KR20200141461A

KR20200141461A - 렙틴 수용체 작용제 항체를 사용한 치료 방법

Info

Publication number: KR20200141461A
Application number: KR1020207030419A
Authority: KR
Inventors: 제스퍼 그로마다; 파나이이오티스 스테비스; 주디스 알타레호스; 앤드류 제이. 머피
Original assignee: 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date: 2018-04-06
Filing date: 2019-04-05
Publication date: 2020-12-18
Also published as: US20220280641A1; RU2020133603A; CN112040980A; CA3094400A1; IL277634A; US11608381B2; JP2021532057A; AU2019249273A1; JP2024045204A; JP7420730B2; EP3773713A1; US20190309079A1; WO2019195796A1; MX2020010547A

Abstract

작용제 렙틴 수용체(LEPR) 항체, 이의 항원 결합 단편, 또는 LEPR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 조성물을 사용하는 치료적 치료 방법이 본원에서 제공된다. 이러한 치료적 방법은, 예를 들어 지방이영양증, 지방 과다증 또는 비만, 체중 감소, 비알코올성 지방간 질환, 이상 식욕 항진증, 고혈당증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 간지방증 및 불임 등을 포함하는, 대사 기능장애와 관련된 병태에 대한 치료를 포함한다.

Description

대사 기능 장애 또는 저렙틴증의 치료에 사용하기 위한 렙틴 수용체 작용제 항체

기술 분야

본 발명은 인간-렙틴 수용체(LEPR)에 결합하는 작용제 항체 및 작용제 항체의 항원 결합 단편을 사용해 렙틴 결핍증 및 지방이영양증에서 대사 기능 장애를 치료하는 방법 및 인슐린 민감도를 복구하는 방법에 관한 것이다.

서열 목록

서열 목록의 공식 사본은, 2019년 4월 5일자로 생성되고 10436WO_SEQ_LIST_ST25의 파일명을 가진 약 105 KB 크기의 ASCII 형식의 서열 목록으로서, EFS-Web을 통해 전자 방식으로 명세서와 함께 동시에 제출된다. 본 ASCII 형식의 문헌에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

렙틴은 지방 조직에 의해 주로 발현되는 폴리펩티드 호르몬이며, 대사, 신경내분비 기능, 면역성, 에너지 균형 및 섭식의 조절에 관여한다. 렙틴 활성은 렙틴 수용체와의 상호 작용 및 렙틴 수용체를 통한 신호 전달에 의해 매개된다. 렙틴 수용체("LEPR", "WSX", "OB 수용체", "OB-R" 및 "CD295"로도 알려짐)는 큰 세포외 도메인(818 아미노산)을 갖는 클래스 I 사이토카인 수용체 패밀리의 단일-통과 막관통 수용체이다. 렙틴 결핍, 렙틴 내성 및 특정 LEPR 신호 전달 결함/신호 전달 손상 돌연변이는 비만, 2형 당뇨병, 이상지질혈증(dyslipidemia), 지방이영양증(lipodystrophies), 간 지방증(hepatic steatosis), 비-알코올성 및 알코올성 지방 간 질환, 심각한 인슐린 내성, 레프리코니즘/도노휴 증후군(Leprechaunism/Donohue syndrome), 랍슨-멘델할 증후군(Rabson-Mendenhall syndrome) 및 관련 합병증과 관련이 있다. 렙틴 내성, 렙틴 결핍, 및 저렙틴증(hypoleptinemia)(예: 지방이영양증)을 다루기 위한 치료적 접근법은 대부분 보조 렙틴이나 렙틴 유사체를 감염된 개체에게 전달하는 데 집중해 왔다. 그러나, 이러한 접근법은 일반적으로, 특히 렙틴-내성 개체에서 제한된 효능을 나타냈고, 빈번하게 부작용과 관련이 있다. 따라서, 렙틴 내성, 및 렙틴 결핍과 관련된 다른 병태, 또는 저렙틴증의 치료에 대한 대안적 접근법에 대한 필요성이 당업계에 존재한다.

본 발명은 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 본 발명의 항체는 작용제 항체로서, LEPR에 대한 본 발명의 항-LEPR 항체의 결합은 특히 세포에서 렙틴 수용체 신호 전달의 활성화를 유발한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 LEPR에 결합하기 위해 렙틴과 경쟁하지 않는다. 본 발명의 항체는, 예를 들어, 대상체에서 렙틴의 정상적인 생물학적 활성을 모방하거나, 치환하거나, 보충하는 데 유용하다. 따라서 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편은 렙틴 저항성 및 렙틴 결핍과 관련된 질환 및 장애의 치료적 치료에 유용하다.

본 발명의 항체는 전장(예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체)이거나 항원 결합 부분(예를 들어, Fab, F(ab')2, 또는 scFv 단편)만을 포함할 수 있고, 작용기에 영향을 미치도록, 예를 들어, 잔류 효과기 기능을 제거하도록 변형될 수 있다(Reddy 등의 2000, J. Immunol. 164:1925-1933 참조).

본 발명의 예시적인 항-LEPR 항체는 본원의 표 1 및 표 2에 열거되어 있다. 표 1은 예시적인 항-LEPR 항체의 중쇄 가변 영역(HCVR), 경쇄 가변 영역(LCVR), 중쇄 상보성 결정 영역(HCDR1, HCDR2 및 HCDR3), 및 경쇄 상보성 결정 영역(LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 표 2는 예시적인 항-LEPR 항체의 HCVR, LCVR, HCDR1, HCDR2 HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3의 핵산 서열 식별자를 제시한다.

본 발명은 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 HCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 LCVR을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 임의의 LCVR 아미노산 서열과 쌍을 이룬 표 1에 열거된 임의의 HCVR 아미노산 서열을 포함하는 HCVR과 LCVR 아미노산 서열 쌍(HCVR/LCVR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 하나에 함유된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍은 서열번호 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 및 82/66으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(HCDR1)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(HCDR2)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(HCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(LCDR1)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(LCDR2)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(LCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나와 쌍을 이룬 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 HCDR3 및 LCDR3 아미노산 서열 쌍(HCDR3/LCDR3)을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에 따르면, 본 발명은 표 1에 열거된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 하나에 함유된 HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCDR3/LCDR3 아미노산 서열 쌍은 서열번호 8/16, 24/16, 32/16, 40/16, 48/16, 56/16, 64/72, 80/72 및 88/72로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 하나에 함유된 6개의 CDR로 이루어진 세트(즉, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 특정 구현예에서, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3 아미노산 서열 세트는 서열번호 4, 6, 8, 12, 14, 16; 20, 22, 24, 12, 14, 16; 28, 30, 32, 12, 14, 16; 36, 38, 40, 12, 14, 16; 44, 46, 48, 12, 14, 16; 52, 54, 56, 12, 14, 16; 60, 62, 64, 68, 70, 72; 76, 78, 80, 68, 70, 72; 및 84, 86, 88, 68, 70, 72로 이루어진 군으로부터 선택된다.

관련 구현예에서, 본 발명은 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 표 1에 열거된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같은 6개의 CDR로 이루어진 세트(즉, HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3)를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 LEPR에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 서열번호 2/10, 18/10, 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 및 82/66으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 내에 함유된 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 및 LCDR3 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다. HCVR 및 LCVR 아미노산 서열 내의 CDR을 식별하기 위한 방법 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 본원에 개시된 특정 HCVR 및/또는 LCVR 아미노산 서열 내에서 CDR을 확인하는 데 사용될 수 있다. CDR의 경계를 식별하는 데 사용될 수 있는 예시적인 규정(convention)은, 예를 들어, Kabat 정의, Chothia 정의, 및 AbM 정의를 포함한다. 일반적인 조건에서, Kabat 정의는 서열 변동성에 기초하고, Chothia 정의는 구조적 루프 영역의 위치에 기초하며, AbM 정의는 Kabat 및 Chothia 접근법을 절충한 것이다. 예를 들어, Kabat의 "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani 등의 J. Mol. Biol. 273:927-948 (1997); 및 Martin 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272 (1989)를 참조한다. 공공 데이터베이스도 항체 내에서 CDR 서열을 확인하는 데 이용할 수 있다.

본 발명은 또한 항-LEPR 항체 또는 이의 일부분을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 표 1에 열거된 HCDR1 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 표 1에 열거된 HCDR2 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 표 1에 열거된 HCDR3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 표 1에 열거된 LCDR1 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR1 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 표 1에 열거된 LCDR2 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR2 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, 표 1에 열거된 LCDR3 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며; 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 LCDR3 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 실질적으로 유사한 서열을 포함한다.

본 발명은 또한, HCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 3개의 CDR로 이루어진 세트(즉, HCDR1, HCDR2, HCDR3)를 포함하고, HCDR1, HCDR2, HCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.

본 발명은 또한, LCVR을 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 LCVR은 3개의 CDR로 이루어진 세트(즉, LCDR1, LCDR2, LCDR3)를 포함하고, LCDR1, LCDR2, LCDR3 아미노산 서열 세트는 표 1에 열거된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 하나에 의해 정의된 바와 같다.

본 발명은 또한 HCVR 및 LCVR 둘 다를 암호화하는 핵산 분자를 제공하며, 여기서 HCVR은 표 1에 열거된 HCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하고, LCVR은 표 1에 열거된 LCVR 아미노산 서열 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 핵산 분자는 표 2에 열거된 HCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열, 및 표 2에 열거된 임의의 LCVR 핵산 서열 중 어느 하나로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 이의 실질적으로 유사한 서열을 포함한다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 특정 구현예에서, 핵산 분자는 HCVR 및 LCVR을 암호화하되, HCVR 및 LCVR 둘 다는 표 1에 열거된 동일한 항-LEPR 항체로부터 유래된다.

본 발명은 또한, 항-LEPR 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 전술한 핵산 분자 중 어느 하나, 즉 표 1에 제시된 바와 같은 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 서열 중 어느 하나를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 발명의 범주에는, 이러한 벡터가 도입된 숙주 세포, 및 항체 또는 항체 단편의 생산을 가능하게 하는 조건 하에서 숙주 세포를 배양하고, 그렇게 생산된 항체 및 항체 단편을 회수함으로써 항체 또는 이의 일부분을 생산하는 방법이 또한 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 LEPR에 특이적으로 결합하는 재조합 인간 항체 또는 이의 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 관련된 양태에서, 본 발명은 항-LEPR 항체 및 제2 치료제의 조합인 조성물을 포함한다. 일 구현예에서, 제2 치료제는 항-LEPR 항체와 유리하게 조합되는 임의의 제제이다.

본 개시 전반에 걸쳐 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"은 용어 "환자"와 상호 교환 가능하다. 대상체 또는 환자는 성인일 수 있다. 소아 환자도 본원에서 제공되는 방법 및 조성물로부터 이익을 얻는 것으로 고려된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 항-LEPR 항체 또는 본 발명의 항체의 항원 결합 부분을 사용하여 LEPR 신호 전달을 향상시키거나 자극하기 위한 치료적 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 치료적 방법은 항체 또는 본 발명의 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물의 치료적 유효량의 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 치료되는 장애는 LEPR 신호 전달을 자극하거나 활성화하거나, 달리 렙틴의 천연 활성을 시험관 내에서 또는 생체 내에서 모방함으로써 개선되거나, 완화되거나, 억제되거나 예방되는 임의의 질환 또는 병태이다.

일부 양태에서, 대사 기능 장애 또는 저렙틴증을 치료 또는 예방하기 위한 치료적 방법이 본원에서 제공한다. 상기 방법은 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 양태에서, 대사 기능 장애 또는 저렙틴증, 또는 대사 기능 장애 또는 저렙틴증과 관련된 질환 또는 병태, 또는 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 치료적 방법이 본원에 제공된다. 상기 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

일부 구현예에서, 병태는 비알코올성 지방간 질환, 비알코올성 지방간염(NASH), 여성 불임, 무월경, 비정상적인 호르몬 사이클, 면역 기능 손상, 갑상선 기능저하증, 비만증, 단성 비만증(monogenic obesity), I형 당뇨병, II형 당뇨병, 지방이영양증, 선천성 지방이영양증, 전신성 지방이영양증, 후천성 지방이영양증, 부분 지방이영양증, 선천성 부분 지방이영양증, 선천성 전신성 지방이영양증, 후천성 부분 지방이영양증, 및 후천성 전신성 지방이영양증으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

일부 구현예에서, 대사 기능장애 또는 저렙틴증과 관련된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상은 지방 과다증, 비만, 이상 식욕 항진증, 고혈당증, 고중성지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 인슐린 저항성, 지질이상혈증, 성장 지체, 사춘기의 성장분출 지체, 비정상적 성장 호르몬 분비, HbA1c 상승, 저 골 무기질 밀도(또는 저 골량), 저 골 무기질량, 및 저 제지방량으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대사 기능장애 또는 저렙틴증과 관련된 질환 또는 병태의 증상은 인간 LEPR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여한 이후에 예방되거나, 완화되거나, 그 중증도 및/또는 기간이 줄어들 수 있다.

또 다른 양태에서, 지방이영양증의 대사 합병증을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 이러한 방법은 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 대상체에서 고혈당증을 완화시키고, 인슐린 저항성을 감소시키고, 고중성지방혈증을 감소시키고, 순환하는 콜레스테롤 수치를 낮추고/낮추거나 대상체에서 Hba1c 수준을 낮춘다. 지방이영양증은 후천성 부분 지방이영양증, 후천성 전신 지방이영양증, 선천성 부분 지방이영양증 및 선천성 전신 지방이영양증을 포함할 수 있다.

선천성 렙틴 결핍증은 LEPR 또는 렙틴의 병원성 변이체를 특징으로 하는 희귀 질환이다. 일부 대상체는 순환하는 렙틴을 갖지만, 생체 불활성 형태의 렙틴을 암호화하는 p.N103K와 같은 유전적 돌연변이로 인해 단백질은 비기능적이다. 일부 대상체는 순환하는 렙틴을 갖지 않거나 거의 갖지 않는다. 다른 유전자는 LMNA, PPARG, PLIN1, AKT2, CIDEC, LIPE, 및 ADRA2A를 포함하는 렙틴 신호 전달 손상에 관여할 수 있고, 본원에 제공된 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편은 이러한 돌연변이가 렙틴 신호전달에 미치는 영향을 완화하는데 유용하다.

일부 양태에서, 선천성 렙틴 결핍증을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 지방이영양증을 갖고 메트렐렙틴으로 치료되지 않는다. 일부 구현예에서, 선천성 지방이영양증과 관련된 증상은 인간 LEPR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여한 이후에 예방되거나, 완화되거나, 감소되거나, 그 중증도 및/또는 기간이 줄어든다. 일부 구현예에서, 치료는 대상체에서 이상 식욕 항진증, 비만증, 고인슐린혈증, 지방이영양증 및 이상지질혈증 및 비알코올성 지방간염 중 하나 이상의 역전시키거나 완화시킨다. 일부 구현예에서, 대상체의 혈당이 감소하고, 대상체의 체중이 감소하고, 대상체가 음식 섭취의 감소를 나타내고, 대상체의 체지방량이 감소하고, 대상체의 제지방량이 증가하고/하거나 대상체의 골량이 증가한다.

일부 양태에서, 비알코올성 지방간 질환 또는 비알코올성 지방간염(NASH)을 치료하기 위한 치료적 방법이 본원에 제공한다. 일부 양태에서, 대상체는 저렙틴 상태이거나, 지방이영양 상태이거나 렙틴 결핍 상태이다. 본 양태에 따르면, 상기 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체의 간 중량은 치료 후 감소한다. 일부 구현예에서, 비알코올성 지방간염을 포함하는 비알코올성 간 질환의 증상은 치료 후 대상체에서 감소한다. 일부 구현예에서, 알라닌 아미노전달효소(ALT) 및/또는 아스파르테이트 아미노전달효소(AST)의 혈장 수준이 대상체에서 감소한다.

또 다른 양태에서, 여성 불임, 무월경을 치료하거나 대사 기능장애 또는 저렙틴증과 관련된 정상 호르몬 주기를 회복하는 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, 인간 LEPR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여는 생식 능력을 증가시키고/시키거나 임신 기회를 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 대상체는 임신한 다. 일부 양태에서, 치료는 정상적인 월경 주기를 회복하거나 개시할 수 있다.

일부 양태에서, 대사 기능장애 또는 저렙틴증과 관련된 면역 기능 손상을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공한다. 이러한 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간 LEPR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여 후, CD4+ T-세포 수가 증가한다.

다른 양태에서, 대사 기능장애 또는 저렙틴증을 가진 대상체에서 골 중량을 증가시키기 위한 치료적 방법이 본원에 제공한다. 상기 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 지방 과다증 또는 비만증을 치료하거나 체중을 감소시키기 위한 치료적 방법이 본원에 제공한다. 본 양태에 따르면, 상기 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 체지방량을 감소시키지만, 제지방량을 감소시키지는 않는다.

일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 저렙틴 상태이거나, 지방이영양 상태이거나 렙틴 결핍 상태이다. 일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체는 저렙틴 상태가 아니거나 렙틴 결핍 상태가 아니다. 일부 구현예에서, 대사 기능 장애, 지방 과다증 또는 비만증은 신호전달 결함 또는 신호전달 손상 LEPR 돌연변이와 관련되거나 이에 의해 야기되지 않는다.

일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 따라 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여하는 것은 시상하부 STAT3 신호 전달을 자극하거나, 렙틴-유도성 또는 렙틴-독립적 STAT3 신호 전달을 향상시킨다.

일부 구현예에서, 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 투여는 순환하는 혈장 중성지방을 낮추고/낮추거나 순환하는 혈장 총 콜레스테롤을 낮춘다.

다른 양태에서, 시상하부 STAT3 신호전달을 자극함으로써 이상 식욕 항진증, 고혈당증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH) 또는 비알코올성 지방 간 질환을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 치료는 순환하는 혈장 중성지방을 낮춘다. 일부 구현예에서, 치료는 순환하는 혈장 총 콜레스테롤을 낮춘다.

또 다른 양태에서, 선천성 렙틴 결핍증과 관련된 성장 지체, 사춘기 성장 분출의 결여 및/또는 비정상적인 성장 호르몬 분비를 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 선천성 렙틴 결핍증과 관련된 갑상선 기능 저하증을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 양태에서, 저렙틴증 및/또는 렙틴 결핍증과 관련된 저 골 무기질 밀도 및/또는 골 무기질량을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다. 이러한 방법은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

인간 LEPR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 함께 하나 이상의 추가 치료제가 본원에 기술된 대상체에게 투여될 수 있다. 제2 치료제는 재조합 인간 렙틴, PCSK9 억제제, 스타틴, 에제티미브, 인슐린, 인슐린 변이체, 인슐린 분비 촉진제, 분비 촉진제, 메트포르민, 설포닐우레아, 소듐 글루코스 공수송체 2 (SGLT2) 억제제, GLP-1 작용제/유사체, 글루카곤 (GCG) 억제제, 글루카곤 수용체 (GCGR) 억제제, 안지오포이에틴-유사 단백질 (ANGPTL) 억제제, 펜터민, 오를리스타트, 토피라메이트, 부프로피온, 토피라메이트/펜터민, 부프로피온/날트렉손, 부프로피온/조니사미드, 프람린타이드/메트렐렙틴, 로르카세린, 세틸리스타트, 테소펜신, 벨네페리트, 항경련제, 디곡신, 쿠마딘, 비타민 D, 티록신, 갑상선 보충제, 비타민제, 칼슘 보충제, 카르니틴, 코엔자임 Q10, 항변비약, 항알러지약, 가바펜틴, 진통제, 케타민, 리도카인, 또는 벤라팍신 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 환자에서 (i) (임의 유형의) 지방이영양증 및/또는 단성 비만증; (ii) 지방이영양증 및/또는 단성 비만증과 관련된 병태; 또는 (iii) (i) 또는 (ii)의 증상을 치료하거나, 예방하거나 완화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 LEPR(예: H4H17319P2)에 특이적으로 결합하는 작용제 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 지방이영양증 및/또는 단성 비만증과 관련된 병태는 비만증의 극단적 조기 발병; 이상 식욕 항진증 및 포만감 손상; 면역 기능 손상(CD4⁺ 계수); 인슐린 저항성; 비알코올성 지방 간 질환; NASH, 이상지질혈증; 당뇨병; 생식 기능 장애; 생식 기능 저하증; 사춘기의 성장 분출 결핍; 갑상선 기능 저하증; 갑상선 기능 손상; 저 골 무기질 밀도 및/또는 저 골량이다. 본 발명의 일 구현예에서, 상기 증상은 간 비대증(enlarged liver), 간 효소 상승(elevated liver enzymes), 알라닌 아미노기 전달효소(ALT)의 혈중 농도 상승, 아스파르테이트 아미노 전달효소(AST)의 혈중 농도 상승, 고 지방증(high adiposity); 체질량 지수 > 연령 및 성별에 맞는 제85 백분위 수; 비정상적인 음식 추구 거동(abnormal food seeking behavior); 비정상적인 음식 공격성 거동(abnormal food aggressive behavior); 재발성 및 잠재적으로 치명적인 감염증(recurrent and potentially lethal infections); 고 인슐린혈증(hyperinsulinemia); 간 지방증(liver steatosis); NASH로의 진행 (지방이영양증); 고 중성지질혈증(hypertriglyceridemia); HbA1c 상승; 혈당 수준 상승(elevated glucose levels); 내당능 손상(impaired glucose tolerance); 사춘기 발달 지체(delayed pubertal development); 2차 성징의 발현 감소(reduced expression of secondary sexual characteristics); 무월경 또는 월경 불순; 불임; 저신장증(short stature); 비정상적 성장 호르몬 분비; T3 변화; TSH 변화; 및/또는 유리 티록신(free thyroxine) 수준의 변화이다.

본 발명의 일 구현예에서, 작용제 항-LEPR 항체 또는 이의 항원 결합 단편(예를 들어, H4H17319P2; WO2017/66204 참조)은 다음과 같이 투여된다: (i) 체중 1 kg당 약 5 mg의 투여량을 1회 이상 정맥 내 투여하고; 이어서 (ii) 매주 1회 약 250 mg 내지 300 mg, 예를 들어 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 피하 투여하고; 이어서 (iii) 임의로, 매월 또는 28일에 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 나누어 피하 투여함. 예를 들어, (i) 체중 1 kg당 약 5 mg의 투여량을 1회 이상 정맥 내 투여하고; 이어서 (ii) 매주 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 피하 투여함. 본 발명의 일 구현예에서, 항체는 다음과 같이 투여된다: (i) 체중 1 kg당 5mg을 1회 정맥 내 투여하고 (1일차); 이어서 (ii) 매주 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 4회 피하 투여하고 (예를 들어, 4, 11, 18 및 25일차); 이어서 (iii) 매월 또는 28일에 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 피하 투여함 (예를 들어, 53, 81, 109, 137, 165 및 193일차 등). 예를 들어, 본 발명의 일 구현예에서, 첫 번째 피하 투여는 4일차에, 즉 1일차에 이루어지는 정맥 내 투여로부터 3일 후에 이루어진다.

다른 구현예는 다음의 상세한 설명을 검토함으로써 명백해질 것이다.

도 1은 ELISA(450 nm에서의 흡광도)로 측정했을 때, 시험 항-LEPR 항체 또는 대조군 분자의 농도가 증가하는 가운데, 인간 렙틴에 대한 이량체 인간 LEPR의 결합을 도시한 것이다.
도 2a 내지 도 2c는 야생형 LEPR(원형), 신호전달-결함 LEPR 돌연변이체(A409E, 사각형) 또는 신호전달-손상 LEPR 돌연변이체(P316T, 삼각형)를 발현하는 HEK293 세포에서 LEPR 신호전달의 정도를 도시한 것이다. LEPR 신호 전달은, 렙틴(도 2a), H4H16650(도 2b), 또는 H4H16679(도 2c)의 농도를 증가시키면서 치료한 세포에서 웨스턴 블롯의 질량계로 측정한 pSTAT3-Y705 / STAT3의 비율로서 표현된다.
도 3은 이소형 대조군 항체 3 mg/kg, 또는 H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 또는 H4H17321P2로부터 선택된 LEPR 항체 3 mg/kg을 투여한 렙틴 결핍 마우스의 평균적인 매일 음식 섭취량을 보여준다.
도 4는 이소형 대조군 항체 3 mg/kg, 또는 H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 또는 H4H17321P2로부터 선택된 LEPR 항체 3 mg/kg을 투여한 마우스의 평균적인 체중 변화 백분율을 보여준다.
도 5는 각 항체 치료군 내 동물을 대상으로 항체 치료 1일 전(음영이 없는 막대) 및 6일 후(음영이 있는 막대)에 μCT로 정량화한 평균적인 체지방량을 평균 ± SEM으로 표현하여 보여준다.
도 6은 H4H18482P2, H4H18487P2, H4H18492P2 또는 이소형 대조군으로부터 선택된 항체 30 mg/kg을 마우스에게 주입한 후 마우스의 체중 변화 백분율을 보여준다.
도 7a 내지 도 7b. 도 7a는 항-LEPR 항체인 H4H18482P2, H4H18487P2 또는 H4H18492P2를 투여하기 전 마우스의 체지방량을 보여준다. 도 7b는 30 mg/kg의 H4H18482P2, H4H18487P2 또는 H4H18492P2로 치료한 마우스의 체지방량을 보여준다.
도 8. 도 8은 시험한 항-LEPR 항체가 IMR-32/STAT3-luc/Mf LEPR 세포주에서 원숭이(Mf) LEPR을 활성화하였음을 보여준다.
도 9a 내지 도 9c. 0일차에, 18주령 수컷 Lepr ^hu/hu 마우스에서 mLepr.ECD의 HDD에 의해 렙틴 결핍증을 유도하였다. HDD 후 7일차에, 체중 변화 백분율을 기준으로 마우스를 2개의 군으로 나누고, 대조군 단클론 항체(회색 원 또는 막대) 또는 H4H17319P2(채워진 원 또는 바)의 1회 SC 투여량 10 mg/kg을 투여하였다. 데이터는 평균 ±SEM이다. *, 표시된 시점에 대조군 단클론 항체 대비 H4H17319P2에 대한 P<0.05. $, 동일한 각각의 투여군 내에서 HDD 이전(-1일차)과 HDD 이후 임의의 날(6일차 또는 13일차) 간의 P<0.05. &, 동일한 각각의 투여군 내에서 단클론 항체 투여 이전(6일차)과 단클론 항체 투여 이후(13일차) 간의 P<0.05. 표시된 일차에 각각의 텍스트 색상으로 표시된 군에 대해 0일차 베이스라인 대비 유의한 차이가 없음(ns). 도 9a는 연구 과정 전반에 걸쳐 Lepr ^hu/hu 마우스의 체중(좌측) 및 매일 음식 섭취량(우측)을 보여주며, 렙틴 결핍증 유도가 급격한 체중 증가와 이상 식욕 항진증을 유발함을 보여준다. 군 당 N=14. 도 9b는 HDD 1일 전(-1일차), 단클론 항체 투여 1일 전(HDD 이후 6일차) 및 투여 후 6일차(HDD 이후 13일차)에 수행한 CT 영상촬영에 의한 체성분 분석을 보여준다. 단클론 항체 투여군(N=14) 및 H4H17319P2 투여군(N=14)(각각 회색 및 검은색 막대)에 대해 정량화한 체지방량(좌측) 및 제지방량(우측)이 도시되어 있다. 도 9c. 대조군 단클론 항체(회색 막대, N=14) 또는 H4H17319P2(검은색 막대, N=14)의 1회 투여량으로 치료한 렙틴 결핍을 유도한 Lepr ^hu/hu 마우스로부터 치료 후 6일차(13일차)에 수득한 혈장의 화학 분석.
도 10a 내지 도 10d. 도 10a. 인간화 Lepr ^hu/hu 마우스의 렙틴 수용체 세포 외 도메인을 생성하기 위한 유전자 표적화를 보여주는 개략도. 도 10b. 야생형 마우스(Lepr ^+/+ , 회색 막대) 및 Lepr ^hu/hu 마우스(검은색 막대)의 체중(9주령) 및 체성분에 대한 마이크로-CT 정량화(9 내지 12주령). 데이터는 평균 ±SEM이다. 군 당 N=6~10. 도 10c. 8 내지 11주령 수컷 Lepr ^+/+ 마우스(회색 원) 및 Lepr ^hu/hu 마우스(검은색 원)에 대한 인슐린 내성 시험(0.75 U/kg, IP). 데이터는 평균 ±SEM이다. 군 당 N=8~9. 도 10d. 9 내지 13주령 수컷 Lepr ^+/+ 마우스(회색 막대) 및 Lepr ^hu/hu 마우스(검은색 막대)에서의 혈청 렙틴 수준. 데이터는 평균 ±SEM이다. 군 당 N=8~9.
도 11a 내지 도 11b. 도 11a. 0일차에 마우스 렙틴 수용체 세포 외 도메인-암호화 플라스미드(mLeprECD.hFc, 검은색 원) 또는 대조군 플라스미드(대조군 hFc, 회색 원)의 유체역학적 DNA 전달(HDD) 후, 8주령 수컷 C57BL/6N 마우스에서의 체중(좌측), 0일차 베이스라인 대비 체중 변화(중간), 및 누적 음식 섭취량(우측). 데이터는 평균 ±SEM이다. 군 당 N=6. 도 11b. 마우스 렙틴 수용체 세포 외 도메인-암호화 플라스미드(mLeprECD.hFc, 검은색 막대) 또는 대조군 플라스미드(대조군 hFc, 회색 막대)의 HDD 후 7일차에 체성분에 대한 마이크로-CT 정량화. 체지방량, 제지방량, 골량, 골 무기질량, 및 골 밀도(좌측에서 우측 방향)에 대한 데이터는 평균 ± SEM이다. 군 당 N=6.
도 12a 내지 도 12c. 0일차에, mLepr.ECD의 HDD에 의해 17 내지 20주령 암컷 또는 18주령 수컷 Lepr ^hu/hu 마우스에서 렙틴 결핍증을 유도하였다. HDD 후 7일차에, 각각 체중 변화의 상대 백분율을 기준으로 마우스를 2개의 동물군으로 나눈 다음, 대조군 단클론 항체(테두리가 없는 회색 원 또는 막대) 또는 H4H17319P2(테두리 없는 검은색 원 또는 막대)의 1회 SC 투여량 10 mg/kg을 투여하였다. 데이터는 평균 ±SEM이다. *, 표시된 시점에 대조군 단클론 항체 대비 H4H17319P2에 대한 P<0.05. $, 동일한 각각의 투여군 내에서 HDD 이전(-1일차)과 HDD 이후 임의의 날(6일차 또는 13일차) 간의 P<0.05. &, 동일한 각각의 투여군 내에서 단클론 항체 투여 이전(6일차)과 단클론 항체 투여 이후(13일차) 간의 P<0.05. 표시된 일차에 각각의 텍스트 색상으로 표시된 군에 대해 0일차 베이스라인 대비 유의한 차이가 없음(ns). 도 12a. 연구 과정 전반에 걸쳐 암컷 마우스의 체중(좌측) 및 음식 섭취량(우측)으로서, 렙틴 결핍증 유도가 급격한 체중 증가와 이상 식욕 항진증을 유발함을 보여준다. 체중 증가는 대조군 단클론 항체 투여 이후 계속된다(N=14). 군 당 N=10~11. 도 12b. 암컷 마우스를 대상으로 HDD 1일 전(-1일차), 단클론 항체 투여 1일 전(HDD 이후 6일차) 및 투여 후 6일차(HDD 이후 13일차)에 마이크로-CT 영상촬영에 의한 체성분 분석을 수행하였다. 체지방량, 제지방량, 골량, 골 무기질량, 및 골 밀도(좌측에서 우측 방향)에 대한 데이터는 평균 ± SEM이다. 군 당 N=10~11. 도 12c. 수컷 마우스를 대상으로 HDD 1일 전(-1일차), 단클론 항체 투여 1일 전(HDD 이후 6일차) 및 투여 후 6일차(HDD 이후 13일차)에 마이크로-CT 영상촬영에 의한 체성분 분석을 수행하였다. 골량, 골 무기질량, 및 골 밀도(좌측에서 우측 방향)에 대한 데이터는 평균 ± SEM이다. 군 당 N=14.
도 13a 내지 13d. 0일차에, mLepr.ECD의 HDD에 의해 17 내지 20주령의 암컷 Lepr ^hu/hu 마우스에서 렙틴 결핍증을 유도하였다. 비교를 위해, 마우스 그룹을 대상으로 대조군 벡터로 HDD를 실시하였다. HDD 후 7일차에, mLepr.ECD를 투여한 마우스를 체중을 기준으로 3개의 군으로 나누고, 대조군 단클론 항체(회색 채워진 원 또는 막대) 또는 H4H17319P2(진회색 원 또는 막대)의 SC 투여량 3 mg/kg을 2회(7일차 및 13일차) 투여하거나 H4H17319P2로 치료한 렙틴 결핍 유도 마우스가 섭취한 양의 먹이를 짝지워 먹였다(pair-fed). 데이터는 평균 ±SEM이다. *, 표시된 시점에 투여된 대조군 단클론 항체가 투여된 HDD mLeprECD 대비 심볼 색상 또는 막대로 표시된 각각의 군의 P<0.05. #은 H4H17319P2로 치료한 HDD mLepr ECD 대 짝지워 먹인 동물의 HDD mLeprECD의 통계적 유의성을 나타낸다. $, 표시된 시점에 대조군 단클론 항체가 투여된 HDD 대조군 마우스 대비 심볼 색상 또는 막대로 표시된 각각의 군의 P<0.05. 도 13a는 HDD 이전 대비 마우스의 체중 변화(좌측) 및 누적 음식 섭취량(우측)을 보여준다. 군 당 N=6~11. 도 13b는 HDD 이후 13일차(치료 후 7일차)에 Lepr ^hu/hu 마우스의 체성분에 대한 마이크로-CT 정량화를 나타낸다. 체지방량, 제지방량, 골량, 골 무기질량, 및 골 밀도(좌측에서 우측 방향). 군 당 N=5~10. 도 13c는 0분에 인슐린 치료(1.0 U/kg, IP)를 하기 전에 4시간 동안 굶긴 마우스에서 HDD 이후 10일차(치료 후 3일차)의 인슐린 내성 시험을 보여준다. 인슐린 내성 시험에서의 혈당 수준 및 혈당 곡선 아래 면적(AUC)이 (각각 좌측과 우측에) 도시되어 있다. 군 당 N=6~11. 도 13d는 16일차 또는 17일차에 수득된 혈장 지질의 화학 분석을 제공한다. 군 당 N=6~11.
도 14a 내지 도 14g. 27 내지 30주령의 수컷 지방이영양증 aP2-nSrebp1c ^Tg ^/+;Lepr ^hu/hu 마우스(Tg)에게 매주 1회 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체(회색 원 또는 막대) 또는 H4H17319P2(검은색 원 또는 막대)를 피하(SC) 투여하였다. 참고로, 27 내지 30주령의 수컷 비-유전자 이식 Lepr ^hu/hu 마우스(nonTG)에게도 매주 1회 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체를 피하(SC) 투여하였다(테두리 없는 마름모 및 막대). 모든 데이터는 평균 ±SEM이다. *, 표시된 시점에 대조군 단클론 항체가 투여된 nonTG 마우스 대비 심볼 색상 및 막대로 표시된 각각의 군의 P<0.05. #, 표시된 시점에 대조군 단클론 항체가 투여된 TG 마우스 대비 심볼 색상 및 막대로 표시된 각각의 군의 P<0.05. $, 각각의 군의 -5일차 대비 27일차의 P<0.05. 도 14a는 체중 및 누적 음식 섭취량을 좌측과 우측에 각각 보여준다. 군 당 N=8~9. 도 14b는 투여 이전인 -5일차 및 치료 이후 27일차에 마이크로-CT 영상촬영에 의해 정량화한 제지방량 및 체지방량을 좌측과 우측에 각각 보여준다. 군 당 N=9. 도 14c는 연구 전반에 걸친 혈당 수준(좌측) 및 28일차의 헤모글로빈 A1c 수준 백분율(우측)을 제공한다. 군 당 N=9. 도 14d는 23일차의 인슐린 내성 시험(0.5 U/kg, IP)에서의 혈당 수준 및 혈당 곡선 아래 영역(AUC)을 제공한다. 군 당 N=9. 도 14e 및 14f는 순환하는 지질(E) 및 간 효소 수준(F)이 H4H17319P2로 치료한 지방이영양증 Lepr ^hu/hu (Tg) 마우스에서 감소함을 보여준다. 지질(중성지방, 콜레스테롤, LDL-C 및 HDL-C) 및 간 효소 수준(알라닌 아미노전달효소, ALT, 및 아스파르테이트 아미노전달효소, AST)에 대해 28일차에 수득한 혈장의 화학 분석. 군 당 N=9. 도 14g는 30일차에 채취한 간에서의 간 중량, 간 중성지방 함량, 및 헤마톡실린과 에오신으로 염색한 대표적인 간 절편을 제공한다(각각 좌측, 중간 및 우측). 군 당 N=5.
도 15a 내지 도 15c. 표시된 주령에서 수컷 nonTg Lepr ^hu/hu 마우스(테두리 없는 검은색 원 또는 검은색 막대) 및 aP2-nSrebp1c ^Tg/+ Lepr ^hu/hu 마우스(테두리 없는 검은색 원 또는 검은색 막대)의 표현형 특징. 데이터는 평균 ± SEM이다. *, 각각의 시점에 Lepr ^hu/hu 마우스에 대한 p<0.05. 도 15a. 좌측, 12 내지 24주령의 체중. 중간, 대략 15 내지 20주령에 마이크로-CT 영상촬영을 통해 정량화한 체지방량. 우측, 19 내지 21주령에 측정한 혈장 렙틴 수준. 군 당 N=17~28. 도 15b. 18 내지 20주령에, 인슐린 내성 시험(0.75 U/kg 인슐린, IP) 도중의 혈당 수준. 군 당 N=12~13. 도 15c. 15 내지 17 주령에, 중성지방, 콜레스테롤, LDL-C 및 HDL-C의 혈장 수준(좌측에서 우측 방향). 군 당 N=20~28.
도 16a. 27 내지 30주령의 수컷 지방이영양증 aP2-nSrebp1c ^Tg ^/+;Lepr ^hu/hu 마우스(Tg)에게 매주 1회 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체(회색 막대) 또는 H4H17319P2(검은색 막대)를 피하(SC) 투여하였다. 참고로, 27 내지 30주령의 수컷 비-유전자 이식 Lepr ^hu/hu 마우스(nonTG)에게도 매주 1회 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체를 피하(SC) 투여하였다(흰색 막대). 모든 데이터는 평균 ±SEM이다. *, 표시된 시점에 대조군 단클론 항체가 투여된 nonTG 마우스 대비 각각의 군의 P<0.05. #, 표시된 시점에 대조군 단클론 항체가 투여된 TG 마우스 대비 각각의 군의 P<0.05. $, 각각의 군의 -5일차 대비 27일차의 P<0.05. 도 16a. 마이크로-CT 영상촬영에 의한 체성분으로서, 투여 이전인 -5일차 및 치료 이후 27일차에 정량화한 골량, 골 무기질량 및 골 밀도(좌측에서 우측 방향)를 보여준다. 군 당 N=9.
도 17a 내지 도 17e: 도 17a에서의 데이터는 수컷 지방이영양증 aP2-nSrebp1c ^Tg ^/+;Lepr ^hu/hu 마우스(Tg)에 대한 것으로서, 10 mg/kg의 대조군(회색 막대) 또는 H4H17319P2(진회색 막대)를 1회 피하(SC) 투여하였거나 렙틴(30 μg/일 SC; 검은색 바)을 주입한 32 내지 38 주령의 지방이영양증 (Tg) 마우스에 대한 것이다. 도 17b 내지 도 17e에서의 데이터를 위해, 27 내지 30주령의 수컷 Tg 마우스에게 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체(회색 원 또는 막대) 또는 H4H17319P2(진회색 원 또는 바)를 매주 1회 투여하거나 렙틴(30 μg/일 SC; 검은색 막대)을 주입하였다. 도시된 바와 같이, 27 내지 30주령의 수컷 비-유전자 이식 Lepr ^hu/hu 마우스(nonTG)에게도 매주 1회 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체를 피하(SC) 투여하였다(테두리 없는 마름모 및 흰 막대). 모든 데이터는 평균 ±SEM이다. *, 대조군 단클론 항체가 투여된 Tg 마우스 대비 심볼 색상 및 막대로 표시된 각각의 군의 P<0.05. #, H4H17319P2가 투여된 Tg 마우스 대비 심볼 색상 및 막대로 표시된 각각의 군의 P<0.05. 도 17a는 브레그마(bregma)로부터 대략 -1.52 mm에 있는 궁상핵(acruate nucleus, Arc) 및 복내측 시상하부(ventromedial hypothalamus, Vmh) 내의 pSTAT3 Y705에 대한 면역조직화학 염색을 제공하며, 32 내지 38주령 수컷 지방이영양증 (Tg) 마우스에서 pSTAT3 Y705⁺ 세포의 수가 증가함을 보여준다. 뇌 절편은 대조군 또는 H4H17319P2를 1회 투여(10 mg/kg SC)하거나 렙틴(30 μg/일 SC)을 주입하여 치료한 후 3일차에 채취한 뇌에서 유래된 것이다. Arc 및 Vmh 내의 pSTAT3 Y705⁺ 세포의 수에 대한 대표적인 현미경 사진 및 정량화가 (좌측, 중간 및 우측에 각각) 도시되어 있다. 군 당 N=4~5. 도 17b의 좌측은 연구 도중의 혈당 수준을 제공한다. 중간과 우측은, 9일차의 인슐린 내성 시험 도중의 혈당 수준 및 혈당 곡선 아래 면적이다. 군 당 N=8~9. 도 17c는 체중(좌측), 체중 변화(중간) 및 누적 음식 섭취량(우측)을 제공한다. Tg 마우스의 군 당 N=8~9. 비-Tg 마우스의 경우 N=5. 도 17d는 13일차에 얻은 혈장의 중성지방, 콜레스테롤, LDL-C 및 HDL-C에 대한 화학 분석을 제공하며, H4H17319P2로 치료한 혈장에서 중성지방과 콜레스테롤이 감소함을 보여준다. Tg 마우스의 군 당 N=8~9. 비-Tg 마우스의 경우 N=5. 도 17e는 14일차에 얻은 간에 대한 간 중량(좌측) 및 간 중성지방 함량(우측)을 제공한다. Tg 마우스의 군 당 N=6~9. 비-Tg 마우스의 경우 N=5.
도 18a 내지 도 18d: 도 18a 및 도 18b에 표시된 데이터는 대조군 단클론 항체(10 mg/kg, SC; 회색의 채워진 원), H4H17319P2(3 mg/kg, SC; 테두리 없는 원) 또는 H4H17319P2(10 mg/kg; 검은색 채워진 원)를 1회 투여한 32주령 암컷 Lepr ^hu/hu 마우스에 대한 것이다. 도 18c에 표시된 데이터는 대조군(SC; 회색의 채워진 원), H4H17319P2(3 mg/kg, SC; 테두리 없는 원) 또는 H4H17319P2(10 mg/kg; 검은색 채워진 원)를 1회 투여한 마른 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에 대한 것이다. 도 18d에 표시된 데이터는 대조군(IV; 회색의 채워진 원) 또는 H4H17319P2(30 mg/kg, IV; 검은색 채워진 원)을 2회 투여한 고 체지방(약 6.0 kg) 수컷 및 암컷 시노몰구스 원숭이에 대한 것이다. 데이터는 평균 ±SEM이다. *, 표시된 시점에 각각의 대조군 대비 H4H17319P2(10 mg/kg)의 P<0.05. #, 표시된 시점에 각각의 대조군 대비 H4H17319P2(3 mg/kg)의 P<0.05. $, 표시된 시점에 H4H17319P2(10 mg/kg) 대비 H4H17319P2(3 mg/kg)의 P<0.05. &, 각각의 대조군 대비 H4H17319P2(30 mg/kg, IV)의 P<0.05. 도 18a는 연구 중인 마른 암컷 마우스에서, 투여 이전인 0일차 대비 체중 변화 백분율(좌측) 및 음식 섭취량(우측)을 제공한다. 군 당 N=6~7. 도 18b는 연구 중인 마른 암컷 마우스에서, 투여 이전인 0일차 대비 체지방량(좌측) 및 제지방량(우측)의 변화율을 보여주는 정량적 NMR 분석을 나타낸다. 군 당 N=6~7. 도 18c는 연구 중인 마른 원숭이에서 투여 이전인 -1일차 대비 체중 변화 백분율을 나타낸다. 군 당 N=12. 도 18d는 연구 중인 고 체지방 원숭이에서, DEXA(체성분 측정을 위한 이중 에너지 X-선 흡수계측법)에 의해 정량화 했을 때, 투여 이전인 -14일차, -7일차 및 -1일차 평균 대비 체중 변화 백분율(좌측) 및 체지방량 변화 백분율(중간) 및 제지방량(우측)을 나타낸다. 대조군 및 H4H17319P2 투여군의 경우 각각 N=4 및 8.
도 19는 동정적 사용(compassionate use) 임상 시험에서 이용되는 단일 환자 프로토콜을 도시한다.
도 20a 내지 도 20b는 치료 기간 1 동안(도 20a) 및 치료 기간 2 및 연장 치료 기간 동안(도 20b) H4H17319P2로 치료를 받는 환자에 대한 평가 일정을 제공하는 표이다.
도 21a 내지 도 21c는 선천성 렙틴 결핍증의 쥣과 동물 모델에서 혈당, 체중 및 음식 섭취량에 H4H17319P2가 미치는 효과를 나타낸다. 도 21a는 혈당을 mg/dL 단위로 제공하고, 도 21b는 체중을 그램 단위로 제공하며, 도 21c는 누적 음식 섭취량을 그램 단위로 제공한다. 회색 원, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^hu/hu (N=5). 검은색 사각형, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- (N=7). 흰색 사각형, H4H17319P2가 투여된 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- (N=8). 데이터는 평균 + SEM으로 표현됨. *, Tukey의 사후 검정과 함께 이원 ANOVA 분석에 의하면, Lepr ^hu/hu , Lep ^-/- + IgG4^P 대조군 대비 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- + H4H17319P2 군의 P<0.05. 양호한 섭취량 평가를 위해, Lepr ^hu/hu Lep ^-/- + IgG4^P 대조 군에서 마우스 2마리 및 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- + H4H17319P2 군에서 마우스 1마리를 제외시켰는데, 이는 이들이 케이지 내에서 먹이를 과도하게 조각 냈기 때문이다.
도 22a 내지 도 22c는 선천성 렙틴 결핍증의 쥣과 동물 모델에서 uCT 체성분 분석에 의한 체지방량, 골량 및 제지방량을 나타낸다. 도 22a는 체지방량을, 도 22b는 골량을, 도 22c는 제지방량을 그램 단위로 제공한다. 연구를 개시하기 전인 D-5일차에 마우스에 대한 베이스라인 스캔을 수행하였다. mAb 투여 후의 스캔은 연구의 35일차에 수행하였다. 회색 막대, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^hu/hu (N=5). 검은색 막대, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- (N=7). 흰색 막대, H4H17319P2가 투여된 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- (N=8). 마우스에게 10 mg/kg의 H4H17319P2 또는 이소형 대조군 항체를 매주 피하 주사하였다. 데이터는 평균 + SEM으로 표현됨. *, 베이스라인 대비 P < 0.05; #, 각 시점에 Lepr ^hu/hu + IgG4^P 대비 P < 0.05; +, 각 시점에 H4H17319P2 군 대비 P < 0.05. Tukey 사후 검정과 함께 이원 ANOVA에 의해 통계적 분석을 수행하였다.
도 23a 내지 도 23c는 선천성 렙틴 수용체 결핍증의 쥣과 동물 모델에서 혈당, 체중 및 음식 섭취량에 H4H17319P2가 미치는 효과를 나타낸다. 도 23a는 혈당을 mg/dL 단위로 제공하고, 도 23b는 체중을 그램 단위로 제공하며, 도 23c는 누적 음식 섭취량을 그램 단위로 제공한다. 회색 원, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^hu/hu (N=7~8). 검은색 사각형, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^A409E/A409E (N=9~10). 흰색 사각형, H4H17319P2가 투여된 Lepr ^A409E/A409E (N=10). 데이터는 평균 + SEM으로 표현됨. *, Sidak 사후 검정과 함께 혼합 효과 모델에 의하면, Lepr ^A409E/A409E + IgG4^P 대조군 대비 Lepr ^A409E/A409E + H4H17319P2 군의 P < 0.05. 양호한 섭취량 평가를 위해, Lepr ^hu/hu + IgG4^P 대조군에서 마우스 1마리 및 Lepr ^A409E/A409E + IgG4^P 대조 군에서 마우스 1마리를 제외시켰는데, 이들은 연구 도중에 사망했기 때문이다. 양호한 섭취량 평가를 위해, Lepr ^hu/hu + IgG4^P 대조 군에서 마우스 1마리 및 Lepr ^A409E/A409E + IgG4^P 대조 군에서 마우스 3마리를 제외시켰는데, 이들은 연구 도중에 먹이를 과도하게 조각 냈기 때문이다.
도 24a 내지 도 24c는 선천성 렙틴 수용체 결핍증의 쥣과 동물 모델에서 uCT 체성분 분석에 의한 체지방량, 골량 및 제지방량을 나타낸다. 도 24a는 체지방량을, 도 24b는 골량을, 도 24c는 제지방량을 그램 단위로 제공한다. 연구를 개시하기 전인 D-1일차에 마우스에 대한 베이스라인 스캔을 수행하였다. mAb 투여 후의 스캔은 연구의 41일차에 수행하였다. 회색 막대, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^hu/hu (N=7~8). 검은색 사각형, IgG4^P 대조군이 투여된 Lepr ^A409E/A409E (N=9~10). 흰색 사각형, H4H17319P2가 투여된 Lepr ^A409E/A409E (N=10). 마우스에게 10 mg/kg의 H4H17319P2 또는 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 매주 피하 주사하였다. 데이터는 평균 + SEM으로 표현됨. *, 베이스라인 대비 P < 0.05; #, 각 시점에 Lepr ^hu/hu + IgG4^P 대비 P < 0.05; +, 각 시점에 Lepr ^A409E/A409E + H4H17319P2 대비 P < 0.05. 통계적 분석은 Sidak 사후 검정과 함께 혼합 효과 모델을 사용하여 수행하였다.
도 25는 파트 A 코호트에 대한 1상 임상 시험의 이벤트 일정을 도시하며, 스크리닝을 위한 각각의 내원, 치료 및 추적관찰을 위한 내원 시에 수행될 절차를 포함한다.
도 26은 파트 B 코호트에 대한 1상 임상 시험의 이벤트 일정을 도시하며, 전 스크리닝, 스크리닝 및 베이스라인 결정을 위한 각각의 내원 시에 수행될 절차를 포함한다.
도 27은 파트 B 코호트에 대한 1상 임상 시험의 이벤트 일정을 도시하며, 치료 및 추적관찰을 위한 각각의 내원 시에 수행될 절차를 포함한다.

렙틴은 에너지 균형 뿐만 아니라 대사 및 신경내분비 기능을 담당하는 지방 조직 호르몬이다 (Flak 및 Myers의, Mol Endocrinol. 2016; 30: 3-12; Zhang 등의 Nature. 1994; 372: 425-432 참조). 에너지 부족 상태에서 순환하는 렙틴 수준이 낮으면 적응성 반응이 유도되는데, 이에는 배고픔의 증가 및 신경내분비 경로의 조절을 통한 에너지 보존이 포함된다. 렙틴(leptin)은 클래스 I 사이토카인 수용체 패밀리의 구성원인 렙틴 수용체(LEPR)를 결합함으로써 에너지 및 대사 균형을 조절한다(Tartaglia 등, 1995 참조). LEPR은 단일 유전자에 의해 암호화되며, 선택적 스플라이싱은 C-말단 서열이 상이한 LEPR의 다수의 스플라이스 이소형을 생성한다(Baumann 등, 1996 참조). 이들 스플라이스 이소형 중, LEPR-b는 렙틴의 효과를 매개하는 주요 이소형이며, JAK-STAT 신호 전달을 자극하는 유일한 이소형이다(Baumann 등, 1996; Tartaglia 등, 1995; White 및 Tartaglia, 1996 참조). 뇌에서 뉴런을 발현하는 LEPR-b는 에너지, 대사 및 신경내분비 항상성의 주요 표적이면서 매개자이다. 이는 Lepr-b ^db/db 마우스에서 Lepr-b의 선택적 신경 발현이 비만증, 당뇨병 및 생식 표현형을 구제한다는 관찰에 의해 뒷받침된다(de Luca 등, 2005 참조). 추가적으로, 뉴런에서 Lepr을 유전적으로 단리시키면 Lepr ^db/db 동물의 비만 및 고혈당증 표현형이 표현형 모사된다(Cohen 등, 2001 참조). 유전적 기능 상실 돌연변이로 인해 마우스 내 Lep 유전자에서 렙틴이 결핍되면 이상 식욕 항진증, 비만증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증 및 신경 내분비 기능의 손상이 초래되고, 이는 렙틴 치료를 통해 역전된다(Barash 등, 1996; Campfield 등, 1995; Chehab 등, 1996; Halaas 등, 1995; Pelleymounter 등, 1995 참조). 임상적으로, 렙틴 유사체인 메트렐렙틴은 렙틴 결핍증으로 인한 단성 비만증을 가진 환자에서 비만증 뿐만 아니라 대사 및 생식 기능 이상을 역전시킨다(Farooqi 등, 1999; Farooqi 등, 2002 참조). 일차 렙틴 결핍증과 유사하게, 이차 저렙틴증의 병태는 포도당과 지질 대사 기능 장애와 관련이 있으며, 이는 렙틴 치료에 의해 역전될 수 있다. 선천성 및 후천성 전신 지방이영양증은 지방 조직 축적의 거의 완전한 상실을 특징으로 하는 드물고 심각한 질환이다(Brown 등, 2016; Patni 및 Garg, 2015 참조). 이들 환자에서는 순환하는 렙틴 수준이 매우 낮은데, 이는 이상 식욕 항진증, 고중성지방혈증, 고콜레스테롤혈증, 간 지방증, 인슐린 저항성 및 당뇨병의 상태를 초래한다(Brown 등, 2016; Patni 및 Garg, 2015 참조). 특히 TG 수준이 500 mg/dL 내지 1000 mg/dL을 초과할 때, 고중성지방혈증의 심각한 합병증은 급성 및 재발성 췌장염으로서(Yadav 및 Pitchumoni 2003 참조), 생명을 위협할 수 있으며, 감염이나 장기 부전과 같은 합병증을 수반되면 사망률은 40%를 넘는다(UK Guidelines 2005). 간에서의 이소성 지질 축적(간 지방증)은 지방간염으로 이어질 수 있는데, 이는 간에서의 지방 축적, 세포 손상 및 염증을 특징으로 하며, 간경변(cirrhosis)의 가장 흔한 원인 중 하나이다(El-Zayadi 2008, Federico 2006, 및 Festi 2004 참조).

렙틴 치료는 지방 저장소의 거의 완전한 상실을 특징으로 하는 전신성 지방이영양증이 발생한 Tg-aP2-nSrebp1c 마우스에서 이상 식욕 항진증을 감소시키고 이상지질혈증, 간 지방증 및 혈당 조절을 개선한다(Shimomura 등, 1999; Shimomura 등, 1998 참조). 메트렐렙틴은 전신성 지방이영양증 환자에서 대사 기능 장애를 완화시키지만(Oral 등, 2002), 부분 지방이영양증 환자의 치료에는 승인되지 않았다 (Ajluni 등, 2016).

지방이영양증 환자들은 만성 신장 질환, 심혈관 합병증, 자가면역 질환, 말초 T 세포 림프종, 급성 림프구 백혈병, 및 호지킨 림프종과 같은 다른 심각한 동반질환(comorbidity)을 종종 경험한다.

선천성 렙틴 결핍증 환자는 생후 첫 수개월 동안 급격한 체중 증가와 면역학적 이상을 나타내며, 생후 첫 10년 또는 그 다음 10년 이내에 사망 위험이 상당히 증가한다(Funcke, 등, Monogenic forms of childhood obesity due to mutations in the leptin gene. Mol Cell Pediatr. 2014; 1(1): 3); (Dubern, 등, Leptin and leptin receptor-related monogenic obesity. Biochimie. 2012; 94(10): 2111-5); (Paz-Filho, 등, Ten years of leptin replacement therapy. Obesity reviews. 2011; 12: e315-e323 참조). 선천성 렙틴 결핍증에 대해 승인된 치료법은 없지만, 렙틴 기능 상실 돌연변이로 인한 단성 비만증 환자에 대한 몇 가지 작은 개발 표지 연구에서, 렙틴 치료는 식욕, 체중, 지방 과다증, 대사 이상, 뼈 나이와 실제 나이의 차이, 호르몬 이상, 및 면역학적 이상을 현저히 감소시켰다(Wabitsch, 등, Severe Early-Onset Obesity Due to Bioinactive Leptin Caused by a p.N103K Mutation in the Leptin Gene. J Clin Endocrinol Metab. 2015; 100(9): 3227-3230); (Farooqi, 등, Effects of recombinant leptin therapy in a child with congenital leptin deficiency. N Engl J Med. 1999; 341(12): 879-84); (Licinio, 등, Phenotypic effects of leptin replacement on morbid obesity, diabetes mellitus, hypogonadism, and behavior in leptin-deficient adults. Proc Natl Acad Sci USA. 2004; 101(13): 4531-6); (Gibson 등, Congenital Leptin Deficiency Due to Homozygosity for the Delta133G mutation: report of another case and evaluation of response to four years of leptin therapy. J Clin Endocrin. & Metab. 2004; 89(10): 4821-4826). 기타 문헌에서는, 렙틴 치료가 혈장 갑상선 호르몬 수준을 신속하고 지속 가능하게 증가시켰고, 사춘기 발달을 시의 적절하게 촉진하였고, 순환하는 CD4(+) T 세포의 수를 개선하였고, T 세포 증식과 사이토카인 방출을 개선하였음이 보고되어 있다(Farooqi 등, Beneficial effects of leptin on obesity, T cell hyporesponsiveness, and neuroendocrine/metabolic dysfunction of human congenital leptin deficiency. J Clin Invest. 2002; 110(8): 1093-1103). 그러나, 일부 경우에, 중화 활성을 갖는 항-메트렐렙틴 항체가 생겨나면 환자에게는 표적 치료 옵션이 없게 된다(Φzsu, 등, Early-onset severe obesity due to complete deletion of the leptin gene in a boy. J Pediatr Endocrinol Metab. 2017; 30(11): 1227-1230). H4H17319P2와 같은 렙틴 수용체 작용제를 사용하여 선천성 렙틴 결핍증을 치료하기 위한 방법이 본원에 제공된다(WO2017/66204 참조).

렙틴과 비슷한 효능으로 인간 LEPR을 활성화하는 작용제 단클론 항체가 본원에 제공된다. LEPR의 단클론 항체 매개 활성화는 일차 및 이차 렙틴 결핍 장애의 마우스 모델에서 심각한 체중 증가 및 대사 기능장애를 역전시키는 데 효과적이다. 또한, LEPR 작용제 단클론 항체는 정상 중량 마우스 뿐만 아니라 정상 및 고 체지방 비인간 영장류에서도 고 지방증과 체중을 감소시키고, 순환하는 렙틴의 존재 하에 LEPR을 자극한다.

본 개시는 기술된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는다는 것을 이해해야 하는데, 이는 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있기 때문이다. 또한 본 개시의 범위는 첨부된 청구항에 의해서만 한정되므로 본원에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기술하기 위한 목적이며, 한정하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 널리 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 설명에 사용된 용어 "약"은 인용된 특정 수치와 관련하여 사용될 때, 이러한 값이 인용된 값과 1% 이내에서 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본 설명에 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99와 101을 포함하고 그 사이의 모든 값(예컨대 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.

본 발명에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료를 지금부터 설명한다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, "렙틴 수용체", "LEPR", 등은 서열번호 113에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 렙틴 수용체를 지칭한다(UniProtKB/Swiss-Prot Accession No. P48357을 또한 참조한다). 과학적 문헌에 사용된 LEPR에 대한 대안적인 명칭으로는 "OB 수용체", "OB-R" 및 "CD295"가 있다. LEPR은 "WSX"로도 지칭된다(예를 들어, 미국 특허 제7,524,937호를 참조한다). "LEPR"이란 표현은 단량체 및 다량체 (예를 들어, 이량체) LEPR 분자 모두를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단량체 인간 LEPR"이란 표현은, 임의의 다량체화 도메인을 함유하거나 갖지 않으며, 다른 LEPR 분자에 대한 직접적인 물리적 연결 없이 단일 LEPR 분자로서 정상적인 조건 하에 존재하는 LEPR 단백질 또는 이의 일부를 의미한다. 예시적인 단량체 LEPR 분자는 서열번호 114의 아미노산 서열을 포함하는 "hLEPR.mmh"로서 본원에서 지칭되는 분자이다(예를 들어, 본원의 실시예 3 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, "이량체 인간 LEPR"이란 표현은 링커, 공유 결합, 비공유 결합을 통해 서로 연결되거나 항체 Fc 도메인과 같은 다량체화 도메인을 통해 서로 연결된 2개의 LEPR 분자를 포함하는 작제물을 의미한다. 예시적인 이량체 LEPR 분자는, 서열번호 115의 아미노산 서열을 포함하는 "hLEPR.mFc"로서 본원에서 지칭되거나 서열번호 116의 아미노산 서열을 포함하는 "hLEPR.hFc"로서 본원에서 지칭되는 분자이다(예를 들어, 본원의 실시예 3 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, "항-LEPR 항체", "LEPR에 특이적으로 결합하는 항체", "LEPR-특이적 결합 단백질" 등은, 구체적으로 달리 명시되지 않는 한, 전장 인간 LEPR, 단량체 인간 LEPR, 이량체 인간 LEPR, 또는 LEPR 세포 외 도메인을 포함하거나 이로 이루어진 다른 작제물에 결합하는 분자를 지칭한다.

본원의 단백질, 폴리펩티드 및 단백질 단편에 대한 모든 언급은, 비인간-종에서 유래된 것으로서 명시적으로 달리 명시되지 않는 한, 각각의 단백질, 폴리펩티드 또는 단백질 단편의 인간 버전을 지칭하도록 의도된다. 따라서, "LEPR"이란 표현은 비-인간 종에서 유래된 것, 예를 들어, "마우스 LEPR", "원숭이 LEPR" 등으로서 달리 명시되지 않는 한 인간 LEPR을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같이, "세포 표면-발현된 LEPR"이란 표현은, LEPR 단백질의 적어도 일부가 세포막의 세포 외 측면에 노출되고 항체의 항원 결합 부분에 접근할 수 있도록, 시험관 내 또는 생체 내 세포의 표면 상에서 발현되는 하나 이상의 LEPR 단백질(들) 또는 이의 세포 외 도메인을 의미한다. "세포 표면-발현된 LEPR"은 정상적으로 (예를 들어, 천연 상태로 또는 야생형 상태로) LEPR 단백질을 발현하는 세포의 표면 상에서 발현된 LEPR 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다. 대안적으로, "세포 표면-발현된 LEPR"은 정상적으로는 그 표면 상에서 인간 LEPR을 발현하지 않지만, 그 표면 상에서 LEPR을 발현하도록 인공적으로 조작된 세포의 표면 상에서 발현된 LEPR 단백질을 포함하거나 이로 이루어질 수 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, "항-LEPR 항체," 또는 "인간 렙틴 수용체에 결합하는 항체"와 같은 표현은 단일 특이성을 갖는 1가 항체 뿐만 아니라, LEPR에 결합하는 제1 아암 및 제2 (표적) 항원에 결합하는 제2 아암을 포함하는 이중특이적 항체를 둘 다를 포함하며, 여기서 항-LEPR 아암은 본원의 표 1에 제시된 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 어느 하나를 포함한다.

본 설명에 사용된 용어 "항체"는 특정 항원(예컨대 LEPR)과 특이적으로 결합하거나 상호 작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원 결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함하는 면역글로불린 분자 뿐만 아니라 이의 다량체(예: IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본원에서 HCVR 또는 V_H로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본원에서 LCVR 또는 V_L로 약칭됨)과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인을 포함한다(C_L1). V_H와 V_L 영역은, 더 보존적인 영역(프레임워크 영역(FR)으로 지칭됨)이 중간에 끼어 있는 초가변 영역(상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭됨)으로 추가로 세분화될 수 있다. 각각의 V_H 및 V_L은 아미노 말단에서 카르복시 말단의 방향으로 다음 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 구현예에서, 항-LEPR 항체(또는 이의 항원 결합 부분)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석에 기초하여 정의될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 전체 항체 분자의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적인, 또는 효소에 의해 수득할 수 있는, 또는 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 적합한 표준 기법, 예컨대 단백질 가수분해성 소화 또는 항체 가변 도메인 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기법을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들어 상업적인 공급원, (예를 들어, 파지-항체 라이브러리 포함하는) DNA 라이브러리로부터 쉽게 이용할 수 있거나, 합성될 수 있다. 이러한 DNA는 시퀀싱될 수 있고, 예를 들면 하나 또는 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적당한 구성으로 배열하기 위해, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하며, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키기 위해서 등, 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 조작될 수 있다.

항원 결합 단편의 비제한적 실시예는: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단쇄 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역(예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보성 결정 영역(CDR))을 모방하는 아미노산 잔기, 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩티드로 이루어진 최소 인지 단위를 포함한다. 다른 조작된 분자, 예컨대, 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 미니바디, 나노바디(예: 1가 나노바디, 2가 나노바디 등), 작은 모듈형 면역치료제(SMIP), 및 상어 가변 IgNAR 도메인 등도 본원에 사용된 바와 같은 "항원 결합 단편"이란 표현에 포함된다.

항체의 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함하게 된다. 이러한 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 그것과 한 프레임에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. V_L 도메인과 결합된 V_H 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, V_H 및 V_L 도메인은 임의의 적절한 배열로 서로에 대해 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있고, V_H-V_H, V_H-V_L 또는 V_L-V_L 이량체를 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체 V_H 또는 V_L 도메인을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유 결합된 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에서 발견될 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비제한적인 예시적 구성은 다음을 포함한다: (i) V_H-C_H1; (ii) V_H-C_H2; (iii) V_H-C_H3; (iv) V_H-C_H1-C_H2; (v) V_H-C_H1-C_H2-C_H3; (vi) V_H-C_H2-C_H3; (vii) V_H-C_L; (viii) V_L-C_H1; (ix) V_L-C_H2; (x) V_L-C_H3; (xi) V_L-C_H1-C_H2; (xii) V_L-C_H1-C_H2-C_H3; (xiii) V_L-C_H2-C_H3; 및 (xiv) V_L-C_L. 위에서 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 이러한 가변 및 불변 도메인은 직접적으로 상호간에 연결되거나 또는 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반 가요성 연결을 초래하는 적어도 2개(예컨대 5, 10, 15, 20, 40, 60 이상)의 아미노산으로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 항체의 항원 결합 단편은 위에서 열거된 가변 및 불변 도메인 구성 중 어느 하나의 동종-이량체 또는 이종-이량체(또는 다른 다량체)를 (예를 들어, 이황화 결합(들)에 의해) 서로 및/또는 하나 이상의 단량체 V_H 또는 V_L 도메인과 비공유 결합으로 포함할 수 있다.

완전 항체 분자와 마찬가지로, 항원 결합 단편은 단일특이적이거나 다중특이적(예: 이중특이적)일 수 있다. 항체의 다중특이적 항원 결합 단편은 일반적으로 적어도 2개의 상이한 가변 도메인을 포함하게 되며, 여기서 각각의 가변 도메인은 별도의 항원에 특이적으로 결합할 수 있거나 동일한 항원 상의 상이한 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 예시적인 이중특이적 항체 포맷을 포함하여, 임의의 다중특이적 항체 포맷은 당업계에서 이용할 수 있는 일상적인 기술을 사용하여 본 발명의 항체의 항원 결합 단편의 맥락에서 사용하기에 적합할 수 있다.

본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 항-LEPR 항체는 인간 항체이다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하도록 의도된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내 체세포성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 예를 들어 CDR에 포함할 수 있고, 특히 CDR3에 포함할 수 있다. 그러나 본 설명에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예를 들면 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위로 그래프트되어 있는 항체를 포함하고자 한 것은 아니다.

본 발명의 항체는 일부 구현예에서, 재조합 인간 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 모든 인간 항체, 예를 들면 숙주 세포 안에 형질전환된 재조합 발현 벡터를 사 용하여 발현된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 재조합된 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자가 도입된 동물(예컨대, 마우스)로부터 분리된 항체(예컨대, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 다른 DNA 서열에 대해 인간 면역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 항체를 포함하고자 한 것이다. 그런 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 일부 구현예에서, 이러한 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 유전자 도입된 동물이 사용되는 경우, 생체 내 체세포성 돌연변이 유발)을 거치므로, 재조합 항체의 V_H 및 V_L 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 V_H 및 V_L 서열로부터 유래되고 이들과 관련되지만, 생체 내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재하지 않을 수 있다.

본 발명은 힌지, C_H2 또는 C_H3 영역에서 하나 이상의 돌연변이를 갖는 항체를 포함하며, 이는 예를 들어 생산에서 원하는 항체 형태의 수율을 개선하는 데 바람직할 수 있다.

본 발명의 항체는 단리된 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "단리된 항체"는 이의 자연 환경의 적어도 하나의 성분으로부터 식별되어 분리되었고/되었거나 회수된 항체를 의미한다. 예를 들어, 유기체의 적어도 하나의 성분으로부터 분리 또는 제거된 항체, 또는 항체가 자연적으로 존재하거나 자연적으로 생산되는 조직이나 세포로부터 분리 또는 제거된 항체가 본 발명의 목적에 맞는 "단리된 항체"이다. 단리된 항체는 재조합 세포 내의 인 시튜(in situ) 항체도 포함한다. 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 또는 단리 단계를 거친 항체이다. 특정 구현예에 따르면, 단리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학물질을 실질적으로 갖지 않을 수 있다.

본 발명은 본원에 개시된 항-LEPR 항체의 변이체를 포함하며, 상기 변이체는 항체가 유래된 상응하는 생식계열 서열과 비교해 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 이러한 돌연변이는 본원에 개시된 아미노산 서열을, 예를 들어, 공개된 항체 서열 데이터베이스로부터 이용할 수 있는 생식선 서열과 비교함으로써 쉽게 확인할 수 있다. 본 발명은 본원에 개시된 아미노산 서열 중 어느 하나로부터 유래된 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함하되, 하나 이상의 프레임워크 영역 및/또는 CDR 영역 내의 하나 이상의 아미노산은 항체가 유래된 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이 되거나, 또 다른 인간 생식계열 서열의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이 되거나, 상응하는 생식계열 잔기(들)의 보존적 아미노산 치환으로 돌연변이 될 수 있다(이러한 서열 변화는 본원에서 "생식계열 돌연변이"로서 통칭한다). 당업자는, 본원에 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열에서 출발하여, 하나 이상의 개별 생식계열 돌연변이 또는 이들의 조합을 포함하는 다수의 항체 및 항원 결합 단편을 쉽게 생산할 수 있다. 특정 구현예에서, V _H 및/또는 V _L 도메인 내의 프레임워크 및/또는 CDR 잔기의 전부는, 항체가 유래된 원래의 생식계열 서열에서 발견되는 잔기로 다시 돌연변이 된다. 다른 구현예에서, 특정한 잔기만이, 예를 들어, FR1의 처음 8개의 아미노산 또는 FR4의 마지막 8개의 아미노산 내에서 발견된 돌연변이된 잔기, 또는 CDR1, CDR2 또는 CDR3에서 발견된 돌연변이된 잔기만이 원래 생식선 서열로 다시 돌연변이 된다. 다른 구현예에서, 프레임워크 및/또는 CDR 잔기(들) 중 하나 이상은 상이한 생식선 서열(즉, 항체가 유래된 원래 생식선 서열과 상이한 생식선 서열)의 상응하는 잔기(들)로 돌연변이 된다. 또한, 본 발명의 항체는 프레임워크 및/또는 CDR 영역 내의 2개 이상의 생식계열 돌연변이의 임의의 조합을 함유할 수 있는데, 예를 들어, 특정 개별 잔기는 특정 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 되는 반면, 원래의 생식계열 서열과 상이한 특정한 다른 잔기는 유지되거나, 상이한 생식계열 서열의 상응하는 잔기로 돌연변이 된다. 일단 획득되면, 하나 이상의 생식계열 돌연변이를 포함하는 항체 및 항원 결합 단편은, 개선된 결합 특이성, 증가된 결합 친화도, 개선되거나 강화된 길항성 또는 작용성 생물학적 특성(경우에 따라), 감소된 면역원성 등과 같은 하나 이상의 원하는 특성에 대해 쉽게 시험될 수 있다. 이러한 일반적인 방식으로 수득된 항체 및 항원 결합 단편은 본 발명에 포함된다.

본 발명은 본원에 개시된 예시적인 항-LEPR 항체 중 어느 하나에서 발견되는 것과 같은 하나 이상의 가변 도메인 또는 CDR 아미노산 서열과 실질적으로 유사하거나 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 포함하는 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

폴리펩티드에 적용되는 바와 같이, 용어 "실질적인 유사성" 또는 "실질적으로 유사한"은, 예를 들어, 디폴트 갭 가중치를 사용하는 GAP 또는 BESTFIT 프로그램에 의해 최적으로 정렬되었을 때, 2개의 펩티드 서열이 적어도 95% 서열 동일성, 더욱 더 바람직하게는 적어도 98% 또는 99%의 서열 동일성을 공유함을 의미한다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적 아미노산 치환만큼 상이하다. "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄(R기)를 갖는 또 다른 아미노산 잔기에 의해 치환되는 것이다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적 치환만큼 서로 상이한 경우, 서열 동일성 백분율 또는 유사성의 정도는 상향으로 조정되어 치환의 보존적 성질을 보정할 수 있다. 이러한 조정을 만드는 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, Pearson의 문헌[(1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331을 참조한다. 화학적 성질이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산의 군의 예는 다음을 포함한다: (1) 지방족 측쇄: 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 및 이소류신; (2) 지방족-히드록실 측쇄: 세린 및 트레오닌; (3) 아미드 함유 측쇄: 아스파라긴 및 글루타민; (4) 방향족 측쇄: 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판; (5) 염기성 측쇄: 리신, 아르기닌, 및 히스티딘; (6) 산성 측쇄: 아스파르트산염 및 글루탐산염; 및 (7) 황 함유 측쇄: 시스테인 및 메티오닌. 바람직한 보존적 아미노산 치환기는: 발린-류신-이소류신; 페닐알라닌-티로신; 리신-아르기닌; 알라닌-발린; 글루탐산염-아스파르트산염; 및 아스파라긴-글루타민이다. 대안적으로, 보존적 치환은 Gonnet 등의 문헌에 개시된 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 양의 값을 갖는 임의의 변화이다(예: Gonnet 등의 (1992) Science 256: 1443-1445 참조). "적당한 보존적" 치환은 PAM250 로그 우도 매트릭스에서 음의 값을 갖는 임의의 변화이다.

서열 동일성으로도 지칭되는, 폴리펩티드에 대한 서열 유사성은 일반적으로 서열 분석 소프트웨어를 사용해 측정된다. 단백질 분석 소프트웨어는 보존적 아미노산 치환을 포함하는 다양한 치환, 결실 및 기타 변형에 배정된 유사성 측정치를 사용하여 유사한 서열들을 대조한다. 예를 들어, GCG 소프트웨어는, 상이한 종의 유기체 유래의 상동성 폴리펩티드와 같은 밀접하게 연관된 폴리펩티드 간의 서열 상동성이나 서열 동일성, 또는 야생형 단백질과 이의 뮤테인 사이의 서열 상동성이나 서열 동일성을 결정하기 위한 디폴트 파라미터와 함께 사용될 수 있는 Gap 및 Bestfit과 같은 프로그램을 포함한다. 예를 들어, GCG 버전 6.1 참조. 폴리펩티드 서열은 GCG 버전 6.1의 프로그램인 FASTA를 사용해, 디폴트 파라미터 또는 권장 파라미터를 사용해 비교할 수도 있다. FASTA(예: FASTA2 및 FASTA3)는 쿼리 및 검색 서열 사이의 가장 중첩된 영역의 정렬 및 서열 동일성 백분율을 제공한다 (전술한 Pearson의 문헌[(2000)] 참조). 상이한 유기체 유래의 다수의 서열이 포함된 데이터베이스와 본 발명의 서열을 비교할 때 바람직한 또 다른 알고리즘은 디폴트 파라미터를 사용하는 컴퓨터 프로그램인 BLAST, 특히 BLASTP 또는 TBLASTN이다. 예를 들어, Altschul 등의 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410 및 Altschul 등의 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402 참조.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 렙틴 결핍증과 관련된 질환 또는 장애의 완화, 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 동물, 바람직하게는 포유동물, 더 바람직하게는 인간을 지칭한다. 대상체는 성인 또는 소아일 수 있다. 대상체는 전신성 또는 부분 지방이영양증과 같은 대사 기능장애를 가질 수 있다. 대상체는 선천성 렙틴 결핍증 또는 후천성 렙틴 결핍증을 가질 수 있다. 선천성 렙틴 결핍증을 가진 대상체에는, 렙틴을 순환하지 않게 하거나 순환하는 렙틴의 수준을 거의 없게 만드는 유전자 돌연변이를 갖거나 순환하지만 생체 불활성인 렙틴을 갖는 대상체가 포함된다. 대상체는 렙틴 결핍증과 관련된 하나 이상의 증상을 가질 수 있습니다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "대상체"는 용어 "환자"와 상호 교환 가능하다. 일부 양태에서, 대상체는 메트렐렙틴에 대한 중화 항체를 갖는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료(treat, treating 또는 treatment)"는 렙틴 결핍증의 적어도 하나의 증상의 중증도가 본 발명의 항체와 같은 치료제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 감소 또는 완화되는 것을 지칭한다. 상기 용어는 연관된 질환의 진행을 억제하는 것 또는 질환과 관련된 병태 또는 증상의 악화를 억제하는 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 질환의 긍정적 예후를 포함한다. 즉, 본 발명의 항체와 같은 치료제의 투여 시 증상이 대상체로부터 없어질 수 있다. 긍정적 예후에는 다음 병태 중 어느 하나의 완화를 포함할 수 있다: 이상 식욕 항진증, 고혈당증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증 또는 간 지방증.

용어 "예방(prevent, preventing 또는 prevention)"은 렙틴 결핍증과 관련된 임의의 증상, 병태 또는 표시의 징후를 억제하는 것을 의미한다.

치료제는 치료적 투여량으로 대상에게 투여될 수 있다. "치료적 유효량"이라는 구절은 투여에 의해 원하는 효과를 생산하는 양을 의미한다. 정확한 양은 치료의 목적에 따라 달라질 것이고, 공지된 기술(예를 들어, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding 참조)을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있으며, 본원에서 보다 상세하게 논의된다.

Fc 변이체를 포함하는 항-LEPR 항체

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 예를 들어, 중성 pH에 비해 산성 pH에서 FcRn 수용체에 대한 항체 결합을 강화시키거나 감쇠시키는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-LEPR 항체가 제공된다. 예를 들어, 본 발명은 Fc 도메인의 C_H2 또는 C_H3 영역에서 돌연변이를 포함하는 항-LEPR 항체를 포함하되, 돌연변이(들)는 산성 환경에서(예를 들어, pH가 약 5.5 내지 6.0 범위인 엔도솜에서) FcRn에 대한 Fc 도메인의 친화도를 증가시킨다. 이러한 돌연변이는, 동물에게 투여되는 경우 항체의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 이러한 Fc 변형의 비제한적인 예는, 예를 들어, 위치 250(예: E 또는 Q)에서의 변형; 250 및 428(예: L 또는 F)에서의 변형; 252(예: L/Y/F/W 또는 T), 254(예: S 또는 T), 및 256(예: S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 위치 428 및/또는 433(예: H/L/R/S/P/Q 또는 K) 및/또는 434(예: A, W, H, F 또는 Y)에서의 변형; 또는 위치 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 위치 307 또는 308(예: 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 포함한다 일 구현예에서, 변형은 428L(예: M428L) 및 434S(예: N434S) 변형; 428L, 259I(예: V259I), 및 308F(예: V308F) 변형; 433K(예: H433K) 및 434(예: 434Y) 변형; 252, 254, 및 256(예: 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형(예: T250Q 및 M428L); 및 307 및/또는 308 변형(예: 308F 또는 308P)을 포함한다.

예를 들어, 본 발명은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 돌연변이의 하나 이상의 쌍 또는 군을 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 항-LEPR 항체를 포함한다: 250Q 및 248L(예: T250Q 및 M248L); 252Y, 254T 및 256E(예: M252Y, S254T 및 T256E); 428L 및 434S(예: M428L 및 N434S); 및 433K 및 434F(예: H433K 및 N434F). 전술한 Fc 도메인 돌연변이 및 본원에 개시된 항체 가변 도메인 내의 다른 돌연변이의 모든 가능한 조합은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 고려된다.

본 발명의 항-LEPR 항체는 효과기 기능이 감소된 변형된 Fc 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "효과기 기능이 감소된 변형된 Fc 도메인"은, 변형된 Fc를 포함하는 분자가 야생형 자연 발생 버전의 Fc 부분을 포함하는 비교 분자에 비해 세포 살해(예: ADCC 및/또는 CDC), 보체 활성화, 식균 작용 및 옵소닌화(opsonization)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 효과의 강도 또는 정도의 감소를 나타내도록, 야생형 자연 발생 Fc 도메인에 비해 변형되고, 돌연변이 되고, 절단된 면역 글로불린의 임의의 Fc 부분을 의미한다. 특정 구현예에서, "효과기 기능이 감소된 변형된 Fc 도메인"은 Fc 수용체(예:, FcγR)에 대한 결합이 감소되거나 약화된 Fc 도메인이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 변형된 Fc 도메인은 힌지 영역에서 치환을 포함하는 변이체 IgG1 Fc 또는 변이체 IgG4 Fc이다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 변형된 Fc는 IgG1 Fc 힌지 영역의 적어도 하나의 아미노산이 IgG2 Fc 힌지 영역에서 유래된 상응하는 아미노산으로 치환되는 변이체 IgG1 Fc를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 맥락에서 사용하기 위한 변형된 Fc는 IgG4 Fc 힌지 영역의 적어도 하나의 아미노산이 IgG2 Fc 힌지 영역에서 유래된 상응하는 아미노산으로 치환되는 변이체 IgG4 Fc를 포함할 수 있다. 본 발명의 맥랑에서 사용될 수 있는 비제한적인 예시적인 변형된 Fc 영역은 미국 특허 출원 공개 제2014/0243504호에 개시되어 있다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 변형된 Fc 도메인 및 Fc 변형은 US 2014/0171623; US 8,697,396; US 2014/0134162; WO 2014/043361에 제시된 임의의 변형을 포함한다. 본원에 기술된 바와 같은 변형된 Fc 도메인을 포함하는 항체 또는 다른 항원 결합 융합 단백질을 작제하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

항체의 생물학적 특성

본 발명은 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 이러한 항체는 본원에서 "작용제 항체"로서 지칭될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "LEPR 신호 전달 활성화"는 일반적으로 LEPR을 발현하는 세포에서 LEPR과 렙틴의 상호작용에 기인하는 세포 내 효과를 자극하는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, "LEPR 신호 전달 활성화"는 STAT3의 전사 활성화를 의미하는데, 이는 STAT3 활성을 직접 또는 간접적으로 측정하거나 식별할 수 있는 임의의 방법, 예를 들어, 리포터 세포주에서 발현된 STAT3의 표지된 버전을 사용해 검출할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은, 예를 들어, 본원의 실시예 7에서 정의된 바와 같은 세포 기반 검정 포맷을 사용해 세포 기반 리포터 검정 또는 실질적으로 유사한 검정에서 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. LEPR 활성화를 검출하는 세포 기반 리포터 검정(예컨대, 본원의 실시예 7에 제시된 검정)은 EC₅₀ 값(즉, 반치 최대 신호 전달을 생성하는 데 필요한 항체 농도) 및/또는 렙틴이 존재할 때 관찰된 최대 신호 전달의 백분율로 표현될 수 있는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있다. 본 발명의 특정 예시적 구현예에서, 예를 들어, 본원의 실시예 7에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 세포 기반 리포터 검정법 또는 실질적으로 유사한 검정법에서, 약 12.0 nM 미만의 EC₅₀ 값으로 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항-LEPR 항체가 제공된다. 본 발명의 특정 예시적 구현예에서, 예를 들어, 본원의 실시예 7에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 세포 기반 리포터 검정법 또는 실질적으로 유사한 검정법에서의 약 65%보다 큰 렙틴 신호 전달에 비해 활성화 최대 백분율로 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항-LEPR 항체가 제공된다.

본 발명은 높은 친화도로 단량체 인간 LEPR에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 25℃또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때, 약 150 nM 미만의 K_D로 단량체 인간 LEPR(예: hLEPR.mmh, 서열번호 114)에 결합하는 항-LEPR 항체를 포함한다. 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때 25℃에서 약 150 Nm 미만, 약 140 nM 미만, 약 130 nM 미만, 약 120 nM 미만, 약 110 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 90 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 40 nM 미만, 약 30 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 9 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 7 nM 미만, 약 6 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 900 pM 미만, 약 800 pM 미만, 약 700 pM 미만, 약 600 pM 미만, 약 500 pM 미만, 약 400 pM 미만 또는 약 300 pM 미만의 K_D로 단량체 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공된다.

본 발명은, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 25℃또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때, 약 50분을 초과하는 해리 반감기(t½)로 단량체 인간 LEPR(예: hLEPR.mmh, 서열번호 114)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 50분 초과, 약 55분 초과, 약 60분 초과, 약 65분 초과 또는 그 이상의 t½로 단량체 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공된다.

본 발명은 높은 친화도로 이량체 인간 LEPR(예: hLEPR.mFc, 서열번호 115)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 예를 들어, 본 발명은, 예컨대 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 25℃또는 37℃에서 표면 플라스몬 공병 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때, 약 1.5 nM 미만의 K_D로 이량체 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체를 포함한다. 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 150 nM 미만, 약 130 nM 미만, 약 110 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 40 nM 미만, 약 30 nM 미만, 약 20 nM 미만, 또는 약 10 nM 미만의 K_D로 이량체 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공된다.

본 발명은, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 25℃또는 37℃에서 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때, 25℃또는 37℃에서 약 10분을 초과하는 해리 반감기(t½)로 이량체 인간 LEPR(예: hLEPR.mFc, 서열번호 115)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 특정 구현예에 따르면, 예를 들어 본원의 실시예 3에 정의된 바와 같은 검정 포맷을 사용해 표면 플라스몬 공명 또는 실질적으로 유사한 검정법에 의해 측정했을 때, 25℃에서 약 10분 초과, 약 15분 초과, 약 20분 초과, 약 25분 초과, 약 30분 초과, 약 40분 초과, 약 50분 초과, 약 60분 초과, 약 70분 초과 또는 그 이상의 t½로 단량체 인간 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체가 제공된다.

본 발명은 인간 렙틴과 복합체를 이룬 LEPR("인간 렙틴과 복합체를 이룬 LEPR"은 "렙틴:LEPR"로 표현될 수도 있음)에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 hLEPR 및 인간 렙틴을 포함하는 미리 형성된 복합체에 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 즉, 특정 구현예에 따르면, 항-LEPR 항체와 LEPR간의 상호작용은 LEPR과 복합체를 이룬 렙틴의 존재에 의해 억제되지 않으며; 마찬가지로, 본 발명의 본 양태에 따른 렙틴과 LEPR 간의 상호작용은 항-LEPR 항체의 존재에 의해 억제되지 않는다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 렙틴과 복합체를 이룬 LEPR에 결합하는 지의 여부를 결정하기 위한 예시적인 검정 포맷은 본원의 실시예 4에 제시되어 있다.

유사하게, 본 발명은 LEPR에 결합하고 LEPR:렙틴 상호작용을 차단하지 않는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 LEPR에 결합하여 항체:LEPR 복합체를 형성할 수 있는 항체를 포함하며, 생성된 항체:LEPR 복합체는 렙틴과 상호작용하여 항체, LEPR 및 렙틴을 포함하는 3원 복합체를 생성할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 LEPR과 렙틴의 상호작용을 차단하거나 방해하지 않는 방식으로 LEPR에 결합할 수 있는지를 결정하기 위한 예시적인 검정 포맷은 본원의 실시예 5에 제시되어 있다.

본 발명은 인간 렙틴의 존재 및/또는 부재 하에 세포 표면-발현 LEPR에 결합하는 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 세포 표면-발현 LEPR은 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 LEPR 분자에 결합할 수 있도록 세포 표면에서 자연적으로 발현되거나 조작된 세포주에서 발현되는 LEPR 또는 이의 일부분(예: LEPR의 세포외 부분)을 의미한다. 특정 구현예에서, 세포 표면-발현 LEPR은 태그 또는 앵커(예: 본원의 실시예 6에 도시된 GPI 앵커)를 통해 세포에 연결된 LEPR의 세포외 도메인을 포함하는 재조합 복합체를 포함한다. 본 발명의 본 양태에 따르면, 렙틴의 부재 시 세포 표면-발현 LEPR에 결합할 수 있고, 렙틴의 존재 시에도(즉, 렙틴이 세포 표면-발현 렙틴에 결합할 수 있는 환경 하에서도) 세포 표면-발현 LEPR에 결합할 수 있는 항체가 제공된다. 즉, 특정 구현예에 따르면, 항-LEPR 항체와 세포 표면-발현 LEPR 간의 상호작용은 세포 표면-발현 LEPR과 복합체를 이룬 렙틴의 존재에 의해 억제되지 않는다. 본 발명의 본 양태에 따른 항체는 항체, 세포 표면-발현 LEPR 및 렙틴을 포함하는 3원 복합체를 세포의 표면 상에 형성할 수 있다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 렙틴의 존재 및 부재 하에 세포 표면-발현 LEPR에 결합할 수 있는지를 결정하기 위한 예시적인 검정 포맷은 본원의 실시예 6에 제시되어 있다.

본 발명의 항체는 전술한 생물학적 특징 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 가질 수 있다. 본 발명의 항체의 생물학적 특성에 대한 전술한 목록은 포괄적인 것으로 의도되지는 않는다. 본 발명의 항체의 다른 생물학적 특성은 본원의 실제 실시예를 포함하여 본 개시를 검토함으로써 당업자에게 명백해질 것이다.

에피토프 맵핑 및 관련 기술

본 발명은 하나 이상의 보존적 치환을 갖는 본원에 개시된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열 중 어느 하나의 변이체를 포함하는 항-LEPR 항체를 또한 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원의 표 1에 제시된 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열에 비해, 예를 들어, 10개 이하, 8개 이하, 6개 이하, 4개 이하 등의 보존적 아미노산 치환을 갖는 HCVR, LCVR, 및/또는 CDR 아미노산 서열을 갖는 항-LEPR 항체를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원의 표 1에 제시된 서열에 비해 변이체 HCVR, LCVR 및/또는 CDR 아미노산 서열을 포함하는 (예를 들어, 보존적 아미노산 치환을 포함하는) 항-LEPR 항체를 제공하며, 여기서 각각의 변이체 항체는 그럼에도 불구하고 본원에 개시된 예시적인 항-LEPR 항체의 하나 이상의 기능 및/또는 특성을 나타낸다.

인간 LEPR의 세포외 도메인은 N-말단 사이토카인 수용체 상동성 도메인(CRH-1), 면역글로불린 유사(Ig) 도메인, 및 렙틴 결합 도메인(LBD)으로 지칭되는 제2 CRH 도메인(CRH-2)을 함유한다. (Carpenter 등 (2012) Structure 20:487-97). 또한, LEPR은 과립구 콜로니 자극 인자(GCSF) 및 당단백질 130(gp13)과 가장 큰 상동성 및 유사한 세포외 도메인 크기 및 구조를 공유한다. (Haniu 등의 (1998) J Biol Chem 273(44): 28691-699).

용어 "에피토프"는 파라토프로 알려진 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원 결합 부위와 상호 작용하는 항원 결정자를 지칭한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 항원 상의 상이한 영역에 결합할 수 있고 상이한 생물학적 효능을 가질 수 있다. 에피토프는 입체적이거나 선형일 수 있다. 입체적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 분절에서 유래된 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬 내 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성된 것이다. 특정 상황에서, 에피토프는 항원 상에 당류, 포스포릴기, 또는 설포닐기의 모이어티를 포함할 수 있다.

본 발명은 인간 LEPR의 아미노산 M1-D839(서열번호 113) 내에서 발견되는 하나 이상의 에피토프와 상호작용하는 항-LEPR 항체를 포함한다. 실시예 11에 제시된 바와 같이, 인간 LEPR의 201 펩티드는 항체 H4H16650P2에 결합할 때 중수소화 흡수가 상당히 감소하였다. 아미노산 162-169(인간 LEPR의 아미노산 LYVLPEVL, 서열번호 113) 및 170-191(인간 LEPR의 아미노산 EDSPLVPQKGSF, 서열번호 113)에 상응하는 펩티드는 H4H16650P2에 결합할 때 중수소화 속도가 더 느려졌는데, 이는 이러한 항체가 서열 LYVLPEVL 또는 EDSPLVPQKGSF(각각 서열번호 113의 아미노산 162-169 또는 170-191)을 갖는 적어도 2개의 인간 LEPR 에피토프에 결합함을 나타낸다.

본 발명의 항체가 결합하는 에피토프는 LEPR 단백질의 3개 이상의 (예를 들어, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의) 아미노산으로 이루어진 단일 연속 서열로 이루어질 수 있다. 대안적으로, 에피토프는 LEPR의 복수의 비연속 아미노산(또는 아미노산 서열)으로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 에피토프는 LEPR의 렙틴-결합 도메인 상에 위치하거나 그 근처에 위치한다. 다른 구현예에서, 에피토프는 LEPR의 렙틴-결합 도메인과 구분되는 영역에, 예를 들어 항체가 이러한 에피토프에 결합할 때 LEPR에 대한 렙틴의 결합을 방해하지 않는 LEPR 표면 상의 위치에 위치한다.

당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용해 특정 항체에 의해 인식되는 에피토프 내 아미노산을 식별할 수 있다. 예시적인 기술은, 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이 분석, 펩티드 블롯 분석, 및 펩티드 절단 분석을 포함한다. 또한, 에피토프 절제, 에피토프 추출 및 항원의 화학적 변형과 같은 방법이 사용될 수 있다(Tomer, 2000, Protein Science 9:487-496 참조). 항체가 상호 작용하는 폴리펩티드 내의 아미노산을 식별하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 질량 분석법에 의해 검출되는 수소/중수소 교환이다. 일반적으로 말하자면, 수소/중수소 교환 방법은 관심 단백질을 중수소-표지하는 단계, 이어서 항체를 중수소-표지된 단백질에 결합시키는 단계를 포함한다. 다음으로, 단백질/항체 복합체가 물로 옮겨져 (중수소 표지된 상태의) 항체에 의해 보호되는 잔기를 제외한 모든 잔기에서 수소-중수소 교환을 일어나게 한다. 항체 해리 후, 표적 단백질을 대상으로 프로테아제 절단 및 질량 분광 분석을 수행하여, 항체가 상호 작용하는 특정 아미노산에 상응하는 중수소-표지된 잔기를 밝혀낸다. 예를 들어, , Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen 및 Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A를 참조한다. 항원과 복합체를 형성한 항체의 X-선 결정학 분석을 사용해 항체가 상호작용하는 폴리펩티드 내 아미노산을 식별할 수도 있다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어, 본원의 표 1에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 동일한 에피토프에 결합하는 항-LEPR 항체를 추가로 포함한다. 마찬가지로, 본 발명은 또한 LEPR에 결합하기 위해 본원에 기술된 특정 예시적인 항체 중 어느 하나(예를 들어, 본원의 표 1에 제시된 것과 같은 아미노산 서열 중 어느 하나를 포함하는 항체)와 경쟁하는 항-LEPR 항체를 포함한다.

당업자는, 당업계에 알려져 있고 본원에 예시된 일상적인 방법을 사용해 항체가 기준 항-LEPR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지, 또는 결합을 위해 기준 항-LEPR 항체와 경쟁하는지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들어, 시험 항체가 본 발명의 기준 항-LEPR 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 기준 항체를 LEPR 단백질에 결합시킬 수 있다. 이어서, LEPR 분자에 결합하는 시험 항체의 능력을 평가한다. 기준 항-LEPR 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 LEPR에 결합할 수 있다면, 시험 항체가 기준 항-LEPR 항체와 다른 에피토프에 결합하는 것으로 결론을 내릴 수 있다. 반면, 기준 항-LEPR 항체와의 포화 결합 후에 시험 항체가 LEPR에 결합할 수 없다면, 시험 항체는 본 발명의 기준 항-LEPR 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 그런 다음, 추가의 일상적인 실험(예를 들어, 펩티드 돌연변이 및 결합 분석)을 수행하여, 시험 항체의 관찰된 결합 결여가 실제로 기준 항체와 동일한 에피토프에 대한 결합으로 인한 것인지, 또는 입체적 차단(또는 다른 현상)이 관찰된 결합 결여의 원인인지 여부를 확인할 수 있다. 이러한 정렬 실험은 ELISA, RIA, Biacore, 유세포 계측법 또는 당업계에서 이용할 수 있는 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 분석법을 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에 따르면, 경쟁 결합 검정에서 측정했을 때, 예를 들어 하나의 1, 5, 10, 20 또는 100배 초과 항체가 다른 하나의 결합을 적어도 50%, 바람직하게는 75%, 90% 또는 심지어 99%만큼 억제하는 경우, 2개의 항체는 동일한 (또는 중첩하는) 에피토프에 결합한다(예를 들어, Junghans 등의 Cancer Res. 1990:50:1495-1502] 참조). 대안적으로, 항원에서 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 하나의 항체의 결합을 감소시키거나 제거하는 아미노산 돌연변이의 서브세트만이 다른 하나의 결합을 감소시키거나 제거하는 경우, 2개의 항체는 "중첩하는 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.

항체가 결합을 위해 기준 항-LEPR 항체와 경쟁하는지 (또는 결합을 위해 교차 경쟁하는지) 여부를 결정하기 위해, 전술한 결합 방법론은 2개의 방향으로 수행된다: 제1 방향에서, 포화 조건 하에서 기준 항체를 LEPR 단백질에 결합시키고, 이어서 LEPR 분자에 대한 시험 항체의 결합을 평가한다. 제2 방향에서, 포화 조건 하에서 시험 항체를 LEPR 분자에 결합시키고, 이어서 LEPR 분자에 대한 기준 항체의 결합을 평가한다. 만약, 2가지 방향 모두에서, 제1 (포화) 항체만이 LEPR 분자에 결합할 수 있다면, 시험 항체 및 기준 항체가 LEPR에 결합하기 위해 경쟁하는 것으로 결론을 내린다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 결합을 위해 기준 항체와 경쟁하는 항체는 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합할 필요는 없지만, 중첩 또는 인접한 에피토프에 결합함으로써 기준 항체의 결합을 입체적으로 차단할 수 있다.

인간 항체의 제조

본 발명의 항-LEPR 항체는 완전한 인간 항체일 수 있다. 완전한 인간 단클론 항체를 포함하여 단클론 항체를 생성하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 임의의 공지된 방법을 본 발명의 맥락에서 사용하여, 인간 LEPR에 특이적으로 결합하는 인간 항체를 제조할 수 있다.

예를 들어, 완전한 인간 단클론 항체를 생성하기 위한 VELOCIMMUNE?? 기술 또는 임의의 다른 알려진 유사한 방법을 사용해 LEPR에 대한 고 친화도 키메라 항체(인간 가변 영역과 마우스 불변 영역을 가짐)를 먼저 단리한다. 하기 실험 섹션에서와 같이, 친화도, 리간드 차단 활성, 선택도, 에피토프 등을 포함하는 바람직한 특성에 대해 항체의 특성을 분석하고 이에 대해 항체를 선택한다. 필요에 따라, 마우스 불변 영역을 원하는 인간 불변 영역(예를 들어 야생형 또는 변형된 IgG1 또는 IgG4)와 치환하여 완전한 인간 항-LEPR 항체를 생성한다. 선택된 불변 영역은 특이적 용도에 따라 매우 다양할 수 있지만, 고친화도 항원 결합 특성 및 표적 특이성 특성은 가변 영역에 존재한다. 특정한 경우에, 완전한 인간 항-LEPR 항체는 항원-양성 B 세포로부터 직접 단리된다.

생물학적 등가물

본 발명의 항-LEPR 항체 및 항체 단편은 기술된 항체의 아미노산 서열과는 다르지만 인간 LEPR에 결합하는 능력을 보유하는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함한다. 이러한 변이체 항체 및 항체 단편은 부모 서열과 비교했을 때 아미노산의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만, 기술된 항체와 본질적으로 동등한 생물학적 활성을 나타낸다. 마찬가지로, 본 발명의 항-LEPR 항체-암호화 DNA 서열은 개시된 서열과 비교했을 때, 뉴클레오티드의 하나 이상의 추가, 결실 또는 치환을 포함하지만 본 발명의 항-LEPR 항체 또는 항체 단편과 본질적으로 생물학적으로 동등한 항-LEPR 항체 또는 항체 단편을 암호화하는 서열을 포함한다. 이러한 변이체 아미노산 및 DNA 서열의 예는 위에서 논의된다.

2개의 항원 결합 단백질 또는 항체가, 예를 들어, 유사한 실험 조건 하에 동일한 몰 투여량(1회 투여량 또는 다회 투여량)으로 투여되었을 때, 흡수 속도 및 정도에 있어서 유의한 차이를 보이지 않는 약학적 등가물 또는 약학적 대안인 경우, 이들은 생물학적으로 동등한 것으로 간주된다. 일부 항체가 흡수 정도에 있어서는 동등하지만 흡수 속도가 다른 경우, 이들은 등가물 또는 약학적 대안으로서 간주될 것이고, 여전히 생물학적으로 동등한 것으로 간주될 수 있는데, 그 이유는, 흡수 속도에 있어서의 이러한 차이는 의도적이고 표지에 반영되어 있으며, 예를 들어, 만성적으로 사용될 때 효과적인 신체 약물 농도를 달성하는 데 반드시 필요하지 않으며, 특정한 연구 의약품에 대해 의학적으로 유의하지 않은 것으로 간주되기 때문이다.

일 구현예에서, 2개의 항원 결합 단백질이 안전성, 순도 및 효능에 있어서 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.

일 구현예에서, 환자가 기준 생성물을 사용하는 치료와 생물학적 생성물을 사용하는 치료 사이에서 1회 이상 전환할 수 있고, 이러한 전환이 없는 연속 요법과 비교했을 때 면역원성에 있어서의 임상적으로 유의한 변화를 포함하여 예상되는 이상 반응의 위험 증가 또는 효과의 감소가 없는 경우, 2개의 항원 결합 단백질은 생물학적으로 동등하다.

일 구현예에서, 2개의 항원 결합 단백질 둘 다가 사용 조건(들)에 대한 공통의 메커니즘 또는 공통의 작용 메커니즘(들)에 의해 이러한 메커니즘이 알려진 정도까지 작용하는 경우, 이들은 생물학적으로 동등하다.

생물학적 동등성은 생체 내 방법 및 시험관 내 방법에 의해 입증될 수 있다. 생물학적 동등성 측정에는, 예를 들어: (a) 항체의 농도 또는 이의 대사가 혈액, 혈장, 혈청, 또는 기타 생물학적 유체에서 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; (b) 인간의 생체 내 생체이용율 데이터와 연관되었거나 이를 합리적으로 예측할 수 있게 하는 시험관 내 시험; (c) 항체(또는 이의 표적)의 적절한 급성 약리학적 효과가 시간의 함수로서 측정되는, 인간 또는 다른 포유동물의 생체 내 시험; 및 (d) 항체의 안전성, 효능, 또는 생체이용률이나 생물학적 동등성을 확립하는 잘 조절된 임상 시험이 있다.

본 발명의 항-LEPR 항체의 생물학적으로 동등한 변이체는, 예를 들어, 잔기 또는 서열의 다양한 치환을 만들거나 생물학적 활성에 필요하지 않은 말단 또는 내부 잔기 또는 서열을 결실함으로써 작제할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 활성에 필수적인 시스테인 잔기를 결실 시키거나 다른 아미노산과 치환하여, 변성 시에 불필요하거나 부정확한 분자내 이황화 브리지가 형성되는 것을 방지할 수 있다. 다른 맥락에서, 생물학적으로 등등한 항체는 항체의 당화 특성을 바꾸는 아미노산 변화, 예를 들어, 당화를 제거하거나 없애는 돌연변이를 포함하는 항-LEPR 항체 변이체를 포함할 수 있다.

종 선택도 및 종 교차 반응성

특정 구현예에 따르면, 본 발명은 인간 LEPR에 결합하지만 다른 종의 LEPR에는 결합하지 않는 항-LEPR 항체를 제공한다. 본 발명은 또한 인간 LEPR 및 하나 이상의 비인간 종의 LEPR에 결합하는 항-LEPR 항체를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항-LEPR 항체는 인간 LEPR에 결합할 수 있고, 경우에 따라 마우스, 랫트, 기니피그, 햄스터, 저빌 쥐, 돼지, 고양이, 개, 토끼, 염소, 양, 소, 말, 낙타, 시노몰구스, 마모셋, 붉은털 원숭이 또는 침팬지 LEPR 중 하나 이상에 결합할 수 있다. 본 발명의 특정 예시적 구현예에 따르면, 인간 LEPR 및 시노몰구스 원숭이(예를 들어, 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) LEPR에 특이적으로 결합하는 항-LEPR 항체가 제공된다. 본 발명의 다른 항-LEPR 항체는 인간 LEPR에 결합하지만, 시노몰구스 원숭이 LEPR에는 결합하지 않거나 약하게만 결합한다.

다중특이적 항체

본 발명의 항체는 단일특이적이거나 다중특이적(예: 이중특이적)일 수 있다. 다중특이적 항체는 하나의 표적 폴리펩티드의 상이한 에피토프에 특이적이거나 둘 이상의 표적 폴리펩티드에 특이적인 항원 결합 도메인을 함유할 수 있다. 예를 들어, Tutt 등의 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer 등의 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244를 참조한다. 본 발명의 항-LEPR 항체는 또 다른 기능성 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질에 연결되거나, 이들과 공동-발현될 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 이의 단편은 (예를 들어, 화학적 결합, 유전적 융합, 비공유 결합에 의하거나 그 외의 방법으로) 하나 이상의 다른 분자 엔티티, 예컨대 또 다른 항체 또는 항체 단편에 연결되어 제2 결합 특이성을 갖는 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 생산할 수 있다.

본 발명은 면역글로불린의 하나의 아암이 인간 LEPR에 결합하고 면역글로불린의 다른 하나의 아암은 제2 항원에 특이적인 이중특이적 항체를 포함한다. LEPR-결합 아암은 본원의 표 1에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 아미노산 서열 중 임의의 것을 포함할 수 있다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 항체 포맷은 제1 면역글로불린(Ig) C_H3 도메인 및 제2 Ig C_H3 도메인을 사용하는 것을 포함하며, 여기서 제1 및 제2 Ig C_H3 도메인은 적어도 하나의 아미노산만큼 서로 상이하며, 적어도 하나의 아미노산 차이는 아미노산 차이가 없는 이중특이적 항체와 비교했을 때 단백질 A에 대한 이중특이적 항체의 결합을 감소시킨다. 일 구현예에서, 제1 Ig C_H3 도메인은 단백질 A에 결합하고, 제2 Ig C_H3 도메인은 H95R 변형(IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R임)과 같이 단백질 A 결합을 감소시키거나 제거하는 돌연변이를 함유한다. 제2 C_H3은 Y96F 변형(IMGT 넘버링에 의함; EU 넘버링은 Y436F)을 추가로 포함할 수 있다. 제2 C_H3에서 발견할 수 있는 추가의 변형은 다음을 포함한다: IgG1 항체의 경우 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 항체의 경우 N44S, K52N 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 항체의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I(IMGT에 의함; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I). 전술한 이중특이적 항체 포맷에 대한 변형은 본 발명의 범위 내에서 고려된다.

본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 다른 예시적인 이중특이적 포맷으로는, 예를 들어, scFv-계열 또는 디아바디 이중 특이적 포맷, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 콰드로마, 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예컨대 놉-인투-홀을 가지는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중으로 작용하는 Fab (DAF)-IgG 및 Mab₂ 이중 특이적 포맷을 포함하되 이들로 한정되지는 않는다(전술한 포맷을 검토를 위해, 예를 들어 Klein 등의 문헌[2012, mAbs 4:6, 1-11] 및 동 문헌에 인용된 참고문헌을 참조한다). 이중특이적 항체는 펩티드/핵산 접합을 사용해 작제될 수도 있는데, 예를 들어, 여기서 직교 화학 반응성을 갖는 비천연 아미노산은 부위특이적 항체-올리고뉴클레오티드 접합체를 생성하는 데 사용되고, 이는 정의된 조성, 원자가 및 기하학적 구조를 갖는 다량체 복합체로 자기 조립된다. (예를 들어, Kazane 등의 J. Am. Chem. Soc. [Epub: Dec. 4, 2012] 참조).

치료 제형 및 투여

본 발명은 본 발명의 항-LEPR 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적절한 담체, 부형제 및 수송, 전달, 내성 등을 개선하는 기타 제제와 함께 제형화된다. 다수의 적절한 제형은 모든 약사들에게 예전에 공지된 다음 문헌에서 확인할 수 있다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. 이러한 제형은, 예를 들어, 분말, 고약(paste), 연고, 젤리, 왁스, 오일, 지질, 지질(양이온성 또는 음이온성) 함유 소포체(예: LIPOFECTIN??, Life Technologies, Carlsbad, CA), DNA 접합체, 무수 흡수 연고제, 수중유 및 유중수 유화제, 카보왁스 유화제(다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜), 반고형성 겔, 및 카보왁스를 함유하는 반고형성 혼합물을 포함한다. Powell 등의 문헌 [""Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311]도 참조함.

환자에게 투여되는 항체의 투여량은 환자의 연령 및 크기, 표적 질환, 병태, 투여 경로 등에 따라 달라질 수 있다. 바람직한 투여량은 일반적으로 체중 또는 신체 표면적에 따라 계산된다. 성인 환자의 경우, 일반적으로 본 발명의 항체를 체중 1 kg 당 약 0.01 내지 약 20 mg, 더 바람직하게는 체중 1 kg 당 약 0.02 내지 약 7 mg, 약 0.03 내지 약 5 mg 또는 약 0.05 내지 약 3 mg의 1회 투여량으로 정맥 내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 병태의 중증도에 따라, 치료의 빈도와 기간을 조정할 수 있다. 항-LEPR 항체를 투여하기 위한 효과적인 투여량과 일정은 경험적으로 결정될 수 있으며; 예를 들어, 환자의 진행 상황에 대한 주기적 평가에 의해 모니터링하고 이에 따라 투여량을 조정할 수 있다. 또한, 투여량의 종간 스케일링은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수행될 수 있다(예를 들어, Mordenti 등의 1991, Pharmaceut. Res. 8:1351 참조).

소아 환자와 같은 환자의 경우, 항체를 체중 1 kg 당 약 5 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 20 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 15 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 10 mg의 치료적 유효 투여량으로, 예를 들어, 정맥 내 투여하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 약 5 mg/kg의 정맥내(IV) 부하 투여량이 100 mg/L 이상의 항체 혈청 농도를 달성하도록 선택될 수 있다. 추가로, 항체를 약 250 mg의 투여량으로, 또는 약 300 mg의 투여량으로, 또는 약 100 mg 내지 약 500 mg의 투여량으로, 또는 약 200 mg 내지 약 300 mg의 투여량으로 피하 투여하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 유지 투여량으로 250 mg의 H4H17319P2 또는 300 mg의 H4H17319P2를 매주 피하(SC) 투여하면 100 mg/L 이상의 혈청 중 저점 농도가 유지된다. 일부 양태에서, SC 투여 요법은 목표 혈청 중 저점 농도를 최선으로 유지하기 위해 IV 부하 투여량의 투여로부터 수 일 후에 시작된다. 일부 양태에서, 제1 SC 투여량은 부하 투여량의 투여로부터 2 내지 7일 후에, 예를 들어, 부하 투여량의 투여로부터 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 후에 투여된다. 일부 양태에서, SC 투여량은 3 내지 14일마다 1회, 예를 들어 3일마다 1회, 4일마다 1회, 5일마다 1회, 6일마다 1회, 매주 1회, 10일마다 1회, 2주마다 1회, 예를 들어, 제1 SC 투여 후 3주 동안 매주 1회 SC 투여에 이어서, 매월 (약 28일마다) 1회 투여된다. 본 발명의 일 구현예에서, 항체(예: H4H17319P2)의 치료적 유효 투여량은 본원의 도 19에 제시된 바와 같지만, 본원에 보이는 마지막 월별 투여 이후에도 임의로 계속된다.

일부 양태에서, 혈청 내 저점 농도는 약 50 mg/L 내지 약 200 mg/L, 또는 약 100 mg/L, 또는 약 150 mg/L, 또는 50 mg/L 이상, 또는 100 mg/L 이상, 또는 150 mg/L 이상으로 유지하는 것이 바람직하다.

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 본원의 약학적 조성물, 예를 들어, 캡슐화된 리포좀, 극미립자, 마이크로캡슐, 돌연변이체 바이러스를 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개 엔도시토시스를 투여하는 데 사용될 수 있다(예를 들어, Wu 등의 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조). 도입 방법은 피내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외 및 구강 경로를 포함하되 이들로 제한되지는 않는다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부의 내벽(예컨대, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성이거나 국소적일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 피하로 또는 정맥 내로 전달될 수 있다. 또한, 피하 전달의 경우, 펜 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물을 전달하는 데 용이하게 적용된다. 이러한 펜 전달 장치는 재사용식이거나 일회용일 수 있다. 재사용식 펜 전달 장치에는 일반적으로 약학적 조성물이 담긴 교체식 카트리지가 사용된다. 일단 카트리지 내의 모든 약학적 조성물이 투여되어 카트리지가 비면, 빈 카트리지를 쉽게 폐기하고 약학적 조성물이 담긴 새로운 카트리지로 교체할 수 있다. 그러면, 펜 전달 장치를 재사용할 수 있다. 일회용 펜 전달 장치에는 교체식 카트리지가 없다. 오히려, 일회용 펜 전달 장치는 약학적 조성물이 장치 내의 저장조에 미리 담긴 상태로 제공된다. 일단 저장조의 약학적 조성물이 비게 되면, 전체 장치가 폐기된다.

다수의 재사용식 펜 전달 장치 및 자가주입 전달 장치가 본 발명의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용된다. 몇 가지를 거명하자면, AUTOPEN??(Owen Mumford, Inc., 영국 우드스톡 소재), DISETRONIC?? 펜(Disetronic Medical Systems, 스위스 버그도르프 소재), HUMALOG MIX 75/25?? 펜, HUMALOG?? 펜, HUMALIN 70/30?? 펜(Eli Lilly and Co., 인디애나주 인디애나폴리스 소재), NOVOPEN?? I, II 및 III(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), NOVOPEN JUNIOR??(Novo Nordisk, 덴마크 코펜하겐 소재), BD?? 펜(Becton Dickinson, 뉴저지주 프랭클린 레이크 소재), OPTIPEN??, OPTIPEN PRO??, OPTIPEN STARLET??, 및 OPTICLIK??(Sanofi-Aventis, 독일 프랑크푸르트 소재)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다. 본 발명의 약학적 조성물을 피하 전달하는 데 적용되는 일회용 펜 전달 장치의 몇 가지만 거명하자면, SOLOSTAR?? 펜(Sanofi-Aventis), FLEXPEN??(Novo Nordisk), 및 KWIKPEN??(Eli Lilly), SURECLICK?? Autoinjector(Amgen, 캘리포니아주 싸우전 오크스 소재), PENLET??(Haselmeier, 독일 슈투트가르트 소재), EPIPEN(Dey, L.P.) 및 HUMIRA?? 펜(Abbott Labs, 일리노이주 애벗 파크)이 포함되지만, 이들로 한정되지는 않는다.

특정 상황에서는, 약학적 조성물이 방출 조절 시스템으로 전달될 수 있다. 일 구현예에서, 펌프가 사용될 수 있다(Langer의 전술한 문헌; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 참조). 또 다른 구현예에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다(Medical Applications of Controlled Release, Langer 및 Wise (eds.), 1974, CRC Pres., Boca Raton, Florida 참조). 또 다른 구현예에서, 방출 조절 시스템은 조성물의 표적에 근접하여 배치될 수 있으며, 따라서 전신 투약량의 단지 일부만을 필요로 한다(예를 들어, Goodson의 전술한 1984, Medical Applications of Controlled Release, vol. 2, pp. 115-138 참조) 다른 조절 방출 시스템은 Lange의 1990, Science 249:1527-1533에서 검토된 내용에 논의되어 있다.

주사식 제제는 정맥 내, 피하, 피 내 및 근육 내 주사, 적가 주입 등을 위한 투약량 형태를 포함할 수 있다. 이들 주사식 제제는 공지의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 주사식 제제는, 예를 들어, 주사용으로 종래에 사용되는 멸균 수성 매질 또는 유성 매질에 전술한 항체 또는 이의 염을 용해, 현탁 또는 유화시킴으로써 제조될 수 있다. 주사용 수성 매질로서는, 예를 들어, 생리 식염수, 알코올(예: 에탄올)과 같은 적절한 가용화제와 조합하여 사용할 수 있고 글루코오스 및 기타 보조제 등을 함유하는 등장성 용액, 다가알코올(예: 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면활성제[예: 폴리소르베이트 80, HCO-50(수소 첨가 피마자유의 폴리옥시에틸렌 (50 몰) 부가물)] 등이 있다. 유성 매질로서는, 예를 들어, 벤질 벤조에이트, 벤질 알코올 등과 같은 가용화제와 조합하여 사용할 수 있는 참기름, 대두유 등이 사용된다. 따라서, 제조된 주사제는 바람직하게는 적절한 앰플에 채워진다.

유리하게는, 전술한 경구 또는 비경구적으로 사용하기 위한 약학적 조성물은 활성 성분의 투여량에 적절히 맞춰진 단위 투여량의 투여 형태로 제조된다. 이러한 투약량 형태는, 예를 들어, 정제, 알약, 캡슐, 주사제(앰플), 좌제 등을 포함한다. 전술한 항체의 함유량은 일반적으로 단위 투여량의 투여 형태 당 약 5 내지 약 500 mg이고; 특히 주사제 형태로는, 전술한 항체가 약 5 내지 약 100 mg으로 함유되고, 다른 투여 형태에 대해서는 약 10 내지 약 250 mg으로 함유되는 것이 바람직하다.

항체의 치료적 용도

본 발명은 항-LEPR 항체(예를 들어, 본원의 표 1에 제시된 것과 같은 HCVR/LCVR 또는 CDR 서열 중 임의의 것을 포함하는 항-LEPR 항체)를 포함하는 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다. 치료 조성물은 본원에 개시된 항-LEPR 항체 중 어느 하나 또는 이의 항원 결합 단편, 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 대사 기능 장애 또는 저렙틴증과 관련되었거나 이에 의해 매개된 임의의 질환 또는 장애, 예를 들어, 비알코올성 지방 간 질환, NASH, 여성의 불임, 무월경, 비정상적인 호르몬 주기, 면역 기능 손상, 갑상선 기능저하증, 비만증, 단성 비만증, I형 당뇨병, II형 당뇨병, 지방이영양증, 선천성 지방이영양증, 전신성 지방이영양증, 후천성 지방이영양증, 부분 지방이영양증, 선천성 부분 지방이영양증, 선천성 전신성 지방이영양증, 후천성 부분 지방이영양증, 및 후천성 전신성 지방이영양증, 또는 LEPR 신호 전달을 자극하거나 시험관 내에서 또는 생체 내에서 렙틴의 자연 활성을 모방함으로써 달리 치료 가능한 것들을 치료, 예방 및/또는 완화시키는 데 특히 유용하다. 예를 들어, 항체 및 이의 항원 결합 단편은 지방이영양증 병태를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 항체 및 항원 결합 단편에 의해 치료 가능한 예시적인 지방이영양증 병태는, 예를 들어 선천성 전신성 지방이영양증, 선천성 부분 지방이영양증, 후천성 전신성 지방이영양증, 가족력 부분 지방이영양증, 후천성 부분 지방이영양증, 원심 복부 지방이영양증, 윤상 지방위축증(lipoatrophia annularis), 국소적 지방이영양증(localized lipodystrophy) 및 HIV 관련 지방이영양증, 및 이러한 병태와 관련된 증상을 포함한다.

본원에 제공된 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편은 단성 비만증(monogenic obesity) 및/또는 지방이영양증의 치료, 예방 및/또는 완화에 유용하다. 단성 비만증 및 지방이영양증은, 예를 들어, 다음을 포함하는 많은 병상(pathologies)과 관련이 있을 수 있다: 연령 및 성별에 맞는 제85 백분위 수를 초과하는 BMI를 갖는 대상체에서의 극단적 조기 발생 비만증; 음식 추구 거동 및 음식 공격성 거동을 나타내는 대상체에서의 이상 식욕 항진증 및 포만감 손상; CD4+ T 세포수의 감소와 재발성 (및 가능하게는 치명적) 감염증을 동반하는 면역 기능 손상; 인슐린 저항성과 고인슐린혈증; 비알코올성 지방간 질환, 간 지방증, 및 지방이영양증으로의 진행; 고중성지질혈증으로 이어지는 이상지질혈증; HbA1c 및/또는 혈당 수준 상승 및 내당능 손상을 동반하는 당뇨병; 생식 기능 장애 내지 생식 기능 저하증, 사춘기의 발달 지체; 2차 성징의 발현 감소, 무월경 또는 월경 불순, 및 불임; 저신장증을 초래하는 사춘기의 성장 분출 결여, 비정상적 성장 호르몬 분비; 갑상선 기능 저하증 또는 갑상선 기능 손상, T3 또는 TSH 또는 유리 티록신 수준의 변화; 및 골 밀도 및 골 무기질량을 포함하는 다양한 골 변화. 단성 비만증 및/또는 지방이영양증과 관련된 병태와 증상의 스펙트럼은 기저 원인이 되는 유전적 요인, 예를 들어 AGPAT2, LMNA, BSCL2 또는 다른 것들에 따라 상이할 수 있다. 주어진 돌연변이는 월경 불순 내지 완전한 무월경과 같은 내분비 중증도를 변화시키는 렙틴 또는 LEPR의 기능 상실을 초래할 수 있다.

본원에 제공된 항체 및 항원 결합 단편은 대사 기능 장애 또는 저렙틴증과 관련된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료, 완화, 또는 예방하는 데에도 유용하다. 이러한 증상에는 고지방증, 비만증, 이상 식욕 항진증, 고혈당증, 고중성지방 혈증, 고콜레스테롤혈증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 성장 지체, 사춘기 성장 분출의 지체, 비정상적 성장 호르몬 분비, HbA1c의 상승, 저 골 무기질 밀도(또는 저 골 중량), 저 골 무기질량, 및 저 제지방량이 포함된다.

본 발명은 하나 이상의 LEPR 돌연변이를 발현하는 세포, 조직 및 기관에 대한 렙틴 신호 전달을 회복하는 데 유용한 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 이러한 돌연변이는 대사 기능 장애 또는 저렙틴증, 및 대상 기능 장애 또는 저렙틴증에 기인하는 질환 또는 병태, 예를 들어, 비만증, 선천성 지방이영양증, 불임, 및 비알코올성 지방간 질환과 관련이 있을 수 있다. 예를 들어, 렙틴의 존재 시 신호 전달을 나타내지 않거나 신호 전달을 감소시키며, 비만증 및 이와 연관된 장애와 관련이 있는 특정 LEPR 돌연변이체가 식별되었다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 렙틴의 존재 시 신호전달을 나타내지 않는 LEPR 돌연변이체는 "신호전달-결함 LEPR 돌연변이체"로서 지칭된다. 예시적인 신호전달-결함 LEPR 돌연변이체는 LEPR-A409E이다(Farooqi 등의 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247 참조). 본원에서 사용되는 바와 같이, 렙틴의 존재 시 (야생형 LEPR에 비해) 신호전달을 감소시키는 LEPR 돌연변이체는 "신호전달-손상 LEPR 돌연변이체"로서 지칭된다. 예시적인 신호전달-손상 LEPR 돌연변이체는 LEPR-P316T이다(Mazen 등의 2011, Mol Genet Metab 102:461-464 참조). 따라서, 본 발명은 하나 이상의 신호전달-결함(예: A409E) 및/또는 신호전달-손상(예: P316T) LEPR 돌연변이체에 의해 초래되거나 이와 관련이 있는 질환 또는 장애를 치료, 예방 및/또는 완화시키는 데 유용한 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편을 포함한다.

본 발명은 렙틴 유전자에서 돌연변이를 경감시킴으로써 렙틴 신호전달을 회복하는 데 유용한 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 일부 대상체는 순환하는 렙틴을 갖지만, 단백질은 생리 비활성 형태의 렙틴을 암호화하는 유전적 돌연변이(예를 들어, 렙틴 유전자에서의 p.N103K 돌연변이)로 인해 비 기능적이다. 일부 대상체는 순환하는 렙틴을 갖지 않거나 거의 갖지 않는다. LMNA, PPARG, AGPAT2, BSCL2, PLIN1, AKT2, CIDEC, LIPE, 및 ADRA2A를 포함하는 다른 유전자는 렙틴 신호전달 손상에 관여할 수 있고, 본원에 제공된 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편은 이러한 돌연변이가 렙틴 신호전달에 미치는 영향을 완화하는데 유용하다.

본 발명의 항-LEPR 항체 및 이의 항원 결합 단편은 비만증, 단성 비만증, 대사 증후군, 식단-유도 음식 갈망(diet-induced food craving), 기능적 시상하부성 무월경, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 여성 불임, 무월경, 면역 기능 손상, 갑상선 기능 저하증, 인슐린 저항성, 심각한 인슐린 저항성(인슐린 수용체에서의 돌연변이로 인한 심각한 인슐린 저항성; 인슐린 수용체에서의 돌연변이에 의해 야기되지 않는 심각한 인슐린 저항성; 하류 신호전달 경로에서의 돌연변이에 의해 야기되거나, 다른 원인에 의해 유도된 심각한 인슐린 저항성을 포함함), 비알코올성 및 알코올성 지방간 질환, 비알코올성 지방간염(NASH), 알츠하이머병, 렙틴 결핍증, 렙틴 저항성, 지방이영양증, 레프리코니즘/도노휴 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 병태, 질환 또는 장애의 치료 또는 예방에도 유용하다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 대사 기능장애를 치료하는 데 유용하다. 상기 방법은 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 지방 과다증 또는 비만증을 치료하거나, 체중을 줄이는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 치료는 치료된 대상체에서 체지방량을 감소시키지만 제지방량을 감소시키지는 않는다. 일부 양태에서, 치료는 피험자가 더 적은 칼로리를 섭취하게 하거나 음식 섭취를 줄이게 한다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 여성 불임을 치료하거나 렙틴 결핍증과 관련된 정상 호르몬 주기를 회복하는데 유용하다. 일부 양태에서, 치료는 생식 능력을 증가시키고/시키거나 임신 기회를 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 치료는 정상적인 월경 주기를 회복할 수 있다. 적어도 부분적으로 렙틴 결핍증으로 인해 손상된 정상적인 월경 주기를 회복하는 방법도 본 발명의 일부이다.

본원에서 입증된 바와 같이, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체가 저렙틴증 또는 렙틴 결핍 환자이거나, 저렙틴증 또는 렙틴 결핍증 환자가 아닌 경우에 유용하다. 상기 방법은, 대사 기능 장애, 지방 과다증 또는 비만증이 신호전달 결함 또는 신호전달-손상 LEPR 돌연변이와 관련이 있거나 관련이 없는 경우 또는 이에 의해 초래되거나 초래되지 않는 경우에 유용하다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 저렙틴증, 지방이영양증 또는 렙틴 결핍 환자에서 비알코올성 지방 간 질환 또는 비알코올성 지방간염(NASH)을 치료하는 데 유용하다. 치료는 대상체에서 비알코올성 지방간 질환, 예컨대 간 지방증의 증상을 감소시킬 수 있다. 일부 경우에, 치료를 받은 후, 대상체에서 알라닌 아미노전달효소(ALT) 및/또는 아스파르테이트 아미노전달효소(AST)의 혈장 수준이 감소한다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 시상하부 STAT3 신호전달을 자극함으로써 이상 식욕 항진증, 고혈당증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 비알코올성 지방간염(NASH) 또는 비알코올성 지방 간 질환을 치료하는 데 유용하다. 치료는 순환하는 혈장 중성지방 및/또는 순환하는 혈장 총 콜레스테롤을 낮출 수 있다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 지방이영양증을 치료하는 데 유용하다. 치료는 치료를 받는 대상체에서 고혈당증을 완화시키고, 인슐린 저항을 감소시키고/시키거나, HbA1c 수준을 낮춘다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 대사 질환 또는 저렙틴증과 관련된 불임 및/또는 무월경을 치료하는 데 유용하다. 치료는 호르몬 주기를 조절하고, 치료를 받는 여성 대상체에서 임신율을 개선할 수 있다. 치료는 정상적인 월경 주기를 회복할 수 있다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 저렙틴증 및/또는 렙틴 결핍증과 관련된 CD4+ T-세포 수 감소와 같은 면역 기능 손상을 치료하는 데 유용하다. 치료는 면역 기능을 개선할 수 있고, 예를 들어, CD4+ T 세포 수를 증가시킬 수 있다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 선천성 렙틴 결핍증과 관련된 성장 지체, 사춘기 성장 분출의 결여 및/또는 비정상적인 성장 호르몬 분비를 치료하는 데 유용하다. 치료는 성장을 개선할 수 있고, 사춘기 성장 분출을 촉진할 수 있고/있거나 성장 호르몬 분비를 개선할 수 있다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 선천성 렙틴 결핍증과 관련된 갑상선 기능저하증을 치료하는 데 유용하다. 치료는 갑상선 기능저하증과 관련된 증상을 개선할 수 있다.

본원에 제공된 LEPR 작용제 항체는 저렙틴증 및/또는 렙틴 결핍증과 관련된 저 골 무기질 밀도 및/또는 골 무기질량을 치료하는 데 유용하다. 치료는 골 무기질 밀도를 개선할 수 있고/있거나 골 무기질량을 개선할 수 있다.

본원에 기술된 치료 방법의 맥락에서, 항-LEPR 항체는 단일 요법(즉, 유일한 치료제)으로서 투여되거나 하나 이상의 추가적인 치료제(이의 예는 본원의 다른 곳에서 기술됨)와 조합하여 투여될 수 있다.

병용 요법 및 제형

본 발명은 본원에 기술된 항-LEPR 항체 중 어느 하나를 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분과 조합으로 포함하는 조성물 및 치료 제형, 및 이러한 조합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법을 포함한다.

본 발명의 항-LEPR 항체는 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분(들), 예를 들어, 비만증, 고콜레스테롤혈증, 고지혈증, 2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 식욕 조절, 무월경, 불임 등을 치료하기 위해 처방된 조제 약품과 함께 공동으로 제형화되고/되거나 이들과 조합으로 투여될 수 있다. 이러한 추가적인 치료적 활성 성분의 예는, 예를 들어, 재조합 인간 렙틴 (예: 메트렐렙틴 [MYALEPT]), PCSK9 억제제 (예: 항-PCSK9 항체 [알리로쿠맙, 에볼로쿠맙, 보코시주맙, 로델시주맙, 랄판시주맙 등]), 스타틴 (아토르바스타틴, 로수바스타틴, 세리바스타틴, 피타바스타틴, 플루바스타틴, 심바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 등), 에제티미브, 인슐린, 인슐린 변이체, 인슐린 분비 촉진제, 메트포르민, 설포닐우레아, 소듐 글루코스 공수송체 2 (SGLT2) 억제제 (예: 다파글리플로진, 카나글리플로진, 엠파글리플로진 등), GLP-1 작용제/유사체 (예: 엑센딘-4, 엑세나티드, 리라글루티드, 릭시세나티드, 알비글루티드, 둘라글루티드 등), 글루카곤 (GCG) 억제제 (예: 항-GCG 항체), 글루카곤 수용체 (GCGR) 억제제 (예: 항-GCGR 항체, 소분자 GCGR 길항제, GCGR-특이적 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항-GCGR 앱타머[예: 스피에겔머(Spiegelmers)] 등), 안지오포이에틴-유사 단백질 (ANGPTL) 억제제 (예: 항-ANGPTL3 항체, 항-ANGPTL4 항체, 항-ANGPTL8 항체, 등), 펜터민(Phentermine), 오를리스타트(Orlistat), 토피라메이트(Topiramate), 부프로피온(Bupropion), 토피라메이트/펜터민, 부프로피온/날트렉손(Naltrexone), 부프로피온/조니사미드(Zonisamide), 프람린타이드(Pramlintide)/메트렐렙틴, 로르카세린(Lorcaserin), 세틸리스타트(Cetilistat), 테소펜신(Tesofensine), 벨네페리트(Velneperit) 등을 포함한다. 추가적인 예는, 예를 들어, 어유(fish oil), 피오글리타존(pioglitazone), 세트멜라노티드(setmelanotide), 피브로이트(예: 페노피브레이트(fenofibrate)), 프레드니손(prednisone), 니아신(niacin), 항경련제(anticonvulsants), 디곡신(digoxin), 쿠마딘(Coumadin), 비타민 D, 티록신(thyroxine), 갑상선 보충제(thyroid supplement), 비타민제, 코엔자임 큐텐(Coenzyme Q10), 항변비약(anti-constipation medication), 항알러지약(anti-allergic medications), 가바펜틴(gabapentin), 진통제(narcotic), 케타민(ketamine), 리도카인(lidocaine), 및 벤라팍신 하이드로클라이드(venlafaxine hydrochloride)를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 항-LEPR 항체는 식욕감퇴제(anorectic agent)와 함께 제형화되거나 투여되지 않는다.

추가적인 치료적 활성 성분(들), 예를 들어, 위에 열거된 제제 중 어느 하나 또는 이의 변이체는 본 발명의 항-LEPR 항체의 투여 직전에, 동시에, 또는 직후에 투여될 수 있다; (본 개시의 목적을 위해, 이러한 투여 요법은 항-LEPR 항체가 추가적인 치료적 활성 성분과 "병용(in combination with)" 투여되는 것으로 간주된다). 본 발명은, 본 발명의 항-LEPR 항체가 본 발명의 다른 곳에 기술된 바와 같은 하나 이상의 추가적인 치료적 활성 성분(들)과 공동으로 제형화되는 약학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 본원에 기술된 항-LEPR 항체 중 어느 하나를 포함하는 조성물 및 치료 제형을 혈장 반출(plasmapheresis)과 같은 치료 절차와 조합하여 사용하는 방법을 포함한다.

투여 처방

본 발명의 특정 구현예에 따르면, 본 발명의 항-LEPR 항체(또는 항-LEPR 항체와 본원에서 언급된 임의의 추가적인 치료적 활성제의 조합을 포함하는 약학적 조성물)의 다회 투여량이 정의된 시간 과정에 걸쳐 대상체에게 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 본 발명의 항-LEPR 항체의 다회 투여량을 순차적으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "순차적 투여"는 항-LEPR 항체의 각 투여량이 상이한 시점에, 예를 들어, 소정의 간격(예: 시간, 일, 주 또는 월)으로 분리된 상이한 날에 대상체에게 투여됨을 의미한다. 본 발명은 항-LEPR 항체의 1회 초기 투여량, 이어서 항-LEPR 항체의 하나 이상의 2차 투여량, 및 이어서 선택적으로 항-LEPR 항체의 1회 이상의 3차 투여량을 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 포함한다.

용어 "초기 투여량", "2차 투여량" 및 "3차 투여량"은 본 발명의 항-LEPR 항체의 시간적 투여 순서를 지칭한다. 따라서, "최초 투여량"은 치료 처방의 시작 시 투여되는 투여량("베이스라인 투여량", "로딩 투여량", "시작 투여량" 등으로도 언급됨); "2차 투여량"은 최초 투여 후 투여되는 투여량이고; "3차 투여량"은 2차 투여 후 투여되는 투여량이다. 초기, 2차 및 3차 투여량은 모두 동일한 양의 항-LEPR 항체를 함유할 수 있지만, 일반적으로 투여 빈도에서 서로 다를 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 초기, 2차 및/또는 3차 투여량에 함유된 항-LEPR 항체의 양은 치료 과정 동안 서로 다를 수 있다(예를 들어, 적절하게 상향 또는 하향 조절됨). 특정 구현예에서, 2가지 이상의(예: 2, 3, 4, 또는 5가지) 투여량이 치료 요법 시작 시 "로딩 투여량"으로서 투여되고, 적은 빈도수 기준으로 투여되는 후속 투여량(예: "유지 투여량")이 이어진다.

항체의 진단적 용도 및 분석적 용도

본 발명의 항-LEPR 항체는 샘플에서 LEPR 또는 LEPR 발현 세포를 검출하고/하거나 측정하기 위해, 예를 들어, 진단 목적으로 사용될 수도 있다. 예를 들어, 항-LEPR 항체 또는 이의 단편은 LEPR의 비정상 발현(예: 과발현, 발현 부족, 발현 결여 등)을 특징으로 하는 병태 또는 질환을 진단하는 데 사용될 수 있다. LEPR에 대한 예시적인 진단적 분석은, 예를 들어, 환자로부터 수득된 샘플을 항-LEPR 항체와 접촉시키는 단계를 포함하되, 항-LEPR 항체는 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자로 표지된다. 대안적으로, 표지되지 않은 항-LEPR 항체가 자체적으로 검출 가능하게 표지된 보조 항체와 조합되어 진단 용도에 사용될 수 있다. 검출 가능한 표지 또는 리포터 분자는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S 또는 ¹²⁵I와 같은 방사성 동위원소; 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 로다민과 같은 형광 모이어티 또는 화학발광 모이어티; 또는 알칼라인 포스파타아제, 베타-갈락토시다아제, 서양 고추냉이 퍼옥시다아제, 또는 루시페라아제와 같은 효소일 수 있다. 샘플에서 LEPR을 검출하거나 측정하는 데 사용할 수 있는 특정 예시적인 검정법은 효소 결합 면역흡착 분석(ELISA), 방사성 면역분석(RIA), 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 양전자 방출 단층촬영(PET)을 포함한다.

본 발명에 따른 LEPR 진단 검정에 사용될 수 있는 샘플에는 환자로부터 얻을 수 있는 임의의 조직 또는 체액 샘플이 포함되며, 이러한 샘플은 정상적인 또는 병리학적 조건 하에서 검출 가능한 양의 LEPR 단백질 또는 이의 단편을 함유한다. 일반적으로, 건강한 대상체(예: 비정상적인 LEPR 수준 또는 활성과 관련이 있는 질환 또는 병태로 고통받지 않는 환자)로부터 수득한 특정 샘플에서 LEPR의 수준을 측정하여 LEPR의 베이스라인 수준 또는 표준 수준을 먼저 확립하게 된다. 그런 다음, LEPR의 이러한 베이스라인 수준을 LEPR 관련 질환이나 병태를 갖는 것으로 의심되는 개체로부터 수득한 샘플에서 측정한 LEPR의 수준과 비교할 수 있다.

실시예

다음 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것으로, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차에 대해서는 설명되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부(parts)는 중량 부(parts by weight)이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.

실시예 1. 렙틴 수용체(LEPR)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질의 생성

LEPR의 세포외 도메인을 포함하는 면역원으로 VELOCIMMUNE^® 마우스(즉, 인간 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 가변 영역을 암호화하는 DNA를 포함하는 조작된 마우스)를 면역화하여 항-LEPR 항체를 수득하였다. 항체 면역 반응은 LEPR-특이적 면역 분석에 의해 모니터링하였다. 이전에 기술된 기술을 사용하여, 완전한 인간 항-LEPR 항체를 분리하고 정제하였다.

본 실시예의 방법에 따라 생성된 예시적인 항-LEPR 항체의 특정 생물학적 특성은 아래에 제시된 실시예에서 상세히 기술된다.

실시예 2. 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 및 핵산 서열

표 1은 본 발명의 선택된 항-LEPR 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 및 CDR의 아미노산 서열 식별자를 제시한다. 상응하는 핵산 서열 식별자들은 표 2에 제시되어 있다.

항체는 일반적으로 다음의 명명법에 따라 본원에서 지칭된다: Fc 접두어(예: "H4H", "H1M", "H2M" 등)에 수치 식별자(예: "16650", "16679" 등)이 이어지고, "P" 또는 "N" 접미어가 이어진다. 따라서, 이러한 명명법에 따르면, 항체는 본원에서, 예를 들어, "H4H16650P2", "H4H16679P2" 등으로 지칭될 수 있다. 본원에서 사용된 항체 명칭의 Fc 접두어(H4H, H1M 및 H2M)는 항체의 특정 Fc 영역 이소형을 나타낸다. 예를 들어, "H4H" 항체는 인간 IgG4 Fc를 갖는 반면 "H1M" 항체는 마우스 IgG1 Fc를 갖는다(모든 가변 영역은 항체 명칭이 'H'로 시작하는 것과 같이 완전한 인간이다). 당업자가 이해할 수 있듯이, 특정 Fc 이소형을 갖는 항체는 다른 Fc 이소형을 갖는 항체로 변환될 수 있지만(예를 들어, 마우스 IgG1 Fc를 갖는 항체는 인간 IgG4 등을 갖는 항체로 변환될 수 있지만), 어떤 경우에도, 표 1 및 표 2에 나타낸 수치 식별자에 의해 표시되는 가변 도메인(CDR 포함)은 동일하게 유지될 것이고, 결합 특성은 Fc 도메인의 성질에 상관없이 동일하거나 실질적으로 유사할 것으로 예상된다.

본원의 실시예에 사용된 것과 같은 "비교자 mAb"는 Fab9F8을 지칭하며, 이에 대해서는 Fazeli 등의(2006) J Immunol Methods 312:190-200 및Carpenter 등의(2012) Structure 20(3):487-97에 기술되어 있다.

국제 특허 출원 공개 WO2017/66204를 참조한다.

실시예 3: 표면 플라스몬 공명으로 유도한 인간 단클론 항-LEPR 항체의 결합 친화도 및 동역학 상수

정제된 항-LEPR 단클론 항체에 결합하는 LEPR에 대한 평형 해리 상수 (K_D)는 Biacore 4000 기기 상에서 실시간 표면 플라스몬 공명을 사용해 결정하였다. 모든 결합 연구는 25℃및 37℃에서 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, pH 7.4(HBS-ET) 가동 완충액(running buffer) 중에서 수행하였다. Biacore 센서 표면을 단클론 마우스 항-인간 Fc 항체(GE, # BR-1008-39)와의 아민 결합에 의해 먼저 유도체화하여 항-LEPR 단클론 항체를 포획하였다. 결합 연구는 다음의 LEPR 시약을 이용해 수행하였다: C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(hLEPR.mmh; 서열번호 114)로 발현된 인간 LEPR 세포외 도메인; C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(mfLEPR-mmh; 서열번호 117)로 발현된 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) LEPR 세포외 도메인; C-말단 마우스 IgG2a Fc 태그(hLEPR.mFc; 서열번호 115)로 발현된 인간 LEPR 세포외 도메인; C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(mLEPR.mmh; 서열번호 118)로 발현된 마우스 LEPR 세포외 도메인; 및 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(rLEPR.mmh; 서열번호 119)로 발현된 랫트 LEPR 세포 외 도메인. HBS-ET 가동 완충액(100 nM - 3.7 nM; 3배 연속 희석물) 중에서, 상이한 농도의 LEPR 시약을 우선 제조하여, 항-인간 Fc 포획된 항-LEPR 단클론 항체 표면에 4분 동안 30 μL/분의 유속으로 주입하는 한 편, LEPR 시약에 결합된 단클론 항체의 해리를 HBS-ET 가동 완충액 중에서 10분 동안 모니터링하였다. 동역학적 결합 속도 상수(k _a ) 및 해리 속도 상수(k _d )는 Scrubber 2.0c 곡선-피팅 소프트웨어를 사용해 실제 결합 센서그램을 질량 운반 제한이 있는 상태에서 1:1 결합 모델에 피팅하여 결정하였다. 결합 해리 평형 상수(K_D) 및 해리 반감기(t½)를 동적 속도 상수로부터 다음과 같이 계산하였다:

25℃와 37℃에서 본 발명의 상이한 항-LEPR 단클론 항체에 결합하는 hLEPR.mmh, mfLEPR.MMH, mfLEPR.MMH 또는 hLEPR.mFc에 대한 결합 동역학 파라미터는 표 3 내지 8에 표시되어 있다.

표 5에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, 항-LEPR 단클론 항체는 7.93 nM 내지 148 nM 범위의 K_D 값으로 hLEPR-MMH에 결합하였다. 표 4에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, 항-LEPR 단클론 항체는 14.8 nM 내지 326 nM 범위의 K_D 값으로 hLEPR-MMH에 결합하였다.

본 발명의 항-LEPR 단클론 항체 12개 중 10개가 mfLEPR.MMH에 결합하였다. 표 7에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, 항-LEPR 단클론 항체는 2.27 nM 내지 139 nM 범위의 K_D 값으로 mfLEPR.MMH에 결합하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, 항-LEPR 단클론 항체는 5.18 nM 내지 264 nM 범위의 K_D 값으로 mfLEPR.MMH에 결합하였다.

표 7에 나타낸 바와 같이, 25℃에서, 항-LEPR 단클론 항체는 613 pM 내지 5.7 nM 범위의 K_D 값으로 hLEPR-mFc에 결합하였다. 표 8에 나타낸 바와 같이, 37℃에서, 항-LEPR 단클론 항체는 1.16 pM 내지 12.8 nM 범위의 K_D 값으로 hLEPR-mFc에 결합하였다.

25℃또는 37℃에서, 본 발명의 항-LEPR 항체 중 mLEPR.MMH 또는 rLEPR.MMH에 결합된 것은 없었다(데이터 미도시).

실시예 4. 렙틴:LEPR 결합의 존재 시 본 발명의 항-LEPR 항체는 LEPR에 결합한다

LEPR에 대한 항-LEPR 항체의 결합을 인간 렙틴이 차단하는 것은 Biacore T200 기기를 상에서 표면 플라스몬 공명 바이오센서를 사용해 평가하였다. 전체 연구는 25℃에서 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20(HBS-ET 가동 완충액)에서 수행하였다. Biacore CM5 센서 표면을 표준 EDC/NHS 표면 화학을 사용해 아민 결합 인간 렙틴(R&D Systems, # 398-LP)에 의해 먼저 유도체화하였다. C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그(hLEPR-MMH; 서열번호 xx)로 발현된 20 nM의 인간 LEPR 세포외 도메인을 인간 렙틴이 고정된 Biacore 센서 표면 위에 10 μL/분 또는 25 μL/분의 유속으로 4분 동안 주입하여 약 200 RU의 결합 반응을 달성함으로써 LEPR과 인간 렙틴의 복합체를 형성하였다. hLEPR-MMH에 대한 항체 결합이 인간 렙틴에 의해 차단되는지 여부를 평가하기 위해, 미리 형성된 hLEPR-MMH:인간 렙틴 복합체에 200 nM의 항-LEPR 단클론 항체를 50 μL/분 또는 25 μL/분의 유속으로 4~5분 동안 주입하였다. hLEPR-MMH와 인간 렙틴의 복합체("렙틴")에 거의 비슷한 신호 강도로 결합한 본 발명의 모든 항-LEPR 항체 및 관찰된 결합(RU 단위)은 표 9에 보고되어 있다. 이 결과는 시험된 항-LEPR 항체에 대한 hLEPR-MMH의 결합을 인간 렙틴이 차단하지 않음을 나타낸다.

실시예 5. 인간 렙틴 수용체 차단 ELISA

ELISA를 위해, 인간 렙틴(hLeptin; R&D Systems, # 398-LP-01M)을 PBS 중 5 μg/mL의 농도로 96-웰 마이크로역가 플레이트 상에 4℃에서 밤새 코팅하였다. 이어서 PBS 중 0.5%(w/v) 용액을 사용해 비특이적 결합 부위들을 차단하였다. C-말단 인간 Fc 태그(hLEPR.hFc; 서열번호 116)로 발현된 LEPR 단백질의 10 nM의 세포외 도메인 부분의 일정량을 8.5 pM 내지 500 nM 범위로 연속 희석한 항-LEPR 항체, hLeptin 단백질, 또는 이소형 대조군 항체로 적정하였다. 그런 다음, 이들 항체-단백질 또는 단백질-단백질 복합체를 실온(RT)에서 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 복합체를 hLeptin으로 코팅된 마이크로역가 플레이트에 옮기고, RT에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 웰을 세척하고, 플레이트에 결합된 hLEPR.hFc를 서양 고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항-인간 IgG 다클론 항체(Jackson ImmunoResearch Inc, #109-035-098)로 검출하였다. TMB 용액(BD Biosciences, #555214; 제조자의 지침에 따라 기질 A와 B를 1:1 비율로 혼합함)을 사용해 샘플을 성장시켜 비색 반응을 생성한 다음, 1 M 황산으로 중화시킨 후, Victor X5 플레이트 판독기를 이용해 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

Prism?? 소프트웨어(GraphPad) 내의 S자형 투여량-반응 모델을 사용해 데이터 분석을 수행하였다. 시험된 항체의 최대 농도에서의 차단율율, 플레이트 상의 인간 렙틴에 대한 10 nM의 hLEPR.hFc의 결합을 차단하는 항체 능력의 표시자로서 계산하였다. 계산에 있어서, 항체가 존재하지 않을 때 10 nM의 hLEPR.hFc의 결합 신호를 100% 결합 또는 0% 차단의 기준으로 삼았고; hLEPR.hFc가 존재하지 않을 때 완충액 단독의 베이스라인 신호를 0% 결합 또는 100% 차단의 기준으로 삼았다. 500 nM 항체 농도에서의 차단 데이터는 표 10에 요약되어 있다.

표 10에 나타난 바와 같이, 본 발명의 어떠한 항-LEPR 항체도 hLeptin이 코팅된 표면에 대한 hLEPR.hFc의 결합을 28%보다 많이 차단하지는 못하는 것으로 나타났다. 그러나, 양성 대조군으로서의 비교자 항체와 hLeptin은 hLeptin이 코팅된 표면에 대한 hLEPR.hFc의 결합의 99% 차단할 수 있었다. 이소형 대조군 항체는 최대 500 nM의 농도에서 측정 가능한 차단이 없는 것으로 나타났다.

실시예 6. HEK293/Mycx2-hLepR(ecto)-GPI 앵커 세포를 사용한, FACS 분석에 의한 세포 결합

렙틴 수용체인 LEPR은 클래스 I 사이토카인 수용체 패밀리의 1회 통과 막관통 수용체이다(Tartaglia 등 (1997) J Biol Chem 7:272(10):6093-6 참조). LEPR은 음식 섭취와 대사의 조절에 관여하는 지방 조직에 의해 주로 발현되는 단백질인 렙틴에 결합할 수 있다(Friedman 등의 (2014) J Endocrinol 223(1):T1-8 참조).

항-LEPR 항체에 의한 세포 결합을 평가하기 위해, HEK293 안정한 세포주를 생성하였다. 하나의 세포주(이하 HEK293/hLEPR-GPI로 지칭됨)는, 단백질이 막에 GPI-고정될 수 있도록 GPI(글리코실포스파티딜리노시톨)의 첨가를 안내하는 인간 카르복시펩티다아제 M((Deddish 등의 (1990) J. Biological Chemistry 265:25:15083-89 참조)의 N-말단 myc-myc 태그와 C-말단 myc-myc 태그를 사용해 인간 LEPR(수탁 번호 P48357(서열번호 113)의 아미노산 22-839, , 이소형 B)의 세포외 도메인을 안정적으로 발현시켰다. 루시퍼라아제 리포터(Stat3-루시퍼라아제, Stat3-luc, SA Bioscience, #CLS-6028L)와 함께 전장 인간 LEPR(수탁번호 P48357(서열번호 113)의 아미노산 1-1165, 이소형 B)를 안정적으로 발현시키기 위해 또 다른 HEK293 세포주를 생성하였다(이하 HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL로 본원에서 지칭됨). Stat3-루시퍼라아제 리포터만을 가진 HEK293 세포(HEK293/Stat3-luc)도 대조군 세포주로서 생성하였다.

FACS 분석을 위해, HEK293 부모세포 및 HEK293/hLEPR-GPI 세포를 해리시키고, 2% FBS를 함유하는 PBS(FACS 완충액) 중에서 웰 당 5 x 10⁵ 세포로 96-웰 v-바닥 플레이트 상에 도말하였다. 세포에 대한 항-hLEPR 항체의 결합 능력이 렙틴의 존재에 의해 영향을 받는지 여부를 시험하기 위해, 1 μM 인간 렙틴(R&D Systems, # 398-LP)이 포함되거나 포함되지 않은 FACS 완충액을 세포와 함께 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 다음, 항-LEPR 항체 또는 대조군 항체를 10 nM으로 FACS 완충액에 첨가하였다. 이어서, 세포를 4°C에서 30분 동안 인큐베이션한 다음 세척한 후, 16 μg/mL의 Alexa Fluor®-647이 접합된 이차 항체(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., # 109-547-003)와 함께 4°C에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, BD CytoFix^TM(Becton Dickinson, # 554655)를 사용해 세포를 고정시키고, 여과하고, HyperCyt 유세포 계측기(Beckman Coulter)를 이용해 분석하였다. 염색되지 않은 대조군 및 2차 항체 단독 대조군도 모든 세포주에 대해 시험하였다. ForeCyt®(IntelliCyt) 및 FlowJo 버전 10 소프트웨어를 사용해 결과를 분석하여 생존 세포에 대한 형광의 기하학적 평균을 결정하였다. 그런 다음, 각각의 샘플에 대한 형광의 기하학적 평균을 염색되지 않은 세포의 기하학적 평균에 대해 정규화하여 "결합 비율(binding ratio)"로 지칭되는 조건 별 상대적인 결합을 얻고, 이들 결합 비율을 각각의 시험한 항체에 대해 기록하였다.

표 11에 나타낸 바와 같이, 10 nM에서 시험한 본 발명의 9개의 항-LEPR 항체는 렙틴이 없을 때 824 내지 3374배 범위의 결합 비율로 HEK293/hLEPR-GPI 세포에 결합하는 것으로 나타났다. 항-LEPR 항체는 1 μM 렙틴이 존재하는 경우에도 398 및 4184배의 결합 비율로 결합하였다. 표 11에 나타낸 바와 같이, 10 nM에서 시험된 비교자 항체는 렙틴이 없을 때 2349배의 결합 비율로 HEK293/hLEPR-GPI 세포에 결합하는 것으로 나타났지만, 1 μM 렙틴이 존재하는 경우 세포에 대한 결합이 현저히 감소한 것으로 나타났는데, 결합 비율은 112였다. 항-LEPR 항체는 1 μM 렙틴의 유무와 상관 없이 HEK293 부모세포에 대한 유의한 결합을 나타내지 않았으며, 결합 비율은 1 내지 9배 범위였다. 이소형 대조 항체 및 이차 항체 단독 샘플 또한 렙틴의 유무와 상관 없이 세포주 중 어느 하나에 대한 유의한 결합을 나타내지 않았으며, 결합 비율은 1 내지 6배 범위였다.

표 12에 나타내 바와 같이, 70 nM에서 시험된 본 발명의 4개의 항체는 렙틴이 없을 때 707 내지 1131배의 결합 비율로 HEK293/hLEPR-GPI 세포에 결합하고, 42 내지 51의 결합 비율로 HEK293/Stat3-luc/hLEPR-FL 세포에 결합하는 것으로 나타났다. 항-LEPR 항체는 HEK293/Stat3-luc 세포에 대한 임의의 유의한 결합을 나타내지 않았으며, 결합 비율은 1 내지 8배 범위였다. 이소형 대조군 항체 및 이차 항체 단독 샘플 또한 시험된 세포주 중 어느 하나에 대한 유의한 결합을 나타내지 않았으며, 결합 비율은 1 내지 2배 범위였다.

실시예 7. 본 발명의 항-LEPR 항체는 렙틴의 존재 또는 부재 하에 LEPR 신호 전달을 활성화한다

인간 신경아세포 세포주인 IMR-32 세포주에서 루시퍼라아제 리포터(STAT3-Luc; Qiagen # CLS-6028L)와 함께 전장 인간 LEPR(hLEPR; 수탁번호 NP_002294.2의 아미노산 1 내지 1165)를 안정적으로 발현하는 리포터 세포주를 사용해 LEPR 활성화를 통한 STAT3의 전사 활성화를 검출하기 위해 생물학적 검정법을 개발하였다. 생성된 안정한 세포주(IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR로 지칭됨)를 단리하고, 10% FBS, NEAA, 1 ug/mL 퓨로마이신, 100 ug/mL의 하이그로마이신 B, 및 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 DME 배지(완전한 배지)에서 유지시켰다.

생성된 생물학적 검정법을 사용하여 렙틴의 존재 또는 부재 시에 본 발명의 항-LEPR 항체가 LEPR 신호전달에 미치는 효과를 측정하였다. 생물학적 검정을 위해, IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포를 완전한 배지에서 96웰 포맷에 대해 20,000개 세포/100 ul/웰의 밀도로 도말하고, 다음 날에 1% BSA 및 0.1% FBS(분석 완충액)가 보충된 적절한 부피의 Opti-MEM 배지와 30분 동안 교체하였다. 렙틴의 부재 시에 본 발명의 항체의 효과를 측정하기 위해, 항-LEPR 항체 또는 이소형 대조군 항체 및 인간 렙틴(hLeptin; R&D Systems, #398-LP)을 분석 완충액에서 100 nM 내지 300 fM의 최종 농도가 될 때까지 반로그(half-log) 연속 희석하여, 이를 세포에 첨가하고 이어서 5% CO2 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션 하였다.

렙틴의 존재 시에 본 발명의 항체의 효과를 측정하기 위해, 분석 완충액 중의 200 pM으로 고정된 농도의 인간 렙틴을 세포에 첨가하고, 바로 이어서 100 nM 내지 300 fM 범위의 최종 농도로 반로그 연속 희석된 항-LEPR 항체 또는 이소형 대조군 항체를 첨가하였다. 그런 다음 샘플을 5% CO2 하에 37°C에서 밤새 인큐베이션하였다. 그런 다음, OneGlo 시약(Promega, # E6051)을 샘플에 첨가하고, Envision Multilabel Plate 판독기(Perkin Elmer)를 발광 모드로 이용하여 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 상대 광 단위(RLU) 값을 수득하고, 비선형 회귀를 사용해 GraphPad Prism 소프트웨어(GraphPad)로 결과를 분석하였다. hLeptin 투여량 반응에서 수득한 최대 RLU 값을 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 검정에서의 100% 활성화로서 정의하였다.

표 13에 나타낸 바와 같이, 연구 1에서는, hLeptin의 부재 시, 시험한 항-LEPR 항체 모두가 각각 134 pM 내지 11.9 nM 범위의 EC₅₀ 값 및 hLeptin 투여량 반응에서 얻은 최대 활성화 대비 5% 내지 13% 범위의 최대 활성화로 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포를 약하게 자극한 것으로 나타났다. 연구 2에서는, hLeptin의 부재 시, 시험한 4개의 항-LEPR 항체가 61.9 pM 내지 206.9 pM 범위의 EC₅₀ 값 및 hLeptin 투여량 반응에서 얻은 최대 활성화에 대비 65% 내지 68% 범위의 최대 활성화로 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포를 자극한 것으로 나타났다. 연구 1에서는, 200 pM의 hLeptin이 존재할 때, 시험한 항-LEPR 항체 모두가 각각 20.2 pM 내지 523 pM 범위의 EC₅₀ 값 및 hLeptin 투여량 반응에서 얻은 최대 활성화 대비 66% 내지 107% 범위의 최대 활성화로 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포를 자극한 것으로 나타났다. 이들 항체가 렙틴-유도 LEPR 신호전달을 증강시켰기 때문에, 이들 항체는 본원에서 정의된 바와 같이 "강화제"로서 분류하였다. 연구 2에서는, 200 pM의 hLeptin이 존재할 때, 시험한 4개의 항-LEPR 항체가 각각 51.9 pM 내지 257.3 pM 범위의 EC₅₀ 값 및 hLeptin 투여량 반응에서 얻은 최대 활성화 대비 76% 내지 88% 범위의 최대 활성화로 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포를 자극한 것으로 나타났다. LEPR 신호 전달은 렙틴의 존재 시에는 이들 항체에 의해 눈에 띄게 강화되지 않았다. 이소형 대조군 항체는 어떠한 검정에서도 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR 세포를 측정 가능하게 자극한 것으로 나타나지 않았다.

실시예 8. 본 발명의 항-LEPR 항체는 신호전달-결함 또는 신호전달-손상 LEPR 돌연변이체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 활성화한다

결함이 있거나 손상된 렙틴-매개 신호 전달을 나타내고 조발형(early-onset) 비만증과 관련이 있는 LEPR 돌연변이체가 식별되었다. 예를 들어, LEPR-A409E는 렙틴 신호를 STAT3에 전달하지 않는 신호전달-결함 돌연변이체 LEPR 단백질인데; A409E 돌연변이체는 원래부터 조발형 비만증의 단성적 원인(monogenic cause)인 것으로 식별되었다. (Farooqi 등의 2007, N Engl J Med 356(3): 237-247). LEPR-P316T는 신호전달-손상 돌연변이체 LEPR 단백질로서, 조발형 비만증과 관련이 있는 것으로 나타났다. (Mazen 등의 2011, Mol Genet Metab 102:461-464).

본 실시예에서, 신호전달-결함 또는 신호전달-손상 LEPR 돌연변이체를 발현하는 세포주에서 LEPR 신호전달을 자극하는 본 발명의 항-LEPR 항체의 능력을 평가하였다. 특히, 야생형 LEPR, LEPR-A409E(신호전달-결함) 또는 LEPR-P316T(신호전달-손상)를 발현하는 리포터 세포주(HEK293)를 작제하였다. 세포를 비히클 단독, 재조합 인간 렙틴, 대조군 IgG, 또는 본 발명의 작용제 항-LEPR 항체(H4H16650 또는 H4H16679)로 치료하고, (STAT3 발현 대비 pSTAT3-Y705 발현을 웨스턴 블롯 검출에 의해 측정했을 때의) LEPR 신호 전달 정도를 결정하였다.

이들 실험에서, 본 발명의 작용제 항-LEPR 항체(H4H16650 및 H4H16679)는 (STAT3 발현에 의해 측정했을 때) LEPR-A409E 돌연변이체 또는 LEPR-P316T 돌연변이를 발현하는 세포에서 투여량 의존적 방식으로 LEPR 신호 전달을 자극하는 것으로 나타났다(도 2, 패널 B 및 C). 대조적으로, 렙틴으로 치료한 경우, LEPR-P316T 돌연변이체를 발현하는 세포에서 단지 약간의 신호전달이 유도되었고, LEPR-A409E 돌연변이체를 발현하는 세포에서는 신호전달이 유도되지 않았다. (도 2, 패널 A). 또한, 비히클 또는 IgG 대조군 항체로 치료한 세포주에서는 LEPR 신호전달이 검출되지 않았다(데이터 미도시). 본 검정에서 다른 신호전달-결함 또는 신호전달-손상 LEPR 돌연변이체를 시험하였으나, 이들은 항-LEPR 돌연변이체에 의해 활성화되지 않았으며(데이터 미도시), 이는 이러한 구조 효과(rescue effect)가 돌연변이-의존적일 수 있음을 시사한다.

본 실시예의 결과는, 본 발명의 작용제 항-LEPR 항체가 특정 신호전달-결함 또는 신호전달-손상 LEPR 돌연변이체(예: LEPR-P316T 또는 LEPR-A409E)에 의해 초래되거나 이와 관련이 있는 질환 및 장애(예: 조발형 비만증)를 치료하는 데 유용할 수 있음을 나타낸다.

실시예 9: 상이한 항-LEPR 단클론 항체 간의 옥텟 교차 경쟁

한 무리의 상이한 항-LEPR 단클론 항체 간의 결합 경쟁은 Octet HTX 바이오센서 플랫폼(Pall ForteBio Corp.) 상에서 실시간, 비표지 바이오-층 간섭 검정을 사용해 결정하였다. 전체 실험은 25°C에서, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.05% v/v 계면활성제 Tween-20, 및 1 mg/mL BSA, pH7.4 (HBS-EBT)를 함유하는 완충액 중에서, 플레이트를 1000 rpm의 속도로 진탕시키면서 수행하였다. 2개의 항체가 C-말단 myc-myc-헥사히스티딘 태그로 발현된 재조합 인간 LEPR(hLEPR.mmh; 서열번호 114) 상에서 이들 각각의 에피토프에 결합하기 위해 서로 경쟁할 수 있는 지 평가하기 위해, 먼저 항-Penta-His 항체가 코팅된 옥텟 바이오센서 팁(Fortebio Inc, # 18-5122)을 20 μg/mL의 hLEPR-MMH를 함유하는 웰에 5분 동안 함침시켜 약 0.25 nm 또는 0.34 nm의 hLEPR-MMH를 옥텟 바이오센서 팁 상에 포획하였다. 이어서, 항원이 포획된 바이오센서 팁을 50 μg/mL의 제1 항-LEPR 단클론 항체(이하 mAb-1로 지칭함) 용액을 함유하는 웰에 210초 동안 침지시켜 mAb-1로 포화시켰다. 그런 다음, 이어서 바이오센서 팁을 50 μg/mL의 제2 항-LEPR 단클론 항체(이하 mAb-2로 지칭함) 용액을 함유하는 웰에 150초 동안 침지하였다. 실험의 모든 단계 사이에, HBS-ETB 완충액에서 바이오센서 팁을 세척하였다. 실시간 결합 반응을 실험의 전체 과정 동안 모니터링하고, 모든 단계가 끝난 후 결합 반응을 기록하였다. mAb-1과 미리 복합체화된 hLEPR-MMH에 대한 mAb-2의 결합 반응을 비교하고, 상이한 항-LEPR 단클론 항체의 경쟁적/비경쟁적 거동을 표 14 및 표 15에 나타낸 바와 같이 결정하였다.

실시예 10: 유도 가능한 렙틴 결핍증의 마우스 모델에서 LEPR 작용제 항체 H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 및 H4H17321P2의 생체 내 효능.

본 발명의 4가지 특이적 작용제 항-LEPR 항체(H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 및 H4H17321P2)가 음식 섭취, 체중 및 지방 과다증에 미치는 효과는, 쥣과 LEPR 엑토도메인 서열 대신에 인간 LEPR 엑토도메인 서열을 갖고, 렙틴 수용체를 발현하는, 유전적으로 조작된 LEPR ^HuHu 마우스에서의 유도 가능한 렙틴 결핍증 마우스 모델에서 결정하였다. 렙틴 결핍증의 모델은 hFc-태그된 마우스 LEPR 엑토도메인(본원에서 mLEPR.hFc 또는 "렙틴 트랩"으로 지칭됨; 서열번호 120)을 암호화하는 플라스미드의 유체 역학적 DNA 전달(HDD)에 의해 유도하였다. 렙틴 트랩은 발현 시에 분비되어 순환하는 렙틴에 결합한다. 렙틴 트랩을 암호화하는 50 μg의 DNA 작제물의 HDD 후, 마우스는 음식 소비의 증가 및 지방 과다증 및 체중 증가를 나타냈다.

베이스라인 일일 음식 섭취량은 렙틴 트랩을 투여하기 7 내지 4일 전에(-7 내지 -4일차) 측정하였다. 0일 차에, 35마리의 13 내지 17주령 수컷 LEPR ^Hu/Hu 마우스를 대상으로 렙틴 트랩의 HDD를 성공적으로 수행하였다. HDD 후 6 및 13일차에, 안와 후 출혈을 통해 채혈하여 μCT에 의해 고 지방증을 포함하는 체성분을 정량화하였다. HDD 후 7일차에, 0일차 대비 체중 변화 백분율을 기준으로 마우스를 7마리씩 5개의 군으로 무작위배정하였다. 각 군에 3 mg/kg의 이소형 대조군 항체, 3 mg/kg의 H4H16650P2, 3 mg/kg의 H4H16679P2, 3 mg/kg의 H4H17319P2, 또는 3 mg/kg의 H4H17321을 1회 투여량으로 피하 주사를 통해 투여하였다. 이소형 대조군 항체는 알려진 마우스 단백질에 결합하지 않았다. 음식 섭취 및 체중을 연구 기간 동안 각 동물마다 측정하였다. 도 3은 각 치료군에 대한 평균 일일 음식 섭취량을 요약한 것이다. 도 3에서, 점선은 HDD 주입 전의 평균 베이스라인 음식 섭취량을 나타낸다. 0일차 대비 체중 변화 백분율을 매 시점마다 각 동물에 대해 계산하였다. 도 4는 각 항체 치료군 내 동물의 평균 체중 변화율을 요약한 것이다. 도 5는 각 항체 치료군 내 동물을 대상으로 항체 치료 전 1일차 및 항체 치료 후 6일차에 μCT로 정량화한 평균 체지방량을 요약한 것이다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다.

도 3 및 도 4에 도시된 바와 같이, 렙틴 트랩을 HDD한 후, 마우스의 군 사이에서 항체 치료 전과 유사한 음식 섭취량 증가 및 체중 변화율이 관찰되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 3 mg/kg의 H4H16650P2 또는 H4H16679P2로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체를 주입한 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 1일 차(HDD 후 8일차)에서 시작하여 후속 측정 시점에 음식 섭취량에 있어서 상당한 감소를 나타냈다. 3 mg/kg의 H4H17319P2 또는 H4H17321P2로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체를 주입한 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 2일 차(HDD 후 9일차) 및 다른 후속 측정 시점에 음식 섭취량에 있어서 상당한 감소를 나타냈다. 도 4에 도시된 바와 같이, 3 mg/kg의 항체 H4H16650P2로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체를 주입한 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 1일 차(HDD 후 8일차) 및 다른 후속 측정 시점에 체중 변화율에 있어서 상당한 감소를 나타냈다. 항체 치료 후 1일차(8일차)에, 이소형 대조군으로 치료한 마우스는 0일차 대비 21.16 ± 1.27%의 체중 증가를 나타낸 반면, H4H16650P2로 치료한 마우스는 0일차 대비 체중이 15.57 ± 0.9% 증가하였다. 3 mg/kg의 항체 H4H16679P2, H4H17319P2 또는 H4H17321P2로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체를 주입한 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 2일 차(HDD 후 9일차) 및 다른 후속 측정 시점에 체중 변화율에 있어서 상당한 감소를 나타냈다. 9일차에, 이소형 대조군, H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 또는 H4H17321P2로 치료한 마우스에 대한 0일차 대비 체중 변화율은 각각 23.18 ± 1.22, 13.17 ± 1.05, 12.95 ± 1.26, 15.98 ± 1.78 및 15.83 ± 2.01이었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 3 mg/kg의 이소형 대조군 항체로 치료한 마우스는 항체 치료 1일 전(HDD 후 6일차)과 비교해 항체 치료 후 6일차(HDD 후 13일차)에 체지방량에 있어서 상당한 증가를 나타냈다. 3 mg/kg의 항체 H4H16650P2, H4H16679P2, H4H17319P2 또는 H4H17321P2로 치료한 마우스는 항체 치료 이전과 비교해 항체 치료 후에 체지방량이 증가하지 않았다. 치료로부터 6일이 지난 후(HDD 후 13일차), 3 mg/kg의 항체 H4H16650P2, H4H16679P2 또는 H4H17319P2로 치료한 마우스는 3mg/kg의 이소형 대조군 항체로 치료한 마우스와 비교해 체지방량의 상당한 감소를 나타냈다.

실시예 11: 수소 중수소 교환에 의한 인간 렙틴 수용체(hLEPR.mmh)에 대한 H4H16650P2 결합의 에피토프 맵핑.

H4H16650P2와 상호작용하는 hLEPR.mmh의 아미노산 잔기(서열번호 114의 아미노산 M1-D839)를 결정하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위해, 질량 분석법을 이용해 H/D 교환 에피토프 맵핑을 수행하였다. H/D 교환 방법의 일반적인 설명은, 예를 들어, Ehring의 (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; 및 Engen 및 Smith의 (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A에 제시되어 있다.

실험 절차. HDX-MS 실험은 중수소 표지화를 위한 Leaptec HDX PAL 시스템, 샘플 분해 및 첨가를 위한 Waters Acquity M-Class (Auxiliary solvent manager), 분석 컬럼 구배를 위한 Waters Acquity M-Class (μBinary solvent manager) 및 펩신 펩티드 질량 측정을 위한 Synapt G2-Si 질량 분석기로 이루어진 통합 Waters HDX/MS 플랫폼 상에서 수행하였다.

표지화 용액은 pD 7.0(pH 6.6과 동등함)의 D2O 중 10 mM PBS 완충액으로 제조하였다. 중수소 표지화를 위해, hLEPR.mmh(8 pmol/μL) 또는 2:1의 몰비로 항체와 미리 혼합한 hLEPR.mmh 3.8 μL를 56.2 μL의 D₂O 표지화 용액과 함께 다양한 시점 동안 (예를 들어, 중수소화되지 않은 대조군의 경우 0초, 표지화된 경우 1분 및 20분) 인큐베이션하였다. 50 μL 샘플을 50 μL 미리 냉각시킨 퀀칭 완충액(0.2 M TCEP, 100 mM 인산염 완충액 중 6 M 구아니딘 클로라이드, pH 2.5)에 옮겨 중수소화를 퀀칭하고, 혼합된 샘플을 1.0℃에서 2분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 퀀칭된 샘플을 온라인 펩신/프로테아제 XIII 분해를 위해 Waters HDX Manager에 주입하였다. 분해된 펩티드를 0℃에서 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm, 2.1 Х 5 mm VanGuard 사전 칼럼 상에 포획하고, 분석 칼럼 ACQUITY UPLC BEH C18 1.7 μm, 1.0 x 50 mm에 용리하여, 5%~40% B로 9분 동안 구배 분리하였다(이동상 A: 물 중 0.1% 포름산, 이동상 B: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산). 질량 분석기는, 콘 전압 37V, 스캔 시간 0.5초, 및 질량/전하 범위 50 내지 1700 Th로 설정하였다.

인간 LEPR로부터의 펩티드를 식별하기 위해, 중수소화되지 않은 샘플의 LC-MSE 데이터를 처리하고, Waters ProteinLynx Global Server (PLGS) 소프트웨어를 통해 인간 LEPR, 펩신 및 이들의 무작위배정 서열을 포함하는 데이터베이스에 대해 검색하였다. 식별된 펩티드를 DynamX 소프트웨어로 가져온 다음 2개의 기준에 따라 여과하였다: 1) 아미노산 당 최소 생성물: 0.2, 및 2) 복제 파일 임계 값: 3. 그러면, DynamX 소프트웨어가 다중 시점에 걸쳐, 각 시점마다 3번씩 반복하여, 체류 시간 및 고 질량 정확도(high mass accuracy, < 10 ppm)를 기준으로 각 펩티드의 중수소 흡수를 자동적으로 결정한다.

결과. MS^E 데이터 획득과 결합된 온라인 펩신/프로테아제 XIII 컬럼을 사용해, 항체의 존재 유무와 상관 없이 70%의 서열 커버리지를 나타내는 총 201개의 펩티드를 인간 LEPR로부터 재현 가능하게 식별하였다. 5개의 펩티드는 표 16에 나타낸 바와 같이 H4H16650P2에 결합될 때 중수소화 흡수를 상당히 감소시켰다(중심부 델타 값 > 0.4달톤, p-값 < 0.05). 기록된 펩티드 질량은 3번 반복하여 결정한 중심부 MH+ 질량의 평균 값에 상응한다. 아미노산 162-169 (인간 LEPR의 아미노산 LYVLPEVL; 서열번호: 113) 및 아미노산 170-181 (인간 LEPR의 아미노산 EDSPLVPQKGSF; 서열번호 113)에 상응하는 이들 펩티드는 H4H16650P2에 결합될 때 중수소화 속도가 느려졌다. 이들 식별된 잔기는 Uniprot 엔트리 P48357에 의해 정의한 바와 같은 인간 LEPR(서열번호 113; 인간 렙틴 수용체)의 아미노산 잔기 162~169 및 170~181에도 상응한다.

실시예 12: 인간화 LEPR 마우스에서 LEPR 강화제 항체의 생체 내 효능 시험.

본 발명의 3가지 특이적 강화제 항-LEPR 항체(H4H18482P2, H4H18487P2 및 H4H18492P2)가 체중 및 지방 과다증에 미치는 효과는, 쥣과 LEPR 엑토도메인 서열(mLEPR.hFc, 서열번호 120) 대신에 인간 LEPR 엑토도메인 서열을 갖고, 렙틴 수용체를 발현하는, 한 마리 씩 수용한 유전적으로 조작된 LEPR ^HuHu 마우스에서 결정하였다.

-19일차에 지방 과다증을 포함하는 체성분을 μCT에 의해 정량화하였다. 0일 차에, 48마리의 14 내지 16주령 암컷 LEPR ^Hu/Hu 마우스를 체중을 기준으로 12마리씩 4개의 군으로 무작위배정하였다. 0 및 11일차에, 각 군의 마우스에게 30 mg/kg의 이소형 대조군 항체, 30 mg/kg의 H4H18482P2, 30 mg/kg의 H4H18487P2 또는 30 mg/kg의 H4H18492P2를 1회 투여량으로 피하 주사를 통해 투여하였다. 이소형 대조군 항체는 알려진 마우스 단백질에 결합하지 않는다. 연구가 진행되는 동안 각 마우스에 대한 체중을 측정하였다. 0일차 대비 체중 변화 백분율을 매 시점마다 각 동물에 대해 계산하였다. 도 6은 각 치료군 내 동물의 평균 체중 변화율을 요약한 것이다. 도 6은 각 항체 치료군 내 동물을 대상으로 항체 치료 전 19일차 및 항체 치료 후 11일차에 μCT로 정량화한 평균 체지방량을 요약한 것이다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 체중 변화율 감소는 LEPR 강화제 항체를 투여한 후 관찰되었지만, 이소형 대조군 항체를 투여한 후에는 관찰되지 않았다. 도6에 도시된 바와 같이, 30 mg/kg의 H4H18482P2로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체를 주입한 마우스와 비교했을 때 치료 2일 후(2일차)부터 시작하여 다른 시점에 체중 변화율에 있어서 상당한 감소를 나타냈다. 30 mg/kg의 H4H18487P2로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체를 주입한 마우스와 비교했을 때 2일차에서 시작하여 다른 시점에 체중 변화율에 있어서 상당한 감소를 나타냈다. 30 mg/kg의 H4H18492P2로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체를 주입한 마우스와 비교했을 때 4, 5 및 17일차에서 체중 변화율에 있어서 상당한 감소를 나타냈지만 다른 시점에는 그렇지 않았다. 30 mg/kg의 H4H18482P2로 치료한 마우스는 H4H18492P2를 주입한 마우스와 비교했을 때, 6일차에서 시작하여 이어지는 일차에 체중 변화율에 있어서 상당한 감소를 나타냈지만, 7, 14 및 17일차에는 그렇지 않았다. 30 mg/kg의 H4H18487P2로 치료한 마우스는 H4H18492P2를 주입한 마우스와 비교했을 때, 3일차에서 시작하여 다른 시점에 체중 변화율에 있어서 상당한 감소를 나타냈지만, 4 및 5일차에는 그렇지 않았다.

도 7a에 도시된 바와 같이, 치료 전(-19일차)에는 군 사이에 체지방량의 차이가 없었다. 도 7b에 도시된 바와 같이, H4H18492를 제외한 30 mg/kg의 H4H18482 및 H4H18487로 치료한 마우스는 이소형 대조군 항체와 비교했을 때, 치료(12일차) 후 17일차에 체지방량에 있어서 통계적으로 유의한 감소를 나타냈다.

실시예 13: 원숭이 LEPR 신호 전달에 본 발명의 항-LEPR 항체가 미치는 효과

원숭이 렙틴 수용체의 전사 활성화를 평가하기 위해, 안정한 세포주를 개발하였다. 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis) LEPR(MfLEPR; 827에 있는 트레오닌이 알라닌으로 바뀐 수탁번호 XP_005543194.1의 아미노산 22 내지 837)의 세포외 도메인을 안정적으로 발현시키도록 IMR-32 세포(인간 신경아세포 ATCC)를 생성하고, 루시퍼라아제 리포터(STAT3-Luc; SABiosciences, # CLS-6028L)와 함께 인간 LEPR(hLEPR; 수탁 번호 NP_002294.2의 아미노산 840 내지 1165)의 막관통 및 세포액 도메인과 융합시켰다. 생성된 안정한 세포주(이하 IMR-32/STAT3-Luc/hLEPR로 지칭됨)를 단리하고, 10% FBS, NEAA, 1 ug/mL 퓨로마이신, 100 ug/mL의 하이그로마이신 B 및 페니실린/스트렙토마이신/L-글루타민으로 보충된 MEM-Earl 배지에서 유지시켰다.

생물학적 검정을 수행하여 렙틴의 존재 시 본 발명의 항-LEPR 항체가 원숭이 LEPR 신호전달에 미치는 효과를 측정하였다. 생물학적 검정을 위해, 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 Optimem 중의 0.1% FBS(분석 완충액)에서 IMR-32/STAT3-Luc/MfLEPR 세포를 96-웰 플레이트에 10,000세포/웰로 도말하고, 5% CO₂ 하에 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 다음 날, 인간 렙틴(hLeptin), 항-LEPR 항체 또는 이소형 대조군 항체를 분석 완충액(시험 분자 없이 완충액만 함유하는 샘플 포함) 중에서 50 nM 내지 0.8 pM까지 연속 희석한 뒤, 세포에 첨가하였다. 5% CO₂ 하에 37℃에서 5.5시간이 지난 후, OneGlo?? 시약(Promega, # E6031) 및 Victor?? X 다중표지 플레이트 판독기(Perkin Elmer)로 루시퍼라아제 활성을 측정하였다. 비선형 회귀(4-파라미터 로지스틱스)를 사용해 Prism?? 6 소프트웨어(GraphPad)로 결과를 분석하여 EC₅₀ 값을 수득하였다. 항체 활성화 백분율은 hLeptin에 의해 달성된 RLU의 최대 범위의 것에 대한 항체에 의해 달성된 RLU의 최대 범위로서 계산하였다.

표 17에 나타낸 바와 같이, hLeptin의 부재 시, 시험한 항-LEPR 항체 모두는 IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR 세포에서 266 pM 내지 368 pM 범위의 EC₅₀ 값 및 76% 내지 82%의 최대 활성화 범위로 원숭이 LEPR 신호전달을 활성화하였음을 보여주었다(여기서, 100% 활성화는 hLeptin이 있을 때 관찰되었고, hLeptin은 333 pM의 EC₅₀ 값으로 활성화됨). 이소형 대조군 항체는 IMR-32/STAT3-Luc/mfLEPR 세포를 측정 가능하게 자극한 것으로 나타나지 않았다.

실시예 14: Luminex MFI 신호를 사용하여 인간 LEPR의 전장 세포외 도메인에 대한 에피토프 결합

본 발명의 항-LEPR 항체가 결합하는 인간 LEPR의 에피토프를 결정하기 위해, Luminex FLEXMAP (FM3DD, LuminexCorp) 유세포 계측법 기반의 검정법을 사용하여 재조합 인간 LEPR 단백질 도메인과 항-LEPR 항체의 상호 작용의 특징을 분석하였다. 검증을 위해, 약 3백만 개의 카르복실화된 Microplex^R 미소구체(Luminex, Cat# LC1000A)를 세척하고, 와동(vortexed)시키고 0.1M NaPO₄, pH 6.2(활성화 완충액) 중에서 초음파 처리한 다음, 원심 분리하여 상청액을 제거하였다. 미소구체를 120 μL의 활성화 완충액 중에 재현탁시키고, 25℃에서 50 mg/mL의 N-히드록시숙신이미드(NHS, Thermo Scientific, Cat# 24500) 15 μL을 첨가하고, 이어서 50 mg/mL의 1-에틸-3-[3-디메틸아미노프로필]카르보디이미드(EDC, ThermoScientific, Cat# 22980) 15 μL를 첨가하여 카르복시산기(-COOH)를 활성화하였다. 10분 후, 50 mM MES, pH 5(결합 완충액) 600 μL를 첨가하여 반응물의 pH를 5.0까지 감소시키고, 미소구체를 와동시키고, 원심 분리하여 상청액을 제거하였다. 결합 완충액 중에서, 활성화된 비드를 마우스 IgG 또는 인간 IgG가 포함된 20 μg/mL 단클론 항-myc 항체 500 μL와 즉시 혼합하고, 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 1 M Tris-HCl, pH 8.0을 첨가하여 결합 반응을 퀀칭시키고, 미소구체를 신속하게 와동시키고, 원심분리하고, 1 mL의 DBPS로 4회 세척하여 미결합된 단백질과 다른 반응 성분을 제거하였다.

C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 세포외 도메인(인간 LEPR-MMH, 서열번호 113), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR CRH1 (D1)(인간 LEPR CRH1 (D1)-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-208, 아미노산 209-236), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR CRH1 (D1,D2) 도메인 (인간 LEPR CRH1 (D1,D2)-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-318, 아미노산 319-346), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR CRH1-Ig (D1,D2,D3) 도메인 (인간 LEPR CRH1 (D1,D2,D3)-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-278, 아미노산 279-306), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR CRH1-Ig (D2,D3) 도메인 (인간 LEPR CRH1-Ig (D2,D3)-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-198, 아미노산 199-226), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR Ig (D3) 도메인 (인간 LEPR Ig (D3)-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-88, 아미노산 89-116), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR CRH2 도메인 (인간 LEPR CRH2-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-207, 아미노산 208-235), C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR FNIII 도메인 (인간 LEPR FNIII-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-204, 아미노산 205-232), 및 C-말단 myc-myc 헥사히스티딘 태그로 발현된 인간 LEPR Ig-CRH2-FNIII 도메인 (인간 LEPR Ig-CRH2-FNIII-MMH, myc-myc 헥사히스티딘 태그를 갖는 서열번호 113의 아미노산 1-510, 아미노산 511-538)을 포함하여, 일시적으로 발현시킨 LEPR 단백질을 무혈청 CHO-S-SFM II 배지(Thermo Fisher, Cat # 31033020)에 현탁한 다음, 원심분리에 의해 정화하였다. 전술한 바와 같이 제조된 고정화된 항-myc 단클론 항체가 포함된 미소구체의 분취물을 이들 단백질 상청액 각각의 1 mL에 개별적으로 첨가하였다. 미소구체를 부드럽게 혼합하고, 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 1 mL의 DBPS로 2회 세척하고, 원심 분리하여 상청액을 제거하고, 최종적으로 1 mL의 DPBS 완충액에 재현탁하였다. 전장 인간 LEPR과 인간 LEPR 도메인 단백질과의 개별 반응으로 생성된 48 μL의 항-myc IgG 결합 미소구체를 회수하여 3.6 mL의 PBS + 20 mg/mL BSA+0.05% 아지드화 나트륨(차단 완충액) 중에서 함께 혼합하였다.

이러한 혼합된 풀에서, 75 μL의 미소구체를 96 웰 필터 플레이트(Millipore, Cat. No: MSBVN1250) 상에 웰마다 도말하고, 25 μL의 개별 항-인간 LEPR 단클론 항체(0.5 또는 5 μg/mL)와 혼합하고, 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 0.05% Tween 20이 포함된 200 μL의 DPBS(세척 완충액)로 2회 세척하였다. 개별 미소구체에 결합된 항-LEPR 항체 수준을 검출하고 그 량을 정량화하기 위해, 차단 완충액 중 100 μL의 2.5 μg/mL R-피코에리트린 접합 염소 F(ab')2 항-인간 카파(Southern Biotech, Cat# 2063-09) 또는 차단 완충액 중 100 μL의 1.25 μg/mL R-피코에리트린 AffiniPure F(ab')2 단편 염소 항-마우스 IgG(F(ab')2 단편 특이적)(Jackson Immunoresearch, Cat. No: 115-116-072)를 첨가하고 25℃에서 30분 동안 배양하였다. 30분 후, 샘플을 200 μL의 세척 완충액으로 2회 세척하고 150 μL의 세척 완충액 중에 재현탁하였다. 미소구체의 중간 형광 강도(MFI)를 Luminex Analyzer에서 측정하였다.

Luminex 기반 분석의 결과는 표 18에 나열되어 있다. Luminex MFI 신호 강도는, 본 발명의 12개의 항-LEPR 항체가 인간 LEPR 세포외 도메인에 결합하였음을 나타낸다. 항-LEPR 항체 H4H18417P2, H4H18438P2 및 H4H18492P2는 인간 LEPR의 CRH1 D2 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다. 항-LEPR 항체 H4H18449P2, H4H16650P 및 H4H16679P는 인간 LEPR의 CRH1(D1-2) 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다. 항-LEPR 항체 비교자 단클론 항체는 인간 LEPR의 CRH2 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다. 항-LEPR 항체 H4H18445P2는 인간 LEPR의 FNIII 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다. 항-LEPR 항체 H4H18446P2, H4H18482P2 및 H4H18487P2는 인간 LEPR의 Ig-CRH2-FNIII 도메인 내에서 에피토프에 결합하였다.

실시예 15~19: 동물 연구를 위한 프로토콜

모든 동물 연구는 Regeneron Pharmaceuticals의 동물 실험 윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 가이드라인과 승인에 따라 수행되었다. 원숭이 연구 또한 Covance Laboratories의 IACUC의 가이드라인과 승인에 따라 수행되었다.

마우스 연구

유체역학적 DNA 전달

유체역학적 DNA 전달(HDD)-기반 생체 내 형질감염은 외래 단백질을 발현시키기 위해 네이키드 플라스미드 DNA가 포함된 다량의 용액을 살아있는 동물에게 신속하게 주입하는 것을 포함하는 프로토콜이다(Suda, 2007). 마우스를 칭량하고, 발현 벡터를 체중(V/W)의 1/10과 동등한 최종 부피의 식염수에 현탁하여 새롭게 제조하여, 이를 가로 절단한 미정맥을 통해 주입하여 전달하였다. 렙틴 싱크 모델 검증 연구(도 11)를 위해, 8주령 수컷 C57BL/6N 마우스(Taconic)에게 마우스 당 50 μg DNA의 mLeprECD 발현 벡터(pRG977.mROR.mLepR.ecto.hFc) 또는 대조군 벡터(pRG977.hFc)를 투여하였다. H4H17319P2 평가 연구(도 9)를 위해, 17 내지 20주령 수컷 및 암컷 Lepr ^hu/hu 마우스에게 마우스 당 50 μg DNA의 mLeprECD 발현 벡터(pRG977.mROR.mLepR.ecto.hFc)를 투여하였다.

체중 및 음식 섭취량 측정

체중은, 무게를 측정해 둔(tared) 디지털 실험실 저울 상의 용기에 마우스를 배치하여 측정하였다. 3초 동안의 동적 칭량에 의한 평균 체중을 사용하였다. 음식 섭취량은 디지털 실험실 저울을 사용해 먹이 호퍼(food hopper) 내의 먹이 중량을 측정함으로써 결정하였다. 음식 섭취량은 호퍼에 공급된 음식의 무게와 호퍼에 남아 있는 음식의 무게의 차이로서 계산하였다.

체성분

마이크로-컴퓨터 단층촬영(마이크로-CT)에 의한 영상촬영은 제조자의 지침에 따라 , 기체 상태의 이소플루란으로 마취시킨 살아 있는 마우스를 대상으로 Quantum Micro-CT 이미징 시스템(Perkin Elmer)으로 수행하였다. 체성분(체지방량, 제지방량, 골량, 골 무기질량 및 밀도)은 제조자의 지침에 따라 Quantum Micro-CT 이미징 시스템(Perkin Elmer)을 사용해 측정하였다. 이어서, 스캔된 이미지를 AnalyzeDirect 이미징 소프트웨어를 사용해 분석하였다. 체지방량, 제지방량 및 골량은 기록된 조직 부피에 각각의 질량 밀도(0.92, 1.05 및 1.7 g/cm³)를 곱하여 계산하였다. 살아있고 의식이 있는 마우스를 대상으로 EchoMRI 100 기기(EchoMRI)를 사용해 정량적 핵 자기 공명(qNMR)을 수행하여 체지방량(fat mass), 제지방량(lean mass), 자유수량(free water mass) 및 체수분량(total water mass)을 측정하였다.

혈당 측정

식후 혈당 수준은 혈당 측정기(AlphaTrak2, Zoetis) 및 혈당 시험 스트립(Zoetis)을 사용하여 의식이 있는 마우스를 대상으로 미정맥을 잘라 측정하였다.

인슐린 내성 시험

동물을 4시간 동안 굶긴 후, 표시된 바와 같이 0.5, 0.75 또는 1.0 U/kg 용량의 인슐린(Humulin R, Eli Lilly and Company)을 복강내(IP) 주사하였다. 인슐린을 주사하고 0, 15, 30, 60 및 120분 후에 AlphaTRAK2 혈당 측정기와 시험 스트립(Zoetis)을 사용해 혈당 측정을 실시하였다. Lepr ^hu/hu 특성 분석 연구에는 Accu-Chek® Compact Plus 혈당 측정기와 시험 스트립(Roche Diabetes Care, Inc.)을 사용하였다.

화학 분석 및 호르몬 검정

달리 표시되지 않는 한, 마우스를 4시간 동안 굶긴 다음, 안와 후 출혈(retro-orbital bleed)을 통해 채혈을 하였다. 혈청을 단리하기 위해, 혈액을 혈청 분리관(Sarstedt AG & Co.)으로 옮기고, 젖은 얼음 상에서 적어도 30분 동안 응고시킨 후 10,000 g에서 5분 동안 원심 분리하였다. 혈청을 제거하여, 렙틴 정량화를 위한 처리 전까지 -80℃에서 보관하였다. 혈장 측정을 위해, 혈액을 K3EDTA-코팅 관(Sarstedt AG & Co.)으로 옮겼다. 디펩티딜 펩티다아제 4(DPP4) 억제제와 프로테아제 억제제 칵테일을 혈액 샘플에 첨가하고, 그 상태로 얼음 위에 두었다가 2000 g에서10분 동안의 원심분리를 통해 혈장을 수득하였다. 혈장을 분취하고, 혈장 지질, 간 효소 및 렙틴 수준의 정량화에 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. HbA1c는 K3EDTA-코팅 관에 채취한 신선한 전혈에서 측정하였다. HbA1c, 혈장 지질 및 간 효소는 화학 분석기(Advia Chemistry XPT, Siemens)를 사용해 정량화하였다. 혈청 또는 혈장 렙틴 수준은 제조자의 권장 프로토콜에 따라 면역검정 키트(Milliplex MAP, Millipore)를 사용해 측정하였다.

간 중성지방의 정량화

100 내지 200 mg의 간에서 간 중성지방 함량을 정량화하고, 액체 질소로 냉각시킨 절구와 공이로 분쇄하여 분말로 만들었다. 분말로 만든 간 조직을 칭량하고 비드 균질화(FastPrep 24-5G, MP Biomedical)에 의해 PBS에서 균질화하였다. 균질물을 5 mL의 폴치 용액(Folch solution, 2:1 클로로포름:메탄올)이 담긴 유리관에 옮기고, 와동시키고, 1500 Х g로 20분 동안 원심분리하였다. 하층상을 수집하여, 5 mL 부피로 만든 뒤, 와동시켰다. 샘플과 트리올레인 표준 용액(Verichem)의 특정 부피(25 내지 50 μL)를 96-웰 폴리프로필렌 플레이트에 옮기고, 10 μL의 클로로포름:Triton X-100의 1:1 혼합물과 혼합하고, 공기 건조시켰다. 건조된 샘플과 표준 용액에, 300 μL의 트리글리세라이드 시약(Thermo Scientific)을 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 진탕시킨 다음, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 200 μL의 각 반응물을 깨끗한 새 폴리프로필렌 96-웰 플레이트에 옮기고 플레이트 판독기(Molecular Devices)를 사용해 500 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

고정 관류 및 면역조직화학

마우스를 펜토바비탈나트륨(110 mg/kg, IP)으로 마취시키고, 2 mL의 식염수에 이어 0.1 M 붕산염 완충액, pH 9.5 중 150 mL의 4% 파라포름알데히드로 경심 관류하였다. 간을 2시간 동안 고정시킨 다음, 70% 에탄올로 옮기고, 파라핀으로 포매처리한 다음, Histoserv에서 절단하여 헤마톡실린과 에오신 염색을 수행하였다. 뇌는 4℃에서 2시간 동안 고정시킨 다음, 4℃의 인산 칼륨 완충 식염수 중 15% 수크로오스에 밤새 침지시켰다. 전체 뇌를 동결 슬라이딩 마이크로톰freezing sliding microtome, Leica) 상에 고정시켜 30 μm 두께로 절단하고, 동일한 간격으로 연속으로 수집하여 동결 보호제(0.1 M 인산 완충액 중 20% 글리세롤 및 30% 에틸렌 글리콜) 중에 저장하고, -20℃에서 동결 보호제(0.1 M 인산 완충액 중 20% 글리세롤 및 30% 에틸렌 글리콜) 중에 저장하였다.

각 실험 군으로부터 150 μm씩 이격된 일련의 뇌 절편들을 동시에 처리하여 동물과 치료제 간에 비슷한 염색이 이뤄지도록 하였다. 모든 면역 염색에 대해, 뇌 절편을 차단하고 1차/2차 항체를 1% 당나귀 혈청(Equitech), 0.03% Triton X-100 및 0.05 M 인산칼륨 인산 완충 식염수를 함유하는 용액에서 희석시켰다. 제조사의 프로토콜(Vector Labs)에 따라 아비딘과 비오틴 차단을 수행하였다. 아비딘-비오틴-복합체 방법을 사용해, 균일한 간격으로 놓인 일련의 뇌 절편을 대상으로 색원체(chromogen)인 디아미노벤지딘(Vector Labs)로 pStat3(Y705) (#9145, Cell Signaling Technologies; 1:1000, 4℃에서 16시간)에 대한 면역조직화학 염색을 수행하였다. P-STAT3 (Y705) 면역조직화학 (IHC)의 경우, 절편을 1% NaOH 중 1% H₂O₂로 10분 동안 전처리하고, K-PBS 중 0.3% 글리신으로 10분 동안 전처리하고, K-PBS 중 0.03% SDS로 10분 동안 전처리하였다.

Scanscope XT (Aperio)에 장착된 40x 대물 렌즈로 전체 슬라이드를 스캐닝하여 명시야상(Bright field image)을 얻었다. 조직 비교에 의해 Franklin과 Paxinos의 마우스 뇌 지도(Franklin and Paxinos mouse brain atlas)와 절편을 매칭시켰다. 신경해부학적 영역과 브레그마로부터의 거리는 이 지도를 기준으로 근사(approximate)하였다. pSTAT3 (Y705) 면역반응 세포의 수는 Halo 소프트웨어(Indica Labs)를 사용해, 표시된 전후방 수준(rostro-caudal level)에서, 주어진 영역에 대해 양측으로 정량화하였다.

원숭이 연구

시노몰구스 원숭이를 대상으로 한 모든 연구는 Covance Laboratories, Inc.에서 수행하였다. 원숭이들에게 Certified Primate Diet #5048 (PMI, Inc.)을 1일 2회 먹이고, 신선한 물을 자유롭게 마실 수 있게 하였다.

체중

원숭이를 투여 당일에 투여 직전에 칭량하고, 잔여 연구 기간 전체에 걸쳐 가급적이면 적어도 매주 1회 칭량하였다.

이중 에너지 X-선 흡수계측법(DEXA)

케타민과 덱스메데토미딘으로 마취시킨 공복 상태의 원숭이를 대상으로 수의학과 연구원의 재량에 따라 Discovery A 밀도계(Hologic)를 사용하여 전신 스캔을 수행하였다.

실시예 15: 항-LEPR 항체는 렙틴 결핍증에 의해 유도된 비만증을 역전시킨다

H4H17319P2가 생체 내에서 효능이 있는지를 결정하기 위한 연구를 수행하였다. H4H17319P2는 마우스 LEPR에 결합하지 않기 때문에, LEPR 세포외 도메인을 암호화하는 마우스 Lepr 유전자의 일부분을 상응하는 인간 LEPR 게놈 서열(Lepr ^hu/hu 도 10a)로 치환한 유전적으로 변형된 마우스를 VelociGene® 기술을 사용해 생성하였다(Valenzuela 등, 2003). Lepr ^hu/hu 마우스는 체중, 체성분, 인슐린 감수성 및 혈청 렙틴 수준에 있어서 Lepr ^+/+ 마우스와 차이를 나타내지 않는다(도 10b, 도 10c 및 도 10d).

렙틴 결핍증의 마우스 모델은, 순환하는 내인성 마우스 렙틴을 격리시키기 위해 hFc-태그된 마우스 Lepr 엑토도메인(mLeprECD)을 암호화하고, 이에 따라 렙틴 싱크로서 작용하여 렙틴 신호전달을 방지하는 플라스미드의 유체 역학적 DNA 전달(HDD)에 의해 개발하였다. mLeprECD의 HDD 이후, 먹이를 먹은 C57BL/6N 마우스는 대조군 hFc를 HDD로 투여한 마우스에 비해 체중이 급격히 불어났고, HDD 후 3일차에서 시작하여 상당히 증가하였다(도 11a). 연구 종료 시(HDD 후 10일차), 체중은 mLeprECD의 HDD 이후 24%만큼 증가한 반면, 대조군에서는 3%의 적은 증가만이 관찰되었다(도 11a). 체중 데이터와 정렬해 보면, 대조군과 비교했을 때, mLeprECD의 HDD 이후 누적 음식 섭취량은 HDD 후 3일차에 시작하여 상당히 증가하였다(도 11a). 체중 증가가 지방 과다의 증가를 반영했음을 확인하기 위해, HDD 후 7일차에 마이크로-CT 영상촬영을 수행하였고, 그 결과 대조군과 비교했을 때, mLeprECD의 HDD 이후 체지방량이 2배로 상당히 증가한 것으로 나타났다(도 11b). 다른 모든 체성분 파라미터들은 군 사이에서 유사하였다(도 11b).

H4H17319P2의 생체 내 효능을 평가하기 위해, 먹이를 먹인 수컷과 암컷 Lepr ^hu/hu 마우스에서 mLeprECD의 HDD에 의해 렙틴 결핍증을 유도하였다. 예상대로, mLeprECD의 발현은 수컷과 암컷 Lepr ^hu/hu 마우스 모두에서 급격한 체중 증가를 촉진하였다(도 9a 및 12a). HDD 후 7일차에, 상대적인 체중 변화율을 기준으로 Lepr ^hu/hu 마우스를 나누고, 10 mg/kg의 대조군 또는 H4H17319P2를 1회 SC 투여하였다. 대조군 단클론 항체(이하, 대조군 mAb)를 투여한 수컷 및 암컷 마우스 모두는 지속적으로 체중이 증가하였는데, HDD 후 14일차에는 각각 40.5 ± 2.7% 및 44.1 ± 4.7%의 체중이 증가하였다(도 9a 및 도 11a). 대조적으로, LEPR 작용제 단클론 항체의 1회 투여량으로 치료한 마우스는 체중이 감소하여, HDD 이전 이들의 초기 체중 수준으로 복귀하였다(도 9a 및 도 11a). H4H17319P2는 인간 LEPR에 결합하지만 마우스 LEPR에 결합하지 않기 때문에, 렙틴을 격리시키는 mLeprECD의 능력을 방해하는 LEPR mAb에 있어서 체중 개선은 부차적인 것일 가능성을 배제할 수 있다. 체중 감소는 음식 섭취 감소와 관련이 있었다(도 9a 및 도 11a). 투여 이전에는 일상적인 먹이 섭취가 두 군 사이에 다르지 않았지만, H4H17319P2로 치료한 마우스는 대조군 단클론 항체 군과 비교했을 때 음식 섭취가 상당한 낮아진 것으로 나타났다(도 9a 및 11a). H4H17319P2를 1회 투여한 후 관찰된 체중 및 음식 섭취 저하 효과는 결국 줄어들었다. 대조군 단클론 항체가 투여된 마우스에 비해 H4H17319P2로 치료한 수컷 및 암컷 마우스에서는 치료 후 각각 12일 및 9일(19일차 및 16일차)이 될 때까지 음식 섭취가 상당히 낮은 상태로 유지되었다(도 9a 및 11a). H4H17319P2로 치료한 수컷 및 암컷 마우스 모두의 체중은 치료 후 16일차 및 13일차(23일차 및 20일차)까지 이들의 베이스라인 체중과 유사하게 유지되었으며, 그 후 체중이 증가하였다(도 9a 및 도 11a).

H4H17319P2 치료에 의해 유도된 체중 감소는 지방 과다와 제지방량의 감소를 반영하였다. 마이크로-CT 분석을 통해, HDD 이전인 -1일차 및 치료 이전인 6일차에, 수컷 또는 암컷 마우스의 모든 치료군이 유사한 체성분을 나타냈음을 밝혀냈다(도 9b, 12b 및 12c). 유도된 렙틴 결핍과 일관되게, 6일차에 모든 군이 HDD 전인 -1일차에 비해 체지방량과 제지방량의 상당한 증가를 나타냈지만, 골량은 증가하지 않았다(도 9b, 도 12b 및 도 12c). 치료 6일 후(13일차), 대조군 단클론 항체-투여 마우스는 6일차에 비해 체지방량이 더 증가한 것으로 나타난 반면, H4H17319P2 치료 후에는 지방 과다증의 추가적인 증가가 검출되지 않았다. 체중 변화와 일관되게, 치료 7일 후에, H4H17319P2-치료 마우스에서 체지방량과 제지방량 모두가 대조군 단클론 항체-투여 마우스에 비해 감소했다. 골량, 골 무기질 또는 골 밀도에 대한 관련 치료 효과는 관찰되지 않았다(도 12b 및 123c).

다음으로, 렙틴 결핍증 유도 마우스에서 순환하는 지질을 변경시키는 능력에 대해 H4H17319P2를 평가하였다. 플라즈마 화학 검정을 통해, H4H17319P2가 치료 6일 후에 대조군 단클론 항체 투여 수컷 마우스와 비교했을 때, 순환하는 혈장 중성지방 및 총 콜레스테롤(HDL 콜레스테롤(HDL-C) 및 LDL 콜레스테롤(LDL-C) 포함)을 저하시킨다는 것을 밝혀냈다(도 9c).

렙틴이 렙틴 결핍증 ob/ob 마우스에서 에너지 소모를 촉진한다는 점을 감안하여(Halaas 등, 1995; Pelleymounter 등, 1995), 유도된 렙틴 결핍증에서 음식 섭취 감소가 H4H17319P2의 체중 저하 효과를 완전히 설명하는지 여부를 명확히 하기 위해 짝지워 먹이기(pair-feeding)의 효과를 평가하였다. 유도된 렙틴 결핍증 Lepr ^hu/hu 마우스는 HDD에 의해 대조군 벡터가 투여된 Lepr ^hu/hu 마우스에 비해 체중이 빨리 늘었고, 이상 식욕 항진 상태였다(도 13a). 7 및 13일차의 투여 후, 대조군 단클론 항체가 투여된 마우스는 더 많은 음식을 소비하여 체중이 늘어난 반면, H4H17319P2-치료 마우스의 경우는 음식 섭취가 줄었고 체중이 감소하였다(도 13a). 짝지워 먹이기도 mLeprECD를 발현하는 Lepr ^hu/hu 마우스에서 체중 감소를 촉진하였다. 주목할 점은, 짝지워 먹인 마우스는 H4H17319P2-치료 마우스와 동일한 양의 음식을 소비했지만 동일한 정도의 체중 손실을 나타내지는 않았다(도 13a). 이러한 데이터와 일관되게, 대조군 단클론 항체가 투여된 마우스와 비교했을 때, 짝지워 먹인 마우스에서 지방 과다증이 감소하였지만, H4H17319P2로 치료한 마우스에서의 지방 과다증 감소보다 훨씬 더 많이 감소했다(도 13b). 대조적으로, 대조군 단클론 항체가 투여된 렙틴 결핍 마우스에 비해, 짝지워 먹이기와 H4H17319P2 치료 사이에서 제지방량 감소에 대한 유사한 효과가 관찰되었다(도 13b). 골량, 골 밀도 또는 골 무기질에 대해서는 아무런 효과가 관찰되지 않았다(도 13b).

렙틴은 렙틴 결핍 ob/ob 마우스에서 인슐린 감수성도 개선한다(Muzzin 등, 1996; Pelleymounter 등, 1995). 따라서, 인슐린 감수성에 대한 H4H17319P2 치료와 짝지워 먹이기의 상대적 효과는 유도된 렙틴 결핍증 이후에 결정하였다. 인슐린 내성 시험은 단클론 항체 투여 또는 짝지워 먹이기로부터 3일 후에 수행하였다. 도 13c에 도시된 바와 같이, mLeprECD를 발현하는, 대조군 단클론 항체가 투여된 Lepr ^hu/hu 마우스는 HDD를 통해 대조군 벡터가 투여된 Lepr ^hu/hu 마우스와 비교했을 때, 인슐린 감수성의 감소를 나타낸다. 특히, H4H17319P2에 의한 치료는 인슐린 감수성을 복구시킨 반면, 짝지워 먹이기는 렙틴 결핍을 유도한 Lepr ^hu/hu 마우스에서 아무런 효과가 없었다(도 13c).

마지막으로, 주로 음식 섭취량을 감소시킴으로써 순환하는 지질을 낮추는 H4H17319P2의 효과를 확인하였다. 렙틴 결핍증에서, H4H17319P2가 혈장 중성지방을 상당히 낮추고 짝지워 먹이기는 그렇지 않았지만, H4H17319P2와 짝지워 먹이기 둘 다는 총 혈장 콜레스테롤과 HDL-C를 감소시켰다(도 13d).

요약하면, 데이터는 유도된 렙틴 결핍증 모델에서 H4H17319P2가 이상 식욕 항진증과 비만증을 역전시킬 뿐만 아니라 인슐린 저항성도 개선시킨다는 것을 입증한다. 참고로, 음식 섭취량의 감소가 H4H17319P2에 의해 관찰된 체중 및 지방 과다증의 저하에 기여하지만, 식품 섭취량의 감소는 인슐린 감수성을 개선하거나 혈장 중성지방 수준을 낮추기에는 충분하지 않다.

실시예 16: H4H17319P2는 지방이영양증 마우스에서 고혈당증, 인슐린 저항성, 이상지질혈증 및 간성 지방증을 역전시킨다.

다음으로, H4H17319P2가 전신 지방이영양증으로 인한 2차 저렙틴증에 걸린 마우스에서 이상 식욕 항진증, 대사 기능장애 및 간 지방증을 완화시키는지 여부를 결정하기 위해 이를 시험하였다. 이 가설을 시험하기 위해, 전신 지방이영양증의 특징인 표현형 특성을 생성하는 aP2-nSrebp1c ^Tg/+ 마우스(Shimomura 등, 1998)를 Lepr ^hu/hu 마우스와 교배시켰다. aP2-nSrebp1c ^Tg/+ 마우스는 aP2 프로모터를 통해 지방 조직에서 핵 Srebp1c를 발현하며, 전신 지방이영양증에서의 낮은 렙틴 수준으로 인한 대사 합병증을 렙틴이 해결한다는 첫 번째 증거를 제공한 고전적인 실험에 사용되었다(Shimomura 등, 1999). 수컷 aP2-nSrebp1c ^Tg/+ ;Lepr ^hu/hu 마우스(Tg) 마우스는 aP2-nSrebp1c ^+/+ ;Lepr ^hu/hu (nonTg) 동물보다 더 무거웠다(도 15a). 그러나, 이전 보고와 일관되게, Tg 마우스는 nonTg 마우스와 비교했을 때 지방 과다증의 감소 및 렙틴 수준 저하를 나타낸다(도 15a). aP2-nSrebp1c ^Tg/+ ;Lepr ^hu/hu 마우스 또한 nonTG 마우스에 비해 현저한 인슐린 저항성 및, 중성지방, 총 콜레스테롤 및 LDL-C의 혈장 수준 증가를 수반하는 경미한 이상지질혈증을 나타낸다(도 15b 및 15c).

수컷 지방이영양증 Tg 마우스에게 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체 또는 H4H17319P2를 매주 1회 (SC) 투여하였다. 추가로, 수컷 nonTg 마우스에게도 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체를 매주 1회 (SC) 투여하여, 야생형 대사 파라미터에 대한 기준으로 삼았다. 치료 전인 0일차에, Tg 마우스는 nonTG 마우스에 비해 상당히 체중이 높은 것으로 나타났다(도 14a). 치료 개시 3일 후에, H4H17319P2가 투여되는 지방이영양증 마우스의 체중은 대조군 단클론 항체를 투여한 지방이영양증 마우스보다 상당히 낮았다(도 14a). 따라서, 대조군 단클론 항체가 투여된 Tg 마우스는 이상 식욕 항진 상태이고, 대조군 단클론 항체가 투여된 비-지방이영양증 nonTg 마우스보다 더 많은 음식을 소비하였다(도 14a). 그러나, H4H17319P2로 치료한 Tg 마우스는 대조군 단클론 항체가 투여된 Tg 마우스보다 더 적은 음식을 소비하였다(도 14a).

관찰된 체중 변화에 대한 근거를 결정하기 위해, 마이크로-CT에 의해 체성분을 정량화하였다. 이들 분석을 통해, 제지방량(lean mass) 차이가 주로 유전자형과 치료 사이에서 체중 변화를 설명한다는 것을 밝혀냈다. 치료 전에(-5일차), 제지방량은 nonTG 마우스와 비교했을 때, 지방이영양증 Tg 마우스에서 상당히 상승하였다(도 14b). 반대로, 투여 이전에(-5일차) Tg 마우스는 nonTg 마우스에 비해 체지방량이 감소했다(도 14b). 주당 1회씩 4주 투여 후, H4H17319P2는 대조군 단클론 항체가 투여된 Tg 마우스의 체지방량 및 제지방량에 비해 Tg 마우스에서 체지방량 및 제지방량을 상당히 낮추었다(도 14b). 골량 및 골 무기질은 야생형 마우스에 비해 Tg 마우스에서 상승하였지만, 투여 전의 전체 치료 군에서는 상당히 상승하지 않앗다(도 16a). 또한, 대조군 단클론 항체 또는 H4H17319P2를 투여한 지방이영양증 마우스에서는 골량 또는 골 무기물의 차이가 관찰되지 않았다(도 16a). 유사하게, 골 밀도에 대해서는 상당한 유전자형- 또는 치료 관련 효과가 검출되지 않았다(도 16a). 이들 데이터는 H4H17319P2가 지방이영양증 마우스에서 제지방량 및 체지방량을 감소시키지만, 골량, 골 무기질 또는 골 밀도에는 영향을 미치지 않음을 보여준다.

이전 소견에 따르면, 치료 이전 0일차에 지방이영양증 Tg 마우스는 nonTg 마우스와 비교했을 때 현저한 고혈당증을 나타냈다(도 14c). H4H17319P2로 치료한 지 3일 후에, 자유롭게 먹인 경우의 혈당 수준은 Tg 마우스에서 정상이 되었고, nonTg 마우스의 혈당 수준과 다르지 않았다. 참고로, 주 1회 H4H17319P2로 처리한 Tg 마우스는 연구의 종료 시까지 정상 혈당을 유지한 반면, 대조군 항체를 투여한 Tg 마우스는 연구 전반에 걸쳐 고혈당을 유지하였다(도 14c). 상응하여, 28일차에는 미리 치료하였거나 대조군 단클론 항체를 투여한 경우와 비교했을 때, 헤모글로빈 A1c(HbA1c) 백분율 수준이 지방이영양증 마우스에서 감소하였다(도 14c). 또한, H4H17319P2 치료에 의한 혈당 수준의 저하는 인슐린 감수성 개선과 관련이 있었다. 23일차에, 인슐린 내성 시험은 대조군 단클론 항체가 투여된 지방이영양증 마우스가 인슐린 저항성인 반면, H4H17319P2로 치료한 지방이영양증 마우스는 대조군 단클론 항체가 투여된 nonTg 마우스만큼 인슐린에 민감하다는 것을 나타냈다(도 14d). 전반적으로, 이들 결과는 H4H17319P2가 전신 지방이영양증의 마우스 모델에서 고혈당증과 인슐린 감수성을 완화하고, HbA1c 수준을 낮춘다는 것을 입증한다.

연구 종료 시(28일차) 실시된 플라즈마 화학 검정은, H4H17319P2가 전신 지방이영양증 마우스에서 고중성지방혈증과 고콜레스테롤혈증을 감소시켰다는 추가로 밝혀냈다. 임상시험 종료 시, 중성지방의 혈장 수준, 총 콜레스테롤 및 LDL-C 수준은 똑 같이 대조군 단클론 항체를 투여한 nonTg 마우스와 비교했을 때, 대조군 단클론 항체를 투여한 Tg 마우스에서 상당히 상승하였다(도 1e). 특히, 혈장 중성지방 및 콜레스테롤 수치는 H4H17319P2로 치료한 Tg 마우스에서 상당히 낮았다. 따라서, H4H17319P2는 전신 지방이영양증 마우스에서 이상지질혈증을 개선시킨다.

당뇨병, 인슐린 저항성 및 이상지질혈증 이외에, 비알코올성 지방간 질환(간 지방증 포함)이 전신 및 부분 지방이영양증 환자에서 발생할 수 있다. 따라서, 지방이영양증 마우스에서 H4H17319P2가 간 효소 수준, 간 중량 및 간 지방증에 미치는 효과를 조사하였다. 28일차에, 대조군 단클론 항체가 투여된 Tg 마우스는 H4H17319P2-치료 Tg 마우스 또는 대조군 단클론 항체가 투여된 nonTg 마우스와 비교했을 때, ALT 또는 AST의 순환하는 수준을 상당히 증가시키는 것으로 나타났다(도 14f). 중요하게는, 개선된 간 효소 프로파일은 간 중량 및 간 지방증에 대한 유익한 효과와 관련이 있었다(도 14g). 구체적으로, 대조군 단클론 항체가 투여되는 지방이영양증 마우스의 간이 대조군 단클론 항체가 투여되는 nonTg 마우스의 간보다 상당히 무거웠고, 그 무게는 3.6 ± 0.7g이었다(도 14g). 또한, 대조군 단클론 항체가 투여된 Tg 마우스의 간은 대조군 단클론 항체가 투여된 nonTg 마우스 및 H4H17319P2로 치료된 지방이영양증 마우스와 비교했을 때 중성지방 함량이 더 높았다(도 14g). 특히, H4H17319P2로 치료한 Tg 마우스의 간은 대조군 단클론 항체가 투여되는 nonTg 마우스의 간과 비교했을 때, 겨우 0.6 ± 0.1 g 더 무거웠고 간 중성지방 함량의 증가는 나타내지 않았다(도 14g). H4H17319P2에 의한 간 지방증의 개선은 헤마톡실린 및 에오신 염색된 간 절편에서도 입증되었다(도 14g).

실시예 17: H4H17319P2는 시상하부 STAT3 신호 전달을 활성화한다

시상하부 궁상핵(Arc)에서의 LEPR 활성화는 에너지 및 대사 균형을 조절하는 데 있어서 중추적 역할을 한다(Coppari 등, 2005; Cowley 등, 2001). H4H17319P2는 지방이영양증 Lepr ^hu/hu 마우스에서 이상 식욕 항진증과 대사 합병증을 완화시키므로, H4H17319P2가 렙틴과 흡사한 Arc에서 STAT3 활성화를 유도하는지 여부를 추가로 조사하였다. pSTAT3 Y705에 대한 면역염색은, 10 mg/kg의 대조군 또는 H4H17319P2를 1회 투여하였거나 (SC), 30 μg/d의 인간 렙틴의 3일 동안 연속 주입한(SC) 수컷 지방이영양증 Tg 마우스로부터 수득한 일치하는 뇌 절편을 이용해 수행하였다. 렙틴 투여량을 선택하였는데, 이는 이전의 작업에서 5 μg/d(SC)가 지방이영양증 마우스에 효과가 있는 것으로 나타났고(Shimomura 등, 1999), 마우스에서의 최대 효능이 10 내지 42 μg/d(SC)에서 관찰되었기 때문이다(Denroche 등, 2013; Halaas 등, 1997; Harris 등, 1998). 이들 분석을 통해, 대조군 단클론 항체가 투여된 지방이영양증 마우스에서 pSTAT3 Y705 염색을 나타내는 세포가 Arc 내에 얼마 되지 않는 다는 것을 밝혀냈다. 대조적으로, 렙틴과 H4H17319P2는 Arc에서 pSTAT3 Y705를 유도하는데, 유사한 수의 pSTAT3 Y705⁺ 세포가 검출된다(도 17a). 비록 초기에는 Arc에 주목했지만(렙틴의 작용을 매개하는 이의 확립된 역할; 및 혈액 뇌 장벽이 없는 정중융기(median eminence)에 밀접한 이의 위치를 주목함), 렙틴과 H4H17319P2 둘 다가 Vmh에서 pSTAT3 Y705를 유도한다는 것에 주목했다. 그러나, H4H17319P2는 렙틴 치료를 통해 검출된 것보다 훨씬 더 많은 수의 Vmh 세포에서 pSTAT3 염색을 유도하였다(도 17a). 요약하면, 이들 데이터는, 렙틴 및 H4H17319P2가 아크 내의 유사한 수의 세포에서 pSTAT3 Y705를 유도하는 반면, H4H17319P2는 Vmh에서 더욱 두드러진 효과를 가졌음을 나타낸다.

CNS 치료제로서 단클론 항체의 단점은 혈액 뇌 장벽을 가로지르는 능력이 제한적이라는 것인데, 순환하는 농축물의 약 0.1%가 CSF에서 검출된다(Zuchero 등, 2016). 이러한 제한에도 불구하고, H4H17319P2는 시상하부 Arc에서 STAT3 인산화를 유도할 뿐만 아니라, Vmh에서 STAT3 신호 전달을 자극하는 것으로 본원에서 결정된다. Arc는 천공된 혈관에 의해 세척되는 것으로 보고되고 있지만, 인접한 정중융기보다는 더 적은 정도이다(Ciofi 등, 2009; Norsted 등, 2008). 현재로서는, Vmh가 혈액 매개 분자에 직접 노출될 수 있는 특별한 것이라는 문헌 증거는 없다. 이론에 구속되기를 바라지는 않지만, 가능한 설명은 단클론 항체가 확산에 의해 Arc로부터 Vmh에 도달한다는 것이다. 대안적으로, H4H17319P2 항체는 렙틴보다 차등 신호전달 특성을 나타낼 수 있다. 기능적 LEPR-b가 Vmh에서 발현되지만, 또 다른 가능성은 H4H17319P2 단클론 항체가 Vmh STAT3 신호전달을 간접적으로 자극할 수 있다는 것이다. 그럼에도 불구하고, H4H17319P2가 렙틴보다 Vmh 내의 더 많은 뉴런에서 STAT3 신호전달을 유도하는 것으로 예상되지는 않는다.

실시예 18: H4H17319P2는 지방이영양증 마우스에서 대사 및 간 기능장애를 경감시키는 데 적어도 렙틴만큼 효능이 있다.

H4H17319P2가 Arc와 Vmh 세포에서 렙틴과 유사하게 또는 더 양호하게 STAT3 신호전달에 관여하므로, H4H17319P2와 렙틴 치료의 효능을 지방이영영증 마우스에서 비교하였다. 수컷 Tg 마우스에게 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체 또는 LEPR 작용제를 주 1회 투여하거나(SC), 30 μg/d의 렙틴을 14일 동안 연속 주입하였다(SC). 참고를 위해, 수컷 nonTg 마우스에게도 10 mg/kg의 대조군 단클론 항체를 매주 1회 (SC) 투여하였다. 치료 전인 0일차에, Tg 마우스는 현저하게 고혈당 상태였다(도 17b). H4H17319P2 투여 또는 렙틴 주입에 의해 혈당 수준은 대조군 단클론 항체 투여와 비교했을 때 동일한 수준으로 낮아졌다(도 17b). H4H17319P2 또는 렙틴 치료 개시 후 2일차에 혈당 수준은 감소하였고, 연구 종료 시까지 낮아진 상태를 유지하였다(도 17b). 인슐린 감수성의 개선이 혈당 저하 효과에 기여하는지 시험하기 위해, 9일차에 인슐린 내성 시험을 수행하였다. 실제로, 인슐린 내성 시험을 통해, 대조군 단클론 항체가 투여된 Tg 마우스는 인슐린 저항성인 반면, H4H17319P2 및 렙틴으로 치료한 Tg 마우스는 인슐린 감수성인 것이 밝혀졌다(도 17b). 혈당 저하 또는 인슐린 감수성에 미치는 영향은 H4H17319P2 치료와 렙틴 치료 사이에 차이가 관찰되지 않았다.

이전 데이터와 일관되게, H4H17319P2는 지방이영양증 마우스에서 대조군 단클론 항체 투여에 비해 치료 후 4일차부터 상당한 체중 감소를 촉진하였다(도 17c). Tg 마우스에서, H4H17319P2는 대조군 단클론 항체와 비교했을 때 누적 음식 섭취량을 감소시켰다(도 17c). 흥미롭게도, 렙틴은 Tg 마우스에서 체중과 음식 섭취량을 저하시켰지만, 이는 H4H17319P2 처리를 통해 관찰된 것보다는 체중을 덜 감소시켰다(도 17c),

H4H17319P2는 렙틴에 비해, 지방이영양증 마우스에서 혈장 지질의 감소시키고 간 비대증을 제거하는 데 있어서 더 나은 이익을 제공하였다. 13일차의 혈장 화학 검증을 통해, H4H17319P2가 대조군 단클론 항체와 비교했을 때, Tg 마우스에서 혈장 중성지방과 콜레스테롤 수준을 저하시켰지만, 렙틴은 그렇지 않은 것으로 나타났다(도 17d). H4H17319P2 치료가 대조군 단클론 항체 투여와 비교했을 때, Tg 마우스에서 다른 지질을 유의하게 변화시킨 것은 확인되지 않았다. 또한, H4H17319P2는 대조군 항체 치료와 비교했을 때, Tg 마우스에서 간 중량을 낮추고 간 지방증을 회복시켰다(도 17e). 이들 효과는 렙틴 치료 마우스에서도 유사하지만, H4H17319P2의 경우에 간 중량의 더 큰 감소가 관찰되었다(도 17e). 간 중량은 H4H17319P2에 의해 정상이 되었고, 대조군 단클론 항체가 투여된 nonTg 마우스에서 간 중량도 유사했지만, 렙틴 치료 시에는 그렇게 되지 않았다(도 17e).

실시예 19: H4H17319P2는 마른 마우스 및 정상 원숭이 및 고 체지방 원숭이에서 체중 및 지방 과다증을 감소시킨다.

시험관 내 결합 및 기능 검정 실험은, H4H17319P2가 렙틴 결합을 위해 경쟁하지 않고, 렙틴의 존재 시 렙틴 단독보다 LEPR의 활성화를 더 크게 유도함을 입증한다. 따라서, H4H17319P2가 정상적인 체중 항상성의 상태에서 체중 저하를 유발할 수 있는지 여부를 결정하였다. 먹이를 먹인 수컷 Lepr ^hu/hu 마우스에게 대조군 단클론 항체(10 mg/kg, SC) 또는 3 또는 10 mg/kg의 H4H17319P2를 1회 투여량으로 0일차에 투여하였다. 대조군 단클론 항체와 비교했을 때, 두 가지 투여량의 H4H17319P2로 치료한 후 1일 및 2일차에 상당한 체중 감소가 관찰되었다(도 18a). 따라서, H4H17319P2의 두 가지 투여량 수준은 대조군 단클론 항체 투여에 비해 음식 섭취를 감소시켰다(도 18a). 체중 변화는 체지방량의 저하와 관련이 있었지만, 제지방과는 관련이 없었다(도 18b). 두 가지 투여량 수준 모두에서, H4H17319P2 치료는 체지방량의 -32% 감소를 유도한 반면, 대조군 단클론 항체 투여는 체지방량을 최소로 -2% 변화시켰다(도 18b). 주목할 것은, 대조군 단클론 항체와 H4H17319P2 치료 간에는 제지방량에 미치는 유의한 차이가 관찰되지 않았다(도 18b). H4H17319P2의 두 가지 투여량 수준은 체중과 체지방량을 유사한 정도로 변화시켰고, 효과의 지속시간은 차이가 있었는데, 약동학의 차이를 반영한 것으로 보인다(도 18a 및 18b).

다음으로, 비인간 영장류에서 체중 저하를 촉진하는 데 H4H17319P2 치료가 미치는 효과를 평가하였다. 먼저, H4H17319P2가 마른 시노몰구스 원숭이의 체중에 미치는 영향을 결정하였다. 원숭이에게 대조군 용액, H4H17319P2 3 mg/kg 또는 10 mg/kg 중 한 가지를 13주 동안 주 1회 투여하였다. H4H17319P2 치료는 대조군 용액을 투여한 원숭이에 비해 투여량 의존적으로 체중을 감소시켰다(도 18c). 13주의 연구 후, 대조군 용액을 투여한 원숭이는 초기 체중보다 9.7±0.9%가 증가한 반면, 3 및 10 mg/kg의 H4H17319P2로 치료한 경우 각각 최소 0.3±1.6% 체중 변화 및 -6.0±1.6%의 체중 감소가 일어났다(도 18c).

H4H17319P2가 마른 원숭이에서 투여량 의존적으로 체중을 감소시켰으므로, 고 체지방 시노몰구스 원숭이에서 체중 및 체성분에 H4H17319P2 치료가 미치는 효과를 시험하였다. 동물에게 대조군 용액 또는 30 mg/kg의 LEPR 작용제 항체를 2주 동안 주 1회 투여하였다. H4H17319P2는 대조군 용액을 주입한 경우에 비교했을 때 체중을 감소시켰다. 연구 종료 시(56일차), 두 가지 투여량의 H4H17319P2를 투여한 원숭이는 베이스라인 대비 3.6±1.9%의 체중 감소를 나타낸 반면, 대조군 용액을 투여한 원숭이는 6.4±1.5%의 체중이 늘었다. 병행하여, H4H17319P2 치료는 이중 에너지 X-선 흡수계측법(DEXA)에 의해 정량화했을 때, 대조군 용액 투여에 비해 체지방량을 감소시켰지만, 제지방량은 감소시키지 않았다(도 18d). 대조군 용액이 투여된 원숭이는 연구의 종료 무렵에 지방 과다증에서 28.0±1.5% 증가를 나타냈다. 대조적으로, LEPR 작용제 H4H17319P2로 치료한 원숭이는 지방 과다증에서 현저한 13.7±6.4% 감소를 나타냈다(도 18d). 종합하면, 이들 데이터는 H4H17319P2 항체가 정상 체중의 Lepr ^hu/hu 마우스 및 마른 비인간 동물 영장류와 고 체지방 비인간 동물 영장류 모두에서 선택적 지방 과다증 감소를 통해 체중 저하를 촉진함을 보여준다.

실시예 20: 항-LEPR 항체를 사용하는 인간에서의 이중 맹검 연구

비만증은 세계적으로 13%의 인류에게 영향을 미치며, 2형 당뇨병, 심혈관 질환, 다양한 유형의 암 및 정형외과적 장애를 발생시키는 위험 인자이다. 서유럽의 국가들에서는, 비만인 사람이 20%가 넘고(Ng 등의 Lancet. 2014; 384: 766-781), 미국에서는 비만 유병률이 이제 35%를 넘었다(Flegal 등의 JAMA. American Medical Association. 2016; 315(21): 2284-2291). 식단과 운동을 바꾸는 것은 일부 개인에서 효과적이지만, 대개는 체중이 약간 감소하고 대부분의 사람들은 비만인 상태로(체질량 지수[BMI] ≥30kg/m²로 정의됨) 또는 과체중 상태로(25 내지 <30 kg/m²의 BMI로 정의됨) 남게 된다.

현재의 체중 감량 약물도 체중에 약간의 영향을 미치고/미치거나 안전성/내약성이 좋지 않아 구매자, 의사 및 환자가 이러한 개입을 제한적으로 받아들이는 결과를 낳았다(Zhang 등, Obes Sci Pract. 2016; 2(2): 104-114). 리라글루타이드, 올리스타트, 날트렉손 HCl/부프로피온 HCl, 펜터민/토피라메이트 및 로카세린 HCl과 같은 현재 표준 치료 약물 요법은 베이스라인 대비 평균적으로 약 3 내지 10%만큼 체중을 감소시킨다. 일반적으로, 체중 감량 정체와 치료는 1년 이내에 중단된다(Sjostrom 등, Lancet. 1998;352(9123):167-72) (Smith 등, N. Engl. J. Med. 2010; 363(3):245-56). 비만 수술은 가장 심각한 비만 환자들만을 (BMI ≥40 kg/m² 또는 동방이환을 동반하는 BMI ≥35 kg/m²) 위해 예비된 수단이며, 미국에서는 매년 20만 건 미만의 사례가 있고(American Society for Metabolic and Bariatric Surgery) 유럽 전역에서는 매년 15만 건에 달하는 사례가 있다(Angrisani 등, Obes Surg. 2017, 27:2279-2289). 비만 및 비만 관련 대사 합병증의 치료 및 예방을 위한 안전하고 효과적인 치료제에 대한 충족되지 않은 의학적 요구가 상당히 존재한다.

렙틴은 시상하부에서의 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하고 음식 섭취, 에너지 소비, 및 포도당/지질 대사의 통제를 조절하는 순환하는 지방 유래의 호르몬이다(Allison 등, J Endocrinol 2014, 223(1):T25-35). 렙틴(LEP) 유전자에서 극히 희귀한 동형접합성 기능 상실 돌연변이에 의한 1차 렙틴 결핍증을 갖거나, LEPR에서 동형접합성 돌연변이에 의한 렙틴 신호전달 결함을 갖는 개인에서는 심각한 비만증, 당뇨병, 감염증에 대한 취약성 및 불임이 발생한다(Montague 등, Nature 1997, 387(6636):903-908) (Clement 등, Nature 1998, 392(6674):398-401). 렙틴 기능 상실 돌연변이로 인한 단성 비만증을 가진 소아 및 성인 환자에게 재조합 인간 렙틴을 투여한 결과 체중이 안정적으로 감소하고 대사 합병증이 개선되었다(Farooqi 등, N Engl Jo Med 1999, 341(12):879-884) (Licinio 등, Proc Nat Acad Sci 2004, 101(13):4531-4536).

2차 렙틴 결핍증은 희귀한 지방이영양증 장애에서도 발생하는데, 이는 신체의 다양한 영역에서 렙틴 생산 지방 조직의 유전적 또는 후천적 상실로 인해 유발된다.

전신성 또는 부분 지방이영양증 환자에서는 다양한 등급의 당뇨병, 심각한 인슐린 저항성, 고 중성지방 혈증 및 지방간이 발병한다(Brown 외, J Clin Endocrinol Metab. 2016; 101(12):4500-4511). 재조합 인간 렙틴을 매일 1회 피하 전달한 결과 전신성 지방이영양증 환자에서 헤모글로빈 A1c(HbA1c), 혈당, 중성지방 및 간 지방증이 감소하는 것으로 나타났다(Oral 등, N Engl J Med. 2002; 346(8):570-578) (Ebihara 등, J Clin Endocrinol Metab 2007, 92(2):532-541). 전신성 지방이영양증 환자의 대부분은 혈청 렙틴의 수준이 <4 ng/mL이었고, 하위집합 검정은 렙틴 수준이 <4 ng/mL일 때 전신성 및 부분 지방이영양증 환자에서 렙틴 치료를 통해 HbA1c 및 중성지방(TG)의 감소가 더 컸음을 시사하였다(Brown 외, J Clin Endocrinol Metab. 2016; 101(12):4500-4511) (FDA Advisory Committee Meeting 2013).

메트렐렙틴(재조합 메티오닐 렙틴; Novelion®)은 현재 전신성 선천성 및 후천성 지방이영양증 환자에서 렙틴 결핍증의 합병증 치료용으로 Risk Evaluation and Mitigation Strategies(REMS) 프로그램에 의거 미국에서 승인되었으며, 일본에서도 지방이영양증의 모든 하위 유형에 대해 승인 되었다. 메트렐렙틴은 매일 투여해야 하며 부작용에는 면역원성의 위험이 포함되는데, 약 85%의 환자에게서 결합 항체가 생겨났고, 약 9%에서는 내인성 렙틴과 교차 반응하는 중화 항체가 생겨났다(Chan, Clin Endocrinol. 2016; 85(1):137-149).

저 렙틴증 또는 렙틴 결핍성 장애와 대조적으로, 과체중이거나 비만인 개체는 일반적으로 높은 수준의 렙틴을 갖는데, BMI가 30~35 kg/m₂ 범위인 대상체에서 렙틴 수중의 중앙값은 남성의 경우 10 ng/mL 및 여성의 경우 24 ng/mL이다(Ruhl 및 Everhart, Am J Clin Nutr. 2001; 74(3): 295-301). BMI가 20~25kg/m²로 정상인 남성 및 여성 성인의 경우 순환하는 렙틴 수준의 중앙값은 각각 3 및 9 ng/mL이며(Ruhl 등, Am J Clin Nutr 2001; 74(3): 295-301), 인용된 정상 범위는 남성의 경우 1.2 내지 9.5 ng/mL이고 여성의 경우 4.1 내지 25 ng/mL이다(Quest Lab Reference Range). BMI가 비슷한 개체 간에도 렙틴 수준에 있어서 고도의 변동성이 있음에도 불구하고(Buettner 등, J Endocrinol. 2002; 175(3): 745-756), 수많은 연구들은 순환하는 렙틴 수준과 BMI 및 체지방율 사이의 상관관계를 입증해왔다(Ruhl 등, Am J Clin Nutr. 2001, 74(3):295-301) (Considine 등, N Engl J Med. 1996, 334(5):292-295). 렙틴 수준은 하루 주기로 변하며(Gavrila 등, J Clin Endocrinol Metab. 2003, 88(6):2838-43) (Schoeller 등, J Clin Invest. 1997, 100(7):1882-87), 영양 상태를 기준으로 변동한다. 렙틴 수준은 정상 체중 개체와 및 비만 개체에서 24시간 공복 후에 35~60%만큼 빠르게 감소하고, 공복이 장기화되면 지속적으로 떨어진다(Chan 등, J Clin Invest. 2003; 111(9): 1409-1421) (Schurgin 등, 2004, J Clin Endocrinol Metab, 89(11): 5402-5409) (Boden 등, J Clin Endocrinol Metab. 1996; 81(9): 3419-3423). 또한, 렙틴 수준은 체중 감량 중에 감소하고(Considine 등, N. Engl J Med, 1996; 334(5): 292-295) (Herrick 등, J Obes. Hindawi. 2016; 2016(2): 8375828-5) (van Dielen 등, J Clin Endocrinol Metab. 2002; 87(4): 1708-1716), 체중 증가 중에 증가하여(Ravussin 등, Cell Metab. 2014; 20(4): 565-572), 체지방량 변화와 일치한다. 비만 대상체에게 재조합 인간 렙틴을 투여한 결과 체중 감소가 미미하였는데(3% PBO를 뺀 체중 감소)(Heymsfield 등, JAMA. 1999; 282(16): 1568-1575) (Hukshorn 등, J Clin Endocrinol Metab. 2000; 11(12): 1163-1172) (Ravussin 등, Obesity. 2009; 17(9): 1736-1743), 이는 높은 내인성 렙틴 수준에 의한 렙틴 수용체 신호전달의 포화로 인한 것일 수 있다. 여러 모집단 연구는, 렙틴 수치가 비교적 낮고(Ruhl 및 Everhart, Am J Clin Nutr. 2001; 74(3): 295-301) (Buettner 등, J Endocrinol. 2002; 175(3): 745-756) 렙틴 수용체가 포화되지 않을 수 있는 비만 환자의 하위 집합이 있을 수 있음을 시사한다. 해결해야 할 핵심 질문은, 렙틴 신호전달의 복구가 상대적으로 낮은 베이스라인 렙틴 수준을 가진 비만 대상체에서 식욕, 음식 섭취량 및 체중을 감소시키는 지 여부이다.

H4H17319P2는 LEPR 작용제로서 작용하고 나노몰 단위의 친화도로 인간 LEPR에 결합하는 인간 항-LEPR 항체이다. 전임상 연구에서, H4H17319P2는 렙틴의 존재 또는 부재 시 LEPR 신호전달을 활성화한다. H4H17319P2(10 mg/kg 피하[SC])를 매주 투여한 결과, 지방이영양증 인간화 LEPR 마우스에서 혈당 조절, 인슐린 감수성, 이상지질혈증, 음식 섭취량, 체중, 간 중량 및 간 지방증이 개선되었다. H4H17319P2는 또한 유도성 렙틴 결핍증을 갖는 인간화 LEPR 마우스에서 체중 및 지방 과다증을 감소시켰지만, 식단-유도 비만 인간화 LEPR 마우스에서는 체중을 감소시키지 않았다. 마른 시노몰구스 원숭이를 13주 동안 매주 1회 H4H17319P2를 피하 주사(3, 10, 30 mg/kg) 또는 정맥 내 주사(100 mg/kg)하여 치료한 비임상시험 관리기준(GLP) 독성학 연구에서, H4H17319P2 노출은 체중 증가를 억제하거나 체중 감량을 유도하였다. H4H17319P2를 투여한 원숭이는 최대 8.7%의 체중이 줄어든 반면(투여 전 체중 대비 군 평균값), 동시에 위약을 투여한 대조군 동물은 동일한 기간에 걸쳐 평균 8.3%의 체중이 증가하였다. 관찰된 체중 감소의 크기는 H4H17319P2로 치료한 동물에서 명확한 투여량 반응 또는 노출 반응을 갖는 것으로 보이지는 않았다. 체중 변화는 무투여 회복 기간 동안 노출 중단 시 역전되는 것으로 관찰되었다.

전술한 바와 같이, H4H17319P2의 투여는 모든 투여량 수준에서 및 두 가지 투여 경로 모두에서 임의의 임상적 부작용 없이 내약성이 양호하였다. 인슐린 및 순환하는 절대 림프구 수(T 세포 수)의 일시적인 감소가 치료 기간 중 약 30일차에 관찰되었지만, 이러한 소견은 투여 기간 종료 시에는 관찰되지 않았고, 효과는 투여량 반응적은 아니었다. 치료 기간 동안 H4H17319P2 치료 군에서 흉선 중량의 감소 및 흉선 피질 세포질 감소가 관찰되었으며, 이는 회복 기간 동안 완전히 또는 부분적으로 가역적이었다. 흉선의 변화 및 T 세포 수의 일시적인 감소는 성장기에 있는 원숭이의 영양 섭취 감소 및 체중 감소와 관련이 있을 수 있고, 정상적인 영양 상태를 가진 성인 인간에서는 관찰되지 않을 가능성이 높다.

본 연구는 건강한 참가자에게 정맥 내(IV) 및 SC 투여된 H4H17319P2 투여량의 안전성, 내약성, 약동학(PK) 및 약력학(PD)을 평가하기 위해 설계된 제1 인간 임상(FIH), 무작위배정, 이중 맹검, 위약 대조형 2-파트 연구이다. 파트 A의 목적은 건강한 남성 및 여성 대상체에서 단일 점증 IV 및 SC 투여량의 안전성, 내약성, PK, 및 PD를 평가하는 것이다. 파트 A에서 PK/PD, 안전성 및 내약성에 대한 중간 분석은 파트 B에서의 평가를 위한 투여량 요법을 선택하는데 사용될 것이다. 파트 A에 등록된 대상체는 파트 B에 등록할 자격이 없다. 파트 B의 경우, 과체중 또는 비만 상태인 새로운 대상체가 등록하여, 12주 동안 H4H17319P2(단일 투여량 수준) 또는 위약의 반복 투여에 대한 안전성, 내약성, PK 및 PD를 평가하게 될 것이다. 음식 섭취, 식욕, 체성분, 및 체중과 같은 바이오마커에 H4H17319P2가 미치는 효과는 베이스라인 렙틴 수준에 의해 정의된 4개의 다른 코호트에서 평가될 것이다.

목표

본 연구의 일차 목적은 건강한 대상체에서 H4H17319P2의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이다. 연구의 이차 목적은:

H4H17319P2의 단일 및 반복 투여량의 약동학(PK) 프로파일을 특성화하고;

H4H17319P2의 반복 투여량이 체중에 미치는 효과를 추정하고;

H4H17319P2의 반복 투여량이 자유롭게 에너지를 섭취한 과체중 및 비만 대상체에게 미치는 효과를 평가하고;

H4H17319P2의 단일 및 반복 투여량이, 시간 경과에 따라 가용성 형태의 지질 조절 단백질(sLEPR 및 ANGPTL3) 수준에 미치는 효과를 평가하고;

H4H17319P2의 단일 및 반복 투여량의 면역원성을 평가하기 위한 것이다.

연구의 다른 탐색적 목적은:

1. H4H17319P2의 단일 투여량이 체중 및 혈청/혈장 혈당 및 지질 파라미터에 미치는 효과를 추정하고;

2. 12주에 걸친 H4H17319P2의 반복 투여량이 다음에 미치는 효과를 추정하기 위한 것이다:

· 혈청/혈장 혈당 및 지질 매개변수

· 섭식 행동에 영향을 줄 수 있는 환자 보고 식욕 평가(예: 배고픔, 배부름 및 포만감)

· 이중 X-선 흡수계측법(DXA) 영상촬영에 의한 총 체지방량과 제지방량 및 그 분포

· 자기 공명 영상 촬영(MRI)에 의한 SC 및 내장 지방(간 지방 포함)의 정량화

· 렙틴, 갑상선 호르몬(T3, T4, 갑상선 자극 호르몬[TSH]), 황체 형성 호르몬(LH), 테스토스테론, 에스트라디올, 코르티솔 및 아디포넥틴 등을 포함하는 기타 탐색적 바이오마커.

이론적 근거

파트 A는 단일 점증 투여량 FIH 설계로서, 최대 88명의 건강한 대상체가 최대 7개의 점증 단일 투여량 코호트(최대 5개의 IV 및 2개의 SC 코호트)로 이루어진 H4H17319P2 대 위약 코호트에 3:1로 무작위배정되어 단일 점증 투여량의 H4H17319P2의 안전성, 내약성 및 약동학을 평가하게 되고, 112일의 추적관찰 기간을 둔다. 7개의 점증 단일 투여량 코호트에는 각 투여량 수준으로 H4H17319P2 또는 위약을 투여받도록 무작위배정된 8명의 대상체(활성제 6명: 위약 2명)가 포함된다. 연구 설계에는 또한 2개의 추가적인 임의 코호트가 포함된다(각 코호트별로 H4H17319P2 또는 위약을 투여받도록 무작위배정된 16명의 대상체(활성제 12명: 위약 4명)). 점증 투여량 코호트의 중간 분석이 공변량(예: 연령, 체중 또는 성별)이 PK 프로파일에 영향을 미칠 수 있다고 시사하는 경우, 임의 코호트를 등록하여 하나 이상의 투여량(본 연구에서는 최대 투여량인 30 mg/kg IV까지)에 대한 추가 데이터를 수집하여, 공변량이 PK에 미치는 효과에 대한 더 양호한 추정치를 얻을 수 있다.

연구의 파트 A는 스크리닝 기간(-21 내지 -2일차), 대상체가 2일 동안 원내에 입원하게 되거나(안전성-감시 블록에 있는 투여량을 IV 투여 받고 SC 투여 받는 대상체의 경우), 1일 동안 원내에 체류하게 되는(SC 투여 받는 대상체의 경우) 베이스라인 전 방문(-1일차), 연구 종료 방문(113일차)을 포함하는 추적 관찰 기간(3일차 내지 113일차)으로 이루어진다.

안전성과 내약성에 대한 평가는 파트 A의 주요 목표이며, 안전성은 연구 전반에 걸쳐 신중하게 평가될 것이다. 본 연구에서 투여되는 시작 투여량 및 최대 투여량은 독성학 연구에서 관찰된 노출보다 각각 약 10,000배 및 약 20배 더 낮을 것으로 예상된다. 임상 연구 전반에 걸쳐, 안전성 평가는 활력 징후, 신체검사, 심전도(ECG), 혈액학/차이를 포함하는 실험실 시험, 및 부작용(AE) 모니터링을 포함한다. 체중 또한 평가될 것이다. 약력학 측정치도 본 연구에서 수집될 것이지만, 마른 개체에서 메트렐렙틴으로 관찰된 체중(<1kg)에 대한 최소 효과를 감안하면, 이를 기반으로 이러한 마른/과체중 대상체 모집단에서 PD 마커의 의미 있는 변화가 관찰될 것으로는 예상되지 않는다(Heymsfield, 1999).

약력학 측정치에는 체중, 대사 매개변수(포도당, 지질), 및 렙틴 및/또는 인슐린에 의해 조절될 수 있는 잠재적 마커인 ANGPTL3을 포함한다(Muniyappa, 2017) (Nidhina Haridas, 2015). 체중은 각 방문 시마다 주의 깊게 평가될 것이다. H4H17319P2 치료의 단일 투여량이 마른/과체중 대상체의 체중에 임상적으로 의미 있는 효과를 갖는 경우, 안전성/투여량 증가의 결정 시기가 변경될 수 있고, 투여량 증가 결정을 내리기 전에 추가 안전성 데이터를 수집할 수 (예를 들어, 15일차 안전성 평가를 기다릴 수) 있다.

파트 B는 과체중/비만 대상체에서 H4H17319P2의 안전성, PK 및 체중에 미치는 효과를 평가하기 위한, 12주의 치료 기간에 걸친 단일 투여량 수준의 반복 투여 연구이다. 여러 모집단 연구는, 렙틴 수치가 비교적 낮고(Ruhl, 2001) (Buettner, 2002) 렙틴 수용체가 포화되지 않을 수 있는 비만 환자 하위 집합이 있음을 시사한다. 파트 B에서 해결해야 할 핵심 질문은, 렙틴 신호전달의 복구가 상대적으로 낮은 베이스라인 렙틴 수준을 가진 과체중 또는 비만 대상체에서 식욕, 음식 섭취량 및 체중을 감소시키는 지 여부이다.

따라서, 파트 B는 다양한 체중을 갖고 베이스라인 렙틴 수준이 상대적으로 낮은 대상체에서 H4H17319P2가 체중, 음식 섭취, 대사 파라미터 및 체성분에 미치는 효과를 평가하게 된다. 과체중이거나 비만인(BMI 범위 25~40 kg/m²) 건강한 대상체가 사전 스크리닝 렙틴 수준에 의해 정의된 4개의 별개 코호트에 등록하게 된다. 4개의 별개 코호트로 등록시키는 것은 다양한 범위의 상대적으로 낮은 베이스라인 렙틴 수준 및 BMI 범위에 걸쳐 적절한 수의 대상체가 연구대상이 되도록 하기 위한 것이다. 코호트 별 구분(stratification)은 H4H17319P2 대 위약으로 무작위배정 시 이루어질 것이다. 최대 약 20명의 대상체가 4개의 코호트 각각에 등록하여, 아래에 정의된 바와 같이 최대 81명의 대상체로 이루어진 총 샘플 크기가 만들어질 것이다. 렙틴 수준 및 BMI를 사전 스크리닝 방문 시에 측정하여, 연구 자격요건 및 4개 코호트 중 1개에 대한 자격요건을 우선적으로 평가하게 될 것이다. 연구 등록은 자격요건에 대해 대상체를 스크리닝할 때 이루어지게 된다. 특정 코호트로 등록할 수 있는 최대 수에 도달한 경우, 대상체에게는 등록을 위한 자격요건이 주어지지 않는다. 일부 코호트는 렙틴 수치가 낮아서 비만 유병률이 낮기 때문에 등록을 완료하기 어려울 수 있으며; 이경우 연구 의뢰자는 특정 코호트 내에서 등록을 중지할 것을 선택할 수 있다.

파트 B 내의 4개의 코호트는 다음과 같이 정의된다:

· 코호트 1: 사전 스크리닝 BMI가 28.0 내지 40.0 kg/m²인 남성 및 여성 대상체로서, 사전 스크리닝 공복 렙틴 수준이 <5 ng/mL인 대상체를 포함한다.

· 코호트 2: 사전 스크리닝 BMI가 25.0 내지 <28 kg/m²인 남성 및 여성 대상체로서, 사전 스크리닝 공복 렙틴 수준이 <5 ng/mL일 것.

· 코호트 3: 사전 스크리닝 BMI가 28.0 내지 40.0 kg/m²인 남성 대상체로서, 사전 스크리닝 공복 렙틴 수준이 5.0 내지 8.0 ng/mL인 대상체를 포함한다.

· 코호트 4: 사전 스크리닝 BMI가 28.0 내지 40.0 kg/m²인 여성 대상체로서, 사전 스크리닝 공복 렙틴 수준이 5.0 내지 24.0 ng/mL인 대상체를 포함한다.

주: 위의 코호트 중 하나에 대한 자격요건은 사전 스크리닝 방문 시의 BMI 및 렙틴 수준을 기준으로 한다. BMI 및/또는 렙틴 수준이 코호트 별로 정의된 범위에 속하지 않는 경우, 피험자에게는 등록을 위한 자격이 주어지지 않는다. 사전 스크리닝 BMI 또는 렙틴 수준이 1개 이상의 코호트에 대한 포함 경계선에 있는 경우, 사전 스크리닝 기간 동안 BMI 및 렙틴 측정을 1회 반복할 수 있다. 반복 측정의 경우, 최저 렙틴 수준이 코호트 중 하나에 대한 포함을 결정하는 데 사용될 것이다. 특정 코호트로 등록할 수 있는 최대 수에 도달한 경우, 대상체에게는 등록을 위한 자격요건이 주어지지 않는다.

파트 A로부터 이용할 수 있는 안전성, PK 및 PD 데이터에 대한 중간 검정에 의해 파트 B의 개시가 촉발되어 파트 B에 대한 적절한 투여량, 투여 빈도, 투여 방법(IV 또는 SC)이 선택된다. 파트 A에 등록한 대상체에게는 파트 B에 등록할 자격이 주어지지 않는다. 파트 B 연구 설계는: BMI 및 공복 렙틴 수준 및 4개의 코호트 중 1개에 대한 자격요건을 평가하기 위한 사전 스크리닝 기간(-60일차 내지 -14일차); 스크리닝 기간(-32일차 내지 -14일차); 베이스라인 기간(-29일차 내지 -1일차); 치료 기간(1일차 내지 85일차); 및 치료 종료 추적 관찰 기간(107일차 내지 191일차)으로 이루어진다. 대상체는 베이스라인 기간 동안(-14일차 내지 -1일차로 예정됨) 정확한 식욕 및 자유로운 음식 섭취 평가를 위해 2일 동안 원내 입원하게 되고, 치료 기간 동안 2가지 시점(29일차 내지 30일차 및 84일차 내지 85일차)에 원내 입원하게 된다. 입원은, 표준화된 식사가 있고 식욕을 제외하고는 음식 섭취에 영향을 미칠 수 있는 요인(예를 들어, 하루 중 시간, 타인의 식습관, 식사량 등)이 최소화된 통제된 환경에서의 자유로운 취식 평가에서 정확한 칼로리 섭취량을 평가하기 위해 필요하다. 대상체는 -1일차에도 2일 동안 입원하게 될 것이다. 치료 기간 중의 1일차에, 대상체는 연구 약물 또는 위약의 제1 투여량을 투여 받게 되고, 일련의 PK 및 다른 실험실 측정을 위한 채혈을 하게 되고, 2일차의 24시간 PK 평가를 완료하기 위해 밤새 마무르게 된다.

치료 기간 중 채혈을 위한 방문은 매주 1회 이루어질 것이다. 연구 약물 투여량 및 빈도는 파트 A의 PK 데이터의 중간 분석에 의해 결정될 것이며, 4주마다 또는 2주마다(최대 투여 빈도는 매주 1회 이하임) 결정될 수 있다.

DXA에 의한 체성분 및 MRI에 의한 간, 복부 및 허벅지 지방의 정량화는 베이스라인 시점에, 치료 종료에 임박해서, 및 추적 관찰 기간 도중에 수행될 것이다. 치료 기간이 끝난 후, 대상체에게는 안전성 및 PD 효과를 평가하기 위한 16주의 약물 중단 기간이 이어지게 된다. 단일 투여량 수준의 반복 투여의 안전성 및 내약성 평가(파트 A의 안전성과 내약성에 기초함)는 연구의 파트 B의 주요 목표일 것이다. 연구 전반에 걸쳐, 안전성 평가는 활력 징후, 신체검사, ECG, 실험실 검사, AE의 모니터링을 포함할 것이다. 항약물 항체 또한 평가될 것이다. 또한, 체중 평가, 자유로운 음식 섭취 및 대사 파라미터(예컨대, 혈당 및 지질)를 평가하기 위한 2차 목표가 연구 전반에 걸쳐 주의 깊게 평가될 것이다.

파트 B의 약력학 측정은, 렙틴 수용체 신호전달의 증가로 영향을 받을 수 있는 파라미터의 베이스라인 평가 및 치료-중 평가를 포함한다. 이러한 PD 평가에는 환자 보고식 식욕 측정, 통제된 입원 환경에서의 음식 섭취의 정량 측정, DXA에 의한 체성분 및 체지방량의 정밀 측정, 보정 저울을 사용한 체중의 정밀 측정이 포함된다. 또한, 렙틴, 혈당, 인슐린, 추정 인슐린 저항성 평가의 항상성 모델(HOMA-IR), HbA1c, 지질과 같은 대사 매개변수를 기준선에서, 치료 기간 도중 및 치료 기간 종료 시에 측정하여 인슐린 감수성 및 지질 대사에 H4H17319P2이 미치는 효과를 평가하게 된다. 간의 MRI도 베이스라인 및 치료 후에 수행하여 H4H17319P2가 간 지방증에 영향을 미치는지 여부를 결정하게 될 것이다.

약력학 및 바이오마커 변수들의 이론적 근거

자유로운 음식 섭취 평가 (파트 B만 해당)

H4H17319P2에 의한 치료는 시상하부 렙틴 수용체 신호전달을 증가시키고, 섭식 거동에 영향을 주는 뉴런에 하류 효과를 가질 것이라고 가정한다. H4H17319P2 치료는 유도성 렙틴 결핍 마우스에서 먹이 섭취와 체중을 상당히 감소시켰다. 시노몰구스 원숭이의 연구에서는 정량적 음식 섭취 평가를 수행하지 않았지만, H4H17319P2 치료는 체중 및 체지방량에 상당한 영향을 미쳤다. 본 연구에서, 렙틴 수준이 상대적으로 낮은 과체중/비만 대상체의 음식 섭취에 H4H17319P2이 미치는 효과는 전술한 바와 같은(Krishna, 2009) (Addy, 2008) 엄격한 정량적 입원 환자의 자유로운 음식 섭취 평가를 사용해 베이스라인 시점 및 치료 도중의 2가지 시점에 평가될 것이다. 요약하자면, 대상체는 공복 상태로 임상 시험 유닛에 입원하게 되고, 표준화된 베이스라인 에너지 섭취를 확립하기 위해 표준화된 아침, 점심 및 저녁 식사를 제공받게 될 것이다. 밤새 공복 이후, 대상체에게는 음식/에너지 섭취를 정량화하기 위한 자유로운 아침, 점심 및 저녁 식사가 제공될 것이다. 대상체는 시간/하루 중 시간 및 사회적 단서에 대한 지각이 차단된 특별한 방에서 모든 시험 식사를 소비하게 된다.

알려진 칼로리 밀도의 식사가 식사량보다 과량으로 4~5회 제공되며, 총 소비 칼로리를 가리는 방식으로 제공될 것이다. 대상체는 본인이 원하는 만큼 많이 또는 적게 먹도록 요청을 받게 된다. 음식 섭취량을 정량화하기 위해 음식 섭취 평가 이전과 이후에 식사량을 칭량하게 되고, 섭취한 칼로리를 산출하게 된다.

식욕 평가 (파트 B만 해당)

렙틴의 식욕 효과는 그 작용 메커니즘에 있어서 중심에 있고, 따라서

H4H17319P2의 예상 작용 메커니즘의 근접 평가이다. LEP의 돌연변이 또는 전신 지방이영양증으로 인한 저렙틴증을 가진 개체는 끝없는 식욕을 드러내는데, 이는 음식 섭취와 비만증을 유발한다. 이러한 개체를 메트렐렙틴으로 치료하면 포만감이 증가하고 음식 섭취량이 감소한다(Farooqi, 1999) (Farooqi, 2007) (Farooqi, 2004). 식욕의 다양한 요인(예: 배고픔, 포만감)을 측정하는 설문(Flint, 2000) (Dalton, 2015)을 사용하여 식욕에 H4H17319P2이 미치는 효과를 베이스라인 시점과 추적 관찰 동안에 측정하게 된다.

식욕은 입원 방문 중에 표준 칼로리를 추가하기 전과 후에 평가하게 되고, 추가의 식욕 설문을 베이스라인, 치료 및 추적관찰 기간 동안에 매일 작성하게 된다.

ANGPTL3

안지오포이에틴 유사 단백질 3(ANGPTL3)은 지단백질 리파아제의 억제를 통해 TG, 저밀도 지단백질 C(LDL-C)와 같은 지단백질 수준을 조절한다(Tikka에 의해 검토됨, 2016). ANGPTL3의 수준은 렙틴 및/또는 인슐린을 섭식함으로써 조절될 수 있다(Minicocci, 2012) (Nidhina, 2015). ANGPTL3의 수준은 지방이영양증 환자에서 상승하고, 메트렐렙틴으로 치료한 후에 감소하며(Muniyappa, 2017), ANGPTL3의 감소는 TG 풍부 지단백질이 리파아제 제거를 향상시키도록 매개할 수 있다. ANGPTL3 및 TG 수준은 지방이영양증의 마우스 모델에서 증가하고 H4H17319P2로 치료한 후 정상화된다. 따라서, ANGPTL3은 렙틴 수용체 신호전달이 증가한 환경에서 감소할 수 있는 약력학적 마커일 수 있다. ANGPTL3은 베이스라인과 및 파트 A와 B의 여러 시점에서 치료 후에 측정될 것이다.

가용성 LEPR

렙틴은 혈류에서 자유 엔티티로 순환하고, LEPR 엑토도메인을 흘려서 생성된 sLEPR에 결합할 수도 있다(Sinha, 1996) (Lammert, 2001). 가용성 LEPR은 렙틴의 생체이용율 및/또는 제거를 조절할 수 있다(Lou, 2010). 가능하게는, 표적 포화도는 sLEPR의 포화에 의존할 수 있고, 따라서 선형 및 비선형 표적 매개된 동역학에서의 변동성은 sLEPR 수준에 의해 영향을 받을 수 있다. 따라서, 파트 A 및 B에서, sLEPR은 베이스라인 및 치료 기간 동안 (항체 약동학을 위한 샘플링에 상응하는) 다양한 시점에서 측정될 것이다.

영상화 (파트 B만 해당)

DXA 및 MRI 영상화를 베이스라인, 치료 종료에 임박해서, 및 연구 종료 시에 수행하여 총 지방 분포 및 국지적 지방 분포, 허벅지/복부 영역의 SC 및 내장 지방, 및 간 지방 함량의 베이스라인 대비 변화를 추정하게 된다. 시노몰구스 원숭이를 대상으로 한 파일럿 연구에서, 전임상 데이터는 H4H17319P2가 제지방량에 대한 영향 없이, 총 체지방량을 감소시켜 체중을 감소시켰음을 입증하였다(DXA에 의해 평가함). DXA는 임상 연구에서 총 체지방량 및 국지적 지방 분포의 유용한 정량적 바이오마커인 것으로 나타났다. 예를 들어, 정상 대상체와 비교했을 때, 부분 지방이영양증 환자에서 DXA를 사용한 국지적 지방 분포의 유의한 차이(1.78 ± 0.53의 하체 지방율 대비 체간 지방율(체지방율 [FMR]))가 관찰되었다(Aijluni, 2017). DXA는 또한 GLP-1 작용제(Jendle, 2009)와 같은 체중 감량제 및 인지 치료(Ponti, 2018)의 임상 실험에서 총 체지방량 및 국지적 체지방량의 변화를 정량화하는 데에도 사용되었다.

자기 공명 영상(MRI)은 전용 펄스 서열을 사용해 전체 장기를 영상화하거나, 제한된 양의 조직에서의 분광분석에 의해 간(Aijluni, 2017) 및 근육(Burakiewicz, 2017)을 포함하는 다양한 조직에서 지방 함량을 측정하는 효과적인 수단일 수 있음을 보여주었다. MRI는 또한 복부 지방 부피 및 분포 측정을 위한 고 대비 화상을 보여주었으며(Klopfenstein, 2012), 여기서 2형 지방이영양증의 가족력을 가진 환자는 대조군 환자보다 2.5배 더 큰 내장 지방 백분율을 나타냈다(Al-Attar, 2007). 또한, 다수의 근육성 이영양증 연구에서 나타난 바와 같이, 근육 내 지방 분획을 정량적 MRI로 평가할 수 있으며, 여기서 해부학적 영상 및 지방 분획 추정을 가능하게 하는 분광법 및 펄스 시퀀스가 질환 진행을 평가하는 데 유망함을 보여주었다(Burakiewicz, 2017).

현재 연구에서는, 복부 및 허벅지의 MRI를 수행하여 베이스라인 및 H4H17319P2로의 치료 후의 SC, 내장 및 간 지방의 국지적 변화를 정량화하게 된다.

투여량 선택 근거

파트 A를 위한 정맥 내 투여량과 SC 투여량은 지방이영양증 및 단성 비만증의 마우스 모델에서의 전임상 연구와 원숭이 독성학 연구에서의 효능, 안전성 및 약동학 데이터를 기준으로 선택하였다. 본 FIH 연구에서 가장 높은 투여량은 30 mg/kg 이하일 것이고, 시작 투여량은 대략 0.3 mg/kg일 것이다. 시노몰구스 원숭이를 대상으로 한 GLP 독성학 연구에서, H4H17319P2는 12주 동안 최대 100 mg/kg IV까지 양호한 내약성을 나타냈으며, 부작용이 관찰되지 않는 수준(NOAEL)은 100 mg/kg였다. 인간에서 H4H17319P2의 예측 혈청 노출에 기초하여, 본 FIH 연구에서 계획된 최대 용량인 30 mg/kg은 NOAEL보다 20배 낮은 노출 배수이다. 0.3 mg/kg의 초기 시작 투여량은 GLP 독성학 연구에서 시험된 최고 투여량 아래로 10,000이 넘는 안전성 마진을 가지며, 인간에게 정량 한계를 초과하는 H4H17319P2 농도를 제공하여 유용한 PK 정보를 제공할 것으로 예상된다.

파트 B를 위한 투여량 선택의 목표는 내약성을 평가하고 노출-반응 관계의 특성화를 용이하게 하기 위한 광범위한 노출을 보장할 뿐만 아니라, 선형 및 비선형 약동학 둘 다의 특성화를 가능하게 하는 약동학적 프로파일의 분석을 설명하는 것을 포함한다. 또한, 투여량 선택은 관심 대상일 수 있는 추정 PD 마커 임계값(예: sLEPR 포화) 위와 아래로의 노출을 보장해야 한다. 파트 B를 위한 투여량은 파트 A의 중간 안전성, PK 및 PK/PD 데이터에 기초하게 된다. 투여량 수준, 투약 간격, 투여 경로(IV 또는 SC)는 안전성, 약동학 및 가능하다면 파트 A의 PK/PD 데이터 뿐만 아니라 동물에서의 임상 연구 데이터에도 기초할 것이다. 파트 B에서의 투여량은 파트 A에서 평가된 것들을 초과하지 않을 것이며, 투여는 4주마다 또는 2주마다 이루어질 수 있지만, 매주 1회보다 더 자주 투여되지는 않을 것이다.

투여량 요법은 독성학 연구에서 관찰된 노출을 초과하지 않을 것이다.

기준

최대 169명의 대상체(파트 A의 경우 최대 88명, 파트 B의 경우 최대 81명)가 표적 모집단에 등록하게 될 것이다: 표적 모집단은, 파트 A의 경우 건강하고 마른 또는 과체중의 남성 및 여성이며, 파트 B의 경우 다양한 베이스라인 렙틴 수준을 갖는 건강하고 과체중이거나 비만인 남성 및 여성일 것이다.

주요 선정 기준

대상체는 임상시험의 파트 A에 선정될 자격을 얻기 위해 스크리닝 시 다음 기준을 충족해야 한다:

1. 18세 이상 내지 50세 이하의 남성 및 여성일 것

2. 체질량 지수 (BMI) 18.5 이상 30.0 kg/m² 미만일 것

3. 대상체는 연구원에 의해 건강 상태가 양호하고, 스크리닝 시 및/또는 연구 약물의 최초 투여량의 투여 이전에 실시된 병력, 신체 검사 및 실험실 안전성 시험에 기초하여 주요 동방이환이 없는 것으로 판단될 것.

4. 임상적 방문, 연구 관련 절차를 준수할 의사가 있고 능력이 있으며, 식이요법 지침을 준수할 수 있어야 함.

5. 연구 전반에 걸쳐 일상적인 식단 및 운동 요법을 유지할 의사가 있어야 함.

6. 서명된 동의서를 제출할 수 있고 제출할 의지가 있어야 함.

대상체는 연구의 파트 B에 포함될 자격을 갖추기 위해 스크리닝 시에 다음의 기준을 충족해야 함(사전 스크리닝에서 결정되는 BMI 및 렙틴 적격성은 제외함).

1. 18세 이상 내지 65세 이하의 남성 및 여성일 것

2. 코호트 중 하나에 의해 아래에 정의된 바와 같이 사전 스크리닝 방문 시의 체질량지수(BMI) 및 공복 렙틴 수준을 가질 것. 특정 코호트로 등록할 수 있는 최대 수에 도달한 경우, 대상체에게는 등록을 위한 자격요건이 주어지지 않는다.

3. 대상체는 연구원에 의해, 스크리닝 시 및/또는 연구 약물의 최초 투여량의 투여 이전에 실시된 병력, 신체 검사 및 실험실 안전성 시험에 기초하여 주요 동방이환이 없는 것으로 판단될 것. 대상체는 경미한 고지혈증 및/또는 경미한 고혈압의 병력이 있을 수 있지만 스크리닝 전 최소 2개월 동안 안정적인 투여량의 지질 저하제 또는 혈압 강하제를 투여하고 있을 것.

제외 기준

스크리닝 시 다음 기준 중 어느 하나를 충족시키는 대상체는 연구의 파트 A에서 제외될 것이다.

1. 임상적으로 유의한 심혈관 질환(예: 고혈압, 심근경색, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 심부전, 부정맥), 호흡기 질환, 간 질환, 신장 질환, 위장 질환, 내분비 질환(예를 들어, 고지혈증), 혈액학적 또는 신경학적 질환의 병력.

2. 1형 또는 2형 당뇨병 또는 당뇨병 전증의 병력 또는 스크리닝 시 >100 mg/dL인 공복 혈당(FBG) 또는 스크리닝 시 >5.7%의 HbA1c.

3. 공복 LDL-C ≥130 mg/dL, TG >250 mg/dL

4. 스크리닝 시 임상적으로 유의한 비정상적인 전혈구 수, 임상 화학, 소변 분석 또는 소변 약물/스크리닝 시험 실험실 결과의 사소한 편차는 허용됨. 주: 임의의 비정상적인 실험실 결과(예: 엄격한 실체 활동으로 인한 것으로 의심되는, 정상 상한(UNL)의 3배 이내인 크레아틴 포스포키나아제(CPK))는 스크리닝 기간 동안 1회 반복될 수 있음.

스크리닝 시 다음 기준 중 어느 하나를 충족시키는 대상체는 연구의 파트 B에서 제외될 것이다.

1. 임상적으로 유의한 심혈관 질환(예: 중간 내지 중증 고혈압, 심근경색, 뇌졸중, 말초 혈관 질환, 심부전, 부정맥), 호흡기 질환, 간 질환, 신장 질환, 위장 질환, 내분비 질환, 혈액학적 또는 신경학적 질환의 병력.

2. 1형 또는 2형 당뇨병 또는 당뇨병 전증의 병력 또는 스크리닝 시 >126 mg/dL인 FBG 또는 스크리닝 시 >6.5%의 HbA1c. "당뇨병 전증"의 진단은 허용됨.

3. 공복 LDL-C >160 mg/dL, 또는 TG >500 mg/dL

4. 위에서 기술된 바와 같은 경미한 지질 또는 혈당 이상을 제외하고, 임상적으로 유의한 비정상적인 전혈구 수, 임상 화학, 소변 분석 또는 소변 약물 스크리닝 시험. 실험실 결과의 사소한 편차는 허용됨. 주: 임의의 비정상적인 실험실 결과(예: 엄격한 실체 활동으로 인한 것으로 의심되는, 3x UNL 이내인 CPK)는 스크리닝 기간 동안 1회 반복될 수 있음.

5. 제한된 식습관(예: 채식주의자 또는 비건), 음식 섭취 평가에 사용되는 특정 음식 범주에 대한 혐오, 또는 음식 섭취, 식욕 또는 음식 조절 평가의 해석을 방해하거나 혼란스럽게 만드는 식습관.

스크리닝 시 다음 기준 중 어느 하나를 충족시키는 대상체는 연구의 파트 A 및 파트 B에서 제외될 것이다.

1. 스크리닝 방문 이전 60일 이내에 입원(즉, >24시간). 이유 불문함.

2. 대상체가 임의의 신체검사 소견이 있고/있거나, 연구원의 의견에 따르면, 연구 결과를 혼란스럽게 할 수 있는 임의의 병력이 있거나, 연구에 참여함으로써 대상체에 대한 추가적인 위험을 초래하는 경우.

3. 시상하부성 무월경 또는 지방이영양증의 병력.

4. 스크리닝 이전 과거 3개월 동안 5%를 초과하는 체중 변화.

5. 비만으로 인한 비만 시술의 과거 이력(예: 소매 위절제술, 위우회술, 밴딩 등).

6. 과거 6개월 동안 체중 감소를 위한 시술(예: 지방흡입) 또는 체형 보정 시술.

7. 지난 3개월 동안 체중 감량을 위한 약물 치료(일반 의약품[OTC] 또는 처방 의약물)(예: 로카세린, 펜터마인/토피라메이트, 날트렉손 HCl/부프로피온 HCl, 리라글루티드).

8. 주요 정신 질환, 섭식 장애(예: 식욕 이상 항진증, 식욕부진)의 병력.

9. 현재 흡연자이거나 스크리닝 전 3개월 이내에 금연한 과거 흡연자(궐련 또는 전자 담배).

10. 스크리닝 방문 전 1년 내에 오락성 약물(마리화나 포함) 또는 알코올 남용(매일 >2병)의 이력.

11. 스크리닝 시 B형 간염 감염 이력 또는 양성 B형 간염 표면 항원(HbsAg+).

12. 스크리닝 방문 시 HIV 감염 이력 또는 HIV 혈청 양성 반응.

13. 스크리닝 시 C형 간염 감염의 이력 또는 양성 C형 간염 시험 결과.

14. 3년 동안 전이성 질환의 증거가 없이 제거된 피부의 기저 세포 또는 편평 상피 암종, 또는 자궁 경부 또는 항문의 상피내 암종을 제외한 과거 10년 이내의 임의의 암종.

15. 활동성 또는 잠복 결핵(TB)의 병력. 주: 잠복 TB의 병력은 양성 투베르쿨린 피부 검사(TST; 칼메트-게렝 균(BCG) 또는 기타 예방접종 이력과 상관없이, 피부 경결>5 mm로서 정의됨) 또는 양성(불확실하지 않음) QuantiFERON® TB Gold 시험으로 정의된다.

16. 파트 A의 경우: 스크리닝 및 베이스라인 방문 시, 최소 2회 측정한 앉은 혈압 또는 누운 혈압 판독 값이 (>140/90 또는 <90/60)이고 휴지 맥박이 (<45 또는 >125)이거나 기립성 변화(수축기 하락 >20 mm Hg 및/또는 확장위치 하락 >10mm Hg)를 수반하는 경우. 파트 B의 경우: 스크리닝 및 베이스라인 방문 시, 최소 2회 측정한 앉은 혈압 또는 누운 혈압 판독 값이 (>150/90 또는 <90/50)이고 휴지 맥박이 (<45 또는 >125)이거나 기립성 변화(수축기 하락 >20 mm Hg 및/또는 확장위치 하락 >10mm Hg)를 수반하는 경우. 혈압 판독 값이 상승한 경우, 혈압 판독을 반복하거나 대상체를 1회 재스크리닝할 수 있다.

17. 스크리닝 시, 대상체가 (MDRD 방정식 사용했을 때) <60 mL/분/1.73m²의 추정 사구체 여과율을 갖는 경우.

18. 임상적으로 유의한 비정상적 ECG 또는 적어도 2회 측정에서 확인된 간격이 비정상적인 경우(남성의 경우 QTcF >450 msec, 여성의 경우 >470 msec; PR <120 msec 또는 >220 msec; QRS >100 msec).

19. 독시사이클린(또는 테트라사이클린 클래스 약물) 또는 제형의 성분에 대한 과민성.

20. 단백질 치료제에 대한 급성 과민성 및/또는 아나필락시스의 이력.

21. 연구원의 견해에서, 대상체에게 잠재적인 위험을 줄 수 있는 심각한 알레르기(라텍스 알레르기 또는 아나필락시스 반응 또는 알레르기 포함)의 병력.

22. 스크리닝 이전에, (생물학적 제제를 포함하는) 또 다른 임상시험용 의약품 또는 요법을 평가하기 위한 임의의 임상시험에 참가하고 적어도 90일 또는 임상시험용 생물학적 의약품의 반감기가 적어도 5회(둘 중 긴 것) 경과하지 않았거나, 다른 임상시험용 의약품의 경우 적어도 4주가 경과하지 않았거나, 면역요법의 경우 6개월이 경과하지 않은 경우.

23. 임신 중이거나 모유 수유 중인 여성

24. 가임기 여성*으로서, 최초 투여/첫 번째 치료의 개시 이전, 연구 도중, 및 마지막 투여 이후 적어도 4개월 동안 매우 효과적인 피임법을 실시할 의지가 없는 경우. 매우 효과적인 피임법은 다음을 포함한다:

a. 스크리닝 전에 2회 이상의 월경 주기 이전에 개시한 배란 억제와 관련된 조합된(에스트로겐 및 프로게스토젠 함유) 호르몬 피임제(경구, 질내, 경피) 또는 프로게스토겐 단독 호르몬 피임제(경구, 주사용, 이식용)의 안정한 사용

b. 자궁내 장치(IUD); 자궁내 호르몬 방출 시스템(IUS)

c. 양측 난관 결찰

d. 정관수술한 파트너

e. 및/또는 성적 금욕 †, ‡

*폐경기 여성은, 가임기로 간주되지 않기 위해서는 최소 12개월 동안 무월경 상태여야 함. 자궁절제술 또는 난관 결찰과 관련된 의료 기록을 가진 여성은 임신 검사 및 피임이 요구되지 않는다.

†성적 금욕은 연구 치료와 관련된 전체 위험 기간 동안 이성간 성교를 자제하는 것으로 정의된 경우에 한해 매우 효과적인 방법으로 간주된다.

‡주기적인 금욕(달력법, 증상체온법, 배란 후 방법), 회수(질외 사정), 살정제 단독 사용, 및 수유 중 무월경 방법(lactational amenorrhea method, LAM)은 허용 가능한 피임법이 아니다. 여성 콘돔과 남성 콘돔을 함께 사용해서는 안된다.

25. 연구 약물 치료 기간 동안 및 연구 약물의 마지막 투여 후 4개월 동안 의학적으로 허용 가능한 다음 형태의 피임법을 사용할 의향이 없는 성적으로 왕성한 남성: 수술이 성공적인 것으로 의학적으로 평가되는 정관절제술 또는 콘돔의 일관된 사용. 연구 도중 및 연구 약물의 마지막 투여 이후 4개월 동안은 정자 기증이 금지된다.

26. 허가된 약물 또는 영양 보충제로 열거된 것을 제외한 병용 약물의 사용.

연구 코호트 및 투여량 증량에 대한 설명

7개의 순차적 점증 투여량 코호트는 0.3 mg/kg 내지 30 mg/kg의 최대 투여량까지의 투여량을 포함하도록 계획된다. 각 투여량 코호트는 8명의 대상체, 즉 H4H17319P2를 투여받도록 무작위배정 된 6명 및 위약을 투여받도록 무작위배정된 2명으로 이루어진다. 안전성을 최적화하기 위해, 코호트 1(0.3 mg/kg IV), 코호트 2(1 mg/kg IV), 코호트 3(3 mg/kg IV), 코호트 4(300 mg SC) 및 코호트 5(10 mg/kg IV)에서 8명의 대상체(활성제 6명: 위약 2명)를 각각 2개의 블록으로 나누게 된다. 2명의 대상체(활성제 1:위약 1)는 안전성-감시로서 블록 1에 등록되고, 나머지 6명의 대상체(활성제 5: 위약 1)는 블록 2에 등록될 것이다. 블록 1의 대상체들이 먼저 등록되고 같은 날에 투여가 이뤄지게 된다. 블록 2의 대상체의 등록은, 블록 1의 모든 대상체가 적어도 24시간의 안전성 평가를 안전하게 마치고, 안전성 데이터가 연구원과 연구 의뢰자 의학 모니터 요원에 의해 검토되고, 블록 2에 대상체의 등록을 개시할 수 있다는 연구원과 연구 의뢰자 의학 모니터 요원의 합의를 거친 후에서야 시작될 것이다. 블록 2의 모든 대상체에 대한 투여는 같은 날에 이루어질 수 있다.

코호트 6(600 mg SC)과 코호트 7(30 mg/kg IV)에서 각각 8명의 대상체(활성제 6: 위약 2)를 4명씩(활성제 3: 위약 1)로 2개의 블록으로 나누게 된다. 각 블록에 대한 투여는 상이한 날에 수행될 것이다. 투여량 증가 코호트는 다음과 같이 등록된다:

□ 코호트 1: 0.3 mg/kg의 H4H17319P2 1회 IV 투여

□ 코호트 2: 1 mg/kg의 H4H17319P2 1회 IV 투여

□ 코호트 3: 3 mg/kg의 H4H17319P2 1회 IV 투여

□ 코호트 4: 300 mg/kg의 H4H17319P2 1회 SC 투여

□ 코호트 5: 10 mg/kg의 H4H17319P2 1회 IV 투여

□ 코호트 6: 600 mg/kg의 H4H17319P2 1회 SC 투여

□ 코호트 7: 명목 투여량으로서 30 mg/kg H4H17319P2 1회 IV 투여

PK 변동성이 예상보다 더 크고, 연령, 체중, 성별과 같은 특정 공변량의 역할을 조사하기 위해 추가 대상체가 필요한 경우, 임의 코호트가 등록을 하게 된다.

□ 코호트 8: 명목 투여량으로서 30 mg/kg의 H4H17319P2 1회 IV 투여

□ 코호트 9: 명목 투여량으로서 30 mg/kg의 H4H17319P2를 1회 IV 투여. 최대 IV 투여량으로서 30 mg/kg이 코호트 8 및 9에 할당되었으나, 새로운 PK 데이터에 따라 더 낮은 용량이 될 수 있다.

투여량 증량: 안전성/투여량 증량 팀에는 연구원, 의학/연구 책임자, 연구 생물통계학자 및 위험 관리 책임자가 포함된다. 연구원(들) 및 기타 연구 기관 직원, 의학 모니터 요원을 포함하는 연구 의뢰자 연구팀도 투여되는 치료제에 대해 맹검될 것이다. 연구 의뢰자 측에는 맹검되지 않는 개인이 있을 수 있지만, 이들 맹검되지 않는 개인은 연구 의뢰자의 연구 팀의 일원이 되지 못할 것이다.

이전 코호트 내의 모든 대상체가 8일차 안전성 평가를 완료하고 맹검 안전성 데이터가 안전성/투여량 증량 팀 회의에서 검토된 후에, 코호트 2(1 mg/kg)에 대한 투여량 증량이 진행될 수 있다.

이전 코호트 내의 모든 대상체가 8일차 안전성 평가를 완료하고 맹검 안전성 데이터가 안전성/투여량 증량 팀 회의에서 검토된 후에, 코호트 3(3 mg/kg IV) 및 코호트 4(300 mg/kg SC)에 대한 투여량 증량이 진행될 수 있다. 코호트 4에서의 투여는 코호트 3에서의 투여와 병행하여 이루어질 수 있다.

코호트 3 내의 모든 대상체가 8일차 안전성 평가를 완료하고 맹검 안전성 데이터가 안전성/투여량 증량 팀 회의에서 검토된 후에, 코호트 5(10 mg/kg IV)에 대한 투여량 증량이 진행될 수 있다.

코호트 6(600 mg/kg SC)에 대한 투여량 증량이 코호트 5와 병행하여 진행될 수 있지만, 코호트 4 내의 모든 대상체가 8일차 안전성 평가를 완료하고 맹검 안전성 데이터가 안전성/투여량 증량 팀 회의에서 검토된 후에 한해서 진행될 수 있다.

30 mg/kg IV의 명목 투여량이 코호트 7에 배정되었으나, 새로운 PK 데이터에 따라 더 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 30 mg/kg IV로 투여량을 증량하기 전에, 코호트 5 내의 모든 대상체가 8일차 안전성 평가를 완료했을 것이고, 맹검 안전성 데이터가 안전성/투여량 증량 팀 회의에서 검토되었을 것이다. 안전성/투여량 증량의 결정 시기는 변경될 수 있고, 체중에 미치는 약력학적 효과가 예상보다 큰 경우, 추가 안전성 데이터를 수집할 수 있다. 예를 들어, 8일차에 6명의 대상체 중 적어도 3명에서 체중이 >3%만큼 감소하면, 임의의 투여량 증량 결정이 이루어지기 전에 관찰 기간은 15일차까지 연장될 것이며; 6명의 대상체 중 적어도 3명에서 2주에 걸쳐 체중이 >5% 추가로 감소하면, 투여량 증량에 대한 결정 이전에 관찰 기간은 4주로 연장될 것이다.

실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 1 코호트 1에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 IV 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 2코호트 2에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 순차적으로 늘여가며 IV 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 3코호트 3에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 순차적으로 늘여가며 IV 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 4코호트 4에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 순차적으로 늘여가며 SC 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 5코호트 5에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 순차적으로 늘여가며 IV 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 6코호트 6에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 순차적으로 늘여가며 SC 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 7코호트 7에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 순차적으로 늘여가며 IV 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 8코호트 8에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 IV 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 A: 1회 투여량 코호트 9코호트 9에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 1회 투여량을 IV 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약
실험: 파트 B: 반복 투여량 코호트 10코호트 10에는 H4H17319P2 또는 상응하는 위약의 반복 회 투여량을 IV 또는 SC 투여한다	약물: H4H17319P2 약물: 위약

연구 설계

이는 건강한 참가자에서 H4H17319P2의 단일 및 반복 투여량의 안전성, 내약성, PK 및 약력학(PD)에 대한 1상 무작위 배정, 이중 맹검, 위약 대조형 2-파트 연구이다. 파트 A에서, 건강하고 마른 또는 과체중인 대상체가 등록하여 단일 점증 정맥내(IV) 투여량 및 피하(SC) 투여량에 대한 안전성, 내약성, PK 및 PD를 평가하게 될 것이다. 파트 A의 중간 PK 및 안전성 정보는 파트 B에 대한 투여량 수준, 빈도, 투여 방식(IV 또는 SC)을 선택하는데 사용될 것이다. 파트 B에서, 체질량 지수(BMI)가 25~40 kg/m²인 과체중/비만 대상체가 등록하여 베이스라인 렙틴 수준에 의해 정의된 4개의 별도 코호트에서 H4H17319P2의 반복 투여량의 안전성, 내약성, PK 및 PD를 평가하게 될 것이다.

파트 A에서, 최대 88명의 대상체가 최대 7개의 순차적 점증 단일 투여량 (최대 5개의 IV 및 2개의 SC 투여량) 코호트(코호트 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7) 및 2개의 임의 단일 투여량 코호트(코호트 8 및 9)에 무작위배정될 것이다. 7개의 순차적 단일 투여량 코호트에는 각 투여량 수준으로 H4H17319P2 또는 위약을 투여받도록 무작위배정된 8명의 대상체(활성제 6명: 위약 2명)가 포함된다. 2개의 추가적인 임의 단일 투여량 코호트에는 H4H17319P2 또는 위약을 투여받도록 무작위배정된 최대 16명의 대상체(활성제 12명: 위약 4명)가 포함된다. 최대 5가지 단일 IV 투여량 수준(0.3, 1.0, 3, 10, 및 30 mg/kg)과 2가지 SC 투여량 수준(300 및 600 mg)이 단일 점증 방식으로 평가될 것이다. 투여량을 증량할 것인지 여부에 대한 결정은 안전성 매개변수 및 AE의 분석에 기초할 것이다. 시간 경과에 따른 항체 농도, 탐색적 PD 측정치 및 경우에 따라, 투여량 코호트 간의 PK/PD 관계에 대한 중간 분석이 투여량 증량 결정의 정보가 될 수도 있다. 투여량 수준이 최대 30mg/kg인 2개의 임의 코호트의 등록 결정은 PK 프로파일 변동성에 대한 중간 분석에 기초할 것이다.

임의 코호트: 대상체 간에 예상보다 더 큰 PK 변동성이 관찰되고, PK 프로파일에 대한 특정 공변량의 효과를 이해하기 위해서는 추가적인 대상체가 필요한 경우, 코호트 8 및 9가 등록될 것이다. 미리 지정된 수의 남성, 여성, 연령 범위, 체중 또는 특정 BMI 탈락 지점과 같은 선정/제외 기준에 의해 정의된 모집단 내의 특정 하위 집합의 대상체들이 등록될 수 있다. 30 mg/kg IV의 명목 투여량이 코호트 8 및 9에 배정되었으나, 새로운 PK 데이터에 따라 더 낮은 투여량이 투여될 수 있다. 코호트 8 및 9 각각에는 16명의 대상체가 등록한다(4명은 위약을 투여받도록 배정되고 12명은 H4H17319P2를 투여받도록 배정됨). 30 mg/kg IV로 투여량을 증량하기 전에, 코호트 5 내의 모든 대상체가 8일차 안전성 평가를 완료했을 것이고, 맹검 안전성 데이터가 안전성/투여량 증량 팀 회의에서 검토되었을 것이다. 연구 설계의 파트 A는 스크리닝 기간(-21 내지 -2일차), 대상체가 2일 동안 원내에 입원하게 되거나(안전성-감시 블록에 있고, IV 투여 받는 대상체 및 SC 투여 받는 대상체의 경우), 1일 동안 원내에 체류하게 되는(SC 투여 받는 다른 대상체의 경우) 베이스라인 전 방문(-1일차), 연구 종료 방문(113일차)을 포함하는 추적 관찰 기간(3일차 내지 113일차)으로 이루어진다. 연구 전반에 걸쳐, 안전성 평가는 활력 징후, 체중, 신체검사, ECG, 실험실 검사, 및 AE의 모니터링, PK 측정, 및 다양한 PD 평가를 포함할 것이다.

파트 B에서, BMI가 25~40 kg/m²인 최대 81명의 대상체가 베이스라인 렙틴 수준에 의해 정의된 4개의 코호트에 등록되어(코호트 당 최대 약 20명), 위약-대조, 이중 맹검, 12주 반복 투여 연구 군으로 무작위배정된다(코호트 할당 시 이에 따라 3:1 또는 6:1의 H4H17319P2 대 위약 군으로 무작위 배정됨). 투여량, 투여 간격, 투여 방법(IV 대 SC)은 파트 A의 안전성, PK 및 가능하다면 PK/PD 데이터에 기초할 것이다. 파트 A의 H4H17319P2의 PK 프로파일은 반복 투여 후 혈청에서의 농도를 예측하는데 사용될 것이다.

본 연구는 사전 스크리닝 기간(-60일차 내지 -14일차); 스크리닝 기간(-32일차 내지 -14일차); 및 체중, DXA와 MRI에 의한 체성분의 베이스라인 측정치를 얻고, 원내 체류를 통해 공복 렙틴, 체중, 식욕 평가 및 자유로운 음식 섭취 평가의 베이스라인 측정치를 수집하기 위한 베이스라인 기간(-29일차 내지 -1일차)로 이루어진다. 대상체는 -1일차에 2일 동안 입원하게 될 것이다. 1일차에, 대상체는 연구 약물 또는 위약의 제1 투여량을 투여받게 되고, 약동학 측정을 위한 일련의 채혈을 하게 되고, 이들이 퇴원하게 되는 2일차의 24시간 PK 샘플링을 위해 밤새 머무르게 된다. 시험 약물은 4주마다 또는 2주마다 투여될 수 있지만, 치료 기간 동안 매주 1회보다 더 자주 투여되지는 않을 것이다(투여 빈도는 파트 A로부터의 PK 데이터의 중간 분석에 의해 결정됨).

체중에 대한 정한 반복 측정치 및 혈청 대사 파라미터(포도당, 인슐린, HOMA-IR, 지질)을 수집하기 위해, 치료 기간 동안 최대 매주 1회의 방문이 이루어진다. 식욕 및 자유로운 음식 섭취에 추적관찰 평가는 4주차 및 치료 기간 종료 시(12주차)의 원내 체류 중에 수행된다. 대상체는 베이스라인 기간, 치료 기간 및 추적관찰 기간 동안 매일 식욕에 관한 설문지를 작성하게 된다. DXA 및 MRI 영상화에 의한 추적관찰 평가 또한 수행될 것이다. 치료 기간이 끝난 후, 대상체에게는 16주의 약물 중단 기간이 이어지게 된다. 연구 전반에 걸쳐, 안전성 평가는 활력 징후, 신체검사, ECG, 실험실 검사, 및 AE의 모니터링을 포함할 것이다. 약물 농도, 표적 결합 마커(sLEPR), 및 탐색적 바이오마커도 연구 전반에 걸쳐 측정될 것이다.

연구 기간

대상체에 대한 연구의 파트 A의 기간은 약 19주이고, 스크리닝 기간을 포함한다. 대상체에 대한 연구의 파트 B의 기간은 약 35주이고, 사전 스크리닝/스크리닝/베이스라인 기간을 포함한다. 연구 종료는 파트 B에서 마지막 대상체의 마지막 방문으로 정의된다.

치료제 투여량/경로/일정

H4H17319P2는 동결건조된 분말로서 IV 또는 SC 투여를 위한 멸균, 일회용, 20 mL 유리 바이알에 제공될 것이다. H4H17319P2에 매칭되는 위약은 단백질을 첨가하지 않는 동일한 제형에서 제조된다. 파트 A의 경우, 단일 투여량이 IV 및 SC 투여될 것이다. 파트 B의 경우, 투여량, 투여 간격, 투여 방법(IV 대 SC)의 선택은 파트 A로부터의 안전성, PK 및 가능하다면 PK/PD 데이터에 기초할 것이다.

절차 및 평가

안전성은 TEAE, 활력 징후, 신체검사, 심전도(ECG) 및 실험실 시험을 모니터링/평가함으로써 평가될 것이다. 약동학을 평가하기 위해, 사전 지정된 시점에서 혈청 내 H4H17319P2 농도를 측정하기 위해 조밀한(dense) 샘플과 성긴(sparse) 샘플을 수집한다. 약력학은 체중 및 허리 둘레, 음식 섭취량과 식욕 평가, 및 DXA 및 MRI를 사용한 체성분 측정에 의해 평가될 것이다.

일차 결과 척도:

1. 치료 후 발생 부작용(TEAE)의 수 [기간: 12주차(치료 종료 기간)]

이차 결과 척도:

1. 시간 경과에 따른 혈청 중 H4H17319P2의 농도[기간: 27주차까지(연구 종료)]

2. 과체중 또는 비만 대상체에서 체중 변화율 [기간: 베이스라인 내지 12주차]

3. 과체중 또는 비만 대상체에서 체중 변화량 [기간: 베이스라인 내지 12주차]

4. 과체중 또는 비만 대상체에서 표준화된 식사에 대한 칼로리 섭취의 베이스라인 대비 변화 [기간: 베이스라인 내지 12주차]

5. H4H17319P2를 1회 투여 후 시간 경과에 따른 지질 조절 단백질 수준의 변화 [기간: 16주차까지]

6. H4H17319P2를 반복 투여 후 시간 경과에 따른 지질 조절 단백질 수준의 변화 [기간: 27주차까지]

7. H4H17319P2를 1회 투여 후 시간 경과에 따른 H4H17319P2에 대한 항-약물 항체의 발생 [기간: 16주차까지]

8. H4H17319P2 반복 투여 후 시간 경과에 따른 H4H17319P2에 대한 항-약물 항체의 발생 [기간: 27주차까지]

약동학적 변수

시간에 추가하여 총 H4H17319P2의 농도를 측정할 것이다. 약동학적 파라미터는 다음을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다:

· AUC_last - 시간 0에서 마지막 양성 농도의 시간까지 계산된 곡선 아래 면적(AUC)

· AUC_0-τ - 길이 τ로 표시된 투여 간격에 대해 계산된 AUC

· C_max - 피크 농도

· t_max - C_max까지 걸린 시간

· CL - 제거율

· C_trough - 저점 농도

파트 B의 경우, 이들 (및 다른) 파라미터의 선택은 선택된 최종 샘플링 일정 뿐만 아니라 수득된 데이터에 따라 달라진다는 점에 유의한다.

항약물 항체 변수

항약물 항체(ADA) 변수는 ADA 반응과 다음과 같은 역가(titer)를 포함한다:

· 치료 후 발생 반응, 베이스라인 결과가 음성일 때, 임의의 투여 후 양성 ADA 검정 반응으로서 정의됨

· 치료 유발성 ADA 반응, ADA 검정에서 베이스라인이 양성일 때, 베이스라인 역가 수준보다 9배 이상 큰 임의의 투여 후 양성 ADA 검정 반응으로서 정의됨.

· 역가 값

· 역가 범주

- 낮음 (역가 <1,000)

- 중간 (1,000≤역가≤10,000)

- 높음 (역가 >10,000)

약력학 및 기타 바이오마커 변수

약력학 및 바이오마커 변수는 다음과 같다: 체중, 자유로운 음식 섭취 평가, 식욕 평가, 혈청/혈장 혈당(예: 공복 혈당, 인슐린, HbA1c) 및 지질 매개변수(예: 총 콜레스테롤, TG, LDL-C, HDL-C), 전체 및 부위별 체지방량 및 제지방량의 DXA 측정 값, 국지적 SC 및 내장 지방의 MRI 정량화, ANGPTL3, 렙틴 및 sLEPR. 추가적인 탐색적 바이오마커는 H4H17319P2가 갑상선 호르몬(T3, T4, TSH), 황체 형성 호르몬(LH), 테스토스테론, 에스트라디올, 코르티솔 및 아디포넥틴에 미치는 효과를 포함할 것이다.

효능 절차

체중은 스크리닝 동안 및 연구 전반에 걸쳐 지정된 연구 방문 시 평가될 것이다. 체중은 다른 연구 평가가 수행되기 전에 고 정밀도의 교정된 디지털 저울을 사용해 3회 평가될 것이다. 체중 평가에 앞서 대상체는 장(방광)을 비워야 한다. 대상체는 체중 평가 동안에는 속옷만 착용하고 신발을 벗어야 한다. 체중은 0.1 kg 단위로 기록될 것이다.

모든 인체 측정은 3회 수행하고, 최종 보고는 평균 값으로 해야 한다. 삼두근, 견갑골, 상장골, 및 허벅지 피부주름 두께는 신체 우측의 건조하고 손상 없는 피부로부터 측정해야 하지만, 기형이나 사지 누락으로 달리 필요한 경우는 예외로 한다. 허리 둘레를 측정하기 위해, 대상체를 똑바로 세우고, 팔은 편안하게 옆에 붙이게 하고, 발은 앞을 향해 모으도록 한다. 장골 능선과 가장 아래 늑골은 촉진에 의해 확인하고, 이들 영역을 덮고 있는 피부에 펜으로 표시한다. 그런 다음, 이들 피부 표시들 간의 중간지점을 줄자로 측정하여 확인하고, 펜으로 표시한다. 그런 다음, 중간점이 표시된 곳에서, 날숨이 완만하게 끝날 때 줄자를 이용해 허리 둘레를 축정한다. 신장은 완전히 직립한 자세에서 들숨이 끝날 때 교정된 스타디오미터를 사용해 측정하고, 0.1 cm 단위로 기록한다. 파트 B 및 파트 A의 임의 코호트의 경우, 신장은 사전 스크리닝 또는 스크리닝 방문 시 각각의 1회 측정 값으로써 측정될 것이다. 체질량 지수는 평균 체중(킬로그램)을 신장(미터)의 제곱으로 나눈 값을 사용해 계산한다. 파트 A에서(임의 코호트 제외), 평균 신장이 계산에 사용된다. 파트 B와 파트 A의 임의 코호트에서는, 각 방문 시의 신장(각각 사전 스크리닝 또는 스크리닝 시의 1회 측정) 및 체중(3회 측정 값의 평균)에 대한 값을 BMI 계산에 사용한다.

자유로운 음식 섭취를 평가할 것이다. 대상체가 비정상적인 식습관을 가지고 있거나 음식 섭취 평가에 사용된 음식에 대해 혐오감을 가지고 있는 경우, 대상체는 스크리닝 시에 제외될 것이다. 자유로운 음식 섭취 평가를 통한 에너지 섭취(아침 + 점심 + 저녁)를 파트 B에서는 베이스라인베이스라인, 치료 후 4주차, 및 치료 종료 기간(12주차)에 정량화할 것이다. 음식 평가가 실시될 경우, 원내 방문의 하루 전에는 과도한 활동과 알코올 섭취를 피할 것을 대상체에게 요청할 것이다.

대상체는 공복 상태로 아침에 병원에 도착하여 입원하게 될 것이다. 4주의 치료 중 입원 환자 음식 섭취 평가에서, 대상체는 이들에게 배정된 치료제(연구 약물 또는 위약)를 투여받게 될 것이다. 그런 다음, 다량 영양소가 함유된 고정된 열량의 표준화된 아침, 점심 및 저녁 식사를 이들에게 제공하고, 밤에는 공복 상태를 유지시킨다. 다음 날, 자유로운 아침, 자유로운 점심 및 자유로운 저녁 식사가 이들에게 제공된다. 자유로운 시험 식사를 하는 동안에는, 정상적인 식사량을 크게 상회하는(4~5배) 양의 음식이 대상체에게 제공된다. 식사는 표준화된 다량 영양소 함량과 알려진 칼로리 밀도로 표준화되도록 영양사가 설계할 것이다. 모든 식사와 식기류는 교정된 전용 저울을 사용해 시험 식사를 하기 전과 시험 식사를 마친 후에 은밀히 칭량하여, 소비된 음식의 양을 0.1 g 단위로 정확히 평가하게 된다. 대상체는, 음식 섭취에 영향을 줄 수 있는 시간 또는 사회적 단서를 제거하도록 시계, 라디오, 휴대 전화 및 텔레비전을 없앤 개인적이고 특별한 방에서 모든 식사를 소비하게 된다. 식사는 소비되는 음식의 양을 가리는 방식으로 제공되므로, 음식 섭취량은 이용할 수 있는 음식의 양과 같은 과식의 시각적/사회적 단서에 의해 영향을 받지 않는다. 대상체는 본인이 원하는 만큼 많이 또는 적게 먹도록 요청을 받게 되고, 시험 식사가 진행되는 동안은 이들은 방해받지 않을 것이고, 독서, 음악 듣기, 통화 또는 비디오 시청과 같은 여가 활동 참여가 금지될 것이다. 대상체는 충분한 포만감을 얻었을 때 시험 식사 공간을 떠날 수 있으며, 충분한 포만감을 얻지 못한 경우, 연구 요원이 1시간 후에 식사를 종료하게 된다.

원내 식욕 평가 및 일상적 식욕 설문 (파트 B만 해당)

원내 식욕은 설문 조사 질문지(Flint, 2000)에 의해 평가될 것이며, 대상체는 시각적 아날로그 척도에 그들의 답변을 기록하도록 지시를 받는다. 대상체는 입원 첫 날 동안 표준화된 저녁 식사의 약 30분 전과 후에 원내 식욕 평가를 완료하게 될 뿐만 아니라, 베이스라인 기간, 치료 기간 및 추적 관찰 기간 동안에도 매일 식욕 설문을 작성하게 된다. 연구 대상체들이 설문조사 결과를 다른 연구 참여자와 공유하지 않도록 주의를 기울일 것이다. 연구의 파트 B에 대한 원내 식욕 평가와 매일 식욕 설문에 사용된 질문에 대한 세부 사항은 연구 매뉴얼에 기술되며, 질문(최종 확정되었을 때)은 파트 B가 시작되기 전에 검토용으로 윤리 위원회에 제출될 것이다.

DXA에 의한 체성분 (파트 B만 해당)

DXA는 임상적 전신 골격 밀도측정에서 광범위하게 사용된다. 총 검사 시간은 짧으며(약 6 내지 7분), 이온 방사선량은 약 0.1 mGy로 최소 수준이다. 이중 X-선 흡수계측법은 제지방량(LBM)과 체성분의 추정치를 제공할 수 있고, 임상 연구 환경에서 LBM 측정에 사용되어 왔다. LBM 측정을 위한 DXA의 임상적 타당성은 LBM의 변화와 신체 기능의 퇴행 간의 유의미한 연관성을 입증하는 종단 연구(longitudinal study)에 의해 뒷받침된다(Goodpaster, 2006). 이중 X-선 흡수계측법은 베이스라인 기간 동안, 치료 종료 방문 시, 및 연구 종료 시 2번 씩 수행된다. DXA 스캔을 위해 개별 대상체를 준비시키는 것과 관련해, 연구 전반에 걸쳐 일관된 수분 섭취, 일관된 식사, 일관된 카페인 섭취, 일관된 활동(스캔 24시간 전 과도한 활동은 금함), 일관된 의복, 및 스캔을 위해 DXA 테이블 상에서 일관된 대상체 포지셔닝을 유지하기 위한 노력을 기울여야 한다. 또한, DXA 스캔은 연구 전반에 걸쳐 임의의 주어진 대상체에 대해 하루 중 같은 시간에 얻어야 한다.

MRI에 의한 체성분 (파트 B만 해당)

간 지방 분획의 측정에 자기 공명 영상화를 사용한다. 간 전체를 커버하기 위해 축 방향 이미지를 획득하는 다중 에코 기울기-회복 에코 시퀀스가 권장된다. 에코 시간은 연속적인 에코 시간(TE)에서 지방과 물이 역위상과 동위상 사이에서 교번하도록 해야 한다. 운동 인공물(motion artifact)을 최소화하기 위해, 짧게 숨을 참은 상태에서 이들을 얻어야 한다. 전체 획득에는 3 내지 5분이 소요된다. 지방 분획을 위한 허벅지 스캐닝은, 대상체의 신중한 위치 설정 및 성형된 발포체 지지부와 로컬라이저를 사용한 고정을 필요로 한다. 완전한 허벅지 MRI 획득에는 최대 10분까지 걸릴 수 있다. 오전 스캔 전에 10 내지 12시간 동안 대상체의 금식이 필요할 수 있다.

연구 활동 일정 및 각주

연구 평가와 절차는 하기 각주와 함께 도 25, 26 및 27에 있는 기간 및 방문별로 제시된다:

1. 비감시 SC 투여군의 임상적 퇴원, 그러나 시험기관은 대상체가 밤새 머물렀다가 다음 날 퇴원하게 할 수 있다.

2. IV 투여 및 안전성-감시 SC 투여군의 임상적 퇴원

3. 파트 A 내 IV 코호트에 대해, 1일차에 활력 징후도 측정해야 하며, AE는 투여 전, 30분, 연구 약물 주입 종료 시, 및 주입 후 1시간, 2시간, 4시간 및 8시간차에 모니터링해야 한다. 파트 A 내 SC 코호트에 대해, 1일차에 활력 징후도 측정해야 하며, AE는 투여 전, 주사 후 30분, 및 주사 후 1시간, 2시간, 4시간 및 8시간차에 모니터링해야 한다. 파트 B에 투여량을 투여하기 위해, 1일차에 활력 징후도 측정해야 하며, AE는 투여 전, 30분, IV 투여의 경우 연구 약물 주입 종료 시, 및 IV 또는 SC 투여의 경우, 주입 또는 주사 후 1시간, 2시간, 4시간 및 8시간차에 각각 모니터링해야 한다. 투여 다음날부터, 활력 징후도 측정해야 하며, AE는 투여 전, 30분, IV 투여의 경우 연구 약물 주입 종료 시, 및 IV 및 SC 투여의 경우, 주입 또는 주사 후 1시간, 2시간 및 4시간차에 각각 모니터링해야 한다. 활력 징후는 또한 스크리닝 방문(파트 A 및 B) 및 1일차(파트 A만 해동)에 대한 기정혈압 평가를 포함한다(파트 A만 해당). 기립성 평가(orthostatic assessment)를 위해, 대상체를 약 10분 동안 반듯이 눕힌 상태로, 기립한 상태로 대략 1분이 지난 후, 및 기립한 상태로 대략 3분이 지난 후 혈압과 맥박을 측정한다.

4. 채혈은 적어도 8시간 동안 금식 후에 채취한다. 투여 당일에는, 투여 전 샘플만 공복 상태에 있어야 한다.

5. 체중은 반드시 공복 상태에서, 장(방광)을 비운 후 신발을 벗고 속옷만 착용한 후, 전용 교정된 저울을 사용해 3회 측정해야 한다.

6. 체지방 분포에 대한 적절한 설명을 제공하기 위해, 다음 영역에서 피부 주름 두께를 3회 측정해야 한다: 삼두근, 견갑골, 상장골 및 허벅지.

7. 1일차에 약물 농도, sLEPR 농도 및 ANGPTL3 농도를 위해 주입/주사 전, 주입/주사 후±15분, 및 주입/주사 후 1시간±15분, 2시간±15분, 4시간±15분, 8시간±15분, 12시간±15분, 및 24시간±15분에 샘플을 채취한다. sLEPR 및 ANGPTL3은 약물 농도가 측정된 시점의 하위 집합에서만 분석될 수 있다.

8. DNA는 임의의 방문 시점에 채취할 수 있다.

9. 밤새 머물고 다음날 퇴원하는 옵션. 파트 B의 경우에도, 대상체는 1일차의 하루 전(-1일차)에 입원하여 밤새 머물게 된다. 1일차 절차(밤새 금식, ECG, PK 측정, 및 연구 약물 투여 이후에 수행해야 하는 평가 제외), 예컨대 약물 스크리닝, 소변 검사 및 소변 임신 검사 등은 -1일차에 수행할 수 있다.

10. 30일차의 방문은 29일차의 방문 후 정확히 1일차에 이루어져야 한다.

11. 85일차의 방문은 84일차의 방문 후 정확히 1일차에 이루어져야 한다.

12. 파트 B에서의 시험 약물 투여의 빈도는 파트 A에서 얻은 결과에 따라 달라질 것이다.

13. 2개의 베이스라인 이미지(DXA 및 MRI)는 -29일차 내지 -14일차에 획득될 것이다. DXA 및 MRI 둘 다는 같은 날에 또는 다른 날에 수행될 수 있지만, 제1 및 제2 DXA와 제1 및 제2 MRI는 반드시 다른 날에 수행되어야 한다.

14. 18일차 방문을 위한 DXA 및 MRI 절차는 방문의 최대 5일전, 또는 18일차 방문의 최대 5일 후에 수행될 수 있지만, DXA 및 MRI는 시험약 투여 후 24시간 이내에 수행해서는 안 된다. 24일차 방문을 위한 DXA 및 MRI 절차는 24일차 방문의 최대 7일 전에 수행될 수 있다.

15. 파트 B의 경우, 실제 샘플 수집 일정은 파트 A로부터의 PK 데이터의 중간 검토에 따라 달라질 것이다. 그러나, 이는 반복 투여이므로, 밀도 샘플링은 제1 투여 이후에, 저점 샘플 수집은 다른 시점에 수행될 것이다.

16. 원내 식욕 평가는 표준화된 저녁 식사 전 및 후에 수행된다.

17. 시험기관은 매 지정 방문 시 매일 식욕 설문지 작성에 대한 대상체의 준수 여부를 확인한다.

18. ECG는 투여 전에 수행된다.

안전성:

체온, 혈압, 맥박 및 호흡 속도를 포함하는 활력 징후는 도 25 내지 도 27에 따른 시점에서, 투여 전 적어도 10분 동안 피험자가 휴식 자세, 앉은 자세, 또는 누운 자세를 취한 후에 수집한다.

도 25 내지 도 27에 따른 시점에 철저한 신체 검사를 수행할 것이다. 대상체의 병력에 나타난 바와 같이, 존재할 수 있는 임의의 이상을 검사하고 평가하는 데 주의를 기울여야 한다.

채혈을 요하는 방문 동안, 채혈 이전에 심전도 검사를 수행해야 한다. 표준 12-리드 ECG가 도 25 내지 도 27에 따른 시점에 수행될 것이다. 12-리드 ECG는 대상체가 적어도 10분 동안 휴식을 취한 후 누운 자세에서 실시해야 한다. ECG는 연구원에 의해 현장에서 해석될 것이다. 심박률은 심실박동률에서 기록되며, PR, QRS, RR, QTcB 및 QTcF 간격이 기록될 것이다. 임의의 임상적으로 유의한 이상은 해당되는 경우 AE/SAE로서 문서화해야 한다. 각 ECG 추적은 스크리닝 기록 추적과 비교하여 분석될 것이다. ECG 스트립 또는 보고서는 소스와 함께 유지된다.

혈액학, 화학, 소변 검사, 약물 스크리닝 및 임신 검사 샘플(혈청 또는 소변)을 분석한다. 혈액 샘플 채취를 위한 상세한 지침은 연구기관에 제공된 실험실 매뉴얼에 나와 있다. 실험실 검사를 위한 샘플은 도 25 내지 도 27에 따른 방문 시 수집될 것이다. 검사에는 다음이 포함된다: 혈액 화학검사: 나트륨, 칼륨, 염화물, 중탄산, 칼슘, 글루코오스, 알부민, 총 혈청 단백질, 크레아티닌, 혈중 요소 질소(BUN), 아스파르테이트 아미노 전달효소(AST), 알라닌 아미노 전달효소(ALT), 알칼리 포스파타아제, 젖산 탈수소 효소, 감마-글루타밀 전달효소(GGT), 총 빌리루빈, 총 콜레스테롤(저밀도 지단백질 [LDL] 및 고밀도 지단백질 [HDL]), 트리글리세라이드, 요산, 크레아틴 포스포키나아제(CPK), LDL-C, HDL-C; 혈액학: 헤모글로빈, 적혈구용적률, 적혈구(RBC), 백혈구(WBC), 적혈구 지수(평균 적혈구 용적[MCV], 평균 적혈구 헤모글로빈[MCH], 평균 적혈구 헤모글로빈 농도[MCHC], 적혈구 분포 지수[RDW]), 혈소판 수, 호중구, 림프구, 단핵구, 호염기구 및 호산구의 감별(*임상적으로 유의한 이상이 관찰되는 경우 세포 하위 집단을 평가하기 위한 유세포 계측에 의한 검사가 수행될 수 있음); 소변 검사: 색상, 포도당, RBC, 투명도, 혈액 히알린과 기타 캐스트, pH, 빌리루빈, 박테리아, 비중, 백혈구 에스테라아제, 상피 세포, 케톤, 아질산염, 결정, 단백질, WBC, 효모; 기타 실험실 검사: 렙틴, 인슐린, 갑상선 호르몬 (T3, T4, TSH), 황체 형성 호르몬 (LH), 테스토스테론, 에스트라디올, HbA1c와 같은 내분비 호르몬은 파트 A와 B에서 평가된다. 파트 B의 경우, 혈청 렙틴은 4개 코호트 중 1개에 대한 대상체 적격성을 결정하기 위한 사전 스크리닝 방문 시에 측정된다. 렙틴은 도 25 내지 도27에 표시된 바와 같이 연구 전반에 걸쳐서도 측정될 것이다. 측정할 다른 단백질에는 아디포넥틴 및 코르티솔이 포함된다.

비정상적인 실험실 값 및 실험실 부작용

모든 실험실 값은 연구원 또는 허락된 대리인의 검토를 반드시 거쳐야 한다. 치료를 시작한 후에 발생하는 유의하게 비정상적인 시험 결과는 반드시 비정상성의 속성과 정도를 반드시 반복해서 확인해야 한다. 필요한 경우, 적절한 부수적인 조사를 개시해야 한다. 비정상성이 연구 약물 또는 이의 투여와 무관한 이벤트 또는 조건에 의해 해결되지 않거나 설명될 수 없는 경우, 반드시 의료/연구 책임자의 자문을 구해야 한다.

연구원은, 비정상적인 시험 값의 임상적 유의성을 연구 중인 질환의 맥락 내에서 결정해야 한다.

약물 농도 측정 및 샘플

파트 A 동안 혈청 중 H4H17319P2의 농도 측정을 위한 샘플은 도 25에 열거된 시점에 수집될 것이다. 명목상으로, 파트 B 동안 혈청 중 H4H17319P2의 농도 측정을 위한 샘플은 도 27에 열거된 시점에 수집될 것이다. 그러나, 파트 B에 대한 이벤트 일정이 파트 A로부터의 데이터의 중간 분석에 기초하여 확인되면, 파트 B 동안 혈청 중 H4H17319P2의 측정을 위한 샘플은 (가능하게는) 한 세트의 수정된 시점에 수집될 것이다. 임의의 미사용 샘플은 탐색적 바이오마커 연구에 사용될 수 있다.

항약물 항체 측정 및 샘플

파트 A 및 B에 대한 항-약물 항체 평가를 위한 샘플은 도 25 및 도 27에 열거된 시점에 수집될 것이다. 임의의 미사용 샘플은 탐색적 바이오마커 연구에 사용될 수 있다.

약력학 및 탐색적 바이오마커 절차

본 연구에서, H4H17319P2가 어떻게 식욕, 음식 섭취, 체중 및 순환하는 마커(예: 가용성 LEPR 및 ANGPTL3) 뿐만 아니라 탐색적 바이오마커를 변경시킬 수 있는지를 탐색하기 위한 연구 평가가 수행될 것이다.

가용성 LEPR은 건강한 대상체 및 질환 대상체의 순환계에 존재한다. 이는 렙틴 수용체의 비-신호전달 형태로서, 렙틴에 결합할 수 있고 이의 생체이용률을 조절할 수 있다. H4H17319P2는 순환하는 sLEPR에 투여량 의존적 및 시간 의존적 방식으로 결합할 수 있다. 가용성 LEPR은 1일차 방문 시 및 도 25와 도 27에 표시된 후속 방문 시, 투여 전에 측정될 것이다. sLEPR의 변화는 H4H17319P2 투여 후 표적 결합 및 포화를 반영할 수 있다.

ANGPTL3은 지단백질 리파아제의 내인성 억제제로서, 순환하는 중성지방을 조절한다. H4H17319P2가 ANGPTL3을 통해 중성지방을 조절하는 것이 가능하므로; ANGPTL3의 순환 농도는 식후 변화를 포착하기 위한 투여 후 다양한 시점에서 투여 전 및 치료 후 혈청에서 측정될 것이다. ANGPTL3에 대한 H4H17319P2의 용량 의존적 효과는 도 25 내지 도 27에 개략된 바와 같이 파트 A 및 B 모두에서 탐색될 것이다.

혈청 또는 혈장에서 측정될 수 있는 다른 탐색적 바이오마커는 렙틴, 아디포넥틴 및 내분비 호르몬을 포함하며, 이들은 체중 감량 중에 조절되는 것으로 여겨진다. 마커들은 도 25 내지 도 27의 바이오마커 평가 수집 일정에 따라 측정될 것이다.

이상반응 및 부작용

주입 반응을 치료하기 위한 응급 장비 및 의약을 즉시 이용할 수 있어야 한다. 모든 주입 반응은 AE로서 보고되어야 하며 적절한 등급 척도를 사용해 등급화 되어야 한다. 다음의 AE 중 어느 하나가 관찰되면 주입을 중단해야 한다: 기침, 오한/한기, 발진, 소양증(가려움증), 두드러기(담마진, 피부발진, 부스럼), 발한(땀), 저혈압, 호흡 곤란(숨가쁨), 구토 및 홍조(flushing).

반응은 증상에 따라 치료해야 하며, 주입을 재개해서는 안된다. 연구원이 전술한 것과 다른 이유로 치료 또는 주입 중단이 의학적으로 필요하다고 느끼면, 일반적인 임상 관행에 따라 적절한 반응을 제공하기 위한 임상적 판단을 사용해야 한다.

다음 AE들 중 하나라도 발생하는 경우, 주입을 종료해야 하고 절대 재개해서는 안 된다: 아나필락시스, 후두/인두 부종, 심각한 기관지 경련, 흉통, 발작, 중증 저혈압, 기타 신경 증상(착란, 의식 상실, 감각이상, 마비 등), 시험자의 견해에서 IV 주입을 종료하는 것이 타당한 임의의 다른 증상 또는 징후. 다음의 경우에는 아나필락시스로 간주한다(Sampson, 2006): 피부, 점막 조직 또는 둘 다와 관련된 질환(예: 전신성 담마진, 소양증 또는 홍조, 입술-혀-목젖 부종)의 급성 발병(몇 분 내지 몇 시간) 및 다음 중 적어도 하나: 호흡기 손상(예: 호흡 곤란, 천명-기관지 경련, 선조, 최대 호기 감소, 저산소혈증) 및 혈압 감소 또는 말단-기관 기능 장애와 관련된 증상(예: 저긴장[붕괴], 실신, 실금).

전신 반응을 치료하기 위한 응급 장비 및 의약을 즉시 이용할 수 있어야 한다. 모든 주입 반응은 AE로서 보고되어야 하며 지시된 바와 같이 적절한 등급 척도를 사용해 등급을 매겨야 한다. 연구 약물(SC)의 주입 후의 급성 전신 반응은 일반적인 임상 관행에 따라 적절한 대응을 결정하는 임상적 판단을 사용해 치료해야 한다.

국소 주사 부위 반응은 AE로서 보고되어야 하며, 미국 식품의약국(FDA)의 September 2007 Guidance for Industry, Toxicity Grading Scale for Healthy Adult and Adolescent Volunteers Enrolled in Preventive Vaccine Clinical Trials(연구 규정 바인더에 제공되어 있음)에 따라 등급화 되어야 한다.

AE는 연구 약물이 투여된 대상체에서의 임의의 의도되지 않은 의학적 사건으로서, 연구 약물과 인과관계가 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서 AE는 연구 약물과 관련이 있는 것으로 간주되는지 여부에 관계없이 연구 약물의 사용과 일시적으로 관련된 모든 바람직하지 않고 의도되지 않은 징후 (비정상적인 검사실 이상 소견), 증상 또는 질환이다. AE는 또한 연구 약물의 사용과 일시적으로 관련된 기존 병태의 악화(즉, 빈도 및/또는 강도의 임상적으로 유의한 변화)를 포함한다.

중대한 이상반응(SAE)은 의도하지 않은 의학적 사건으로서, 임의의 투여량이:

· 사망을 초래하는 것 - 모든 사망, 심지어 연구 약물과 전혀 관련이 없는 것으로 보이는 것들(예: 대상체가 승객인 교통 사고)도 포함함.

· 생명을 위협하는 것 -연구원의 관점에서, 대상체가 사건 발생 시점에 즉각적인 사망 위험에 처해 있는 것. 이는 사망을 초래했을 수도 있는 더 심각한 형태로 발생한 AE를 포함하지는 않는다.

· 입원을 초래하거나 기존 입원 기간의 연장이 필요하게 하는 것. 입원(impatient hospitalization)은 병원 또는 응급실에 24시간 이상 입원하는 것으로 정의됨. 기존 입원 기간의 연장은 원래 사건에 대해 예상했던 것보다 더 오래 병원에 체류하는 것, 또는 연구원이나 치료 의사가 결정한 바에 따라 새로운 AE의 발생으로 인한 연장으로서 정의됨.

· 지속적이거나 중대한 장애/불능을 야기하는 것(정상적인 생활 기능을 수행하는 능력의 실질적인 파괴).

· 선천성 기형/선천성 결함의 원인이 되는 것.

· 중요한 의학적 사건인 것 - 중요한 의학적 사건은 즉시 생명을 위협하거나 사망 또는 입원으로 이어지지는 않지만, 대상체를 위험에 빠뜨리거나 위에 나열된 다른 심각한 결과 중 하나를 방지하기 위해 개입(예: 응급실 또는 집에서 알레르기성 기관지 경련에 대한 집중 치료; 입원을 초래하지 않는 혈액질환 또는 발작; 또는 약물 의존성 또는 약물 남용의 발생에 대해 응급실 또는 집에서의 집중적인 치료)을 필요로 할 수 있다.

이들 사건의 경우, SAE 보고를 위한 기준을 반드시 준수해야 한다.

특별 관심대상 이상반응(AESI, 심각하거나 심각하지 않음)은 연구 의뢰자의 의약품 또는 프로그램에 특이적인 과학적 및 의학적 우려 중 하나이며, 연구원이 지속적으로 모니터링하여 연구 의뢰자에게 신속하게 전달하는 것이 적절할 수 있다. 이러한 사건은 이를 특성화하고 이해하기 위한 추가 조사에 타당성을 부여할 수 있다. 사건의 속성에 따라, 임상시험 의뢰자가 다른 당사자(예: 규제 기관)에게 신속하게 전달하는 것이 타당할 수도 있다.

주입 반응은 주입 동안 또는 주입 완료 후 2시간 이내에 발생하는 임의의 관련 AE로서 정의된다. 모든 주입 반응은 AE로서 보고되어야 하고 등급화 되어야 한다.

연구원(또는 허락된 대리인)은 동의서 작성 시점부터 연구 종료 시까지 발생하는 모든 AE를 기록할 것이다. 실험실 이상, 활력 징후 이상 또는 ECG 이상은 AE로서 기록되어야 한다. 연구 약물과의 인관 관계에 대한 평가와 관계 없이 모든 SAE는 24시간 이내에 연구 의뢰자(또는 허락된 대리인)에게 보고해야 한다.

초기 보고 시점에 이용할 수 없었던 정보는 후속 조치 보고서로 문서화 되어야 한다. 관련 병원 기록이나 의료 기록 및 진단 시험 보고서와 같은 입증 데이터가 요구될 수도 있다. 대상체가 연구를 완료한 후에 연구원에게 SAE가 통보된 경우, 다음이 적용된다:

파트 A: 연구 종료 후 30일 이내 또는, 대상체가 연구를 일찍 종료한 경우, 마지막 연구 약물 투여 후 112일 이내에 SAE가 발생한 경우 - 이 SAE는 연구 의뢰자에게 보고된다. 연구원은 해당 사건이 만성 및/또는 안정으로 간주될 때까지 모든 노력을 기울여 결과에 대한 후속 정보를 확보해야 한다.

파트 B: 연구 종료 후 30일 이내 또는, 대상체가 연구를 일찍 종료한 경우, 마지막 연구 약물 투여 후 112일 이내에 SAE가 발생한 경우 - 이 SAE는 연구 의뢰자에게 보고된다. 연구원은 해당 사건이 만성 및/또는 안정으로 간주될 때까지 모든 노력을 기울여 결과에 대한 후속 정보를 확보해야 한다.

파트 A 및 B: 연구 종료/조기 종결 방문 후 30일이 지나서 SAE가 발생한 경우 - 치명적인 SAE 및 약물 관련 SAE로 연구원이 간주하는 것들에 대해서만 연구 의뢰자에게 보고된다. 연구원은 해당 사건이 만성 및/또는 안정으로 간주될 때까지 모든 노력을 기울여 약물 관련 SAE의 결과에 대한 후속 정보를 확보해야 한다.

결과

연구의 초기 단일 점증 투여량 부분(파트 A)에서는, H4H17319P2 대 위약이 3:1로 투여되는 7개 중 1개의 코호트에 환자들을 무작위배정하고, 0.3 mg/kg 내지 최대 30 mg/kg의 투여량을 정맥내 투여(IV)하고 300 mg/kg 내지 최대 600 mg의 투여량을 피하(SC) 투여하였다. 56명의 환자에게 H4H17319P2 또는 위약을 투여하였으며, 투여량을 투여한 후 최소 85일 동안 약동학(PK) 및 안전성 데이터를 이용할 수 있다. 맹검 데이터를 검토한 결과, 투여된 투여량 중 어느 하나와 관련된 심각하거나 중대한 이상반응이 없었으며, 사망은 보고되지 않았다. H4H17319P2 또는 위약을 이용한 치료는 IV 또는 SC 경로로 투여될 때 전체적으로 내약성이 양호하였다. 일시적인 치료 중단 또는 중단은 없었다. 가장 흔히 보고된 치료 유발 이상반응(TEAE)은 두통이었다. 안전성 실험실 매개변수, 활력 징후 또는 ECG에서 베이스라인 대비 임상적으로 유의한 이상 또는 용량 의존성 변화가 없었다.

실시예 21: 소아 환자를 대상으로 선천성 렙틴 결핍증을 치료하기 위한 항-LEPR 항체의 임상적 사용

간략하게, 환자는 생후 6개월차에 극단적인 비만증, 이상 식욕 항진증, 고인슐린혈증, 이상지질혈증, 2급 간 지방증, 및 저 렙틴 수준(0.55 ng/mL)을 나타냈다. 환자를 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 의해 렙틴 유전자 결실(LEP ^-/-)로 진단하였고, 및 이 진단은 European Medical Genetics Quality Network standards에 따라 다중 결찰 의존 프로브 증폭(multiplex ligation-dependent probe amplification)으로 확인하였다. 생후 24개월부터 환자는 메트렐렙틴 치료를 시작하였고, 이후 6개월에 걸쳐 10 kg의 체중 감소(37 kg에서 27 kg까지)로 반응하였다. 그런 다음, 환자의 체중이 빠르게 증가하기 시작했다. 환자는 최근에 극단적인 비만증과 빈번한 감염이 원인일 것으로 추정되는, 입원을 요하는 호흡기 손상을 입었다. 의사는 메트렐렙틴 투여 1시간 후에 렙틴 수준을 측정하여 중화 항체에 대해 시험하였다. 실험실 시험에서는 렙틴 수준이 <0.1 ng/mL인 것으로 나타났으며, 이를 통해 환자가 메트렐렙틴에 대한 중화 항체를 생성하였음을 확인하였다. 이러한 소견은 환자의 체중 증가의 원인을 설명하고, 더 이상은 메트렐렙틴이 이 환자의 병태의 치료를 위한 효과적인 치료법이 아니라는 것을 입증한다.

H4H17319P2 치료는 선천성 렙틴 결핍증에서 LEPR 신호 전달을 회복시키고, 이러한 병태의 이상 식욕 항진증, 체중 증가, 및 대사 합병증을 개선하는데 사용될 것이다.

추가 소아 환자에 대한 선정/제외 기준

환자가 이러한 동정적 사용 프로그램에 선정될 자격을 갖추기 위해서는 반드시 다음 기준을 충족해야 한다:

1. LEP 기능 상실 변이체 및/또는 유전자 결실의 유전적 진단이 확인된, 선천성 렙틴 결핍증

2. 성인의 경우 BMI ≥40kg/m² 및 소아의 경우 체중이 연령 및 성별 제97 백분위수를 초과하는 것으로 정의되는, 중증 비만증

3. 렙틴 수준 <1.0 ng/mL

4. 다음과 같이 정의되는, 메트렐렙틴에 대한 중화 항체의 증거:

· 치료 의사의 판단에 의한 메트렐렙틴의 효과 상실로서, 체중 증가 및 렙틴 치료에 대한 문서화된 증빙 첨부, 및

· 렙틴 주사 후 1시간차 또는 메트렐렙틴 제조업체인 Aegerion에 의해 수행된 양성 중화 항체 활성 검정에서의 렙틴 수준 <1.0 ng/mL.

선천성 렙틴 결핍증의 치료를 위해 현재 진행 중인 임상 시험에 적격인 환자는 제외된다.

투여량 선택

본원에 기술된 투여량 요법은 일반적으로 내약성이 양호할 것으로 예상된다. H4H17319P2는 0.3 내지 30 mg/kg IV 및 300 및 600 mg SC의 단일 투여량으로 투여될 때 건강한 성인 자원자에 대해 내약성이 양호하였다. 30　mg/kg IV 투여량에서 혈청 중 최고 농도인 1035 mg/L가 관찰되었는데, 이는 소아 환자를 대상으로 한 치료 과정에서 관찰될 것으로 예측된 최대 값의 거의 2배이다. 또한, 정태에서 1주의 투약 간격 동안 예측된 농도-시간 곡선 아래 면적(AUC)은, 시노몰구스 원숭이를 대상으로 한 3번의 전임상 독성학 연구로부터 유래된 약동학 모델로부터 (부작용이 관찰되지 않는 수준(NOAEL)에서) 추정된, 정태에서 동일한 투여 간격 동안의 AUC보다 적어도 8배 낮을 것으로 예상된다.

100 mg/L 이상의 혈청 중 H4H17319P2의 농도를 빠르게 달성하기 위해 5 mg/kg의 정맥내(IV) 부하 투여량을 선택하였다. 이 IV 부하 투여량을 선정하면 혈청 중 H4H17319P2의 최대 농도(C_max)를 즉시 평가할 수 있다. 유지 투여량으로 250 mg의 H4H17319P2를 매주 피하(SC) 투여하면 100 mg/L 이상의 혈청 중 저점 농도가 유지된다. 이러한 SC 투여 요법은 목표 혈청 중 저점 농도를 최선으로 유지하기 위해 IV 부하 투여량의 투여로부터 3일차에 시작된다.

치료 및 평가 일정

소아 환자에 대한 초기 치료 및 평가 계획은 표 20에 요약되어 있다. PK 및 PD 데이터가 이용 가능해지면, 치료 및 평가 권장사항을 업데이트하여 의사(들)에게 전달한다. 계획은 가능한 한 가깝게 준수해야 하며, 모든 편차가 언급되어야 한다. H4H17319P2를 투여하거나 아래 평가 중 어느 하나를 수행하기 전에 반드시 서면 동의서를 받아야 한다. 1일차에 5 mg/kg 부하 투여량을 1회 IV 투여한 후, 250 mg의 H4H17319P2를 Q7일차(주 1회) SC 투여량으로 투여한다. 제1 SC 투여량은 4일차에 투여된다.

H4H17319P2는 1일차에 IV를 통해서만 투여되며, 1시간에 걸쳐 주입된다. H4H17319P2의 정맥내 투여는 명시된 유형의 IV 주입 펌프(Alaris, Gemini, PC-1 또는 유사한 것; Baxter, Flo-Gard 6201 또는 유사한 것; Hospira, Lifecare 5000 또는 유사한 것) 및 IV 주입 세트(Baxter, 제품 코드 2C6571 또는 유사한 것; Alaris, 제품 번호 2430-0500 또는 유사한 것; Alaris, 제품 코드 11532269 또는 유사한 것; Hospira 제품 번호 14255-28 또는 유사한 것; Baxer, 제품 번호 2H6480 또는 유사한 것; Hospira 제품 번호 12336-05 또는 유사한 것)를 통해 이루어져야 한다. 인라인 필터 및 IV 주입 펌프는 1 ml/분 만큼 조금씩 정확하게 전달할 수 있어야 한다.

H4H17319P2 약물 농도 및 항-H4H17319P2 항체 측정을 위한 샘플링, 체중 평가, 대사 파라미터 평가 및 임상시험 의뢰자에 대한 샘플 발송 시점이 또한 표 20에 제공되어 있다. 환자의 H4H17319P2 수준 및 체중 측정치는, 25일차 이후에 권장 투여량 수준 및 투여 빈도를 업데이트하고, H4H17319P2 투여가 본 환자를 대상으로 이로운 징후를 나타내는 지 여부를 확립하는 데 사용될 수 있다. 항체 농도를 측정하면 선택된 투여량 및 투여 요법이 최적인지 여부, 또는 조정이 필요한지 여부를 평가할 수 있다. 약물 농도 및 항약물 항체(ADA) 평가를 위해 수집된 모든 미사용 혈청 샘플은 예상하지 못한 이상반응을 조사하는 데 사용될 수 있고, 연구 목적으로 사용될 수 있고, 최대 15년 동안 보관될 수 있다.

환자의 일상적인 표준 치료의 일환으로서 의사에 의해 수득된 임의의 기타 질환 관련 임상 매개변수는 안전성 모니터링을 목적으로 연구 의뢰자에게 전달되어야 한다. 여기에는 활력 징후와 실험실 값(간 효소, 혈액학, 대사 파라미터에 대한 혈액 화학검사)이 포함되나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 정보는 환자를 위한 추가 투여에 대한 정보를 제공할 수 있고, H4H17319P2 투여가 유익하거나 유해한 징후를 나타내는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수도 있다.

아나필락시스 또는 과민성의 경우, 추가 혈청 샘플은 가능한 한 이벤트에 가까운 시점에 수집해야 한다. 예정되지 않은 샘플 채취의 경우 추가의 라벨이 부착된다.

H4H17319P2의 IV 주입 후의 주입 반응 또는 H4H17319P2의 주사 후의 전신 반응을 치료하기 위한 응급 장비 및 약물이 시험기관에 구비되어 있어야 한다. H4H17319P2의 투여 후의 급성 IV 주입 반응 또는 전신 반응은 일반적인 임상 관행에 따라 적절한 대응을 결정하는 임상적 판단을 사용해 치료해야 한다. 치료 의사가 알게 되는 모든 안전성 관련 소견 및 이상반응은 가능한 한 빨리 임상시험 의뢰자에게 보고되어야 하며, 동정적 사용을 기반으로 한 임상시험용 의약품의 사용과 관련된 모든 현지 요건을 엄격하게 따라야 한다. 이러한 이상반응에는, 사망에 초래하거나, 생명을 위협하거나, 입원을 요하거나 기존 입원 기간의 연장을 요하거나, 지속적인 또는 중대한 장애/무능력을 초래하고, 선천성 기형/선천성 결함이거나, 중요한 의학적 사건(예컨대, 응급실 또는 집에서 알레르기성 기관지 경련에 대한 집중 치료; 입원을 초래하지 않는 혈액질환 또는 발작; 또는 약물 의존성 또는 약물 남용의 발생에 대해 응급실 또는 집에서의 집중적인 치료)인 의도하지 않은 의학적 사건을 포함한다.

IV 주입 주머니를 통해 투여되는 5 mg/kg 투여량의 H4H17319P2의 제조

5 mg/kg의 투여량으로 IV 주머니에 첨가될 재구성된 H4H17319P2의 부피는 아래 표 21에 나열되어 있다.

5 mg/kg의 투여량을 맞추기 위해 100 mL의 식염수가 담긴 IV 주머니에 첨가할 50 mg/mL H4H17319P2의 양
환자 체중 (kg)	IP 부피(ml)	IV 주머니에서 덜어 낼 식염수의 부피 (mL)	IP 바이알 수
40	4.0	4.0	1
41	4.1	4.1	1
42	4.2	4.2	1
43	4.3	4.3	1
44	4.4	4.4	1
45	4.5	4.5	1
46	4.6	4.6	1
47	4.7	4.7	1
48	4.8	4.8	1
49	4.9	4.9	2
50	5.0	5.0	2
51	5.1	5.1	2
52	5.2	5.2	2
53	5.3	5.3	2
54	5.4	5.4	2
55	5.5	5.5	2
56	5.6	5.6	2
57	5.7	5.7	2
58	5.8	5.8	2
59	5.9	5.9	2
60	6.0	6.0	2
61	6.1	6.1	2
62	6.2	6.2	2
63	6.3	6.3	2
64	6.4	6.4	2
65	6.5	6.5	2
66	6.6	6.6	2
67	6.7	6.7	2
68	6.8	6.8	2
69	6.9	6.9	2
70	7.0	7.0	2
71	7.1	7.1	2
72	7.2	7.2	2
73	7.3	7.3	2
74	7.4	7.4	2
75	7.5	7.5	2

IP=임상시험용 의약품

H4H17319P2의 각 바이알은 4.9 mL의 주사용 멸균수와 함께 재구성될 것이다.

재구성되면, H4H17319P2의 각 바이알에는 4.8 mL의 인출 가능한 부피가 담긴다. IV 투여를 위해 재구성될 때, 바이알 내 H4H17319P2의 농도는 50 mg/mL가 된다. 재구성의 단계는 다음과 같다:

1. 0.9% 염화나트륨의 100 mL 주입 주머니와 함께, 필요한 수만큼 동결건조된 H4H17319P2의 바이알을 확보한다.

2. 단단하고 깨끗한 표면 상에서 H4H17319P2를 준비한다.

3. 바이알(들)의 캡(들)을 제거하고, 바이알의 상단면을 알코올 솜으로 닦아낸다.

4. 투여에 사용될 각 바이알에 대해, 1개의 21-게이지 바늘과 10.0 mL 폴리프로필렌 주사기를 확보한다. 바늘의 캡을 제거하지 않고, 21-게이지 바늘을 10.0 mL 폴리프로필렌 주사기에 부착한다. 커버가 덮인 상태로, 10.0 mL 주사기 상에서 플런저를 5.5 mL 마크까지 당긴다. 이는 공기를 주사기 내로 흡인하기 위한 것이다.

5. 21-게이지 바늘의 캡을 제거한다. 주사용 멸균수가 담긴 바이알의 상단 고무마개 안으로 바늘을 삽입한다. 플런저를 밀어 그 안의 공기를 모두 바이알에 주입한다. 한 손으로 바이알을 뒤집어 바늘의 선단이 물 속에 있도록 한다. 적어도 5.5 mL의 주사용 멸균수를 주사기 내로 빨아들인다. 바늘을 오염된 표면에 놓거나, 손가락으로 바늘을 만지거나, 바늘을 직접 불어서는 안된다.

6. (바늘이 위로 가게) 주사기를 뒤집고 공기가 주사기로부터 다 빠져나올 때까지 플런저를 눌러 주사기를 프라이밍한다. 소량의 액체가 나오고, 플런저가 4.9 mL에 도달할 때까지 플런저를 계속 눌러 준다.

7. H4H17319P2 바이알을 단단한 면에 놓고 상단에 바늘을 삽입한다. 4.9 mL의 주사용 멸균수를 약물 바이알에 첨가하되, 멸균수가 바이알의 측면을 통해 분말 약물 속으로 흘러 들어가게 유도한다.

8. 모든 멸균수를 주사기로부터 바이알에 밀어 넣은 후 바이알에서 니들을 제거한다. 바늘과 주사기는 Sharps 용기 내에 버린다.

9. 모든 분말이 용해될 때까지 바이알을 세운 상태에서 부드럽게 돌려 준다.

10. 바이알을 진탕해서는 안된다. 진탕 시 거품이 생길 수 있다.

H4H17319P2의 IV 투여

항체를 투여하는 단계는 다음과 같다:

1. 표준 무균 기술을 사용해, 적당한 크기의 폴리프로필렌 주사기와 21-게이지 바늘을 사용해 적당량의 H4H17319P2를 표 21에 따라 인출한다. 바늘을 오염된 표면에 놓거나, 손가락으로 바늘을 만지거나, 바늘을 직접 불어서는 안된다.

2. 100 mL IV 주머니에 H4H17319P2 용액을 첨가하기 전에, IV 주머니에 첨가할 H4H17319P2의 부피와 동일한 부피의 0.9%의 염화나트륨을 IV 백으로부터 인출한다.

3. 적절한 부피의 H4H17319P2를 IV 주머니에 추가한 다음, IV 주머니를 10회 뒤집어 약물과 0.9% 염화나트륨이 잘 섞이게 한다.

4. 준비된 IV 주머니에는 시험기관에 의해 승인된 라벨링 요건에 따라 라벨을 부착한다. 라벨은 다음을 포함해야 한다: 환자 이니셜, 제조 일자/시간, 0.9% 염화나트륨 주머니 중 H4H17319P2의 양(mg) 1x1, 주입 백의 전체 내용물을 정맥내 주입하되 프로토콜에 따라 1시간에 걸쳐 흘러 들어가게 하라는 지침, 사용자 날짜/시간 및 치료의사의 이름.

5. H4H17319P2는 재구성 후 4시간 내에 주입해야 한다.

H4H17319P2의 피하 제제 및 투여

H4H17319P2의 각 바이알은 1.4 mL의 주사용 멸균수와 함께 재구성될 것이다. 재구성되면, 각 바이알에는 1.2 mL의 인출 가능한 부피가 담긴다. SC 투여를 위해 재구성될 때, H4H17319P2의 농도는 150 mg/mL가 된다. 투여를 위해서는 H4H17319P2의 바이알 2개가 필요하다.

1. 단단하고 깨끗한 면 상에서 H4H17319P2를 준비한다.

2. 바이알(들)의 캡(들)을 제거하고, 바이알(들)의 상단면을 알코올 솜으로 닦아낸다.

3. 바늘의 캡을 제거하지 않고, 21-게이지 바늘을 3.0 mL 폴리프로필렌 주사기에 부착한다. 커버가 덮인 상태로, 주사기 상에서 플런저를 2.0 mL 마크까지 당겨 주사기 내에 공기를 흡인한다. 21-게이지 바늘의 캡을 제거한다. 주사용 멸균수가 담긴 바이알의 상단 고무마개 안으로 바늘을 삽입한다. 플런저를 밀어 그 안의 공기를 모두 바이알에 주입한다. 한 손으로 바이알을 뒤집어 바늘의 선단이 물 속에 있도록 한다. 최소한 2.0 mL의 주사용 멸균수를 주사기 내로 빨아들인다. 바늘을 오염된 표면에 놓거나, 손가락으로 바늘을 만지거나, 바늘을 직접 불어서는 안된다.

4. (바늘이 위로 가게) 주사기를 뒤집고 공기가 주사기로부터 다 빠져나올 때까지 플런저를 눌러 주사기를 프라이밍한다. 소량의 액체가 나오고, 플런저가 1.4 mL 마크에 도달할 때까지 플런저를 계속 눌러 준다.

5. H4H17319P2 바이알을 단단한 면에 놓고 상단에 바늘을 삽입한다. 1.4 mL의 주사용 멸균수를 H4H17319P2 바이알에 첨가하되, 멸균수가 바이알의 측면을 통해 분말 약물 속으로 흘러 들어가게 유도한다.

6. 모든 멸균수를 주사기로부터 바이알에 밀어 넣은 후 바이알에서 니들을 제거한다. 바늘과 주사기는 Sharps 용기 내에 버린다.

7. 모든 분말이 용해될 때까지 바이알을 세운 상태에서 부드럽게 돌려 준다.

8. 바이알을 진탕해서는 안된다. 진탕 시 거품이 생길 수 있다.

250 mg 투여량의 H4H17319P2의 SC 투여

이 투여량은 H4H17319P2를 2회 주사해야 한다. 한 번의 주사는 0.67 mL SC 주사이고, 다른 한번은 1.0 mL SC 주사이다.

1. 1.0 mL 폴리프로필렌 플라스틱 주사기 및 3.0 mL 폴리프로필렌 주사기를 확보하고, 21-게이지 바늘을 각 주사기에 부착한다.

2. 동결건조된 H4H17319P2의 바이알 2개를 확보한다.

3. 위에 표시된 바와 같이, 동결 건조된 H4H17319P2의 각 바이알을 1.4 mL의 멸균수와 함께 재구성한다.

4. 바늘 커버가 덮인 상태로, 1.0 mL 폴리프로필렌 주사기 상에서 플런저를 1.0 mL 마크까지 당겨 주사기 내에 공기를 흡인한다.

5. 바늘 캡을 제거하고 바이알의 상단 고무마개 안으로 바늘을 삽입한다.

6. 플런저를 밀어 그 안의 공기를 모두 바이알에 주입한다.

7. 바늘이 바이알 안에 둔 상태로, 한 손으로 바이알을 뒤집어 바늘의 선단이 액체 속에 있도록 한다. 다른 손을 사용해 플런저를 끌어 당겨서 최소 1.0 mL의 약물을 주사기 내로 흡인한다. 바늘에 캡을 씌운다. 캡을 씌운 바늘을 제거해 Sharps 용기에 넣는다.

8. 바늘의 커버를 제거하지 않고, 최소 1.0 mL의 약물이 담긴 1.0 mL 폴리프로필렌 주사기에 27-게이지 0.5 인치 바늘을 부착한다.

9. 바늘 캡을 제거하고, 약물로 27-게이지 0.5 인치 바늘을 프라이밍한다. 바늘에 캡을 씌운다.

10. 준비된 SC 주사기는 0.67 mL = 100 mg/0.67 mL이다.

11. 준비된 SC 주사기에는 시험기관의 표준 작업 지침서에 따라 라벨이 부착된다.

12. 바늘 커버가 덮인 상태로, 3.0 mL 폴리프로필렌 주사기 상에서 플런저를 1.5 mL 마크까지 당겨 주사기 내에 공기를 흡인한다.

13. 바늘 캡을 제거하고 바이알의 상단 고무마개 안으로 바늘을 삽입한다.

14. 플런저를 밀어 그 안의 공기를 모두 바이알에 주입한다.

15. 바늘이 바이알 안에 둔 상태로, 한 손으로 바이알을 뒤집어 바늘의 선단이 액체 속에 있도록 한다. 다른 손을 사용해 플런저를 끌어 당겨서 최소 1.2 mL의 약물을 주사기 내로 흡인한다. 바늘에 캡을 씌운다. 캡을 씌운 바늘을 제거해 Sharps 용기에 넣는다.

16. 바늘의 커버를 제거하지 않고, 최소 1.2 mL의 약물이 담긴 1.0 mL 폴리프로필렌 주사기에 27-게이지 0.5 인치 바늘을 부착한다.

17. 바늘 캡을 제거하고, 약물로 27-게이지 0.5 인치 바늘을 프라이밍한다. 바늘에 캡을 씌운다.

18. 준비된 SC 주사기는 1.0 mL = 150 mg/1.0 mL이다.

19. 준비된 SC 주사기에는 시험기관의 표준 작업 지침서에 따라 라벨이 부착된다.

20. H4H17319P2는 재구성 후 4시간 내에 전달되어야 한다.

H4H17319P2의 영구 중단

다음의 경우에, H4H17319P2의 투여가 영구적으로 중단되도록 권고된다:

· H4H17319P2와 관련된 것으로 간주되는 심각한 또는 중증 알레르기 반응

· 특정 유형의 간 기능 장애(예: Hy의 법칙이 [Guidance for Industry Drug Induced Liver Injury: Premarketing Clinical Evaluation FDA 2009]를 충족한 경우)

· 임신의 증거

· 환자/법정 대리인의 동의 철회

· 연구 의뢰자에 의해 H4H17319P2의 최적 투여량 및 투여 요법으로 간주된 것으로 일정 기간(치료 의사 및 연구 의뢰자에 의해 논의될 것임) 치료한 후, 환자가 임상적 이익(체중 감소)을 나타내지 않는 경우.

H4H17319P2의 일시적 중단

다음의 경우에, H4H17319P2의 투여가 일시적으로 중단되도록 권고된다:

· 호중구 수 ≤1.0 x 10³/μL

· ALT/AST 값이 정상 상한치(ULN)의 3배보다 더 큰 상태를 유지하고 + 총 빌리루빈 >2x ULN이거나 단리된 AST/ALT >5x ULN인 경우

· 수술 절차

· 입원

H4H17319P2 일시 중단을 초래한 조건이 해결되면, H4H17319P2 투여를 재개할 수 있다. H4H17319P2의 일시적 중단 및/또는 H4H17319P2 투여 개개의 결정은 연구 의뢰자 대표와 논의해야 한다.

상황의 긴급성으로 인해 즉각적인 조치가 요구되는 경우, 및 환자의 이익을 위한 최선이라고 결정되는 경우에 치료 의사는 연구 의뢰자 대표와의 협의 없이도 H4H17319P2 투여를 언제라도 일시적으로 중단할 수 있다. 그러나, 연구 의뢰자 대표에게는 가능한 한 빨리 연락해야 한다. H4H17319P2 투여를 재개하는 것은 치료 의사와 연구 의뢰자 대표자 간에 논의되고 서로 동의해야 한다.

요약하면, H4H17319P2는 선천성 렙틴 결핍증 환자에서 LEPR 신호 전달을 회복시키고, 환자에게서 이러한 병태의 이상 식욕 항진증, 체중 증가, 및 대사 합병증을 개선하거나 역전할 것이다.

실시예 22: 소아 환자에서 부분 지방이영양증의 치료를 위한 항-LEPR 항체의 임상적 사용

11세 때, 한 여성 환자는 간비장 비대 및 고 중성지방(>500 mg/dL)을 나타냈을 뿐만 아니라 사지 지방 결여를 보였다. 그녀는 항-GAD(글루탐산 데카르복실라아제) 항체를 가지고 있는 것으로 밝혀졌고, 상용 LMNA 유전자 분석은 음성이었다. 지방이영양증과 관련된 간 질환의 치료에 있어서 메트렐렙틴의 효능을 평가하는 연구에 대한 평가 시점에 식별된 추가 특징에는 손 구축, 척추 측만증, 및 성증발생(adrenarche) 결여의 비정형적 특징이 있었다. 그녀의 베이스라인 렙틴 수준은 3.2 ng/dL이었다.

그녀는 13세 때, 고 중성지방과 중증 간 지방증을 치료하기 위한 임상 연구 프로토콜(ClinicalTrials.gov 식별자: NCT01679197)의 일환으로서 메트렐렙틴 치료를 시작하였고, 임의의 중대한 이상반응 없이 12개월 동안 메트렐렙틴 치료를 계속하였다. 그녀의 대사 파라미터는 메트렐렙틴 이후에 약간의 개선을 나타냈지만, 그녀의 간 생검에서는 개선이 나타났다. 그녀는 다른 연구 프로토콜(ClinicalTrials.gov 식별자: NCT02654977)의 일환으로서 메트렐렙틴 치료를 계속하였다. 그러나, 치료의 17개월차 동안에 환자는 피로, 갈증, 시야 흐림 및 번갈을 보고하였으며, 1개월 동안 5파운드의 체중이 줄어들었다. 실험실 결과는 양성 음이온 갭 및 양성 케톤을 수반하는 유의한 고혈당증 및 고지혈증으로 나타났다. 항-GAD65 (글루탐산 데카르복실라아제의 이소형 65 kDa) 수준은 5.39 nmol/L이었고(2개월 후 재측정 시 항-GAD65는 8.38 nmol/L), 주사 후 1시간 만에 인출한 렙틴 수준은 검출 불가하였다. 중화 활성을 갖는 메트렐렙틴 항체의 존재가 최종적으로 확인되었다. 렙틴 값이 이렇게 낮은 것은 진행 중인 메트렐렙틴 치료에 대한 면역원성 교차반응성의 결과로 항-메트렐렙틴 항체 형성, 가능하게는 지방 조직의 지속적인 손실, 또는 렙틴 생산을 억제하는 메커니즘으로 인한 것일 가능성이 있었다.

6개월 후에는, 메트렐렙틴 뿐만 아니라 내인성 렙틴에 대한 중화 활성이 양성으로 확인되었다. 이 기간 동안, 혈당과 지질 조절이 실질적으로 더 나빠졌으며, 중성지방은 지속적으로 >2,000 mg/dL이었다. 그녀는 고 투여량 인슐린 치료와 함께 기저+볼루스 요법을 유지하였고, 인슐린 펌프로 바꾸었다. 그녀는 메트포르민 투여도 시작했다. 당뇨병성 케토산증, 췌장염 또는 췌장염 예방을 위해 여러 번 입원해야 했다.

그런 다음, 지질 조절이 나빠진 탓에(중성지방 >2,000 mg/dL) 환자는 페노피브레이트의 투여를 시작하고, 이어서 피오글리타존의 투여를 시작하였다. 메트렐렙틴을 중단하고 1개월 후, LFT는 정상 수준보다 실질적으로 10배까지 상승하였다. 간 생검의 결과, 자가면역 간염과 일치하는 혈장 세포 및 계면 손상을 포함하는 성긴 문맥 및 문맥 주위 염증이 나타났다. 자가면역 간염을 관리하기 위해, 그녀는 3개월 동안 프레드니손 치료를 받았고, 이는 간 기능 이상을 해결하는 데 도움이 되었다. 프레드니손 중단 도중 및 중단 후, 환자는 당뇨병성 케톤산증과 함께 고 중성지방 혈증(높게는 8,000 mg/dL)으로 인한 급성 췌장염의 여러 에피소드를 겪었다. 위에서 언급된 대사 합병증 또는 췌장염으로 인해, 환자는 정기적으로 입원하였다.

환자는 1 mg/일의 세트멜라노티드(ClinicalTrials.gov 식별자: NCT03262610)로 치료를 시작했고, 중성지방이 500 mg/dl 아래로 떨어질 때까지 투여량을 상향으로 적정하였다. 세트멜라노티드는 이 환자의 체중을 감소시키지는 않았다. 배고픔 척도가 약간 감소하였지만, 효과가 강력하지는 않았다. 치료는 혈당 조절 및 고 중성지방 혈증을 개선하지 못했다. 총 일일 인슐린 투여량의 약간 감소하였지만, HbA1c 수준이 높게 유지되었기 때문에 임상적으로 유의한 것으로 간주되지 않았다. 모세혈관이 약간 감소하였지만, 세트멜라노티드는 간 지방량에 영향을 미치지 않았다.

환자의 중성지방 수준이 상승하였기 때문에(>500 mg/dL 및 높게는 >2,000 mg/dL) 재발성 췌장염을 예방하기 위해서는 혈장 교환 요법이 요구된다. 그녀는 인슐린 아스파르트, 인슐린 글라진 및 메트포르민 외에 매일 10 mg의 엠파글리플로진으로도 치료 중이다.

이론적 근거

본 임상 연구 프로토콜의 목적은 요구되는 적합성 기준을 충족하고 아래에 명시된 기준을 충족하는 환자에게 임상시험용 의약품(IP)인 H4H17319P2를 제공하는 것이다:

· 환자가, 동정적 사용승인이 허락되는 심각하거나 생명을 위협하는 질환을 가짐.

· 약물의 제안된 작용 메커니즘에 기초하여 임상적으로 의미 있는 이점이 기대될 수 있다는 충분한 효능의 증거.

· 질환 또는 상태를 치료하기 위한 비슷하거나 만족스러운 대체 요법이 없음.

· 이 환자에게 H4H17319P2를 투여함으로써 부당한 위험이 있을 수 있음을 시사하는 고유한 것이 이 특정 환자에게는 없음.

중화 활성을 갖는 항-메트렐렙틴 항체가 메트렐렙틴으로 치료된 전신성 지방이영양증 환자에서 확인된 적이 있다. 이러한 중화 항체로 인한 결과가 잘 특성화되어 있지는 않지만, 내인성 렙틴 작용의 억제 및/또는 메트렐렙틴 효능의 상실을 포함할 수 있을 것이다(Chan, 등 Immunogenicity associated with Metreleptin treatment in patients with obesity or lipodystrophy. Clin Endocrinol. 2016;85(1):137-149). 심각한 감염증 및/또는 대사 조절의 악화가 보고되었다. 진행성 대사 악화 뿐만 아니라 1형 당뇨병이 출현이 이 환자에게서 항-메트렐렙틴 중화 항체의 출현과 동시에 나타났으며, 지속되었다. 질환이 자연적으로 진행되었는지 또는 항체의 출현이 어떤 역할을 했는지에 대해서는 명확하지 않다. 그럼에도 불구하고, 환자의 지방이영양증은 적절히 치료될 수 없다.

이러한 개별 환자의 동정적 사용승인 프로토콜의 목적은, 췌장염의 재발로 이어지는 불응성 고 중성지방 혈증을 갖는 이 환자에서 지방이영양증으로 인한 중증 대사 합병증의 잠재적 치료제로서 H4H17319P2를 제공하는 것이다. 또한, 이 환자에서 H4H17319P2의 안전성 및 효능이 평가될 것이다. 치료 기간은 고 중성지방 혈증 및 재발성 췌장염을 앓고 있는 중증 지방이영양증 환자인 이 단일 환자의 반응 정도에 따라 달라지며, 치료의 의도는 중증 대사 이상을 개선하는 데 H4H17319P2가 치료적 이점을 제공할 수 있는지를 평가하는 것이다.

일차 평가변수:

· 베이스라인 대비 24주차 공복 중성지방의 변화율

· 진행 중인 혈장반출(plasmapheresis) 없이 24주차에 공복 중성지방 <500 mg/dL의 달성

· 치료 유발성 이상반응

이차 평가변수

· 베이스라인 대비 12주차 공복 중성지방의 변화율

· 진행 중인 혈장반출 없이 12주차에 공복 중성지방 <500 mg/dL의 달성

· 시간 경과에 따른 공복감 점수(hunger score)의 베이스라인 대비 변화

· 시간 경과에 따른 공복 혈당 및 당화 헤모글로빈(HbA1c)의 베이스라인 대비 변화

· 시간 경과에 따른 췌장염으로 인한 입원 회수

· 시간 경과에 따른 평균 인슐린 요구 투여량의 베이스라인 대비 변화

· 시간 경과에 따른 다른 공복 지질 파라미터(총 공복 콜레스테롤, HDL-C, LDL-C 및 VLDL-C 포함)의 베이스라인 대비 변화

· 이 환자를 대상으로 한, 시간 경과에 따른 DEXA 및 간 지방 파라미터(가능한 경우)의 베이스라인 대비 변화율

· 시간 경과에 따른 혈청 중 총 H4H17319P2의 농도

· 시간 경과에 따른 H4H17319P2에 대한 항약물 항체(ADA)의 존재

프로토콜 설계

프로토콜은 2주의 스크리닝 기간 및 3개의 개방 표지 치료 기간을 포함한다: 치료 기간 1(1~12주차), 치료 기간 2(13~24주차) 및 치료 연장 기간(25~52주차). 스크리닝 기간 동안, 환자는 적격성 평가를 받게 되고, H4H17319P2로 치료하기 전에, 지방이영양증 및 지방 조직의 부재 또는 부족으로 인한 내인성 렙틴의 부재 또는 결핍과 관련된 공복 증상의 이해를 돕기 위해 최소 별개인 3일 동안 공복감 설문지를 작성하도록 요청을 받게 된다. 이러한 병태는 희귀하므로, 스크리닝 중에 공복감 점수를 확보하면 환자에게 특이한 중요 세부 사항을 수집할 수 있고, 이는 이러한 장애를 대상으로 한 공복감 증상을 더 잘 이해할 수 있게 한다.

치료 기간 1 동안, 환자는 H4H17319P2의 초기 투여 요법을 투여 받는다. 치료 기간 1의 종료 시(12주자), 효능 평가(TG 저하) 및 H4H17319P2 약물 수준(PK) 평가를 수행하여 치료 기간 2를 위한 H4H17319P2 투여 요법을 결정하게 될 것이다. 치료 기간 2에서의 투여량 수준 및 투여 빈도는 치료 기간 1의 수준을 초과하지 않을 것이다. 24주차에, 효능 평가(TG 저하) 및 H4H17319P2 약물 수준(PK) 평가를 수행하여, 치료 연장 기간을 계속할 환자의 적격성을 결정한다.

따라서, 이 환자는 도 19에 도시된 바와 같이 프로토콜을 통해 순차적으로 진행하게 될 것이다.

공복 중성지방(TG) 수준 및 혈장반출의 필요성이 치료 효과가 달성되었는지 여부를 평가하는 데 사용되는 주요 기준일 것이다. 이 환자가 24주차까지 공복 TG 수준 <500 mg/dL까지 필요한 치료적 목표 반응을 나타내지 않으면, 프로토콜에서 제외될 것이다.

고 중성지방 혈증의 동시 관리를 위해, 이 환자에게는 치료 의사의 판단 하에 필요에 따라 혈장반출 치료를 계속할 자격이 주어질 것이다. H4H17319P2 치료에 대한 치료 반응이 달성되었는지 여부를 결정하기 위한 공복 TG 수준은 가장 마지막 혈장반출 치료로부터 적어도 1주일 후에 한 번에 측정되어야 한다.

투여량 선택

실시예 15 내지 19에서 전술한 전임상 연구에서, PD 효과는 H4H17319P2에 대한 광범위한 노출과 관련이 있었던 반면, 효과의 지속가능성은 H4H17319P2의 표적 매개 제거(TMC)가 포화되는 투여 조건 하에서 관찰되었다. (전술한) 지방이영양증의 마우스 모델에서, H4H17319P2의 단일 투여량은 포도당 농도를 정상화시켰고 체중은 줄어들었다. 이들 효과는 4 mg/L를 초과하는 혈청 중 H4H17319P2의 농도에서 분명하였지만, TMC 경로를 포화시키는 농도에서 특히 더 유지되었다. 전술한 원숭이 연구에서, 30 mg/L보다 높은 정태 농도에서 지속적인 체중 효과(대조군 동물과 비교했을 때, 체중 감소 또는 감소된 체중의 증가 중 하나)가 관찰되었다. 그러나, H4H17319P2의 농도가 원숭이에서 TMC를 포화시키는 데 필요한 농도인 100 mg/L을 초과할 때 더 전체적인 효과가 관찰되었다. 렙틴 결합 수용체가 광범위하게 발현되지만 표적 (신호전달) 수용체가 중추 신경계에 대해 제한된다면, 전임상 PK/PD 데이터는 뇌에서의 적절한 노출을 달성하기 위해 말초 LEPR에 대한 결합과 관련된 TMC를 포화시킬 필요성을 반영하는 것으로 추정된다. 또한, TMC를 포화시키고 지속적인 PD 효과를 전달하기 위해 필요한 농도의 종간 차이는 말초 표적 부담에서의 차이의 결과일 수 있다.

실시예 20에 기술된 인간 임상 연구에서, TMC 경로의 포화도는 농도 대 시간 프로파일에 기초하여 100 mg/L를 초과하는 혈청 농도에서 분명하였다. 건강한 자원자에 단일 투여량으로 투여될 때, H4H17319P2의 관련 약동학적 특성을 포착하는 본 FIH 연구의 데이터를 이용해 모집단 PK 모델을 구축하였다. 이 모델은 건강한 자원자에게서 관찰된 H4H17319P2의 PK 특성이 이 환자와 관련이 있다는 가정 하에, 다른 투여 요법에서의 예상 농도 프로파일을 시뮬레이션하기 위해 사용되었다.

H4H17319P2는 동결건조된 분말로서 IV 또는 SC 투여를 위한 멸균, 일회용, 20 mL 유리 바이알에 제공될 것이다. 각 바이알에는 265 mg의 H4H17319P2가 담기며, 이는 IV 투여 및 SC 투여를 위해 주사용 멸균수와 함께 재구성될 것이다.

100 mg/L 이상의 혈청 중 H4H17319P2의 농도를 빠르게 달성하기 위해 5 mg/kg의 정맥내(IV) 부하 투여량을 선택하였다. 이 IV 부하 투여량을 선정하면 혈청 중 H4H17319P2의 최대 농도(C_max)도 즉시 평가할 수 있다. 유지 투여량으로 300 mg의 H4H17319P2를 매주 피하(SC) 투여하면 100 mg/L 이상의 혈청 중 저점 농도가 유지된다. 이러한 SC 투여 요법은 IV 부하 투여량의 투여로부터 4일차에 시작되며, 목표 혈청 중 저점 농도를 최선으로 유지할 것으로 예상된다. 환자가 임상적으로 표시된 혈장반출을 수행하는 날에는, 혈장반출이 완료된 후에 H4H17319P2를 투여해야 한다.

건강한 56명의 피험자에서 진행 중인 2파트 연구의 첫 번째 파트의 데이터(실시예 20)에 기초하면, 설명된 투여량 요법은 일반적으로 내약성이 양호할 것으로 예상된다. H4H17319P2는 0.3 내지 30 mg/kg IV 및 300 mg와 600 mg SC의 단일 투여량으로 투여될 때 실시예 20의 건강한 성인 자원자에 대해 내약성이 양호하였다. 1035 mg/L의 혈청 중 최대 농도는 30 mg/kg IV 투여량으로 관찰되었고, 이는 연구 과정에 걸쳐 이 환자에서 달성될 것으로 예상되는 최대 노출의 6배보다 더 크다. 또한, 정태에서 1주의 투약 간격 동안 예측된 농도-시간 곡선 아래 면적(AUC)은, 시노몰구스 원숭이를 대상으로 한 3번의 전임상 독성학 연구로부터 유래된 약동학 모델로부터 (부작용이 관찰 되지 않는 수준(NOAEL)에서) 추정된, 정태에서 동일한 투여 간격 동안의 AUC보다 거의 27배 더 적을 것으로 예상된다.

초기 투여량인 5 mg/kg IV 부하 투여량 + 300 mg의 매주 SC 유지는 투여량은 내약성이 있을 것으로 예상되며, 이는 말초 수용체를 포화시켜 지속적인 약리학적 효과를 제공하는 H4H17319P2의 혈청 농도를 빠르게 달성하도록 선택되었다. 더 낮은 투여 수준 또는 덜 빈번한 투여가 동일한 효능을 나타낼 수 있는 것도 가능하다. 따라서, 투여 수준 및 투여 빈도는 계획된 중간 효능 및 약물 수준 평가를 완료한 후에 하향 조정될 수 있다. 또한, 혈장반출이 순환으로부터 H4H17319P2를 포함하는 항체를 제거할 수 있으므로, 효과적인 H4H17319P2 수준을 보장하기 위해 투여를 혈장반출 후로 조정하는 것이 필요할 수 있다. 환자가 혈장반출을 수행하는 날에는, 목표 약물 농도를 달성하기 위해 300 mg의 H4H17319P2를 추가로 투여하는 것이 필요할 수 있다. 일상적인 최대 투여량(혈장분리로 인한 변화를 고려하지 않는 경우)은 매주 300 mg SC를 초과해서는 안된다.

효능 및 약물 수준 평가

효능 및 약물 수준의 중간 평가는 선택된 투여 요법이 예상 약물 수준 및 PK 프로파일을 달성했는지 및 지질 매개변수에 영향을 미치는지 평가하기 위해 프로토콜의 12주차 및 24주차에 수행될 것이다. 투여 수준 및 투여 빈도는 필요에 따라 효능 및 약물 수준 평가 후에 조정될 수 있다.

데이터 검토위원회는 (1) 숙련된 지방이영양증 전문의, (2) 환자의 소아과 중환자실 의사, (3) 그녀의 치료와 관련된 준전문의 중 한 명(소아 GI 또는 간 분야) 및 (4) 전임상 및 임상 연구에서 H4H17319P2 노출-반응 관계에 정통한 연구 의뢰자의 대표(들)를 포함한다.

환자 참여 지속시간

총 프로토콜 기간은 스크리닝 기간을 포함하여 54주 정도로 예상된다. 본 프로토콜에 대한 환자의 참여는 다음 기간으로 이루어진다: 스크리닝 기간, 치료 기간 1[기간 12주 예상], 치료 기간 2[기간 12주 예상], 그 후 환자가 자격을 갖추고 있는 경우, 장기 치료 연장 기간[28 주]. 치료 연장 기간 동안 양호한 안전성 및 내약성과 함께 실질적인 대사 개선이 입증되는 경우, 환자에게는 향후 별도의 연장 프로토콜에 등록하여 지속적인 치료를 받을 수 있는 기회가 제공될 수 있다. 이러한 향후 확장 프로토콜은, 현재 프로토콜의 기간을 넘어서 환자에게 투여가 이루어지기 전에, 해당 규제 당국에 제출되고 이들로부터 승인을 받게 될 것이다.

임상 종료는 마지막 환자의 마지막 방문으로 정의될 것이다. 환자는 어떠한 이유로든, 언제라도 아무런 영향 없이 본 프로토콜에서 철수할 권리를 갖는다. 연구원은 임상 안전성 우려 또는 효능 부족으로 인해 언제든지 환자를 철회 시킬 수 있다.

프로토콜 중단

본 프로토콜의 실행은, 임상시험 책임자 또는 연구 의뢰자의 견해에 따라 충분히 합당한 사유가 있는 경우 조기에 종료될 수 있다. 종료 당사자는 프로토콜 종료 사유를 문서화한 서면 통지를 연구원 또는 연구 의뢰자에게 보낼 것이다.

종료가 타당한 상황에는 다음이 포함되나 이에 국한되지는 않는다:

· 환자에 대한 예상치 못한, 유의미하거나 또는 용인할 수 없는 위험의 결정

· 프로토콜 요건 준수 미흡

· 완료 데이터 및/또는 평가 가능한 데이터 미흡

· 임신의 증거

· 약물과 관련된 것으로 간주되는 심각한 또는 중증 알레르기 반응

· 설명할 다른 이유를 찾을 수 없는 중증 간 손상 또는 기능 장애, 예컨대, 바이러스성 A, B 또는 C형 간염; 기존의 간 질환 또는 급성 간 질환; 또는 관찰된 손상을 야기할 수 있는 또 다른 약물. 이 환자의 간 손상은 ALT 또는 AST > 3 x 평균 베이스라인 및 총 빌리루빈 > 2 x 베이스라인(또는 국제 정규화 비율(INR) >1.5)으로서 정의된다.

· 환자의 동의 철회

· 약물 개발을 수정, 보류 또는 중단하는 계획

· 12주차 데이터 검토에서, 충분한 이점이 관찰되지 않았다는 데이터 검토 위원회의 의견

· 24주 데이터 검토에서, 환자가 동시 혈장반출 관리 없이 공복 TG 값을 <500 mg/dL로 일관되게 유지할 수 없다는 데이터 검토 위원회의 의견.

데이터 검토 위원회가 만장일치 의견으로, 환자가 동시에 혈장반출 관리 없이는 TG 값을 500 mg/dL 미만으로 일관되게 유지할 수 없음에도 불구하고 상당한 임상적 이익을 경험하고 있다고 판단하는 것이면, 치료 방문이 종료되는 52주차까지 투여를 계속할 수 있다.

치료 순응도 평가

약물의 안전성, 내약성 및 약동학을 평가하기 위해, 환자가 지시된 대로 H4H17319P2를 투여받는 것이 중요하다. 사용된 모든 H4H17319P2는 프로토콜의 준수 여부를 평가하기 위해 수집될 것이다.

첫 2회의 프로토콜 기간(초기 투여 기간과 개방 표지 활성 치료 기간) 동안, H4H17319P2는 숙련된 간병인에 의해서 환자에게 투여될 것이다. 개방 표지 연장 기간 동안, H4H17319P2는 각각 임상시험 실시기관에서 투여하거나, 자가 투여하거나/환자가 투여하거나, 지정된 사람이 투여할 수 있다. 환자가 H4H17319P2를 자가 투여하거나 지정된 사람으로 하여금 H4H17319P2를 투여하게 하기로 선택하는 경우, 반드시 자격을 갖춘 임상시험 실시기관의 직원에 의해 H4H17319P2 투여에 대한 교육이 이루어져야 하며, 첫 번째 자기 투여는 동일인이 반드시 관찰해야 한다. 또한, 자기 투여의 개시 또는 부모나 간병인과 같이 지정된 사람에 의한 투여의 개시 전에, 환자/지정인에게 의약품 투여 일지가 제공할 것이다. 일지는 약물이 투여될 때마다 반드시 작성해야 한다. 준수 여부를 모니터링 하기 위해 환자 및/또는 보호자는 일지를 꾸준하게 작성할 필요가 있다. 또한, 투여 시간이 환자 일지에 기록될 것이다. 환자가 약물의 전체 투여량을 투여받지 못하는 경우, 투여된 양을 기록한다. 투여량이 조정된 이유(들)는 근거 문서와 CRF에 기록해야 한다.

또한, SOA에 따라 혈액 샘플을 채취하여 혈청 중 H4H17319P2 및 항-H4H17319P2 항체의 저점 농도를 측정하게 된다.

이전 치료와 병용 치료 및 절차/허가된 의약품

병용 약물이 강력한 잠재적 안전성 문제를 드러낼 가능성이 없는 한, 이 프로토콜의 일반적인 목적은 이러한 매우 희귀한 병태를 가진 환자가 프로토콜에 참여할 수 있게 하는 것이다. 따라서, 환자에게는 프로토콜에 참여하는 동안 (예를 들어, 후술하는 바와 같은) 만성 병용 약물이 허용된다. 여기에는 다음이 포함될 수 있다:

· 1형 당뇨병을 치료하기 위한 인슐린 제제;

· 인슐린 저항성을 치료하기 위한 메트포르민;

· 결핍증을 치료하기 위한 비타민 D;

· 티록신 또는 기타 갑상선 보조제;

· LD 환자에게 흔히 사용되는, 다음을 포함하는 기타 약물: 내분비 치료제(예: 비타민 및 칼슘 보충제); 및 기타 약물(예: 카르니틴, 코엔자임 Q10, 비타민, 항변비 약물, 항-알레르기 약물);

· 통증 조절에 필요한 진통제 또는 케타민/리도카인 주입약, 패치 또는 정제와 함께 사용하는 뉴론틴;

· 항우울제 에펙소르(Effexor);

· 낮은 역치 약물(항경련제, 디곡신, 쿠마딘 등)은 예외로 하고, 다른 약물은 안정적인 투여량인 경우 및 치료 의사에 의해 필수적인 것으로 간주되는 경우에는 허용 가능함

· 혈장반출은 환자 치료 의사의 재량으로 계속될 수 있음

상기 치료제와 H4H17319P2 상호작용에 관한 데이터는 현재로서는 없다. 환자와 그녀의 보호자는 환자가 받게 될 임의의 약물로 인해 발생할 수 있는 약물 상호작용의 가능한 부작용에 대한 주의 사항을 알고 있어야 한다.

스크리닝에서 최종 프로토콜 방문까지의 프로토콜 기간 동안, 이 환자가 임의의 다른 약물을 투여해야 할 필요가 생기는 경우, 그녀는 프로토콜 담당자에게 이를 즉시 알려야 하고, 특정 약물(들) 및 징후(들)에 대해 연구원과 반드시 상의해야 한다는 것을 매 방문 시마다 이 환자에게 상기시켜야 한다. 프로토콜이 진행되는 동안 투여된 모든 병용 약물은 근거 문서에 기록해야 한다.

금지 약물과 물질 및 병용 절차

새로운 지질 저하제 또는 새로운 당뇨병 약물의 추가와 같이, 프로토콜 기간 중에 효능 평가에 영향을 미칠 수 있는 약물은 담당 치료 의사에 의해 필요한 것으로 간주되지 않는 한 금지된다.

흔한 부작용으로서 식욕부진을 동반하는 식욕억제제 또는 약물은 프로토콜 기간 동안 금지된다.

혈장반출 및 부작용을 치료하는 데 사용되는 다른 것들을 포함하여, 프로토콜 기간 동안 수행되는 병용 절차는 CRF에 보고되어야 한다.

평가 및 일정

프로토콜 도중에 수행될 평가 일정(SOA)은 도 20a 및 도 20b에 도시되어 있다.

이 단일 환자 프로토콜에서 요구되는 절차와 평가는 2008 지침문서 "소아 모집단을 대상으로 수행된 의약품 임상 시험에 대한 윤리적 고려 사항(Ethical Considerations for Clinical Trials on Medicinal Products Conducted with the Paediatric Population)"에 따라 "무위험 또는 최소 위험"으로 분류되었지만("약간 증가 또는 최소 위험"으로 분류된 DEXA는 예외로 함), 18세 미만의 참가자의 통증 및 고통을 줄이기 위한 배려가 포함되어 있다.

시험대상자 동의가 제출되면, 환자는 스크리닝 기간에 들어간다. 스크리닝 기간 동안, 환자는 적격성 평가를 받게 되고, H4H17319P2로 치료하기 전에, 지방이영양증과 관련된 공복감의 이해를 돕기 위해 별개인 3일 동안 공복감 설문지를 작성하도록 요청을 받게 된다. 스크리닝 동안, 필요한대로 최근의 의료 차트 검토를 포함하여 임의의 추가적인 병력을 확보하는 것도 중요하다.

스크리닝 기간 동안 추가적인 병력이 이 환자에 대한 인구통계학적 데이터와 함께 확보될 것이다. 근거문서 및 CRF에 기록될 데이터는 환자의 성별, 인종, 출생일 및 병용 약물 사용을 포함된다.

지속적인 프로토콜 적격성 및 최종 선정/배제 기준에 대한 준수를 평가하기 위해 약물의 첫 번째 투여 전인 1일차에 최근 병력을 확보한다. 이러한 최근 병력은 스크리닝 대비 변화에 대한 검토를 비롯하여 환자의 최근 약물 사용의 검토 및 이전 방문 이후 임의의 변화가 있었는지 여부에 대한 평가를 포함한다.

말초 림프절, 머리, 눈(결막 포함), 귀, 코, 입과 구인두, 목, 심장, 폐, 복부, 등을 포함하는 근골격, 사지 및 신경계의 검토를 포함하는 완전한 신체 검사가 수행된다. 이 환자는 태너 스테이징(Tanner Staging)으로도 평가되는데; 그녀가 아직 태너 스테이지 V에 도달하지 않았기 때문이다. 이는 SOA에 따라 이루어진다.

임상적으로 유의한 것으로 연구원에 의해 식별된 임의의 신체검사 소견에 있어서의 베이스라인 대비 변화는 적절한 CRF에 AE로서 기록되어야 한다.

신장(cm)은 벽면 장착형 스타디오미터를 사용하여 SOA에 따라 신발을 벗은 상태로 측정한다.

병용 약물의 검토는 스크리닝 기간 동안 및 매 프로토콜 방문 시 수행될 것이다. 환자가 복용하는 약물을 근거문서에 기록될 것이다.

연구원은 인슐린 저항성 및 고 중성지방 혈증이 개선됨에 따라 병용 항당뇨병제와 지질 약물의 투여량을 치료 개시 시점에 조정해야 할 수 있음을 알고 있다. 환자의 병용 약물(들)을 조정하는 기간 동안 환자를 주의 깊게 모니터링해야 한다. 인슐린 치료 중인 환자도 치료의 처음 몇 주 동안 밀접하게 모니터링 해야 하는데, 저혈당증을 피하기 위해서는 인슐린 투여량을 많게는 매주 하향 조절하는 것이 필요할 수 있기 때문이다(특히, 인슐린 고 투여량 환자들). 유사하게, 연구원은 고 중성지방 혈증 때문에 지질 약물을 복용하고 있는 환자를 대상으로, 치료 도중의 각 추적관찰 방문 시 지질 약물의 투여량을 조정할 필요가 있는지를 평가해야 하며, 혈장반출이 필요한 지 고려해야 한다. 어떠한 이유로든 약물 치료를 중단하는 경우, 췌장염의 잠재적 위험을 완화하기 위한 지질 저하제 등과 같은 병용 약물의 추가 조정이 타당할 수 있다.

활력 징후는 SOA에 따라 측정될 때마다 적어도 5분 휴식 후 앉은 자세에서 얻게 된다. 혈압(BP; mmHg) 및 심박수(HR; bpm)는 프로토콜 전체에 걸쳐 동일한 방법론을 사용하여 측정된다(수동 또는 자동화). 모든 BP와 HR 측정치는 적어도 5분 휴식 후 앉은 자세에서 얻게 된다. 모든 측정은 약 2분 간격으로 3회 실시된다. 가능한 경우, BP는 동일한 방법론(자동화 또는 수동)을 사용하여 프로토콜 전체에 걸쳐 주로 사용하지 않는(non-dominant) 팔에서 측정해야 한다. BP 또는 HR이 크게 증가하는 경우, 반복 측정과 더 빈번한 모니터링이 적용될 수 있다.

저점 혈압 판독을 가능하게 하려면, 활력 징후를 병원에서 측정해야 하는 프로토콜 날짜에는 프로토콜 약물을 복용하지 않도록 지시해야 하며, 약물을 병원에서 복용하게 해야 한다. 이는 SOA에 따라, 병원에서 투여 후 과정에 걸쳐 보다 집중적으로 혈압을 모니터링하게 되는 치료 기간 1 방문 동안에 특히 중요하다.

체온(°C) 및 호흡수(호흡/분)는 적어도 5분 휴식 후 앉은 자세로 측정하게 된다.

단일 12-리드 심전도는 누운 자세로 적어도 10분 휴식 후 수행될 것이다.

임상 안전성 실험실 검사는 현지 실험실에서 실시할 것이며, 환자들은 8시간 동안 금식해야 한다. 안전성 실험실 검사는 투여 전에 완료해야 한다.

모든 임상적으로 유의한 실험실 이상은 반복 검사를 통해 추적 관찰되며 연구원의 판단에 따라 추가로 조사될 것이다.

간 기능 검사 이상은 FDA 지침(2009)에 따라 평가될 것이다. 혈액학 및 임상 화학검사 샘플들은 공복 상태에서 채취될 것이다. 혈소판 수가 포함된 전혈구 수 및 표준 지수가 측정된다.

· 화학검사: 나트륨, 칼륨, 염화물, CO₂, 알부민, 총 단백질, 포도당, 혈중 요소 질소(BUN), 크레아티닌, 요산, 아스파르테이트 아미노전달효소(AST), 알라닌 아미노전달효소(ALT), 감마-글루타밀트랜스펩티다아제(GGT), 크레아틴 포스포키나아제(CPK), 알칼리 인산화효소, 총 빌리루빈, 직접 빌리루빈, 젖산 데하이드로게나아제(LDH), 칼슘 및 인.

· 소변검사: 딥스틱 분석 또는 기계 소변검사에 의한 pH, 포도당, 단백질, 케톤, 빌리루빈, 혈액, 우로빌리노겐, 비중, 아질산염 및 백혈구류. 딥스틱 상의 양성 소견으로 인해 추가 검사가 타당한 경우, 소변 현미경 검사가 수행된다.

· 응고 프로파일: 프로트롬빈 시간(PT) 또는 국제 정상화 비율(INR), 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)으로도 지칭되는 부분 트롬보플라스틴 시간(PTT).

프로토콜 기간 동안에는, 주사 부위를 주의 깊게 검사하고, 평가하고 점수를 매기게 된다. 주사 부위 평가에는 홍반, 부종 및 경결 영역의 식별 및 측정 뿐만 아니라 국소 통증, 압통과 가려움증의 존재가 포함된다.

임상적 조건에 의해 타당한 경우, 예정되지 않은 평가가 기록될 수도 있다.

항약물 항체(ADA) 측정

항-약물 항체를 측정하기 위한 혈액 샘플은 투여 전 및, 그 이후에는 SOA에서 식별된 시점에 수집될 것이다. 이 환자가 양성 ADA를 보이는 경우, 해결 시까지 추적 관찰하게 된다.

환자 설문지

환자 설문지는 환자가 작성하고/하거나 신중하게 교육을 받은 후 그녀의 보호자가 작성하게 된다.

공복증 점수

공복증(hunger)은 SOA에 따라 특정 프로토콜 방문 시 요청되는 2개의 글로벌 질문 세트 뿐만 아니라 3부분으로 구성된 설문지를 사용해 평가된다. 공복증은 0~10 범위의 숫자 등급 점수를 사용하여 평가될 것이고; 여기서, "0 = 전혀 배고프지 않음"이고 "10 = 가장 배고픔"이다. 모든 일일 공복증 설문지 점수는 환자에게 리커트(Likert)형 척도를 기준으로 환자에게 공복증에 점수를 매기도록 요청하여 평가되며, 여기서 0은 "전혀 배고프지 않음(not hungry at all)"이며 10은 "가장 배고픔(hungriest possible)"이다. 공복증 설문지 점수는 환자가 아침 식사를 하기 전에 매일 기록된다. 공복증 설문지는 스크리닝 동안 별개의 3일과 임상 방문 시 완료해야 하며, 아침 투여 전에 작성해야 한다. 환자들은 아침 식사 전에 본인의 공복증 점수를 기록한다(공복 상태). 글로벌 공복증 설문지: 평가 일정에 따라 특정 프로토콜 방문 시 2가지 글로벌 질문을 받게 된다.

SF-36 건강 설문지

SF-36은 다목적, 짧은 형태의 건강 설문조사로, 질문은 36개에 불과하다. 이를 통해서, 기능적 건강 및 웰빙 점수에 대한 8가지 척도의 프로파일 뿐만 아니라 심리검사 기반의 신체 및 정신 건강 요약 측정치 및 선호도 기반 건강 유틸리티 지수를 산출한다. 이는 특정 연령, 질병 또는 치료 그룹을 표적으로 하는 것과 반대로, 일반적인 척도이다. 따라서, SF-36은 일반 설문조사와 특정 모집단 설문조사, 질환의 상대적 부담 비교, 및 광범위한 상이한 치료에 의해 생기는 건강상의 이점을 차별화하는 데 유용한 것으로 입증되었다.

환자 건강 설문지-9(PHQ-9)

PHQ-9는 9개 항목의 우울증 척도로 이루어진 환자 건강 설문지이다. PHQ-9는 임상의가 우울증을 진단할 때 뿐만 아니라 치료를 선택하고 모니터링할 때에도 도움을 주는 도구이다. 환자가 PHQ-9 설문지를 작성한 후, 이를 프로토콜 직원이 점수를 매긴다.

프로토콜 도중 임의 시점에, 개별 환자의 PHQ-9 점수가 ≥10인 경우, 환자를 MHP에게 의뢰해야 한다. PHQ-9는 SOA에 따라 구현된다.

콜럼비아-자살 심각도 평가 척도(C-SSRS)

C-SSRS는 자살 시도를 예측할 뿐만 아니라, 다음 단계에 대한 기준을 통해(예를 들어, 정신 건강 전문가(MHP)에게 의뢰하여) 전체 범위의 증거 기반 아이디어와 행동 항목을 평가하는 데에도 사용되는 도구이다. SOA에 따라 본 프로토콜에서 활용할 C-SSRS의 2가지 버전이 있다: (1) 척도의 베이스라인/스크리닝 버전은 베이스라인 형태와 스크리닝 형태를 결합하여 환자의 생애 중 및 미리 정의된 기간 동안 자살경향성을 평가한다. 이 버전은 데이터 수집 목적 뿐만 아니라 선정/배재 기준에 기초한 적격성을 위해 환자의 생애 중 자살경향성을 평가할 수 있다. (2) 척도의 마지막 방문 이후(Since Last Visit) 버전은 환자의 마지막 방문 이후 자살경향성을 평가한다. 이 버전은 적어도 1회의 초기 C-SSRS 평가를 완료한 환자들을 평가하는 데 사용하기 위한 것이며, 후속 방문 때마다 사용해야 한다. C-SSRS의 "마지막 방문 이후" 버전은 C-SSRS를 마지막으로 제시 받은 이후로 환자/참여자가 가졌을 수 있는 임의의 자살 생각 또는 행동에 대해 질문한다.

프로토콜 도중 임의의 시점에, 환자가 4 또는 5형의 자살 생각이나 자살 행동을 가진 경우, 환자를 MHP에게 의뢰해야 한다.

환자 적격성 여부가 결정되는 스크리닝 기간 후, 환자는 치료 기간 1에 들어간다. 이 단계에서, H4H17319P2의 1차 투여량이 프로토콜 1일차에 IV투여될 것이다. 1차 피하(SC) 투여량 투여는 프로토콜 5일차에 이루어진다. 환자는 투여량 투여를 위해 매주 클리닉으로 복귀한다. 실험실 및 시험 평가는 도 20에 기술된 바와 같다.

이 프로토콜 동안에 수행될 안전성, 실험실, PK 및 ADA 평가에 대한 상세한 설명은 다음 섹션에 제공된다.

환자는 스크리닝 방문에서 시작하여 모든 방문 시, 그 전날에 밤새 금식해야 한다. 그녀는 매 병원 방문일 아침에 늘 먹던 약물을 물과 함께 복용할 수 있다.

평가는 스크리닝 기간 동안 여러 날에 걸쳐 이루어질 수 있다. 별개의 3일 동안 수집된 공복증 증상에 대한 충분한 베이스라인 데이터를 얻기 위해, 스크리닝 기간은 최소 3일에서 최대 2주가 필요하다.

이 환자와 프로토콜 직원에게 병원 방문 횟수에 대한 유연성을 제공하기 위해, 병원 방문의 실제 일정에 있어서 방문 시간에 유연성을 허용할 수 있다. 치료 기간 1 및 치료 기간 2 동안에, 목표는 방문이 +/- 3일 이내에 발생하는 것이다. 수집된 모든 데이터는, 설사 방문 윈도우에서 벗어난 것일지라도 평가변수의 분석에 포함된다.

이상반응의 모니터링은 프로토콜 전체에 걸쳐 수행될 것이다. 이상반응은 스크리닝에서부터 최종 프로토콜 방문 시까지 CRF에 기록될 것이다. 약물 투여 시작 후 발생하는 이상반응은 치료 유발성 이상반응(TEAE)으로 간주될 것이다. SAE는 최종 프로토콜 방문까지 기록될 것이다. 모든 이상반응은 이들이 해결되거나 환자의 안정한 병태, 만성 병태, 또는 병발 질환(들)으로 인한 것으로 명백히 결정될 때까지 모니터링 되어야 한다.

이상반응 정의, 문서화 및 보고

이상반응(AE)은 약물 관련 여부를 불문하고 인간에게 약물을 사용하는 것과 관련된 모든 의도하지 않은 의학적 사건이다. 이상반응(이상사례로도 지칭됨)은 인과성에 대한 아무런 판단 없이, 약물의 사용과 일시적으로 연관된 바람직하지 않고 의도하지 않은 징후(예: 비정상적인 실험실 소견), 증상, 또는 질환일 수 있다. AE는 임의의 약물 사용(예: 비공개 표지 사용, 또 다른 약물과의 병용)으로 인해 발생할 수 있고, 임의의 투여 경로, 제형, 또는 과다 투여를 포함하는 투여량으로 인해 발생할 수 있다.

H4H17319P2는 제1 인간 임상 연구에서 내약성이 양호하였다. 약물 관련 TEAE(이상반응이 가능하게는 또는 어쩌면 약물과 관련이 있는 것으로 연구원이 평가한 TEAE)가 보고되었다. 현재까지 H4H17319P2에 대한 임상 경험이 매주 제한적이므로, 알려지지 않은 다른 부작용이 있을 수 있다. 임상 응급 상황에 대비하여 프로토콜 참여자는 항상 PI(또는 대체 임상의)와 연락할 수 있으며; 이러한 연락 가능성과 응급 상황 시 연구원에게 연락하는 방법은 프로토콜 참여자에게 구두로 및 서면으로 명확히 전달될 것이다. 모든 프로토콜 개입은 무상으로 제공될 것이다.

연구원 또는 연구 의뢰자 중 하나의 관점에서, 다음 결과 중 어느 하나로부터 생기는 AE 또는 의심되는 이상반응은 중대한 이상반응(SAE)으로 간주된다:

· 사망.

· 생명을 위협하는 것. 생명을 위협하는 것은 환자가 반응으로 인해 즉각적인 사망의 위험에 처했다는 것을 의미하며, 더 심각한 형태로 발생했다면 가상적으로 사망을 초래했을 수도 있는 반응은 포함하지 않는다.

· 입원 또는 기존 입원 기간의 연장. 프로토콜 기간 동안 발생하도록 예정된 입원 및/또는 외과적 수술로서, 프로토콜 입력 전에 계획된 것은 환자가 프로토콜에 등록되기 전에 질병이나 질환이 존재한 경우 AE로 간주되지 않는다. 단, 프로토콜 중에 예기치 않은 방식으로 (예: 계획보다 수술이 일찍 실시된 경우) 악화되지 않아야 한다.

· 정상 생활 기능을 수행하는 능력의 지속적이거나 중대한 불능 또는 실질적인 파괴.

· 중요한 의학적 사건. 중요한 의학적 사건은 사망을 초래하지 않거나, 생명을 위협하지 않거나, 입원을 필요로 하지 않을 수 있지만, 적절한 의학적 판단에 따라, 환자를 위험에 빠뜨릴 수 있고 SAE 정의에 나열된 결과 중 하나를 방지하기 위한 의학적 또는 수술적 개입이 필요할 수 있는 경우, SAE로 간주될 수 있다. 이러한 의학적 사건의 예에는 응급실이나 집에서 집중 치료를 요하는 알레르기성 기관지 경련, 입원을 초래되지 않는 혈액 질환 또는 발작, 또는 약물 의존성 또는 약물 남용의 발생이 포함된다.

이상반응의 모니터링 및 관찰 기간

각 환자는 임의의 AE 발생에 대해 주의 깊게 모니터링해야 한다. 이러한 정보는 비-선도(non-leading) 질문(예: "기분이 어떠세요?")의 형태로 얻거나, 각 검사 도중에 검출된 징후와 증상, 프로토콜 직원의 관찰, 환자의 자발적 보고를 통해서 얻게 된다.

AE는 스크리닝 시부터 최종 프로토콜 방문을 포함하는 시점까지 근거문서에 기록될 것이다. SAE와 사망은 ICF가 서명한 시점부터 최종 프로토콜 방문 시까지 지속적으로 SAE CRF에 기록될 것이다. 모든 AE는 이들이 해결되거나 환자의 안정한 병태, 만성 병태, 또는 병발 질환(들)으로 인한 것으로 명백히 결정될 때까지 모니터링 되어야 한다.

환자가 자발적으로 및/또는 프로토콜 직원의 개방형 질문에 반응하여 보고했거나, 관찰, 신체검사 또는 기타 진단 절차에 의해 드러난 모든 AE(중대한 및 중대하지 않은)는 적절한 CRF에 기록될 것이다. 실험실 평가 또는 기타 임상 소견에서 임상적으로 관련된 모든 악화(deterioration)는 AE로 간주되며 적절한 CRF에 기록해야만 한다. 가능한 경우, 일반적인 기저 병리학을 나타내는 징후와 증상은 하나의 종합적인 사건으로서 언급되어야 한다.

프로토콜의 완료 후 임의 시점에 발생하고, 연구원이 약물과 관련이 있다고 간주하는 임의의 AE는 반드시 연구 의뢰자에게 보고되어야 한다.

프로토콜의 과정 중에 발생하는 모든 SAE는 연구원이 SAE를 알게 된 시점으로부터 24시간 이내에 연구원이 의학 모니터 요원에게 보고해야 한다. 모든 SAE는 약물과 인과관계가 있는 것으로 간주되는지 여부와 관계없이 보고되어야 한다. SAE 서식을 완성하고, 수집된 정보에는 환자 번호, 이상 반응에 대한 서술식 설명(관련 이력, 병용 약물과 관련 실험실 및 진단 시험 결과를 포함할 수 있음) 및 이상반응의 중증도 및 약물 관련성에 대한 연구원의 평가가 포함된다. SAE에 대한 추적관찰 정보는 연구 의뢰자 또는 그 대리인이 요청할 수 있다.

모든 SAE 대응은 연구 의뢰자에게 전달되어야 한다.

치료 기간 동안 및 임상기관 병원 방문 동안 환자를 주의 깊게 모니터링할 뿐만 아니라 프로토콜 직원이 주기적으로 환자에게 전화를 걸어 모니터링하게 된다. AE로 인해 환자가 치료를 철회한 경우, 문제가 해결될 때까지 이벤트를 모니터링하고 프로토콜에서 정의된 추가 안전성 평가 데이트를 얻기 위해서는 환자가 최종 프로토콜/조기 종료 방문을 완료하도록 독려해야 한다.

상기한 바와 같이, 환자가 10이 넘는 PHQ-9 점수를 받았거나, 임의의 자살 행동을 하거나, C-SSRS에서 4형 또는 5형의 자살 생각을 갖는 경우, 그녀/그를 MHP에게 의뢰해야 한다. MHP에게 의뢰하는 것은, 연구원의 의견으로, 환자의 안전성을 위해 필요하다고 판단되는 경우에도 이루어져야 한다. 환자의 정신질환을 정신과치료 및/또는 약물치료법으로 적절히 치료할 수 있는 경우, MHP의 재량으로 환자는 임상시험을 계속할 수 있어야 한다.

약물 사용과 관련된 중대한 예상하지 못한 약물이상반응이 있는 경우, 적절한 규제 기관(들), 윤리 위원회(EC) 및 참여 중인 모든 연구원에게 신속하게 통보해야 한다. IRB/IEC에서 요구하는 경우, 인간 환자에 대한 위험이 수반되는 모든 예상하지 못한 중대한 이상약물반응을 임상시험심사위원회(IRB)/독립윤리위원회(IEC)에 즉시 통지하는 것은 연구원의 책임이다. 예상치 못한 사건은 IB에 보고되지 않는 것이다.

중대한 AE 및 중대하지 않은 AE 둘 다의 경우, 연구원은 이상반응의 강도 및 H4H17319P2 투여와 이상반응의 관계 둘 다를 결정해야 한다. 연구원에 의해 임상적으로 유의한 것으로 간주되는 주사 부위 반응만이 AE로 기록될 것이다.

임상적으로 유의한 치료 유발성 실험실 이상, 주사 부위 반응 및 잠재적 전신 반응을 포함한 모든 AE의 강도는 CTCAE 버전 4.03에 따라 등급이 매겨질 것이다. CTCAE 등급은 AE의 중증도를 가리키며, 그 범위는 등급 1(경증 AE)에서, 2등급(중간 AE), 3등급(중증 AE) 및 4등급(생명을 위협하는 또는 불능화 AE) 및 5등급(AE와 관련된 사망)까지이다.

CTCAE에 의해 열거되지 않은 이상반응은 다음과 같이 등급이 정해질 것이다:

· 경증: 불편함이 드러나지만, 일상 활동에 대한 파괴는 없음.

· 중간: 일상 활동에 감소시키거나 영향을 미치기에 충분한 불편함.

· 중증: 일을 하거나 정상적인 일상 활동을 수행할 수 없음.

· 생명을 위협하는: 생명에 대한 즉각적인 위협을 나타냄.

H4H17319P2 투여와의 관계는 다음 기준에 따라 연구원이 결정할 것이다:

· 없음(None): 이상반응과 약물 투여 사이의 관계가 없음. 이상반응은 다른 병인, 예컨대 병용약물 또는 환자의 임상적 상태와 관련이 있음.

· 가능성이 낮음(Unlikely): 현재의 지식 상태로는 H4H17319P2에 대한 관계가 가능성이 낮거나, 시간 관계상, 관찰된 이상사례와 H4H17319P2가 합당한 연관성을 갖지 않았을 것임을 의미함.

· 가능함(Possible): H4H17319P2의 투여로부터 그럴듯한 시간 순서를 따르고, 의심 약물에 대한 알려진 반응 패턴을 따르는 반응. 반응은 환자의 임상 상태 또는 환자에게 투여되는 다른 치료 방식에 의해 생성될 수 있다.

· 개연성이 있음(Probable): H4H17319P2의 투여로부터 그럴듯한 시간 순서를 따르고, 해당 약물에 대한 알려진 반응 패턴을 따르는 반응. 반응은 환자의 임상 상태의 알려진 특징 또는 환자에게 투여되는 다른 치료 방식에 의해 합리적으로 설명할 수 없다.

안전성 분석을 위해, "가능함" 또는 "개연성이 있음"으로 분류된 모든 AE는 치료 관련 이상반응으로 간주될 것이다.

관리 요건

임상시험 관리기준

프로토콜은 국제의약품규제조화위원회(ICH)의 임상시험 관리기준(GCP) 및 적절한 규제 요건(들)에 따라 수행된다. 연구원은 프로토콜과 IB에 기술된 바와 같은 약물의 적절한 용도에 완전히 익숙할 것이다. 프로토콜의 유효성 및 수집된 데이터의 무결성을 입증하기 위한 필수 임상 문서가 유지 관리될 것이다. 마스터 파일은 프로토콜의 시작 시점에 확립되고 프로토콜의 기간 동안 유지되며 적절한 규정에 따라 유지되어야 한다.

윤리적 고려 사항

프로토콜은 헬싱키 선언에 설립된 윤리적 원칙에 따라 실시될 것이다. IRB/IEC는 환자의 권리, 안전성 및 복지를 보호하기 위해 모든 적절한 프로토콜 문서를 검토할 것이다. 프로토콜은 IRB/IEC 승인을 획득한 시험기관에서만 수행될 것이다. 프로토콜, IB, 동의서, 광고(해당 시), 환자에게 제공된 서면 정보(일지 카드 포함), 안전성 업데이트, 연간 진행 보고서 및 이들 문서들에 대한 일체의 개정이 시험자에 의해 IRB/IEC에 제공될 것이다.

H4H17319P2는 환자에서 부분 지방이영양증(PLD)을 치료할 뿐 아니라, 환자를 대상으로 PLD와 관련된 간비장 비대증, 고 중성지방 및 사지의 지방 결핍도 개선한다.

실시예 23 및 24: 선천성 렙틴 결핍증 및 선천성 LEPR 결핍증의 마우스 모델에서 작용제 항-LEPR 항체의 효과

본 발명의 특정 작용제 항-LEPR 항체인 H4H17319P2가 혈당 수준, 체중, 음식 섭취, 및 체성분(체지방량, 제지방량 및 질량)에 미치는 효과를 기능 상실 돌연변이로 인한 선천성 렙틴 결핍증 및 선천성 렙틴 수용체 결핍증의 쥣과 모델에서 결정하였다. 쥣과 LEPR 엑토도메인 서열 대신에 인간 LEPR 엑토도메인 서열로 이루어진 렙틴 수용체를 발현하고 렙틴은 발현하지 않는 유전적으로 조작된 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 마우스를 선천성 렙틴 결핍증의 쥣과 모델로서 사용하였다. 선천성 LEPR 결핍증의 모델은 유전적으로 조작된 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스로서, 쥣과 LEPR 엑토도메인 서열 대신에 미스센트 A409E 돌연변이를 갖는 인간 LEPR 엑토도메인 서열로 이루어진 렙틴 수용체를 발현한다.

실시예 23: 선천성 렙틴 결핍증의 쥣과 동물 모델에서 H4H174319P2의 효과

0일차에, 16마리의 27 내지 32주령 암컷 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 마우스를 체중을 기준으로 2개의 군으로 나누었다. 각각의 군에게 10 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체 또는 10 mg/kg의 H4H17319P2를 피하 주사를 통해 매주 1회 0, 7, 14, 21, 28 및 35일차에 투여하였다. 7마리의 27 내지 32주령 암컷 Lepr ^hu/hu 대조군 마우스에게 10 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 피하 주사를 통해 매주 1회 0, 7, 14, 21, 28 및 35일차에 투여하였다. -5 및 35일차에, μCT로 체성분을 정량화하였다. 음식 섭취, 체중 및 혈당 수준을 연구 기간 동안 각 동물마다 측정하였다. 도 21은 각 치료군에 대한 혈당 수준, 체중 및 누적 음식 섭취량을 요약한 것이다. 도 22는 각 항체 치료군 내 동물을 대상으로 항체 치료 전 5일차 및 항체 치료 후 35일차에 μCT로 정량화한 체지방량, 제지방량 및 골량을 요약한 것이다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다.

도 21a에 도시된 바와 같이, 항체 투여 전 0일차에, 렙틴-결핍 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 마우스는 대조군 Lepr ^hu/hu 마우스와 비교했을 때 고혈당 상태였다. 10 mg/kg의 H4H17319P2로 치료한 렙틴 결핍 마우스는 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 투여한 렙틴 결핍증 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 2일차에 시작하여 이어지는 측정 시점에서 혈당 수준의 유의한 감소를 나타냈다. 10 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P)를 투여한 렙틴 결핍 마우스 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 는 측정된 모든 시점에서 고혈당 상태를 유지하였다.

도 21a에 도시된 바와 같이, 항체 투여 전 0일차에, 렙틴-결핍 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 마우스는 대조군 Lepr ^hu/hu 마우스와 비교했을 때 상당히 더 무거웠다. 10 mg/kg의 H4H17319P2로 치료한 렙틴 결핍 마우스는 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 투여한 렙틴 결핍 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 15일차에 시작하여 이어지는 측정 시점에서 체중의 유의한 감소를 나타냈다. 10 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 투여한 렙틴 결핍증 마우스 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 는 모든 측정 시점에서 베이스라인 대비 체중 감소를 나타내지 않았다.

도 21c에 도시된 바와 같이, 렙틴 결핍 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 마우스는 H4H17319P2 치료 후 2일차 및 다른 후속 측정 시점에 이소형 대조군 (IgG4_P) 항체가 주사된 렙틴 결핍 마우스와 비교했을 때 누적 음식 섭취량의 상당한 감소를 나타냈다.

도 22에 도시된 바와 같이, 항체 투여 전인 -5일차에 렙틴 결핍 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 마우스는 Lepr ^hu/hu 마우스와 비교했을 때, 체지방량의 상당한 증가, 제지방량의 감소 및 골량의 감소를 나타냈다. 35일차에, 10 mg/kg의 H4H17319P2로 치료한 렙틴 결핍 Lepr ^hu/hu Lep ^-/- 마우스는 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 주입한 렙틴 결핍 마우스와 비교했을 때, 상당한 체지방량 감소 및 제지방량과 골량의 증가를 나타냈다.

실시예 24

0일차에, 20마리의 24 내지 28주령 수컷 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스를 체중을 기준으로 2개의 군으로 나누었다. 각각의 군에게 5 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체 또는 5 mg/kg의 H4H17319P2를 피하 주사를 통해 매주 1회 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일차에 투여하였다. 8마리의 24 내지 28주령 수컷 Lepr ^hu/hu 대조군 마우스에게 5 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 피하 주사를 통해 매주 1회 0, 7, 14, 21, 28, 35 및 42일차에 투여하였다. -1 및 41일차에, μCT로 체성분을 정량화하였다. 음식 섭취, 체중 및 혈당 수준을 연구 기간 동안 각 동물마다 측정하였다. 도 23은 각 치료군에 대한 혈당 수준, 체중 및 누적 음식 섭취량을 요약한 것이다. 도 24는 각 항체 치료군 내 동물을 대상으로 항체 치료 전 -1일차 및 항체 치료 후 41일차에 μCT로 정량화한 체지방량, 제지방량 및 골량을 요약한 것이다. 모든 결과는 평균 ± SEM으로 표현된다.

도 23a에 도시된 바와 같이, 항체 투여 전 0일차에, 렙틴 수용체 결핍 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스는 대조군 Lepr ^hu/hu 마우스와 비교했을 때 고혈당 상태였다. 5 mg/kg의 H4H17319P2로 치료한 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스는 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 투여한 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 7일차에 시작하여 이어지는 다른 측정 시점에서 혈당 수준의 유의한 감소를 나타냈다. 5 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 투여한 렙틴 수용체 결핍 마우스 Lepr ^{huA409E/huA409E} 는 측정된 모든 시점에서 고혈당 상태를 유지하였다.

도 23b에 도시된 바와 같이, 항체 투여 전 0일차에, 렙틴 수용체 결핍 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스는 대조군 Lepr ^hu/hu 마우스와 비교했을 때 상당히 더 무거웠다. 5 mg/kg의 H4H17319P2로 치료한 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스는 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 투여한 렙틴 수용체 결핍 마우스와 비교했을 때, 항체 치료 후 13일차에 시작하여 이어지는 다른 측정 시점에서 체중의 유의한 감소를 나타냈다. 5 mg/kg의 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 투여한 Lepr ^{huA409E/huA409E} 는 모든 측정 시점에서 베이스라인 대비 체중 감소를 나타내지 않았다.

도 23c에 도시된 바와 같이, Lepr ^{huA409E/huA409E} 는 H4H17319P2 치료 후 7일차 및 다른 후속 측정 시점에 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체가 주사된 렙틴 결핍 마우스와 비교했을 때 누적 음식 섭취량의 상당한 감소를 나타냈다.

도 24에 도시된 바와 같이, 항체 투여 전인 -1일차에 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스는 Lepr ^hu/hu 마우스와 비교했을 때, 상당한 지방 과다증의 증가, 제지방량의 감소 및 골량의 감소를 나타냈다. 41일차에, 5 mg/kg의 H4H17319P2로 치료한 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스는 이소형 대조군 (IgG4^P) 항체를 주입한 Lepr ^{huA409E/huA409E} 마우스와 비교했을 때, 상당한 체지방량 감소 및 제지방량과 골량의 증가를 나타냈다.

본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 전술된 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 이내에 포함되는 것으로 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Gromada, Jesper Stevis, Panayiotis Altarejos, Judith Murphy, Andrew J. <120> METHODS OF TREATMENT USING A LEPTIN RECEPTOR AGONIST ANTIBODY <130> 9774.436WO1/10436WO01 <140> TBD <141> 2019-04-05 <160> 120 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaagtc cctgagactc 60 tcctgtgtag cgtctggatt caccttcagt tccgatgcca tgtactgggt ccgccaggct 120 ccaggcaagg ggctggaatg ggtggcagtt atttattatg atggaaatta tcaatactat 180 gaagactccg ttaagggtcg attcaccatc tccagagaca attcccagaa cacgctggat 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggctgtat atttctgtgc gcgtctcaac 300 tgggattact ggtatctcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Lys 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Asp 20 25 30 Ala Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro 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Claims

대사 기능장애 또는 저렙틴증, 또는 대사 기능장애 또는 저렙틴증과 관련된 질환 또는 병태, 또는 상기 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, 병태는 비알코올성 지방간 질환, NASH, 여성 불임, 무월경, 비정상적인 호르몬 주기, 면역 기능 손상, 갑상선 기능저하증, 비만증, 단성 비만증(monogenic obesity), I형 당뇨병, II형 당뇨병, 지방이영양증, 선천성 지방이영양증, 전신성 지방이영양증, 후천성 지방이영양증, 부분 지방이영양증, 선천성 부분 지방이영양증, 선천성 전신성 지방이영양증, 후천성 부분 지방이영양증, 및 후천성 전신성 지방이영양증으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제2항에 있어서, 비알코올성 지방간 질환을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
제2항에 있어서, 선천성 지방이영양증을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
제2항에 있어서, 전신성 지방이영양증을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
제2항에 있어서, 후천성 지방이영양증을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
제2항에 있어서, 부분 지방이영양증을 치료 또는 예방하기 위한 방법.
제2항에 있어서, 단성 비만증을 치료 또는 예방을 위한 방법.
제2항에 있어서, 대사 기능장애 또는 저렙틴증과 관련된 병태는 선천성 지방이영양증이고,
선천성 지방이영양증과 관련된 증상은 인간 LEPR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여한 이후에 예방되거나, 개선되거나, 감소되거나, 그 중증도 및/또는 기간이 줄어드는, 방법.
제9항에 있어서, 인간 LEPR에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 투여한 후에, 대상체의 혈당이 감소하고, 대상체의 체중이 감소하고, 대상체가 음식 섭취의 감소를 나타내고, 대상체의 체지방량이 감소하고, 대상체의 제지방량이 증가하고/하거나 대상체의 골량이 증가하는, 방법.
제2항에 있어서, 병태는 비알코올성 지방간 질환이고, 대상체의 간 중량은 치료 후 감소하고, 대상체의 알라닌 아미노전달효소(ALT)의 혈장 수준은 감소하고/하거나 대상체의 아스파르테이트 아미노전달효소(AST)의 혈장 수준은 감소하는, 방법.
제2항에 있어서, 병태는 여성 불임인, 방법.
제12항에 있어서, 병태는 여성 불임이고, 대상체의 호르몬 사이클은 복구되고/되거나 대상체는 임신하게 되는, 방법.
제2항에 있어서, 병태는 무월경(amenorrhea)인, 방법.
제14항에 있어서, 병태는 무월경이고, 대상체는 정상적인 호르몬 주기를 갖기 시작하는, 방법.
제2항에 있어서, 병태는 면역 기능 손상인, 방법.
제16항에 있어서, 병태는 면역 기능 손상이고, 대상체의 CD4+ T 세포 수가 증가하는, 방법.
제1항에 있어서, 대사 기능 장애 또는 저렙틴증, 또는 대사 기능장애 또는 저렙틴증과 관련된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 증상은 지방 과다증, 비만, 이상 식욕 항진증, 고혈당증, 고중성지질혈증, 고콜레스테롤혈증, 인슐린 저항성, 지질이상혈증, 성장 지체, 사춘기의 성장분출 지체, 비정상적 성장 호르몬 분비, HbA1c 상승, 저 골무기질 밀도(또는 저 골량), 저 골무기질량, 및 저 제지방량으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 방법.
저 골량을 가진 대상체에서 골량을 증가시키는 방법으로서, 저 골량은 대상체가 앓고 있는 대사 기능장애 또는 저렙틴증의 증상이고, 상기 방법은 인간 렙틴 수용체(LEPR)에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 렙틴 결핍증 환자인, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 이를 필요로 하는 대상체는 렙틴 결핍증 환자가 아닌, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 증상은 비만이고, 비만은 신호 전달 결함 또는 신호 전달 손상 LEPR 돌연변이와 관련이 없거나 이에 의해 야기되지 않는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 체지방량을 감소시키지만, 제지방량은 감소시키지 않는, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 LEPR에 결합하여 LEPR 신호 전달을 활성화하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 사용하는 치료는 시상하부 STAT3 신호 전달을 자극하거나, 렙틴-유도성 또는 렙틴-독립적 STAT3 신호 전달을 향상시키는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 순환하는 플라즈마 중성지방을 낮추는, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 순환하는 플라즈마 총 콜레스테롤을 낮추는, 방법.
대상체에서
(i) 지방이영양증 및/또는 단성 비만증(monogenic obesity);
(ii) 지방이영양증 및/또는 단성 비만증과 관련된 병태; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 증상을 치료, 예방 또는 완화하는 방법으로서,
LEPR에 특이적으로 결합하는 작용제 항체를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
제27항에 있어서, 지방이영양증 및/또는 단성 비만증과 관련된 병태는 비만증의 극단적 조기 발병; 이상 식욕 항진증 및 포만감 손상; 면역 기능 손상(CD4⁺ 수); 인슐린 저항성; 비알코올성 지방 간 질환; NASH, 이상지질혈증; 당뇨병; 생식 기능 장애; 생식 기능 저하증; 사춘기의 성장 분출 결핍; 갑상선 기능 저하증; 갑상선 기능 손상; 저 골무기질 밀도 또는 저 골량인, 방법.
제27항에 있어서, 증상은 간 비대증(enlarged liver), 간 효소 상승(elevated liver enzymes), 알라닌 아미노기 전달효소(ALT)의 혈중 농도 상승, 아스파르테이트 아미노 전달효소(AST)의 혈중 농도 상승, 고 지방증(high adiposity); 체질량 지수 > 연령 및 성별에 맞는 제85 백분위 수; 비정상적인 음식 추구 거동(abnormal food seeking behavior); 비정상적인 음식 공격성 거동(abnormal food aggressive behavior); 재발성 및 잠재적으로 치명적인 감염증(recurrent and potentially lethal infections); 고 인슐린혈증(hyperinsulinemia); 간 지방증(liver steatosis); NASH로의 진행 (지방이영양증); 고 중성지질혈증(hypertriglyceridemia); HbA1c 상승; 혈당 수준 상승(elevated glucose levels); 내당능 손상(impaired glucose tolerance); 사춘기 발달 지체(delayed pubertal development); 2차 성징의 발현 감소(reduced expression of secondary sexual characteristics); 무월경 또는 월경 불순; 불임; 저신장증(short stature); 비정상적 성장 호르몬 분비; T3 변화; TSH 변화; 유리 티록신(free thyroxine) 수준의 변화인, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 메트렐렙틴(metreleptin)으로 치료되지 않은, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 다음과 같이 투여되는, 방법:
(i) 체중 1 kg당 약 5 mg의 투여량을 1회 이상 정맥 내 투여하고; 이어서
(ii) 매주 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 피하 투여하고; 이어서
(iii) 임의로, 매월 또는 28일에 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 피하 투여함.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 다음과 같이 투여되는, 방법:
(i) 체중 1 kg당 약 5 mg의 투여량을 1회 이상 정맥 내 투여하고; 이어서
(ii) 매주 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 피하 투여함.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 다음과 같이 투여되는, 방법:
(i) 체중 1 kg당 5mg을 1회 정맥 내 투여하고; 이어서
(ii) 매주 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 4회 피하 투여하고; 이어서
(iii) 매월 또는 28일에 1회 약 250 mg 또는 약 300 mg의 투여량을 1회 이상 피하 투여함.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 첫 번째 피하 투여는 정맥 내 투여로부터 3일 후에 이루어지는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단백질은:
(a) 서열번호 26, 서열번호 34, 서열번호 42, 서열번호 50, 서열번호 58, 서열번호 74 또는 서열번호 82의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(HCVR)의 상보성 결정 영역(CDR); 및 　　　　　
(b) 서열번호 10 또는 서열번호 66의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(LCVR)의 CDR을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 및 82/66으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍의 중쇄 및 경쇄 CDR을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 26/10, 34/10, 42/10, 50/10, 58/66, 74/66 및 82/66으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단백질은 서열번호 26/10의 HCVR/LCVR 아미노산 서열 쌍을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 28/30/32/12/14/16의 HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 아미노산 서열 조합을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하되, 제2 치료제는 재조합 인간 렙틴, PCSK9 억제제, 스타틴, 에제티미브, 인슐린, 인슐린 변이체, 인슐린 분비 촉진제, 분비 촉진제, 메트포르민, 설포닐우레아, 소듐 글루코스 공수송체 2 (SGLT2) 억제제, GLP-1 작용제/유사체, 글루카곤 (GCG) 억제제, 글루카곤 수용체 (GCGR) 억제제, 안지오포이에틴-유사 단백질 (ANGPTL) 억제제, 펜터민, 오를리스타트, 토피라메이트, 부프로피온, 토피라메이트/펜터민, 부프로피온/날트렉손, 부프로피온/조니사미드, 프람린타이드/메트렐렙틴, 로르카세린, 세틸리스타트, 테소펜신, 벨네페리트, 항경련제, 디곡신, 쿠마딘, 비타민 D, 티록신, 갑상선 보충제, 비타민제, 칼슘 보충제, 카르니틴, 코엔자임 Q10, 항변비약, 항알러지약, 가바펜틴, 진통제, 케타민, 리도카인, 및 벤라팍신 하이드로클로라이드로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.