PL189309B1 - Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (sTNFR), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą sTNFR, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania sTNFR, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie sTNFR do wytwarzania środka leczniczego - Google Patents

Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (sTNFR), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą sTNFR, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania sTNFR, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie sTNFR do wytwarzania środka leczniczego

Info

Publication number
PL189309B1
PL189309B1 PL97331240A PL33124097A PL189309B1 PL 189309 B1 PL189309 B1 PL 189309B1 PL 97331240 A PL97331240 A PL 97331240A PL 33124097 A PL33124097 A PL 33124097A PL 189309 B1 PL189309 B1 PL 189309B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
stnfr
cys
truncated
cooh
group
Prior art date
Application number
PL97331240A
Other languages
English (en)
Other versions
PL331240A1 (en
Inventor
Eric F. Fisher
Carl K. Edwards Iii
Gary L. Kieft
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of PL331240A1 publication Critical patent/PL331240A1/xx
Publication of PL189309B1 publication Critical patent/PL189309B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7151—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for tumor necrosis factor [TNF], for lymphotoxin [LT]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/08—Antiepileptics; Anticonvulsants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/08—Vasodilators for multiple indications
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Abstract

1. Obciety rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (obciety sTNFR) obejm ujacy strukture okreslona nastepuja- cym wzorem R1-[Cys19-Cys103]-R 2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obcietym sTNFR typu-I (którego schem at numeracji reszt aminokwasowych od- powiada kolejnosci reszt aminokwasowych na rysunku fig 1 - SEQ ID NO 2, dla ulatwienia porównania), R1 oznacza grape o wzorze NH 2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zas R2 oznacza grupe o wzorze -FN-COOH oraz jego warianty i pochodne 2 Obciety sTNFR wedlug zastrz 1, znam ienny tym, ze jest wybrany z grupy obejmujacej sTNFR 2 6D/C105 N H 2- MDSVCPQGKYIHPQNNSlC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, sTNFR 2 6D/C106 N H 2-M DSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys1 0 3 ]- FNCSL-COOH, sTNFR-I 2 6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys1 9-Cys1 03]-FN-COOH, sTNFR-I 2 3D/d8 NH2- MYlHPQNNSIC-[Cys1 9 -C ys1 03]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2 3D /dl5 NH2-M SIS-[C ys1 9 -Cys103]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2 3D /d18NH2-M -[Cys1 9 -Cys103]-FNCSL-COOH 31 Kompozycja farm aceutyczna zawierajaca substancje aktywna oraz nosnik i/lub substancje pomocnicze, znam ienna tym, ze jako substancje aktywna zawiera a) wielowartosciowa proteine wiazaca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejm ujaca co najmniej jeden obciety sTNFR obejmujacy strukture okreslona nastepujacym wzorem R 1 -[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys19-C ys1 0 3 ] oznacza reszty od 19 do 103 w obcietym sTNFR typu-I (którego schem at numeracji reszt aminokwasowych od- powiada kolejnosci reszt aminokwasowych na rysunku fig 1 - SEQ ID NO 2, dla ulatwienia porownania), R 1 oznacza grupe o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zas R2 oznacza grupe o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególnosci obejm ujaca obciety sTNFR wybrany z grupy, do której naleza sTNFR 2 6D/C105 NH2- -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH, sTNFR 2 6D /C 106 NH2-M DSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys1 9 -Cys1 0 3 ]- -FNCSL-COOH, sTNFR-I 2 6D/N105 N H 2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-C ys103-FN-COOH, sTNFR-I 2 3D/d8 NH2 - -MYIHPQNNSIC-[Cys1 9 -C ys103]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2 3D /d15 NH 2-M SIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2 3D/d18 NH2-M -[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH, PL PL PL PL PL PL

Description

Wynalazek dotyczy także obciętego sTNFR będącego rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zdefiniowanej wyżej.
Wynalazek obejmuje także sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję aktywną oraz nośnik i ewentualne substancje pomocnicze, polegający na tym, ze jako substancję aktywną stosuje się obcięty sTNFR określony wyżej i/lub wielowartościową proteinę wiążącą TNF (TNFbp) określoną wyżej i terapeutycznie skuteczną ilość wskazanej substancji aktywnej miesza się z jednym lub z więcej niż jednym farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
189 309
Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i nośnik oraz ewentualne substancje pomocnicze, według wynalazku cechuje się tym, ze jako substancję aktywną zawiera obcięty sTNFR określony wyżej, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Alternatywnie, kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną i nośnik oruz ewentualne substancje pomocnicze, według wynalazku cechuje się tym, że jako substancję aktywną zawiera wielowartościową proteinę wiążącą TNF (TNFbp) określoną wyżej, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Korzystnie, kompozycja według wynalazku zawiera kompozycję zapewniającą przedłużone uwalnianie substancji aktywnej. Korzystnie również kompozycja według wynalazku jest zliofilizowunu.
Wynalazek obejmuje także zastosowanie obciętego sTNFR określonego wyżej albo wielowurtościowej proteiny wiążącej TNF (TNFbp) określonej wyżej do wytwarzaniu środku leczniczego do leczenia chorób mediowunych przez czynnik martwicy nowotworu - TNF.
Zgodnie z wynalazkiem obcięty sTNFR określony wyżej, albo wielowurtościowu proteina wiążącu TNF (TNFbp) określona wyżej, albo też kompozycja farmaceutyczna określona wyżej znajdują zastosowanie do wytwarzaniu środka leczniczego do leczenia cukrzycy, przeczulicy bólowej, choroby zapalnej jelit, urazu niedokrwiennego, urazu związanego zreperfuzją lub choroby reumatycznej. Choroba reumatyczna jest przy tym wybrana z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zapalenie skórnomięśniowe, łuszczycowe zapalenie stawów, twardzina skóry, syndrom Sjogrena oruz zapalenie naczyń.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku wytwarzany środek leczniczy mu postać odpowiednią do podawaniu dożylnego, domięśniowego, śródskórnego, podskórnego, dostuwowego lub przez infuzję. Korzystnie, wytwarzany środek mu postać odpowiednią do podawania przed, po lub równocześnie z podawaniem środka przeciwzapalnego.
W zastosowaniu według wynalazku środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDs), kortykosteroidy, powolnie działające leki przeciwreumatyczne (SAARDs) Iub leki modyfikujące chorobę (DM). Środkiem przeciwzapalnym może być również inhibitor interleukiny-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ru) oraz rozpuszczalny receptor IL-1. Korzystnym środkiem przeciwzapalnym jest metotreksat.
Zgodnie z wynalazkiem, kompozycja farmaceutyczna może dodatkowo zawierać środek przeciwzapalny. Korzystnie, środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAIDs), kortykosteroidy, powolnie działające leki przeciwreumatyczne (SAARDs) lub leki modyfikujące chorobę (DM), zwłaszcza metotreksat.
Środkiem przeciwzapalnym może być również inhibitor interleukiny-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ru) oraz rozpuszczalny receptor IL-1. Korzystnie ŻL-1ra zawiera sekwencję ludzkiego IL-1ra.
Obecny wynalazek dotyczy funkcjonalnie aktywnych obciętych form sTNFR-I, które w niniejszym opisie określane są jako „obcięty sTNFR” lub „obcięte sTNFRs”. Obcięte sTNFRs są zmodyfikowanymi formami sTNFR-I, które nie zawierają czwartej domeny (reszty aminokwasowe Thr127-Asn161 w sTNFR-I); części trzeciej domeny (reszty aminokwasowe Asn111-Cys*26 w sTNFR-I) oruz ewentualnie nie zawierają części pierwszej domeny (reszty aminokwasowe Asp1-Cys1 w sTNFR-I). Te nowe inhibitory TNF (przykładowo TNF-α i/lub TNF-β) mają ogólną stosowalność.
Obcięte sTNFRs według wynalazku obejmują proteiny określone wzorem R1-[Cys-Cys1°3]-R2. Proteiny te są obciętymi formami sTNFR-I.
Przez określenie „R1-[Cys-Cys1<)3]-R2 ” rozumie się jedną lub więcej protein w których [Cys19-Cys1()3] oznacza reszty od 19 do 103 w sTNFR-I; schemat numeracji reszt aminokwusowych jest podany na rysunku fig. 1 (SEQ ID NO:2) dla ułatwieniu porównania, gdzie R1 i R2 mają wyżej określone znaczenie.
W jednym aspekcie obecnego wynalazku obcięte sTNFRs mogą być wytworzone w postaci form glikozylowanych lub nieglikozylowunych. Obcięte sTNFRs wytwarza się
189 309 rekombiąayyjąymi technikami inżynierii genetycznej. W alternatywnym wykonaniu obcięte sTNFRs syntezuje się metodami chemicznymi lub metodami mieszanymi: eekombinacyjąymi i chemicznymi.
W innym aspekcie obecnego wynalazku obcięte sTNFRs można derywatyzować przez przyłączenie obciętych sTNFRs do polimeru rozpuszczalnego w wodzie. Przykładowo, obcięte sTNFRs można sprzęgać z jedną lub większą ilością cząsteczek glikolu polietylenowego aby polepszyć farmakkkiąetycząś właściwości przez zwiększenie pozornego ciężaru cząsteczkowego tej cząsteczki.
Jeszcze inny aspekt obecnego wynalazku obejmuje różne polinukleotydy kodujące obcięte sTNFRs. Odpowiednie sekwencje kwasów nukleinowych obejmują przykładowo te specyficznie przedstawione na załączonych rysunkach, jak również sekwencje degenerowane i występujące w naturze ich odmiany alelowe. Takie sekwencje kwasów nukleinowych można stosować w ekspresji obciętych sTNFRs w eukariotycznych lub prokariotycznych komórkach gospodarza, przy czym produkty ekspresji lub ich pochodne charakteryzują się zdolnością modulowania aktywności TNF.
Dalszy aspekt obecnego wynalazku obejmuje wektory zawierające uoliąkkleotydy kodujące obcięte sTNFRs operacyjnie połączone z sekwencjami kontrolnymi amplifikacji i/lub ekspresji. Zarówno peokariktyyzne jak i eukariotyczne komórki gospodarza mogą być trwale transformowane lub teansfekkwaąś takimi wektorami dla ekspresji obciętych sTNFRs. Obecny wynalazek obejmuje ponadto rśkomCiąacyjąś wytwarzanie obciętych sTNFRs, przy czym komórki gospodarza zawierające takie pklinkklśktydy hoduje się w odpowiedniej pożywce do hodowli, a oCcięte sTNFRs będące wynikiem ekspresji w tych komórkach są, ewentualnie, wyodrębniane z komórek gospodarza i/luC z pożywki do hodowli.
Inny aspekt obecnego wynalazku obejmuje kompozycje farmaceutyczne zawierające obcięte sTNFRs lub ich pochodne. Typowo obcięte sTNFRs lub ich pochodne można przeprowadzać w preparat w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnymi zarobkami. Można użyć szereg innych substancji pomocniczych które ułatwiają wytwarzanie, przechowywanie, posługiwanie się, dostarczanie oraz i/luC skuteczność obciętych sTNFRs lub ich pochodnych.
Środki lecznicze wytwarzane zgodnie z zastosowaniem według wynalazku służą do modulowania aktywności TNF w szczególności choroby, w których pośredniczy TNF (przykładowo choroby z pośrednictwem TNF-α i/lub TNF-β) można leczyć przez podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznych ilości obciętych sTNFRs luC ich pochodnych.
Polinkklśotydy kodujące obcięte sTNFR-y można również stosować w terapii komórkowej lub w terapii genowej.
Obcięte sTNFRs według wynalazku nadają się szczególnie do wytwarzania ilości proteiny na dużą skalę. Na przykład sTNFR-I ma miejsce deamidowania w oCręCie sekwencji amiąokwasowej od 111 do 126 (aminokwasy Asnu -Gly126). Można się spodziewać, że nieoCeyność tego miejsca zwiększy trwałość Cikyhśmicząą oczyszczonej proteiny zmniejszając możliwe produkty degradacji i prowadząc do protein bardziej trwałych przy przechowywaniu. Obcięte sTNFRs mają mniej mostków dwktiaeyzkowych niż poprzednio ujawnione proteiny inhibitorów TNF. Przykładowo sTNFR-I ma dwa mostki dwusiaeyzkowe w obrębie sekwencji αmiąokwasowej od 111 do 126 i trzy mostki dwksiaeyzkowe w obrębie sekwencji amiąkkwasowej od 127 do 161. Zmniejszona liczba mostków dwusiaecokowyyh jest ważna z tego względu, że większe ilości tych połączeń mogą skomplikować proces powtórnego fałdowania proteiny. Nieoczekiwanie, obcięte sTNFRs mają mniej miejsc dla epitopów antygenowych niż inne, poprzednio ujawnione proteiny inhibitorów TNF (przykładowo skrócona forma sTNFRI mająca pierwsze trzy domeny, ma ąeo-śpitkpy spowodowane przez wyeksponowanie pewnych reszt; patrz przykład III), co prowadzi do stosunkowo zmniejszonej antygeąąoścr i nie daje znaczącego zmniejszenia w szybkości usuwania z kewikkCiśgu przy powtarzanym podawaniu. Można się spodziewać, że zmniejszona immknkgenąość obciętych sTNFRs jest odpowiednia dla leczenia chorób z pośrednictwem TNF, w tym w szczególności przewlekłych chorób zapalnych.
Dalsze aspekty i korzyści z tego wynalazku będą widoczne dla biegłych w sztuce po zapoznaniu się z poniższym opisem, który podaje szczegóły praktyki obecnego wynalazku.
i6 i89 309
Wiele aspektów i korzyści obecnego wynalazku przedstawi przegląd rysunków, w których:
Figura 1 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO:1) kodującą Asp1-Asni6i, rekombinacyjnego ludzkiego sTNFR-I o pełnej długości. Przedstawiona jest także sekwencja aminokwasowa (SEQ ID NO:2) dla Asp -Asn61.
Figura 2 przedstawia sekwencje kwasu nukleinowego (SEQ ID NO:3) kodującą NH2 -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys-Cysi°3]-FC-COOH (określany również jako sTNFR-I 2.6D/C105). Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasową (SEQ ID NO:4) NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cys1()3]-FC-COOH.
Figura 3 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO:5) kodującą NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys-CysI03]-FNCSL-COOH (określany również jako sTNFR-I 2.6D/C106). Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasową (SEQ ID NO:6) NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cys1()3] -FNCSL-COOH.
Figura 4 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO:7) kodującą NH2 MDSVCPQGKYTHPQNNSIC-[Cys-Cysi°3]-FN-COOH (określany również jako sTNFR-I 2.6D/N105). Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasową (SEQ ID NO:8) NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi°3]-FN-COOH.
Figura 5 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO: 11) kodującą NH2 MYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi°3]-^CSL-COOH (określany również jako sTNFR-l 2.3D/d8). Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasową (SEQ ID NO: 12) NH2- NH2-MYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi°3]-FNCSL-COOH.
Figura 6 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO:9) kodującąNH2-M-[Cysi9-Cysi°3]-FNCSL-COOH (określany również jako sTNFR-I 2.3D/d18). Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasową (SEQ ID NO:10) NHrMjCys^-Cys^J-FNCSL-COOH.
Figura 7 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO: 13) kodującą NH2-MSIS-[Cysi9-CysW3]-FNCSL-COOH (określany również jako sTNFR-I 2.3D/d15). Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasową (SEQ ID NO: 14) NH2-MSIS-[Cys-Cysl°3]-FNCSL-COOH.
Figura 8 przedstawia sekwencję kwasu nukleinowego (SEQ ID NO:34) kodującą Leu1-Th?79, dojrzałego rekombinacyjnego ludzkiego sTNFR-II. Przedstawiona jest również sekwencja aminokwasowa (SEQ iD NO:35) Leu1-Thrr79.
Figura 9 przedstawia wielkość opuchlizny wywołanej w modelu reaktywacji indukowanej przez ściany komórkowe streptokoków, opisanym w przykładzie Il.
Figura 10 przedstawia profile sTNFR-I 4D/C105db w osoczu u zdrowych pawianów po dwuminutowej infuzji dożylnej 0,2 mg/kg, jak opisano w przykładzie IlI.
Figura 11 przedstawia profile sTNFR-I 3D/C105db w osoczu u zdrowych pawianów po dwuminutowej infuzji dożylnej 0,2 mg/kg, jak opisano w przykładzie III.
Figura 12 przedstawia profile sTNFR-Ι 2.6D/C105db w osoczu u zdrowych pawianów po dwuminutowej infuzji dożylnej 0,2 mg/kg, jak opisano w przykładzie III.
Figura 13 przedstawia zależność między dawką a usuwaniem z krwiobiegu różnych dimerycznych konstruktów sTNFR-l, jak opisano w przykładzie III.
Obecny wynalazek jest oparty na nieoczekiwanym odkryciu, że sTNFR-l (a także sTNFR-ll) może być zmniejszony co do wielkości tak, by wyłączyć nie tylko czwartą domenę lecz i część trzeciej domeny oraz ewentualnie, część pierwszej domeny przy zachowaniu jednak aktywności biologicznej i osiągnięciu zmniejszonej antygenności. Przynajmniej z następujących powodów uważa się za korzystne wytwarzanie biologicznie aktywnych obciętych sTNFRs lub ich pochodnych. Po pierwsze, cząsteczki te mogą mieć o jedno mniej destabilizujące miejsce deamidowania. Po drugie, cząsteczki te mają mniej mostków dwusiarczkowych, co potencjalnie czyni łatwiejszym powtórne składanie i oczyszczanie. Po trzecie, cząsteczki te mają zmniejszone miejsca dla potencjalnych epitopów antygennych.
Stosowane w niniejszym tekście określenie „obcięte sTNFR(s)” obejmuje jedną lub więcej biologicznie aktywnych syntetycznych lub rekombinacyjnych cząsteczek o wzorze R1-[Cys19-Cysi03]-R2 i ich warianty (włączając w to warianty będące wynikiem wstawienia, podstawiania i usunięcia), jak opisane niżej.
189 309
Określenie „biologicznie aktywny” stosowane w niniejszym zgłoszeniu oznacza, że obcięty sTNFR wykazuje podobne właściwości inhibitowuniu TNF, lecz niekoniecznie wszystkie z te właściwości i niekoniecznie w tym samym stopniu juk sTNFR-I. Zasadniczo, obcięte sTNFRs i ich pochodne mają zdolność inhibitowuniu TNF. Biotesty obciętych sTNFRs opisano dalej w przykładzie II, poniżej. Wybór konkretnych rozpatrywanych właściwości inhibitowuniu TNF zależy od pożądanego zastosowaniu obciętego sTNFR.
W jednym aspekcie obecnego wynalazku, obcięte sTNFRs można korzystnie wytwarzać technikami rekombinacyjnymi w układach komórek bakterii, ssaków lub owadów i mogą być one w postaci albo glikozylowanej lub nieglikozylowanej proteiny. Alternatywnie, obcięte sTNFR-y można wytwarzać na drodze syntezy chemicznej. Uważane obecnie za korzystne sposoby wytwarzania opisano bardziej szczegółowo poniżej.
Każdy z obciętych sTNFRs może być typowo wyodrębniany i oczyszczany tuk, by był zasadniczo wolny od obecności innych materiałów proteinopodobnych (tzn. nieobciętych sTNFRs). Korzystnie, obcięty sTNFR jest w około 8°% pozbawiony innych protein, które mogą być obecne wskutek zastosowanej techniki otrzymywania przy wytwarzaniu obciętego sTNFR. Bardziej korzystnie obcięty sTNFR jest w około 90% pozbawiony innych protein, w szczególności w około 95% pozbawiony innych protein, a najbardziej korzystnie w około >98% pozbawiony innych protein. Należy jednak rozumieć, ze żądunu proteina może być łączona z innymi składnikami aktywnymi, kompozycjami chemicznymi i/lub odpowiednimi farmaceutycznymi substancjami stosowanymi w formach galenicznych przed jej podaniem, jak opisano bardziej szczegółowo poniżej.
Obcięte sTNFRs
W jednym podstawowym wykonaniu obcięte sTNFRs według wynalazku mogą być jedną lub więcej protein określonych następującym wzorem
MCyS^-Cys^ w którym [Cys -Cys 3 oznacza reszty od 19 do 103 wsTNFR-1, schemat numeracji reszt aminokwasowych podany jest na rys. fig. 1 (SEQ ID NO:2) dlu ułatwienia porównaniu; i w którym R1 oznacza grupę NH2-MdSvCPQGKyIHPQNNSIC, u R2 oznacza grupę -FN-COOH oruz ich warianty i pochodne
Inny aspekt obecnego wynalazku obejmuje jeden lub więcej wariantów R1-[Cys19-Cys103]-R.2, w postaci metionylowunej lub niemetionylowunej. Określenie „obcięty sTNFR(s)” obejmuje zatem jedną lub więcej występujących naturalnie odmian alelowych R1-[Cys-CysI03 ]-R2 oraz jedną lub więcej wariantowych protein, z których usunięto aminokwasy („odmiany delecyjne”), do których wstawiono („odmiany addycyjne”) lub w których podstawiono (..odmiany podstawione”) reszty w obrębie sekwencji aminokwasowych R1-[Cys19-Cys103]-R2.
Delecje sekwencji aminokwasowych typowo obejmują około 20 reszt aminokwusowych, zwłaszcza od około 1 do 10, u w najbardziej typowym przypadku od około 1 do 5 reszt, tuk by nie naruszyć fałdowania proteiny. Delecje obejmują delecje N-końcowe, C-końcowe oruz wewnątrz-sekwencyjne. Całkowitą liczbę delecji i/lub nieprzerwanej delecji wybiera się tak, by zachować trzeciorzędową strukturę proteiny w odpowiedniej domenie, przykładowo usieciowanie cysteinowe.
Delecje w obrębie sekwencji uminokwusowej R1-[Cys19-Cys1°3]-R2 można wykonać w obszarach o niskiej homologii z sekwencjami innych członów rodziny receptorów NGF/TNF w grupie protein powierzchni komórki. Delecje w obrębie sekwencji aminokwasowej Rl-lCys19-Cys-03]-R2 można wykonać w obszarach zasadniczej homologii z sekwencjami innych członów rodziny receptora NGF/TNF i prawdopodobnie zmodyfikują one znacząco aktywność biologiczną. W szczególności, podobieństwo sekwencji wśród członów rodziny receptora NGF/TNF jest szczególnie wysokie w obszarze odpowiadającym pierwszym dwóm pętlom dwusiarczkowym domeny 1, całej domeny 2 i pierwszej pętli dwusiarczkowej domeny 3 (Banner i wssp. (1993), Cell, 73:431-445). Nu przykład, dwa egzemplarze odmian delecji R1-[Cys’9-Cys1<)3*]-R2 mają postać Rl-lCysl8(ΔThr20-Cys^^ oruz R^^s^^Cys^Lys21)-Cys103]-R2, w których R1 i R2 maj ą znaczenie podane wyżej.
Addycje sekwencji aminokwasowych mogą obejmować fuzje nu końcu aminowym i/lub karboksylowym sięgające co do długości od jednej do stu Iub więcej reszt, juk również
189 309 wewnętrzne wstawienia wewnątrz-sekwencyjne pojedynczych lub wiolu roszt aminekmasewych. Wewnętrzne addycje mogą obejmować typowo od ąkąłą 1 do 10 reszt amidopmacewych, w bardziej typowym przypadku od około 1 do 5 reszt amidąpmesowych, a w najbardziej typowo od około 1 do 3 reszt amidokmacowych.
Warianty będące wynikiem addycji do końca amidowpaą obejmują addycję metioniny (przykładowo jako pozostający poza kontrolą skutek bezpośredniej oksprosji proteiny w bakteryjnej tpkombidacyjnpj hodowli komórkowej) lub dodatkowej roszty lub sekwencji aminokwasowoj. Dalszy przykład wstawienia na końcu aminowym obejmuje fuzję sekwencji sygnalnej, jak również/lub innych sekwencji pre-pro aby ułatwić wydzielanie proteiny z tekombidacyjnych komórek gospodarza. W przypadku prokariątycznych komórek gospodarza, któro nie rozpązdajo, i przetwarzają sekwencji sygnałowych rodzimych sTNFR-I, sekwencję sygnałową można zastąpić przez ptopariotyczno sekwencję sygnalno, wybraną przykładowo z grupy liderów· fosfatazy alkalicznej, ppnicylidary lub stabilnej termicznie pdtprotoksyny-II. W przypadku komórek drożdży sekwencję sygnalną można wybrać, przykładowo z grupy sekwencji lidera inwertazy drożdży, czynnika alfa lub fosfatazy pmacąmej. W ekspresji w komórkach ssaka rodzime sokmodcje sygnałowe sTNFR-I (dokumenty EP 393 438 i EP 422 339) są zadowalające, jakkolwiek mogą być odpowiednio inno sekwencjo sygnałowe ssaków (przykładowo sekwencje wyprowadzone z innych członów rodziny receptorów NGF/TNF.
Odmiany będące wynikiem aadycji do końca karboksy nio wiążą się z addycją jednej lub więcej reszt amidokwasąmych które prowadziłyby, oapąwiodnCo, do rekonstrukcji sTNFR-I. Należy rozumioć, że odmiana powstała przez addycję do końca karboksy nie będzie obejmować addycji jednej lub więcej reszt kwasów karboksylowych, która doprowadziłaby do rekonstrukcji trzeciej domeny Iub czwartej domeny sTNFR-I. Przykład wariantów będących wynikiem adaycji do końca karboksy obejmuje proteiny chimeryczne zawierające fiizję R1-Cys19-Cyslin]-R2 z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunegląbulCdy. TaPie proteiny chimeryczne są korzystno, gdy część immudeglobulidowa każdej proteiny obejmujo wszystkie domeny oprócz pierwszej domeny stałego obszaru ciężkiego łańcucha ludzkiej immudoglobuliny takiej jak IgG, IgA, IgM lub IgE, a zwłaszcza IgG, przykładowo IgG1 lub IgG3. Specjalista z tej dziedziny techniki jest zrozumiałe, zo dowolny aminokwas każdej części immudoglobulidy możo być poddany delpcji lub pedstawipdiu jednym lub więcej aminokwasami, albo jeden lub więcej z aminokwasów można dodać tak długo, jak część wiążąca TNF będzio wiązać nadal TNF, a część immudoalobulinowa będzie wykazywać jedną lub więcej swoich cech charakterystycznych.
Inna grupa wariantów to odmiany będące wynikiem podctemionia aminokwasów. Każdy z tych weriedtóm ma usuniętą co najmniej jedną resztą aminokwaso-wą w R|-[Cysl9-Cysl°3]-R2 i wstawioną Ϊ))ο resztę na jpj miejsce. Warianty będące wynikiem podstawienia obejmują odmiany alelowe, któro cochują się zmianami sekwencji dukleotydu naturalnie występującymi w populacji gatunku, co może prowadzić lub nie - do zmiany aminokwasu. Biegły w sztuce może wykorzystać dowolną znaną informację o wiążącym lub aktywnym miejscu polippptyau przy wyborze możliwych miejsc mutacji.
Jeden zo sposobów identyfikacji reszt aminokwasewych lub obszarów dla mutaaedpry proteiny jest zwany „mutagenezą skanowania alaniny” (Cudningham i Wolls (1989), Science, 244: 1081-1085, które to ujawnienie jost włączone tutaj jako odnośnik literaturowy). W tym sposobie reszta amidokwacowo lub grupa reszt docelowych proteiny jest iaentyfikomada (przykładowo reszty z ładunkiem takio, jak Arg, Asp, His, Lys i Glu) i zamieniana przez aminokwas obojętny lub naładowany ujemnie (najkorzystniej alaninę lub polialaninę) aby uzyskać oddziaływanio aminokwasów z otaczającym środowiskiem moadym w- lub na zewnątrz komórki. Reszty te wykazujące wrażliwość funkcjonalną na podstawienia są następnie korygewadp przez wprowadzanie dodatkowych lub alternatywnych roszt w miejscach aodstamipnia. Zatem, miejsce wprowadzania modyfikacji sekwencji amidąpwasowej jest wstępnie określone i aby optymalizować wyniki mutacji wdanym miejscu można przeprowadzać skaning alaniny Iub mutagenozę losowo, a uzyskany wariantowy polipeatyd - jest poddany sPrididaomi na optymalną kombinację żądanej aktywności i stopnia aktywności.
189 309
Miejsca interesujące z punktu widzenia muSagepezy przez podstawienie obejmują miejsca, gdzie aminokwasy znajdujące się w R1-[Cys19-Cysl°3]-R2 są zasadniczo różne w kategoriach masy łańcucha bocznego, ładunku i/lub hydrofoUowości od protein sTNFRpodobnych takich, jak sT^Rs innych gatunków, lub innych członów rodziny receptorów NGF/TNF.
Inne miejsca będące przedmiotem zainteresowania obejmują te, w których szczególne reszty są podobne lub identyczne z występującymi w proteinach sTNbR-I-yodobnych. Pozycje takie są generalnie ważne dla biologicznej aktywności proteiny. Przykładowo, specjalista z tej dziedziny techniki wie, że przed obecnym wynalazkiem wpływ obcięcia sTNFR-I i sTNFR-II na ich odpowiednie struktury trójwymiarowe nie byłby przewidywalny. Jednakże, biorąc pod uwagę ujawnione obecnie wyniki specjalisto z dziedziny techniki uzna, że pierwsze zasady opracowania strategii wykonywania odmian mogłyby w części opierać się na wcześniejszych informacjach odnoszących się do sTNFR-I o pełnej długości. Zgodnie z tym, wskazano następujące informacje wyjaśniające dotyczące sTNFR-I (Banner i wsp., (1993), jak wyżej oroz Fu i wsp. (1995), Protein Engineering, 8(12): 1233-1241). Reszty Tyr9, Th^9, His55 w domenie 1, reszty Phe^, Ser63, Asp82 w domenie 2 i reszty Tyr^ i Ser 7 w domenie 3 zidentyfikowano jako potencjalnie ważne dla stabilizacji struktury odpowiednio domen 1, 2 i 3. Reszty Pron i His* zidentyfikowano aako ΡοΟ)^!)^ oddoaałątąee z Ser86-Tyr77 poąeednostk 7 C TNTa. Reszty Glu45-Pho49 zidentyfikowano jako będące w pętli, która potencjalnie oddziałuje z resztami Leu29-Arg32 podjed^stU A TNFa. Reszty Gly48 zidentyfikowano jako potencjalnie oddziałujące z Asn-Pro20 podjed^stU A TNFa. Reszty His58-Leu6) potencjalnie zidentyfikowano jako mające strukturę rozciągniętej pici i oddziałujące poprzez łańcuch boczny z resztami Arg31 -Ala33 yodjednosSki A TNFa, przy czym reszto His58 sTNFR-I specyficznie oddziałujące z resztą Arg3 . Reszty Lyn64-Arg6“ zidentyfikowano jako mające strukturę rozciągniętej nici i oddziałujące poprzez łańcuch boczny oraz poprzez łańcuch główny z resztami Ala^-Glu^ i resztą Glu5 podjed^stU A TNFa. Resztę Mot69 zidentyfikowano jako potencjalnie oddziałującą z resztą TyrH5 podjedpatSki A TNFa. Reszty His94-PheKn zidentyfikowano jako tworzące pętlę, która oddziałuje z resztami Thr^-Leu* i Asn 137 podjed^stU C TNFa, przy czym reszta Trp96 sTNbR-I specyficznie oddziałuje z resztami Ser7‘-Thr72 podjednostki C TNFa, Lou^ sTNFR-I jest w bliskim sąsiedztwie z resztą Asn^ podjed^stU C TNFa, A reszto Glnw2 sT^R specyficznie oddziałuje z resztą ProH3 podjed^stU A TNFa. Zgodnie z tym, biegły w sztuce może ocenić, że początkowo miejsca powinny być modyfikowane przez podstawienie w stosunkowo zachowawczy sposób.
Takie zachowawcze podstawienia podano w tabeli 1 w kolumnie „Korzystne podstawienia”. Jeżeli takie podstawienia prowadzą do zmiany w biologicznej aktywności, wtedy można wprowadzić bardziej zasadnicze zmiany (wskazane w kolumnie „Przykładowe podstawienia”) i/lub wykonać inne addysje/delesjo i poddać otrzymane produkty skriningowi.
Tabela 1
Podstawienia aminokwasów
Oryginalne reszty Korzystne podstawienia Przykładowe podstawniki
1 2 3
Ala (A) Val Val, Leu; Ile
Arg (R) Lys Lys; Gl), Asp
Asp (N) Gl) Gl); His; Lys, Arg
Asp (D) Glu Glu
Cys (C) Ser Ser
Gl) (Q) Asp As)
Glu (E) Asp Asp
i89 309 cd tabeli 1
1 2 3
Gly (G) Pro Pro
His (H) Arg Asn; Gln, Lys, Arg
Ile (I) Leu Leu, Val; Met, Ala; Phe, norleucyna
Leu (L) Ile Norleucyna; Ile; Val; Met; Ala; Phe
Lys (K) Arg Arg; Gln; Asn
Met (M) Leu Leu; Phe; Ile
Phe (F) Leu Leu; Val; Ile; Ala
Pro (P) Gly Gly
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Ser Ser
Trp (W) Tyr Tyr
Tyr(Y) Phe Trp, Phe, Thr; Ser
Val (V) Leu Ile; Leu; Met; Phe; Ala; norleucyna
Przy wykonywaniu takich zmian o równoważnym charakterze można brać pod uwagę indeks hydropatyczny aminokwasów. Każdemu aminokwasowi przypisano indeks hydropatyczny na podstawie ich hydrofobowości i ładunku, jak następuje: izoleucyna (+4,5); Walina (+4,2); leucyna (+3,8); fenyloalanina (+2,8); cysteina/cystyna (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicyna (-0,4); treonina (-0,7); seryna (-0,8); tryptofan (-0,9); tyrozyna (-1,3); prolina (-1,6); histydyna (-3,2); glutaminian (-3,5); glutamina (-3,5); asparaginian (-3,5); asparagina (-3,5); lizyna (-3,9) i arginina (-4,5).
Znaczenie indeksu hydropatycznego aminokwasów przy nadawaniu proteinie funkcji interaktywności biologicznej jest powszechnie uznane w stanie techniki (Kyte i Doolittle (1982), J Mol Biol., 157: 105-131, którego ujawnienie jest włączone tutaj na zasadzie odsyłacza literaturowego). Wiadomo, że pewne aminokwasy można podstawiać za inne aminokwasy o podobnym indeksie lub wartości hydropatycznej, zachowaniem nadal podobnej aktywności biologicznej. Przy wykonywaniu zmian w oparciu o indeks hydropatyczny korzystne jest podstawianie aminokwasów, których indeksy hydropatyczne są w zakresie ± 2, a szczególnie korzystne - tych, które są w zakresie ± 1, a zwłaszcza tych w zakresie ± 0,5.
Uznane jest także w stanie techniki, że podstawienie podobnych aminokwasów można wykonać skutecznie w oparciu o hydrofilowość szczególnie tam, gdzie proteina lub peptyd w ten sposób utworzony, o równoważnej czynności biologicznej - ma być w zamierzeniu stosowany w wykonaniach immunologicznych, jak to ma miejsce w obecnym przypadku.
Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 4.554.101, którego ujawnienie jest włączone w całości jako odsyłacz literaturowy - podaje, że największa średnia lokalna hydrofilowość proteiny, wynikająca z hydrofilowości jej sąsiednich aminokwasów skorelowana jest z jej immunogennością i antygennością, to znaczy z właściwościami biologicznymi proteiny.
Jak podano szczegółowo w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Nr 4.554.101, następujące wartości hydrofilowości przypisano resztom aminokwasowym: arginina (+3,0); lizyna (+3,0); asparaginian (+3,0 ± 1); glutaminian (3,0 ±1); seryna (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicyna (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ±1); alanina (-0,5); histydyna (-0,5); cysteina (-1,0); metionina (-1,3); walina (-1,5); leucyna (-1,8); izoleucyna (-1,8); tyrozyna (-2,3); fenyloalanina (-2,5); tryptofan (-3,4).
Przy wykonywaniu zmian w oparciu o podobieństwo wartości hydrofilowości korzystne jest podstawianie aminokwasów, których indeksy hydrofilowości są w zakresie ± 2, a szczególnie korzystne tych które są w zakresie ± 1, a zwłaszcza tych, których są w zakresie ± 0,5.
199 099
Opis patentowy Stanów Zjednoczonych Nr 4.554.101 ujawnia także identyfikacje i wytwarzanie epitopów z pierwotnych sekwencji yminokwaazwych na podstawie hydrofilowości. Dzięki sposobom ujawnionym w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 4.554.101 biegły w sztuce mógłby zidentyfikować epitopy sekwencji aminokwaazwej takiej, jak sekwencje sTNFRs obecnie ujawnione. Obszary tz są także nazywane „obszarami rdzenia epitopowegz”.
Liczne naukowe publikacje poświęcono przewidywaniu struktury drngorzędowzjj i identyfikacji epitopów z analizy sekwencji αminokwaszwyzh (Chou i Fasman (1974), Biochemistry, 13(2) 222-245; Chou i Fasman (1978), Biochemistry, 113(2): 211-222; Chou i Fasman (1978), Adv. Enzymol Relat Areas Mol.. Biol, 47: 45-148; Chou i Fasman, Ann. Rev Biochem., 47: 251-276 oraz Chou i Fasman, (1979), Biophys J, 26: 367-384, których ujawnienie jest włączone tutaj jako odsyłacz literaturowy). Ponadto, są obecnie dostępne programy komputerowe wspomagające przewidywania części antygenowych i obszarów rdzenia epitopzwego protein. Przykłady obejmują programy oparte na analizie Jamesona-Wolfa (Jameson i Wolf (1998), Comput. Appl Biosci, 4(1): 181-186 i Wolf i wsp. (1998), Comput. Appl. Biosi, (4)1: 187-191, ujawnSzaSz których jest włączone tutaj jako odsyłacz literaturowy), program PepPlot® (Brutlag i wsp. (1990), CABS, 6: 237-245 oraz Wziabzrger i wsp. (1985), Science, 228: 740-742, ujawnizaie których jzst włączone tutaj jako odnośnik literaturowy) oraz inne nowe programy dla przewidywania trzeciorzędowej struktury protein (Fetrow i Bryant (1993), BIOTECHNOLOGY, 11: 479-483, ujawnienie którego jzst włączone tutaj jako odnośnik literaturowy).
Można się spodziewać, zz zachowawcze modyfikacje sekwencji aminokwasów (i odpowiednie modyfikacje kodujących sekwencji kwasu nukleinowego) R1-[Cys19-Cysll)3]-R2 i R4-[Cys32-Cysn5]-R5 wytworzą proteiny o zhyrakterystyzz funkcjonalnej i chemicznej podobnej jak w modyfikowanej proteinie.
Natomiast przeciwnie, zasadnicze modyfikacje charakterystyki funkcjonalnej i/lub chemicznej R1-[Cys19-CyS1°3]-R2 można wykonać przez wybór podstawień różniących się znacznie swym wpływem na zachowanie (a) struktury szkieletu polipzptydzwego w obszarze podstawienia, przykładowo jako konformacja yrkuszy lub hzlisy, (b) ładunku lub elektrzfobowośzi proteiny w miejscu docelowym, (c) masy (objętości) łańcucha bocznego. Występujące naturalnie reszty są podzielone na grupy w oparciu o wspólne właściwości łańcucha bocznego:
1) hydrofobowe: nzrjeuzyna, Met, Ala, Vs1, Leu, Ilz;
2) obojętne hydrofilowz: Cys, Ser, Thr;
3) kwasowe: Asp, Glu;
4) zasadowe: Asn, Gln, His, Lys, Arg;
5) reszty, którz wpływają na orientację łańcucha: Gly, Pro; oraz
6) aromatyczne: Trp, Tyr, Phe.
Podstawienia niezychowawcze mogą się wiązać z wymianą elementu)ednei z tych grup na inny. Takie podstawione reszty można wprowadzić w obszary Rl-[Cysl9-Cyall)3]-R_2, które są homologiczne lub niehzmzlzgiczae względem innych członów rodziny receptorów NGF/TNF.
Specyficzne mutacje sekwencji R^Cys^-Cys^J-R mogą wiązać się z podstawieniem nie rodzimego aminokwasu na N-końcu, C-końcu Iub w jakimkolwiek miejscu modyfikowanej proteiny przez addycję węglowodanu N-połączonego Iub O-połączonego. Takiz modyfikacje mogą mieć szczególną użyteczność, tak jak przy addycji aminokwasu (na przykład cysteiny), która jest korzystna dla wiązania rozpuszczalnego w wodziz polimeru z wytworzeniem pochodnej, jak opisano poniżej. Patrz, przykładowo, rysunek fig. 5, gdzie naturalnie występujący Asn z sTNFR-l jest zamieniony na „Cys” by ułatwić przyłączenie cząsteczki glikolu pzlietylznzwegz (przykład l).
Ponadto, sekwencje R1-[Cys-Cys1°3]-R2 można zmodyfikować by dodać miejsca glikonylawaaia lub by usunąć miejsca glikozylzwania N-połączone Iub O-połączone. Takiz miejsce rozpoznania glikzzylowyniα połączone z asparaginą obejmuje trójpzptydową sekwencję, która jest specyficznie rozpoznawana przez odpowiednie komórkowe enzymy glikzzylowaaiy. Tymi sekwencjami trójpeptydzwymi są albo Asa-Xaa-Thr lub Asa-Xaa-Ser, gdzie Xss może być dowolnym aminokwasem innym niż Pro. Udowodnione lub przewidywane reszty
189 309 asparaginowe sTNFR-I występują w pozycjach 14, 105 i 111. Można wykonać szereg podstawień Iub delecji aminokwasów uby zmodyfikować Iub dodać N-połączone Iub O-połączone miejscu glikozylowunia, prowadzących do proteiny o zmienionym glikozylowaniu.
W szczególnym wykonaniu warianty są zasadniczo homologiczne względem aminokwasu R1-[Cys19-Cys103]-R2. Stosowane w obecnym opisie określenie „zasadniczo homologiczny” oznuczu stopień homologii który korzystnie wynosi ponad 70%, bardziej korzystnie ponad 80%, a jeszcze bardziej korzystnie ponad 90%, zuś najkorzystniej 95%. Procent homologii, jak to jest opisywane w obecnym zgłoszeniu, oblicza się jako procentowość reszt aminokwasowych znalezionych w mniejszej z dwóch sekwencji ustawionej w linii z identycznymi resztami uminokwasowymi w sekwencji porównywanej, gdy można wprowadzić cztery przerwy w długości 100 aminokwasów uby ułatwić to ustawienie w linii, juk podano przez: Dayhoff (1972), w Atlas of Protein Sequence and Structure, 5:124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C., ujawnienie którego jest włączone tutaj jako odsyłacz literaturowy. Jako zasadniczo homologiczne są także włączone obcięte sTNFRs, które można wyodrębnić dzięki wzajemnej reaktywności z przeciwciałami względem sekwencji aminokwasowych, odpowiednio, SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:35, Iub których geny można wyodrębnić przez hybrydyzację z DNA SEQ ID NO:l Iub SEQ ID NO:34 Iub z ich segmentami.
Przykładowe sTNFRs według wynalazku obejmują następujące cząsteczki: NH2-MDSVCPQGKYJHPQNNSIC-[Cys-Cys1°3]-FC-COOH (określany także jako sTNFR-I 2.6D/C105); NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys^03]-FN-CSL-COOH (określany także juko sTNFR-I 2.6D/C106); NH2-MDSVCPQGKYinPQNNSIC-[Cys19-Cys'°3]-FN-COOH (określany także juko sTNFR-I 2.6D/N105); NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys-Cysw3]-FNCSL-COOH (określany także jako sTNFR-I 2.3D/d8); NH2-M-lCysl9-Cyslθ3]-FNCSL-COOH (określany także jako sTNFR-I 2.3D/d18); oruz NH2-MSIC-lCysI9-Cysl03]-FNCSL-COOH (określany także jako sTNFR-I 2.3D/d15), metionylowane Iub niemetionylowune, oruz ich warianty i pochodne.
Wytwarzanie obciętych sTNFRs będących wariantami opisano bardziej szczegółowo poniżej. Odmiany takie można wytworzyć przez wprowadzanie odpowiednich zmian nukleotydowych do DNA kodującego obcięte sTNFRs Iub przez chemiczną syntezę in vitro żądanych obciętych sTNFRs. Biegli w sztuce uznają, że można wykonać wiele kombinacji delecji, wstawień i podstawień, pod warunkiem, ze końcowe obcięte sTNFRs będą biologicznie aktywne.
Techniki mutugenezy dla zastępowania, wstawiania Iub usuwania jednej Iub więcej wybranych reszt aminokwasowych są dobrze znane biegłemu w sztuce (przykładowo, opis patentowy Stanów Zjednoczonych, Nr 4.518.584, ujawnienie którego jest włączone tutaj jako odsyłacz literaturowy). Istnieją dwu główne czynniki przy konstruowaniu każdej odmiany sekwencji aminokwasowej, a mianowicie; umiejscowienie miejsca mutacji i charakter mutacji. Przy projektowaniu każdego wariantu umiejscowienie każdego miejsca mutacji i charakter mutacji zależeć będą od podlegających modyfikacji cech biochemicznych. Każde miejsce mutacji można zmodyfikować indywidualnie lub w szeregu, przykładowo przez (1) podstawienie najpierw wybranymi zachowawczymi aminokwasami, a następnie przy użyciu bardziej radykalnych wyborów w zależności od osiągniętych wyników; (2) usuwanie docelowej reszty uminokwusowej; Iub (3) wstawianie reszt aminokwasowych sąsiadujących z umiejscowionym miejscem.
Biegły w sztuce może wytworzyć modyfikowane chemicznie pochodne obciętych sTNFRs nu podstawie danych podanych w obecnym zgłoszeniu. Konjuguty można wytworzyć stosując obcięte sTNFRs glikozylowune, nieglikozylowune Iub deglikozylowune. Typowo będzie się stosować nieglikozylowane obcięte sTNFRs. Odpowiednie ugrupowania chemiczne do derywatyzucji obciętych sTNFRs obejmują polimery rozpuszczalne w wodzie.
Rozpuszczalne w wodzie polimery są pożądane, ponieważ proteina - do której każdy z nich jest dołączony - nie będzie się wytrącać w środowisku wodnym, takim juk środowisko fizjologiczne. Korzystnie, polimer ma być dopuszczalny farmaceutycznie dlu wytwarzaniu terapeutycznego produktu Iub kompozycji. Biegły w sztuce będzie mógł wybrać żądany polimer w oparciu o takie rozważaniu jak to, czy konjugat polimer/proteinu będzie stosowany
189 309 terapeutycznie i jeśli tak, jakie będzie żądane dawkowanie, czasu obiegu i odporność na protśolizę.
Odpowiednie, dopuszczalne klinicznie, rozpuszczalne w wodzie polimery obejmują, bez ograniczania się do nich, glikol polietylenowy (PEG), aldehyd prouioąowy glikolu polietylenowego, kopolimery glikolu etylenowego i glikolu propylenowego, glikol mkąometoksyuoliśtylenowy, karboksymetylkyślulkzę, dekstran, alkohol poliwinylowy (PVA), poliwiąylopirolidon, pkli-1,3-dikksolaą, poli-1,3,6-teikkssą, kopolimer etylenu i Cezwodnika maleinowego, poli-fe-ammokwasy) (homopolimśey bądź kopolimery losowe), glikol poli-(n-wrnylopieolidknk)polietylśąkwy, homopklimery glikolu propylenowego (PpG) i inne tlenki poliaSkΠenów, kopolimery tlenek polipropylśąk/tlenek etylenu, polikksyetylowαąś alkohole wielowkdorotlenowe (POG) (przykładowo gliceryna) i inne polioksyetylkwsąe alkohole wielowkdorotlenowe, polioksyetylowaąy soeCitkl, lub uolioksyetylowaną glukozę, kwasy kolonowe luC inne polimery węglowodanowe, Ficoll luC dekstran i ich mieszaniny.
W znaczeniu stosowanym w obecnym zgłoszeniu, termin glikol polietylenowy obejmuje wszelkie formy, które Cyły stosowane do dśrywatyzαcji innych protein, takie jak glikol moąk(C1-C10)alkoksy luC arylkksy-pkliśtylenkwy. Aldehyd prkpioąowy glikolu polietylenowego może wykazywać zalety przy wytwarzaniu wskutek jego trwałości w wodzie.
Każdy z rozpuszczalnych w wodzie polimerów może mieć dowolny ciężar cząsteczkowy i może być rozgałęziony lub niśrkzgałęzioąy. Każdy z rozpuszczalnych w wodzie polimerów ma typowo średni ciężar cząsteczkowy zawierający się w przedziale od około 2 kDa do około 100 kDa (określenie „około” wskazuje, że w preparatach polimeru rozpuszczalnego w wodzie niektóre cząsteczki będą ważyły więcej, niektóre mniej, niż podany ciężar cząsteczkowy). Średni ciężar cząsteczkowy każdego rozpuszczalnego w wodzie polimeru korzystnie wynosi między około 5 kDa a około 50 kDa, bardziej korzystnie między około 12 kDa a około 40 kDa, a najbardziej korzystnie między około 20 kDa a około 35 kDa.
Generalnie, im większy ciężar cząsteczkowy lub im więcej rozgałęzień, tym większy będzie stosunek polimer : proteina. Można stosować rozmiary, w zależności od żądanego profilu terapeutycznego (przykładowo, okresu trwania długotrwałego uwalniania; wpływu - jeśli taki występuje - na aktywność biologiczną; łatwości obróbki; stopnia - luC braku antygenności, i innych znanych aspektów wpływu rozpuszczalnego w wodzie polimeru na terapeutyczną proteinę).
Każdy z rozpuszczalnych w wodzie polimerów powinien być przyłączony do proteiny przy uwzględnieniu jego wpływu na funkcjonalne lub antygenowe domeny proteiny. Ogólnie, derywatyzację chemiczną można wykonać w dowolnych odpowiednich waekąkach stosowanych do przeprowadzenia reakcji proteiny z aktywowaną cząsteczką polimeru. Grupy aktywujące, które można użyć dla połączenia polimeru rozpuszczalnego w wodzie z jedną lub więcej proteinami, są następujące: sulfonowa, maleimidowa, sulfhydeylkwa, tiolowa, trrflankwa, tresylaąiaąkwa, azydyrynowa, kksyeaąowa i 5-pirvdylowa.
Każdy z rozpuszczalnych w wodzie polimerów jest generalnie połączony z proteiną przy grupach a-amino IuC ε-amiąk aminokwasów luC przy reaktywnej grupie dolowej, lecz bierze się również pod uwagę, że rozpuszczalna w wodzie grupa może Cyć przyłączona do jakiejkolwiek reaktywnej grupy proteiny, która jest wystarczająco reaktywna Cy być przyłączoną do grupy rozpuszczalnej w wodzie w odpowiednich w^ronkach reakcji. Przeto, rozpuszczalny w wodzie polimer może być połączony kowalencyjnie z proteiną przez grupę reaktywną, taką jak wolna grupa aminowa Iub karboksylowa. Reszty aminkkwasowe o wolnej grupie aminowej mogą obejmować reszty lizynowe i N-końcową resztę aminokwasowi Reszty posiadające wolną grupę karboksylową mogą obejmować reszty kwasu asparaginowego, reszty kwasu glutaminowego oraz C-końcową resztę aminokwasowi Grupy aminkkwaskwe posiadające reaktywną grupę tioluwą obejmują reszty cysternowe.
Sposoby wytwarzania protein skonjugowaąych z rozpuszczalnymi w wodzie polimerami będą, w każdym przypadku, zasadniczo obejmować etapy: (a) poddania proteiny reakcji z rozpuszczalnym w wodzie polimerem w warunkach, w których proteina ulega przyłączeniu do jednego Iub więcej rozpuszczalnych w wodzie polimerów oraz (b) otrzymania produktu reakcji. Warunki reakcji dla każdej konjkgacji można wybrać z warunków znanych w stanie techniki lub warunków później opracowanych, lecz powinny one być tak dobrane by uniknąć i89 309
Iub ograniczyć wystawienie na działanie warunków reakcji takich, jak: temperatura, rozpuszczalniki, oraz poziom pH, które mogłyby inaktywować modyfikowaną proteinę. Generalnie, optymalne warunki reakcji dla tych reakcji będą określone odrębnie dla każdego przypadku w oparciu o znane parametry i pożądany skutek. Przykładowo, im wyższy stosunek rozpuszczalnego w wodzie polimeru: konjugat proteiny, tym większa procentowość skonjugowanego produktu. Optymalny stosunek (w kategoriach wydajności reakcji w tym sensie, że nie ma nadmiaru nieprzereagowanej proteiny Iub polimeru) można określić za pomocą takich czynników, jak żądany stopień derywatyzacji (przykładowo mono-, di-, tri-, itd.), ciężar cząsteczkowy wybranego polimeru, to czy polimer jest rozgałęziony czy też nierozgałęziony oraz stosowane warunki reakcji. Stosunek rozpuszczalnego w wodzie polimeru (np. PEG) do proteiny będzie ogólnie w przedziale 1:1 do 1:100. Jeden Iub więcej oczyszczonych konjugatów można wytworzyć z każdej mieszaniny standardowymi technikami oczyszczania, zawierających obejmującymi, między innymi dializę, wysalanie, ultrafiltrację, chromatografię jonowymienną, chromatografię filtracyjną na żelu i elektroforezę.
Można zmierzać do specyficznej proteiny, chemicznie modyfikowanej na N-końcu. Można dokonać wyboru polimeru rozpuszczalnego w wodzie ze względu na ciężar cząsteczkowy, stopień rozgałęzienia itd., proporcję rozpuszczalnego w wodzie polimeru do cząsteczek proteiny (Iub peptydu) w mieszaninie reakcyjnej, rodzaj przeprowadzanej reakcji, metodę otrzymywania wybranej proteiny chemicznie modyfikowanej na N-końcu. Sposób wytwarzania preparatu proteiny chemicznie modyfikowanej na N-końcu (to znaczy oddzielania tych cząstek od innych monoderywatyzowanych reszt, jeśli to konieczne) mogą polegać na oczyszczaniu materiału proteiny chemicznie modyfikowanej na N-końcu z populacji chemicznie modyfikowanych cząsteczek białkowych. Selektywną chemiczną modyfikację na N-końcu można osiągnąć przez redukcyjne alkilowanie z wykorzystaniem różnicy w reaktywności różnych rodzajów pierwszorzędowych grup aminowych (lizyna w porównaniu z N-końcem) dostępnych do derywatyzacji w danej proteinie. W odpowiednich warunkach reakcji osiąga się zasadniczo selektywną derywatyzację proteiny przy N-końcu za pomocą polimeru zawierającego grupę karbonylową. Przykładowo, można selektywnie przyłączyć rozpuszczalny w wodzie polimer do N-końca proteiny przez prowadzenie reakcji przy pH, które pozwala na wykorzystanie różnicy w pKa pomiędzy grupą ε-aminową reszt lizynowych i grupą α-aminową N-końcowej reszty proteiny. Dzięki takiemu selektywnemu otrzymywaniu pochodnych kontroluje się związanie rozpuszczalnego w wodzie polimeru z proteiną: sprzężenie z polimerem ma miejsce przede wszystkim przy N-końcu proteiny i nie występuje żadna znacząca modyfikacja innych reaktywnych grup, takich jak grupy aminowe w bocznych łańcuchach reszt lizynowych. Stosując redukcyjne alkilowanie rozpuszczalny w wodzie polimer może być jednym z rodzajów wyżej opisanych i powinien mieć jeden reaktywny aldehyd dla przyłączania do proteiny. Może być stosowany aldehyd propionowy glikolu polietylenowego zawierający jeden reaktywny aldehyd.
Obecny wynalazek dotyczy w szczególności chemicznie derywatyzowanej proteiny, zawierającej jedną Iub wiele (przykładowo 2-4) reszt PEG. Pegylowanie może być przeprowadzane za pomocą jednej z reakcji pegylowania znanej w sztuce. Sposoby wytwarzania produktu pegylowania proteiny generalnie obejmują etapy (a) reakcji produktu białkowego z glikolem polietylenowym (takim jak reaktywna pochodna estrowa Iub aldehydowa PEG) w warunkach, w których proteina przyłącza się do jednej Iub wielu grup PEG oraz (b) otrzymywania produktu(ów) reakcji. Ogólnie, optymalne warunki reakcji będą określone odrębnie dla każdego przypadku w oparciu o znane parametry i pożądany wynik.
Jest wiele sposobów przyłączania znanych biegłym w sztuce. Patrz, przykładowo dokument EP 0 401 284, którego ujawnienie włącza się ty na zasadzie odnośnika literaturowego; patrz także: Malik i wsp. (1992), Exp. Hematol, 20:1028-1035; Francis (1992), Focus on Growth Factors, 3(2):4-10 (opublikowany przez Mediscript, Mountain Court, Friem Barnet Lane, Londyn N20 OLD, UK); EP 0 154 316; EP 0 401 384; WO 92/16221; WO 95/34326; i inne publikacje wymieniane tutaj, dotyczące pegylowania, których ujawnienie przywołuje się obecnie na zasadzie odnośnika literaturowego.
W szczególności pegylowanie można prowadzić przez reakcję acylowania Iub reakcję alkilowania z cząsteczką reaktywnego glikolu polietylenowego. Tak więc, proteinowe produki89 309 ty według wynalazku obejmują pegylowane proteiny, w których grupa(y) PEG jest(są) przyłączona^) poprzez grupy acylowe lub alkilowe. Takie produkty mogą być jedno-pegylowane lub poli-pegylowane (na przykład mogą zawierać 2-6, a korzystnie 2-5 grup PEG). Grupy PEG są, ogólnie, przyłączone do proteiny do grup α-aminowych lub ε-aminowych w aminokwasach, ale również uwzględnia się, że grupy PEG mogą być przyłączane do dowolnej grupy aminowej połączonej z proteiną, która jest dostatecznie reaktywna by przyłączyć się do grupy PEG w odpowiednich warunkach reakcji.
Pegylowanie przez acylowanie ogólnie obejmuje prowadzenie reakcji aktywnej pochodnej estrowej glikolu polietylenowego (PEG) z proteiną. Do reakcji acylowania wybrany(ne) polimer(y) powinien(powinny) mieć pojedynczą reaktywną grupę estrową. Dowolna znana lub następnie odkryta reaktywna cząsteczka PEG może być wykorzystana do realizacji reakcji pegylowania. Korzystnym aktywowanym estrem PEG jest PEG poddany estryfikacji do N-hydroksybursztynoimidu (NHS). W znaczeniu stosowanym w obecnym zgłoszeniu „acylowanie” w zamierzeniu obejmuje bez ograniczeń następujące typy wiązań między terapeutyczną proteiną a rozpuszczalnym w wodzie polimerem, takim jak PEG: amidowe, karbaminianowe, uretanowe i tym podobne (patrz: Chamow (1994), Bioconjugate Chem., 5(2) 133-140, ujawnienie którego zostało włączone tu jako odnośnik). Warunki reakcji można wybrać spośród dowolnych znanych ze stanu techniki odnośnie pegylowania lub następnie opracowanych, lecz powinny one unikać takich warunków temperatury, rozpuszczalnika i pH, które reaktywowałyby modyfikowaną proteinę.
Pegylowanie poprzez acylowanie prowadzi generalnie do proteiny poli-pegylowanej. Korzystnie, łączącym wiązaniem będzie wiązanie amidowe. Również korzystnie, otrzymany produkt będzie zasadniczo jedynie (przykładowo > 95%) mono-, di-, lub tri-pegylowany. Jednak mogą tworzyć się pewne indywidua o wyższych stopniach pegylowania w ilościach zależnych od szczególnych, zastosowanych warunków reakcji. Jeśli jest to pożądane, można wydzielić bardziej oczyszczone substancje pegylowane z mieszaniny (w szczególności z substancjami nieprzereagowanymi), za pomocą standardowych technik oczyszczania, wśród których są dializa, wy salonie, ultrafiltracja, chromatografia jonowymienna, filtracyjna chromatografia żelowa i elektroforeza.
Pegylowanie poprzez alkilowanie, generalnie wiąże się z poddaniem końcowej pochodnej aldehydowej PEG reakcji z proteiną w obecności środka redukującego. Dla reakcji alkilowania redukcyjnego wybrany(ne) polimer(y) powinny(powinien) mieć pojedynczą, reaktywną grupę aldehydową. Przykładem reaktywnego aldehydu PEG jest aldehyd propionowy glikolu polietylenowego który jest trwały w wodzie, lub jego mono-pochodne C1-C10 alkoksylową lub aryloksylowa (patrz: patent Stanów Zjednoczonych nr 5.252.714, którego ujawnienie zostało włączone tu jako odnośnik literaturowy).
Pegylowanie przez alkilowanie może także prowadzić do proteiny polipegylowanej. Ponadto, można zmieniać warunki reakcji tak, by zasadniczo sprzyjały pegylowaniu jedynie przy grupie α-aminowej N-końca proteiny (to znaczy do proteiny monopegylowanej). W każdym przypadku, zarówno monopegylowania lub polipegylowania grupy PeG są korzystnie przyłączone do proteiny przez grupę -CH2 -NH-. Ze szczególnym odniesieniem do grupy -CH2-, ten typ wiązania określany jest w obecnym opisie jako połączenie „alkilowe”.
Alkilowanie redukcyjne dla wytworzenia zasadniczo homogenicznej populacji produktu monopolimer/proteina będzie zasadniczo obejmować etapy: (a) poddania proteiny reakcji z reaktywną cząsteczką PEG w warunkach redukcyjnego alkilowania przy odpowiednim pH, by umożliwić selektywną modyfikację grupy α-amino przy aminowym końcu wspomnianej proteiny oraz (b) otrzymanie produktu(ów) reakcji. Derywatyzacja przez alkilowanie redukcyjne z wytworzeniem monopegylowanego produktu wykorzystuje różnice pKa między grupami aminowymi lizyny i grupą α-aminową przy N-końcu (pKa oznacza pH, przy którym 50% grup aminowych jest protonowanych, a pozostałe 50% - nie).
Reakcję prowadzi się przy pH umożliwiającym wykorzystanie różnic pKa między grupami ε-aminowymi reszt lizynowych i grupą α-aminową N-końcowej reszty proteiny. Generalnie, jeżeli pH jest niższe, będzie pożądany większy nadmiar polimeru względem proteiny (tzn. im mniej reaktywna grupa α-aminowa na N-końcu, tym więcej potrzeba polimeru dla osiągnięcia optymalnych warunków). Jeżeli pH jest wyższe, stosunek polimerproteina nie
189 309 musi być tuk duży (tzn. jest więcej reaktywnych grup, więc mniej jest potrzebnych cząsteczek polimeru). Dlu celów obecnego wynalazku pH będzie zasadniczo mieścić się w przedziale 3-9, korzystnie 3-6. Dla redukcyjnego alkilowaniu, środek redukcyjny powinien być trwały w wodnym roztworze i korzystnie powinien być zdolny do redukowania jedynie zasady Schiffa utworzonej w początkowym procesie redukcyjnego alkilowaniu. Odpowiednie środki redukujące mogą być wybrane spośród: borowodorku sodu, cyjanoborowodorku sodu, borowodorek dwumetyloaminy, borowodorek trójmetyloaminy i borowodorek pirydyny. Szczególnie odpowiednim środkiem redukcyjnym jest cyjanoborowodorek sodu. Inne parametry reakcji takie jak rozpuszczalnik, czasy reakcji, temperatura i sposoby oczyszczaniu produktów można wyznaczyć w odrębnie dlu każdego przypadku, w oparciu o opublikowane informacje odnośnie derywatyzucji protein przy użyciu polimerów rozpuszczalnych w wodzie.
Dzięki takiej selektywnej derywatyzucji, przyłączanie polimeru rozpuszczalnego w wodzie (który zawiera reaktywną grupę taką jak aldehyd) do proteiny można kontrolować: sprzęganie z polimerem zachodzi głównie przy N-końcu proteiny i nie występują żadne znaczące modyfikacje innych reaktywnych grup, takich jak grupy aminowe w łańcuchu bocznym lizyny. Wytworzy się typowo ponad 90% konjugutu monopolimer/proteinu, a w bardziej typowym przypadku ponad 95% konjugatu monopolimer/proteina, przy czym pozostałe obserwowulne cząsteczki są cząsteczkami, które nie uległy reakcji (tzn. proteina bez ugrupowaniu polimerowego).
Szczególnym wykonaniem obecnego wynalazku jest nierozgułęziona cząsteczka aldehydu glikolu monometoksypolietylenowego o średnim ciężarze cząsteczkowym około 20 kDa lub około 33 kDa (przykładowo między 30 kDa u 35 kDa), lub aldehyd glikolu t-butylopolietylenowego o średnim ciężarze cząsteczkowym około 33 kDa (przykładowo między 30 kDa u 35 kDa), sprzężony poprzez alkilowanie redukcyjne z sTNFR-I 2.6D/N105.
Pegylowanie można również specyficznie prowadzić tuk, ze polimery rozpuszczalne w wodzie o co najmniej jednej reaktywnej grupie hydroksylowej (przykładowo glikol polietylenowy) można poddać reakcji z reagentem mającym reaktywną grupę kurbonylową, nitrylową Iub sulfonową, aby grupę hydroksylową przekształcić w reaktywny akceptor Michaela, tworząc tym samym aktywowany linker przydatny do modyfikowania różnych protein by uzyskiwać konjuguty o lepszej aktywności biologicznej. „Reaktywna grupa karbonylowa, nitrylowa lub sulfonowa” oznacza grupę kurbonylową, nitrylową lub sulfonową, do której przyłączona jest grupa z dwoma atomami węgla, mająca miejsce reaktywne dla tiolospecyficznego sprzęganiu na drugim atomie węgla od grupy kurbonylowej, nitrylowej Iub sulfonowej (dokument WO 92/16221).
Aktywowane linkery mogą być jednofunkcyjne, dwufunkcyjne lub wielofunkcyjne. Przydatne reagenty mające reaktywną grupę sulfonową, które można zastosować w tych metodach obejmują, bez ograniczaniu, chlorosulfon, winylosulfon i dwuwinylosulfon.
W specyficznym wykonaniu polimer rozpuszczalny w wodzie jest aktywowany akceptorem Michaela. Dokument WO 95/13312 opisuje, między innymi, rozpuszczalne w wodzie polietylenoglikole PEGs aktywowane przez sulfon, które są wysoce selektywne przy sprzęganiu z resztami tiolowymi zamiast ugrupowań aminowych nu cząsteczkach i nu powierzchniach. Te pochodne PEG są trwałe względem hydrolizy przez dłuższe okresy w środowiskach wodnych przy pH= około 11 lub mniej, i mogą tworzyć wiązaniu z cząsteczkami dując konjuguty które są również trwałe hydrolitycznie. Połączenie, przez które PEG i cząsteczka biologicznie aktywna są sprzężone, obejmuje resztę sulfonową sprzężoną z resztą tiolową i ma strukturę PEG-SO2-CH2-CH2-S-W, gdzie W oznacza biologicznie aktywną cząsteczkę, przy czym resztą sulfonową jest winylosulfon lub aktywny etylosulfon. Dwoma szczególnie przydatnymi pochodnymi homobifunkcyjnymi są PEG-bis-chlorosulfon i PEG-bis-winylosulfon.
Międzynarodowe zgłoszenie nr PCT/US96/19459, którego ujawnienie jest tu przywołane jako odnośnik literaturowy, podaje sposoby wykonywania aktywowanych przez sulfon linkerów przez otrzymanie związku o reaktywnej grupie hydroksylowej i przemianę grupy hydroksylowej w reaktywny akceptor Michaela z wytworzeniem aktywowanego linkeru, przy użyciu czterowodorofuranu (THF) juko rozpuszczalniku dla konwersji. Międzynarodowe zgłoszenie nr PCT/US96/19459, którego ujawnienie przywołuje się tu nu zasadzie odnośniku literaturowego, podaje proces oczyszczaniu aktywowanych linkerów, wykorzystujący chromu189 309 tografię ąadziałymania hyarąeąbąmego w celu rozdziału lidkoróm ze względu na o wielkość i funkcjonalność grup końcowych.
W szczpaóldości, obecny wynalazek rozpatruje następująco czosteczki będące wynikiem ekspresji prokariotów, dprymatyzomane chemicznie z warąmadzoniem mono- lub poli- (przykładowo 2-4) reszt PEG: sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 oraz sTNFR-I 2.3D/d15, metiąnylowane Iub niemetiąnylowanp oraz ich warianty i pochodne.
Form(my) mieląmartąściowa(wo)
Można zbudować formy(mę) poliwalpdcyjnp(do), to znaczy cząsteczki obejmujące więcej niż jedno ugrupąmadio aktywne. W jednym mypądadiu cząsteczka może mieć wiole miejsc wiązania czynnika martwicy nowotworu dla ligandu TNF (przykładowo, kombinacja produktu obciętego sTNFR). Ponadto, cząsteczka może mieć co najmniej jedno miejsce wiązania czynnika martwicy nąmotmąru i - w zależności od żądanej charakterystyki formy wielowartościomej - co najmniej jedno miejsce wiązania innej czosteczki (przykładowo, kombinacja co najmniej jednogo produktu obciętego sTNFR i co najmniej jednego antagonisty receptora idterleukidy-1 („IL-1ra”), jak episade poniżej).
W jednym wykonaniu formę wielemartościomo można zbudować, przykładowo, przez chemiczne sprzęganie co najmniej jednego produktu obciętego sTNFR i innej czosteczki, korzystnie innego produktu obciętego sTNFR przy użyciu dowąldoaą dopuszczalnego klinicznie linkom (przykładowo, rozpuszczalnego w moazie polimeru jak ąpisadą powyżej). W zasadzie linkor nie pewinied nadawać nowej immudeaeddości, ani tez poprzez nowo reszty amidekmasomp - zmieniać hydrąeobąwości i ładunku w strukturze ze szkodą dla jej biodystrybucji i usuwania z krmiobCoau (clearance).
Takio polimery, gdy so stosąmane jako litery, mogą to być homopolimory, kopelimory ^ϋρ Iub blokowe i terpolimery oparto na wyżej wymienionych monomerach, o prostym łańcuchu albo rozgałęzione, podstamiedp Iub diepeastawione. Polimer może mieć aemelną długość Iub o aomelny ciężar cząsteczkowy, lecz te cechy mogą wpływać na właściwości biologiczne. Średnio ciężary cząsteczkowo pelimeróm, szczególnie przydatno dla obniżania szybkości usuwania z krmiąbiegu (clearanco) w zastosowaniach farmaceutycznych są w zakresie od 2.000 do 35.000 daltonów. Ponadto, długość polimerów' może się zmieniać tak, by zoptymalizować Iub nadać żodaną aktywność bieląaiczdo.
Grupy aktywujące, któro można użyć do połączenia polimeru rozpuszczalnego w wodzip z dwiema Iub więcej proteinami, obejmują następujące: sulfonowo, maleimidomo, sulfhydrylewo, holową, trieledomo, tresyladomo, azyayrydąwą, ąpsyradomą Iub 5-airydylową.
W szczególnym wykonaniu można wytworzyć amueunpcyjdy Iub miρlofudPcyjdy aktywowany linkor o co najmniej jednym reaktywnym akceptorze Michaela, zaądnie ze zgłoszeniem patentowym Stanów Zjednoczonych nr 08/473.809 i oczyścić zgodnie zo zgłoszeniem patentowym Stanów Zjednoczonych nr 08/611.918.
Cząstki aktywno można łączyć stosując typowe techniki sprzęgania (patrz publikacja PCT nr WO 92/16221 i publikacja PCT nr WO 95/34326, ujamdienie których przywołuje się tutaj jako odnośniki literaturowe). Ponadto, publikacja PCT nr WO 92/16221 opisuje wytwarzanie różnych dimoryząmanych cząsteczek inhibitora sTNFR-I, przykładowo zaimeryzowanogo c105 sTNFR-I. Przykładową mielomartościową protoinę wiążąco czynnik martwicy nowotweru o ϋπτο (sTNFR-I 2.6D/C 106)2-(20 kDa PEG) ujawniono w przykładzie I.
Alternatywnie, dmumartościąmo cząsteczka możo składać się z dwóch powtórzeń elementów produktów obciętego sTNFR rozdzielonych przez obszar linkem polipeptydomego. Projektowanie linPeróm pąlipeptydąmych jest podobno do prąjoktąmania wstamiadia krótkich sekwencji pętli między domenami w projektowanych de novo proteinach (Muttor (1988), TIBS, 13: 260-265 i Regan i DeGrado (1988), Science, 241: 976-978, ujawnienie których przywołano tu jako odnośniki). Wykazano, żp linker ąapowioani dla przeciwciał o pojedynczym łańcuchu jest skuteczny dla 'wytwarzania formy aimoryczdej rekembinacyjnego ludzkiego sTNFR-II (Neve i wsp., (1996), Cytokine, 8(5): 365-370, ujawnienie którego zamieszczedo tu jako odnośnik literaturOwy). Zestawiono szereg różnych konstruktów linkorowych i wykazano, żo są one przydatne dla przeciwciał; większość linkerów funkcyjnych ma wielkość od 12 do 25 aminokwasów (aminokwasy mające nioreaktymne grupy boczne, przy28
189 309 kładowo alanina, seryna i glicyna), które razem tworzą sekwencję hydrofilową, mają pewną liczbę przeciwnie naładowanych reszt by zwiększyć rozpuszczalność i są giętkie (Whitlow i Filpupa (1991), Methods. A Companion to Methods in Enzymology, 2: 97-105 oraz Brigido i wsp. (1993), J Immunol., 150: 469-479, ujawnienie których przywołano tu jako odnośniki literaturowe).
W innym wykonaniu obcięte sTNbRt mogą być chemicznie sprzęgane z biotyną, a sprzężone układy biotyna/abcioSe sTNFRs są następnie poddawane łączeniu z awidyną z wytworzeniem cztorowarSaśclowych cząsteczek awidyna/biotyna/obcięty sTNbR. Obcięte nTNbRt można także sprzęgać kowalencyjnie z dwunitrofenolem (DNP) lub trój nitrofenolem (TNP), a uzyskane kopjugaSy wytrącać przy użyciu apty-DNP lub anty-TNP-IgM z wytworzeniem dekamerowych kanjugotów o wartościowości 10 względem miejsc wiązania TNF.
W jeszcze innym wykonaniu możno także wytworzyć rekomUinacyjpe proteiny fuzyjne z obciętym sTNFR, gdzie każda rokomUinacyjna cząsteczka chimeryczna ma sekwencję sTNFR, jak opisano wyżej, podstawioną za zmienne domeny jednego lub obydwu ciężkich i lekkich łańcuchów cząsteczki immunoglobuliny i ma wszystkie lub część stałych domen, lecz co najmniej jedną stałą domenę ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunogloUulipy. Przykładowo, każda taka chimeryczna proteina fuzyjna: obcięty sTNbR/IgG1 może być wytworzona z dwóch genów chimerycznych: chimery o lekkim łańcuchu - obcięty tTNbR/ludzkl kappa (aUsięty sTNFR/Ck) i chimery o ciężkim łańcuchu - obcięty tTNFR/ludzki gamma-1 (obcięty sTNbR/Cg-1). Po transkrypcji i translacji dwóch genów chimerycznych, jak opisano poniżej, produkty genowe można złączyć w jedną cząsteczkę chimeryczną z obciętym nTNbR usytuowanym w położeniu dwuwartaśclawym. Dalsze szczegóły dotyczące budowania takich cząsteczek chimerycznych ujawniono w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5.116.964; publikacji PCT nr WO 89/09622; publikacji PCT nr WO 91/16437 i opisie EP 315062, ujawnienie których przywołano tu jako odnośniki literaturowe.
W jeszcze innym wykonaniu można także wytworzyć rekomUinacyjne proteiny fuzyjpe z obciętym sTNFR, w których każda rekombinasyjna cząsteczka chimeryczna ma sekwencję tTNbR, jak opisano powyżej, i co najmniej jedną część obszaru 186-401 osteoyroSegeryny (OPG), opisanej w europejskim zgłoszeniu patentowym nr 96309363.8.
Palinuklootydy
Obecny wynalazek dostarcza ponadto polipukleoSydy kodujące obcięte sTNFRs. W oparciu o obecny opis i stosując uniwersalną tabelę kodonów, zwykły biegły w sztuce może łatwo określić wszystkie sekwencje kwasów nukleinowych, które kodują sekwencje ami^kwasowe obciętych tTNbRs. Obecnie korzystne sekwencje kwasów nukleinowych obejmują polipukleotydy kodujące tTNbR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 2.6D/N105, tTNbR-I 2.3D/d8, sTNFR-I 2.3D/d18 oraz sTNFR-I 2.3D/d15. Przykłady różnych polinukleotydów przedstawiono na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 oraz 7.
Można postępować według rekombinacyjnych technik ekspresji wykonywanych w zgodzie z opisami podanymi poniżej, aby wytworzyć te polinukleotydy i w wyniku ekspresji uzyskać zakodowane proteiny. Przykładowo, przez wstawienie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej obcięty sTNFR w odpowiedni wektor, biegły w sztuce może łatwo wytworzyć duże ilości żądanej sekwencji nukleoSydowej. Następnie sekwencje te można użyć do wytworzenia sond detekcyjnych lub primerów amplifikacji. Alternatywnie, polipukleotyd kodujący obcięty sTNFR można wstawić w wektor ekspresji. Przez wprowadzenie wektora ekspresji do odpowiedniego gospodarza można wytworzyć w dużych ilościach żądany obcięty tTNbR.
Jak opisano poniżej w niniejszym tekście istnieją liczne układy gospodarz/wektor dostępne dla propagacji żądanych sekwencji kwasów nukleinowych i/lub wytwarzania obciętych tTNbRt. Obejmują one - lecz nie są ograniczone do plazmidu, wektorów wirusowych i wektorów ipsercyjnych, oraz gospodarzy yrakariotysznysh i eukariotycznych. Biegły w sztuce może wybrać układ gospodarz/wektor zdolny do propagacji i ekspresji hoSerologiszpoga DNA by wytworzyć lub poddać ekspresji sekwencje według obecnego wynalazku.
Ponadto, biegli w sztuce wiedzą, ze uwzględniając obecne ujawnienie - nowe sekwencje kwasów nukleinowych obejmują degenerowane sekwencje kwasu nukleinowego kodujące
199 099 obcięte sTNFRs o sekwencjach podanych na rysunku oraz te sekwencje kwasu nukleinowego, które hybrydyzują (korzystnie w ścisłych warunkach hybrydyzacji) uzupełniając te sekwencje (tworząc sekwencje komplementarne względem tych sekwencji) kwasu nukleinowego (Maniatis i wsp. (1982), Molecular Cloning (A Labo^ory Manual), Cold Spring Harbor Labzratory, str. 387-389). Przykładowymi, ścisłymi warunkami hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 4 x SSC w 62-67°C, a następnie przemywanie w 0,1 x SSC w62-67°C przez około 1 godzinę. Alternatywnie, przykładowymi ścisłymi warunkami hybrydyzacji jest hybrydyzacja w 45-55% formamidzie, 4 x SSC w40-45°Ć. Objęte są także sekwencje DNA, które hybrydyzują do sekwencji kwasu nukleinowego przedstawionych na rysunku fig. 1 i 9, w rozluźnionych warunkach hybrydyzacji, i które kodują obcięte sTNFRs. Przykładami takich ściśle rozluźnionych warunków hybrydyzacji są 4 x SSC w45-55°C lub hybrydyzacja w 30-40% formamidzie w 40-45 °C.
Obecny wynalazek dostarcza także rzkombinαzyjaz konstrukry DNA obejmujące wektorowy DNA z sekwencjami DNA kodującymi obcięte sTNFRs. W każdym takim kzastrnkzie DNA sekwencja kwasu nukleinowego kodująca obcięty sTNFR (-z lub -bez peptydów sygnalnych) jest skojarzona operacyjnie z odpowiednią kontrolną lub regulacyjną sekwencją ekspresji zdolną do nkiern.nkzwαaia replikacji ekspresji obciętego sTNFR w wybranym gospodarzu.
Ekspresja rzkombinacyjna
Przygotowanie pzliankleotydów
Sekwencje kwasu anklzinzwzgo kodujące obcięte sTNFRs można łatwo otrzymać na szereg sposobów włączając w to - lzcz bez ograaiznyniy się: syntezę chemiczną, skaning bibliotek cDNA lub gznomowych, skrining bibliotek ekspresji i/lub amplifikację PCR cDNA. Metody te i inne, które przydatne są dla wyodrębniania takich sekwencji kwasu nukleinowego wyłożono w: Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989); Ausubel i wsp., wyd. Current Protocols in Molecular Biology, Current Protzcols Press, (1994); oraz przzz: Bzrger iKimmel, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniąues, Vol. 152, Azαdemiz Press, Inc., San Diego, CA, (1987), ujawnienie których umieszczono tutaj jako odnośniki.
Syntezę chemiczną kwasu aukleinzwzgo, które kodują obcięte sTNFRs można wykonać stosując sposoby dobrze znanz według stanu techniki, takie jak podane przez: Engels i wsp., (1989), Angew. Chem. Intl. Ed, 28:716-734; i Wzlls i wsp. (1985), Gene, 34:315, ujawnienie których umieszczono tutaj jako odnośniki. Metody te obejmują, między innymi, metodę fosfotriestrową, fosforoamidynową i H-fosfoaiynzwą syntezy sekwencji kwasu nukleinowego. Duże sekwencje kwasu nukleinowego, przykładowo większe niż 1 ϋϋ auklzztydów pod względem długości, można zsyntzzowyć jako szzreg fragmentów. Fragmenty te można następnie ligować razem tworząc sekwencję kwasu nukleinowego kodujące obcięte sTNFRs. Korzystnym sposobem jest synteza na polimerze przy użyciu standardowych reakcji chemii fosforamidynów.
Alternatywnie, odpowiednią sekwencją kwasu nukleinowego można otrzymać przez skrining odpowiedniej biblioteki cDNA (tzn. biblioteki wytworzonej z jednego lub więczj źródła tkanki, o których sądzi się, żz exprzsjoaują proteinę) lub biblioteki genzmowej (biblioteki wytworzonej z całości genomowego cDNA). Źródłem biblioteki cDNA jest w typowym przypadku tkanka z jakiegokolwiek gatunku, o którym sądzi się, że exprzsjzauje żądaną proteinę w rozsądnych ilościach. Źródłem biblioteki gzaomowej może być jakakolwiek tkanka lub tkanki z jakiegokolwiek gatunku ssaków lub innego, o których sądzi się, ze przechowują gen kodujący obcięty sTNFR.
Pożywki hybrydyzacji można poddać skriniagzwi na obecność DNA kodującego obcięty sTNFR stosując jedną lub więcej sond kwasu nukleinowego (oligonukleotydy, fragmenty cDNA lub fragmenty gznomzwego DNA, które mają dopuszczalny stopień homo^n względem cDNA lub gznu, który ma być klonowany), którz będą hybrydyzzwαć selektywnie z cDNA(s) lub genzm(ami) obecnym w bibliotece. Sondy w typowym przypadku stosowane dla takiego skriaiagn kodują mały obszar sekwencji DNA z tzgo samego lub podobnego gatunku co gatunek, z którego jest wytworzona biblioteka. Alternatywnie, sondy mogą być zdzgenerowane, tak jak się to omawia w obecnym zgłoszeniu.
189 309
Hybrydyzację w typowym przypadku wykonuje się przez rekombinację sondy oligoąkklśktydkwej lub cDNA z klonami do postaci dwuąrciowśj, w ściśle określonych, ostrych warunkach, które zapobiegają niespecyficznemu wiązaniu, lecz umożliwiają wiązanie tych klonów, które wykazują znaczny poziom homo^n z sondą lub primerem. Typowe, ścisłe warunki hybrydyzacji i przemywania zalezą po części od wielkości (tzn. liczby ąuklśotydów wchodzących w skład łańcucha) cDNA IuC sondy oligonuklektydowej i od tego, czy sonda jest zdegenerowana. Rozpatruje się również prawdopodobieństwo identyfikacji klonu przy projektowaniu pożywki hybrydyzacyjnej (przykładowo od tego, czy jest poddawana skriąiągowi CiClikteka cDNA lub biblioteka genomowa).
Gdy jako sonda jest użyty fragment DNA (taki jak cDNA), typowe warunki hybrydyzacji obejmują te podane przez AusuCela i wsp. (1994), wydanie jak wyżej. Po hybrydyzacji pożywka hyCrydyzacyjna jest przemywana przy zachowaniu odpowiednio ścisłych warunków zależnie od szeregu czynników takich, jak: wielkość sondy, spodziewana homolmgia sondy względem klonu, pożywka hyCrydyzacyjna poddana skriąingowi, liczba klonów poddana skriningnwi itp. Przykłady ścisłych roztworów przemywających, które zwykle charakteryzują się niską mocą jonową i są stosowane przy stosunkowo wysokich temperaturach, są następujące: jednym takim ścisłym roztworem przemywającym jest 0,015 M NaCl, 0,005 M cytrynian sodu i 0,1% SDS w 55-65°C; innym takim ścisłym roztworem przemywającym jest 1 mM Na2EDTA, 40 mM NsHPO4 , pH=7,2, oraz 1%o SDS w temperaturze około 40-50°C; i jeszcze inny ścisły roztwór przemywającym jest 0,2 x SSC i 0,1% SDS w około 50-65°C.
Są także protokoły przykładowe dla ścisłych warunków przemywania gdzie sondy oligknkklektydowś stosuje się do skerąingk pożywek hyCrydyzacyjnych. Przykładowo, pierwszy protokół stosuje 6 x SSC z 0,05% pirofosfoeaąu sodu w temperaturze między około 35°C a 63°C, w zależności od długości sondy. Przykładowo, sondy o 14 zasadach przemywa się w 35-40°C, sondy o 17 zasadach w 45-50°C, sondy o 20 zasadach w 52-57°C, i sondy o 23 zasadach w 57-63°C. Temperaturę można zwiększyć o 2-3°C tam gdzie wiązanie niespecyficzne w tle okazuje się wysokie. Drugi protokół stosuje do przemywania roztwór chlorku yzteromśtyloamknkwśgo (TMAC). Jednym takim ścisłym roztworem przemywającym jest 3 M TMAC, 50mM Tris-HCl, o pH=8,0 i 0,2 % SDS.
Innym odpowiednim sposobem otrzymywania odpowiedniej sekwencji kwasu nukleinowego jest reakcja łańcuchowa pklimerazy (PCR). W tej metodzie cDNA jest wytwarzany zpoly(A)+RNA luC całkowitego RNA przy użyciu enzymu odwrotnej traąskryptazy. Dwa primery, w typowym przypadku komplementarne względem dwóch oddzielnych obszarów cDNA (kligkąuklektydów) kodujących obcięty sTNFR, są następnie dodawane do cDNA wraz z pnlimeeazą taką jak polime^za Taq, i uolimśrazα amplifikuje obszar cDNA pomiędzy dwoma pr^erami.
Sekwencje kligonkkleotydowe wybrane jako sondy lub primery powinny mieć o odpowiednią długość i powinny Cyć wystarczająco jednoząayząe by zminimalizować ilość niespecyficznego wiązania, która może wystąpić podczas skriningu lub amplifikacji PCR. Faktyczna sekwencja sond lub primerów jest zwykle oparta na zachowanych Iub wysoce homologicoąych sekwencjach luC obszarach. Ewentualnie, sondy luC primery mogą Cyć całkowicie luC częściowo zdegenerowane, to znaczy mogą zawierać mieszaninę sond/primeeów, które wszystkie kodują tę samą sekwencję aminokwasową, lecz przy użyciu różnych kodonów. Alternatywą dla wytwarzania sond zdegenerowanych jest umieszczenie i^zyzy w pewnych luC we wszystkich pozycjach kodmu, które zmieniają się w zależności od gatunku. Oligkąuklektydowe sondy Iub primery można wytworzyć metodami chemicznej syntezy dla DNA, jak opisano powyżej.
Jak opisano powyżej, sekwencja odmiany jest sekwencją naturalną (przykładowo odmianą alelową) lub syntetyczną, zawi^^ia^c^^jedną lub więcej podstawień, delecji i/lub inseecji ąkkleotydów w porównaniu do sekwencji z rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7 oraz prowadzi to do ekspresji odmian sekwencji amiąkkwasowśj w porównaniu do sekwencji amiąkkwasowj'j dzikiego typu. Wytwarzanie syntetycznych sekwencji odmian jest również dobrze znane według stanu techniki, jak to opisano, przykładowo, w: Sambrook i wsp. (1989), jak wyżej; i Wells i wsp. (1985), Geee, 34: 315, ujawnienie których umieszczono tutaj jako odnośniki.
i89 309
3i
Wektory
DNA kodujące obcięte sTNFRs można wstawić w wektory dla dalszego klonowania (amplifikacja DNA) lub dla ekspresji. Odpowiednie wektory są dostępne handlowo lub wektor może być specyficznie zbudowany. Wybór lub budowa odpowiedniego wektora będzie zależała od: (1) od tego, czy ma być stosowany dla amplifikacji DNA czy też dla ekspresji DNA; (2) od wielkości wstawianego DNA do wektora; i (3) od zamierzanej komórki gospodarza poddawanej transformowaniu wektorem.
Każdy z wektorów zawiera sekwencję kwasu nukleinowego kodującą żądaną proteinę w operatywnym powiązaniu z jedną lub więcej następujących sekwencji kontrolnych ekspresji lub regulacyjnych zdolnych do ukierunkowania, kontrolowania lub w inny sposób wpływania na ekspresję żądanej proteiny przez wybraną komórkę gospodarza. Każdy wektor zawiera różne składniki, w zależności od ich funkcji (amplifikacja DNA lub ekspresja DNA) i ich zgodności z zamierzoną komórką gospodarza. Składniki wektora zasadniczo obejmują, lecz bez ograniczeń, jedną lub więcej z następujących pozycji: sekwencja sygnałowa, początek replikacji, jeden lub więcej genów selekcji Iub markerów, promotory, elementy enhancera, sekwencja zakończenia transkrypcji itp. Składniki te można otrzymać ze źródeł naturalnych lub mogą być otrzymane znanymi sposobami na drodze syntezy.
Przykłady odpowiednich prokariotycznych wektorów do klonowania obejmują bakteriofagi takie jak pochodne lambda lub plazmidy z E. coli (przykładowo: pBR322, col El, pUC, F-faktor i pochodne plazmidu Bluescript® (Stratagene, LaJolla, CA)). Można również do tego celu zastosować inne odpowiednie wektory ekspresji, których wiele typów znanych jest według stanu techniki i dla opisanych poniżej komórek gospodarza.
Sekwencja sygnalna
Kwas nukleinowy kodujący sekwencję sygnałową można wstawić w pozycji 5' sekwencji kodującej obcięty sTNFR, przykładowo może być składnikiem wektora, lub może być częścią kwasu nukleinowego kodującego obcięty sTNFR. Znane są kwasy nukleinowe kodujące rodzime sekwencje sygnałowe sTNFR-I i sTNFR-II (dokumenty EP 393 438 oraz EP 422 339). '
Początek replikacji
Każdy z wektorów ekspresji i klonowania zawiera w ogólnym przypadku sekwencję kwasu nukleinowego umożliwiającą by wektor replikował w jednej lub więcej komórkach gospodarza. W wektorze klonowania, sekwencja ta w typowym przypadku jest taką, która umożliwia, by wektor replikował niezależnie od DNA chromosomowego gospodarza i obejmuje początki replikacji lub sekwencje replikujące autonomicznie. Takie sekwencje są dobrze znane. Początek replikacji z plazmidu pBR322 jest odpowiedni dla większości bakterii gram-ujemnych, a różne początki (przykładowo, SV40, polioma, adenowirus, VSV łub BPV) są przydatne dla wektorów klonowania w komórkach ssaków. W ogólnym przypadku początek replikacji nie jest potrzebny dla wektorów ekspresji ssaków (przykładowo, początek SV40 jest często stosowany jedynie dlatego, ze zawiera wczesny promotor.
Gen selekcji
Każdy z wektorów ekspresji i klonowania zawiera w typowym przypadku gen selekcji. Gen ten koduje proteinę „markera” niezbędną dla przeżycia lub wzrostu transformowanych komórek gospodarza kiedy są one hodowane w selektywnej pożywce do hodowli. Komórki gospodarza, które nie są transformowane przy użyciu wektora nie będą zawierać genu selekcji i stąd nie przeżyją w pożywce do hodowli. Typowe geny selekcji kodują proteiny, które: (a) nadają odporność na antybiotyki i inne toksyny, przykładowo, ampicylinę, neomycynę, metotreksan lub tetracyklinę, (b) uzupełniają auksotroficzne niedobory, Iub (c) zaopatrują w krytyczne składniki odżywcze niedostępne z pożywki do hodowli.
Można stosować inne geny selekcji dla amplifikacji genów, które mają ulec ekspresji. Amplifikacja jest procesem, w którym geny o większym zapotrzebowaniu na proteiny krytyczne dla wzrostu są dublowane jeden za drugim w obrębie chromosomu przy kolejnych tworzeniach komórek rekombinacyjnych. Przykłady odpowiednich wybieralnych markerów dla komórek ssaków obejmują reduktazę dihydrofolanową (DHFR) i kinazę tymidynową. Transformanty komórki umieszcza się pod wybranym ciśnieniem do, którego przezycia są przystosowane jedynie transformanty dzięki markerom obecnym w wektorze. Wybrane ciśnienie jest
I89 309 przykładane poprzez hodowlę transformowanych komórek w warunkach, w których stężenie wybranego środka w pożywce jest kolejno zmieniane prowadząc tym samym do amplifikacji genów selekcji i DNA kodującego obcięte sTNFRs. W wyniku tego są syntezowane zwiększone ilości obciętych sTNFRs z amplifikowanego DNA.
Przykładowo, komórki transformowane przy użyciu genu selekcji DHFR są najpierw identyfikowane przez hodowlę wszystkich transformant w pożywce do hodowli zawierającej metotreksan, konkurencyjnego antagonisty DHFR. Odpowiednią komórką gospodarza, gdy jest używany DHFR dzikiego typu, jest linia komórkowa komórek jajnika chomika chińskiego z niedoborem aktywności DHFR (Urlaub i Chasin (1980), Proc. Natl. Acad Sci, USA, 77(7): 4216-4220, ujawnienie którego umieszczono tutaj jako odnośnik). Transformowane komórki są następnie wystawiane na działanie podwyższonych poziomów metotreksanu. Prowadzi to do syntezy wielokrotnych kopii genu DHFR i - wraz z tym - do wielokrotnych kopii innych DNA obecnych w wektorze ekspresji, takich jak DNA kodujący obcięty sTNFR.
Promotor
Każdy z wektorów ekspresji i klonowania będzie w typowym przypadku zawierał promotor, który jest rozpoznawany przez organizm gospodarza i znajduje się w operacyjnym powiązaniu z sekwencją kwasu nukleinowego kodującą obcięty sTNFR. Promotor jest nietranslowaną sekwencją umiejscowioną w górę (5') od start-kodonu genu strukturalnego (w ogólnym przypadku w zakresie od około 100 do 1000 par zasad), który kontroluje transkrypcję i translację szczególnej sekwencji kwasu nukleinowego, takiej jak kodująca obcięty sTNFR. Promotor może być - w typowym przypadku - pogrupowany w jedną z dwóch klas; promotorów indukowalnych i promoterów konstytutywnych. Promotor indukowalny inicjuje zwiększone poziomy transkrypcji z DNA pod jego kontrolą w odpowiedzi na pewne zmiany w warunkach pożywki, takie jak obecność lub nieobecność składnika odzywczego lub zmiana temperatury. Dobrze znana jest pewna liczba promotorów, rozpoznawalnych przez wiele potencjalnych komórek gospodarza. Promotor może być operacyjnie powiązany z DNA kodującym obcięty sTNFR przez usunięcie promotora ze źródłowego DNA za pomocą wytrawiania enzymem restrykcyjnym i wstawienie sekwencji żądanego promotora. Rodzimą sekwencję promotora sTNFR-I można użyć do ukierunkowania amplifikacji i/lub ekspresji DNA kodującego obcięty sTNFR. Korzystny jest promotor heterologiczny, jednak jeśli umożliwia większą transkrypcję i wyższe wydajności expresjonowanej proteiny w porównaniu z promotorem rodzimym i jeśli jest zgodny z wybranym do zastosowania układem komórek gospodarza. Przykładowo, można użyć jakąkolwiek z rodzimych sekwencji promotora innych członów rodziny NGF/TNF do ukierunkowania amplifikacji i/lub ekspresji DNA kodującego obcięty sTNFR.
Promotory odpowiednie dla stosowania u prokariotycznych gospodarzy obejmują układy promotorów beta-laktamazy i laktozy: alkaliczną fosfatazę, układ promotora tryptofanu (trp); układ genu luminescencji bakteryjnej (luxR) i promotory hybrydowe takie jak promotor „tac”. Odpowiednie są również inne promotory bakteryjne. Ich sekwencje nukleotydowe opublikowano, umożliwiając tym samym biegłemu w sztuce wykonanie ligacji do żądanych sekwencji DNA stosując - wedle potrzeby - linkery lub adaptery by dostarczyć jakiekolwiek żądane miejsca restrykcyjne.
Odpowiednie sekwencje promujące dla stosowania u gospodarzy będących drożdżami są również dobrze znane według stanu techniki. Odpowiednie promotory do stosowania w komórkach gospodarzy ssaków są dobrze znane i obejmują te otrzymane z genomów wirusów takich, jak: wirus polioma, wirus ospy ptaków, adenowirus (taki jak Adenowirus 2), bydlęcy wirus brodawczaka, ptasi wirus mięsaka, cytomegalowirus, retrowirus, wirus zółtaczki-B i - a zwłaszcza - Simian Virus 40 (SV40). Inne odpowiednie promotory ssaków obejmują heterologiczne promotory ssaków, przykładowo promotory szoku cieplnego i promotor aktynowy.
Element enhancera
Każdy z wektorów ekspresji klonowania będzie w typowym przypadku zawierał sekwencję enhancera dla zwiększenia transkrypcji przez wyższe eukarioty sekwencji DNA kodującej obcięty sTNFR. Enhancery są cis-działającymi elementami DNA, zwykle od około 10 do 300 par zasad długości, które działają na promotor by zwiększyć jego transkrypcję. Enhancery są stosunkowo niezależne od orientacji i pozycji. Stwierdzono ich obecność
189 309 w pozycjach 5' i 3' względem jednostki transkrypcji. Enhancery z drożdży są korzystnie stosowane w przypadku promotorów drożdży. Jest znanych szereg sekwencji enhancerów dostępnych z genów ssUków (przykładowo: globinu, elastuza, albumina, alpha-feto-proteina i insulina). Ponadto, enhancery wirusowe takie jak enhancer SV40, enhancer wczesnego promotora cytomegulowirusa, enhancer poliomu i enhancer udenowirusa są przykładowymi elementami enhancerów dla aktywacji eukariotycznych promotorów. Podczas gdy enhancer może być złączony w wektorze w pozycji 5' Iub 3' z DNA kodującym obcięty sTNFR, w typowym przypadku jest umiejscowiony w pozycji 5' od promotora.
Zakończenie transkrypcji
Każdy z wektorów ekspresji stosowany w komórkach gospodarzu eukariotycznego będzie w typowym przypadku zawierał sekwencję niezbędną do zakończenia transkrypcji i dla stabilizacji mRNA. Takie sekwencje są powszechnie dostępne z nietranslowunych obszarów 5' i niekiedy 3' eukariotycznych DNA Iub cDNA. Obszary te zawierają segmenty nukleotydowe transkrybowune jako fragmenty poliudenylowune w nietranslowanej części mRNA kodującej obcięty sTNFR.
Budowa wektora
Budowa odpowiedniego wektora zawierającego jeden Iub więcej podanych wyżej składników (wraz z sekwencją kodującą obcięty sTNFR) jest dokonywana za pomocą standardowych technik ligucji. Izolowane plazmidy Iub fragmenty DNA są rozszczepiane, cięte i powtórnie ligowune w żądanym porządku, by wytworzyć żądany wektor. Aby potwierdzić, ze zbudowano poprawną sekwencję, można użyć mieszanki ligacyjnej dla transformowaniu E coli, i można wybrać udane transformanty znanymi technikami, jak opisano powyżej. Następnie wytwarza się pewne ilości wektora z trunsformuntów, analizuje endonukleuzą restrykcyjną i/lub sekwencjonuje by potwierdzić obecność żądanego konstruktu.
Można również użyć wektor, który zapewnia przejściową ekspresję DNA kodującego obcięty sTNFR w komórkach ssaków. W ogólnym przypadku przejściowa ekspresja wiąże się z użyciem wektora ekspresji, który jest zdolny do skutecznej replikacji w komórce gospodarzu tuk, ze komórka gospodarzu nagromadza wiele kopii wektora ekspresji, i z kolei syntezuje wysokie poziomy żądanej proteiny kodowanej przez wektor ekspresji. Każdy układ przejściowej ekspresji obejmujący odpowiedni wektor ekspresji i komórkę gospodarzu, pozwala nu dogodną, pozytywną identyfikację protein kodowanych przez klonowane DNA, juk również nu szybki skrining takich protein pod kątem żądanych właściwości biologicznych i fizjologicznych, to znaczy identyfikowania aktywnego biologicznie obciętego sTNFR.
Komórki gospodarzu
Jakakolwiek z mnogości rekombinacyjnych komórek gospodarzu, z których każda zawiera sekwencję kwasu nukleinowego dlu stosowania przy ekspresji żądanej proteiny, jest również dostarczona przez obecny wynalazek. Przykładowe prokariotyczne i eukariotyczne komórki gospodarza obejmują komórki bakteryjne, ssaków, grzybów, owadów, drożdży Iub roślin.
Prokariotyczne komórki gospodarzu obejmują, lecz nie są ograniczone do, eubukterii takich jak organizmy Gram-ujemne Iub Grum-dodutnie (przykładowo, E coli (HB 101, DH5a, DH10 i MC 1061); Bacilli takie jak: B subtilis; Pseudomonas species, takie jak P. aeruginosa; Streptomyces spp., Salmonella typhimurium; Iub Serratia marcescans. W szczególnym wykonaniu żądana proteina może być ekspresjonowuna w E coli.
Oprócz prokariotycznych komórek gospodarzu, mikroorganizmy eukariotyczne takie, juk nitkowate grzyby Iub drożdże mogą być odpowiednimi gospodarzami dlu ekspresji obciętych sTNFRs. Saccharomyces cerevisiae, Iub zwykłe drożdże piekarskie - to najpowszechniej używany spośród eukariotycznych mikroorganizmów gospodarzu, lecz dobrze znane i powszechnie dostępne jest szereg innych rodzajów, gatunków i szczepów.
Obcięty sTNFR może być ekspresjonowuny w formie glikozylowanej przez jedną z wielu odpowiednich komórek gospodarzu wyprowadzonych z organizmów wielokomórkowych. Takie komórki gospodarza są zdolne do złożonego przetwarzania i działań glikozylujących. W zasadzie, mogłaby być zastosowana jakakolwiek hodowla komórkowa wyższych eukuriotów niezależnie od tego, czy hodowla tUka dotyczy komórek kręgowców czy bezkrę34
189 309 gowców włączając komórki roślin i owadów. W szczególnym wykonaniu żądana proteina może Cyć ekspeesjknowaąa w komórkach bakulowirusa.
Można zastosować komórki kręgowców ponieważ propagacja komórek kręgowców w hodowli (hodowla tkankowa) jest procedurą dobrze znaną. Przykłady przydatnych linii komórkowych gospodarza ssaka obejmują, lecz nie są ograniczone do, linie nerek małpy CV1 transfoęmkwaąyyh przez SV40 (COS-7), linie nerek embrionu ludzkiego (komórki 293 lub komórki 293 skbklonowaąe dla wzrostu dla hodowli zawiesinowej), komórki nerek młodego chomika i komórki jajników chomika chińskiego. Inne odpowiednie linie komórkowe ssaków obejmują, lecz nie są ograniczone do, HeLa, komórki L-929 małpy, pochodne linii 3T3 Swiss, myszy BalC-c luC nIh, i BHK lub linie komórkowe HaK chomika. W szczególnym wykonaniu żądana proteina może być śkspeśsjonowαąa w komórkach COS.
Komórka gospodarza może być transfśkowaąa i korzystnie transformowana przy użyciu żądanego kwasu nukleinowego w odpowiednich warunkach umożliwiających ekspresję kwasu nukleinowego. Wybór odpowiednich komórek gospodarza i metod transformacji hodowli, amplifikacji, skriningu oraz wytwarzania produktu i oczyszczania są doCrze znane według stanu techniki (Gething i Sambrook (1981), Naturę, 293: 620-625 lub - alternatywnie Kaufnan i wsp. (1985), Mol. Cell Biol., 5(7) 1750-1759, lub opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 4.419.446, ujawnienie których jest umieszczone tutaj jako odnośniki). Na przykład, w przypadku komórek ssaków bez ścian komórkowych można zastosować metodę wytrącania fosforanem wapnia. Można również zastosować ślekteopkrację, mikekinjekcjp i inne znane techniki.
Możliwe jest również, że obcięte sTNFRs można wytwarzać przez homologiczną rekombinację luC przy użyciu metod wytwarzania rekkmCinayyjnego wykorzystujących elementy kontenląś wprowadzone do komórek już zawierających DNA kodujący kCciptś sTNFRs. Rekombinacja homologiczna jest techniką oryginalnie kpraykwaąą dla przypadku, Cy celujące geny indukowały lub korygowały mutacje w genach aktywnych teaąskęypcyjąiś (Kucherlapati (1989), Prog WNucl Acid Res. and Mol. Biol., 36: 301, ujawnienie którego jest umieszczone tutaj jako odnośnik). Zasadniczą technikę opracowano jako metodę dla wprowadzania specyficznych mutacji w specyficzne obszary genomu ssaków (Thomas i wsp. (1986), Cell, 44: 419-428; Thomas i Capecchi (1987), Cell, 51: 503-512, oraz Dketschmaą i wsp. (1988), Proc. Natl. Acad Sci., 85: 8583-8587, ujawnienie których umieszczono tutaj jako odnośniki), lub by korygować specyficzne mutacje w genach defektywnych (Dketschman i wsp. (1987), Naturę, 330: 576-578, ujawnienie którego umieszczono tutaj jako odnośnik). Przykładowe techniki podano w: opisie patentowym Stanów Zjednoczonych nr 5.272.071; dokumencie WO 92/01069; dokumencie WO 93/03183; dokumencie WO 94/12650 oraz w dokumencie WO 94/31560, ujawnienie których umieszczono tutaj jako odnośniki.
Przez rekombinację homologiczną sekwencję DNA, która ma być wstawiona w genom, można skierować do specyficznego obszaru rozpatrywanego genu przez przyłączenie go do DNA celującego. Celujące DNA jest to DNA komplementarne (homologiczne) względem obszaru geąkmkwśgk DNA. Małe fragmenty celującego DNA, komplementarne względem specyficznego obszaru genomu są doprowadzane do kontaktu z nicią macierzystą podczas procesu replikacji DNA. Ogólną właściwością DNA wstawionego do komórki jest hybrydyzacja - i stąd rekombinacja - z innymi fragmentami endogennego DNA przez wspólne obszary homologiczne. Jeśli ta komplementarna nić jest dołączona do oligknukleotydk, który zawiera mutację luC różną sekwencję DNA, to jest ona również włączona w nowo syntezowaną nić w wyniku rekombinacji. W wyniku funkcji korekty jest możliwe, by nowa sekwencja DNA służyła jako szablon. Przeto, przeniesiony DNA jest włączony do genomu.
Jeśli jest znana sekwencja konkretnego genu, taka jak sekwencja kwasu nukleinowego kbyiętegk sTNFR, sekwencja kontrolna ekspresji (fragment DNA komplementarny względem wybranego obszaru genu) może być zsyntśzowaąa lub inaczej otrzymana, tak jak przez odpowiednią restrykcję rodzimego DNA w specyficznych miejscach rozpoznania wiążących rozpatrywany obszar. Fragment ten służy jako sekwencja celująca po wstawieniu do komórki i będzie hybrydyzować do jego obszaru homologicznego w obręCie genomu. Jeśli ta hybrydyzacja następuje podczas replikacji DNA, ten fragment DNA, i jakakolwiek sekwencja dołąi89 309 czona do niego będzie funkcjonować jako fragment Okazaki i będzie „wszyta”w nowo zsyntezowana nić „córkę”DNA.
Do tych fragmentów celującego DNA są dołączone obszary DNA, które mogą oddziaływać z ekspresją obciętego sTNFR. Przykładowo, element promotora/enhancera, supresor lub element modulacyjny transkrypcji egzogennej jest wstawiony do genomu komórki zamierzonego gospodarza w bliskości i w orientacji wystarczającej, by wpływać na transkrypcję DNA kodującego żądany obcięty sTNFR. Element kontrolny nie koduje obciętego sTNFR, lecz zamiast tego kontroluje część DNA obecnego genomu komórki gospodarza. Zatem, ekspresję obciętego sTNFR można osiągnąć nie przez transfekcję DNA kodującego obcięty sTNFR, lecz raczej przez użycie celującego DNA (zawierającego obszary homologii z rozpatrywanym genem endogennym) sprzężonego z segmentami regulacyjnymi DNA dostarczającymi sekwencję genu endogennego z rozpoznawalnymi sygnałami transkrypcji obciętego sTNFR.
Hodowla komórek gospodarza
Sposób hodowli każdej z jednej lub więcej rekombinacyjnych komórek gospodarza dla wytwarzania żądanej proteiny będzie różny zależnie od wielu czynników i okoliczności; optymalna procedura wytwarzania w danej sytuacji będzie widoczna dla biegłych w sztuce po wykonaniu minimalnej liczby eksperymentów. Takie rekombinacyjne komórki gospodarza hoduje się w odpowiedniej pożywce i obcięty sTNFR będący wynikiem ekspresji jest następnie ewentualnie odzyskiwany, wyodrębniany i oczyszczany z pożywki hodowli (Iub z komórki, jeśli jest wynikiem ekspresji wewnątrzkomórkowej) odpowiednimi sposobami znanymi biegłym w sztuce.
W szczególności, każdą z komórek rekombinacyjnych użytych do wytworzenia żądanego obciętego sTNFR można hodować w pożywkach odpowiednich dla indukowania promotorów, wybierając odpowiednie rekombinacyjne komórki gospodarza lub amplifikując gen kodujący żądany obcięty sTNFR. Pożywki można uzupełniać wedle potrzeby hormonami i/lub innymi czynnikami wzrostu (takimi jak insulina, transferyna lub naskórkowy czynnik wzrostu), solami (takimi jak chlorek sodu, wapnia, magnezu i fosforan), buforami (takimi jak HEPES), nukleozydami (takimi jak adenozyna i tymidyna), antybiotykami (takimi jak gentamycyna), elementami śladowymi (określonymi jako nieorganiczne związki zwykle obecne w końcowych stężeniach w zakresie mikromolowym), glukozą lub innymi źródłami energii. Można również włączyć inne uzupełnienia, w odpowiednich stężeniach, jak to uznają biegli w sztuce. Odpowiednie warunki hodowli, takie jak temperatura, pH itp., są także dobrze znane biegłym w sztuce dla stosowania w wybranych komórkach gospodarza.
Uzyskany produkt ekspresji może następnie być oczyszczany niemal do jednorodności stosując procedury znane według stanu techniki. Przykładowe techniki oczyszczania podano w EP 393 438 i EP 422 339, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze.
Kompozycje farmaceutyczne
Każda z kompozycji farmaceutycznych będzie zasadniczo zawierać terapeutycznie skuteczną ilość obciętych sTNFRs i chemicznie zmodyfikowanych pochodnych obciętych sTNFRs (zbiorczo, „produkt(y) obciętego sTNFR”) zmieszaną z zaróbką. Zaróbka korzystnie zawiera jeden lub więcej farmaceutycznie i fizjologicznie dopuszczalnych substancji do tworzenia preparatu zmieszanych z produktem (produktami) obciętego sTNPR i substancją o kontrolowanym uwalnianiu.
Pierwotny rozpuszczalnik w zaróbce może być wodny lub niewodny. Ponadto zaróbka może zawierać inne farmaceutycznie dopuszczalne substancje pomocnicze dla modyfikowania lub utrzymywania pH korzystnie między 5-6,5, a zwłaszcza między 5,5-6,0 (przykładowo bufory takie jak cytryniany, fosforany i aminokwasy, takie jak glicyna); środki pęczniejące dla preparatu liofilizowanego (przykładowo, mannitol i glicyna); dla utrzymywania osmolarności (przykładowo, mannitol i chlorek sodu); środki powierzchniowo czynne (przykładowo, polisorbat 20, polisorbat 80, triton, i pluzoniks); środki dla utrzymywania lepkości; klarowności; barwy; sterylności; trwałości (przykładowo, sacharoza i sorbitol); przeciwutleniacze (przykładowo, siarczyn sodu i wodorosiarczyn sodu); środki konserwujące (przykładowo, kwas benzoesowy i kwas salicylowy); zapach preparatu; środki smakowe i rozcieńczające; środki dla
189 309 zapewnienia szybkości rozpuszczania (przykładowo, salubilizatary lub środki solubilizujące, takie jak alkohole, glikole polietylenowe i chlorek sodu); środki dlo zapewnienia szybkości uwalniania; środki emulgujące; środki ułatwiające tworzenie zawiesiny; rozpuszczalniki; wypełniacze; zarobki związane z dostarczaniem; rozcieńczalniki; zarobki i/lub adiuwapty farmaceutyczne. Przewidziane są także inne skuteczne formy podawania, takie jak preparaty pozajelitowe o powolnym uwalnianiu, aerozole do inhalacji, preparaty czynne doustnie Iub czopki. Kompozycja może także zawierać preparaty w postaci cząstek związków polimerowych, takich jak polimery ulegające degradacji w masie (przykładowo, kwas ytli(mlekowy-koglikolowy) (PLGA) kopolimery, mieszanki polimerowe PLGA, kopolimery blokowe PEG i kwasu mlekowego i glikolowego, poli(cyjanaakrylany)); polimery ulegające degradacji powierzchniowej (przykładowo, yoli(bezwodniki) i poli(arto-ottry)); estry hydrożeli (przykładowo, pluronowe alkohole wielowadoratlenawe, alkohol poliwinylowy), polliwipylopirolidon), kopolimery bezwodnika maleinowego i eteru alkllowinylowega, celuloza, pochodne kwasu hialuronawoga, alginian, kolagen, żelatyno, albumina i skrobie i dekstrany) i ich układy kompozycji; Iub preparaty lipatamów Iub mikrosfery. Takie kompozycje mogą wpływać na stan fizyczny, trwałość, szybkość uwalniania in vivo i szybkość in vivo usuwania obecnych protein i pochodnych. Optymalny preparat farmaceutyczny dla żądanej proteiny będzie określony przez biegłego w sztuce zależnie od drogi podawania i żądanego dawkowania. Przykładowe kompozycje farmaceutyczne ujawniono w: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. wyd. (1990), Mack Publinhipg Co., Eosto) PA 18092, s. 1435-1712; Gombotz i Pettit (1995), Blasonjugate Chem., 6: 332- 351; Leone-Bay, i ip. (1995), Journal of Medicinal Chemistry, 38:4263-4269; Haas, i in. (1995), Clinical Immunology and Immunopathology, 76(1:93: WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772 i WO 94/21235, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze.
Szczególne kompozycje o powolnym uwalnianiu są dostępne u następujących dostawców: Doyotosh (Depofoam™, liposom wielopęcherzykowy); Alkermes (PraLeaso™, mikrosfera PLGA). W obecnym zgłoszeniu, hialuronian w zamierzeniu obejmuje hialuronian, kwas hialuropowy, jego ^Ιο (takie jak hialuronian sodu), estry, etery, pochodne enzymatyczne i usieclawano żele kwasu hlaluronawoga i chemicznie zmodyfikowano pochodne kwasu hialuropowega (takie jak hylan). Przykładowe formy hialuronianu ujawniono w: Peyrop i Balazs (1974), Path. Biol., 22(8):731-736: Isdalo i in. (1991), J Drug Dev., 4(2):93-99; Larsep i ip. (1993), Journal of Biomedical Materials Research, 27:1129-1134; Namiki i in. (1982), International Journal of Clinical Pharmacology, Therapy and Toxicology, 20(11):501-507; Meyer i in. (1995), Journal of Controlled Release. 35:67-72; Kikuchi i in. (1996), Osteoarthritis and Cartilage, 4:99-110; Soka^am i in. (1994), Clinical Orthopaedics and Related Research, 299:282-292: Meyors i Brandt (1995), 22(9): 1732-1739; Laurent i in. (1995), Acta Orthop Scand, 66(266): 116-120; Cascone i ip. (1995), Biomatericds, 16(7):569-574; Yerashalmi i in. (1994), Arch^es of Biochemistry and Biophysics, 313(2):267-273; Bomatchez i in. (1993), Journal of Biomedical Materials Re^orch, 27(5):677-681: Tan i in. (1990), Australian Journal of Blotechnology, 4(1):38-43; Gombotz i Pettit (1995), Blasanjugote Chem., 6:332-351; opisy patentowe USA nr. 4 582 865, 4 605 691, 4 636 524, 4 713 448, 4 716 154, 4 716 224, 4 772 419, 4 851 521, 4 957 774, 4 863 907, 5 128 326, 5 202 431, 5 336 767, 5 356 883; europejskie zgłoszenia patentowe nr: 0 507 604 A2 i 0 718 312 a2; i WO 96/05845, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze. Specyficzne kompozycje hialuronianu są dostępne u następujących dostawców: BioMatrix, Inc. Ridgefield, NJ (Synyisc™, mieszanina 90:10 płynu hylap i żelu hylan); Fidia S.p.A., Abano Terme, Italy (Hyalgan™, sól sodowa kwasu hlaluropawego pochodzącego z grzebienia koguta (c. cząst. -500000 do -700000)); Kaken Pharmaseutlcal Co., Ltd., Tokyo, Japan (Artz™, 1% roztwór kwasu hialuropowego pochodzący z grzebienia koguta, c. cząst. -700,000 MW); Pharmacia AB, Stockholm, Szwecja (Healop™, kwas hialuronowy pochodzący z grzebienia koguta, c. cząst. ~4 x 106 MW); Genzyme Corporation, Cambridge, MA (Surgicoot™, rokombinacyjny kwas hialuropowy); Prawa Biopolymer, Inc. Parttmoush, NH (Kwas hialuronowy FCH, o dużym ciężarze cząsteczkowym (przykładowo, -1,5-2,2 x 106 MW) kwas hioluropowy wytworzony z hodowli Streptococcus zooepidemicus; Hialuroniap sodu MV, -1,0-1,6 x 10 MW i hialuronian sodu LY, -1,5-2,2 x 106 MW); Calbiochem-Novabiachem AB, Lautelfmgen,
189 309
Szwajcaria (Kwas hCaluronomy, sól sodowa (Katalog firmy 1997 nr 385908) wytworzony z Streptococcus sp.); Interfon Company, Purcha.se, NY (Kwas healuronąwy pochodzący z grzebienia koguta >1x10° MW); Diosynth Inc., Chicago, IL; Amorchol Corp., Edison, NJ i Kyoma Hakko Koayą Co., Ltd., Tokyo, Japonia.
Po zestawieniu kompozycji farmaceutycznej, możo ona być przechowywana w sterylnych fiolkach jako roztwór, zawiesina, żel, emulsja, ciało stało Iub proszek odwodniony Iub liefilCząmady. Preparaty takie mogą być przechowywane w postaci gotowej do użycia Iub w postaci (przykładowo liefilCzowadej) wymagającej rekąnstytuąmadia przed podaniem.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zestawy dla wytwarzania jednostki podawania pojedynczej dawki. Każdy z zestawów możo zawierać zarówno piermsry pojemnik z suchą proteiną jak i drugi pojemnik z preparatom wodnym. Zestawami objętymi zakresom obecnego wynalazku są pojedyncze i mieląpąmąrąme uprzednio napełniono strzykawki; przykładowe uprzednio napełnione strzykawki (przykładowo, strzykawki z cieczą, i lią-ctrzykamki, takio jak Lyo-Joct®, uprzednio napełniona lią-strzykamka dwukomorowa) są dostępne z firmy Vetter GmbH, Ravensburg, Niemcy].
ZastosąmenCa
Produkty obciętego sTNFR mogą być przydatne jako reagenty do badań oraz jako środki terapeutyczne i diagnostyczne. Zatem obcięte sTNFRs mogą być użyto w próbach diagnostycznych in vitro i/lub in vivo dla ujęcia ilościowpgą rodzimogo sTNFR-I w próbce tkanki Iub organu Iub aby wyznaczyć i/lub wyodrębnić komórki, któro eksprosjąnują TNF (Scallon i in.(1995), ^upra). W próbach tkanek Iub organów będzio mniejsza radioaktywność pochodząca od m-obciętych sTNFRs wiążących się z TNF, w porównaniu zo standaryzowaną krzywą wiązania 12ai-obciętych sTNFRs, wskutek dieznacząnogą rodzimogo sTNFR-I Iub sTNFR-I wiążącogo się z TNF. Podobnie, można użyć 125I-obcięte sTNFRs, by wykryć obecność TNF w różnych typach komórek.
Obecny wynalazek także rozważa użycie produktów obciętego sTNFR przy tworzeniu przeciwciał i przeciwciał będących wynikiem reakcji (szczogólnio obejmując, to które także wiążą się z rodzimym sTNFR-I Iub sTNFR-II). Można uzyskać przeciwciała, które wiążą się z obciętymi sTNFR, takie jak epitopy w obrębie sekwencji amidopwasowpj wzorem Rι-[Cycl9-Cys1°3]-R2 Iub w obrębio sekwencji aminePmasomęj Ri-[Cys32-CySH5]-R5. Typowy biegły w sztuce może zastosować dobrze znane opublikowane procedury, by uzyskać przeciwciała modoplonaldo i poliklodelne Iub przeciwciała rokąmbidacyjne, któro specyficznie rozpoznają i wiążą się z rozmaitymi proteinami kąaewanymi przoz sekwencjo eminokwasome obecnego wynalazku. Takie przeciwciała można następnie użyć, by oczyścić i scharakteryzować połnej długości, dojrzały inhibitor TNF o 30 kDa i pełnej długości, dojrzały inhibitor TNF o 40 kDa.
Obecny wynalazek dotyczy także sposobów leczenia pewnych chorób i stanów zdrowotnych (z których wielo można scharakteryzować jako choroby zapalne) zachodzących za pośrednictwem TNF. Uważa się, ze choroba Iub stan zarąmątdy jest rozpatrywany jako „choroba zachodząca za pośrednictwem TNF”, jeśli choroba (samorzutna Iub związana z eksperymentom) jest kojarzona z pądmyższedym poziomem TNF w płynach ustrojowych Iub w tkankach przylogających do ogniska choroby Iub wskazania w obrębie organizmu. Choroby zachodzące za pośrednictwem TNF można także rozpoznać poprzoz następująco dwa warunki.· (1) patologiczno wyniki badań związane z chorobo można naśladować doświadczalnie u zwierząt przez podawanie TNF i (2) stan patologiczny indukowany w doświadczalnych modelach zwierzęcych choroby można hamować Iub znieść przez działanie środkami, które inhibitują działanie TNF. Wiele chorób zachodzocych za pośrednictwem TNF spełnia dwa z tych trzech merunkóm, a inne spełniają wszystkie trzy marunpi. Niepełna lista chorób zachodzących za pośrednictwem TNF oraz pokrewnych następstw i związanych z tym objawów, z których każdy może być leczony sposobami według obecnego wynalazku to: zespół zaburzeń oddechowych aąrącłych; Pacheksja/adoreksja; rak (przykładowo leukemio); zespół przewlekłego zmęczenia; roakcja przeszczepu przeciw gospodarzowi; przeczulica bólowa; choroba zapalna jelit; choroby neurozapalde; uraz nioaąkrmiendy/ związany z roperfuzją, obejmujący dipaoPrmiedio mózgu (uraz mózgu w wyniku padaczki, krwotoku Iub udaru, z których każdo może prowadzić do neurodegedpracji); cukrzyca (przykładowo młodzieńczy początek
I89 309 cukrzycy typu i); stwardnienie rozsiane; choroby oczne; ból; zapalenie trzustki; zwłóknienie płucne; choroby reumatyczne (przykładowo reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, seroujemne zapalenie wielostawowe, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zespół Reitera i reaktywne zapalenie stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, enteropatyczne zapalenie stawów, zapalenie wielomięśniowe, zapalenie skórno-mięśniowe, twardzina skóry, stwardnienie układowe, zapalenie naczyń, zapalenie naczyń mózgowych, zestaw Sjogrena, ostry gościec stawowy, zapalenie wielochrząstkowe i zespół bólu wielomięśniowego z wysokim OB i olbrzy-miokomórkowe zapalenie tętnicy skroniowej); szok septyczny; efekty uboczne terapii radiacyjnej; układowy liszaj rumieniowaty; choroba stawu skroniowo-zuchwowego; zapalenie tarczycy i transplantacja tkanki.
Każdy z produktów obciętego sTNFR może być podawany pacjentowi w terapeutycznie skutecznych ilościach dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując takie choroby jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i wywoływane przez gronkowce („septyczne”) zapalenie stawów). Określenie „pacjent” w zamierzeniu obejmuje zwierzęta (przykładowo koty, psy i konie) jak również ludzi.
Produkt obciętego sTNFR może być podawany przez podawanie miejscowe, dojelitowe lub pozajelitowe obejmując, bez ograniczania, iniekcję i infuzję dożylną, domięśniową, dotętniczą, dooponową, wewnątrztorebkową, wewnątrzoczodołową, dosercową, doskórną, wewnątrzotrzewnową, przeztchawiczą, podskórną, podnaskórkową, dostawową, podtorebkową, podpajęczynówkową, wewnątrzrdzeniową, dokomorową i domostkową. Produkt obciętego sTNFR może także być podawany drogą ustną lub być podawany przez błony śluzowe, tzn., donosowo, podjęzykowo, dopoliczkowo lub doodbytniczo dla podawania układowego.
Korzystne jest, by produkty obciętego sTNFR były podawane przez iniekcję dostawową, podskórną, domięśniową lub dożylną. Ponadto, produkt obciętego sTNFR może być podawany przez ciągłą infuzję (przykładowo modulujące przepływ urządzenia do stałej lub przerywanej infuzji implantowanej lub zewnętrznej) tak, by w sposób ciągły zapewniać żądany poziom produktu obciętego sTNFR we krwi w czasie podawania. Korzystnie wykonuje się to za pomocą ciągłej infuzji poprzez, przykładowo minipompę, taką jak minipompa osmotyczna. Tymi sposobami można zapewnić, że ilość leku jest utrzymywana na żądanym poziomie i można pobrać próbki krwi oraz monitorować ilość leku w strumieniu krwi. Są dostępne handlowo rozmaite pompy, u dostawców takich jak MiniMed Inc, Sylmar, CA (przykładowo MT507) i Alza Corp., Palo Alto, CA (przykładowo pompa osmotyczna Alzet, model 2MLI).
Rozważa się także, ze można stosować inne sposoby ciągłego lub prawie ciągłego dawkowania. Na przykład derywatyzacja chemiczna może prowadzić do form o powolnym uwalnianiu proteiny, co daje efekt ciągłej obecności w strumieniu krwi w przewidywalnych ilościach w oparciu o wyznaczony tryb dawkowania.
Sposoby stosowania produktów obciętego sTNFR do leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, włączając w to stany zapalne stawów (przykładowo zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów i reumatoidalne zapalenie stawów), podano w Europejskim Zgłoszeniu Patentowym 567566, którego ujawnienie włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacz. Tytułem przykładu lecz nie ograniczania, w jednym szczególnym wykonaniu produkty obciętego sTNFR mogą być podawane dostawowo dla leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów i zapalenia kości i stawów. Tytułem przykładu - lecz nie ograniczania - w innym szczególnym wykonaniu, produkty obciętego sTNFR mogą być podawane podskórnie lub domięśniowo dla leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów, choroby zapalnej jelit, kacheksji/ anoreksji lub stwardnienia rozsianego. Tytułem przykładu - lecz nie ograniczania - w jeszcze innym szczególnym wykonaniu produkty obciętego sTNFR mogą być podawane dożylnie dla leczenia urazu mózgu w wyniku traumy, padaczki, krwotoku lub udaru; lub podawane dokomorowo dla leczenia urazu mózgu w wyniku traumy. Korzystny sposób leczenia zapalenia stawów obejmuje: (i) pojedynczą dostawową iniekcję produktu obciętego sTNFR podawaną okresowo wedle potrzeby, by zapobiec lub leczyć reaktywację zapalenia stawów i (2) okresowe podskórne iniekcje produktu obciętego sTNFR. Zapoczątkowanie
199 399 leczenia szoku septycznego powinno się rozpocząć możliwie najszybciej po posocznicy lub diagnozowaniu możliwości posocznicy. Na przykład leczenie może być rozpoczęte bezpośrednio po operacji lub wypadku lub jakimkolwiek zdarzeniu, którz może nizść ryzyko zyinicjowαaia szoku septycznego. Korzystne sposoby leczenia zespołu zaburzeń oddechowych dorosłych obejmują: (1) pojedyncze lub wielokrotne doopzaowe podawanie produktu obciętego sTNFR i (2) podanie jednej dużej dawki leku lub ciągłą infuzję dożylną obciętego produktu sTNFR.
W innym wykonaniu, jest rozważana także terapia komórkowa, przykładowo wszczepienie komórek wytwarzających obcięty sTNFR. To wykonanie obecnego wynalazku możz zawierać wszczepienie do komórek pacjentów, które są zdolne do zsyatetyzowaniy i wydzielania bizlogizzniz aktywnej formy obciętego sTNFR. Takiz komórki wytwarzające obcięty sTNFR mogą być komórkami, które normalnie nie wytwarzają obciętego sTNFR, lecz które zmodyfikowano, by wytwarzały obcięty sTNFR, lub którz mogą być komórkami, których zdolność do wytwarzania obciętego sTNFR zwiększono przez przekształcenie przy użyciu pzlinukleotydu odpowiedniego dla ekspresji i wydzielania obciętego sTNFR. Aby zminimalizować potencjalną reakcję immunologiczną u pacjentów przez podawanie obciętego sTNFR obcych gatunków, korzystne jest, by komórki były tego samego gatunku jak pacjent (przykładowo człowiek) lub by komórki były w otoczce z materiału, który dostarcza barierę przeciw rozpoznaniu immnnologizzaemn, Iub by komórki były umieszczone w immunologicznie uprzywilejowanym miejscu anatomicznym, takim jak w jądra, oko lub ośrodkowy układ nerwowy.
Komórki ludzkie lub zwizrzęce można implantować u pacjentów wbłokzInpytybilnych, półprzepnszznαlaych polimerowych osłonkach łub membranach, by umożliwić uwalnianie obciętego sTNFR, lecz zapobiec znisncnzniu komórzk przez układ immunzjzgizzny pacjenta lub przez inne szkodliwe czynniki z otaczającej tkanki. Alternatywnie, komórki własne pacjenta, transformowane ex vivo by wytwarzać obcięty sTNFR, można imputować bezpośrednio do organizmu pacjenta bzz takiej otoczki. Metodologia otoczkowa^a błony żywych komórzk jest znana typowym biegłym w sztuce, i można wykonać wytwarzanie otoczkowanych komórek i ich wszczepienie do organizmu pacjentów.
W jeszcze innym wykonaniu, rozpatruje się także terapię genową in vivo, w której sekwencja kwasu nukleinowego kodująca obcięty sTNFR jest wprowadzana bezpośrednio pacjentowi. Na przykład sekwencja kwasu nukleinowego kodująca obcięty sTNFR jest wprowadzana do komórek docelowych przzz lokalną iniekcję koastrnktn kwasu nukleinowego, z lub bez odpowiedniego wektora dostarczania, takiego jak wektor wirusa adeao-skojarzonego. Alternatywne wektory wirusowe obejmują (lecz niz są ogranizzznz do): wektory retrowirusa, adeaowirnsa, wirusa opryszczki zwykłej i wirusa brodawzzaka. Fizyczne przeniesienie można osiągnąć in vivo przez lokalną inizkcję kzastrnktn żądanego kwasu nukleinowego lub innego odpowiedniego wektora dostarczania zawierającego żądaną sekwencję kwasu nukleinowego, przeniesienie za pośrednictwem lipzszmów, bezpośrednią iniekcję („gołego” DNA), przeniesienie za pośrednictwem receptora (kompleks ligand-DNA) lub bombardowanie mikrocząstkami (działo genowe).
Przykładowe techniki terapii genowej i komórkowej ujawaiznz w następujących pozycjach: opis patentowy USA nr 4,892,538; opis patentowy USA 5 011 472; opis patentowy USA 5 106 627; DE 4219626, WO 94/20517 i 96/22793, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze.
Niezależnie od sposobu podawania, leczenie choroby zachodzącej za pośrednictwem TNF wymaga dawki lub całkowitego trybu dawkowania obciętego sTNFR, skutecznej by zmniejszyć lub wyleczyć objawy choroby. Inne czynniki występujące przy określaniu odpowiedniego dawkowania mogą obejmować: chorobę lub stan poddawany leczeniu, lub któremu chce się zapobiec, ostrość choroby, drogę podawania i wiek, płeć i stan zdrowotny pacjenta. Dalsze uściślenie obliczeń potrzebnych do wyznaczenia odpowiedniego dawkowania przy leczeniu jest rutynowo wykonywane przez biegłych w sztucz, zwłaszcza w świetle informacji o dawkowaniu w njywaizaych tu próbach. Dawkowanie może takżz być wynayczzaz przez użycie znanych prób dla wyznaczenia dawkowania stosowanych w połączeniu z odpowiednimi
189 309 danymi dawka-reakcja. Konkretną dawkę oblicza się zgodnie z przybliżoną wagą ciała lub polem powierzchni ciała pacjenta.
Częstotliwość dawkowania zależy od parametrów farmakokinetycznych obciętego sTNFR w użytym preparacie. Obcięty sTNFR może być podawany raz, lub w przypadkach ostrych i przewlekłych zaburzeń, podawany codziennie w mniej częstych dawkach lub podawany w postaci dużej dawki początkowej, a następnie ciągłej dawki lub powolnego dostarczania. W przypadku podawania pozajelitowego, pozajelitowe dawki jednostkowe, przykładowo mogą wynosić do 10 mg każda, zasadniczo do 15 mg, a zwłaszcza do 20 mg. W przypadku podawania do jumy stawowej, kompozycja farmaceutyczna jest korzystnie podawana jako pojedyncza iniekcja, przykładowo w postaci od 3 do 10 ml strzykawki zawierającej dawkę, przykładowo między około 5 mg/ml do 10 mg/ml obciętego sTNFR rozpuszczonego w izotonicznym roztworze soli buforowanym fosforanem. Preparat może być podawany do jamy stawowej z częstością przykładowo raz na 7 do 10 dni. W taki sposób, podawanie jest prowadzone ciągle, przykładowo 4 do 5 razy zmieniając w razie potrzeby dawkę.
W pewnych przypadkach, produkty obciętego sTNFR mogą być podawane jako wspomaganie innej terapii i także przy innych preparatach farmaceutycznych odpowiednich dla rozpatrywanego wskazania. Produkt obciętego sTNFR i jakikolwiek jeden lub więcej z tradycyjnych lub nowych leków przeciwzapalnych może być podawany oddzielnie lub w połączeniu.
Produkty obciętego sTNFR (przykładowo proteiny wzorem R1-[Cys19-Cys1°3]-R2) i jakikolwiek jeden lub więcej z dodatkowych leków przeciwzapalnych mogą być podawane oddzielnie lub w połączeniu. Informację dotyczącą następujących związków można znaleźć w: The Merck Manuał of Diagnosis und Therupy, 16. wyd., Merck, Sharp&Dohme Research Laboratories, Merck & Co., Ruhway, NJ (1992) i w Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.
Obecne leczenie chorób zachodzących zu pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenie, takie jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i indukowane gronkowcem („septyczne”) zapalenie stawów) obejmuje leki pierwszej linii dla kontroli bólu i zapalenia klasyfikowane jako niesteroidowe leki przeciwzapalne (NSAID). Wtórne leczenie obejmuje kortykosteroidy, powoli działające leki przeciwreumatyczne (SAARD) lub leki modyfikujące chorobę (DM).
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na stosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R|-lCysI9-CysIθ3]-R2) i jakiegokolwiek z jednej lub więcej NSAID dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenie, takie jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i wywoływane przez gronkowce („septyczne”) zapalenie stawów); i choroba reakcji przeszczepu na gospodarza. NSAID zawdzięczają swoje działanie przeciwzapalne, przynajmniej w części, inhibitowaniu syntezy prostaglandyny (Goodman i Gilman w: „The Pharmucological Basis of Therapeutics,” MacMillan, 7. wyd. (1985)). NSAID można sklasyfikować w dziewięciu grupach: (1) pochodne kwasu salicylowego; (2) pochodne kwasu propionowego; (3) pochodne kwasu octowego; (4) pochodne kwasu fenaminowego; (5) pochodne kwasu karboksylowego; (6) pochodne kwasu masłowego; (7) oksykamy; (8) pirazole i (9) pirazolony.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie obciętego produktu sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cys19-Cys1°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakąkolwiek jedną lub więcej pochodnych kwasu salicylowego, estrów proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli. Takie pochodne kwasu salicylowego, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują: acetaminosalol, aloksyprin, aspirynę, benorylat, bromosaligeninę, acetylosalicylan wapnia, trisulicylan magnezowy choliny, diflusinal, etersalat, fendosal, kwas gentisowy, salicylan glikolu, salicylan imidazolu, acetylosalicylan lizyny, mesalaminę, salicylan morfoliny, salicylan 1 -naftylu, olsalazynę, parsalmid, acetylosalicylan fenylu, salicylan fenylu, salacetumid, salicylamid kwasu O-octowego, salsalat i sulfasalazynę. Strukturalnie pokrewne pochodI89 309
4i ne kwasu salicylowego o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi03]-R.2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakąkolwiek jedną lub więcej pochodną kwasu propionowego, estrami proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Pochodne kwasu propionowego, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują: alminoprofen, benoksaprofen, kwas bukloksynowy, karprofen, deksyndoprofen, fenoprofen, flunoksaprofen, fluprofen, flurbiprofen, furkloprofen, ibuprofen, ibuprofen glinowy, ibuproksam, indoprofen, isoprofen, ketoprofen, loksoprofen, miroprofen, naproksen, oksaprozin, piketoprofen, pimeprofen, pirprofen, pranoprofen, kwas protizynowy, pyridoksyprofen, suprofen, kwas tiaprofenowy i tioksaprofen. Strukturalnie pokrewne pochodne kwasu propionowego o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakąkolwiek jedną lub więcej pochodną kwasu octowego, estrami proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Pochodne kwasu octowego, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują: acemetacynę, alklofenak, amfenak, bufeksamak, cinmetacynę, klopirak, delmetacynę, diklofenak sodowy, etodolak, felbinak, fenklofenak, fenclorak, kwas fenklozowy, fentiazak, furofenak, glukametacynę, ibufenak, indometacynę, izofezolak, izoksepak, lonazolak, kwas metiazynowy, oksametacynę, okspinak, pimetacynę, proglumetacynę, sulindak, talmetacynę, tiaramid, tiopinak, tolmetynę, zydometacynę i zomepirak. Strukturalnie pokrewne pochodne kwasu octowego o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R^Cys^-Cys^]^) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakąkolwiek jedną lub więcej pochodną kwasu fenaminowego, estrami proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Pochodne kwasu fenaminowego, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują: kwas enfenaminowy, etofenaman, kwas flufenaminowy, izoniksynę, kwas meklofenaminowy, meklofenaman sodowy, kwas medofenaminowy, kwas mefanaminowy, kwas niflumowy, talnifluman, terofenaman, kwas tolfenaminowy i ufenamat. Strukturalnie pokrewne pochodne kwasu fenaminowego o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakąkolwiek jedną lub więcej pochodną kwasu karboksylowego, estrów proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Pochodne kwasu karboksylowego, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które mogą być użyte obejmują: klidanak, diflunizal, flufenizal, inorydynę, ketorolak i tinorydynę. Strukturalnie pokrewne pochodne kwasu karboksylowego o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakąkolwiek jedną lub więcej pochodnymi kwasu masłowego, estrami proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Pochodne kwasu masłowego, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują: bumadizon, butibufen, fenbufen i ksenbucynę. Strukturalnie pokrewne pochodne kwasu masłowego o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina Rr[CysI9-Cysi°3]-R2) w połączeniu (le42
189 309 czenie wstępne, leczenie następcze luC leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym lub więcej oksykamami, estrami praleku luC ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Oksykamy, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują: droksykam, eąoliksm, izoksykam, phOksykam, sudoksykam, tenoksykam i 4-hydrkksylo-1,2-Cśązotiazyąo-1,1ditlenek 4-(N-fśnylo)-karboksamidu. Strukturalnie pokrewne oksykamy o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cys19-CysW3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze luC leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym luC więcej pirazolami, estrami praleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Pirazole, estry prożku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które mogą być użyte obejmują: difenamizkl i epirizol. Strukturalnie pokrewne pirazole o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R^Cys^-Cys^j-Ri) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze luC leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym IuC więcej pirazolonami, estrami prolekami lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami. Pirazoloąy, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które mogą być użyte obejmują: apazoą, azapropaoon, bśązkpiperylon, fepraokn, mkfebutαooą, mkrazką, oksyfeąCutazką, fenyloCutaooą, pipeC^o^ propylfenaokn, eamifenaooą, suksybuooą i tiazolinoCutazoą. Steuktuealąiś pokrewne pirazolony o podobnych właściwościach przśyrwCólkwych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cys19-CysW3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze luC leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym IuC więcej z następujących NSAID: kwas ε-ayetamidokapronkwy, S-adśąozylometioąiąa, kwas 3-amino-4-hydroksymasłowy, amiksetryna, anitrazafśą, antrafenina, Cśądazαk, lizynian beądazaku, Ceąoydamiąa, bśprozyna, broperamol, Cukolkm, bufezolak, yiprokwazon, kloksymat, dazydamina, deCoksamet, detkmidyąa, difeąpieamid, difenpiramid, difrsalsmina, ditazol, emorfsooą, mezylan faneti^olu, fenflumizol, flkktafeąiąa, flumizol, fluniksyna, fluprokwaoką, fopirtoliąα, fosfozal, guajmezal, g^az^en, izkąiksim, lefetamina HCl, leflunomid, lofemizol, ^fazo) kloniksyąian lizyny, meseklαoon, ąabumśtkn, niktindol, ąimesulid, orgoteina, oepanoksyąa, oksaceprolm, oksapadol, parany-lina, perizoksal, cytrynian ueeizoksalu, pifoksym, ujprkksen, pirαoolak, pirfenidon, ueokwαoką, proksazol, tielawma B, tiflamizol, timegadyna, tolektin, tklpadkl, tryptamid i związki oznaczone numerem kodowym firm, takim jak 4801565, AA861, AD1590, AFPB02, AFPB6O, AI778, AP504, AU8001, BPPC, BW540C, CHINOIN 127, CN100, EH382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, ITF182, KCNTEI6090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, 0N03144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, SIR133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA6O, TAI-901 (kwas 4-Cenzoil-1-mdankaeboksylowy), TVX2706, U60257, UR2301 iWY41770. Strukturalnie pokrewne NSAID o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych jak powyższe NSAID także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, oCecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina Ri-[Cys|9-Cys1°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym IuC więcej kketykksteroidami, estrami proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenie takie jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i indukowane gronkkwcśm („septycząś”) zapalenie stawów); i stwardnienie rozsiane. Kketykksteroidy, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole zawierają hydrokortyzon i związki, które są wyprowadzone z hydrokkrtyzoąu, takie jak 21 -acetoksyueegąeąolon, alklomśeazon, a^eston, amcinonid, beklometazoą, Cśtamjtazoą, walśrianiaą bśtametaoonu, budesoąid, chloroprednizoą, klkCśtaool, propioąiαą
189 309 klobetazolu, klobetuzon, maślan klobetazonu, klokortolon, kloprednol, kortykosteron, kortyzon, kortiwazol, deflazakon, desonid, desoksymerazon, deksametuzon, diflorazon, diflukortolon, difluprednut, enoksolon, fluazakort, flukloronid, flumetazon, piwalan flumetuzonu, flunizolid, acetonid flucynolonu, fluocynonid, acetonid fluorocynolonu, fluokortin butylu, fluokortolon, heksanoun fluorokortolonu, walerianian diflukortolonu, fluorometolon, octan fluperol łonu, octan fluprednidenu, fluprednizolon, flurandenolid, formokortal, halcynonid, halometazon, octan halopredonu, hydrokortamat, hydrokortyzon, octun hydrokortyzonu, maślan hydrokortyzonu, fosforan hydrokortyzonu, 21 -bursztynian sodowy hydrokortyzonu, tebutat hydrokortyzonu, mazypredon, medryson, meprednizon, metyloprednikolon, pirośluzan mometazonu, parametazon, prednikarbat, prednizolon, 21 -diedryaminooctun prednizolonu, fosforan sodowy prednizolonu, bursztynian sodowy prednizolonu, 21 -m-sulfobenzoesan sodowy prednizolonu, 21 -stearoglikolan sodowy prednizolonu, tebutute prednizolonu, 21 -trimetyloctun prednizolonu, prednizon, predniwal, predniliden, 21 -dietylaminooctun prednilidenu, tiksokortol, triamcinolon, acetonid triamcinolonu, benetonid triamcinolonu i heksacetonid triamcinolonu. Strukturalnie pokrewne kortykosteroidy o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R^Cys^-Cys1°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym Iub więcej powoli działających leków przeciwreumatycznych (SAARDs) lub leków przeciwreumatycznych modyfikujących choroby (DMARDs), estrami proleku Iub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami dla leczeniu chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenia, takie jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i indukowane przez gronkowca („septyczne”) zapalenie stawów); i stwardnienie rozsiane. SAARDs lub DMARDs, estry proleku i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole obejmują: allokupreid sodowy, auranofmę, aurotioglukozę, aurotioglikanid, azatioprinę, brechinar sodowy, bucylaminę, 3-aurotio-2-propanolo---sulfoman wapnia, chlorambucyl, chlorochin, klobuzaryt, kuproksolinę, cyklofosfamid, cyklosporynę, dapson, -5-deoksyspurgualmę, diacereinę, glucozaminę, sole złota (przykładowo sól złota cyklochiny, tiojabłczan złoto wo-sodo wy, tiosiarczan złotowo-sodowy), hydroksychlorochin, hydroksymocznik, kebuzon, lewamizol, lobenzaryt, melitynę, 6-merkaptopurynę, metotreksat, mizorybinę, mikofenolan mofetilu, mioral, musztardę azotową, D-penicylaminę, pirydynoloimidazole, takie juk SKNF86002 i SB203580, rupamycynę, tiole, tymopoetynę i winkrystynę. Strukturalnie pokrewne SAARDs lub DMARDs o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany nu zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina Rr[Cys19-Cys^j-IG) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym lub więcej inhibitorami COX2, ich estrami proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenie. Przykłady inhibitorów COX2, estrów proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli obejmują przykładowo celekoksyb. Strukturalnie pokrewne inhibitory COX2 o podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany nu zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina Rl-[CysI9-CysIθ3j-R.2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym lub więcej środkami przeciwbakteryjnymi, estrami proleku lub ich farmaceutycznie dopuszczalnymi solami dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenie. Środki przeciwbakteryjne obejmują, przykładowo ampicylinę, amoksycylinę, aureomycynę, bacytracynę, cefti^^ydym, ceftriakson, cefotaksim, cefachlor, cefaleksynę, cefradynę, ciprofloksacynę, kwas klawulanowy, kloksacylinę, dikloksacylan, erytromycynę, flukloksacylan, gentamycynę, gramicydynę, meticilan, neomycynę,
I89 309 oksacylan, penicylinę i wankomycynę. Strukturalnie pokrewne środki przeciwbakteryjne 0 podobnych właściwościach przeciwbólowych i przeciwzapalnych także w zamierzeniu mają być objęte przez tę grupę.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym lub więcej z następujących związków dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenie: czynnik stymulujący kolonię granulocytów; talidomid; BN50730; tenidap; E 5531; tiapafant PCA 4248; nimesulid; panawir; rolipram; RP 73401; peptyd T; MDL 201,449A; Chlorowodorek (łR^,3S)-cis-1-[9-(2,6-N -diaminopurynylo)] -3 -hydroksy-4-cyklopentenu; (1 R,3R)-trans-1 - [9-(2,6-diamino)puryno] -3-acetoksycyklopentan; chlorowodorek (łR,3R)-trans---[9-adenyl)-3-azydocyklopentanu 1 (1 R,3R)-trans-1 -[6-hydroksy-puryn-9-ylo)-3-azydocyklopentan.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R^Cys^-Cys^J^) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jednym lub więcej dodatkowymi inhibitorami TNF dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, włączając ostre i przewlekłe zapalenie. Inhibitory TNF zawierają związki i proteiny, które blokują syntezę in vivo lub pozakomórkowe uwalnianie TNF, obejmując następujące związki.
Dodatkowe inhibitory TNF zawierają przeciwciała anty-TNF (przykładowo MAK 195F przeciwciało Fab (Holler i in. (1993), 1 st International Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147; CDP 571 - przeciwciało monoklonalne anty-TNF (Rankin i in. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342, których ujawnienia włączono do obecnego opisu jako odsyłacze); BAY X 1351 mysie przeciwciało monoklonalne przeciw czynnikowi martwicy guza (Kieft i in. (1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 9, którego ujawnienie włączono do obecnego opisu jako odsyłacz); CenTNF cA2 - przeciwciało monoklonalne anty-TNF (Elliott i in. (1994), Lancet, 344:11251127 i Elliott i in. (1994), Lancet, 344: 1105-1 110, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze).
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z rozpuszczalnym rekombinacyjnym ludzkim antygenem Fas lub jego odmianami rekombinacyjnymi (WO 96/20206 i Mountz i in., J. Immunology, 155:4829-4837; iEP 510 691), których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze. WO 96/20206 ujawnia wydzielany ludzki antygen Fas (rodzimy i rekombinacyjny, obejmujący proteinę fuzyjną Ig), sposoby wyodrębniania genów odpowiedzialnych za kodowanie rozpuszczalnego rekombinacyjnego ludzkiego antygenu Fas, sposoby klonowania genu w odpowiednich wektorach i typach komórek, i sposoby ekspresji genu, by wytworzyć inhibitory. EP 510 691 podaje DNA kodujące ludzki antygen Fas, obejmujący rozpuszczalny antygen Fas, wektory ekspresji dla wspomnianych DNA i transformanty transfekowane wektorem. Przy podawaniu pozajelitowym, dawki każdej proteiny fuzyjnej antygenu Fas wynoszą zasadniczo od 1 mikrogram/kg do 100 mikrogram/kg.
W szczególnym wykonaniu, obecny wynalazek jest ukierunkowany na zastosowanie produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi°3]-R2) w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jakimkolwiek jednym lub więcej inhibitorami interleukiny-1 dla leczenia chorób zachodzących za pośrednictwem TNF, jak określono powyżej, obejmując ostre i przewlekłe zapalenie, takie jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i wywoływane przez gronkowce („septyczne”) zapalenie stawów); uraz mózgu w wyniku traumy, padaczki, krwotoku lub udaru; i stwardnienie rozsiane. Klasy inhibitorów interleukiny-1 obejmują antagonistów receptora interleukiny-i (jakikolwiek związek zdolny do specyficznego zapobiegania aktywacji receptorów komórkowych względem IL-1), takie jak lL-1ra, jak opisano poniżej; anty-IL-1 - przeciwciała monoklonalne receptora (przykładowo EP 623674, którego
199 099 ujawnienie włączono do obecnego opisu jako odsyłacz); proteiny wiążące IL-1, takiz jak rozpuszczalne receptory IL-1 (przykładowo U.S.P. 5,492,888, U.S.P. 5,488,032, 5 U.S.P. 5,464,937, U.S.P. 5,319,071 i U.S.P. 5,180,812, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze); przeciwciała mznoklznalne anty-IL-1 (przykładowo WO 9501997, WO 9402627, WO 9006371, U.S.P. 4935343, EP 364778, EP 267611 i EP 220063, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze); dodatkowe proteiny receptora IL-1, przykładowo WO 96/23067 (którego ujawnienie włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacz) i inne związki i proteiny, które blokują syntezę in vivo Iub pozakzmórkowego uwalnianie IL-1.
Antagonista receptora iatzrleukiny-1 (lL-1ra) jest ludzką proteiną, która działa jako naturalny inhibitor iaterlznkSny-1. Korzystnych antagonistów receptora, jak również sposoby wykonania i sposoby ich stosowania, opisano w opisie patentowym USA 5,075,222 (zwanym tu patentem ’222); WO 91/08285; WO 91/17184; AU 9173636; WO 92/16221; WO 93/21946; międzynarodowe zgłoszenie PCT nr US97/02131, którz podaje kompozycję farmaceutyczną obejmującą (a) skuteczną ilość polimeru o kontrolowanym uwalnianiu (przykładowo kwas hialnrznowy) i (b) skuteczną ilość lL-1ra; WO 94/06457; WO 94/21275; FR 2706772; WO 94/21235; DE 4219626, WO 94/20517; i WO 96/22793, których ujawnienia włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacze. Proteiny nawizryją glikozylzwyne jak również nizglikozylowaae formy antagonistów receptora IL-1.
Szczególnie, trzy korzystne formy lL-1ra (IL-1 raa, lL-1raP i lL-1 rax), z których każdą wyprowadzono z tej samzj sekwencji kodującej DNA ujawniono i opisano w opisie patentowym USA 5,075,222 przez Hannum i in., pt. „Inhibitory Interlzukiny-T”. Opis patentowy USA określany tu jako patent '222, jest w szczególności włączony do obecnego zgłoszenia jako odsyłacz. Wszystkie trzy z inhibitorów iaterleukiny-1 mają podobną aktywność funkcyjną i immunologiczną. Sposoby wytwarzania inhibitorów IL-1, w szczególności lL-1ras, także ujawniono w patencie '222. Jeden ujawniony sposób wiąże się z wyodrębnieniem inhibitorów ludzkich moaozytów (gdzie są onz naturalnie wytwarzane). Drugi ujawniony sposób wiąże się z wyodrębnieniem gznu odpowiedzialnego za kodowanie lL-1ra, klonowaniem genu w odpowiednich wektorach i typach komórek, ekspresji genu dla wytworzenia lL-1ra oraz zbierania lL-1ra. Ostatni sposób, który jest przykładem metod rzkombiaacyjnych DNA w ogólności, jest korzystnym sposobem według wynalazku. W szczególnym wykonaniu, lL-1ra zawiera N-końcową grupę metiznyjową w konsekwencji zksprzsji w E coli. Obecny wynalazek takżz obejmuje zmodyfikowane lL-1ra. Zmodyfikowane lL-1ra zawierają, przykładowo muteiny takich inhibitorów, w których reszta cysteinowa jzst podstawiona za aminokwas przy jzdnym Iub więcej miejscach w sekwencji aminzkwaszwej naturalnie występującego inhibitora. Takie m^ziny mogą następnie być poddane reakcji selektywnie co do miejsca z jednostkami fnnkzjzaalizzwanego glikolu pzlietylenzwzgz (PEG) lub innymi polizterami zawierającymi grupy tiolowe tworząc lL-1ra PEG. Publikacja PCT nr WO 92/16221 ujawnia pewną liczbę zmodyfikowanych IL-1ra i sposoby wykonania takich inhibitorów zmodyfikowanych PEG.
Dodatkowa klasa inhibitorów interlenkiny-1 zawizra związki zdolne szczególnie do zapobiegania aktywacji receptorów komórkowych względem IL-1. Związki takiz zawierają proteiny wiążące lL-1, takiz jak rozpuszczalne receptory i przeciwciała mzazklonalnz. Związki takie zawierają także przeciwciała monzklonalae względem receptorów.
Dalsza klasa inhibitorów iaterleukiay-1 zawiera związki i proteiny blokującz syntezę in vivo i/lub pozykomórkowe uwalnianie lL-1. Związki takiz zawierają środki wpływające na transkrypcję genów lL-1 lub przetwarzanie preprotein IL-1.
Powyższe podano tytułem przykładu i niz wyklucza innych terapii, które mogą być użyte współbieżnie z tymi związkami przeciwzapalnymi, które są znane biegłym w sztuce lub do których mogliby dojść biegli w sztuce stosując wytyczne wyłożone w obecnym opisie.
Korzystne jest zwłaszcza tworzenie kompozycji dodatkowych związków przeciwzapalnych w jednostkowych formach dawkowania dla łatwego podawania i jednolitości dawkowania. „Jednostkowa fzrmy dawkowania” w obecnym zgłoszeniu dotyczy fizycznie nieciągłych jednostek odpowiednich jako jednostkowe dawkowania dla osobników-ssaków poddawanych leczeniu, z których każda jednostka zawiera uprzednio wyznaczoną ilość dodatkowych związ46
189 309 ków przeciwzapalnych obliczoną tak, by wytworzyć żądany efekt terapeutyczny w połączeniu z wymaganym nośnikiem farmaceutycznym. W obecnym zgłoszeniu, „farmaceutycznie dopuszczalny nośnik” obejmuje jakikolwiek i wszystkie rozpuszczalniki, pożywki dyspersyjne, powłoki, środki przpcimbakteryjdo i przecimarzybiczp, środki izotądiczde i opóźniające absorpcję itp., które są kompatybilne ze składnikiem aktywnym i zo sposobem podawania i innymi składnikami preparatu i nie są szkodliwe dla biorcy. Zastosowanie takich pożywek i środków jest dobrze znane wodług stanu techniki (patrz przykładowo Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. wyd. (1990), Mack Publishing Co., Easton, PA 18042, s. 1435-1712, który to ujawnienie jest włączony do obecnego zgłoszenia jako odsyłacz). Do kompozycji mogą także być włączone dodatkowe składniki aktywne.
Dla doustnego podawania terapeutycznego, dodatkowy związek przecimzapeldy możo być włączony z zarobkami i stosąmany w formie tabletek trawionych, tabletek do jamy ustnej, pastylek do ssania, kapsułek, nalewek, zawiesin, syropów, opłatków itp., Iub może być włączona bezpośrednio do pożywienia. Tabletki, pastylki do ssania, pigułki, kapsułki itp. także mogą zawierać następujące: lepiszcze, takio jak guma tragakadt, akacja, skrobia kukurydziana Iub żelatyna; zarobki takio jak fosforan aimapdiomy; substancja rozpadowa, taka jak skrobia kukurydziana, kwas alginowy itp.; substancja smarująca, taka jak stearynian magnezu; środek słodzący, taki jak sacharoza, laktoza Iub sacharyna; Iub substancja smakowa, taka jak mięta pieprzowa, olej winterarCdąwy Iub wiśniowy Iub smak pomarańczy. Gdy jednostkową formą dawkowania jest kapsułka, możo ona zawierać, oprócz materiału powyższego typu, nośnik ciekły. Rozmaito inne materiały mogą być obecno jako powłoka Iub by w inny sposób zmodyfikować postać fizyczną jednostki dawkowania. Na przykład tabletki, pigułki Iub kapsułki mogą być powlekane szelakiem, cukrem Iub obydwoma z nich. Oczywiście, jakikolwiek materiał użyty przy wytwarzaniu jakiejkolwiek jednostkowej formy aamkomania pomidipd być farmaceutycznie czysty i zasadniczo nietoksyczny w użytych ilościach. Ponadto, może być włączony dodatkowy związek przeciwzapalny do preparatu o pąmąlnym uwalnianiu. Ilość dodatkowego związku przeciwzapalnogo w takiej terapeutycznie przydatnej kemaezycji jest taka, by uzyskać odpowiednie damkomanie.
W przypadku aozajelitemogą podawania terapeutycznego, każdy dodatkowy związek przeciwzapalny może być włączony do sterylnego roztworu iniekcyjnego. Sterylny roztwór idiρkcyjdy może być wytworzony przez włączenie dodatkowego związku przeciwzapalnpae w żądanej ilości w eapąmieanim farmaceutycznie dopuszczalnym nośniku, przy rozmaitych innych wyliczonych poniżej składnikach (żądanych), a następnie przez sterylizację z sączeniom. W przypadku dyspersji, każda z nich może być wytworzona przez włączenie dodatkowego związku prrecimzapalnpgą do sterylnej zarobki, która zawiera zasadniczą pożywkę dyspersyjną i żądane inne składniki spośród wyliczonych powyżej. W przypadku sterylnych roztworów idiekcyjdych, każdy z nich może być wytworzony przoz włączenio proszku - dodatkomeaą związku przeciwzapalnego i, ewentualnie, jePieaoPolwioP dodatkowego żądanego składnika z jogo uprzednio przesączonogo storylnio roztworu, przy czym proszek jest wytworzony jakąkolwiek odpąmieanią techniką (przykładowo suszenie próżniowo i suszenie z wymrazanipm).
Konkretną dawkę aądatkomego związku przeciwzapalnego oblicza się zgodnie z przybliżoną wagą ciała Iub powierzchnią ciała pacjenta. Inno czynniki występujące przy określaniu eaaomipadieae damkomania mogą obejmować: chorobę Iub stan poddawany leczeniu Iub któremu chce się zapobiec, ostrość choroby, drogę podawania i wiek, płeć i stan zdrowotny pacjenta. Dalsze uściślenio obliczeń potrzebnych do wyznaczenia odpowiedniego dawkowadia przy leczeniu jest rutynowO wykonywane przez biegłych w sztuce, zwłaszcza w świetle informacji o dawkomaniu w ujawnionych tu próbach. Dawkowanie może także być wyznaczone przez użycie znanych prób dla wyznaczenia damkąmadia stosowanych w połączeniu z oapąwipanimi danymi damka-roakcje.
Zatem, w zakresie wynalazku mieści się przykładowo, że dawki dodatkowych związków przeciwzapalnych wybranych dla leczenia szczególnych ostrych Iub przewlpkfych chorób zapalnych, takich jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lymp, młodzieńczo (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowo zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i wymołymadp przez arądPomce („septyczne”) zapalenie
189 309 stawów) można zmieniać, by osiągnąć żądany efekt terapeutyczny. Gdy jeden z dodatkowych związków przeciwzapalnych daje efekty uboczne, może być podawany pacjentów podczas przemiennych okresów leczenia w terapii kombinacyjnej. Na przykład przewlekłe leczenie metaSreksatem jest kojarzono z toksycznością zołądkowo-jelitową, wątrobową, szpiku kostnego i płucną (Sapdoval i in. (1995), British Journal of Rheumatology, 34: 49-56, którego ujawnienie włączono do obecnego zgłoszenia jako odsyłacz).
Testy do monitorowania poprawy stanu chorobowego mogą zawierać specyficzne tosty ukierunkowane, przykładowo pa oznaczenie reakcji układowej pa zapalenie, które obejmuje szybkość sedymentacji erytrocytów (ESR) i reaktopty fazy ostrej (APR). Wykonuje się obserwacje obrzęku itp. części ciała dotkniętych chorobą. Obserwuje się także poprawę zesztywnienia i chwytu (tam, gdzie ma to zastosowanie) oraz zmniejszenie bólu u pacjenta. Jeśli stop pacjenta jest stabilny, jest on powtórnie poddawany kuracji przy tym samym dawkowaniu tygodniowo i oceniany tygodniowo. Leczenie może być kontynuowane pod warunkiem, że sta) pacjenta jest stabilny. Po sześciu miesiącach leczenia, wyznacza się zmiany anatomiczne kośćca za pomocą obrazowania radiologicznego przykładowo przez radiografię X.
Przy końcu każdego okresu, pacjenta ponownie poddaje się ocenie. Porównanie wstępnego leczenia i leczenia następczego za pomocą oceny radiologicznej, ESR i APR wskazuje skuteczność leczenia. Zgodnie ze skutecznością leczenia i stanem pacjenta, dawkowanie można zwiększyć Iub utrzymywać na stałym poziomie przez okres trwania leczenia.
Korzystnie, obecny wynalazek jest ukierunkowany na sposób z, ewentualnie, jedną z następujących kombinacji dla leczenia Iub zapobiegania ostrej Iub przewlekłej zapalnej chorobie i stanu, jak określono powyżej, takiej jak choroby reumatyczne (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i wywoływane przez gronkowce (^optyczne”) zapalenie stawów): produkt obciętego sTNFR (przykładowo proteina R:-[Cys19-Cys103]-R2) i metod-oksat; produkt obciętego sTNbR (przykładowo, proteina R:-[Cytl9-Cytlθ3]-R2), metaSrektat i inhibitor IL-1, korzystnie IL-1ra; produkt obciętego sTNFR (przykładowo proteina R:-[Cyt:9-Cytlθ3i-R2) i jakikolwiek jeden Iub więcej wybrany spośród następujących: metod-oksat, immunotuyretapt (przykładowo cyklasporypą), ciproflaktasyna, antygen Fas i inhibitor IL-1, korzystnie IL-1ra; produkt obciętego tTNbR (przykładowo proteina R^Cys^-Cys^^) i metatroktat i immunotupretant (przykładowo cyklotyarypą); produkt obciętego sTNFR (przykładowo proteina R:-[Cys -Cytl03i-R2) i metaSrektat i ciproflaksacyna; oraz produkt obciętego sTNFR (przykładowo proteina R:-[Cysl9-Cytlθ3]-R2) i metatrektat i inhibitor IL-1, korzystnie IL-1ra; produkt obciętego sTNFR (przyk-ładawa proteina R1-[Cys19-CysW3]-R2) i jakikolwiek jeden Iub więcej spośród następujących: meSotreksat, sulfatazypa i hydroksychloroship; produkt obciętego sTNFR (przykładowo proteina Rl-[Cysl9-Cytlθ3i-R2). metatrektat i hydroktyshlorochin; i produkt obciętego sTNFR (przykładowo proteina Rl-[Cysl9-Cytlθ3]-R2), mototreksat i sulfasazyna.
W specyficznym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie (przykładowo dasSawawe, podskórne Iub domięśniowe) produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R:-[Cytl9-Cysl03]-R2), ewentualnie w postaci preparatu o powolnym uwalnianiu (przykładowo hialuropian)), ewentualnie w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze Iub leczenie współbieżne) z metatreksatem i/lub inhibitorem IL-1 (przykładowo IL-1ra) i/lub rozpuszczalpym rekombinasyjnym ludzkim antygenem Fas dlo leczenia chorób reumatycznych, jak określono powyżej (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i wywoływane przez gronkowce („septyczpe”), i związanych z tym objawów.
W szczególnym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie (przykładowo dożylne Iub dakomorowe) produktu obciętego sT^R (przykładowo proteina Rl-[Cys!9-Cytl03i-R2. ewentualnie w postaci preparatu o powolnym uwalnianiu (przykładowo hialuroniap)) ewentualnie w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze Iub leczenie współbieżne) z aktywatorem plozminogepu tkanki i/lub inhibitorem IL-1 (przykładowo IL-1ra), by leczyć uraz mózgu w wyniku traumy, padaczki, krwotoku Iub udaru, z których każde może prowadzić do neurodegeneracji.
I89 309
W szczególnym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie (przykładowo podskórne lub domięśniowe) produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina - Rr[Cys'9-Cysi°3]-R2, ewentualnie w postaci preparatu o powolnym uwalnianiu (przykładowo hialuronian)), ewentualnie w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z jednym lub więcej kortykosteroidem, cyklosporyną, FK-506, lub interferonem (przykładowo alfa-interferon, beta-interferon, gamma-interferon lub interferon konsensusowy) i/lub TL-lra, by leczyć stwardnienie rozsiane.
W szczególnym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie (przykładowo podskórne lub domięśniowe) produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R^Cys^-CysD3]-R2, ewentualnie w postaci preparatu o powolnym uwalnianiu (przykładowo hialuronian)), ewentualnie w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z G-CSF i/lub IL-1ra, by leczyć chorobę zapalnąjelit.
W szczególnym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie (przykładowo podskórne lub domięśniowe) produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cys19-Cysi°3]-R2, ewentualnie w postaci preparatu o powolnym uwalnianiu (przykładowo hialuronian)) ewentualnie w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z leptyną, Marinol™ lub Megace™ by leczyć kacheksję/anoreksję.
W szczególnym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie (przykładowo podskórne, dokomorowe Iub dooponowe) produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi°3]-R2), ewentualnie w postaci preparatu o powolnym uwalnianiu (przykładowo hialuronian)), ewentualnie w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze Iub leczenie współbieżne) z NSAID (przykładowo indometacyna) i/lub inhibitorem IL-1 (przykładowo IL-1ra), by leczyć chorobę Alzheimera.
W szczególnym korzystnym wykonaniu, sposób obejmuje podawanie (przykładowo podskórne, dokomorowe Iub dooponowe) produktu obciętego sTNFR (przykładowo proteina R1-[Cysi9-Cysi03]-R2, ewentualnie w postaci preparatu o powolnym uwalnianiu (przykładowo hialuronian)), ewentualnie w połączeniu (leczenie wstępne, leczenie następcze lub leczenie współbieżne) z rozpuszczalnym rekombinacyjnym ludzkim antygenem Fas, by leczyć raka (przykładowo leukemie), cukrzycę (przykładowo młodzieńczy początek cukrzycy typu i); reakcję przeszczepu przeciw gospodarzowi; zapalenie wątroby; uraz związany z niedokrwieniem/reperfuzją, obejmując niedokrwienie mózgu (uraz mózgu w wyniku traumy, padaczki, krwotoku lub udaru, z których każde może prowadzić do neurodegeneracji); choroby neurozapalne; choroby reumatyczne, jak określono powyżej (przykładowo choroba Lyme, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, łuszczycowe zapalenie stawów, reumatoidalne zapalenie stawów i wywoływane przez gronkowce („septyczne”) i transplantację tkanki.
Inne aspekty i zalety obecnego wynalazku będą zrozumiałe po rozważeniu następujących przykładów ilustrujących.
Standardowe metody wielu procedur opisanych w poniższych przykładach lub nadające się procedury alternatywne są podane w szeroko uznanych podręcznikach biologii molekularnej, takich, jak na przykład: Sambroock i wsp. (1989), jak wyżej oraz Ausubel i wsp. (1990), jak wyżej. Dla wygody czytelników podajemy, ze „mL” oznacza mililitry, a „L” oznacza litr.
Przykład I
Poniższe przykłady uczą wytwarzania różnych form obciętego, rozpuszczalnego rekombinacyjnego TNFR-I:
NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi03]-FC-COOH(sTNFR-I 2.6D/C105);
NH2-MDSVCPQGKYTHPQNNSIC-[Cys19-Cys103l-FNCSL-COOH(sTNFR-I2.6D/C106);
NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH(sTNFR-12.6D/N105);
NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys-Cysi03]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d8);
NH2-M-[Cys19'-Cysi03]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3D/d18); i
NH2-MSIS-[Cysr9-Cysi°3]-FNCSL-COOH (sTNFR-I 2.3D/d15).
A. Wytwarzanie DNA:
1. sTNFR-I 2.6D/C106
Amplifikację PCR sTNFR-I 2.6D/C106 prowadzi się stosując jako wzorzec pochodną sklonowanego cDNA z klonu Iambda-gt107ctnfbp (EP 422339) i następujące primery PCR:
189 309
5' OLIGO#1: (SEQ ID NO:68)
5' -GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3'- OLIGO#2 (SEQ ID NO:69)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
Związki OLIGO11 i OLIGO#2 kodują Ndel i HindllI i przyklejają odpowiednio do końca 5' i 3' obciętego genu. Amplifikację PCR prowadzi się w 25 cyklach; każdy cykl składa się z 30 sekund w temperaturze 94°C w celu denaturacji, 15 sekund w 55°C w celu przyklejenia i 1 minutę w 72°C w celu wydłużenia [termocykler Model 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT]. Produkt PCR oczyszcza się przy użyciu zestawu „QIAquick™ PCR Purification Kit” (QIAGEN, Chatsworth, CA) według instrukcji producenta. Oczyszczony produkt PCR jest cięty Ndel i Hindm po czym oczyszczany na żelu przy użyciu zestawu „QIAquick™ Gel Extraction Kit” (QIAGEN, Chatsworth, CA) według instrukcji producenta. Oddzielony na żelu produkt PCR jest ligowany do pAMGll (WO 95/26746) i transformowany do komórek FM15 E. coli (ATCC 55765).
2. sTNFR-I 2.6D/C105
Amplifikację PCR sTNFR-I 2.6D/C105 prowadzi się stosując sTNFR-I 2.6D/C106 plazmid DNA juko wzorzec i następujące primery PCR:
OLIGO#3: (SEQ ID NO:70)
5'-ACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGTCCA-3'
OLIGO#4: (SEQ ID NO:71)
5'-CAGGTCGGATCCTATCAGCAGAAGCACTGGAAAAGGTTTTC-3'
Związki OLIGO#3 i OLIGO#4 kodują BamHI i mutację N(105)C, po której następuje stopkodon. Są one (OLIGO#3 i OLIGO#4) zaprojektowane aby rozciągać się całkowicie wokół wzorca w celu wprowadzenia nowego miejsca BamHI dla ligucji. Amplifikację PCR prowadzi się w 35 cyklach; 10 cykli, z których każdy obejmuje 10 sekund w temperaturze 92°C w celu denaturacji, 30 sekund w temperaturze 55° w celu przyklejenia, i 4 minuty w temperaturze 68°C w celu wydłużenia, po czym następuje 25 cykli, z których każdy składu się z 10 sekund w92°C w celu denaturacji, 30 sekund w55°C w celu przyklejenia, i 4 minut + 20 sekund w 68°C w celu wydłużenia [termocykler Model 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT]. Produkt PCR oczyszcza się na żelu przy użyciu zestawu „QIAquick™ Gel Extraction Kit” (QIAGEN, Chatsworth, CA) według instrukcji producenta, tnie BamHI, ekstrahuje mieszaniną fenol/chloroform i wytrąca etanolem. Następnie po ponownym przeprowadzeniu w zawiesinę liguje się do pAMGl 1 i transformuje do komórek Fm 15 E. coli.
3. sTNFR-I 2.6D/N105
Amplifikację PCR sTNFR-I 2.6D/N105 prowadzi się stosując sTNFR-I 2.6D/C106 plazmid DNA jako wzorzec i następujące primery PCR'
5' OLIGO#5: (SEQ ID NO:72)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3' OLIGO#6: (SEQ ID NO:73) '-CGCGGATCCCTATTA.TTGAAGCACTGGAAAAGG-3'
Związki OLIGO#5 i OLIGO#6 odpowiednio kodują Ndel i BamHI i przyklejają do końców 5' i 3' obciętego genu. Amplifikację PCR prowadzi się w 35 cyklach; każdy z cykli składa się z 45 sekund w temperaturze 95°C w celu denaturacji, jednej minuty w 65°C w celu przyklejenia i 2 minut w 72°C w celu wydłużenia [termocykler Model 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT].
Produkt PCR oczyszcza się stosując „Wizard™ DNA Clean-Up System (Promega, Madison, WI) według instrukcji producenta. Oczyszczony produkt PCR tnie się Ndel i BamHI, ekstrahuje mieszaniną fenol/chloroform i wytrąca etanolem. Następnie po ponownym przeprowadzeniu w zawiesinę liguje się do pA-MGl 1 i transformuje do komórek FM15 E. coli.
W oparciu o opis obecnego wynalazku specjaliści o zwykłej biegłości w sztuce należycie ocenią, ze różnorodne materiały i sposoby można łatwo zastosować Iub zaadoptować w celu odpowiedniej ekspresji w komórce gospodarzu (na przykład E coli i innych bakterii).
4. sTNFR 2.3D/d18; sTNFR-I 2.3D/d8 i sTNFR-I 2.3D/d15
189 309
Każdą z amplifikacji PCR sTNFR 2.3D/d18; sTNFR-I 2.3D/d8 i sTNFR-I 2.3D/d15 prowadzi się przy użyciu plazmidu DNA 2.6D/C106 jako wzorca i następujących primerów:
sTNFR-I 2.3D/d8 primery PCR:
5' OLIGO#7: (SEQ ID NO:74)
5'-CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATAAT-3'
3' OLIGO#9: (SEQ ID NO.75)
5' -CCCAAGCTTTTACAG AGAGCAATTGAAGCACTG-3' sTNFR-I 2.3D/d15 primery PCR :
5' OLIGO#9: (SEQ ID NO:76)
5'-CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-3'
3' OLIGO# 10: (SEQ ID NO:77)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3' sTNFR-I 2.3D/d18 primery PCR
3' OLIGO# 11: (SEQ ID NO:78)
5'-CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-3'
3' OLIGO# 12: (SEQ ID NO:79)
5'-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3'
Każdy z OLIGO#7, OLIGO#9 i OLIGO# 11 koduje Ndel a każdy zOLIGO#8, OLIGO#10 i OLIGO#12 koduje HindlII. Amplifikację PCR prowadzi się w 25 cyklach: każdy z cykli składa się z 45 sekund w 95°C w celu denaturacj) jednej minuty w 65° w celu przyklejenia i 2 minut w 72°C w celu wydłużenia [tśrmkcykler Model 2400 (Peekią-Elmśr Cetus, Ndrwalk, CT], Produkty PCR oczyszcza się stosując „Wizard™ DNA Clean-Up System (Promega, Madison, WI) według instrukcji producenta. Oczyszczone produkty PCR tnie się Ndel i Hindlll, ekstrahuje mieszaniną fśnkl/chlorofkem i wytrąca etanolem. Następnie po ponownym przeprowadzeniu w zawiesinę liguje się do pAMG11 i transformuje do komórek FM 15 E coli.
A. Wytwarzanie w E. coli:
Na wstępie, zapoczątkowano jedną małą świeżą hodowlę szczep żądanego uśkomCinαątowśgo klonu E. coli, zawierającego żądany konsteukt dla sTNFR-I 2.6D/N105, sTNFR-I 2.6D/C105, sTNFR-I 2.6D/C106, sTNFR 2.3D/d18, sTNFR-I 2.3D/d8 i sTNFR-I 2.3D/d15 przez przeniesienie całej zawartości ampułki (około 1,5 ml) zamrożonych w glicerolu zapasowych zarodków do 2 litrowej kolCy zawierającej 500 ml brzeczki Luna. Hodowlę iąkuCujś się w wirowym wy^ząsaczu w 37°C przy 350 obr/mią. Gęstość hodowli określa się przez pomiar abskeCancji przy 660 nm (OD660)· Hodowlę zarodków namnaża się do gęstości >2,0 (OD660) i w tym momencie 125 ml przenosi się aseptycznie do 15 litrowego produkcyjnego naczynia fermentacyjnego zawierającego 10 litrów sterylnej pożywki wzrostowej.
Rodzaj pożywki i warunki fermentacji w produkcyjnym naczyniu fermentacyjnym są kompleksowymi warunkami fermentacji w pożywce jakiś opisał Sniff (1993) w pracy doktorskiej „A Chemically-Defmśd Medium for the Overproduction of a Reckmbiąaąat Protein in E coli” (Chemiyząie zdefiniowana pożywka do nadprodukcji ęekoInbinan1k)wego Ciałka w E coli), Colorado State University. Generalnie, w przywołanym odnośniku literaturowym ujawniono stosowanie kompleksowej pożywki zawierającej hydrolizat kazeiny, sole, glicerynę i środek pęzeyiwpieąiący, które sterylizuje się w naczyniu fermentacyjnym. Po ochłodzeniu pojemnika do poniżej 40°C dodaje się sterylizowane przez filtrację minerały śladowe i chlorowodorek tiamiąy.
Kiedy temperatura pożywki jest ustalona na 37°C pożywkę zaszczepia się hodowlą zarodków. Wzrost hodowli monitoruje się przez mierzenie OD660- Hodowlę utrzymuje się w pH=6,0 przez automatyczne dodawanie 5 M wodorotlenku sodu i 5 M kwasu solnego. Kiedy OD660 zawiera się między 9,5 a 10,5 hodowlę indukuje się przez aseptyczne dodanie sterylnego izopropylu (IPTG) do końcowego stężenia 0,50 mM. Hodowlę zbiera się po ustaniu wzrostu.
Pożywka i warunki wzrostu są takie jak opisał Sniff (1993) - patrz wyżej, z następującymi wyjątkami: do pożywki dodaje się siarczan amonu (2,0 g/l) i jednowkdoiaą chlorowodorku L-cystśiny (1,0 g/l); pomija się chlorowodorek tetracykliny; pH utrzymuje się i89 309
5i raczej na poziomie 6,0 za pomocą wodorotlenku sodu i kwasu solnego niż na poziomie 7,0 tylko za pomocą wyłącznie wodorotlenku sodu; temperaturę wzrostu podwyższa się do 37°C; stężenie induktora podwyższa się z 0,15 mM na 0,50 mM IPTG; kryterium zbioru oparte jest raczej na ustaniu wzrostu niż upływie czasu po indukcji.
Po zakończeniu fermentacji komórki zbiera się przez odwirowanie w 500 ml butelkach. Komórki pastylkuje się przez odwirowanie przy 10.000 obr/min. przez 30 minut. Odzyskaną pastę z komórek rozcieńcza się do 15% zawartości części stałych w przerywającym buforze składającym się z 50 mM Tris i 5 mM EDTA o pH=8,0. Następnie zawiesinę komórek poddaje się lizie przez trzykrotne przepuszczenie roztworu przez homogenizer (APV Gaulin, Inc., Everett, MA) pracujący pod ciśnieniem 5,52 x 107 Pa (8000 psi). Uzyskaną homogeniczną substancję następnie odwirowuje się przy 10.000 obr/min. przez 30 minut aby oddzielić ciała inkluzyjne (IBs). Ciała IBs przemywa się przez ponowne zawieszenie w buforze przerywającym i odwirowanie roztworu po raz trzeci przy 10.000 obr/min przez 30 minut. Ciała IBs ponownie zawiesza się w zdejonizowanej wodzie (w stosunku 1:1) i odwirowuje się po raz ostatni przy 10.000 obr/min przez 30 minut celem drugiego przemycia. Oddzielone, przemyte ciała inkluzyjne dla każdej proteiny są gotowe do rozpuszczania, ponownego złożenia i oczyszczania. Z każdego rzutu otrzymuje się około 200-250 gramów ciał IBs.
W alternatywnym wykonaniu obcięty sTNFR-I można poddać fermentacji jak następuje:
Na wstępie, zapoczątkowuje się jedną małą świeżą hodowlę szczepu żądanego rekombinantowego klonu E. coli, przechowującego żądany konstrukt dla sTNFR-I 2.6D/N105 lub sTNFR-I 2.6D/C106, przez przeniesienie całej zawartości ampułki (około 1,5 ml) zamrożonych w glicerolu zapasowych zarodków do 2 litrowej kolby zawierającej 500 ml ekstraktu drożdży BBL o stężeniu 10 g/l, opH=7,0. Hodowlę inkubuje się w wirowym wytrząsaczu w 37°C przy 300 obr/min. Gęstość hodowli określa się przez pomiar absorbancji przy 600 nm (OD600). Hodowlę zarodków namnaża się do gęstości >2,0 OD600 i w tym momencie przenosi się aseptycznie (80 ml) do 15 litrowego produkcyjnego naczynia fermentacyjnego zawierającego 7 litrów sterylnej pożywki wzrostowej.
Fermentację produkcyjną prowadzi się metodą rzutową z zasilaniem reagentami. Pożywką jest kompleksowa pożywka zawierająca ekstrakt drożdży, sole i środek przeciwpieniący, które sterylizuje się w naczyniu do fermentacji. Po ochłodzeniu pojemnika do poniżej 40°C dodaje się sterylizowane przez filtrację minerały śladowe, glukozę, siarczan magnezu i heksametafosforan. Stosuje się zasilanie dwoma pożywkami, z których pierwsza - Feed 1, jest zasilaniem węglem (glukoza/siarczan magnezu), a druga - Feed 2 - zasilaniem azotem i jest oparta na ekstrakcie drożdży.
Kiedy temperatura pożywki ustali się na 33°C, pożywkę inokuluje się hodowlą zarodków. Wzrost hodowli monitoruje się przez pomiar OD600· Hodowlę utrzymuje się przy pH=7,0 przez automatyczne dodawanie amoniaku i 48,78% roztworu kwasu cytrynowego. Kiedy OD600 zawiera się między 8,0 a 12,0, uruchamia się zasilanie Feed 1, stosując wykładniczą szybkość zasilania. Kiedy OD600 zawiera się między 30,0 a 40,0, uruchamia się zasilanie Feed 2, stosując stałą szybkość zasilania. Kiedy OD600 osiąga 67-83 hodowlę indukuje się przez aseptyczne dodanie sterylnego autoinduktora (lakton homoseryny) do końcowego stężenia 0,6 mg/l. Szybkość zasilania Feed 1 oraz Feed 2 zmienia się na stalą szybkość zasilania po zapoczątkowaniu indukcji. Hodowlę zbiera się po 16 ± 2 godzinach.
Po zakończeniu fermentacji komórki zbiera się przez odwirowanie w 500 ml butelkach. Komórki pastylkuje się przez odwirowanie przy 10.000 obr/min. przez 30 minut. Odzyskaną pastę z komórek rozcieńcza się do 15% zawartości części stałych w przerywającym buforze składającym się z 50 mM Tris i 5 mM EDTA o pH=8,0. Następnie zawiesinę komórek poddaje się lizie przez trzykrotne przepuszczenie roztworu przez homogenizer (APV Gaulin, Inc., Everett, mA) pracujący pod ciśnieniem 5,52 x 107 Pa (8000 psi). Uzyskaną homogeniczną substancję następnie odwirowuje się przy 10.000 obr/min. przez 30 minut aby oddzielić ciała inkluzyjne (IBs). Ciała IBs przemywa się przez ponowne zawieszenie w buforze przerywającym i odwirowanie roztworu po raz trzeci przy 10.000 obr/min przez 30 minut. Ciała IBs ponownie zawiesza się w zdejonizowanej wodzie (w stosunku 1:1) i odwirowuje się po raz ostatni przy 10.000 obr/min przez 30 minut celem drugiego przemycia. Oddzielone, przemyte
189 309 ciała idkluzyjne dla każdej proteiny są gotowe do sąlubilizacji, aądąmdogą złożenia i oczyszczania.
3. Selubilizacja/Pądąwne złożenio:
Przemyte ciała idkluzyjnp (IBs) z każdej całkąmitej 10 litrowoj fermentacji rozpuszcza się w 800 ml buforu solubilizującego (50 mM Tris, 8M mocznik, 160 mM cysteina, o pH=9,5). Odczyn mieszaniny sąlubilizacyjdoj ustala się na pąziąmio pH=9,5 za pomocą 10N NaOH i poddaje mieszaniu w temperaturze pokojowej przoz 2-3 godziny. Każdy rzut dajp około 200-250 gramów ciał IBs.
Każdą mieszaninę sąlubilizecyjdą rozcieńcza się 1:20 zimnym buforom renaturacyjnym (50 mM Tris, 1,1 M mocznik). Końcowa objętość każdej mioczadiny wydosi około 16 litrów. Następnie każdą mieszaninę doprowadza się do pH=9,7 za pomocą 6N HCl i powoli miesza w 4°C przez 2-3 dni.
Odczyn każdej mieszadidy doprowadza się następnie do pH=5,0 za pomocą kwasu octowego lodowatego i 6N HCl. Z każdej mioszadidy wytrąca się osad, który usuwa się przez odmirąmanio przy 10.000 g w wirówce typu Beckman Model J2-HS. Każdy materiał sączy się następnie przez filtr 5 pm i 0,22 pm.
D. Oczyszczanie:
Pąnomdie złożone materiały są gotowe do oczyszczania kolumnowego na kolumnie IX-1 SP-Sepharose Big Boad™ (Pharmacia Biotech, Inc., Piscatemay, NJ).
Kolumna typu IX-1 SP-Sepharąso Big Boad™ (4,4 cm x 20 cm)
Bufor A Bufor B mM octan 25 mM ocaan mM NaCl 375 mM NaCl pH=5,0
Kolumnę doprowadza się do stanu równowagi za pomocą 4-5 objętości kolumnowych buforu A przez rozdziałem ładunków każdego ponownie złożonego materiału. Materiały ponownie złożone są osobno wprowadzano na kolumnę w celu oczyszczania. Za każdym razom na kolumnę wprowadza się nio więcej niz 12 gramów proteiny na litr żywicy. Po każdej wprowadzonej na kolumnę porcji kolumnę przemywa się 3-4 objętoś^ami kolumnowymi buforu A (aż do powrotu U.V. do martąści tła). Przy każdym załadowaniu kolumny proteinę wymywa się z kolumny stosując 8 objętości kolumnowych buforu o wzrastającym liniowo gradiencie stężonia soli między 50-375 NaCl. Cały pik białkowy zbiera się jako jedną porcję. Zbieranie każdego piku białkowego rozpoczyna się gdy absąrbancja U.V. wzrasta do około 20% maksimum piku. Zbieranie przerywa się w momencie gdy ebsąrbadcja U.V. osiąga około 50% maksimum piku Iub gdy abcąrbadcja przestaje zmniojszać się cokolwiek nastąpi wcześniej.
Szybkość przepływu - 7.5 cm3/aoaz. W czasio doprowadzania do równowagi i przemywania
- 15 cm3/godz dla rałaaąmadie
- 6 cn^/gomz go wymywamiu
Każde kolumnowe oczyszczanie prowadzi się w 4°C.
Każdy roztwór zebrany z kolumny IX-1 jest gotowy do oczyszczania na kolumnie typu Toyo Pearl™ Butyl 650M HIC (Toso Haas, Philadelphia, PA).
Kolumna 300 ml - Toyo Pearl Butyl™ 650M (4,4 cm x 20 cm)
Bufor A bufor rozcieńczający bufor B mM NaPO4 40 mM N NaPO4 Milli Q H2O
1,8 M NaCl, pH=6,0 4 M NaCl , pH=6,0
Kolumnę doprowadza się do stanu równowagi za pomocą 4-5 objętości kolumnowych buforu A przoz rozdziałem ładunków każdego zebranego z kolumny IX-1 materiału. Każdą zebraną z kolumny IX-1 poroję rozoieńoza się 1:1 buforom rozcieńczającym i odczyn doprowadza się do pH=6,0. W każdym przypadku rozcieńczony materiał wprowadza się na
199 009 kolumnę. Za każdym razem na kolumnę wprowadza się niz więczj niż 10 gramów proteiny na litr żywicy. Po każdej wprowadzonej na kolumnę porcji kolumnę przemywa się 3 objętościami kolumnowymi buforu. Przy każdym załadowaniu kolumny proteinę wymywa się z kolumny stosując 8 objętości kolumnowych buforu o zmniejszającym się liniowo gradiencie stężenia soli od 1,8 M NaCl do czystej wody. Zbieranie każdego piku białkowego rozpoczyna się gdy abszrbancja U.V. wzrasta do około 15-20% maksimum piku. Zbieranie przerywa się w momencie gdy abaorbaazja U.V. osiąga około 50%o maksimum piku Iub gdy absorbαnzta przestajz zmniejszać się, cokolwiek nastąpi wcześniej.
Szybkość przepływu - 6 cm3/godz. w czasie doprowadzania do równowagi, załadowania i wymywania
- 3 cm/godz. dla wymywania
Każdz kolnmaowe oczyszczanie prowadzi się w tzmpzraturzz pokojowej. Każdy roztwór zebrany z kolumny HIC jzst gotowy do zytęzαniy/diafiltracji.
Zαtężaaie/Diαfiltracja (C/D)
0,093 m2 (jedną stopę kwadratową) PLCC™ membrany zdcinąjązej z regenerowanej celulozy o ciężarze cząsteczkowym 5.000 (MilliPzre, Bedford, MA) stosuje się do etapu C/D dla każdego roztworu zebranego z kolumny HlC. Każdy roztwór zebrany z kolumny HlC zatęża się do około 200 ml, po czym diafiltruje względem 6-7 objętości kolumnowych 20 mM NaPCU o pH=6,0 aż do momentu gdy przewodność jest < 4 mm/godniaę.
Każdy ztap zatężania/dlafiltrycjl prowadzi się w temperaturze pokojowej.
Każdy porcja materiału z etapu C/D jzst następnie gotowa do oczyszczania na kolumnie typu 1Χ-2-365 mL SP-Sepharose HP™ (Phyrmyclα Biotzch, Inc., Piszataway, NJ).
1Χ-2 - kolumna 365 ml SP-Sepharose HP™ (5 cm x 18,5 cm)
Bufor do doprowadzania do równowagi Bufor A mM Na NaPO4 20 mM NsPO4 pH=6,0 pH-6,3 50 mM NaCl
Bufor B 20 mM NaPO4 pH-6,8
Kolumnę doprowadza się do stanu równowagi za pomocą 4 objętości kolumnowych buforu doprowadzającego do stanu równowagi przez rozdziałem ładunków każdej porcji materiału C/D. Każdą porcję materiału C/D wprowadza na kolumnę stosując nie więcej niż 8 gramów proteiny na litr żywicy. Po każdej wprowadzonej na kolumnę porcji kolumnę przemywa się 3 objętościami kzlnmazwymi buforu doprzwadzajązzgz do stanu równowagi, a następnie 3 objętościami kolumnowymi buforu A. Po każdym załadowaniu kolumny proteinę wymywa się z kolumny stosując 8 objętości kolumnowych buforu o wzrastającym linizwz gradiencie pH między 6,3 a 6,8 i wzrastającym liniowo gradiencie stężenia soli od 0 do 50 mM NaCl (bufor B). Zbieranie rozpoczyna się od 1.0 O.D. i kontynuuje na wzrastającym froatzwym obszarze piku i przerywa się przy 50% maksymalnej wysokzścipiku na opadającej jego części.
W alternatywnym wykonaniu obcięty sTNFR-1 może być szlnbilizowyny, ponownie składany i oczyszczany jak następuje:
C. l Solublllzacjα/Ponzwne składanie:
Przemyte ciała iaklunyjne (1Bs) solubilizuje się stosując 8 M moznaSk, 60 mM Tris, 100 mM cysteinę do końcowego stężenia 6,5 M mocznika, 50 mM Tris i 80 mM cysteiny, 0 pH=9,5 i 5-10 mg/mL obciętego sTNFR-1. (Ten ostatni wynik jest oparty na zliczaniu ilości obciętego sTNFR-1 w przemytych ciałach IBs wyrażonej w g/L. Materiał pozostawia się mieszając w temperaturze pokojowej na 90 minut, po czym ponownie składa się przez rozcieńczenie 1:10 w zimnym (4 - 8°C) 0,85 M moczniku, 50 mM Tris opER^^ (pH mierzzaz w 4 - 8°C).
Roztwór ponownie złożonego materiału pozostawia się mieszając na 24 - 72 godziny w 4 - 8°C. Pod konizc tego czasu dodaje się kwas octowy lodowaty (około 20 mM) i doprowadza się odczyn do pH=5,0. Powstający osad usuwa się przzz odwirowanie i ciecz znad osadu zachowuje się do wprowadzenia na pierwszą kolumnę.
D. 1 Oczyszczanie
Sklarowany kwasem roztwór po wytrącaniu osadu wprowadza się na kolumnę SP-Sepharose Big Bead™ (Pharmyzia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) doprowadzoną do stanu
189 309 równowagi za pomocą 20 mM octanu sodu, 75 mM NaCl, o pH=5,0. Kolumnę napełnia się nie więcej niż 15 g obciętego sTNFR-1 na jeden litr objętości złoża kolumny. Po załadowaniu kolumnę przemywa się 3 objętościami kolumnowymi 20 mM octanu sodu, 75 mM NaCl, pH=5,0 i wymywa się 9 objętościami kolumnowymi o liniowo zmieniającym się gradiencie stężenia od 75 mM do 450 mM NaCl w 20 mM octanie sodu, pH=5,0. Cały proces oczyszczania na kolumnie SP-Sepharose Big Beud™ (SP-BB) prowadzi się w temperaturze 4 - 8°C.
Roztwór zebrany z kolumny SP-BB rozcieńcza się 1:1 w 2 M NaCl, 60 mM octanie o pH=4,5 i doprowadza odczyn do pH=4,5 jeżeli to konieczne. Rozcieńczony roztwór zebrany z kolumny SP-BB umieszcza się na kolumnie Toyopearl™ Butyl 650M (Toso Haas, Philadelphia, PA), którą zrównoważono za pomocą roztworu 1 M NaCl, 30 mM octanu, o pH=4,5. Na kolumnę wprowadza się około 10-13 gramów obciętego sTNFR-I na 1 litr objętości złożu. Po załadowaniu, kolumnę przemywa się 3 objętościami kolumnowymi roztworu 1 M NaCl, 30 mM octanu, o pH=4,5 i wymywa się 8 objętościami kolumnowymi o liniowym gradiencie stężenia 1 M - 0 M NuCl w 30 mM octanie, o pH=4,5.
Oczyszczone frakcje obciętego sTNFR-I z kolumny typu Butyl 650M połączono, rozcieńczono 1:5 wodą i wprowadzono na kolumnę SP-Sepharose High Performance™ (Sp-HP) (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) zrównoważoną roztworem 30 mM octanu o pH=4,5 (wprowadzają nie więcej niż około 15 g/L objętości złoża). Kolumnę następnie przemywa się 3 objętościami kolumnowymi roztworu 30 mM octanu, o pH=4,5 i wymywa 12 objętościami kolumnowymi o liniowo zmieniającym się gradiencie stężenia od 100 mM do 400 mM NaCl w 30 mM octanie, o pH=4,5. Oczyszczone frakcje obciętego sTNFR-I połączono i doprowadzono do pH=5,0 za pomocą NaOH.
C. PEGylowanie:
1. Wytwarzanie sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa)
Do ochłodzonego (4°C) mieszanego roztworu sTOFR-2.6D/N105 (3,5 mg/ml) w 50 mM octanie sodu, o pH=4, dodaje się 3-krotny molowy nadmiar t-BuPEG (glikol monot-butoksypolietylenowy, średnia masa cząsteczkowa MW=33 kDa, Shearwater Polymers, Inc.). Dodaje się NaCNBH3 do końcowego stężenia 20 mM i mieszaninę reakcyjną miesza się w 7°C przez 18-24 godzin.
Stopień modyfikacji proteiny podczas przebiegu reakcji monitoruje się metodą SEC HPLC stosując kolumnę TSKG3000swxL (Toso Haas, Montgomeryville, PA) i wymywanie za pomocą roztworu 0,1 M buforu fosforano-sodowego o pH=6,9, 0,5 M NaCl i 10% etanolu z prędkością 0,7 ml/min (Toso Haas, Montgomeryville, PA).
Odczyn mieszaniny reakcyjnej doprowadza się do około pH=3,5 za pomocą 1 M HCl i mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się wodą do końcowego stężenia proteiny 1,5 mg/ml. sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) oddziela się od nadmiaru t-BupEG i innych ubocznych produktów reakcji stosując chromatografię jonowymienną SP Sepharose HP 161/10™ (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
Mieszaninę reakcyjną umieszcza się na kolumnie i nieprzereagowany BuPEG wymywa się trzema objętościami kolumnowymi wyjściowego buforu A (20 mM octun sodu o pH=4,0). sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) wymywa się stosując 20 objętości kolumnowych roztworu o liniowym gradiencie stężeniu 0-30% buforu B (1 M NaCl w 20 mM octan o pH=4,0). Wyciek jest monitorowany przy 280 nm. Każdą frakcję zawierającą sTNFR-I 2.6D/N-°5-t-BuPEG (33 kDa) analizuje się metodą SDS-PAGE stosując 4-20% uprzednio uformowane żele gradientowe (Novex, Sun Diego, CA). W oparciu o wyniki analizy SDSPAGE frakcje połączono, zatężono i sterylnie przesączono. Każdy końcowy rzut oczyszczonego sTNFR-I 2.6D/N-05-t-BuPEG (33 kDa) analizuje się ponownie metodą SDS-PAGE i SEC HPLC. Proteinę formułuje się w 10 mM siarczanie sodu o pH=6,5 i 20 mM NaCl.
2. Wytwarzanie sTNFR-I 2.6D/N 105-33 kDa (MePEG)
Do ochłodzonego (7°C) mieszanego roztworu sTNFR-2.6D/N-°5 (4 mg/ml) dodaje się 10% kwas octowy aż do pH=5,0. Do tego roztworu dodaje się 15 mM NaCNBH3 i 2-krotny molowy nadmiar t-butoksy PEG (glikol t-butoksypolietylenowy, średni ciężar cząsteczkowy MW=33 kDa, Shearwater Polymers, Inc.). Mieszaninę reakcyjną miesza się krótko w tej samej temperaturze, a następnie poddaje inkubacji przez około 18 godzin.
189 309
Po upływie 18 godzin stężenie proteiny w mieszaninie reakcyjnej doprowadza się do pH=3,0 za pomocą kwasu cytrynowego.
sTNFR-2.6D/N105-MśPEG (33 kDa) oddziela się od nadmiaru MśPEG i innych produktów reakcji za pomocą chromatografii jonowymiennej stosując kolumnę SP Sepharose HP™ (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ).
Mieszaninę reakcyjną umieszcza się (nie więcej niż 8 mg/ml żywicy) na kolumnie i ąiśprzerśagowany MśPEG wymywa się 3 kbjętkśyiami kolumnowymi startina buforu A (20 mM cytrynian sodu o pH=3,0). sTNFR-2.6D/N105-MśPEG (33 kDa) wymywa się stosując 16 objętości kolumnowych roztworu o gradiencie stężenia od 0,1 do 0,5 M NaCl w 20 mM cytrynianie o pH=3,0. Wyciek monitoruje się przy 280 nm. Każdą frakcję zawierającą sTNFR-2.6D/N105-Mś-PEG (33 kDa) analizuje się metodą SDS-PAGE stosując 4-20% uprzednio uformowane żele gradientowe (NkVśx, San Diego, CA). W oparciu o wyniki analiz metodą SDS-PAGE frakcje połączono, zatężoąk i sterylnie przesączono. Każdy końcowy rzut oczyszczonego sTNFR-I 2.6D/N105-MśPEg (33 kDa) analizuje się ponownie metodą SDSPaGe. Oczyszczony sTNFR-I 2.6D/N105-MśPEG (33 kDa) zatęża się do 5 - 20 mg/ml i formułuje albo wPBS kpH=6,5 (10 mM fosforan sodu, 35-100 mM NaCl) alCo w roztworze 20 mM octanu i 100 mM NaCl o pH=5,0.
3. Wytwarzanie sTNFR-I 2.6D/N105-MśPEG (20 kDa)
Zasadniczo powtarza się procedurę opisaną w punkcie „A” dla wytwarzania sTNFR-I 2.6D/N 105-MśPEG (33 kDa) z tą różnicą, ze MśPeG (glikolem monometoksypkliśtylenkwym, średni ciężar cząsteczkowy MW=20 kDa, Shearwater P^^ers, Inc.) zastępuje się MśPEG (glikol mkąometoksypolietylśąkwy', średni ciężar cząsteczkowy MW= 33 kDa, S^rwater Polymers, Inc.). Proteinę tę formułuje się w 10 mM fosforanie sodu o pH=6,5 i 20 mM NaCl.
4. Wytwarzanie dodatkowych koąjugatów
Dodatkowe kknjugaty sTNFR-I 2.6D/N105 wytwarza się zasadniczo tak jak sTNFR-I 2.6D/N105-MśPEG (33 kDa) z tą różnicą, że stosuje się następujące rodzaje aldehydów PEG (Shearwater Polymers, Inc.):
liniowe jednofUąkcyjne - MW 5 kDa, 6 kDa i 57 kDa;
rozgałęzione jednofunkcyjne - MW 10 kDa, 20 kDa i 40 kDa;
liniowe dwufkąkyyjąe - MW 8 kDa i 20 kUa;
rozgałęzione tęoyfkąkcyjąj - M^W10kD^£i.
Proteiny te formułuje się w 10 mM fosforanie sodu o pH=6,5 i 20 mM NaCl.
5. Alternatywne metody PEGylacji
W alternatywnym wykonaniu obcięte cząsteczki sTNFR-1 mogą Cyć PEGylkwαąj i oczyszczane przy zastosowaniu następujących technik:
Wyciek SP-HP (3 - mg/ml doprowadzony do pH=5,0) poddaje się reakcji z 2 molami glikolu polietylenowego (na przykład MśPEG luC t-BuPEG) na 1 mol sTNFR-I 2.6D/N105 (około 5 gramów t-BuPEG na 1 gram sTNFR-I 2.6D/N105). Po rozpuszczeniu glikolu polietylenowego dodaje się 10 - 20 mM cyjanobnrowodorku sodu i roztwór pozostawia się do inkubacji przez noc w 7 - 15°C. Po zakończeniu reakcji pegylowaąia (około 18 godzin) reakcję gasi się przez dodanie 10 mM glicyny.
Mieszaninę pjgylacyjąą rozcieńcza się 4 objptościami 50 mM octanu o pH=4,0 lub doprowadzonego do pH=4,0 jeśli to konieczne, i umieszcza się na kolumnie SP-HP zrównoważoną za pomocą 50 mM octanu o pH=4,0. Kolumnę załadowuje się nie więcej niż około 8 gramami sTNFR-2.6D/N105 na 1 litr kbjętkści złoża. Po załadowaniu kolumnę przemywa się 3 kCjętościami kolumnowymi buforu równoważącego i wymywa roztworem o liniowym gradiencie stężenia 0 - 0,3 M NaCl w 50 mM octanie o pH=4,0. Zbiera się frakcje mkąkpegylkwαne-goSTNFR-2.6D/N105-30 kDa, doprowadza do pH=5,0, zatęża i diafilteuje do fkęmklayyjąjgo buforu izktoąicznegk. Wszystkie etapy oczyszczania przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Proteinę formułuje się albo w PBS o pH=6,5 (10 mM fosforan sodu, 35-100 mM NaCl) alCo w 20 mM octanie i 100 mM NaCl o pH=5,0.
I89 309
6. Wytwarzanie sTNFR-I 2.6D/C105 db i sTNFR-I 2.6D/C106 db
Aktywowany sulfonowo glikol polietylenowy (wytwarzany i oczyszczany zasadniczo zgodnie ze zgłoszeniem patentowym USA Nr 08/473.809, zgłoszonym 7 czerwca 1995 roku i zgłoszeniem patento^^ym USA Nr 08/611.918, zgłoszonym 6 marca 1996 roku) [PEG20.000-óis-winylosulfon] stosuje się do dimeryzacji protein zasadniczo zgodnie metodą opisaną w publikacji PCT Nr WO 95/34326, za wyjątkiem warunków redukcji i reakcji. Proteiny redukuje się przed przyłączeniem glikolu polietylenowego z 4 molami DTT na jeden mol proteiny w 5-6°C o pH=7,6. Wszystkie reakcje przeprowadza się w obecności 30% glicerolu. Zdimeryzowane proteiny nazywa się sTNFR-I 2.6D/C105db i sTNFR-I 2.6D/C106db. Każdą proteinę wykształca się albo w PBS o pH=6,5b (Io mM fosforan sodu, 35-100 mM NaCl) albo w 20 mM octanu, 100 mM NaCl, o pH=5,0.
7. Wytwarzanie cząsteczek porównawczego sTNFR-I (i) . sTNFR-I 4D/N105 wytwarza się jak opisano w dokumencie EP 422339. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa) wytwarza się przez pegylowanie sTNFR-I 4D/N105 zasadniczo zgodnie z procedurą podaną wyżej dla pegylacji sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa). sTNFR-I 4D/N105-t-MePEG (33 kDa) wytwarza się przez pegylowanie sTNFR-I 4D/N105 zasadniczo w zgodzie z procedurami podanymi wyżej dla pegylacji sTNFR-I 2.6D/N105MePEG (33 kDa). sTNFR-I 4D/C105 i sTNFR-I 4D/C105db wytwarza się jak to opisano w publikacji PCT Nr WO 95/34326. Proteinę tę formułuje się w 10 mM fosforanie sodu o pH=6,5 i 20 mM NaCl.
(ii) . sTNFR-I 4D/C105-33 kDa(MePEG) wytwarza się przez pegylowanie 4D/C105 zasadniczo zgodnie z procedurami podanymi wyżej dla pegylowania sTNFR-I 2.6D/C 105-33 kDa (MePEG) z tą różnicą, ze reakcja przebiega przy pH=7,5 przy użyciu 1,3 mola DTT na jeden mol sTNFR-I przez około 5-6 godzin, a następnie przez usunięcie DTT na kolumnie SPSepharose™ fF i pegylowanie przy użyciu 1,5-3 moli PEG na jeden mol proteiny przez co najmniej 15 godzin w temperaturze pokojowej. Proteinę tę wykształca się albo w PBS o pH=6,5 (10 mM fosforan sodu, 35-100 mM NaCl) albo w 20 mM octanie, 100 mM NaCl o pH=5,0.
(iii) . sTNFR-I 3D/N105 obcięte C-koniec 34 aminokwasów w sTNFR-I 4D/N104) wytwarza się jak następuje. Amplifikacja PCR przebiega przy użyciu sTNFR-I 4D/N105 jako wzorca i OLIGO# 13 i OLIGO 14 które odpowiednio kodują MM i Hindll i przyłączeniu, odpowiednio, do końców 5' i 3' obciętego genu. Amplifikację PCR prowadzi się w 25 cyklach; każdy cykl składa się z 30 sekund w 94°C w celu denaturacji, 15 sekund w 60° w celu przyłączania i 1 minuty w 72°C w celu wydłużenia [termocykler Model 2400 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)]. Produkt PCR oczyszcza się stosując QIAquick™ PCR Purification Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA). Oczyszczony produkt PCR obcięto z Ndel i Hindill po czym żel oczyszcza się stosując QIAquick™ Gel Extraction Kit (QIAGEN, Chatsworth, CA). Produkt PCR wyizolowany na żelu liguje się do pAMG11 i transformuje do komórek FM15 E. coli.
5' OLIGO#13: (SEQ ID NO:80)
5'-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3'
3'-OLIGO#14: (SEQ ID NO:81) ' -CCC/AAGCTTTTAGGTGCACACOGTGTTCTGTTT-Proteinę tę formułuje się w 10 mM fosforanie sodu o pH=6,5 i 20 mM NaCl.
(iv) . sTNFR-I 3D/C105 (obcięcie C-końcowe 34 aminokwasów sTNFR-I 4D/C105) wytwarza się zasadniczo jak sTNFR-I 3D/N105 z tą różnicą że wzorcem jest sTNFR-I 4D/C105. sTNPR-I 3D/C105 wykształca się albo w PBS o pH=6,5 (10 mM fosforan sodu, 35-100 mM NaCl) albo w 20 mM octanie, 100 mM NaCl, o pH=5,0.
(v) . sTNFR-I 3D/C105db wytwarza się zasadniczo jak sTNFR-I 4D/C105db z tą różnicą, ze jako wyjściowy materiał stosuje się sTNFR-I 3D/C105 zamiast sTNFR-I 4D/C105. sTNFR-I 3D/N105db wykształca się albo w PBS o pH-=6,5 (10 mM fosforan sodu, 35-100 mM NaCl) albo w 20 mM octanie, 100 mM NaCl o pH=5,0.
Przykład II
Różne formy obciętego, rekombinacyjnego rozpuszczalnego TNFR-I oceniono pod względem ich zdolności do inhibitowania aktywności TNF.
189 309
A. Próba sytotoksycznośsi WEHI:
Próba WEHI jest próbą proliferacji komórki in vitro (Edwards i wsp. (1991), Endocrinology, 128:989-996). Linie komórkowe są czuło na TNF-α (to znaczy, ze TNF-α jest cytotoknyczny). W obecności inhibitora TNF-α komórki są ochraniano przed efektem cySatoksycznym i dlatego są zdolne do proliferacji.
Protokół:
Czułe na TNF komórki 13 klonu WEHI-164 (ATCC, Rockvillo, MD) przeprowadzono w stap zawiesiny w stężeniu 20 x 104 komórek/mL w pożywce RPMI (Gibco, Grand Island, NY) uzupełnionej 5% Fotal Calf Serum (Hyclone, Ogdon, UT) i penicyliną 50 U/mL: streptomycyną 50 mg/mL. Sto mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej umieszczono w każdym płaskodennym zagłębieniu płytki do mikroanalizy o 96 zagłębieniach i komórki pozostawiono do przylegania przez 4-6 godzin w 37°C w atmosferze 5% CO2. Do każdego zagłębienia dodano 10 μΐ 0,0060 mg/mL aktynamysyny-D (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Do każdego zagłębienia dodano 10 mikrolitrów rokombipasyjnega ludzkiego TNFa o stężeniu 50 ng/mL (końcowe stężenie 5 ng/ml). Seryjnie dwukrotnie rozcieńczono różno formy sTNFR (sTNbR-I 2.6D/C106, sTNFR-I 4D/C105 i sTNbR-I 4D/C105db) rozcieńczono stosując PBS, po czym dodano do zdublowanych zagłębień (10 μL/zagłębleme) przylegające komórki WEHI-164 po dodaniu rekomUlnacyjnogo ludzkiego TNF-α. Komórki 13 klonu WEHI-164 lnkubowana przez 18 godzin w 37°C i w atmosferze 5% CO2. Po zakończeniu inkubacji dodano 10 mL o stężeniu 2 mg/mL roztworu barwnika organicznego MTT teSrazalium (bromek 3-[4,5dlmethylatiozo-2-ila]2.5-difenylotetrazolium; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), i komórki inkubowano przez dodatkowe 4-6 godzin. Komórki poddano salubilizosjl przez dodanie 50 μL roztworu DMF/SDS (20% SDS i 50% N,N dwumotylaformamid, pH=4,7). Roztwór DMF/SDS kilkakrotnie zaciągano pipetą w górę i w dół aż do chwili, kiedy wszystkie kryształy MTT rozpuściły się, i komórki poddano inkubacji przez dalsze 2-22 godzin. Ab(abs) są gotowe do odczytu pa urządzeniu „Vmax leader” przy 570. Procentową sytaSoktyczność właściwą obliczono z gęstości optycznych stosując wzór:
n/ _ . , . 100%x[abs(komórki + pożywka) - abs(komórki + próbka)] % specyficzni sytotaksycznoscl =-Ł s-+-—ż a-)-tabs(komćrki + ροΐΑ-ΑνΤη) - abs(komórki + TX -100)
Ilość jednostek TNF w każdej próbce określono przy użyciu procentowych cytaSaksyczTości właściwych mysich wzorców, jak to uprzednio opisano.
Wyniki próby WEHI zostawiono poniżej w tabeli 2:
Tabela 2 Aktywność in vitro w próbie WEHI
Związek IC50 ()g/mL)
sTNFR-I 2.6D/C106 208
sTNFR-I 4D/C105 238
sTNFR-I 4D/C105db N/A
W oparciu o wyniki próby WEHI widać, że nie ma znaczących różnic pomiędzy sTNFR-I 2.6D/C106 a sTNFR-I 4D/C105 w kategoriach bioofoktywności in vitro.
B. Próba Cytatoksysznośsl L929:
Próba sytotoksycznoścl przy użyciu L929 jest próbą proliferacji komórek in vitro (Parmely i wsp. (1993), J, Immunol, 151:389-396). która także ocenia „cytotoksyczpość zabijania wrażliwego na TNF-α. Linie komórkowe są wrażliwo na TNF-α (na przykład TNF-α jest cytotaksyczny). W obecności inhibitora rozpuszczalnego TNF-α, komórki są chronione przed efektem cytoSoksycz)ym i tym samym zdolne są do proliferacji.
Protokół:
Linię komórkową L929 otrzymano z kolekcji American Typo Culturo Callestian (Katalog pumor CCL 1, klon NCTC 929, klony szczepu L, tkanka łączna, mysz). Pożywką użytą do propagacji była pożywka o nazwie RPMI Medium 1640, uzupełniono roztworem 10% FBS, +1% roztworom L-glutaminy, +1% roztworom yeplcyhna-stroytomysyna.
i89 309
W próbie stosowano płytki do mikroanalizy o 96 zagłębieniach (Corning) i tylko 60 wewnętrznych zagłębień wykorzystano. Próbkę wzorca i próbkę badaną zbadano potrójnie na tej samej płytce.
Stosowany w próbie TNFa pochodzi z firmy R&D Systems (Minneapolis, MN). Końcowe stężenie stosowanego w próbie TNFa wynosi 1 ng/mL we wszystkich zagłębieniach próby.
Rozcieńczalnikiem przy próbie była pożywka wzrostu L929, TNFa o stężeniu 10 pg/mL i aktynomycyna D o stężeniu 10 ng/mL (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO).
Płytki zebrano stosując roztwór XTT/MEN (1.5 mg/mL XTT + 75 mM MEN).
Pierwszego dnia komórki posiano na płytkach do prób. Zawiesinę komórek sporządzono pod działaniem trypsyny i ponowne przeprowadzenie wstań zawiesiny przy 3,33 x 104 komórek/mL. 180 mL tej zawiesiny komórkowej posiano w każdym z 60 wewnętrznych zagłębień płytek do prób. W 36 zewnętrznych zagłębień płytki rozprowadzono 200 mL pożywki wzrostu, aby uniemożliwić odparowanie w próbie. Przykryte folią płytki pozostawiono w temperaturze pokojowej w miejscu bez przewiewu, przez około 1 godzinę. Płytki do prób umieszczono w inkubatorze o temperaturze 37±2°C, o wysokiej wilgotności i w obecności 5±1% CO 2. Płytki inkubowano przez około 20-22 godziny przed dodaniem seryjnych rozcieńczeń sTNFR-I.
Drugiego dnia wytworzono wzorcowy sTNFR-I 4D/N105 i próbki do badań w następujący sposób: rozcieńczono wzorcowy sTNFR-I 4D/N105 i próbki do badań do stężenia około 2,0 mg/mL (lub do innego, odpowiedniego stężenia). Sporządzono seryjne rozcieńczenia tego stężenia w celu wykreślenia 10-punktowej krzywej rozcieńczania w przedziale od około 1.0 x 106 ng/mL do 1,0 x 10'3 ng/mL, obejmującą punkt o stężeniu 0 ng/mL (tylko dla próby rozcieńczenia). Jeżeli inne stężenia są odpowiednie to mogą być użyte. Do każdej płytki dodano potrójnie 1000 pL każdego rozcieńczenia. Inkubowano płytki w inkubatorze w temperaturze 37±2°C o wysokiej wilgotności i w obecności 5±1% CO2 przez 20±1 godzin po przeniesieniu próbek seryjnych rozcieńczeń na płytki do prób.
Trzeciego dnia dodano się 50 μL/zagłębienie roztworu XTT/MEN do 60 wewnętrznych zagłębień płytek do prób. Płytki inkubowano w inkubatorze (Falcon, New York, New York) w temperaturze 37±2°C o wysokiej wilgotności i w obecności 5±1% CO2 przez 24±0,5 godziny.
Czwartego dnia odczytano gęstość optyczną (OD) badanych płytek przy 450 nm minus 650 nm na czytniku płytek ELISA (SpectraMAx, Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA). Jeżeli otrzymuje się wartości 4.000 OD dla zagłębień w płytce przy tych długościach fali, to płytkę należy przeczytać ponownie bezpośrednio przy 490 nm minus 650 nm i dane tak odczytane powinny być użyte do obliczania.
Krzywą wzorcową dawka-reakcja względem skali logarytmicznej wykreśla się przy użyciu dopasowania krzywej czteroparametrowej. Oryginalne stężenia nieznanych próbek oblicza się z krzywej wzorcowej i wyznacza ED50 dla wzorca i współczynnik korelacji dla krzywej wzorcowej.
Wyniki: Wyniki próby cytotoksyczności L929 zebrano poniżej w tabeli 3:
Tabela 3:
Aktywność in vitro w próbie cytotoksyczności L929
Związek Stężenie ED50 (ng/ml)
sTNFR-I 4D/C105db 7,8 1,0±0,1
sTNFR-l 2 6D/C105db 2,6 1,1+0,0
sTNFR-l 2.6D/C106db 2,2 1,0±0,1
sTNFR-l 4D/N105-t-BuPEG (33kDa) 2,0 229,2±18
sTNFR-1 4D/C105-t-BuPEG (33 kDa) 1,1 325,5±147
sTNFR-I 2 6D/C105-t-BuPEG (33kDa) 1,7 210,2±9
Wzorzec wewnętrzny·
sTNFR-l 4D/C105 3,5 210,2+671881
189 309
Powyższe dane wskazują, że sTNFR-I 4D/C105db oraz sTNFR-I 2.6D/C105db i sTNFR-I 2.6D/C106db są aktywne i wykazują porównywalne reakcje na dawkę przy porównaniu ze wzorcem. Wyniki te wskazują także, ze sTNFR-I i sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa) oraz sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG (33 kDa) są blisko 100 razy mniej aktywne, lecz są aktywne w tej próbie, niemniej, gdy są porównane z sTNFR-I 4D/C105db.
Rzut #2
sTNFR-I 3D/C105db 0,2 2,27±0,3
sTNFR-I 3D/C105db 0,,2 2,0 *;
sTNFR-I 3D/C105db 1,,9 1,8 *
sTNFR-I 3D/N105 2,,4 413,3
Wzorzec wewnętrzny: sTNFR-I 4D/C105 3,5 Π5,9±42,1
*’ Pojedynczy wynik
Powyższe dane wskazują, że sTNFR-I 3D/C105db jest aktywny i obszar wartości ED50 zawiera się w przedziale dla sTNFR-I 4D/C105db (rzut #1), sTNFR-I 2.6D/C105db (rzut #1) i sTNFR-I 2.6D/C106db (rzut #1). Dane te wskazują również, że sTNFR-I 3D/N105 jest mniej aktywny w porównaniu do wzorcu wewnętrznego sTNFR-I 4D/C105.
C. Model reaktywacji wywoływany przez ścianę komórkową paciorkowców:
Model reaktywacji wywoływany przez ścianę komórkową paciorkowców zapalenia stawów przy próbach ze szczurami realizuje się przy użyciu znanych protokołów (Esser i wsp. (1985), Arthritis AndRheumatism, 28: 1402-1411, i Makarov i wsp. (1996), Proc Natl. Acad. Sci USA, 93: 402-406).
Protokół:
Samicom szczurzej rodziny Lewis (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA), każda ważąca 175 to 185 gramów, wstrzyknięto dostawowo do prawego stawu skokowego sterylną zawiesinę produktów ściany komórkowej paciorkowców zawierającą peptydoglikanpolisucharyd (SCW) (Lee Laboratory, Grayson, GA) w dawkach zawierających 1,5 mg/10 mg na staw. Roztwór soli wstrzyknięto do stuwu przeciwstronnego, by zapewnić kontrolę. Wstrzyknięcie dostawowe SCW powoduje ostre zapalenie stawów o stosunkowo krótkim okresie trwania, z pęcznieniem stawu osiągającym maksimum w jeden do dwóch dni po iniekcji. Po upływie 20 dni, podczas których wywołała się ostra reakcja zapalna, ponownie podano SCW poprzez dożylną iniekcję w dawkach po 200 mg/200 mL na jednego szczura. Druga dawka SCW jest wystarczająca do reaktywowania zapaleniu w stawie skokowym, do którego wstrzyknięto uprzednio SCW i ma mały wpływ na staw, do którego wstrzyknięto roztwór soli. Aby ocenić stopień zapalenia po 72-godzinnym okresie po wstrzyknięciu SCW zmierzono rozmiary tylnego stawu skokowego po upływie 0; 24; 36; 48 i 72 godzin po reaktywowaniu zapalenia stawów, a następnie część tylnego stawu skokowego zebrano dla celów histologii (przykładowo: zapalenie, tworzenie łuszczki rogówki, uszkodzenie chrząstki i uszkodzenie kości).
Wyniki:
Zbadano wpływ sTNFR-I 2.6D/C106db w przypadku podawania na rozwój obrzęku stawów podczas reaktywacji zapalenia stawów. Inhibitory i zaróbkę podawano w pojedynczych iniekcjach dożylnych 24 godziny przed reaktywacją SCW.
sTNFR-I 2.6D/C106db cechuje statystycznie znacząca skuteczność w zmniejszaniu obrzęku stawów przez analizę wariancji (ANOVA) i test Fishera „post-hoc” (Stutview®) przy wszystkich czterech dawkach, drugiego i trzeciego dnia po reaktywacji i przy wszystkich z wyjątkiem j’ednej - dawki (1,5 mg/kg) pierwszego dnia. To zmniejszenie obrzęku jest porównywalne do pozytywnego wyniku próbki kontrolnej sTNFR-I 4D/C105db podanej przy dawce 0,5 mg/kg dziennie (tzn. 8.8 nM) poczynając od pierwszego dniu przed reaktywacją do trzech dni po reaktywacji. sTNFR(s) wykazują również znaczącą skuteczność gdy rozpatruje się juko całość ilość obrzęku po trzech dniach. Pole pod krzywą (AUC) pokazuje zależność dawku-reakcja przy wszystkich dawkach (patrz rysunek fig. 9, gdzie sTNFR-I 2.6D/C106db określono jako „sTNFR-I 2.6D”, a sTNFR-I 4D/C106db określono jako „sTNFR-I 4D”).
189 309 sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) wykazuje znacząco zmniejszenie szerokości stawu skokowego i msPaźniPóm histąlągiczdyoh w porównaniu z grupą kontrolną choroby w modelu.
D. Model D-aalaPtozoaminy/hpope>liseoharyau:
Model D-galaktązoamidy (D-GalNH2)/lipepąlicacharyau (LPS) (Parmoly i wsp. (1993), jak wyżej), jost in vivo, wysoce zależny od TTF-α zmierzęcpgą modelu totalności. Ponadto wykazano, żo myszy auteimmtmizomano MRL-lpr/lpr są wybitnie wrażliwe na TNF-α indukowany przez LPS Iub SEB. (Mountz i wsp. (1995), J. Immunol, 155:4829-4837).
Protokół:
Po oełądoodym głodzeniu, 6-8-tyaoddiomp dojrzałe samioe myszy MRL-lpr/lpr (Jackson Laboratery, Bar Harbor, ME) otrzymały dawkę I.P. następujących reagentów farmakologicznych: 25 mg D-GalNH2 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) przeprowadzonego w stan zawiosidy w roztworzo Hanka (HankN Balanoed Salt Sąlutiod (Gibco Laboratories, Inc., Grand Island, NY) o stężoniu 50 mg/mL; i lipąpolisacharyd (LPS) z Serotypu 0127:B8 E. coli (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w sterylnym, wolnym od endątoPsynl buforowanym fosforanem roztworze soli (PBS) (25 mg/mysz), Iub SEB (Toxin Technologies, Sarasota, FL) w normalnym roztworze soli (50 mg/mysz). Różne formy sTNFR podano w seriach o dwukrotnym rozoieńczeniu (dawki mg/kg) w celu otrzymania krzywych ED50 utworzonych przy użyciu statystycznych programów dla firmy Macintosh (Statview®, Mountain Viem, CA). Totalność obsermąmadą przez 48 gąazid po podaniu dawki.
Wyniki:
Jak pokazano pąmżej w tabeli 4, gdy sTNFR-I 2.6D/C106db jest podawany jak opisano powyżej, 1 godzinę przod podaniem dawki LPS/DGalNH2, ED50 (tzn. dawka sTNFR-I 2.6D/C106ab wymagana dla 50% ochrony) po upływie 48 godzin wydosC 50 pg/kg (N=8 myszy). W porównaniu z sTNFR-I 4D/C105db nip raobsermomado znaczących różnic (P>0,05) w zdolności tej formy do zapobieżenia letalności (ED50 = ~ 50 pg/kg; N=8 myszy).
Tabela 4:
Porównanie sTNFR i optymalnych form obciętego sTNFR w modelu LPS/D-GaINH2
Środek ED 100 ED50
sNFR-I 4D/C105db ~ 100 pg/kg ~ 50 pg/kg
sTNFR-I 2.6D/C106db ~ 100 pg/kg ~ 50 pg/kg
sTNFR-I 2 6D/N105-t-BuPEG (33kDa) ~ 2 pg/kg ~ 400 pg/kg
sTNFR-I 2.6D/N 105-MePEG (20 kDa) ~ 800-1000 pg/kg ~ 1 pg/kg
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (20 kDa, rozgałęziony) 2 mg/kg -111,5 pg/kg
sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG (40 kDa, rozgałęziony) 1,5 mg/kg ~ 1 pg/kg
Powyższe dano wskazują, żo sTNFR-I 2.6D/C106ab wykazuje równoważną aktywność w porównaniu do sTNFR-I 4D/C105db, lecz zo sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) jest mniej aktywny w tym modelu z ED50 około 400 pg/kg (n=5 indywidualnych myszy). Ponadto, aktywność sTNFR-I 2.6D/N105-Me PEG (20 kDa, rozgałęziony) i 2.6D/N105-MePEG (40 kDa, rozgałęziony) są mniej aktywno w tym modelu.
E. Modd zapalenia ljnwów mymołancgo )uartaclcbzmt pemoaoigzγn)i: Rgumatojgajne zapalenie stawów indukowane u szczurów przez farmaceutyczne substancje pomąonicre ma wiele cech podobnych do ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stamóm. Colom obecnego eksperymentu jest wykazanie, że systemowo podawanio obciętych sTNFRs ma mitygujący wpływ na padtogodezę zapalenia stawów wywołanego farmaceutycznymi substancjami pomocniczymi u myszy.
Protokół:
Samco szczurów szczepu Lewis (5-7 osobników w grupie) (Charles River Laboratories Inc., Wllmingted, MA), każdy o wadzo co najmniej 200 g, kanuląwado za pomocą cewników SQ i aezmolodo im powrócić do normy przez kilka dni. Następnie zostały umieszczone
189 309 w klatkach infkzyjąyyh, gdzie aklimatyzowały się przez tydzień przed rozpoczęciem infuzji roztworem soli.
W dniu „zero” wszystkim szczurom wstrzyknięto 100 pl kompletnego adjuwanta Freunds'a (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), do którego dodano 50 mg/ml syntetycznej substancji pomocniczej N,N-dikktylodjcylkdeyylo-N',N-bis(2-hydroxy-etylk)propαąodwuaminy. Ósmego dnia różnym grupom szczurów podano metodą infuzji ciągłej Sq, sTNFR-I 4D/C105 i sTNFR-I 2.6D/N105.
Wyniki zestawiono w tabeli 5.
Tabela 5:
zapalenie stawów wywołane substancjami pomocniczymi
Związek Dawka mg/kg/godz % AUC, (% mh.) Masa łapki (% inh) Zapalenie ResoęuyJa kości Histopatologia (% inh.) (% mh.)
Badanie #1
sTNFR-I 4D/C105 5 61 46 37 89
1 49 45 26 855
0,2 33 40 14 34
sTNFR-I 2 6D/N105 1 55 53 33 51
Badanie #2
sTNFR-I 2.6D/N105 5 42 ND 19 67
1 38 ND 13 49
Badanie #3
sTNFR-I 2.6D/N105- 9 50 40 13 27
-MePEG (20 kDa) 3 35 34 9 22
1 36 30 0 0
sTNFR-I 2.6D/C105- 9 43 37
-MśPEG (33 kDa) 3 38 33
1 24 20
Nieoczekiwanie okazało się, ze sTNFR-I 2.6D/N 105-t-BuPEG (33kDa) i sTNFR-I 4D/C105db mają pkrówąywalne działanie przeciwzapalne w zapaleniu stawów wywołanym substancjami pomocniczymi u szczurów Lświs'a, jakkolwiek sTNFR-I 4D/C105db jest bardziej skuteczny próbach cytotkksyyząości in vitro WEHI-164 i L929, jak również w modelu LPS/GalN.
F. Model zapalenia stawów indukowanego przez kolagen:
Zapalenie stawów indukowαągo przez kolagen, typ II ma wiele cech podobnych do ludzkiego reumatoidalnego zapalenia stawów. Celem obecnego eksperymentu jest wykazanie, ze systemowe podawanie obciętych sTNFRs ma mitygujący wpływ na paątogeąezę zapalenia stawów wywołanego przez kolagen, typ II u szczurów i myszy.
Protokół Cadań na szczurach:
Samice szczurów szczepu Lewis (Charles Rwer Laboratories, Inc., Wilmiągtoą, MA), miały zaimulantkwαąe cewniki SQ i zostały przyzwyczajone do cewnikowania poprzez ciągłą infkzjp. Następnie zostały poddane immunizacji bydlęcym kolagenem typu II w kompletnym
199 099 αdjuwynciz Frenads'a. W dniach 13, 14 lub 15 po immunizacji, zwierzęta z rozwiniętym zapaleniem stawów zostały losowo podzielone na grupy liczące po osiem osobników każda. Zwierzętom w grupach doświadczalnych podawano inf uzyjnie sam nośnik lub nośnik z różnymi dawkami sTNFR-1, jak to opisano w tabeli 6 przez 7 dni. Zapalenie w łapkach oceniano poprzez codzienny pomiar suwmiarką stawów kostki. Siódmego dnia, zwierzęta uśpiono i pobrano im łapki w celu określenia masy łapek jako wskaźnik zapalenia. Stawy kostkowe i kolanowe wypreparowano do oceny histopatologicznej parametrów zapalenia stawów.
Rezultaty zestawiono w poniższej tabeli 6A.
Interesujące jzst, żz u szczurów w modelu kolagenowym wszystkie grupy leczone miały prawie taką samą sprawność (przykładowo kształt krzywych procent iahibitowaaia powierzchni pod krzywą /AUC/, o zakresie 30-59%, oraz iahibitowyniz masy łapek, o zakresie 40-64%. Żadna z grup leczonych nie jest statystycznie odmienna od pozostałych w tym modelu zapalenia stawów.
Protokół badań na myszach:
Samce rodziny DBA/1 (Jackson Laboratories, 1nc., Bar Harbor, ME), poddaje się immunizacji bydlęcym kolagenem typu 11 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w niekompletnym adjnwαnzle Freundsą. W dniach 24, 25 i 26 po immnaizαcji, zwierzęta z rozwiniętym zapaleniem stawów zostały losowo podzielone na grupy liczące po osiem osobników każda. Zwierzętom w grupach doświadczalnych podawano dwa razy dziennie, dootrzewnowo infuzyjnie sam roztwór soli lub nośnik z sTNFR-1 2.6D/N105-MePEG (33 kDa), przez 3 kolejne dni (dni +27, +28, +29). Zapalenie w łapkach oceniano poprzez codzienny pomiar suwmiarką stawów kostki. W dniu +34, zwierzęta uśpiono i pobrano im łapki w celu określenia masy łapek jako wskaźnik zapalenia. Stawy kostkowe i kolanowe wypreparowano do oceny histopatologicznej parametrów zapalenia stawów.
Rezultaty zestawiono w poniższej tabeli 6B.
Tabela 6A:
Zapalenie stawów indukowane kolagenem
Związek Dawka mg/kg/godz % AUC, (% inh.) Masa łapki. (% inh) Zapalenie Resorpzsy kości Histopatologia
(% inh.) (% inh.)
1 2 3 4 5 6
Badanie # 1 5 65 81 ND ND
STNFR-1 4D/C105 1 35 34 ND ND
0,2 19 22 ND ND
STNFR-1 2 6D/N105 1 mg/kg/dzień 39 41 ND ND
Badanie # 2
STNFR-1 2.6D/N105-MePEG (33 kDa) 3 50 60 76 46
STNFR-I 4D/N105- MePEG 3 47 50 ND ND
(33 kDa) mg/kg/dzizń
Badanie # 3
STNFR-I 2 6D/N105-MePEG (33 kDa) 9 25 44 ND ND
i89 309 cd tabeli 6 A
1 2 3 4 5 6
STNFR-I 2 6D/N 105-HePEG (33 kDa) 3 25 37 ND ND
STNFR-1 2 6D/N105-MePEG (20 kDa) 9 35 52 ND ND
STNFR-I 2 6D/N 105-HePEG (20 kDa) 3 35 37 ND ND
Tabela 6Bzapalenie stawów indukowane kolagenem
Związek Dawka mg/kg/2D % AUC, (% inh) Histopatologia (% inh)
Badanie # 1 STNFR-I 4D/C105db 5 61 39
sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33 kDa) 1 55 55
Badanie # 2 sTNFR-I 2.6D/N 105-HePEG (33 kDa) 9 73 ND
sTNFR-I 2 6D/N 105-HePEG (33 kDa) 3 75 ND
G. Szczurzy model produkcji TNF-α indukowanej poprzez ciągłą infuzję LPS: sTNFR-I 2.6D/C105db i sTNFR-I 2.6D/C106db, sTNFR-I 2.6D/N105 i sTNFR-I
4D/N105 implantuje się do żyły szyjnej (IV) za pomocą mini-pomp Alzet™ (Alza Corp., Palo Alto, CA), zgodnie z instrukcją producenta, przez 48-godzinną ciągłą infuzję (1 mg/kg). Poziomy TNF-α w surowicy, oznaczane przy zastosowaniu zestawu ELISA (Genzyme, Cambridge, MA), są znacząco obniżone w porównaniu z poziomem u zwierząt kontrolnych w godzinie +2 po podaniu wysokiej dawki LPS.
Przykład III: Badania immunogenności
Oceniono różne formy obciętego, rekombinacyjnego rozpuszczalnego TNFR-I pod względem immunogenności w szeregu modelach zwierzęcych.
A. Gryzonie:
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa); oraz sTNFR-I 4D/C105db (kontrolny) podano w tym badaniu podskórnie w dniach 1 i 5 samicom szczurów Sprague Dawley (Charles Rivers Labs, Wilmington, MA) w dawkach 4 mg/kg, (n=6-8 zwierząt w grupie). Próbki krwi zza oczodołów zbierano tygodniowo do dnia 21 po początkowym podaniu. Próbki oceniono ze względu na wytwarzanie przeciwciał IgM i IgG.
Jak widać z tabeli 7, w przypadku sTNFR-I 4D/C105db podawanego podskórnie (SC) w dniach +1 i +5 występowały wyższe miana przeciwciała IgG, anty-sTNFR-I u szczurów aż do dnia +21, niż w przypadku sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa), któremu odpowiadają bardzo słabe miana przeciwciała, o ile w ogóle występują. Podobne tendencje odnośnie immunogenności obserwowano również u szczurów wytwarzających przeciwciała IgM antysTNFR-I przez +21 dni. sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) nie wytwarzały szczurzych przeciwciał IgM anty-sTNFR-I przez +21 dni.
B. Papio anubis:
Celem fazy A części 1 tego badania było wyznaczenie farmakokinetyki i immunogenności, odpowiednio, sTNFR-I 4D/C105db (0,2 mg/kg masy ciała [BW]), sTNFR-I 3D/C105db
I89 309 sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg BW); albo sTNFR-I 2.6D/C105db (0,2 mg/kg BW), przy podawaniu IV dwukrotnie w odstępie +21 dni zdrowemu pawianowi.
Badania w części 1. podzielono na dwie fazy. Część 1, Fazy A, miała na celu wyznaczenie farmakokinetyki i immunogenności różnych konstruktów sTNF-R1 u zdrowego pawiana w reakcji na dwie iniekcje. Dwanaście pawianów podzielono na trzy grupy. Po znieczuleniu, każda grupa otrzymywała dawkę 0,2 mg/kg BW sTNFR-I 4D/C105db, sTNFR-I 3D/C105db, albo sTNFR-I 2.6D/C105db. Podczas każdej sesji badano trzy pawiany. Zwierzęta obserwowano się przez 21 dni, po czym otrzymały one drugą identyczną iniekcję IV proteiny i były badane przez dalsze 21 dni. Farmakokinetykę i immunogenność określono następnie w pewnych odstępach czasowych.
Tabela 7:
Immunogeniczność gryzoni
Czas (dni) 0,01 7 14 21
Grupa + ilość zwierzęta Miano Igm Miano Igm Miano Igm Miano Igm
sTNFR-I 2 6D/N105-33 kDaPEG NEG 0 0 0
1 NEG 0 0 0
2 NEG 0 0 0
3 NEG 0 0 0
4 NEG 0 0 0
6 NEG 0 0 0
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG33 kDa 0 0,00 0,00 0,00
SEM 0 0,00 0,00 0,00
Kontrola
7 0 0 50 0
8 0 0 50 0
3 0 0 100 0
9 0 0 0 0
10 0 0 100 50
11 0 0 100 0
12 0 0 100 0
13 0 0 0 0
Kontrola 0 0 62,5 6,3
SEM 0 0 15,7 6,3
189 309
Czas (dni) 0,01 7 14 21
Grupa + zwierzęta# Miano IgG Miano IgG Miano IgG Miano IgG
sTNFR-I 2 6D/N105-t-BuPEG 33 kDa NEG NEG 0 0
1 NEG NEG 0 0
2 NEG NEG 0 0
3 NEG NEG 0 0
4 NEG NEG 0 0
6 NEG NEG 0 0
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG33 kDu 0,00 0,00 0,00 0,00
SEM 0,00 0,00 0,00 0,00
Kontrola
7 NEG NEG 0 200
8 NEG NEG 0 200
9 NEG NEG 0 0
10 NEG NEG 200 400
11 NEG NEG 0 200
12 NEG NEG 200 800
13 NEG NEG 0 50
Kontrola 0 0 50 231,3
SEM 0 0 32,7 94,0
Faza B części 1 badania ma na celu ocenę skuteczności tych preparatów w dobrze ustalonym modelu letulności za pośrednictwem TNFu (Espat i wsp., J Surq Res., 59:153-158, 1995). Letalna bakteremia E. coli jest indukowana u 16 zwierząt w grupach po 4 osobniki, przez podanie 5-10 x WOciu/kg (jednostek tworzących kolonie/kg) żywych E. coli. Grupę placebo porównuje się z pawianami uprzednio poddanymi działaniu IV z sTNFR-I 4D/C105db (0,2 mg/kg masy ciału), sTNFR-I 3D/C105db (0,2 mg/kg masy ciała), ulbo sTNFR-I 2.6D/C105db podanymi przy 1 mg/kg masy ciała.
W obu fazach badania części 1, dorosłe pawiany Younga, samce i samice Papio anubis (6-11 kg) (Biomedical Research Foundation, San Antonio, TX) były głodzone przez noc. Zwierzęta znieczulono przy użyciu ketuminy (10 mg/kg, domięśniowo - i.m.) i wkłuto się podskórnie w żyłę igłą. Znieczulenie utrzymywano przez początkowe podanie do 35 mg/kg pentobarbitalu sodowego, a następnie powtarzano iniekcję przy użyciu 3-5 mg/kg/godzinę pentobarbitalu sodowego. Górne drogi oddechowe zabezpieczono przez umieszczenie rurki wewnątrztchawiczej z mankietem (endotracheotomia) i zwierzęta utrzymały spontaniczne oddychanie. Wprowadzono przez skórę cewnik do tętnicy udowej co umożliwia powtarzane pobierunie próbek krwi tętniczej, jak również ciągłe monitorowanie częstości akcji serca i średniego ciśnienia tętniczego krwi przy użyciu monitora znieczulenia „Datascope 2000 anesthesiu monitor” (Datuscope, San Antonio, TX). Próbki krwi tętniczej zbierano w pewnych odstępach czasu, antykoagulowano przy użyciu EDTA Iub heparyny i chłodzono na lodzie bezpośrednio po pobraniu. Frakcje osocza oddzielono przez wirowanie w 4°C i przechowywano w -70°C do momentu próby. Temperaturę rdzenia monitorowano za pomocą sondy odbytniczej. Umieszczono cewnik moczowy typu Foley'a aby umożliwić zbieranie moczu i monitorowanie wychodzenia moczu i usuwania kreatyniny. Parametry hemodynamiczne
189 309 manitorawana co 15 minut. Wszystkie zwierzęta otrzymywały dożylnie 0,9% roztwór chlorku sodu (4 ml/kg) jako płyn podtrzymujący (/'.ν). W badaniach fazy B zwierzęta otrzymywały dodatkowy płyn (10 ml/kg co 15 minut), jeżeli spełnione były dwa spośród następujących kryteriów fizjologicznych: 1) średnie siśpienie tętnicze spadło o więcej niż 30%; 2) nastąpił wzrost częstości akcji serca więcej niż o 30%; 3) spadek wydalania moczu do <1 ml/kg/godz. Po pobraniu próbki krwi przy linii bazowej i odczekaniu okresu co najmniej 1 godziny by umożliwić zrównoważenie rozpoczęto infuzję protein.
W fazie A części pierwszej badań, proteiny rekamUinacyjne wprowadzano za pomocą infuzji przez żyłę głowową i zwierzęta obserwowano przez okres 8 godzin, po którym to czasie wszystkie cewniki usunięto i zwierzęta powróciły do swoich klatek na 21 dni. Po 24 i 48 godzinach i w dniach: 3, 5, 8, 11, 16, i 21, zwierzęta krótko znieczulano przy użyciu 1 M ketaminy (10 mg/kg) i pobierano próbki krwi żylnej. W 21 dniu zwierzęta ponownie znieczulano, otrzymywały one drugą injokcję proteiny i całą procedurę prowadzoną w dniu „0” powtarzano przez następne 21 dni, w którym to czasie zwierzęta uśmiercono.
W fazie B części 1 badań, jedną godzinę przed infuzją E. coli, czworo zwierząt losowo przypisano do tego, by otrzymały placebo lub jeden z uprzednio wspomnianych kopstruktów. Zwierzęta obserwowano przez okres 8 godzin, po którym to czasie wszystkie cewniki usunięto, zwierzęta wróciły do swoich klatek i oUterwowapo przeżycie śmiertelnej bakteremii. Zwierzęta podlegające nadmiernemu dyskomfortowi uśmiercano. Nadmierny dyskomfort określony jest przez IACUC jako: 1) niezdolność do utrzymania pozycji siedzącej lub pionowej przez poprzednie 12 godzi), 2) niezdolność do pobierania pożywienia lub wody przez ostatnie 12 godzin, 3) niekontrolowane krwawienie z miejsc cewników, lub 4) niereagowanie pa bodźce zewnętrzne. Próbki krwi żylnej pobrano w: -1; 0; 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 24 oraz 48 godzinie i w dniach: 3, 5, 8, 11, 16, i 21. Dnia dwudziestego pierwszego zwierzęta, które przeżyły, uśmiercono.
Obecność przeciwciał Papio względem podawanych protein rokombipasyjnych oznaczono za pomocą zestawu sandwicz ELISa. Bardzo krótko, konstrukty sTNFR-1 nanietiopa na płytki ELISA (1 μg/ml0 i dodano (100 μΐ) rozcieńczone osocze krwi pawiana (1:50 do 1:100.000). Po przemyciu próbek, dodano proteinę A (0,5 μg/ml) sprzężoną zperoksydazą (HRP) chrzanową, i próby wizualizowano przy użyciu TMB.
Wyniki (Część I):
Czasy trwania w osoczu różniły się znacznie dla trzech konstruktów. Czasy znikania oznaczono przy użyciu metody niezależnej od modelu i pozorne czasy półtrwania zasadniczo oceniono na pomiędzy 8 a 172 godziny. U zwierząt nie stykających się z danym bodźcem czas półtrwapia w osoczu jest najdłuższy u pawianów, na które działano konstruktem domeny 4.0 (29 godzin) i obniża się ttopniawa u pawianów, na które działano sTNFR-I 3D/C105dU (24,7 godzin) i sTNbR-I 2.6D/C105dU (21,5 godzin). Różnica - chociaż znacząca statystycznie -wyposi tylko 26%.
Nieoczekiwanie, po drugim podaniu protein odpowiednim pawianom czasy półtrwapia w osoczu miały tendencję do skracania, wskazując pa szybsze usuwanie. To zmniejszenie czasu półtrwania jest najbardziej wyraźno u pawianów otrzymujących tTNbR-I 4D/C105dU, gdzie jest on skrócony o 48% (p<0,01) [rysunek fig. 10]. Zmniejszenie czasów półtrwania jest pośrednie u pawianów, na któro działano tTNbR-I 3D/C105db (31%) [rysunek fig. 11] i przynajmniej u zwierząt, którym podawano sTNbR-I 2.6D/C105dU (14%) [rysunek fig. 12]. Zmniejszenie czasu półtrwania nie jest znaczące statystycznie u pawianów, na które działano tTNFR-l 2^/Ο05όΚ
Wszystkie preparaty są immunogenne u pawianów. Jednak częstość immunogenności jest większa u pawianów na które działano sTNFR-I 4D/C105db, pośrednia - u zwierząt, pa które działano sTNFR-I 3D/C105dU, i najniższa - u zwierząt na któro działano sTNFR-I 2.6D/C105dU (tabela 8).
189 309
Tabela 8:
Maksymalne reakcje na przeciwciaSa θ
Pierwsze 21 dni Drugie 21 dni
mediana 25%-27% mediana 25%-75%
sTNFR-I 4D/C105dC (n=4) 3,20 3,20 3,20 3,95 3,50 4,40
sTNFR-I 3D/C105dC (n=4) 1,60 0,00 3,65 3,50 1,30 4,75
sTNFR-I 2.6D/C105db (n=4) 0,00*) 0,00 1,75 1,45 0,00 3,50
skala logarytmiczna (odwektąe ęozcijńcoeąie osocza niezbędne do uzyskania półmaksymalnej aCsoęCancj! na saądwicok ELISA; patrz: Experimental Methods) +) p=0,056, ANOVA - analiza dwustronna, wg Kruskal-Wallis (wartości przekształcone logarytmicznie me spełniły testu ąkr'maląkśyi)
Reakcje na przeciwciała w ogólnym przypadku rozwijają się około 8 dnia po podaniu koąstęuktów i są obecne przez okres 21 dni badania. Ponadto, reakcje na przeciwciała mają tendencję być silniejsze podczas reakcji na drugą iąjjkcję kknstękktów proteinowych.
Wszystkie cztery pawiany otrzymujące sTNFR-I 4D/C105db rozwinęły przeciwciała, dwa z czterech zwierząt otrzymujących sTNFR-I 3D/C105dC rozwinęły przeciwciała, oraz jedno z czterech zwierząt otrzymujące sTNFR-I 2.6D/C105dC rozwinęło przeciwciała. Według analizy waęiaącyjnej (ANOVA) wg Keuskall-Wallis wielkość reakcji na przeciwciało (transformowanej logarytmicznie) jest znacząco różna dla trzech grup w funkcji czasu (p<0,05). Analiza „pkst-hoy” sugeruje, ze znacząca różnica w reakcjach na przeciwciało zasadniczo występuje między zwierzętami otrzymującymi sTNFR-I 4D/C105db i sTNFR-I 2.6D/C105db przy pośrednich (i nieząaczących) reakcjach w przypadku zwierząt, na które działano sTNFR-I 3D/C105dC.
Została zaobserwowana zależność korelacyjna między rozwojem przeciwciał i zmianą w usuwaniu między dwoma, 21-dniowymi badaniami (p<0,01). Nie jest to nieoczekiwane, ze u tych zwierząt, które rozwijają silną reakcję przeciwciał po pierwszym podaniu konstruktu, proteina jest usuwana szybciej niż po drugim podaniu. Zmiana w usuwaniu między pierwszą a drugą iniekcją jest porównywana między zwierzętami, które rozwinęły reakcję przeciwciał (n=7) a tymi, które jej nie rozwinęły (n=5) (rysunek fig. 13).
Przeciwciała wykrywane w plazmie pawianów ocenia się u wybranej liczby zwierząt na bezpośrednią cytotoksyczność w stosunku do linii komórkowej ME-180 i na zdolność do neutralizacji w próbie L-929. Nie zaobserwowano cytotoksycząośyi ani neutralizacji w przypadku przeciwciał wytwoęzoąyyh względem któregokolwiek z tych kkąsteuktów.
W części A fazy I badania pawianów zwierzęta, które rozwinęły najsilniejsze reakcje przeciwciał także wykazywały najszybszy wzrost usuwania koąsteuktów po ich drugim podaniu. Przeto, takie ustalenia sugerują, że reakcje przeciwciała mogą zmniejszyć biologiczny czas półtrwania i tym samym może być dobór skuteczności terapeutycznej koąsteuktów i dostosowanie dawki. Jednak nie stwierdzono jakiejkolwiek niekkroystąej reakcji klinicznej na obecność przeciwciał, gdy koąstrukty Cyły podane po raz drugi. Zatem, starania terapeutyczne Cy zmodyfikować takie kkąsteukty w celu zmniejszenia immunogeąąości bez znaczącego wpływania na czas półtrwania Iub skuteczności są skierowane, w pierwszym rzędzie, raczej na zmniejszenie potrzeby zwiększania dostosowania dawki niż na ryzyko reakcji niekorzystnych.
Część 1 Faza B - wyniki:
Ostatecznie, w przypadku pawianów nie poddanych działaniu bodźca wszystkie trzy kknstękkty są nieomal jednakowo skuteczne w zapobieganiu urazowi po Cakteremii E. coli zachodzącemu za pośrednictwem yytokią w przypadku gdy są podawane w dawce 1,0 mg/kg SW. Jeden z czterech pawianów któremu podano placebo przeżył; 4 z 4 pawianów poddanych działaniu sTNFR-I 4D/C105dC- i sTNFR-I 3D/C105dC- przeżyły; i 3 z 4 pawianów poddane działaniu sTNFR-I 2.6D/C105db przeżyły odpowiednio. Wszystkie trzy koąsteukty zapobiegają Cikaktywąośyi TNFa i dostarczają nadmiarową zdolność do neutralizacji.
189 309
Część II:
Szczególnym celem ozęśoi II badań u pawianów było określenie, ozy powtarzane wystamiadCp na działanie (tzn. 3 oddzielno iniekcje) zwierząt na różne kąnstrUkty sTNF-RI prowadzi do dalszej immudoaondości i obniżonych czasów półtrmadia. Ponadto, badanie to miało na celu porównanie immudągeddąści i farmakokinetyki szeregu podstruktów sTNF-R1, włączając w to sTNFR-I 2.6D/CI05ab; oraz sTNFR-I 4D/C105db; sTNFR-I 2.6D/N105-tBuPEG (33 kDa) oraz sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa). Ostatecznie, badanie to miało na celu ocenę znaczenia PlCniozdego reakcji przeciwciała, oraz zmianę usuwania w wyniku następczoj roakcji na uraz za pośrednictwem TNFa (baktoremia E coli).
W dniach 0, 21 oraz 42, aamiadąm podano dożylnie 0,2 mg/kg różnych kedstruktów (sTNFR-I 4D/C105db; sTNFR-I 2.6D/C105db; sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa); Iub sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa), odpomipddie). W dniu 63 pawiany otrzymały 2,0 mg/kg BW ich ądpąmioanCoh kądctrUktów. W dniu 65 (to znaczy 48 godzin później), pawianom podano dawkę śmiertelną E. coli jak eaisade powyżej w częśoi I. Główno ustalenia części II są następująco:
Wyniki (część II):
Zasadniczo, sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa); i sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) mają dłuższe czasy półtrwania niż TNFR-I 4D/C105db i sTNFR-I 2.6D/C105db u pawianów, nie poddanych działaniu bodźca dlpzależdie od liozby domon, czasy półtrwania sięgają od 30-35 godzin dla form sTNFR-I medepegylowadych w porównaniu z 10-20 godzinami dla dimeromyoh form peaylowanych. Ponadto, sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa) i TNFR-I 4D/C105db mają dłuższo czasy półtrwadia niż 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) i sTNFR-I 2.6D/C105db u pawianów nie poddanych działaniu bodźca.
sTNFR-I 4D/C105db i sTNFR-I 2.6D/CI05ab są również immunągodiczno, przy umiarkowanym trendzio w kierunku zmniejszonej immunoaeddośoi przy sTNFR-I 2.6D/C105db. Jednak tylko TNFR-I 4D/C105db wykazuje obniżone usuwanie przy powtarzanych podawaniach. sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa) i 2.6D/N 105-t-BuPEG (33 kDa) nie są ani antygenne, ani nio zmieniają znacząco ich szybkości usuwania przy powtarzanym podawaniu.
Surowica otrzymana z każdego pawiana (N=3) poddawanego działaniu różnych związków w dniach: 21, 42, i 61 została oceniona in vitro na immudąreaktymność (przez wychwyt sadamiczemy ELISA) względom innych kodstruktóm przez użycio różnych kodstruktów jako antygenu wychwytu. PrzykładowO, surowica otrzymana z pamiadóm, którym podawano 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) w 21 dniu (tabela 9) nio „reagowała” ani na sTNFR-I 4D/C105db, ani na sTNFR-I 4D/N105, gdy tp związki użyto na płytce ELISA jako antygen wychwytu.
Dodatnią reakcją jest reakcja przeciwciała przy mianie >1:400. Dano z dnia 42 i 61 podano w tabelach 10 i 11. Ważne jest, żo zachodzi dodatnia reakcja in vitro w przypadku surowicy uzyskanej z jednego pawiana, uprzednio poddanego działaniu 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa), gdy badano na antygen wychwytu sTNFR-I 4D/C105db (tabela 11).
W przypadku pawianów uprzednio wystawionych trzykrotnie na działanie kedstruktów, skuteczność reakcji na uraz za pośrednictwem TNFa jost największa w: (1) sTNFR-I 4D/C105db; (2) sTNFR-I 2.6D/C105db; (3) sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa); i (4) 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) (jak określono przez przeżycie, niemyaąldość organów wielosystememych (MSOF), reakcję IL-6 i WBC surowicy). „Ostrzeżenie” jest takie, że badanie to nip rozpatruje różnic w zdolności neutralizowania TNF różnych kodstruktów.
i89 309
Tabela 9
Reakcja przeciwciała pawianów IgG (miano > 1:400) dzień 21
Ilość zwierząt- n=3 sTNFR-I 2 6D/C105db sTNFR-I 2 6D/N105- t-BuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/N105-1- BuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/C105db sTNFR-l 4D/N3105
sTNFR-I 2 6D'N105-1BuPEG (33 kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/C105db 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I 4D/N105-tBuPEG (33 kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33 kDa)
sTNFR-l 4D/C105db 1/3 react (400) 3/3 neg
T abela 1·
Reakcja przeciwciała pawianów IgG (miano > 1 · 400) dzień 42
Ilość zwierząt- n=3 sTNFR-I 2.6D/C105db sTNFR-l 2 6D/N105- t-BuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/N105-t- BuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/C105db sTNFR-I 4D/N3105
sTNFR-l 2.6D/N105-tBuPEG (33 kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-l 26D/C105db 1/3 react (1600) 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I 4D/N105-t- BuPEG (33 kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33 kDa)
sTNFR-I 4D/C105db 2/3 react (3200) 2/3 react (800)
I89 309
Tabela 11:
Reakcja przeciwciała pawianów IgG ( miano > 1 : 400) dzień 61
Ilość zwierząt' n=3 sTNFR-I 2.6D/C105db sTNFR-I 2.6D/N105t-BuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/N105-t- BuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33 kDa) sTNFR-I 4D/C105db sTNFR-I 4D/N3105
sTNFR-I 2 6D/N105-tBuPEG (33 kDa) 3/3 neg 1/3 react (1600) 3/3 neg
sTNFR-I 2 6D/C105db 2/3 react (204800) 1/3 react (1600) 1/3 react (3200)
sTNFR-I 4D/N105-tBuPEG (33 kDa) 3/3 neg 1/3 react (6400) 1/3 react (6400)
sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33 kDa)
sTNFR-I 4D/C105db 1/3 react (3200) 3/3 react (800)
C. Szympansy:
Celem tego badania jest ocena immunogeniczności różnych form sTNF-R1, które są wielokrotnie wstrzykiwane drogą dożylną szympansom przez okres 1 miesiąca. Formami sTNF-R1 poddanymi badaniom w tych badaniach są: sTNFR-I 2.6D/C105db; sTNFR-I 4D/C105db; sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33 kDa); sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPET (33 kDa); i sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG (33 kDa). W każdej badanej grupie są łącznie 3 szympansy.
Tryb i parametry dawkowania w tym badaniu są następujące: Każdy szympans otrzymuje badaną substancję w postaci dożylnej iniekcji przy 0,1 mg/kg, dwukrotnie w tygodniu, w poniedziałki i piątki przez 4 tygodnie (w sumie 8 dawek). Objętość dawki jest zmienna, w zależności od stężenia dostarczanej substancji badanej. Z każdego zwierzęcia pobiera się 5-cio mililitrową próbkę surowicy w dniu „0” przed badaniem. Dodatkowe próbki surowicy pobiera się bezpośrednio przed podaniem leku w dniach: 7, 14, 21, i 28.
Dane immunogenności szympansów przedstawiono w tabeli 12.
Do dnia 28 u wszystkich zwierząt (N=3), na które działano albo sTNFR-I 4D/C105db, albo sTNFR-I 2.6D/C105db zaobserwowano dodatnią reakcję (zmierzoną przez ELISA), przy czym największe zaobserwowane miano wyniosło, odpowiednio, 1:12.800 Iub 1:3200 (tabela 12).
(Uwaga: w tej części eksperymentu wszystkie antygeny „immunizujące” są stosowane jako odpowiednie antygeny wychwytu immobilizowane na płytce ELISA).
Jedno ze zwierząt, na które działano sTNFR-I 4D/Cl05-t-BuPET (33 kDa) Iub sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG (33 kDa) wykazało dodatnią reakcję przeciwciała w dniach 21 i 28 (tabela 12). Ważne jest to, ze u żadnego ze zwierząt, na które działano sTNFR-I 4D/C105-tBuBEG (33 kDa) Iub sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPET (33 kDa) nie zaobserwowano wykształcenia się przeciwciał anty-sTNFR-I podczas eksperymentu (tabela 12).
Jak opisano w dziale eksperymentalnym dotyczącym pawianów, surowicę otrzymaną z każdego z szympansów (N=3), na które podziałano różnymi formami sTNF-R1 w dniach 28 oceniono in vitro na immunoreaktywność (za pomocą ELISA) względem innych konstruktów przez użycie form sTNF-R1 jako antygenu wychwytu. Reakcja dodatnia to reakcja antygenu przy mianie > 1:400. Ważne jest to, ze surowica otrzymana z szympansów, którym podawano sTNFR-I 2.6D/105N-t-BuPEG (33 kDa) nie „reagowała” z żadnym z sTNFR-I 4D/C105db; sTNFR-I 4D/N105, z sTNFR-I 4D/C105db; sTNFR-I 4D/N105, gdy związki te stosowano na płytkach ELISA jako antygen wychwytu (tabela 13).
199 099
Zaobserwowano to również w przypadku zwierząt, na które działano sTNFR-I 4D/C105db; sTNFR-1 4D/C105-t-BnPEG (33 kDa), lub sTNFR-1 4D/N105db-t-BnPEG (33 kDa) (tabela 13).
Tabela 12:
Wyniki przeciwciał Miano IgG (ilość zwierząt)
Dzizń „0” (dawka wstępna) Dzień 7 (2 dawki) Dzień 14. (4 dawki) Dzizń 21 (6 dawek) Dzień 28 (8 dawek)
sTNFR-I 2 6D/C106db 100(1) 400(1) 1600 (1) 3200(1) 800 (1) 3200 (2)
sTNFR-l 4D/C105db 3200(1) 400(1) 16^0(1) 800 (2) 12800 (1)
sTNFR-I 4D/N105-t- BuPEG (33 kDa)
sTNFR-I 2.6D/N105-tBuPEG (33 kDa) 200 (1)* 1600(1)
sTNFR-l 4D/N105-tBuPEG (33 kDa) 100(1)* 400(1)
♦Uwaga Miana uzyskane przy zastosowaniu sTNFR-1 4D/C105db jako antygenu wychwytu
Tabela 13:
Wyniki przeciwciał u szympansów IgG (Miano > 1:400)
Ilość zwierząt: n=3 sTNFR-1 2 6D/C105db sTNFR-1 2 6D/N105-tBuPEG (33 kDa) sTNFR-1 4D/N105-t- BuPEG (33 kDa) sTNFR-1 4D/C105-tBuPEG (33 kDa) sTNFR-1 4D/C105db sTNFR-1 4D/N105
sTNFR-I 2 6D/N1054BuPEG (33 kDa) 3/3 neg 3/3 neg 3/3 neg
sTNFR-I 2.6D/C105db 3/3 react (3200) 2/3 react (3200) 1/3 react (400)
sTNFR-I 4D/N105-t- BuPEG (33 kDa) 3/3 neg 2/3 react (1600) 2/3 react (3200)
sTNFR-I 4D/C105-tBuPEG (33 kDa) 3/3 neg 1/3 react (400) 3/3 neg
sTNFR-I 4 D/Cl 05 db 3/3 react (12800) 3/3 react (6400)
189 309
Przykład IV
EAE jest to ostra lub przewlekła, zapalna choroba demielinująca CNS (OUN) wynikająca z uczulenia podatnych genetycznie zwierząt na neuroantygeny takie, jak zasadnicza proteina mielinowa (MBP). EAE jest uznanym wedle stanu techniki i często stosowanym modelem zwierzęcym dla ostrego, ludzkiego MS.
Samice szczurów Lewisa (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) znieczulono i immunizowuno w dniu „0” w lewą tylną łapę przy użyciu 0,1 mL emulsji zawierającej zasadniczą proteinę mielinową w kompletnym adjuwancie Freunds'a rozpuszczonym w roztworze soli buforowanym fosforanem (PBS) z równą objętością kompletnego adjuwantu Freunds'a (CFA) zawierającego 5 mg/mL Mycobacterium tuberculosis H37Ru (Difco Lab MI). Szczury kontrolne otrzymały 0,1 mL emulsji PBS/CFA bez MBP stopę lewej tylnej łapy.
Ocena choroby klinicznej jest oparta nu konwencjonalnej skali punktacji 0-5. ZUkres jest następujący: 0 - normalne; 0,5 - częściowa utrata napięcia ogona; 1 - pełna utrata napięciu ogona; 2 - ciągnięcie jednej tylnej łapy; 3 - paraliż obu tylnych łap; 4 - stan niewydolności; 5 - śmierć. Wszystkie iniekcje konstruktów sTNFR-I lub zarobki podano przy 1 mg/kg S.C. co drugi dzień poczynając od 9 dnia po immunizacji. Wszystkie zwierzęta zakończono 21 dnia. Wyniki przedstawiono w dwóch postaciach - w skali ostrości klinicznej jako funkcji czasu oraz zintegrowany wynik kliniczny dla każdego szczura przez cały okres choroby, obliczony jako pole powierzchni pod krzywą dziennego wyniku klinicznego względem czasu. Wartości badanych grup dla zintegrowanego wyniku klinicznego porównano statystycznie względem wyników uzyskanych dla grupy kontrolnej stosując test Mann'a-Whitney'a.
Zwierzęta, na które działano samą zaróbką miały początek choroby około dnia 10, maksimum choroby dnia 16, a następnie stan chorobowy opadał. sTNFR-I 4D/C106db osłabiał objawy kliniczne o około 73% w porównaniu do zwierząt, którym podawano zaróbkę. sTNFR-I 4D/C-05-t-BuPEG (33 kDa) również osłabia objawy kliniczne o około 85%. sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG (33 kDa) i sTNFR-I 2.6DN105-t-BuPEG (33 kDa) mają równą siłę działania pod względem osłabiania objawów klinicznych (odpowiednio 64 i 57%).
W konkluzji, okazuje się, że obcięte sTNFRs są skuteczne w pośredniczeniu w niektórych następstwach klinicznych w tym modelu zwierzęcym MS.
Podczas gdy obecny wynalazek opisano wyżej zarówno ogólnie jak i w kategoriach korzystnych wykonań należy rozumieć, że biegli w sztuce mogą na podstawie powyższego opisu przewidzieć inne warianty i modyfikacje.

Claims (46)

1. Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (obcięty sTNFR) obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
Ri-[Cys19-Cys'03]-R2, w którym i o* i m [Cys -Cys ] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH oraz jego warianty i pochodne.
2. Obcięty sTNFR według zastrz. 1, znamienny tym, że jest wybrany z grupy obejmującej: sTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys’9-CyslW]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYHPQNNSIC-rCys-Cysi°3]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys -Cys^-FN-COOIl, sTNFR-I 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys-Cys1°3]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19-Cys1°3]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3D/d18NH2-M-[Cys19-Cys103]FNCSL-COOH.
3. Obcięty sTNFR według zastrz. 1, znamienny tym, że na końcu karboksylowym jest sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny.
4. Obcięty sTNFR według zastrz. 1, znamienny tym, że wskazana sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR jest nieglikozylowana.
5. Obcięty sTNFR według zastrz. 1, znamienny tym, że wskazana sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR jest glikozylowana.
6. Obcięty sTNFR według zastrz. 1, znamienny tym, że obcięty sTNFR jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem.
7. Obcięty sTNFR według zastrz. 6, znamienny tym, że rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy
8. Wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), znamienna tym, że obejmuje co najmniej jeden obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
Rr[CyŁs19-CysH)3]-R2, w którym [Cys19-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne.
9. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, ze obejmuje obcięty sTNFR wybrany z grupy, do której należą: sTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[CysH9 -CysH-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cys1<)3J189 309
-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGICYHPQNNSIC-[Cysi9-Cys103]FN-COOH, sTNFR-I 2.3D/C8 NH2- MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys1()3]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.3D/d15 NH2-MSlS-[Cys'9-CysK)3]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3D/d18 NH2-M-[Cys19-Cys1°3]- FNCSL-COOH.
10. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, że obcięty sTNFR jest na końcu karboksylowym sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny.
11. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, ze wskazana sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR jest glikozylowana lub nieglikozylowana.
12. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, ze obcięty sTNFR jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym.
13. TNFbp według zastrz. 8, znamienna tym, że ma budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X- Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś
Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym sTNFR według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5.
14. TNFbp według zastrz. 13, znamienna tym, że rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy.
15. TNFbp według zastrz. 14, znamienna tym, że obcięty sTNFR ma budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X-Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylo sulfonem, zaś
Ra, Rb - każdy oznacza NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-CySi°3]-FC-COOH (określany także jako sTNFR-I 2.6D/C105) albo wzorem ogólnym
Ra-X-Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylo sulfonem, zaś
Ra i Rb - każdy oznacza NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi()3]-FNCSL-COOH (określany także jako sTNFR-I 2.6D/C106).
16. Polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następujący m wzorem:
R1-[Cys19-Cysrt)3]-R2, w którym [Cysi9-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCpQgKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną.
17. Polinukleotyd według zastrz. 16, znamienny tym, że posiada sekwencję kodującą obcięty sTNFR wybrany z grupy obejmującej: sTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cysi03 ]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NIró
-HDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cy'si9-Cysi03]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cys103]-FN-COOH, sTNFR-I 2.3D/d8 MU
-MYIHP^N^SIC-[Cys'i9-CysH)3]-^CSL-COOH, sTNFR-I 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys-CysW3]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3DM18 NH2-M-[Cysi9-Cys^°3]-FNCSL-COOH, bądź sekwencję do niej komplementarną.
18. Polinukleotyd według zastrz. 16, znamienny tym, że posiada sekwencję kodującą obcięty sTNFR sprzężony na końcu karboksylowym z częścią lub całością stałej domeny
189 309 ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, bądź sekwencję do niej komplementarną.
19. Polinukleotyd według zastrz. 16, znamienny tym, że ma sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących.
20. Wektor zawierający polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
R,-[Cys19-Cys1°3]-R2, w którym [Cys -Cys ] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
IR oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję.
21. Wektor według zastrz. 20, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR wybrany z grupy obejmującej: sTNFR 2.6D/C105 Nh2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys1°3]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2.103
MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys10,l-FNCSL-C:OOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2,Λ sTNFR-I 2.3D/d8 NH2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys'9-Cys^-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3D/d18 NH2-M^Cys^-Cys^-FNCSL-COOH, bądź sekwencję do niej komplementarną, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję.
22. Wektor według zastrz. 20 albo 21, znamienny tym, że zawiera polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR sprzężony na końcu karboksylowym z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, bądź sekwencję do niej komplementarną, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję.
23. Wektor według zastrz. 20, znamienny tym, ze zawiera polinukleotyd posiadający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję.
24. Prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
R1-[Cysi9-CySi°3]-R2,
-MDSVCPQGKYIHPÓNNSIC-[Cysi9-Cysi03]-FN-COOH, -MYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi03]-FNCSL-COOH, sTNFR-I w którym [Cys -Cys ] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących.
25. Sposób wytwarzania obciętego sTNFR, znamienny tym, że obejmuje
a) prowadzenie hodowli domórki gospodarza zawie rającej polinupleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
Ri-[Cys|9-Cys1°3]-R2, w którym
189 309 [Cys^-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
Ri oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYI'HPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących,
b) utrzymywanie komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego sTNFR przez te komórki gospodarza.
26. Sposób wytwarzania obciętego sTNFR, znamienny tym, że obejmuje
a) prowadzenie hodowli komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
R1-[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cysi9-Cys1()3] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO.2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCpQgKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących,
b) utrzymywanie komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego sTNFR przez te komórki gospodarza oraz
c) wyodrębnienie wytworzonego obciętego sTNFR.
27. Sposób według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, ze jako komórki gospodarza stosuje się komórki E coli.
28. Obcięty sTNFR będący rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
R,-[Cys19-Cysw3]-R2, w którym [Cysi9-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
Ri oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących,
29. Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję aktywną oraz nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienny tym, ze jako substancję aktywną stosuje się
a) obcięty sTITNR obejmujący strukturęokreśloną następującym wzorem:
R,-[Cys’1>-CysH)3]-R2, w którym [Cys’9-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt amiąkrwasowyyh odpowiada kolejności reszt aminorwasowyyh na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia pkrównaąia),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCpQgKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH
189 309 lub jego warianty i pochodne, albo
b) obcięty sTNFR będący rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
Rr[Cys19-Cysli)3]-R2, w którym [Cys19-CysK)3] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-l (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
Ri oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCpQgKYIHPQNNS1C, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, bądź
c) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejmującą co najmniej jeden obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
Ri-[Cysi9-CySD3]-R2, w którym [Cys -Cys ] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-l (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCpQgKYIHPQNNS1C, zaś
R2 oznacza, grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejmującą obcięty sTNFR wybrany z grupy, do której należą: sTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYlHPQNNSlC-[Cysrt9Cysi90]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYlHPQNNSlC-[Cysi9-CysK)0]-FNCSL-COOH, sTNFR-l 2.6D/N105 NIl2-MDSVCPQGKYlHPQNNSlC-[Cys19-Cys1l)3]-FN-C'OOH, sTNFR-l 2.3D/d8 NH2-MYłHPQNNSlC-[Cysr9-Cysi°0]-FNCSL-COOH, sTNFR-l 2.3D/d15 NH2-MSlS-[Cys19103 ]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-l 2.3D/d18 NH2 -M-[Cys19-Cysi°0]-FNCSL-COOH,
-Cys gdzie obcięty sTNFR jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, przy czym w proteinie TNFbp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR jest glikozylowana lub nieglikozylowana, i/lub wskazany obcięty sTNFR jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo
d) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp) mającą budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X-Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś
Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym sTNFR według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, oraz terapeutycznie skuteczną ilość wskazanej substancji aktywnej miesza się farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub substancjami pomocniczymi.
30. Kompozycja fsurnaceutyczna zzwierająca substancję aktywną oraz nrśnin iśluk suty stancje pomocnicze, znamienna tym, ze jako substancję aktywną zawiera
a) oł^c^ii^tty tTNFFR obeżmujący tttukturę okreźlonn naatępΐ-ϋιογm wzorem:
R1-[CysH’-Cysi°0]-R2, w którym [Cysi9-Cys1()3] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-l (którego schemat numeracji reszt amiaokwasowych odpowiada kolejności reszt amiaokwasowyzh na rysunku fig. 1 - SEQ lD NO:2, dla ułatwienia porównania),
189 309
Ri oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGK.YIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, albo
b) obcięty sTNFR będący rekombinacyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
Rr[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cysi9-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
31. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję aktywną oraz nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienna tym, ze jako substancję aktywną zawiera
a) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejmującą co najmniej jeden obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
R1-[Cys19-Cysi°3]-R2, w którym [Cys^-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCpQgKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejmującą obcięty sTNFR wybrany z grupy, do której należą: sTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi°3]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[CysI9-Cysi°3]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys1(,3]-FN-COOH, sTNFR-I 2.3D/d8 NH2-MYIHP^NNSIC-[Cys19-Cysi03]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys1919
103,
-Cysi03]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3D/d18 NH2 -M^Cys^-Cysi^-FNCSL-COOH, gdzie obcięty sTNFR jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny, przy czym w proteinie TNFbp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR jest glikozylowana lub nieglikozylowana, i/lub wskazany obcięty sTNFR jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo
b) wielowartościową proteinę wiążącą czynnik martwicy nowotworu (TNFbp) mającą budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X-Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś
Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest obciętym sTNFR według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4 albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
32. Kompozycja według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że zawiera kompozycję zapewniającą przedłużone uwalnianie substancji aktywnej.
33. Kompozycja według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że jest zliofilizowana.
189 309
34. Zastosowmie a) uTTOFR obejmcjąceką sjruktuek ouręślorrą nrntęąujuppm wzorem:
Rr[Cys19-CysH)3]-R2, w którym [Cys^-Cys’03] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwaskwych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego wariantów i pochodnych, albo
b) obciętego sTNFR będącego eekomCinacyjąym produktem ekspresji peokariotycząej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej ukliąuklśotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
RHCyACys^-R^ w którym [Cys^-Cys1^] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwaskwych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH 2-MDSVCpQgKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, bądź
c) wielowsetolyikwej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), obejmującej co najmniej jeden obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
^-^1^1°3]¾ w którym [Cys^-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwaskwych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCpQgKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, a w szczególności obejmującej obcięty sTNFR wybrany z grupy, do której należą: sTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysn)3]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi°3]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys-Cys1()3]-FN-COOH, sTNFR-I 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cysr9-Cysi°3]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.3D/d15 NH2 -MSIS-[Cys19-Cysi°3]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3D/d18 NH2-M^Cys^-Cys^j-FNCSL-COOH, gdzie obcięty sTNFR jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immknkglobkliąy, przy czym w proteinie TNFCp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR jest glikozylowana lub nieglikozylowana, i/lub wskazany obcięty sTNFR jest sprzęż zony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo
d) wielowaetolciowej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNFbp) mającej budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X-Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś
Rs i Rc są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kkwalentniś związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z podstawników Rs i Re jest obciętym sTNFR według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy,
189 309 do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób mediowanych przez czynnik martwicy nowotworu - TNF.
35. Zastosowanie a) obciętego sTNFR obejmująceują serukturu okrę śloną następająęym wzorem:
103n
Rr[Cys19-Cysm3]-R2, w którym [Cysi9-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w oUsiętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwanowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zoś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego wariantów i pochodnych, albo
b) obciętego sTNFR będącego reOomUipasyjnym produktem ekspresji prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza zawierającej polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną, następującym wzorem:
Rr[Cys19-Cys103]-R2, w którym [Cys^-Cys1^] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminakwasowysh odpowiada kolejności reszt amipokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, bądź sekwencję do niej komplementarną, korzystnie mający sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także tę sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących, bądź
c) wielowartościowej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (TNI-Fp), obejmującej co najmniej jeden obcięty sTNFR obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
,103η
R^Cy^-Cys^J-R^ w którym [Cysi9-Cys103] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminakwasowysh odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 ozpoczo grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zoś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH lub jego warianty i pochodne, o w szczególności obejmującej obcięty sTNFR wybrany z grupy, do której należą: tTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys1^)3]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIPiPQNNSIC-[C^ 9-CysKn]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2-MDSVCPQGKYlHPQNNSIC-[Cyn1’-Cysv®3]-bN-COOH, sTNFR-I 2.3D/d8 Od^2-MYIl·^PQNNSICT[Cys-Cytl03]-bNCSL-COOH, sTNFR-I 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys19-CysI03]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3D/d18 NH2-M^Cys^-Cys^]-FNCSL-COOH, gdzie obcięty sT^R jest na końcu karboksylowym ewentualnie sprzężony z częścią lub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunogloUuliny, przy czym w proteinie TNFbp, wskazana wyżej sekwencja aminokwasów obciętego tTNFR jest glikozylowapa lub pieglikozylawαna, i/lub wskazany obcięty sT^R jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem, korzystnie z glikolem polietylenowym, albo
d) wielawarSaściowej proteiny wiążącej czynnik martwicy nowotworu (T^Ep) mającej budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X-Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś
189 309
Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, przy czym co najmniej jeden z pedctewdiPóm Ra i Rb jest obciętym sTNFR według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, gdzie korzystnie rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy, albo o) kompozycji fary^iiceutm^^r^t^j zavderajacej r^sjan^ę aatywną okrc)loep w'punkmea) albo b), albo c), albo d), ewentualnio zamierającoj kompozycję zapewniającą przedłużone uwalnianie substancji aktywnej lub mającej formę liofilizowaną do wytwarzania środka leczniczego do leczenia cukrzycy, przeczulicy bólowej, choroby zapalnej jelit, urazu nieaokrwieddpae, urazu związanego z reperfiarąlub choroby reumatycznej.
36. Zastosowanie według zastrz. 35, znamienne tym, ze choroba reumatyczna jest wybrana z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, zapalenie kości i stawów, młodzieńcze (reumatoidalne) zapalonie stawów, zesztywniające zapalenio stawów kręgosłupa, zapalenie skórdo-mięśniąwe, łuszczycowe zapalenie stawów, twardzina skóry, syndrom Sjogrena oraz zapalenie naczyń.
37. Zastosowanie wodług zastrz. 34 albo 35, albo 36, znamienne tym, żo wytwarzany środek ma postać odpowiednią do podawania dożylnego, domięśniowego, śródskórnege, podskórnego, dąctewomego lub przez infuzję.
38. Zastosowanie według zastrz. 34 albo 35, albo 36, znamienne tym, żo wytwarzany środek ma postać odpowiednią do stosowania ze środkiem atzeciwzepalnym.
39. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, żo środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej diosteroidome leki przeciwzapalne (NSAIDs), kortykoctereidy, powolnie działające leki przeciwreumatyczno (SAARDs) lub leki modyfikująco chorobę (DM).
40. Zastosowanie wodług zastrz. 38, znamienne tym, że środkiem przeciwzapalnym jest inhibitor interleukiny-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ra) oraz rozpuszczalny receptor IL-1.
41. Zastosowanie według zastrz. 38, znamienne tym, ze środkiem przeciwzapalnym jest mototteksat.
42. Kompozycja earmacoutyczde według zastrz. 30 albo 31, znamienna tym, że dodatPowo zawiera środek przeciwzapalny.
43. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 42, znamienna tym, zo środek przeciwzapalny jest wybrany z grupy obejmującej niosteroiaowp leki przociwzapalne (NSAIDs), kortykąstptoidy, powolnie działające loki przeciwreumatyczne (SAARDs) lub loki modyfikujące chorobę (DM).
44. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 43, znamienna tym, że środkiem przeciwzapalnym jest metotroksat.
45. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 42, znamienna tym, ze środkiem przeciwzapalnym jest inhibitor idtetleuPidy-1 (IL-1) wybrany z grupy obejmującej antagonistę receptora IL-1 (IL-1ra) oraz rozpuszczalny receptor IL-1.
46. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 45, znamienna tym, żo IL-1ra zemipre sekwencję ludzkiego IL-1ra.
Przedmiotom wynalazku jest obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (sTNFR), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), pelinuklρątyd posiadający sekwencję kodującą sTNFR, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania sTNFR, kompozycja farmaceutyczna, sposób joj wytwarzania oraz zastosomadio sTNFR do wytwarzania środka leczniczego. Wynalazek związany jest ze zwalczaniem stanów zapalnych.
Stan zapalny jost reakcją obronną organizmu na urazy takie, jak wywołane przez uszkodzenie mechaniczne, infekcję Iub stymulację antygenem. Reakcja zapalna może być wyrażana patologicznie, gdy zapalenie jest wywołane przez nipeapowipani bodziec taki, jak euteadty199 099 gen, jest wyrażana w sposób wyolbrzymiony lub trwa długo po usunięciu czynników urazowych. Taka reakcja zapalna może obejmować wytwarzanie pewnych zytzkia.
O ile etiologii skniu sapaunego jnzt żak dotąd s^d rozumiana, zmazącą porcję 01^macji uzyskano ostatnio odnośnie molekularnych aspektów zapalenia. Badania te doprowadziły do identyfikacji pewnych cynkin, o których uważa się, że odgrywają maczną rolę w pośredniczeniu zapaleniu. Cytokiny są zzwnutrndomórkowymi proteinami modyfikującymi zachowanie komórzk, szczególnie tych komórek, które znajdują się w bezpośrednim obszarze syntezy i uwalniania zytokia. Czynniki martwicy nowotworu (TNFs) są klasą zytzkia wytwarzanych przez licznz typy komórek, w tym mzaocyty i makrofagi.
Dotychczas opisano przynajmniej dwa TNFs, mianowicie TNF alfa (TNF-α) i TNF beta (TNF-β lub limaotzkayna) i każdy z nich jest aktywny jako cząsteczka trimeryczna. Uważa się, żz TNF inicjuje sygnalizację komórkową za pośrednictwem receptorów sieciujących (Engelmann i wsp. (1990), J Biol Chem., 265: 14497-14504).
Szereg dowodów wskazuje na to, że TNF-α i TNF-β są głównymi cytzkinαmi zapalnymi. Te znane TNFs wywierają ważny wpływ fizjologicmy na szereg różnych komórek docelowych związanych z reakcjami zapalnymi na szereg bodźców takich, jak infekcja i uraz. Proteiny te powodują, żz zarówno fibroblasty jak i komórki syaowialae wydzielają utajoną kzlαgenazę i prostygjadyaę E2 i powodują, ze komórki zstzocytowe stymulują resorpcję kości. Proteiny te zwiększają właściwości adhezyjne powierzchni komórek śródbłzadzwyzh w stosunku do neutrofili. Powodują one również, że komórki śródbłzadzwe wydzielają aktywność koagulującą oraz zmniejszają ich zdolność do lizy klotów. Ponadto przzkiernadzwnją aktywność adypocytów z przechowywania lipidów przez inhibitowanie ekspresji enzymu lipazy lipoprzteiaowzj. TNFs powodują także, że hepatocyty syntezują klasę protein znaną jako „reagenty ostrej fazy”, które działają na podwzgórze jako pirzgzay, tj. substancje gorączkztwórzne (Selby i wsp., (1988), Lancet, 1(8583):483: Starnes, Jr. i wsp. (1988), J Clin Invest, 82:1321; Oliff i wsp. (1987), Cell, 50: 555; i Waage i wsp. (1987), Lancet, 1f8529):355). Ponadto, wyniki badań przedkliaSczaych na różnych predykcyjnych modelach zwierzęcych zapalenia, włączając w to reumatoidalne zapalenie stawów, sugerują że inhibitowanie TNF może mieć znaczny wpływ na postęp choroby i jej ostrość (Dayer i wsp. (1994), European Cytokine Network, 5(6):563-571 iFejdmyan i wsp., (1995), Annals Of The New York Academy Of Sciences, 66:272-278). Ponadto ostatnie wstępne badania kliniczne na ludziach w renmatoidajaym zapaleniu stawów z inhibitorami TNF wykazały obiecujące rezultaty (Rankin i wsp. (1995), British Journal OO Rheumatology, 3(4): 4334-4342; Elliott i wsp. (1995), Lancet, 344:1105-1110; Tak i wsp. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1077-1081; oraz Paleolog i wsp. (1996), Arthritis and Rheumatism, 39:1082-1091).
Inhibitory proteinowe TNF ujawaiznz w stanie techniki. Dokument EP 308 378 podajz, ze proteina pochodząca z moczu chorych z gorączką ma aktywność inhibitującąTNF. Wpływ tej proteiny wynika przypuszczalnie z mechanizmu konkurencji na poziomie receptorów. Dokument EP 308 378 ujawnia proteinę wystarczająco czystą aby mogła być zcharaktzryzowαaa poprzez jej N-koniec. Źródło to jednak nie podaje jakiejkolwiek sekwencji DNA ani inhibitora TNF wytworzonego rekombinazyjaie.
lnhibitory TNF wytworzone rekombiaαcyjaSe są również znane w staniz techniki. Przykładowo, dokumenty EP 393 438 i EP 422 339 opisują sekwzncjz aminokwasów i kwasów nukleinowych dojrzałego, rzkzmbinazyjaego ludzkiego „inhibitora TNF o 30 kDa” (określanego również jako receptor p55 oraz jako sTNFR-l) oraz dojrzałego, rekzmbinαcyjaego „ludzkiego inhibitora o 40 kDa” (określanego również jako receptor p75 oraz jako sTNFR-ll), jak również ich zmodyfikowanych form, przykładowo fragmentów, funkcjonalnych pochodnych i odmian. Dokumenty EP 393 438 i EP 422 399 ujawniają także sposoby wyodrębnienia genów odpowiedzialnych za kodowanie inhibitorów, klonowania genów w odpowiednich wektorach i typach komórek, oraz ekspresji genu w celu wytworzenia inhibitorów. Wykazano, ze dojrzały rekombinazyjay ludzki inhibitor TNF o 30 kDa i dojrzały rekombinacyjay ludzki inhibitor TNF o 40 kDa jest zdolny do iahSbitowanSa TNF (EP 393 438, EP 422 339, publikacja PCT nr WO 92/16221 i publikacja PCT nr WO 95/34326).
sTNFR-l i sTNFR-II są członami superrodziny receptorów TNF i czynnika wzrostu nerwów, która obejmuje receptor czynnika wzrostu nerwu (NGF), antygen CD40 komórki B, i2 i89 309
4-1BB, antygen MRC 0X40 szczurzej komórki T, antygen Fas, i antygeny CD27 i CD30 (Smith i wsp., (1990), Science, 248:1019-1023). Najbardziej utrwaloną cechą spośród tej grupy powierzchniowych receptorów komórki jest zewnątrzkomórkowy obszar wiązania ligandu bogaty w cysteinę, który można podzielić na cztery powtarzające się motywy o około 40 aminokwasach i który zawiera 4-6 reszt cysternowych w pozycjach, które są dobrze zachowane. (Smith i wsp., (1990), jak wyżej).
Dokument EP 393 438 mówi dalej o Δ51 inhibitora TNF o 40 kDa i Δ53 inhibitora TNF o 40 kDa, które są obciętymi wersjami rekombinacyjnej proteiny inhibitora TNF o 40 kDa o pełnej długości, w których odpowiednio 51 Iub 53 reszty aminokwasowe na karboksylowym końcu dojrzałej proteiny zostały usunięte. Zgodnie z tym specjalista w tej dziedzinie techniki może ocenić, że czwarta domena inhibitora TNF o 30 kDa, jak również inhibitora o 40 kDa nie jest niezbędna dla inhibitowania TNF. W istocie, różne grupy potwierdziły takie stanowisko. Wytworzono pochodne inhibitorów TNF o 30 kDa i 40 kDa z delecją domen i pochodne te bez czwartej domeny zachowują pełną aktywność wiązania TNF, podczas gdy pochodne odpowiednio bez pierwszej, drugiej Iub trzeciej domeny - nie zachowują aktywności wiązania TNF. (Corcoran i wsp. (1994), Eur. J. Biochem., 223:831-840: Chih-Hsueh i wsp. (1995), The Journal of Biological Chemistry, 270(6):2874-2878: i Scallon i wsp. (1995), Cytokinę, 7(8):759-770).
Wskutek stosunkowo niskiego inhibitowania cytotoksyczności wykazywanego przez inhibitor TNF o 30 kDa i inhibitor TNF o 40 kDa (Butler i wsp. (1994), Cytokine, 6(6):616623), różne grupy wytworzyły dimery protein inhibitora TNF (Butler i wsp. (1994), jak wyżej; i Martin i wsp. (1995), Exp. Neurol., 131:221-228). Jednakże dimery mogą wywoływać reakcję przeciwciała (Martin i wsp. (1995), jak wyżej; oraz Fisher i wsp. (1996), The New England Journal of Medicine, 334(26): 1697-1702).
Celem wynalazku jest dostarczenie funkcjonalnie aktywnych obciętych sTNFRs. Ten oraz inne cele obecnego wynalazku będą widoczne z poniższego opisu.
Wynalazek obejmuje obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (obcięty sTNFR) obejmujący strukturę określoną następującym wzorem:
R1-[Cysi9-Cys1,3]-R2, w którym [Cys -Cys ] oznacza reszty od 19 do 103 w obciętym sTNFR typu-I (którego schemat numeracji reszt aminokwasowych odpowiada kolejności reszt aminokwasowych na rysunku fig. 1 - SEQ ID NO:2, dla ułatwienia porównania),
R1 oznacza grupę o wzorze NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC, zaś
R2 oznacza grupę o wzorze -FN-COOH oraz jego warianty i pochodne.
Korzystnie, obcięty sTNFR według wynalazku jest wybrany z grupy obejmującej: sTNFR 2.6D/C105 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys-Cysf°3]-FC-COOH, sTNFR 2.6D/C106 NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cys'03 ]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.6D/N105 NH2 -MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys1°3]-FN-COOH, sTNFR-I 2.3D/d8 NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys-Cysi03]-FNCSL-COOH, sTNFR-I 2.3D/d15 NH2-MSIS-[Cys’9-Cysi°3]-FNCSL-COOH oraz sTNFR-I 2.3D/d18 NH2-M-[Cysi9-Cysw3]-FNCSL-COOH.
Korzystnie, wyżej określony obcięty sTNFR jest na końcu karboksylowym sprzężony z częścią Iub całością stałej domeny ciężkiego Iub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny.
Korzystnie, wskazana sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR nie jest glikozylowana.
Alternatywnie, wskazana sekwencja aminokwasów obciętego sTNFR jest glikozylowana.
Korzystnie, obcięty sTNFR według wynalazku jest sprzężony z rozpuszczalnym w wodzie polimerem. Korzystnym rozpuszczalnym w wodzie polimerem jest glikol polietylenowy.
Wynalazkiem objęta jest również wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), cechująca się tym, że obejmuje co najmniej jeden obcięty sTNFR określony wyżej.
i89 309 i3
Korzystnie, TNFbp według wynalazku zawiera dimer obciętego sTNFR, sprzężonego na końcu karboksylowym z częścią Iub całością stałej domeny ciężkiego lub lekkiego łańcucha ludzkiej immunoglobuliny.
Korzystnie, TNFbp według wynalazku ma budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X- Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest rozpuszczalnym w wodzie polimerem, zaś
Ra i Rb są biologicznie aktywnymi cząsteczkami kowalentnie związanymi ze wskazanym rozpuszczalnym w wodzie polimerem, gdzie co najmniej jeden z podstawników Ra i Rb jest wyżej określonym obciętym sTNFR.
Korzystnie, w TNFbp według wynalazku rozpuszczalnym w wodzie polimerem stanowiącym część linkera jest glikol polietylenowy.
Korzystnie, w TNFbp według wynalazku obcięty sTNFR ma budowę określoną wzorem ogólnym
Ra-X-Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylosulfonem, zaś
Ra i Rb - każdy oznacza NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cysi9-Cysi°3]-FC-COOH (określany także jako sTNFR-I 2.6D/C105) albo wzorem ogólnym
Ra-X- Rb, w którym:
X zawiera linker, gdzie ów linker jest PEG-20.000-bis-winylosulfonem, zaś
Ra i Rb - każdy oznacza NIT-MDSVCPQGKYIfffQNNSIC-[Cysi9-Cysi°3]-FNCSLCOOH (określany także jako sTNFR-I 2.6D/C106).
Wynalazek obejmuje także polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą obcięty sTNFR określony wyżej lub sekwencję komplementarną względem niej.
Korzystnie, polinukleotyd według wynalazku ma sekwencję kwasu nukleinowego wybraną z grupy obejmującej sekwencje przedstawione na rysunku fig. 2, 3, 4, 5, 6 i 7, a także te sekwencję o zdegenerowanych obszarach kodujących.
Wynalazek obejmuje także wektor zawierający polinukleotyd określony wyżej, operacyjnie przyłączony do sekwencji kontrolującej ekspresję.
Wynalazkiem objęta jest również prokariotyczna lub eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca polinukleotyd określony wyżej albo wektor zawierający taki polinukleotyd.
Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania obciętego sTNFR, polega na tym, ze obejmuje prowadzenie hodowli komórki gospodarza określonej wyżej, utrzymywanie komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego sTNFR przez te komórki gospodarza oraz ewentualnie wyodrębnienie wytworzonego obciętego sTNFR.
W sposobie według wynalazku, jako komórkę gospodarza stosuje się komórkę E coli. Korzystnie, jako komórki gospodarza stosuje się E. coli.
Korzystnie w sposobie wytwarzania obciętego sTNFR, według wynalazku wyodrębnia się następujące etapy:
a) etap prowadzenia hodowli prokariotycznej lub eukariotycznej komórki gospodarza określonej wyżej,
b) etap utrzymywania komórek gospodarza w warunkach pozwalających na ekspresję obciętego sTNFR przez te komórki gospodarza oraz
c) ewentualnie etap wyodrębnienia wytworzonego obciętego sTNFR.
PL97331240A 1996-07-09 1999-01-05 Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (sTNFR), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą sTNFR, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania sTNFR, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie sTNFR do wytwarzania środka leczniczego PL189309B1 (pl)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US2144396P 1996-07-09 1996-07-09
US3253496P 1996-12-06 1996-12-06
US3773797P 1997-01-23 1997-01-23
US3931497P 1997-02-07 1997-02-07
US3979297P 1997-03-04 1997-03-04
PCT/US1997/012244 WO1998001555A2 (en) 1996-07-09 1997-07-09 Truncated soluble tumor necrosis factor type-i and type-ii receptors

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL331240A1 PL331240A1 (en) 1999-07-05
PL189309B1 true PL189309B1 (pl) 2005-07-29

Family

ID=27533913

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL97331240A PL189309B1 (pl) 1996-07-09 1999-01-05 Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (sTNFR), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą sTNFR, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania sTNFR, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie sTNFR do wytwarzania środka leczniczego

Country Status (22)

Country Link
US (2) US6989147B2 (pl)
EP (1) EP0914431B1 (pl)
JP (2) JP2002514048A (pl)
KR (1) KR20000023695A (pl)
AT (1) ATE364695T1 (pl)
AU (2) AU3601397A (pl)
BG (1) BG64910B1 (pl)
BR (1) BR9710350A (pl)
CA (1) CA2259156C (pl)
CZ (1) CZ296835B6 (pl)
DE (1) DE69737814T2 (pl)
EA (1) EA003900B1 (pl)
ES (1) ES2288304T3 (pl)
IL (1) IL127874A0 (pl)
NO (1) NO990086L (pl)
NZ (1) NZ333647A (pl)
PL (1) PL189309B1 (pl)
SK (1) SK1599A3 (pl)
TR (1) TR199700610A2 (pl)
TW (1) TW555765B (pl)
WO (1) WO1998001555A2 (pl)
YU (1) YU299A (pl)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005413B1 (en) * 1995-12-22 2006-02-28 Amgen Inc. Combination therapy for conditions leading to bone loss
EP2002846B1 (en) 1996-12-06 2017-01-25 Amgen Inc. Combination therapy using an IL-1 inhibitor for treating IL-1 mediated diseases
US6316408B1 (en) 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
IL132304A0 (en) 1997-04-16 2001-03-19 Amgen Inc Osteoprotegerin binding proteins and receptors
US20040220103A1 (en) * 1999-04-19 2004-11-04 Immunex Corporation Soluble tumor necrosis factor receptor treatment of medical disorders
US6576668B1 (en) * 1999-06-21 2003-06-10 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Remedies for arthrosis deformans
US7148061B2 (en) 2000-02-11 2006-12-12 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Identification of a novel domain in the tumor necrosis factor receptor family that mediates pre-ligand receptor assembly and function
US20030103978A1 (en) 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
US7087224B2 (en) 2000-10-31 2006-08-08 Amgen Inc. Method of treating anemia by administering IL-1ra
JP2004525869A (ja) * 2000-12-06 2004-08-26 アプライド・リサーチ・システムズ・エイアールエス・ホールディング・ナムローゼ・フェンノートシャップ 硬皮症の治療及び／又は予防のためのｓａｒｐ−１の使用
CA2451955C (en) 2001-06-26 2015-09-29 Abgenix, Inc. Antibodies to opgl
CA2481074A1 (en) 2002-04-05 2003-10-23 Amgen Inc. Human anti-opgl neutralizing antibodies as selective opgl pathway inhibitors
US20040002451A1 (en) * 2002-06-20 2004-01-01 Bruce Kerwin Compositions of pegylated soluble tumor necrosis factor receptors and methods of preparing
WO2004098595A1 (en) * 2003-05-12 2004-11-18 Altana Pharma Ag COMPOSITION COMPRISING ROFLUMILAST AND A TNFα ANTAGONIST
EP1718304A1 (en) * 2004-02-20 2006-11-08 Boehringer Ingelheim International GmbH Pharmaceutical compositions based on anticholinergics and pegsunercept
MX2007001221A (es) 2004-08-04 2007-03-23 Amgen Inc Anticuerpos para proteina dickkopf-1 (dkk-1).
EP1909831A4 (en) 2005-06-14 2013-02-20 Amgen Inc PREPARATIONS OF SPONTANEOUS TAMPING PROTEINS
PE20070684A1 (es) 2005-11-14 2007-08-06 Amgen Inc MOLECULAS QUIMERICAS DE ANTICUERPO RANKL-PTH/PTHrP
US7833527B2 (en) 2006-10-02 2010-11-16 Amgen Inc. Methods of treating psoriasis using IL-17 Receptor A antibodies
WO2009009186A2 (en) * 2007-04-13 2009-01-15 The Regents Of The University Of California Receptors useful for gas phase chemical sensing
BRPI0815368A2 (pt) 2007-08-21 2015-02-10 Amgen Inc "proteinas c-fms humanas a antigeno"
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
AR072596A1 (es) 2008-07-23 2010-09-08 Hanmi Pharmaceutical Co Ltd Un complejo proteico que comprende una proteina dimerica y un polimero no peptidico
EP2492281B1 (en) * 2009-10-19 2018-04-11 HanAll Biopharma Co., Ltd. Modified human tumor necrosis factor receptor-1 polypeptide or fragment thereof, and method for preparing same
MY182680A (en) 2010-01-15 2021-01-29 Amgen K A Inc Antibody formulation and therapeutic regimens
KR101273893B1 (ko) 2010-09-13 2013-06-14 한올바이오파마주식회사 변형된 인간 종양 괴사 인자 수용체-1 폴리펩티드 또는 그의 절편 및 그의 제조방법
JP5819439B2 (ja) * 2010-12-23 2015-11-24 ハノル バイオファーマ カンパニー リミテッド 修飾されたヒト腫瘍壊死因子受容体−１ポリペプチドまたはその断片及びその製造方法
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
JP2018508496A (ja) * 2015-01-28 2018-03-29 ディーエヌエックス バイオテック， エルエルシー 半減期増加のために改変された可溶性ＴＮＦ−α受容体を使用する組成物および方法
CA3016894A1 (en) 2016-03-08 2017-09-14 Janssen Biotech, Inc. Gitr antibodies, methods, and uses
BR112019007858A2 (pt) 2016-10-21 2019-07-02 Amgen Inc formulações farmacêuticas e métodos para produzir as mesmas

Family Cites Families (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IN150740B (pl) 1978-11-24 1982-12-04 Hoffmann La Roche
US4760067A (en) 1979-08-15 1988-07-26 Merck & Co., Inc. Allylsulfoxide enzyme inhibitors
EP0040506B1 (en) 1980-05-21 1986-08-20 Teijin Limited Reactive polymer and process for the preparation thereof
US4560649A (en) 1981-10-15 1985-12-24 Cornell Research Foundation Assaying for hLH or hCG with immobilized hormone receptors
JPH0751511B2 (ja) 1982-03-15 1995-06-05 味の素株式会社 インターロイキン２を含有してなる癌治療剤
DE3378250D1 (en) 1982-04-22 1988-11-24 Ici Plc Continuous release formulations
US4587046A (en) 1982-05-18 1986-05-06 The Regents Of The University Of California Drug-carrier conjugates
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4966888A (en) 1985-07-08 1990-10-30 Cornell Research Foundation, Inc. hCG-hLH receptor and hCG-hLH receptor-hCG complex as antigens, antibodies thereto and contraceptive vaccine
US4522750A (en) 1984-02-21 1985-06-11 Eli Lilly And Company Cytotoxic compositions of transferrin coupled to vinca alkaloids
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
SE470099B (sv) 1984-05-17 1993-11-08 Jerker Porath Sulfonaktiverade tioeteradsorbenter för separation av t ex protein
US4578335A (en) 1984-05-21 1986-03-25 Immunex Corporation Interleukin 2 receptor
CA1283661C (en) 1984-06-20 1991-04-30 Franz Jansen Imidazolides, process for their preparation and application as intermediates for the synthesis of cytotoxic conjugates
US4675285A (en) 1984-09-19 1987-06-23 Genetics Institute, Inc. Method for identification and isolation of DNA encoding a desired protein
SE454885B (sv) 1984-10-19 1988-06-06 Exploaterings Ab Tbf Polymerbelagda partiklar med immobiliserade metalljoner pa sin yta jemte forfarande for framstellning derav
US4959314A (en) 1984-11-09 1990-09-25 Cetus Corporation Cysteine-depleted muteins of biologically active proteins
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
EP0229108B1 (en) 1985-06-26 1990-12-27 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4935233A (en) 1985-12-02 1990-06-19 G. D. Searle And Company Covalently linked polypeptide cell modulators
JPS62185029A (ja) 1986-02-07 1987-08-13 Ajinomoto Co Inc 修飾インタ−ロイキン−２
CA1283046C (en) 1986-05-29 1991-04-16 Nandini Katre Tumor necrosis factor formulation
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
IN165717B (pl) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US4931544A (en) 1986-09-04 1990-06-05 Cetus Corporation Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions
IL80005A (en) 1986-09-10 1992-11-15 Yeda Res & Dev Compositions for modulating the effect of tnf and il-1
US4965271A (en) 1986-12-31 1990-10-23 Hoechst Roussel Pharmaceuticals, Inc. Method of inhibiting the activity of leukocyte derived cytokines
US5359032A (en) 1987-08-26 1994-10-25 Biogen Inc. Interkeukin-1 inhibitor
IL83878A (en) * 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
IL98078A0 (en) 1991-05-07 1992-06-21 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising an anticytokyne
IL90339A (en) 1989-05-18 1996-10-16 Yeda Res & Dev Anti-cytotoxic protein and its purification
US4904584A (en) 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US5153265A (en) 1988-01-20 1992-10-06 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
US4847325A (en) 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
GB8806339D0 (en) 1988-03-17 1988-04-13 Hoffmann La Roche Monoclonal antibodies
GB8807803D0 (en) 1988-03-31 1988-05-05 Glaxo Group Ltd Biochemical product
IL89790A (en) 1988-04-01 2002-05-23 Johns Hopking University Sequences of nucleic acids encoding and cells producing CR1 protein and methods for its production and purification
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
US5214131A (en) 1988-05-06 1993-05-25 Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited Polyethylene glycol derivatives, modified peptides and production thereof
KR0148009B1 (ko) 1988-05-27 1998-08-01 그래고리 비. 아보트 인터루킨-1 억제제
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
JPH0240399A (ja) 1988-07-27 1990-02-09 Takeda Chem Ind Ltd 線維芽細胞増殖因子ムテインの複合体あるいは組成物
IL95064A0 (en) * 1990-07-12 1991-06-10 Yeda Res & Dev Molecular cloning of tnf binding protein
US5811261A (en) 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
GB8824592D0 (en) 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Purification process
GB8824869D0 (en) 1988-10-24 1988-11-30 Stevenson G T Synthetic antibody
US5681566A (en) 1988-10-24 1997-10-28 3I Research Exploitation Limited Antibody conjugates with two or more covalently linked FC regions
US5162430A (en) 1988-11-21 1992-11-10 Collagen Corporation Collagen-polymer conjugates
AU4660789A (en) 1988-11-23 1990-06-12 Genentech Inc. Polypeptide derivatives
AU645745B2 (en) 1988-12-22 1994-01-27 Xoma Corporation Hindered linking agents and methods
US4902502A (en) 1989-01-23 1990-02-20 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5089261A (en) 1989-01-23 1992-02-18 Cetus Corporation Preparation of a polymer/interleukin-2 conjugate
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
CA2011450C (en) 1989-03-07 2002-06-04 Tadatsugu Taniguchi Recombinant b-chain of the il-2 receptor
EP0386289A1 (en) 1989-03-07 1990-09-12 Taniguchi, Tadatsugu, Dr. Recombinant interleukin-2 receptor
US5122614A (en) 1989-04-19 1992-06-16 Enzon, Inc. Active carbonates of polyalkylene oxides for modification of polypeptides
US7264944B1 (en) * 1989-04-21 2007-09-04 Amgen Inc. TNF receptors, TNF binding proteins and DNAs coding for them
JPH03164179A (ja) * 1989-04-21 1991-07-16 Boehringer Ingelheim Internatl Gmbh Ｔｎｆレセプター、ｔｎｆ結合たん白質およびこれらをコードするｄｎａ
DE59010941D1 (de) * 1989-04-21 2005-03-24 Amgen Inc TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
US5166322A (en) 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
DE3922089A1 (de) 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
DK0398327T4 (da) * 1989-05-18 2013-04-15 Yeda Res & Dev Tumornekrosefaktor-bindende protein, dets oprensning og antistoffer dertil
IL95031A (en) * 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US6143866A (en) * 1989-07-18 2000-11-07 Amgen, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) inhibitor and method for obtaining the same
AU630497B2 (en) 1989-09-05 1992-10-29 Immunex Corporation Tumor necrosis factor-alpha and -beta receptors
NZ235148A (en) 1989-09-05 1991-12-23 Immunex Corp Tumour necrosis factor receptor protein and dna sequences
US5605690A (en) 1989-09-05 1997-02-25 Immunex Corporation Methods of lowering active TNF-α levels in mammals using tumor necrosis factor receptor
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
DK0939121T4 (da) 1989-09-12 2008-02-04 Ahp Mfg B V TNF-bindende proteiner
US5350836A (en) * 1989-10-12 1994-09-27 Ohio University Growth hormone antagonists
US5234903A (en) 1989-11-22 1993-08-10 Enzon, Inc. Chemically modified hemoglobin as an effective, stable non-immunogenic red blood cell substitute
CA2068320C (en) 1989-11-29 2000-10-17 Robert Hageman Production of recombinant human interleukin-1 inhibitor
AU642938B2 (en) * 1989-12-13 1993-11-04 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein 1 (TBP-1)
US5136021A (en) 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
US5171264A (en) 1990-02-28 1992-12-15 Massachusetts Institute Of Technology Immobilized polyethylene oxide star molecules for bioapplications
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US6458360B1 (en) 1990-04-25 2002-10-01 The Johns Hopkins University Soluble complement regulatory molecules
GB2246569A (en) 1990-06-15 1992-02-05 Charing Cross Sunley Research Tumour necrosis factor - alpha binding protein
WO1992001002A1 (fr) 1990-07-11 1992-01-23 Teijin Limited Inhibiteur de l'activite du facteur de la necrose tumorale et son procede de preparation
GB9015908D0 (en) 1990-07-19 1990-09-05 Celltech Ltd Multivalent immunoglobulin
EP0540612A1 (en) 1990-07-20 1993-05-12 Pharmacia AB Heterobifunctional reagents and conjugates with oxaalkylene units for amphiphilic bridge structures
DE69120821T2 (de) 1990-08-31 1997-01-23 Univ Minnesota Polyethylenglykol-Derivate für Festphasenanwendungen
GB9022648D0 (en) * 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
CA2100329C (en) 1991-01-18 2009-09-29 David F. Carmichael Methods for treating tumor necrosis factor mediated diseases
DK0573551T3 (da) 1991-02-27 2003-08-04 Micromet Ag Serinrige peptidlinkere
EP0575545B1 (en) * 1991-03-15 2003-05-21 Amgen Inc. Pegylation of polypeptides
CA2101918A1 (en) 1991-03-18 1992-09-19 Samuel Zalipsky Hydrazine containing conjugates of polypeptides and glycopolypeptides with polymers
EP0594772B1 (en) 1991-07-04 1996-08-28 Immunodex K/S Water-soluble, polymer-based reagents and conjugates comprising moieties derived from divinyl sulfone
IL99120A0 (en) * 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
US5569779A (en) 1991-12-23 1996-10-29 Albemarle Corporation Polyfunctional michael addition products
US5447851B1 (en) * 1992-04-02 1999-07-06 Univ Texas System Board Of Dna encoding a chimeric polypeptide comprising the extracellular domain of tnf receptor fused to igg vectors and host cells
JPH08502082A (ja) 1992-07-02 1996-03-05 コラーゲン コーポレイション 生体適合性ポリマー結合体
US5382657A (en) 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
WO1994006476A1 (en) 1992-09-15 1994-03-31 Immunex Corporation Method of treating tnf-dependent inflammation using tumor necrosis factor antagonists
US6270766B1 (en) 1992-10-08 2001-08-07 The Kennedy Institute Of Rheumatology Anti-TNF antibodies and methotrexate in the treatment of arthritis and crohn's disease
EP0622394A1 (en) 1993-04-30 1994-11-02 S.A. Laboratoires S.M.B. Reversible modification of sulfur-containing molecules with polyalkylene glycol derivatives and their use
ATE196849T1 (de) 1993-07-30 2000-10-15 Kennedy Inst Of Rheumatology Verfahren zur behandlung von multiplesklerose
GB9317618D0 (en) 1993-08-24 1993-10-06 Royal Free Hosp School Med Polymer modifications
US5446090A (en) * 1993-11-12 1995-08-29 Shearwater Polymers, Inc. Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules
PL318501A1 (en) * 1994-07-22 1997-06-23 Hoffmann La Roche Pharmaceutic compositions containing a tnc bonding chimeric protein
DE4441446A1 (de) * 1994-11-22 1996-05-23 Ulrich Theis Verfahren zur Übergabe von Wäschestücken und vorzugsweise zur Durchführung des Verfahrens dienende Muldenmangel
TW313568B (pl) 1994-12-20 1997-08-21 Hoffmann La Roche
US7429646B1 (en) * 1995-06-05 2008-09-30 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor-like 2
US5747639A (en) 1996-03-06 1998-05-05 Amgen Boulder Inc. Use of hydrophobic interaction chromatography to purify polyethylene glycols

Also Published As

Publication number Publication date
BG103091A (en) 2000-05-31
KR20000023695A (ko) 2000-04-25
US6989147B2 (en) 2006-01-24
WO1998001555A3 (en) 1998-05-22
CZ296835B6 (cs) 2006-06-14
US20050250696A1 (en) 2005-11-10
SK1599A3 (en) 2001-02-12
NO990086L (no) 1999-03-09
WO1998001555A2 (en) 1998-01-15
CA2259156A1 (en) 1998-01-15
EA199900095A1 (ru) 2000-02-28
BG64910B1 (bg) 2006-08-31
EP0914431B1 (en) 2007-06-13
ES2288304T3 (es) 2008-01-01
ATE364695T1 (de) 2007-07-15
CA2259156C (en) 2010-09-07
JP2009280612A (ja) 2009-12-03
NO990086D0 (no) 1999-01-08
PL331240A1 (en) 1999-07-05
AU3601397A (en) 1998-02-02
CZ499A3 (cs) 2000-01-12
IL127874A0 (en) 1999-10-28
AU1112101A (en) 2001-04-05
US7732587B2 (en) 2010-06-08
TR199700610A3 (tr) 1998-01-21
TR199700610A2 (xx) 1998-01-21
AU774307B2 (en) 2004-06-24
EP0914431A2 (en) 1999-05-12
NZ333647A (en) 2000-09-29
JP2002514048A (ja) 2002-05-14
DE69737814T2 (de) 2008-03-06
YU299A (en) 1999-11-22
US20030054439A1 (en) 2003-03-20
EA003900B1 (ru) 2003-10-30
DE69737814D1 (de) 2007-07-26
BR9710350A (pt) 1999-08-17
TW555765B (en) 2003-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL189309B1 (pl) Obcięty rozpuszczalny receptor czynnika martwicy nowotworu (sTNFR), wielowartościowa proteina wiążąca czynnik martwicy nowotworu (TNFbp), polinukleotyd posiadający sekwencję kodującą sTNFR, wektor oraz komórka gospodarza zawierające taki polinukleotyd, sposób wytwarzania sTNFR, kompozycja farmaceutyczna, sposób jej wytwarzania oraz zastosowanie sTNFR do wytwarzania środka leczniczego
EP0942740B1 (en) Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
JP4771563B2 (ja) Ｉｌ−１媒介疾患を処置するためにｉｌ−１インヒビターを使用する組合せ療法
JP4344404B2 (ja) インターロイキン―１インヒビターおよび制御放出ポリマーを含む組成物
US6294170B1 (en) Composition and method for treating inflammatory diseases
KR19990082399A (ko) 인터루킨-1 저해제 및 조절 방출 중합체를 함유하는 조성물
MXPA01003790A (es) Proteinas de fusion beta - interferon y sus usos.
TWI238191B (en) IL-17 like molecules and uses thereof
AU771793B2 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
MXPA99005224A (en) Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
EP1352656A2 (en) Combination therapy using a TNF binding protein for treating TNF-mediated diseases
MXPA99005227A (en) Combination therapy using an il-1 inhibitor for treating il-1 mediated diseases

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20090709