DE69120821T2

DE69120821T2 - Polyethylenglykol-Derivate für Festphasenanwendungen

Info

Publication number: DE69120821T2
Application number: DE69120821T
Authority: DE
Inventors: Fernando E-08028 Barcelona Albericio; George Falcon Heights Mn 55113 Barany; Jane Vernon Hills Il 60061 Chang; Nuria A. Minneapolis Mn 55414 Sole; Samuel Princeton Nj 08540 Zalipsky
Original assignee: University of Minnesota
Current assignee: University of Minnesota
Priority date: 1990-08-31
Filing date: 1991-08-27
Publication date: 1997-01-23
Anticipated expiration: 2011-08-28
Also published as: DE69120821D1; EP0546055A1; EP0687691A2; EP0801082A3; JP3122460B2; JPH06500331A; DE69133235D1; DE69130333T2; EP0687691B1; WO1992004384A1; JP2002080530A; DE69133235T2; EP0546055B1; EP0801082B1; EP0801082A2; JP3435541B2; EP0687691A3; DE69130333D1; JP2001081099A; JP3266600B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Brückenglieder (Spacer) sind auf vielen Gebieten der modernen Biochemie wesentliche Gruppen. Spacer können definiert werden als Moleküle, die ein Molekül an ein anderes Molekül oder an einen inerten Träger binden. So wurde beispielsweise Polyethylenglykol vorteilhaft verwendet, um Enzyme an unlösliche Träger oder andere Biomoleküle zu binden, wobei die Enzymaktivität erhalten blieb; M. Stark und K. Holmberg, Biotech. and Bioeng. 34 (1989) 942-950. Dieses Konzept hat wichtige Folgen für technische Verfahren unter Verwendung von immobilisierten Enzymen (beispielsweise Reinigungsverfahren an Affinitätssäulen) und diagnostische Assays (beispielsweise ELISA-Assays (enzyme linked immunosorbent assay)). Zwei weitere Gebiete, auf welchen Polyethylenglykol-Spacer verwendet wurden, sind die Peptidsynthese und die Sequenzanalyse. Das Kupplungsverhältnis von geschützten Nucleotiden und Aminosäuren an inerte Träger, wie Siliciumdioxid-, Membran- und Polystyrol-Träger, steigt oft mit der räumlichen Trennung der Reaktionsstelle vom Trägergrundgerüst an. Ähnliche Effekte wurden für die Sequenzanalyse von an Festphasen immobilisierten Proben gezeigt; J.K. Inman et al., in Solid Phase Methods in Protein Sequence Analysis, Previero and Coletti-Previero (Hrsg.), Elsevier, North-Holland Biomed. Press, S. 81-94 (1977).
Die Wirksamkeit von Nucleinsäure- oder Peptidsynthesen oder Sequenzanalysen an Festphasen wird von der Festphase oder dem Träger beeinflußt, auf dem die reaktiven Stellen verankert sind. Sowohl Polystyrolgele als auch poröses Glas wurden beispielsweise als feste Träger für Peptid-Sequenzanalysen verwendet. In vielen Anwendungen können die in dem Verfahren verwendeten Lösungsmittel dazu führen, daß die Polystyrolpartikel ihr Volumen ändern, wodurch die Blockierung der Reaktionssäule und ein Druckverlust hervorgerufen wird. Poröses Glas ist andererseits vollkommen formstabil und ändert sein Volumen nicht, aber die chemischen Eigenschaften von porösen Glasderivaten zeigten eine mangelnde Reproduzierbarkeit. Polymerpartikel, wie Polystyrolpartikel, die in einer Weise derivatisiert wurden, daß reaktive Gruppen an sie gebunden werden können, haben sich für viele Anwendungen als zweckdienlich erwiesen. Polyethylenglykol (PEG)-Strukturen wurden als chemisch inerte Spacer verwendet, da sie mit einer Vielzahl von Lösungsmitteln kompatibel sind; Inman et al., ibid. Durch die Verwendung von PEG- Spacern werden die durch den Träger hervorgerufenen sterischen Effekte minimiert. PEG-Spacer weisen eine weitere nützliche Funktion auf, indem sie die Eigenschaften des Porenraums so modifizieren, daß die an den Träger gebundene reaktive Einheit mit einer größeren Zahl von Lösungsmitteln und Reagentien kompatibel ist.
PEG-modifizierte Polystyrolharze (PEG-PS) wurden zur Verwendung in Festphasen-Peptidsequenzanalysen beschrieben; Inman et al., ibid. PEG-PS-Harze wurden ferner als Phasentransferkatalysatoren verwendet; W.M. McKenzie et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. (1978) 541-543; S.L. Regen et al., J. Amer. Chem. Sec. 101 (1979) 116-120; J.G. Heffernan et al., J. Chem. Soc. Perkin II (1981) 514-517; Y. Kimura et al., J. Org. Chem. 48 (1983) 185-386; M. Tomoi et al., Reactive Polymers 10 (1989) 27-36. PEG-PS-Harze wurden als Träger für die Festphasen-Peptidsynthese beschrieben; Bekker et al., Makromol. Chem. Rapid Commun. 3 (1982) 217-223; H. Hellermann et al., Makromol. Chem. 184 (1983) 2603-2617. Die PEG-PS-Harze, die nach den in den Referenzen angegebenen Verfahren hergestellt wurden, weisen jedoch mehrere Nachteile auf. Die Reaktionen schreiten mit PEG mit hohem Molekulargewicht (beispielsweise über 400 Dalton) nur langsam voran, und symmetrische bifunktionelle PEG neigen dazu, Vernetzungen zu bilden. Diese Probleme werden dadurch vermindert, daß Ethylenoxid direkt auf vernetztes Polystyrol anionisch polymerisiert wird; Bayer et al., in Peptides: Structure and Function, V.J. Hruby und D.H. Rich (Hrsg.), Proc. 8th Am. Peptide Symp. S. 87-90, Pierce Chem. Co., Rockford IL (1983); Bayer and Rapp, (1986) Deutsches Patent DE-A1-3 500 180. Die PEG-Kettenlängen sind jedoch in diesem Verfahren schwierig zu kontrollieren und die Einheitlichkeit der PEG-Polymeren ist nicht sicher gewährleistet. Ein weiteres Problem dieses Verfahrens besteht darin, daß Polystyrol unter Verwendung von Chlormethylether, der sehr toxisch ist, funktionalisiert wird und die restlichen Chlormethylgruppen können Nebenreaktionen während der Peptidsynthese hervorrufen.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung von PEG-Pfropfcopolymeren wurde von Zalipsky et al., in Peptides: Structure and Function, C.M. Deber, V.J. Hruby und K.D. Kopple (Hrsg.), Proc. 9th Am. Pep. Symp., S. 257-260, Pierce Chem. Co., Rockford, IL (1985), beschrieben. In diesen Verfahren werden bestimmte heterobifunktionelle PEG-Derivate mit definiertem Molekulargewicht (d.h. 2000 bis 4000 Dalton) verwendet. Diese Derivate sind jedoch nicht leicht erhältlich, was ihre Kommerzialisierung behindert.
Ein Verfahren zur Herstellung nichttoxischer und effizienter fester Träger, die in einer Vielzahl von Lösungsmitteln verwendet werden können, wäre für die Verwendung in der Festphasen-Synthese oder Sequenzanalyse von Peptiden oder Nucleinsäuren oder für weitere Festphasen-Anwendungen von Nutzen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft mit Polyethylenglykol derivatisierte gepfropfte Träger.
Die vorliegende Beschreibung offenbart Verfahren zur Herstellung dieser Träger und Verfahren zur Verwendung der Träger zur Festphasen-Synthese von Peptiden. Die erfindungsgemäßen PEG-gepfropften Träger stellen funktionalisierte PEG-Derivate dar, die über kovalente Bindungen mit festen Trägern verbunden sind. Die PEG-gepfropften Träger sind in Fig. 1 gezeigt und entsprechen der Formel I: Formel I
worin bedeuten:
n eine ganze Zahl von 5 bis 150,
R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Gruppen, die unabhängig voneinander unter Wasserstoff (H) und Alkylgruppen oder Arylgruppen, wie Methyl, Ethyl oder Phenyl, ausgewählt sind,
X Wasserstoff oder H&sub2;N-B-NH-C(O)-A-C(O)-, wobei A und B unabhängig voneinander eine geradkettige oder verzweigte Alkylengruppe, wie Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen, Isobutylen oder andere Gruppen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen (A stammt beispielsweise von Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure oder anderen derartigen Säuren; B stammt z.B. von Ethylendiamin oder anderen aliphatischen Diaminen), oder eine Gruppe CH=CH bedeuten (beispielsweise stammt A von Maleinsäure) oder eine aromatische Gruppe (A stammt beispielsweise von Phthalsäure, B von Phenylendiamin), und
SS den festen Träger.
Die Amino-Endgruppe kann wahlweise durch eine Nω-Schutzgruppe, wie tert.-Butoxycarbonyl (BOC) und 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (FMOC) und weitere bekannte Schutzgruppen, geschützt sein. Der in Klammern gesetzte Mittelteil der Formel entspricht einer Reihe von leicht zugänglichen aminofunktionalisiertem Polyethylenglykol (PEG)-Polymerderivaten.
Die vorliegende Erfindung gibt kompakte, kommerziell gangbare Verfahren zur Herstellung von funktionalisierten inerten Trägern für Festphasen-Anwendungen unter Verwendung von monofunktionellem oder homobifunktionellem Polyethylenglykol als Ausgangsmaterial an. Die vorliegenden PEG-gepfropften Träger weisen physikalische und mechanische Eigenschaften auf, die für die Festphasen-Peptidsynthese, die Nucleinsäuresynthese und weitere Anwendungen, in denen immobilisierte Moleküle verwendet werden, vorteilhaft sind.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt die allgemeine Struktur eines Polyethylenglykol-Polystyrol-Pfropfpolymerträgers (PEG-PS). X gibt den Punkt an, von dem aus die Biopolymerkette zu wachsen beginnt.
Fig. 2 zeigt schematisch eine Reihe von Reaktionen, die zur Herstellung eines Spacers, seiner Kupplung an ein aminofunktionalisiertes Polystyrolharz und zur Anbringung einer Handle-Gruppe an dem an das Harz gebundenen Spacer führen, sowie seine Verwendung zur Peptidsynthese.
Fig. 3 zeigt schematisch eine Reihe von Reaktionen, die zu weiteren PEG-PS-Pfropfpolymerträgern führen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Harze, die funktionalisierte Polyethylenglykol-Derivate enthalten, die kovalent an einen festen Träger gebunden sind.
Der resultierende gepfropfte Träger stellt ein symmetrisches Poly(oxyethylen)diaminderivat dar, das an den Träger gebunden ist und folgende Formel I aufweist: Formel I
worin bedeuten:
n eine ganze Zahl von 5 bis 150,
R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Gruppen, die unabhängig voneinander unter Wasserstoff (H) und Alkyl- oder Arylgruppen, wie Methyl, Ethyl oder Phenyl, ausgewählt sind,
SS einen festen Träger,
X Wasserstoff oder H&sub2;N-B-NH-C(O)-A-C(O)-, wobei
A und B unabhängig voneinander geradkettige oder verzweigte Alkylengruppen, wie Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen, Isobutylen, oder andere Gruppen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen (A stammt beispielsweise von Bernsteinsäure, Glutarsäure, Adipinsäure oder anderen derartigen Säuren; B stammt z.B. von Ethylendiamin oder weiteren aliphatischen Diaminen), oder eine Gruppe CH=CH bedeuten (beispielsweise stammt A von Maleinsäure) oder eine aromatische Gruppe (A stammt beispielsweise von Phthalsäure, B von Phenylendiamin). Der in Klammern angegebene Mittelteil der Formel entspricht einer Reihe von Polyoxyethylendiaminpolymeren. Die Aminogruppe(n) können ggf. mit bekannten Nω-Schutzgruppen geschützt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung von Pfropfpolymerträgern der Formel I besteht darin, aminofunktionalisierte Grundpolymere mit Dicarbonsäurederivaten, einschließlich Anhydriden, umzusetzen, um carboxyfunktionalisierte Moleküle herzustellen. Nach diesem Verfahren wird das Diaminpolymer mit mindestens zwei Äquivalenten des aktivierten Carbonsäurederivats umgesetzt. Dicarbonsäuren, die in diesem Verfahren verwendet werden können, umfassen Alkyldisäuren mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen, wie beispielsweise Maleinsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure oder Adipinsäure, Anhydride, wie Maleinsäureanhydrid, Bernsteinsäureanhydrid oder Glutarsäureanhydrid, oder aromatische Anhydride, wie Phthalsäureanhydrid. Nach einer Ausführungsform dieses Verfahrens wird das Diaminpolymer mit Bernsteinsäure-, Maleinsäure- oder Glutarsäureanhydrid umgesetzt, um typische Vertreter der beanspruchten Verbindungen, d.h. bis(succinyliertes), bis(maleyliertes) oder bis(glutarylisiertes) PEG herzustellen. Die Figuren 2 und 3 verdeutlichen die Bildung und die anschließende Bindung dieser Derivate an aminofunktionalisierte feste Träger.
Homobifunktionelle PEG-Diaminverbindungen, die nachfolgend umgesetzt werden können, um Harze der Formel I herzustellen, weisen die allgemeine Formel III auf: Formel III
worin bedeuten:
n eine ganze Zahl von 5 bis 150,
R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig voneinander Gruppen, die unter Wasserstoff, Alkylgruppen und Arylgruppen ausgewählt sind,
X OH, Halogen und die aktivierende Gruppe eines aktiven Esters oder Thioesters,
A eine geradkettige oder verzweigte Alkylengruppe mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, eine Gruppe CH=CH oder eine aromatische Gruppe.
Der Ausdruck "aktiver Ester" bezieht sich auf Verbindungen, die Carboxygruppen aktivieren, damit diese schneller Reaktionen mit Aminogruppen eingehen. Aktivierende Gruppen, die in der vorliegenden Zusammensetzung und dem vorliegenden Verfahren verwendet werden können, sind beispielsweise Trichlorphenyl(TCP)-ester, Pentafluorphenyl(PFP)-ester, Pentachlorphenyl(PCP)-ester und Methylphenylpyrazolinon-(MPP)- ester.
Die symmetrischen Diamine, die als Mittelteil des Polymers verwendet werden, umfassen Polymere entsprechend der in Klammern gezeigten Strukturen der Formeln I und III. Derartige PEG-Derivate, die einen der Theorie entsprechenden Gehalt an Amino-Gruppen aufweisen, können durch eine Reihe bekannter Verfahren hergestellt werden; siehe beispielsweise Duckmann et al., Makromol Chem. 182 (1983) 1379; Zalipsky et al., Eur. Polym. J. 19 (1983) 1177. Polymere, die für diesen Zweck besonders geeignet sind, umfassen eine Reihe von Poly(oxyethylen)diaminen mit einem Molekulargewicht von bis zu 6000 Dalton, die kommerziell unter dem Handelsnamen Jeffamine (Texaco Chemical Co., Bellaire, TX) erhältlich sind. Die Poly(oxyethylen)diaminharze Jeffamine sind aliphatische primäre Diamine, die strukturell von Polyethylenglykol abgeleitet sind, das Polypropylenoxid- Endgruppen aufweist. Diese Produkte sind durch einen hohen Anteil an Aminen insgesamt und einen hohen Gehalt an primären Aminen gekennzeichnet. Andere symmetrische Diamine, die die gewünschten Eigenschaften aufweisen, können auch verwendet werden. Für einige Anwendungen können symmetrische dicarboxy-funktionalisierte Polymere verwendet werden, die in etwa die gleiche allgemeine Struktur aufweisen.
Carboxy-funktionalisierte Spacer, die durch das vorliegende Verfahren hergestellt wurden, werden dann an geeignete Grundträger gekuppelt, die mit Aminogruppen funktionalisiert wurden. Beispiele für Träger, die als Festphase in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind Makromoleküle oder Feststoffe, wie Membranen, poröses Glas, Siliciumdioxid, Polystyrole, Polydimethylacrylamide, Baumwolle oder Papier. Feste Träger, die besonders gut verwendet werden können, umfassen amino-funktionalisiertes Polystyrol, Aminomethylpolystyrol, Aminoacylpolystyrol und p- Methylbenzhydrylaminpolystyrol. Ein besonders bevorzugter Träger ist ein amino-funktionalisiertes Polystyrolcopolymer mit 1 % Divinylbenzol. Die Aminogruppen des Grundträgers können durch Umsetzung eines Äquivalents des Trägers, bezogen auf die Aminogruppen, mit einem Überschuß an carboxyfunktionalisierten Derivaten umgesetzt werden. Die meisten Aminogruppen des Trägers werden mit Polyethylenglykolderivaten substituiert, wodurch Spacer gebildet werden, die eine freie Carboxygruppe aufweisen.
Das Einführen einer Amino-Funktionalität an den vorliegenden PEG-Derivaten ist für viele Synthesen wünschenswert. Dies kann durch Säurehydrolyse (s. Fig. 2) der Amideinheit erreicht werden, wobei die Aminogruppe, die zuvor am Diamin vorhanden war, umgesetzt wird, oder wobei ein freies oder mit einer Schutzgruppe geschütztes Diamin mit niedrigem Molekulargewicht (beispielsweise Ethylen- oder Hexamethylendiamin) an die Carboxy-Endgruppe (s. Fig. 3) gebunden wird. An Grundträgern, die mit bis(maleylierten) PEG-Spacern (s. Fig. 2) modifiziert wurden, wird die terminale Maleylgruppe selektiv hydrolysiert, indem in kontrollierter Weise mit einer Säure, beispielsweise Trifluoressigsäure oder verdünnter Salzsäure (HCl), behandelt wird, wobei die andere Maleylgruppe, die das PEG an den Träger bindet, im wesentlichen stabil ist. Durch diese Verfahren werden amino-funktionalisierte PEG-modifizierte Materialien schnell, effizient und ökonomisch hergestellt.
Polyethylenglykol-Polystyrol-Pfropfpolymerträger (PEG-PS), die durch die erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, sind besonders nützlich. Die unter Verwendung der vorliegenden PEG-Derivate hergestellten PEG-PS-Träger weisen verschiedene Eigenschaften auf, die für die Festphasenanwendung wünschenswert sind. Sie quellen in einer Vielzahl von Lösungsmitteln, sind unter Bedingungen stabil, die in den meisten Festphasensynthesen verwendet werden, und sie verhalten sich sowohl in diskontinuierlichen als auch Säulenreaktoren, die in Festphasenanwendungen verwendet werden, und insbesondere in der Festphasen-Peptidsynthese gut.
Festphasen-Peptidsynthesen beginnen typischerweise mit der kovalenten Bindung der Carboxyendgruppe einer ersten Aminosäure an den festen Träger. Die Carboxygruppe einer Nα- geschützten Aminosäure wird kovalent an die Handle-Einheit gebunden, die an der Aminogruppe des freien Endes (des Endes, das nicht an den festen Träger gebunden ist) des PEG- Spacers vorgesehen ist (Fig. 1, 2 und 3). Eine "Handle- Gruppe" ist als bifunktioneller Spacer definiert, der dazu dient, den anfänglichen Aminosäurerest an dem Polymerträger anzubringen. Ein Ende der Handle-Gruppe beinhaltet eine leicht spaltbare Schutzgruppe, und das andere Ende der reaktiven Gruppe ist an die funktionalisierten festen Träger gebunden. Handle-Gruppen, die mit den vorliegenden Spacern in der Festphasen-Peptidsynthese verwendet werden können, umfassen beispielsweise säurespaltbare p-Alkoxybenzyl- (PAB)-Gruppen, durch Licht spaltbare o-Nitrobenzylester- Gruppen und Handle-Gruppen, die von Albericio et al. in J. Org. Chem. 55 (1990) 3730-3743 und den darin zitierten Referenzen beschrieben sind. Geeignete Handle-Gruppen werden quantitativ in einem einzigen Schritt an die aminofunktionalisierten Träger gebunden, um einen allgemeinen Startpunkt für gut definierte Strukturen für den Peptidketten-Aufbau anzugeben. Die Handle-Schutzgruppe wird entfernt, und das C-Ende der Nα-geschützten ersten Aminosäure wird quantitativ an die Handle-Gruppe gebunden. Nachdem die Handle-Gruppe an die Festphase gebunden ist, und die anfängliche Aminosäure oder das Peptid an der reaktiven Gruppe angebracht ist, wird der allgemeine Synthesezyklus fortgeführt. Der Synthesezyklus besteht allgemein darin, die Nα-Schutzgruppe der Aminosäure oder des Peptids am Harz zu entfernen, zu waschen und erforderlichenfalls zu neutralisieren, wonach mit der carboxy-aktivierten Form einer nächsten Nα-geschützten Aminosäure umgesetzt wird. Der Zyklus wird wiederholt, um das gewünschte Peptid oder Protein zu bilden. Festphasen-Peptidsyntheseverfahren unter Verwendung von funktionalisierten unlöslichen Trägern sind gut bekannt; Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963) 2149; Barany und Merrifield, in Peptides, Bd. 2, S. 1-284 (1979); Barany et al., Int. J. Peptide Protein Res. 30 (1987) 705-739.
Die vorliegenden PEG-Derivate sind besonders als Spacer geeignet, die den inerten Träger von den umzusetzenden Aminosäuren, die während des Syntheseprozesses die Peptidkette bilden, trennen. Die Wahl des Spacers, der diesen Abstand möglich macht, ist ein kritischer Parameter in Festphasenanwendungen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden eine Vielzahl von PEG-Spacern mit einem mittleren Molekulargewicht von etwa 2000 Dalton zwischen amino-funktionellen Gruppen auf einem Polystyrolgrundgerüst und dem Punkt für das Anbringen von geeigneten reaktiven Gruppen eingefügt. Die resultierenden PEG-PS-Pfropfpolymerträger enthalten etwa gleiche Gewichtsanteile PEG und PS. Diese Träger weisen reproduzierbare Vorteile gegenüber PS-Trägern bezüglich ihrer physikalischen chemischen Eigenschaften, wie des Quellens, und bezüglich der Synthese von Modellpeptiden auf. Durch die erfindungsgemäßen PEG-PS-Träger können Peptidsynthesen unter Verwendung von Acetonitril als Lösungsmittel in allen Reaktionsschritten und Waschschritten durchgeführt werden. Kontrollexperimente unter Verwendung von PS und unter Anwendung von Acetonitril als Lösungsmittel ergaben keine Peptidprodukte.
In einer weiteren Ausführungsform wurden Vergleichsexperimente durchgeführt, in welchen die schwierige 65-74-Decapeptidsequenz des Acylcarrierproteins unter Verwendung von FMOC-Aminosäuren synthetisiert wurde. Das Peptid wurde mit dem neuen PEG-PS mit im Vergleich zu PS, Tentagel (Warenzeichen von Rapp Chem., Tübingen, Deutschland) oder Pepsyn K (Warenzeichen von Cambridge Research Biochem., Cambridge, England) größerer Reinheit hergestellt. Das PEG-PS- Material zeigte sich sowohl für die kontinuierliche Synthese als auch für diskontinuierliche Synthese gut geeignet. Selbst bei hohen Strömungsgeschwindigkeiten wurden vernachlässigbare Druckverluste festgestellt.
Durch die Synthese einiger großer, komplexer Peptidsequenzen (mit beispielsweise etwa 30 bis 60 Einheiten), wie Cecropin-Alaloga, Calcitonin, β-Endorphin, Corticoliberin (Corticotropin releasing factor), zwei Zink-Finger-Sequenzen und einiger partieller Sequenzen von HIV-1-tat-Protein, konnte gezeigt werden, daß die PEG-PS-Pfropf-Polymerträger allgemein von Nutzen sind. Die Verbesserung in der Syntheseeffizienz, die aus der Verwendung der vorliegenden PEG- PS-Spacer resultiert, scheint von einer oder mehreren der folgenden Gründe herzurühren: (i) einem Spacer-Effekt, durch den die reaktiven Stellen aus der Nachbarschaft der Polymergrundeinheit entfernt werden; (ii) einem allgemeinen Umgebungseffekt, der die hydrophobe Natur des Harzes mit einem gleichzeitigen günstigen Einfluß auf die Reaktionsratengeschwindigkeiten modifiziert und (iii) einem speziellen Effekt auf bezüglich der Konformation schwierige Kupplungen, der durch die weniger ausgeprägte Sekundärstruktur (Bildung von Wasserstoffbindungen) hervorgerufen wird.
Die PEG-Derivate können ferner in der Nucleinsäuresynthese oder Nucleinsäuresequenzanalyse als Spacer oder Brückenglieder zwischen einem inerten Träger und den reagierenden Nucleotiden oder Nucleinsäuren verwendet werden. Die Derivate können beispielsweise wie oben beschrieben an den Polystyrolharzen angebracht und bei der Amidit-vermittelten DNA-Synthese verwendet werden. Die PEG-PS-Harze quellen in Acetonitril, das als Lösungsmittel in dem Amidit-Kupplungsverfahren verwendet wird.
Die Erfindung wird nachstehend durch die folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiele

Beispiel 1.

Herstellung eines bis(maleylierten) Derivats von Jeffamine ED-2001

Maleinsäureanhydrid (4,5 g, 46 mmol) wurde zu einer gerührten Lösung von Jeffamine ED-2001 (30 g, 15 mmol, 30 mmol Aminogruppen) in Tetrahydrofuran (90 ml) bei 25 ºC auf einmal gegeben. Nach 5 h wurde das Lösungsmittel durch Verdampfung im Vakuum entfernt, und das resultierende Öl wurde zu kaltem gerührten Ether (100 ml) bei 0 ºC während 5 min zugegeben. Die resultierende weiße Suspension wurde weitere 15 min bei 0 ºC gerührt, anschließend durch Filtration gewonnen, gründlich mit Ether gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet. Ausbeute: 28,9 g (88 %). Die NMR-Daten und die Daten der Elementaranalyse stimmten mit der erwarteten nachfolgend gezeigten Struktur überein:
worin a + b = 2,5 ist.

Beispiel 2.

Herstellung eines bis(glutarylierten) Derivats von Jeffamine ED-2001

Ein Gemisch von Jeffamine ED-2001 (40 g, 20 mmol, 40 mmol Aminofunktionen) und Glutarsäureanhydrid (5,0 g, 44 mmol) in Dichlormethan (200 ml) wurde bei 25 ºC 2 h gerührt. Das homogene Reaktionsgemisch, das einen negativen Ninhydrintest ergab, was eine vollständige Acylierung anzeigte, wurde im Vakuum aufkonzentriert, wodurch ein viskoses Öl erhalten wurde, das unter kräftigem Rühren in ein Becherglas mit Ethylether (300 ml) bei 4 ºC dekantiert wurde. Es bildete sich schnell ein weißer Niederschlag, der gesammelt, mit weiterem kaltem Ether gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxid getrocknet wurde. Ausbeute: 38 g (86 %). Die NMR-Daten und die Daten der Elementaranalyse stimmten mit der Struktur überein.

Beispiel 3.

Verfahren zur Bindung des PEG-Disäurederivats an ein MBHA- Harz

Zu einer gerührten Lösung der in Beispiel 1 hergestellten PEG-Disäure (26 g, 11,8 mmol, 23,6 mmol Carboxygruppen) in N,N-Dimethylformamid (DMF, 30 ml) wurden 1-Hydroxybenzotriazol (HOBt, 0,81 g, 6,0 mmol) in DMF (3 ml) und Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (BOP, 2,63 g, 6,0 mmol) in DMF (8 ml) gegeben. Eine Lösung von N,N-Diisopropylethylamin (DIEA, 1,56 ml, 9 mmol) in Dichlormethan (5 ml) wurde während 10 min zugegeben, und die resultierende Lösung wurde weitere 10 min gerührt, bevor sie in ein Reaktionsgefäß, das den vorgewaschenen p-Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Polystyrolharzträger (5,0 g, 0,6 mmol/g, 3,0 mmol Aminogruppen) enthielt, übergeführt wurde. Das Gemisch wurde 2 Tage bewegt, bis ein Ninhydrintest an einer Probe weitgehend negativ verlief. Nichtumgesetzte Aminogruppen wurden durch Acetylierung blockiert, und der Träger wurde anschließend mit Dichlormethan für die weitere Behandlung wie in Beispiel 7 beschrieben gewaschen.

Beispiel 4

Verfahren zum Binden des PEG-Diacidderivats an ein Nle-Harz

In einem getrennt durchgeführten Experiment wurde ein Aminomethylpolystyrolharzträger (0,68 mmol/g) mit FMOC-Norleucin unter Anwendung von Standardverfahren derivatisiert. An einem Teil des resultierenden 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl- Norleucin-Harzes (FMOC-Nle-Harz) (0,23 g, 0,55 mmol/g, 0,13 mmol) wurden mit Piperidin-DMF (3:7, V/V) (2 + 10 min) die Schutzgruppen entfernt, und das Harz wurde mit DMF und Dichlormethan gewaschen. Parallel hierzu wurden die PEG- Disäure aus Beispiel 2 (0,86 g, 0,39 mmol, 0,78 mmol Carboxygruppen), BOP (88 mg, 0,2 mmol) und HOBt (27 mg, 0,2 mmol) in DMF (4 ml) gelöst, worauf eine Lösung von DIEA (45 µl, 0,26 mmol) in Dichlormethan (2 ml) zugesetzt wurde. Nach 10 min Voraktivierung bei 25 ºC wurde die PEG-Lösung zu dem Harz gegeben, dessen Schutzgruppen entfernt worden waren und das gewaschen worden war, und die Bindung wurde 5 h bei 25 ºC durchgeführt, was einen im wesentlichen negativen Ninhydrintest ergab. Durch Zusatz von Essigsäureanhydrid (40 µl, 0,4 mmol) in Dichlormethan (2 ml) wurden während 30 min Schutzgruppen eingeführt. Der am Ende vorliegende PEG-PS-Propfpolymerträger (0,49 g) wies aufgrund der Elementaranalyse und der Aminosäureanalyse ein Verhältnis PEG:PS:Nle von 0,51:0,45:0,04 auf, woraus berechnet werden kann, daß etwa 40 % der PEG-Ketten Vernetzungen eingegangen waren.

Beispiel 5.

Verfahren zum Entfernen der endständigen Maleylgruppen

Der in Beispiel 4 hergestellte PEG-funktionalisierte Träger wurde mit Trifluorethanol in einer Sinternutsche gewaschen und in einen silanisierten Rundkolben übergeführt. Ein Gemisch von Trifluorethanol/Trifluoressigsäure/Wasser (8:1:1, 50 ml) wurde zugegeben, und die Suspension wurde auf Rückflußtemperatur erwärmt (Ölbadtemperatur 100 ºC) und mit einem Magnetrührer 24 h gerührt. Das Material wurde anschließend mit Dichlormethan, 5 % DIEA in Dichlormethan und Methanol gewaschen und im Vakuum mit P&sub2;O&sub5; getrocknet. Der Gehalt an Aminogruppen wurde an einer aliquoten Menge durch Pikrinsäuretitration oder durch Beladen mit einer FMOC- Aminosäure bestimmt. Das am Ende vorliegende PEG-PS weist ein Verhältnis PEG:PS von 0,45:0,55 und eine Beladung von 0,17 mmol/g auf, (aufgrund der CHN-Elementaranalyse und der Aminosäureanalyse); es kann berechnet werden, daß etwa 65 % der PEG-Ketten in diesem Träger als Spacer dienen, wobei die restlichen Ketten Vernetzungen eingegangen sind.

Beispiel 6

Verfahren zur Ethylendiaminaddition

Der PEG-PS-Träger aus Beispiel 5 (0,4 g, 0,12 mmol anfänglich vorhandene Norleucin (Nle)-Stellen) wurde für eine anfängliche Quellung mit Dichlormethan gewaschen, wonach N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIPCDI) (94 µl, 0,6 mmol) und HOBt (81 mg, 0,6 mmol) in DMF (2 ml) zu dem Harz für eine 5minütige Voraktivierung gegeben wurden. Dann wurde Ethylendiamin (40 µl, 0,6 mmol) in DMF (0,5 ml) zu dem Harz gegeben und 5 Stunden umgesetzt; am Ende wurde mit DMF, Dichlormethan und Methanol gewaschen. Das Harz (0,4 g, keine Gewichtsänderung in diesem Schritt) wurde im Vakuum über P&sub2;O&sub5; getrocknet, wonach die üblichen Beladungsbestimmungen mit 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Alanin (FMOC-Ala) zeigten, daß der Substitutionsgrad 0,11 mmol/g bei einem Verhältnis von Alanin-Norleucin (Ala:Nle) von 0,3 betrug (was mit der früheren Schätzung des Vernetzungsgrades übereinstimmt).

Beispiel 7

Diskontinuierliche Peptidsynthese mit dem Polyethylenglykol-Polystyrol-Pfropfpolymer (PEG-PS)

Das PEG-PS wurde nach dem Verfahren aus Beispiel 4 und 5 hergestellt; mit 5 g p-Methylbenzhydrylaminharz (mit einer Beladung vom 0,6 mmol/g) wurden 8,7 g PEG-PS (Beladung 0,17 mmol/g) hergestellt. 2 g PEG-PS wurden mit einer FMOC- PAL [5'-(4"-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-aminoethyl-3,5- dimethoxyphenoxy)-valeriansäure] Handle-Gruppe verlängert, die durch die BOP + HOBt-Vorgehensweise (D. Hudson, J. Org. Chem. 53 (1987) 617-624 gebunden wurden, wodurch ein vollständig funktionalisiertes Ninhydrin-negatives Produkt erhalten wurde. Unter Verwendung eines Peptidsynthesizers Milligen/Biosearch Modell 9600 wurde ein Testpeptid, das Acylcarrierprotein 65-74, mit den Standard-BOP + HOBt- Kupplungsprogrammen (Milligen/Biosearch, Novato, CA) hergestellt. Zur Herstellung der gleichen Sequenz wurden in aufeinanderfolgenden Arbeitsgängen auch Pepsyn K , normales Polystyrol sowie Tentagel als Träger verwendet. Die resultierenden Peptide wurden durch Aminosäurenanalyse (AAA), Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie unter Beschuß mit schnellen Atomen (FAB, fast atom bombardment) untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß die Synthese unter Verwendung von PEG-PS das Produkt mit der höchsten Ausbeute und mit höherer Reinheit ergab.

Claims

1. Harz für die Festphasen-Peptidsynthese, das die Formel

aufweist, in der bedeuten:

- n eine ganze Zahl von 5 bis 150,

- R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; Gruppen, die unabhängig voneinander unter Wasserstoff, Alkylgruppen und Arylgruppen ausgewählt sind,

- X Wasserstoff oder H&sub2;N-B-NH-C(O)-A-C(O)-, wobei A und B Gruppen, die unabhängig voneinander unter geradkettigen und verzweigten Alkylgruppen mit bis zu 10 Kohlenstoffatomen, -CH=CH-Gruppen und aromatischen Gruppen ausgewählt sind, bedeuten, und

- SS einen festen Träger, wobei die ω-Aminogruppe wahlweise durch eine Nω- Schutzgruppe geschützt ist.

2. Harz nach Anspruch 1, wobei R¹, R², R³, R&sup4;, R&sup5; und R&sup6; unabhängig Wasserstoff, Methylgruppen oder Ethylgruppen darstellen.

3. Harz nach Anspruch 1, wobei A unter Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen und Isobutylen ausgewählt ist.

4. Harz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der feste Träger unter aminofunktionalisierten Membranen, aminofunktionalisiertem porösem Glas, aminofunktionalisiertem Siliciumdioxid, aminofunktionalisierten Polystyrolen, aminofunktionalisierten Polydimethylacrylamiden, aminofunktionalisierter Baumwolle und aminofunktionalisiertem Papier ausgewählt ist.

5. Harz nach Anspruch 4, wobei das Polystyrol unter Aminopolystyrolen, Aminomethylpolystyrolen, Aminoacylpolystyrolen und p-Methylbenzhydrylaminopolystyrolen ausgewählt ist.