D Systems,#398-LP)来衍生化Biacore CM5传感器表面。通过在人瘦蛋白固定化的Biacore传感器上以10μL/min或25μL/min的流速注射20nM用C-末端myc-myc-六组氨酸标签表达的人LEPR胞外结构域(hLEPR-MMH；SEQ ID NO:xx)4分钟，形成人LEPR和人瘦蛋白的复合物，以实现大约200RU的结合反应。为了评估人瘦蛋白是否阻断抗体与hLEPR-MMH的结合，将200nM抗LEPR单克隆抗体以50μL/min或25μL/min的流速注射到预先形成的hLEPR-MMH:人瘦蛋白复合物上4-5分钟。表9报道了，本发明的所有抗LEPR抗体以几乎相似的信号强度结合至hLEPR-MMH和人瘦蛋白(“瘦蛋白:LEPR”)的复合物，并且观察到以RU表示的结合。该结果表明，人瘦蛋白不阻断hLEPR-MMH与所测试的抗LEPR抗体的结合。
表9：抗LEPR单克隆抗体与hLEPR-MMH和人瘦蛋白的前复合物的结合。
Figure BDA0002715660290000461
实施例5.人瘦蛋白受体阻断ELISA
于ELISA，将人瘦蛋白(人瘦蛋白；R&D Systems,#398-LP-01M)以5g/mL的浓度(溶于PBS)涂覆在96孔微量滴定板上，在4C下放置过夜。随后使用0.5％(w/v)溶于PBS的BSA溶液阻断非特异性结合位点。用抗LEPR抗体、人瘦蛋白或同种型对照抗体(连续稀释范围8.5pM至500nM)滴定恒定量的10nM用C-末端人Fc标签(hLEPR.hFc；SEQ ID NO:116)表达的LEPR蛋白的胞外结构域部分。然后将这些抗体-蛋白质或蛋白质-蛋白质复合物在室温(RT)下温育1.5小时。随后将复合物转移至涂覆有人瘦蛋白的微量滴定板中，并且在室温下温育2小时，洗涤孔，并且用缀合至辣根过氧化物酶的抗人IgG多克隆抗体来检测贴板的hLEPR.hFc(Jackson ImmunoResearch Inc,#109-035-098)。用TMB溶液(BD Biosciences，#555214；按照制造商的说明按1:1比例混合底物A和B)对样品显影，以产生比色反应，然后用1M硫酸中和，然后在Victor X5读板器上测量450nm的吸光度。
使用Prism软件(GraphPad)中的S形剂量反应模型进行数据分析。计算所测试的抗体在最大浓度下的阻断百分比，作为抗体阻断平板上的10nM hLEPR.hFc与人瘦蛋白结合的能力的指标。在计算中，将不存在抗体的10nM hLEPR.hFc的结合信号称为100％结合或0％封闭；将不存在hLEPR.hFc的单缓冲液的基线信号称为0％结合或100％阻断。表10汇总了在500nM抗体浓度下的阻断数据。
如表10所示，本发明的抗LEPR抗体均未展示出>28％的hLEPR.hFc与人瘦蛋白涂覆的表面的结合的阻断。然而，比较抗体和人瘦蛋白作为阳性对照，能够阻断99％的hLEPR.hFc与人瘦蛋白涂覆的表面的结合。同种型对照抗体在最高500nM的浓度下未展示出可测量的阻断。
表10：通过抗LEPR抗体阻断hLEPR.hFc与人瘦蛋白的结合的ELISA
Figure BDA0002715660290000462
Figure BDA0002715660290000471
实施例6.通过使用HEK293/Mycx2-hLepR(ecto)-GPI锚定细胞进行的FACS分析测量的细胞结合
瘦蛋白受体LEPR是I类细胞因子受体家族的单次跨膜受体(Tartaglia等人(1997)J Biol Chem 7:272(10):6093-6)。LEPR可以结合至瘦蛋白，瘦蛋白是主要由脂肪组织表达，涉及食物摄入和代谢调节的蛋白质(Friedman等人(2014)J Endocrinol 223(1):T1-8)。
为了通过抗LEPR抗体评估细胞结合，产生了HEK293稳定细胞系。一种细胞系(下文称为HEK293/hLEPR-GPI)稳定表达具有N-末端myc-myc标签和来自人羧肽酶M的C-末端肽序列的人LEPR的胞外结构域(登录号P48357的氨基酸22-839(SEQ ID NO:113)，同种型B)，所述C-末端肽序列指导GPI(糖基磷脂酰肌醇)(Deddish等人(1990)J.BiologicalChemistry265:25:15083-89)的添加，以使得蛋白质可以通过GPI锚定到膜上。产生了另一种稳定表达全长人LEPR(登录号P48357的氨基酸1-1165(SEQ ID NO:113)，同种型B)以及荧光素酶报告基因(Stat3-luciferase,Stat3-luc,SA Bioscience,#CLS-6028L)的HEK293细胞系，这种细胞系在下文称为HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL。还产生了只具有Stat3-荧光素酶报告基因的HEK293细胞(HEK293/Stat3-luc)作为对照细胞系。
对于FACS分析，将HEK293亲本细胞和HEK293/hLEPR-GPI细胞解离，并且溶于含有2％FBS的PBS(FACS缓冲液)中，以5×105个细胞/孔涂铺于96孔v型底平板上。为了测试抗hLEPR抗体结合至细胞的能力是否受到瘦蛋白的存在的影响，将具有或不具有1μM人瘦蛋白的FACS缓冲液(R&D Systems,#398-LP)与细胞一起在4℃下温育30分钟，然后在FACS缓冲液中以10nM添加抗LEPR抗体或对照抗体。随后将细胞在4℃下温育30分钟，然后洗涤，然后与16g/mL Alexa
Figure BDA0002715660290000481
缀合的二抗(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,#109-547-003)一起在4℃下温育30分钟。随后使用BD CytoFixTM(Becton Dickinson,#554655)固定细胞，过滤，并且在HyperCyt流式细胞仪(Beckman Coulter)上进行分析。还针对所有细胞系测试了单独的未染色和二抗对照。使用ForeCyt(IntelliCyt)和FlowJoversion10软件来分析结果，以确定活细胞的荧光的几何平均值。然后将每个样品的荧光的几何平均值归一化为未染色的细胞的几何平均值，以获得每个条件的相对结合，称为“结合比率”，并且记录每种测试抗体的这些结合比率。
如表11所示，在10nM下测试的9个本发明的抗LEPR抗体展示出在不存在瘦蛋白的情况下以范围为从824至3374倍的结合比率结合至HEK293/hLEPR-GPI细胞。抗LEPR抗体还在存在1μM瘦蛋白的情况下以398和4184倍的结合比率结合。如表11所示，在10nM下测试的比较抗体展示出在不存在瘦蛋白的情况下以2349倍的结合比率结合至HEK293/hLEPR-GPI细胞，但是在存在1M瘦蛋白的情况下与细胞的结合显著减少，结合比率为112。抗LEPR抗体不展示出在存在和不存在1μM瘦蛋白的情况下与HEK293亲本细胞的任何显著结合，结合比率在1至9倍的范围内。单独的同种型对照抗体和二抗样品也不展示出在具有或不具有瘦蛋白的情况下与任一细胞系的显著结合，结合比率在1至6倍的范围内。
如表12所示，在不存在瘦蛋白的情况下在70nM下测试的本发明的四种抗体展示出以在707至1131倍的范围内的结合比率结合至HEK293/hLEPR-GPI细胞，以及以在42至51的范围内的结合比率结合至HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL细胞。抗LEPR抗体不展示出与HEK293/Stat3-luc细胞的任何显著结合，结合比率在1至8倍的范围内。单独的同种型对照抗体和二抗样品也不展示出与测试细胞系中的任一者的显著结合，结合比率在1-2倍的范围内。
表11：10nM抗LEPR抗体与HEK293/hLEPR-GPI和HEK293亲本细胞+/-1μM人瘦蛋白的结合
Figure BDA0002715660290000491
*将抗体分类为“激动剂”或“增效剂”部分基于本文的实施例7和8中观察到的结果。
表12：70nM抗LEPR抗体与HEK293/hLEPR-GPI、HEK293/Stat3-hLEPR-FL和HEK293/Stat3-luc亲本细胞的结合
Figure BDA0002715660290000492
实施例7.本发明的抗LEPR抗体在存在或不存在瘦蛋白的情况下活化LEPR信号传导
开发了一种在IMR-32细胞系即人神经母细胞瘤细胞系中检测经由LEPR活化的STAT3转录活化的生物测定法，所述生物测定法使用稳定表达全长人LEPR(hLEPR；登录号NP_002294.2的氨基酸1至1165)以及荧光素酶报告基因(STAT3-Luc；Qiagen,#CLS-6028L)的报告细胞系。分离所得的稳定细胞系(称为IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR)，并且维持在MEM-Earl培养基中，所述培养基补充有10％FBS、NEAA、1ug/mL嘌呤霉素、100ug/mL潮霉素B和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(完全培养基)。
在存在或不存在瘦蛋白的情况下，将所得的生物测定法用于测量本发明的抗LEPR抗体对LEPR信号传导的作用。对于生物测定法，将IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞以20,000个细胞/100ul/孔的密度涂铺在96孔板的完全培养基中，并且在第二天更换为适当体积的Opti-MEM培养基(补充有1％BSA和0.1％FBS(测定缓冲液))放置30分钟。为了在不存在瘦蛋白的情况下测量本发明的抗体的作用，将抗LEPR抗体或同种型对照抗体和人瘦蛋白(人瘦蛋白；R&D Systems,#398-LP)在测定缓冲液中半对数连续稀释至范围为100nM至300fM的终浓度，所述测定缓冲液被添加至细胞中，随后在37℃、5％CO2中温育过夜。
为了测量在存在瘦蛋白的情况下本发明的抗体的作用，将固定浓度的人瘦蛋白在测定缓冲液中以200pM添加至细胞中，然后立即添加抗LEPR抗体或同种型对照抗体，所述抗体半对数连续稀释至范围为100nM至300fM的终浓度。然后将样品在37℃、5％CO2中温育过夜。然后将OneGlo试剂(Promega，#E6051)添加到样品中，并在Envision Multilabel标仪(Perkin Elmer)上以发光模式测量萤光素酶活性。获得相对光单位(RLU)值，并使用GraphPad Prism软件(GraphPad)使用非线性回归分析结果。从人瘦蛋白剂量反应中获得的最大RLU值在IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR测定法中定义为100％活化。
如表13所示，在研究1中，在不存在人瘦蛋白的情况下，所有测试抗LEPR抗体均展示出IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的弱刺激，对于从人瘦蛋白剂量反应获得的最大活化，分别地，EC50值的范围为134pM至11.9nM，最大活化的范围为5％至13％。在研究2中，在不存在人瘦蛋白的情况下，4种测试抗LEPR抗体展示出IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的刺激，对于从人瘦蛋白剂量反应获得的最大活化，分别地，EC50值的范围为61.9pM至206.9pM，最大活化的范围为65％至68％。在研究1中，在存在200pM人瘦蛋白的情况下，所有测试抗LEPR抗体均展示出IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的刺激，对于从人瘦蛋白剂量反应获得的最大活化，分别地，EC50值的范围为20.2pM至523pM，最大活化的范围为66％至107％。由于这些抗体增强了瘦蛋白诱导的LEPR信号传导，因此如本文所定义，这些抗体被归类为“增效剂”。在研究2中，在存在200pM人瘦蛋白的情况下，4种测试抗LEPR抗体展示出IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的刺激，对于从人瘦蛋白剂量反应获得的最大活化，EC50值的范围为51.9pM至257.3pM，最大活化的范围为76％至88％。在存在瘦蛋白的情况下，这些抗体并未明显增强LEPR信号传导。在任何测定法中，同种型对照抗体均未展示出IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR细胞的任何可测量的刺激。
表13：通过抗LEPR抗体进行的hLEPR的活化
Figure BDA0002715660290000511
实施例8.本发明的抗LEPR抗体活化表达信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体的细胞中的信号传导
已经鉴定出表现出瘦蛋白介导的信号传导缺陷或受损，并且与早发性肥胖相关联的LEPR突变体。例如，LEPR-A409E是一种信号传导缺陷型突变体LEPR蛋白，它不会将瘦蛋白信号转导至STAT3；A409E突变体最初被确定为早发性肥胖的单基因致因。(Farooqi等人,2007,N Engl J Med 356(3):237-247)。LEPR-P316T是一种信号传导受损型突变体LEPR蛋白，它也显示出与早发性肥胖相关联。(Mazen等人,2011,Mol Genet Metab 102:461-464)。
在该实施例中，评估了本发明的抗LEPR抗体在表达信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体的细胞系中刺激LEPR信号传导的能力。具体而言，构建了表达野生型LEPR、LEPR-A409E(信号传导缺陷型)或LEPR-P316T(信号传导受损型)的报告细胞系(HEK293)。使用仅媒介物、重组人瘦蛋白、对照IgG或本发明的激动剂抗LEPR抗体(H4H16650或H4H16679)来处理细胞，并且测定LEPR信号传导的程度(如通过相对于STAT3表达的pSTAT3-Y705表达的蛋白质印迹检测来测量)。
在这些实验中显示了本发明的激动剂抗LEPR抗体(H4H16650和H4H16679)以剂量依赖性方式刺激表达LEPR-A409E突变体或LEPR-P316T突变体的细胞中的LEPR信号转导(如通过STAT3表达来测量)(图2，图板B和C)。相比之下，瘦蛋白处理在表达LEPR-P316T突变体的细胞中仅诱导适度的信号传导，而在表达LEPR-A409E突变体的细胞中不诱导信号传导。(图2，图板A)。此外，在用媒介物或IgG对照抗体处理的任何细胞系中均未检测到LEPR信号转导(数据未示出)。在该测定法中测试了其他信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体，但是未被抗LEPR突变体活化(数据未示出)，这表明这种挽救作用可以是突变体依赖性的。
该实施例的结果表明，本发明的激动剂抗LEPR抗体可以用于治疗由某些信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体(例如，LEPR-P316T或LEPR-A409E)导致的或与这些信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变体相关联的疾病和障碍(例如，早发性肥胖)。
实施例9：不同的抗LEPR单克隆抗体之间的Octet交叉竞争。
在Octet HTX生物传感器平台(Pall ForteBio Corp.)上，使用实时、无标记生物层干涉测量测定法来确定一组不同的抗LEPR隆抗体之间的结合竞争。整个实验在25℃下在含有10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA、和0.05％v/v表面活性剂Tween-20、1mg/mL BSApH7.4的缓冲液(HBS-EBT)中进行，平板以1000rpm的速度振荡。为了评估两种抗体是否能够彼此竞争重组人LEPR(用C-末端myc-myc-六组氨酸标签表达)(hLEPR.mmh，SEQ ID:114)上的各自的表位的结合，首先通过将生物传感器尖端浸入含有20μg/mL hLEPR-MMH的孔中5分钟，从而将约0.25nm或0.34nm hLEPR-MMH捕获至抗五His抗体涂覆的Octet生物传感器尖端(Fortebio Inc,#18-5122)上。然后，通过浸入含有50μg/mL mAb-1溶液的孔中210秒，从而用第一抗LEPR单克隆抗体(下文称为mAb-1)来饱和抗原捕获的生物传感器尖端。随后将生物传感器尖端浸入含有50μg/mL第二抗LEPR单克隆抗体(下文称为mAb-2)溶液的孔中150秒。在实验的每个步骤之间，在HBS-EBT缓冲液中洗涤生物传感器尖端。在整个实验过程中监测实时结合反应，并记录每个步骤结束时的结合反应。比较mAb-2与预先复合有mAb-1的hLEPR-MMH的结合反应，并且确定不同的抗LEPR单克隆抗体的竞争/非竞争行为，如表14和表15所示。
表14：抗LEPR单克隆抗体之间的交叉竞争
Figure BDA0002715660290000521
Figure BDA0002715660290000531
表15：抗LEPR单克隆抗体之间的交叉竞争
Figure BDA0002715660290000532
Figure BDA0002715660290000541
实施例10：LEPR激动剂抗体H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2和H4H17321P2在瘦蛋白缺乏的诱导型小鼠模型中的体内功效。
在经基因工程改造的LEPRHu/Hu小鼠中，在瘦蛋白缺乏的诱导型模型中确定了本发明的四种特定激动剂抗LEPR抗体H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2和H4H17321P2对食物摄入量、体重和肥胖倾向的作用，所述小鼠表达瘦蛋白受体，所述瘦蛋白受体由代替鼠科动物LEPR胞外结构域序列的人LEPR胞外结构域序列组成。通过编码hFc标记的小鼠LEPR胞外结构域的质粒(本文称为mLEPR.hFc或“瘦蛋白陷阱”；SEQ ID NO:120)的流体动力学DNA递送(HDD)来诱导瘦蛋白缺乏模型。瘦蛋白陷阱在表达时会分泌出来，并且结合循环瘦蛋白。在50g编码瘦蛋白陷阱的DNA构建体的HDD后，小鼠表现出食物消耗量增加，以及肥胖倾向和体重增加。
在瘦蛋白陷阱的施用前7天和4天(第-7和-4天)之间测量基线每日食物摄入量。在第0天，使三十五只13至17周龄雄性LEPRHu/Hu小鼠成功接受瘦蛋白陷阱的HDD。在HDD后第6和13天，通过眶后采血，并且通过CT定量包括肥胖倾向在内的身体组成。在HDD后第7天，根据从第0天起的体重变化百分比，将小鼠随机分为五组，每组7只。每组经由皮下注射接受单剂量的3mg/kg同种型对照抗体、3mg/kg H4H16650P2、3mg/kg H4H16679P2、3mg/kgH4H17319P2或3mg/kg H4H17321中的任一者。同种型对照抗体不结合任何已知的小鼠蛋白质。在研究期间测量每只动物的食物摄入量和体重。图3汇总了每个治疗组的平均每日食物摄入量。在图3中，点线表示在HDD注射之前的平均基线食物摄入量。计算每只动物在每个时间点从第0天起的体重变化百分比。图4汇总了每个抗体治疗组中动物的平均体重变化百分比。图5汇总了每个抗体治疗组中的动物的平均脂肪质量，所述脂肪质量通过在抗体处理之前1天和在抗体处理之后6天的CT来定量。所有结果均表示为平均值±SEM。
如图3和4所示，在用瘦蛋白阱进行HDD后，在抗体治疗前的各组小鼠中观察到相似的食物摄入量增加和体重变化百分比。如图3所示，与用同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg抗体H4H16650P2或H4H16679P2治疗的小鼠，从抗体治疗后一天(HDD后第8天)开始和后续测量时间点，表现出食物摄入量显著减少。与同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg抗体H4H17319P2或H4H17321P2治疗的小鼠，在抗体治疗后两天(HDD后第9天)和其他后续测量时间点，表现出食物摄入量显著减少。如图4所示，与同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg抗体H4H16650P2治疗的小鼠，在抗体治疗后一天(HDD后第8天)和其他后续测量时间点，表现出体重变化百分比显著减少。在抗体治疗后一天，在第8天，用同种型对照治疗的小鼠，显示出从第0天起体重增加21.16±1.27％，而用H4H16650P2治疗的小鼠从第0天起体重增加15.57±0.9％。与同种型对照抗体注射的小鼠相比，用3mg/kg抗体H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2治疗的小鼠，在抗体治疗后两天(HDD后第9天)和其他后续测量时间点，表现出体重变化百分比显著减少。在第9天，分别地，对于用同种型对照H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2治疗的小鼠，从第0天起％体重变化为23.18±1.22、13.17±1.05、12.95±1.26、15.98±1.78和15.83±2.01。如图5所示，与抗体治疗前1天(HDD后第6天)相比，用3mg/kg同种型对照抗体治疗的小鼠，在抗体治疗后6天(HDD后第13天)表现出脂肪质量显著增加。与抗体治疗前相比，在抗体治疗后，用3mg/kg抗体H4H16650P2、H4H16679P2、H4H17319P2或H4H17321P2治疗的小鼠的脂肪质量不增加。在治疗6天后(HDD后第13天)，与用3mg/kg同种型对照抗体治疗的小鼠相比，用3mg/kg抗体H4H16650P2、H4H16679P2或H4H17319P2治疗的小鼠表现出脂肪质量显著减少。
实施例11：H4H16650P2通过氢氘交换结合至人瘦蛋白受体(hLEPR.mmh)的表位作图。
进行实验以确定与H4H16650P2相互作用的hLEPR.mmh的氨基酸残基(SEQ ID NO:114的氨基酸M1-D839)。出于此目的，进行使用质谱的H/D交换表位作图。H/D交换方法的一般描述在例如,Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；和Engen andSmith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A中有所阐述。
实验程序.HDX-MS实验在集成的Waters HDX/MS平台上进行，该平台由用于氘标记的Leaptec HDX PAL系统、用于样品消化和上样的Waters Acquity M-Class(辅助溶剂管理器)、用于分析柱梯度的Waters Acquity M-Class(μBinary溶剂管理器)和用于胃酶解肽质量测量的Synapt G2-Si质谱仪组成。
标记溶液在10mM溶于D2O的pD7.0(相当于pH6.6)的PBS缓冲液中制备。对于氘标记，将以2:1摩尔比与抗体预混合的3.8μL hLEPR.mmh(8pmol/μL)或hLEPR.mmh与56.2μLD2O标记溶液一起温育不同的时间点(例如，未氘化的对照＝0秒，标记1分钟和20分钟)。通过将50μL样品转移至50μL预冷的淬灭缓冲液(0.2M TCEP、溶于100mM磷酸盐缓冲液的6M氯化胍pH2.5)来使氘化淬灭，并且将混合的样品在1.0℃下温育两分钟。然后将淬灭的样品注射至Waters HDX管理器中，以进行联机胃蛋白酶/蛋白酶XIII消化。在0℃下将消化肽捕获到ACQUITY UPLC BEH C18 1.7-μm,2.1×5mm VanGuard前置柱上，并且洗脱至分析柱ACQUITY UPLC BEH C181.7-μm,1.0×50mm，进行5％-40％B的梯度分离9分钟(流动相A：溶于水的0.1％甲酸，流动相B：溶于乙腈的0.1％甲酸)。质谱仪被设定为锥电压37V、扫描时间0.5s和质荷比范围50-1700Th。
对于来自人LEPR的肽的鉴定，对来自未氘化的样品的LC-MSE数据进行处理，并且经由Waters ProteinLynx Global Server(PLGS)软件在数据库中进行搜索，所述数据库包括人LEPR、胃蛋白酶及其随机化序列。将所鉴定的肽导入DynamX软件并且以两个标准进行过滤：1)每个氨基酸的最小产物：0.2，和2)复制文件阈值：3。然后，DynamX软件根据保留时间和多个时间点的高质量准确性(<10ppm)来自动确定每个肽的氘摄取量，每个时间重复3次。
结果.使用联机胃蛋白酶/蛋白酶XIII柱与MSE数据采集结合，在不存在或存在抗体的情况下，可重复地鉴定出来自人LEPR的总共201个肽，这代表70％的序列覆盖率。如表16所示，当结合至H4H16650P2时，五个肽的氘化摄取量显著减少(质心δ值>0.4道尔顿，p值<0.05)。所记录的肽质量对应于来自三个重复的质心MH+质量的平均值。这些肽对应于氨基酸162-169(人LEPR的氨基酸LYVLPEVL；SEQ ID NO:113)和氨基酸170-181(人LEPR的氨基酸EDSPLVPQKGSF；SEQ ID NO:113)，当这些肽结合至H4H16650P2时，氘化率减慢。这些鉴定的残基也对应于Uniprot条目P48357(SEQ ID NO.113；人瘦蛋白受体)所定义的人LEPR的残基酸162-169和170-181。
表16：人瘦蛋白受体肽在结合至抗体H4H16650P2时具有显著的保护
Figure BDA0002715660290000561
实施例12：人源化LEPR小鼠中的LEPR增效性抗体的体内功效测试。
在单笼圈养的经基因工程改造的LEPRHu/Hu小鼠中，确定了本发明的三个特定增效性抗LEPR抗体H4H18482P2、H4H18487P2和H4H18492P2对体重和肥胖倾向的作用，所述小鼠表达瘦蛋白受体，所述瘦蛋白受体由代替鼠科动物LEPR胞外结构域序列的人LEPR胞外结构域序列组成(mLEPR.hFc,SEQ ID NO:120)。
在第-19天，通过CT定量包括肥胖倾向在内的身体组成。在第0天，根据体重将四十八只14至16周龄雌性LEPRHu/Hu小鼠随机分为四组，每组12只。在第0和11天，来自每组的小鼠经由皮下注射接受单剂量的30mg/kg同种型对照抗体、30mg/kg H4H18482P2、30mg/kgH4H18487P2或30mg/kg H4H18492P2。同种型对照抗体不结合任何已知的小鼠蛋白质。在研究期间测量每只动物的体重。计算每只动物在每个时间点从第0天起的体重变化百分比。图6汇总了每个治疗组中动物的平均体重变化百分比。图6汇总了每个抗体治疗组中的动物的平均脂肪质量，所述脂肪质量通过在抗体处理之前19天和在抗体处理之后11天的CT来定量。所有结果均表示为平均值±SEM。
如图6所示，在给予LEPR增效性抗体而非同种型对照抗体后观察到体重变化百分比减少。如图6所示，与同种型对照抗体注射的小鼠相比，用30mg/kg H4H18482P2治疗的小鼠，从治疗后两天(第2天)开始和其他时间点，表现出体重变化百分比显著减少。与同种型对照抗体注射的小鼠相比，用30mg/kg H4H18487P2治疗的小鼠，从第2天开始和其他时间点，表现出体重变化百分比显著减少。与同种型对照抗体注射的小鼠相比，用30mg/kgH4H18492P2治疗的小鼠，在第4、5和17天而不是其他时间点，表现出体重变化百分比显著减少。与用H4H18492P2注射的小鼠相比，用30mg/kg H4H18482P2治疗的小鼠，从第6天开始和后续几天(但不是第7、14和17天)，表现出体重变化百分比显著减少。与用H4H18492P2注射的小鼠相比，用30mg/kg H4H18487P2治疗的小鼠，从第3天开始和其他时间点(但不是第4和5天)，表现出体重变化百分比显著减少。
如图7A所示，治疗前(第-19天)各组之间的脂肪质量无差异。如图7B所示，与同种型对照抗体相比，用30mg/kg抗体H4H18482和H4H18487而不是H4H18492治疗的小鼠在治疗后17天(第12天)，显示出统计学上显著的脂肪质量减少。
实施例13：本发明的抗LEPR抗体对猴LEPR信号传导的作用
为了评估猴瘦蛋白受体的转录活化，开发了稳定细胞系。产生稳定表达与人LEPR的跨膜和胞质结构域(hLEPR；登录号NP_002294.2的氨基酸840至1165)以及萤光素酶报告基因(STAT3-Luc；SABiosciences,#CLS-6028L)融合的食蟹猴LEPR的胞外结构域(MfLEPR；登录号XP_005543194.1的氨基酸22至837，第827位苏氨酸变为丙氨酸)的IMR-32细胞(人神经母细胞瘤ATCC)。分离所得的细胞系(下文称为IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR)并且维持在MEM-Earl培养基中，所述培养基补充有10％FBS、NEAA、1ug/mL嘌呤霉素、100ug/mL潮霉素B和青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺。
在不存在瘦蛋白的情况下，进行生物测定法以测量本发明的抗LEPR抗体对猴LEPR信号传导的作用。对于生物测定法，将IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR细胞以10,000个细胞/孔涂铺在96孔板中的0.1％FBS中(溶于含青霉素/链球菌的Optimem中)，并且在5％CO2中37℃下温育过夜。第二天，将人瘦蛋白(hLeptin)、抗LEPR抗体或同种型对照抗体在测定缓冲液(加上仅含有缓冲液但不含有测试分子的的样品)中从50nM连续稀释至0.8pM，并且添加至细胞中。在5％CO2中于37℃下放置5.5小时后，用OneGloTM试剂(Promega，#E6031)和VictorTMX多标记酶标仪(Perkin Elmer)测量荧光素酶活性。使用非线性回归(4参数对数)和PrismTM6软件(GraphPad)对结果进行分析，以获得EC50值。抗体的活化百分比的计算公式如下：通过抗体实现的RLU的最大范围除以通过人瘦蛋白实现的RLU的最大范围。
如表17所示，在不存在人瘦蛋白的情况下，所有测试抗LEPR抗体在IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR细胞中均显示出猴LEPR信号传导的活化，EC50值的范围为266pM至368pM，最大活化的范围为76％至82％，其中100％活化通过人瘦蛋白获得，活化的人瘦蛋白的EC50值为333pM。同种型对照抗体均未展示出IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR细胞的任何可测量的刺激。
表17：通过抗LEPR抗体进行的食蟹猴LEPR的活化
Figure BDA0002715660290000581
实施例14：使用Luminex MFI信号进行的与人LEPR的全长胞外结构域的表位结合
为了确定本发明的抗LEPR抗体结合的人LEPR的表位，采用基于Luminex FLEXMAP(FM3DD,LuminexCorp)流式细胞术的分析来表征抗LEPR抗体与重组人LEPR蛋白结构域的相互作用。对于该测定法，将约300万个羧化的MicroplexR微球(Luminex,目录号LC1000A)进行洗涤，涡旋并在pH6.2的0.1M NaPO4(活化缓冲液)中超声处理，然后离心除去上清液。将微球重新悬浮在120L的活化缓冲液中，并通过添加15L的50mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，Thermo Scientific，产品目录号24500)将羧酸酯基团(-COOH)活化。在25℃下15L 50mg/mL的1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC，ThermoScientific，产品目录号22980)。10分钟后，通过添加600L的50mM MES，pH5(偶联缓冲液)将反应的pH降低至5.0，并将微球涡旋，并离心除去上清液。立即将活化的珠子与500L 20g/mL含小鼠IgG或人IgG的单克隆抗myc单克隆抗体在偶联缓冲液中混合，并且在25℃下温育两小时。加入50L 1M Tris-HCl(pH8.0)淬灭偶联反应，将微球快速涡旋，离心并用1mL DPBS洗涤四次，以除去未偶联的蛋白质和其他反应组分。
将瞬时表达的LEPR蛋白悬浮于无血清CHO-S-SFM II培养基(Thermo Fisher，产生目录#31033020)中，然后通过离心来澄清，所述LEPR蛋白包括用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPR胞外结构域(人LEPR-MMH，SEQ ID NO:113)、用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPR CRH1(D1)(人LEPR CRH1(D1)-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQ IDNO:113的氨基酸1-208，氨基酸209-236)、用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPRCRH1(D1、D2)结构域(人LEPR CRH1(D1、D2)-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQ ID NO:113的氨基酸1-318，氨基酸319-346)、用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPR CRH1-Ig(D1、D2、D3)结构域(人LEPR CRH1(D1、D2、D3)-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQ IDNO:113的氨基酸1-278，氨基酸279-306)、用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPRCRH1-Ig(D2、D3)结构域(人LEPR CRH1-Ig(D2、D3)-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQID NO:113的氨基酸1-198，氨基酸199-226)、用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPRIg(D3)结构域(人LEPR Ig(D3)-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQ ID NO:113的氨基酸1-88，氨基酸89-116)、用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPR CRH2结构域(人LEPRCRH2-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQ ID NO:113的氨基酸1-207，氨基酸208-235)、用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPR FNIII结构域(人LEPR FNIII-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQ ID NO:113的氨基酸1-204，氨基酸205-232)、以及用C-末端myc-myc六组氨酸标签表达的人LEPR Ig-CRH2-FNIII结构域(人LEPR Ig-CRH2-FNIII-MMH，具有myc-myc六组氨酸标签的SEQ ID NO:113的氨基酸1-510，氨基酸511-538)。将如上所述制备的具有固定化抗myc单克隆抗体的微球等分试样分别添加至1mL每种这些蛋白质上清液中。将微球轻轻混合，在25℃下温育两小时，用1mL DBPS洗涤两次，离心除去上清液，最后重悬于1mL DPBS缓冲液中。分别从与全长人LEPR和每个人LEPR结构域蛋白的单个反应中提取的48L抗myc IgG偶联微球，并在3.6mL PBS+20mg/mL BSA+0.05％叠氮化钠(阻断缓冲液)中混合在一起。
从该混合池中，将75L微球/孔涂铺在96孔滤板(Millipore，产品目录号：MSBVN1250)上，并且与25L单个抗人LEPR单克隆抗体(0.5或5g/mL)混合，在25℃下温育两小时，然后用200L含有0.05％Tween 20的DPBS(洗涤缓冲液)洗涤两次。为了检测和定量结合至单个微球的抗LEPR抗体水平的量，添加溶于封闭缓冲液的100L 2.5g/mL R-藻红蛋白缀合的山羊F(ab')2抗人κ抗体(Southern Biotech，产品目录#2063-09)或溶于封闭缓冲液的100L 1.25g/mL R-藻红蛋白AffiniPure F(ab')2片段山羊抗小鼠IgG、F(ab')2片段特异性(Jackson Immunoresearch，产品目录号：115-116-072)，并且在25℃下温育30分钟。在30分钟后，将样品用200L洗涤缓冲液洗涤两次，然后重悬于150L洗涤缓冲液中。在Luminex分析仪中测量微球的中位数荧光强度(MFI)。
表18：结合至myc标签捕获的人LEPR和分离的人LEPR结构域的全长胞外结构域的抗LEPR抗体的Luminex MFI信号
Figure BDA0002715660290000601
表18中列出了基于Luminex的分析结果。Luminex MFI信号强度表明，本发明的十二个抗LEPR抗体结合至完全人LEPR胞外结构域。抗LEPR抗体H4H18417P2、H4H18438P2和H4H18492P2，结合至人LEPR的CRH1 D2结构域内的表位。抗LEPR抗体H4H18449P2、H4H16650P和H4H16679P，结合至人LEPR的CRH1(D1-2)结构域内的表位。抗LEPR抗体比较单克隆抗体，结合至人LEPR的CRH2结构域内的表位。抗LEPR抗体H4H18445P2，结合至人LEPR的FNIII结构域内的表位。抗LEPR抗体H4H18446P2、H4H18482P2和H4H18487P2，结合至人LEPR的Ig-CRH2-FNIII结构域内的表位。
实施例15-19：动物研究方案
所有动物研究均根据指南进行，并且得到Regeneron Pharmaceuticals的机构动物护理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)的批准。猴研究也根据指南进行，并且获得Covance Laboratories的IACUC的批准。
小鼠研究
流体动力学DNA递送
基于流体动力学DNA递送(HDD)的体内转染是一种涉及大量含有裸质粒DNA的溶液的快速注射以在活体动物中表达外源蛋白质的方案(Suda,2007)。对小鼠进行称重，并且通过悬浮于最终体积等于1/10体重(V/W)的盐水中来新鲜制备表达载体，所述表达载体通过侧尾静脉注射来递送。对于瘦蛋白沉陷模型验证研究(图11)，使8周龄雄性C57BL/6N小鼠(Taconic)接受每只小鼠50μgDNA的mLeprECD表达载体(pRG977.mROR.mLepR.ecto.hFc)或对照载体(pRG977.hFc)。对于H4H17319P2评估研究(图9)，使17至20周龄雄性和雌性Leprhu /hu小鼠接受每只小鼠50μgDNA的mLeprECD表达载体(pRG977.mROR.mLepR.ecto.hFc)。
体重和食物摄入量测量
通过将小鼠放置于已配衡的数字实验室天平上的容器中来测量体重。使用3秒动态称重的平均体重。通过使用数字实验室秤测量进料斗内的食物质量来确定食物摄入量。食物摄入量的计算公式为：进料斗中提供的食物的重量减去进料斗中剩余的食物的重量之差。
身体组成
根据制造商的说明，使用量子微型CT成像系统(Perkin Elmer)对用气态异氟烷麻醉的活小鼠进行微型计算机断层扫描(微型CT)成像。根据制造商的说明，使用量子微型CT成像系统(Perkin Elmer)来测量身体组成(脂肪质量、瘦体质量、骨骼质量、骨矿物质含量和密度)。随后使用AnalyzeDirect成像软件来分析扫描结果。通过将记录的组织体积乘以相应的质量密度：0.92、1.05和1.7g/cm3来计算脂肪质量、瘦体质量和骨骼质量。使用EchoMRI 100仪器(EchoMRI)对有意识的活小鼠进行定量核磁共振(qNMR)，以测量脂肪质量、瘦体质量、游离水质量和总水质量。
血糖测量
使用血糖仪(AlphaTrak2,Zoetis)和葡萄糖试纸(Zoetis)从有意识的小鼠的尾静脉切口测量进食血糖水平。
胰岛素耐量测试
在禁食4小时后，根据指示，用0.5、0.75或1.0U/kg剂量的胰岛素(Humulin R,EliLilly and Company)对动物进行腹膜内(IP)注射。在胰岛素注射后0、15、30、60和120分钟，使用AlphaTRAK2血糖仪和试纸(Zoetis)进行葡萄糖测量。在Leprhu/hu表征研究中，使用
Figure BDA0002715660290000611
Compact Plus血糖仪和试纸(Roche Diabetes Care,Inc.)。
化学分析和激素测定法
除非另外指明，否则使小鼠禁食4h，然后通过眶后采血来收集血液。对于血清分离，将血液转移至血清分离管(Sarstedt AG&Co.)，并且在湿冰上使血液凝结至少30分钟，然后以10,000g离心5分钟。移出血清并将其储存在-80℃下直到进行瘦蛋白定量。对于血浆测量，将血液转移至K3EDTA涂覆的管(Sarstedt AG&Co.)中。将二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂和蛋白酶抑制剂混合物添加至血样中，将血样放置于冰上，直到通过2000×g离心10分钟获得血浆。等分血浆并将其储存在-80℃下直到用于血浆脂质、肝酶和瘦蛋白水平的定量。测量收集于K3EDTA涂覆的管中的新鲜全血中的HbA1c。使用化学分析仪(Advia ChemistryXPT,Siemens)对HbA1c、血浆脂质和肝酶进行定量。使用免疫测定法试剂盒(MilliplexMAP,Millipore)并且按照制造商推荐的方案来测量血清或血浆瘦蛋白水平。
肝甘油三酯定量
从100至200mg肝脏定量肝甘油三酯含量，所述肝脏用液氮冷却的研钵和研杵磨成粉末。对粉末状肝组织进行称重，并且通过珠匀浆仪(FastPrep24-5G,MP Biomedical)在PBS中匀浆。将匀浆物转移至含有5mL Folch溶液(2:1氯仿:甲醇)的玻璃管中，涡旋振荡，并且以1500×g离心20分钟。收集下层相，使其达到5mL体积，并且涡旋振荡。将特定体积(25至50μL)的样品和三油精标准品(Verichem)转移至96孔聚丙烯板中，与10μL氯仿:Triton X-100的1:1混合物混合，并且进行风干。向干燥样品和标准品中添加300μL甘油三酯试剂(Thermo Scientific)，使板振荡5分钟，然后在37℃下温育20分钟。将200μL每个反应物转移至新的透明聚丙烯96孔板中，并且使用读板器(Molecular Devices)来测量500nm下的吸光度。
固定灌注和免疫组织化学
用戊巴比妥钠(110mg/kg，腹腔)麻醉小鼠，并且经心脏灌注2mL盐水，然后灌注150mL溶于0.1M硼酸盐缓冲液pH9.5的4％多聚甲醛。使肝脏后固定2小时，转移至70％乙醇中，并且进行石蜡包埋处理，在Histoserv切片以进行苏木精和伊红染色。使大脑在4℃下后固定2h，然后在4℃下浸入溶于磷酸钾缓冲盐水的15％蔗糖中过夜。将全脑安装在冷冻滑动切片机(Leica)上，切成30μm厚的切片，以等间隔系列收集，储存在冷冻保护剂(溶于0.1M磷酸盐缓冲液的20％甘油和30％乙二醇)中，以及储存在-20℃冷冻保护剂(溶于0.1M磷酸盐缓冲液的20％甘油和30％乙二醇)中。
对来自每个实验组的间隔150μm的一系列大脑切片进行同步处理，以确保动物和处理之间的可比染色。对于所有免疫染色，封闭大脑切片，并且在含有1％驴血清(Equitech)、0.03％Triton X-100和0.05M磷酸钾缓冲盐水的溶液中稀释一抗/二抗。亲和素和生物素封闭根据制造商的方案(Vector Labs)进行。使用亲和素-生物素复合物方法和生色团二氨基联苯胺(Vector Labs)对等间隔系列的大脑切片进行pStat3(Y705)的免疫组织化学染色(#9145,Cell Signaling Technologies；1:1000，在4℃下进行16h)。对于P-STAT3(Y705)免疫组织化学(IHC)，将切片用溶于1％NaOH的1％H2O2预处理10分钟，用溶于K-PBS的0.3％甘氨酸预处理10分钟，并且用溶于K-PBS的0.03％SDS预处理10分钟。
通过在Scanscope XT(Aperio)上用40倍物镜对整个载玻片进行扫描，可以获得明视野图像。通过与Franklin和Paxinos小鼠大脑图谱进行组织比较来匹配切片。神经解剖学面积以及与前囟的距离根据该图集来估算。使用Halo软件(Indica Labs)在指定的首尾水平对给定区域进行pSTAT3(Y705)免疫反应性细胞数量的的双边定量。
猴研究
所有食蟹猴研究均在Covance Laboratories,Inc.进行。每天用认证的灵长类动物食料#5048(PMI,Inc.)给猴喂食两次，并且允许猴随意获取淡水。
体重
在剂量施用当天给予前，对猴进行称重，并且在整个研究的其余时间里，根据需要每周至少称重一次。
双能X射线吸收测定法(DEXA)
根据兽医的判断，使用Discovery A密度计(Hologic)对氯胺酮和右旋美托咪啶麻醉的空腹猴进行全身扫描。
实施例15：瘦蛋白缺乏诱导的抗LEPR抗体逆转肥胖
进行研究以确定H4H17319P2是否在体内有效。由于H4H17319P2不结合小鼠LEPR，因此使用
Figure BDA0002715660290000631
技术(Valenzuela等人,2003)来产生经遗传修饰的小鼠，其中编码LePR胞外结构域的小鼠Lepr基因的一部分被替换为对应的人LEPR基因组序列(Leprhu/hu；图10A)。Leprhu/hu小鼠未显示出在体重、身体组成、胰岛素敏感性和血清瘦蛋白水平方面与Lepr+/+小鼠的差异(图10B、C和D)。
通过质粒的流体动力学DNA递送(HDD)来开发瘦蛋白缺乏的小鼠模型，所述质粒编码hFc标记的小鼠Lepr胞外结构域(mLeprECD)，以隔离内源性循环小鼠瘦蛋白，从而作为瘦蛋白沉陷，以及从而阻止瘦蛋白信号传导。在mLeprECD的HDD后，饲料喂食的C57BL/6N小鼠的体重迅速增加，与接受对照hFc的HDD的小鼠相比，HDD后第3天开始显著增加(图11A)。在研究结束时(HDD后第10天)，在mLeprECD的HDD后体重增加24％，而在对照组中仅观察到3％的微小增加(图11A)。与体重数据一致的是，从HDD后第3天开始，与对照组相比，在mLeprECD的HDD后累积食物摄入量显著增加(图11A)。为了确认体重增加反映了肥胖倾向增加，在HDD后第7天进行微型CT成像，并且显示出与对照组相比，在mLeprECD的HDD后脂肪质量显著增加2倍(图11B)。各组之间的所有其他身体组成参数相似(图11B)。
为了评估H4H17319P2的体内功效，通过mLeprECD的HDD在饲料喂食的雄性和雌性Leprhu/hu小鼠中诱导瘦蛋白缺乏。如所预期的那样，mLeprECD的表达促进了两种性别Leprhu /hu小鼠的体重快速增加(图9A和12A)。在HDD后七天，根据体重的相对变化百分比对Leprhu/hu小鼠进行分层，并且施用单个10mg/kg皮下剂量的对照或H4H17319P2。在HDD后14天，施用对照单克隆抗体(下文称为对照mAb)的雄性和雌性小鼠二者的体重继续增加，体重增加分别为40.5±2.7％和44.1±4.7％(图9A和11A)。相比之下，用单剂量的LEPR激动剂单克隆抗体治疗的小鼠的体重减少，并且在HDD前恢复到初始体重(图9A和11A)。由于H4H17319P2结合人而非小鼠LEPR，因此可以排除体重增加仅次于LEPR mAb干扰mLeprECD隔离瘦蛋白的能力的可能性。体重丧失与食物摄入量减少相关联(图9A和11A)。虽然给予前两组之间的每日食物摄入量无差异，但是与对照单克隆抗体组相比，用H4H17319P2治疗的小鼠的食物摄入量显著下降(图9A和11A)。用单剂量的H4H17319P2观察到的体重和食物摄入量降低作用最终减弱。与对照单克隆抗体施用的小鼠相比，用H4H17319P2治疗的雄性和雌性小鼠的食物摄入量保持显著较低，直到分别地治疗后12和9天(第19和16天)(图9A和11A)。用H4H17319P2治疗的雄性和雌性小鼠的体重直到治疗后16天和13天(第23和20天)保持与基线体重相似，此后出现体重增加(图9A和11A)。
H4H17319P2治疗诱导的体重下降反映了肥胖倾向和瘦体质量减少。微型CT分析显示，在第-1天HDD前和第6天治疗前，雄性或雌性小鼠的治疗组均显示出相似的身体组成(图9B、12B和12C)。与诱导的瘦蛋白缺乏一致的是，与第-1天HDD前相比，在第6天两个组均显示出脂肪质量和瘦体质量显著增加，但是骨骼质量不增加(图9B、12B和12C)。在治疗后六天(第13天)，与第6天相比，给予对照单克隆抗体的小鼠显示出脂肪质量进一步增加，而在H4H17319P2治疗后未检测到肥胖倾向的进一步增加。与体重变化一致的是，相对于在7天治疗后对照单克隆抗体施用的小鼠，H4H17319P2治疗的小鼠的脂肪质量和瘦体质量二者均减少。未观察到对骨骼质量、骨矿物质含量或骨密度的治疗相关影响(图12B和123C)。
然后，评估H4H17319P2改变诱导的瘦蛋白缺乏型小鼠中的循环脂质的能力。血浆化学分析显示，与在6天治疗后对照单克隆抗体给予的雄性小鼠相比，H4H17319P2降低循环血浆甘油三酯和总胆固醇，包括HDL-胆固醇(HDL-C)和LDL-胆固醇(LDL-C)(图9C)。
鉴于瘦蛋白可促进瘦蛋白缺乏型ob/ob小鼠的能量消耗(Halaas等人,1995；Pelleymounter等人,1995)，评估成对喂养的作用，以说明食物摄入量减少是否能完全解释诱导的瘦蛋白缺乏中H4H17319P2的体重降低作用。与通过HDD接受对照载体的Leprhu/hu小鼠相比，诱导的瘦蛋白缺乏型Leprhu/hu小鼠的体重迅速增加，并且食欲过盛(图13A)。在第7和13天给予后，施用对照单克隆抗体的小鼠继续消耗更多食物并且体重增加，而H4H17319P2治疗的小鼠的食物摄入量减少并且体重减少(图13A)。成对喂养还促进了表达mLeprECD的Leprhu/hu小鼠的体重减轻。值得注意的是，成对喂养的小鼠消耗的食物量与H4H17319P2治疗的小鼠相同，但是未显示出相同程度的体重减轻(图13A)。与这些数据一致的是，与对照单克隆抗体施用的小鼠相比，成对喂养的小鼠的肥胖倾向减少，但是显著大于用H4H17319P2治疗的小鼠的肥胖倾向(图13B)。相比之下，相对于对照单克隆抗体施用的瘦蛋白缺乏型小鼠，在成对喂养和H4H17319P2治疗之间观察到类似的瘦体质量减少作用(图13B)。未观察到针对骨骼质量、骨密度或骨矿物质含量的作用(图13B)。
瘦蛋白还改善了瘦蛋白缺乏型ob/ob小鼠的胰岛素敏感性(Muzzin等人,1996；Pelleymounter等人,1995)。因此，在诱导的瘦蛋白缺乏之后，确定了H4H17319P2治疗和成对喂养对胰岛素敏感性的相对作用。在单克隆抗体给予或成对喂养后三天进行胰岛素耐量测试。如图13C中所示，与用对照载体进行HDD的Leprhu/hu小鼠相比，对照单克隆抗体施用的表达mLeprECD的Leprhu/hu小鼠显示出胰岛素敏感性减少。值得注意的是，用H4H17319P2治疗恢复了胰岛素敏感性，而成对喂养在诱导的瘦蛋白缺乏型Leprhu/hu小鼠中无影响(图13C)。
最后，确定了H4H17319P2主要通过减少食物摄入量来降低循环脂质的作用。虽然H4H17319P2而非成对喂养显著降低了瘦蛋白缺乏的血浆甘油三酯，但是H4H17319P2和成对喂养均减少了总血浆胆固醇和HDL-C(图13D)。
总之，数据表明，在诱导的瘦蛋白缺乏模型中，H4H17319P2不仅逆转了食欲过盛和肥胖，而且还改善了胰岛素抵抗。值得注意的是，虽然食物摄入量减少促进了通过H4H17319P2观察到体重和肥胖倾向减少，但是食物摄入量减少不足以改善胰岛素敏感性或降低血浆甘油三酯水平。
实施例16：H4H17319P2逆转脂肪营养不良小鼠中的高血糖、胰岛素抵抗、血脂异常和肝性脂肪变性
然后，对H4H17319P2进行测试，以确定它是否可以减轻由于全身脂肪营养不良而导致的继发性低瘦蛋白血症小鼠中的食欲过盛、代谢功能障碍和肝脂肪变性。为了验证该假设，使aP2-nSrebp1c Tg/+小鼠(表现出全身脂肪营养不良的表型特征)(Shimomura等人,1998))与Leprhu/hu小鼠交配。aP2-nSrebp1cTg/+小鼠通过aP2启动子在脂肪组织中表达核Srebp1c，并且被用于经典实验，所述经典实验首次证明了瘦蛋白可解决由于全身脂肪营养不良的低瘦蛋白水平而导致的代谢并发症(Shimomura等人,1999)。雄性aP2-nSrebp1cTg/+；Leprhu/hu小鼠(Tg)小鼠比aP2-nSrebp1c+/+；Leprhu/hu(非Tg)动物重(图15A)。然而，与此前报道一致的是，与非Tg小鼠相比，Tg小鼠显示出肥胖倾向减少和瘦蛋白水平降低(图15A)。相对于非Tg小鼠，aP2-nSrebp1cTg/+；Leprhu/hu小鼠还表现出显著的胰岛素抵抗和轻度血脂异常，并且甘油三酯、总胆固醇和LDL-C的血浆水平升高(图15B和15C)。
雄性脂肪营养不良Tg小鼠每周接受10mg/kg(皮下)剂量的对照单克隆抗体或H4H17319P2一次。此外，雄性非Tg小鼠每周还接受10mg/kg(皮下)剂量的对照单克隆抗体一次，以作为野生型代谢参数的参考。在第0天治疗前，相对于非Tg小鼠，Tg小鼠显示出体重显著增加(图14A)。在治疗开始后三天，接受H4H17319P2的脂肪营养不良小鼠的体重显著低于给予对照单克隆抗体的脂肪营养不良小鼠(图14A)。因此，给予对照单克隆抗体的Tg小鼠是食欲过盛的，并且消耗的食物多于给予对照单克隆抗体的非脂肪营养不良非Tg小鼠(图14A)。然而，用H4H17319P2治疗的Tg小鼠消耗的食物少于给予对照单克隆抗体的Tg小鼠(图14A)。
为了确定所观察的体重变化的基础，通过微型CT对身体组成进行定量。这些分析显示，瘦体质量差异主要负责基因型和治疗之间体重变化。在治疗前(第-5天)，与非Tg小鼠相比，在脂肪营养不良Tg小鼠中瘦体质量显著增加(图14B)。相反，在给予前(第-5天)，与非Tg小鼠相比，Tg小鼠的脂肪质量减少(图14B)。在每周施用一次4周后，与对照单克隆抗体给予的Tg小鼠的脂肪质量和瘦体质量相比，H4H17319P2显著降低Tg小鼠中的脂肪质量和瘦体质量(图14B)。相对于野生型小鼠，Tg小鼠中的骨骼质量和骨矿物质含量升高，但是在给予前各治疗组均未显著升高(图16A)。此外，在施用对照单克隆抗体或H4H17319P2的脂肪营养不良小鼠之间未观察到骨骼质量或骨矿物质含量的差异(图16A)。类似地，未检测到对骨密度的显著基因型或治疗相关作用(图16A)。这些数据显示，H4H17319P2减少脂肪营养不良小鼠中的瘦体质量和脂肪质量，但是不影响骨骼质量、骨矿物质含量或骨密度。
根据此前的发现，与在第0天治疗之前的非Tg小鼠相比，脂肪营养不良Tg小鼠显示出显著的高血糖(图14C)。在用H4H17319P2处理后三天，在Tg小鼠中自由进食血糖水平是归一化的，并且不同于非Tg小鼠的血糖水平。值得注意的是，通过每周一次H4H17319P2治疗，Tg小鼠到研究结束时一直维持正常血糖，而接受对照单克隆抗体的Tg小鼠在整个研究中保持高血糖(图14C)。相应地，在第28天，与预处理或对照单克隆抗体施用相比，脂肪营养不良小鼠中的血红蛋白A1c(HbA1c)百分比水平有所降低(图14C)。另外，通过H4H17319P2治疗降低血糖水平与胰岛素敏感性改善相关联。在第23天，胰岛素耐量测试显示，对照单克隆抗体施用的脂肪营养不良小鼠是胰岛素耐受的，而H4H17319P2治疗的脂营养不良小鼠的胰岛素敏感性相当于对照单克隆抗体施用的非Tg小鼠(图14D)。总体而言，这些结果表明，H4H17319P2减轻了全身脂肪营养不良的小鼠模型中的高血糖、胰岛素抵抗并且降低了HbA1c水平。
在研究结束时(第28天)进行的血浆化学分析进一步揭示，H4H17319P2减少了全身脂肪营养不良小鼠中的高甘油三酯血症和高胆固醇血症。在研究结束时，与另外接受对照单克隆抗体的非Tg小鼠相比，在接受对照单克隆抗体的Tg小鼠中，甘油三酯、总胆固醇和LDL-C的血浆水平显著升高(图1E)。值得注意的是，用H4H17319P2治疗的Tg小鼠中的血浆甘油三酯和胆固醇水平显著降低。因此，H4H17319P2改善了患有全身脂肪营养不良的小鼠中的血脂异常。
除糖尿病、胰岛素抵抗和血脂异常之外，患有全身和局部脂肪营养不良的患者还可以患上非酒精性脂肪肝疾病(包括肝性脂肪变性)。因此，研究了H4H17319P2对脂肪营养不良小鼠中的肝酶水平、肝脏重量和肝脂肪变性的作用。在第28天，与H4H17319P2治疗的Tg小鼠或施用对照单克隆抗体的非Tg小鼠相比，接受对照单克隆抗体的Tg小鼠显示出ALT和AST的循环水平显著增加(图14F)。重要的是，改善的肝酶谱与对肝脏重量和肝脂肪变性的有利作用相关联(图14G)。具体而言，来自接受对照单克隆抗体的脂肪营养不良小鼠的肝脏比来自接受对照单克隆抗体的非Tg小鼠的肝脏显著更重，重量为3.6±0.7g(图14G)。与接受对照单克隆抗体的非Tg小鼠和H4H17319P2治疗的脂肪营养不良小鼠二者相比，来自对照单克隆抗体施用的Tg小鼠的肝脏也具有更高的甘油三酯含量(图14G)。值得注意的是，来自H4H17319P2治疗的Tg小鼠的肝脏重量值增加0.6±0.1g，并且与来自接受对照单克隆抗体的非Tg小鼠的肝脏相比，表现出肝脏甘油三酯含量不增加(图14G)。从苏木精和伊红染色的肝脏切片也可以明显看出，H4H17319P2可改善肝性脂肪变性(图14G)。
实施例17：H4H17319P2活化下丘脑STAT3信号传导
下丘脑的弓状核中的LEPR活化在能量和代谢平衡的控制中发挥关键作用(Coppari等人,2005；Cowley等人,2001)。由于H4H17319P2减轻了脂肪营养不良Leprhu/hu小鼠中的食欲过盛和代谢并发症，因此进一步探讨了H4H17319P2是否诱导类似于瘦蛋白的弓状核中的STAT3活化。pSTAT3Y705的免疫染色针对从接受单剂量对照或10mg/kg(皮下)的H4H17319P2，或连续输注30μg/d(皮下)的人瘦蛋白3天的雄性脂肪营养不良Tg小鼠获得的匹配的大脑切片进行。选择瘦蛋白剂量，因为此前的研究显示，5μg/d(皮下)在脂肪营养不良小鼠中是有效的(Shimomura等人,1999)，并且在小鼠中观察到的最大功效为10至42μg/d(皮下)(Denroche等人,2013；Halaas等人,1997；Harris等人,1998)。这些分析显示，在接受对照单克隆抗体的脂肪营养不良小鼠中，弓状核中很少细胞显示出pSTAT3 Y705染色。相比之下，瘦蛋白和H4H17319P2二者均在弓状核中诱导pSTAT3 Y705，并且检测到相似数量的pSTAT3 Y705+细胞(图17A)。虽然最初的关注点是弓状核(一种缺乏血脑屏障的脑室周围器官)，因为它在介导瘦蛋白的作用及其在正中隆突的近侧位置方面具有确定的作用，但是注意到瘦蛋白和H4H17319P2二者均在腹内侧下丘脑中诱导pSTAT3 Y705。然而，与通过瘦蛋白治疗所检测相比，H4H17319P2在更多数量的腹内侧下丘脑细胞中诱导pSTAT3染色(图17A)。总之，这些数据显示，瘦蛋白和H4H17319P2在类似数量的弓状核中的细胞中诱导pSTAT3Y705，而H4H17319P2在腹内侧下丘脑中具有更明显的作用。
单克隆抗体作为CNS疗法的一个缺点是它们跨越血脑屏障的能力有限，在CSF中检测到～0.1％的循环浓度(Zuchero等人,2016)。虽然有此局限，但是本文确定了，H4H17319P2不仅在下丘脑弓状核中诱导STAT3磷酸化，而且还在腹内侧下丘脑中刺激STAT3信号传导。据报道，弓状核由有孔血管供血，但是程度低于邻近的正中隆突(Ciofi等人,2009；Norsted等人,2008)。目前，没有文献证据表明腹内侧下丘脑有权直接暴露于血源分子。虽然不希望受理论的束缚，但是可能的解释是单克隆抗体通过从弓状核扩散达到腹内侧下丘脑。或者，H4H17319P2抗体可以表现出不同于瘦蛋白的信号传导性质。虽然功能性LEPR-b在腹内侧下丘脑中表达，但是另一种可能性是H4H17319P2单克隆抗体可以间接刺激腹内侧下丘脑STAT3信号传导。然而，出乎意料的是，与瘦蛋白相比，H4H17319P2在腹内侧下丘脑中的更多神经元中诱导STAT3信号传导。
实施例18：H4H17319P2在减轻脂肪营养不良小鼠中的代谢和肝功能障碍方面的效果至少相当于瘦蛋白
由于H4H17319P2在弓状核和腹内侧下丘脑细胞中参与STAT3信号传导方面类似于或好于瘦蛋白，因此在脂肪营养不良小鼠中比较了H4H17319P2和瘦蛋白治疗的功效。雄性Tg小鼠每周接受10mg/kg(皮下)剂量的对照单克隆抗体或LEPR激动剂一次，或连续输注30μg/d(皮下)的瘦蛋白14天。作为参考，雄性非Tg小鼠每周接受10mg/kg(皮下)剂量的对照单克隆抗体一次。在第0天治疗之前，Tg小鼠具有显著的高血糖(图17B)。与对照单克隆抗体施用相比，通过H4H17319P2或瘦蛋白输注使血糖水平降低至相同的程度(图17B)。在开始H4H17319P2或瘦蛋白治疗后2天，血糖水平降低，并且直到研究结束一直保持低水平(图17B)。为了测试改善的胰岛素敏感性是否有助于血糖降低作用，在第9天进行胰岛素耐量测试。实际上，胰岛素耐量测试显示，对照单克隆抗体施用的Tg小鼠是胰岛素耐受的，而H4H17319P2和瘦蛋白治疗的Tg小鼠是胰岛素敏感的(图17B)。未观察到H4H17319P2和瘦蛋白治疗之间在血糖降低或胰岛素敏感性方面的差异。
与此前数据一致的是，从治疗后4天开始，在脂肪营养不良小鼠中，相对于对照单克隆抗体施用，H4H17319P2显著促进体重减轻(图17C)。与对照单克隆抗体相比，在Tg小鼠中，H4H17319P2减少累积食物摄入量(图17C)。有趣的是，虽然瘦蛋白降低了Tg小鼠中的体重和食物摄入量，但是与H4H17319P2治疗所观察相比，它导致的体重减轻更少(图17C)。
在脂肪营养不良小鼠中，与瘦蛋白相比，H4H17319P2在减少血浆脂质和解决肝肿大方面具有更好的有益效果。在第13天的血浆化学分析显示，与对照单克隆抗体相比，在Tg小鼠中，H4H17319P2而非瘦蛋白降低血浆甘油三酯和胆固醇水平(图17D)。在Tg小鼠中，与对照单克隆抗体施用相比，H4H17319P2治疗的其他脂质无显著变化。在Tg小鼠中，与对照抗体治疗相比，H4H17319P2还降低了肝脏质量并且解决了肝性脂肪变性(图17E)。虽然在瘦蛋白治疗的小鼠中这些作用类似，但是使用H4H17319P2观察到的肝脏质量减少更多(图17E)。肝脏质量通过H4H17319P2而不是瘦蛋白治疗归一化，并且类似于接受对照单克隆抗体的非Tg小鼠中的肝脏质量(图17E)。
实施例19：H4H17319P2在瘦小鼠以及正常和高体脂肪猴中减轻体重和肥胖倾向
体外结合和功能测定实验表明，H4H17319P2不竞争瘦蛋白结合，并且在瘦蛋白存在下比单独的瘦蛋白诱导的LEPR活化更多。因此，确定了H4H17319P2是否可以在正常体重体稳态的情况下引起体重降低。在第0天，以3或10mg/kg对饲料喂食的雄性Leprhu/hu小鼠施用单剂量对照单克隆抗体(10mg/kg，皮下)或H4H17319P2。在两种剂量水平下用H4H17319P2处理后，在第1天和第2天后，观察到与对照单克隆抗体相比，体重显著下降(图18A)。因此，相对于对照单克隆抗体施用，两个剂量水平的H4H17319P2均减少了食物摄入量(图18A)。体重变化与脂肪质量减少相关联，但是与瘦体质量无关(图18B)。在两个剂量水平下，H4H17319P2治疗均导致-32％的脂肪质量减少，而对照单克隆抗体施用则导致脂肪质量的最小变化为-2％(图18B)。值得注意的是，在对照单克隆抗体和H4H17319P2治疗之间，未观察到瘦体质量的显著差异(图18B)。虽然H4H17319P2的两个剂量水平均导致相似的体重和脂肪质量变化幅度，但是作用的持续时间有所不同，这可能反映了药代动力学的差异(图18A和18B)。
然后，评估了H4H17319P2治疗对促进非人灵长类动物体重降低的作用。首先，确定H4H17319P2对瘦食蟹猴体重的作用。猴每周接受3mg/kg或10mg/kg对照溶液H4H17319P2一次，持续13周。与接受对照溶液的猴相比，H4H17319P2治疗导致体重以剂量依赖性降低(图18C)。在13周的研究后，施用对照溶液的猴的体重增加了其初始体重的9.7±0.9％，而3和10mg/kg H4H17319P2治疗则分别地导致的体重变化最小为0.3±1.6％，体重减轻为-6.0±1.6％(图18C)。
由于H4H17319P2剂量依赖性地降低了瘦猴的体重，因此在高体脂肪食蟹猴中测试了H4H17319P2治疗对体重和身体组成的作用。动物每周接受30mg/kg对照溶液或LEPR激动剂抗体一次，持续2周。与对照溶液注射相比，H4H17319P2降低了体重。在研究结束时(第56天)，接受两剂H4H17319P2的猴的体重比基线降低3.6±1.9％，而接受对照溶液的猴的体重增加6.4±1.5％。平行地，与对照溶液施用相比，H4H17319P2处理减少了脂肪质量，但是未减少瘦体质量，如通过双能X射线吸收测定法(DEXA)所定量(图18D)。到研究结束时，接受对照溶液的猴的肥胖倾向增加了28.0±1.5％。相比之下，用LEPR激动剂H4H17319P2治疗的猴的肥胖倾向显著下降13.7±6.4％(图18D)。总之，这些数据表明，H4H17319P2抗体通过正常体重Leprhu/hu小鼠的肥胖倾向的选择性丧失来促进体重降低，并且二者都倾向于高体脂肪非人灵长类动物。
实施例20：在人类中使用抗LEPR抗体进行双盲研究
肥胖影响全世界13％的人，是2型糖尿病、心血管疾病、各种癌症和骨科疾病发展的风险因素。在西欧国家，超过20％的个体肥胖(Ng等人,Lancet.2014；384:766-781)，而在美国，肥胖的患病率现已超过35％(Flegal等人,JAMA.American MedicalAssociation.2016；315(21):2284-2291)。饮食和运动习惯对某些人有效，但是通常会导致体重适度降低，而大多数人仍然肥胖(定义为身体质量指数[BMI]≥30kg/m2)或超重(定义为BMI等于25至<30kg/m2)。
目前的减肥药物也对体重具有适度作用，和/或安全性/耐受性较差，这会导致付费者、医生和患者对这些干预措施的使用受到限制(Zhang等人,Obes Sci Pract.2016；2(2):104-114)。目前的护理药物治疗标准，诸如利拉鲁肽、奥利司他、盐酸纳曲酮/盐酸安非他酮、芬特明/托吡酯和盐酸氯卡色林可使体重平均比基线降低约3％至10％。通常，体重减轻平台期和疗法会在一年内停止(Sjostrom等人,Lancet.1998；352(9123):167–72)(Smith等人,N.Engl.J.Med.2010；363(3):245–56)。减肥手术仅适用于最严重的肥胖患者(BMI≥40kg/m2或BMI≥35kg/m2，患有合并症)，美国每年少于200,000例(美国代谢和减肥手术学会(American Society for Metabolic and Bariatric Surgery))以及全欧洲每年少于150,000例(Angrisani等人,Obes Surg.2017,27:2279-2289)。对于治疗和预防肥胖和与肥胖相关代谢并发症的安全有效的疗法，医疗上存在极大的需求缺口。
瘦蛋白是一种循环脂肪源性激素，与下丘脑中的瘦蛋白受体(LEPR)结合并调节食物摄入量、能量消耗和葡萄糖/脂质代谢的控制(Allison等人,J Endocrinol 2014,223(1):T25-35)。由于瘦蛋白(LEP)基因中超罕见的纯合子功能突变或由于LEPR中的纯合子突变而导致的瘦蛋白信号传导缺陷，原发性瘦蛋白缺乏的个体会出现严重的肥胖、糖尿病、易感染性和不孕(Montague等人,Nature 1997,387(6636):903-908)(Clement等人,Nature1998,392(6674):398-401)。对由于瘦蛋白功能突变而导致的单基因型肥胖儿童和成年肥胖患者进行重组人瘦蛋白施用可导致体重显著降低并改善代谢并发症(Farooqi等人,N Engl Jo Med 1999,341(12):879-884)(Licinio等人,Proc Nat Acad Sci 2004,101(13):4531-4536)。
继发性瘦蛋白缺乏也发生在脂肪营养不良的罕见疾病中，这是由从身体各个部位产生的产生瘦蛋白的脂肪组织的遗传或获得性丧失引起的。
患有全身和局部脂肪营养不良的患者会出现不同程度的糖尿病、严重胰岛素抵抗、高甘油三酯血症和脂肪肝(Brown等人,J Clin Endocrinol Metab.2016；101(12):4500-4511)。每天皮下递送的重组人瘦蛋白已被证明能减少全身脂肪营养不良患者的血红蛋白A1c(HbA1c)、葡萄糖、甘油三酯和肝脂肪变性(Oral等人,N Engl J Med.2002；346(8):570-578)(Ebihara等人,J Clin Endocrinol Metab 2007,92(2):532-541)。大多数全身脂肪营养不良患者的血清瘦蛋白水平<4ng/mL，子组分析表明，在瘦蛋白水平＜4ng/mL的全身和局部脂肪营养不良患者中，瘦蛋白治疗的HbA1c和甘油三酯(TG)降低更多(Brown等人,JClin Endocrinol Metab.2016；101(12):4500-4511)(FDA咨询委员会会议2013(DAAdvisory Committee Meeting 2013))。
美曲普汀(重组甲硫氨酰瘦蛋白；
Figure BDA0002715660290000701
)目前已在美国通过风险评估和缓解策略(Risk Evaluation and Mitigation Strategies,REMS)计划批准用于治疗全身先天性和获得性脂肪营养不良患者的瘦蛋白缺乏的并发症，并且在日本也被批准用于治疗脂肪营养不良的所有亚型。需要每日给予美曲普汀的剂量，不良反应包括免疫原性风险，约85％的患者产生结合抗体，约9％的开发的中和抗体与内源性瘦蛋白发生交叉反应(Chan,ClinEndocrinol.2016；85(1):137-149)。
与低瘦蛋白或瘦蛋白缺乏障碍相反，超重或肥胖的个体通常具有较高的瘦蛋白水平，BMI在30-35kg/m2范围内的受试者中，男性的中位数水平为10ng/mL，女性为24ng/mL。(Ruhl和Everhart,Am J Clin Nutr.2001；74(3):295-301)。正常BMI为20-25kg/m2的成年男性和女性的循环瘦蛋白水平的中位数水平分别为3和9ng/mL(Ruhl等人,Am J Clin Nutr2001；74(3):295-301)，男性的正常范围为1.2至9.5ng/mL，女性的范围为4.1至25ng/mL(Quest Lab参考范围)。大量研究表明，循环瘦蛋白水平与BMI和体脂肪百分比之间存在相关性(Ruhl等人,Am J Clin Nutr.2001,74(3):295-301)(Considine等人,N Engl JMed.1996,334(5):292-295)，虽然在具有相似BMI的个体中瘦蛋白水平具有高度的可变性(Buettner等人,J Endocrinol.2002；175(3):745-756)。瘦蛋白水平有昼夜变化(Gavrila等人,J Clin Endocrinol Metab.2003,88(6):2838-43)(Schoeller等人，J Clin Invest。1997，100(7)：1882-87)并且根据营养状况而波动。在正常体重和肥胖的个体中禁食24小时后，瘦蛋白水平迅速降低35-60％，并在长期禁食后继续下降(Chan等人,J ClinInvest.2003；111(9):1409-1421)(Schurgin等人,2004,J Clin Endocrinol Metab,89(11):5402-5409)(Boden等人,J Clin Endocrinol Metab.1996；81(9):3419-3423)。瘦蛋白水平在体重减轻过程中也会降低(Considine等人,N.Engl J Med,1996；334(5):292-295)(Herrick等人,J Obes.Hindawi.2016；2016(2):8375828-5)(van Dielen等人,J ClinEndocrinol Metab.2002；87(4):1708-1716)并在体重增加期间增加(Ravussin等人,CellMetab.2014；20(4):565-572)，这符合脂肪质量的变化。向肥胖受试者的重组人瘦蛋白施用导致体重减轻最少(3％PBO减去体重减轻)(Heymsfield等人,JAMA.1999；282(16):1568-1575)(Hukshorn等人,J Clin Endocrinol Metab.2000；11(12):1163-1172)(Ravussin等人,Obesity.2009；17(9):1736-1743)，这可能是由于高内源性瘦蛋白水平导致的瘦蛋白受体信号传导饱和。若干人群研究表明，可以存在瘦蛋白水平相对较低的肥胖患者的子集(Ruhl和Everhart,Am J Clin Nutr.2001；74(3):295-301)(Buettner等人,JEndocrinol.2002；175(3):745-756)，并且瘦蛋白受体可以不饱和。要解决的一个关键问题是瘦蛋白信号传导的恢复是否会降低基线瘦蛋白水平相对较低的肥胖受试者的食欲、食物摄入量和体重。
H4H17319P2是人抗LEPR抗体，可充当LEPR激动剂并以纳摩尔亲和力与人LEPR结合。在临床前研究中，H4H17319P2在存在或不存在瘦蛋白的情况下活化LEPR信号传导。每周一次施用H4H17319P2(10mg/kg皮下[SC])可改善脂肪营养不良的人源化LEPR小鼠的血糖控制、胰岛素敏感性、血脂异常、食物摄入量、体重、肝脏质量和肝性脂肪变性。H4H17319P2还可降低诱导型瘦蛋白缺乏的人源化LEPR小鼠的体重和肥胖倾向，但是不会降低饮食诱导的肥胖人源化LEPR小鼠的体重。在一项良好实验室规范(GLP)毒理学研究中，通过每周皮下(3、10、30mg/kg)或静脉内(100mg/kg)注射一次使用H4H17319P2对瘦食蟹猴进行治疗，持续13周，H4H17319P2暴露的结果是抑制体重增加或诱导体重减轻。施用H4H17319P2的猴体重下降了8.7％(与给予前体重相比，组平均值)，而同步施用安慰剂的对照动物的体重在同一时期平均增长了8.3％。在H4H17319P2治疗的动物中，观察到的体重减轻幅度似乎没有明确的剂量或暴露反应。在无剂量恢复期中，停止暴露后体重变化会发生逆转。
如上所述，H4H17319P2的施用在所有剂量水平以及通过两种施用途径均具有很好的耐受性，而没有任何不利的临床影响。在治疗期间大约30天观察到胰岛素的瞬时减少和循环绝对淋巴细胞计数(T细胞数量减少)，但在给药期结束时未观察到这些发现，并且该作用不具有剂量反应性。在治疗期间，在H4H17319P2治疗组中观察到较低的胸腺重量和胸腺皮质细胞结构减少，并且在恢复期间可完全或部分逆转。胸腺的变化和T细胞数量的瞬时减少可能与处于生长期的猴的营养摄入量减少和体重减轻相关联，在正常营养状态的成年人中可能不会观察到。
这项研究是一项首次在人类(FIH)中进行的随机、双盲、安慰剂对照的两部分研究，旨在评估健康参与者中静脉内(IV)和皮下施用的H4H17319P2剂量的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和药效动力学(PD)。A部分的目的是评估健康男性和女性受试者中单次递增静脉内和皮下剂量的安全性、耐受性、PK和PD。A部分中PK/PD、安全性和耐受性的中期分析将用于选择在B部分中评估的剂量方案。A部分中纳入的受试者不符合B部分的条件。对于B部分，超重或肥胖的新受试者将被纳入，以评估重复剂量的H4H17319P2(单剂量水平)或安慰剂12周的安全性、耐受性、PK和PD。H4H17319P2对生物标志物诸如食物摄入量、食欲、身体组成和体重的影响将在由基线瘦蛋白水平定义的4个不同队列中进行评估。
目的
这项研究的主要目的是评估H4H17319P2在健康受试者中的安全性和耐受性。该研究的次要目的是：
●表征单次和重复剂量的H4H17319P2的药代动力学(PK)特征；
●估计重复剂量的H4H17319P2对体重的影响；
●评估重复剂量的H4H17319P2对超重和肥胖受试者自由摄入能量的影响；
●评估单次和重复剂量的H4H17319P2对可溶性脂质调节蛋白(sLEPR和ANGPTL3)水平随时间推移的影响；
●评估单次和重复剂量的H4H17319P2的免疫原性。
该研究的其他探索性目的是：
1.估计单剂H4H17319P2对体重和血清/血浆血糖和血脂参数的影响
2.估计在12周内重复剂量的H4H17319P2对以下参数的影响：
●血清/血浆血糖和血脂参数
●患者报告的食欲评估会影响喂食行为(例如饥饿、满足感和饱腹感)
●双X射线吸收测定法(DXA)成像的脂肪和瘦体重总量和分布
●通过磁共振成像(MRI)定量皮下和内脏脂肪(包括肝脂肪)
●其他探索性生物标志物包括瘦蛋白、甲状腺激素(T3、T4、促甲状腺激素[TSH])、促黄体生成激素(LH)、睾酮、雌二醇、皮质醇和脂联素。
基本原理
A部分是单次递增剂量FIH设计，其中在多达7个递增单次剂量队列(最多5个静脉内和2个皮下)中，将多达88名健康受试者3:1随机分配给H4H17319P2与安慰剂，以评估单次递增剂量的H4H17319P2的安全性、耐受性和药代动力学，随访期为112天。七个递增单剂量队列将有8名受试者，在每个剂量水平上随机接受H4H17319P2或安慰剂(6个活性药物:2个安慰剂)。研究设计还包括2个其他可选队列(16个受试者随机接受H4H17319P2或安慰剂(每个队列中12个活性药物:4个安慰剂))。如果对递增剂量的队列进行的中期分析表明，协变量(例如，年龄、体重或性别)可以对PK特征有影响，则可以纳入可选的队列，以收集关于一种或多种剂量的另外数据(直至这项研究中的最大剂量30mg/kg静脉内)，以更好地估计协变量对PK的影响。
研究的A部分包括筛选期(第-21天至-2天)、基线前访视(第-1天)，其中受试者将被允许进行为期2天的住院(对于接受静脉内的受试者和安全剂量范围内的皮下剂量)或为期1天的临床住院(对于接受皮下给予的受试者)、随访期(第3天至第113天)和研究访视结束(第113天)。
安全性和耐受性的评估是A部分的主要目的，在整个研究过程中将仔细评估安全性。预期该研究中的起始剂量和最大剂量分别比毒理学研究中观察到的暴露低约10000和约20倍。在整个临床研究中，安全性评估包括生命体征、身体检查、心电图(ECG)、包括血液学/鉴别诊断的实验室检查以及不良事件(AE)的监测。体重也将被评估。在这项研究中，还将收集药效动力学指标，但根据瘦个体中的美曲普汀所观察的对体重(<1kg)的最小影响，预计在瘦/超重受试者群体中不会观察到PD标志物的有意义变化(Heymsfield,1999年)。
药效学指标包括体重、代谢参数(葡萄糖、脂质)和ANGPTL3(可以受瘦蛋白和/或胰岛素调节的潜在标志物)(Muniyappa,2017)(Nidhina Haridas,2015)。每次访视都会仔细评估体重。如果单剂量H4H17319P2治疗对瘦/超重受试者的体重具有临床意义的影响，则可以修改安全性/剂量递增决定的时间排程，并且在进行剂量递增决定之前收集其他安全性数据(例如，等待第15天安全性评估)。
B部分是单剂量水平的重复剂量研究，治疗为期12周，以评估超重/肥胖受试者的安全性、PK和H4H17319P2对体重的影响。若干群体研究表明，肥胖患者中的瘦蛋白水平相对较低(Ruhl,2001)(Buettner,2002)，并且瘦蛋白受体可能不饱和。部分B中的要解决的一个关键问题是瘦蛋白信号传导的恢复是否会降低基线瘦蛋白水平相对较低的超重或肥胖受试者的食欲、食物摄入量和体重。
因此，B部分将评估H4H17319P2对体重变化和基线瘦蛋白水平相对较低的受试者的体重、食物摄入量、代谢参数和身体组成的影响。超重或肥胖(BMI范围为25-40kg/m2)的健康受试者将被纳入4个由瘦蛋白水平预筛选定义的独特队列。将进行4个独特队列的纳入，以确保在相对较低的基线瘦蛋白水平和BMI范围内研究足够数量的受试者。通过队列的分层将在H4H17319P2与安慰剂的随机分组时进行。最多约20名受试者将被纳入4个队列中的每个中，B部分的总样品大小为最多81名受试者，如下所述。瘦蛋白水平和BMI将在预筛选访视时进行测量，以初步评估该研究和4个队列中的1个队列的资格。在筛选符合条件的受试者时将进行研究纳入。如果特定队列的纳入已达到允许的最大数，则受试者将不符合纳入资格。鉴于低瘦蛋白水平的肥胖患病率低，某些队列可能难以纳入；资助者可以选择停止特定队列的纳入。
B部分中的4个队列的定义如下：
●队列1：男性和女性受试者，预筛选BMI在28.0和40.0kg/m2之间，包括端值在内，预筛选禁食瘦蛋白水平<5ng/mL
●队列2：男性和女性受试者，预筛选BMI为25.0至<28kg/m2，而预筛选禁食瘦蛋白水平<5ng/mL
●队列3：男性受试者，预筛选BMI在28.0和40.0kg/m2之间，包括端值在内，预筛选禁食瘦蛋白水平在5.0和8.0ng/mL之间，包括端值在内
●队列4：女性受试者，预筛选BMI在28.0和40.0kg/m2之间，包括端值在内，预筛选禁食瘦蛋白水平在5.0和24.0ng/mL之间，包括端值在内
注：以上队列之一的资格基于预筛选访视时的BMI和瘦蛋白水平。如果BMI和/或瘦蛋白水平不在队列定义的范围内，则受试者将不符合纳入条件。如果预筛选BMI或瘦蛋白水平处于临界值以纳入1个或1个以上队列，则可以在预筛选窗口中重复进行一次BMI和瘦蛋白测量。对于重复测量，将使用最低瘦蛋白水平，以将其纳入其中一个队列。如果特定队列的纳入已达到允许的最大数，则受试者将不符合纳入资格。
B部分的起始将通过对A部分的可用安全性、PK和PD数据进行中期分析来触发，以为B部分选择合适的剂量、给药频率和给药方式(静脉内或皮下)。已纳入A部分的受试者将不符合参加B部分。B部分研究设计包括一个预筛选期(第-60至-14天，用于评估BMI和空腹瘦蛋白水平以及4个队列中的1个队列的资格)、一个筛选期(第-32至-14天)、由(第-29至-1天)组成的基线期、治疗期(第1至85天)和治疗后随访期(第107至191天)。受试者将被允许临床住院2天，以在基线期(预定在第-14至-1天之间)和治疗期期间的2个时间点(第29至30天和第84至85天)进行准确食欲和自由食物摄入量评估。临床住院是必要的，以在受控环境中的自由食物评估中评估精确的热量摄入，其中存在可以影响除食欲之外的食物量标准化饮食和线索最新化(例如，一天中的时间、捕食其他食物行为、部分大小等)。受试者也将在第-1天允许2天的临床住院。在治疗期间的第1天，受试者将接受第一剂量的研究药物或安慰剂，进行血液采样以进行系列PK和其他实验室测量，并在第2天过夜以完成24小时PK评估。
在治疗期间进行访视，以便每周采血一次。研究药物的剂量和频率将通过对A部分的PK数据进行中期分析来确定，可能为每4周或每2周一次(最大频率不超过每周一次)。
DXA的身体组成以及MRI对肝脏、腹部和大腿脂肪的定量将在基线、治疗快结束时和随访期间进行。在治疗期后，将在受试者停药16周后评估其安全性和PD效果。单剂量水平的重复剂量的安全性和耐受性评估(基于A部分的安全性和耐受性)将是研究B部分的主要目的。在整个研究过程中，安全性评估将包括生命体征、身体检查、ECG、实验室测试、AE监测。抗药物抗体也将被评估。此外，将在整个研究中仔细评估次要目的，以评估体重、自由食物摄入量和代谢参数诸如血糖和血脂。
B部分中的药效动力学指标包括可能受到瘦蛋白受体信号转导影响的参数的基线和治疗中评估。这些PD评估包括患者报告的食欲测量、在可控住院条件下食物摄入量的定量测量、通过DXA的身体组成和脂肪质量的精确测量、以及使用校准量表进行的体重的精确测量。此外，代谢参数诸如瘦蛋白、葡萄糖、胰岛素、稳态模型评估估计的胰岛素抵抗(HOMA-IR)、HbA1c、脂质将在基线、治疗期间和治疗结束时进行测量，以评估H4H17319P2对胰岛素敏感性和脂质代谢的作用。还将在基线和治疗后对肝脏进行MRI，以确定H4H17319P2是否对肝脂肪变性有影响。
药效动力学和生物标志物变量的基本原理
自由食物摄入量评估(仅限B部分)
假设用H4H17319P2治疗将增加下丘脑瘦蛋白受体信号传导，并在影响进食行为的神经元中具有下游作用。H4H17319P2治疗导致诱导型瘦蛋白缺乏型小鼠的食物摄入量和体重显著减少。虽然在食蟹猴的研究中未进行食物摄入量评估，但H4H17319P2治疗对体重和脂肪质量产生了显著影响。在目前的研究中，H4H17319P2对具有相对低的瘦蛋白水平的超重/肥胖受试者食物摄入量的作用将在治疗期间基线和2个时间点使用严格的定量住院自由食物摄入量评估进行，如此前所描述(Krishna,2009)(Addy,2008)。简而言之，将禁食后的受试者送入临床试验单位，并提供标准化的早餐、午餐和晚餐，以建立标准化的基线能量摄入。在禁食一夜后，将为受试者提供自由早餐、午餐和晚餐，以进行定量/能量摄入。受试者将在专门的房间内食用所有测试食物，这些房间掩盖了对时间/日时和社交线索的感知。
已知热量密度的食物将以4-5倍的过量部分提供，并且以掩盖消耗的卡路里总数的方式提供。受试者将被要求根据需要进食。在食物摄入量评估之前和之后对膳食进行称重，以定量食物摄入量，并计算摄入的卡路里。
食欲评估(仅限B部分)
瘦蛋白的食欲作用是其作用机制的核心，因此是近似的
H4H17319P2的预期作用机制评估。LEP突变或全身脂肪营养不良引起的低瘦蛋白血症患者表现出食欲不振，导致进食和肥胖。对这些个体进行美曲普汀治疗可增加饱腹感并减少食物摄入量(Farooqi,1999)(Farooqi,2007)(McDuffie,2004)。H4H17319P2对食欲的影响使用测量食欲的各个组成部分(例如，饥饿、饱腹感)的问卷(Flint,2000)(Dalton,2015)进行，所述测量将在基线和随访期间进行。
在门诊就诊期间，将在标准热量负荷之前和之后评估食欲，并在基线、治疗和随访期间每天完成一份食欲问卷。
ANGPTL3
血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)通过抑制脂蛋白脂酶来调节脂蛋白水平，诸如TG、低密度脂蛋白C(LDL-C)(Tikka的综述,2016)。ANGPTL3的水平可以通过进食、瘦蛋白和/或胰岛素来调节(Minicocci,2012)(Nidhina,2015)。脂肪营养不良患者中ANGPTL3的水平升高，并在用美曲普汀治疗后降低(Muniyappa,2017)，并且ANGPTL3的降低可以介导富含TG的脂蛋白的脂肪酶清除增加。ANGPTL3和TG水平在脂肪营养不良小鼠模型中也增加，并在用H4H17319P2治疗后恢复正常。因此，ANGPTL3可以是药效动力学标志物，在增加的瘦蛋白受体信号传导中可以降低。ANGPTL3将在A部分和B部分的若干时间点在基线和治疗后进行测量。
可溶性LEPR
瘦蛋白作为游离实体在血液中循环，也可以与sLEPR结合，sLEPR通过LEPR胞外结构域脱落产生(Sinha,1996)(Lammert,2001)。可溶性LEPR可以调节瘦蛋白的生物利用率和/或清除率(Lou,2010)。目标饱和度可以取决于sLEPR的饱和度，因此sLEPR水平可以影响线性和非线性目标介导的动力学变化。因此，在A和B部分中，将在治疗期间的基线和各个时间点(对应于抗体药代动力学的采样)测量sLEPR。
成像(仅限B部分)
DXA和MRI成像将在基线、治疗快结束时和研究结束时进行，以估算大腿/腹部区域以及肝脏脂肪含量的总体和局部脂肪分布、皮下和内脏脂肪相对于基线的变化。在一项食蟹猴的初步研究中，临床前数据表明H4H17319P2通过减少总脂肪质量来减轻体重，而对瘦体质量没有影响(通过DXA评估)。DXA已显示是临床研究中总脂肪质量和区域脂肪分布的有用的定量生物标志物。例如，在局部脂肪营养不良患者中，与正常受试者相比，使用DXA观察到局部脂肪分布的显著差异(％脂肪躯干至％脂肪腿(脂肪质量比[FMR])为1.78±0.53)(Aijluni,2017)。在减肥药诸如GLP-1激动剂(Jendle,2009)和认知疗法(Ponti,2018)的试验中，DXA还被用于定量总体和区域脂肪的变化。
磁共振成像(MRI)已显示出是通过专用脉冲序列对整个器官成像或在有限体积的组织中通过光谱法测量包括肝脏(Aijluni,2017)和肌肉(Burakiewicz,2017)在内的多个组织中脂肪含量的有效手段。MRI还显示了用于测量腹部脂体积和分布的高对比度图像(Klopfenstein,2012年)，其中2型家族性脂肪营养不良患者的内脏脂肪百分比比对照患者高2.5倍(Al-Attar,2007)。肌肉中的脂肪含量也可以通过定量MRI进行评估，如多次肌肉营养不良研究所表明，其中允许解剖学成像和脂肪含量估算的光谱学和脉冲序列在评估疾病进展方面显示出是有前景的(Burakiewicz,2017)。
在本研究中，将对腹部和大腿进行MRI，以定量基线和H4H17319P2治疗后皮下、内脏和肝脂肪的区域变化
剂量选择的基本原理
根据功效、安全性以及
脂肪营养不良和单基因肥胖的小鼠模型的临床前研究和猴毒理学研究的药代动力学数据来选择A部分的静脉内和皮下剂量。该FIH研究中的最高剂量将不超过30mg/kg，起始剂量将为约0.3mg/kg。在食蟹猴的GLP毒理学研究中，H4H17319P2每周静脉内给予最多100mg/kg 12周具有最高耐受性，未观察到不良事件水平(NOAEL)为100mg/kg。根据预计的人类H4H17319P2血清暴露量，该FIH研究中计划的最大剂量30mg/kg暴露倍数比NOAEL低二十倍。初始起始剂量为0.3mg/kg，其安全范围比GLP毒理学研究中测试的最高剂量低10,000倍以上，预计可提供超过定量限的人类H4H17319P2浓度，因此可提供有用的PK信息。
B部分剂量选择的目标包括确保广泛的暴露量以评估耐受性并促进暴露-反应关系的表征，以及阐明能够表征线性和非线性药代动力学的药代动力学特征。另外，剂量选择应确保可能引起关注的推定PD标志物阈值之上和之下的暴露(例如，sLEPR饱和)。B部分的剂量将基于临时安全性、A部分的PK和PK/PD数据。剂量水平、给药间隔和给药途径(静脉内或皮下)的选择将基于安全性、药代动力学和(如果有的话)PK/PD、A部分的数据以及动物的临床前研究。B部分中的剂量不会超过A部分中评估的剂量，并且可能每4周或每2周施用一次，但不会比每周一次更频繁地施用。
剂量方案不超过毒理学研究中观察到的暴露量。
标准
最多169名受试者(A部分最多88名，B部分最多81名)被纳入目标群体：目标群体将是A部分的健康瘦或超重男性和女性，B部分的健康超重或肥胖男性和女性(基线瘦蛋白水平各不相同)。
关键纳入标准
受试者在筛选时必须满足以下标准，才有资格被纳入研究的A部分：
1.18至50岁(含)的男性和女性
2.身体质量指数(BMI)为18.5至<30.0kg/m2
3.根据病史、身体检查、筛选时和/或在施用研究药物初始剂量之前进行的实验室安全性测试，研究者将受试者判断为身体健康、没有重大合并症
4.愿意并且能够遵守门诊就诊，研究相关程序并遵守饮食指导
5.愿意在整个研究过程中保持日常饮食和运动习惯
6.能够并愿意提供签署的知情同意书
受试者必须满足以下所有筛选标准(除BMI和瘦蛋白资格(在预筛选时确定)之外)才有资格纳入研究的B部分：
1.18至65岁(含)的男性和女性
2.预筛选就诊时具有身体质量指数(BMI)和禁食瘦蛋白水平，如以下队列之一所定义。如果特定队列的纳入已达到允许的最大数，则受试者将不符合纳入资格。
3.根据病史、身体检查、筛选时和/或在施用研究药物初始剂量之前进行的实验室安全性测试，研究者将受试者判断为没有重大合并症受试者可能有轻度高脂血症和/或轻度高血压病史，但在筛选前至少2个月应服用稳定剂量的降脂药或降压药
4.愿意并且能够遵守门诊就诊，研究相关程序并遵守饮食指导
5.愿意在整个研究过程中保持日常饮食和运动习惯
6.能够并愿意提供签署的知情同意书
排除标准
筛选时符合以下任何标准的受试者将被排除在研究的A部分之外：
1.具有临床意义的心血管病史(例如，高血压、心肌梗塞、中风、周围血管疾病、心力衰竭、心律不齐的病史)、呼吸道、肝、肾、胃肠道、内分泌(例如，高脂血症)，血液病或神经病史。
2.1型或2型糖尿病或糖尿病前期病史，或筛选时空腹血糖>100mg/dL，或筛选时HbA1c>5.7％。
3.空腹LDL-C≥130mg/dL，TG>250mg/dL
4.筛选时具有临床意义的异常全血细胞计数、临床化学、尿液分析或尿液药物筛选测试。实验室结果的微小偏差是允许的。注：在筛选期间，可以重复进行任何异常的实验室检查结果一次(例如，肌酸磷酸激酶(CPK)在正常值(ULN)的3倍以内，并且由于严格的体育活动而引起的可疑原因)。
筛选时符合以下任何标准的受试者将被排除在研究的B部分之外：
1.具有临床意义的心血管病史(例如，中度-重度高血压、心肌梗塞、中风、周围血管疾病、心力衰竭、心律不齐的病史)、呼吸道、肝、肾、胃肠道、内分泌，血液病或神经病史。
2.1型或2型糖尿病或病史，或筛选时FBG>126mg/dL，或筛选时HbA1c>6.5％。允许诊断为“糖尿病前期”。
3.空腹LDL-C>160或TG>500mg/dL
4.除上述轻度脂质或血糖异常之外，筛选时具有临床意义的异常全血细胞计数、临床化学、尿液分析或尿液药物筛选测试。实验室结果的微小偏差是允许的。注：在筛选期间，可以重复进行任何异常的实验室检查结果一次(例如，CPK在ULN的3倍以内，并且由于严格的体育活动而引起的可疑原因)。
5.饮食习惯受到限制(例如，素食主义者或素食者)、对食物摄入量评估中使用的特定食物类别的厌恶，或会干扰或混淆对食物摄入量、食欲或食物控制评估的解释的饮食行为
筛选时符合以下任何标准的受试者将被排除在研究的A部分和B部分之外：
1.筛选访视后60天内因任何原因住院(即>24小时)
2.研究者认为，受试者具有任何身体检查发现和/或任何疾病病史，可能会混淆研究结果或因其参与研究而给受试者带来另外的风险。
3.下丘脑闭经或脂肪营养不良的病史。
4.在筛选之前的过去3个月中，体重变化超过5％。
5.肥胖减肥手术的既往史(例如，套管胃切除术、胃旁路手术、绑扎带等)。
6.在过去的6个月中，进行了减肥(例如，抽脂)或塑身的程序。
7.在过去3个月内使用减肥的药物(非处方药[OTC]或处方药)治疗(例如，氯卡色林、芬特明/托吡酯、盐酸那曲酮/盐酸安非他酮、利拉鲁肽)。
8.重大精神疾病、进食障碍(例如，贪食症、厌食症)的病史。
9.目前的吸烟者或以前的吸烟者(香烟或电子烟)在筛选前3个月内停止吸烟。
10.筛选访视前一年内有消遣性药物(包括大麻)或酒精滥用(每天>2杯)的病史。
11.筛选时有乙肝感染史或乙肝表面抗原阳性(HbsAg+)。
12.筛选时有HIV感染或HIV血清阳性的病史。
13.筛选时有丙肝感染史或丙肝抗体阳性测试结果。
14.在过去的10年中，除皮肤的基底细胞或鳞状上皮癌或子宫颈或肛门原位癌之外，任何恶性肿瘤均已切除，但3年内无转移性疾病的证据。
15.活动性或潜伏性结核病(TB)的病史。注：潜在结核病史定义为结核菌素皮肤试验阳性(TST；定义为皮肤硬结>5mm，与卡介苗(BCG)或其他疫苗接种史无关)，或阳性(不是不确定的)
Figure BDA0002715660290000791
TB金测试。
16.对于A部分：在筛选和基线访视时进行坐位或仰卧位血压读数的至少2次测定(>140/90或<90/60)和静息脉搏(<45或>125)或体位性改变(收缩压下降>20mmHg和/或舒张压下降>10mmHg)。对于B部分：在筛选时进行坐位或仰卧位血压读数的至少2次测定(>150/90或<90/50)和静息脉搏(<45或>125)或体位性改变(收缩压下降>20mmHg和/或舒张压下降>10mmHg)。如果血压读数升高，可以重复血压读数或对受试者再筛选一次。
17.筛选时受试者的肾小球滤过率估计值(使用MDRD方程)<60mL/min/1.73m2。
18.临床显著异常ECG或至少在2次测定中确认异常间隔(男性QTcF>450毫秒，女性>470毫秒；PR<120毫秒或>220毫秒；QRS>100毫秒)。
19.对强力霉素(或四环素类药物)或制剂的其他组分具有超敏性。
20.急性过敏和/或对蛋白质治疗过敏的病史。
21.严重过敏史(包括乳胶或过敏反应或过敏)，研究者认为这可能代表该受试者的严重风险。
22.参与任何评估另一种研究药物(包括生物制剂)或疗法的临床研究，该研究应在90天内或研究生物学药物的至少5个半衰期(以较长的时间为准)进行研究，或对于其他研究产物至少4周或者对于免疫治疗在筛选访视之前6个月。
23.孕妇或哺乳期妇女。
24.具有生育能力*的妇女，在首次剂量/开始首次治疗之前，在研究期间以及在最后一次剂量后至少4个月内不愿进行高效避孕的妇女。高效避孕措施包括：
a.稳定使用与筛选前2个或多个月经周期引发的排卵抑制相关联的组合(含雌激素和孕激素)激素避孕药(口服、阴道内、透皮)或仅使用孕激素的激素避孕药(口服、注射用、植入式)
b.宫内节育器(IUD)；宫内激素释放系统(IUS)
c.双侧输卵管结扎术
d.输精管配偶体
e.和或性禁欲
Figure BDA0002715660290000801
*绝经后妇女必须闭经至少12个月，才能不考虑生育潜力。有子宫切除术或输卵管结扎术记录的妇女无需进行孕检和避孕。
Figure BDA0002715660290000802
仅在定义为与研究治疗相关的整个风险期间避免异性性交时，性禁欲才被认为是一种高效的方法。
Figure BDA0002715660290000803
周期性禁欲(日历、排卵、排卵后方法)、戒断(性交中断)、仅使用杀精剂和哺乳性闭经方法(LAM)是不可接受的避孕方法。女用避孕套和男用避孕套不应一起使用。
25.在研究药物治疗期间和最后一次研究药物给药后4个月内不愿意使用以下形式的医学可接受的节育措施的性活跃男性：输精管结扎术，对手术成功进行医学评估，或持续使用避孕套。在研究期间以及最后一剂研究药物使用后的4个月内，禁止捐献精子。
26.除允许的药物或营养补充物中列出的药物之外，还应使用伴随药物。
研究队列和剂量递增的描述
计划包括的七个连续的递增剂量队列为0.3mg/kg剂量，直至最大剂量30mg/kg。每个剂量组将由8名受试者组成：6名随机接受H4H17319P2，而2名随机接受安慰剂。为了优化安全性，将队列1(0.3mg/kg静脉内)、队列2(1mg/kg静脉内)、队列3(3mg/kg静脉内)、队列4(300mg皮下)和队列5(10mg/kg静脉内)中的各8名受试者(6名活性药物；2名安慰剂)分为2个区块。将2名受试者(1名活性药物：1名安慰剂)作为安全前哨组纳入区块1，其余6名受试者(5名活性药物：1名安慰剂)纳入区块2。区块1的受试者将首先被纳入，并在同一天给药。只有在区块1中的两个受试者均已安全完成至少24小时安全评估后，研究者和资助医疗监管者对安全性数据进行审查并获得研究者和资助医疗监管者的同意(可以开始将受试者纳入区块2中)后，才开始纳入区块2中的受试者。区块2中的所有受试者可以在同一天给药。
队列6(600mg皮下)和队列7(30mg/kg静脉内)中的各8名受试者(6名活性药物：2名安慰剂)将被分为2个区块，每个区块4名受试者(3名活性药物：1名安慰剂)。每个区块的剂量将在不同的日期执行。递增剂量队列将按以下方式纳入：
□队列1H4H17319P2，0.3mg/kg静脉内，单剂量
□队列2H4H17319P2，1mg/kg静脉内，单剂量
□队列3H4H17319P2，3mg/kg静脉内，单剂量
□队列4H4H17319P2，300mg皮下，单剂量
□队列5H4H17319P2，10mg/kg静脉内，单剂量
□队列6H4H17319P2，600mg皮下，单剂量
□队列7H4H17319P2，标称剂量30mg/kg静脉内，单剂量
如果PK变异性大于预期且需要其他受试者检查特定协变量(诸如年龄、体重、性别)的作用，则将纳入可选队列。
□队列8H4H17319P2，标称剂量30mg/kg静脉内，单剂量
●队列9H4H17319P2，标称剂量30mg/kg静脉内，单剂量，最多30mg/kg静脉内的最大剂量已分配给队列8和队列9，但是可以根据最新的PK数据施用更低的剂量。
剂量递增：安全性/剂量递增组将包括研究者、医学/研究主管、研究生物统计学家和风险管理负责人。研究者和其他研究现场人员、包括医疗监管者在内的资助研究小组也不知道所施用的治疗。可以有资助者的非盲个体，这些非盲个体将不是资助研究小组的一部分。
一旦前一个队列中的所有受试者均已完成第8天安全性评估并且在安全性/剂量递增小组会议上审查了盲的安全性数据，就可以将剂量递增至队列2(1mg/kg)。
一旦前一个队列中的所有受试者均已完成第8天安全性评估并且在安全性/剂量递增小组会议上审查了盲的安全性数据，就可以将剂量递增至队列3(3mg/kg静脉内)和队列4(300mg皮下)。队列4中的给药可以与队列3中的给药平行进行。
一旦队列3中的所有受试者均已完成第8天安全性评估并且在安全性/剂量递增小组会议上审查了盲的安全性数据，就可以将剂量递增至队列5(10mg/kg静脉内)。
一旦队列4中的所有受试者均已完成第8天安全性评估并且在安全性/剂量递增小组会议上审查了盲的安全性数据，就可以将剂量递增至与队列5平行的队列6(600mg皮下)，但只进行一次。
30mg/kg静脉内的标称剂量已分配给队列7，但是可以根据最新的PK数据施用更低的剂量。在剂量递增至30mg/kg静脉内之前，队列5中的所有受试者均已完成第8天安全性评估并且在安全性/剂量递增小组会议上审查了盲的安全性数据。如果对体重的药效动力学作用大于预期，则可以修改安全性/剂量递增决定的时间排程，并收集其他安全性数据。例如，如果在8天时至少6名受试者中的3名体重减轻>3％，则观察期将延长至第15天，然后再做出任何剂量递增决定；如果在6名受试者中至少有3名受试者在2周内体重进一步降低至>5％，则观察期将延长至4周，然后再决定剂量递增。
表19：研究的A部分和B部分中的给药队列
Figure BDA0002715660290000821
Figure BDA0002715660290000831
研究设计
这项是一项健康参与者中的单个和重复剂量的H4H17319P2的安全性、耐受性、PK和药效动力学(PD)的I期、随机、双盲、安慰剂对照的2部分研究。在A部分中，健康瘦或超重受试者将被纳入评估单次递增静脉内(IV)和皮下(SC)剂量的安全性、耐受性、PK和PD。来自A部分的中期PK和安全性信息将用于选择B部分的剂量水平、频率和给药方式(静脉内或皮下)。在B部分中，身体质量指数(BMI)为25-40kg/m2的超重/肥胖受试者将被纳入评估由基线瘦蛋白水平定义的4个不同队列中的重复剂量的H4H17319P2的安全性、耐受性、PK和PD。
在A部分，最多88名受试者将被随机分配至多达7个连续递增单剂量(最多5个静脉内和2个皮下)队列(队列1、2、3、4、5、6、7)和2个可选的单剂量队列(队列8和9)。七7个连续单剂量队列将有8名受试者，在每个剂量水平上随机接受H4H17319P2或安慰剂(6个活性药物:2个安慰剂)。2个另外任选的单剂量队列将有最多16名受试者，随机接受H4H17319P2或安慰剂(12个活性药物:4个安慰剂)。以单次递增方式评估多达5个单个静脉内剂量水平(0.3、1.0、3、10和30mg/kg)和2个皮下剂量(300和600mg)。是否递增剂量的决定将基于对安全性参数和AE的分析。随时间推移的抗体浓度的中期分析、探索性PD措施以及剂量队列之间的PK/PD关系(如果适用)也可以有助于剂量递增决定。根据PK特征变异性的中期分析，决定是否以最大30mg/kg剂量水平纳入2个任选队列。
可选的队列：如果在受试者中观察到大于预期的PK变异性，则将纳入队列8和队列9，还需要其他受试者以了解特定协变量对PK特征的影响。可以纳入由纳入/排除标准(诸如预先指定的男性、女性、年龄范围、体重或特定BMI切割点)定义的群体中特定子组的受试者。30mg/kg静脉内的标称剂量已分配给队列8和9，但是可以根据最新的PK数据施用更低的剂量。队列8和9中的每个将分别纳入16名受试者(4名受试者被分配接受安慰剂，12名受试者接受H4H17319P2)。在剂量递增至30mg/kg静脉内之前，队列5中的所有受试者均已完成第8天安全性评估并且在安全性/剂量递增小组会议上审查了盲的安全性数据。A部分研究设计包括筛选期(第-21天至-2天)、基线前访视(第-1天)，其中受试者将被允许临床住院2夜(对于接受静脉内的受试者和接收安全剂量范围内的皮下剂量的受试者)或为期1天的临床住院(对于接受皮下给予的其他受试者)、随访期(第3天至第113天)和研究访视结束(第113天)。在整个研究过程中，安全性评估包括生命体征、体重、身体检查、ECG、实验室检查以及对AE、PK指标和各种PD评估的监测。
在B部分中，将最多81名BMI 25-40kg/m2的受试者纳入基线瘦蛋白水平定义的4个队列(每个队列最多约20名)中，并随机分组(3:1或6:1H4H17319P2与安慰剂，取决于队列分配)至安慰剂对照、双盲、12周重复剂量研究。剂量、给药间隔和给药方式(静脉内与皮下)的选择将基于A部分的安全性、PK和PK/PD(如果有的话)。将使用来自A部分的H4H17319P2的PK特征来预测重复施用后血清中的浓度。
该研究包括预筛选期(第-60至-14天)、筛选期(第-32至-14天)、基线期(第-29至-1天)以通过DXA和MRI获取体重、身体组成的基线测量值，以及在临床住院时收集空腹瘦蛋白、体重、食欲评估和自由食物摄入评估的基线测量值。受试者将在第-1天允许2天的临床住院。在第1天，受试者将接受第一剂研究药物或安慰剂，进行系列血液采样以进行药代动力学测量，并在出院后的第2天过夜24小时以进行PK采样。研究药物可以每4周或每2周施用一次，但在治疗期间每周给药的频率不超过每周一次(给药频率将通过对A部分的PK数据的中期分析来确定)。
治疗期间的访视将持续到每周一次，以收集精确和重复的体重和血清代谢参数(葡萄糖、胰岛素、HOMA-IR、脂质)测量值。食欲和自由食物摄入量的随访评估将在临床住院第4周和治疗期末(12周)进行。受试者还将在基线、治疗和随访期间完成每日食欲问卷。还将进行DXA和MRI成像的随访评估。在治疗期后，将在停药16周后对受试者进行访视。在整个研究过程中，安全性评估将包括生命体征、身体检查、ECG、实验室测试和AE监测。在整个研究过程中，还将测量药物浓度、靶标接合标志物(sLEPR)和探索性生物标志物。
研究持续时间
受试者的研究A部分的持续时间为大约19周，包括筛选期。受试者的研究B部分的持续时间为大约35周，包括预筛选/筛选/基线期。研究的结束定义为B部分中最后一名受试者的最后一次访视。
治疗剂量/途径/时间表
H4H17319P2将以冻干粉末形式提供于无菌、一次性使用20mL玻璃小瓶中，用于静脉内或皮下施用。匹配H4H17319P2的安慰剂以相同的制剂制备，无需添加蛋白质。对于A部分，将通过静脉内和皮下施用单剂量。对于B部分，剂量、给药间隔和给药方式(静脉内与皮下)的选择将基于安全性、PK(如果有的话)、PK/PD、来自A部分的数据。
程序和评估
安全性将通过TEAE、生命体征、身体检查、心电图(ECG)和实验室测试的监测/评估来评估。为了评估药代动力学，将在预先指定的时间点收集致密和稀疏样品以测量血清中的H4H17319P2浓度。药效动力学将通过测量体重和腰围、食物摄入量和食欲评估以及使用DXA和MRI的身体组成来评估。
主要结局指标：
1.治疗中出现的不良事件(TEAE)的数量[时间帧：第12周(治疗期结束)]
次要结局指标：
1.随时间推移的血清中的H4H17319P2的浓度[时间帧：直至第27周(研究结束)]
2.超重或肥胖受试者的体重变化百分比[时间帧：基线至第12周]
3.超重或肥胖受试者的体重绝对变化[时间帧：基线至第12周]
4.超重或肥胖受试者响应于标准化饮食的卡路里摄入量从基线的变化[时间帧：基线至第12周]
5.单剂量H4H17319P2后，脂质调节蛋白水平随时间推移的变化[时间帧：直至第16周]
6.重复剂量H4H17319P2后，脂质调节蛋白水平随时间推移的变化[时间帧：直至第27周]
7.单剂量H4H17319P2后，H4H17319P2抗药物抗体随时间推移的发病率[时间帧：直至第16周]
8.重复剂量H4H17319P2后，H4H17319P2抗药物抗体随时间推移的发病率[时间帧：直至第27周]
药代动力学变量
除时间之外，还将测量H4H17319P2的总浓度。药代动力学参数可以包括但不限于以下各项：
●AUC最后–曲线下面积(AUC)，从时间零到最后一次正浓度的时间计算
●AUC0-τ–在长度τ的给予间隔内计算的AUC
●Cmax–峰值浓度
●tmax–达到Cmax的时间
●CL–清除率
●C谷–谷浓度
注意，对于B部分，这些(和其他)参数的选择取决于最终选择的采样时间表以及所获得的结果数据。
抗药物抗体变量
抗药物抗体(ADA)变量包括如下的ADA反应和滴定度：
●治疗中出现的反应，定义为基线结果为负时任何给予后正的ADA测定法反应
●治疗加强的ADA反应，定义为当ADA测定法中的基线为正时，任何给予后正ADA测定法反应均超过基线滴定度水平9倍或更高
●滴定度值
●滴定度种类
-低(滴定度<1,000)
-中(1,000≤滴定度≤10,000)
-高(滴定度>10,000)
药效动力学和其他生物标志物变量
药效动力学和生物标志物变量是：体重、自由食物摄入评估、食欲评估、血清/血浆血糖(例如，空腹血糖、胰岛素、HbA1c)和脂质参数(例如，总胆固醇、TG、LDL-C、HDL-C)、总体脂肪质量和瘦体质量的DXA测量以及身体位置、区域皮下和内脏脂肪、ANGPTL3、瘦蛋白和sLEPR的MRI定量。其他探索性生物标志物将包括H4H17319P2对甲状腺激素(T3、T4、TSH)、促黄体生成激素(LH)、睾酮、雌二醇、皮质醇和脂联素的影响。
功效程序
在筛选期间以及整个研究期间，将在指定的研究访视时评估体重。在进行其他研究评估之前，将使用高精度校准数字秤一式三份评估体重。体重评估之前，受试者应排空(排空膀胱)。体重评估期间，受试者只能穿着内衣，不能穿鞋。体重将被记录到最近的0.1kg。
所有人体测量应一式三份进行，最终报告值为平均值。在干燥、完整的皮肤区域，应从身体右侧获取三头肌、肩胛下肌、上轨肌和大腿皮褶厚度，除非另有要求，否则应避免畸形或四肢缺失。为了测量腰围，指示受试者笔直站立并放松，两臂放在一臂，双脚并拢指向前方。髂嵴和最低肋边缘可通过触诊来识别，并用笔标记覆盖这些区域的皮肤。然后使用卷尺确定这些皮肤标记之间的中点并用笔标记。然后在平缓呼气结束时用卷尺测量中点标记处的腰围。在吸气结束时使用校准的测距仪在完全直立站立位置测量身高，并记录到最近的0.1cm。对于B部分和A部分中的任选的队列，身高将分别在预筛选或筛选访视时作为单次测量来测量。身体质量指数将使用体重的平均值(千克)除以身高(米)的平方来计算。在A部分(除任选队列之外)中，将使用平均身高进行计算。在B部分和A部分中的任选队列中，每次访视时使用身高(分别在预筛选或筛选时进行单次测量)和体重(3次测定的平均值)来计算BMI。
评估自由食物摄入量。如果受试者的饮食行为异常或对食物摄入评估中使用的食物有厌恶，则将其排除在筛选之外。用自由食物摄入量评估能量摄入(早餐+午餐+晚餐)将在B部分基线、治疗4周后、在治疗期(12周)结束进行定量。在进行食物评估时，将要求受试者在门诊就诊前1天避免剧烈运动和饮酒。
受试者将以禁食状态进入诊所，并于早晨到达诊所。在4周住院患者食物摄入量评估中，受试者将接受分配的治疗(研究药物或安慰剂)。然后为他们提供固定热量和大量营养素的标准化早餐、午餐和晚餐，然后禁食过夜。第二天，他们将被提供自由早餐、自由午餐和自由晚餐。在自由试验餐期间，受试者将被提供的食物的量大大超过典型部分(4-5倍)。营养学家将把膳食设计为具有标准化大量营养素含量和已知的卡路里密度。在测试餐前和测试餐后，将使用专用的校准秤秘密称量所有餐食和食物，以准确评估所食用的食物量在0.1g以内。受试者将在没有时钟、收音机、手机和电视的私人专用房间内享用所有餐食，以消除可能影响食物摄入量的时间或社交线索。膳食将以某种方式掩盖所消耗的食物数量，以使食物摄入量不会因过量摄入(诸如可用食物量)的视觉/社交线索而受到影响。受试者将被要求根据需要进食，并且在测试餐期间他们将保持不受干扰，并且被禁止从事休闲活动，诸如阅读、听音乐、打电话或看视频。受试者充分饱食后将被允许离开测试餐室，如果他们在1小时后仍未离开餐室，则进食将由研究人员终止。
临床食欲评估和每日食欲问卷(仅限B部分)
将通过调查问题(Flint,2000)评估临床胃口，并指示受试者以视觉模拟量表记录他们的答案。受试者将在临床住院第一天的标准化的晚餐前后约30分钟内完成临床食欲评估，以及在基线、治疗和随访期间的每日食欲问卷。注意确保研究受试者不会与其他研究参与者共有调查结果。在研究B部分的临床食欲评估和每日食欲问卷中使用的问题的详细信息将在研究手册中进行描述，并且这些问题(最终定稿时)将在B部分开始之前提交给伦理委员会审核。
通过DXA测量身体组成(仅限B部分)
DXA广泛用于临床全身骨密度测定。总检查时间很短(约6至7分钟)，电离辐射剂量极小，约为0.1mGy。双X射线吸收测定法能够提供瘦体重(LBM)和身体组成的估计值，并且已在临床研究中用于LBM测量。纵向研究证实了DXA在LBM测量中的临床有效性，所述研究表明LBM的变化与身体机能的下降之间存在显著相关性(Goodpaster,2006)。在基线期间、治疗访视结束和研究结束时，将进行X射线吸收测定法两次。关于DXA扫描的个体受试者准备，对于在整个研究中进行扫描，应努力保持一致的水分、一致的进食量、一致的咖啡因摄入量、一致的活动(扫描前24小时无剧烈活动)、一致的衣服和一致的在DXA桌上的受试者定位。同样，在整个研究过程中，对于任何给定的受试者，应在一天的同一常规时间获取DXA扫描。
通过MRI测量身体组成(仅限B部分)
磁共振成像用于测量肝脏脂肪含量。建议使用多回波梯度-回波序列来获取轴向图像以覆盖整个肝脏。回波时间应使得在连续的回波时间(TE)、脂肪和水在异相和同相之间交替。为了最大程度地减少运动伪影，应在短暂的屏气时间期内获取这些伪影。完整的采集需要3至5分钟。扫描大腿上的脂肪含量需要对受试者进行仔细定位，并使用成形的泡沫支撑和定位器进行固定。大腿MRI完整采集可以需要最多10分钟。可以要求受试者在早晨扫描之前禁食10至12小时。
事件和脚注的研究时间表
图25、26和27中按时间期和访视提供了研究评估和程序，并具有以下脚注：
1.非前哨皮下给予组的临床出院，但中心可以选择让受试者过夜在第二天出院。
2.静脉内给药和安全前哨皮下给予的临床出院
3.在A部分的IV队列的第1天，还应在给予前、30分钟、研究药物输注结束时、以及输注后1小时、2小时、4小时和8小时测量生命体征并监测AE。在A部分的皮下队列的第1天，还应在给予前、注射后30分钟、以及注射后1小时、2小时、4小时和8小时，测量生命体征并监测AE。对于在第1天在B部分进行剂量施用，还应在给予前、30分钟、研究药物输注静脉内剂量结束时、以及分别在静脉内或皮下剂量输注或注射后1小时、2小时、4小时和8小时测量生命体征并监测AE。在随后的给予天数中，还应在给予前、30分钟、静脉内剂量的研究药物输注结束时、以及分别静脉内和皮下剂量的输注或注射后1小时、2小时和4小时，测量生命体征并监测AE。生命体征还包括在筛选访视(A和B部分)和第1天(仅A部分)进行体位性血压评估。对于体位评估，在受试者仰卧约10分钟、站立约1分钟后和站立约3分钟后测量血压和脉搏率。
4.禁食至少8小时后收集血液。在给予的几天中，仅给药前样品需要处于禁食状态。
5.在空腹(排空膀胱)后不穿鞋，仅穿内衣的情况下，必须使用专用的经过校准的体重秤，在空腹状态下，一式三份测量体重。
6.皮褶厚度应从以下三个区域一式三份采集：三头肌、肩胛下肌、上轨肌和大腿，以充分说明体内脂肪分布。
7.第1天药物浓度、sLEPR浓度和ANGPTL3浓度的样品收集将在输注前/注射、输注后/注射±15分钟以及输注/注射后1小时±15分钟、2小时±15分钟、4小时±15分钟、8小时±15分钟、12小时±15分钟和24小时±15分钟。sLEPR和ANGPTL3只能在测量药物浓度的时间点的子集中进行分析。
8.每次访视均可收集DNA
9.选择过夜在第二天出院。对于B部分，受试者也将在第1天前一天(第-1天)入院并过夜。第1天的程序(除了必须过夜禁食、心电图、PK测量和研究药物施用之后进行的评估)，第-1天可以进行诸如药物筛选、尿液分析和尿液妊娠试验。
10.第30天的访视必须在第29天访视后的正好1天进行。
11.第85天的访视必须在第84天访视后1天进行。
12.B部分中研究药物给予的频率将取决于A部分中获得的结果。
13.从第-29天到-14天将获得两个基线图像(DXA和MRI)。DXA和MRI可以在同一天或不同的天进行；然而，第一和第二DXA以及第一和第二MRI必须分开进行
14.访视18的DXA和MRI程序可以在访视之前最多5天或访视18后最多5天执行，但是DXA和MRI不应在研究药物给予后的24小时内执行。访视24的DXA和MRI程序最多可在访视24前7天执行。
15.对于B部分，实际样品收集时间表将取决于对A部分的PK数据的中期审查。然而由于是重复给予，因此将在其他时间点的第一剂量和谷样品之后进行密集采样。
16.在标准化晚餐前后进行临床食欲评估
17.每次指定访视时，中心将检查受试者是否完成每日食欲问卷。
18.ECG将在给予前进行。
安全性
在根据图25-27的时间点在受试者静坐或仰卧至少10分钟后，收集包括温度、血压、脉搏和呼吸速率在内的生命体征。
根据图25-27的时间点将进行充分的身体检查。如受试者的病史所示，应注意检查和评估可能存在的任何异常情况。
在需要抽血的访视期间，应在抽血之前进行心电图检查。根据图25-27的时间点进行标准12导程ECG。受试者休息至少10分钟后，应在仰卧位进行12导程ECG。研究者将对ECG进行局部解释。从心室率中记录心率，并记录PR、QRS、RR、QTcB和QTcF间隔。如果适用，任何临床上明显的异常都应记录为AE/SAE。将每个ECG追踪与筛选记录追踪进行比较分析。ECG条或报告将与来源一起保留。
将分析血液学、化学、尿液分析、药物筛选和妊娠试验样品(血清或尿液)。提供给研究中心的实验室手册中有详细的血液样品采集说明。根据图25-27，在访视时将收集用于实验室测试的样品。测试将包括：血液化学：钠、钾、氯化物、碳酸氢盐、钙、葡萄糖、白蛋白、总血清蛋白、肌酐、血尿素氮(BUN)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、碱性磷酸酶、乳酸脱氢酶(LDH)、γ-谷氨酰转移酶(GGT)、总胆红素、总胆固醇(低密度脂蛋白[LDL]和高密度脂蛋白[HDL])、甘油三酯、尿酸、肌酸磷酸激酶(CPK)、LDL-C、HDL-C；血液 学：血红蛋白、血细胞比容、红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、红细胞指数(平均红细胞体积[MCV]、平均红细胞血红蛋白[MCH]、平均红细胞血红蛋白浓度[MCHC]、红细胞分布宽度[RDW])、血小板计数、差异(*如果观察到有临床意义的异常，则可通过流式细胞术进行其他测试以评估细胞亚群)，包括中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜碱性细胞和嗜酸性粒细胞；尿液分析：颜色、葡萄糖、RBC、透明度、血液透明质酸和其他组分、pH、胆红素、细菌、比重、白细胞酯酶、上皮细胞、酮、亚硝酸盐、晶体、蛋白质、WBC、酵母；其他实验室测试：瘦蛋白、胰岛素和内分泌激素(诸如甲状腺激素(T3、T4、TSH)、促黄体生成激素(LH)、睾酮、雌二醇)以及HbA1c将在A部分和B部分进行评估。对于B部分，血清瘦蛋白将在预筛选时进行，以确定4个队列中的1个的受试者资格。瘦蛋白也将在整个研究过程中进行测量，如图25-27所示。将要测量的其他蛋白质包括脂联素和皮质醇。
实验室值异常值和实验室不良事件
所有实验室值都必须由研究者或授权的指定人员进行审查。开始治疗后出现的明显异常测试结果必须重复，以确认异常的性质和程度。在必要时，应启动适当的辅助检查。如果异常无法解决或无法由与研究药物或其施用无关的事件或状况解释，则必须咨询医学/研究主管。
在研究的疾病范围内，异常测试值的临床意义必须由研究者确定。
药物浓度测量和样品
将在图25列出的时间点收集用于在A部分期间测量血清H4H17319P2浓度的样品。在名义上，将在图27列出的时间点收集用于在B部分期间测量血清H4H17319P2浓度的样品。然而，一旦基于对A部分数据的中期分析确定了B部分事件的时间表，即可在一组(可能)修订的时间点收集B部分中血清H4H17319P2测量样品。任何未使用的样品均可用于探索性生物标志物研究。
抗药物抗体测量和样品
将在图25和27中列出的时间点收集用于A部分和B部分抗药物抗体评估的样品。任何未使用的样品均可用于探索性生物标志物研究。
药效动力学和探索性生物标志物程序
在这项研究中，将进行研究评估，以探索H4H17319P2如何改变食欲、食物摄入量、体重和循环标志物，诸如可溶性LEPR和ANGPTL3，以及探索性生物标志物。
可溶性LEPR存在于健康和疾病受试者的血液循环中。它是瘦蛋白受体的非信号传导形式，能够与瘦蛋白结合并调节其生物利用率。H4H17319P2可以以剂量依赖性和时间依赖性方式与循环中的sLEPR结合。可溶性LEPR将在第1天访视前和随后的访视时进行剂量测量，见图25和27。sLEPR的变化可以反映H4H17319P2施用后靶标接合和饱和。
ANGPTL3是脂蛋白脂肪酶的内源性抑制剂，它可调节循环中的甘油三酯。H4H17319P2可能通过ANGPTL3调节甘油三酯；因此，在给药后的各个时间点将在给予前和治疗后的血清中测量ANGPTL3的循环浓度，以捕获餐后变化。H4H17319P2对ANGPTL3的剂量依赖性效应将在图25-27中概述的A部分和B部分中进行探讨。
可以在血清或血浆中测量的其他探索性生物标志物包括瘦蛋白、脂联素和内分泌激素，它们在体重减轻过程中得到调节。标志物将根据图25-27中的生物标志物评估收集进行测量。
不良反应和不良事件
用于治疗输注反应的急救设备和药物必须立即可用。所有输注反应必须报告为AE，并使用适当的分级量表进行分级。如果观察到以下任何AE，应中断输注：咳嗽、强直/发冷、皮疹、瘙痒(痒)、荨麻疹(荨麻疹、贴边、鞭痕)、发汗(出汗)、低血压、呼吸困难(呼吸急促)、呕吐和潮红。
应对症处理反应，不应重新开始输注。如果研究者认为除上述以外，还有医疗上需要治疗或中止输注的情况，则应根据典型的临床实践，运用临床判断提供适当的反应。
如果发生以下任何一种AE，则应终止输注，并且不要重新开始输注：过敏性反应、喉/咽水肿、严重支气管痉挛、胸痛、癫痫发作、严重低血压、其他神经症状(意识模糊、意识丧失、感觉异常、麻痹等)，研究者认为有必要终止静脉内输注的任何其他症状或体征。如果发现以下情况，则考虑过敏性反应(Sampson,2006)：皮肤、粘膜组织或二者均受累(例如，全身荨麻疹、瘙痒或潮红、唇-舌-悬雍垂浮肿)的疾病的急性发病(几分钟至若干小时)和以下至少一者：呼吸系统损害(例如，呼吸困难、喘息性支气管痉挛、喘鸣、峰值呼气量减少、低氧血症)和血压降低或相关的终末器官功能障碍症状(例如，张力减退[塌陷]、晕厥、失禁)。
用于治疗全身反应的急救设备和药物必须立即可用。所有输注反应必须报告为AE，并根据说明使用分级量表进行分级指令。注射研究药物(皮下)后的急性全身反应应根据典型临床规范，根据临床判断来确定适当的反应。
注射部位的局部反应必须报告为AE，并根据美国食品药品监督管理局(FDA)2007年9月的针对参加预防性疫苗临床试验的健康成人和青少年志愿者的毒性分级量表(由研究监管机构提供)指南进行。
AE是在施用研究药物的受试者中发生的任何不良医学事件，可能或不可能与研究药物有因果关系。因此，AE是与研究药物的使用在时间上相关的任何不利和意外的征象(包括实验室检查异常)、症状或疾病，无论是否与研究药物相关。不良事件还包括与研究药物的使用在时间上相关的既有疾病的任何恶化(即，频率和/或强度的任何临床上显著变化)。
严重不良事件(SAE)是任何剂量的任何不良医学事件：
●导致死亡–包括所有死亡，甚至包括那些与研究药物完全无关的死亡(例如，交通事故中受试者为乘客)。
●是危及生命的–在研究者看来，该事件发生时，受试者处于立即死亡的风险。这不包括以更严重的形式发生，可能导致死亡的AE。
●需要住院或延长现有住院时间。住院的定义为进入医院或急诊室超过24小时。现有住院时间的延长定义为住院时间比该事件原先预期的住院时间长，或者由于研究者或主治医生确定的新AE的出现而延长。
●导致持续或严重的残疾/无行为能力(严重破坏人的正常生命功能)。
●是先天性异常的/出生缺陷的。
●是重要的医疗事件-重要的医疗事件可以不立即威胁生命或导致死亡或住院，但可以危及受试者或可能需要干预以防止上述其他严重结局之一(例如，针对过敏性支气管痉挛的在急救室或家中的强化治疗；不会导致住院的血液流动力学异常或痉挛；或发展为药物依赖性或药物滥用)。
这些事件必须遵循报告SAE的标准。
特别值得关注的不良事件(AESI；严重或不严重)是针对资助者的产品或计划的科学和医学问题之一，对此，研究人员与资助者进行持续的监视和快速沟通可以是适当的。此类事件可能需要进一步调查以进行表征和理解。根据事件的性质，还可能需要试验资助者与其他各方(例如监管机构)进行快速沟通。
输注反应定义为在输注过程中或输注完成后2小时内发生的任何相关AE。所有输注反应必须报告为AE并分级。
研究者(或指定人员)将记录从知情同意书签署到研究结束之间发生的所有AE。实验室、生命体征或ECG异常应记录为AE。无论评估与研究药物的因果关系如何，所有SAE都必须在24小时内报告给资助者(或指定人员)。
初次报告时未提供的信息必须记录在后续报告中。可能还需要提供与诸如相关的医院或病历的真实数据以及诊断测试报告。如果研究者在受试者完成研究后被告知SAE，则适用以下条件：
部分A：如果受试者提前退出研究，则在研究结束后30天内或上次研究药物给药后112天内发生SAE-SAE将报告给资助者。在事件被认为是慢性和/或稳定之前，研究者应尽一切努力获得相关结果的随访信息。
部分B：如果受试者提前退出研究，则在研究结束后30天内或上次研究药物给药后112天内发生SAE-SAE将报告给资助者。在事件被认为是慢性和/或稳定之前，研究者应尽一切努力获得相关结果的随访信息。
A部分和B部分：自研究结束/提早终止访视后发病日期超过30天的SAE-仅致命SAE和研究者认为与药物相关的SAE才向资助者报告。在事件被认为是慢性和/或稳定之前，研究者应尽一切努力获得药物相关SAE的结局的随访信息。
结果
在研究的初始(A部分)单次递增剂量部分中，将患者以3:1的比例随机分为接受0.3mg/kg静脉内(IV)至最多30mg/kg静脉内，和300mg皮下至600mg皮下的7个队列之一中的H4H17319P2与安慰剂。已经向五十六位患者给予了H4H17319P2或安慰剂，并且在施用后至少85天可获得药代动力学(PK)和安全性数据。盲法数据的审查未发现任何剂量施用引起任何严重或严重不良反应，也没有死亡报告。通过静脉内或皮下途径施用时，通常对H4H17319P2或安慰剂的治疗耐受性良好。没有治疗中断或停止。头痛是最常报告的治疗中出现的不良事件(TEAE)。在安全性实验室参数、生命体征或ECG中，没有从基线的临床显著异常或剂量依赖性变化。
实施例21：抗LEPR抗体用于儿童患者中的先天性瘦蛋白缺乏治疗的临床使用
简而言之，一名患者在6个月大时出现严重肥胖、食欲过盛、高胰岛素血症、血脂异常、2级肝脂肪变性和瘦蛋白水平低(0.55ng/mL)。该患者通过聚合酶链式反应被诊断为瘦蛋白基因缺失(LEP-/-)，并根据欧洲医学遗传学质量网络标准通过多重连接依赖性探针扩增证实了该诊断。患者在24个月大时开始接受美曲普汀疗法，随后6个月体重减轻了10kg(从37kg降至27kg)。然后患者开始迅速增重。最近，患者可能由于极端肥胖和频繁感染而出现呼吸困难，需要住院治疗。医生在美曲普汀施用后1小时通过测量瘦蛋白水平来测试中和抗体。实验室测试表明瘦蛋白水平<0.1ng/mL，证实该患者已产生抗美曲普汀的中和抗体。这些发现解释了患者的体重增加，并证明了美曲普汀不再是治疗该患者状况的有效疗法。
H4H17319P2治疗将用于恢复先天性瘦蛋白缺乏中的LEPR信号传导，并改善这种情况下的食欲过盛、体重增加和代谢并发症。
其他儿童患者的纳入/排除标准
患者必须满足以下标准，才有资格被纳入该同情用药计划中：
1.先天性瘦蛋白缺乏，具有确诊的遗传诊断LEP功能丧失变体和/或基因缺失
2.严重肥胖，针对成人，定义为BMI≥40kg/m2，以及针对儿童，定义为针对年龄和性别的体重>第97个百分位。
3.瘦蛋白水平<1.0ng/mL
4.中和抗美曲普汀抗体的证据，定义为：
●在治疗医生的判断下，美曲普汀的有效性丧失，并有证据证明瘦蛋白疗法可增加体重，并且
●注射瘦蛋白后1小时内瘦蛋白水平<1.0ng/mL，或由美曲普汀的制造商Aegerion进行阳性中和抗体活性测定法。
有资格进行正在进行的先天性瘦蛋白缺乏治疗的临床试验的患者将被排除在外。
剂量选择
预期本文所述的给药方案通常具有良好耐受性。当H4H17319P2以0.3至30mg/kg静脉内以及300和600mg的皮下单剂量施用时，在健康的成年志愿者中具有良好的耐受性。在静脉内注射30mg/kg剂量时，血清中的最高浓度为1035mg/L，几乎是在治疗过程中儿童患者预期的最高浓度的两倍。此外，在相同剂量间隔下，稳态下1周给药间隔内浓度-时间曲线(AUC)下的预测面积预计比稳态下AUC至少低8倍(未观察到不良反应水平[NOAEL])，是根据来自3个食蟹猴临床前毒理学研究的药代动力学模型估算得出的。
选择5mg/kg静脉内(IV)负荷剂量，以快速达到100mg/L或以上的血清H4H17319P2浓度。包括该静脉内负荷剂量将允许立即评估血清中H4H17319P2的最大浓度(Cmax)。每周皮下(SC)维持剂量250mg H4H17319P2将使血清中谷浓度保持在100mg/L或以上。该皮下给药方案应在静脉内负荷剂量施用后3天开始，以最好地保持血清中的目标谷浓度。
治疗和评估时间表
表20概述了儿童患者的初始治疗和评估计划。当PK和PD数据可用时，治疗和评估建议将被更新并传达给医生。该计划应尽可能严格遵循，并应注意任何偏差。在施用H4H17319P2或进行以下任何评估之前，必须获得书面知情同意。在第1天5mg/kg的单次静脉内负荷剂量后，将以250mg的Q7天(每周)的皮下剂量施用H4H17319P2。第一皮下剂量将在第4天施用。
H4H17319P2将在第1天经1小时静脉内输注1次。H4H17319P2的静脉给药应通过指定类型的静脉内输注泵(Alaris,Gemini,PC-1或类似产品；Baxter,Flo-Gard 6201或类似产品；Hospira,Lifecare 5000或类似产品)和静脉内输注器(Baxter,产品代码2C6571或类似产品；Alaris产品编号2430-0500或类似产品；Alaris产品编号11532269或类似产品；Hospira产品编号14255-28或类似产品；Baxter产品编号2H6480或类似产品；Hospira产品编号12336-05或类似产品)进行。联机过滤器和静脉内输注泵必须能够以低至1mL/min的速度精确输送。
表20还提供了H4H17319P2药物浓度和抗H4H17319P2抗体测量的血清采样时间、体重评估、代谢参数评估以及将样品运送到试验资助者的时间。患者的H4H17319P2水平和体重测量值可用于在第25天后更新剂量水平和给药频率建议，并确定H4H17319P2给药是否在该患者中显示出有益的迹象。测量抗体浓度可以评估所选的剂量和剂量方案是否最佳或是否需要调整。收集用于药物浓度和抗药物抗体(ADA)评估的任何未使用的血清样品可用于调查出乎意料的不良事件并用于研究目的，并可保存长达15年。
出于安全性监控目的，应将医生作为患者常规和标准护理的一部分而获得的任何其他疾病相关临床参数，都应传达给试验资助者。这包括但不限于生命体征和实验室值(即，肝酶的血液化学、血液学、代谢参数)。此类信息可以为患者提供更多剂量，也可以帮助确定H4H17319P2施用是否显示出有益或有害的迹象。
如果发生过敏反应或超敏反应，应尽可能在事件发生附近收集其他血清样品。计划外的样品收集会提供额外的标签。
中心必须有应急设备和药物，用于静脉输注H4H17319P2后的输注反应或注射H4H17319P2后的全身性反应。施用H4H17319P2后的急性静脉内输注或全身注射反应应根据典型临床规范，根据临床判断来确定适当的反应。主治医生了解到的所有与安全相关的发现和不良事件应尽快并严格按照与同情用药基础上与使用研究产品相关的任何当地要求，报告给试验资助者。此类不良事件包括导致死亡、危及生命、需要住院治疗或延长现有住院时间、导致持续或严重的残疾/丧失能力，是先天性异常/出生缺陷，或是重要医学的任何不良医学事件(诸如在急诊室或家里因过敏性支气管痉挛而进行的强化治疗；不导致住院的血液异常或抽搐；或产生药物依赖性或药物滥用)。
表20：治疗、评估和样品采集时间表
Figure BDA0002715660290000951
Figure BDA0002715660290000952
除非基于资助者对PK和体重数据的审查建议进行修改，否则将每周一次继续施用H4H17319P2和给予前血清。
通过静脉输注袋施用的5mg/kg剂量的H4H17319P2的制备
下表21列出了以5mg/kg剂量添加到静脉内注射袋中的复原H4H17319P2的体积。
表21：将50mg/mL H4H17319P2的量添加至100mL含盐水的静脉内注射袋中，剂量为5mg/kg
Figure BDA0002715660290000961
Figure BDA0002715660290000971
IP＝研究产品
每个小瓶的H4H17319P2将用4.9mL无菌注射用水复原。
在复原后，每个小瓶的H4H17319P2含有4.8mL抽出量。当复原用于静脉内施用时，小瓶中的H4H17319P2浓度为50mg/mL。复原步骤如下：
1.获得所需小瓶数的冻干H4H17319P2以及100mL 0.9％氯化钠输注袋
2.在坚硬、干净的表面上制备H4H17319P2
3.从小瓶上取下瓶盖，然后用酒精拭子擦拭小瓶的上表面。
4.对于用于给予的每个小瓶，获得一个21号针头和一个10.0mL聚丙烯注射器。在不从针头上取下盖子的情况下，将21号针头附接到10.0mL聚丙烯注射器上。盖上盖子，将10.0mL注射器上的柱塞拉回到5.5mL标记。这是为了将空气吸入注射器。
5.从21号针头上取下盖子。将针头插入装有无菌注射用水的小瓶的橡胶顶部。向下推柱塞，将所有空气注入小瓶中。一只手将小瓶颠倒，并确保针尖在水中。将至少5.5mL无菌注射用水注入注射器中。请勿将针头放在肮脏的表面上，不要用手指触摸针头或直接在针头上呼吸。
6.倒转注射器(针头向上)并压下柱塞，直到从注射器中排出空气，从而对注射器进行灌注。继续按下柱塞，直到少量液体流出，柱塞达到4.9mL。
7.将H4H17319P2小瓶放在坚硬的表面上，然后将针头插入顶部。将4.9mL无菌注射用水注射到药物瓶中，将水流引导到小瓶的侧面并进入粉末状药物。
8.将所有水从注射器中推入小瓶后，从小瓶中取下针头。将针头和注射器丢入Sharps容器。
9.轻轻旋转小瓶，使其直立，直到所有粉末溶解。
10.不要摇动小瓶。摇动可能会导致起泡。
H4H17319P2的静脉内施用
抗体施用的步骤如下：
1.使用标准的无菌技术，使用适当尺寸的聚丙烯注射器和21号针头，根据表21抽取适量的H4H17319P2。请勿将针头放在肮脏的表面上，不要用手指触摸针头或直接在针头上呼吸。
2.在将H4H17319P2溶液添加到100mL静脉内输注袋之前，从静脉内输注袋中抽出等于要添加到静脉内输注袋中的H4H17319P2的体积的0.9％氯化钠。
3.将适量的H4H17319P2加入静脉内输注袋中，然后将静脉内输注袋倒置10次以确保药物和0.9％氯化钠充分混合。
4.准备好的静脉内输注袋将根据中心批准的标签要求贴标签。标签应包括：患者姓名缩写、制备日期/时间、在0.9％氯化钠袋1x1中的H4H17319P2 mg、静脉输注袋中所有内容物的指示，并且按照规程在1小时内冲洗、按日期/时间使用，以及主治医生的名字。
5.H4H17319P2应该在复原后的4小时内输注。
H4H17319P2的皮下制备和施用
每个小瓶的H4H17319P2将用1.4mL无菌注射用水复原。在复原后，每个小瓶将含有1.2mL抽出量。当复原用于皮下施用时，H4H17319P2浓度为150mg/mL。给予需要两个小瓶H4H17319P2。
1.在坚硬、干净的表面上制备H4H17319P2。
2.从小瓶上取下瓶盖，然后用酒精拭子擦拭小瓶的上表面。
3.在不从针头上取下盖子的情况下，将21号针头附接到3.0mL聚丙烯注射器上。盖上盖子，将注射器上的柱塞向后拉至2.0mL标记以将空气吸入注射器。从21号针头上取下盖子。将针头插入装有无菌注射用水的小瓶的橡胶顶部。向下推柱塞，将所有空气注入小瓶中。一只手将小瓶颠倒，并确保针尖在水中。将至少2.0mL无菌注射用水注入注射器中。请勿将针头放在肮脏的表面上，不要用手指触摸针头或直接在针头上呼吸。
4.倒转注射器(针头向上)并压下柱塞，直到从注射器中排出空气，从而对注射器进行灌注。继续按下柱塞，直到少量液体流出，柱塞达到1.4mL标记。
5.将H4H17319P2小瓶放在坚硬的表面上，然后将针头插入顶部。将1.4mL无菌注射用水注射到H4H17319P2小瓶中，将水流引导到小瓶的侧面并进入粉末状药物。
6.将所有水从注射器中推入小瓶后，从小瓶中取下针头。将针头和注射器丢入Sharps容器。
7.轻轻旋转小瓶，使其直立，直到所有粉末溶解。
8.不要摇动小瓶。摇动可能会导致起泡。
250mg剂量的H4H17319P2的皮下施用
该剂量需要注射两次H4H17319P2。一次注射为0.67mL皮下注射，另一次为1.0mL皮下注射。
1.获得一个1.0mL聚丙烯塑料注射器和一个3.0mL聚丙烯注射器，并将21号针头连接到每个注射器上。
2.获得2瓶冻干的H4H17319P2。
3.如上所示，用1.4mL无菌注射用水复原每个冻干的H4H17319P2小瓶。
4.盖上盖子，将1.0mL聚丙烯注射器上的柱塞向后拉至1.0mL标记以将空气吸入注射器。
5.取下针头盖，然后将针头插入样品小瓶的橡胶顶部。
6.向下推柱塞，将所有空气注入小瓶中。
7.将针头保持在小瓶中，一只手将小瓶倒置，并确保针尖在液体中。用另一只手向后拉柱塞，以将至少1.0mL的药物吸入注射器。盖上针上的盖子。取下加盖的针并将其放入Sharps容器中。
8.在不取下针头盖的情况下，将27号0.5英寸针头附接到1.0mL装有至少1.0mL药物的聚丙烯注射器上。
9.取下针头盖，并用药物灌注27号0.5英寸针头。盖上针上的盖子。
10.制备的皮下注射器为0.67mL＝100mg/0.67mL。
11.制备的皮下注射器将根据中心标准操作程序的要求贴标签。
12.盖上盖子，将3.0mL聚丙烯注射器上的柱塞向后拉至1.5mL标记以将空气吸入注射器。
13.取下针头盖，然后将针头插入样品小瓶的橡胶顶部。
14.向下推柱塞，将所有空气注入小瓶中。
15.将针头保持在小瓶中，一只手将小瓶倒置，并确保针尖在液体中。用另一只手向后拉柱塞，以将至少1.2mL的药物吸入注射器。盖上针上的盖子。取下加盖的针并将其放入Sharps容器中。
16.在不取下针头盖的情况下，将27号0.5英寸针头附接到1.0mL装有至少1.2mL药物的聚丙烯注射器上。
17.取下针头盖，并用药物灌注27号0.5英寸针头。盖上针上的盖子。
18.制备的皮下注射器为1.0mL＝150mg/1.0mL。
19.制备的皮下注射器将根据中心标准操作程序的要求贴标签。
20.H4H17319P2应该在复原后的4小时内递送。
H4H17319P2的永久停止
建议在以下情况下永久停止H4H17319P2的施用：
●与H4H17319P2相关联的严重或严重过敏反应
●特定类型的肝功能障碍(例如，符合Hy定律([行业药物引起的肝损伤指南：上市前临床评估FDA 2009])
●怀孕的证据
●患者/法律代表撤回同意书
●在一段时间(由治疗医生和资助者讨论)的情况下，患者未表现出对资助者的H4H17319P2的最佳剂量和给药方案的临床益处(即体重减轻)
H4H17319P2的暂时停止
建议在以下情况下暂时停止H4H17319P2的施用：
●中性粒细胞计数≤1.0×103/μL
●维持的ALT/AST值大于正常上限(ULN)3倍加上总胆红素>2倍ULN或分离的AST/ALT>5倍ULN
●手术程序
●住院治疗
在导致暂时停止H4H17319P2的病症解决后，可以恢复H4H17319P2给予。应与资助者代表讨论暂时中止H4H17319P2和/或恢复H4H17319P2给予的决定。
是如果情况的紧急性需要立即采取行动，并且如果确定这符合患者的最大利益，则治疗医生可以随时中止H4H17319P2给予，即使没有与资助者代表协商也可以。然而，应尽快与资助者代表联系。H4H17319P2给予的恢复应在治疗医生和资助者代表之间进行讨论并达成共识。
总之，H4H17319P2将在患有先天性瘦蛋白缺乏的患者中恢复LEPR信号传导，并改善或逆转这种情况下的食欲过盛、体重增加和/或代谢并发症。
实施例22：抗LEPR抗体用于儿童患者中的局部脂肪营养不良治疗的临床使用
一名女性患者11岁时出现肝脾肿大和高甘油三酯(>500mg/dL)，并且四肢缺乏脂肪。发现她具有抗GAD(谷氨酸脱羧酶)抗体，商业LMNA基因分析为阴性。在评估美曲普汀在治疗与脂肪营养不良相关的肝脏疾病的功效时进行评估时确定的其他特征包括手部挛缩、脊柱侧弯和肾上腺缺乏的非典型特征。在基线时，她的瘦蛋白水平为3.2ng/dL。
作为临床研究方案(ClinicalTrials.gov标识符：NCT01679197)的一部分，美曲普汀疗法始于13岁，用于治疗高甘油三酯和严重肝脂肪变性，她持续进行美曲普汀治疗12个月而未发生任何严重不良事件。然而，在美曲普汀施用后，她的代谢参数显示出轻微的改善，肝活检显示出改善。她继续使用美曲普汀作为另一项研究方案的一部分(ClinicalTrials.gov标识符：NCT02654977)。然而，在治疗的第17个月期间，患者报告疲倦、口渴、视力模糊和烦躁不安，一个月减重5磅。实验室结果显示出显著的高血糖和高脂血症、阴离子间隙为正、酮为阳性。抗GAD65(谷氨酸脱羧酶的65kDa亚型)水平为5.39nmol/L(两个月后重复抗GAD65：8.38nmol/L)，注射后一小时提取的瘦蛋白水平无法检测到。最终证实了具有中和活性的美曲普汀抗体的存在。瘦蛋白的这种低值可能是由于正在进行的抗瘦蛋白肽抗体形成的美曲普汀治疗与免疫原性交叉反应，脂肪组织可能持续丢失或抑制瘦蛋白产生的机制所致。
在大约6个月后，证实对美曲普汀和内源性瘦蛋白的中和活性为阳性。在这段时间内，葡萄糖和脂质的控制明显变差，甘油三酯始终>2,000mg/dL。她采用基础+推注方案维持高剂量胰岛素治疗，并转用胰岛素泵。她也开始服用二甲双胍。糖尿病性酮症酸中毒、胰腺炎或胰腺炎的预防需要多次住院。
然后，由于脂质控制恶化(甘油三酯>2,000mg/dL)，患者开始服用非诺贝特，然后开始服用匹格列酮。在停用美曲普汀后一个月，LFT较正常水平升高了10倍。肝活检显示门静脉和门静脉炎斑片状，包括浆细胞和界面损伤，与自身免疫性肝炎一致。为了控制自身免疫性肝炎，她接受了泼尼松治疗三个月，这有助于解决肝功能异常。在泼尼松停药期间和停药后，由于高甘油三酯血症(高达8,000mg/dL)并伴有糖尿病性酮症酸中毒，患者经受了多发急性胰腺炎。由于上述代谢并发症或胰腺炎，患者应定期入院。
患者开始以1mg/d的剂量服用塞美拉肽(ClinicalTrials.gov标识符：NCT03262610)，然后逐渐增加剂量，直到甘油三酯降至500mg/dl以下。塞美拉肽未引起该患者体重减轻。虽然饥饿感略有下降，但效果并不明显。该治疗未能改善血糖控制和高甘油三酯血症。由于HbA1c水平仍然很高，因此每日总胰岛素剂量的轻微下降在临床上不被认为是有意义的。虽然内脏脂肪略有减少，但塞美拉肽对肝脏脂肪含量无影响。
患者的甘油三酯水平升高(>500mg/dL，高达>2,000mg/dL)，需要进行血浆去除术疗法以预防反复出现的胰腺炎。除胰岛素、甘精胰岛素和二甲双胍外，每天还接受10mg恩格列净治疗。
基本原理
该临床研究方案的目的是向符合所需资格标准且符合以下概述的标准的患者提供研究产品(IP)H4H17319P2：
●患者患有严重或威胁生命的疾病，已批准扩大使用方案。
●根据所提出的药物作用机制，可以预期获得临床上有意义的功效的充分证据。
●没有可比或令人满意的替代疗法来治疗该疾病或病症。
●关于该特定患者，没有独特之处表明通过向该患者施用H4H17319P2会构成不合理的风险。
在已被美曲普汀治疗的全身脂肪营养不良的患者中，已鉴定出具有中和活性的抗美曲普汀抗体。这些中和抗体的后果尚未得到很好的表征，但可能包括抑制内源性瘦蛋白作用和/或美曲普汀功效的丧失(Chan等人,Immunogenicity associated withMetreleptin treatment in patients with obesity or lipodystrophy.ClinEndocrinol.2016；85(1):137-149)。已报道有严重感染和/或代谢控制恶化。注意到该患者患有进行性代谢恶化以及1型糖尿病的出现，同时出现了持续存在的抗美曲普汀中和抗体。目前尚不清楚该疾病是否已自然进展，或者抗体的出现是否起作用。无论如何，不能适当治疗患者的脂肪营养不良。
该患者扩大使用方案的目的是提供H4H17319P2作为该患者难治性高甘油三酯血症导致脂肪性营养不良，导致胰腺炎复发的严重代谢并发症的潜在治疗。此外，还将评估H4H17319P2在该患者中的安全性和功效。治疗期将取决于这名患者的反应程度，该患者是患有高甘油三酯血症和复发性胰腺炎的重症脂肪营养不良患者，旨在评估H4H17319P2是否可以提供治疗益处以改善严重的代谢异常。
主要终点：
●空腹甘油三酯从基线到第24周的变化百分比
●在第24周无需进行血浆去除术即可实现空腹甘油三酯<500mg/dL
●治疗中出现的不良事件
次要终点：
●空腹甘油三酯从基线到第12周的变化百分比
●在第12周无需进行血浆去除术即可实现空腹甘油三酯<500mg/dL
●饥饿得分从基线随时间推移的变化
●空腹血糖和糖化血红蛋白(HbA1c)随时间推移的变化
●随时间推移因胰腺炎入院的发病率
●随时间推移平均胰岛素剂量需求相对于基线的变化
●其他空腹血脂参数(包括总空腹胆固醇、HDL-C、LDL-C和VLDL-C)随时间推移从基线的变化
●该患者的DEXA和肝脂肪参数(如果可行)随时间推移从基线的变化百分比
●随时间推移血清中总H4H17319P2的浓度
●随时间推移存在针对H4H17319P2的抗药物抗体(ADA)
方案设计
该方案包括2周的筛选期和3个开放标签治疗期：治疗期1(第1-12周)、治疗期2(第13-24周)和治疗延长期(第25-52周)。在筛选期间，将对患者进行资格评估，并指示其至少在3天之内完成饥饿问卷，以增进对与脂肪营养不良和内源性瘦蛋白不存在或缺乏相关联的饥饿症状的了解，所述脂肪营养不良和内源性瘦蛋白不存在或缺乏是在H4H17319P2治疗之前脂肪组织的不出现或缺乏的结果。由于这种情况很少见，因此在筛选期间获得饥饿得分将有助于收集重要的患者特定细节，从而可以更好地了解该障碍的饥饿症状。
在治疗期1中，患者将接受H4H17319P2的初始给药方案。在治疗期1(第12周)结束时，将进行功效评估(TG降低)和H4H17319P2药物水平(PK)，以确定治疗期2的H4H17319P2给药方案。治疗期2中的剂量水平和给药频率将不超过治疗期1中的剂量水平和给药频率。在第24周时，将进行疗效评估(TG降低)和H4H17319P2药物水平(PK)，以确定患者是否有资格继续治疗延长期。
因此，该患者将按图19所示的方案依次进行。
空腹甘油三酯(TG)水平和血浆去除术的要求将是用于评估是否达到治疗效果的主要标准。如果该患者在第24周内未表现出对空腹TG水平<500mg/dL的所需治疗靶标反应，则应退出方案。
为了同时管理高甘油三酯血症，该患者将有资格根据主治医生的判断继续进行血浆去除术治疗。应在最近一次血浆去除术治疗后至少1周的时间测量空腹TG水平，以确定是否已实现对H4H17319P2治疗的治疗反应。
剂量选择
在以上实施例15-19中所述的临床前研究中，PD作用与H4H17319P2的广泛暴露相关，而在H4H17319P2的靶向介导清除率(TMC)饱和的给予条件下观察到了作用的可持续性。在脂肪营养不良的小鼠模型(如上所述)中，单剂量的H4H17319P2导致葡萄糖浓度正常化和体重减轻。这些作用在血清中H4H17319P2浓度高于4mg/L时很明显，但在使TMC途径饱和的浓度下更明显。在上述猴研究中，在稳态浓度高于30mg/L时，观察到持续的体重影响(与对照动物相比，体重减轻或体重增加减少)。然而，当H4H17319P2的浓度超过100mg/L(在猴中饱和TMC所需的浓度)时，可以看到更大的总体效果。鉴于瘦蛋白结合受体得到广泛表达，但靶标(信号传导)受体仅限于中枢神经系统，因此推测临床前PK/PD数据反映出需要饱和TMC并与外周LEPR结合以实现在大脑中足够的暴露。此外，使TMC饱和和传递持续的PD效应所需的物种间浓度差异可能是外周靶标负荷差异的结果。
在实施例20中描述的人类临床研究中，基于浓度与时间曲线，当血清浓度超过100mg/L时，TMC途径的饱和是明显的。利用该FIH研究的数据建立了PK群体模型，该数据在健康志愿者中单剂量施用时捕获了H4H17319P2的相关药代动力学特征。假设健康志愿者中观察到的H4H17319P2的PK特征与该患者相关联，则采用该模型来模拟不同剂量方案下的预期浓度特征曲线。
H4H17319P2将以冻干粉末形式提供于无菌、一次性使用20mL玻璃小瓶中，用于静脉内或皮下施用。每个小瓶包含265mg H4H17319P2，将其用无菌注射用水复原以进行静脉内施用和皮下施用。
选择5mg/kg静脉内(IV)负荷剂量，以快速达到100mg/L或以上的血清H4H17319P2浓度。包括该静脉内负荷剂量还将允许立即评估血清中H4H17319P2的最大浓度(Cmax)。每周皮下(SC)维持剂量300mg H4H17319P2预期使血清中谷浓度保持在100mg/L或以上。该皮下给药方案应在静脉内负荷剂量施用后4天开始，并且预期最好地保持血清中的目标谷浓度。在患者进行临床指示的血浆去除术的几天中，血浆去除术完成后必须进行H4H17319P2的施用。
基于对56名健康受试者的正在进行的2部分研究的第一部分的数据(实施例20)，预期所描述的给药方案通常具有良好耐受性。当H4H17319P2以0.3至30mg/kg静脉内以及300和600mg的皮下单剂量施用时，在实施例20中在健康的成年志愿者中具有良好的耐受性。在30mg/kg静脉注射剂量下，观察到的血清最大浓度为1035mg/L，这大于该研究过程中预期患者达到的最大暴露量的六倍。此外，在相同的给药间隔下，稳态下1周给药间隔内浓度-时间曲线(AUC)下的预测面积预计比稳态下的AUC少近27倍。观察到的不良反应水平[NOAEL])是根据来自3个食蟹猴临床前毒理学研究的药代动力学模型估算得出的。
静脉注射5mg/kg初始剂量加上每周300mg的皮下维持是可耐受的，并且已被选择为快速达到H4H17319P2的血清浓度，该浓度会使外周受体饱和，从而提供维持的药理作用。较低的剂量水平或较低的给药频率可能同样有效。因此，在计划的中期疗效和药物水平评估后，可以向下调整剂量水平和给药频率。另外，由于血浆去除术可以从循环中除去包括H4H17319P2的抗体，因此可能有必要在血浆去除术后调整剂量，以确保有效的H4H17319P2水平。在患者进行血浆去除术的几天中，可能需要另外300mg的H4H17319P2剂量才能达到目标药物浓度。常规最大剂量(不考虑血浆去除术引起的可能变化)每周不应超过300mg皮下。
功效和药物水平评估
方案的第12周和第24周后将进行中期功效和药物水平评估，以评估所选的给药方案是否达到预期的药物水平和PK曲线以及对脂质参数的影响。在功效和药物水平评估后，可以根据需要调整剂量水平和给药频率。
数据审查委员会将包括(1)经验丰富的脂肪营养不良专家(2)患者的儿童重症监护室医生(3)涉及其护理的一名专科医生(儿童GI或肝病学)，以及(4)熟悉临床前和临床研究中的H4H17319P2暴露-反应关系的资助者代表。
患者参与的持续时间
整个方案的持续时间预计约为54周，包括筛选期。患者参加此方案包括以下时间期：筛选期、治疗期1[预计持续12周]、治疗期2[预计持续12周]，然后，如果患者符合条件，则进行长期的治疗延长期[28周]。可以预期，如果在治疗延长期内显示出具有良好安全性和耐受性的代谢得到实质性改善，则可以为患者提供纳入将来单独延伸方案的机会，以允许继续治疗。在对患者进行超出该方案持续时间的给药之前，该未来延伸方案将由适用的监管机构提交并批准。
试验结束将被定义为最后一次访视的患者。患者有权在任何时间以任何理由退出该治疗方案，而不会受到任何影响。由于临床安全问题或功效缺乏，研究者还可以随时使患者退出。
方案停止
如果主要研究者或资助者认为有足够合理的理由，则可提前终止该方案的执行。终止方将向研究者或资助者提供书面通知书、说明方案终止的原因。
保证终止的情况包括但不限于：
●患者的出乎意料的、显著的或不可接受的风险的确定
●对方案要求的依从性不足
●完整和/或可评估的数据不足
●怀孕的证据
●与药物相关联的严重或严重过敏反应
●无其他原因可解释严重肝损伤或功能障碍，诸如病毒性甲肝、乙肝或丙肝；既往或急性肝病；或其他能够引起观察到的伤害的药物。该患者的肝损伤定义为ALT或AST>平均基线水平的3倍以上，总胆红素>基线水平的2倍以上(或国际标准化比值(INR)>1.5)
●病人撤回同意书
●计划修改、暂停或停止药物开发
●在第12周的数据审查中，数据审查委员会认为，没有观察到足够的有益效果
●在第24周的数据复查中，数据审查委员会认为，在没有伴随的血浆去除术管理的情况下，患者无法将空腹TG值始终保持在<500mg/dL。
如果数据审查委员会的一致意见认为，虽然无法在未进行血浆去除术管理的情况下将TG值始终保持在500mg/dL以下，但患者仍在取得显著的临床获益，则所述给予可以持续至治疗访视第52周。
治疗依从性评估
为了评估药物的安全性、耐受性和药代动力学，至关重要的是患者应按指示接受H4H17319P2。将收集所有使用的H4H17319P2以评估对方案的遵守情况。
在前2个方案期(初始剂量期和开放标签有效治疗期)中，有经验的医疗保健提供者将H4H17319P2施用给患者。在开放标签延长期内，H4H17319P2可以在临床中心施用，也可以由患者或指定人员自行施用/施用。如果患者选择自行施用H4H17319P2或由指定人员施用H4H17319P2，则必须由合格的临床中心人员进行相关H4H17319P2施用的培训，并且必须首先观察到这种自行施用的情况。另外，在开始自行施用或由指定人员(诸如父母或护理者)施用之前，将向患者/指定人员提供药物施用日记。每次药物施用后必须完成日记。患者和/或其看护者将被要求保持日记以监测依从性。此外，给予时间将记录在患者日记中。如果患者未收到全部剂量的药物，则将记录施用量。调整剂量的原因应记录在原始文件和CRF中。
此外，将根据SOA收集血液样品以测量血清中H4H17319P2和抗H4H17319P2抗体的谷浓度。
既往和伴随治疗和程序/许可药物
除非伴随药物可能会引起强烈的潜在安全隐患，否则该方案的总体目标是使患有这种超罕见病的患者参与该方案。因此，在参与方案时，将允许患者进行慢性伴随药物治疗(例如，如下所述)。这些可以包括：
●用于治疗1型糖尿病的胰岛素制备剂；
●二甲双胍可治疗胰岛素抵抗；
●维生素D可治疗缺乏；
●甲状腺素或其他甲状腺补充剂；
●LD患者常用的其他药物包括：内分泌疗法(例如，维生素和钙补充剂)；和其他药物(例如，肉碱、辅酶Q10、维生素、抗便秘药物、抗过敏药物)；
●诺立汀，以及所需的麻醉剂或氯胺酮/利多卡因输注剂、贴剂或片剂，用于控制疼痛；
●情绪激动者；
●除低阈值药物(即抗惊厥药、地高辛、香豆素等)外，如果剂量稳定且治疗医生认为必不可少，则可以允许使用其他药物
●由患者的主治医生酌情决定是否继续血浆去除术
目前尚无关于H4H17319P2与上述治疗相互作用的数据。应警告患者及其护理人员，患者将接受的任何药物可能发生的药物相互作用可能产生的副作用。
每次访视时都会提醒该患者，如果从方案筛选到最终方案访视期间，她有必要在治疗方案期间服任何其他药物，则必须立即告知治疗方案工作人员，并且具体的药物和适应症必须与研究者讨论。在方案过程中服用的所有伴随药物必须记录在原始文件中。
违禁药物和物质及伴随程序
禁止在方案期间影响药物疗效的药物，除非主治医生认为必要，否则不得使用诸如添加新的降脂治疗药物或添加任何新的糖尿病药物。
在整个方案期间，禁止使用厌食药或具有厌食作为非罕见副作用的药物。
在方案持续时间内进行的伴随程序，包括血浆去除术和其他用于治疗不良事件的程序，应在CRF上报告。
评估和时间表
在方案期间要进行的评估计划(SOA)如图20(A-B)所示。
虽然根据2008年指导文件“针对儿科人群的药品试验的临床上的道德考量”，该单例患者方案中要求的程序和评估被分类为“无风险或最低风险”(DEXA除外，它可能被分类为“最低风险略有增加”)，但是其中包括减轻18岁以下参与者疼痛和痛苦的考虑因素。
在提供知情同意后，患者将进入筛选期。在筛选期间，将对患者进行资格评估，并指示其在3个独立天填写饥饿调查表，以增强对H4H17319P2治疗前与脂肪营养不良相关的饥饿的了解。在筛选过程中，获取任何其他病史(包括必要时的近期病历检查)也很重要。
在筛选期间将获得该患者的其他病史以及人口统计学数据。原始文档和CRF中要记录的数据包括患者的性别、种族、出生日期和伴随药物使用情况。
最近的病史将在第一次给予前的第1天获得，以评估持续方案合格性和对最终纳入/排除标准的依从性。最近的病史包括对筛选变化的审查以及对患者最近药物的审查，并评估自上次访视以来是否发生了任何变化。
将会进行全面身体检查，包括检查外周淋巴结、头、眼(包括结膜)、耳、鼻、嘴和口咽、颈、心、肺、腹部、肌肉骨骼(包括背部、四肢和神经系统)。该患者还将接受Tanner分期评估；因为她还未达到Tanner第V期。这将根据SOA进行。
研究者确定的任何具有临床意义的身体检查发现与基线相比的变化都必须在适当的CRF上记录为AE。
将根据SOA使用壁挂式测距仪测量不穿鞋的身高(cm)。
在筛选期间和每次方案访视时都会对伴随药物进行审查。患者服用的任何药物都将记录在原始文件中。
研究者意识到，随着胰岛素抵抗和高甘油三酯血症的改善，开始治疗时可能需要调整抗糖尿病药和脂质药物的剂量。在调整伴随用药物期间，将对患者进行仔细监控。接受胰岛素治疗的患者，应在治疗的前几周进行严密监测，因为可能需要每周降低频率一次(尤其是那些使用大剂量胰岛素的患者)，以免发生低血糖。类似地，对于使用高甘油三酯血症的脂质药物的患者，研究者应在治疗期间的每次随访中评估是否需要调整脂质药物的剂量，并考虑是否需要血浆去除术。如果由于某种原因而中断了药物治疗，则可能需要进一步调整伴随用药，例如，降低血脂的药物以减轻潜在的胰腺炎性风险。
每次根据SOA进行至少5分钟的休息后，就会在坐姿获得生命体征。在整个方案中，将使用相同的方法(手动或自动)进行血压(BP；mmHg)和心率(HR；bpm)测量。至少休息5分钟后，应在坐姿获得所有BP和HR测量值。所有测量均一式三份进行，相隔约2分钟。在可能的情况下，在整个方案中，应使用相同的方法(自动或手动)将BP置于非优势实验组。可以采取重复措施和更频繁的监测以显著增加BP或HR。
为了获得低谷血压读数，应指示患者在要在诊所测量生命体征的方案日不要服用方案药物，而要在诊所服用。根据SOA的规定，这在治疗1次访视期间尤其重要，在该治疗期间，在临床用药后的整个过程中将对血压进行更严格的监测。
休息至少5分钟后，就可以在坐姿获得体温(℃)和呼吸速率(呼吸/分钟)。
在仰卧位休息至少10分钟后，将执行单12导程心电图检查。
应由当地实验室进行临床安全实验室测试，患者应禁食8小时。给予前应进行安全实验室测试。
所有具有临床意义的实验室异常都将通过重复测试进行随访，并根据研究者的判断进行进一步调查。
肝功能检查异常将根据FDA指南(2009)进行评估。禁食状态下将采集血液学和临床化学样品。将获得全血细胞计数以及血小板计数和标准指数。
●化学：钠、钾、氯、CO2、白蛋白、总蛋白、葡萄糖、血尿素氮(BUN)、肌酐、尿酸、天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、γ-谷氨酰转肽酶(GGT)、肌酸磷酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、总胆红素、直接胆红素、乳酸脱氢酶(LDH)、钙和磷。
●尿液分析：pH值、葡萄糖、蛋白质、酮、胆红素、血液、尿胆素原、比重、亚硝酸盐和白细胞，可通过浸棒分析或机器尿液分析。如果浸棒的阳性发现需要进一步检查，将进行尿液镜检。
●凝血特征：凝血酶原时间(PT)或国际标准化比值(INR)，以及部分促凝血酶原激酶时间(PTT)，也称为活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)。
在方案期间，将对注射部位进行仔细检查、评估和评分。注射部位评估将包括红斑、水肿和硬结区域的鉴定和测量，以及局部疼痛、压痛和瘙痒的存在。
根据临床状况，可能还会记录计划外的评估。
抗药物抗体(ADA)的测量
在给药之前，然后在SOA中确定的时间点，将收集用于测量抗药物抗体的血样。如果该患者的ADA阳性，将对其进行跟踪直至解决。
患者问卷
经过认真培训后，患者和/或她的看护人将回答患者问卷。
饥饿得分
根据SOA，将使用分为3部分的问卷以及在特定方案访视中提出的2个全局问题对饥饿进行评估。饥饿将使用0-10的数字评分来评估；0＝一点不饿，10＝可能最饿。将通过要求患者根据类似Likert的量表对饥饿进行评分来评估所有每日饥饿问卷得分，其中0为一点不饿，10为可能最饿。饥饿问卷分数将在患者早饭前每天记录。饥饿问卷应在筛选期间的三个独立天中完成，并在早晨给药之前在诊所就诊。患者将在早饭之前(禁食)记录他们的饥饿评分。整体饥饿问题：根据评估时间表，在某些方案访问中将询问两个整体问题。
SF-36健康问卷
SF-36是一种多功能的简短健康调查，仅包含36个问题。它提供了一个8级的功能健康和健康分数概况，以及基于心理测量的身心健康总结指标以及基于偏爱的健康效用指数。与针对特定年龄、疾病或治疗组的措施相反，这是一种通用措施。因此，事实证明，SF-36可用于一般人群和特定人群的调查，比较疾病的相对负担以及区分多种不同治疗所产生的健康益处。
患者健康问卷9(PHQ-9)
PHQ-9是“患者健康调查表”的九项抑郁量表。PHQ-9是协助临床医生诊断抑郁症以及选择和监测治疗的工具。患者完成PHQ-9问卷后，由方案工作人员进行评分。
如果在方案中的任何时候，单个患者的PHQ-9得分≥10，则应将其转诊至MHP。PHQ-9将根据SOA实施。
哥伦比亚自杀严重等级量表(C-SSRS)
C-SSRS是一种工具，不仅可以用来预测自杀企图，还可以评估所有基于证据的想法和行为项目，以及下一步的标准(例如，转介给心理健康专业人员(MHP))。根据SOA，此方案将使用两种版本的C-SSRS：(1)量表的基线/筛选版本结合了基线和筛选表格，以评估患者一生中和在预定时间期内的自杀倾向。该版本可以评估患者的终生自杀意愿，以用于数据收集以及基于纳入/排除标准的资格。(2)该量表的“自上次访视以来”评估了患者自上次访视以来的自杀倾向。该版本旨在评估已完成至少一项初始C-SSRS评估的患者，并应在以后的每次访视中使用。C-SSRS的“自上次访视以来”版本询问患者/参与者自上次施用C-SSRS以来可能具有的任何自杀念头或行为。
如果在方案中的任何时候患者具有4型或5型自杀意念或任何自杀行为，则应将患者称为MHP。
在确定患者资格的筛选期之后，患者将进入治疗期1。在此阶段，将在方案第1天静脉内施用第一剂量的H4H17319P2。首次皮下(SC)剂量施用将在方案第5天进行。患者将每周返回诊所进行剂量施用。实验室和测试评估如图20所示。
以下各节将详细介绍此方案期间要进行的安全性、实验室、PK和ADA评估。
从筛选访视开始，将要求患者在所有访视前一天禁食过夜。在每次诊所访视的早晨，她都可以喝一点水来服用常规药物。
在筛选期间，评估可能会持续数天。为了获得分别在3个单独天之内收集到的相关联饥饿症状的基线数据，筛选期应至少为3天，最多2周。
为了向该患者和方案人员提供临床访视次数的灵活性，临床访视的实际安排可以允许访视时间的灵活性。在治疗期1和治疗期2之间，目标是在+/-3天内进行访视。即使在访视窗口之外，收集的所有数据也将包括在端点分析中。
不良事件的监测将在整个方案中进行。从筛选到最终方案访视，不良事件将记录在CRF中。在开始药物施用后发生的不良事件将被视为治疗出现的不良事件(TEAE)。SAE将通过最终方案访视记录。应监测所有不良事件，直到它们得到解决或明确确定是由于患者的稳定或慢性病或并发疾病引起的。
不良事件：定义、文档和报告
不良事件(AE)是与人类使用药物相关的任何不良医学事件，无论是否与药物相关。不良事件(也称为不良经历)可以是任何与药物使用相关的不利且意想不到的征象(例如，实验室检查结果异常)、症状或疾病，而无需对因果关系做出任何判断。AE可以来源于任何药物使用(例如，标示外使用，与另一种药物组合使用)和任何给药途径、配制或剂量(包括过量)。
H4H17319P2在首次人类研究中具有良好的耐受性。报告了与药物相关的TEAE(研究者认为该不良事件可能与药物相关联或与药物相关联)。由于迄今为止H4H17319P2的临床经验非常有限，因此可能还有其他未知的副作用。在发生临床紧急情况时，PI(或负责临床医生)将始终可供方案参与者使用；这种可用性以及在紧急情况下如何与研究者联系的方法将通过口头和书面形式清楚地传达给方案参与者。所有方案干预措施将免费提供。
如果研究者或资助者认为，AE或怀疑的不良反应为严重(SAE)，则可导致以下任何结果：
●死亡。
●威胁生命。威胁生命的是指患者在发生反应时立即处于死亡风险的状态，即，它不包括可能以更严重的形式假设可能导致死亡的反应。
●住院或延长现有住院时间。如果疾病或疾病在患者纳入方案之前就已经存在，原计划在方案期间发生但计划在方案进入之前计划的住院入院和/或外科手术将不被认为是AE，只要该疾病在方案中未以意外的方式恶化(例如，手术早于计划)。
●进行正常生活功能的能力持续或严重丧失工作能力或严重中断。
●重要医疗事件。重要的医疗事件是可能不会导致死亡，危及生命或需要住院的事件，但根据适当的医学判断，如果该事件可能会危及患者或患者的病情并且可能需要进行医学或外科手术，以防止SAE定义中列出的结果之一，则可以视为SAE。此类医疗事件的实例包括需要在急诊室或家中进行强化治疗的过敏性支气管痉挛、不会导致住院治疗的血液动力学障碍或抽搐、或者发展为药物依赖性或药物滥用。
不良事件的监测和观察期
必须仔细监测每位患者的不良事件发生情况。该信息应为非引导性问题的形式(例如“您感觉如何？”)以及每次检查中发现的体征和症状、方案人员的观察以及患者的自发报告来获得。
从筛选到最终方案访视(包括最终方案访视)，不良事件将记录在原始文件中。自签署ICF以来，SAE和死亡将记录在SAE CRF中，并一直持续到最终方案访视。应监测所有AE，直到它们得到解决或明确确定是由于患者的稳定或慢性病或并发疾病引起的。
患者自发报告的和/或响应方案人员的一个开放性问题或通过观察、身体检查或其他诊断程序发现的所有不良事件(严重和非严重)将记录在适当的CRF上。实验室评估或其他临床发现中任何与临床相关的恶化都被认为是AE，并且必须记录在适当的CRF上。在可能的情况下，应将指示常见潜在病理的体征和症状视为一项全面事件。
在研究方案完成后任何时候出现的、研究人员认为与药物相关联的任何SAE，都必须报告给资助者。
在研究过程中发生的所有SAE必须由研究者在研究者意识到SAE的24小时内向医学监测仪报告。无论是否认为与药物有因果关系，必须报告所有SAE。将填写SAE表格，收集的信息将包括事件的患者数、叙述性描述(可能包括相关病史、伴随用药以及相关的实验室和诊断测试结果)，并由调查员评估该事件的严重性、事件和与药物的关系。资助者或其指定人员可能会要求提供相关SAE的随访信息。
所有SAE对应都应与资助者进行沟通。
在治疗期间，将在中心诊所就诊期间对患者进行仔细监控，并且方案工作人员会定期给患者打电话。如果患者因AE而退出治疗，则应鼓励患者完成最终方案/尽早终止访视，以监测事件的解决情况并获得附加的方案定义的安全性评估。
如上所述，如果患者的PHQ-9得分大于10，有任何自杀行为或在C-SSRS上有任何4型或5型自杀意念，则应转给MHP。如果研究者认为出于患者安全考虑，也应转给MHP。如果可以通过心理和/或药物疗法适当治疗患者的精神病，则应由MHP决定是否继续进行该患者治疗。
如果出现与药物使用相关的严重、意外药物不良反应，将尽快通知适当的监管机构、伦理委员会(EC)和所有参与研究者。研究者有责任在IRB/IEC要求的情况下，将涉及风险对人类患者的所有意料之外的严重药物不良反应迅速通知机构审查委员会(IRB)/独立伦理委员会(IEC)。意外事件是IB中未报告的事件。
对于严重和非严重不良事件，研究者必须确定事件的强度以及事件与H4H17319P2施用的关系。只有那些研究者认为具有临床意义的注射部位反应才会记录为AE。
将根据CTCAE版本4.03对所有AE的强度进行分级，包括临床上显著的治疗中出现的实验室异常、注射部位反应和潜在的全身反应。CTCAE等级是指AE的严重度，范围从1级(轻度AE)、2级(中度AE)、3级(严重AE)和4级(危及生命的或致残性AE)到5级(与死亡相关的AE)。
CTCAE未列出的不良事件将被评级如下：
●轻度：注意到不适，但正常日常活动没有中断。
●中度：不适感足以减少或影响日常活动。
●严重：无法工作或进行正常的日常活动。
●威胁生命：表示对生命的直接威胁。
与H4H17319P2施用的关系将由研究者根据以下标准确定：
●无：事件与药物施用之间没有关系。该事件与其他病因，诸如伴随药物或患者的临床状态相关联。
●不太可能：目前的知识状态表明不太可能与H4H17319P2有关系，或者时间上的关系使得H4H17319P2与观察到的事件没有任何合理的关联。
●可能：发生从H4H17319P2的施用起似乎合理的时间顺序并遵循对可疑药物的已知反应模式的反应。该反应可能是由于患者的临床状态或施用于患者的其他疗法方式引起的。
●很可能：发生从H4H17319P2的施用起似乎合理的时间顺序并遵循已知的药物反应模式的反应。该反应不能通过患者临床状态的已知特征或施用于患者的其他疗法方式进行合理解释。
出于安全性分析的目的，所有被分类为可能或很可能的AE均被视为治疗相关事件。
施用要求
良好临床规范
该方案将根据国际良好临床规范统一委员会(ICH)和适当的法规要求进行。研究者将完全熟悉方案和IB中所述药物的正确用法。将维护必要的临床文件以证明方案的有效性和所收集数据的完整性。主文件应在方案开始时建立，并在方案期间保持不变，并根据适当的规定进行保留。
伦理考量
该方案将根据赫尔辛基宣言中确立的伦理原则进行。IRB/IEC将审查所有适当的方案文件，以维护患者的权利、安全和健康。该方案仅在获得IRB/IEC批准的中心进行。研究者将向IRB/IEC提供方案、IB、知情同意书、广告(如果适用)、给患者的书面信息(包括日记卡)、安全性更新、年度进度报告以及对这些文件的任何修订。
H4H17319P2将治疗患者的局部脂肪营养不良(PLD)以及减轻患者的肝脾肿大、高甘油三酯和患者四肢脂肪缺乏的情况，这与PLD相关联。
实施例23和24：激动剂抗LEPR抗体在先天性瘦蛋白缺乏和先天性LEPR缺乏的小鼠模型中的作用
在由于功能丧失突变引起的先天性瘦蛋白缺乏和先天性瘦蛋白受体缺陷的鼠科动物模型中确定了本发明的特定激动剂抗LEPR抗体H4H17319P2对血糖水平、体重、食物摄入量和身体组成(脂肪质量、瘦体质量和骨骼质量)的作用。经基因工程改造的、表达瘦蛋白受体的Leprhu/huLep-/-小鼠被用作先天性瘦蛋白缺乏的鼠科动物模型，所述瘦蛋白受体由人LEPR胞外结构域序列代替鼠科动物LEPR胞外结构域序列组成，并且不表达瘦蛋白。先天性LEPR缺乏的模型是基因工程改造的LeprhuA409E/huA409E小鼠，它们表达瘦蛋白受体，所述受体由人LEPR胞外结构域序列组成，具有错义的A409E突变，代替鼠科动物LEPR胞外结构域序列。
实施例23：H4H174319P2在先天性瘦蛋白缺乏鼠科动物模型中的作用
在第0天，根据体重将十六只27至32周龄雌性Leprhu/huLep-/-小鼠分层为两组。每组通过皮下注射在第0、7、14、21、28和35天每周接受10mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体或10mg/kg H4H17319P2一次。七只27至32周龄雌性Leprhu/hu对照小鼠在第0、7、14、21、28和35天每周通过皮下注射施用10mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体一次。在第-5天和第35天，通过CT定量身体组成。在研究期间测量每只动物的食物摄入量、体重和血糖水平。图21汇总了每个治疗组的血糖水平、体重和累积食物摄入量。图22汇总了每个抗体治疗组中动物的脂肪质量、瘦体质量和骨骼质量，如抗体治疗前5天和治疗后35天通过CT所定量。所有结果均表示为平均值±SEM。
如图21A所示，在抗体施用前第0天，瘦蛋白缺乏型Leprhu/huLep-/-小鼠与对照Leprhu/hu小鼠相比具有高血糖。与注射同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠相比，用H4H17319P2以10mg/kg剂量处理的瘦蛋白缺乏型小鼠表现出血糖水平显著降低，如在抗体治疗后第2天和其他后续时间点所测量。接受10mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠Leprhu/huLep-/-在所有测量的时间点都保持高血糖。
如图21B所示，在抗体施用前第0天，瘦蛋白缺乏型Leprhu/huLep-/-小鼠与对照Leprhu/hu小鼠相比显著更重。与注射同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠相比，用H4H17319P2以10mg/kg剂量处理的瘦蛋白缺乏型小鼠表现出体重显著降低，如在抗体治疗后第15天和其他后续时间点所测量。接受10mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠Leprhu/huLep-/-在所有测量的时间点都未显示出体重从基线的降低。
如图21C所示，与注射同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠相比，瘦蛋白缺乏型Leprhu/huLep-/-小鼠在H4H17319P2治疗后和其他后续测量时间点两天内的累积食物摄入量显著降低。
如图22所示，在第-5天施用抗体前，与Leprhu/hu小鼠相比，瘦蛋白缺乏型Leprhu/ huLep-/-小鼠显示出脂肪质量显著增加、瘦体质量减少和骨骼质量减少。在第35天，与注射同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠相比，用10mg/kg H4H17319P2治疗的瘦蛋白缺乏型Leprhu/huLep-/小鼠表现出脂肪质量显著减少，并且瘦体质量和骨骼质量增加。
实施例24
在第0天，根据体重将二十只24至28周龄雄性LeprhuA409E/huA409E小鼠分层为两组。每组通过皮下注射在第0、7、14、21、28、35和42天每周接受5mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体或5mg/kg H4H17319P2一次。八只24至28周龄雄性Leprhu/hu对照小鼠在第0、7、14、21、28、35和42天每周通过皮下注射施用5mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体一次。在第-1天和第41天，通过CT定量身体组成。在研究期间测量每只动物的食物摄入量、体重和血糖水平。图23汇总了每个治疗组的血糖水平、体重和累积食物摄入量。图24汇总了每个抗体治疗组中动物的脂肪质量、瘦体质量和骨骼质量，如抗体治疗前-1天和治疗后41天通过CT所定量。所有结果均表示为平均值±SEM。
如图23A所示，在抗体施用前第0天，瘦蛋白受体缺乏型LeprhuA409E/huA409E小鼠与对照Leprhu/hu小鼠相比具有高血糖。与注射同种型对照(IgG4P)抗体的LeprhuA409E/huA409E小鼠相比，用H4H17319P2以5mg/kg剂量处理的LeprhuA409E/huA409E小鼠表现出血糖水平显著降低，如在抗体治疗后第7天和其他后续时间点所测量。接受5mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠LeprhuA409E/huA409E在所有测量的时间点都保持高血糖。
如图23B所示，在抗体施用前第0天，瘦蛋白受体缺乏型LeprhuA409E/huA409E小鼠与对照Leprhu/hu小鼠相比显著更重。与注射同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白受体缺乏型小鼠相比，用H4H17319P2以5mg/kg剂量处理的LeprhuA409E/huA409E小鼠表现出体重显著降低，如在抗体治疗后第13天和其他后续时间点所测量。接受5mg/kg同种型对照(IgG4P)抗体的LeprhuA409E/huA409E在所有测量的时间点都未显示出体重从基线的降低。
如图23C所示，与注射同种型对照(IgG4P)抗体的瘦蛋白缺乏型小鼠相比，LeprhuA409E/huA409E在H4H17319P2治疗后和其他后续测量时间点7天内的累积食物摄入量显著降低。
如图24所示，在第-1天施用抗体前，与Leprhu/hu小鼠相比，LeprhuA409E/huA409E小鼠显示出肥胖倾向显著增加、瘦体质量减少和骨骼质量减少。在第41天，与注射同种型对照(IgG4P)抗体的LeprhuA409E/huA409E小鼠相比，用5mg/kg H4H17319P2治疗的瘦蛋白缺乏型LeprhuA409E/huA409E小鼠表现出脂肪质量显著减少，并且瘦体质量和骨骼质量增加。
本发明在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，除了本文中所述的那些内容之外，所属领域的技术人员根据前述说明和附图将显而易知本发明的各种修改。此类修改旨在落在所附权利要求书的范围内。
序列表
<110> 瑞泽恩制药公司
J·科洛马达
P·史蒂维斯
J·阿尔塔雷霍斯
A·J·莫菲
<120> 用于治疗代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的瘦蛋白受体激动剂抗体
<130> 9774.436WO1/10436WO01
<140> TBD
<141> 2019-04-05
<160> 120
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
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tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt tccgatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggaatg ggtggcagtt atttattatg atggaaatta tcaatactat 180
gaagactccg ttaagggtcg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cacgctggat 240
ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggctgtat atttctgtgc gcgtctcaac 300
tgggattact ggtatctcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 2
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Asn Tyr Gln Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Leu Asp Leu Trp Gly Arg Gly
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Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<220>
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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<220>
<223> 合成
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gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
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<223> 合成
<400> 24
Ala Ser Tyr Asn Trp Asn Tyr Trp Tyr Phe Asp Phe
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<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctgcaaatga gcagcctgcg agccgacgac tcggctctat attactgtgc gcgtctcaac 300
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1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ile Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Thr Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Asp Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
ggattcacct tcagtacata tgcc 24
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala
1 5
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
ttatactctg atggaagtaa taaa 24
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 31
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
gcgcgtctca actgggatta ctggtacttc gatctc 36
<210> 32
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Ala Arg Leu Asn Trp Asp Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 33
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgaag cgtctggatt cagcagcagt gacaatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatatcatg atggaagtta taaatactat 180
gaagactccg tgaagggccg attcaccatc gccagagaca attccaagaa cacgctttat 240
ttgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtat attactgtgc gaggtataac 300
tggaaccact ggtacttcga tgtctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357
<210> 34
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Ser Ser Ser Asp Asn
20 25 30
Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr His Asp Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Glu Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asn Trp Asn His Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Arg Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
ggattcagca gcagtgacaa tgcc 24
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Gly Phe Ser Ser Ser Asp Asn Ala
1 5
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
atatatcatg atggaagtta taaa 24
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Ile Tyr His Asp Gly Ser Tyr Lys
1 5
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
gcgaggtata actggaacca ctggtacttc gatgtc 36
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Ala Arg Tyr Asn Trp Asn His Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 41
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgtcagtt atatcatatg acgaaagtaa taagtactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatt tctagagaca attccaagaa cgcgctgtat 240
ttacaaatga acagcctgag aaatgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatcgg 300
ccttttggat tggttaccgg atggttcgac ccctggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 360
tcctca 366
<210> 42
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Ser Tyr Asp Glu Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ala Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asn Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Arg Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
ggattcacct tcagtaccta tggc 24
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Gly
1 5
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
atatcatatg acgaaagtaa taag 24
<210> 46
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Ile Ser Tyr Asp Glu Ser Asn Lys
1 5
<210> 47
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
gcgagagatc ggccttttgg attggttacc ggatggttcg acccc 45
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Ala Arg Asp Arg Pro Phe Gly Leu Val Thr Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 49
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cgtctggatt cagtttcaat acctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtgacaatt atatggtatg atggaagtat taaatactat 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attattgtgc gagaggtgga 300
tatagtggct acctctactt tgactactgg ggccagggaa ccctggtcac cgtctcctca 360
<210> 50
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Thr Ile Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 51
ggattcagtt tcaataccta tggc 24
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 52
Gly Phe Ser Phe Asn Thr Tyr Gly
1 5
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 53
atatggtatg atggaagtat taaa 24
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 54
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Ile Lys
1 5
<210> 55
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 55
gcgagaggtg gatatagtgg ctacctctac tttgactac 39
<210> 56
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 56
Ala Arg Gly Gly Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 372
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 57
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agcggtggtg actactggag ctggatccgc 120
cagctcccag ggaagggcct ggagtggatt gggtacatct attacagtgg gagcgcctac 180
tataatccgt ccctcaagag tcgaggtacc atatcaatag acacgtctaa gaaccagttc 240
tccctgaagc tgacctctgt gactgccgcg gacacggccg tatatttctg tgtgaaatta 300
cgatttttgg agtggttctt ggggggctgg ttcggcccct ggggccaggg aaccctggtc 360
accgtctcct ca 372
<210> 58
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 58
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Gly Asp Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Gly Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 59
ggtggctcca tcagcagcgg tggtgactac 30
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 60
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 61
atctattaca gtgggagcgc c 21
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 62
Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Ala
1 5
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 63
gtgaaattac gatttttgga gtggttcttg gggggctggt tcggcccc 48
<210> 64
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 64
Val Lys Leu Arg Phe Leu Glu Trp Phe Leu Gly Gly Trp Phe Gly Pro
1 5 10 15
<210> 65
<211> 351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 65
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc cgggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc aactatggca tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct attactggtg gtggtggtag cacatactac 180
tcaaactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacggtgtat 240
ctgcgaatga acagtgtgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gaaatataag 300
tggaacttcg tggacgactg gggccaggga accacggtca ccgtctcctc a 351
<210> 66
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 66
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Met Asn Ser Val Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 67
ggattcacct ttagcaacta tggc 24
<210> 68
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 68
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly
1 5
<210> 69
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 69
attactggtg gtggtggtag caca 24
<210> 70
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 70
Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 71
gcgaaatata agtggaactt cgtggacgac 30
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 72
Ala Lys Tyr Lys Trp Asn Phe Val Asp Asp
1 5 10
<210> 73
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 73
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgttg cctctggatt caccttcaat aaatacgaca tgcactgggt ccgccaaact 120
actggaaaag gtctagagtg ggtctcaggt attgatactg atggtgacac atactatcca 180
ggctccgtga agggccgatt caccatctcc agagaaaatg ccgagaactc cctgtatctt 240
caaatgaacg gcctgagagt cggggacacg gctgtgtatt actgtgcaag atggccttgg 300
agtggtttct atggtgcttt tgatatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360
<210> 74
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Thr Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Gly Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Glu Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Gly Leu Arg Val Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 75
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 75
ggattcacct tcaataaata cgac 24
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 76
Gly Phe Thr Phe Asn Lys Tyr Asp
1 5
<210> 77
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 77
attgatactg atggtgacac a 21
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 78
Ile Asp Thr Asp Gly Asp Thr
1 5
<210> 79
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 79
gcaagatggc cttggagtgg tttctatggt gcttttgata tc 42
<210> 80
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 80
Ala Arg Trp Pro Trp Ser Gly Phe Tyr Gly Ala Phe Asp Ile
1 5 10
<210> 81
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 81
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcacagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtggtaatt actactggaa ctggatccgc 120
caacagccag gagagggcct ggagtggatt gcttacatct atcacaatgg ggtcaccaac 180
ttcaatccgt ccctcaagag tcgacttact atatcagtag acacgtctaa gactcagttc 240
tccctgaagt tgaggtctgt gactgccgcg gacacggccg tttattactg tgcgagatca 300
ggcagctggt tcgagaactg gtacttcgat ctctggggcc gtggcaccct ggtcactgtc 360
tcctca 366
<210> 82
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 82
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Gln Pro Gly Glu Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Tyr Ile Tyr His Asn Gly Val Thr Asn Phe Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Thr Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ser Gly Ser Trp Phe Glu Asn Trp Tyr Phe Asp Leu Trp
100 105 110
Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 83
ggtggctcca tcagcagtgg taattactac 30
<210> 84
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 84
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Asn Tyr Tyr
1 5 10
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 85
atctatcaca atggggtcac c 21
<210> 86
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 86
Ile Tyr His Asn Gly Val Thr
1 5
<210> 87
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 87
gcgagatcag gcagctggtt cgagaactgg tacttcgatc tc 42
<210> 88
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 88
Ala Arg Ser Gly Ser Trp Phe Glu Asn Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
<210> 89
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 89
gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccttg gacgttcggc 300
caagggacca aggtggaaat caaa 324
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 90
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
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<211> 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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cagagtgtta gcagcagcta c 21
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
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<223> 合成
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<223> 合成
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Gly Ala Ser
1
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<223> 合成
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cagcagtatg gtagctcacc ttggacg 27
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<211> 9
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Trp Thr
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<220>
<223> 合成
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caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagt aattcctact ggagctggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggatat gtctattccc gtgggaacac caagtacaac 180
ccctccctca cgagtcgagt caccatgtca tttgacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aaactgaggt ctgtgaccgc cgcagacacg gccgtgtatt actgtgcgag aagcagcagc 300
tggtacgagg actggtactt cgatctctgg ggccgtggca ccctggtcac tgtctcctca 360
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 98
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Val Tyr Ser Arg Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Pro Ser Leu Thr
50 55 60
Ser Arg Val Thr Met Ser Phe Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Arg Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Ser Ser Ser Trp Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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ggtggctcca tcagtaattc ctac 24
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ser Tyr
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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gtctattccc gtgggaacac c 21
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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Val Tyr Ser Arg Gly Asn Thr
1 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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gcgagaagca gcagctggta cgaggactgg tacttcgatc tc 42
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 104
Ala Arg Ser Ser Ser Trp Tyr Glu Asp Trp Tyr Phe Asp Leu
1 5 10
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<220>
<223> 合成
<400> 105
caggtgcagc tacagcagtg gggcgcaggg ctgtttaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcgatg tctatggtgg gtccttcaga ggttattatt ggagttggat ccgccagccc 120
ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcagttata gtggtttcac caattacaac 180
ccgtccctca agagtcgagt catcatatca atagatacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagatgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtttatt actgtgcgag agttacctat 300
ggttatggga cctttgatta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 106
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Phe Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Asp Val Tyr Gly Gly Ser Phe Arg Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ile Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<220>
<223> 合成
<400> 107
ggtgggtcct tcagaggtta ttat 24
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 108
Gly Gly Ser Phe Arg Gly Tyr Tyr
1 5
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
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atcagttata gtggtttcac c 21
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<212> PRT
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<220>
<223> 合成
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Ile Ser Tyr Ser Gly Phe Thr
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<212> DNA
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<220>
<223> 合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 112
Ala Arg Val Thr Tyr Gly Tyr Gly Thr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 1165
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hLEPR登录号P48357
<400> 113
Met Ile Cys Gln Lys Phe Cys Val Val Leu Leu His Trp Glu Phe Ile
1 5 10 15
Tyr Val Ile Thr Ala Phe Asn Leu Ser Tyr Pro Ile Thr Pro Trp Arg
20 25 30
Phe Lys Leu Ser Cys Met Pro Pro Asn Ser Thr Tyr Asp Tyr Phe Leu
35 40 45
Leu Pro Ala Gly Leu Ser Lys Asn Thr Ser Asn Ser Asn Gly His Tyr
50 55 60
Glu Thr Ala Val Glu Pro Lys Phe Asn Ser Ser Gly Thr His Phe Ser
65 70 75 80
Asn Leu Ser Lys Thr Thr Phe His Cys Cys Phe Arg Ser Glu Gln Asp
85 90 95
Arg Asn Cys Ser Leu Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val
100 105 110
Ser Thr Val Asn Ser Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn
115 120 125
Ile Gln Cys Trp Leu Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val
130 135 140
Glu Ser Leu Phe Lys Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His
145 150 155 160
Leu Leu Tyr Val Leu Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro
165 170 175
Gln Lys Gly Ser Phe Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu
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Cys Cys Glu Cys Leu Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr
195 200 205
Leu Leu Met Cys Leu Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser
210 215 220
Pro Leu Met Ser Val Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro
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Leu Gly Leu His Met Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser
245 250 255
Trp Ser Ser Pro Pro Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys
260 265 270
Tyr Ser Glu Asn Ser Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val
275 280 285
Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr
290 295 300
Glu Val Gln Val Arg Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser
305 310 315 320
Asp Trp Ser Thr Pro Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe
325 330 335
Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys
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Ile Tyr Lys Lys Glu Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp
355 360 365
Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val
370 375 380
Ser Asp His Val Ser Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys
385 390 395 400
Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His
405 410 415
Glu Cys His His Arg Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile
420 425 430
Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg
435 440 445
Trp Ser Thr Ser Thr Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu
450 455 460
Arg Tyr His Arg Ser Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His
465 470 475 480
Pro Ile Ser Glu Pro Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr
485 490 495
Glu Cys Ile Phe Gln Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp
500 505 510
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Ala Glu Ile Thr Ile Asn Ile Gly Leu Leu Lys Ile Ser Trp Glu Lys
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Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu
565 570 575
Ser Gly Lys Glu Val Gln Trp Lys Met Tyr Glu Val Tyr Asp Ala Lys
580 585 590
Ser Lys Ser Val Ser Leu Pro Val Pro Asp Leu Cys Ala Val Tyr Ala
595 600 605
Val Gln Val Arg Cys Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn
610 615 620
Trp Ser Asn Pro Ala Tyr Thr Val Val Met Asp Ile Lys Val Pro Met
625 630 635 640
Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg Ile Ile Asn Gly Asp Thr Met Lys Lys
645 650 655
Glu Lys Asn Val Thr Leu Leu Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser
660 665 670
Leu Cys Ser Val Gln Arg Tyr Val Ile Asn His His Thr Ser Cys Asn
675 680 685
Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val Gly Asn His Thr Lys Phe Thr Phe Leu
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Trp Thr Glu Gln Ala His Thr Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile
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Gly Ala Ser Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser
725 730 735
Lys Val Asn Ile Val Gln Ser Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Asn Ser Ser
740 745 750
Cys Val Ile Val Ser Trp Ile Leu Ser Pro Ser Asp Tyr Lys Leu Met
755 760 765
Tyr Phe Ile Ile Glu Trp Lys Asn Leu Asn Glu Asp Gly Glu Ile Lys
770 775 780
Trp Leu Arg Ile Ser Ser Ser Val Lys Lys Tyr Tyr Ile His Asp His
785 790 795 800
Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Ile Phe Met
805 810 815
Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys Ile Ile Asn Ser Phe Thr Gln Asp Asp
820 825 830
Ile Glu Lys His Gln Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Val Ile Val Pro Val
835 840 845
Ile Ile Ser Ser Ser Ile Leu Leu Leu Gly Thr Leu Leu Ile Ser His
850 855 860
Gln Arg Met Lys Lys Leu Phe Trp Glu Asp Val Pro Asn Pro Lys Asn
865 870 875 880
Cys Ser Trp Ala Gln Gly Leu Asn Phe Gln Lys Pro Glu Thr Phe Glu
885 890 895
His Leu Phe Ile Lys His Thr Ala Ser Val Thr Cys Gly Pro Leu Leu
900 905 910
Leu Glu Pro Glu Thr Ile Ser Glu Asp Ile Ser Val Asp Thr Ser Trp
915 920 925
Lys Asn Lys Asp Glu Met Met Pro Thr Thr Val Val Ser Leu Leu Ser
930 935 940
Thr Thr Asp Leu Glu Lys Gly Ser Val Cys Ile Ser Asp Gln Phe Asn
945 950 955 960
Ser Val Asn Phe Ser Glu Ala Glu Gly Thr Glu Val Thr Tyr Glu Asp
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Ser Lys Pro Ser Glu Thr Gly Glu Glu Gln Gly Leu Ile Asn Ser Ser
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Val Thr Lys Cys Phe Ser Ser Lys Asn Ser Pro Leu Lys Asp Ser
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Leu Ser Asp Gln His Pro Asn Ile Ile Ser Pro His Leu Thr Phe
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Ser Glu Gly Leu Asp Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly Asn Phe Pro
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Glu Glu Asn Asn Asp Lys Lys Ser Ile Tyr Tyr Leu Gly Val Thr
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Ser Ile Lys Lys Arg Glu Ser Gly Val Leu Leu Thr Asp Lys Ser
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Arg Val Ser Cys Pro Phe Pro Ala Pro Cys Leu Phe Thr Asp Ile
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Arg Val Leu Gln Asp Ser Cys Ser His Phe Val Glu Asn Asn Ile
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Asn Leu Gly Thr Ser Ser Lys Lys Thr Phe Ala Ser Tyr Met Pro
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Gln Phe Gln Thr Cys Ser Thr Gln Thr His Lys Ile Met Glu Asn
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Lys Met Cys Asp Leu Thr Val
1160 1165
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<220>
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myc-myc-六组氨酸标签六组氨酸标签
<400> 114
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Cys Ala Asp Asn Ile Glu Gly Lys Thr Phe Val Ser Thr Val Asn Ser
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Leu Val Phe Gln Gln Ile Asp Ala Asn Trp Asn Ile Gln Cys Trp Leu
100 105 110
Lys Gly Asp Leu Lys Leu Phe Ile Cys Tyr Val Glu Ser Leu Phe Lys
115 120 125
Asn Leu Phe Arg Asn Tyr Asn Tyr Lys Val His Leu Leu Tyr Val Leu
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Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe
145 150 155 160
Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu
165 170 175
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Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro
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Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser
245 250 255
Thr Thr Val Ile Arg Glu Ala Asp Lys Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu
260 265 270
Leu Val Asp Ser Ile Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg
275 280 285
Gly Lys Arg Leu Asp Gly Pro Gly Ile Trp Ser Asp Trp Ser Thr Pro
290 295 300
Arg Val Phe Thr Thr Gln Asp Val Ile Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu
305 310 315 320
Thr Ser Val Gly Ser Asn Val Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Lys Glu
325 330 335
Asn Lys Ile Val Pro Ser Lys Glu Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala
340 345 350
Glu Lys Ile Pro Gln Ser Gln Tyr Asp Val Val Ser Asp His Val Ser
355 360 365
Lys Val Thr Phe Phe Asn Leu Asn Glu Thr Lys Pro Arg Gly Lys Phe
370 375 380
Thr Tyr Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu His Glu Cys His His Arg
385 390 395 400
Tyr Ala Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu
405 410 415
Thr Asp Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Thr Ser Thr
420 425 430
Ile Gln Ser Leu Ala Glu Ser Thr Leu Gln Leu Arg Tyr His Arg Ser
435 440 445
Ser Leu Tyr Cys Ser Asp Ile Pro Ser Ile His Pro Ile Ser Glu Pro
450 455 460
Lys Asp Cys Tyr Leu Gln Ser Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Ile Phe Gln
465 470 475 480
Pro Ile Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His
485 490 495
Ser Leu Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser
500 505 510
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515 520 525
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580 585 590
Lys Arg Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Asn Pro Ala
595 600 605
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<212> PRT
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<220>
<223> hLEPR.mFc aa 1-818: P48357的F22-D839 aa 819-1051: 小鼠IgG2a
(P01863的E98-K330)
<400> 115
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130 135 140
Pro Glu Val Leu Glu Asp Ser Pro Leu Val Pro Gln Lys Gly Ser Phe
145 150 155 160
Gln Met Val His Cys Asn Cys Ser Val His Glu Cys Cys Glu Cys Leu
165 170 175
Val Pro Val Pro Thr Ala Lys Leu Asn Asp Thr Leu Leu Met Cys Leu
180 185 190
Lys Ile Thr Ser Gly Gly Val Ile Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Val
195 200 205
Gln Pro Ile Asn Met Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met
210 215 220
Glu Ile Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Ser Ser Pro Pro
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Leu Val Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Ser Glu Asn Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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275 280 285
Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Leu Pro Gln Leu
290 295 300
Phe Thr Thr Gln Asp Val Met Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser
305 310 315 320
Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe Cys Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln
325 330 335
Thr Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Met Asn Leu Ala Glu Lys
340 345 350
Ile Pro Glu Thr Gln Tyr Asn Thr Val Ser Asp His Ile Ser Lys Val
355 360 365
Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala
385 390 395 400
Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp
405 410 415
Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln
420 425 430
Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu
435 440 445
Tyr Cys Pro Asp Asn Pro Ser Ile Arg Pro Thr Ser Glu Leu Lys Asn
450 455 460
Cys Val Leu Gln Thr Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile
465 470 475 480
Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu
485 490 495
Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val
500 505 510
Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu Ile Thr Ile Asn Thr
515 520 525
Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn
530 535 540
Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Asn Gly Lys Glu Ile Gln Trp
545 550 555 560
Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Pro
565 570 575
Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg
580 585 590
Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr
595 600 605
Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg
610 615 620
Ile Met Asp Gly Asp Ile Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu
625 630 635 640
Trp Lys Pro Leu Met Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr
645 650 655
Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Gln Asp Val
660 665 670
Gly Asn Gln Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Ala Glu Ser Ala His Thr
675 680 685
Val Thr Val Leu Ala Ile Asn Ser Ile Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe
690 695 700
Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Asn Ala Val Gln Ser
705 710 715 720
Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr
725 730 735
Leu Ser Pro Asn Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys
740 745 750
Asn Leu Asn Asp Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn
755 760 765
Val Asn Lys Tyr Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys
785 790 795 800
Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Asp Ile Ala Lys Gln Gln Asn Asp
805 810 815
Ala Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Gly Glu Gln
820 825 830
Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu His His His His His His
835 840 845
<210> 120
<211> 1045
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mLEPR.hFc aa 1-818: 小鼠LEPR (NP_666258.2的L22-G839) aa
819-1045: 人IgG1 标签(P01857的D104-K330)
<400> 120
Leu Asn Leu Ala Tyr Pro Ile Ser Pro Trp Lys Phe Lys Leu Phe Cys
1 5 10 15
Gly Pro Pro Asn Thr Thr Asp Asp Ser Phe Leu Ser Pro Ala Gly Ala
20 25 30
Pro Asn Asn Ala Ser Ala Leu Lys Gly Ala Ser Glu Ala Ile Val Glu
35 40 45
Ala Lys Phe Asn Ser Ser Gly Ile Tyr Val Pro Glu Leu Ser Lys Thr
50 55 60
Val Phe His Cys Cys Phe Gly Asn Glu Gln Gly Gln Asn Cys Ser Ala
65 70 75 80
Leu Thr Asp Asn Thr Glu Gly Lys Thr Leu Ala Ser Val Val Lys Ala
85 90 95
Ser Val Phe Arg Gln Leu Gly Val Asn Trp Asp Ile Glu Cys Trp Met
100 105 110
Lys Gly Asp Leu Thr Leu Phe Ile Cys His Met Glu Pro Leu Pro Lys
115 120 125
Asn Pro Phe Lys Asn Tyr Asp Ser Lys Val His Leu Leu Tyr Asp Leu
130 135 140
Pro Glu Val Ile Asp Asp Ser Pro Leu Pro Pro Leu Lys Asp Ser Phe
145 150 155 160
Gln Thr Val Gln Cys Asn Cys Ser Leu Arg Gly Cys Glu Cys His Val
165 170 175
Pro Val Pro Arg Ala Lys Leu Asn Tyr Ala Leu Leu Met Tyr Leu Glu
180 185 190
Ile Thr Ser Ala Gly Val Ser Phe Gln Ser Pro Leu Met Ser Leu Gln
195 200 205
Pro Met Leu Val Val Lys Pro Asp Pro Pro Leu Gly Leu His Met Glu
210 215 220
Val Thr Asp Asp Gly Asn Leu Lys Ile Ser Trp Asp Ser Gln Thr Met
225 230 235 240
Ala Pro Phe Pro Leu Gln Tyr Gln Val Lys Tyr Leu Glu Asn Ser Thr
245 250 255
Ile Val Arg Glu Ala Ala Glu Ile Val Ser Ala Thr Ser Leu Leu Val
260 265 270
Asp Ser Val Leu Pro Gly Ser Ser Tyr Glu Val Gln Val Arg Ser Lys
275 280 285
Arg Leu Asp Gly Ser Gly Val Trp Ser Asp Trp Ser Ser Pro Gln Val
290 295 300
Phe Thr Thr Gln Asp Val Val Tyr Phe Pro Pro Lys Ile Leu Thr Ser
305 310 315 320
Val Gly Ser Asn Ala Ser Phe His Cys Ile Tyr Lys Asn Glu Asn Gln
325 330 335
Ile Ile Ser Ser Lys Gln Ile Val Trp Trp Arg Asn Leu Ala Glu Lys
340 345 350
Ile Pro Glu Ile Gln Tyr Ser Ile Val Ser Asp Arg Val Ser Lys Val
355 360 365
Thr Phe Ser Asn Leu Lys Ala Thr Arg Pro Arg Gly Lys Phe Thr Tyr
370 375 380
Asp Ala Val Tyr Cys Cys Asn Glu Gln Ala Cys His His Arg Tyr Ala
385 390 395 400
Glu Leu Tyr Val Ile Asp Val Asn Ile Asn Ile Ser Cys Glu Thr Asp
405 410 415
Gly Tyr Leu Thr Lys Met Thr Cys Arg Trp Ser Pro Ser Thr Ile Gln
420 425 430
Ser Leu Val Gly Ser Thr Val Gln Leu Arg Tyr His Arg Arg Ser Leu
435 440 445
Tyr Cys Pro Asp Ser Pro Ser Ile His Pro Thr Ser Glu Pro Lys Asn
450 455 460
Cys Val Leu Gln Arg Asp Gly Phe Tyr Glu Cys Val Phe Gln Pro Ile
465 470 475 480
Phe Leu Leu Ser Gly Tyr Thr Met Trp Ile Arg Ile Asn His Ser Leu
485 490 495
Gly Ser Leu Asp Ser Pro Pro Thr Cys Val Leu Pro Asp Ser Val Val
500 505 510
Lys Pro Leu Pro Pro Ser Asn Val Lys Ala Glu Ile Thr Val Asn Thr
515 520 525
Gly Leu Leu Lys Val Ser Trp Glu Lys Pro Val Phe Pro Glu Asn Asn
530 535 540
Leu Gln Phe Gln Ile Arg Tyr Gly Leu Ser Gly Lys Glu Ile Gln Trp
545 550 555 560
Lys Thr His Glu Val Phe Asp Ala Lys Ser Lys Ser Ala Ser Leu Leu
565 570 575
Val Ser Asp Leu Cys Ala Val Tyr Val Val Gln Val Arg Cys Arg Arg
580 585 590
Leu Asp Gly Leu Gly Tyr Trp Ser Asn Trp Ser Ser Pro Ala Tyr Thr
595 600 605
Leu Val Met Asp Val Lys Val Pro Met Arg Gly Pro Glu Phe Trp Arg
610 615 620
Lys Met Asp Gly Asp Val Thr Lys Lys Glu Arg Asn Val Thr Leu Leu
625 630 635 640
Trp Lys Pro Leu Thr Lys Asn Asp Ser Leu Cys Ser Val Arg Arg Tyr
645 650 655
Val Val Lys His Arg Thr Ala His Asn Gly Thr Trp Ser Glu Asp Val
660 665 670
Gly Asn Arg Thr Asn Leu Thr Phe Leu Trp Thr Glu Pro Ala His Thr
675 680 685
Val Thr Val Leu Ala Val Asn Ser Leu Gly Ala Ser Leu Val Asn Phe
690 695 700
Asn Leu Thr Phe Ser Trp Pro Met Ser Lys Val Ser Ala Val Glu Ser
705 710 715 720
Leu Ser Ala Tyr Pro Leu Ser Ser Ser Cys Val Ile Leu Ser Trp Thr
725 730 735
Leu Ser Pro Asp Asp Tyr Ser Leu Leu Tyr Leu Val Ile Glu Trp Lys
740 745 750
Ile Leu Asn Glu Asp Asp Gly Met Lys Trp Leu Arg Ile Pro Ser Asn
755 760 765
Val Lys Lys Phe Tyr Ile His Asp Asn Phe Ile Pro Ile Glu Lys Tyr
770 775 780
Gln Phe Ser Leu Tyr Pro Val Phe Met Glu Gly Val Gly Lys Pro Lys
785 790 795 800
Ile Ile Asn Gly Phe Thr Lys Asp Ala Ile Asp Lys Gln Gln Asn Asp
805 810 815
Ala Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
820 825 830
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
835 840 845
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
850 855 860
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
865 870 875 880
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
885 890 895
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
900 905 910
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
915 920 925
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
930 935 940
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
945 950 955 960
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
965 970 975
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
980 985 990
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
995 1000 1005
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
1010 1015 1020
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
1025 1030 1035
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
1040 1045

Claims (40)

1.一种用于治疗或预防代谢功能障碍或低瘦蛋白血症、或者与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的疾病或病症、或者所述疾病或病症的一个或多个症状的方法，所述方法包括将药物组合物施用于对其有需要的受试者，所述药物组合物包含结合人瘦蛋白受体(LEPR)和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述病症选自由以下各项组成的组：非酒精性脂肪肝疾病、NASH、女性不孕、闭经、激素周期异常、免疫功能受损、甲状腺机能减退、肥胖、单基因肥胖、I型糖尿病、II型糖尿病、脂肪营养不良、先天性脂肪营养不良、全身脂肪营养不良、获得性脂肪营养不良、局部脂肪营养不良、先天性局部脂肪营养不良、先天性全身脂肪营养不良、获得性局部脂肪营养不良和获得性全身脂肪营养不良。
3.如权利要求2所述的方法，其用于治疗或预防非酒精性脂肪肝疾病。
4.如权利要求2所述的方法，其用于治疗或预防先天性脂肪营养不良。
5.如权利要求2所述的方法，其用于治疗或预防全身脂肪营养不良。
6.如权利要求2所述的方法，其用于治疗或预防获得性脂肪营养不良。
7.如权利要求2所述的方法，其用于治疗或预防局部脂肪营养不良。
8.如权利要求2所述的方法，其用于治疗或预防单基因肥胖。
9.如权利要求2所述的方法，其中所述与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的病症是先天性脂肪营养不良，并且
其中在施用所述结合人LEPR的抗体或其抗原结合片段后，所述与先天性脂肪营养不良相关联的症状得到预防、或改善、或严重度和/或持续时间减轻/缩短、或减少。
10.如权利要求9所述的方法，其中在施用所述结合人LEPR的抗体或其抗原结合片段后，所述受试者的血糖得以降低，所述受试者的体重得以减轻，所述受试者表现出食物摄入量减少，所述受试者的脂肪质量得以减少，所述受试者的瘦体质量得以增加，以及/或者所述受试者的骨骼质量得以增加。
11.如权利要求2所述的方法，其中所述病症是非酒精性脂肪肝疾病，并且所述受试者的肝脏重量在治疗后得以减轻，所述受试者的丙氨酸转氨酶(ALT)的血浆水平得以降低，以及/或者所述受试者的天冬氨酸转氨酶(AST)的血浆水平得以降低。
12.如权利要求2所述的方法，其中所述病症是女性不孕。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述病症是女性不孕，并且所述受试者的激素周期得以恢复和/或所述受试者受孕。
14.如权利要求2所述的方法，其中所述病症是闭经。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述病症是闭经，并且所述受试者开始具有正常的激素周期。
16.如权利要求2所述的方法，其中所述病症是免疫功能受损。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述病症是免疫功能受损，并且所述受试者的CD4+T细胞计数增加。
18.如权利要求1所述的方法，其用于治疗或预防代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的一个或多个症状，或者与代谢功能障碍或低瘦蛋白血症相关联的疾病或病症的一个或多个症状，其中所述症状是选自由以下各项组成的组中的一者或多者：肥胖倾向、肥胖、食欲过盛、高血糖、高甘油三酯血症、高胆固醇血症、胰岛素抵抗、血脂异常、生长延迟、青春期骤长延迟、生长激素分泌异常、HbA1c升高、低骨矿物质密度(或低骨骼质量)、低骨矿物质含量和低瘦体重。
19.一种用于增加具有低骨骼质量的受试者中的骨骼质量的方法，所述低骨骼质量是所述受试者患有的代谢功能障碍或低瘦蛋白血症的症状，所述方法包括将结合人瘦蛋白受体(LEPR)和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载剂或稀释剂施用于对其有需要的所述受试者。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述对其有需要的受试者是瘦蛋白缺乏的。
21.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述对其有需要的受试者不是瘦蛋白缺乏的。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述症状是肥胖，并且所述肥胖与信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变不相关或者不是由信号传导缺陷型或信号传导受损型LEPR突变导致的。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述治疗减少脂肪质量，但是不减少瘦体质量。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中用所述结合人LEPR和活化LEPR信号传导的抗体或其抗原结合片段进行治疗刺激下丘脑STAT3信号传导或者增强瘦蛋白诱导的或非瘦蛋白依赖性的STAT3信号传导。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述治疗降低循环血浆甘油三酯。
26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述治疗降低循环血浆总胆固醇。
27.一种用于治疗、预防或改善患者中的以下方面的方法
(i)脂肪营养不良和/或单基因肥胖；
(ii)与脂肪营养不良和/或单基因肥胖相关联的病症；或者
(iii)(i)或(ii)的症状；
所述方法包括将特异性结合LEPR的激动剂抗体施用于对其有需要的所述患者。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述与脂肪营养不良和/或单基因肥胖相关联的病症是极度早发性肥胖、食欲过盛和饱腹感受损、免疫功能受损(CD4+计数)、胰岛素抵抗、非酒精性脂肪肝疾病、NASH、血脂异常、糖尿病、生殖功能障碍、性腺功能减退、青春期骤长缺乏、甲状腺机能减退、甲状腺功能受损、低骨矿物质密度或低骨骼质量。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述症状是肝脏肿大、肝酶升高、丙氨酸氨基转移酶(ALT)的血液水平升高、天冬氨酸氨基转移酶(AST)的血液水平升高、高肥胖倾向；针对年龄和性别的身体质量指数>第85个百分位；觅食行为异常；护食行为异常；反复和潜在致死感染；高胰岛素血症；肝脂肪变性；向NASH的进展(脂肪营养不良)；高甘油三酯血症；HbA1c升高；葡萄糖水平升高；葡萄糖耐量降低；青春期发育延迟；第二性征的表现减少；无月经或月经不调；不孕；身材矮小；生长激素分泌异常；T3改变；TSH改变；或游离甲状腺素水平改变。
30.如权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述受试者用美曲普汀治疗失败。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述抗体的剂量如下：
(i)一个或多个约5mg/kg体重的静脉内剂量；然后是
(ii)每周一次一个或多个约250mg或约300mg的皮下剂量；然后是
(iii)任选地，每月或约28天一次一个或多个约250mg或约300mg的皮下剂量。
32.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述抗体的剂量如下
(i)一个或多个约5mg/kg体重的静脉内剂量；然后是
(ii)每周一次一个或多个约250mg或约300mg的皮下剂量。
33.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述抗体的剂量如下
(i)5mg/kg体重静脉内一次；然后是
(ii)每周一次四个约250mg或约300mg的皮下剂量；然后是
(iii)每月或28天一次一个或多个约250mg或约300mg的皮下剂量。
34.如权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述第一皮下剂量在所述静脉内剂量后三天进行。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)重链可变区(HCVR)的互补决定区(CDR)，所述HCVR包含SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:82的氨基酸序列，以及
(b)轻链可变区(LCVR)的CDR，所述LCVR包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:66的氨基酸序列。
36.如权利要求1-34中任一项的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对的重链和轻链CDR，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
37.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述HCVR/LCVR氨基酸序列对选自由以下各项组成的组：SEQ ID NO:26/10、34/10、42/10、50/10、58/66、74/66和82/66。
38.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:26/10的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
39.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQID NO:28/30/32/12/14/16的HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3氨基酸序列组合。
40.如权利要求1-39中任一项所述的方法，所述方法还包括将第二治疗剂施用于所述受试者，其中所述第二治疗剂选自由以下各项组成的组：重组人瘦蛋白、PCSK9抑制剂、他汀类、依泽替米贝、胰岛素、胰岛素变体、胰岛素促分泌剂、二甲双胍、磺酰脲、钠葡萄糖协同转运蛋白2(SGLT2)抑制剂、GLP-1激动剂/类似物、胰高血糖素(GCG)抑制剂、胰高血糖素受体(GCGR)抑制剂、血管生成素样蛋白(ANGPTL)抑制剂、芬特明、奥利司他、托吡酯、安非他酮、托吡酯/芬特明、安非他酮/那曲酮、安非他酮/唑尼沙胺、普兰林肽/美曲普汀、氯卡色林、新利司他、特索芬辛、韦利贝特、抗惊厥药、地高辛、香豆素、维生素D、甲状腺素、甲状腺补充剂、维生素补充剂、钙补充剂、肉碱、辅酶Q10、抗便秘药物、抗过敏药物、加巴喷丁、麻醉剂、氯胺酮、利多卡因和盐酸文拉法辛。
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