ES2244990T3 - Receptor de la proteina ob y composiciones y metodos relacionados. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA CLASE DE RECEPTORES DE PROTEINA, DENOMINADOS AQUI RECEPTORES DE PROTEINA OB O RECEPTORES OB, QUE SE CREE QUE SE UNEN SELECTIVAMENTE A LA PROTEINA OB. SE PROPORCIONA COMO TAL LA FAMILIA DE RECEPTORES OB, ASI COMO NUMEROSOS MIEMBROS DE LA MISMA. ASIMISMO, SE PROPORCIONAN NUMEROSOS ACIDOS NUCLEICOS, VECTORES Y CELULAS HUESPED QUE CONTIENEN DICHOS ACIDOS NUCLEICOS, ACIDOS NUCLEICOS ANTISENTIDO RELACIONADOS, MOLECULAS QUE SE UNEN SELECTIVAMENTE AL RECEPTOR DE LA PROTEINA OB, Y COMPOSICIONES RELACIONADAS DE INTERES, COMO COMPLEJOS RECEPTOR OB/PROTEINA OB Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS. EN OTROS ASPECTOS, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS DE UTILIZACION DE LAS CITADAS COMPOSICIONES, COMO METODOS DIAGNOSTICOS Y/O TERAPEUTICOS, Y METODOS DE PREPARACION DE LIGANDOS DEL RECEPTOR OB.

Description

Receptor de la proteína OB y composiciones y métodos relacionados.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a receptores de la proteína OB, a composiciones relacionadas y a métodos para preparar y usar tales receptores y composiciones relacionadas.

Antecedentes

Aunque la base molecular de la obesidad es desconocida en gran parte, la identificación del "gen OB" y la proteína codificada ("proteína OB") ha esclarecido en parte los mecanismos que utiliza el organismo para regular la deposición de la grasa del organismo. Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994); véase también, the Correction at Nature 374: 479 (1995). La proteína OB es activa in vivo, tanto en los ratones mutantes ob/ob (ratones obesos debido al defecto en la producción del producto del gen OB) así como en ratones normales de tipo salvaje. La actividad biológica se manifiesta, entre otros síntomas, en la pérdida de peso. Véase en general,, Barinaga, "Obese" Protein Slims Mice, Science 269,: 475-476 (1995). Véase PCT Publicación Internacional Número WO 96/05309, "Modulators of Body Weight, Corresponding Nucleic Acids and Proteins, and Diagnostic and Therapeutic Uses Thereof," incorporada aquí a título de referencia.

Los otros efectos biológicos de la proteína OB no están bien caracterizados. Se sabe, por ejemplo, que en ratones mutantes ob/ob, la administración de la proteína OB produce una disminución de los niveles de insulina en suero y de los niveles de glucosa en suero. También se sabe que la administración de la proteína OB produce una reducción de la grasa del cuerpo. Esto se observó tanto ratones mutantes ob/ob, como también en ratones normales no obesos. Pelleymounter et al., Science 269: 540-543 (1995); Halaas et al., Science 269: 543-546 (1995). Véase también, Campfield et al., Science: 546-549 (1995) (La administración periférica y central de dosis de microgramos de proteína OB redujo la ingesta de alimentos y el peso corporal de ratones ob/ob y de ratones obesos sometidos a dieta, pero no en ratones obesos db/db.) En ninguno de estos informes se reportó toxicidad, incluso a las dosis más elevadas.

A pesar de la promesa de la aplicación clínica de la proteína OB, no está plenamente aclarado el modo de acción de la proteína OB in vivo, en parte debido a la ausencia de información sobre el receptor OB. Se detectó una unión de elevada afinidad de la proteína OB en el hipotálamo de rata, indicando según el informe, la ubicación del receptor OB. Stephens et al., Nature 377: 530-532 (1995). El ratón db/db presenta un fenotipo idéntico al del ratón ob/ob, es decir obesidad extrema y diabetes tipo II; se cree que este fenotipo se debe a un receptor OB defectuoso, particularmente desde que los ratones db/db no respondieron a la administración de la proteína OB. Véase Stephens et al., supra.

La identificación del receptor de la proteína OB es clave para determinar la vía de la transducción de señales. Más aún, la identificación del receptor de la proteína OB brindaría una importante aplicación en usos diagnósticos, por ejemplo, para determinar si los individuos se beneficiarían con el tratamiento de proteína OB. Además, el receptor OB puede ser un componente clave en un ensayo para determinar moléculas adicionales que se unen al receptor y dan lugar a la actividad biológica deseada. Además, tal receptor soluble podría aumentar o alterar la efectividad de la proteína OB (o de análogos o derivados de la misma).

Síntesis de la invención

La presente invención se refiere a una nueva clase de receptores de proteínas denominado aquí "receptores de la proteína OB" o "receptores OB", de los cuales se cree que selectivamente se unen a la proteína OB. Como tal, se provee la nueva familia de receptores OB, así como nuevos miembros de tal familia. También se ofrecen ácidos nucleicos, vectores y células huésped que contienen tales ácidos nucleicos, ácidos nucleicos relacionados contrarios al marco de lectura, moléculas que se unen selectivamente al receptor de la proteína OB, y composiciones relacionadas al tema, tales como complejos proteína receptora OB/proteína OB. En otros aspectos, la presente invención se refiere a métodos para usar las composiciones que se indicaron previamente, tales como métodos terapéuticos y/o diagnósticos, y métodos para preparar ligandos del receptor OB.

Descripción detallada

Se provee una nueva familia de receptores OB. Esta familia nueva resulta de la identificación de un fragmento de PCR aislado de una biblioteca de ADNc de células hepáticas humanas. El fragmento de PCR original, a partir del cual se aislaron cebadores, contenía un motivo "WSXWS", común a los receptores de citoquinas. Como se ilustra mediante los ejemplos de trabajo a continuación, al utilizar este fragmento se identificaron cuatro miembros de esta familia de receptores de proteína OB. Estos miembros, que se designan aquí como "A", "B", y "C" y "D" son idénticos en las posiciones de los aminoácidos 1-891 (usando la numeración de la SEC. ID N° 1), pero difieren desde la posición 892 hasta el extremo C-terminal. Varían en longitud en el extremo C-terminal más allá del aminoácido 891, y las diferentes formas parecen tener una diferente distribución tisular.

Mediante el análisis de hidrofobicidad, la secuencia líder parece incluir los aminoácidos (SEC. ID. N°1) 1-21, 1-22, o 1-28. El primer aminoácido de la proteína madura puede ser 22 (F), 23 (N) o 29 (T). Con mayor probabilidad, basándose en el análisis de la expresión en célula eucariotas (expresión en células CHO, véase, por ejemplo 8, a continuación), el primer aminoácido de la proteína madura es 22 (F). El comienzo del dominio transmembrana parece estar ubicado en la posición 840 (A) u 842 (L). El final del dominio transmembranal parece estar ubicado en la posición 862 (1), 863 (S) u 864 (H). Así, basado en las predicciones del análisis de hidrofobicidad, para la unión de la proteína OB, se necesita al menos el dominio extracelular de la proteína madura, desde los aminoácidos 22, 23 ó 29 hasta los aminoácidos 839 (D) u 841 (G). Por lo tanto, la presente clase de proteínas receptoras OB es la que incluye los aminoácidos (según la SEC. ID N° 1):

(a) 1-896;

(b) 22-896;

(c) 23-896;

(d) 29-896,

(e) 22-891;

(f) 23-891;

(g) 29-891;

(h) las secuencias (e) hasta (g) que poseen los aminoácidos C-terminales seleccionados entre:

(i)

posiciones 892-904 del receptor OB-B (SEC. ID N° 3);

(ii)

posiciones 892-958 del receptor OB C (SEC. ID N° 5); y

(i) los aminoácidos de las subpartes b, c, d, e, f, g, h que carecen de secuencia líder, que presentan un residuo metionilo en el extremo N-terminal.

(j) un derivado químicamente modificado de cualquiera de las subpartes (a) hasta (h).

Los dominios funcionales del receptor OB pueden predecirse utilizando la información incluida en Bazan et al., PNAS-USA 87: 6934-6938 (1990) (incorporado aquí a título de referencia). Para el presente receptor OB, existen dos dominios de hematopoyetina, una región de arrollamiento al azar, el dominio transmembrana y el dominio intracelular. La ubicación general puede ilustrarse del siguiente modo:

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Utilizando la información provista por Bazán, supra, pueden predecirse los dominios, con esencialmente un error de aproximadamente más o menos tres pares de bases (aplicado a toda ubicación de aminoácido especificada a los efectos de identificar los dominios previstos por Bazan). Las ubicaciones exactas pueden determinarse empíricamente por métodos conocidos en la técnica, tal como preparar y expresar ADNs recombinantes modificados. Las características estructurales se consideran importantes para mantener la integridad estructural de la molécula, y por ende, en la medida que esa estructura es importante para la función, así como para las características funcionales.

Se supone que los dominios de hematopoyetina (H1 y H2) presentan dos repeticiones de fibronectina tipo 3 cada uno, un juego de residuos de cisteína apareados cada uno (de los que se cree que forman un puente de disulfuro), y una "caja WSXWS" (referido a la abreviatura de aminoácidos de una sola letra, siendo "X" cualquier aminoácido). Los dominios de fibrinectina tipo 3 pueden identificarse mediante la ubicación de una prolina doble ("PP"), que marca el comienzo de la segunda repetición de fibronectina tipo 3; el inicio real de tal segunda repetición de fibronectina tipo 3 es probable que comience aproximadamente 3 aminoácidos corriente arriba de tal prolina doble.

El primer dominio de hematopoyetina puede comenzar en el aminoácido 123 (usando la numeración según SEC. ID N° 1, por ejemplo), que es un residuo de isoleucina (I). El último aminoácido del dominio de hematopoyetina puede ser el aminoácido 339, que es un residuo lisina (K). Las dos repeticiones de fibronectina tipo 3 pueden ubicarse aproximadamente en los aminoácidos 123 hasta 235 y 236 hasta 339. Allí existe un par individual de residuos de cisteína, que pueden formar un puente disulfuro, ubicado en posición 131 y posición 142. La "caja WSXWS" se ubica en posición 319 hasta 323.

El segundo dominio de hematopoyetina puede comenzar en posición 428, que es una isoleucina (1) y finalizar en posición 642 que es una glicina (G). Las repeticiones de los pares de fibronectina tipo 3 se ubican en aproximadamente la posición 428 hasta posición 535 y alrededor de la posición 536 hasta alrededor de la posición 642. Un par de cisteínas se ubica en posición 436 y posición 447, y el segundo par se ubica en posición 473 y 488. La "caja WSXWS" se ubica en posición 622-626.

Entre el primero y el segundo dominio de hematopoyetina (aminoácidos 339-428, aproximadamente) se encuentra una región de importancia funcional desconocida.

La región de arrollamiento al azar ("RC" entre el dominio H2 y el dominio transmembrana, "TM") puede comenzar en el aminoácido que sigue al final del segundo dominio de hematopoyetina, y puede finalizar al iniciarse el dominio transmembrana. Esto es factible desde alrededor del aminoácido 642 hasta el aminoácido 839 ó 841 (con el inicio del dominio transmembrana en posición 840 (A) o 842 (L)). El dominio intracelular ("IC") puede comenzar en posición 861 (L), 862 (I), 863 (S) o 864 (H).

El dominio intracelular ("IC") incluye tres regiones, o "cajas", de las que se cree que participan en la transducción de señales (dos cajas "JAK" y una sola caja "STAT", "Caja 1", "Caja 2" y "Caja 3"). Con respecto a la numeración de las posiciones del aminoácido de la forma "D" del receptor OB (SEC. ID N° 7, a continuación), la caja 1 se ubica en el aminoácido 871 (F) hasta 878 (P). La Caja 2 se ubica aproximadamente en el aminoácido número 921 (I) hasta 931 (K). La Caja 3 en la forma "D" se ubica aproximadamente en la posición 1141 hasta 1144 (aminoácidos YMPQ, como la caja "STAT" típicamente es una región conservada de "YXXQ" donde "X" se refiere a cualquier aminoácido). Se cree que el dominio intracelular es responsable de la transducción de señales. Una forma posible de acción es a través de la fosforilación de diferentes residuos. Véase Ihle et al., Cell 84: 331-334 (1996) (artículo de revisión, incorporado aquí a título de referencia.)

Una forma posible de acción es aquella en la cual al unirse un ligandos (en este caso la unión de la proteína OB), el receptor OB se dimeriza con otro receptor. Una quinasa ("JAK") se une con la caja 1, y se fosforila. (La JAK ya puede estar unida previo a la dimerización.) Asimismo, "STATS" se une a la caja 3 y es fosforilada en una tirosina específica. Se cree que esta fosforilación resulta, probablemente en forma indirecta, en la producción de una proteína de unión al ADN, que resulta en la trascripción alterada del ADN, y así en la expresión alterada. Como puede verse más adelante en el Ejemplo 6, una medida de la capacidad de un receptor OB para transducir una señal es el grado de fosforilación de las moléculas JAK/STAT.

La región del extremo C-terminal es intracelular (del receptor OB unido a células). Las diferencias en el extremo C-terminal entre miembros de la presente familia de receptores OB pueden dar lugar a diferencias en la transducción de señales entre las especies. Así, los presentes receptores OB incluyen al menos el dominio extracelular, que es importante para la unión del ligando de la proteína OB. Los ácidos nucleicos que codifican los presentes receptores OB, vectores, y células huésped también son provistos aquí.

El dominio extracelular puede estar modificado y continuar manteniendo la función de la unión de ligandos, particularmente por una de las siguientes modificaciones: (a) la región de arrollamiento al azar (como se indicó previamente, que se produce corriente abajo del segundo dominio hematopoyético hasta el comienzo del dominio transmembrana) puede estar suprimida (esto puede ser aproximadamente en las posiciones 642 hasta 839 ó 841); (b) la caja "WSXWS" puede estar modificada por (i) la sustitución de la primera serina con otro aminoácido, particularmente conservado en términos de hidrofobicidad y/o carga, tal como una glicina; (ii) la última serina puede estar sustituida con otro aminoácido, tal como una tironina; (iii) el primer triptofano puede estar sustituido con otro aminoácido, por ejemplo una tirosina.

El ADN genómico humano que codifica los receptores de la proteína OB también es provisto aquí. El ADN genómico fue localizado en el cromosoma humano 1P31, que se cree corresponde al cromosoma 4 del ratón, la ubicación del sitio db del ratón.

El análisis de distribución tisular demuestra que la presencia de ácidos nucleicos del receptor OB es bastante ubicua, y se nota particularmente en el hígado. También se observa en ovario y corazón; y en menor medida, en intestino delgado, pulmón, músculo esquelético, riñón, y en menor medida aún, en bazo, timo, próstata, testículos, placenta y páncreas (Ejemplo 2, más adelante). También pueden existir una o más formas del receptor OB en suero, tal como el receptor OB soluble, que puede complejarse con una o más formas de la proteína OB.

Secuencias de Aminoácidos y Composiciones

Según la presente invención, se proveen nuevos receptores de proteína OB y secuencias de ADN que codifican todos o parte de tales receptores OB. La presente invención provee productos polipeptídicos purificados y aislados que poseen parte o toda la conformación estructural primaria (es decir, secuencia continua de residuos de aminoácidoa) y una o más de las propiedades biológicas (p.ej., propiedades inmunológicas y actividad biológica in vitro) y propiedades físicas (p.ej., peso molecular) del receptor OB de mamíferos natural, incluyendo variantes alélicas del mismo. El término "purificado y aislado" significa aquí sustancialmente libre de sustancias no deseadas, de modo que los presente polipéptidos son útiles para el propósito requerido. Por ejemplo, se puede tener un receptor OB recombinante humano sustancialmente libre de proteínas humanas o agentes patológicos. Estos polipéptidos también se caracterizan porque son un producto de células de mamíferos, o el producto de procedimientos de síntesis química o de expresión del huésped procariota o eucariota (p. ej. mediante células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, insectos y de mamíferos en cultivo) de secuencias de ADN exógeno obtenidas por clonación genómica o de ADNc o mediante síntesis de genes. Los productos de expresión en células huésped típicas de levadura (p.ej., Saccharomyces cerevisiae), insectos o procariotas (p.ej. E. coli) están libres de asociación con proteínas humanas de cualquier tipo. Los productos de la expresión en células de vertebrados (p.ej., mamíferos no humanos (p.ej. COS o CHO) y de aves) están libres de asociaciones con proteínas humanas de cualquier tipo. Dependiendo del huésped empleado y de otros factores, los polipéptidos de la invención pueden ser glicosilados con carbohidratos de mamíferos u otros eucariotas o pueden ser no glicosilados. Se puede modificar el ácido nucleico, de modo que se incluyan los sitios de glicosilación en el polipétido resultante. Se puede elegir desglicosilar total o parcialmente un polipéptido glicosilado. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo inicial del aminoácido metionina (en posición -1 respecto del primer residuo de aminoácido del polipéptido maduro).

Además de las formas alélicas naturales del receptor OB, la presente invención también describe otros productos del receptor OB, tales como análogos del polipétido receptor OB y fragmentos del receptor OB. Siguiendo los procedimientos de la solicitud publicada por Alton et al. (WO 83/04053), indicada anteriormente, se puede diseñar y producir genes que codifican para la expresión microbiana de polipéptidos que presentan conformaciones primarias que difieren de aquellas especificadas aquí, respecto de la identidad o la ubicación de uno o más residuos (p.ej., sustituciones, adiciones o supresiones terminales o intermedias). De modo alternativo, la modificación del ADNc y los genes genómicos puede lograrse perfectamente aplicando técnicas bien conocidas de mutagénesis dirigidas al sitio y emplearse para generar análogos y derivados del receptor OB. Tales productos compartirían al menos una de las propiedades biológicas del receptor OB de mamíferos, pero pueden diferir en otras. Como ejemplos, los productos proyectados incluyen aquellos que son acortados, p.ej., por supresiones; o aquellos que son más estables frente a la hidrólisis (y así, pueden tener efectos más pronunciados o de mayor duración que los de existencia natural); o aquellos que fueron alterados para suprimir uno o más sitios potenciales para la glicosilación (de lo que puede resultar en mayor actividad para los productos producidos por la levadura); o en los que se suprimieron o reemplazaron uno o más residuos de cisteína, por p.ej., por residuos de alanina o serina y pueden aislarse potencialmente con mayor facilidad en forma activa a partir de sistemas microbianos, o los que presentan uno o más residuos de tirosina reemplazados por fenilalanina; o los que presentan una composición en lisina alterada (tal como aquellos preparados a los fines de la derivatización). Se describen aquellos polipéptidos con sustituciones de aminoácidos que son "conservativas" según la acidez, la carga, hidrofobicidad, polaridad, el tamaño o cualquier otra característica conocida por aquellos especialistas en la técnica. Véase, en general, Creighton, Proteins, W.H. Freeman y Company, N.Y., (1984) 498 pp. plus index, passim. Se pueden introducir cambios en los aminoácidos seleccionados, en tanto tales cambios conserven el plegamiento o actividad global de la proteína, (véase Tabla 1, a continuación). También pueden estar presentes pequeñas extensiones del extremo amino-terminal, tal como un residuo de metionina amino-terminal, un pequeño péptido conector de hasta aproximadamente 20-25 residuos, o una pequeña extensión que facilita la purificación, tal como un tramo de poli-histidina, un epítope antigénico o un dominio de enlace. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2.: 95-107, 1991.

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TABLA 1 Sustituciones conservativas de aminoácidos

Básicos:	arginina
	lisina
	histidina
Ácidos:	ácido glutámico
	ácido aspártico
Polares:	glutamina
	asparagina
Hidrofóbicos:	leucina
	isoleucina
	valina
Aromática:	fenilalanina
	triptofano
	tirosina

TABLA 1 (continuación)

Pequeños:	glicina
	alanina
	serina
	tironina
	metionina

También se describen fragmentos de polipéptidos que duplican sólo una parte de la secuencia de aminoácidos continua o las conformaciones secundarias dentro del receptor OB, fragmentos que pueden presentar una actividad del receptor OB de mamíferos (particularmente de seres humanos) (p.ej. la actividad inmunológica) y no otras (p. ej., actividad de unión a la proteína OB).

Pueden aplicarse a fragmentos del receptor OB y a análogos de polipéptidos, los informes de la actividad inmunológica de péptidos sintéticos que sustancialmente duplican la extensión de la secuencia de aminoácidos en proteínas de existencia natural, glicoproteínas y nucleoproteínas. Más específicamente, los polipéptidos de peso molecular relativamente bajo, evidenciaron participar en reacciones inmunes que son similares en su duración y extensión a las reacciones inmunes de proteínas fisiológicamente significativas, tales como antígenos virales, hormonas polipeptídicas y similares. Se incluye en las reacciones inmunes de tales polipétidos, la provocación de la formación de anticuerpos específicos en animales inmunológicamente activos. Véase, por ejemplo, Lerner et al., Cell 22: 309-310 (1891); Ross et al., Nature 294: 654-656 (1891); Walter et al., PNAS-USA 21: 5197-5200 (1980); Lerner et al., PNAS-USA, 78: 3403-3407 (1891); Walter et al., PNAS-USA 78: 4882-4886 (1891); Wong et al., PNAS-USA 79: 5322-5326 (1982); Baron et al., Cell, 28.: 395-404 (1982); Dressman et al., Nature 295: 185-160 (1982); y Lerner, Scientific American 248: 66-74 (1983). Véase, también, Kaiser et al. Science 223: 249-255 (1984) referente a actividades biológicas e inmunológicas de péptidos sintéticos que comparten aproximadamente las estructuras secundarias de las hormonas peptídicas, pero pueden no compartir su conformación estructural primaria. La presente invención también describe esa clase polipéptidos codificados por porciones del ADN complementarias a la hebra que codifica proteínas del ADNc humano o las secuencias de ADN genómico del receptor OB, o sea "proteínas invertidas complementarias" como fueron descriptas por Tramontano et al.. Nucleic Acid Res. 12: 5049-5059 (1984). Los polipéptidos o análogos de los mismos también pueden incluir uno o más análogos de aminoácidos, tales como péptidomiméticos.

Así, la presente clase de receptores de la proteína OB es aquella que posee los aminoácidos (según la SEC. ID N° 1):

(a) 1-896;

(b) 22-896;

(c) 23-896;

(d) 29-896

(e) 22-891;

(f) 23-891;

(g) 29-891;

(h) las secuencias (e) hasta (g) que poseen la secuencia de aminoácidos C-terminal comenzando en la posición 892 del receptor OB B (SEC. ID N° 3) o C (SEC.. ID. N° 5);

(i) los aminoácidos de las subpartes b, c, d, e, f, g y h, que carecen de una secuencia líder, que presentan un residuo metionilo N-terminal, y

(j) un derivado químicamente modificado de cualquiera de las subpartes (a) hasta (h).

Como se indicó previamente, se pueden preparar receptores solubles por eliminación de las regiones transmembrana e intracelular. Los ejemplos de tales receptores solubles incluyen aquellos expuestos en SEC. ID N° 10 y 13. También se describe aquí lo que se supone una forma nativa secretada de un receptor OB soluble humano. Esta forma de receptores de proteína OB presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada entre (según SEC. ID N° 13):

(a) los aminoácidos 1-804;

(b) los aminoácidos 22-804;

(c) los aminoácidos 23-804;

(d) los aminoácidos 29-804; y

(e) los aminoácidos de las subpartes (b), (c) o (d), que poseen un residuo metionilo N-terminal.

Además, dado que la región del extremo C-terminal de los polipéptidos anteriores difiere en la posición 892 (respecto de la SEC. ID Nos. 1, 3, 5, 7 y 13), sería deseable preparar sólo los polipéptidos que son diferentes:

(a) aquellos que sólo tienen los aminoácidos 892-896 de SEC. ID N° 1;

(b) aquellos que sólo tienen los aminoácidos 892-904 de SEC. ID N° 3;

(c) aquellos que sólo tienen los aminoácidos 892-958 de SEC. ID N° 5;

(d) aquellos que sólo tienen los aminoácidos 892-1165 de SEC. ID N° 7; y,

(e) aquellos que sólo tienen los aminoácidos 799-804 de SEC. ID N° 13.

Los polipéptidos anteriores que presentan un dominio extracelular pueden modificarse, como se indicó previamente, y aún mantener la función de unión de ligandos. Tal modificación puede incluir una o más de las siguientes:

(a) la región de arrollamiento al azar (como se indicó previamente, que se produce corriente abajo del segundo dominio hematopoyético hasta el comienzo del dominio transmembrana) puede suprimirse (ello puede ser aproximadamente en las posiciones 642 hasta 839 ó 841);

(b) la caja "WSXWS" puede modificarse mediante (i) la sustitución de la primera serina con otro aminoácido, particularmente conservado en términos de hidrofobicidad y/o carga, tal como una glicina; (ii) la última serina puede sustituirse por otro aminoácido, tal como una tironina; (iii) el primer triptofano puede sustituirse por otro aminoácido, por ejemplo, una tirosina.

Así, los presente polipéptidos incluyen (según la numeración de SEC. ID N° 7):

(a) 1-896;

(b) 22-896;

(c) 23-896;

(d) 29-896

(e) 22-891;

(f) 23-89;

(g) 29-891;

(h) las secuencias (e) hasta (g), que tienen los aminoácidos del extremo C-terminal seleccionados de los aminoácidos 892-904 del extremo C-terminal del receptor OB B (SEC. ID N° 3), o los aminoácidos 892-958 del receptor OB C (SEC. ID N° 5);

(i) los aminoácidos de las subpartes b, c, d, e, f, g y h, que carecen de una secuencia líder y que tienen un residuo metionilo de extremo N-terminal; y

(j) los aminoácidos de las subpartes (a) hasta (i) anteriores, que poseen al menos una de las siguientes modificaciones:

(i)

supresión total o parcial de la secuencia de la región de arrollamiento al azar seleccionada de

(a)

640 hasta 839 (usando la numeración según la SEC. ID N° 1);

(b)

641 hasta 839;

(c)

642 hasta 839;

(d)

640 hasta 841;

(e)

641 hasta 841; y

(f)

642 hasta 841;

y

(ii)

modificación de una secuencia "WSXWS" que es:

(a)

una sustitución de la primera serina por otro aminoácido, particularmente conservado en términos de hidrofobicidad y/o carga, tal como una glicina;

(b)

sustitución de la última serina por otro aminoácido, tal como una treonina; y

(c)

sustitución del primer triptofano por otro aminoácido, por ejemplo una tirosina.

Se puede modificar el receptor OB para crear una molécula de fusión con otra secuencia peptídica. Por ejemplo, si se desea "marcar" el receptor OB con un péptido inmunogénico, se puede construir un ADN que resultaría en tal proteína de fusión. La marca puede ser en el extremo N-terminal. Asimismo, dado que es evidente que el extremo C-terminal no es necesario para la actividad de unión de ligandos, se puede modificar químicamente el extremo C-terminal de, por ejemplo, un receptor OB soluble. Se puede desear, por ejemplo, una preparación, donde se unan una o más moléculas de polímero tal como son moléculas de polietilenglicol. Así, otro aspecto de la presente invención son receptores de proteína OB químicamente modificados (también descritos en mayor detalle infra).

Un ejemplo de tal "marca" se provee aquí usando el extremo C-terminal de un receptor OB soluble recombinante. La SEC. ID N° 12 suministra una versión "Marca FLAG" de un receptor OB soluble tal (se provee la secuencia del ácido nucleico, que puede ser transcripta para preparar el polipéptido). Tal "Marca FLAG" también puede unirse al extremo N-terminal u otra región de una proteína receptora OB. Este tipo de "tagging" es útil para unir la proteína utilizando reactivos, tales como anticuerpos, que son selectivos para tal marca. Tal unión puede ser para detectar la ubicación o la cantidad de proteína, o para procesos de captura de proteínas donde, por ejemplo, se utiliza una columna de afinidad para unirse a la marca, y así a la proteína deseada. Otros tipos de etiquetas detectables, tales como radioisótopos, emisión de luz (p.ej., compuestos fluorescentes o fosforescentes), escindible enzimáticamente, anticuerpo detectable (o una modificación del mismo), u otras sustancias pueden usarse para tal etiquetado de las presentes proteínas. La detección de la proteína mediante el empleo de etiquetas puede ser útil para identificar la presencia o la cantidad de receptores de proteína OB o un compuesto que contiene tal proteína (p.ej., proteína OB complejada con el receptor OB). Además, tal proteína marcada puede ser útil para distinguir una proteína receptora OB exógena de la forma endógena.

Ácidos nucleicos

Las nuevas secuencias de ácido nucleico de la invención incluye secuencias útiles para asegurar la expresión en células huésped procariotas o eucariotas de productos polipeptídicos que poseen al menos una parte de la conformación estructural primaria y una o más de las propiedades biológicas del receptor OB humano recombinante. Los ácidos nucleicos pueden purificarse y aislarse, de modo que la región codificadora deseada es útil para producir los presentes polipéptidos, por ejemplo, o con fines diagnósticos, como se describe en mayor detalle más adelante. Las secuencias de ADN de la invención incluyen específicamente: (a) cualquiera de la secuencias de ADN indicadas en la SEC. ID N° 2, 4, 6 (y hebras complementarias); (b) una secuencia de ADN que hibridiza (en condiciones de hibridación reveladas en la sección de selección de bibliotecas de ADNc a continuación, usando el fragmento de 300 pb de PCR como se describe para hibridizar selectivamente con un ADNc que codifica una proteína receptora OB en una biblioteca de ADNc de hígado humano, o condiciones equivalentes o en condiciones más rigurosas) con la secuencia de ADN en la subparte (a) o con fragmentos de los mismos; y (c) una secuencia de ADN que, de no ser por la degeneración del código genético, hibridizaria con la secuencia de ADN de la subparte (a). Están comprendidas específicamente en las partes (b) y (c) las secuencias genómicas de ADN que codifican formas alélicas variantes del receptor OB humano y/o que codifican el receptor OB de otras especies de mamíferos, y secuencias manufacturados de ADN que codifican el receptor OB, fragmentos del receptor OB, y análogos del receptor OB, cuyas secuencias de ADN pueden incorporar codones para facilitar la trascripción y traducción de ARN mensajero en huéspedes microbianos. Tales secuencias manufacturadas pueden ser construidas según los métodos de Alton et al., solicitud PCT WO 83/04053 publicada.

El ADN genómico, tal como el de la SEC. ID N° 9, que codifica los presentes receptores OB, puede contener bases no codificadores adicionales o intrones, y tales ADNs genómicos pueden obtenerse mediante hibridación total o parcial del ADNc, como se muestra en las SEC. ID Nos. 2, 4, 6, 8, 11 y 14 a una fuente de ADN genómico, tal como una biblioteca de ADN humano genómico. Tal ADN genómico codificará receptores OB funcionales polipeptídicos; de todos modos, el uso de ADNcs puede ser más factible, dado que desde que sólo está implicada la región codificadora, se facilita la manipulación recombinante. La ubicación intrón/exón del ADN genómico se expone en la SEC. ID N° 9, infra.

Las secuencias de ácido nucleico incluyen la incorporación de codones que aumentan la expresión mediante huéspedes no mamíferos seleccionados; la provisión de sitios para escisión mediante enzimas endonucleasas de restricción; y la provisión de secuencias adicionales de ADN iniciales, terminales o intermedias que facilitan la construcción de vectores de clonación y/o de expresión.

La presente invención también describe secuencias de ADN que codifican para análogos de polipéptidos o derivados del receptor OB que difieren de las formas naturales en los términos descritos anteriormente. La secuencia de ADN líder puede sustituirse por otra secuencia líder para facilitar la expresión o para otros fines.

Asimismo, pueden prepararse ácidos nucleicos en el sentido contrario al marco de lectura contra los presentes ADNs. Tales ácidos nucleicos en sentido contrario al marco de lectura puede ser útiles para modular los efectos de receptores de la proteína OB in vivo. Por ejemplo, pueden prepararse ácido nucleicos en el sentido contrario al marco de lectura que imposibilita efectivamente la capacidad de una célula de producir el receptor OB mediante la unión con el ácido nucleico que codifica tal receptor OB.

Las secuencias de ADN de la invención también son materiales adecuados para usarse como sondas marcadas para aislar ADN humano genómico que codifica el receptor OB, como se mencionó anteriormente, y proteínas relacionadas, así como ADNc y secuencias genómicas de ADN de otras especies de mamíferos. Las secuencias de ADN también pueden ser útiles en diferentes métodos alternativos de síntesis de proteínas (p.ej., en células de insectos) o, como se describe infra, para el tratamiento genético en seres humanos y otros mamíferos. Se espera que las secuencias de ADN de la invención sean útiles para desarrollar especies transgénicas de mamíferos, que puedan usarse como "huéspedes" eucariotas para la producción de receptores OB y productos de receptores OB en cantidades mayores. Véase, en general, Palmiter et al., Science 222: 809-814 (1983).

Vectores y células huésped

Según otro aspecto de la presente invención, las secuencias de ADN que se describen que codifican los polipéptidos del receptor OB son valiosas para la información que suministran referente a la secuencia de aminoácidos de la proteína de mamíferos, que hasta ahora no ha estado disponible. Dicho de otro modo, las secuencias de ADN provistas por la invención son útiles para generar nuevos y útiles plásmidos de vectores ADN virales y circulares, nuevas y útiles células huésped procariotas y eucariotas transformadas y transfectadas (incluyendo células bacterianas, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos crecidas en cultivo), y nuevos y útiles métodos para el crecimiento cultivado de tales células huésped capaces de expresar el receptor OB y sus productos relacionados.

El ADN aquí provisto (o los correspondientes ARNs) también pueden usarse para la terapia génica, por ejemplo el tratamiento de afecciones caracterizadas por la sobre-expresión de la proteína OB, tales como anorexia o caquexia. Alternativamente, la terapia génica puede aplicarse en los casos en los cuales un individuo presenta una afección caracterizada por la capacidad defectuosa de los receptores de la proteína OB de unirse o retener la unión con la proteína OB. Habitualmente, los vectores adecuados para la terapia génica (tales como vectores retrovirales o adenovirales modificados a los efectos de la terapia génica, de pureza adecuada y aceptables para uso farmacéutico) pueden ser administrados para aplicar al pulmón, por ejemplo. Tales vectores pueden incorporar un ácido nucleico que codifica los presentes polipéptidos para la expresión en una ubicación deseada. La terapia génica puede incluir más de un gen para una proteína deseada o para diferentes proteínas deseadas.

Alternativamente, pueden no usarse vectores de modo de facilitar la presencia relativamente estable en el huésped. Por ejemplo, la recombinación homóloga de un ADN provista aquí de una región de control de trascripción o traducción adecuada puede facilitar la integración en una expresión a partir de un genoma huésped. (Ello puede realizarse a los efectos de la producción, así como, p.ej., en la patente norteamericana N° 5.272.071 y WO 91/09955.) El ácido nucleico puede incluirse en un vehículo aceptable para uso farmacéutico para facilitar la absorción celular, tal como un vehículo en solución de lípidos (p.ej., un lípido con carga), un liposoma o un vehículo polipeptídico (p.ej., polilisina). Un artículo de revisión de terapia génica es Verma, Scientific American, November 1990, páginas 68-84, que se incorpora aquí a título de referencia.

Así, la presente invención suministra a una población de células que expresan un receptor OB de la presente familia de receptores OB. Tales células son adecuadas para el transplante o el implante en un individuo con fines terapéuticos. Por ejemplo, pueden prepararse una población de células para sobre-expresar el receptor OB (tal como uno identificado en las Secuencias ID's o indicado de otro modo aquí), o para expresar una forma deseada del receptor OB, tal como una que es particularmente sensible a la proteína OB (es decir, una forma que tiene la capacidad deseada para la transducción de señales). Se puede entonces implantar tales células en un individuo para aumentar la sensibilidad del individuo a la proteína OB. Tales células pueden ser, por ejemplo, células hepáticas, células de médula ósea o células derivadas del cordón umbilical. Alternativamente, puede existir el deseo de usar células circulatorias de sobre-expresión, tales como células progenitoras sanguíneas, células T u otras células sanguíneas. Para los seres humanos, deben usarse células humanas. Las células pueden encontrarse en forma de tejido. Tales células pueden ser cultivadas previo al transplante o al implante. Tal sobre-expresión del receptor OB, o la expresión de formas particularmente sensibles del receptor OB pueden lograrse, por ejemplo, alterando el mecanismo regulatorio para la expresión del receptor OB, tal como usando técnicas de recombinación homólogas, como se describieron supra. Así, se provee una población de células huésped modificadas en forma tal que se aumente la expresión del ADN endógeno del receptor OB.

Las células a ser transferidas al recipiente pueden cultivarse usando uno o más factores que afecten el crecimiento o la proliferación de tales células, si es apropiado. Pueden usarse factores hematopoyéticos para cultivas células hematopoyéticas. Tales factores incluyen G-CSF, EPO, MGDF, SCF, ligando Flt-3, interleuquinas (p.ej., IL1-IL13), GM-CSF, LIF y análogos y derivados de los mismos que están a disposición del especialista en la técnica.

También pueden usarse células nerviosas, tales como neuronas o glias, y éstas pueden cultivarse con factores neurotróficos, tal como BDNF, CNTF, GDNF, NT3 u otros.

Puede haber una terapia co-génica incluyendo el transplante de células que expresan más de una proteína deseada. Por ejemplo, pueden usarse los receptores de proteína OB que expresan células en conjunto, simultáneamente o in serriatim con células que expresan la proteína OB.

Para las dosificaciones de la terapia génica, generalmente se usarán entre una copia y muchos miles de copias del presente ácido nucleico por célula, dependiendo del vector, del sistema de expresión, la edad, el peso y el estado del individuo receptor y otros factores que serán obvios para aquellos expertos en la técnica. El suministro celular de tal proteína puede diseñarse para durar un período de tiempo seleccionado, tal como un período de días, semanas, meses o años. Al final del período de tiempo efectivo, el receptor de tales células transformadas, puede recibir otra "dosis" (p.ej., trasplante de células). Las células puede ser seleccionadas por su tiempo de vida, su período de tiempo de expresión de la proteína deseada, o su capacidad de ser reaisladas de un individuo (es decir, de células sanguíneas, puede usarse leucaforesis para reparar células transformadas usando marcadores presentes en la superficie celular). Los vectores pueden diseñarse de modo similar, usando por ejemplo, virus que presentan un período de expresión conocido de ADNs allí contenidos.

Las células o vectores deseados pueden almacenarse usando ténicas, tales como congelado, disponibles para los expertos en la técnica.

Así, la presente invención también describe un método para administrar receptores de proteína OB a un individuo, donde la fuente de dichos receptores de proteína OB se selecciona de (i) una población de células que expresan receptores de proteína OB y (ii) una población de vectores que expresan receptores de proteína OB. Dichos receptores de proteína OB pueden seleccionarse entre aquellos que se describen aquí. Dichos vectores pueden ser vectores de virus capaces de infectar células humanas. Dichas células pueden seleccionarse entre tejidos o células individuales. Dichas células individuales pueden seleccionarse entre adipocitos, fibroblastos, células de médula ósea, células progenitoras sanguíneas periféricas, glóbulos rojos y glóbulas blancos, incluyendo células T y células nerviosas. Dicha población de células o vectores pueden ser co-administrados con una población de células o vectores que expresan la proteína OB u otra proteína deseada. Dichas células o vectores pueden almacenarse para ser usados en un individuo. El almacenamiento puede realizarse por congelamiento.

Complejos

Además del receptor de proteína OB descripto aquí, se pueden preparar complejos de receptor de proteína OB y proteína OB, análogos o derivados.

La proteína OB puede seleccionarse de aquellas que se describen en la publicación PCT WO 96/05309. La Figura 3 de esa publicación (SEC. ID N° 4, como se cita en la misma) muestra la secuencia de aminoácidos deducida en su totalidad derivada para el gen OB humano. Los aminoácidos están numerados de 1 a 167. Un sitio de escisión de secuencia de señal se ubica después del aminoácido 21 (Ala) de modo que la proteína madura se extiende desde el aminoácido 22 (Val) hasta el aminoácido 167 (Cys). Para la presente revelación, se utiliza una diferente numeración, donde la posición del aminoácido 1 es el residuo Valina que se encuentra al comienzo de la proteína madura.

Generalmente, la proteína OB para su uso será capaz de complejarse con el receptor de proteína OB seleccionado. Así, puede verificarse empíricamente la capacidad de unión (a todo o parte del dominio del dominio extracelular del receptor OB como se indicó previamente) para determinar qué formas de proteína OB pueden usarse. Por lo general, las modificaciones que se aplican usualmente, como se indicó previamente para la proteína receptora OB, también pueden aplicarse aquí. Como se determinó en la WO 96 05309, la proteína OB en su forma nativa o fragmentos (tales como productos de ruptura enzimática) u otras formas truncadas, análogos y derivados, retienen todos la actividad biológica. Tales formas pueden usarse en tanto la forma se una a al menos una porción del dominio extracelular de las presentes proteínas receptoras OB.

Puede seleccionarse una cantidad efectiva de una proteína OB, un análogo o derivado de la misma entre conforme a la secuencia de aminoácidos presentada en la PCT WO 96/05309, Figura 3 numerada de modo tal que el primer aminoácido de la proteína madura es el número 1:

(a) la secuencia de aminoácidos 1-146, que opcionalmente carece de un residuo glutaminilo en posición 28, y que además opcionalmente presenta un residuo metionilo en el extremo N-terminal ;

(b) una secuencia de aminoácidos de la subparte (a) que posee un aminoácido diferente sustituido en una o más de las siguientes posiciones: 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145;

(c) un análogo de proteína OB truncada seleccionado entre: (usando la numeración de la subparte (a) anterior)

(i)

los aminoácidos 98-146

(ii)

los aminoácidos 1-32

(iii)

los aminoácidos 1-35

(iv)

los aminoácidos 40-116

(v)

los aminoácidos 1-99 y 112-146

(vi)

los aminoácidos 1-99 y 112-146,

presentando uno o más de los aminoácidos 100-111 ubicados secuencialmente entre los aminoácidos 99 y 112; y,

(vii)

el análogo de OB truncado de la subparte (i) que presenta uno o más de los aminoácidos 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 sustituido por otro aminoácido;

(viii)

el análogo truncado de la subparte (ii) que presenta uno o más de los aminoácidos 4, 8 y 32 sustituidos por otro aminoácido,

(ix)

el análogo truncado de la subparte (iv) que presenta uno o más de los aminoácidos 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111 y 112 reemplazado por otro aminoácido;

(x)

el análogo truncado de la subparte (v) que presenta uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 reemplazado por otro aminoácido;

(xi)

el análogo truncado de la subparte (vi) que presenta uno o más de los aminoácidos 4, 8, 32, 33, 35, 48, 50, 53, 60, 64, 66, 67, 68, 71, 74, 77, 78, 89, 97, 100, 102, 105, 106, 107, 108, 111, 112, 118, 136, 138, 142 y 145 reemplazado por otro aminoácido;

(xii)

el análogo truncado de cualquiera de las subpartes (i)-(xi) que presenta un residuo metionilo N-terminal; y

(d) la proteína OB o derivado del análogo de cualquiera de las subpartes (a) hasta (c) que comprende un residuo químico contectado al residuo de proteína;

(e) un derivado de la subparte (d) donde dicho residuo químico es un residuo polimérico soluble en agua;

(f) un derivado de la subparte (e) donde dicho residuo polimérico soluble en agua es polietilenglicol;

(g) un derivado de la subparte (f) donde dicho residuo polimérico soluble en agua es un residuo de poliaminoácido;

(h) un derivado de la subparte (g) donde dicho residuo polimérico soluble en agua está unido solamente con el extremo N-terminal de dicho residuo de proteína;

(i) una proteína OB, un análogo o derivado de cualquiera de las subpartes (a) hasta (h) en un vehículo aceptable para uso farmacéutico.

Las proteínas OB, los análogos y las moléculas relacionadas también se informan en las publicaciones siguientes; de todos modos, no se realiza representación respecto de la actividad de ninguna composición informada:

Patentes estadounidenses Nos. 5.521.283; 5.532.336; 5.552.522; 5.552.523; 5.552.524; 5.554.727; 5.559.208; 5.563.243; 5.563.244; 5.563.245; 5.567.678; 5.567.803; 5.569.744; 5.569.743 (todas asignadas a Eli Lilly & Company);

PCT W096/23517; W096/23515; W096/23514; W096/24670; W096/23513; W096/23516; W096/23518; W096/
23519; W096/23520; W096/23815; W096/24670; W096/27385 (todas asignadas a Eli Lilly & Company);

PCT W096/22308 (asignada a Zymogenetics);

PCT W096/29405 (asignada a Ligand Pharmaceuticals, Inc.);

PCT W096/31526 (asignada a Amyin Pharmaceuticals, Inc.);

PCT W096/34885 (asignada a Smithkline Beecham PLC);

PCT W096/35787 (asignada a Chiron);

EP 0 725 079 (asignada a Eli Lilly y Company);

EP 0 725 078 (asignada a Eli Lilly y Company);

EP 0 736 599 (asignada a Takeda);

EP 0 741 187 (asignada a F. Hoffman LaRoche).

En la medida que estas referencias proveen proteínas OB útiles o análogos o derivados de las mismas, o composiciones o métodos asociados, tales composiciones y/o métodos pueden usarse conjuntamente con los presentes receptores de proteínas OB, tales como para la co-administración (en forma conjunta o separada, en un esquema de dosificación elegido) o mediante composiciones complejantes a los presentes receptores de proteínas OB.

Derivados y formulaciones

El presente receptor de proteína OB y/o proteína OB (en este caso el término "proteína" se usa para incluir "péptidos" y análogos del receptor o de la proteína OB, tales como los citados más abajo, a menos que se indique de otro modo) también puede ser derivatizado por incorporación de uno o más restos químicos al resto de la proteína. Si las presentes composiciones farmacéuticas contienen como principio activo un complejo del receptor de la proteína OB y la proteína OB, una o las dos proteínas pueden ser derivatizadas. Además, los derivados modificados químicamente pueden ser formulados para su administración intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, oral, nasal, pulmonar, tópica, etc. Se ha descubierto que la modificación química de las proteínas biológicamente activas brindan ventajas adicionales en determinadas circunstancias, tales como el aumento de la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y la disminución de la inmunogenicidad. Véase Patente EE.UU N° 4.179.337, Davis y col., publicada el 18 de diciembre de 1979. Para su revisión, véase Abuchowski y col., en Enzymes as Drugs. (J.S. Holcerberg y J. Roberts Editores, pág. 367-383 (1891)). Un artículo de revisión, donde se describe la modificación de la proteína y las proteínas de fusión, se encuentra en Focus on Growth Factors 3: 4-10 (mayo de 1992), publicado por Mediscript, Mountview Court, Friern Barnet Lane, Londres N20, OLD, Reino Unido).

Preferentemente, para el uso terapéutico de la preparación del producto final, el radical químico para derivatización debe ser aceptado por las normas farmacéuticas. Se puede usar un polímero. Las personas expertas en la técnica podrán seleccionar el polímero deseado sobre la base de aspectos tales como si el conjugado del polímero o de la proteína se usará terapéuticamente y, si así fuera, la posología, el tiempo de circulación, la resistencia a la proteólisis y demás aspectos deseados. La eficacia de la derivatización, para las presentes proteínas y péptidos, se puede averiguar administrando el derivado en la forma deseada; por ejemplo mediante bomba osmótica, inyección o infusión o, por ejemplo, además formulado para su administración por vía oral, pulmonar o nasal, y observando los efectos biológicos descritos aquí.

Los radicales químicos adecuados para la derivatización se pueden seleccionar entre varios polímeros hidrosolubles. El polímero seleccionado deberá ser hidrosoluble, de modo tal que la proteína a la que se une sea miscible en un medio acuoso, tal como el medio fisiológico. El polímero hidrosoluble se puede seleccionar de un grupo que incluye, por ejemplo, polietilenglicoles, copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli-1, 3-dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos, ya sea homopolímeros o copolímeros aleatorios o no aleatorios (véase más arriba lo referente a moléculas de fusión) y dextrano o poli(n-vinil pirolidona) polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilenados, poliestirenmaleato y alcohol polivinílico. El polietilenglicol-propionaldehído puede tener ventajas en la elaboración dada su estabilidad en agua.

Las proteínas de fusión se pueden preparar uniendo los poliaminoácidos al receptor de la proteína OB o al radical de la proteína OB (análogo o complejo). Por ejemplo, el poliaminoácido puede ser una proteína portadora que sirve para aumentar la vida media de circulación de la proteína. Para cumplir con los presentes propósitos terapéuticos o cosméticos, el ácido poliamínico debe ser tal que no cree una respuesta antigénica neutralizante u otra respuesta adversa. Ese poliaminoácido se puede seleccionar del grupo compuesto por albúmina sérica, tal como la albúmina sérica humana, un anticuerpo o una parte de él, tal como una región constante del anticuerpo, a veces denominada "Fc" u otros poliaminoácidos. Según se indica más abajo, la ubicación de la unión del poliaminoácido puede estar en el extremo N-terminal del radical de la proteína OB, o en otro lugar, y también puede estar conectado a la proteína OB por un radical químico "conector".

El polímero puede ser de cualquier peso molecular y puede estar ramificado o no ramificado. El peso molecular preferido para los polietilenglicoles está, aproximadamente, entre 2 kDa y 100 kDa, el término "aproximadamente" indica que en las preparaciones de polietilenglicol, algunas moléculas pesarán más y otras menos que el peso molecular establecido, para facilitar su manipulación y elaboración. Se pueden usar otros tamaños, de acuerdo con el perfil terapéutico deseado; por ejemplo la duración deseada de la liberación continua; los efectos en la actividad biológica, si los hubiera, la manipulación fácil, el grado o la ausencia de antigenicidad y otros efectos conocidos de los polietilenglicoles sobre una proteína terapéutica o su análogo).

La cantidad de moléculas del polímero unidas así puede variar y un experto en la técnica podrá averiguar su efecto sobre la función. Se podrá hacer una mono-derivatización o podrá facilitar una di-, tri-, tetra o alguna otra combinación de derivatización con los mismos o con diferentes radicales químicos; por ejemplo, polímeros, tales como pesos diferentes de polietilenglicoles. La proporción de moléculas de polímero correspondiente a las moléculas de la proteína o del péptido variará, tal como variarán sus concentraciones en la mezcla de reacción. En general, el coeficiente óptimo respecto de la eficiencia de la reacción, en cuanto a la inexistencia de exceso de proteína o polímero no reactivo, se determinará por medio de factores, tales como el grado deseado de derivatización; por ejemplo, mono, di-, tri-, etc.), el peso molecular del polímero selecto, ya sea si el polímero es ramificado o no ramificado, y las condiciones de la reacción.

Los radicales químicos deberán unirse a la proteína tomando en consideración los efectos en los dominios funcionales o antigénicos de la proteína. Existe una cantidad de métodos de unión al alcance de los expertos en la ciencia. Por ejemplo, EP 0 401 384 (acoplamiento PEG a G-CSF), véase también Malik y col., Exp. Hematol. 20: 1028-1035 (1992) (informando pegilación del GM-CSF mediante cloruro de tresilo). Por ejemplo, el polietilenglicol puede estar unido en forma covalente, por medio de un grupo reactivo, a través de los residuos de aminoácido, tal como un grupo carboxilo o amino libre. Los grupos reactivos son los que pueden unirse a una molécula u otro radical químico de polietilenglicol activado. Los residuos de aminoácido que tienen un grupo amino libre pueden incluir residuos de lisina y el residuo del aminioácido N-terminal. Los que tienen un grupo carboxilo libre pueden incluir residuos de ácido aspartámico, residuos de ácido glutámico y el residuo del aminoácido C-terminal. Los grupos sulfhidrilo también se pueden usar como grupo reactivo para la unión de la/s molécula/s de polietilenglicol u otro radical químico. Se prefiere la unión a un grupo amino para propósitos de elaboración terapéutica, tal como la unión al extremo N-terminal o al grupo lisina. Deberá evitarse la unión a los residuos importantes para la ligadura del receptor si se desea la unión al receptor.

Se puede desear específicamente una proteína con el extremo N-terminal modificado químicamente. Usando el polietilenglicol como ilustración de las composiciones presentes, se puede hacer una selección, a partir de una variedad de moléculas de polietilenglicol, por peso molecular, ramificación, etc.; proporción de moléculas de polietilenglicol correspondiente a las moléculas de proteína en la mezcla de reacción; tipo de reacción de pegilación, que se llevará a cabo, y método de obtención de la proteína pegilada N-terminal seleccionada. El método de obtención de la preparación pegilada N-terminal; es decir si fuera necesario separando este radical de otros radicales monopegilados, puede ser por purificación del material pegilado N-terminal de una población de moléculas proteicas pegiladas. La modificación química N-terminal selectiva se puede lograr por alquilación reductiva, que aprovecha la reactividad diferencial de diferentes tipos de grupos amino primarios (lisina contra N-terminal) disponibles para la derivatización en una proteína particular. Véase PCT WO 96/11953. La derivatización de la proteína selectiva se logra sustancialmente con las condiciones de reacción apropiada en el extremo N-terminal con un grupo carbonilo que contiene el polímero. Por ejemplo, se puede pegilar selectivamente la proteína en forma N-terminal, realizando la reacción a un pH que permita valerse de las diferencias de pK_{a} entre el grupo e-amino de los residuos lisina y las del grupo a-amino del residuo N-terminal de la proteína. Mediante la derivatización selectiva mencionada, se controla la unión del polímero a la proteína: la conjugación con el polímero tiene lugar predominantemente en el extremo N-terminal de la proteína y no se produce ninguna modificación significativa de otros grupos reactivos, tales como los grupos amino de la cadena lateral lisina. Usando la alquilación reductiva, el polímero puede ser del tipo descrito más arriba y deberá tener un solo aldehído reactivo para acoplarse a la proteína. Se puede usar polietilenglicol-propionaldehído, que contiene un solo aldehído reactivo.

Para facilitar la producción del producto terapéutico es preferible un derivado modificado químicamente en forma N-terminal, en lugar de las otras formas de modificación química. La modificación química N-terminal asegura un producto homogéneo como caracterización del producto, que se simplifica en relación a los productos di-, tri- o multi-derivados. Se prefiere el uso del proceso de alquilación reductiva precedente para la preparación del producto modificado químicamente en forma N-terminal, porque facilita la elaboración comercial.

En otro aspecto más de la presente invención, se proporcionan métodos para el uso de composiciones farmacéuticas de las proteínas y sus derivados. Las composiciones farmacéuticas mencionadas pueden ser inyectables o por vía oral, pulmonar, nasal, transdérmica o mediante otras formas de administración. En general, la invención abarca composiciones farmacéuticas que incluyen cantidades efectivas de proteínas o productos derivados de la invención junto con diluyentes, conservantes, solubilizantes, emulsionantes, adyuvantes y/o vehículos aceptados por la técnica farmacéutica. Las composiciones mencionadas incluyen diluyentes que contienen diversos buffers, por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato; pH y fuerza iónica; aditivos, tales como detergentes y agentes solubilizantes; por ejemplo, Tween 80, Polisorbato 80, antioxidantes; por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, preservativos; por ejemplo, Thimersol, alcohol bencílico, y sustancias que aumentan el volumen; por ejemplo, lactosa, manitol; incorporación del material en preparaciones particuladas de compuestos poliméricos, tales como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., o en liposomas. Véase, por ej.: PCT WO 96/29989, Collins y col., "Stable protein: phospholipid compositions and methods", publicada el 3 de octubre de 1996. También se puede usar el ácido hilaurónico que puede producir el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Las composiciones mencionadas pueden influir en el estado físico, la estabilidad, el índice de liberación in vivo y el índice de clearance in vivo de las presentes proteínas y derivados. Véase, por ejemplo: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edic. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712. Las composiciones se pueden preparar como líquidos o en polvo seco, tal como la forma liofilizada. También se han contemplado las formulaciones de liberación continua implantables, tales como las formulaciones transdérmicas.

Las formas posológicas orales de las proteínas derivadas precedentes están específicamente contempladas. La proteína puede ser modificada químicamente, para que la administración del derivado sea eficaz. Por lo general, la modificación química contemplada es la unión de, por lo menos, un radical a la molécula, en sí, de la proteína o del péptido, en donde el radical mencionado permite (a) la inhibición de la proteólisis y (b) la captación en el torrente sanguíneo desde el estómago o el intestino. También es deseable el aumento de la estabilidad global de la proteína y el aumento en el tiempo de circulación en el organismo. Véase PCT WO 95/21629, Habberfield, "Oral Delivery of Chemically Modified Proteins", publicado el 17 de agosto de 1995) y la Patente de EE.UU. N° 5.574.018 Habberfield y col., "Conjugates of Vitamin B12 and Proteins", publicado el 12 de noviembre de 1996.

Aquí también se contempla la distribución pulmonar de la presente proteína o de su derivado. La proteína (derivado) ingresa a los pulmones del mamífero mediante su inhalación y atraviesa la capa epitelial del pulmón hacia el torrente sanguíneo. Véase PCT WO 94/20069, Niven y col., "Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor", publicado el 15 de septiembre de 1994.

También se contempla la distribución de la proteína, su análogo o derivado, por vía nasal. La distribución nasal permite el pasaje de la proteína directamente al torrente sanguíneo después de administrar el producto terapéutico por la nariz, sin necesidad de la deposición del producto en el pulmón. Las formulaciones para distribución nasal incluyen a las que contienen agentes estimulantes de la absorción, tales como dextrano o ciclodextrano. También está contemplada la distribución mediante el transporte a través de las membranas de la mucosa.

Posología

Las personas expertas en la técnica podrán indagar la posología efectiva mediante la administración y la observación de los efectos terapéuticos deseados. Preferentemente, la formulación de la molécula o del complejo en una composición farmacéutica será tal que aproximadamente entre 10 \mug/Ikg/día y 10 mg/kg/día brindarán el efecto terapéutico deseado. La posología efectiva se puede determinar, con el transcurso del tiempo, usando las herramientas de diagnóstico. Por ejemplo, se puede usar primero el diagnóstico para evaluar la cantidad de proteína OB o de proteína del receptor OB en sangre, plasma o suero y determinar los niveles endógenos de proteína OB o del receptor. Esta herramienta de diagnóstico se puede presentar como un ensayo del anticuerpo, tal como el ensayo sándwich del anticuerpo. Inicialmente se cuantifica la cantidad de proteína del receptor OB endógeno, tal como el receptor soluble, y luego se determina el nivel basal. La posología terapéutica se determina como la cuantificación de los receptores de la proteína OB endógeno y exógeno; es decir, proteína, análogo o derivado, encontrado en el organismo, ya sea producido por él o administrado. Por lo tanto, la posología puede variar a lo largo del tratamiento, usando inicialmente una dosis relativamente alta hasta observar el beneficio terapéutico y luego reducirla para mantener los beneficios
terapéuticos.

Durante el curso inicial de una terapia de una persona obesa, la posología se puede administrar, según se logra la pérdida de peso y el aumento concomitante de la disminución del tejido graso. Cuando se alcanza la pérdida de peso adecuada, se puede administrar la dosis suficiente para evitar nuevamente subir de peso y, al mismo tiempo, suficiente para mantener el peso o la masa grasa deseados. Estas posologías se pueden determinar empíricamente, mientras sean reversibles los efectos de la proteína OB. Por ejemplo, Campfield y col., Science 269; 546-549 (1995) al 547. Por lo tanto, si se observa que la dosis produce una pérdida de peso no deseada, se administrará una dosis menor, que mantenga el peso adecuado.

Composiciones y Métodos Terapéuticos

Las presentes proteínas del receptor OB solas o en combinación con una proteína OB y los ácidos nucleicos se pueden usar como métodos de tratamiento o para la elaboración de medicamentos como métodos de tratamiento. Dicho tratamiento incluye las condiciones caracterizadas por una producción excesiva de proteína OB, en donde los presentes receptores OB, en particular solubles, se pueden usar como complemento/complejo y, por consiguiente, inactivar el exceso de proteína OB, o dicha proteína del receptor OB, en particular solubles, pueden actuar para proteger la actividad de la proteína OB. Si bien, en teoría no se desea la unión, se puede postular que la actividad agonista del receptor de la proteína OB se puede llevar a cabo mediante el efecto protector logrado, cuando el receptor de la proteína OB (en particular el receptor soluble) se compleja con la proteína OB. Este efecto puede prolongar la vida media en suero de la proteína OB in vivo. Estos tratamientos se pueden llevar a cabo preparando el receptor soluble (por ejemplo, uso de un dominio extracelular, según se describe más arriba) y administrando esa composición al individuo que la necesite o preparando una población de células que contengan o expresen al receptor OB y trasplantando esas células en el individuo que las necesite.

Los presentes receptores OB también se pueden usar para el tratamiento de quienes tienen receptores OB defectuosos. Por ejemplo, se puede tratar a un individuo que tiene receptores OB defectuosos, mediante la preparación de una población de células que contienen ese receptor OB no defectuoso, y trasplantando esas células en el individuo. O un individuo puede tener un número inadecuado de receptores OB y las células que contienen esos receptores pueden ser trasplantadas, a fin de aumentar el número de receptores OB disponibles en un individuo.

Las proteínas receptoras OB presentes y las composiciones relacionadas, tales como el complejo proteína receptora OB/proteína OB, facilitan la pérdida de peso, pérdida de grasa, el aumento de masa magra, aumento de la sensitividad insulínica, aumento del vigor en general, aumento de los glóbulos rojos y la oxigenación sanguínea, disminución de la resorción ósea o de la osteoporosis, disminución o mantenimiento de los niveles de colesterol en suero, disminución o mantenimiento de los niveles de triglicéridos (LDL y VLDL), prevención o reducción en la formación de placa arterial, tratamiento de la hipertensión y prevención o reducción de la formación de cálculos biliares. Considerando que la composición de la grasa corporal probablemente esté correlacionada con determinados tipos de cáncer, las composiciones presentes pueden resultar eficaces para la prevención o la mejoría de determinados tipos de cáncer. La presente invención también incluye los métodos de elaboración de un medicamento para usar conjuntamente con las condiciones cosméticas/terapéuticas aquí descritas, que contienen por lo menos una de las presentes composi-
ciones.

Las composiciones y los métodos presentes se pueden usar conjuntamente con otros medicamentos, tales como los que son eficaces para el tratamiento de la diabetes (por ejemplo la insulina o sus análogos, tiazolidinadionas u otros agentes antihiperglucémicos, y posiblemente amilina o sus antagonistas), medicamentos depresores del colesterol y de la presión sanguínea (tales como los que reducen los niveles de lípidos en sangre u otros medicamentos cardiovasvulares) y los medicamentos que aumentan la actividad (por ejemplo, las anfetaminas). También se pueden usar supresores del apetito, tales como los moduladores de la serotonina, los neuropéptidos y sus antagonistas. Tal administración puede ser simultánea o in seriatim.

Además, los presentes métodos se pueden usar conjuntamente con procedimientos quirúrgicos, tales como las cirugías cosméticas diseñadas para modificar la apariencia general del cuerpo; por ejemplo, liposucción o las cirugía con láser diseñadas para reducir la masa corporal o cirugías de implantes diseñadas para aumentar la apariencia de la masa corporal. Los beneficios para la salud de las cirugías cardíacas, tales como la cirugía de bypass u otras cirugías diseñadas para aliviar el estado nocivo, causado por el bloqueo de los vasos sanguíneos con depósitos de grasa, tales como la placa arterial, pueden incrementarse con el uso concomitante de las presentes composiciones y métodos. Los métodos para eliminar los cálculos biliares, tales como los métodos del ultrasonido y el láser, también se pueden usar tanto antes, como durante y después del curso de los presentes métodos terapéuticos. Asimismo, los presentes métodos se pueden usar como adyuvantes para las cirugías o el tratamiento de fracturas, contracturas musculares u otras terapias que se verían beneficiadas mediante el aumento de la masa de tejido magro.

La presente invención proporciona, en otro aspecto, los métodos de elaboración de un medicamento para el tratamiento de la obesidad, diabetes tipo II, exceso de lípidos en sangre o de niveles de colesterol, aumento de la sensibilidad a la insulina, aumento de masa magra y otras afecciones expuestas más arriba. También se suministran tratamiento cosméticos solamente para individuos que desean mejorar su apariencia mediante la pérdida de peso y, más específicamente, la pérdida de depósitos de grasa, aun cuando no haya beneficio terapéutico.

Composiciones y métodos de diagnóstico

Según se ha indicado arriba, los productos polipeptídicos de la invención pueden estar "marcados" por asociación con una sustancia marcadora detectable (por ej. radiomarcados con ^{125}I, fluorescencia, quimioluminiscencia, enzima) para proporcionar reactivos eficaces en la detección y cuantificación del receptor OB o sus complejos en tejido sólido y muestras de fluido, tales como sangre u orina. Los ácidos nucleicos de la invención también pueden ser marcados con marcadores detectables (tales como radiomarcadores y marcadores no isotópicos tales como la biotina) y emplearse en los procesos de hibridación para ubicar la posición del gen receptor OB humano y/o la posición de cualquier familia genética relacionada en un mapa cromosómico. Las secuencias de ácido nucleico que se unen selectivamente al gen del receptor OB humano son útiles para este propósito. También se pueden utilizar para la identificación de trastornos del gen del receptor OB humano a nivel del ADN y como marcadores del gen para la identificación de los genes vecinos y sus trastornos. Estas secuencias de ácido nucleico se pueden usar para la detección o la medición del nivel del ARNm del receptor OB de una muestra biológica. Aquí se contemplan kits que contienen los materiales marcados mencionados.

La proteína y/o los ácidos nucleicos suministrados aquí, también pueden ser incorporados como parte de un kit o un artículo de manufactura que incluye el material del envase y una o más preparaciones de las composiciones suministradas actualmente. El material de envase mencionado comprende una etiqueta, en donde se indica que la preparación de la proteína o del ácido nucleico es útil para la detección y/o la cuantificación de la cantidad de receptor OB en una muestra biológica como los defectos en una muestra biológica. El kit, como tal, puede incluir opcionalmente materiales para llevar a cabo los análisis mencionados, tales como los reactivos eficaces tanto para realizar el análisis de hibridación del ADN o del ARN, como el análisis de PCR en sangre, orina o muestras de tejido.

Además, se describen las moléculas de unión selectivas, tales como los anticuerpos monoclonales que se unen selectivamente al receptor OB. La técnica de hibridoma descripta originalmente por Kohler y Milstein Eur. J. Inmunol. 6, 511-519 (1976) ha sido aplicada ampliamente para la producción de líneas celulares híbridas que segregan niveles elevados de anticuerpos monoclonales contra muchos antígenos específicos. También se pueden preparar anticuerpos recombinantes (véase Huse y col., Science 246: 1275 (1989)). Además, los anticuerpos recombinantes mencionados se pueden modificar, por ejemplo, por modificación de complementariedad, determinando regiones para aumentar o alterar la afinidad o "humanizando" esos anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos mencionados se pueden incorporar a un kit destinado para el diagnóstico. Un kit de diagnóstico se puede emplear para determinar la ubicación y/o la cantidad o el receptor OB de un individuo. Los equipos de diagnóstico también se pueden usar para determinar si un individuo tiene receptores que se unen a la proteína OB o si éstos tienen grados variables de capacidad o habilidad de unión reducida. Según se detalla más abajo, dichos anticuerpos se pueden preparar usando porciones inmunogénicas de una proteína del receptor OB. Estas moléculas de unión selectiva, de por sí, pueden ser alternativas a la proteína OB y formuladas para composiciones farmacéuticas.

Las proteínas mencionadas y/o los ácidos nucleicos se pueden usar en los ensayos de distribución de tejido (por ejemplo, según consta en el ejemplo de trabajo, más abajo) o en otros ensayos para determinar la ubicación del receptor OB.

La presente familia de los receptores de la proteína OB se puede usar en métodos para obtener análogos, miméticos o moléculas pequeñas de la proteína OB. Se podría preparar simplemente una proteína receptora OB deseada, en particular, una que tuviera la capacidad de unirse a los receptores de la proteína OB nativa y analizar la molécula de prueba, que podría estar marcada con una sustancia marcadora detectable, por su habilidad para unirse al receptor mencionado. Otros parámetros, tales como la afinidad y la ubicación de la unión también se pueden averiguar mediante métodos disponibles para todos los expertos en la técnica. Por ejemplo, se podría usar porciones de los presentes receptores OB, en particular, porciones del dominio extracelular que son necesarias para la unión del ligando, para determinar la ubicación de esa unión. Se podrían preparar receptores OB que tuvieran varios truncamientos o supresiones de regiones del dominio extracelular, que se podrían usar para determinar la ubicación de la unión de la molécula de prueba. Se podría usar un receptor OB que se sabe es defectuoso en la unión OB nativa, tal como potencialmente una de un individuo que tiene dichos receptores defectuosos, y usarla como base para averiguar la proteína OB que sería efectiva para producir la actividad biológica adecuada (es decir, pérdida de peso, reducción de las dislipidemias en sangre o la disminución de los niveles de colesterol, reducción en la incidencia o la gravedad de la diabetes). Otros usos incluyen solamente los usos cosméticos para la alteración de la apariencia corporal, en particular la remoción de
grasa.

La presente proteína receptora OB o los ácidos nucleicos presentes también pueden ser útiles para identificar sustancias que regulan la proteína o el receptor OB. Por ejemplo, la expresión temporal del receptor OB in vivo puede ser útil para determinar si una sustancia administrada causa el aumento o la disminución del receptor OB. Se puede llegar a la conclusión de que un aumento en la expresión del receptor OB produce la modulación del peso o del metabolismo lipídico.

La divergencia en el extremo C-terminal puede representar receptores OB con diferentes capacidades en la transducción de señales. Por lo tanto, los diferentes miembros de la familia del receptor se pueden usar para diferentes ensayos, dependiendo del tipo de transducción de señales observado. Se considera que, al menos, una porción del dominio intracelular es necesaria para la transducción de señales (véase más arriba).

Los ejemplos que se ofrecen, a continuación, son para ilustrar la invención con mayores detalles, pero no se deben interpretar como limitantes del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Identificación de la proteína receptora OB humana

El ADN de los receptores de la proteína OB humana fue identificado, en dos pasos, en una biblioteca del ADNc de hígado humano. En el primer paso, se usaron dos iniciadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar una región de 300 pares de bases seleccionada de la biblioteca del ADNc de hígado humano. En el segundo paso, se usó el fragmento de PCR como sonda para investigar la biblioteca de ADNc de hígado humano. Se obtuvieron trece clones, pero estaban incompletos en el extremo 5'. Se realizó un procedimiento para completar el extremo 5' y hacer clones completos. Se secuenciaron doce clones. Estos doce clones fueron identificados como "A", "B" o "C", según indica el extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos prevista.

Reacción en Cadena de la Polimerasa

El cebador de PCR original se basó en el extremo 5' y el extremo 3' de una secuencia de 416 pares de bases que tiene N° de Acceso a la Base de Datos GenBank T73849. Esta secuencia se seleccionó sobre la base de un motivo conocido, presente en receptores de citoquinas "WSXWS".

El cebador 5' tenía la secuencia 73-96 de la secuencia de 416 pb. El iniciador 3' tenía la secuencia 337-360 de la secuencia de 416 pb.

Estos cebadores se usaron para sondear la biblioteca de ADNc de hígado humano (Stratagene). Se usaron métodos estándar.

Esto derivó en un fragmento de PCR que tenía la secuencia 73-360 del fragmento de 416 pb.

Hibridación

Se usó el fragmento de PCR de 300 pb para sondear la biblioteca de ADNc de hígado humano (Stratagene), utilizando métodos estándar. Esta segunda hibridación produjo 13 clones positivos. Estos eran clones parciales, incompletos en el extremo 5'.

Completado del extremo 5'

Se usó la amplificación rápida del extremo del ADNc (kit "RACE" de GIBCO/BRL) para obtener clones de longitud completa.

Resultados de la secuenciación

Las secuenciaciones revelaron los tres tipos de ADNs del receptor OB. De los trece clones, 4 clones fueron de tipo "A" (SEC. ID N° 1 y 2); 1 clon fue de tipo "B" (SEC. ID N° 3 y 4) y 4 clones fueron de tipo "C" (SEC. ID N° 5 y 6).

Según se puede observar a partir de las Identificaciones de Secuencias (abajo), el receptor OB "A" es de 896 aminoácidos de longitud, el "B" es de 904 aminoácidos de longitud y el "C" es de 958 aminoácidos de longitud. Estos receptores de OB diferentes son idénticos en las posiciones de los aminoácidos 1-891 y difieren casi por completo, comenzando en la posición 892. Se presupone que la secuencia líder, según el análisis de hidrofobicidad, es la de los aminoácidos 1-21 (M-A), 1-22 (M-F) o 1-28 (M-I) con la proteína madura comenzando en las posiciones 22 (F), 23 (N) o 29 (T). Sobre la base del análisis de hidrofobicidad, es más probable que la secuencia líder esté en las posiciones 1-21 (desde M hasta A). La producción de las Células de Ovario de Hámster Chino ("CHO") de la forma secretada de los receptores de la proteína OB también produjo una proteína que tiene el número de aminoácido 22 como primer aminoácido de la proteína madura. Probablemente, la región transmembrana comienza en la posición 840 (A) o en la 842 (L), pasa por la posición 862 (I), 863 (S) u 864 (H). Para el receptor OB tipo "A", el último aminoácido está ubicado en la posición 896 y es una lisina (L). Para el receptor OB tipo "B", el último aminoácido está ubicado en la posición 904 y es una glutamina (Q). Para el receptor OB tipo "C", el último aminoácido está ubicado en la posición 958 y es un ácido glutámico (E).

Para la proteína receptora OB de tipo "C", la región C-terminal posee una elevada homología con un elemento transposable humano conocido. Desde el nucleótido 2737 hasta el 2947 de la presente proteína receptora OB humana tipo "C", hay un 98,1% de homología con una sección de la base 211 de un elemento retrotransposable humano, descrito en Ono y col., Nucl. Acids Res. 15: 8725-8737 (1987) (bases desde 520 hasta 731, SINE-R11, N° de acceso a GENBANK x07417).

Ejemplo 2 Distribución tisular

Para averiguar la distribución tisular se usaron dos métodos. El primer método incluía el uso del receptor OB de tipo "A" entero. El segundo método incluía el uso de sondas específicas para la región del extremo C de la proteína. Dado que estas regiones del extremo C son divergentes, el segundo método detectó la distribución tisular de los diferentes miembros de la familia de receptores OB.

En el primer método se usó un kit de Transferencia northern (Clontech), que empleaba como sonda el ADN del receptor OB de tipo A entero. En el segundo método se usó la PCR con cebadores específicos para los ácidos nucleicos que codifican el extremo C-terminal divergente de los tres tipos. Se usaron métodos estándar.

En la Tabla 2 se detallan los resultados, según los métodos de Transferencia Northern y de la PCR. El signo "+" indica la determinación subjetiva del investigador de la intensidad de la señal. Para el análisis de Transferencia Northern, el triple "+++" indica que se observó un resultado (una banda oscura sobre la película de rayos X), tras la exposición de la película durante toda la noche; el doble "++" indica que las bandas se observaron a las dos semanas de exposición y el "+" sólo indica que las bandas fueron observadas después de tres semanas de exposición. Además, mediante este método se observaron dos pesos moleculares, uno en 4 Kb y otro en 6,2 Kb. Aunque la distribución fue ubicua, las señales más intensas se observaron para ovario, corazón e hígado. Para el análisis de la PCR, el receptor OB "A" se observó en todos los tipos de tejidos examinados (próstata, ovario, intestino delgado, corazón, pulmón, hígado y músculo esquelético), el tipo "B" sólo fue observado en pulmón e hígado, y el tipo "C" fue observado en ovario, corazón, pulmón e hígado.

TABLA 2 Distribución Tisular del Nuevo Receptor OB

	Transferencia Northern		PCR
	4 Kb	6,2 Kb		A	B	C
Bazo	-	+
Timo	-	+
Próstata	-	+		+	-	-
Testículo	-	+
Ovario	-	+++		+	-	+
Intestino delgado	-	++		+	-	-
Colon	-	-
Leucocito periférico	-	-
Corazón	-	+++		+	-	+
Cerebro	-	-
Placenta	-	+
Pulmón	+	++		+	+	+
Hígado	+++	+++		+	+	+
Músculo esquelético	-	++		+	-	-
Riñón	-	++
Páncreas	-	+

Ejemplo 3 Identificación del ADN genómico del receptor OB humano y localización cromosómica; identificación del receptor OB humano "D"

También se preparó el ADN genómico del receptor OB humano de longitud total. Se usó el ADNc del receptor OB "A", en su totalidad, como una sonda contra una biblioteca de ADN genómico humano, usando materiales y métodos de un kit que puede adquirise comercialmente (Genome Systems, usando una biblioteca genómica humana en un vector P1). Se detectó un solo clon positivo. Existen intrones ubicados en (con respecto al receptor OB "A" ADN) los pares de bases números: 559, 1059, 1350, 1667, 1817, 1.937, 2060, 2277, 2460, 2662 y 2738.

El gen del receptor OB humano se ubicó en el cromosoma humano 1P31 mediante el análisis de FISH (Genome Systems). Se cree que el cromosoma humano 1 corresponde al cromosoma 4C7 del ratón, del que se supe se encuentra en la ubicación del sitio db.

Se aisló otra secuencia cromosómica. Esta secuencia cromosómica de ADN se aisló a partir de una biblioteca genómica humana como se describió previamente. Esta secuencia cromosómica codifica lo que aquí se denomina receptor OB "D" humano, y la secuencia de aminoácidos codificada se indica en la SEC. ID N° 7. Un ADNc que codifica esta secuencia de aminoácidos se indica en la SEC. ID N° 8. El mapa de unión intrón/exón del ADN cromosómico se indica en la SEC. ID N° 9.

Como con las formas "A", "B" y "C", para la presente forma "D" de la proteína receptora OB, es probable que el primer aminoácido de la proteína madura (usando el análisis de hidrofobicidad) comience en la posición 22 (F), 23 (N) o 29 (T). El último aminoácido de la proteína está en posición 1165 y es un residuo de valina. Como con las otras formas, el dominio extracelular se extiende desde la posición 22 (F), 23 (N) o 29 (T) hasta la posición 839 (D) u 841 (G). El dominio transmembrana aparentemente se indica en la posición 840 (A) u 842 (L). El final del dominio transmembrana parece estar ubicado en la posición 862 (I), 863 (S) u 864 (H). La región del extremo C-terminal, más allá de la región transmembrana, parece participar en la transducción de señales, y se ubica en la posición 863 (S) , 864 (H) u 865 (Q) hasta la posición 1165 (V) .

La presente forma "D" del receptor OB es idéntica a la publicada por Tartaglia et al, Cell 83: 1263-1271 (Diciembre 29, 1995) con la excepción de un cambio de un solo aminoácido en la posición del aminoácido 976 (comenzando el codón del nucleótido en la posición 3022). El aminoácido en posición 976 del presente tipo "D" es ácido aspártico, y el aminoácido publicado que corresponde a la misma posición es alanina. Esto constituye una sustitución no conservativa, véase infra, y dado que la ubicación de la sustitución se encuentra dentro de la región que se supone importante para la transducción de señales, este cambio podría afectar la función de la molécula.

Ejemplo 4 Preparación del receptor OB soluble

Se han preparado tres formas de receptor OB humano soluble:

1. Líder + Dominio Extracelular (SEC. ID N° 10 y 11): Se preparó una forma recombinante del receptor OB humano soluble. Esta forma incluye en la proteína inmadura, la secuencia líder y el dominio extracelular (aminoácidos 1-839). La proteína madura tendrá suprimida la secuencia líder y el primer aminoácido del receptor OB humano soluble recombinante maduro será 22 (F), 23 (N) o 29 (T). Esta proteína se expresó como se describe a continuación.

2. Líder + Dominio Extracelular + FLAG C-terminal (SEC. ID N° 12): También se preparó una segunda forma del receptor OB humano soluble recombinante. Esta forma presentaba una marca "FLAG" ubicada en el extremo "C" de la proteína. El péptido "FLAG" es una útil herramienta de investigación, dado que permite el seguimiento de la proteína usando un anticuerpo que reconoce el péptido "FLAG". Tales reactivos pueden adquirirse en el mercado (IBI, New Haven, CT). Esta proteína se expresó como se describe a continuación.

3. Variante de Empalme Nativa (SEC. ID N° 13 y 14): Se cree que esta forma es la forma recombinante de un receptor OB humano soluble secretado de existencia natural. Esta forma presenta la mayoría de los aminoácidos en el dominio extracelular (aminoácidos 22-798), y una sola secuencia de 6 aminoácidos en el extremo carboxilo-terminal. Comenzando en el aminoácido de posición 799 de SEC. ID N° 13, la secuencia de aminoácidos de esta variante de empalme nativa de la proteína del receptor OB humano es "G K F T I L".

Ejemplo 5 Preparación de vectores de expresión

Se prepararon vectores de expresión de receptores OB recombinantes humanos para la expresión en celdas de mamíferos. Como se indicó previamente, la expresión también puede efectuarse en células de especies no mamíferas, tales como células bacterianas. El ADNc tipo "A" (SEC. ID N° 2) se insertó en un vector de mamífero que puede adquirirse comercialmente (pCEP4, Invitrogen) para su expresión en células de mamíferos, incluyendo la línea celular renal embrionaria humana "293", de la que se dispone comercialmente.

Los vectores de expresión de receptores OB recombinantes humanos se prepararon para la expresión de un receptor OB soluble recombinante, que comprende la secuencia líder y el dominio extracelular (SEC. ID-N°. 10 y 11), usando el mismo sistema que el indicado previamente (el vector pCEP4 de mamíferos comercialmente disponible, y células "293"). Este receptor OB recombinante humano soluble también se expresó en células CHO de modo similar.

La forma con "marca FLAG" (SEC. ID N° 12) del receptor OB recombinante humano soluble y la forma "D" (SEC. ID N° 7) también se expresaron en células "293" de modo similar al anterior.

Se efectuó la detección de la proteína deseada usando el análisis de BIACORE (Pharmacia). Este análisis es análogo al que se describe en Bartley et al., Nature 368: 558-560 (1994).

La máquina BIACORE esencialmente mide las interacciones de afinidad entre dos proteínas. En este caso, se inmovilizó la proteína OB en la máquina, y se agregó a la máquina medio acondicionado de líneas celulares que expresan el receptor OB. Cualquier proteína receptora presente en el medio condicionado se unió a la superficie de la proteína OB. La máquina BIACORE suministró una lectura indicando que la proteína receptora se estaba expresando. Para la expresión de los receptores solubles recombinantes (SEC. ID N° 10) en células "293", la lectura fue de 191,0 respecto de una lectura basal de 0. Para la expresión de receptores solubles recombinantes (SEC. ID. N° 10) en células CHO, la lectura fue de 150,9 respecto del valor basal de 0. Para los receptores solubles recombinantes con una marca FLAG del extremo C-terminal (SEC. ID. N° 12), la lectura fue de 172,0 respecto del valor basal de 0.

Para la expresión en células bacterianas, típicamente se eliminaría aquella porción que codifica la secuencia líder (p.ej., potencialmente los aminoácidos 1-21, 1-22 ó 1-28). Se puede agregar un metionilo adicional en el extremo N-terminal para la expresión bacteriana. Adicionalmente, se puede sustituir la secuencia líder nativa con una secuencia líder diferente u otra secuencia para escisión, a modo de facilitar la expresión.

Ejemplo 6 Demostración de transducción de señales

Este Ejemplo demuestra que la forma "D" es activa para producir una señal dentro de una célula, donde en el mismo tipo de célula no lo hace la forma "A". El ensayo de transducción de señales se efectuó usando células "293" que expresan transitoriamente ya sea la forma "A" o la forma "D" (véase antes la preparación de los clones de expresión "293"). La fosforilación de moléculas, la que se asume participa de la transducción de señales dentro de la célula, se examinó en la unión de proteína OB a la proteína receptora OB examinada. Los resultados demuestran que al unirse la proteína OB al dominio extracelular, la forma "D" de la presente proteína receptora OB realiza una transducción de señales que es suficiente para iniciar la fosforilación de las moléculas de señalización.

Métodos

1. Moléculas de receptor OB. Como se indicó previamente, se estudiaron la forma "A" (SEC. ID N° 1) y la forma "D" (SEC. ID. N° 7).

2. Sistema de expresión. El sistema pCEP 4 (como se describió previamente) con ADN insertado que codifica la forma "A" (SEC. ID N° 2) o la forma "D" (SEC. ID N° 8) se utilizó para transfectar células "293". Estas células no permitieron que el vector pCEP4 se integrara al genoma, de modo que tal expresión fue transitoria. También se prepararon células no recombinantes (falsamente transfectadas) como controles.

3. Detección de fosforilación. Se analizaron las células falsamente transfectadas y las células que expresan la forma "A" o la forma "D". Previo al tratamiento, las células se privaron de suero mediante la incubación en un medio con suero al 0,5% durante 16 horas previo a los tratamientos. Las células se trataron con la proteína OB (10 mg/ml) durante 15 minutos a 37°C, después de lo cual las células se lisaron en buffer NP40 modificado (Tris 50 mM, pH 8,0, cloruro de sodio 150 mM, 1% NP40, 10 mg/ml de aprotinina, EDTA 5 mM, ortovanadato de sodio 200 mM). Las proteínas que contenían fosfotirosina se inmunoprecipitaron (anticuerpo 4G10 anti-fosfotirosina, UBI, Lake Placid, NY), y se separaron mediante electroforesis con SDS en gel de poliacrilamida. Luego de la electroforesis y la electrotransferencia a membranas, los inmunoprecipitados se comunicaron mediante sondas con anticuerpos a diferentes moléculas de transducción de señales. Se obtuvieron anticuerpos de STATs, JAKs y ERKs de Santa Cruz Biotechnology Inc. Se detectaron complejos inmunes mediante reactivos secundarios de peroxidasa conjugada de rábano picante, utilizando quimioluminiscencia como describe el fabricante (ECL, Amersham). Como control positivo, se trataron células 32D con IL-3, de la que se sabe activa la mayoría de las moléculas que se analizan por fosforilación de la tirosina.

4. Resultados. Los resultados se presentan en la Tabla 3, a continuación. Como puede verse, sólo la forma "D" presentó capacidad de responder ya sea a proteína OB humana o de ratón, como se detectó mediante fosforilación de las moléculas JAK y STAT. Una designación "+" indica que la señal fue detectada, una designación "-" significa que no se observó señal alguna.

TABLA 3

Señal /AB \neq	293 solo	293/D hrOB*	293/D mrOB**	293/A hrOB #	293/A mrOB # #	32 D IL-3
STAT 1	-	+
STAT 3	-	+	+	-	-	+
STAT 5	-	+	+			+
JAK 1	-	+	+	-	-	+
JAK2	-	+	+	-	-	+
JAK 3	-	-	-			-
TYK 2	-	+	+			-
ERKs 1,2	-	-	-	-	-	+
\alm{1} \; objetivo de detección de anticuerpo
* \; células 293 que expresan la forma "D" del receptor, tratadas con OB recombinante humana
** células 293 que expresan la forma "D" del receptor, tratadas con OB recombinante murina
\alm{1} \; células 293 que expresan la forma "A" del receptor, tratadas con OB recombinante humana
\alm{2} células 293 que expresan la forma "A" del receptor, tratadas con OB recombinante murina.

La forma "D" es capaz de iniciar la señalización a través de las vías JAK/STAT en células 293, mientras que la forma "A" no puede hacerlo.

Ejemplo 7 Uso de receptores OB solubles como un agente terapéutico

Este Ejemplo demuestra que la proteína receptora OB soluble actúa para proteger la actividad de la proteína OB. A continuación, se suministró un receptor OB soluble y/o una proteína OB a un mamífero mediante un "transplante génico" -ello significa, a través de células de médula ósea modificadas genéticamente para expresar los ADN deseados. Cuando se suministró un receptor OB soluble combinado con proteína OB, los animales perdieron más peso que al suministrárseles la proteína OB sola. Esto demuestra la actividad protectora de la proteína receptora OB.

Dado que no se desea que la teoría constituya una limitación, una explicación del modo de acción es que la proteína receptora OB soluble actúa para proteger la proteína OB en suero de agentes o afecciones que pueden reducir su actividad. La acción protectora parece incrementar la vida media en circulación de la proteína. Como tal, el presente ejemplo demuestra que el receptor OB ya sea solo o administrado como un complejo con proteína OB (o análogos o derivados de los mismos) podría actuar como un agente terapéutico.

Materiales y métodos 1. Preparación de células packaging recombinantes OB del vector retroviral

Uso de ADNc ob murino Se amplificó el ADNc ob murino de tipo salvaje de longitud total mediante PCR usando oligonucleótidos sintéticos diseñados a partir de la secuencia publicada por Zhang et al., Nature 372: 425-432 (1994). Se usaron conectores (un conector Eco RI y un conector Bgl II) para facilitar el subclonado.

Uso de ADNc de receptores OB solubles recombinantes humanos. Se utilizaron métodos similares a los que se usaron anteriormente. Se utilizó una construcción que contenía el receptor recombinante humano soluble de SEC. ID N° 10 y se modificó con conectores para facilitar el clonado (p. ej. la adición de un sitio de restricción Bgl II de reconocimiento de endonucleasa).

Ubicación del ADNc deseado en el vector. Se digirieron productos de PCR con EcoRI y BglII y se clonaron en el vectores progenitor de digestión similar (pMSCV2.1) bajo el control transcripcional del promotor viral LTR. El vector progenitor MSCV (suministrado por R. Hawley, University de Toronto, Canadá) se derivó a partir de MESV (virus de células tronacles embrionarias murinas) y contiene gen resistente a la fosfotransferasa de neomicina (neo^{r}) conducido por un promotor interno de fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK), como se describe en Hawley, et al, J. Exp. Med. 176: 1149-1163 (1992). Los plásmidos progenitores pMSCV2.1 y pMSCV-OB se someten a electroporación en forma independiente en la línea celular de packaging GP+E-86 (suministrada por el Dr. A. Bank, Columbia University, NY) Markowitz et al., J. Virol. 62: 1120-1124 (1988). Se cosecharon sobrenadantes transitorios a partir de poblaciones electroporadas y se usaron para infectar células GP+E-86 progenitoras tratadas con tunicamicina. El tratamiento con tunicamicina alivia el bloque a la superinfección de las células de packaging progenitoras. Se seleccionaron clones resistentes G418 (0,78 mg/ml, 67% de actividad, GIBCO Laboratories, Life Technologies, Inca, Grand Island, NY) de cada población infectada y se titularon por infección de células NIH3T3. Los clones con el mayor título de resistencia G418 se expandieron y congelaron como alícuotas. Cada infección de médula ósea y cada experimento de transplante utilizó alícuotas del mismo pasaje de células de packaging virales congeladas. Se estudiaron ambas líneas celulares, las progenitoras y las de packaging ob, respecto de la presencia del virus competente de replicación, mediante un ensayo sensible de rescate de marcador, no encontrándose dicho virus. Moore, et al., (1993) en: Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, Ed. (Oxford University Press, New York, NY).

2. Producción de sobrenadantes retrovirales

Las líneas celulares de packaging recombinantes productoras de virus se cultivaron en matraces de cultivo tisular de 175 cm^{2} en un medio de Dulbecco Modificado de Iscove (IMDM) (GIBCO), 10% (v/v) de FBS, a 37ºC. Se alimentaron monocapas de células sub-confluentes (aproximadamente 60%) con medio fresco 24 horas antes de cosechar los sobrenadantes que contenían el virus. Los sobrenadantes virales se removieron de las líneas celulares de packaging mediante aspiración, se filtraron en forma estéril (0,45 mM) y se agregaron directamente a cultivos de médula ósea. Se descongelaron las alícuotas frescas de líneas celulares de packaging congeladas para ser usadas en cada experi-
mento.

3. Infección de médula ósea y transplante

Se usaron ratones hembra de 8 a 12 semanas de edad C57BU6J (+/+) u (ob/ob) como donantes de médula ósea y receptores. Todos los ratones fueron adquiridos en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en condiciones específicas libres de patógenos en un viviario según las regulaciones gubernamentales y las directivas institucionales.

\newpage

Se cosecharon células de médula ósea de fémores y tibias de ratones donantes 4 días después del tratamiento con 5-fluorouracilo (5FU, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). (150 mg/kg i.v.). Se incubaron las células de médula ósea (6 X 10^{5}/ml) en recipientes para cultivo tisular de 150 mm (30 ml/recipiente) que contenía sobrenadante viral fresco (como se describió previamente), 15% de FBS, 6 mg/ml de polibreno (Sigma), albúmina de suero bovino al 0,1% (BSA, Fraction V. Sigma), 2,5 ng/ml de IL-3 de ratón recombinante (rmIL-3), 100 ng/ml de cada una de IL-6 humana recombinante (rhIL-6), IL-11 humana recombinante (rhIL-il) y SCF de rata recombinante (rrSCF). Todos los factores de crecimiento habían sido producidos por Amgen, Inc. (Thousand Oaks, CA). El medio de cultivo se reemplazó a diario con sobrenadante fresco que contenía virus y factores de crecimiento.

Al final del período de infección, se lavaron las células no adherentes totales y las células adherentes y se resuspendieron en solución salina BSA al 1% y se transplantaron en ratones g-irradiados (12 Gy, Cs^{137}). Cada animal fue transplantado con 2,5 X 10^{6} singeneicas. Fueron de aproximadamente 10 animales por cohorte.

4. Análisis de la expresión de proteína OB en células transfectadas y animales transplantados

Se realizó el análisis Western para células de médula ósea transfectadas. Se resolvió el sobrenadante de células del vector packaging mediante SDS-PAGE (acrilamida 16%), luego se transfirieron a Hybond-ECL (Amersham, Arlington Heights, IL). El filtrado se incubó con anticuerpo policlonal de proteína OB anti-ratón de conejo purificada por afinidad (1 mg/ml) en buffer T-TBS (Tris-cloruro 20 mM, pH 7,6, NaCl 137 mM, 0,1% de Tween20) a temperatura ambiente durante 45 min. Se diluyó IgG de burro anti-conejo (Amersham) conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) en T-TBS (1:2500) y se incubó con el filtro a temperatura ambiente durante 45 min. Se efectuó una detección de quimioluminiscencia aumentada (ECL, Amersham) según lo recomendado por el fabricante.

Para los animales transplantados, se analizó el suero. Se sangró a los animales en forma retroorbital bajo anestesia de isofluorano. Se resolvió el suero de animales ob/ob transplantados mediante SDS-PAGE (acrilamida 4-20%) en condiciones reductoras y no reductoras, luego se transfirió a membranas Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Las membranas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con anticuerpo de proteína OB anti-ratón de conejo conjugado con HRP (0,125 mg/ml) en buffer T-TBS que contenía 5% de suero bovino fetal y 1% de albúmina de suero bovino. Se detectó la proteína OB unida mediante ECL (Amersham), del modo recomendado por el fabricante.

Para la cuantificación de los niveles de proteína OB soluble, se sometió el suero de animales transplantados a análisis por ELISA. Resumidamente, se recubrieron placas de 96-pocillos con anticuerpo policonal de proteína anti-OB de conejo purificada por afinidad. Se agregaron los patrones (monómero purificado recombinante de proteína OB, Peileymounter et al., Science 269: 540-543 (1995) y muestras experimentales, y las placas se incubaron a temperatura ambiente. Las placas se lavaron dos veces y se agregó anticuerpo de proteína OB de conejo purificada por afinidad conjugada con peroxidasa de rábano picante. Después de la incubación a temperatura ambiente, las placas se lavaron cuatro veces con TNE-Tween20. Se agregó TMB/sustrato de peroxidasa y se leyó el color de la reacción a 450 nm en una lectora de placas de Molecular Devices. Se estimaron las concentraciones de proteína OB en suero a los efectos de su comparación con una curva estándar preparada a partir de patrones internos. Los niveles de proteína OB se midieron en forma confiable en muestras que contenían >160 pg/ml.

5. Peso corporal e ingesta de alimentos

Se ofreció a los ratones alimento pelletizado para roedores (PMT Feeds, Inc., St. Louis, MO) ad libitum. El peso corporal de los animales individuales se registró diariamente en los primeros dos meses del análisis y posteriormente una vez por semana. El consumo de alimento se midió a diario en grupos seleccionados de animales alojados individualmente.

Resultados

Los resultados se representan en las Tablas 4 y 5 a continuación. La administración del receptor de la proteína OB aumentó la efectividad de la proteína OB. Esto puede haberse realizado mediante un mayor tiempo de circulación de la proteína OB en presencia de receptores de la proteína OB.

Como puede verse en la Tabla, los animales a los que se administró una combinación de la proteína OB y receptores de la proteína OB (mediante terapia génica) presentaron una mayor pérdida de peso al cabo de 28 días que con cualquier composición sola. La Tabla presenta los resultados de dos experimentos ("/"). Como puede verse, el uso de la proteína OB sola en el día 40 dio como resultado animales con 87,5% y 72,2% del peso de partida. La utilización del receptor OB en combinación con la proteína OB, de todos modos, dio lugar a animales con 68% y 53,6% del peso de partida. El uso del receptor solo pareció tener escaso efecto, o ningún efecto.

TABLA 4

Tratamiento	Reducción de peso (g)	% del peso de partida	% del peso de partida
	en el día 28 (prom.)	(prom.) en el día 28	(prom.) en el día 40
OB sola *	6,3/12,7	87,9/75,3	87,5/72,2
Receptor ** solo	[1,4]/[0,3]	103/100,6	104,2/101,7
OB + Receptor ***	12,6/16,8	76,3/67,5	68/53,6
\; \; * \begin{minipage}[t]{140mm}50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de proteína OB como se describió previamente, y 50% de células de médula ósea sin alteración genética\end{minipage}
\; ** \begin{minipage}[t]{140mm}50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de la proteína receptora OB como se describió previamente, y 50% de células de médula ósea sin alteración genética\end{minipage}
*** \begin{minipage}[t]{140mm}50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de proteína OB como se describió previamente, y 50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de la proteína receptora OB como se describió previamente.\end{minipage}

La Tabla 5, a continuación, incluye resultados de los niveles de OB encontrados en el suero de animales, a los que se administró proteína OB sola, o a los que se administró proteína OB en combinación con receptores de la proteína OB (mediante el método "terapia génica" de este ejemplo). Los datos reflejan nanogramos de proteína OB por mililitro de suero, más o menos el error estándar de la media.

TABLA 5

Tratamiento	Experimento # 1 \neq	Experimento # 2 \neq \neq
OB sola*	2,93 +/- 0,77	9,74 +/- 1,02
Receptor ** solo	0,08 +/- 0,05	0,12 +/- 0,07
OB + Receptor ***	12,11 +/- 1,90	15,18 +/- 2,52
\; \; * \begin{minipage}[t]{135mm}50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de proteína OB como se describió previamente, y 50% de células de médula ósea sin alteración genética\end{minipage}
\; ** \begin{minipage}[t]{135mm}50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de proteína receptora OB como se describió previamente, y 50% de células de médula ósea sin alteración genética\end{minipage}
*** \begin{minipage}[t]{135mm}50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de proteína OB como se describió previamente, y 50% de células de médula ósea transfectadas con ADNc de proteína receptora OB como se describió previamente.\end{minipage}
\; \neq \begin{minipage}[t]{135mm}El experimento \alm{1} 1 se realizó como se describió previamente, con niveles de proteína OB en suero medidos al cabo de 38 días.\end{minipage}
\neq\neq \begin{minipage}[t]{135mm}El experimento \alm{1} 2 también se realizó como se describió previamente, con niveles de proteína OB en suero medidos al cabo de 24 días.\end{minipage}

Los datos demuestran los efectos protectores del receptor OB. Como puede verse, en presencia del receptor OB, la proteína OB presenta una mayor acumulación en suero. Se observa que el grado de acumulación se incrementa inversamente a los niveles de la proteína OB en suero. En el Experimento #1 (con un nivel basal de proteína OB de aproximadamente 2,93 ng/ml), aumentó el nivel en suero de la proteína OB alrededor del 400% con el agregado de receptor, donde en el experimento #2 (con una base de alrededor de 9,74), los niveles de proteína OB en suero aumentaron en alrededor del 25%.

El receptor OB administrado ya sea solo o en asociación con la proteína OB (o análogos o derivados de la misma) pueden servir para incrementar el tiempo de circulación de la proteína OB, aumentando así la eficacia terapéutica de la proteína OB, ya sea exógena o endógena.

Ejemplo 8 Preparación de moléculas de unión selectiva

Se inmunizaron animales para la preparación de anticuerpos policlonales usando los siguientes péptidos (respecto de la numeración de los aminoácidos para el receptor OB A, SEC. ID N° 1): 54-64; 91-100; 310-325; 397-406; 482-496; 874-885; y, con respecto a los aminoácidos del receptor OB "C" (SEC. ID N° 5), 910-929. Algunos de los anticuerpos policlonales preparados (en conejos) se ensayaron respecto de su capacidad para unirse a la proteína receptora OB humana recombinante. Se encontró que el anticuerpo policlonal preparado contra los aminoácidos 54-64 presentó la mayor afinidad para el receptor de proteína OB recombinante humana. También se observó que el anticuerpo policlonal preparado contra los aminoácidos 397-406 se une a la proteína receptora OB recombinante humana. Se encontró que el anticuerpo policlonal preparado contra los aminoácidos 91-100 se unía levemente con la proteína receptora OB recombinante humana. Se observó que el anticuerpo policlonal preparado contra los aminoácidos 874-885 no formaba unión con la proteína receptora OB recombinante humana.

Se realizó un estudio adicional, que demostró la expresión y purificación del dominio extracelular de la proteína receptora OB en células CHO y anticuerpos que reconocen este dominio extracelular de la proteína receptora OB.

El dominio extracelular de la proteína receptora OB humana se expresó como una proteína secretada, soluble en células CHO, como se describió previamente supra. Se aislaron líneas celulares individuales y se cultivaron en proporciones crecientes de metotrexato para aumentar la selección/expresión del receptor de la proteína recombinante (100, 200 ó 500 microgramos de metotrexato por ml de medio). Se recogió medio condicionado de las líneas celulares CHO, y se fraccionaron las proteínas del medio condicionado mediante SDS-PAGE. El dominio extracelular del receptor OB migró como una banda ancha con un rango aparente de tamaño de alrededor de 140 kDa hasta alrededor de 200 kDa. El dominio extracelular de la proteína receptora OB se detectó mediante análisis Western Blot usando anticuerpos policlonales preparados contra una porción del dominio extracelular de la proteína receptora OB. La proteína desplegada, expresada en forma bacteriana, se utilizó como antígeno para generar antisueros en conejos. El dominio extracelular identificado del receptor OB se purificó mediante cromatografía de afinidad. La proteína purificada se secuenció en el extremo amino-terminal para confirmar que era el receptor OB y asimismo para determinar el comienzo de la proteína madura (luego de la escisión del péptido señal) expresada en células CHO. Se encontró que el aminoácido N° 22 (conforme a la numeración de la secuencia de aminoácidos SEC. ID N° 1, infra), era el primer aminoácido de la proteína madura expresada en células CHO.

Pueden usarse otros péptidos inmunogénicos. Pueden prepararse fragmentos policlonales, policlonales monoespecíficos, monoclonales, fragmentos de anticuerpos y anticuerpos recombinantes, usando métodos conocidos por los especialistas en la técnica.

Además pueden usarse técnicas recombinantes o métodos de síntesis de péptidos para alterar el carácter de tales moléculas de unión selectiva. Esto puede realizarse al prepararse anticuerpos recombinantes que presentan regiones alteradas determinantes de la complementariedad (en ocasiones denominadas "CDR's" en la técnica) para, por ejemplo, "humanizar" los anticuerpos usando regiones Fe humanas (constantes). Pueden prepararse otros tipos de anticuerpos recombinantes, por ejemplo aquellos que presentan CDR's alteradas para aumentar la afinidad o la selectividad respecto de uno o más miembros de la familia de los receptores OB y usar métodos conocidos por los especialistas en la técnica. Véase, Winter et al., Nature 349: 293 299 (1991).

La presente proteína receptora OB puede usarse como un ensayo para seleccionar las moléculas deseadas de unión selectiva. Tal ensayo puede estar basado en la capacidad de producir la unión, o en la actividad biológica o en otros medios para detectar la transducción de señales. Por ejemplo, si se prepara una serie de anticuerpos modificados, se puede verificar en ellos la afinidad (p. ej. la intensidad de la unión) respecto del correspondiente receptor OB blanco.

Las moléculas de unión selectiva pueden ser útiles a los fines de diagnóstico, tal como el análisis de distribución tisular, o para diagnosticar la afinidad relativa de los receptores OB de un individuo para tal molécula de unión selectiva para determinar la funcionalidad del receptor OB de un individuo durante el transcurso de la terapia. Las moléculas de unión selectiva pueden ser productos terapéuticos o cosméticos alternativos a la proteína OB.

Ejemplo 9 Terapia génica

Se puede suministrar la presente proteína receptora OB mediante una terapia génica, como se describe infra.

Se puede proceder usando materiales y métodos disponibles para aquellos especialistas en la técnica que se proveen aquí, usando células T como agente portador del receptor OB de expresión de ADN, para la terapia génica. Un individuo recibiría células T seleccionadas usando la selección CD34+ y un dispositivo de selección de micropartículas magnéticas. Tales células serían transfectadas con el ADN deseado, o la regulación de la región codificadora deseada puede alterarse usando la recombinación homóloga u otras técnicas in situ. Las células transducidas podrían seleccionarse empíricamente, usando medios para detectar la proteína deseada, o puede incluirse un marcador que permita la detección indirecta (es decir, un marcador seleccionable como se conoce en la técnica). Opcionalmente, tales células podrían expandirse, por ejemplo, usando uno o más factores de crecimiento, tal como SCF o una interleuquina, y tales células podrían almacenarse para un uso futuro. De tal modo, el procedimiento sólo debería llevarse a cabo una vez o de modo infrecuente en la vida del individuo, para la posterior transferencia al individuo. Las células serían re-implantadas en el individuo, y el individuo sería monitoreado respecto del efecto terapéutico deseado, tal como pérdida de peso/mantenimiento de peso, recurrencia de diabetes, niveles de lípidos en sangre u otras condiciones.

Secuencias Ilustrativas de Ácidos Nucleicos y Aminoácidos

Las secuencias de aminoácidos y de ADN que se indican a continuación son aquellas a las que se ha hecho referencia. Un asterisco ("*") indica la posición de un codón de detención.

Secuencia de Aminoácidos del Receptor "A" de OB Humana (Sec. ID No. 1 (Abreviatura de aminoácidos de letra única)

2

Secuencia de ADN de OB Humana (Sec. ID No. 2 (ADN)

3

4

5

Secuencia de Aminoácidos del Receptor "B" de OB Humana (Sec. ID No. 3)

6

Secuencia de ADN del Receptor "B" de OB Humana (Sec. ID No. 4 (ADN)

7

8

9

Secuencia de Aminoácidos del Receptor "C" de OB Humana (Sec. ID No. 5 (Aminoácidos))

10

11

Secuencia de ADN del Receptor "D" de OB Humana (Sec. ID No. 6 (ADN)

12

13

14

Secuencia de Aminoácidos del Receptor "D" de OB Humana (Secuencia ID No. 7)

15

Secuencia de Ácido Nucleico del Receptor "D" de OB Humana (Secuencia ID No. 8)

16

17

18

ADN Cromosómico de la Proteína Receptora "D" de OB Humana (Secuencia ID No. 9)

19

20

Proteína Receptora de OB Humana, secuencia de aminoácidos del Receptor Secretado Recombinante (Sec. ID No. 10)

21

Proteína Receptora de OB Humana, secuencia del ADN del Receptor Secretado Recombinante (Sec. ID No. 11)

22

23

Proteína Receptora de OB Humana, secuencia del ADN del Receptor Secretado Recombinante con FLAG C-terminal (Sec. ID. No. 12)

24

25

26

Proteína Receptora Recombinante de OB Humana, secuencia de aminoácidos de la Variante de Empalme Natural (Sec. ID. No. 13)

27

Proteína Receptora de OB Humana, ADN de la Variante de Empalme Natural (Sec. ID. No. 14)

28

29

Aunque la presente invención se ha descrito en términos de formas de realización preferidas, se comprende que a los expertos en la técnica les surgirán variaciones y modificaciones. Por ende, es la intención que las reivindicaciones adjuntas abarquen todas las mencionadas variaciones equivalentes comprendidas dentro del alcance de la invención reivindicada.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: CHANG, MING-SHI

\hskip3,9cm WELCHER, ANDREW A.

\hskip3,9cm FLETCHER, FREDERICK A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: RECEPTOR DE LA PROTEÍNA OB Y COMPOSICIONES Y MÉTODOS RELACIONADOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 33

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Amgen Inc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1840 Dehavilland Drive

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Thousand Oaks

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 91320

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: disco Floppy

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

COMPUTADORA: PC IBM compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL LETRADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Pessin, Karol M.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: A-382-A

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 965 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 1:

30

31

32

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3193 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

75

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 995 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: de aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 3

36

37

38

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3063 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO): 4:

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 969 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

42

43

44

45

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 969 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 6:

46

47

48

49

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1216 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: de aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

50

51

52

53

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3599 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

58

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

NNNNNTACCT TTTCCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 839 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: de aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

59

60

61

62

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2624 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

65

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2948 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

66

67

68

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 804 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: de aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

69

70

71

72

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2507 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 14:

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTTATT TGNNNNNATA TCCTAACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGCATTA GCNNNNNTTT TAAATTCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTACCA AANNNNNTTT TCAATATAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTTATG CANNNNNTTT TTCCTTAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 28 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTATAT TTNNNNAATA TTTAACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGGTTATG TANNNNNCCC TCATTACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGAAAAC AGNNNNNTGT TTCAAATAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACCTATTA TTNNNNNTAT CTTTTAAAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATGTCAAG CTNNNNNAAA AATTTCTAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACCTTTTA CTNNNNNCTT ATTTTACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTGCAGAG ATNNNNNGTC ATTTTGCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTCCCAA TTNNNNNTAT TTACTACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTCCCAA TTNNNNNTAT TTACTACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAGTTTAC TANNNNNTTT TCTCCTCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAAAAATTA TANNNNNTTT CTTTTTCAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATTGTACT TGNNNNNTAT CCTTTGTAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTGCTTTTT CANNNNNTTA TCTAAACAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 32:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACATTTGT CTNNNNNCTT TTCTTTTAG

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATCCAGTG TTNNNNNCTT TCTAAACAG

\hfill

Claims (11)

1. Una preparación de proteína receptora OB que contiene una proteína receptora OB, opcionalmente en una formulación aceptable para uso farmacéutico, en la cual dicha proteína receptora OB comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos (conforme a la Sec. ID N° 1):

(a) 1-896;

(b) 22-896, opcionalmente con un residuo metionilo N-terminal;

(c) 23-896, opcionalmente con un residuo metionilo N-terminal;

(d) 29-896, opcionalmente con un residuo metionilo N-terminal;

(e) 22-891, opcionalmente con un residuo metionilo N-terminal;

(f) 23-891, opcionalmente con un residuo metionilo N-terminal;

(g) 29-891, opcionalmente con un residuo metionilo N-terminal;

(h) las secuencias (e) hasta (g), que además poseen los aminoácidos C-terminales, comenzando en la posición 892, del receptor B de OB (Sec. ID N° 3) o C (Sec. ID N° 5); e

(i) un derivado químicamente modificado de cualquiera de las subpartes (a) hasta (h).

2. Una preparación de proteína receptora OB de la reivindicación 1, en la cual dicha proteína receptora OB ha sustituido los aminoácidos C-terminales, comenzando en la posición 799, por G K F T I L (Sec. ID N° 13).

3. Una preparación de proteína receptora OB según la reivindicación 1 o 2, en la cual el dominio extracelular, que se extiende desde la posición 22(F), 23(N) o 29(T) a la posición 839(D) u 841(G) de dicha proteína receptora OB, está modificado, estando dicha modificación seleccionada entre:

(a) supresión de todo o parte del dominio de arrollamiento helicoidal desde aproximadamente el aminoácido 642 hasta el aminoácido 839 u 841,

(b) modificación de una o ambas cajas "WSXWS" por sustitución de la primera serina con otro aminoácido;

(c) modificación de una o ambas cajas "WSXWS" por sustitución de la última serina con otro aminoácido; y

(d) modificación de una o ambas cajas "WSXWS" por sustitución del primer triptofano con otro aminoácido.

4. Una molécula de ADN que codifica una proteína receptora OB según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector de expresión o de clonación que contiene un ADN de la reivindicación 4.

6. Una célula huésped procariota o eucariota que contiene el vector de la reivindicación 5.

7. Una célula huésped de la reivindicación 6, que es una célula huésped humana aislada.

8. Un proceso para producir una proteína receptora OB que comprende el cultivo en condiciones adecuadas, de una célula huésped según la reivindicación 6, la obtención del receptor OB producido y opcionalmente la preparación de una composición farmacéutica que contiene dicho receptor OB.

9. Uso de una proteína receptora OB según las reivindicaciones 1 - 3, o producida mediante el proceso de la reivindicación 8, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la obesidad, diabetes, niveles elevados de lípidos en sangre o niveles elevados de colesterol.

10. Preparación de un complejo de proteína OB/proteína receptora OB que contiene un resto de la proteína OB y un resto de la proteína receptora OB, opcionalmente en una formulación aceptable para uso farmacéutico, en la cual:

(a) dicha proteína receptora OB se seleccionada entre las expuestas en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y

(b) dicho resto de la proteína OB se seleccionado entre:

(i)

una proteína OB natural; y

(ii)

una proteína OB no natural, un análogo o derivado de la misma.

11. Uso de una preparación de complejo de proteína OB/proteína receptora OB según la reivindicación 10, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la obesidad, diabetes, niveles elevados de lípidos en sangre o niveles elevados de colesterol.