DE69734443T2 - Ob-rezeptor und liganden - Google Patents

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den OB-Rezeptor und -Liganden und Verwendungen dieser Moleküle.
  • Beschreibung des Standes der Technik
  • A. HÄMATOPOESE
  • Der Prozess der Blutzellbildung, wodurch rote und weiße Blutzellen durch die Teilung von Zellen, die im Knochenmark vorhanden sind, ersetzt werden, wird als Hämatopoese bezeichnet. Eine Beschreibung der Hämatopoese ist in Dexter & Spooncer (Ann. Rev. Cell Biol. 3, 423–441 (1987)) zu finden.
  • Es gibt viele verschiedene Arten von Blutzellen, die unterschiedlichen Zellstammbäumen angehören. In jedem Stammbaum gibt es Zellen in verschiedenen Reifestadien. Reife Blutzellen sind für verschiedene Funktionen spezialisiert. Beispielsweise sind Erythrozyten in O2- und CO2-Transport eingebunden; T- und B-Lymphozyten sind in Zell- bzw. Antikörper-vermittelte Immunantworten eingebunden; Blutplättchen sind zur Blutgerinnung erforderlich; und die Granulozyten und Makrophagen wirken als allgemeine Phagozyten und Nebenzellen. Granulozyten können weiter in Basophile, Eosinophile, Neutrophile und Mastzellen unterteilt werden.
  • Jede dieser verschiedenen Blutzelltypen entsteht aus pluripotenten oder totipotenten Stammzellen, die in der Lage sind, Selbsterneuerung zu erfahren oder Vorläuferzellen oder koloniebildende Einheiten (KBE) entstehen zu lassen, die eine kleinere Gruppe an Zelltypen ergeben. Da Stammzellen schrittweise ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung verlieren, wird ihr Stammbaum immer stärker eingeschränkt. Es wurde gezeigt, dass sich Stammzellen zu multipotenten Zellen (die von Dexter & Spooncer, s.o., als "CFC-Mix" bezeichnet werden) entwickeln können. Manche der CFC-Mix-Zellen können Erneuerung erfahren, während andere zu Stammbaumeingeschränkten Vorläufern führen, die sich schließlich zu reifen Knochenmarkszellen entwickeln (z.B. Neutrophile, Megakaryozyten, Makrophagen und Basophile). In ähnlicher Weise sind pluripotente Stammzellen in der Lage, PreB- und PreT-Lymphoidzellstammbäume entstehen zu lassen, die sich zu reifen B- bzw. T-Lymphozyten differenzieren. Vorläufer sind durch ihre Nachkommenschaft definiert, z.B. Granulozyten/Makrophagen-koloniebildende Vorläuferzellen (GM-CFU) differenzieren sich zu Neutrophilen oder Makrophagen; primitive Erythroid-Burst-Forming-Units (BFU-E) differenzieren sich zu Erythroid-koloniebildenden Einheiten (CFU-E), die reife Erythrozyten entstehen lassen. In ähnlicher Weise sind Meg-CFU-, Eos-CFU- und Bas-CFU-Vorläufer in der Lage, sich in Megakaryozyten, Eosinophile bzw. Basophile zu differenzieren.
  • Für hämatopoetische Wachstumsfaktoren (siehe Andrea, NEJM 330(12), 839–846 (1994)) wurde gezeigt, dass sie Wachstum und/oder Differenzierung von Blutzellen über Aktivierung von Rezeptoren, die an der Oberfläche von Blutvorläuferzellen des Knochenmarks vorhanden sind, steigern. Während manche dieser Wachstumsfaktoren Proliferation von eingeschränkten Stammbäumen von Blutzellen stimulieren, steigern andere die Proliferation von Mehrfach-Stammbäumen von Blutzellen. Beispielsweise unterstützt Erythropoietin (EPO) die Proliferation von Erythrozyten, während Interleukin-3 (IL-3) die Proliferation von Erythrozyten- und Knochenmarksstammbäumen induziert und daher als ein Multi-Stammbaumfaktor betrachtet wird.
  • In den vergangenen Jahren wurden mehrere hämatopoetische Wachstumsfaktorrezeptoren isoliert. Durch ihre geringe Häufigkeit und ihre Existenz sowohl in hochaffinen als auch in niederaffinen Formen wurde die biochemische Charakterisierung dieser Rezeptoren bisher behindert.
  • Cytokinrezeptoren ordnen sich häufig zu Mehrfachuntereinheit-Komplexen an. Manchmal ist die α-Untereinheit dieses Komplexes in die Bindung des zugehörigen Wachstumsfaktors eingebunden, und die β-Untereinheit kann über eine Fähigkeit verfügen, ein Signal zur Zelle zu transduzieren. Diese Rezeptoren wurden je nach gebildeten Komplexen drei Unterfamilien zugeordnet. Unterfamilie 1 umfasst die Rezeptoren für Erythropoietin (EPO), Granulozyten-Koloniewachstum stimulierenden Faktor (G-CSF), Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-7 (IL-7), Wachstumshormon (GH) und Prolactin (PRL). Von Ligandenbindung an Rezeptoren, die zu dieser Unterfamilie gehören, wird angenommen, dass sie in Homodimerisierung des Rezeptors resultiert. Unterfamilie 2 umfasst Rezeptoren für IL-3, Granulozyten-Makrophagen-Koloniewachstum stimulierenden Faktor (GM-CSF), Interleukin-5 (IL-5), Interleukin-6 (IL-6), Leukämie inhibierenden Faktor (LIF), Oncostatin M (OSM) und ciliary neurotrophic factor (CNTF). Unterfamilie-2-Rezeptoren sind Heterodimere mit einer α-Untereinheit für Ligandenbindung und einer β-Untereinheit (entweder die gemeinsame β-Untereinheit der IL-3-, GM-CSF- und IL-5-Rezeptoren oder die gp130-Untereinheit der IL-6-, LIF-, OSM- und CNTF-Rezeptoren) für Signaltransduktion. Unterfamilie 3 enthält nur den Interleukin-2- (IL-2-) Rezeptor. Die β- und γ-Untereinheiten des IL-2-Rezeptorkomplexes sind Cytokin-Rezeptorpolypeptide, die sich mit der α-Untereinheit des nicht verwandten Tac-Antigens assoziieren.
  • B. Obesität
  • Obesität ist die häufigste Ernährungsstörung, die jüngsten epidemiologischen Studien zufolge etwa ein Drittel aller Amerikaner im Alter von 20 Jahren oder mehr betrifft. Kuczmarski et al., J. Am. Med. Assoc. 272, 205–211 (1994). Obesität ist für zahlreiche verschiedene schwerwiegende Gesundheitsprobleme verantwortlich, einschließlich kardiovaskulärer Störungen, Typ-II-Diabetes, Insulinresistenz, Bluthochdruck, Hypertriglyceridämie, Dysliporoteinämie und mancher Formen von Krebs. F. Pi-Sunyer, Anns. Int. Med. 119, 655–660 (1993); G. Colfitz, Am. J. Clin. Nutr. 55, 503S–507S (1992). Von einer Einzelgen-Mutation (die Obesität- oder "ob"-Mutation) wurde gezeigt, dass sie bei Mäusen zu Obesität und Typ-II-Diabetes führt. Friedman, Genomics 11, 1054–1062 (1991).
  • Zhang et al., Nature 372, 425–431 (1994), berichteten erst jüngst vom Klonieren und Sequenzieren des Maus-ob-Gens und seines menschlichen Homologs und schlugen vor, dass das ob-Genprodukt, Leptin oder OB-Protein, als Teil eines Signalstoff-Stoffwechselweges aus Fettgewebe funktionieren kann, dessen Wirkung die Regulation der Größe des Körperfettdepots darstellt. Parabiose-Versuche, die vor über 20 Jahren durchgeführt worden waren, sagten voraus, dass genetisch adipöse Mäuse, die zwei mutierte Kopien des ob-Gens (ob/ob-Maus) enthalten, keinen Sättigungsfaktor produzieren, der ihre Nahrungsmittelaufnahme reguliert, während die diabetische (db/db) Maus den Sättigungsfaktor zwar produziert, jedoch nicht darauf reagiert. Coleman & Hummal, Am. J. Physiol. 217, 1298–1304 (1969); Coleman, Diabetol 9, 294–298 (1973). Jüngste Berichte von drei voneinander unabhängigen Forschungsteams zeigten, dass tägliche Injektionen von rekombinantem OB-Protein Nahrungsmittelaufnahme hemmen und Körpergewicht und -fett bei stark adipösen ob/ob-Mäusen reduzieren, jedoch nicht bei db/db-Mäusen (Pelleymounter et al., Science 269, 540–543 (1995); Halaas et al., Science 269, 543–546 (1995); Campfield et al., Science 269, 546–549 (1995)), was darauf schließen lässt, dass das OB-Protein solch ein Sättigungsfaktor ist, wie er in den frühen Kreuzzirkulations-Studien erwogen wurde.
  • Forscher schlugen vor, dass zumindest ein OB-Rezeptor im Gehirn angeordnet ist. Über die Identifikation und das Expressionsklonieren eines Leptin-Rezeptors (OB-R) wurde von Tartaglia et al., Cell 83, 1263–1271 (1995), berichtet. Verschiedene Isoformen eines OB-Rezeptors werden von Cioffi et al., Nature 2, 585–589 (1996), beschrieben. Siehe auch die WO 96/08510.
  • Das Maus-db-Gen wurde erst jüngst kloniert (Lee et al., Nature 379, 632 (1996), und Chen et al., Cell 84, 491–495 (1996)). Ältere Daten schlugen vor, dass das db-Gen für den Rezeptor des Obesität- (ob-) Genprodukts, Leptin, kodierte (Coleman et al., Diebetologia 9, 294–298 (1973), und Coleman et al., Diebetologia 14, 141–148 (1978)). Erst jüngst wurde bestätigt, dass die db/db-Maus aus einer trunkierten Spleißvariante des OB-Rezeptors entsteht, der wahrscheinlich den Rezeptor für Signaltransduktion defekt macht (Lee et al., Nature 379, 632 (1996), und Chen et al., Cell 84, 491–495 (1996)).
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft den OB-Cytokinrezeptor, der hierin als WSX-Rezeptor bezeichnet wird.
  • Die Erfindung stellt in einem Aspekt Verfahren zur Identifikation eines Moleküls bereit, das sich an den WSX-Rezeptor gemäß den Ansprüchen 16 oder 17 bindet oder diesen aktiviert. Dies ist nützlich zur Entdeckung von Molekülen (wie z.B. Peptiden, Antikörpern und kleinen Molekülen), die Agonisten des WSX-Rezeptors sind. Solche Verfahren umfassen im Allgemeinen das Aussetzen eines immobilisierten WSX-Rezeptors gegenüber einem Molekül, von dem angenommen wird, dass es sich daran bindet, und das Bestimmen der Bindung des Moleküls an den immobilisierten WSX-Rezeptor und/oder das Bewerten, ob das Molekül den WSX-Rezeptor aktiviert oder nicht. Um solche WSX-Liganden zu identifizieren, kann der WSX-Rezeptor an der Oberfläche einer Zelle exprimiert und verwendet werden, um Bibliotheken von synthetischen Verbindungen und natürlich vorkommenden Verbindungen (z.B. endogene Quellen solcher natürlich vorkommenden Verbindungen, wie beispielsweise Serum) zu screenen.
  • In weiteren Ausführungsformen stellt die Erfindung Antikörper bereit, die sich spezifisch an den WSX-Rezeptor binden. Bevorzugte Antikörper sind monoklonale Antikörper, die in Menschen nicht-immunogen sind und sich an ein Epitop in der extrazellulären Domäne des Rezeptors binden. Bevorzugte Antikörper binden den WSX-Rezeptor mit einer Affinität von zumindest etwa 106 L/mol, noch bevorzugter 107 L/mol.
  • Antikörper, die sich an den WSX-Rezeptor binden, können gegebenenfalls an ein heterologes Polypeptid fusioniert sein, und der Antikörper oder die Fusion davon kann verwendet werden, um WSX-Rezeptor aus einer Quelle des Rezeptors zu isolieren oder zu reinigen.
  • Basierend auf der vorliegenden Beobachtung, dass CD34+-Zellen WSX-Rezeptor aufweisen, wird die Verwendung von WSX-Antikörpern zur Identifikation und/oder Anreicherung von Stammzellpopulationen (auf eine ähnliche Weise wie zur Zeit CD34-Antikörper verwendet werden) in Betracht gezogen.
  • Für bestimmte Anwendungen ist es wünschenswert, einen Agonistenantikörper zu haben, auf den wie hierin beschrieben gescreent werden kann. Solche Agonistenantikörper sind nützlich zur Aktivierung des WSX-Rezeptors für In-vitro-Verwendungen, wobei eine Steigerung von Proliferation und/oder Differenzierung einer Zelle, die den Rezeptor umfasst, erwünscht ist. Weiters können diese Antikörper verwendet werden, um Leiden zu behandeln, bei denen ein wirksames Ausmaß an WSX-Rezeptor-Aktivierung zu einem therapeutischen Nutzen im damit behandelten Säugetier führt. Beispielsweise kann der Agonistenantikörper verwendet werden, um Proliferation und/oder Differenzierung einer Zelle zu steigern, die den WSX-Rezeptor gemäß Anspruch 12 umfasst. Insbesondere können Agonistenantikörper und andere WSX-Liganden verwendet werden, um Proliferation von Stammzellen/Vorläuferzellen entweder in vitro oder in vivo zu stimulieren.
  • Für therapeutische Anwendungen ist es wünschenswert, eine Zusammensetzung herzustellen, die den Agonistenantikörper und einen physiologisch annehmbaren Träger umfasst. Gegebenenfalls kann solch eine Zusammensetzung weiters ein oder mehrere Cytokine umfassen.
  • Zusätzlich zu oben Genanntem werden hierin isolierte Nucleinsäuremoleküle, Expressionsvektoren und Wirtszellen offenbart, die für den WSX-Rezeptor kodieren und die zur rekombinanten Herstellung von WSX-Rezeptor wie hierin beschrieben verwendet werden können. Die isolierten Nucleinsäuremoleküle und Vektoren sind auch für Gentherapieanwendungen zur Behandlung von Patienten mit WSX-Rezeptor- defekten und/oder zur Steigerung der Reaktionsfähigkeit von Zellen auf WSX-Liganden nützlich.
  • Diese Anwendung betrifft auch Agonistenantikörper, die sich spezifisch an den WSX-Rezeptor binden und eine oder mehrere biologische Aktivitäten von natürlich vorkommendem WSX-Liganden, OB-Protein, nachahmen. Bevorzugte Antikörper sind jene mit einer starken Bindungsaffinität für menschlichen WSX-Rezeptor (z.B. mit einer Kd von nicht mehr als etwa 1 × 108 M; und vorzugsweise von nicht mehr als etwa 1 × 109 M). In bevorzugten Ausführungsformen bindet sich der Agonistenantikörper sowohl an menschlichen als auch an Maus-WSX-Rezeptor.
  • Antikörper mit definierter Agonistenaktivität in einem Biotest, dem KIRA-ELISA, sind hierin offenbart. Bevorzugte Antikörper weisen einen IC50 im KIRA-ELISA von etwa 0,5 μg/ml oder weniger, vorzugsweise von etwa 0,2 μg/ml oder weniger, und am meisten bevorzugt von etwa 0,1 μg/ml oder weniger auf.
  • Die Agonistenantikörper, die hierin von Interesse sind, können eine oder mehrere biologische Eigenschaften von Antikörper 2D7, 1G4, 1E11 oder 1C11 (siehe Beispiel 13) oder von Klonen 3, 4 oder 17 (siehe Beispiel 14) aufweisen. Beispielsweise kann sich der Antikörper an das Epitop durch jeden dieser Antikörper binden und/oder kann manche oder alle der Reste der hypervariab en Region dieser Antikörper aufweisen.
  • Der Agonistenantikörper kann einer sein, der Körpergewicht und/oder Fettdepotgewicht und/oder Nahrungsmittelaufnahme bei einem adipösen Tier (z.B. einer ob/ob-Maus) senkt. Der bevorzugte Agonistenantikörper ist einer, der eine fettreduzierende Wirkung bei einem adipösen Säugetier (z.B. einer ob/ob-Maus) ausübt, die größer ist als jene, die durch eine Reduktion der Nahrungsaufnahme induziert wird (Levin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1726–1730 (1996)).
  • Der Agonistenantikörper kann auch die Eigenschaft besitzen, Differenzierung und/oder Proliferation und/oder Überleben von hämatopoetischen Vorläuferzellen zu induzieren. Beispielsweise kann der Agonistenantikörper Lymphopoese, Erythropoese und/oder Myelopoese induzieren.
  • Die Erfindung offenbart hierin eine Zusammensetzung, die den Agonistenantikörper und einen physiologisch annehmbaren Träger umfasst. Die Zusammensetzung zur therapeutischen Verwendung ist steril und kann lyophilisiert werden. Zur Verwendung bei Blutbildung kann die Zusammensetzung beispielsweise weiters ein Cytokin umfassen.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Aktivierung des WSX-Rezeptors bereit, das das Aussetzen des WSX-Rezeptors gegenüber einer Menge an Agonisten-Anti-WSX-Rezeptorantikörper umfasst, die zur Aktivierung des WSX-Rezeptors wirksam ist. Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Steigerung von Proliferation und/oder Differenzierung einer Zelle bereit, die den WSX-Rezeptor an ihrer Zelloberfläche exprimiert, umfassend das Aussetzen der Zelle gegenüber einer Menge an exogenem Agonisten-Anti-WSX-Rezeptorantikörper, die zur Steigerung von Proliferation und/oder Differenzierung der Zelle wirksam ist.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die hierin dargestellte Entdeckung, dass WSX-Liganden, wie z.B. Obesität- (OB-) Protein, über Signalabgabe durch den WSX-Rezeptor eine Rolle bei der Blutbildung spielen. Die Rolle des WSX-Rezeptor-Liganden-Signalstoff-Stoffwechselweges scheint auf der Ebene des frühen hämatopoetischen Vorläufers zu liegen, wie aus der Fähigkeit von OB-Protein, Myelopoese, Erythropoese (z.B. Milz-Erythropoese) und, am stärksten, Lymphopoese, zu stimulieren, eindeutig hervorgeht. Demgemäß können WSX-Liganden verwendet werden, um Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Überleben von hämatopoetischen Vorläuferzellen in vitro zu stimulieren.
  • Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Stimulation von Proliferation und/oder Differenzierung einer Zelle bereit, die den WSX-Rezeptor (insbesondere die WSX-Rezeptor-Variante 13.2, für die hierin gezeigt wird, dass sie die Fähigkeit besitzt, ein Proliferationssignal zu übertragen) an ihrer Zelloberfläche exprimiert, umfassend den Schritt des Kontaktierens des WSX-Rezeptors mit einer Menge an WSX-Liganden, die zur Stimulation von Proliferation und/oder OB-Proteindifferenzierung der Zelle wirksam ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle, die dem WSX-Liganden ausgesetzt wird, ein hämatopoetischer Vorläufer, z.B. eine CD34+-Zelle. Der WSX-Ligand kann ein Agonistenantikörper sein, der sich an den WSX-Rezeptor bindet. Das hierin erwogene Verfahren kann zu einer Steigerung der Proliferation und/oder Differenzierung von Lymph-, Knochenmark- und/oder Erythrozyten-Blutzellstammbäumen führen und umfasst sowohl In-vitro- als auch In-vivo-Verfahren. Bei In-vitro-Verwendungen kann die den WSX-Rezeptor aufweisende Zelle in Zellkultur vorhanden sein. Bei In-vivo-Verfahren kann die Zelle in einem Säugetier, insbesondere in einem Menschen (z.B. einem, der unter reduzierter Blutkonzentration leidet und der von einer Steigerung der verschiedenen Blutzellen profitieren könnte), vorhanden sein. Potenzielle Patienten umfassen jene, die Chemo- oder Strahlungstherapie oder auch Knochenmarktransplantations-Therapie unterzogen wurden. Somit stellt die Erfindung ein Verfahren zur Repopulation von Blutzellen (z.B. Erythrozyten-, Knochenmark- und/oder Lymphblutzellen) in einem Säugetier bereit, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge eines WSX-Liganden an das Säugetier.
  • Säugetiere, die von einer Steigerung von Lymphopoese profitieren können, umfassen jene, die eine Veranlagung zu einem der folgenden Beispielleiden aufweisen oder an einem dieser Leiden erkrankt sind: Lymphozytopenie; Lymphorrhoe; Lymphostase; Immunschwäche (z.B. HIV und AIDS); Infektionen (einschließlich z.B. opportunistische Infektionen und Tuberkulose (TB)); Lupus; und andere Störungen, die durch einen Mangel an Lymphozyten charakterisiert sind. Eine wirksame Menge des WSX-Liganden kann in einem Verfahren von Immunopotenzierung oder zur Verbesserung von Immunfunktion in einem Säugetier verwendet werden.
  • Andererseits können WSX-Rezeptor- oder WSX-Ligandenantagonisten (wie z.B. WSX-Rezeptor-ECD oder -Immunoadhäsin und WSX-Rezeptor- oder OB-Proteinneutralisierende Antikörper) bei der Behandlung von jenen Störungen verwendet werden, bei denen nicht annehmbare Lymphozytenkonzentrationen im Säugetier vorhanden sind, insbesondere, wenn dies durch übermäßige Aktivierung des WSX-Rezeptors verursacht wird. Beispiele für Leiden, bei denen Verabreichung eines solchen Antagonisten nützlich sein könnte, umfassen: neoplastische Störungen (wie z.B. Hodgkin-Krankheit; Lymphosarkom; Lympohblastom; lymphozytische Leukämie; und Lymphom) und Lymphozytose.
  • Erkrankungen oder Störungen, bei denen eine Steigerung der Erythropoese einen Nutzen darstellen kann, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf: Erythrozytopenie; erythrodegenerative Störungen; Enthroblastopenie; Leukoerythroblastose; Erythroklasie; Thalassämie; und Anämie (z.B. hämolytische Anämie, wie z.B. erworbene, Autoimmun- oder mikroangiopathische hämolytische Anämie; aplastische Anämie; angeborene Anämie; z.B. angeborene dyserythropoetische Anämie, angeborene hämolytische Anämie oder angeborene hypoplastische Anämie; dyshämopoetische Anämie; Faconi-Anämie; genetische Anämie; hämorrhagische Anämie; hyperchrome oder hypochrome Anämie; Anämie entstehend aus Ernährungsmangel, Eisenmangel oder hypoferrische Anämie; hypoplastische Anämie; infektiöse Anämie; Bleianämie; lokale Anämie; makrozytäre oder mikrozytäre Anämie; maligne oder perniziöse Anämie; megaloblastische Anämie; molekulare Anämie; normozytäre Anämie; physiologische Anämie; traumatische oder posthämorrhagische Anämie; refraktäre Anämie; Bestrahlungsanämie; Sichelzellenanämie; Anaemia splenica; und toxische Anämie).
  • Eine Steigerung von Myelopoese kann bei jeder der zuvor genannten Erkrankungen oder Störungen sowie im Falle der folgenden beispielhaften Leiden von Nutzen sein: Myelofibrose; Thrombozytopenie; Hypoplasie; disseminierte intravaskuläre Gerinnung (DIC); Immun- (Autoimmun-) thrombozytopenischer Purpura (ITP); HIV-induzierter ITP; Myelodysplasie; thrombozytischen Erkrankungen und Thrombozytose.
  • Das Verfahren kann weiters die Schritte des Aussetzens blutbildender Zellen (unabhängig davon, ob sie in Zellkultur oder in einem Säugetier sind) gegenüber einem oder mehreren anderen Cytokine (z.B. Stammbaum-spezifischen Cytokinen) umfassen, und dies kann zu einer synergistischen Steigerung der Proliferation und/oder Differenzierung der Zellen führen. Beispiele für Cytokine umfassen Thrombopoietin (TPO); Erythropoietin (EPO); Makrophagen-koloniestimulierenden Faktor (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukin-1 (IL-1); 1L-1α; IL-2; IL-3; IL-4; IL-5; IL-6; IL-7; IL-8; IL-9; IL-10; IL-11; IL-12; Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) oder KIT-Ligand (KL). In dieser Ausführungsform kann Aussetzung gegenüber Cytokin der Aussetzung gegenüber WSX-Liganden vorangehen, gleichzeitig damit stattfinden oder nachfolgen. Vorzugsweise werden der WSX-Ligand und ein oder mehrere Cytokine dem Patienten gleichzeitig verabreicht (sofern das Verfahren ein In-vivo-Verfahren ist) und werden, gegebenenfalls, kombiniert, um eine pharmazeutische Zusammensetzung zu bilden.
  • Zur Verwendung in den obigen Verfahren wird hierin ein Herstellungsgegenstand beschrieben, umfassend: ein Behältnis; eine Markierung am Behältnis; und eine Zusammensetzung, die einen Wirkstoff umfasst, innerhalb des Behältnisses; worin die Zusammensetzung zur Steigerung der Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen, einschließlich des WSX-Rezeptors in einem Säugetier, wirksam ist, die Markierung am Behältnis angibt, dass die Zusammensetzung zur Steigerung von Proliferation und/oder Differenzierung dieser Zellen verwendet werden kann, und der Wirkstoff in der Zusammensetzung ein WSX-Ligand ist. Gegebenenfalls umfasst der Herstellungsartikel ein oder mehrere Behältnisse, die (ein) weitere(s) Cytokin(e) umfassen, in einer verpackten Kombination mit dem Behältnis, das den WSX-Liganden enthält.
  • In einer anderen Ausführungsform kann eine wirksame Menge des WSX-Liganden verwendet werden, um Transplantatakzeptanz bei Knochenmarktransplantation zu verbessern oder um Mobilisierung von blutbildenden Stammzellen in einem Säugetier vor dem Ernten von hämatopoetischen Vorläufern aus dem peripheren Blut von diesem zu stimulieren.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1A bis 1H zusammen stellen das doppelsträngige Nucleotid (Seq.-ID Nr. 1) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2), die für die menschliche Volllängen-WSX-Rezeptorvariante 13.2 kodiert, dar. Die Nucleotide sind am Beginn des Sense-Strangs nummeriert. Aminosäurereste sind am Beginn der Aminosäuresequenz nummeriert. Restriktionsenzymstellen sind über der Nucleotidsequenz dargestellt.
  • Die 2A bis 2B zusammen stellen einen Aminosäuresequenzabgleich von menschlichen Volllängen-WSX-Rezeptorvarianten 6.4 (Seq.-ID Nr. 3), 12.1 (Seq.-ID Nr. 4) bzw. 13.2 dar. Homologe Reste sind umrahmt. WSX-Rezeptorvarianten 6.4, 12.1 und 13.2 sind menschliche Nativsequenz-WSX-Rezeptorvarianten, die, ohne hier eine Einschränkung auf eine bestimmte Theorie zu beabsichtigen, durch alterniertes Spleißen von WSX-Rezeptor-mRNA gebildet zu sein scheinen. Die mutmaßlichen Signalpeptid-, Transmembran-, Box-1-, Box-2- und Box-3-Domänen sind angegeben. Die extrazellulären und zytoplasmatischen Domänen sind amino- bzw. carboxy-terminal zur Transmembrandomäne. Die gezeigten Box-1-3-Domänen entsprechen den Motiven von Box 1-3, die in Baumann et al., Mol. Cell. Biol. 14(1), 138–146 (1994), beschrieben sind.
  • Die 3A bis 3E zusammen zeigen einen Abgleich der Nucleotidsequenzen, die für menschliche WSX-Rezeptorvarianten 6.4 (Seq.-ID Nr. 5), 12.1 (Seq.-ID Nr. 6) bzw. 13.2 kodieren.
  • Die 4A bis 4B zeigen einen Abgleich der menschlichen Volllängen-WSX-Rezeptorvariante-13.2-Aminosäuresequenz (oben) mit jener einer teilweisen Maus-WSX-Rezeptor-Extrazellulärdomänensequenz (unten) (Seq.-ID Nr. 7), die wie in Beispiel 7 beschrieben erhalten wurde. Das mutmaßliche Maus-Signalpeptid ist mit einem Pfeil bezeichnet.
  • Die 5A bis 5F zeigen einen Abgleich der Nucleotidsequenzen, die für menschliche WSX-Rezeptorvariante 13.2 (unten) bzw. teilweise Maus-WSX-Rezeptor-Extrazellulärdomäne (oben) (Seq.-ID Nr. 8) kodieren.
  • 6 ist ein Säulendiagramm, das die Resultate des Thymidin-Inkorporationstests, der in Beispiel 5 beschrieben wird, zeigt. Es wird 3H-Thymidininkorporation (cpm) in parentalen Baf3-Zellen oder Baf3-Zellen gezeigt, die mit GH/WSX-Variante-13.2-Chimäre in Gegenwart von variierenden Konzentrationen von menschlichem Wachstumshormon (GH) Elektrophorese unterzogen wurden.
  • 7 zeigt die menschlichen oder Maus-Oligonucleotide (Seq.-ID Nr. 9–38), die für den in Beispiel 8 beschriebenen Antisense-Versuch verwendet wurden.
  • Die 8 und 9 zeigen Thymidin-Inkorporationstests an Baf-3-Zellen. Für diese Tests wurde Zellen IL-3 16–18 Stunden lang entzogen (in RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FCS)). Zellen wurden in serumfreiem RPMI 1640 gewaschen und bei 50.000 Zellen pro Well in 0,2 ml serumfreiem RPMI 1640, ergänzt mit der angegebenen Konzentration von menschlichem GH oder menschlichem OB-Protein, ausplattiert. Die Zellen wurden 24 Stunden lang stimuliert, und Thymidininkorporation wurde wie beschrieben bestimmt (Zeigler et al., Blood 84, 2422–2430 (1994)). Die Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt, und die Resultate wurden in drei voneinander unabhängigen Versuchen bestätigt.
  • In 8 wurden chimäre Proteine von GH-Rezeptor-WSX-Rezeptorvariante 12.1 oder 13.2 in Baf-3-Zellen wie in Beispiel 5 beschrieben exprimiert. Diese transfizierten Zellen und die parentale Baf-3-Linie wurden mit hGH stimuliert, und die Inkorporation von titriertem Thymidin wurde bestimmt.
  • In 9 wurden Baf-3-Zellen stabil mit WSX-Rezeptorvariante 13.2 transfiziert. Thymidininkorporation wurde dann in diesen Zelllinien nach Stimulation mit menschlichem OB-Protein bestimmt.
  • In den 10A bis 10C wurden fötale Maus-Leber-AA4+Sca+Kit+- (flASK-) Stammzellen in Suspensionskultur oder Methylcellulose kultiviert. In 10A wurden flASK-Zellen in Suspensionskultur, die Serum mit Kit-Liganden (KL) oder Kit-Liganden und OB-Protein enthielt, kultiviert. Zellzählungen und Cytospin-Analysen wurden 7 Tage später durchgeführt. In 10B wurden flASK-Zellen in Methylcellulose entweder unter Knochenmark- oder Lymphbedingungen wie in Beispiel 10 beschrieben ausgesät. Koloniezählungen wurden 14 Tage später durchgeführt. Für Kolonien, die unter Lymphbedingungen hergestellt wurden, zeigte die FACS-Analyse, dass die große Mehrheit der Zellen B220-positiv war. In 10C wurden flASK-Zellen in Methylcellulose, die Kit-Liganden enthielt, ausgesät. Zu diesem Basismedium wurden Erythropoietin (EPO) oder Erythropoietin und OB-Protein zugesetzt. Die resultierenden Kolonien wurden 14 Tage später gezählt. FACS-Analyse zeigte, dass etwa 95% dieser Kolonien TER-119-positiv waren. Alle Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und in zumindest drei voneinander unabhängigen Versuchen bestätigt.
  • 11 veranschaulicht Methylcellulosetests zur Bestimmung des Koloniebildungspotenzials von db/db-, ob/ob- und dem entsprechenden ausgesät, und die resultierenden Kolonien wurden nach 14 Tagen gezählt. Tests wurden unter Verwendung von sowohl Knochenmark- als auch Lymphbedingungen durchgeführt. Die Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und die Versuche wurden mindestens dreimal wiederholt.
  • Die 12A bis 12B zeigen Knochenmark-Zellprofile in Misty-Gray-Wildtyp-Homozygoten-, Misty-Gray/db-Heterozygoten- und Homozygoten-db/db-Mäusen. Gesamt-Zellularität im db/db-Knochenmark war im Vergleich zu den Kontrollen unverändert. 12A zeigt Zellprofile, die unter Verwendung von Anti-B220-, Anti-CD43- und Anti-TER119-Antikörpern bestimmt wurden. 12B zeigt Zellprofile der Milzen der oben genannten Gruppen.
  • Die 13A bis 13C stellen eine Analyse von peripherem Blut in db/db-Homozygoten, Misty-Gray-db/db-Heterozygoten und Misty-Gray-Homozygoten dar. 40 μl peripheres Blut wurden über Blutabnahme aus der Orbita entnommen und an einem Serrono-Baker-System 9018 analysiert. Alle durch die Kästchen beschriebenen Bereiche stehen für das Mittel ± Standardabweichung der zwei Parameter.
  • 14 ist ein Vergleich der peripheren Lymphozyt-Zählungen und Blutglucosekonzentrationen. In fünf Gruppen an Tieren, Misty-Gray-, Misty-Gray/db-, db/db-, Interferon-α-transgene und Glucokinase-transgene heterozygote Mäuse (gLKa), wurden mittels Blutabnahme hinter der Orbita Proben gezogen. Blutglucosekonzentrationen in diesen Mäusen wurden bestimmt. Alle durch die Kästchen beschriebenen Bereiche stehen für das Mittel ± Standardabweichung der zwei Parameter.
  • In den 15A bis 15C wurden Misty-Gray-Homozygoten-, db/Misty-Gray-Heterozygoten- und homozygote db/db-Mäuse subletaler Bestrahlung ausgesetzt, und die Genesungskinetik des peripheren Bluts wurde mittels Blutabnahmen aus dem retroorbitalen Bereich bestimmt.
  • Die 16A bis 16Q zeigen zusammen die Nucleotidsequenz (Seq.-ID Nr. 46) und die Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 47) der menschlichem OB-Immunglobulinchimäre im Plasmid aus Beispiel 11.
  • 17 zeigt Bindung von Anti-WSX-Rezeptoragonisten-Antikörpern an menschlichen WSX-Rezeptor. Die in Beispiel 13 gebildeten Anti-WSX-Rezeptoragonisten-Antikörper (2D7 und 1G4) und eine IgG-Isotopenkontrolle wurden auf ihre Fähigkeit, sich an menschlichen WSX-Rezeptor zu binden, durch Einfang-ELISA bewertet.
  • 18 zeigt die Aktivität von mAbs 2D7 und 1G4 sowie von OB-Protein im KIRA-ELISA (siehe Beispiel 13). Absorption bei 490 nm gegenüber Konzentration von Antikörper oder Liganden in diesem Test sind dargestellt.
  • 19 zeigt Bindung von Anti-WSX-Rezeptoragonisten-Antikörpern an Maus-WSX-Rezeptor. Die Anti-WSX-Rezeptoragonisten-Antikörper (2D7 und 1G4) und IgG-Isotopenkontrolle wurden durch Einfang-ELISA auf ihre Fähigkeit bewertet, sich an Maus-WSX-Rezeptor zu binden.
  • Die 20A bis 20B zeigen die Resultate von Epitop-Kartierung der Agonisten-Anti-WSX-Rezeptor-Antikörper, die wie in Beispiel 13 beschrieben hergestellt wurden. 20A zeigt die Blockierungsfähigkeit von Anti-WSX-Rezeptorantikörpern auf Epitop A unter Verwendung von biotinyliertem 2D7. 20B zeigt Blockierungsfähigkeit von Anti-WSX-Rezeptorantikörpern auf Epitop B unter Verwendung von biotinylier tem 1C11. Basierend auf dem Konkurrenzbindungs-ELISA band sich 2D7 an ein anderes Epitop als 1E11, 1C11 und 1G4.
  • 21 zeigt einen Abgleich der Aminosäuresequenzen von menschlicher Volllängen-WSX-Rezeptorvariante 6.4 (hWSXR) (Seq.-ID Nr. 3) und Maus-WSX-Rezeptor (mWSXR) (Seq.-ID Nr. 51).
  • 22 ist eine Standardkurve für menschliches OB-Protein im KIRA-ELISA, die schematisch innerhalb des Diagramms das KIRA-ELISA-Panning von WSX-Rezeptor mit scFv-Phagen wie in Beispiel 14 beschrieben zeigt.
  • 23 zeigt die Aktivität von Klon Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 17 von scFv-Phagen aus Beispiel 14 und Anti-HER2-scFv-Phagen-Kontrolle (Her2-Klon) im KIRA-ELISA. Absorption gegenüber Phagentiter ist gezeigt.
  • 24 zeigt die Aktivität von Klon Nr. 3, Nr. 4 und Nr. 17 von scFv aus Beispiel 14, Anti-HER2-scFv-Kontrolle (Her2-Klon) und OB-Protein im KIRA-ELISA. Absorption gegenüber Antikörperkonzentration ist gezeigt.
  • 25 gleicht die Aminosäuresequenzen von Agonistenantikörper-Klon Nr. 3 (3.scFv) (Seq.-ID Nr. 48), Klon Nr. 4 (4.scFv) (Seq.-ID Nr. 49) und Klon Nr. 17 (Seq.-ID Nr. 50) ab, die wie in Beispiel 14 beschrieben erhalten wurden. Reste der komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) gemäß Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflage, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), sind unterstrichen, und hypervariable Schleifenreste (Chothia et al., Nature 342, 8767 (1989)) sind kursiv geschrieben.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • I. Definitionen
  • Bei der Beschreibung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Bezeichnungen verwendet, die sind wie nachstehend definiert zu verstehen sind.
  • Die Bezeichnungen "WSX-Rezeptor" oder "WSX-Rezeptorpolypeptid", wenn hierin verwendet, umfassen Nativsequenz-WSX-Rezeptor; WSX-Rezeptorvarianten; extrazelluläre WSX-Domäne; und chimären WSX-Rezeptor (die alle hierin definiert sind). Gegebenenfalls ist der WSX-Rezeptor nicht mit nativer Glykosylierung assoziiert. "Native Glykosylierung" bezieht sich auf die Kohlenhydratgruppierungen, die kovalent an WSX-Rezeptor gebunden sind, wenn dieser in der Säugetierzelle gebildet wird, von der er natürlicherweise abstammt. Demgemäß ist menschlicher WSX-Rezeptor, der in einer nicht-menschlichen Zelle produziert wird, ein Beispiel für einen WSX-Rezeptor, der "nicht mit nativer Glykosylierung assoziiert" ist. Manchmal ist der WSX-Rezeptor unglykosyliert (z.B. als ein Resultat seiner rekombinanten Bildung in einem Prokaryoten).
  • "WSX-Ligand" ist ein Molekül, das sich an einen Nativsequenz-WSX-Rezeptor (insbesondere WSX-Rezeptorvariante 13.2) bindet und diesen aktiviert. Die Fähigkeit eines Moleküls, sich an WSX-Rezeptor zu binden, kann durch die Fähigkeit eines mutmaßlichen WSX-Liganden bestimmt werden, sich an WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin (siehe Beispiel 2), ausplattiert auf einer Testplatte beispielsweise, zu binden. Der Thymidin-Inkorporationstest liefert ein Mittel zum Screenen auf WSX-Liganden, die den WSX-Rezeptor aktivieren. Beispiele für WSX-Liganden umfassen Anti-WSX-Rezeptoragonisten-Antikörper und OB-Protein (z.B. in Zhang et al., Nature 372, 425–431 (1994), beschrieben).
  • Die Bezeichnungen "OB-Protein" und "OB" sind hierin synonym verwendet und beziehen sich auf Nativsequenz-OB-Proteine (auch als "Leptine" bekannt) und ihre funktionellen Derivate.
  • Ein "Nativsequenz"-Polypeptid ist eines, das dieselbe Aminosäuresequenz wie ein Polypeptid (z.B. WSX-Rezeptor oder OB-Protein) aufweist, das aus einer natürlichen Quelle abstammt. Solche Nativsequenz-Polypeptide können aus der Natur isoliert oder können durch Rekombinations- oder Synthesemittel gebildet werden. Somit kann ein Nativsequenz-Polypeptid die Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem, menschlichem Polypeptid, Maus-Polypeptid oder Polypeptid aus jeder anderen Säugetierspezies aufweisen.
  • Die Bezeichnung "Nativsequenz-WSX-Rezeptor" umfasst insbesondere natürlich vorkommende, trunkierte Formen des WSX-Rezeptors, natürlich vorkommende Variantenformen (z.B. alternativ gespleißte Formen wie beispielsweise die hierin beschriebenen WSX-Rezeptorvarianten 6.4, 12.1 und 13.2) und natürlich vorkommende Allelvarianten des WSX-Rezeptors. Der bevorzugte Nativsequenz-WSX-Rezeptor ist ein reifer, menschlicher Nativsequenz-WSX-Rezeptor, wie z.B. menschliche WSX-Rezeptorvariante 6.4, menschliche WSX-Rezeptorvariante 12.1 oder menschliche WSX-Rezeptorvariante 13.2 (die alle in den 2A–2B gezeigt sind). Am meisten bevorzugt ist die reife menschliche WSX-Rezeptorvariante 13.2.
  • Die Bezeichnung "Nativsequenz-OB-Protein" umfasst jene OB-Proteine aus jeder beliebigen Tierspezies (z.B. von Mensch, Maus, Kaninchen, Katze, Rind, Schaf, Huhn, Schwein, Pferd usw.), wie sie in der Natur auftreten. Die Definition umfasst insbesondere Varianten mit oder ohne Glutamin an Aminosäureposition 49 unter Verwendung der Aminosäure-Nummerierung nach Zhang et al., s.o. Die Bezeichnung "Nativsequenz-OB-Protein" umfasst die nativen Proteine mit oder ohne dem/das initiierende(n) N-terminale(n) Methionin (Met) und mit oder ohne der/die Signalsequenz, entweder in monomerer oder in dimerer Form. Die auf dem Gebiet der Erfindung bekannten menschlichen oder Maus-Nativsequenz-OB-Proteine sind 167 Aminosäuren lang, enthalten zwei konservierte Cysteine und weisen die Eigenschaften eines sekretierten Proteins auf. Das Protein ist großteils hydrophil, und die vorhergesagte Signalsequenz-Spaltungsstelle liegt an Position 21 unter Verwendung der Aminosäure-Nummerierung nach Zhang et al., s.o. Die gesamte Sequenzhomologie der menschlichen und Maus-Sequenzen beträgt etwa 84%. Die zwei Proteine zeigen eine höhere Identität in der N-terminalen Region des reifen Proteins mit nur vier konservativen und drei nicht-konservativen Substitutionen unter den Resten zwischen der Signalsequenz-Spaltungsstelle und dem konservierten Cys an Position 117. Das Molekulargewicht von OB-Protein beträgt etwa 16 kD in einer monomeren Form.
  • Die "extrazelluläre WSX-Rezeptordomäne" (ECD) ist eine Form des WSX-Rezeptors, die im Wesentlichen frei von den Transmembran- und Zytoplasmadomänen des WSX-Rezeptors ist, d.h. weniger als 1% solcher Domänen, vorzugsweise 0,5 bis 0% solcher Domänen, und noch bevorzugter 0,1 bis 0% solcher Domänen, aufweist. Üblicherweise hat die WSX-Rezeptor-ECD eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 95% Aminosäuresequenzidentität mit der Aminosäuresequenz der ECD von WSX-Rezeptor, die in den 2A–B für menschliche WSX-Rezeptorvarianten 6.4, 12.1 und 13.2 angegeben sind, vorzugsweise zumindest etwa 98%, noch bevorzugter zumindest etwa 99% Aminosäuresequenzidentität, und umfasst somit WSX-Rezeptorvarianten wie nachstehend definiert.
  • Eine Polypeptid-"Variante" bezeichnet ein biologisch aktives Polypeptid wie nachstehend definiert mit weniger als 100% Sequenzidentität mit einem Nativsequenz-Polypeptid (z.B. WSX-Rezeptor mit der in den 1A–H gezeigten, abgeleiteten A-minosäuresequenz für menschliche WSX-Rezeptorvariante 13.2). Solche Varianten umfassen Polypeptide, worin ein oder mehrere Aminosäurereste am N- oder C-Terminus oder innerhalb der Nativsequenz hinzugefügt sind; etwa ein bis dreißig Aminosäurereste deletiert und gegebenenfalls durch einen oder mehrere Aminosäurereste substituiert sind; und Derivate der obigen Polypeptide, worin ein Aminosäurerest kovalent modifiziert wurde, sodass das resultierende Produkt eine nicht-natürlich vorkommende Aminosäure aufweist. Üblicherweise weist eine biologisch aktive WSX-Rezeptorvariante eine Aminosäuresequenz mit zumindest etwa 90% Aminosäurensequenzidentität mit der in den 1A–H gezeigten menschlichen WSX- Rezeptorvariante 13.2 auf, vorzugsweise zumindest etwa 95%, insbesondere zumindest etwa 99%. Üblicherweise weist eine biologisch aktive OB-Proteinvariante eine Aminosäuresequenz mit zumindest 90% Aminosäurensequenzidentität mit einem Nativsequenz-OB-Protein, vorzugsweise zumindest etwa 95%, noch bevorzugter zumindest etwa 99%, auf.
  • Ein "chimäres" OB-Protein oder ein "chimärer" WSX-Rezeptor ist ein Polypeptid, das OB-Protein oder Volllängen-WSX-Rezeptor oder eine oder mehrere Domänen davon (z.B. die extrazelluläre Domäne des WSX-Rezeptors), fusioniert oder gebunden an heterologes Polypeptid, umfasst. Der chimäre WSX-Rezeptor hat im Allgemeinen zumindest eine biologische Eigenschaft mit der menschlichen WSX-Rezeptorvariante 13.2 gemeinsam. Das chimäre OB-Protein hat im Allgemeinen eine biologische Eigenschaft mit einem Nativsequenz-OB-Protein gemeinsam. Beispiele für chimäre Polypeptide umfassen Immunoadhäsine und Epitop-markierte Polypeptide.
  • Die Bezeichnung "WSX-Immunoadhäsin" wird synonym mit der Bezeichnung "WSX-Rezeptor-Immunglobulinchimäre" verwendet und bezeichnet ein chimäres Molekül, das einen Teil des WSX-Rezeptors (im Allgemeinen die extrazelluläre Domäne davon) mit einer Immunglobulinsequenz kombiniert. In ähnlicher Weise bezieht sich ein "OB-Protein-Immunoadhäsin" oder eine "OB-Immunglobulinchimäre" auf ein chimäres Molekül, das OB-Protein (oder einen Teil davon) mit einer Immunglobulinsequenz kombiniert. Die Immunglobulinsequenz ist vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, eine konstante Immunglobulindomäne. Die Immunglobulingruppierung in den Chimären der vorliegenden Erfindung kann von IgG1-, IgG2-, IgG3- oder IgG4-Untertypen, IgA, IgE, IgD oder IgM, jedoch vorzugsweise IgG1 oder IgG3, gewonnen werden.
  • Die Bezeichnung "Epitop-markiert", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf ein chimäres Polypeptid, das WSX-Rezeptor oder OB-Protein, fusioniert an ein "Markierungs-Polypeptid", umfasst. Das Markierungs-Polypeptid weist genug Reste auf, um ein Epitop bereitzustellen, gegen das ein Antikörper hergestellt werden kann, ist jedoch stets kurz genug, um die biologische Aktivität des WSX-Rezeptors oder OB- Proteins nicht zu stören. Das Markierungs-Polypeptid ist vorzugsweise auch eher einmalig, sodass der Antikörper hiergegen im Wesentlichen nicht mit anderen Epitopen kreuzreagiert. Geeignete Markierungs-Polypeptide weisen im Allgemeinen sechs Aminosäurereste und üblicherweise etwa 8 bis 50 Aminosäurereste (vorzugsweise etwa 9 bis 30 Reste) auf.
  • "Isolierter" WSX-Rezeptor (oder "isoliertes" OB-Protein) bezeichnet WSX-Rezeptor (oder OB-Protein), der/das aus einer WSX-Rezeptor- (oder OB-Protein-) Quelle gereinigt wurde oder durch Rekombinations- oder Syntheseverfahren hergestellt wurde und ausreichend frei von anderen Peptiden oder Proteinen ist, (1) um zumindest 15 und vorzugsweise 20 Aminosäurereste der N-terminalen oder einer inneren Aminosäuresequenz unter Verwendung eines Zentrifugenröhrchensequenzierers oder des besten, im Handel erhältlichen Aminosäuresequenzierers, wie am Markt erhältlich oder wie durch bis zum Datum dieser Anmeldung veröffentlichte Verfahren modifiziert, zu erhalten oder (2) um Homogenität durch SDS-PAGE unter nicht reduzierenden oder reduzierenden Bedingungen unter Verwendung von Coomassie-Blau- oder, vorzugsweise, Silberfärbung zu erreichen. Homogenität bedeutet hier weniger als etwa 5% Verunreinigung mit anderen Quellenproteinen.
  • Ein "im Wesentlichen reines" Protein bezeichnet eine Zusammensetzung, die zumindest etwa 90 Gew.-%, vorzugsweise zumindest etwa 95 Gew.-%, Protein, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, umfasst. Ein "im Wesentlichen homogenes" Protein bezeichnet eine Zusammensetzung, die zumindest etwa 99 Gew.-% Protein, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, umfasst.
  • "Biologische Eigenschaft", wenn in Verbindung mit entweder "WSX-Rezeptor" oder "isoliertem WSX-Rezeptor" verwendet, bedeutet, dass dieser Rezeptor eine Effektor- oder Antigenfunktion oder -aktivität aufweist, die direkt oder indirekt durch Nativsequenz-WSX-Rezeptor verursacht oder ausgeführt wird (unabhängig davon, ob in seiner nativen oder denaturierten Konformation). Effektorfunktionen umfassen Ligandenbindung; und Steigerung von Überleben, Differenzierung und/oder Proliferation von Zellen (insbesondere Proliferation von Zellen). Effektorfunktionen umfassen je doch nicht Besitz einer Epitop- oder Antigenstelle, die in der Lage ist, mit Antikörpern, die gegen Nativsequenz-WSX-Rezeptor gezüchtet werden, zu kreuzreagieren.
  • "Biologische Eigenschaft", wenn in Verbindung mit entweder "OB-Protein" oder "isoliertem OB-Protein" verwendet, bedeutet, dass das Protein eine Effektorfunktion aufweist, die direkt oder indirekt durch Nativsequenz-OB-Protein verursacht oder ausgeführt wird. Effektorfunktionen von Nativsequenz-OB-Protein umfassen WSX-Rezeptorbindung und -aktivierung; und Steigerung von Differenzierung und/oder Proliferation von Zellen, die diesen Rezeptor exprimieren (wie im Thymidin-Inkorporationstest beispielsweise bestimmt wird). Ein "biologisch aktives" OB-Protein ist eines, das eine biologische Eigenschaft von Nativsequenz-OB-Protein aufweist.
  • Ein "funktionelles Derivat" eines Nativsequenz-OB-Proteins ist eine Verbindung mit einer qualitativen biologischen Eigenschaft, die sie mit einem Nativsequenz-OB-Protein gemeinsam hat. "Funktionelle Derivate" umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Fragmente von Nativsequenz-OB-Proteinen und Derivate von Nativsequenz-OB-Proteinen und ihre Fragmente, mit der Maßgabe, dass sie eine gemeinsame biologische Aktivität mit einem entsprechenden Nativsequenz-OB-Protein aufweisen. Die Bezeichnung "Derivat" umfasst sowohl Aminosäuresequenz-Varianten von OB-Protein als auch kovalente Modifikationen davon.
  • Die Bezeichnung "lange Halbwertszeit", sofern sie in Verbindung mit OB-Derivaten verwendet wird, bezieht sich auf OB-Derivate mit einer längeren Plasma-Halbwertszeit und/oder langsamerer Clearance als ein entsprechendes Nativsequenz-OB-Protein. Die Derivate mit langer Halbwertszeit weisen vorzugsweise eine Halbwertszeit auf, die zumindest etwa 1,5-mal länger ist als jene eines nativen OB-Proteins; noch bevorzugter zumindest etwa 2-mal länger ist als jene eines nativen OB-Proteins, und noch bevorzugter zumindest etwa 3-mal länger ist als jene eines nativen OB-Proteins. Das native OB-Protein ist vorzugsweise jenes von der zu behandelnden Person.
  • Eine "antigene Funktion" bezeichnet den Besitz einer Epitop- oder Antigenstelle, die in der Lage ist, mit Antikörpern, die gegen Nativsequenz-WSX-Rezeptor gezüchtet wurden, zu kreuzreagieren. Die grundlegende antigene Funktion eines WSX-Rezeptors ist, dass er sich mit einer Affinität von zumindest etwa 106 L/mol an einen Antikörper bindet, der gegen Nativsequenz-WSX-Rezeptor gezüchtet wurde. Üblicherweise bindet sich das Polypeptid mit einer Affinität von zumindest etwa 107 L/mol. Die zur Definition von "antigener Funktion" verwendeten Antikörper sind polyklonale Kaninchenantikörper, die durch Formulieren des WSX-Rezeptors in komplettem Freundschem Adjuvans, subkutane Injektion der Formulierung und Boosten der Immunantwort durch intraperitoneale Injektion der Formulierung, bis der Titer von Anti-WSX-Rezeptor oder Antikörper Sättigung erreicht hat, gezüchtet wurden.
  • "Biologisch aktiv", wenn in Verbindung mit entweder "WSX-Rezeptor" oder "isoliertem WSX-Rezeptor" verwendet, beschreibt ein WSX-Rezeptorpolypeptid, das eine Effektorfunktion von Nativsequenz-WSX-Rezeptor aufweist oder eine Effektorfunktion mit ihm gemeinsam hat und das zusätzlich eine antigene Funktion besitzen kann (jedoch nicht muss). Eine hauptsächliche Effektorfunktion des WSX-Rezeptors ist seine Fähigkeit, Proliferation von menschlichen CD34+-Nabelschnurblutzellen im in Beispiel 8 beschriebenen Kolonietest zu induzieren.
  • "Antigenisch aktiver" WSX-Rezeptor ist definiert als ein Polypeptid, das eine antigene Funktion von WSX-Rezeptor besitzt und das darüber hinaus eine Effektorfunktion besitzen kann (jedoch nicht muss).
  • "Prozent Aminosäuresequenzidentität" ist hierin definiert als der Prozentsatz von Aminosäureresten in der Kandidatensequenz, die mit den Resten in der Nativsequenz nach Abgleich der Sequenzen und Einführen von Lücken, sofern erforderlich, um den maximalen Prozentsatz an Sequenzidentität zu erreichen und ohne Betrachtung der konservativen Substitutionen als Teil der Sequenzidentität, identisch sind. N-terminale, C-terminale oder innere Extensionen, Deletionen oder Insertionen in die Kandidatensequenz sind alle nicht als eine Beeinflussung der Sequenzidentität oder -homologie zu sehen.
  • Ein "Thymidin-Inkorporationstest" kann verwendet werden, um auf Moleküle zu screenen, die den WSX-Rezeptor aktivieren. Um diesen Test durchzuführen, werden IL-3-abhängige Baf3-Zellen (Palacios et al., Cell 41, 727–734 (1985)) stabil mit Volllängen-Nativsequenz-WSX-Rezeptor wie in Beispiel 4 beschrieben transfiziert. Den so gebildeten WSX-Rezeptor/Baf3-Zellen wird IL-3 z.B. 24 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C in 5% CO2 und Luft entzogen. Nach IL-3-Entzug werden die Zellen in 96-Well-Kulturplatten mit oder ohne eine(r) Testprobe, die einen potenziellen Agonisten enthält (solche Testproben sind gegebenenfalls verdünnt), ausplattiert und 24 Stunden lang in einem Zellkulturinkubator kultiviert. 20 μl serumfreies RPMI-Medium, das 1 μCi 3H-Thymidin enthält, werden zu jedem Well zumindest 6–8 Stunden lang zugesetzt. Die Zellen werden dann in 96-Well-Filterplatten geerntet und mit Wasser gewaschen. Die Filter werden dann beispielsweise unter Verwendung eines "Packard Top Count Microplate Scintillation Counter" gezählt. Von Agonisten wird erwartet, dass sie eine statistisch signifikante Steigerung (zu einem P-Wert von 0,05) der 3H-Aufnahme in Bezug auf die Kontrolle induzieren. Bevorzugte Agonisten führen zu einer Steigerung der 3H-Aufnahme, die dann zumindest das Doppelte der Aufnahme der Kontrolle beträgt.
  • Ein "isoliertes" WSX-Rezeptor-Nucleinsäuremolekül ist ein Nucleinsäuremolekül, das identifiziert und von zumindest einem verunreinigenden Nucleinsäuremolekül getrennt ist, mit dem es üblicherweise in der natürlichen Quelle der WSX-Rezeptornucleinsäure assoziiert ist. Ein isoliertes WSX-Rezeptornucleinsäuremolekül weist eine andere Form oder Anordnung auf als jene, in der es in der Natur zu finden ist. Isolierte WSX-Rezeptor-Nucleinsäuremoleküle werden daher vom WSX-Rezeptor-Nucleinsäuremolekül, wie es in natürlichen Zellen besteht, unterschieden. Ein isoliertes WSX-Rezeptor-Nucleinsäuremolekül umfasst jedoch WSX-Rezeptor-Nucleinsäuremoleküle, die in Zellen enthalten sind, die üblicherweise WSX-Rezeptor exprimieren, worin sich beispielsweise das Nucleinsäuremolekül an einer anderen chromosomalen Stelle als in natürlichen Zellen befindet.
  • Die Bezeichnung "Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression von operabel gebundener Kodiersequenz in einem bestimmten Wirtsor ganismus erforderlich sind. Die Kontrollsequenzen, die für Prokaryoten beispielsweise geeignet sind, umfassen einen Promotor, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosombindungsstelle und möglicherweise noch andere Sequenzen, die bisher noch kaum erforscht wurden. Eukaryotische Zellen sind bekannt dafür, Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer zu verwenden.
  • Nucleinsäure ist "operabel gebunden", wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gebracht wird. Beispielsweise ist DNA für eine Präsequenz oder einen Sekretionsleader operabel an DNA für ein Polypeptid gebunden, wenn es als ein Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptids teilnimmt; ein Promotor oder Enhancer ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosombindungsstelle ist operabel an eine Kodiersequenz gebunden, wenn sie so angeordnet ist, dass sie Translation erleichtert. Im Allgemeinen bedeutet "operabel gebunden", dass die gebundenen DNA-Sequenzen zusammenhängend sind und, im Fall eines Sekretionsleaders, zusammenhängend sind und in Lesephase stehen. Enhancer müssen jedoch nicht zusammenhängend sein. Bindung erfolgt durch Ligation an passenden Restriktionsstellen. Sind solche Stellen nicht vorhanden, so werden die synthetischen Oligonucleotidadaptoren oder -linker gemäß der herkömmlichen Praxis verwendet.
  • Wie hierin verwendet, werden die Bezeichnungen "Zelle", "Zelllinie" und "Zellkultur" synonym verwendet, und alle diese Bezeichnungen beziehen Nachkommenschaft mit ein. Somit umfassen die Termini "Transformanten" und "transformierte Zellen" die primär bearbeitete Zelle und die davon abgeleiteten Kulturen, ohne Berücksichtigung der Anzahl der Transfers. Es gilt auch zu verstehen, dass die gesamte Nachkommenschaft aufgrund von beabsichtigen oder unbeabsichtigten Mutationen nicht exakt identisch bezüglich DNA-Gehalt sein kann. Mutierte Nachkommenschaft, die gewisse Funktionen oder biologische Aktivität, auf die in der ursprünglich transformierten Zelle gescreent wurden, aufweisen, sind eingebunden. Sind spezifische Bezeichnungen beabsichtigt, so wird dies aus dem Zusammenhang hervorgehen.
  • Die Bezeichnung "Antikörper" wird im weitesten Sinn verwendet und bezieht sich insbesondere auf monoklonale Antikörper, Antikörperzusammensetzungen mit polyepitopischer Spezifität, bispezifische Antikörper, Diabodies und einkettige Moleküle sowie Antikörperfragmente (z.B. Fab, F(ab')2 und Fv), solange sie die erwünschte biologische Aktivität aufweisen.
  • Die Bezeichnung "monoklonaler Antikörper" wie hierin verwendet bezieht sich auf einen Antikörper, der aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen wurde, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, da sie gegen eine einzige antigene Stelle gerichtet sind. Darüber hinaus ist, im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise verschiedene Antikörper umfassen, die gegen verschiedene Determinanten (Epitope) gerichtet sind, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzige Determinante am Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität weisen die monoklonalen Antikörper darin einen Vorteil auf, dass sie durch die Hybridomkultur synthetisiert werden, unkontaminiert von anderen Immunglobulinen. Das Adjektiv "monoklonal" beschreibt die Eigenschaft des Antikörpers, aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern gewonnen worden zu sein, und ist nicht als ein Erfordernis zu verstehen, den Antikörper mittels eines bestimmten Verfahrens herzustellen. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind, mittels des Hybridomverfahrens hergestellt werden, das als erstes von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder sie können durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden (siehe z.B. das US-Patent Nr. 4.816.567 (Cabilly et al.)). Die "monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagen-Antikörperbibliotheken unter Verwendung der von Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschriebenen Verfahren isoliert werden.
  • Die monoklonalen Antikörper hierin umfassen insbesondere "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), in denen ein Teil der schweren und/oder leichten Ketten mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer bestimmten Spezies abstammen oder zu einer bestimmten Antikörperklasse oder -subklasse gehören, identisch oder zu diesen homolog sind, während der Rest der Kette(n) mit den entsprechenden Sequenzen in Antikörpern, die von einer anderen Spezies abgeleitet sind oder zu einer anderen Antikörperklasse oder -subklasse gehören, identisch oder zu diesen homolog sind, sowie Fragmente solcher Antikörper, solange sie die erwünschte biologische Aktivität aufweisen (Cabilly et al., s.o.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851–6855 (1984)).
  • "Humanisierte" Formen von nicht-menschlichen (z.B. Maus-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulinketten oder Fragmente davon (wie z.B. Fv, Fab, Fab', F(ab')2 oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die eine Minimalsequenz enthalten, die von nicht-menschlichem Immunglobulin abstammt. Im Großteil der Fälle sind humanisierte Antikörper menschliche Immunglobuline (Rezipienten-Antikörper), in denen Reste aus einer komplementaritätsbestimmenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer nicht-menschlichen Spezies (Donor-Antikörper) wie z.B. Maus, Ratte oder Kaninchen mit der erwünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt werden. In manchen Fällen werden Fv-Gerüstregion- (FR-) Reste des menschlichen Immunglobulins durch entsprechende nicht-menschliche Reste ersetzt. Darüber hinaus können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipientenantikörper noch in den importierten CDR- oder Gerüstsequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen werden vollzogen, um Antikörperleistung weiter zu verfeinern und optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen alle von zumindest einer, vorzugsweise zwei, variablen Domäne(n), in der/denen alle oder im Wesentlichen alle der CDR-Regionen jenen eines nicht-menschlichen Immunglobulins entsprechen und alle oder im Wesentlichen alle der FR-Regionen jene einer menschlichen Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst im Optimalfall auch zumindest einen Teil einer konstanten Immunglobulinregion (Fc), typischerweise jenen eines menschlichen Immunglobulins. Nähere Details sind in Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323–329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593–596 (1992), zu finden. Der humanisierte Antikörper umfasst einen PrimatizedTM-Antikörper, worin die Antigen-Bindungsregion des Antikörpers von einem Antikörper abstammt, der durch Immunisieren von Makakenaffen mit dem Antigen von Interesse gebildet wird.
  • Die Bezeichnung "hypervariable Region", wenn hierin verwendet, bezieht sich auf die Aminosäurereste eines Antikörpers, der für Antigen-Bindung verantwortlich ist. Die hypervariable Region umfasst Aminosäurereste aus einer "komplementaritätsbestimmenden Region" oder "CDR" (d.h. Reste 24–34 (L1), 50–56 (L2) und 89–97 (L3) in der variablen Leichtkettendomäne und 31–35 (H1), 50–65 (H2) und 95–102 (H3) in der variablen Schwerkettendomäne; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. Auflage, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) und/oder Reste aus einer "hypervariablen Schleife" (d.h. Reste 26–32 (L1), 50–52 (L2) und 91–96 (L3) in der variablen Leichtkettendomäne und 26–32 (H1), 53–55 (H2) und 96–101 (H3) in der variablen Schwerkettendomäne; Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196, 901–917 (1987)). "Gerüst"- oder "FR"-Reste sind jene Reste der variablen Domäne, die nicht die Reste der hypervariablen Region wie hierin definiert sind.
  • "Nicht-immunogen in einem Menschen" bedeutet, dass bei Kontaktieren des Polypeptids von Interesse in einem physiologisch annehmbaren Träger und in einer therapeutisch wirksamen Menge mit dem geeigneten Gewebe eines Menschen kein Zustand von Empfindlichkeit oder Resistenz gegenüber dem Polypeptid von Interesse bei der zweiten Verabreichung des Polypeptids von Interesse nach einer geeigneten Latenzzeit (z.B. 8 bis 14 Tage) erkennbar ist.
  • Unter "Agonistenantikörper" wird ein Antikörper verstanden, der in der Lage ist, Nativsequenz-WSX-Rezeptor zu aktivieren. Der Agonistenantikörper von besonderem Interesse hierin ist einer, der eine oder mehrere (z.B. alle) biologischen Eigenschaften des natürlich vorkommenden WSX-Liganden, OB-Proteins nachahmt. In bevorzugten Ausführungsformen weist der Agonistenantikörper eine quantitative biologische Eigenschaft von OB-Protein auf, die innerhalb von zwei Größenordnungen, und vorzugsweise innerhalb einer Größenordnung, von jener des OB-Proteins liegt. Der Agonistenantikörper kann sich an WSX-Rezeptor binden und diesen aktivieren und dadurch Proliferation und/oder Differenzierung und/oder Reifung und/oder Überleben einer Zelle stimulieren, die den WSX-Rezeptor exprimiert (z.B. WSX-Rezeptor-Variante 13.2). In dieser Ausführungsform der Erfindung kann der Agonistenantikörper einer sein, der Proliferation und/oder Differenzierung einer hämatopoetischen Vorläuferzelle fördert, die den WSX-Rezeptor an ihrer Zelloberfläche exprimiert; der Proliferation und/oder Differenzierung von Lymphblutzellstammbäumen fördert; der Proliferation und/oder Differenzierung von Knochenmarkblutzellstammbäumen fördert; und/oder der Proliferation und/oder Differenzierung von Erythrozytenblutzellstammbäumen fördert. Der Agonistenantikörper kann Agonistenaktivität bei Bindung an einen chimären Rezeptur, der die WSX-Rezeptor-Extrazellulärdomäne umfasst, im KIRA-ELISA aufweisen. Der Agonistenantikörper kann 3H-Aufnahme im Thymidin-Inkorporationstest unter Verwendung eines Signalgebungs-WSX-Rezeptors stimulieren (siehe oben); er kann Körpergewicht und/oder Fettdepotgewicht und/oder Nahrungsmittelaufnahme in einem adipösen Säugetier (z.B. in der ob/ob-Maus) reduzieren; er kann Ca2+-Influx in Adipozyten bewirken; und/oder stromab-liegende signalgebende Moleküle von OB-Protein aktivieren.
  • Ein "neutralisierender Antikörper" ist einer, der in der Lage ist, eine Effektorfunktion von Nativsequenz-WSX-Rezeptor oder -OB-Protein zu blockieren oder signifikant zu reduzieren. Beispielsweise kann ein neutralisierender Antikörper WSX-Rezeptoraktivierung durch einen WSX-Liganden, wie er im Thymidin-Inkorporationstest oder in einem KIRA-ELISA bestimmt wird, inhibieren oder reduzieren.
  • Die Bezeichnung "zytotoxisches Mittel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Substanz, die die Funktion von Zellen inhibiert oder unterbindet und/oder Zerstörung von Zellen verursacht. Die Bezeichnung soll radioaktive Isotope (z.B. I131, I125, Y90 und Re186), chemotherapeutische Mittel und Toxine, wie z.B. enzymatisch aktive Toxine bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder von Pilzen, oder Fragmente davon umfassen.
  • Ein "chemotherapeutisches Mittel" ist eine chemische Verbindung, die zur Behandlung von Krebs nützlich ist. Beispiele für chemotherapeutische Mittel umfassen Adriamycin, Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Cytosinarabinosid ("Ara-C"), Cyclophosphamid, Thiotepa, Taxotere (Docetaxel), Busulfan, Cytoxin, Taxol, Methotrexat, Cisplatin, Melphalan, Vinblastin, Bleomycin, Etoposid, Ifosfamid, Mitomycin C, Mitoxantron, Vincreistin, Vinorelbin, Carboplatin, Teniposid, Daunomycin, Carminomycin, Aminopterin, Dactinomycin, Mitomycine, Esperamicine (siehe das US-Patent Nr. 4.675.187), Melphalan und andere verwandte N-Losts.
  • Die Bezeichnung "Prodrug" wie in dieser Anmeldung verwendet bezieht sich auf eine Vorläufer- oder Derivatform einer pharmazeutisch aktiven Substanz; die weniger zytotoxisch gegenüber Tumorzellen ist als der verwandte Wirkstoff und in der Lage ist, enzymatisch aktiviert oder zur aktiveren verwandten Form umgesetzt zu werden. Siehe z.B. Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions 14, 375–382, 615th Meeting Belfast (1986), und Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al. (Hrsg.), 247–267, Humana Press (1985). Die Prodrugs dieser Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Phosphat-hältige Prodrugs, Thiophosphat-hältige Prodrugs, Sulfat-hältige Prodrugs, Peptid-hältige Prodrugs, D-Aminosäure-modifizierte Prodrugs, glykosylierte Prodrugs, β-Lactam-hältige Prodrugs, gegebenenfalls substituierte Phenoxyacetamid-hältige Prodrugs oder gegebenenfalls substituierte Phenylacetamid-hältige Prodrugs, 5-Fluorcytosin und andere 5-Fluoruridin-Prodrugs, die zum aktiveren zytotoxischen, freien Wirkstoff umgesetzt werden können. Beispiele für zytotoxische Wirkstoffe, die zu einer Prodrug-Form zur Verwendung in dieser Erfindung derivatisiert werden können, umfassen jene chemotherapeutischen Mittel, die zuvor beschrieben wurden, sind jedoch nicht beschränkt darauf.
  • Ein "Antagonist" des WSX-Rezeptors und/oder OB-Proteins ist ein Molekül, das Bindung und/oder Aktivierung des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins unterbindet oder stört. Solche Moleküle können beispielsweise auf ihre Fähigkeit gescreent werden, kompetitiv WSX-Rezeptoraktivierung durch OB-Protein im hierin offenbarten Thymi din-Inkorporationstest zu inhibieren. Beispiele für solche Moleküle umfassen: WSX-Rezeptor-ECD; WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin; neutralisierende Antikörper gegen WSX-Rezeptor oder OB-Protein; kleine Moleküle und Peptidantagonisten; und Antisense-Nucleotide gegen den WSX-Rezeptor oder das ob-Gen.
  • Die Phrase "Fördern von Proliferation einer Zelle" umfasst den Schritt der Steigerung des Ausmaßes an Wachstum und/oder Reproduktion der Zelle in Bezug auf eine nicht-behandelte Zelle entweder in vitro oder in vivo. Eine Steigerung der Zellproliferation in Zellkultur kann durch Zählen der Anzahl an Zellen vor und nach dem Aussetzen gegenüber einem Molekül von Interesse nachgewiesen werden. Das Ausmaß an Proliferation kann mittels mikroskopischer Untersuchung des Konfluenzgrades quantifiziert werden. Zellproliferation kann auch unter Verwendung des hierin beschriebenen Thymidin-Inkorporationstests quantifiziert werden.
  • Unter "Fördern von Differenzierung einer Zelle" wird das Steigern des Ausmaßes des Erwerbens oder des Verfügens über eine(r) oder mehrere(r) Eigenschaften oder Funktionen verstanden, die sich von jenen der ursprünglichen Zelle unterscheiden (d.h. Zellspezialisierung). Dies kann durch Screenen auf eine Veränderung des Phänotyps der Zelle (z.B. Identifizieren morphologischer Veränderungen in der Zelle) nachgewiesen werden.
  • Eine "hämatopoetische Vorläuferzelle" oder "primitive blutbildende Zelle" ist eine, die in der Lage ist, sich zu differenzieren, um einen genauer definierten oder reiferen Blutzelltyp zu bilden.
  • "Lymphblutzellstammbäume" sind jene hämatopoetischen Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich zu differenzieren, um Lymphozyten (B-Zellen oder T-Zellen) zu bilden. In ähnlicher Weise stellt "Lymphopoese" die Bildung von Lymphozyten dar.
  • "Erythrozytenblutzellstammbäume" sind jene hämatopoetischen Vorläuferzellen, die in der Lage sind, sich zu differenzieren, um Erythrozyten (rote Blutzellen) zu bilden, und "Erythropoese" steht für die Bildung von Erythrozyten.
  • Die Bezeichnung "Knochenmarkblutzellstammbäume" umfasst für die Zwecke hierin alle hämatopoetischen Vorläuferzellen, die keine Lymph- und Erythrozytenblutzellstammbäume wie zuvor definiert sind, und "Myelopoese" umfasst die Bildung von Blutzellen (die keine Lymphozyten und Erythrozyten sind).
  • Eine "CD34+-Zellpopulation" ist an hämatopoetischen Stammzellen angereichert. Eine CD34+-Zellpopulation kann beispielsweise aus Nabelschnurblut oder Knochenmark gewonnen werden. Menschliche Nabelschnurblut-CD34+-Zellen können zur Verwendung von immunomagnetischen Perlen, die von Miltenyi (Kalifornien) vertrieben werden, gemäß den Anweisungen des Herstellers selektiert werden.
  • "Physiologisch annehmbare" Träger, Arzneimittelträger oder Stabilisatoren sind Substanzen, die gegenüber der Zelle oder dem Säugetier, das dieser Substanz ausgesetzt wird, bei den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch sind. Häufig ist der physiologisch annehmbare Träger eine wässrige, pH-gepufferte Lösung. Beispiele für physiologisch annehmbare Träger umfassen Puffer wie z.B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien einschließlich Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (mit weniger als 10 Resten); Proteine, wie z.B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie z.B. Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie z.B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie z.B. EDTA; Zuckeralkohole wie z.B. Mannit oder Sorbit; salzbildende Gegenionen wie z.B. Natrium; und/oder nichtionische Tenside wie z.B. Tween, Pluronics oder Polyethylenglykol (PEG).
  • Wie hierin verwendet bezieht sich die Bezeichnung "Salvage-Rezeptorbindungsepitop" auf ein Epitop der Fc-Region eines IgG-Moleküls (z.B. IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4), das für die Steigerung der In-vivo-Serumhalbwertszeit des IgG-Moleküls verantwortlich ist. Beispiele für Salvage-Rezeptorbindungsepitop-Sequenzen umfassen HQNLSDGK (Seq.-ID Nr. 39); HQNISDGK (Seq.-ID Nr. 40); HQSLGTQ (Seq.-ID Nr. 41); VISSHLGQ (Seq.-ID Nr. 42) und PKNSSMISNTP (Seq.-ID Nr. 43).
  • Die Bezeichnung "Cytokin" ist eine generische Bezeichnung für Proteine, die von einer Zellpopulation freigesetzt werden und auf eine andere Zelle als interzelluläre Mediatoren wirken. Beispiele für solche Cytokine sind Lymphokine, Monokine und herkömmliche Polypeptidhormone. Cytokine umfassen OB-Protein; Wachstumshormone wie z.B. menschliches Wachstumshormon, menschliches N-Methionylwachstumshormon und Rinderwachstumshormon; Parathormon; Thyroxin; Insulin; Proinsulin, Relaxin; Prorelaxin; Glycoproteinhormone wie z.B. Follitropin (FSH), Thyreotropin (TSH) und Luteotropin (LH); Leberwachstumsfaktor; Fibroblastenwachstumsfaktor; Prolactin; Placenta-Lactogen; Tumornekrosefaktor-α und -β; Müller-inhibierende Substanz (MIS); Maus-Gonadotropin-assoziiertes Peptid; Inhibin; Activin; Gefäßendothelwachstumsfaktor; Integrin; Thrombopoietin (TPO); Nervenwachstumsfaktoren wie z.B. NGF-β; Plättchen-Wachstumsfaktor; transformierende Wachstumsfaktoren (TGFs) wie z.B. TGF-α und TGF-β; Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I und -II; Erythropoietin (EPO); osteoinduktive Faktoren; Interferone wie z.B. Interferon-α, -β und -γ; koloniestimulierende Faktoren (CSFs) wie z.B. Makrophagen-CSF (M-CSF); Granulozyten-Makrophagen-CSF (GM-CSF); und Granulozyten-CSF (G-CSF); Interleukine (ILs) wie z.B. IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12; und andere Polypeptidfaktoren einschließlich Leukämie inhibierenden Faktor (LIF) und Kit-Ligand (KL). Wie hierin verwendet umfasst die Bezeichnung Cytokin Proteine aus natürlichen Quellen oder aus rekombinanter Zellkultur und biologisch aktive Äquivalente der Nativsequenzcytokine.
  • Ein "Stammbaum-spezifisches Cytokin" ist eines, das auf relativ genau definierte Zellen in der Blutbildungskaskade wirkt und eine Vermehrung von Blutzellen in einem einzelnen Stammbaum auslöst. Beispiele für solche Cytokine umfassen EPO, TPO und G-CSF.
  • "Behandlung" bezieht sich sowohl auf therapeutische Behandlung als auch auf prophylaktische oder präventive Maßnahmen. Jene, die einer Behandlung bedürfen, umfassen jene, die bereits die Störung aufweisen, sowie jene, bei denen es die Störung zu unterbinden gilt.
  • Die Bezeichnung "Obesität" wird verwendet, um ein Leiden in Verbindung mit Übergewicht zu beschreiben, das mit übermäßigem Körperfett zusammenhängt. Das wünschenswerte Gewicht für eine bestimmte Person hängt von zahlreichen Faktoren einschließlich Geschlecht, Größe, Alter, Körperbau usw. ab. Dieselben Faktoren bestimmen, wann eine Person als adipös zu betrachten ist. Die Bestimmung eines optimalen Körpergewichts für eine bestimmte Person liegt durchwegs im Kompetenzbereich eines gewöhnlichen Arztes.
  • "Säugetier" für die Zwecke der Erfindung bezieht sich auf jedes beliebige Tier, das als ein Säugetier klassifiziert ist, einschließlich Menschen, Haus- und Nutztiere und Zoo-, Sport- oder Kleintiere, wie z.B. Hunde, Pferde, Katzen, Rinder usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
  • Unter "Festphase" ist eine nicht-wässrige Matrix zu verstehen, an der ein Reagens von Interesse (z.B. der WSX-Rezeptor oder ein Antikörper hiergegen) anhaften kann. Beispiele für Festphasen, die hierin eingebunden sind, umfassen jene, die teilweise oder vollständig aus Glas (z.B. Controlled Pore Glass), Polysacchariden (z.B. Agarose), Polyacrylamiden, Polystyrol, Polyvinylalkohol und Silikonen gebildet sind. In bestimmten Ausführungsformen, je nach Zusammenhang, kann die Festphase den Well einer Testplatte umfassen; in anderen ist sie eine Reinigungssäule (z.B. eine Affinitätschromatographiesäule). Diese Bezeichnung umfasst auch eine diskontinuierliche Festphase aus diskreten Teilchen, wie z.B. im US-Patent Nr. 4.275.149 beschrieben wird.
  • II. Arten der Durchführung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung des WSX-Rezeptors. Die hierin beschriebenen Versuche zeigen, dass dieses Molekül ein Cytokinrezeptor ist, der bei der Förderung von Proliferation und/oder Differenzierung von blutbildenden Zellen eine Rolle zu spielen scheint. Insbesondere wurde für diesen Rezeptor erkannt, dass er in angereicherten menschlichen Stammzellpopulationen vorhanden ist, was darauf hinweist, dass WSX-Liganden, wie z.B. Agonistenantikörper, verwendet wer den können, um Proliferation von blutbildenden Stammzellen/Vorläuferzellen zu stimulieren. Andere Verwendungen für diesen Rezeptor werden sich anhand der folgenden Erläuterungen zeigen. Es folgt eine Beschreibung, wie WSX-Rezeptor oder OB-Proteine hergestellt werden können.
  • a. Herstellung von WSX-Rezeptor oder OB-Protein
  • Verfahren, die zur Herstellung von WSX-Protein oder OB-Protein geeignet sind, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und umfassen das Isolieren von WSX-Rezeptor oder OB-Protein aus einer endogenen Quelle des Polypeptids, Peptidsynthese (unter Verwendung eines Peptidsynthesegeräts) und Rekombinationsverfahren (oder jegliche Kombination dieser Verfahren). Das bevorzugte Verfahren zur Herstellung von WSX-Rezeptor oder OB-Protein ist ein Rekombinationsverfahren, das nachstehend beschrieben wird.
  • Der Großteil der nachstehenden Erläuterungen betrifft Rekombinationsherstellung von WSX-Rezeptor oder OB-Protein durch Kultivieren der Zellen, die mit einem Vektor transformiert sind, der WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Nucleinsäure enthält, und Gewinnen des Polypeptids aus der Zellkultur. Weiters wird in Betracht gezogen, dass der WSX-Rezeptor oder das OB-Protein dieser Erfindung mittels homologer Rekombination hergestellt werden kann, wie es in der WO 91/06667, veröffentlicht am 16. Mai 1991, dargestellt wird.
  • Kurz zusammengefasst umfasst dieses Verfahren die Transformation menschlicher Primärzellen, die ein für einen WSX-Rezeptor oder für ein OB-Protein kodierendes Gen enthalten, mit einem Konstrukt (d.h. einem Vektor), das ein amplifizierbares Gen (wie z.B. Dihydrofolatreductase (DHFR) oder andere, die nachstehend noch erläutert werden) und zumindest eine flankierende Region mit einer Länge von zumindest etwa 150 bp umfasst, die mit einer DNA-Sequenz am Locus der Kodierregion des WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Gens homolog ist, um für Amplifikation des WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Gens zu sorgen. Die Transformation wird so durchge führt, dass das Konstrukt homolog in das Genom der Primärzellen integriert wird, um eine amplifizierbare Region zu definieren.
  • Primärzellen, die das Konstrukt umfassen, werden dann mittels des amplifizierbaren Gens oder eines anderen Markers, der im Konstrukt vorhanden ist, selektiert. Die Gegenwart des Markergens zeigt die Gegenwart und Integration des Konstrukts im bzw. in das Wirtsgenom auf. Keine weitere Selektion der Primärzellen müssen durchgeführt werden, da Selektion im zweiten Wirt erfolgt. Sofern erwünscht, kann das Auftreten des homologen Rekombinationsereignisses durch Einsatz von PCR und entweder Sequenzieren der resultierenden amplifizierten DNA-Sequenzen oder Bestimmen der geeigneten Länge des PCR-Fragments bestimmt werden, wenn DNA aus korrekten homologen Integranten vorhanden ist, und Vermehren nur jener Zellen, die solche Fragmente enthalten. Sofern erwünscht, können die selektierten Zellen auch zu diesem Zeitpunkt durch Beanspruchung der Zellen mit dem geeigneten amplifizierenden Mittel (wie z.B. Methotrexat, sofern das amplifizierbare Gen DHFR ist) amplifiziert werden, sodass Mehrfachkopien des Zielgens erhalten werden. Vorzugsweise wird der Amplifikationsschritt jedoch nicht vor der nachstehend beschriebenen, zweiten Transformation durchgeführt.
  • Nach dem Selektionsschritt werden DNA-Abschnitte des Genoms, die ausreichend groß sind, dass sie die gesamte, amplifizierbare Region umfassen, aus den selektierten Primärzellen isoliert. Sekundäre Säugetier-Expressionswirtszellen werden dann mit diesen genomischen DNA-Abschnitten transformiert und kloniert, und jene Klone werden selektiert, die die amplifizierbare Region enthalten. Die amplifizierbare Region wird dann mittels eines Amplifikationsmittels amplifiziert, sofern sie nicht bereits in den Primärzellen amplifiziert wurde. Schließlich werden die sekundären Expressionswirtszellen, die nun Mehrfachkopien der amplifizierbaren Region enthalten, die WSX-Rezeptor oder OB-Protein enthält, so gezüchtet, dass sie das Gen exprimieren und das Protein produzieren.
  • i. Isolierung von DNA, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodiert
  • Die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodierende DNA kann von jeder beliebigen cDNA-Bibliothek erhalten werden, die aus Gewebe hergestellt wird, von dem angenommen wird, dass es die WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-mRNA aufweist und diese in einer nachweisbaren Konzentration exprimiert. Demgemäß kann WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-DNA leicht aus einer cDNA-Bibliothek, die aus fötaler Säugetierleber erstellt wurde, gewonnen werden. Das für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodierende Gen kann auch aus einer genomischen Bibliothek oder durch Oligonucleotidsynthese gewonnen werden.
  • Bibliotheken werden mit Sonden (wie z.B. Antikörper gegen den WSX-Rezeptor oder das OB-Protein, oder Oligonucleotide mit etwa 20–80 Basen) gescreent, die darauf abzielen, das Gen von Interesse oder das Protein, für das dieses Gen kodiert, zu identifizieren. Screenen der cDNA oder der genomischen Bibliothek mit der selektierten Sonde kann unter Verwendung von Standardverfahren wie in den Kapiteln 10–12 von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)), beschrieben durchgeführt werden. Ein alternatives Mittel, um das für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodierende Gen zu isolieren, ist die Verwendung von PCR-Methodik gemäß der Beschreibung in Abschnitt 14 von Sambrook et al., s.o.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Durchführung dieser Erfindung ist die Verwendung sorgfältig selektierter Oligonucleotidsequenzen, um cDNA-Bibliotheken aus verschiedenen menschlichen Geweben, vorzugsweise aus fötaler Menschenleber, zu screenen. Die als Sonden selektierten Oligonucleotidsequenzen sollten ausreichend lang und ausreichend unzweideutig sein, sodass falsche Positive minimiert werden können.
  • Das Oligonucleotid muss markiert sein, sodass es bei seiner Hybridisierung an DNA in der gescreenten Bibliothek nachgewiesen kann. Das bevorzugte Markierungsverfahren ist die Verwendung von 32P-markiertem ATP mit Polynucleotidkinase, wie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, um das Oligonucleotid radioaktiv zu markieren. Allerdings können auch andere Verfahren verwendet werden, um das Oligonucleotid zu markieren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Biotinylierung oder Enzymmarkierung.
  • Aminosäuresequenz-Varianten von WSX-Rezeptor oder OB-Protein werden durch Einführen geeigneter Nucleotidveränderungen in die WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-DNA oder durch Synthese des erwünschten WSX-Rezeptors oder OB-Proteins hergestellt. Solche Varianten weisen Insertionen, Substitutionen und/oder spezifizierte Deletionen von Resten innerhalb der oder an einem oder beiden Enden der Aminosäuresequenz eines natürlich vorkommenden, menschlichen WSX-Rezeptors oder OB-Proteins auf, wie beispielsweise die WSX-Rezeptorvarianten, die in den 2A bis 2B gezeigt sind, oder das menschliche OB-Protein von Zhang et al., s.o. Vorzugsweise stellen diese Varianten Insertionen und/oder Substitutionen innerhalb der oder an einem oder beiden Enden der reifen Sequenz und/oder Insertionen, Substitutionen und/oder spezifizierte Deletionen innerhalb der oder an beiden Enden der Signalsequenz des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins dar. Jegliche Kombination von Insertion, Substitution und/oder spezifizierter Deletion wird vollzogen, um das Endkonstrukt zu erlangen, mit der Maßgabe, dass das Endkonstrukt die erwünschte biologische Aktivität wie hierin definiert aufweist. Die Aminosäureänderungen können auch posttranslationale Prozesse des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins verändern, wie z.B. durch die Änderung der Anzahl oder Position von Glykosylierungsstellen, durch Veränderung der Membran-Verankerungseigenschaften und/oder durch Änderung der intrazellulären Platzierung des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins durch Insertieren, Deletieren oder eine andere Art der Beeinflussung der Leadersequenz des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins.
  • Variationen in der Nativsequenz wie zuvor beschrieben können unter Verwendung eines beliebigen der Verfahren und beliebiger Richtlinien für konservative und nicht-konservative Mutationen, die im US-Patent Nr. 5.364.934 beschrieben sind, vollzogen werden. Diese umfassen Oligonucleotid-vermittelte (ortsgerichtete) Mutagenese, Alaninscanning und PCR-Mutagenese. Siehe auch beispielsweise Tabelle I hierin und die Erläuterung in Bezug auf diese Tabelle als Richtlinie zur Selektion von Aminosäuren, die es zu ändern, hinzuzufügen oder deletieren gilt.
  • ii. Insertion von Nucleinsäure in replizierbaren Vektor
  • Die Nucleinsäure (z.B. cDNA oder genomische DNA), die für den WSX-Rezeptor oder das OB-Protein kodiert, wird in einen replizierbaren Vektor zum weiteren Klonieren (Amplifikation der DNA) oder zur Expression insertiert. Zahlreiche Vektoren sind verfügbar. Die Vektorkomponenten umfassen im Allgemeinen, sind jedoch nicht beschränkt auf, eine oder mehrere der folgenden Komponenten: eine Signalsequenz, einen Replikationsursprung, ein oder mehrere Markergene, ein Enhancer-Element, einen Promotor und eine Transkriptionsterminationssequenz.
  • (1) Signalsequenzkomponente
  • Der WSX-Rezeptor oder die OB-Proteine dieser Erfindung können rekombinant nicht nur direkt, sondern auch als ein Fusionspolypeptid mit einem heterologen Polypeptid hergestellt werden, das vorzugsweise eine Signalsequenz oder ein anderes Polypeptid mit einer spezifischen Spaltungsstelle am N-Terminus des reifen Proteins oder Polypeptids ist. Im Allgemeinen kann die Signalsequenz eine Komponente des Vektors sein, oder sie kann ein Teil der WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-DNA darstellen, die in den Vektor insertiert wird. Die vorzugsweise selektierte heterologe Signalsequenz ist eine, die durch die Wirtszelle erkannt und verarbeitet (z.B. durch eine Signalpeptidase gespaltet) wird. Bei prokaryotischen Wirtszellen, die die native WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Signalsequenz nicht erkennen und verarbeiten, wird die Signalsequenz durch eine selektierte prokaryotische Signalsequenz substituiert, beispielsweise eine aus der Gruppe der alkalischen Phosphatase, Penicillinase, Ipp oder wärmestabilen Entrotoxin-II-Leader. Zur Hefesekretion kann die native Signalsequenz durch z.B. den Hefe-Invertaseleader, α-Faktorleader (einschließlich Saccharomyces- und Kluyveromyces-α-Faktorleader, wobei Letztere im US-Patent Nr. 5.010.182, ausgegeben am 23. April 1991, beschrieben sind) oder saure Phosphata se-Leader, den C.-albicans-Glucoamylase-Leader ( EP 362.179 , veröffentlicht am 4. April 1990) oder das in der WO 90/13646, veröffentlicht am 15. November 1990, beschriebene Signal substituiert werden. Bei der Säugetier-Zellexpression ist die native Signalsequenz (z.B. die WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Präsequenz, die normalerweise Sekretion von WSX-Rezeptor oder OB-Protein aus menschlichen Zellen in vivo steuert) zufrieden stellend, obwohl andere Säugetier-Signalsequenzen auch geeignet sein können, wie z.B. Signalsequenzen aus anderen Tier-WSX-Rezeptoren oder – OB-Proteinen und Signalsequenzen aus sekretierten Polypeptiden derselben oder einer verwandten Spezies sowie virale Sekretionsleader, beispielsweise das Herpes-Simplex-gD-Signal.
  • Die DNA für solch eine Vorläuferregion wird in Leseraster an DNA, die für den reifen WSX-Rezeptor oder das reife OB-Protein kodiert, ligiert.
  • (2) Komponente des Replikationsursprungs
  • Sowohl Expressions- als auch Kloniervektoren enthalten eine Nucleinsäuresequenz, die es dem Vektor ermöglicht, sich in einer oder mehreren selektierten Wirtszellen zu replizieren. Im Allgemeinen ist diese Sequenz in Kloniervektoren eine, die dem Vektor die Fähigkeit verleiht, sich unabhängig von der chromosomalen Wirts-DNA zu replizieren, und umfasst Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen. Solche Sequenzen sind für zahlreiche verschiedene Bakterien, Hefe und Viren bekannt. Der Replikationsursprung aus dem Plasmid pBR322 ist für die meisten Gram-negativen Bakterien geeignet, der 2 μ-Plasmidursprung ist für Hefe geeignet, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) sind für Kloniervektoren in Säugetierzellen nützlich. Im Allgemeinen bedarf es der Replikationsursprungskomponente bei Säugetier-Expressionsvektoren nicht (der SV40-Ursprung kann typischerweise nur verwendet werden, da er den frühen Promotor enthält).
  • Die meisten Expressionsvektoren sind "Shuttle"-Vektoren, d.h. sie sind zur Replikation in zumindest einer Klasse von Organismen in der Lage, können jedoch in andere Organismen zur Expression transfiziert werden. Beispielsweise wird ein Vektor in E. coli kloniert, und derselbe Vektor wird in Hefe- oder Säugetierzellen zur Expression transfiziert, obwohl er nicht in der Lage ist, sich unabhängig vom Wirtszellen-Chromosom zu replizieren.
  • DNA kann auch durch Insertion in das Wirtsgenom amplifiziert werden. Dies erfolgt leicht unter Verwendung von Bacillus-Spezies als Wirte, beispielsweise durch Einbinden einer DNA-Sequenz in den Vektor, die zu einer Sequenz, die in genomischer Bacillus-DNA zu finden ist, komplementär ist. Transfektion von Bacillus mit diesem Vektor resultiert in homologer Rekombination mit dem Genom und Insertion von WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-DNA. Die Gewinnung von genomischer DNA jedoch, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodiert, ist komplexer als jene eines exogen replizierten Vektors, da mittels Restriktionsenzymverdau die WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-DNA erst ausgeschnitten werden muss.
  • (3) Selektionsgenkomponente
  • Expressions- und Kloniervektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Dieses Gen kodiert für ein Protein, das für das Überleben oder das Wachstum transformierter Wirtszellen, die in einem selektiven Kulturmedium wachsen, erforderlich ist. Wirtszellen, die nicht mit dem das Selektionsgen enthaltenden Vektor transformiert sind, überleben im Kulturmedium nicht. Typische Selektionsgene kodieren für Proteine, die (a) Resistenz gegenüber Antibiotika oder anderen Toxinen, z.B. Ampicillin, Neomycin, Methotroxat oder Tetracyclin, verleihen, (b) auxotrophe Mängel komplementieren oder (c) essenzielle Nährstoffe liefern, die aus komplexem Medium nicht erhältlich sind, z.B. das für D-Alaninracemase kodierende Gen für Bacilli.
  • Ein Beispiel für ein Selektionsschema verwendet einen Wirkstoff, um Wachstum einer Wirtszelle anzuhalten. Jene Zellen, die erfolgreich mit einem heterologen Gen transformiert wurden, produzieren ein Protein, das Wirkstoffresistenz verleiht, und überleben somit das Selektionsschema. Beispiele für solche dominierende Selektion verwenden die Wirkstoffe Neomycin, Mycophenolsäure und Hygromycin.
  • Ein anderes Beispiel für geeignete selektierbare Marker für Säugetierzellen sind jene, die die Identifikation von Zellen ermöglichen, die in der Lage sind, die WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Nucleinsäure aufzunehmen, wie z.B. DHFR oder Thymidinkinase. Die Säugetierzell-Transformanten werden unter Selektionsdruck gesetzt, den nur die Transformanten durch ihre Beschaffenheit überleben können, da sie den Marker in sich aufgenommen haben. Selektionsdruck wird durch Kultivieren der Transformanten unter Bedingungen auferlegt, unter denen die Konzentration an Selektionsmittel im Medium ausreichend verändert ist, um zur Amplifikation sowohl von Selektionsgen als auch von DNA, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodiert, zu führen. Amplifikation ist der Prozess, durch den Gene, an denen größerer Bedarf zur Produktion eines Proteins besteht, das für Wachstum maßgeblich ist, in Tandem innerhalb der Chromosome aufeinander folgender Generationen von rekombinanten Zellen reiteriert werden. Gesteigerte Mengen an WSX-Rezeptor oder OB-Protein werden aus der amplifizierten DNA synthetisiert. Andere Beispiele für amplifizierbare Gene umfassen Metallothionein-I und -II, vorzugsweise Primaten-Metallothionein-Gene, Adenosindesaminase, Ornithindecarboxylase usw.
  • Zellen, die mit dem DHFR-Selektionsgen transformiert sind, werden beispielsweise zuerst durch Kultivieren aller Transformanten in einem Kulturmedium identifiziert, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, enthält. Eine geeignete Wirtszelle, wenn Wildtyp-DHFR verwendet wird, ist die Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zelllinie, der DHFR-Aktivität fehlt, hergestellt und vermehrt wie von Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980), beschrieben. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Konzentrationen von Methotrexat ausgesetzt. Dies führt zur Synthese von Mehrfachkopien des DHFR-Gens und gleichzeitig zu Mehrfachkopien anderer DNA, die die Expressionsvektoren enthält, wie z.B. DNA, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodiert. Dieses Amplifikationsverfahren kann mit jeglichem, sonst geeignetem Wirt, z.B. ATCC-Nr. CCL61 CHO-K1, verwendet werden, ungeachtet der Gegenwart von endogener DHFR, wenn beispielsweise ein mutiertes DHFR-Gen, das gegenüber Mtx hochresistent ist, verwendet wird ( EP 117.060 ).
  • Alternativ dazu können Wirtszellen (insbesondere Wildtyp-Wirte, die endogene DHFR enthalten), die mit DNA-Sequenzen, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodieren, Wildtyp-DHFR-Protein und anderen selektierbaren Markern wie z.B. Aminoglycosid-3'-phosphotransferase (APH) transformiert oder co-transformiert sind, durch Zellwachstum in Medium, das ein Selektionsmittel für den selektierbaren Marker, wie z.B. ein aminoglykosidisches Antibiotikum, z.B. Kanamycin, Neomycin oder G418, enthält, selektiert werden. Siehe das US-Patent Nr. 4.965.199.
  • Ein geeignetes Selektionsgen zur Verwendung in Hefe ist das trp-1-Gen, das im Hefeplasmid YRp7 vorhanden ist (Stinchcomb et al., Nature 282, 39 (1979)). Das trp1-Gen liefert einen Selektionsmarker für einen mutierten Hefestamm, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, beispielsweise ATCC-Nr. 44076 oder PEP4-1. Jones, Genetics 85, 12 (1977). Die Gegenwart der trp1-Läsion im Hefe-Wirtszellgenom sorgt dann für eine wirksame Umgebung zur Detektion von Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan. In ähnlicher Weise werden Leu2-defiziente Hefestämme (ATCC 20.622 oder 38.626) durch bekannte Plasmide, die Leu2-Gen in sich tragen, komplementiert.
  • Darüber hinaus können Vektoren, die vom ringförmigen 1,6-μm-Plasmid pKD1 abstammen, zur Transformation von Kluyveromyces-Hefen verwendet werden. Bianchi et al., Curr. Genet. 12, 185 (1987). In noch jüngerer Vergangenheit wurde über ein Expressionssystem zur großtechnischen Herstellung von rekombinantem Rinder-Chymosin für K. lactis berichtet. Van den Berg, Bio/Technology 8, 135 (1990). Stabile Mehrfachkopien-Expressionsvektoren zur Sekretion von reifem rekombinantem menschlichem Serumalbumin durch industrielle Stämme von Kluyveromyces wurden auch bereits offenbart. Fleer et al., Bio/Technology 9, 968–975 (1991).
  • (4) Promotorkomponente
  • Expressions- und Kloniervektoren enthalten üblicherweise einen Promotor, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und operabel an die WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Nucleinsäure gebunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromauf (5') zum Startcodon eines strukturellen Gens (im Allgemeinen innerhalb etwa 100 bis 1.000 bp) liegen und die Transkription und Translation einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, wie z.B. der WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Nucleinsäuresequenz, an die sie operabel gebunden sind, steuern. Solche Promotoren sind typischerweise einer von zwei Klassen zuzuordnen: den induzierbaren und konstitutiven Promotoren. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die erhöhte Transkriptionsniveaus von der DNA unter ihrer Kontrolle in Reaktion auf gewisse Änderungen der Kulturbedingungen, z.B. Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder Änderung der Temperatur, bewirken. Aktuell sind zahlreiche Promotoren, die durch eine Vielzahl an verschiedenen potenziellen Wirtszellen erkannt werden, bekannt. Diese Promotoren sind durch Entfernung des Promotors aus der Quellen-DNA durch Restriktionsenzymverdau und Insertieren der isolierten Promotorsequenz in den Vektor operabel an die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodierende DNA gebunden. Sowohl die native WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Promotorsequenz als auch zahlreiche heterologe Promotoren können zur direkten Amplifikation und/oder Expression der WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-DNA verwendet werden. Heterologe Promotoren sind jedoch bevorzugt, da sie im Allgemeinen im Vergleich zu nativem WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Promotor höhere Transkription und größere Ausbeuten an WSX-Rezeptor oder OB-Protein ermöglichen.
  • Promotoren, die zur Verwendung mit prokaryotischen Wirten geeignet sind, umfassen die β-Lactamase- und Lactose-Promotorsysteme (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281, 544 (1979)), alkalische Phosphatase, ein Tryptophan- (trp-) Promotorsystem (Goeddel, Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP 36.776 ) und Hybridpromotoren wie z.B. den tac-Promotor. deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21–25 (1983). Es sind jedoch auch andere bakterielle Promotoren geeignet. Ihre Nucleotidsequenzen wurden bereits veröffentlicht, wodurch Fachleute die Möglichkeit haben, sie operabel mit DNA, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodiert, unter Verwendung von Linkern oder Adaptoren, um jegliche erforderlichen Restriktionsstellen bereitzustellen, zu ligieren (Siebenlist et al., Cell 20, 269 (1980)). Promotoren zur Verwendung in bakteriellen Systemen enthalten auch eine Shine-Dalgarno- (S.D.-) Sequenz, die operabel an die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodierende DNA gebunden ist.
  • Promotorsequenzen sind für Eukaryoten bekannt. Praktisch alle eukaryotischen Gene weisen eine AT-reiche Region auf, die etwa 25 bis 30 Basen stromauf von der Stelle, an der Transkription initiiert wird, liegt. Eine andere Sequenz, die 70 bis 80 Basen stromauf vom Transkriptionsstart zahlreicher Gene liegt, ist eine CXCAAT-Region, worin X für jedes beliebige Nucleotid stehen kann. Am 3'-Ende der meisten eukaryotischen Gene liegt eine AATAAA-Sequenz, die das Signal für Addition des Poly-A-Fortsatzes an das 3'-Ende der Kodiersequenz darstellen kann. Alle diese Sequenzen werden auf geeignete Weise in eukaryotische Expressionsvektoren insertiert.
  • Beispiele für geeignete Promotorsequenzen zur Verwendung mit Hefewirten umfassen die Promotoren für 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 225, 2073 (1980)) oder andere glykolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7, 149 (1968); Holland, Biochemistry 17, 4900 (1978)), wie beispielsweise Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase.
  • Andere Hefepromotoren, die induzierbare Promotoren mit dem zusätzlichen Vorteil von durch Wachstumsbedingungen gesteuerter Transkription sind, sind die Promotorregionen für Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, degradative Enzyme, die mit Stickstoffmetabolismus assoziiert sind, Metallothionein, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase und Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwendung verantwortlich sind. Geeignete Vektoren und Promotoren zur Ver wendung bei Hefeexpression werden näher in der EP 73.657 beschrieben. Hefe-Enhancer werden auch vorteilhafterweise mit Hefepromotoren verwendet.
  • WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Transkription aus Vektoren in Säugetier-Wirtszellen wird beispielsweise durch Promotoren gesteuert, die aus den Genomen von Viren wie z.B. Polyomavirus, Geflügelpockenvirus ( UK 2.211.504 , veröffentlicht am 5. Juli 1989), Adenovirus (wie z.B. Adenovirus 2), Rinder-Papillomavirus, Vogel-Sarkomvirus, Zytomegalie-Virus, einem Retrovirus, Hepatitis-B-Virus und, am meisten bevorzugt, Affenvirus 40 (SV 40), aus heterologen Säugetierpromotoren, z.B. dem Actinpromotor oder einem Immunglobulinpromotor, aus Hitzeschock-Promotoren und aus dem Promotor, der normalerweise mit der WSX-Rezeptor- oder OB-Proteinsequenz assoziiert ist, erhalten werden, vorausgesetzt, solche Promotoren sind mit den Wirtszellsystemen kompatibel.
  • Die frühen und späten Promotoren des SV40-Virus werden leicht aus einem SV40-Restriktionsfragment erhalten, das auch den viralen SV40-Replikationsursprung enthält. Fiers et al., Nature 273, 113 (1978); Mulligan et al., Science 209, 1422–1427 (1980); Pavlakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 7398–7402 (1981). Der unmittelbar frühe Promotor des menschlichen Zytomegalie-Virus ist leicht als ein HindIII-E-Restriktionsfragment zu erhalten. Greenaway et al., Gene 18, 355–360 (1982). Ein System zur Expression von DNA in Säugetierwirten unter Verwendung des Rinderpapillomavirus als Vektor ist im US-Patent Nr. 4.419.446 offenbart. Eine Modifikation dieses Systems ist im US-Patent Nr. 4.601.978 beschrieben. Siehe auch Gray et al., Nature 295, 503–508 (1982), zum Thema Expression von cDNA, die für Immuninterferon kodiert, in Affenzellen; Reyes et al., Nature 297, 598–601 (1982), zum Thema Expression von menschlicher β-Interferon-cDNA in Mauszellen unter der Steuerung eines Thymidinkinase-Promotors aus Herpes-Simplex-Virus; Canaani et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5166–5170 (1982), zum Thema Expression des menschlichen Interferon-β1-Gens in kultivierten Maus- und Kaninchenzellen; und Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6777–6781 (1982), zum Thema Expression von bakteriellen CAT-Sequenzen in CV-1-Affennierenzellen, embryonalen Hühner fibroblasten, Chinahamster-Eierstockzellen, HeLa-Zellen und Maus-NIH-3T3-Zellen unter Verwendung der langen terminalen Wiederholung des Rous-Sarkomvirus als Promotor.
  • (5) Enhancerelement-Komponente
  • Transkription einer DNA, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein dieser Erfindung kodiert, durch höhere Eukaryoten wird häufig durch Insertieren einer Enhancersequenz in den Vektor gesteigert. Enhancer sind cis-wirkende Elemente von DNA, üblicherweise etwa 10 bis 300 bp lang, die auf einen Promotor wirken, um seine Transkription zu steigern. Enhancer sind relativ ausrichtungs- und positionsunabhängig, was daraus geschlossen wird, dass sie 5' (Laimins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 993 (1981)) und 3' (Lusky et al., Mol. Cell Biol. 3, 1108 (1983)) zur Transkriptionseinheit, innerhalb eines Introns (Banerji et al., Cell 33, 729 (1983)) sowie innerhalb der Kodiersequenz selbst gefunden wurden. Osborne et al., Mol. Cell Bio. 4, 1293 (1984). Zahlreiche Enhancersequenzen sind nun aus Säugetiergenen (Globin, Elastase, Albumin, α-Fetoprotein und Insulin) bekannt. Typischerweise wird jedoch ein Enhancer aus einem eukaryotischen Zellvirus verwendet. Beispiele umfassen den SV40-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs (bp 100–270), die frühen Promotorenhancer des Zytomegalie-Virus, der Polyoma-Enhancer an der späten Seite des Replikationsursprungs und Adenovirus-Enhancer. Siehe auch Yaniv, Nature 297, 17–18 (1982), bezüglich Enhancerelemente zur Aktivierung von eukaryotischen Promotoren. Der Enhancer kann in den Vektor an einer Position 5' oder 3' zur WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Kodiersequenz gespleißt werden, liegt jedoch vorzugsweise an einer Stelle 5' vom Promotor.
  • (6) Transkriptionsterminations-Komponente
  • Expressionsvektoren, die in eukaryotischen Wirtszellen (Hefe, Pilze, Insekt, Pflanze, Tier, Mensch oder kernhaltigen Zellen aus anderen mehrzelligen Organismen) verwendet werden, enthalten auch Sequenzen, die zur Termination von Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind. Solche Sequenzen sind üblicher weise aus den untranslatierten 5'-, und gegebenenfalls 3'-, Regionen von eukaryotischen oder viralen DNAs oder cDNAs erhältlich. Diese Regionen enthalten Nucleotidsegmente, die als polyadenylierte Fragmente in den untranslatierten Abschnitt der mRNA, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodiert, transkribiert werden.
  • (7) Konstruktion und Analyse von Vektoren
  • Zur Konstruktion geeigneter Vektoren, die eine oder mehrere der oben genannten Komponenten enthalten, werden herkömmliche Ligationsverfahren eingesetzt. Isolierte Plasmide oder DNA-Fragmente werden gespaltet, zugeschnitten und in der erwünschten Form neuerlich ligiert, um die erforderten Plasmide zu bilden.
  • Zur Analyse, um korrekte Sequenzen in konstruierten Plasmiden zu bestätigen, werden die Ligationsgemische verwendet, um E.-coli-K12-Stamm 294 (ATCC 31.446) zu transformieren, und erfolgreiche Transformanten werden durch Ampicillin- oder Tetracyclinresistenz, je nach Erfordernis, selektiert. Plasmide aus den Transformanten werden hergestellt, durch Restriktionsendonucleaseverdau analysiert und/oder durch das Verfahren nach Messing et al., Nucleic Acids Res. 9, 309 (1981), oder durch das Verfahren nach Maxam et al., Methods in Enzymology 65, 499 (1980), sequenziert.
  • Vektoren zur vorübergehenden Expression
  • Besonders nützlich zur praktischen Durchführung dieser Erfindung sind Expressionsvektoren, die für die vorübergehende Expression von DNA, die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodieren, in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen umfasst vorübergehende Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der in der Lage ist, in einer Wirtszelle effizient zu replizieren, sodass die Wirtszelle zahlreiche Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und ihrerseits hohe Konzentrationen an einem erwünschten Polypeptid, für das der Expressionsvektor kodiert, synthetisiert. Sambrook et al., s.o., 16.17–16.22. Vorübergehende Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, ermöglichen die einfache positive Identifikation von Polypeptiden, für die klonierte DNAs kodieren, sowie rasches Screenen solcher Polypeptide auf erwünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Somit sind Systeme zur vorübergehenden Expression in der Erfindung besonders nützlich für Zwecke wie die Identifikation von Analoga und Varianten von WSX-Rezeptor oder OB-Protein, die biologisch aktive WSX-Rezeptoren oder OB-Proteine sind.
  • (8) Geeignete Beispiele für Wirbeltierzellvektoren
  • Andere Verfahren, Vektoren und Wirtszellen, die zur Adaptation an die Synthese von WSX-Rezeptor oder OB-Protein in rekombinanter Wirbeltierzellkultur geeignet sind, werden in Gething et al., Nature 293, 620–625 (1981); Mantei et al., Nature 281, 40–46 (1979); EP 117.060 und EP 117.058 beschrieben. Ein besonders nützliches Plasmid für Säugetier-Zellkulturexpression von WSX-Rezeptor oder OB-Protein ist pRK5 ( EP 307.247 ) oder pSV16B. WO 91/08291, veröffentlicht am 13. Juni 1991.
  • iii. Selektion und Transformation von Wirtszellen
  • Geeignete Wirtszellen zum Klonieren oder Exprimieren der DNA in den Vektoren hierin sind die zuvor beschriebenen Prokaryoten-, Hefe- oder höheren Eukaryotenzellen. Geeignete Prokaryoten für diesen Zweck umfassen Eubakterien, wie z.B. Gram-negative oder Gram-positive Organismen, beispielsweise Enterobacteriaceae wie Escherichia, z.B. E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, z.B. Salmonella typhimurium, Serratia, z.B. Serratia marcescans, und Shigella sowie Bacilli wie z.B. B. subtilis und B. licheniformis (z.B. B. licheniformis 41P, offenbart in DD 266.710, veröffentlicht am 12. April 1989), Pseudomonas wie z.B. P. aeruginosa und Streptomyces. Ein bevorzugter E.-coli-Klonierwirt ist E. coli 294 (ATCC 31.446), obwohl andere Stämme wie beispielsweise E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) und E. coli W3110 (ATCC 27.325) geeignet sind. Diese Beispiele dienen zur Veranschaulichung und stellen keine Einschränkung dar. Stamm W3110 ist ein besonders bevorzugter Wirt oder Elternwirt, da er ein gemeiner Wirtsstamm für Fermentationen von DNA-Rekombinationsprodukten ist. Vorzugsweise sollte die Wirtszelle geringe Mengen an proteolytischen Enzymen sekretieren. Beispielsweise kann Stamm W3110 so modifiziert werden, dass er eine genetische Mutation in den Genen, die für Proteine kodieren, bewirkt, wobei Beispiele für solche Wirte E. coli W3110 Stamm 27C7 umfassen. Der vollständige Genotypus von 27C7 ist tonA Δptr3 phoA ΔE15 Δ(argF-lac)169 ompTΔ degP41kanr. Stamm 27C7 wurde am 30. Oktober 1991 bei der American Type Culture Collection als ATCC Nr. 55.244 hinterlegt. Alternativ dazu kann der Stamm von E. coli mit mutierter periplasmatischer Protease, offenbart im US-Patent Nr. 4.946.783, ausgegeben am 7. August 1990, verwendet werden. Wiederum alternativ dazu sind Verfahren zum Klonieren, z.B. PCR oder andere Nucleinsäure-Polymerasereaktionen, geeignet.
  • Zusätzlich zu Prokaryoten sind eukaryotische Mikroben wie z.B. Fadenpilze oder Hefe geeignete Klonier- oder Expressionswirte für WSX-Rezeptor- oder OB-Proteinkodierende Vektoren. Saccharomyces cerevisiae, oder gewöhnliche Bäckerhefe, wird unter niedereren eukaryotischen Wirts-Mikroorganismen am häufigsten verwendet. Es sind jedoch auch zahlreiche andere Gattungen, Spezies und Stämme allgemein erhältlich und hierin nützlich, wie z.B. Schizosaccharomyces pombe (Beach et al., Nature 290, 140 (1981); EP 139.383 , veröffentlicht am 2. Mai 1985); Kluyveromyces-Wirte (US-Patent Nr. 4.943.529; Fleer et al., s.o.) wie z.B. K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574), K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg et al., s.o.), K. thermotolerans und K. marxianus; Yarrowia ( EP 402.226 ); Pichia pastoris ( EP 183.070 ; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol. 28, 265–278 (1988)); Candida; Trichoderma reesia ( EP 244.234 ); Neurospora crassa (Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 5259–5263 (1979)); Schwanniomyces wie z.B. Schwanniomyces occidentalis ( EP 394.538 , veröffentlicht am 31. Oktober 1990); und Fadenpilze wie z.B. Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, veröffentlicht am 10. Jänner 1991) und Aspergillus-Wirte wie z.B. A. nidulans (Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 284–289 (1983); Tilburn et al., Gene 26, 205–221 (1983); Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1470–1474 (1984)) und A. niger. Kelly et al., EMBO J. 4, 475–479 (1985).
  • Geeignete Wirtszellen für die Expression von glykosyliertem WSX-Rezeptor oder OB-Protein stammen von vielzelligen Organismen. Solche Wirtszellen sind zu komplexen Verarbeitungs- und Glykosylierungsaktivitäten fähig. Prinzipiell ist jede beliebige, höhere eukaryotische Zellkultur verarbeitbar, unabhängig davon, ob sie aus einer Wirbeltier- oder Wirbellosenkultur abstammt. Beispiele für Zellen von Wirbellosen umfassen Pflanzen- und Insektenzellen. Zahlreiche Baculovirus-Stämme und – Varianten und entsprechende permissive Insektenwirtszellen von Wirten wie z.B. Spodoptera frugiperda (Raupe), Aedes aegypti (Stechmücke), Aedes albopictus (Stechmücke), Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) und Bombyx mori wurden bereits identifiziert. Siehe z.B. Luckow et al., Bio/Technology 6, 47–55 (1988); Miller et al., in: Genetic Engineering, Setlow et al. (Hrsg.), Bd. 6, Plenum Publishing, 277–279 (1986); und Maeda et al., Nature 315, 592–594 (1985). Zahlreiche Virusstämme zur Transfektion sind öffentlich erhältlich, z.B. die L-1-Variante von Autographa californica NPV und der Bm-5-Stamm von Bombyx mori NPV, und solche Viren können als das Virus hierin gemäß der vorliegenden Erfindung, insbesondere zur Transfektion von Spodoptera-frugiperda-Zellen, verwendet werden.
  • Pflanzen-Zellkulturen von Baumwolle, Kukuruz (Mais), Erdäpfel (Kartoffel), Sojabohne, Petunie, Paradeiser (Tomate) und Tabak können als Wirte verwendet werden. Typischerweise werden Pflanzenzellen durch Inkubation mit bestimmten Stämmen des Bakteriums Agrobacterium tumefaciens transfiziert, das davor manipuliert wurde, um die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodierende DNA zu enthalten. Während der Inkubation der Pflanzenzellkultur mit A. tumefaciens wird die für den WSX-Rezeptor oder das OB-Protein kodierende DNA auf den Pflanzenzellwirt übertragen, sodass dieser transfiziert ist, und unter geeigneten Bedingungen die für WSX-Rezeptor oder OB-Protein kodierende DNA exprimiert. Darüber hinaus sind Regulations- und Signalsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie z.B. der Nopalinsynthase-Promotor und Polyadenylierungssignalsequenzen, erhältlich. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen. 1, 561 (1982). Weiters sind DNA-Segmente, die aus der Stromauf-Region des T-DNA-780-Gens isoliert sind, in der Lage, Transkriptionsniveaus von in Pflanzen exprimierbaren Genen in rekombinantem, DNA-hältigem Pflanzengewebe zu aktivieren oder zu steigern. EP 321.196 , veröffentlicht am 21. Juni 1989.
  • Das Interesse war jedoch stets für Wirbeltierzellen am größten, und die Vermehrung von Wirbeltierzellen in Kultur (Gewebekultur) ist zu einem Routineverfahren geworden. Siehe z.B. Tissue Culture, Academic Press, Kruse & Patterson (Hrsg.) (1973). Beispiele für nützliche Säugetier-Wirtszelllinien sind Affennieren-CV1-Linie, transformiert durch SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); menschliche embryonale Nierenlinie (293 oder 293-Zellen, für Wachstum in Suspensionskultur subkloniert, Graham et al., J. Gen Virol. 36, 59 (1977)); Babyhamster-Nierenzellen (BHK, ATCC CCL 10); Chinahamster-Eierstockzellen/-DHFR (CHO; Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980)); Maus-Sertolizellen (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23, 243–251 (1980)); Affennierenzellen (CV1 ATCC CCL 70); Nierenzellen der afrikanischen grünen Meerkatze (VERO-76, ATCC CRL 1587); menschliche Zervixkarzinomzellen (HELA, ATCC CCL 2); Hundenierenzellen (MDCK, ATCC CCL 34); Büffelrattenleberzellen (BRL 3A, ATCC CRL 1442); menschliche Lungenzellen (W138, ATCC CCL 75); menschliche Leberzellen (Hep G2, HB 8065); Maus-Brusttumor (MMT 060562, ATCC CCL 51); TRI-Zellen (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383, 44–68 (1982)); MRC-5-Zellen; FS4-Zellen; und eine menschliche Hepatomlinie (Hep G2).
  • Wirtszellen werden transfiziert und vorzugsweise mit den zuvor beschriebenen Expressions- und Kloniervektoren zur WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Herstellung transformiert und in herkömmlichem Nährmedium, modifiziert je nach Bedarf zur Induktion von Promotoren, Selektion von Transformanten oder Amplifikationen der Gene, die für die erwünschten Sequenzen kodieren, kultiviert.
  • Transfektion bezieht sich auf die Aufnahme eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, unabhängig davon, ob eine Kodiersequenz tatsächlich exprimiert wird oder nicht. Zahlreiche Transfektionsverfahren sind durchschnittlichen Fachleuten bekannt, beispielsweise CaPO4 und Elektroporation. Erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen daran erkannt, wenn irgendein Hinweis auf die Wirkung dieses Vektors innerhalb der Wirtszelle auftritt.
  • Transformation bedeutet das Einführen von DNA in einen Organismus, sodass die DNA replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder als chromosomaler Bestandteil. Je nach verwendeter Wirtszelle erfolgt Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Die Calciumbehandlung unter Verwendung von Calciumchlorid, wie sie im Abschnitt 1.82 von Sambrook et al., s.o., beschrieben ist, oder Elektroporation wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen, die wesentliche Zellwandbarrieren aufweisen, verwendet. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens wird zur Transformation bestimmter Pflanzenzellen verwendet, wie von Shaw et al., Gene 23, 315 (1983), und in der WO 89/05859, veröffentlicht am 29. Juni 1989, beschrieben wird. Darüber hinaus können Pflanzen unter Verwendung von Ultraschallbehandlung, wie in der WO 91100358, veröffentlicht am 10. Jänner 1991, beschrieben wird, transfiziert werden.
  • Für Säugetierzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Fällverfahren von Graham et al., Virology 52, 456–457 (1978), bevorzugt. Allgemeine Aspekte von Transformationen von Säugetier-Wirtszellsystemen werden im US-Patent Nr. 4.399.216, ausgegeben am 16. August 1983, beschrieben. Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., J. Bact. 130, 946 (1977), und Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 3829 (1979), durchgeführt. Es können jedoch auch andere Verfahren zur Einführung von DNA in Zellen verwendet werden, wie beispielsweise mittels Nuklearmikroinjektion, Elektroporation oder bakterieller Protoplastenfusion mit intakten Zellen oder mittels Polykationen, z.B. Polybren, Polyornithin usw. Für verschiedene Verfahren zur Transformation von Säugetierzellen siehe Keown et al., Methods in Enzymology 185, 527–537 (1990), und Mansour et al., Nature 336, 348–352 (1988).
  • iv. Kultivieren der Wirtszellen
  • Prokaryotische Zellen zur Herstellung von WSX-Rezeptor oder OB-Protein dieser Erfindung werden in geeigneten Medien wie allgemein in Sambrook et al., s.o., beschrieben verwendet.
  • Die zur Herstellung von WSX-Rezeptor oder OB-Protein dieser Erfindung verwendeten Säugetierzellen können in zahlreichen verschiedenen Medien kultiviert werden. Handelsübliche Medien wie z.B. Ham's F10 (Sigma), Minimal Essential Medium ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) und Dulbecco's Modified Eagle's Medium ((DMEM), Sigma) sind zur Kultivierung der Wirtszellen geeignet. Weiters können sämtliche Medien, die in Ham et al., Meth. Enz. 58, 44 (1979); Barnes et al., Anal. Biochem. 102, 255 (1980); in den US-Patenten Nr. 4.767.704, 4.657.866, 4.927.762, 4.560.655 oder 5.122.469; WO 90/03430, WO 87/00195; oder US-Patent Re. 30.985 beschrieben werden, als Kulturmedium für die Wirtszellen verwendet werden. Jegliches dieser Medien kann, je nach Bedarf, mit Hormonen und/oder anderen Wachstumsfaktoren (wie z.B. Insulin, Transferrin oder epidermalem Wachstumsfaktor), Salzen (wie z.B. Natriumchlorid, Calcium, Magnesium und Phosphat), Puffern (wie z.B. HEPES), Nucleosiden (wie z.B. Adenosin und Thymidin), Antibiotika (wie z.B. Wirkstoff GENTAMYCINTM), Spurenelementen (definiert als anorganische Verbindungen, die üblicherweise in Endkonzentrationen im mikromolaren Bereich vorhanden sind) und Glucose oder einer äquivalenten Energiequelle ergänzt werden. Auch jegliche anderen erforderlichen Ergänzungen können bei geeigneten Konzentrationen eingebunden werden, die Fachleuten bekannt sein werden. Die Kulturbedingungen wie Temperatur, pH und dergleichen sind jene, die davor für die zur Expression selektierte Wirtszelle verwendet wurden, und werden durchschnittlichen Fachleuten ersichtlich sein.
  • Im Allgemeinen sind Grundlagen, Arbeitsvorschriften und praktische Verfahren zur Maximierung der Produktivität von Säugetier-Zellkulturen in Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler (Hrsg.), IRL Press (1991), zu finden.
  • Die Wirtszellen, auf die in dieser Offenbarung Bezug genommen wird, umfassen Zellen in Kultur sowie Zellen, die innerhalb eines Wirtstiers vorhanden sind.
  • v. Detektion von Genamplifikation/-expression
  • Genamplifikation und/oder -expression kann in einer Probe direkt, beispielsweise durch herkömmliches Southern-Blotting oder Northern-Blotting zur Quantifizierung der Transkription von mRNA (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5201–5205 (1980)), Dot-Blotting (DNA-Analyse) oder In-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer geeignet markierten Sonde, basierend auf den hierin bereitgestellten Sequenzen, gemessen werden. Verschiedene Markierungen können verwendet werden, am üblichsten Radioisotope, insbesondere 32P. Es können jedoch auch andere Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise die Verwendung von Biotin-modifizierten Nucleotiden zur Einführung in ein Polynucleotid. Das Biotin dient dann als Bindungsstelle an Avidin oder Antikörper, die mit zahlreichen verschiedenen Markierungen markiert sein können, wie z.B. Radionucliden, fluoreszierenden Substanzen, Enzymen und dergleichen. Alternativ dazu können Antikörper verwendet werden, die spezifische Duplices erkennen können, einschließlich DNA-Duplices, RNA-Duplices und DNA-RNA-Hybridduplices oder DNA-Protein-Duplices. Die Antikörper können nun markiert sein, und der Test kann durchgeführt werden, wenn der Duplex an eine Oberfläche gebunden ist, sodass bei Bildung des Duplex an der Oberfläche die Gegenwart eines Antikörpers, der an den Duplex gebunden ist, nachgewiesen werden kann.
  • Genexpression kann alternativ dazu durch immunologische Verfahren wie z.B. immunhistochemisches Färben von Gewebeschnitten und Tests an Zellkultur oder Körperflüssigkeiten gemessen werden, um die Expression von Genprodukt direkt zu quantifizieren. Bei immunhistochemischen Färbungsverfahren wird eine Zellprobe hergestellt, typischerweise durch Dehydratisierung und Fixation, gefolgt von Umsetzung mit markierten Antikörpern, die für das gebundene Genprodukt spezifisch sind, worin die Markierungen üblicherweise sichtbar nachweisbar sind, wie z.B. enzymatische Markierungen, fluoreszierende Markierungen, lumineszierende Markierungen und dergleichen. Ein besonders empfindliches Färbungsverfahren, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird in Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75, 734–738 (1980), beschrieben.
  • Antikörper, die zum immunhistochemischen Färben und/oder Testen von Probenflüssigkeiten nützlich sind, können entweder monoklonal oder polyklonal sein und können wie hierin beschrieben hergestellt werden.
  • vi. Reinigung von WSX-Rezeptor oder OB-Protein
  • WSX-Rezeptor (z.B. WSX-Rezeptor-ECD) oder OB-Protein wird vorzugsweise aus dem Kulturmedium als ein sekretiertes Polypeptid gewonnen, obwohl er/es ebenfalls aus Wirtszelllysaten gewonnen werden kann. Ist der WSX-Rezeptor membrangebunden, so kann er aus der Membran unter Verwendung einer geeigneten Detergenslösung (z.B. Triton-X 100) freigesetzt werden.
  • Wird WSX-Rezeptor oder OB-Protein in einer rekombinanten Zelle hergestellt, die nicht menschlichen Ursprungs ist, so ist der WSX-Rezeptor oder das OB-Protein vollständig frei von Proteinen oder Polypeptiden menschlichen Ursprungs. Es ist jedoch erforderlich, WSX-Rezeptor oder OB-Protein von rekombinanten Zellproteinen oder -polypeptiden zu reinigen, um Präparate zu erhalten, die im Wesentlichen homogen zu WSX-Rezeptor oder OB-Protein sind. In einem ersten Schritt wird das Kulturmedium oder -lysat zentrifugiert, um partikuläre Zelltrümmer zu entfernen. WSX-Rezeptor oder OB-Protein wird hiernach von verunreinigenden löslichen Proteinen und Polypeptiden gereinigt, wobei die folgenden Verfahren Beispiele für geeignete Reinigungsverfahren hierzu sind: Fraktionierung an einer Ionenaustauschsäule; Ethanolfällung; Umkehrphasen-HPLC; Chromatographie auf Kieselgel oder auf einem Kationenaustauschharz wie z.B. DEAE; Chromatofokussierung; SDS-PAGE; Ammoniumsulfatfällung; Gelfiltration unter Verwendung von beispielsweise Sephadex G-75TM; und Protein-A-SepharoseTM-Säulen, um Verunreinigungen wie IgG zu entfernen.
  • WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Varianten, in denen Reste deletiert, insertiert oder substituiert wurden, werden auf dieselbe Weise wie Nativsequenz-WSX-Rezeptor oder -OB-Protein gewonnen, wobei jegliche wesentliche Änderungen von Eigenschaften, die durch die Variation hervorgerufen werden, berücksichtigt werden. Im munoaffinitätssäulen wie z.B. eine Säule für polyklonalen/s Kaninchen-Anti-WSX-Rezeptor oder -OB-Protein kann verwendet werden, um die WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Variante durch Bindung an zumindest ein verbleibendes Immunepitop zu absorbieren.
  • Ein Proteaseinhibitor wie z.B. Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) kann auch nützlich sein, um proteolytischen Abbau während der Reinigung zu hemmen, und Antikörper können eingebunden werden, um das Wachstum von zufällig hinzugekommenen Kontaminanten zu unterbinden.
  • vii. Kovalente Modifikationen
  • Kovalente Modifikationen von WSX-Rezeptor oder OB-Protein sind in den Schutzumfang dieser Erfindung eingebunden. Sowohl Nativsequenz-WSX-Rezeptor oder -OB-Protein als auch Aminosäuresequenzvarianten des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins können kovalent modifiziert sein. Ein Typ von kovalenter Modifikation des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins wird in das Molekül durch Umsetzen von Target-Aminosäureresten des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins mit einem organischen derivatisierenden Mittel, das in der Lage ist, mit ausgewählten Seitenketten oder den N-oder C-terminalen Resten des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins zu reagieren, eingeführt.
  • Cysteinylreste werden üblicherweise mit α-Halogenacetaten (und entsprechenden Aminen), wie z.B. Chloressigsäure oder Chloracetamid, umgesetzt, um Carboxymethyl- oder Carboxyamidomethyl-Derivate zu ergeben. Cysteinylreste werden auch durch Umsetzung mit Bromtrifluoraceton, α-Brom-β-(5-imidozoyl)propionsäure, Chloracetylphosphat, N-Alkylmaleinimid, 3-Nitro-2-pyridyldisulfid, Methyl-2-pyridyldisulfid, p-Chlormercuribenzoat, 2-Chlormercuri-4-nitrophenol oder Chlor-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol derivatisiert.
  • Histidylreste werden durch Umsetzung mit Diethylpyrocarbonat bei pH 5,5–7,0 derivatisiert, da dieses Mittel relativ spezifisch für die Histidylseitenkette ist. Para-Bromphenacylbromid ist auch nützlich; die Reaktion wird vorzugsweise in 0,1 M Natriumcacodylat bei pH 6,0 durchgeführt.
  • Lysinyl- und Amino-terminale Reste werden mit Bernsteinsäure- oder anderen Carbonsäureanhydriden umgesetzt. Derivatisierung mit diesen Mitteln hat die Wirkung, die Ladung der Lysinylreste umzukehren. Andere geeignete Reagenzien zur Derivatisierung von α-Amino-hältigen Resten umfassen Imidoester wie z.B. Methylpicolinimidat, Pyridoxalphosphat, Pyridoxal, Chlorborhydrid, Trinitrobenzolsulfonsäure, O-Methylisoharnstoff, 2,4-Pentandion und Transaminase-katalysierte Reaktion mit Glyoxylat.
  • Arginylreste werden durch Umsetzung mit einem oder mehreren herkömmlichen Reagenzien modifiziert, darunter Phenylglyoxal, 2,3-Butandion, 1,2-Cyclohexandion und Ninhydrin. Derivatisierung von Argininresten erfordert aufgrund des hohen pKa der funktionellen Guanidingruppe, dass die Umsetzung unter alkalischen Bedingungen erfolgt. Weiters können diese Reagenzien mit den Lysingruppen sowie mit den Arginin-ε-Aminogruppen reagieren.
  • Die spezifische Modifikation von Tyrosylresten kann mit besonderem Interesse an der Einführung von Spektralmarkierungen in Tyrosylreste durch Umsetzung mit aromatischen Diazoniumverbindungen oder Tetranitromethan erfolgen. Am üblichsten werden N-Acetylimidizol und Tetranitromethan verwendet, um O-Acetyltyrosylspezies bzw. 3-Nitro-Derivate zu bilden. Tyrosylreste werden unter Verwendung von 125I oder 131I iodiert, um markierte Proteine zur Verwendung in Radioimmuntests herzustellen, wozu das Chloramin-T-Verfahren geeignet ist.
  • Carboxyl-Seitengruppen (Aspartyl oder Glutamyl) werden selektiv durch Umsetzung mit Carbodiimiden (R-N=C=N-R') modifiziert, worin R und R' verschiedene Alkylgruppen sind, wie beispielsweise 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)carbodiimid oder 1-Ethyl-3-(4-azonia-4,4-dimethylpentyl)carbodiimid. Weiters werden Aspartyl- und Glutamylreste zu Asparaginyl- und Glutaminylresten durch Reaktion mit Ammoniumionen umgesetzt.
  • Derivatisierung mit bifunktionellen Mitteln ist zum Vernetzen von WSX-Rezeptor oder OB-Protein zu einer wasserunlöslichen Trägermatrix oder -oberfläche zur Verwendung im Verfahren zur Reinigung von Anti-WSX-Rezeptor- oder -OB-Protein-Antikörpern nützlich, und umgekehrt. Üblicherweise verwendete Vernetzungsmittel umfassen z.B. 1,1-Bis(diazoacetyl)-2-phenylethan, Glutaraldehyd, N-Hydroxysuccinimidester, beispielsweise Ester mit 4-Azidosalicylsäure, homobifunktionelle Imidoester einschließlich Disuccinimidylester wie 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) und bifunktionelle Maleinimide wie Bis-N-maleinimido-1,8-octan. Derivatisierungsmittel wie Methyl-3-((p-azidophenyl)dithio)propioimidat ergeben photoaktivierbare Zwischenprodukte, die in der Lage sind, Vernetzungen in Gegenwart von Licht zu bilden. Alternativ dazu werden reaktive, wasserunlösliche Matrizen wie beispielsweise Cyanogenbromid-aktivierte Kohlenhydrate und die reaktiven Substrate, die in den US-Patenten Nr. 3.969.287; 3.691.016; 4.195.128; 4.247.642; 4.229.537; und 4.330.440 beschrieben sind, zur Proteinimmobilisierung verwendet.
  • Glutaminyl- und Asparaginylreste werden häufig zu den entsprechenden Glutamyl- bzw. Aspartylresten desamidiert. Diese Reste werden unter neutralen oder basischen Bedingungen desamidiert. Die desamidierte Form dieser Reste liegt im Schutzumfang dieser Erfindung.
  • Andere Modifikationen umfassen Hydroxylierung von Prolin und Lysin, Phosphorylierung von Hydroxylgruppen von Seryl- oder Threonylresten, Methylierung der α-Aminogruppen von Lysin-, Arginin- und Histidin-Seitenketten (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 79–86 (1983)), Acetylierung des N-terminalen Amins und Amidierung jeglicher C-terminalen Carboxylgruppe.
  • Ein anderer Typ von kovalenter Modifikation des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins, der im Schutzumfang dieser Erfindung liegt, umfasst das Ändern des nativen Glykosylierungsmusters des Polypeptids. Durch Ändern wird das Deletieren von einer oder mehreren Kohlenhydratgruppierungen verstanden, die im nativen WSX-Rezeptor oder OB-Protein vorhanden sind, und/oder das Hinzufügen einer oder mehrerer Glykosylierungsstellen, die im nativen WSX-Rezeptor oder OB-Protein nicht vorhanden sind.
  • Glykosylierung von Polypeptiden ist typischerweise entweder N-gebunden oder O-gebunden. N-gebunden bezieht sich auf die Anbindung der Kohlenhydratgruppierung an der Seitenkette eines Asparaginrests. Die Tripeptidsequenzen Asparagin-X-Serin und Asparagin-X-Threonin, worin X jede beliebige Aminosäure außer Prolin ist, sind die Erkennungssequenzen für enzymatische Anbindung der Kohlenhydratgruppierung an die Asparaginseitenkette. Somit schafft die Gegenwart von einer dieser Tripeptidsequenzen in einem Polypeptid eine mögliche Glykosylierungsstelle. O-gebundene Glykosylierung bezieht sich auf die Anbindung eines der Zucker N-Acetylgalactosamin, Galactose oder Xylose an eine Hydroxylaminosäure, am häufigsten Serin oder Threonin, obwohl 5-Hydroxyprolin oder 5-Hydroxylysin auch verwendet werden kann.
  • Hinzufügen von Glykosylierungsstellen zum WSX-Rezeptor oder OB-Protein wird leicht durch Ändern der Aminosäuresequenz erreicht, sodass sie eine oder mehrere der zuvor beschriebenen Tripeptidsequenzen (für N-gebundene Glykosylierungsstellen) enthält. Die Änderung kann auch durch das Hinzufügen von, oder die Substitution durch, einem/einen oder mehreren/mehrere Serin- oder Threoninresten/Threoninreste zur/an der nativen WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Sequenz (für O-gebundene Glykosylierung) erfolgen. Aus praktischen Gründen wird die Aminosäuresequenz des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins vorzugsweise durch Änderungen auf DNA-Niveau geändert, insbesondere durch Mutieren der DNA, die für den WSX-Rezeptor oder das OB-Protein kodiert, an vorausgewählten Basen, sodass Codons gebildet werden, die zu den erwünschten Aminosäuren translatieren. Die DNA-Mutation(en) kann/können unter Verwendung von Verfahren erfolgen, die zuvor und im US-Patent Nr. 5.364.934, s.o., beschrieben wurden.
  • Ein anderes Mittel zur Steigerung der Anzahl an Kohlenhydratgruppierungen am WSX-Rezeptor oder OB-Protein erfolgt durch chemisches oder enzymatisches Binden von Glykosiden an das Polypeptid. Diese Verfahren sind darin von Vorteil, dass sie keine Produktion des Polypeptids in einer Wirtszelle erfordern, die über Glykosylierungsfähigkeiten für N- oder O-gebundene Glykosylierung verfügt. Je nach verwendeter Bindungsart können die Zucker (kann der Zucker) an (a) Arginin und Histidin, (b) freie Carboxylgruppen, (c) freie Sulfhydrylgruppen wie jene von Cystein, (d) freie Hydroxylgruppen wie jene von Serin, Threonin oder Hydroxyprolin, (e) aromatische Reste wie jene von Phenylalanin, Tyrosin oder Tryptophan oder (f) die Amidgruppe von Glutamin gebunden werden. Diese Verfahren werden in der WO 87/05330, veröffentlicht am 11. September 1987, und in Aplin et al., CRC Crit. Rev. Biochem., 259–306 (1981), beschrieben.
  • Entfernung von Kohlenhydratgruppierungen, die am WSX-Rezeptor oder OB-Protein vorhanden sind, kann chemisch oder enzymatisch erfolgen. Chemische Deglykosylierung erfordert die Aussetzung des Polypeptids gegenüber der Verbindung Trifluormethansulfonsäure oder einer äquivalenten Verbindung. Diese Behandlung resultiert in der Spaltung der meisten oder aller Zucker unter Ausnahme des verbindenden Zuckers (N-Acetylglucosamin oder N-Acetylgalactosamin), während das Polypeptid intakt bleibt. Chemische Glykosylierung wird von Hakimuddin et al., Arch. Biochem. Biophys. 259, 52 (1987), und von Edge et al., Anal. Biochem. 118, 131 (1981), beschrieben. Enzymatische Spaltung von Kohlenhydratgruppierungen an Polypeptiden kann durch die Verwendung zahlreicher verschiedener Endo- und Exoglykosidasen, wie von Thotakura et al., Meth. Enzymol. 138, 350 (1987), beschrieben, erreicht werden.
  • Glykosylierung an potenziellen Glykosylierungsstellen kann durch die Verwendung der Verbindung Tunicamycin, wie von Duskin et al., J. Biol. Chem. 257, 3105 (1982), beschrieben, unterbunden werden. Tunicamycin blockiert die Bildung von Protein-N-Glykosid-Bindungen.
  • Ein anderer Typ von kovalenter Modifikation von WSX-Rezeptor oder OB-Protein umfasst das Binden des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins an eines von zahlreichen verschiedenen, nicht-proteinhältigen Polymeren, z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol oder Polyoxyalkylene, auf eine Weise, wie sie in den US-Patenten Nr. 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 oder 4.179.337 beschrieben ist.
  • Da es häufig schwierig ist, die Eigenschaften einer WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Variante vorherzusagen, wird verständlich sein, dass gewisses Screenen der gewonnenen Variante erforderlich sein wird, um die optimale Variante zu selektieren. Eine Veränderung der immunologischen Eigenschaft des WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Moleküls, wie z.B. Affinität zu einem bestimmten Antikörper, kann auch durch einen Immuntest vom kompetitiven Typ gemessen werden. Die WSX-Rezeptorvariante wird auf Veränderungen der Fähigkeit des Proteins getestet, Zellproliferation im Kolonietest aus Beispiel 8 zu induzieren. Andere potenzielle Modifikationen von Protein- oder Polypeptideigenschaften wie z.B. Redox- oder Wärmestabilität, Hydrophobizität, Empfindlichkeit gegenüber proteolytischem Abbau oder Neigung zur Aggregation mit Trägern oder zu Multimeren werden durch Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, getestet.
  • viii. Epitop-markierter/s WSX-Rezeptor oder OB-Protein
  • Diese Erfindung betrifft chimäre Polypeptide, die WSX-Rezeptor oder OB-Protein, fusioniert an ein heterologes Polypeptid, umfassen. Ein chimärer WSX-Rezeptor oder ein chimäres OB-Protein ist ein Typ von WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Variante wie hierin definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das chimäre Polypeptid eine Fusion des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins mit einem Markierungs-Polypeptid, das ein Epitop bereitstellt, an das sich ein Anti-Markierungs-Antikörper selektiv binden kann. Die Epitopmarkierung ist im Allgemeinen am Amino- oder Car boxylterminus des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins bereitgestellt. Solche Epitop-markierten Formen des WSX-Rezeptors oder OB-Proteins sind wünschenswert, da die Gegenwart davon unter Verwendung eines markierten Antikörpers gegen das Markierungs-Polypeptid nachgewiesen werden kann. Auch ermöglicht die Bereitstellung der Epitopmarkierung, dass der WSX-Rezeptor oder das OB-Protein leicht durch Affinitätsreinigung unter Verwendung des Anti-Markierungs-Antikörpers gereinigt werden kann. Affinitätsreinigungsverfahren und Diagnosetests, die Antikörper einbinden, werden später hierin beschrieben.
  • Markierungs-Polypeptide und ihre jeweiligen Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Beispiele umfassen das flu-HA-Markierungspolypeptid und seinen Antikörper 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol. 8, 2159–2165 (1988)); die c-myc-Markierung und die 8F9-, 3C7-, 6E10-, G4-, B7- und 9E10-Antikörper hiergegen (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5, 3610–3616 (1985)); und Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (-gD-) Markierung und ihre Antikörper. Paborsky et al., Protein Engineering 3(6), 547–553 (1990). Andere Markierungspolypeptide wurden bereits offenbart. Beispiele umfassen das Flag-Peptid (Hopp et al., BioTechnology 6, 1204–1210 (1988)); das KT3-Epitoppeptid (Martin et al., Science 255, 192–194 (1992)); und α-Tubulin-Epitoppeptid (Skinner et al., J. Biol. Chem. 266, 15163–15166 (1991)); und die T7-Gen-10-Proteinpeptidmarkierung. Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 6393–6397 (1990). Nachdem das Markierungspolypeptid ausgewählt wurde, kann ein Antikörper hiergegen unter Verwendung der hierin offenbarten Verfahren gebildet werden.
  • Die allgemeinen Verfahren, die zur Konstruktion und Produktion von Epitop-markiertem WSX-Rezeptor oder OB-Protein geeignet sind, sind dieselben wie jene, die hier zuvor offenbart wurden. WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Markierungspolypeptid-Fusionen werden am einfachsten mittels Fusionieren der cDNA-Sequenz, die für den WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Abschnitt in Raster kodiert, an die Markierungspolypeptid-DNA-Sequenz und Exprimieren des resultierenden DNA-Fusionskonstrukts in geeigneten Wirtszellen konstruiert. Üblicherweise wird bei der Herstellung der WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Markierungspolypeptid-Chimären der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure, die für den WSX-Rezeptor oder das OB-Protein kodiert, an seinem 3'-Ende an Nucleinsäure fusioniert, die für den N-Terminus des Markierungspolypeptids kodiert, wobei jedoch auch 5'-Fusionen möglich sind.
  • Epitop-markierter/s WSX-Rezeptor oder OB-Protein kann mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung des Anti-Markierungs-Antikörpers leicht gereinigt werden. Die Matrix, an die der Affinitätsantikörper angebunden ist, ist meistens Agarose, doch auch andere Matrizen sind erhältlich (z.B. Controlled Pore Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol). Der Epitop-markierte WSX-Rezeptor oder das Epitop-markierte OB-Protein kann aus der Affinitätssäule durch Variieren des Puffer-pH oder der Ionenstärke oder durch Zusatz von chaotropen Mitteln beispielsweise eluiert werden.
  • ix. WSX-Rezeptor- oder OB-Protein-Immunoadhäsine
  • Chimären, die aus einer Rezeptorsequenz konstruiert werden, die an eine geeignete Immunglobulin-Konstantdomänensequenz gebunden ist, sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Immunoadhäsine, über die in der Literatur berichtet wurde, umfassen Fusionen des T-Zellrezeptors* (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987)); CD4* (Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989); Traunecker et al., Nature 339, 68–70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9, 347–353 (1990); Byrn et al., Nature 344, 667–670 (1990)); L-Selectin (homing-Rezeptor) (Watson et al., J. Cell Biol. 110, 2221–2229 (1990); Watson et al., Nature 249, 164–167 (1991)); CD44* (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990)); CD28* und B7* (Linsley et al., J. Exp. Med. 173, 721–730 (1991)); CTLA-4* (Lisley et al., J. Exp. Med. 174, 561–569 (1991)); CD22* (Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)); TNF-Rezeptor (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10535–10539 (1991); Lesslauer et al., Eur. J. Immunol. 27, 2883–2886 (1991); Peppel et al., J. Exp. Med. 174, 1483–1489 (1991)); NP-Rezeptoren (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266, 23060–23067 (1991)); und IgE-Rezeptor α* (Ridgway et al., J. Cell. Biol. 115, Abstr. 1448 (1991)), worin die Sternchen (*) angeben, dass der Rezeptor Mitglied der Immunglobulin-Oberfamilie ist.
  • Das einfachste und unkomplizierteste Immunoadhäsin-Design kombiniert die Bindungsregion(en) des "Adhäsin"-Proteins mit den Gelenks- und Fc-Regionen einer Immunglobulin-Schwerkette. Üblicherweise wird bei der Herstellung der WSX-Rezeptor- oder OB-Immunglobulinchimären der vorliegenden Erfindung Nucleinsäure, die für OB-Protein oder die extrazelluläre Domäne des WSX-Rezeptors kodiert, C-terminal an Nucleinsäure, die für den N-Terminus einer Immunglobulin-Konstantdomänensequenz kodiert, fusioniert, wobei jedoch auch N-terminale Fusionen möglich sind. Im Fall von OB-Immunglobulinchimären kann ein OB-Proteinfragment, das die Fähigkeit beibehält, sich an den WSX-Rezeptor zu binden, verwendet werden.
  • Typischerweise behält in solchen Fusionen das kodierte chimäre Polypeptid zumindest funktionell aktive Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen der konstanten Region eines Immunglobulin-Schwerkette bei. Fusionen können auch an den C-Terminus des Fc-Abschnittes einer konstanten Domäne oder unmittelbar N-terminal zur CH1-Region der schweren Kette oder der entsprechenden Region der leichten Kette erfolgen.
  • Die präzise Stelle, an der die Fusion erfolgt, ist nicht maßgeblich; bestimmte Stellen sind bekannt und können ausgewählt werden, um die biologische Aktivität, Sekretions- oder Bindungseigenschaften der WSX-Rezeptor- oder OB-Immunglobulinchimären zu optimieren.
  • In manchen Ausführungsformen werden die WSX-Rezeptor- oder OB-Immunglobulin-Chimären als Monomere oder Hetero- oder Homomultimere assembliert, und insbesondere als Dimere oder Rotamere, im Wesentlichen wie es die WO 91/08298 veranschaulicht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die OB-Proteinsequenz oder WSX-Rezeptor-Extrazellulärdomänensequenz an den N-Terminus des C-terminalen Abschnitts eines Antikörpers (insbesondere der Fc-Domäne), der die Effektorfunktionen eines Immunglobulins, z.B. Immunglobulin G1 (IgG1), umfasst, fusioniert. Es ist möglich, die gesamte Schwerketten-Konstantregion an die Sequenz der extrazellulären Domäne des OB-Proteins oder WSX-Rezeptors zu fusionieren. Bevorzugter wird jedoch eine Sequenz, die in der Gelenksregion unmittelbar stromauf der Papain-Spaltungsstelle (die IgG-Fc chemisch definiert; Rest 216, wenn der erste Rest der Schwerketten-Konstantregion als 114 angenommen wird, oder analoge Stellen anderer Immunglobuline) beginnt, in der Fusion verwendet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die OB-Protein- oder WSX-Rezeptor-Aminosäuresequenz an die Gelenksregion, CH2- und CH3- oder die CH1-, Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen einer IgG1-, IgG2- oder IgG3-Schwerkette fusioniert. Die präzise Stelle, an der die Fusion stattfindet, ist nicht maßgeblich, und die optimale Stelle kann mittels routinemäßiger Versuche bestimmt werden.
  • In manchen Ausführungsformen werden die WSX-Rezeptor- oder OB-Immunglobulinchimären als Multimere assembliert, und insbesondere als Homodimere oder -tetramere. Im Allgemeinen weisen diese assemblierten Immunglobuline bekannte Einheitsstrukturen auf. Eine vierkettige Basisstruktureinheit ist die Form, in der IgG, IgD und IgE bestehen. Eine Vierereinheit kommt in den höhermolekularen Immunglobulinen wiederholt vor; IgM besteht im Allgemeinen als ein Pentamer aus Basis-Vierereinheiten, die durch Disulfidbindungen zusammengehalten werden. IgA-Globulin, und gegebenenfalls IgG-Globulin, können auch in multimerer Form in Serum bestehen. Im Fall von Multimeren kann jede Vierereinheit die gleiche oder eine andere sein.
  • Verschiedene Beispiele für assemblierte WSX-Rezeptor- oder OB-Immunglobulinchimären innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung sind nachstehend schematisch dargestellt:
    • (a) ACL-ACL;
    • (b) ACH-(ACH, ACL-ACH, ACL-VHCH oder VLCL-ACH);
    • (c) ACL-ACH-(ACL-ACH, ACL-VHCH, VLCL-ACH oder VLCL-VHCH);
    • (d) ACL-VHCH-(ACH oder ACL-VHCH oder VLCL-ACH);
    • (e) VLCL-ACH-(ACL-VHCH oder VLCL-ACH); und
    • (f) (A-Y)n-(VLCL-VHCH)2,
    worin
    jedes A für gleiche oder verschiedene OB-Protein- oder WSX-Rezeptor-Aminosäuresequenzen steht;
    VL eine variable Immunglobulin-Leichtkettendomäne ist;
    VH eine variable Immunglobulin-Schwerkettendomäne ist;
    CL eine konstante Immunglobulin-Leichtkettendomäne ist;
    CH eine konstante Immunglobulin-Schwerkettendomäne ist;
    n eine Ganzzahl größer als 1 ist;
    Y den Rest eines kovalenten Vernetzers bezeichnet.
  • Um die Darstellung so einfach wie möglich zu gestalten, stellen die obigen Strukturen nur Schlüsseleigenschaften dar; sie geben weder Bindungs- (J-) oder andere Domänen der Immunglobuline an, noch sind Disulfidbindung gezeigt. Sind jedoch solche Domänen für Bindungsaktivität erforderlich, so gilt es, diese an den üblichen Positionen, die sie in den Immunglobulinmolekülen einnehmen, als vorhanden zu verstehen.
  • Alternativ dazu kann die Sequenz der extrazellulären Domäne des OB-Proteins oder WSX-Rezeptors zwischen Immunglobulin-Schwerketten- und -Leichtketten-Sequenzen insertiert werden, sodass ein Immunglobulin, das eine chimäre Schwerkette umfasst, erhalten wird. In dieser Ausführungsform wird die OB-Protein- oder WSX-Rezeptorsequenz an das 3'-Ende einer Immunglobulinschwerkette in jedem Arm eines Immunglobulins fusioniert, entweder zwischen der Gelenks- und der CH2-Domäne oder zwischen den CH2- und CH3-Domänen. Ähnliche Konstrukte wurden von Hoogenboom et al., Mol. Immunol. 28, 1027–1037 (1991), berichtet.
  • Obwohl die Gegenwart einer Immunglobulinleichtkette nicht in Immunoadhäsinen der vorliegenden Erfindung erforderlich ist, kann eine Immunglobulinleichtkette entweder kovalent an ein OB-Protein- oder WSX-Rezeptor-Immunglobulinschwerketten-Fusionspolypeptid assoziiert sein oder direkt an die WSX-Rezeptor-Extrazellulärdomäne oder das OB-Protein fusioniert sein. Im erstgenannten Fall wird DNA, die für eine Immunglobulinleichtkette kodiert, mit der DNA, die für das OB-Protein- oder WSX-Rezeptor-Immunglobulinschwerketten-Fusionsprotein kodiert, co-exprimiert. Bei Sekretion werden die hybride Schwerkette und die leichte Kette kovalent assoziiert, um eine Immunglobulin-ähnliche Struktur bereitzustellen, die zwei Disulfid-gebundene Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare aufweist. Verfahren, die zur Herstellung solcher Strukturen geeignet sind, werden beispielsweise im US-Patent Nr. 4.816.567, ausgegeben am 28. März 1989, offenbart.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die Immunglobulinsequenzen, die zur Konstruktion der Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung verwendet werden, aus einer konstanten IgG-Immunglobulin-Schwerkettendomäne. Für menschliches Immunoadhäsin wird die Verwendung von menschlichen IgG1- und IgG3-Immunglobulinsequenzen bevorzugt. Ein großer Vorteil der Verwendung von IgG1 ist, dass IgG1-Immunoadhäsine wirksam an immobilisiertem Protein A gereinigt werden können. Im Gegensatz dazu erfordert Reinigung von IgG3 Protein G, ein signifikant weniger vielseitiges Medium. Dennoch sollten auch andere strukturelle und funktionelle Eigenschaften von Immunglobulinen in Erwägung gezogen werden, wenn der Ig-Fusionspartner für eine bestimmte Immunoadhäsinkonstruktion ausgewählt wird. Beispielsweise ist das IgG3-Gelenk länger und flexibler, sodass es größere Adhäsindomänen aufnehmen kann, die sich nicht korrekt falten oder funktionieren können, wenn sie an IgG1 fusioniert sind. Eine andere Erwägung kann sich auf die Wertigkeit beziehen; IgG-Immunoadhäsine sind zweiwertige Homodimere, während Ig-Subtypen wie IgA und IgM dimere bzw. pentamere Strukturen der Basis-Ig-Homodimereinheit hervorbringen können. Für Immunoadhäsine, die zur In-vivo-Anwendung konzipiert sind, sind die pharmakokinetischen Eigenschaften und die Effektorfunktionen, die durch die Fc-Region spezifiziert werden, ebenfalls wichtig. Obwohl IgG1, IgG2 und IgG4 In-vivo-Halbwertszeiten von 21 Tagen aufweisen, sind ih re relativen Wirksamkeiten zur Aktivierung des Komplementsystems unterschiedlich. IgG4 aktiviert Komplement nicht, und IgG2 weist signifikant schwächere Komplementaktivierung auf als IgG1. Darüber hinaus bindet sich IgG2 im Gegensatz zu IgG1 nicht an Fc-Rezeptoren an mononuklearen Zellen oder Neutrophilen. Während IgG3 optimal für Komplementaktivierung ist, beträgt seine In-vivo-Halbwertszeit etwa ein Drittel der anderen IgG-Isotypen. Eine andere wichtige Überlegung im Zusammenhang mit Immunoadhäsinen, die als menschliche Therapeutika verwendet werden sollen, ist die Anzahl an allotypischen Varianten des bestimmten Isotyps. Im Allgemeinen werden IgG-Isotypen mit weniger serologisch definierten Allotypen bevorzugt. Beispielsweise weist IgG1 nur vier serologisch definierte allotypische Stellen auf, von denen zwei (G1m und 2) in der Fc-Region angeordnet sind; eine dieser Stellen G1m1 ist nicht-immunogen. Dahingegen gibt es 12 serologisch definierte Allotypen in IgG3, die alle in der Fc-Region liegen; nur drei dieser Stellen (G3m5, 11 und 21) haben einen Allotypus, der nicht-immunogen ist. Somit ist die potenzielle Immunogenität eines γ3-Immunoadhäsins größer als jene eines γ1-Immunoadhäsins.
  • In Bezug auf das parentale Immunglobulin liegt ein nützlicher Verbindungspunkt unmittelbar stromauf der Cysteine des Gelenks, das die Disulfidbindungen zwischen den zwei schweren Ketten bildet. In einem häufig verwendeten Design liegt das Codon für den C-terminalen Rest des WSX-Reeztpor- oder OB-Proteinteils des Moleküls direkt stromauf der Codons für die Sequenz DKTHTCPPCP (Seq.-ID Nr. 44) der IgG1-Gelenksregion.
  • Die allgemeinen Verfahren, die für die Konstruktion und Expression von Immunoadhäsinen geeignet sind, sind dieselben, wie hierin zuvor in Bezug auf WSX-Rezeptor und OB-Protein offenbart wurden. Immunoadhäsine werden sehr leicht durch Fusionieren der cDNA-Sequenz, die für den WSX-Rezeptor- oder OB-Proteinabschnitt in Raster kodiert, an eine Ig-cDNA-Sequenz hergestellt. Es kann jedoch auch Fusion an genomische Ig-Fragmente verwendet werden (siehe z.B. Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2936–2940 (1987); Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Stamenkovic et al., Cell 66, 1133–1144 (1991)). Der letztgenannte Fusionstyp erfordert die Gegenwart von Ig-Regulationssequenzen zur Expression. cDNAs, die für konstante IgG-Schwerkettenregionen kodieren, können basierend auf veröffentlichten Sequenzen aus cDNA-Bibliotheken aus Milz oder peripherem Blutlymphozyten, durch Hybridisierungs- oder Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Verfahren isoliert werden. Die für den WSX-Rezeptor oder das OB-Protein kodierenden cDNAs und Ig-Teile des Immunoadhäsins werden im Tandem in einen Plasmidvektor insertiert, der wirksame Expression in den ausgewählten Wirtszellen steuert. Zur Expression in Säugetierzellen können pRK5-basierte Vektoren (Schall et al., Cell 61, 361–370 (1990)) und CDM8-basierte Vektoren (Seed, Nature 329, 840 (1989)) verwendet werden. Die exakte Verbindung kann durch Entfernen der zusätzlichen Sequenzen zwischen den entworfenen Verbindungscodons unter Verwendung von Oligonucleotid-gerichteter Deletionsmutagenese (Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10, 6487 (1982); Capon et al., Nature 337, 525–531 (1989)) geschaffen werden. Synthetische Oligonucleotide können verwendet werden, worin jede Hälfte zur Sequenz an einer Seite der erwünschten Verbindung komplementär ist; im Idealfall sind dies 36- bis 48-mere. Alternativ dazu können PCR-Verfahren verwendet werden, um die zwei Teile des Moleküls in Raster mit einem geeigneten Vektor zu verbinden.
  • Die Auswahl der Wirtszelllinie für die Expression des Immunoadhäsins hängt hauptsächlich vom Expressionsvektor ab. Eine andere Überlegung betrifft die Menge an erforderlichem Protein. mg-Mengen können oft mittels vorübergehender Transfektion hergestellt werden. Beispielsweise kann die durch Adenovirus E1A transformierte, menschliche embryonale Nierenzelllinie mit pRK5-basierten Vektoren durch eine Modifikation des Calciumphosphatverfahrens vorübergehend transfiziert werden, um wirksame Immunoadhäsinexpression zu ermöglichen. CDM8-basierte Vektoren können verwendet werden, um COS-Zellen durch das DEAE-Dextranverfahren zu transfizieren (Aruffo et al., Cell 61, 1303–1313 (1990); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. US 9, 347–353 (1990)). Sind größere Mengen an Protein erwünscht, so kann Immunoadhäsin nach stabiler Transfektion einer Wirtszelllinie exprimiert werden. Beispielsweise kann ein pRK5-basierter Vektor in Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen in Gegenwart eines zusätzlichen Plasmids, das für Dihydrofolatreductase (DHFR) kodiert und G418-Resistenz verleiht, eingeführt werden. Klone, die gegenüber G418 resistent sind, können in Kultur selektiert werden; diese Klone werden in der Gegen wart steigender Konzentrationen an DHFR-Inhibitor Methotrexat gezüchtet; Klone, in denen die Anzahl an Genkopien, die für die DHFR- und Immunoadhäsinsequenzen kodieren, co-amplifiziert wird, werden selektiert. Enthält das Immunoadhäsin eine hydrophobe Leadersequenz an seinem N-Terminus, so ist es wahrscheinlich, dass es durch die transfizierten Zellen verarbeitet und sekretiert wird. Die Expression von Immunoadhäsinen mit komplexeren Strukturen kann ausschließlich dafür geeignete Wirtszellen erfordern; beispielsweise können Komponenten wie z.B. Leichkette oder J-Kette durch bestimmte Myelom- oder Hybridom-Zellwirte bereitgestellt werden (Gascoigne et al. (1987), s.o., Martin et al., J. Virol. 67, 3561–3568 (1993)).
  • Immunoadhäsine können einfach durch Affinitätschromatographie gereinigt werden. Die Eignung von Protein A als ein Affinitätsligand hängt von der Spezies und dem Isotyp der Immunglobulin-Fc-Domäne ab, die in der Chimäre verwendet wird. Protein A kann verwendet werden, um Immunoadhäsine zu reinigen, die auf menschlichen γ1-, γ2- oder γ-4-Schwerketten aufbauen (Lindmark et al., J. Immunol. Meth. 62, 1–13 (1983)). Protein G wird für alle Maus-Isotypen und für menschliches γ3 empfohlen (Guss et al., EMBO J. 5, 1567–1575 (1986)). Die Matrix, an die der Affinitätsligand gebunden ist, ist sehr häufig Agarose, wobei jedoch auch andere Matrizen erhältlich sind. Mechanisch stabile Matrizen wie z.B. Controlled Pore Glass oder Poly(styroldivinyl)benzol ermöglichen raschere Durchflussgeschwindigkeiten und kürzere Verarbeitungszeiten als mit Agarose erreicht werden können. Die Bedingungen für Bindung eines Immunoadhäsins an die Protein-A- oder -G-Affinitätssäule werden zur Gänze durch die Eigenschaften der Fc-Domäne bestimmt; das heißt von ihrer Spezies und ihrem Isotyp. Im Allgemeinen tritt wirksame Bindung, wenn der richtige Ligand ausgewählt wurde, direkt aus nicht-konditionierter Kulturflüssigkeit auf. Eine unterscheidende Eigenschaft von Immunoadhäsinen ist, dass im Fall von menschlichen γ1-Molekülen die Bindungskapazität für Protein A verglichen mit einem Antikörper desselben Fc-Typs gemindert ist. Gebundenes Immunoadhäsin kann wirksam entweder bei sauerm pH (bei oder über 3,0) oder in einem neutralen pH-Puffer, der ein leicht chaotropes Salz enthält, eluiert werden. Dieser Affinitätschromatographieschritt kann in einem Immunoadhäsinpräparat resultieren, das zu > 95% rein ist.
  • Andere Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, können anstelle von oder zusätzlich zu Affinitätschromatographie an Protein A oder G zur Reinigung von Immunoadhäsinen verwendet werden. Immunoadhäsine verhalten sich ähnlich wie Antikörper bei thiophiler Gel-Chromatographie (Hutchens et al., Anal. Biochem. 159, 217–226 (1986)) und immobilisierter Metallchelat-Chromatographie (Al-Mashikhi et al., J. Dairy Sci. 71, 1756–1763 (1988)). Im Gegensatz zu Antikörpern jedoch wird ihr Verhalten an Ionenaustauschsäulen nicht nur durch ihre isoelektrischen Punkte, sondern auch durch einen Ladungsdipol, der in den Molekülen aufgrund ihrer chimären Natur bestehen kann, bestimmt.
  • Sofern erwünscht, können die Immunoadhäsine bispezifisch gemacht werden. So können die Immunoadhäsine der vorliegenden Erfindung eine WSX-Rezeptor-Extrazellulärdomäne und eine Domäne, wie beispielsweise die extrazelluläre Domäne, einer anderen Cytokinrezeptor-Untereinheit kombinieren. Beispiele für Cytokinrezeptoren, aus denen solche bispezifischen Immunoadhäsinmoleküle hergestellt werden können, umfassen TPO- (oder mpl-Ligand-), EPO-, G-CSF-, IL-4-, IL-7-, GH-, PRL-, IL-3-, GM-CSF-, IL-5-, IL-6-, LIF-, OSM-, CNTF- und IL-2-Rezeptoren. Alternativ dazu kann eine OB-Proteindomäne mit einem anderen Cytokin, wie beispielsweise jenen, die hierin als Beispiele aufgelistet wurden, zur Bildung eines bispezifischen Immunoadhäsins kombiniert werden. Für bispezifische Moleküle sind trimere Moleküle, zusammengesetzt aus einer Hybridantikörper-Schwerkette in einem Arm und einem Hybridantikörper-Schwerketten-Leichtketten-Paar im anderen Arm ihrer Antikörper-ähnlichen Struktur, aufgrund ihrer einfachen Reinigungsmöglichkeiten von Vorteil. Im Gegensatz zu Antikörper-bildenden Quadromen, die üblicherweise zur Herstellung von bispezifischen Immunoadhäsinen verwendet wurden, die ein Gemisch aus zehn Tetrameren produzieren, bilden Zellen, die mit Nucleinsäure transfiziert sind, die für die drei Ketten einer trimeren Immunoadhäsinstruktur kodiert, ein Gemisch aus nur drei Molekülen, wodurch Reinigung des erwünschten Produkts aus diesem Gemisch entsprechend einfacher ist.
  • x. Derivate von OB-Protein mit langer Halbwertszeit
  • Bevorzugte funktionelle OB-Proteinderivate zur Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung umfassen OB-Immunglobulinchimären (Immunoadhäsine) und andere Moleküle mit längerer Halbwertszeit. Verfahren zur Bildung von OB-Protein-Immunoadhäsinen wurden bereits oben beschrieben. Das bevorzugte OB-Immunoadhäsin wird gemäß den in Beispiel 11 nachstehend beschriebenen Verfahren hergestellt.
  • Andere Derivate der OB-Proteine, die eine längere Halbwertszeit besitzen als die nativen Moleküle, umfassen die OB-Protein- oder eine OB-Immunglobulinchimäre, die kovalent an ein nicht-proteinhältiges Polymer gebunden ist. Das nicht-proteinhältige Polymer ist üblicherweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d.h. ein Polymer, das sonst nicht in der Natur zu finden ist. Polymere, die in der Natur vorkommen und durch Rekombinations- oder In-vitro-Verfahren hergestellt werden, sind jedoch auch nützlich, wie auch Polymere, die aus nativen Quellen isoliert werden. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den Schutzumfang dieser Erfindung, z.B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders nützlich sind Polyalkylenether wie Polyethylenglykol (PEG); Polyelkylene wie Polyoxyethylen, Polyoxypropylen und Block-Copolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (PluronicsTM); Polymethacrylate, Carbomere; verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, die die Saccharidmonomere D-Mannose, D- und L-Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Glucuronsäure, Sialsäure, D-Galacturonsäure, D-Mannuronsäure (z.B. Polymannuronsäure oder Alginsäure), D-Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose und Neuraminsäure umfassen, einschließlich Homopolysaccharide und Heteropolysaccharide, wie z.B. Lactose, Amylopectin, Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glykogen oder die Polysaccharid-Untereinheit von sauren Mucopolysacchariden, z.B. Hyaluronsäure; Polymere von Zuckeralkoholen wie z.B. Polysorbit und Polymannit; Heparin oder Heparon. Das Polymer muss, bevor es vernetzt wird, nicht wasserlöslich sein, ist es aber vorzugsweise, doch das Endkonjugat muss wasserlöslich sein. Darüber hinaus sollte das Polymer in der konjugierten Form nicht hoch immunogen sein, und auch sollte es keine Viskosität besitzen, die mit in travenöser Infusion oder Injektion inkompatibel ist, sofern dieses Polymer für derartige Wege der Verabreichung konzipiert ist.
  • Vorzugsweise enthält das Polymer nur eine einzelne Gruppe, die reaktiv ist. Dies trägt dazu bei, Vernetzung von Proteinmolekülen zu unterbinden. Es liegt jedoch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, Reaktionsbedingungen zu optimieren, um Vernetzung zu reduzieren, oder die Reaktionsprodukte durch Gelfiltration oder chromatographische Siebe zu reinigen, um im Wesentlichen homogene Derivate zu gewinnen.
  • Das Molekulargewicht des Polymers kann wünschenswerterweise im Bereich von etwa 100 bis 500.000, und vorzugsweise von etwa 1.000 bis 20.000, liegen. Die Auswahl des Molekulargewichts hängt von der Beschaffenheit des Polymers und dem Grad an Substitution ab. Im Allgemeinen gilt, dass je größer die Hydrophilie des Polymers und je höher der Grad an Substitution sind, desto geringer kann das verwendete Molekulargewicht sein. Optimale Molekulargewichte werden mittels Routine-Versuchen bestimmt.
  • Das Polymer ist durch einen multifunktionellen Vernetzer, der mit dem Polymer und einem oder mehreren Aminosäure- oder Zuckerresten der zu bindenden OB-Protein- oder OB-Immunglobulinchimäre reagiert, kovalent an die OB-Protein- oder die OB-Immunglobulin-Chimäre gebunden. Es liegt jedoch im Schutzumfang der Erfindung, das Polymer durch Umsetzen eines derivatisierten Polymers mit dem Hybrid oder umgekehrt direkt zu vernetzen.
  • Die kovalente Vernetzungsstelle an der OB-Protein- oder OB-Immunglobulinchimäre umfasst die N-terminate Aminogruppe und epsilon-Aminogruppen, die an Lysinresten zu finden sind, sowie andere Amino-, Imino-, Carboxyl-, Sulfhydryl-, Hydroxyl- oder andere hydrophile Gruppen. Das Polymer kann ohne Verwendung eines multifunktionellen (üblicherweise bifunktionellen) Vernetzungsmittels kovalent direkt an das Hybrid gebunden sein. Kovalente Bindung an Aminogruppen erfolgt mittels bekannter Chemieverfahren basierend auf Cyanurchlorid, Carbonyldiimidazol, reaktiven Al dehydgruppen (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Essigsäureanhydrid; oder PEG-Chlorid plus Phenoxid von 4-Hydroxybenzaldehyd, Succinimidyl-aktive Ester, aktiviertes Dithiocarbonat-PEG, 2,4,5-Trichlorophenylchloroformiat- oder P-Nitrophenylchlorofarmiat-aktiviertes PEG). Carboxylgruppen werden durch Binden von PEG-Amin unter Verwendung von Carbodiimid derivatisiert.
  • Polymere werden an Oligosaccharidgruppen durch Oxidation unter Verwendung von Chemikalien, z.B. Metaperiodat, oder Enzymen, z.B. Glucose- oder Galactoseoxidase (die beide das Aldehydderivat des Kohlenhydrats produzieren), konjugiert, gefolgt von Reaktion mit Hydrazid- oder Amino-derivatisierten Polymeren auf dieselbe Weise, wie von Heitzmann et al., P.N.A.S. 71, 3537–3541 (1974), oder von Bayer et al., Methods in Enzymology 62, 310 (1979), beschrieben wird, zur Markierung von Oligosacchariden mit Biotin oder Avidin. Weiters sind andere chemische oder enzymatische Verfahren, die hierfür verwendet wurden, um Oligosaccharide zu binden, von besonderem Vorteil, da im Allgemeinen weniger Substitutionen als Aminosäurestellen zur Derivatisierung vorhanden sind, wodurch die Oligosaccharidprodukte homogener sind. Die Oligosaccharid-Substituenten werden gegebenenfalls vor der Polymerderivatisierung auch durch Enzymverdau modifiziert, um Zucker zu entfernen, z.B. durch Neuraminidaseverdau.
  • Das Polymer trägt eine Gruppe, die direkt mit einer Aminosäureseitenkette oder dem N- oder C-Terminus des gebundenen Polypeptids reaktiv ist oder die mit dem multifunktionellen Vernetzer reaktiv ist. Im Allgemeinen sind Polymere, die solche reaktiven Gruppen tragen, für die Herstellung von immobilisierten Proteinen bekannt. Um solche chemischen Verfahren hierin zu verwenden, sollte ein wasserlösliches Polymer eingesetzt werden, das im Übrigen auf dieselbe Weise derivatisiert wird wie unlösliche Polymere, die bisher für Proteinimmobilisierung verwendet wurden. Cyanogenbromid-Aktivierung ist ein besonders nützliches Verfahren zum Vernetzen von Polysacchariden.
  • "Wasserlöslich" in Bezug auf das Ausgangspolymer bedeutet, dass das Polymer oder sein reaktives Zwischenprodukt, das zur Konjugation verwendet wird, ausreichend wasserlöslich ist, um in einer Derivatisierungsreaktion mitzuwirken.
  • "Wasserlöslich" in Bezug auf das Polymerkonjugat bedeutet, dass das Konjugat in physiologischen Flüssigkeiten wie z.B. Blut löslich ist.
  • Der Substitutionsgrad bei solch einem Polymer variiert je nach der Anzahl an reaktiven Stellen am Protein, unabhängig davon, ob das gesamte Protein oder ein Fragment davon verwendet wird, ob das Protein eine Fusion mit einem heterologen Protein (z.B. einer OB-Immunglobulinchimäre) ist, je nach Molekulargewicht, Hydrophilie und anderen Eigenschaften des Polymers sowie je nach den besonderen Proteinderivatisierungsstellen, die ausgewählt werden. Im Allgemeinen enthält das Konjugat etwa 1 bis 10 Polymermoleküle, obwohl jede beliebige, heterologe Sequenz mit einer im Wesentlichen uneingeschränkten Anzahl an Polymermolekülen substituiert sein kann, solange die erwünschte Aktivität nicht signifikant negativ beeinflusst wird. Der optimale Vernetzungsgrad ist leicht durch eine Versuchsmatrix zu bestimmen, in der Dauer, Temperatur und andere Reaktionsbedingungen variiert werden, um den Substitutionsgrad zu verändern, wonach die Fähigkeit der Konjugate, auf die erwünschte Weise zu funktionieren, bestimmt wird.
  • Das Polymer, z.B. PEG, wird mittels zahlreicher verschiedener Verfahren, die an sich für die kovalente Modifikation von Proteinen mit nicht-proteinhältigen Polymeren wie PEG bekannt sind, vernetzt. Bestimmte von diesen Verfahren werden jedoch für die vorliegenden Zwecke nicht bevorzugt. Cyanurchlorid-Chemie führt zu zahlreichen Nebenreaktionen, einschließlich Proteinvernetzung. Weiters führen sie sehr wahrscheinlich zur Inaktivierung von Proteinen, die Sulfhydrylgruppen enthalten. Carbonyldiimidazol-Chemie (Beauchamp et al., Anal. Biochem. 131, 25–33 (1983)) erfordert einen hohen pH (> 8,5), der Proteine deaktivieren kann. Weiters ist ein sehr großer molarer Überschuss an "aktiviertem PEG" gegenüber Protein erforderlich, da das "aktivierte PEG"-Zwischenprodukt mit Wasser reagieren kann. Die hohen Konzentrationen an PEG, die für die Carbonyldiimidazol-Chemie erforderlich sind, führten auch zu Problemen bei der Reinigung, da sowohl Gelfiltrationschromatographie als auch Hydrophil-Chromatographie dadurch negativ beeinflusst werden. Weiters können die hohen Konzentrationen an "aktiviertem PEG" Protein fällen, ein Problem, das an sich bereits zuvor erkannt wurde (Davis, US-Patent Nr. 4.179.337). Andererseits ist die Aldehyd-Chemie (Royer, US-Patent Nr. 4.002.531) effizienter, da sie nur einen 40fachen molaren Überschuss von PEG und eine 1- bis 2-tündige Inkubation erfordert. Das von Royer zur Herstellung des PEG-Aldehyd vorgeschlagene Mangandioxid ist jedoch aufgrund der ausgeprägten Neigung von PEG, Komplexe mit metall-basierten Oxidationsmitteln zu bilden, problematisch (Harris et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed. 22, 341–352 (1984)). Die Verwendung einer Moffatt-Oxidation unter Einsatz von DMSO und Essigsäureanhydrid umgeht dieses Problem. Darüber hinaus muss das von Royer vorgeschlagene Natriumborhydrid bei hohem pH verwendet werden und weist eine signifikante Neigung auf, Disulfidbindungen zu reduzieren. Im Gegensatz dazu wird Natriumcyanoborhydrid, das bei neutralem pH wirksam ist und eine sehr geringe Neigung aufweist, Disulfidbindungen zu reduzieren, bevorzugt.
  • Funktionalisierte PEG-Polymere zur Modifikation der OB-Protein- oder OB-Immunglobulinchimären der vorliegenden Erfindung sind bei Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL), erhältlich. Solche handelsüblichen PEG-Derivate umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Amino-PEG, PEG-Aminosäureester, PEG-Hydrazid, PEG-Thiol, PEG-Succinat, carboxymethyliertes PEG, PEG-Propionsäure, PEG-Aminosäuren, PEG-Succinimidylsuccinat, PEG-Succinimidylpropionat, Succinimidylester von carboxymethyliertem PEG, Succinimidylcarbonat von PEG, Succinimidylester von Aminosäure-PEGs, PEG-Oxycarbonylimidazol, PEG-Nitrophenylcarbonat, PEG-Tresylat, PEG-Glycidylether, PEG-Aldehyd, PEG-Vinylsulfon, PEG-Maleinimid, PEG-Orthopyridyldisulfid, heterofunktionelle PEGs, PEG-Vinylderivate, PEG-Silane und PEG-Phospholide. Die Reaktionsbedingungen zur Bindung dieser PEG-Derivate hängen vom Protein, von dem erwünschten PEGylierungsgrad und vom verwendeten PEG-Derivat ab. Manche in die Auswahl von PEG-Derivaten eingebundene Faktoren umfassen: den erwünschten Anbindungspunkt (Lysin oder Cystein), hydrolytische Stabilität und Reaktivität der Derivate, Stabilität, Toxizität und Antigenität der Bindung, Eignung zur Analyse usw. Spezifische Anweisungen für die Verwendung jedes beliebigen Derivats sind vom Hersteller erhältlich.
  • Die Konjugate mit langer Halbwertszeit dieser Erfindung werden durch Gelfiltration aus den nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien getrennt. Heterologe Spezies der Konjugate werden voneinander auf dieselbe Weise gereinigt. Das Polymer kann auch wasserunlöslich in Form eines hydrophilen Gels vorliegen.
  • Die Konjugate können auch durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden. Die chemischen Eigenschaften von zahlreichen, elektrophil aktivierten PEGs resultieren in einer Reduktion von Aminogruppenladung des PEGylierten Produkts. Somit kann Ionenaustauschchromatographie mit hoher Auflösung verwendet werden, um die freien und konjugierten Proteine voneinander zu trennen und um Spezies mit verschiedenen Graden an PEGylierung aufzulösen. Auch ist die Auflösung verschiedener Spezies (z.B. jene, die einen oder zwei PEG-Reste enthalten) aufgrund der unterschiedlichen ionischen Eigenschaften der nicht umgesetzten Aminosäuren möglich.
  • C. Nicht-therapeutische Verwendungen für den WSX-Rezeptor
  • WSX-Rezeptor-Nucleinsäure ist für die Herstellung von WSX-Rezeptorpolypeptid durch hierin dargestellte Rekombinationsverfahren nützlich, das dann zur Herstellung von Anti-WSX-Rezeptorantikörper mit verschiedenen, nachstehend beschriebenen Nützlichkeiten verwendet werden kann.
  • Der WSX-Rezeptor (Polypeptid oder Nucleinsäure) kann verwendet werden, um Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen in vitro zu induzieren. Insbesondere wird erwogen, dass dieses Molekül verwendet werden kann, um Proliferation von Stammzellen/Vorläuferzellen-Populationen (z.B. CD34+-Zellpopulationen, die wie in Beispiel 8 nachstehend beschrieben erhalten werden) zu induzieren. Diese Zellen, die ex vivo zu züchten sind, können gleichzeitig anderen bekannten Wachstumsfaktoren oder Cytokinen, wie jenen, die hierin beschrieben sind, ausgesetzt werden.
  • Dies resultiert in Proliferation und/oder Differenzierung der Zellen, die den WSX-Rezeptor aufweisen.
  • In wiederum einem anderen Aspekt der Erfindung kann der WSX-Rezeptor für Affinitätsreinigung von WSX-Liganden verwendet werden. Kurz beschrieben umfasst dieses Verfahren: (a) das Kontaktieren einer Quelle von WSX-Liganden mit einem immobilisierten WSX-Rezeptor unter Bedingungen, unter denen der zu reinigende WSX-Ligand selektiv am immobilisierten Rezeptor adsorbiert wird; (b) das Waschen des immobilisierten WSX-Rezeptors und seines Trägers, um nicht-adsorbiertes Material zu entfernen; und (c) das Eluieren der WSX-Ligandenmoleküle aus dem immobilisierten WSX-Rezeptor, an den sie adsorbiert sind, mit einem Elutionspuffer. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform von Affinitätsreinigung bindet sich der WSX-Rezeptor kovalent an eine inerte und poröse Matrix (z.B. Agarose, die mit Cyanogenbromid umgesetzt ist). Besonders bevorzugt ist ein WSX-Rezeptorimmunoadhäsin, das an eine Protein-A-Säule immobilisiert ist. Eine Lösung, die WSX-Liganden enthält, wird dann durch das chromatographische Material durchgeführt. Der WSX-Ligand adsorbiert an die Säule und wird in weiterer Folge durch Änderung der Elutionsbedingungen (z.B. durch Ändern des pH oder der Ionenstärke) freigesetzt.
  • Der WSX-Rezeptor kann für kompetitives Screenen von potenziellen Agonisten auf Bindung an den WSX-Rezeptor verwendet werden. Solche Agonisten können potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Leiden darstellen, die durch unzulängliche WSX-Rezeptoraktivierung gekennzeichnet sind.
  • Das bevorzugte Verfahren zur Identifikation von Molekülen, die sich an den WSX-Rezeptor binden, verwendet einen chimären Rezeptor (z.B. Epitop-markierten WSX-Rezeptor oder WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin), gebunden an eine Festphase wie z.B. den Well einer Testplatte. Bindung von Molekülen, die gegebenenfalls markiert (z.B. radioaktiv markiert) sind, an den immobilisierten Rezeptor kann bewertet werden.
  • Um WSX-Rezeptoragonisten zu identifizieren, kann der Thymidin-Inkorporationstest verwendet werden.
  • Die WSX-Rezeptorpolypeptide sind auch als Molekulargewichtsmarker nützlich. Um ein WSX-Rezeptorpolypeptid als einen Molekulargewichtsmarker zu verwenden, werden Gelfiltrationschromatographie oder SDS-PAGE beispielsweise verwendet, um Protein(e) zu trennen, für die erwünscht ist, ihr Molekulargewicht auf im Wesentlichen normale Weise zu bestimmen. Der WSX-Rezeptor und andere Molekulargewichtsmarker werden als Standards verwendet, um einen Bereich an Molekulargewichten bereitzustellen. Beispielsweise können Phosphorylase b (MG = 97.400), Rinderserumalbumin (MG = 68.000), Ovalbumin (MG = 46.000), WSX-Rezeptor (MG = 44.800), Trypsininhibitor (MG = 20.100) und Lysozym (MG = 14.400) als MG-Marker verwendet werden. Die anderen, hierin erwähnten Molekulargewichtsmarker sind im Handel bei Amersham Corporation, Arlington Heights, IL, erhältlich. Die Molekulargewichtsmarker sind im Allgemeinen markiert, um die Detektion davon zu erleichtern. Beispielsweise können die Marker biotinyliert sein und können nach Trennung mit Streptavidin-Meerrettichperoxidase inkubiert werden, sodass die verschiedenen Marker durch Lichtdetektion nachgewiesen werden können.
  • Der gereinigte WSX-Rezeptor und die für ihn kodierende Nucleinsäure können auch als Reagenzien für Mechanismusstudien zum WSX-Rezeptor und seinen Liganden verkauft werden, um die Rolle des WSX-Rezeptors und des WSX-Liganden bei normalem Wachstum und normaler Entwicklung sowie anormalem Wachstum und anormaler Entwicklung, z.B. im Fall von Malignitäten, zu untersuchen.
  • WSX-Rezeptorvarianten sind als Standards oder Kontrollen in Tests für den WSX-Rezeptor, beispielsweise für ELISA, RIA oder RRA, nützlich, vorausgesetzt, sie werden durch das eingesetzte analytische System, z.B. einen Anti-WSX-Rezeptorantikörper, erkannt.
  • D. WSX-Rezeptorantikörper-Herstellung
  • 1. Polyklonale Antikörper
  • Polyklonale Antikörper werden im Allgemeinen in Tieren durch multiple subkutane (sk) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens und eines Adjuvans gezüchtet. Dadurch, dass das bevorzugte Epitop in der ECD des WSX-Rezeptors liegt, ist es wünschenswert, WSX-Rezeptor-ECD oder ein Molekül, das die ECD umfasst (z.B. WSX-Rezeptorimmunoadhäsin), als das Antigen zur Bildung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern zu verwenden. Es kann nützlich sein, das relevante Antigen an ein Protein, das in den zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z.B. Schlüssellochnapfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinderthyroglobulin oder Sojabohnentrypsininhibitor, unter Verwendung eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, beispielsweise Maleinimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cysteinreste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl2 oder R1N=C=NR, worin R und R1 verschiedene Alkylgruppen sind, zu konjugieren.
  • Tiere werden gegen das Antigen, immunogene Konjugate oder Derivate durch Kombinieren von 1 mg oder 1 μg des Peptids oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina komplettem Freundschem Adjuvans und intradermales Injizieren der Lösung an mehreren Stellen immunisiert. Einen Monat später werden die Tiere mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge von Peptid oder Konjugat in komplettem Freundschem Adjuvans durch subkutane Injektion an mehreren Stellen geboostet. Sieben bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen, und das Serum wird auf Antikörpertiter getestet. Die Tiere werden geboostet, bis der Titer gesättigt ist. Vorzugsweise wird das Tier mit dem Konjugat desselben Antigens, das jedoch an ein anderes Protein und/oder durch einen anderen Vernetzer konjugiert ist, geboostet. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Auch werden geeigneterweise aggregierende Mittel wie z.B. Alaun verwendet, um die Immunantwort zu steigern.
  • 2. Monoklonale Antikörper
  • Monoklonale Antikörper werden aus einer Population von im Wesentlichen homogenen Antikörpern gewonnen, d.h. dass die einzelnen Antikörper, aus denen die Population besteht, bis auf mögliche, natürlich vorkommende Mutationen, die in geringen Mengen vorhanden sein können, identisch sind. Somit bezeichnet das Adjektiv "monoklonal" die Eigenschaft des Antikörpers, kein Gemisch aus unterschiedlichen Antikörpern darzustellen.
  • Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper unter Verwendung des Hybridomverfahrens, das als erstes von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, hergestellt werden oder können durch DNA-Rekombinationsverfahren (Cabilly et al., s.o.) hergestellt werden.
  • Im Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes, geeignetes Wirtstier, wie z.B. ein Hamster, wie hierin zuvor beschrieben immunisiert, um Lymphozyten hervorzubringen, die Antikörper produzieren oder in der Lage sind, diese zu produzieren, die sich spezifisch an das zur Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Lymphozyten werden dann mit Myelomzellen unter Verwendung eines geeigneten Fusionsmittels, wie z.B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 59–103 (1986)).
  • Die so hergestellten Hybridomzellen werden überimpft und in einem geeigneten Kulturmedium, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der nicht fusionierten, parentalen Myelomzellen inhibieren, gezüchtet. Fehlt beispielsweise den parentalen Myelomzellen das Enzym Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferase (HGPRT oder HPRT), so umfasst das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), Substanzen, die das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen unterbinden.
  • Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die wirksam fusionieren, stabile, hochgradige Produktion von Antikörper durch die ausgewählten Antikörper-produzierenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium wie beispielsweise HAT-Medium empfindlich sind. Zu diesen bevorzugten Myelomzelllinien zählen Maus-Myelomlinien, wie z.B. jene, die von MOPC-21- und MPC-11-Maustumoren abstammen, die beim Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Kalifornien, USA, erhältlich sind, und SP-2-Zellen, die bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, erhältlich sind. Menschliche Myelom- und Maus-Mensch-Heteromyelom-Zelllinien wurden auch bereits zur Herstellung von menschlichen monoklonalen Antikörpern beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, 51–63 (1987)).
  • Kulturmedium, in dem Hybridomzellen wachsen, wird auf Produktion von monoklonalen Antikörpern, die gegen das Antigen gerichtet sind, getestet. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität von monoklonalen Antikörpern, die durch Hybridomzellen produziert werden, mittels Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest, wie z.B. Radioimmuntest (RIA) oder enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA), bestimmt.
  • Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann beispielsweise durch die Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
  • Nachdem Hybridomzellen identifiziert wurden, die Antikörper mit der erwünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und mittels herkömmlicher Verfahren gezüchtet werden (Goding, s.o.). Geeignete Kulturmedien für diesen Zweck umfassen beispielsweise D-MEM- oder RPMI-1640-Medium. Weiters können die Hybridomzellen in vivo als Ascites-Tumoren in einem Tier gezüchtet werden.
  • Die monoklonalen Antikörper, die von den Subklonen sekretiert werden, werden geeigneterweise aus dem Kulturmedium, der Ascites-Flüssigkeit oder dem Serum durch herkömmliche Immunglobulinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Protein-A-Sepharose, Hydroxylapatitchromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie, getrennt.
  • DNA, die für die monoklonalen Antikörper kodiert, wird leicht und unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren (z.B. unter Verwendung von Oligonucleotidsonden, die in der Lage sind, sich spezifisch an Gene, die für die Schwer- und Leichtketten von Maus-Antikörpern kodieren, zu binden) isoliert und sequenziert. Die Hybridomzellen dienen als eine bevorzugte Quelle für solche DNA. Nachdem sie isoliert wurde, kann DNA in Expressionsvektoren platziert werden, die dann in Wirtszellen wie beispielsweise E.-coli-Zellen, Affen-COS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen transfiziert werden, die sonst kein Immunglobulinprotein produzieren, um die Synthese von monoklonalen Antikörpern in den rekombinanten Wirtszellen zu erreichen. Artikel, die einen Überblick über rekombinante Expression in Bakterien von DNA, die für den Antikörper kodiert, geben, umfassen Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5, 256–262 (1993), und Plückthun, Immunol. Revs. 130, 151–188 (1992).
  • In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente aus Antikörperphagenbibliotheken isoliert werden, die unter Verwendung von Verfahren erstellt wurden, welche in McCafferty et al., Nature 348, 552–554 (1990), beschrieben sind. Clackson et al., Nature 352, 624–628 (1991), und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581–597 (1991), beschreiben das Isolieren von Maus- bzw. menschlichen Antikörpern unter Verwendung von Phagenbibliotheken. Nachfolgende Publikationen beschreiben die Herstellung von menschlichen Hochaffinitäts- (im nM-Bereich) Antikörpern durch Ketten-Shuffling (Mark et al., Bio/Technology 10, 779–783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als eine Vorgehensweise zur Konstruktion von sehr großen Phagenbibliotheken (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res. 21, 2265–2266 (1993)). Somit sind diese Verfahren gut einsetzbare Alternativen zu herkömmlichen Verfahren für monoklonale Antikörperhybridome zur Isolierung von monoklonalen Antikörpern.
  • Die DNA kann auch beispielsweise durch Substituieren der Kodiersequenz für menschliche konstante Schwerketten- und Leichtkettendomänen anstelle der homologen Maussequenzen (Cabilly et al., s.o.; Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder durch kovalentes Binden der gesamten Kodiersequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Poylpeptid oder eines Teils davon an die für Immunglobulin kodierende Sequenz modifiziert werden.
  • Typischerweise werden solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide anstelle der konstanten Domänen eines Antikörpers substituiert, oder sie werden anstelle der variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines Antikörpers eingesetzt, um einen chimären, zweiwertigen Antikörper zu schaffen, der eine Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für ein Antigen und eine andere Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
  • Chimäre oder hybride Antikörper können auch in vitro unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Protein-Synthesechemie bekannt sind, einschließlich jener, die Vernetzungsmittel einbinden, hergestellt werden. Beispielsweise können Immunotoxine unter Verwendung einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bilden einer Thioetherbindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien für diesen Zweck umfassen Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.
  • 3. Humanisierte und menschliche Antikörper
  • Verfahren zur Humanisierung von nicht-menschlichen Antikörpern sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Im Allgemeinen weist ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste auf, die aus einer Quelle, die nicht-menschlich ist, in ihn eingeführt wurden. Diese nicht-menschlichen Aminosäurereste werden häufig als "Import"-Reste bezeichnet, die typischerweise von einer variablen "Import"-Domäne bezogen werden. Humanisierung kann im Wesentlichen gemäß dem Verfahren von Winter und Mitarbeitern (Jones et al., Nature 321, 522–525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323–327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239, 1534–1536 (1988)) durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen anstelle der entsprechenden Sequenzen eines menschlichen Antikörpers erfolgen. Demgemäß sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (Cabilly et al., s.o.), worin im Wesentlichen weniger als eine intakte menschliche variable Domäne durch die entsprechende Sequenz aus einer nicht-menschlichen Spezies substituiert ist. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise menschliche Antikörper, in denen manche CDR-Reste und möglicherweise manche FR-Reste durch Reste aus analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert wurden.
  • Die Auswahl der menschlichen variablen Domänen, sowohl der leichten als auch der schweren, die bei der Herstellung der humanisierten Antikörper zu verwenden sind, ist sehr wichtig, um Antigenität zu reduzieren. Gemäß der so genannten "Methode der optimalen Anpassung" wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetier-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek bekannter Sequenzen menschlicher variabler Domänen gescreent. Die menschliche Sequenz, die jener des Nagetiers am ähnlichsten ist, wird dann als das menschliche Gerüst (FR) für die humanisierten Antikörper ausgewählt (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Ein anderes Verfahren verwendet ein bestimmtes Gerüst, das von der Consensus-Sequenz aller menschlichen Antikörper einer bestimmten Untergruppe von Leicht- oder Schwerketten abgeleitet ist. Dasselbe Gerüst kann für mehrere unterschiedliche humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
  • Weiters ist es wichtig, dass Antikörper unter Beibehaltung von hoher Affinität zum Antigen und anderer günstiger biologischer Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden gemäß einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper mittels eines Verfahrens der Analyse der parentalen Sequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Verwendung von dreidimensionalen Modellen der parentalen und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulinmodelle sind üblicherweise erhältlich und sind Fachleuten bekannt. Auch sind Computerprogramme verfügbar, die mögliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Kandidaten-Immunglobulinsequenzen veranschaulichen und darstellen. Eine Untersuchung dieser Darstellungen ermöglicht die Analyse der wahrscheinlichen Rolle der Reste, die sie bei der Funktion der Kandidaten-Immunglobulinsequenz spielen, d.h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Kandidaten-Immunglobulins beeinflussen, sich an sein Antigen zu binden. Auf diese Weise können FR-Reste selektiert und aus den Consensus- und Importsequenzen kombiniert werden, sodass die erwünschte Antikörpereigenschaft, wie z.B. gesteigerte Affinität für Targetantigen(e), erlangt wird. Im Allgemeinen spielen die CDR-Reste eine direkte und sehr wesentliche Rolle bei der Beeinflussung der Antigenbindung.
  • Alternativ dazu ist es nun möglich, transgene Tiere (z.B. Mäuse) herzustellen, die in der Lage sind, bei Immunisierung ein vollständiges Repertoire an menschlichen Antikörpern ohne endogener Immunglobulinproduktion zu produzieren. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Bindungsregions- (JH-) Gens bei chimären und Keimlinien-mutierten Mäusen zu einer vollständigen Inhibition endogener Antikörperproduktion führt. Transfer der menschlichen Keimlinien-Immunglobulin-Genanordnung in solchen Keimlinien-mutierten Mäusen resultiert in der Produktion von menschlichen Antikörpern bei Antigen-Provokation. Siehe z.B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255–258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993). Menschliche Antikörper können auch in Phagendisplay-Biblitoheken produziert werden (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581 (1991)).
  • 4. Bispezifische Antikörper
  • Bispezifische Antikörper (BsAbs) sind Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zumindest zwei verschiedene Antigene aufweisen. BsAbs können als Tumor-Targeting- oder -Bildgebungs-Mittel verwendet werden und können verwendet werden, um Enzyme oder Toxine auf eine Zelle, die den WSX-Rezeptor aufweist, zu richten. Solche Antikörper können von Volllängenantikörpern oder Antikörperfragmenten (z.B. F(ab')2-bispezifische Antikörper) abstammen. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der BsAb einen Arm aufweisen, der den WSX-Rezeptor bindet, und einen anderen Arm, der ein Cytokin oder einen anderen Cytokinrezeptor (oder eine Untereinheit davon), wie z.B. die Rezeptoren für TPO, EPO, G-CSF, IL-4, IL-7, GH, PRL; die α- oder β-Untereinheiten der IL-3-, GM-CSF-, IL-5-, IL-6-, LIF-, OSM- und CNTF-Rezeptoren; oder die α-, β- oder γ-Untereinheiten des IL-2-Rezeptorkomplexes, bindet. Beispielsweise kann der BsAb WSX-Rezeptor und gp130 binden.
  • Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt. Herkömmliche Herstellung von bispezifischen Volllängen-Antikörpern basiert auf der Coexpression von zwei Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paaren, worin die zwei Ketten verschiedene Spezifitäten aufweisen (Millstein et al., Nature 305, 537–539 (1983)). Aufgrund der zufälligen Zusammenstellung von Immunglobulin-Schwer- und -Leichtketten produzieren diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch aus 10 verschiedenen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur aufweist. Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise mittels Affinitätschromatographieschritten erfolgt, ist eher aufwendig, und die Produktausbeuten sind gering. Ähnliche Verfahren sind in der WO 93/08829, veröffentlicht am 13. Mai 1993, und in Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655–3659 (1991), offenbart.
  • Gemäß einem anderen und noch bevorzugteren Ansatz werden variable Antikörper-domänen mit erwünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) an Immunglobulin-Konstantdomänensequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer konstanten Immunglobulin-Schwerkettendomäne, die zumindest einen Teil der Gelenks-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es wird bevorzugt, dass sie die erste konstante Schwerkettenregion (CH1), die die für Leichtkettenbindung erforderliche Stelle enthält, in zumindest einer der Fusionen enthält. DNAs, die für die Immunglobulin-Schwerkettenfusionen und, sofern erwünscht, die Immunglobulinleichtkette kodieren, werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies sorgt für große Flexibilität beim Einstellen der gegenseitigen Anteile der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, in denen ungleiche Verhältnisse der drei Polypeptidketten, die zur Konstruktion verwendet werden, die optimalen Ausbeuten liefern. Es ist jedoch möglich, die Kodiersequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu höheren Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse keinen signifikanten Einfluss haben.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Ansatzes setzen sich die bispezifischen Antikörper aus einer Hybridimmunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybridimmunglobulin-Schwerketten-Leichtkettenpaar (das eine zweite bispezifische Bindung bereitstellt) im anderen Arm zusammen. Es wurde erkannt, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der erwünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulinkettenkombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglobulin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für einen leichten Trennungsvorgang sorgt. Dieser Ansatz ist in der WO 94104690, veröffentlicht am 3. März 1994, offenbart. Weitere Details zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind beispielsweise in Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986), zu finden.
  • Bispezifische Antikörper umfassen vernetzte oder "Heterokonjugat"-Antikörper. Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin, der andere an Biotin gebunden sein. Solche Antikörper wurden beispielsweise vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen zu richten (US-Patent Nr. 4.676.980), und wurden auch zur Behandlung von HIV-Infektion vorgeschlagen (WO 91/00360, WO 92/200373 und EP 03089 ). Heterokonjugat-Antikörper können unter Verwendung jedes herkömmlichen Vernetzungsverfahrens hergestellt werden. Geeignete Vernetzungsmittel sind auf dem Gebiet der Erfindung bekannt und werden im US-Patent Nr. 4.676.980 zusammen mit zahlreichen Vernetzungsverfahren offenbart.
  • Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten werden auch in der Literatur beschrieben. Die folgenden Verfahren können ebenfalls zur Herstellung zweiwertiger Antikörperfragmente verwendet werden, die nicht notwendigerweise bispezifisch sind. Gemäß diesen Verfahren können Fab'-SH-Fragmente aus E. coli gewonnen werden, die chemisch gebunden werden können, um zweiwertige Antikörper zu bilden. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217–225 (1992), beschreiben die Herstellung eines vollständig humanisierten BsAb-F(ab')2-Moleküls. Jedes Fab'-Fragment wurde getrennt aus E. coli sekretiert und gerichteter chemischer Bindung in vitro unterzogen, um den BsAb zu bilden. Der so gebildete BsAb war in der Lage, sich an Zellen zu binden, die den HER2-Rezeptor und normale menschliche T-Zellen überexprimieren, sowie die lytische Aktivität von menschlichen zytotoxischen Lymphozyten gegen menschliche Brusttumor-Targets auszulösen. Siehe auch Rodrigues et al., Int. J. Cancers (Beilage) 7, 45–50 (1992).
  • Verschiedene Verfahren zur Herstellung und Isolierung zweiwertiger Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenfalls bereits beschrieben. Beispielsweise wurden zweiwertige Heterodimere unter Verwendung von Leucinzippern hergestellt. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547–1553 (1992). Die Leucinzipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte von zwei verschiedenen Antikörpern mittels Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Gefenksregion reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Die "Diabody"-Technologie, die von Hollinger et al. in Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444–6448 (1993), beschrieben wird, stellt einen alternativen Mechanismus zur Herstellung von BsAb-Fragmenten bereit. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerkettendomäne (VH), gebunden an eine variable Leichtkettendomäne (VL) über einen Linker, der zu kurz ist, um Paarbildung zwischen den zwei Domänen an derselben Kette zu ermöglichen. Demgemäß werden die VH- und VL-Domänen eines Fragments gezwungen, mit den komplementären VL- und VH-Domänen eines anderen Fragments Paare zu bilden, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen gebildet werden. Auch von einer anderen Vorgehensweise zur Herstellung von BsAb-Fragmenten durch die Verwendung von ein kettigen Fv- (sFv-) Dimeren wurde bereits berichtet. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).
  • 5. Antikörper-Screenen
  • Es kann wünschenswert sein, Antikörper mit einer starken Bindungsaffinität für den WSX-Rezeptor zu selektieren. Antikörperaffinitäten können beispielsweise durch Sättigungsbindung; enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung (ELISA); und Konkurrenztests (z.B. RIAs) bestimmt werden. Der Antikörper mit einer starken Bindungsaffinität kann den WSX-Rezeptor mit einem Bindungsaffinitäts- (Kd-) Wert von nicht mehr als etwa 1 × 10–7 M, vorzugsweise nicht mehr als etwa 1 × 10–8 M, und am meisten bevorzugt von nicht mehr als etwa 1 × 10–9 M (z.B. bis etwa 1 × 10–12 M), binden.
  • In einer anderen Ausführungsform kann auf einen Antikörper gescreent werden, der ein WSX-Rezeptorepitop von Interesse bindet. Beispielsweise kann ein Antikörper, der sich an das Epitop bindet, das durch den Antikörper 2D7, 1G4, 1E11 oder 1C11 (siehe Beispiel 13) oder Antikörperklon Nr. 3, Nr. 4 oder Nr. 17 (siehe Beispiel 14) gebunden ist, identifiziert werden. Um auf Antikörper zu screenen, die sich an das Epitop am WSX-Rezeptor binden, das durch einen Antikörper von Interesse gebunden ist (z.B. jene, die Bindung von jedem beliebigen der oben genannten Antikörper an WSX-Rezeptor blockieren), kann ein routinemäßiger Kreuzblockierungs-Test, wie jener, der in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow & David Lane (1988), beschrieben wird, durchgeführt werden. Alternativ dazu kann Epitop-Kartierung, z.B. wie in Champe et al., J. Biol. Chem. 270, 1388–1394 (1995), beschrieben wird, durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob der Antikörper ein Epitop von Interesse bindet.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Agonistenantikörper ausgewählt. Verschiedene Verfahren zur Selektion von Agonistenantikörpern sind verfügbar. In einer Ausführungsform werden die Agonisten-Eigenschaften des Antikörpers bei Bindung an einen chimären Rezeptor, der die ext razelluläre WSX-Rezeptordomäne umfasst, in einem Test, der als enzymgekoppelte Immunadsorptionsbestimmung durch Kinase-Rezeptor-Aktivierung (KIRA-ELISA) bezeichnet wird, beschrieben in der WO 95/14930 (hierin ausdrücklich durch Verweis aufgenommen), bewertet.
  • Um den KIRA-ELISA durchzuführen, wird ein chimärer Rezeptor, der die extrazelluläre Domäne des WSX-Rezeptors und die Transmembran- und intrazelluläre Domäne von Rse-Rezeptor umfasst (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269(14), 10720–10728 (1994)), mit einer Carboxyl-terminalen Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (gD-) Markierung hergestellt, und dp12.CHO-Zellen werden hiermit wie in Beispiel 4 der WO 95/14930 beschrieben transformiert.
  • Die WSX/Rse.gD-transformierten dp12.CHO-Zellen werden in die Wells einer Flachboden-96-Well-Kulturplatte in 100 μl Medium überimpft (3 × 104 pro Well) und über Nacht bei 37°C in 5% CO2 kultiviert. Am darauf folgenden Morgen werden die Well-Überstände entfernt, und verschiedene Konzentrationen des Antikörpers werden zu den einzelnen Wells zugesetzt. Die Zellen werden bei 37°C 30 min lang stimuliert, die Well-Überstände werden dekantiert. Um die Zellen zu lysieren und die chimären Rezeptoren löslich zu machen, werden 100 μl von Lysepuffer zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wird dann auf einem Plattenschüttler (Bellco Instruments, Vineland, NJ) 60 min lang bei Raumtemperatur leicht geschüttelt.
  • Während die Zellen solubilisiert werden, wird eine ELISA-Mikrotiterplatte (Nunc Maxisorp, Inter Med, Dänemark), die über Nacht bei 4°C mit dem monoklonalen 5B6-Anti-gD-Antikörper (5,0 μg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, 100 μl/Well) beschichtet wurde, dekantiert und mit 150 μl/Well Block-Buffer 60 min lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach 60 Minuten wird die Anti-gD-5B6-beschichtete Platte sechsmal mit Waschpuffer (PBS mit 0,05% TWEEN 20TM und 0,01% Thimerosal) gewaschen.
  • Das solubilisiertes WSX/Rse.gD enthaltende Lysat aus dem Zellkultur-Mikrotiterwell wird (85 μl/Well) zu Anti-gD-5B6-beschichtetem und blockiertem ELISA-Well transfe riert und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das ungebundene WSX/Rse.gD wird durch Waschen mit Waschpuffer entfernt, und 100 μl biotinyliertes 4G10 (Anti-Phosphotyrosin), verdünnt 1:18.000 in Verdünnungspuffer (PBS, die 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 5 mM EDTA und 0,01% Thimerosal enthält), d.h. 56 ng/ml, werden zu jedem Well zugesetzt. Nach 2-stündiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Platte gewaschen, und HRPO-konjugiertes Streptavidin (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) wird zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wird 30 min lang bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubiert. Das freie Avidin-Konjugat wird abgewaschen, und 100 μl frisch hergestellte Substratlösung (Tetramethylbenzidin (TMB); 2-Komponenten-Substratset; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) werden zu jedem Well zugesetzt. Die Reaktion wird 10 min lang laufen gelassen, wonach die Farbentwicklung durch den Zusatz von 1,0 M H3PO4, 100 μl/Well, gestoppt wird. Die Absorption bei 450 nm wird mit einer Bezugswellenlänge von 650 nm (ABS450/650) unter Verwendung eines νmax-Plattenlesers (Molecular Devices, Palo Alto, CA), gesteuert durch einen Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) und DeltaSoft-Software (BioMetallics, Inc., Princton, NJ), abgelesen.
  • Jene Antikörper, die einen IC50 im KIRA-ELISA von etwa 0,5 μg/ml oder weniger (z.B. von etwa 0,5 μg/ml bis etwa 0,001 μg/ml), vorzugsweise von etwa 0,2 μg/ml oder weniger und am meisten bevorzugt von etwa 0,1 μg/ml oder weniger, aufweisen, sind bevorzugte Agonisten.
  • In einer anderen Ausführungsform wird auf Antikörper gescreent, die Stromab-Signalgebungsmoleküle für OB-Protein aktivieren. Beispielsweise kann die Fähigkeit des Antikörpers, Signal-Transduktoren und -Aktivatoren von Transkription (STATs) zu aktivieren, bewertet werden. Der Agonistenantikörper von Interesse kann beispielsweise Bildung von STAT-1- und STAT-3-Komplexen stimulieren. Um auf solche Antikörper zu screenen, kann der in Rosenblum et al., Endocrinology 137(11), 5178–5181 (1996), beschriebene Test durchgeführt werden.
  • Alternativ dazu kann ein Antikörper, der Proliferation und/oder Differenzierung von blutbildenden Zellen stimuliert, selektiert werden. Beispielsweise können die Häma topoese-Tests aus Beispiel 10 durchgeführt werden. Maus-Fötalleber-flASK-Zellen können beispielsweise aus der fötalen Leber mittleren Gestationsalters, wie in Zeigler et al., Blood 84, 2422–2430 (1994), beschrieben wird, isoliert und in Stammzellen-Suspensionskultur oder Methylcellulosetests untersucht werden. Für die Stammzellen-Suspensionskulturen werden 20.000 flASK-Zelten in einzelne Wells in einem 12-Well-Format in DMEM-4.5/F12-Medium, ergänzt mit 10% hitzedeaktiviertem fötalem Kälberserum (Hyclone, Logan, UT) und L-Glutamin, überimpft. Wachstumsfaktoren werden in den folgenden Konzentrationen zugesetzt: Kit-Ligand (KL) bei 25 ng/ml, Interleukin-3 (IL-3) bei 25 ng/ml, Interleukin-6 (IL-6) bei 50 ng/ml, G-CSF bei 100 ng/ml, GM-CSF bei 100 ng/ml, EPO bei 2 U/ml, Interleukin-7 (IL-7) bei 100 ng/ml (alle Wachstumsfaktoren von R and D Systems, Minneapolis, MN). Der Agonistenantikörper wird dann zugesetzt, und die Fähigkeit des Antikörpers, die in Suspensionskultur gezüchteten flASK-Zellen auszubreiten, wird getestet. Methylcellulosetests werden wie zuvor beschrieben (Zeiger et al., s.o.) durchgeführt. Kurz zusammengefasst werden Methylcellulosekolonietests unter Verwendung von "komplettem" Methylcellulose- oder Prä-B-Methylcellulosemedium (Stem Cell Technologies, Vancouver, British Columbia, Kanada) unter Zusatz von 25 ng/ml KL (R and D Systems, Minneapolis, MN) durchgeführt. Cytospin-Analysen der resultierenden Kolonien werden wie zuvor in Zeigler et al. beschrieben durchgeführt. Die Fähigkeit des Agonistenantikörpers, Knochenmark-, Lymph- und Erythrozyten-Koloniebildung zu steigern, wird bewertet. Auch kann die Wirkung des Agonistenantikörpers auf die Maus-Knochenmark-Stammzellenpopulation, LinIoSca+, bewertet werden.
  • Es kann ein Agonistenantikörper selektiert werden, der eine statistisch signifikante Reduktion des Körpergewichts und/oder Fettdepotgewichts und/oder der Nahrungsmittelaufnahme bei einem adipösen Säugetier (z.B. bei einer ob/ob-Maus) induziert. Verfahren zum Screenen auf solche Moleküle werden beispielsweise in Levin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 1726–1730 (1996), beschrieben. Bevorzugte Agonistenantikörper sind jene, die fettreduzierende Wirkungen bei einem adipösen Säugetier wie z.B. der ob/ob-Maus zeigen, die stärkere Wirkungen sind als jene, die durch reduzierte Nahrungsmittelaufnahme induziert werden.
  • Der Antikörper von Interesse kann die Reste einer hypervariablen Region von einem der Antikörper aus den Beispielen 13 und 14 aufweisen. Auch umfasst die Erfindung "affinitätsgereifte" Formen dieser Antikörper, in denen Reste der hypervariablen Region dieser Antikörper modifiziert wurden. Solche affinitätsgereiften Antikörper weisen vorzugsweise eine biologische Aktivität auf, die dieselbe oder eine bessere ist als jene des ursprünglichen Antikörpers. Die affinitätsgereiften Antikörper können etwa 1–10, z.B. 5–10, Deletionen, Insertionen oder Substitutionen (jedoch vorzugsweise Substitutionen) in den hypervariablen Regionen davon aufweisen. Ein nützliches Verfahren zur Bildung von affinitätsgereiften Antikörpern wird als "Alanin-Scanning-Mutagenese" bezeichnet (Cunningham & Wells, Science 244, 1081–1085 (1989)). Hierin werden ein oder mehrere Rest(e) der hypervariablen Region durch Alanin- oder Polyalaninrest(e) ersetzt, um die Wechselwirkung der Aminosäuren mit dem WSX-Rezeptor zu beeinflussen. Jene(r) Rest(e) hypervariabler Regionen, der/die funktionelle Empfindlichkeit gegenüber Substitution aufweist/aufweisen, wird/werden dann durch Einführen weiterer oder anderer Mutationen an oder anstelle der Substitutionsstellen verfeinert. Die auf diese Weise produzierten ala-Mutanten werden auf ihre biologische Aktivität wie hierin beschrieben gescreent. Ein anderes Verfahren ist Affinitätsmutation unter Verwendung von Phagendisplay (Hawkins et al., J. Mol. Biol. 254, 889–896 (1992), und Lowman et al., Biochemistry 30(45), 10832–10837 (1991)). Kurz zusammengefasst werden Stellen hypervariabler Regionen (z.B. 6–7 Stellen) mutiert, um alle möglichen Amino-Substitutionen an jeder Stelle zu bilden. Die so gebildeten Antikörper-Mutanten werden einwertig aus filamentösen Phagenpartikeln als Fusionen an das Gen-III-Produkt von M13, gepackt innerhalb jedes einzelnen Partikels, dargestellt. Die mittels Phagendisplay dargestellten Mutanten werden dann auf ihre biologische Aktivität (z.B. Bindungsaffinität) gescreent.
  • 6. Antikörpermodifikationen
  • Es kann wünschenswert sein, den Antikörper für verschiedene Anwendungen spezifisch zu gestalten. Beispiele für Antikörpermodifikationen werden nachstehend beschrieben.
  • In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann es wünschenswert sein, ein Antikörperfragment zu verwenden, und nicht einen intakten Antikörper. In diesem Fall kann es wünschenswert sein, das Antikörperfragment zu modifizieren, um seine Serum-Halbwertszeit zu steigern. Dies kann beispielsweise durch Inkorporation eines Salvage-Rezeptorbindungsepitops in das Antikörperfragment erreicht werden. Siehe die WO 96/32478, veröffentlicht am 17. Oktober 1996. Alternativ dazu kann der Antikörper an ein nicht-proteinhältiges Polymer konjugiert werden, wie beispielsweise jene, die zuvor für die Herstellung von OB-Proteinderivaten mit langer Halbwertszeit beschrieben wurden.
  • Ist der Antikörper zu verwenden, um beispielsweise Krebs zu behandeln, so werden verschiedene Modifikationen des Antikörpers (z.B. eines neutralisierenden Antikörpers), die die Wirksamkeit des Antikörpers zur Behandlung von Krebs steigern, hierin in Erwägung gezogen. Beispielsweise kann es wünschenswert sein, den Antikörper der Erfindung hinsichtlich der Effektorfunktion zu modifizieren. Beispielsweise können Cysteinrest(e) in die Fc-Region eingeführt werden, wodurch Zwischenketten-Disulfidbindungsbildung in dieser Region ermöglicht wird. Der so gebildete homodimere Antikörper kann verbesserte Internalisierungsfähigkeit und/oder gesteigertes Komplement-vermitteltes Zelltöten und Antikörper-abhängige zelluläre Cytotoxizität (ADCC) aufweisen. Siehe Caron et al., J. Exp. Med. 176, 1191–1195 (1992), und B. Shopes, J. Immunol. 148, 2918–2922 (1992). Homodimere Antikörper mit gesteigerter Anti-Tumoraktivität können auch unter Verwendung von heterobifunktionellen Vernetzern wie in Wolff et al., Cancer Research 53, 2560–2565 (1993), beschrieben hergestellt werden. Alternativ dazu kann ein Antikörper gebildet werden, der duale Fc-Regionen aufweist und dadurch verbesserte Komplementen-Lyse- und ADCC-Fähigkeiten besitzen kann. Siehe Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3, 219–230 (1989).
  • Die Erfindung betrifft auch Immunokonjugate, die den hierin beschriebenen Antikörper, konjugiert an ein zytotoxisches Mittel wie beispielsweise ein chemotherapeutisches Mittel, Toxin (z.B. ein enzymatisch aktives Toxin bakteriellen, pflanzlichen oder tierischen Ursprungs oder von Pilzen) oder ein radioaktives Isotop (d.h. ein Radiokonjugat), umfassen.
  • Chemotherapeutische Mittel, die zur Bildung solcher Immunkonjugate nützlich sind, wurden bereits zuvor beschrieben. Enzymatisch aktive Toxine und Fragmente davon, die verwendet werden können, umfassen Diphtherie-A-Kette, nicht-bindende aktive Fragmente von Diphtherie-Toxin, Exotoxin-A-Kette (aus Pseudomonas aeruginosa), Ricin-A-Kette, Abrin-A-Kette, Modeccin-A-Kette, α-Sarcin, Aleurites-fordii-Proteine, Dianthin-Proteine, Phytolaca-americana-Proteine (PAPI, PAPII und PAP-S), Momordica-charantia-Inhibitor, Curcin, Crotin, Sapaonaria, Officinalis-Inhibitor, Gelonin, Mitogellin, Restrictocin, Phenomycin, Enomycin und die Tricothecene. Eine Vielzahl von Radionucliden zur Herstellung von Radiokonjugat-Antikörpern sind erhältlich. Beispiele umfassen 212Bi, 131I, 131In, 90Y und 186Re.
  • Konjugate aus dem Antikörper und dem zytotoxischen Mittel werden unter Verwendung zahlreicher verschiedener bifunktioneller Protein-Bindungsmittel, wie beispielsweise N-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol)propionat (SPDP), Iminothiolan (IT), bifunktioneller Derivate von Imidoestern (wie z.B. Dimethyladipimidat HCL), aktiver Ester (wie z.B. Disuccinimidylsuberat), Aldehyden (wie z.B. Glutaraldehyd), Bis-azido-Verbindungen (wie z.B. Bis(p-azidobenzoyl)hexandiamin), Bis-diazoniumderivaten (wie z.B. Bis-(p-diazoniumbenzoyl)ethylendiamin), Diisocyanaten (wie z.B. Toluol-2,6-diisocyanat) und Bis-aktiven Fluorverbindungen (wie z.B. 1,5-Difluor-2,4-dinitrobenzol), hergestellt. Beispielsweise kann ein Ricin-Immunotoxin wie in Vitetta et al., Science 238, 1098 (1987), beschrieben hergestellt werden. 14C-markierte 1-Isothiocyanatobenzyl-3-methyldiethylentriaminpentaessigsäure (MX-DTPA) ist ein Beispiel für Chelatbildner zur Konjugation von Radionucleotid an den Antikörper. Siehe die WO 94/11026.
  • In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper an einen "Rezeptor" (wie Streptavidin) zur Verwendung bei Tumor-Prätargeting verwendet werden, worin das Antikörper-Rezeptor-Konjugat dem Patienten verabreicht wird, woraufhin Entfernung von ungebundenem Konjugat aus dem Blutkreislauf unter Verwendung eines Klä rungsmittels und anschließende Verabreichung eines "Liganden" (z.B. Avidin), der an ein zytotoxisches Mittel gebunden ist (z.B. ein Radionucleotid), folgt.
  • Der Antikörper kann auch als ein Immunoliposom formuliert werden. Liposomen, die den Antikörper enthalten, werden durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt, wie sie beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und in den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben werden. Liposomen mit erhöhter Blutkreislaufdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
  • Besonders nützliche Liposomen können durch das Umkehrphasen-Verdampfungsverfahren mit einer Lipidzusammensetzung, die Phosphatidylcholin, Cholesterin und PEG-derivatisiertes Phosphatidylethanolamin (PEG-PE) umfasst, gebildet werden. Liposomen werden durch Filter mit definierter Porengröße extrudiert, um Liposomen mit dem erwünschten Durchmesser zu ergeben. Fab'-Fragmente des Antikörpers der vorliegenden Erfindung können an die Liposomen, wie in Martin et al., J. Biol. Chem. 257, 286–288 (1982), beschrieben wird, über eine Disulfid-Wechselwirkungsreaktion konjugiert werden. Ein chemotherapeutisches Mittel (wie beispielsweise Doxorubicin) ist gegebenenfalls im Liposom enthalten. Siehe Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81(19), 1484 (1989).
  • Der Antikörper der vorliegenden Erfindung kann auch in ADEPT durch Konjugieren des Antikörpers an ein Prodrug-aktivierendes Enzym, das ein Prodrug (z.B. ein chemotherapeutisches Peptidyl-Mittel, siehe die WO 81/01145) zu einem aktiven Antikrebs-Wirkstoff umsetzt, verwendet werden. Siehe beispielsweise die WO 88/07378 und das US-Patent Nr. 4.97.5.278.
  • Die Enzymkomponente des Immunokonjugats, die für ADEPT nützlich ist, umfasst jedes beliebige Enzym, das in der Lage ist, auf ein Prodrug auf solche Weise zu wirken, dass es dieses zu seiner aktiveren, zytotoxischen Form umsetzt.
  • Enzyme, die im Verfahren dieser Erfindung nützlich sind, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, alkalische Phosphatase, die zur Umsetzung von Phosphat-hältigen Prodrugs zu freien Wirkstoffen nützlich ist; Arylsulfatase, die zur Umsetzung von Sulfat-hältigen Prodrugs zu freien Wirkstoffen nützlich ist; Cytosindesaminase, die zur Umsetzung von nicht-toxischem 5-Fluorcytosin zum Antikrebs-Wirkstoff 5-Fluoruracil nützlich ist; Proteasen, wie z.B. Serratia-Protease, Thermolysin, Subtilisin, Carboxypeptidasen und Cathepsine (wie z.B. Cathepsine B und L), die zur Umsetzung von Peptid-hältigen Prodrugs zu freien Wirkstoffen nützlich sind; D-Alanylcarboxypeptidasen, die zur Umsetzung von Prodrugs nützlich sind, die D-Aminosäuresubstituenten enthalten; Kohlenhydrat-spaltende Enzyme wie z.B. β-Galactosidase und Neuraminidase, die zur Umsetzung von glykosylierten Prodrugs zu freien Wirkstoffen nützlich sind; β-Lactamase, die zur Umsetzung von Wirkstoffen, die mit β-Lactamen derivatisiert sind, zu freien Wirkstoffen nützlich ist; und Penicillin-Amidasen, wie z.B. Penicillin-V-Amidase oder Penicillin-G-Amidase, die zur Umsetzung von Wirkstoffen, die an ihren Amin-Stickstoffen mit Phenoxyacetyl- bzw. Phenylacetylgruppen derivatisiert sind, zu freien Wirkstoffen nützlich sind. Alternativ dazu können Antikörper mit enzymatischer Aktivität, die auch als "Abzyme" bekannt sind, verwendet werden, um die Prodrugs der Erfindung zu freien aktiven Wirkstoffen umzusetzen (siehe z.B. Massey, Nature 328, 457–458 (1987)). Antikörper-Abzym-Konjugate können wie hierin für die Zufuhr des Abzyms zu einer Tumorzellpopulation hergestellt werden.
  • Die Enzyme dieser Erfindung können kovalent an die Antikörpermutante mittels Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind, wie beispielsweise mittels der Verwendung der heterobifunktionellen Vernetzer wie zuvor erläutert, gebunden werden. Alternativ dazu können Fusionsproteine, die zumindest die Antigen-Bindungsregion eines Antikörpers der Erfindung, gebunden an zumindest einen funktionell aktiven Abschnitt eines Enzyms der Erfindung, umfasst, unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (siehe z.B. Neuberger et al., Nature 312, 604–608 (1984)), konstruiert werden.
  • In anderen Ausführungsformen kann der Antikörper kovalent modifiziert werden; Beispiele für solche Modifikationen wurden bereits oben beschrieben.
  • E. Therapeutische Verwendungen für WSX-Rezeptorliganden und -antikörper
  • In einer Ausführungsform können die WSX-Liganden (wie z.B. Agonisten-WSX-Rezeptorantikörper) der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Repopulation von reifen Blutzellstammbäumen in Säugetieren, die einer Chemo- oder Bestrahlungstherapie oder Knochenmarktransplantation unterzogen wurden, zu fördern. Im Allgemeinen wirken die Liganden über eine Förderung der Proliferation und/oder Differenzierung (jedoch insbesondere Proliferation) von primitiven hämatopoetischen Zellen. Die Liganden können auf ähnliche Weise nützlich zur Behandlung von Erkrankungen sein, die durch eine Abnehme der Blutzellen charakterisiert sind. Beispiele für diese Erkrankungen umfassen: Anämie (einschließlich makrozytäre Anämie und aplastische Anämie), Thrombozytopenie; Hypoplasie; Immun- (Autoimmun-) thrombozytopenische Purpura (ITP); und HIV-induzierte ITP. Auch können die Liganden verwendet werden, um einen Patienten zu behandeln, der eine Hämorrhagie erlitten hat. WSX-Liganden können auch verwendet werden, um Stoffwechselstörungen wie z.B. Obesität und Diabetes mellitus zu behandeln oder um Nieren-, Leber- oder Lungenwachstum und/oder -wiederherstellung (z.B. bei Nierenversagen) zu fördern.
  • Die WSX-Rezeptorliganden und -antikörper können alleine oder zusammen mit einem oder mehreren Cytokinen verabreicht werden. Weiters werden hierin als eine alternative zur Verabreichung des WSX-Ligandenproteins auch Gentherapieverfahren erwogen.
  • Bei Anwendungen im Rahmen von Gentherapie werden Gene in Zellen eingeführt, um In-vivo-Synthese eines therapeutisch wirksamen genetischen Produkts zu erzielen, beispielsweise zur Ersetzung eines defekten Gens. "Gentherapie" umfasst sowohl herkömmliche Gentherapie, bei der eine anhaltende Wirkung durch eine einzel ne Behandlung erzielt wird, als auch die Verabreichung von gentherapeutischen Mitteln, die eine einmalige oder wiederholte Verabreichung einer therapeutisch wirksamen DNA oder mRNA einbindet. Antisense-RNAs und -DNAs können als therapeutische Mittel zum Blockieren von Expression bestimmter Gene in vivo verwendet werden. Es wurde bereits gezeigt, dass kurze Antisense-Oligonucleotide in Zellen importiert werden können, wo sie trotz ihrer geringen intrazellulären Konzentrationen, die durch die eingeschränkte Aufnahme durch die Zellmembran verursacht werden, als Inhibitoren wirken (Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143–4146 (1986)). Die Oligonucleotide können modifiziert werden, um ihre Aufnahme zu steigern, z.B. durch Substituieren ihrer negativ geladenen Phosphodiestergruppen durch ungeladene Gruppen.
  • Es gibt zahlreiche verschiedene Verfahren, die zur Einführung von Nucleinsäuren in lebensfähige Zellen verfügbar sind. Die Verfahren variieren je nachdem, ob die Nucleinsäure in kultivierte Zellen in vitro oder in vivo in die Zellen des beabsichtigten Wirts transferiert wird. Verfahren, die für den Transfer von Nucleinsäuren in Säugetierzellen in vitro geeignet sind, umfassen die Verwendung von Liposomen, Elektroporation, Mikroinjektion, Zellfusion, DEAE-Dextran, Calciumphosphat-Fällungsverfahren usw. Die zur Zeit bevorzugten In-vivo-Gentransferverfahren umfassen Transfektion mit viralen (typischerweise retroviralen) Vektoren und Virus-Hüllprotein-Liposomen-vermittelte Transfektion (Dzau et al., Trends in Biotechnology 11, 205–210 (1993)). In manchen Situationen ist es wünschenswert, die Nucleinsäurequelle mit einem Mittel zu versehen, das auf die Target-Zellen gerichtet ist, wie z.B. mit einem Antikörper, der spezifisch für ein Zelloberflächenmembranprotein oder die Targetzelle ist, mit einem Liganden für einen Rezeptor an der Targetzelle usw. Werden Liposomen eingesetzt, so können Proteine, die sich an eine Zelloberflächenmembran binden, die mit Endozytose assoziiert ist, zum Targeting und/oder zur Erleichterung von Aufnahme verwendet werden, z.B. Capsidproteine oder Fragmente davon, die für einen bestimmten Zelltyp tropisch sind, Antikörper für Proteine, die Internalisierung bei Zyklierung erfahren, und Proteine, die auf intrazelluläre Lokalisation gerichtet sind und intrazelluläre Halbwertszeit steigern. Das Verfahren von Rezeptor-vermittelter Endozytose wird beispielsweise von Wu et al., J. Biol. Chem. 262, 4429–4432 (1987); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410–3414 (1990), beschrieben. Einen Überblick über die zur Zeit bekannten Genmarkierungs- und Gentherapie-Arbeitsvorschriften bietet Anderson et al., Science 256, 808–813 (1992).
  • Für therapeutische Anwendungen werden die WSX-Rezeptorliganden und -antikörper der Erfindung einem Säugetier, vorzugsweise einem Menschen, in einer physiologisch annehmbaren Dosierungsform verabreicht, einschließlich jener, die einem Menschen intravenös in Form eines Bolus oder durch kontinuierliche Infusion über eine bestimmte Zeitspanne hinweg, intramuskulär, intraperitoneal, intracerebrospinal, subkutan, intraartikulär, intrasynovial, intrathekal, oral, topisch oder über Inhalation verabreicht werden können. Die WSX-Rezeptorliganden und -antikörper werden auch geeigneterweise intratumoral, peritumoral, intraläsionell oder periläsionell oder in die Lymphe verabreicht, um örtliche wie auch systemische therapeutische Wirkungen zu erzielen.
  • Solche Dosierungsformen umfassen physiologisch annehmbare Träger, die in sich nicht-toxisch und nicht-therapeutisch sind. Beispiele für solche Träger umfassen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine wie z.B. menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen wie z.B. Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, partielle Glyceridgemische von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlroid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid, Magnesiumtrisilicat, Polyvinylpyrrolidon, Cellulose-basierte Substanzen und PEG. Träger für topische oder gelbasierte Formen von WSX-Rezeptorantikörpern umfassen Polysaccharide wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose oder Methylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylate, Polyoxyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, PEG und Holzwachsalkohole. Für alle Verabreichungen werden geeigneterweise herkömmliche Lagerformen verwendet. Solche Formen umfassen Mikrokapseln, Nano-Kapseln, Liposome, Pflaster, Inhalationsformen, Nasensprays, sublinguale Tabletten und Retard-Präparate. Der WSX-Rezeptorligand oder -antikörper wird typi scherweise in solchen Vehikeln in einer Konzentration von etwa 0,1 mg/ml bis 100 mg/ml formuliert.
  • Geeignete Beispiele für Retard-Präparate umfassen semipermeable Matrizen aus festen hydrophoben Polymeren, die den WSX-Rezeptorliganden oder -antikörper enthalten, wobei diese Matrizen in Form eines Formstücks, z.B. in Form von Folien oder Mikrokapseln, vorliegen. Beispiele für Retard-Matrizen umfassen Polyester, Hydrogele, beispielsweise Poly(2-hydroxyethylmethacrylat), wie beispielsweise von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15, 167–277 (1981), und Langer, Chem. Tech. 12, 98–105 (1982), beschrieben wird, oder Poly(vinylalkohol), Polylactide (US-Patent Nr. 3.773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-Glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22, 547–556 (1983)), nicht abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., s.o.), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie z.B. Lupron DepotTM (injizierbare Mikrokügelchen, zusammengesetzt aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(–)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z.B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über eine Zeitspanne von 100 Tagen ermöglichen, setzen bestimmte Hydrogele Proteine im Laufe kürzerer Zeitspannen frei. Bleiben eingekapselte WSX-Rezeptorantikörper für eine lange Zeit im Körper, so können sie infolge der Aussetzung gegenüber Feuchtigkeit bei 37°C denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Änderungen in Bezug auf Immunogenität führt. Zweckmäßige Vorgehensweisen können zur Stabilisierung je nach dem eingebundenen Mechanismus entworfen werden. Wird beispielsweise erkannt, dass der Aggregationsmechanismus intermolekulare S-S-Bindungsbildung durch Thio-Disulfid-Austausch ist, so kann Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Steuern des Feuchtigkeitsgehaltes, Verwendung geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrixzusammensetzungen erreicht werden.
  • Retard-WSX-Rezeptorliganden- oder -antikörperzusammensetzungen umfassen auch liposomal eingeschlossene Antikörper. Liposomen, die den WSX-Rezeptorliganden oder -antikörper enthalten, werden durch Verfahren hergestellt, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind und beispielsweise in Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und den US-Patenten Nr. 4.485.045 und 4.544.545 beschrieben sind. Üblicherweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200–800 Å) unilamellaren Typ, in dem der Lipidgehalt über etwa 30 Mol-% Cholesterin liegt, wobei der ausgewählte Anteil auf die optimale WSX-Rezeptorliganden- oder -antikörpertherapie abgestimmt wird. Liposomen mit gesteigerter Blutkreislaufdauer sind im US-Patent Nr. 5.013.556 offenbart.
  • Zur Prävention oder Behandlung von Erkrankungen hängt die geeignete Dosierung von WSX-Rezeptorliganden oder -antikörper vom zu behandelnden Erkrankungstyp, wie zuvor definiert, der Schwere und dem Verlauf der Erkrankung ab, davon, ob die Antikörper zu präventiven oder therapeutischen Zwecken verabreicht werden, von früheren Therapien, der Anamnese des Patienten und der Reaktion auf den WSX-Rezeptorliganden oder -antikörper und unterliegt dem Ermessen des behandelnden Arztes. Der WSX-Rezeptorligand oder -antikörper wird geeigneterweise dem Patienten einmalig oder im Rahmen einer Reihe von Behandlungen verabreicht.
  • Je nach Typ und Schwere der Erkrankung stellen etwa 1 μg/kg bis 15 mg/kg WSX-Rezeptorligand oder -antikörper eine anfängliche, mögliche Dosierung zur Verabreichung an den Patienten dar, die entweder beispielsweise durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch kontinuierliche Infusion zugeführt wird. Eine typische Tagesdosierung kann je nach den zuvor erwähnten Faktoren im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 μg/kg (z.B. 1–50 μg/kg) oder mehr liegen. Beispielsweise kann die Dosierung dieselbe wie jene für andere Cytokine wie z.B. G-CSF, GM-CSF und EPO sein. Für wiederholte Verabreichungen über mehrere Tage hinweg oder sogar länger, je nach Leiden, wird die Behandlung fortgesetzt, bis eine erwünschte Unterdrückung der Erkrankungssymptome eintritt. Es können jedoch auch andere Dosierungspläne nützlich sein. Der Fortschritt dieser Therapie kann auf einfache Weise mittels herkömmlicher Verfahren und Tests beobachtet werden.
  • Werden ein oder mehrere Cytokine mit dem WSX-Rezeptorliganden zusammen verabreicht, so können geringere Dosen des WSX-Liganden verwendet werden. Geeignete Dosen eines Cytokins liegen im Bereich von etwa 1 μg/kg bis etwa 15 mg/kg Cytokin. Eine typische Tagesdosis von Cytokin kann im Bereich von etwa 1 μg/kg bis 100 μg/kg (z.B. 1–50 μg/kg) oder mehr liegen. Beispielsweise kann die Dosis dieselbe sein wie jene für andere Cytokine wie z.B. G-CSF, GM-CSF und EPO. Das Cytokin oder die Cytokine kann/können vor, gleichzeitig mit oder nach der Verabreichung des WSX-Liganden verabreicht werden. Das/Die Cytokine) und der WSX-Ligand können kombiniert werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung für gleichzeitige Verabreichung an das Säugetier zu bilden. In bestimmten Ausführungsformen sind die Mengen an WSX-Ligand und Cytokin so beschaffen, dass eine synergistische Repopulation von Blutzellen (oder synergistische Steigerung von Proliferation und/oder Differenzierung blutbildender Zellen) im Säugetier bei Verabreichung des WSX-Liganden und Cytokins eintritt. In anderen Worten ist die koordinierte Wirkung der zwei oder mehreren Mittel (d.h. des WSX-Liganden und des/der Cytokins/e) in Bezug auf Repopulation von Blutzellen (oder Proliferation/Differenzierung blutbildender Zellen) stärker als die Summe der einzelnen Wirkungen dieser Moleküle.
  • F. Herstellungsartikel
  • Ein Herstellungsartikel, der Materialien enthält, die für die Behandlung der zuvor beschriebenen Leiden nützlich sind, wird ebenfalls bereitgestellt. Der Herstellungsartikel umfasst ein Behältnis und eine Markierung. Geeignete Behältnisse umfassen beispielsweise Flaschen, Phiolen, Spritzen und Teströhrchen. Die Behältnisse können aus zahlreichen verschiedenen Materialien wie z.B. Glas oder Kunststoff gebildet sein. Das Behältnis trägt eine Zusammensetzung, die wirksam zur Behandlung des Leidens ist, und kann eine sterile Zugangsöffnung aufweisen (beispielsweise kann das Behältnis ein Lösungsbeutel zur intravenösen Verabreichung oder eine Phiole mit einem Septum sein, das mit einer subkutanen Injektionsnadel durchstochen werden kann). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist der WSX-Ligand. Die Markierung am Behältnis oder in Verbindung mit dem Behältnis gibt an, dass die Zusammensetzung zur Behandlung des bestimmten Leidens verwendet wird. Der Her stellungsartikel kann weiters ein zweites Behältnis umfassen, das ein Cytokin zur Co-Verabreichung mit dem WSX-Liganden enthält. Weitere(s) Behältnis(se) kann/können mit dem Herstellungsartikel bereitgestellt werden, das/die beispielsweise einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung oder Dextrose-Lösung, enthält/enthalten. Der Herstellungsartikel kann weiters andere Materialien einbinden, die aus handelstechnischer Sicht und aus der Sicht des Benutzers wünschenswert sind, umfassend andere Puffer, Verdünnungsmittel, Filter, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Gebrauchsanweisungen.
  • G. Nicht-therapeutische Verwendungen für WSX-Rezeptorliganden und -antikörper
  • WSX-Rezeptorliganden und -antikörper können zur Detektion und/oder zur Anreicherung von hämatopoetischen Stammzell/Vorläuferzellpopulationen auf ähnliche Weise, wie zur Zeit CD34-Antikörper eingesetzt werden, verwendet werden. Für Stammzellenanreicherung können die WSX-Rezeptorantikörper in den auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren wie z.B. Immun-Panning, Durchflusszytometrie oder in immunomagnetischen Perlen verwendet werden.
  • Gemäß einer In-vitro-Anwendung der WSX-Liganden werden den WSX-Rezeptor umfassende Zellen bereitgestellt und in ein Zellkulturmedium gegeben. Beispiele für solche WSX-Rezeptor-hältigen Zellen umfassen hämatopoetische Vorläuferzellen wie z.B. CD34+-Zellen.
  • Geeignete Gewebekulturmedien sind Fachleuten bekannt und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Minimal Essential Medium (MEM), RPMI-1640 und Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). Diese Gewebekulturmedien sind im Handel bei Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) und GIBCO (Grand Island, NY) erhältlich. Die Zellen werden in Zellkulturmedium unter Bedingungen kultiviert, die für die Zellen ausreichend sind, dass sie lebensfähig bleiben und in Gegenwart einer wirksamen Menge an WSX-Liganden und, gegebenenfalls, weiteren Cytokinen und Wachstums faktoren wachsen. Die Zellen können auf zahlreiche verschiedene Wege kultiviert werden, einschließlich Kultivieren in einer Koagulum-, Agar- oder Flüssigkultur.
  • Die Zellen werden bei einer physiologisch annehmbaren Temperatur wie z.B. 37°C in Gegenwart einer wirksamen Menge an WSX-Liganden kultiviert. Die Menge an WSX-Liganden kann variieren, liegt jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 10 ng/ml bis etwa 1 mg/ml. Der WSX-Ligand kann natürlich der Kultur in einer von Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren empirisch festgelegten Dosis zugesetzt werden. Die Konzentration von WSX-Ligand in der Kultur hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie beispielsweise den Bedingungen, unter denen die Zellen und der WSX-Ligand kultiviert werden. Die spezifische Temperatur und Dauer der Inkubation sowie andere Kulturbedingungen, können je nach solchen Faktoren variiert werden, z.B. der Konzentration des WSX-Liganden und dem Typ der Zellen und des Mediums.
  • Es wird erwogen, dass die Verwendung von WSX-Ligand zur Steigerung von Zellproliferation und/oder -differenzierung in vitro auf verschiedene Arten nützlich ist. Beispielsweise können hämatopoetische Zellen, die in vitro in Gegenwart von WSX-Liganden kultiviert werden, in ein Säugetier, das an reduzierten Konzentrationen der Zellen leidet, infundiert werden. Auch können die kultivierten, blutbildenden Zellen zum Gentransfer bei Gentherapieanwendungen verwendet werden. Stabile In-vitro-Kulturen können auch zum Isolieren zellspezifischer Faktoren und zur Expression von endogenen oder rekombinant eingeführten Proteinen in der Zelle verwendet werden. WSX-Ligand kann auch verwendet werden, um Zellüberleben, Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen, die das Wachstum und/oder die Differenzierung anderer Zellen in Zellkultur unterstützen, zu steigern.
  • Die hierin offenbarten WSX-Rezeptorantikörper sind auch als Affinitätsreinigungsmittel nützlich. In diesem Verfahren werden die Antikörper gegen WSX-Rezeptor an einem geeigneten Träger, wie z.B. einem Sephadex-Harz oder Filterpapier, unter Verwendung von auf dem Gebiet der Erfindung bekannten Verfahren immobilisiert. Der immobilisierte Antikörper wird dann mit einer Probe kontaktiert, die den zu reinigen den WSX-Rezeptor enthält, und hiernach wird der Träger mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen, das im Wesentlichen das gesamte Material unter Ausnahme des WSX-Rezeptors, der an den immobilisierten Antikörper gebunden ist, entfernt. Schließlich wird der Träger mit einem anderen geeigneten Lösungsmittel wie z.B. Glycinpuffer, pH 5,0, gewaschen, das den WSX-Rezeptor vom Antikörper freisetzt.
  • WSX-Rezeptorantikörper können auch in diagnostischen Tests für WSX-Rezeptor nützlich sein, z.B. zur Detektion seiner Expression in spezifischen Zellen, Geweben oder Serum. Für diagnostische Anwendungen werden Antikörper typischerweise mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert. Die nachweisbare Gruppierung kann jede sein, die in der Lage ist, entweder direkt oder indirekt ein nachweisbares Signal zu produzieren. Beispielsweise kann die nachweisbare Gruppierung ein Radioisotop, wie z.B. 3H, 14C, 32P, 35S oder 125I; eine fluoreszierende oder chemilumineszierende Verbindung, wie z.B. Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin oder Luciferin; radioaktive isotopische Markierungen, wie z.B. 125I, 32P, 14C oder 3H; oder ein Enzym wie z.B. alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Meerrettichperoxidase sein.
  • Jedes beliebige, auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren zum separaten Konjugieren der Polypeptidvariante mit der nachweisbaren Gruppierung kann verwendet werden, einschließlich jener Verfahren, die von Hunter et al., Nature 144, 945 (1962); David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981); und Nygren, J. Histochem. and Cytochem. 30, 407 (1982), beschrieben werden.
  • Die hierin offenbarten Antikörper können in jedem beliebigen bekannten Testverfahren, wie z.B. kompetitiven Bindungstests, direkten und indirekten Sandwichtests und Immunfällungstests, eingesetzt werden. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, 147–158, CRC Press, Inc. (1987).
  • Kompetitive Bindungstests beruhen auf der Fähigkeit eines markierten Standards, mit dem Testprobenanalyt um Bindung mit einer eingeschränkten Menge an Antikörper zu konkurrieren. Die Menge an WSX-Rezeptor in der Testprobe ist umgekehrt proportional zur Menge des Standards, der an die Antikörper gebunden wird. Um die Bestimmung der Menge an Standard, der gebunden werden soll, zu erleichtern, werden die Antikörper im Allgemeinen vor oder nach der Konkurrenz unlöslich gemacht, sodass der Standard und der Analyt, die an die Antikörper gebunden sind, von dem Standard und Analyt, die ungebunden bleiben, leicht getrennt werden können.
  • Sandwichtests umfassen die Verwendung von zwei Antikörpern, von denen jeder in der Lage ist, sich an einen anderen immunogenen Abschnitt, oder ein Epitop, des nachzuweisenden Proteins zu binden. In einem Sandwichtest wird der Testprobenanalyt durch einen ersten Antikörper gebunden, der an einen festen Träger immobilisiert ist, und hiernach bindet sich ein zweiter Antikörper an den Analyt, wodurch ein unlöslicher, dreiteiliger Komplex gebildet wird. Siehe z.B. das US-Patent Nr. 4.376.110. Der zweite Antikörper kann selbst mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert sein (direkter Sandwichtest) oder kann unter Verwendung eines Anti-Immunglobulin-Antikörpers, der mit einer nachweisbaren Gruppierung markiert ist, gemessen werden (indirekter Sandwichtest). Ein Typ von Sandwichtest ist beispielsweise ein ELISA-Test, wobei hier die nachweisbare Gruppierung ein Enzym ist.
  • H. Hinterlegung von Materialien
  • Die folgenden biologischen Materialien wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, USA (ATCC), hinterlegt:
  • Figure 01090001
  • Diese Hinterlegungen wurden gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den darunter gültigen Bestimmungen (Budapester Vertrag) vorgenommen. Dies stellt die Aufrechterhaltung einer lebensfähigen Kultur 30 Jahre vom Datum der Hinterlegung an sicher. Jede der hinterlegten Kulturen wird von der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages verfügbar gemacht und unterliegt einem Abkommen zwischen Genentech, Inc., und ATCC, das sicherstellt, dass (a) der Zugang zur Kultur während der Anhängigkeit der Patentanmeldung einer vom Präsident des Patentamtes der Vereinigten Staaten bestimmten Person zugänglich gemacht wird, die hierzu gemäß 37 CFR §1.14 und 35 USC §122 befugt ist, und (b) dass alle Einschränkungen in Bezug auf die Verfügbarkeit der so hinterlegten Kultur für die Öffentlichkeit unwiderruflich mit der Vergabe des Patents ausgeräumt werden.
  • Der Abtretungsempfänger der vorliegenden Anmeldung hat sich einverstanden erklärt, dass, sofern irgendeine der hinterlegten Kulturen trotz Kultivierung unter geeigneten Bedingungen sterben sollte oder verloren gehen oder zerstört werden sollte, diese unverzüglich nach Bekanntgabe mit einem lebensfähigen Muster derselben Kultur ersetzt wird. Verfügbarkeit der hinterlegten Zelllinien gilt nicht als eine Lizenz zur Praktizierung der Erfindung im Widerspruch zu den Rechten zu verstehen, die unter der Autorität jeder beliebigen Regierung gemäß ihren Patentgesetzen zuerkannt werden.
  • Die obige ausformulierte Beschreibung wird als ausreichend erachtet, um Fachleuten die Möglichkeit zu geben, die Erfindung praktisch durchzuführen. Die vorliegende Erfindung ist durch keine der hinterlegten Kulturen in ihrem Schutzumfang eingeschränkt, da es die hinterlegte Ausführungsform als eine Veranschaulichung eines Aspektes der Erfindung zu verstehen gilt, und jede Kultur, die funktionell äquivalent ist, liegt ebenfalls innerhalb des Schutzumfangs dieser Erfindung. Die Materialhinterlegung hierin kommt nicht einem Eingeständnis gleich, dass die hierin bereitgestellte ausformulierte Beschreibung nicht geeignet ist, um die praktische Durchführung jedes beliebigen Aspekts der Erfindung, einschließlich der besten Ausführungsform hiervon, zu ermöglichen, noch ist sie als Einschränkung des Schutzumfanges der Ansprüche auf die spezifische Darstellung, der sie darstellt, zu verstehen. Tatsächlich werden verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu jenen, die hierin gezeigt und beschrieben wurden, Fachleuten durch die obige Beschreibung ersichtlich sein und fallen ebenfalls in den Schutzumfang der beiliegenden Patentansprüche.
  • III. Experimenteller Teil
  • Nachstehend werden spezifische Ausführungsformen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung beschrieben. Die Beispiele sind ausschließlich zu Zwecken der Veranschaulichung bereitgestellt und sollen in keiner Weise den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken.
  • BEISPIEL 1
  • Klonieren von menschlichem WSX-Rezeptor
  • Eine Oligonucleotidsonde, die als WSX.6#1 bezeichnet wird, wurde basierend auf der T73849-EST-Sequenz sequenziert. Die WSX.6#1-Sonde war ein 51-mer mit der folgenden Sequenz:
  • Figure 01110001
  • Die radioaktiv markierte WSX.6#1-Sonde wurde verwendet, um 1,2 × 106 Klone aus einer zufälligen und Oligo-dT-geprimten λgt10-Fötalleberbibliothek (Clontech, Palo Alto, CA) zu sondieren. Nach Hybridisierung über Nacht bei 42°C wurden die Filter bei 50°C in 0,5 × SSC und 0,1% NaDodSO4 (SDS) gewaschen. Aus dem anfänglichen Screen wurden 10 Klone selektiert, und bei nachfolgendem Screenen wurden 5 einzelne Plaque-reine Klone isoliert. Von diesen 5 einzelnen Klonen wurden vier Klone, die als Klon 1, 5, 6 und 9 bezeichnet wurden, in pBSSK– (Stratagene) nach EcoRI-Verdau subkloniert. Sequenzanalyse zeigte, dass Klon 5 und Klon 9 das mutmaßliche Initiationsmethionin und Signalpeptid enthielten. Klon 6 (bezeichnet als 6.4) enthielt den Großteil von 3'-Sequenz und wurde daraufhin für weiteres Screenen verwendet.
  • Um das Volllängengen zu erhalten, wurde Klon 6.4 (Fragment Nsi-HindIII) radioaktiv markiert und verwendet, um 1,2 × 106 Klone aus einer λgt10-Bibliothek, die aus einer Hepatom-Hep3B-Zelllinie erstellt wurde, zu screenen. Dieser Screen resultierte in 24 positiven Klonen. Nach PCR-Analyse der Klone unter Verwendung von λgt10-Primern (F und R) wurden die vier längsten Klone 12.1, 13.2, 22.3 und 24.3 isoliert. Diese Klone wurden in pBSSK– unter Verwendung der EcoRI-Stelle subkloniert, und nach Untersuchung mittels Restriktionsenzymverdau wurden die Klone 12.1 und 13.2 Sequenzierung unterzogen. DNA-Sequenzierung wurde mit dem Taq-Farbstoff-Desoxynucleotidterminatorzyklus-Sequenzierungsset an einem automatisierten DNA-Sequenzierer von Applied Biosystems durchgeführt.
  • Die assemblierte, zusammenhängende Sequenz aus allen isolierten Klonen kodierte für einen Consensus-Aminoterminus für das neu identifizierte Polypeptid, das als WSX-Rezeptor bezeichnet wird. Sequenzanalyse zeigte jedoch auf, dass zumindest drei natürlich vorkommende Varianten des WSX-Rezeptors bestehen, die unterschiedliche zytoplasmatische Regionen aufweisen. Diese Varianten scheinen am Lysinrest an Position 891 unterschiedlich gespleißt zu sein. Klon 6.4 endet 5 Aminosäuren nach Lys 891. Klon 12.1 unterscheidet sich von 13.2 und 6.4 nach Lys 891 und kodiert für eine mutmaßliche Box-2-Region, die sich von jener unterscheidet, für die Klon 13.2 kodiert. Klon 13.2 enthält eine potenzielle Box-1-Region und kodiert nach Lys 891 für mutmaßliche Box-2- und Box-3-Motive. Siehe Baumann et al., Mol. Cell. Biol. 14(1), 138–146 (1994).
  • Das Volllängen-WSX-Gen basierend auf der Klon-13.2-Zytoplasmaregion kodiert mutmaßlich für ein 1165-Aminosäure-Transmembranprotein. Die 841-Aminosäure-extrazellulärdomäne (ECD) enthält zwei WSXWS-Domänen. Der ECD folgt eine 24-Aminosäure-Transmembrandomäne und eine 300-Aminosäure-Zytoplasmaregion.
  • BEISPIEL 2
  • WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin
  • Unter Verwendung von Polymerasekettenamplifikation wurde ein WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin durch Bearbeiten einer In-Raster-Fusion der extrazellulären Domäne des WSX-Rezeptorgens (WSX.ECD) mit menschlichem CH2CH3(Fc)IgG (Bennett et al., J. Biol. Chem. 266(34), 23060–23067 (1991)) am C-Terminus der ECD geschaffen und in pBSSK– (Strategene) kloniert. Zur Expression wurde die WSX-Fc mit ClaI und BstEII ausgeschnitten und in den pRKS.HuIF.grbhlgG-Genenase-I-Vektor (Beck et al., Molecular Immunology 31(17), 1335–1344 (1994)) ligiert, um das Plasmid pRK5.WSX-IgG-Genenase I zu schaffen. Dieses Plasmid wurde vorübergehend in 293-Zellen unter Verwendung von Standard-Calciumphosphat-Transfektionsverfahren transfiziert. Die transfizierten Zellen wurden bei 37°C in 5% CO2 in DMEM F12 50:50, ergänzt mit 10% FBS, 100 mM HEPES (pH 7,2) und 1 mM Glutamin kultiviert. Das WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin wurde unter Verwendung einer ProSepATM-Protein-A-Säule gereinigt.
  • BEISPIEL 3
  • Antikörperherstellung
  • Um Antikörper gegen den WSX-Rezeptor zu züchten, wurde das WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin aus Beispiel 2 verwendet, um Kaninchen zu inokulieren, um polyklonale Antikörper zu züchten, und um Mäuse zu inokulieren, um monoklonale Antikörper zu züchten, unter Verwendung herkömmlicher Verfahren.
  • BEISPIEL 4
  • Bildung einer Zelllinie, die WSX-Rezeptor exprimiert
  • Die für Volllängen-WSX-Rezeptorvariante 13.2 kodierende Nucleinsäure wurde in das pRKtkNeo-Plasmid (Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)) insertiert. 100 μg des so gebildeten pRKtkNeo.WSX-Plasmids wurden linearisiert, Ethanolgefällt und in 100 μl RPMI 1640 resuspendiert. 7 × 106 Baf3-Zellen (5 × 105/ml) wur den in 900 μl RPMI suspendiert und zum linearisierten Plasmid zugesetzt. Nach Elektroporation bei 325 V, 1180 μF unter Verwendung einer BRL-Elektroporationsvorrichtung wurden die Zellen in 15 ml RPMI 1640, das 5% WEHI3B-konditioniertes Medium und 15% Serum enthielt, ausplattiert. 48 h später wurden Zellen in 2 mg/ml G418 selektiert.
  • Um die Baf3/WSX-Zelllinie, die WSX-Rezeptorvariante 13.2 exprimiert, zu erhalten, wurden die G418-selektierten Klone durch FACS unter Verwendung der polyklonalen Kaninchen-Antiseren, die gegen das WSX-Fc-Hybridprotein wie zuvor beschrieben gezüchtet wurden, analysiert. Der am stärksten exprimierende Klon (bezeichnet als E6) wurde mittels FACS sortiert, um eine Population mit einem hohen Grad an WSX-Rezeptorexpression zu erhalten.
  • BEISPIEL 5
  • Rolle von WSX-Rezeptor bei Zellproliferation
  • Die proliferativen Potenziale von WSX-Rezeptorvarianten 13.2 und 12.1 wurden durch Konstruieren menschlicher Wachstumshormonrezeptor-WSX-Rezeptor- (GH-WSX-) Fusionen, die für chimäre Proteine, bestehend aus extrazellulären GH-Rezeptordomänen und GH-Rezeptor-Transmembrandomänen und den intrazellulären Domänen der WSX-Rezeptorvarianten 13.2 oder 12.1, kodieren, getestet. Diese chimären Genfusionen wurden in die IL-3-abhängige Zelllinie Baf3 transfiziert. Die Fähigkeit der GH-WSX-transfizierten Baf3-Zellen, auf exogenes Wachstumshormon (GH) zu reagieren, wurde in einem Thymidininkorporationstest getestet. Wie in den 6 und 8 zu sehen ist, war die GH-WSX-Rezeptorvariante-13.2-Chimäre in der Lage, Thymidinaufnahme in den transfizierten Baf3-Zellen zu steigern, was auf das proliferative Potenzial der WSX-Rezeptorvariante 13.2 hinweist. Die WSX-Rezeptorvariante 12.1 war jedoch nicht in der Lage, ein proliferatives Signal in diesem Versuch zu übertragen (8).
  • Materialien und Verfahren
  • Rekombinante PCR wurde verwendet, um die chimären Rezeptoren, die die extrazellulären und transmembranen Domänen des hGH-Rezeptors und die zytoplasmatische Domäne entweder von WSX-Rezeptorvariante 12.1 oder 13.2 enthalten, zu bilden. Kurz zusammengefasst wurde die zytoplasmatische Domäne entweder von Variante 12.1 oder 13.2, die mit Arg an Aminosäure 866 beginnt und sich bis zu Aminosäure 958 bzw. Anmosäure 1165 erstreckt, in Raster durch sequenzielle PCR an die extrazelluläre und transmembrane Domäne von hGH-Rezeptor, die mit Met an Aminosäure 18 beginnt und sich bis zu Arg an Aminosäure 274 erstreckt, fusioniert. Die GH-WSX-Chimäre wurde zuerst unter Verwendung von PCR zur Bildung der extrazellulären und transmembranen Domäne des menschlichen GH-Rezeptors konstruiert. Der 3'-End-Primer, der für diese PCR verwendet wurde, enthielt 20 Nucleotide am 5'-Ende des Primers, was den ersten 20 Nucleotiden der WSX-Zytoplasmadomäne entspricht. Das 3'-Ende der Chimäre wurde unter Verwendung von PCR gebildet, worin der 5'-End-Primer die letzten 19 Nucleotide der menschlichen GH-Rezeptortransmembrandomäne enthielt. Um die Volllängenchimäre zu bilden, wurde das 5'-Ende des menschlichen GH-Rezeptorprodukts mit dem 3'-End-WSX-Rezeptorzytoplasma-PCR-Produkt kombiniert und daraufhin amplifiziert, um eine Fusion der zwei Produkte zu bilden.
  • Diese chimäre Fusion wurde mit ClaI und XbaI verdaut und an pRKtkNeo ligiert (Holmes et al., Science 253, 1278–1280 (1991)), um den chimären Expressionsvektor zu schaffen. Die IL-3-abhängige Zelllinie Baf3 wurde dann mit diesem hGH/WSX-Hybridexpressionsvektor elektroporiert.
  • Kurz zusammengefasst wurden 100 μg pRKtkNeo/GH.WSX-Plasmid linearisiert, Ethanol-gefällt und in 100 μl RPMI 1640 resuspendiert. 7 × 106 Baf3-Zellen (5 × 105/ml) wurden in 900 μl RPMI suspendiert und zum linearisierten Plasmid zugesetzt. Nach Elektroporation bei 325 V, 1180 μF unter Verwendung einer BRL-Elektroporationsvorrichtung wurden die Zellen in 15 ml RPMI 1640, das 5% WEHI-konditioniertes Medium und 15% Serum enthielt, ausplattiert. 48 h später wurden Zellen in 2 mg/ml G418 selektiert.
  • Um die Baf3/GH.WSX-Zelllinien zu erhalten, wurden die G418-selektierten Zellen unter Verwendung eines Anti-Mensch-GH-mAb (3B7) bei 1 μg/ml FACS-sortiert. Die obersten 10% der exprimierenden Zellen wurden selektiert und vermehrt.
  • BEISPIEL 6
  • Expressionsanalyse des WSX-Rezeptors
  • Das Expressionsprofil des WSX-Rezeptors wurde anfänglich mittels Northern-Analyse untersucht. Northern-Blots von menschlicher fötaler oder erwachsener Gewebe-mRNA wurde von Clontech (Palo Alto, Kalifornien) erhalten. Ein Transkript von etwa 6 kb wurde in menschlicher fötaler Lunge, Leber und Niere nachgewiesen. In der erwachsenen Probe wurde ein geringer Grad an Expression in zahlreichen verschiedenen Geweben einschließlich Leber, Placenta, Lungenskelettmuskel, Niere, Ovarien, Prostata und Dünndarm nachgewiesen.
  • PCR-Analyse von menschlichem Nabelschnurblut identifizierte Transkripte in CD34+-Subfraktion. PCR-Analyse zeigte, dass alle drei Varianten des WSX-Rezeptors in CD34+-Zellen vorhanden waren. Die CD34+-Subfraktion schien bei derselben PCR-Analyse negativ zu sein.
  • Mittels PCR-Analyse waren sowohl Variante 6.4 als auch Variante 13.2 in der AA4+Sca+Kit+- (flASK-) Zellpopulation, isoliert von der fötalen Leber mittleren Gestationsalters wie von Zeigler et al., Blood 84, 2422–2430 (1994), beschrieben, eindeutig zu erkennen.
  • Menschliche B-Zellen, isoliert aus peripherem Blut unter Verwendung von Anti-CD19/20-Antikörpern, waren auch für Rezeptor-mRNA-Expression kurzer Form (6.4-Variante) und langer Form (13.2-Variante) positiv.
  • Der WSX-Rezeptor scheint sowohl an Vorläufer- als auch an reiferen blutbildenden Zellen exprimiert zu werden.
  • BEISPIEL 7
  • Klonieren von Maus-WSX-Rezeptor
  • Der menschliche WSX-Rezeptor wurde als eine Sonde verwendet, um Maus-WSX-Rezeptor zu isolieren. Das pRKtkNeo.WSX-Plasmid aus Beispiel 4 wurde unter Verwendung von Ssp1 verdaut. Dieses Ssp1-Fragment (1624 bp) wurde isoliert und radioaktiv markiert und weiters verwendet, um eine Maus-Leber-λgt10-Bibliothek (Clontech) zu screenen. Dies resultierte in 4 positiven Klonen; die isoliert und nach Subklonieren in pBSSK– über EcoRI-Verdau sequenziert wurden. Die resultierenden Klone, bezeichnet als 1, 2, 3, 4, zeigten Homologie zur extrazellulären Domäne des menschlichen WSX-Rezeptors; die zusammenhängenden Sequenzen, die aus diesen Klonen resultierten, erstreckten sich vom Initiations-Methionin bis zu Tryptophan an Position 783. Die Gesamtähnlichkeit von menschlichem WSX-Rezeptor und Maus-WSX-Rezeptor beträgt 73% über diese Region der jeweiligen extrazellulären Domänen (siehe die 4A–B).
  • BEISPIEL 8
  • Die Rolle von WSX-Rezeptor bei Proliferation hämatopoetischer Zellen
  • Die Gegenwart des WSX-Rezeptors in der angereicherten menschlichen Stammzellenpopulation CD34+ aus Nabelschnurblut ist ein Hinweis auf eine potenzielle Rolle dieses Rezeptors bei Stammzellen/Vorläuferzellen-Proliferation. Die Proliferation von menschlichen CD34+-Blutzellen in Methylcellulosemedium (Stem Cell Technologies) wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von WSX-Rezeptor-Antisense-Oligonucleotiden bestimmt. Diese Versuche wurden auch im Maus-Hämatopoesesystem unter Verwendung von AA4+Sca+Kit+-Stammzellen aus der fötalen Mausleber wiederholt. In beiden Fällen inhibierten die Antisense-Oligonucleotide in statistisch signifikantem Ausmaß Koloniebildung aus den hämatopoetischen Vorläuferzellen. Siehe Tabelle 1 unten. Die anti-proliferativen Wirkungen waren unter Verwendung der –20- Antisense- und der +85-Antisense-Oligonucleotidkonstrukte am stärksten ausgeprägt. Diese Inhibition war nicht Stammbaum-spezifisch für irgendeinen bestimmten Knochenmarkstammbaum, der aus der Vorläufervermehrung resultierte. Die grundlegende Wirkung der Antisense-Oligonucleotide war eine Reduktion der Gesamt-Kolonieanzahl. Die Größe der einzelnen Kolonien wurde auch reduziert.
  • Antisense-Oligonucleotidversuche unter Verwendung sowohl von menschlichen als auch von Maus-Stammzellen zeigten eine Inhibition von Knochenmarkkoloniebildung. Dennoch konnte die Reduktion von Myelopoese, die in diesen Tests beobachtet wurde, durch die zusätzliche Einbindung von G-CSF und GM-CSF im Kulturmedium unterbunden werden. Diese Daten dienen zur Veranschaulichung der Redundanz an Cytokinwirkung im myelopoetischen Kompartiment.
  • TABELLE 1
    Figure 01190001
  • Materialien und Verfahren
  • Menschliche Stammzellen: Menschliches Nabelschnurblut wurde in PBS/Heparin (1.000 μ/ml) gesammelt. Die mononukleare Fraktion wurde unter Verwendung eines Dextrangradienten getrennt, und jegliche verbleibenden roten Blutzellen wurden in 20 mM NH4Cl lysiert. CD34+-Zellen wurden unter Verwendung von CD34+-immunomagnetischen Perlen (Miltenyi, CA) isoliert. Diese isolierten CD34+-Zellen wurden mittels FACS-Analyse als 90–97% CD34+ erkannt.
  • Maus-Stammzellen: Fötale Leber mittleren Gestationsalters wurde geerntet und positiv für das AA4–-Antigen durch Immun-Panning selektiert. Die AA4–-positive Fraktion wurde dann weiter an Stammzellengehalt durch FACS-Isolierung der AA4+Sca+Kit+-Fraktion angereichert.
  • Antisense-Versuche: Oligodesoxynucleotide wurden gegen Regionen der menschlichen oder Maus-WSX-Rezeptoren synthetisiert. Für jedes ausgewählte Oligonucleotid wurden Antisense- (AS-), Sense- (S-) und ungeordnete (SCR-) Versionen synthetisiert (siehe 7). + oder – bezeichnet die Position in Bezug auf das Initiations-Methionin des WSX-Rezeptors. CD34+- oder AA4+Sca+Kit+-Zellen wurden in einer Konzentration von 103/ml in 50:50-DMEM/F12-Medium, ergänzt mit 10% FBS, L-Glutamin und GIBCOTM-Lipidkonzentrat, das entweder Sense-, Antisense- oder ungeordnete Oligonucleotide in einer Konzentration von 70 μg/ml enthielt, inkubiert. Nach 16 h wurde eine zweite Aliquote des jeweiligen Oligonucleotids zugesetzt (35 μg/ml), und die Zellen wurden weitere 6 h lang inkubiert.
  • Kolonietests: 5.000 Zellen aus jeder der oben genannten Bedingungen wurden in 5 ml Methylcellulose (Stem Cell Technologies), die Kit-Liganden (KL) (25 ng/ml), Interleukin-3 (IL-3) (25 ng/ml) und Interleukin-6 (IL-6) (50 ng/ml) enthielt, in Aliquoten aufgeteilt. Die Methylcellulosekulturen wurden dann 14 Tage lang bei 37°C inkubiert, und die resultierenden Kolonien wurden gezählt und phänotypisiert. Alle Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.
  • BEISPIEL 9
  • WSX-Rezeptorvariante 13.2 ist ein Rezeptor für OB-Protein
  • Die WSX-Rezeptorvariante 13.2 weist im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz wie der jüngst klonierte Leptin- (OB-) Rezeptor auf. Siehe Tartaglia et al., Cell 83, 1263–1271 (1995). OB-Protein war in der Lage, Thymidininkorporation in Baf3-Zellen, die mit WSX-Rezeptorvariante 13.2, wie in Beispiel 4 beschrieben (siehe 9), transfiziert sind, zu stimulieren.
  • Es wurde die OB-Proteinexpression in hämatopoetischen Zellen untersucht. Oligonucleotidprimer, die spezifisch gegen das OB-Protein entworfen waren, veranschaulichten die Gegenwart dieses Liganden in fötaler Leber und fötalem Gehirn sowie in zwei fötalen Leberstromazelllinien, die als 10-6 und 7-4 bezeichnet sind. Für beide dieser sich unbegrenzt vermehrenden Stromazelllinien wurde gezeigt, dass sie sowohl Knochenmark- als auch Lymphproliferation von Stammzellpopulationen unterstützen (Zeigler et al., Blood 84, 2422–2430 (1994)).
  • BEISPIEL 10
  • Die Rolle von OB-Protein bei Hämatopoese
  • Um die hämatopoetische Aktivität von OB-Protein zu untersuchen, wurden viele verschiedene In-vitro-Tests durchgeführt.
  • Fötale Mausleber-flASK-Stammzellen wurden aus der fötalen Leber mittleren Gestationsalters wie in Zeigler et al., Blood 84, 2422–2430 (1994), beschrieben isoliert und in Stammzellen-Suspensionskultur oder Methylcellulosetests untersucht.
  • Aus den Stammzellen-Suspensionskulturen wurden 20.000 der flASK-Zellen in einzelne Wells in einem 12-Well-Format in DMEM-4.5/F12-Medium, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (Hyclone, Logan, UT) und L-Glutamin, überimpft. Wachstumsfaktoren wurden in den folgenden Konzentrationen zugesetzt: Kit-Ligand (KL) bei 25 ng/ml, Interleukin-3 (IL-3) bei 25 ng/ml, Interleukin-6 (IL-6) bei 50 ng/ml, G-CSF bei 100 ng/ml, GM-CSF bei 100 ng/ml, EPO bei 2 U/ml, Interleukin-7 (IL-7) bei 100 ng/ml (alle Wachstumsfaktoren von R and D Systems, Minneapolis, MN). OB-Protein wurde bei 100 ng/ml, außer anders angegeben, zugesetzt. Rekombinantes OB-Protein wurde wie in Levin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 93, 1726–1730 (1996), beschrieben hergestellt.
  • In Einklang mit seiner Fähigkeit, ein proliferatives Signal in Baf3-Zellen zu transduzieren (siehe obiges Beispiel), stimulierte OB-Protein auf drastische Weise die Vermehrung von flASK-Zellen, die in Suspensionskultur in Gegenwart von Kit-Liganden gezüchtet wurden (10A). Der Zusatz von OB-Protein alleine zu diesen Suspensionskulturen war nicht in der Lage, Überleben der hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) zu bewirken. Wurden zahlreiche verschiedene hämatopoetische Wachstumsfaktoren in Suspensionskulturtests getestet, so schien sich die Hauptsynergie von OB-Protein mit KL, GM-CSF und IL-3 zu zeigen (Tabelle 2). Keine bevorzugte Vermehrung irgendeines bestimmten Stammbaums wurde aus der Cytospinanalyse der resultierenden Kulturen erkannt.
  • TABELLE 2
    Figure 01220001
  • flASK-Zellen wurden isoliert. 20.000 Zellen wurden in Suspensionskultur mit der relevanten Wachstumsfaktorkombination ausplattiert. Die Zellen wurden nach 7 Tagen geerntet und gezählt. Die Zellanzahlen sind × 103 dargestellt. Tests wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt und in zwei unabhängigen Versuchen wiederholt.
  • Methylcellulosetests wurden wie zuvor beschrieben (Zeigler et al., s.o.) durchgeführt. Kurz zusammengefasst wurden Methylcellulosekolonietests unter Verwendung von "komplettem" Methylcellulose- oder Prä-B-Methylcellulosemedium (Stem Cell Technologies, Vancouver, British Columbia, Kanada) mit dem Zusatz von 25 ng/ml KL (R and D Systems, Minneapolis, MN) durchgeführt. Cytospinanalysen der resultierenden Kolonien erfolgten wie zuvor bereits in Zeigler et al. beschrieben.
  • Wenn diese Methylcellulosetests verwendet wurden, erhöhte OB-Protein die Knochenmarkkoloniebildung und erhöhte die Lymphozten- und Erythrozytenkolonie-Bildung drastisch (10B und 10C), was zeigt, dass das OB-Protein auf sehr frühe Zellen des hämatopoetischen Stammbaumes wirken kann. Es ist wichtig, dass die hämatopoetische Aktivität von OB-Protein nicht auf fötale Leberstammzellen, die Maus-Knochenmark-Stammzellpopulation, eingeschränkt war; LinIoSca+ proliferierte auch in Reaktion auf OB-Protein (KL: 5fache Vermehrung, KL und OB-Protein: 10fache Vermehrung).
  • Weitere hämatopoetische Analyse der Rolle des WSX-Rezeptors wurde durch Untersuchen hämatopoetischer Defekte in der db/db-Maus durchgeführt.
  • Diese Defekte wurden durch Messen des proliferativen Potenzials von db/db-homozygotem mutiertem Knochenmark getestet. Unter Bedingungen, die entweder Knochenmark- (Humphries et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 3629–3633 (1981)) oder Lymphozyten- (McNiece et al., J. Immunol. 146, 3785–3790 (1991)) Vermehrung begünstigten, wurde das koloniebildende Potenzial des db/db-Knochenmarks im Vergleich zum Kontroll-Wildtypknochenmark signifikant reduziert (11). Dies wurde besonders deutlich, wenn der Vergleich unter Prä-B-Methylcellulosebedingungen durchgeführt wurde, worin KL und IL-7 verwendet wurden, um Lymphopoese voranzutreiben (McNiece et al., s.o.). Entsprechende Analyse der komplementären Mausmutation ob/ob, die bezüglich der Produktion von OB-Protein defizient ist (Zhang et al., Nature 372, 425–431 (1994)), zeigte auch, dass die lymphoproliferative Kapazität in Abwesenheit eines funktionellen OB-Protein-Signalstoff-Stoffwechsel weges beeinträchtigt ist (11). Diese Reduktion war jedoch weniger als die unter Verwendung von db/db-Knochenmark beobachtete Reduktion.
  • Eine Analyse des Zellprofils des db/db- und Wildtyp-Knochenmarks zeigte signifikante Unterschiede zwischen den beiden auf. Gesamtzellularität des db/db-Knochenmarks war unverändert. Wurden jedoch verschiedene B-Zellpopulationen im db/db-Knochenmark untersucht, so wurden erniedrigte Konzentrationen sowohl für B220+- als auch für B220+/CD43+-Zellen gefunden. B220+-Zellen repräsentierten alle B-Zell-Stammbäume, während bezüglich CD43 erwogen wird, dass es vorzugsweise an den frühesten Zellen der B-Zellhierarchie exprimiert wird (Hardy et al., J. Exp. Med. 173, 1213–1225 (1991)). Keine Unterschiede wurden zwischen den CD4/CD8-Färbungsprofilen der zwei Gruppen beobachtet. Die TER119- (ein roter Zellstammbaum-Marker) Population war im db/db-Knochenmark erhöht (12A).
  • Ein Vergleich von Milzen aus den zwei Gruppen zeigte einen signifikanten Rückgang sowohl des Gewebegewichts als auch der Zellularität der db/db-Mäuse im Vergleich zu den homozygoten Misty-Gray-Kontrollen (0,063 ± 0,009 g vs. 0,037 ± 0,006 g und 1,10 × 107 ± 1 × 104 vs. 4,3 × 106 ± 103 Zellen > p0,05). Diese herabgesetzte Zellularität in der db-Milz spiegelte sich in einer ausgeprägten Reduktion von TER119-Färbung wider (12B). Dieses Resultat scheint die Synergie zu bestätigen, die zwischen OB-Protein und EPO gezeigt wurde, und weist auf eine Rolle des OB-Proteins bei der Regulierung von Erythropoese hin.
  • Die Untersuchung des hämatopoetischen Kompartiments der db/db-Maus in vivo zeigte eine signifikante Reduktion der peripheren Blutlymphozyten im Vergleich zu heterozygoten oder Wildtyp-Kontrollen. Db/db-Mäuse können Blut-Glucosekonzentrationen nicht regulieren und werden in einem Alter von etwa 6–8 Wochen diabetisch; daher wurden Zählungen peripheren Bluts im Laufe der Reifung der Tiere verfolgt.
  • Zur Beschaffung von Blutproben vor dem Versuch und zu den Zeitpunkten während der Studie wurden 40 μl Blut aus der Orbitahöhle entnommen und unverzüglich in 10 ml Verdünnungsmittel verdünnt, um Gerinnung zu unterbinden. Die vollständige Blutzählung aus jeder Blutprobe wurde an einem System-9018-Blutanalysegerät von Serrono Baker innerhalb von 60 min nach Blutabnahme gemessen. Nur der Hälfte der Tiere in jeder Dosierungsgruppe wurde an einem bestimmten Tag Blut abgenommen, wodurch jedem Tier zu wechselnden Zeitpunkten Blut abgenommen wurde. Blut-Glucosekonzentrationen wurden in Blutproben aus der Orbitahöhle unter Verwendung von One-Touch-Glucosemetern und Teststreifen (Johnson & Johnson) gemessen. Die Resultate dieser Versuche sind in den 13A–C gezeigt.
  • Diese Analyse zeigte, dass Lymphozyten aus peripherem Blut zu allen Zeitpunkten im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant reduziert sind und dass sich die periphere Lymphozytenpopulation der db/db-Maus mit dem Alter nicht signifikant ändert. FACS-Analyse zeigte auf, dass die reduzierte Lymphozytenpopulation einen Rückgang sowohl an B220+-Zellen als auch an CD4/CD8-Zellen aufwies. Sowohl Erythrozyten als auch Blutplättchen weisen während der gesamten untersuchten Zeitspanne Wildtyp-Konzentrationen auf. Die Lymphozytenkonzentrationen in peripherem Blut in homozygoten mutierten ob/ob-Mäusen blieben im Vergleich zu Wildtyp-Kontrollen unverändert.
  • Hämatopoetische Analyse der db/db-Maus kann durch das Einsetzen von Diabetes verkompliziert werden. Daher wurde die Auswirkung von hohen Glucosekonzentrationen auf Lymphopoese durch Vergleichen der peripheren Blutprofile und der Blutglucosekonzentrationen in zwei anderen diabetischen Modellen, der heterozygoten Glucokinase-Knockout-Maus (Grupe et al., Cell 83, 69–78 (1995)) und der IFN-α-transgenen Maus (Stewart et al., Science 260, 1942–1946 (1993)), untersucht. Der Vergleich von peripheren Lymphozyten und Blutglucose in db/db-Mäusen, ihre geeigneten Kontrollen und die Modelle mit hoher Glucosekonzentration zeigten keinen Zusammenhang zwischen Blutglucose- und Lymphozytenzählungen (14). Diese Resultate lassen daher darauf schließen, dass die Lymphoiddefekte, die in der db/db-Maus zu beobachten sind, direkt der hämatopoetischen Funktion des OB-Protein-Signalstoff-Stoffwechselweges zuzuschreiben ist.
  • Um die Kapazität des db/db-hämatopoetischen Kompartiments, auf Provokation zu reagieren, zu testen, wurden die db/db-Mäuse und die Kontrollen subletaler Bestrahlung unterzogen. C57BLKS/J-db/db-, C57BLKS/Jm+/db- und C57BLKS/J-+m/+m-Mäuse wurden subletaler Ganzkörperbestrahlung (750 cGy, 190 cGy/min) in Form einer Einzeldosis aus einer 137Cs-Quelle unterzogen. Die Tiere wurden pro Versuchsgruppe verwendet. Die Kinetik der hämatopoetischen Erholung wurde dann durch Beobachten des peripheren Bluts während der Erholungsphase verfolgt. Dieser Versuch veranschaulichte die Unfähigkeit des hämatopoetischen db/db-Systems, das lymphopoetische Kompartiment des peripheren Bluts 35 Tage nach der Bestrahlung vollständig wiederherzustellen. Blutplättchen-Konzentrationen in diesen Mäusen folgten derselben Erhohlungskinetik wie bei den Kontrolltieren, wobei jedoch die Reduktion an Erythrozyten 7–10 Tage hinter den Kontrollen zurückblieb. Diese Erkenntnis kann eventuell die gesteigerte TER-119-Population widerspiegeln, die im Knochenmark der db/db-Mäuse zu finden ist (12A).
  • Materialien und Verfahren
  • Knochenmark, Milzen und peripheres Blut wurden aus den diabetischen Mausstämmen: C57BLKS/J-db/db (Mutante), C57BLKS/Jm+/db (magere heterozygote Kontroll-Wurfgeschwister), C57BLKS/J+m/+m (magere homozygote Misty-Gray-Hülle-Kontroll-Wurfgeschwister) und den adipösen Mausstämmen: C57BL/6J-ob/ob (Mutante) und C57BL/6J-ob/+ (magere Wurfgeschwister-Kontrolle) geerntet. Alle Stämme stammen aus dem Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME. Ein Minimum von fünf Tieren wurde pro Versuchsgruppe verwendet. Femurknochen wurden mit "Hank's balanced salt solution" (HBSS) plus 2% FCS gewaschen, und eine Einzelzellsuspension wurde aus den Knochenmarkzellen hergestellt. Milzen wurden geerntet, und die Milzkapsel wurde aufgebrochen und durch ein Nylonnetz filtriert. Peripheres Blut wurde durch die retroorbitale Höhle in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 10 U/ml Heparin und 1 mmol EDTA gesammelt und wie zuvor beschrieben verarbeitet. Das Knochenmark, Splenozyten und peripheres Blut wurden dann mit den monoklonalen Antikörpern gegen die folgenden Antigene gefärbt: B220/CD45R- (Pan-B-Zelle) FITC-Antimaus, TER-119/Erythrozyten-R-PE-Antimaus, CD4 (L3T4), FITC- Antimaus, CD8 (Ly 3.2), FITC-Antimaus und sIgM (Igh-6b), FITC-Antimaus (alle monoklonalen Antikörper wurden von Pharmigen, San Diego, CA bezogen). Die geeigneten Isotyp-Kontrollen wurden in jeden Versuch eingebunden. Für Methylcellulosetests wurde das Knochenmark aus fünf Tieren pro Gruppe gesammelt, und 100.000 Zellaliquoten aus jeder Gruppe wurden für jeden Testpunkt verwendet.
  • BEISPIEL 11
  • Expression von OB-Immunoadhäsin
  • Unter Verwendung von Protein-Verarbeitungsverfahren wurde das menschliche OB-Protein als eine Fusion mit den Gelenks-, CH2- und CH3-Domänen von IgG1 exprimiert. DNA-Konstrukte, die für die Chimäre des menschlichen OB-Proteins und die IgG1-Fc-Domänen kodieren, wurden mit den Fc-Regionklonen von menschlichem IgG1 hergestellt. Menschliche OB-cDNA wurden durch PCR aus menschlicher Fettzellen-dscDNA (Clontech Buick-Clone cDNA-Produkt) gewonnen. Die Quelle der IgG1-cDNA war das Plasmid pBSSK-CH2CH3. Die Chimäre enthielt die Kodiersequenz des Volllängen-OB-Proteins (Aminosäuren 1–167 in 16) und menschliche IgG1-Sequenzen, beginnend bei Asparaginsäure 216 (wobei Aminosäure 114 als der erste Rest der konstanten Schwerkettenregion angenommen wird) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. Auflage (1987)), die der erste Rest des IgG1-Gelenks nach dem Cysteinrest ist, der in Schwer-Leichtkettenbindung eingebunden ist, und endend mit Resten 441, um die CH2- und CH3-Fc-Domänen von IgG1 einzubinden. Zwischen dem OB-Protein und den IgG1-Kodiersequenzen war ein Insert von Codons für drei Aminosäuren (GlyValThr) vorhanden. Sofern erforderlich, konnte diese kurze Linkersequenz leicht deletiert werden, beispielsweise durch ortsgerichtete Deletionsmutagenese, um eine exakte Verbindung zwischen den Kodiersequenzen des OB-Proteins und der IgG1-Gelenksregion zu schaffen. Die Kodiersequenz des OB-IgG1-Immunoadhäsins wurde für vorübergehende Expression in 293-Zellen unter Verwendung des Calciumphosphatverfahrens (Suva et al., Science 237, 893–896 (1987)) in den pRK5-basierten Vektor pRK5tk-neo, der einen Neomycin-selektierbaren Marker enthält, subkloniert. 293-Zellen wurden in "HAM's: Low Glucose DMEM"-Medium (50:50), das 10% FBS und 2 mM L-Gln enthält, kultiviert.
  • Zur Reinigung von OB-IgG1-Chimären wurden Zellen in serumfreies Produktionsmedium PS24 am Tag nach der Transfektion getauscht, und das Medium wurde nach drei Tagen gesammelt. Das Kulturmedium wurde filtriert.
  • Der filtrierte 293-Zellüberstand (400 ml), der rekombinantes menschliches OB-IgG1 enthielt, wurde 1 mM in Phenylmethylsulfonylfluorid und 2 μg/ml in Aprotinin gemacht. Dieses Material wurde bei 4°C auf eine 1-x-4,5-cm-Protein-A-Agarosesäule (Pierce, Katalog-Nr. 20365), äquilibriert in 100 mM HEPES, pH 8, geladen. Die Durchflussgeschwindigkeit betrugt 75 ml/h. Nachdem die Probe geladen war, wurde die Säule mit Äquilibrierungspuffer gewaschen, bis die A280-Basislinie erreicht war. Das OB-IgG1-Protein wurde mit 3,5 M MgCl2 + 2% Glycerin (nicht gepuffert) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 15 ml/h eluiert. Das Eluat wurde bei gelegentlichem Mischen in 10 ml von 100 mM HEPES, pH 8, gesammelt, um die MgCl2-Konzentration um etwa die Hälfte zu reduzieren und den pH zu erhöhen. Das eluierte Protein wurde dann in phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert, konzentriert, sterilfiltriert und entweder bei 4°C oder gefroren bei –70°C gelagert. Das durch dieses Verfahren hergestellte OB-IgG1-Immunoadhäsin wird mittels SDS-PAGE auf eine Reinheit von über 90% geschätzt.
  • BEISPIEL 12
  • Herstellung von PEG-OB
  • Die PEG-Derivate des menschlichen OB-Proteins wurden durch Reaktion von hOB-Protein, gereinigt durch Umkehrphasenchromatographie, mit einem Succinimidylderivat von PEG-Propionsäure (SPA-PEG) mit einem nominalen Molekulargewicht von 10 kD, das von Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL), erhalten worden war, hergestellt. Nach Reinigung des hOB-Proteins durch Umkehrphasenchromatographie wurde eine etwa 1–2-mg/ml-Lösung des Proteins in 0,1% Trifluoressigsäure und etwa 40% Acetonitril mit 1/3 bis 1/2 Volumen von 0,2 M Boratpuffer verdünnt und der pH auf 8,5 mit NaOH eingestellt. SPA-PEG wurde zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um Molverhältnisse von 1:1 und 1:2 von Protein zu SPA-PEG herzustellen, und das Gemisch wurde 1 h lang bei Raumtemperatur inkubieren gelassen.
  • Nach Reaktion und Reinigung durch Gelelektrophorese oder Ionenaustauschchromatographie wurden die Proben ausführlich gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung dialysiert und durch Filtration durch ein 0,22-μm-Filter sterilisiert. Proben wurden bei 4°C gelagert. Unter diesen Bedingungen bestand das aus der Reaktion mit 1:1-Molverhältnis zwischen Protein und SPA-PEG resultierende PEG-hOB primär aus Molekülen mit einem 10-kD-PEG, gebunden an geringere Mengen von 2 PEG enthaltenden Spezies. Das PEG-hOB aus der Reaktion mit Molverhältnis 1:2 bestand aus etwa gleichen Mengen von 2 und 3 PEGs, gebunden an hOB, wie mittels SDS-Gelelektrophorese bestimmt wurde. In beiden Reaktionen wurden auch geringe Mengen an nicht umgesetztem Protein nachgewiesen. Dieses nicht umgesetzte Protein kann durch Gelfiltration- oder Ionenaustausch-Verfahrensschritte, je nach Bedarf, wirksam entfernt werden. Die PEG-Derivate des menschlichen OB-Proteins können auch im Wesentlichen gemäß dem chemischen Verfahren mit Aldehyd, das in der EP 372.752 , veröffentlicht am 13. Juni 1990, beschrieben wird, hergestellt werden.
  • BEISPIEL 13
  • Maus-Agonistenantikörper
  • Mäuse wurden fünfmal mit 20 μg WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin (siehe Beispiel 2 oben), resuspendiert in MPL-TDM (Monophosphoryllipid A/Trehalosedicorynomycolat; Rabi, Immunochemical Research Inc.), in jeden Pfotenballen immunisiert. 3 Tage nach der letzten Immunisierung wurden Lymphzellen aus der Kniekehle mit Mausmyelomzellen, X63-Ag8.8.653-Zellen, unter Verwendung von 50% Polyethylenglykol wie beschrieben (Laskov et al., Cell. Immunol. 55, 251 (1980)) fusioniert.
  • Das anfängliche Screenen von Hybridomkulturüberständen erfolgte unter Verwendung eines Einfang-ELISA. Für den Einfang-ELISA wurden Mikrotiterplatten (Maxisorb; Nunc, Kamstrup, Dänemark) mit 50 μl/Well von 2 μg/ml Ziegen-Antikörpern, die spezifisch für den Fc-Abschnitt von menschlichem IgG sind (Ziege-Anti-hIgG-Fc; Cappel), in PBS über Nacht bei 4°C beschichtet und mit 2 × BSA 1 h lang bei Raumtemperatur blockiert. Dann wurden 50 μl/Well von 2 μg/ml von WSX-Rezeptor- Immunoadhäsin zu jedem Well 1 h lang zugesetzt. Die verbleibenden Anti-Fc-Bindungsstellen wurden mit PBS, die 3% menschliches Serum und 10 μg/ml CD4-IgG enthielt, 1 h lang blockiert. Die Platten wurden mit 50 μl/Well von 2 μg/ml monoklonalem Anti-WSX-Rezeptor-Antikörper (oder Hybridomkulturüberstand) 1 h lang inkubiert. Die Platten wurden dann mit 50 μl/Well HRP-Ziege-Anti-Maus-IgG inkubiert. Das gebundene Enzym wurde durch den Zusatz des Substrats (OPD) nachgewiesen, und die Platten wurden bei 490 nM mit einem ELISA-Plattenleser gelesen. Zwischen jedem Schritt wurden die Platten in Waschpuffer (PBS, die 0,05% TWEEN 20TM enthielt) gewaschen.
  • Agonistenantikörper wurden unter Verwendung des KIRA-ELISA, der in der WO 95/14930 beschrieben ist, gescreent. Ein chimärer Rezeptor, der die extrazelluläre Domäne des WSX-Rezeptor und die Transmembran- und intrazelluläre Domäne von Rse-Rezeptor (Mark et al., Journal of Biological Chemistry 269(14), 10720–10728 (1994)) mit einer Carboxyl-terminalen Herpes-Simplex-Virus-Glykoprotein-D- (gD-) Markierung umfasst, wurde hergestellt, und dp12.CHO-Zellen wurden hiermit wie in Beispiel 4 der WO 95/14930 beschrieben transformiert.
  • Die WSX/Rse.gD-transformierten dp12.CHO-Zellen wurden in den Wells einer flachbödigen 96-Well-Kulturplatte in 100 μl Medium überimpft (3 × 104 pro Well) und über Nacht bei 37°C in 5% CO2 kultiviert. Am darauf folgenden Morgen wurden die Well-Überstände entfernt, und verschiedene Konzentrationen von gereinigtem mAb wurden zu einzelnen Wells zugesetzt. Die Zellen wurden bei 37°C 30 min lang stimuliert, und die Well-Überstände wurden dekantiert. Um die Zellen zu lysieren und die chimären Rezeptoren löslich zu machen, wurden 100 μl Lysepuffer zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wurde dann auf einem Plattenschüttler (Bellco Instruments, Vineland, NJ) 60 min lang bei Raumtemperatur sanft geschüttelt.
  • Während die Zellen löslich gemacht wurden, wurde eine ELISA-Mikrotiterplatte (Nunc Maxisorp, Inter Med, Dänemark), beschichtet über Nacht bei 4°C mit monoklonalem 5B6-Anti-gD-Antikörper (5,0 μg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, 100 μl/Well), dekantiert und mit 150 μl/Well Block-Buffer, der 2% BSA enthielt, 60 min lang bei Raumtemperatur blockiert. Nach 60 min wurde die Anti-gD-5B6-beschichtete Platte sechsmal mit Waschpuffer (PBS, die 0,05% TWEEN 20TM und 0,01% Thimerosal enthielt) gewaschen.
  • Das Lysat, das löslich gemachtes WSX/Rse.gD aus dem Zellkultur-Mikrotiterwell enthielt, wurde (85 μl/Well) zu dem Anti-gD-5B6-beschichteten und blockierten ELISA-Well transferiert und 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das ungebundene WSX/Rse.gD wurde durch Waschen mit Waschpuffer und 100 μl biotinyliertem 4G10 (Anti-Phosphotyrosin), verdünnt 1:18.000 in Verdünnungspuffer (PBS mit 0,5% BSA, 0,05% Tween-20, 5 mM EDTA und 0,01% Thimerosal), d.h. 56 ng/ml wurden pro Well zugesetzt, entfernt. Nach zweistündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Platte gewaschen, und HRPO-konjugiertes Streptavidin (Zymed Laboratories, S. San Francisco, CA) wurde zu jedem Well zugesetzt. Die Platte wurde 30 min lang bei Raumtemperatur unter sanftem Schütteln inkubiert. Das freie Avidin-Konjugat wurde abgewaschen, und 100 μl frisch zubereitete Substratlösung (Tetramethylbenzidin (TMB); 2-Komponenten-Substratset; Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD) wurden zu jedem Well zugesetzt. Die Reaktion wurde 10 min lang laufen gelassen, wonach die Farbentwicklung durch den Zusatz von 1,0 M H3PO4, 100 μl/Well, gestoppt wurde. Die Absorption bei 450 nm wurde bei einer Bezugswellenlänge von 650 nm (ABS450/650) unter Verwendung eines νmax-Plattenlesers (Molecular Devices, Palo Alto, CA), gesteuert durch einen Macintosh Centris 650 (Apple Computers, Cupertino, CA) und DeltaSoft-Software (BioMetallics, Inc., Princeton, NJ), abgelesen.
  • Vier der 25 monoklonalen Anti-WSX-Rezeptor-Antikörper aktivierten den chimären WSX/Rse-Rezeptor im KIRA-ELISA. Die Antikörper wurden wie folgt benannt: 2D7, 1G4, 1E11 und 1C11.
  • Um zu bestimmen, ob die vier Agonisten-Anti-WSX-Rezeptor-mAbs dieselben oder unterschiedliche Epitope erkannten, wurde ein Konkurrenzbindungs-ELISA gemäß der Beschreibung in Kim et al., J. Immunol. Method 156, 9–17 (1992), unter Verwendung von biotinylierten mAbs (Bio-mAb) durchgeführt. Bio-mAbs wurden unter Ver wendung von N-Hydroxylsuccinimid, wie in Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, E. Harlow & D. Lane (Hrsg.), 341 (1988), beschrieben wird, hergestellt. Mikrotiterwells wurden mit 50 μl Ziege-Anti-hIgG-Fc beschichtet und über Nacht bei 4°C gehalten, mit 2% BSA 1 h lang blockiert und mit 25 μl/Well menschlichem WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin (1 μg/ml) 1 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurde ein Gemisch mit einer vorbestimmten optimalen Konzentration von Bio-mAb, gebunden an einen tausendfachen Überschuss an nicht markiertem mAb, zu jedem Well zugesetzt. Nach einstündiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Platten gewaschen, und die Menge an Bio-mAb wurde durch den Zusatz von HRP-Streptavidin nachgewiesen. Nach Waschen der Platten wurde das gebundene Enzym durch den Zusatz des Substrats o-Phenylendiamindihydrochlorid (OPD) nachgewiesen, und die Platten wurden bei 490 nm mit einem ELISA-Plattenleser gelesen.
  • Die Fähigkeit der mAbs, Maus-WSX-Rezeptor zu erkennen, wurde in einem Einfang-ELISA bestimmt. Maus-WSX-Rezeptor (21), fusioniert an eine gD-Markierung (siehe oben), wurde durch eine Anti-gD- (5B6-) beschichtete ELISA-Platte eingefangen. Nach dem Waschen wurden verschiedene Konzentrationen von biotinylierten mAbs zu jedem Well zugesetzt. Biotinylierte mAbs, gebunden an WSX-Rezeptor-gD, wurden unter Verwendung von HRP-Streptavidin wie zuvor beschrieben nachgewiesen.
  • Um zu bestimmen, ob die Antikörper membrangebundenen Rezeptor banden, wurde FACS-Analyse unter Verwendung von 293-Zellen, transfiziert mit WSX-Rezeptor, durchgeführt. 105 WSX-Rezeptor-transfizierte 293-Zellen wurden in 100 μl PBS plus 1% fötales Kälberserum (FSC) resuspendiert und mit 2D7- oder 1G4-Hybridomzellüberstand 30 min lang auf Eis inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit 100 μl FITC-Ziege-Anti-Maus-IgG 30 min lang bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, in 150 μl PBS plus 1% FCS resuspendiert und mittels FACscan (Becton Dickinson, Mountain View, CA) analysiert. Die Antikörper 2D7 und 1G4 banden sich gemäß der FACS-Analyse an Membran-WSX-Rezeptor.
  • Die Eigenschaften von Agonistenantikörpern 2D7 und 1G4 sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst. TABELLE 2
    Figure 01330001
    • a Für diese mAbs wurde mittels kompetitivem Bindungs-ELISA gezeigt, dass sie verschiedene Epitope erkennen.
    • b Diese Resultate wurden mittels ELISA bestimmt (hWSXR steht für menschlicher WSX-Rezeptor und mWSXR für Maus-WSX-Rezeptor).
    • c Die agonistischen Aktivitäten wurden durch KIRA-ELISA bestimmt.
  • BEISPIEL 14
  • Menschliche Agonistenantikörper
  • Einkettige Fc- (scFv-) Fragmente, die sich an den menschlichen WSX-Rezeptor (hWSXR) binden, wurden aus einer großen menschlichen scFv-Bibliothek (Vaughan et al., Nature Biotechnology 14, 309–314 (1996)) unter Verwendung von Antigen, das auf Immunoröhrchen plattiert war, oder von biotinyliertem Antigen in Verbindung mit Streptavidin-beschichteten magnetischen Perlen (Griffiths et al., EMBO J. 13, 3245–3260 (1994); und Vaughan et al. (1996)) isoliert. Kurz zusammengefasst wurden die Immunoröhrchen, die über Nacht mit 10 μg/ml menschlichem WSX-Rezeptor-Immunoadähsin (siehe Beispiel 2 oben) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) beschichtet wurden, für drei Panning-Durchgänge verwendet. Der humanisierte Antikörper, huMAb4D5-8 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285–4289 (1992)), wurde verwendet, um auf Antikörper, die sich an das Fc des Immunoadhäsins binden, mittels Gegenauswahl zu selektieren. Dies erfolgte unter Verwendung von 1 mg/ml huMAb4D5-8 in Lösung für die Panning-Schritte. Weiters wurde die extrazelluläre Domäne von menschlichem WSX-Rezeptor (gespaltet aus dem WSX- Rezeptor-Immunoadhäsin mit Genenase (Carter et al., Proteins: Structure, Function and Genetics 6, 240–248 (1989))) biotinyliert und für drei Panning-Durchgänge verwendet. Einzelne Phagen wurden nach zwei oder drei Panning-Durchgängen durch Antigen-Bindungs-ELISA charakterisiert (Tabellen 3 und 4). TABELLE 3 Panning mit Immunoröhrchen, beschichtet mit menschlichem WSX-Rezeptor-Immunoadhäsin
    Figure 01340001
    • a Gesamtzahl von 11 verschiedenen identifizierten Klonen
    TABELLE 4 Panning mit biotinyliertem menschlichem WSX-Rezeptor
    Figure 01340002
    • a Gesamtzahl von 7 verschiedenen identifizierten Klonen.
  • Klone, die sich an menschlichen WSX-Rezeptor binden, wurden durch BstNI-Fingerprinting eines PCR-Fragments, das für das scFv kodiert, näher charakterisiert. Eine Gesamtzahl an 18 Klonen wurden identifiziert: 11 aus dem Panning unter Verwendung von Immunoröhrchen und 7 aus dem Panning unter Verwendung von bioti nyliertem Antigen (es gab keine Überlappung zwischen diesen Gruppen). Die DNA für alle 18 Klone wurde sequenziert.
  • Die wie zuvor beschrieben erhaltenen Anti-huWSXR-Klone wurden auf Agonistenaktivität in einem KIRA-ELISA-Test analysiert (siehe oben und 22), zuerst als scFv-Phage und dann als scFv. Der scFv-Phage wurde PEG-gefällt (Carter et al., Mutagenesis: A Practical Approach, M. McPherson (Hrsg.), IRL Press, Oxford, UK, Kapitel 1, 1–25 (1991)) und vor dem Screenen in PBS resuspendiert. Um das scFv herzustellen, wurde DNA aus den Klonen zu 33D3-Zellen transformiert (ein Nicht-Suppressor-Stamm zur Expression von löslichem Protein). Die Zellen wurden auf 2YT/2% Glucose/50 μg pro ml Carbenicillin ausplattiert und bei 37°C über Nacht inkubiert. Eine 5-ml-Kultur (2YTG:2YT, 2% Glucose, 50 μg/ml Carbenicillin) wurde inokuliert und bei 30°C über Nacht wachsen gelassen. Am darauf folgenden Morgen wurde die 5-ml-Kultur in 500 ml 2YTG-Medium verdünnt und bei 30°C wachsen gelassen, bis eine OD550 ~ 0,3 erreicht war. Dann wurde das Medium von 2YTG zu 2YT/50 μg/ml Carbenicillin/2 mM IPTG gewechselt und bei 30°C 4–5 h lang zur scFv-Produktion wachsen gelassen. Die Kultur wurde geerntet, und das Zellpellet wurde bei –20°C eingefroren. Zur Reinigung wurde das Zellpellet in 10 ml Shockate-Puffer (50 mM TrisCHI, pH 8,5, 20% Saccharose, 1 mM EDTA) resuspendiert und bei 4°C 1 h lang gerührt. Die Zelltrümmer wurden zentrifugiert, und der Überstand wurde genommen, um an einer Ni-NTA-Superose-Säule (Qiagen) gereinigt zu werden. MgCl2 wurde zum Überstand bis 5 mM zugesetzt und auf 0,5-ml-Ni-NTA-Superose, gepackt in eine Einwegsäule, geladen. Die Säule wurde dann mit 2 × 5 ml Waschpuffer 1 (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 25 mM Imidazol, pH 8,0) gewaschen, gefolgt von 2 × 5 ml Waschpuffer 2 (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 50 mM Imidazol, pH 8,0). Das scFv wurde dann mit 2,5 ml Elutionspuffer (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0) eluiert. Der eluierte Pool wurde in PBS mit einer NAP5-Säule (Pharmacia) pufferausgetauscht und bei 4°C gelagert.
  • Für die Klone Nr. 3, 4 und 17 wurde erkannt, dass sie Agonistenaktivität als Phage und als scFv aufwiesen (siehe die 23 und 24). Die Sequenzen dieser Agonistenklone sind in 25 gezeigt. Die Aktivität der Antikörper als F(ab')2 im KIRA- ELISA wurde getestet, wobei Klon Nr. 4 und Klon Nr. 17 erhöhte Aktivität als F(ab')2 zeigten. Die Fähigkeit der Antikörper, Maus-WSX-Rezeptor in einem Einfang-ELISA zu binden (siehe Beispiel 13), wurde getestet. Klon Nr. 4 und Klon Nr. 17 banden Maus-WSX-Rezeptor in diesem Test.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01370001
  • Figure 01380001
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Claims (17)

  1. Verfahren zur Steigerung der In-vitro-Proliferation oder -Differenzierung einer Zelle, die den OB-Rezeptor umfasst, umfassend das Aussetzen der Zelle gegenüber einer Menge von OB-Rezeptorliganden, worin der Ligand aus OB-Protein oder einem OB-Agonistenantikörper ausgewählt ist, die zur Steigerung von Proliferation oder Differenzierung der Zelle wirksam ist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der OB-Rezeptor die OB-Rezeptorvariante 13.2 mit einer Aminosäuresequenz gemäß Seq.-ID Nr. 2 ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Zelle eine blutbildende Vorläuferzelle ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Zelle eine CD34+-Zelle ist.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Proliferation der Zelle steigert.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das Differenzierung der Zelle steigert.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der OB-Rezeptorligand OB-Protein ist.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin der OB-Rezeptorligand ein Anti-OB-Rezeptor-Agonistenantikörper ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das Proliferation oder Differenzierung von Knochenmarkblutzellstammbäumen steigert.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das Proliferation oder Differenzierung von Erythrozytenblutzellstammbäumen steigert.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, weiters umfassend das Aussetzen der Zelle gegenüber einem weiteren Cytokin.
  12. Verwendung eines Anti-OB-Rezeptor-Agonistenantikörpers bei der Herstellung einer physiologisch annehmbaren Dosierungsform für therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung eines Säugetiers mit einer Störung, die durch einen Rückgang an Blutzellen charakterisiert ist, wobei diese Behandlung die Steigerung der Proliferation und/oder Differenzierung von primitiven blutbildenden Zellen verursacht, um die Repopulation von reifen Blutzellstammbäumen zu fördern.
  13. Verwendung nach Anspruch 12, worin das Säugetier ein Mensch ist.
  14. Verwendung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die rückläufigen Blutzellkonzentrationen durch Chemo- oder Bestrahlungstherapie oder durch Knochenmarktransplantationstherapie verursacht werden.
  15. Verwendung nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die Störung eine aus: Anämie, Thrombozytopenie, Hypoplasie, Immun- (Autoimmun-) thrombozytopenischer Purpura (ITP) und HIV-induzierter ITP ausgewählte Erkrankung ist.
  16. Verfahren zur Identifikation eines Moleküls, das den OB-Rezeptor aktiviert, umfassend das Aussetzen des OB-Rezeptors gegenüber einem Molekül, von dem angenommen wird, dass es in der Lage ist, den OB-Rezeptor zu aktivieren, und das Messen von Aktivierung des OB-Rezeptors, worin das Verfahren verwendet wird, um auf einen Agonistenantikörper mit der Eigenschaft, Proliferation und/oder Differenzierung einer Zelle, die den OB-Rezeptor an ihrer Oberfläche exprimiert, zu induzieren, zu screenen.
  17. Verfahren zur Identifikation eines Moleküls, das den OB-Rezeptor aktiviert, umfassend das Aussetzen des OB-Rezeptors gegenüber einem Molekül, von dem angenommen wird, das es in der Lage ist, den OB-Rezeptor zu aktivieren, und das Messen von Aktivierung des OB-Rezeptors, worin die Aktivierung durch seine Fähigkeit bestimmt wird, Proliferation von menschlichen CD34+-Blutzellen in Methylcellulose-Medium zu induzieren.
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