DE60017955T2

DE60017955T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur peptidsynthese

Info

Publication number: DE60017955T2
Application number: DE60017955T
Authority: DE
Inventors: Brian Bray; Marc Andersen; E. Paul FRIEDRICH; Myung-Chol Kang
Original assignee: Trimeris Inc
Current assignee: Trimeris Inc
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2006-01-12
Anticipated expiration: 2020-07-06
Also published as: ATE288278T1; BR0012249A; DE60017955D1; CA2378086A1; CN1450906A; WO2001034635A9; EP1372686B1; TWI237640B; CN1267449C; AR024686A1; US6469136B1; MXPA02000021A; KR20020038676A; AU4133701A; WO2001034635A2; DK1372686T3; KR100631874B1; EP1372686A2; US20030125516A1; JP2003530311A

Description

1. EINFÜHRUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich erstens auf Verfahren für die Synthese von Peptiden, insbesondere Peptiden, auf die hierin als T-1249 (SEQ ID Nr. 1) und T-1249-ähnliche Peptide Bezug genommen wird. Solche Verfahren nutzen Fest- und Flüssigphasensynthesevorgänge, um Gruppen spezifischer Peptidfragmente zu synthetisieren und zu kombinieren, um das Peptid von Interesse zu liefern. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiter auf einzelne Peptidfragmente, die als Zwischenprodukte bei der Synthese der Peptide von Interesse (z. B. T-1249) wirken können. Die vorliegende Erfindung bezieht sich immer noch weiter auf Gruppen solcher Peptidzwischenfragmente, die gemeinsam genutzt werden können, um T-1249 und T-1249-ähnliche Peptide voller Länge zu erzeugen. Die vorliegende Erfindung beschreibt noch weiter Verfahren für die Aufreinigung von Peptiden, insbesondere von T-1249 und T-1249-ähnlichen Peptiden, und die einzelnen Peptidfragmente, die als Zwischenprodukte bei der Synthese der gegenständlichen Peptide wirken.
2. HINTERGRUND
Kürzlich wurde eine große Anzahl an Peptiden identifiziert, die eine Fähigkeit ausüben, fusionsverknüpfte Ereignisse zu inhibieren und die wichtigerweise ebenfalls eine potente antivirale Aktivität zeigen. Siehe z. B. US-Patente Nrn. 5,464,933, 5,656,480; PCT-Veröffentlichungen Nrn. WO 94/28920, WO 96/19495. Indem diese Peptide ausgedehnt verwendet werden, z. B. als Therapeutika, steigt der Bedarf für eine Fähigkeit, sie in Mengen mit großem Umfang zu synthetisieren.
Während Techniken für die Peptidsynthese existieren (siehe z. B. Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters, 29: 4005–4008; Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters, 29: 4009–4012; Kamber et al. (Hrsg.), "Peptides, Chemistry and Biology", ESCOM, Leiden, 1992, 525–526; und Riniker et al., 1993, Tetrahedron Letters, 49: 9307–9320), existieren gegenwärtig keine Techniken, die für die ökonomische Produktion im großen Umfang von leicht gereinigten Peptiden wie T-1249 genutzt werden könnten.
3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich erstens auf Verfahren für die Synthese von Peptiden, insbesondere Peptiden, auf die hierin Bezug genommen wird als T-1249 (SEQ ID Nr. 1) und T-1249-ähnliche Peptide. Solche Verfahren nutzen Fest- und Flüssigphasensynthesevorgänge, um Gruppen spezifischer Peptidfragmente zu synthetisieren und zu kombinieren, um das Peptid von Interesse zu liefern. Allgemein umfassen die Verfahren der Erfindung das Synthetisieren spezifischer Peptidfragmentzwischenprodukte mit geschützten Seitenketten von T-1249 oder einem T-1249-ähnlichen Peptid auf einem festen Träger, das Koppeln der geschützten Fragmente in Lösung, um ein geschütztes T-1249- oder T-1249-ähnliches Peptid zu bilden, gefolgt von der Deprotektionierung der Seitenketten, um das endgültige T-1249- oder T-1249-ähnliche Peptid zu ergeben. Eine bevorzugte Ausführung der Verfahren der Erfindung schließen die Synthese eines T-1249-Peptids mit einer Aminosäuresequenz ein, wie sie in SEQ ID Nr. 1 abgebildet ist.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf einzelne Peptidfragmente, die als Zwischenprodukte bei der Synthese der Peptide von Interesse (z. B. T-1249) wirken. Die Peptidfragmente der Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf jene, die Aminosäuresequenzen haben, wie in Tabelle 1 unten dargestellt:
TABELLE 1
Die vorliegende Erfindung bezieht sich noch weiter auf bestimmte Gruppen von Peptidfragmenten, die als Zwischenprodukte bei der Synthese des Peptides von Interesse wirken. Die Gruppen an Peptidfragmenten gemäß der Erfindung schließen die Gruppen 1 bis 6 ein, wie in Tabelle 2 unten bezeichnet.
TABELLE 2
Diese Erfindung wird zum Teil auf der unerwarteten Entdeckung der Erfinder basiert, dass es gewisse Kombinationen von Festphasen-Flüssigphasen-Synthesereaktionen erlauben, hochreine T-1249- und T-1249-ähnliche Peptide zum ersten Mal in einem großen Umfang mit hohem Durchsatz und einer hohen Ausbeute herzustellen. Insbesondere können T-1249- und T-1249-ähnliche Peptide in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung in einem Umfang von einem oder mehreren Kilogramm synthetisiert werden. Es wurde gefunden, dass durch das Selektieren der spezifischen T-1249-Peptidfragmente der Erfindung für Festphasensynthese das hocheffiziente Koppeln von Festphasentechniken ausgenutzt werden kann, ohne dass der 3-, 4- oder sogar 5-fache Überschuss an Aminosäuren und Reagenzien verwendet werden muss, der normalerweise für die Festphasensynthese erforderlich ist. Die Verfahren der Erfindung verwenden nur ungefähr einen 0,5-fachen Überschuss (ungefähr 1,5 Äquivalente) an Aminosäuren bei der Festphasensynthese der Peptidfragmente der Erfindung. Diese Reduktion in der Menge an Aminosäuren und Reagenzien macht die Verfahren der Erfindung für die Synthese von T-1249- und T-1249-ähnlichen Peptiden im großen Umfang geeignet.
Zusätzlich haben die Erfinder überraschenderweise gefunden, dass gewisse Peptidfragmente in der festen Phase bei einer Beladung von ungefähr > 0,5 mmol pro Gramm Festphasenharz synthetisiert werden können. Diese Beladung steigert den Durchsatz gegenüber dem Ladungsbereich von 0,25 bis 0,35 mmol pro Gramm Harz, der typischerweise bei der Festphasenpeptidsynthese erreicht wird, signifikant. Ferner fanden die Erfinder, das das Synthetisieren ausgewählter Peptidfragmente in der festen Phase unter Verwendung von für Übersäuren sensitivem Harz Peptidfragmente von ungewöhnlich hoher Reinheit erzeugt. Chromatographietechniken sind nicht notwendig, um die gemäß der Erfindung hergestellten Peptidfragmente zu reinigen; die Fragmente werden einfach durch Fällungs- und/oder Pulverisierungsschritte vor der Verwendung hindurchgeführt oder werden so verwendet, wie sie direkt von dem Harz gewonnen werden. Die Verwendung eines für Supersäuren empfindlichen Harzes ermöglicht es, dass die synthetisierten, geschützten Peptide der Erfindung von dem Harz abgespalten werden, ohne gleichzeitige Entfernung der Seitenkettenschutzgruppen. Dies reduziert Unreinheiten und erlaubt es, Peptide, die 10 Aminosäuren oder mehr umfassen, in hoher Reinheit und Ausbeute zu synthetisieren.
Das Verunreinigungsprofil von T-1249 und T-1249-ähnlichen Peptiden, die in der Lösungsphase gemäß den Verfahren der Erfindung durch Koppeln der gemäß der Erfindung erzeugten hochreinen Peptidfragmente synthetisiert werden, besteht aus Fragmenten, die nicht koppelten und enthält signifikant niedrigere Spiegel eng verwandter Deletionsanaloga als T-1249 und T-1249-ähnliche Peptide, die mit üblichen Techniken, z. B. einfach nur Festphasensynthese, synthetisiert worden sind. Demgemäß sind gemäß der Erfindung hergestellte T-1249- und T-1249-ähnliche Peptide viel einfacher zu reinigen als jene, die mit üblichen Techniken hergestellt worden sind. Insbesondere kann T-1249, hergestellt gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, leicht auf > 90% Reinheit in einer Chromatographie mit einem einzigen Durchgang aufgereinigt werden. Zum Beispiel kann T-1249 in Übereinstimmung mit den Verfahren der Erfindung in Mengen von 400 g oder mehr unter Verwendung einer 5-Inch-Säule gereinigt werden. Im Gegensatz dazu ist T-1249, das unter Verwendung von üblichen Festphasensynthesen (SPPS) zubereitet worden ist, sehr schwierig zu reinigen, was Chromatographie mit mehrfachen Durchgängen erfordert. Im Wege des Beispiels resultiert die Reinigung von durch SPPS zubereitetem T-1249 typischerweise in 10 g oder weniger gereinigtem Material von einer 8-Inch-Säule.
Die im Abschnitt 9 unten vorgestellten Beispiele belegen solche kombinatorischen Synthesen von T-1249-Peptiden voller Länge. Die T-1249- und T-1249-ähnlichen Peptide und Zwi schenprodukte können in einem Maßstab von einem oder mehreren Kilogramm durch die Verfahren der Erfindung hergestellt werden.
Die vorliegenden Erfinder haben ebenfalls unerwarteterweise herausgefunden, dass Peptide wie T-1249 und andere T-1249-ähnliche Peptide, ebenso wie gewisse hierin beschriebene Peptidfragmente unter Verwendung von Materialien mit hoher Kapazität gereinigt werden können, wegen der hohen Reinheit von T-1249 nach der Lösungsphasensynthese. Folglich beschreibt die vorliegende Erfindung noch weiter Verfahren für die Aufreinigung von Peptiden, insbesondere T-1249 und T-1249-ähnlichen Peptiden, und der einzelnen Peptidfragmente, welche als Zwischenprodukte bei der Synthese der gegenständlichen Peptide wirken.
3.1 DEFINITIONEN
Die hierin verwendeten Aminosäurebezeichnungen sind üblich und sind wie folgt:
Allgemeine Aminosäureabkürzungen
4. KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: T-1249-Drei-Fragment-Ansatz. Diese Figur bildet das Schema ab, dem in den Beispielen, die in den Abschnitten 8 und 9 unten vorgestellt werden, für die Synthese von T-1249 voller Länge gefolgt wird, beginnend mit der Zwischenpeptidfragmentgruppe 1, wie in Tabelle 2 oben gezeigt, und veranschaulicht ein nicht begrenzendes Ausführungsbeispiel der Verfahren der Erfindung.
5. DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
5.1 PEPTIDE VOLLER LÄNGE
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren, Peptidfragmente, Gruppen von Peptidfragmenten, die verwendet werden können, um das als T-1249 bekannte Peptid zu synthetisieren. T-1249 ist ein 39 Aminosäurenreste langes Polypeptid, dessen Sequenz von viralen HIV-1-, HIV-2- und SIV-gp41-Polypeptidsequenzen abgeleitet worden ist. T-1249 hat die folgende Aminosäuresequenz:
NH₂-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-COOH
Es wird verstanden werden, dass die Verfahren, Fragmente und Gruppen von Fragmenten und Techniken, die für das Auswählen der Fragmente und Gruppen von Fragmenten der vorliegenden Erfindung genutzt werden, verwendet werden können, um T-1249-ähnliche Fragmente zusätzlich zu T-1249 zu synthetisieren. Der Begriff "T-1249-ähnlich", wie er hierin verwendet wird, bedeutet irgendein HIV- oder Nicht-HIV-Peptid, das in der internationalen Veröffentlichung Nr. PCT/US99/11212, angemeldet am 20. Mai 1999, aufgelistet ist.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen T-1249- und T-1249-ähnlichen Peptiden können die Verfahren, Fragmente und Fragmentgruppen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um Peptide mit modifizierten amino- und/oder carboxyterminalen Enden zu synthetisieren. Wenn T-1249 als ein Beispiel genommen wird, können solche Peptide die folgende Formel haben:
X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z
worin X für eine Aminogruppe, eine hydrophobe Gruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbobenzoxyl, Dansyl und t-Butyloxycarbonyl, eine Acetylgruppe, eine 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-(FMOC)-Gruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipid-Fettsäure-Konjugaten, Polyethylenglykol und Kohlenhydraten, steht und Z für eine Carboxylgruppe, eine Amidgruppe, eine t-Butyloxycarbonylgruppe, eine Paranitrobenzylestergruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipid-Fettsäure-Konjugaten, Polyethylenglykol und Kohlenhydraten steht. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Verfahren der Erfindung verwendet, um das Peptid mit der obigen Formel zu synthetisieren, worin X eine Acetylgruppe und Z eine Amidgruppe ist. Techniken für die Addition solcher "X"- und "Z"- Gruppen sind Fachleuten wohl bekannt.
In einem bevorzugten Verfahren können T-1249- und T-1249-ähnliche Peptide und Zwischenprodukte unter Verwendung von irgendeiner nicht auf Kieselsäure basierenden Säulenpackung (um die Ladungskapazität zu maximieren) gereinigt werden, einschließlich, jedoch nicht begrenzt auf auf Zirkonium basierende Packungen, auf Polystyrol, Polyacrylsäure oder einem anderen Polymer basierende Packungen, die bei hohen und niedrigen pH-Bereichen stabil sind. Zum Beispiel befinden sich unter den nicht mit Kieselsäure beladenen Säulenpackungen, die einen breiten pH-Bereich zeigen, der pH-Werte einschließt, die höher sind als 7, jene, die von Tosohaas (Montgomeryville, PA) verkauft werden. Säulen, die mit solchem Material gepackt sind, können in der Chromatographie mit niedrigem, mittlerem oder hohem Druck laufen gelassen werden, gemäß im Stand der Technik wohl bekannten Standardtechniken.
Die in Abschnitt 9 unten vorgestellten Beispiele demonstrieren die erfolgreiche Synthese von T-1249-Peptiden im Wege des Koppelns der unten in Abschnitt 5.2 beschriebenen Peptidzwischenprodukte.
5.2 PEPTIDZWISCHENPRODUKTE
Die vorliegende Erfindung schließt ein, ist jedoch nicht begrenzt auf Peptidfragment-Zwischenprodukte von T-1249 und T-1249-ähnlichen Peptiden mit spezifischen Aminosäuresequenzen, wie sie in Tabelle 1 oben aufgelistet sind, und die Gruppen der Peptidfragment-Zwischenprodukte, die in Tabelle 2 aufgelistet sind. Solche Peptidzwischenprodukte unten, insbesondere in Gruppen, wie in Tabelle 2 aufgelistet, können genutzt werden, um T-1249 und T-1249-ähnliche Peptide zu produzieren.
Jede einzelne oder mehrere der Seitenketten der Aminosäurereste der Peptidfragmente, die in Tabelle 1 oder 2 aufgelistet sind, können mit Standardschutzgruppen wie t-Butyl (t-Bu), Trityl (trt) und t-Butyloxycarbonyl (Boc) geschützt werden. Die t-Bu-Gruppe ist die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für die Aminosäurereste Tyr (Y), Thr (T), Ser (S), Glu (E) und Asp (D); die trt-Gruppe ist die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für die Aminosäurereste Gln (Q) und Asn (N); und die Boc-Gruppe ist die bevorzugte Seitenkettenschutzgruppe für die Aminosäurereste Lys (K) und Trp (W).
Vorzugsweise werden die Gln-(Q)-Reste der Peptidfragmente der Erfindung mit Trityl-(trt)-Gruppen geschützt. Falls jedoch eine niedrigere Löslichkeit von irgendeinem der Peptidfragmente der Erfindung in organischen Lösungsmitteln gewünscht wird, können die Tritylschutzgruppen von irgendeinem oder mehreren der Glutaminreste der Fragmente eliminiert werden.
Vorzugsweise werden die Asn-(N)-Reste jedes Peptidfragmentes der Erfindung geschützt. Zusätzlich ist es bevorzugt, dass die Trp-(W)-Reste mit einer Boc-Gruppe geschützt werden.
Geschützte Peptidfragmente gemäß den in Tabelle 1 oben aufgelisteten Peptidformeln 1–5 schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die in Tabelle 3 unten aufgelisteten Verbindungen.
TABELLE 3
Irgendeine oder mehrere der Seitenketten der Aminosäurereste der in Tabelle 3 oben aufgelisteten Peptide können mit Standard-Seitenkettenschutzgruppen wie t-Bu, trt und Boc, wie oben beschrieben, geschützt werden. Repräsentative Synthesen der Peptide von Tabelle 3 werden in den Abschnitten 7 und 8 unten vorgestellt, welche die in Abschnitt 5.3 unten diskutierten allgemeinen Techniken nutzen.
5.3 PEPTIDSYNTHESE
Wie oben diskutiert, werden etliche der einzelnen Peptidfragmente der Erfindung vorzugsweise unter Verwendung von Festphasensynthesetechniken hergestellt, während andere Peptide der Erfindung vorzugsweise unter Verwendung einer Kombination von Festphasen- und Lösungsphasensynthesetechnik gemacht werden, wobei diese Synthesen in der Produktion von T-1249 und T-1249-ähnlichen Peptiden, wie hierin beschrieben, gipfeln. Es wird jedoch verstanden werden, dass die Peptidfragmente der Erfindung durch im Stand der Technik wohl bekannte Techniken synthetisiert oder zubereitet werden können. Siehe z. B. Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY.
Die Peptide der Erfindung können alternativ so synthetisiert werden, dass eine oder mehrere der Bindungen, welche die Aminosäurereste der Peptide verknüpfen, Nicht-Peptidbindungen sind. Diese alternativen Nicht-Peptidbindungen können unter Ausnutzen von Reaktionen, die Fachleuten wohl bekannt sind, gebildet werden und können einschließen, sind jedoch nicht begrenzt auf Imino-, Ester-, Hydrazid-, Semicarbazid- und Azobindungen, um nur ein paar zu nennen.
In noch einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung können T-1249 und T-1249-ähnliche Peptide, welche die oben beschriebenen Sequenzen umfassen, mit zusätzlichen chemischen Gruppen, die an ihren Amino- und/oder Carboxylenden vorhanden sind, synthetisiert werden, so dass z. B. die Stabilität, Reaktionsfähigkeit und/oder Löslichkeit, der Peptide erhöht wird. Zum Beispiel können hydrophobe Gruppen wie Carbobenzoxyl-, Dansyl-, Acetyl- oder t-Butyloxycarbonylgruppen zu den Aminotermini der Peptide hinzugefügt werden. Ähnlich kann eine Acetylgruppe oder eine 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe an den Aminotermini der Peptide platziert werden. (Siehe "X"-Modifikation von T-1249, oben beschrieben.) Zusätzlich kann die hydrophobe Gruppe t-Butyloxycarbonyl oder eine Amidgruppe an die Carboxylenden der Peptide angeheftet werden. Ähnliche kann eine Paranitrobenzylester- oder Benzylestergruppe an den Carboxylenden der Peptide platziert werden. (Siehe "Z"-Modifikation von T-1249, beschrieben oben.) Techniken für das Einführen solcher Modifikationen sind Fachleuten wohl bekannt.
Ferner könnten T-1249 und T-1249-ähnliche Peptide so synthetisiert werden, dass ihre sterische Konfiguration geändert wird. Zum Beispiel kann das D-Isomer von einem oder mehreren der Aminosäurereste der Peptide verwendet werden, eher als das übliche L-Isomer.
Immer noch weiter kann wenigstens einer der Aminosäurereste der Peptide der Erfindung durch einen der wohl bekannten, nicht natürlich vorkommenden Aminosäurereste ersetzt werden. Änderungen wie diese können dazu dienen, die Stabilität, das Reaktionsvermögen und/oder die Löslichkeit der Peptide der Erfindung zu steigern.
Jedes der T-1249- und T-1249-ähnlichen Peptide kann synthetisiert werden, um zusätzlich eine makromolekulare Trägergruppe zu haben, die kovalent an ihre Amino- und/oder Carboxytermini angeheftet ist. Solche makromolekularen Trägergruppen können z. B. Lipid-Fettsäure-Konjugate, Polyethylenglykol, Kohlenhydrate oder zusätzliche Peptide einschließen. Die oben beschriebene "X"-Modifikation von T-1249 kann deshalb zusätzlich irgendeine der obigen makromolekularen Trägergruppen repräsentieren, die kovalent an den Aminoterminus eines Peptides angeheftet sind, wobei eine zusätzliche Peptidgruppe bevorzugt ist. Ähnlich kann die oben beschriebene "Z"-Modifikation von T-1249 zusätzlich irgendeine der oben beschriebenen makromolekularen Trägergruppen darstellen.
Vorzugsweise werden die Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung durch Festphasenpeptidsynthese-(SPPS)-Techniken unter Verwendung von Standard-FMOC-Protokollen synthetisiert. Siehe z. B. Carpino et al., 1970, J. Am. Chem. Soc., 92(19): 5748–5749; Carpino et al., 1972, J. Org. Chem., 37(22): 3404–3409. In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird die Festphasensynthese der Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung auf für Supersäuren empfindlichen festen Trägern durchgeführt, die einschließen, jedoch nicht begrenzt sind auf 2-Chlortritylchloridharz (siehe z. B. Barlos et al., 1989, Tetrahedron Letters, 30(30): 3943–3946) und 4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxybuttersäureharz (siehe z. B. Seiber, 1987, Tetrahedron Letters, 28(49): 6147–6150, und Richter et al., 1994, Tetrahedron Letters, 35(27): 4705–4706). Sowohl 2-Chlortritylchlorid- und 4-Hydroxymethyl-3-methoxyphenoxybuttersäureharze können von Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA, erworben werden.
Allgemein werden hierin nicht begrenzende Verfahren für die Herstellung und das Beladen von Harzen beschrieben, die bei der Festphasenpeptidsynthese genutzt werden können. Zusätzlich beschreiben die in Abschnitt 6 unten vorhandenen Beispiele exemplarisch Harzzubereitungen.
Harzbeladung kann z. B. im Wege der folgenden Techniken durchgeführt werden: Das Harz, vorzugsweise ein für Supersäuren empfindliches Harz, wie das 2-Chlortritylharz, wird in die Reaktionskammer gefüllt. Das Harz wird mit einem chlorierten Lösungsmittel wie Dichlormethan (DCM) gewaschen. Das Bett wird entleert und eine Lösung aus 0,5 bis 1,5 Äquivalenten einer Aminosäure mit einem 0,2- bis 0,5-fachen Überschuss an Diisopropylethylamin (DIEA) in ungefähr 8–10 Volumina Dichlorethan (DCE) wird hinzugefügt. Der N-Terminus der Aminosäure sollte geschützt sein, vorzugsweise mit Fmoc, und die Seitenkette der Aminosäure sollte, wo es notwendig oder geeignet ist, geschützt sein. Die Mischung wird unter Stickstoffbegasung für 2 bis 24 Stunden geschüttelt.
Es sollte festgestellt werden, dass ein chloriertes Lösungsmittel wie DCM oder DCE für das adäquate Schwellen des 2-Chlortritylharzes wünschenswert ist.
Nach dem Schütteln wird das Bett entleert und mit DCM gewaschen. Die aktiven Zentren auf dem Harz werden mit einer 9:1-MeOH:DIEA-Lösung für ungefähr 20–30 Minuten dem End-Capping unterzogen. Das Bett wird entleert, viermal mit DCM gewaschen und mit einer Stickstoffspülung getrocknet, um das beladene Harz zu ergeben.
Fmoc ist die bevorzugte Schutzgruppe für den N-Terminus der Aminosäure. In Abhängigkeit davon, welche Aminosäure geladen wird, kann ihre Seitenkette geschützt sein oder nicht. Zum Beispiel sollte ihre Seitenkette, wenn Tryptophan (Trp) geladen wird, mit Boc geschützt sein. Es ist jedoch nicht notwendig, die Seitenkette von Leucin (Leu) zu schützen. Vorzugsweise werden Glutaminsäure (Glu), Asparaginsäure (Asp), Threonin (Thr) und Serin (Ser) als t-Butylether oder t-Butylester geschützt und Tryptophan (Trp) und Lysin (Lys) werden als t-Butoxycarbonylcarbamate (Boc) geschützt. Die Amidseitenkette von Asparagin (Asn) und Glutamin (Gln) kann mit Tritylgruppen geschützt sein oder nicht.
Die mit Fmoc geschützten Aminosäuren, die beim Laden des Harzes und bei der Peptidsynthese verwendet werden, sind mit oder ohne Seitenkettenschutzgruppen, wie erforderlich, von zahlreichen Verkäufern erhältlich, einschließlich Senn oder Genzyme. Als eine Alternative zu dem obigen Vorgehen kann das Harz bereits mit der geeigneten Aminosäure beladen erworben werden.
Die in Abschnitt 6 unten vorgestellten Beispiele beschrieben beispielhafte Harzzubereitungen.
Festphasensynthesetechniken können z. B. gemäß den folgenden, nicht begrenzenden Techniken durchgeführt werden: Das beladene Harz wird zu der Reaktionskammer hinzugefügt und mit einem Lösungsmittel, vorzugsweise Methylenchlorid (DCM; vorzugsweise mit ungefähr 10 Vol.) unter Stickstoffschütteln oder Rühren für ungefähr 15 Minuten konditioniert, um die Harzperlen anzuschwellen. DCM wird für das adäquate Schwellen des 2-Chlortritylharzes benötigt. Das Harzvolumen wird auf das 3–6-fache in der Reaktionskammer ansteigen, indem die Perlen schwellen, und die aktiven Zentren entfalten sich und werden für die Reaktion zugänglich. Nachdem das Harz geschwollen ist, wird das Lösungsmittel von der Reaktionskammer abgelassen.
Das Entfernen der Fmoc-(9-Fluorenylmethyloxycarbonyl)-Schutzgruppe von dem endständigen Amin oder dem Harz kann durch Behandeln des Harzes mit zwei Aliquoten einer 20%igen Lösung von Piperidin in N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für ungefähr jeweils 10 Minuten bewerkstelligt werden. Das Volumen der 20%igen Lösung von Piperidin in NMP, das für jede Aliquote benötigt wird, wird von dem Umfang der abgelaufenen Reaktion abhängen. Das Harz wird dann 5–7 mal mit Aliquoten von NMP (ungefähr 10 Vol.) gewaschen, um die Fmoc-Nebenprodukte (das heißt Dibenzofulven und seine Piperidinanhänge) und das restliche Piperidin zu entfernen.
Ein Chloraniltest kann verwendet werden, um festzustellen, ob das Entfernen von restlichem Pyridin abgeschlossen ist. Die Chloraniltestlösung wird durch Hinzufügen eines Tropfens einer gesättigten Lösung Chloranil in Toluol zu ungefähr 1 ml Aceton zubereitet. Die NMP-Waschschritte können durch Hinzufügen eines Tropfens der Waschlösung zu der Chloraniltestlösung getestet werden. Eine blaue oder violette Farbe ist ein positives Anzeichen für die Anwesenheit von sekundärem Amin, was anzeigt, dass restliches Piperidin immer noch anwesend ist. Die NMP-Waschschritte werden solange wiederholt bis die blaue oder violette Farbe nicht länger beobachtet wird.
In der Zwischenzeit wird die nächste Aminosäure in der Sequenz, die zu dem Harz hinzugefügt werden soll, für die Reaktion an ihrem Carboxyterminus aktiviert. Der Aminoterminus jeder Aminosäure sollte mit Fmoc geschützt sein. In Abhängigkeit davon, welche Aminosäure hinzugefügt wird, kann ihre Seitenkette geschützt sein oder nicht. Vorzugsweise werden die Seitenketten von Tyr (Y), Thr (T), Ser (S), Glu (E) und Asp (P) mit t-Bu geschützt, die Seitenketten von Gln (Q) und Asn (N) werden mit trt geschützt und die Seitenketten von Lys (K) und Trp (W) werden mit Boc geschützt. Es ist nicht notwendig, dass die Seitenketten von Leu oder Ile geschützt werden.
Die Aminosäure kann wie folgt aktiviert werden. Die mit Fmoc geschützte Aminosäure (1,5 Äq.), 1-Hydroxybenzotriazolhydrat (HOBT) (1,5 Äq.) und Diisopropylethylamin (DIEA) (1,5 Äq.) werden in einem polaren aprotischen Lösungsmittel wie N-Methylpyrrolidinon (NMP), Dimethylformamid (DMF) oder Dimethylacetamid (DMAC) (ungefähr 7,5 Vol.) bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird auf 0–5°C abgekühlt und dann werden O-Benzotriazol-1-yl-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) oder O-Benzotriazol-1-yl-tetramethyltetrafluorborat (TBTU) (1,5 Äq.) hinzugefügt, gefolgt von Rühren für 5–15 Minuten, um zu lösen. Es ist wichtig, dass die Aktivierung bei 0–5°C durchgeführt wird, um die Racemisierung der Aminosäure zu minimieren. Das HBTU ist das letzte Reagens, das zu der kalten Lösung hinzugefügt wird, da Aktivierung und Racemisierung in seiner Abwesenheit nicht stattfinden können.
Die Lösung aus aktivierter Aminosäure wird auf das entleerte Harz geladen, wobei es mit DCM (annähernd 2,5 Vol.) eingewaschen wird. Merke, dass die Aktivierung der Aminosäure in NMP wegen der Unlöslichkeit von HBTU in DCM durchgeführt wird. DCM wird jedoch zu der Reaktion an diesem Punkt hinzugefügt, um das adäquate Schwellen der Harzperlen aufrecht zu halten. Die Reaktion wird unter N₂-Begasung für ungefähr 1 Stunde bei 20–30°C geschüttelt. Kopplungsvervollständigung kann mit einem qualitativen Ninhydrintest, wie unten beschrieben, überwacht werden.
Um den Abschluss der Reaktion unter Verwendung von qualitativem Ninhydrintest zu überprüfen, kann eine Probe mit 2–20 mg des Harzes entnommen und mit Methanol sauber gewaschen werden. Zu der Probe werden 3 Tropfen einer 76%igen Lösung von Phenol in Ethanol, 4 oder 5 Tropfen einer 0,2 mM KCN-Lösung in Pyridin und 3 Tropfen einer 0,28 M Lösung Ninhydrin in Ethanol hinzugefügt. Die Probe wird mit Ethanol auf ein Volumen von ungefähr 0,5 ml verdünnt und wird in einen Heizblock bei ungefähr 75°C für 5–10 Minuten gestellt. Eine blaue oder violette Farbe ist ein positives Anzeichen für die Anwesenheit freier Amine, was anzeigt, dass Reaktion noch nicht abgeschlossen ist. Die Probe kann weiter auf ein Volumen von ungefähr 3 ml verdünnt werden, um leichter den Grad der Farbänderung in der konzentrierten Probe zu eichen.
Falls ein positiver Ninhydrintest nach einer Stunde beobachtet wird, wird die Kopplungsreaktion für eine zusätzliche Stunde fortgesetzt. Falls der positive Ninhydrintest nach 3 Stunden fortdauert, wird das Harz entleert, einmal in annähernd 10 Volumen NMP gewaschen und die Kopplungsreaktion wird unter Verwendung von 0,5–1 Äquivalenten aktivierter Aminosäure wiederholt.
Falls das Harz über Nacht zwischen den Kopplungszyklen gelagert werden muss, kann das Harzbett entleert und mit NMP unter einer Stickstoffdecke bedeckt werden. Alternativ kann das Bett entleert, unter einer Stickstoffdecke gelagert und dann mit einer DCM-Waschung vor dem Fortschreiten mit dem nächsten Kopplungszyklus konditioniert werden. Falls das abgeschlossene Fragment über Nacht vor dem Abspalten gelagert werden muss, sollte das Harzbett frei von NMP mit IPA gewaschen werden, da eine signifikante Fmoc-Deprotektionierung in NMP geschehen kann.
Nachdem das Koppeln als abgeschlossen beurteilt worden ist, wird das Harz entleert und mit drei Aliquoten (annähernd 10 Vol.) NMP gewaschen. Der Zyklus wird für nachfolgende Struktureinheiten (das heißt Aminosäuren) des Peptidfragments wiederholt. Nach der letzten Kopplungsreaktion wird das Harz mit 4 Aliquoten (ungefähr 10 Vol.) NMP und dann mit 2 Aliquoten (annähernd 10 Vol.) DCM und 2 IPA gewaschen. Das harzgebundene Peptid kann mit einer Stickstoffspülung oder in einem Ofen getrocknet werden.
Peptide, die über Festphasensynthesetechniken synthetisiert wurden, können abgespalten und isoliert werden, gemäß z. B. den folgenden nicht begrenzenden Techniken: Das Peptid kann von dem Harz unter Verwendung von Fachleuten wohl bekannten Techniken abgespalten werden. Zum Beispiel können Lösungen von 1% oder 2% Trifluoressigsäure (TFA) in DCM oder eine Kombination einer 1%- und einer 2%-Lösung TFA in DCM verwendet werden, um das Peptid abzuspalten. Essigsäure (HOAC), Salzsäure (HCl) oder Ameisensäure können ebenfalls verwendet werden, um das Peptid abzuspalten. Das spezifische Abspaltungsreagens, Lösungsmittel oder Zeit, die für die Abspaltung benötigt wird, wird von dem bestimmten abzuspaltenden Peptid abhängen. Nach der Abspaltung werden die Spaltungsfraktionen Standard-Aufarbeitungsvorgängen ausgesetzt, um das Peptid zu isolieren. Typischerweise werden die kombinierten Spaltungsfraktionen unter Vakuum konzentriert, gefolgt von der Rekonstitution mit polaren aprotischen oder polaren aprotischen Lösungsmitteln wie Ethanol (EtOH), Methanol (MeOH), Isopropylalkohol (IPA), Aceton, Acetonitril (ACN), Dimethylformamid (DMF), NMD, DMAC, DCM etc., gefolgt von Fällen oder Kristallisieren mit Antilösungsmittel wie Wasser oder Hexanen und Sammeln durch Vakuumfiltration. Alternativ kann das Produkt mit organischen Lösungsmitteln oder Wasser nach der Isolation des Peptides behandelt werden.
Die in den Abschnitten 7.1 bis 7.6 unten vorgestellten Beispiele präsentieren Festphasensynthesen von Peptidzwischenprodukten, wie in den Tabellen 1, 2 und/oder 3 gezeigt.
Für die Synthese von T-1249-Peptiden voller Länge können die Peptidzwischenprodukte von Tabelle 1 oben miteinander gekoppelt werden, um das T-1249-Peptid zu ergeben. Zum Beispiel können die in Tabelle 2 aufgelisteten Gruppen an Peptidzwischenprodukten aneinander gekoppelt werden, um das T-1249-Peptid voller Länge zu erzeugen. Repräsentative Beispiele der Synthese von T-1249 voller Länge aus Zwischenpeptidfragmenten werden in Abschnitt 9 unten vorgestellt und werden schematisch in 1 abgebildet.
In gewissen Ausführungsbeispielen kann einem Drei-Fragment-Ansatz für die Synthese von T-1249 gefolgt werden. Eine "Drei-Fragment-Ansatz"-Synthese bezieht sich auf ein T-1249-Syntheseschema, das mit drei T-1249-Zwischenpeptidfragmenten beginnt, die synthetisiert werden und die gekoppelt werden unter Verwendung von Fest- und Flüssigphasensynthesetechniken zu einem T-1249-Peptid voller Länge. Zwischenpeptidfragmentgruppen 1, 2, 3 und 4, gezeigt in Tabelle 2 oben, stellen bevorzugte Gruppen dar. 1 bildet einen beispielhaften Drei-Fragment-Ansatz ab, der die Peptidzwischenproduktgruppe 1 der Tabelle 2 nutzt, um T-1249 voller Länge zu synthetisieren. Für diese Gruppe wird angemerkt, dass der Aminosäurerest 39 (der carboxyterminale Aminosäurerest von T-1249) einzeln während des Fragmentkopplungsvorgangs eingeführt wird. Die Anhäufung des in 1 gezeigten T-1249-Syntheseschemas wird in dem in Abschnitt 9.1 vorgestellten Beispiel gezeigt.
Lösungsphasenpeptidsynthesetechniken, die Fachleuten wohl bekannt sind, können für die Synthese der Peptidzwischenfragmente der Erfindung genutzt werden. Die in Abschnitt 8 vorgestellten Beispiele beschreiben beispielhafte Lösungsphasenpeptidsynthesen von Peptidzwischenprodukten, die in den Tabellen 1, 2 und/oder 3 aufgelistet sind. Zum Beispiel werden von den nicht mit Kieselsäure beladenen Säurenpackungen, die einen breiten pH-Wert zeigen, der pH-Stabilitätswerte bei hohem oder niedrigem pH einschließt, welche von Tosohaas (Montgomeryville, PA) verkauft.
6. BEISPIEL: Harzsynthesen
6.1. Bevorzugtes beispielhaftes Verfahren für das Laden von Aminosäuren auf 2-CTC-Harz
Das luftempfindliche 2-Chlortritylchloridharz (Senn Chemicals, Lot A 3573, 1 Äq., 12,0 mmol, 10,0 g) wird zu einem 250-ml-Rundbodenkolben hinzugefügt und unmittelbar mit einer vorbereiteten Lösung aus FmocLeuOH (1,0 Äq., 12 mmol, 4,24 g) und Diisopropylethylamin (5 Äq., 60,0 mmol, 5,20 ml) in DCM (10 Vol., 100 ml) behandelt. Der Schlamm wird mit einer Kappe verschlossen und für 3 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Filtration entfernt und das Harz wird mit DCM (5 Vol., 50 ml) gewaschen. Die verbleibenden aktiven Zentren auf dem Harz werden durch Behandeln des Harzes mit 9:2 MeOH:DIEA (5 Vol., 5,0 ml DIEA und 45 ml MeOH) für 30 Minuten mit End-Capping versehen. Das Lösungsmittel wird entfernt und das Harz wird mit 3 × 5 Volumen DCM gewaschen. Das Harz wird auf ein konstantes Gewicht getrocknet, was 13,2 g beladenes Harz mit einer berechneten Beladung von 0,98 mmol Fmoc-LeuOH pro Gramm liefert.
Dieses Verfahren kann ebenfalls für das Laden von FmocTrp(Boc)OH auf 2-CTC-Harz verwendet werden.
In den Abschnitten 6.2–6.3 hierin werden Beispiele beschrieben, in denen Chlortritylchloridharze mit Aminosäuren substituiert worden sind, welche in Verbindung mit Festphasensynthese der hierin beschriebenen Peptide und Peptidzwischenprodukte genutzt werden können. Sämtliche der Peptide und Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung können durch Festphasenpeptidsynthese (SPPS) unter Verwendung der in den Abschnitten 6.2 und 6.3 unten beschriebenen Beladungsvorgänge synthetisiert werden.
6.2. Zubereitung von Fmoc-Trp(Boc)-2-Chlortritylharz
Vorgehen:
Das 2-Chlortritylchloridharz (25 g, 1 Äq.) wurde in eine 500-ml-Peptidkammer gefüllt und mit 250 ml DCM gewaschen. Das Bett wurde entleert und eine Lösung des Fmoc-Trp(Boc)-OH (1,5 Äq.) und des DIEA (1,7 Äq.) in 10 Volumen DCE wurde hinzugefügt. Die Mischung wurde unter Stickstoffbegasung für 2 Stunden geschüttelt.
Das Bett wurde entleert und mit 250 ml DCM gewaschen. Die aktiven Zentren auf dem Harz wurden mit 200 ml einer 9:1 MeOH:DIEA-Lösung für 20 Minuten mit End-Capping versehen. Das Bett wurde entleert, mit 4 × 250 ml DCM gewaschen und mit einer Stickstoffspülung getrocknet, um 34,3 g beladenes Harz zu ergeben.
Quantitative HPLC-Analyse wurde durch Abspalten der Fmoc-Aminosäure von dem Harz und dem Testen gegen einen Standard durchgeführt. HPLC-Test des Materials zeigte eine Beladung des Harzes von 0,68 mmol/g.

Säule: Phenomenox Jupiter C18; 300 Å; 5 μ

Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/Min.

Detektion: UV bei 260 nm

mobile Phase: A: 0,1% wässrige TFA B: 0,1% TFA in Acetonitril 65% B isokratisch

Retentionszeit: annähernd 14 Minuten
6.3 Zubereitung von Fmoc-Leu-2-Chlortritylharz
Vorgehen:
Das Harz wurde in eine 3-Liter-Peptidkammer gefüllt und mit 1,5 DCM gewaschen. Das Bett wurde entleert und eine Lösung des FmocLeuOH (1,5 Äq.) und des DIEA (1,7 Äq.) in 8 Volumen DCE wurde hinzugefügt. Die Mischung wurde unter Stickstoffhegasung für 2 Stunden geschüttelt.
Das Bett wurde entleert und mit 1,5 l DCM gewaschen. Die aktiven Zentren auf dem Harz wurden mit 1,5 l einer 9:1 MeOH:DIEA-Lösung für 30 Minuten mit End-Capping versehen. Das Bett wurde entleert, mit 4 × 1,5 l DCM gewaschen und mit einer Stickstoffspülung getrocknet, um 345 g beladenes Harz zu ergeben.

Quantitative HPLC-Analyse wurde durch Abspalten der Fmoc-Aminosäure von dem Harz und Testen gegen einen Standard durchgeführt. HPLC-Test des Materials zeigte eine Beladung des Harzes von 0,72 mmol/g.

Säule:	Phenomenox Jupiter C18; 300 Å; 5 μ
Durchflussgeschwindigkeit:	1 ml/Min.
Detektion:	UV bei 260 nm
mobile Phase:	A: 0,1% wässrige TFA B: 0,1% TFA in Acetonitril 65% B isokratisch
Retentionszeit:	annähernd 8 Minuten

7. BEISPIEL: FESTPHASENSYNTHESE VON PEPTIDEN
Unten in den Abschnitten 7.1–7.6 werden Beispiele der Festphasensynthese von Peptidzwischenprodukten, wie in den Tabellen 1, 2 und/oder 3 aufgelistet, vorgestellt.
7.1 Bevorzugtes Verfahren für die Festphasenpeptidsynthese (SPPS); allgemeines Vorgehen
Eine SPPS-Kammer wurde mit FmocLeu-Harz (1 Äq.) beladen. Das Harz wird in 5% Piperidin/DCM (7,5 Vol.) mit einer Stickstoffspülung für 15 bis 30 Minuten konditioniert. Das Lösungsmittel wird abgezogen und das Harz wird mit 2 × 20% Piperidin in NMP (Volumen) für 30 Minuten behandelt, um die Fmoc-Schutzgruppe zu entfernen. Nach der zweiten Behandlung mit 20% Piperidin/NMP wird das Harz mit 5–7 × NMP (5 Vol.) bis zu einem negativen Chloraniltest gewaschen.
Währenddessen werden die nachfolgende Aminosäure (1,5 Äq.), HOBT (1,5 Äq.) und DIEA (1,5 Äq.) in 3:1 NMP/DCM (10 Vol.) vereinigt, es wird ihnen ermöglicht, sich bei Raumtemperatur vollständig zu lösen, und auf 0°C abgekühlt. HBTU wird hinzugefügt, die Lösung wird für 10–15 Minuten gerührt, um den Feststoff aufzulösen und wird dann zu dem Harz hinzugefügt. Die Suspension wird unter Rühren unter einer Stickstoffatmosphäre für 1–3 Stunden geschüttelt. Kopplungsvervollständigung wird mit einem qualitativen Ninhydrintest überwacht. Falls die Reaktion nach 3 Stunden noch nicht abgeschlossen ist (positiver Ninhydrintest dauert an), sollte der Reaktor entleert werden und eine erneute Kopplung sollte mit einer frischen Lösung aktivierter Aminosäure (0,5 Äq.) durchgeführt werden. Normalerweise wird nach 30 Minuten bis 1 Stunde der erneuten Kopplung ein negativer Ninhydrintest erhalten. Dieser Zyklus wird für die verbleibenden Aminosäuren in dem Fragment wiederholt. Indem sich das Fragment bildet, können die beiden in den Waschschritten verwendeten Lösungsmittelvolumina um 5 Volumen erhöht werden. In dem Fall von AcAA1-12OH wurde das End-Capping mit Essigsäureanhydrid durchgeführt durch Behandeln von (HAA1-12-Harz), bei dem das Fmoc entfernt worden ist, mit Pyridin (5 Äq.) und dann Essigsäureanhydrid (5 Äq.) in 3:1 NMP/DCM (10 Vol.). Nach dem letzten Koppeln wird das Harz mit 3 × 5–8 Volumina NMP und dann mit 2 × 10 Volumina DCM gewaschen und auf ein konstantes Gewicht in einem Vakuumofen bei 40°C getrocknet.
7.2 Bevorzugte Verfahren für die Abspaltung des Peptids von Harz
Die Verfahren unten beschreiben die Abspaltung des Peptids AcAA1-12OH von dem Harz. Dieselben Verfahren können jedoch für die Abspaltung anderer Peptidfragmente der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Verfahren A: Verwendung von HOAc
Das Harz (1 g, 0,370 mmol) wurde mit einer Mischung aus AcOH/MeOH/DCM (5:1:4, 20 Vol., 20 ml) mit Stickstoffbewegung für 1,5 Stunden behandelt und die Lösung wurde in einen Rundbodenkolben überführt, gerührt und mit Wasser (20 Vol.) behandelt. Der resultierende weiße Schlamm wurde aufkonzentriert (Rotavap, 40°C-Bad), um DCM zu entfernen, und das Produkt wurde durch Filtration gesammelt. Das Trocknen auf ein konstantes Gewicht liefert 0,69 g (74%) AcAA1-12OH mit einer Reinheit von 87 A%. Eine zweite Behandlung des Harzes, wie oben, verschaffte zusätzlich 0,08 g (8,5%) AcAA1-12OH von weniger reinem Material (83 Oberflächen-%), was eine gewünschte Reaktionszeit von knapp > 1,5 Stunden nahe legt.
Verfahren B: Verwendung von TFA
Das Harz (1 Gew.-%, 20 g) wurde mit 5–6 × 1,7 Volumina 1% TFA in DCM gewaschen, jeweils 3–5 Minuten. Die 1% TFA/DCM-Waschschritte werden in einem Kolben, der Pyridin (1:1 Volumenverhältnis mit dem TFA in dem Waschvorgang) enthält, gesammelt. Die Produkt enthaltenden Waschlösungen werden vereinigt (600 ml, 30 Vol.) und das DCM wird durch Destillation bis zu einem minimalen Topfvolumen (~1/3 des Ausgangsvolumens) entfernt. Vakuum wird angepasst, um eine Topftemperatur von 15–25°C aufrecht zu erhalten. Ethanol (6,5 Vol.) wird hinzugefügt und die Destillation wird fortgesetzt, bis das DCM entfernt ist (wie bestimmt durch einen Anstieg in der Temperatur des Destillates). Wiederum wird das Vakuum angepasst, um eine Topftemperatur von 15–20°C aufrecht zu erhalten. Das Topfendvolumen sollte ungefähr 8–9 Volumina betragen. Die Lösung wird auf 5–10°C abgekühlt und Wasser (6,5 Vol.) wird über 30 Minuten hinweg hinzugefügt, um das AcAA1-12OH auszufällen. Der Feststoff wird durch Vakuumfiltration gesammelt und durch Waschschritte mit Wasser (2–3 Vol.). Der Schlamm wird bei 0–5°C für 30 Minuten gerührt, die Feststoffe werden durch Vakuumfiltration gesammelt und auf ein konstantes Gewicht getrocknet, um 16,80 g AcAA1-12OH in 90%iger Ausbeute und mit einer Reinheit von 84 Oberflächen-% (A%) zu ergeben.
7.3 Bevorzugtes Verfahren für die Aufarbeitung von AcAA1-12OH
Erhitze AcAA1-12OH (257-21-1, 3,00 g) in 70 ml Methanol (23,3 Volumina) bei 65°C unter Rühren für 3 Stunden. Kühle es auf Raumtemperatur ab und rühre über Nacht. Saugfiltration und Trocknen auf ein konstantes Gewicht im Vakuumofen (40°C) ergaben 2,43 g (81%) mit einer Reinheit von 90 A%.
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
7.4 SPPS von FmocAA13-26OH und Abspalten von dem Harz
SPPS von FmocAA13-26 wurde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei mit 6,5 g FmocLeuO-Harz, beladen mit 1,02 mmol/g, gestartet worden ist. Das Abspaltungsverfahren A oder B ist annehmbar (169/137, 60% Ausbeute, 85 A%).
7.5 Bevorzugtes Aufarbeitungsvorgehen für FmocAA13-26OH
FmocAA13-26OH (3,60 g, 85 A%) wurde in 15 ml (5 Vol.) Acetonitril auf 78°C erhitzt. Der Schlamm wurde mit zusätzlichem Lösungsmittel behandelt, bis sich die Feststoffe aufgelöst hatten (insgesamt 0,6 ml). Der Lösung wurde ermöglicht, auf Raumtemperatur abzukühlen, und sie wurde für 7 Stunden gerührt. Saugfiltration und Trocknen auf ein konstantes Gewicht stellten 2,6 g (72%) FmocAA13-26OH in einer Reinheit von 95 A% bereit.
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
7.6 SPPS von FmocAA27-38OH und Abspalten von dem Harz
SPPS von FmocAA27-38OH wurde wie oben beschrieben durchgeführt, wobei mit 10 g FmocTrp(Boc)OR, beladen mit 0,75 mmol/g, gestartet worden ist. Das Abspaltungsverfahren B wurde verwendet (169/120/1, Ausbeute 78%, 87,9 A%).
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
8. BEISPIEL: LÖSUNGSPHASENSYNTHESE VON PEPTIDFRAGMENTEN
Unten in den Abschnitten 8.1 bis 8.4 sind Beispiele der Lösungsphasensynthese von Peptidzwischenprodukten vorgestellt, wie aufgelistet in den Tabellen 1, 2 und/oder 3.
8.1 Zubereitung des Fragmentes Fmoc-AA27-39-NH₂ durch Lösungsphasenkoppeln von HPheNH₂ an Fmoc-AA27-38OH
FmocAA27-39NH₂ kann durch Umwandeln des Carboxylendes von FmocAA27-38OH zu einem aktivierten HOBT- oder HOAT-Ester unter Verwendung von HBTU oder TBTU bzw. HOBT oder HOAT in der Anwesenheit von DIEA und Phenylalaninamid zubereitet werden. Die Reaktion wird in einem polaren aprotischen Lösungsmittel wie DMF oder NMP bei 0 bis 25°C laufen gelassen. Nach Abschluss der Reaktion werden Alkohol oder ein wasservermischbares Lösungsmittel und/oder Wasser hinzugefügt, um FmocAA27-39NH₂ zu fällen.
Beispiel:
FmocAA27-38OH (169-120-1, 5,40 g, 1,98 mmol, 1,00 Äq.), HPheNH₂ (Bachem, 0,390 g, 2,38 mmol, 1,20 Äq.), HOBT·H₂O (0,330 g, 2,16 mmol, 1,10 Äq.) wurden in NMP (54 ml, 10 Vol.) gelöst, mit DIEA (0,16 ml, 0,921 mmol, 1,10) behandelt und bei Raumtemperatur gerührt, bis alles gelöst war (ca. 30 Min.). Die Lösung wurde unter Verwendung eines Eisbades gekühlt (Innentemperatur = 2–3°C) und HBTU (0,827 g, 2,18 mmol, 1,10 Äq.) wurde in einer Portion hinzugefügt, eine Stunde und dann über Nacht gerührt. Die Reaktion kann durch TLC (uv, 10% MeOH/DCM, SM mid Rf Produkt oben) überwacht werden. Die tropfenweise Zugabe von Methanol (54 ml, 10 Vol.) und dann Wasser (54 ml, 10 Vol.) über einen Zeitraum von einer Stunde bildete einen frei fließenden Feststoff, der weitere 2 Stunden gerührt wurde und dann durch Filtration gesammelt wurde. Der Filterkuchen wurde mit 1:1 Wasser/Methanol (2 × 25 ml) gewaschen. Trocknen über Nacht im Vakuumofen bei 40°C lieferte 5,30 g (93%) FmocAA27-39NH₂ mit einer Reinheit von 81 A%. HPLC-Analyse zeigte ebenfalls, dass < 0,2% des Ausgangsmaterials FmocAA27-38OH vorhanden war. ES pos = 2871 (MH+), ES neg = 2869 (M – 1). Durchschnittliches MW = 2870.
HPLC-Bedingunen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
8.2 Zubereitung des Fragmentes HAA27-39NH₂ durch Entfernen der Fmoc-Gruppe
Die Fmoc-Schutzgruppe von FmocAA27-39NH₂ wird unter Verwendung einer Base wie Piperidin oder Kaliumcarbonat in organischen Lösungsmitteln, wie DCM, DMF, NMP, Methyl-t-butylether (MTBE), Hexan oder Mischungen davon, entfernt.
Beispiel:
FmocAA27-39OH (257-25-1, 4,00 g, 1,39 mmol) wurde in 40 ml (10 Vol.) MTBE und 10 ml (2,5 Vol.) Heptan verschlämmt und wurde dann mit Piperidin (0,75 ml, 8,34 mmol, 5,5 Äq.) behandelt. Der Schlamm wurde 12 Stunden gerührt, zu welchem Zeitpunkt 0,5% Ausgangsmaterial verblieb (HPLC), und 20 ml (5 Vol.) Heptan wurden hinzugefügt. Der frei fließende Schlamm wurde eine Stunde gerührt, wurde dann durch Saugfiltration isoliert und mit 3 × 7 ml (2 Vol. bei jedem Waschschritt) mit 1:1 MTBE/Heptan gewaschen und in einem Vakuumofen bei 40°C bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, was 3,55 g (96%) an 257-40-1 in einer Reinheit von 83 A% lieferte.
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
8.3 Zubereitung von Fmoc-AA13-39-NH₂-Fragment durch Lösungsphasenkoppeln von Fragmenten an Fmoc-AA13-26OH und HAA27-39NH₂
FmocAA13-39NH₂ wird durch Umwandeln des Carboxyterminus von FmocAA13-26OH zu einem aktivierten HOBT- oder HOAT-Ester unter Verwendung von HBTU oder TBTU bzw. HOBT oder HOAT in der Anwesenheit von DIEA und HAA27-39NH₂. Die Reaktion wird in einem polaren, aprotischen Lösungsmittel wie DMF oder NMP bei 0 bis 25°C laufen gelassen. Nach Abschluss der Reaktion werden Alkohol oder ein wassermischbares Lösungsmittel und/oder Wasser hinzugefügt, um FmocAA13-39NH₂ auszufällen.
Beispiel:
FmocAA13-26OH (257-41-1, 3,00 g, 0,8417 mmol, 1 Äq.), HAA27-39NH₂ (2,23 g, 0,8417 mmol, 1 Äq.), HOBT-Hydrat (0,135 g, 0,884 mmol, 1,05 Äq.) wurden in DMF (25 ml, 30 Min.) gelöst, mit einem Eisbad abgekühlt und mit DIEA (0,23 ml, 1,33 mmol, 1,50 Äq.) und dann mit HBTU behandelt (0,335 g, 0,884 mmol, 1,05 Äq.) und gerührt. Nach 1 Stunde war die Reaktion zu 90% abgeschlossen, basierend auf dem Verlust an Ausgangsmaterialien (HPLC) und wurde auf Raumtemperatur erwärmt. Nach 4 Stunden wurde zusätzliches HBTU (0,150 g, 0,395 mmol, 0,5 Äq.) hinzugefügt und die Reaktion wurde über Nacht gerührt. Methanol (50 ml) und dann Wasser (50 ml) wurden tropfenweise hinzugefügt, wodurch Klebrigwerden bewirkt wurde, was sich zu einem Schlamm nach 16-stündigem Rühren bei Raumtemperatur verfestigte. Der Feststoff wurde durch Filtration gesammelt, mit 2 × 20 ml 1:1 MeOH:Wasser gewaschen und auf ein konstantes Gewicht getrocknet, was 5,18 g (99%) FmocAA13-39NH₂ mit einer Reinheit von 60 A% ergab. Der Feststoff hatte 5 A% jeweils von sauren und Aminausgangsmaterialien.
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
8.4 Zubereitung des Fragments HAA13-39NH₂ durch Entfernen der Fmoc-Gruppe
Die Fmoc-Schutzgruppe von FmocAA13-39NH₂ wird unter Verwendung einer Base wie Piperidin oder Kaliumcarbonat in organischen Lösungsmitteln, wie DCM, DMF, NMP, MTBE, Hexan oder Mischungen davon, entfernt.
Beispiel:
FmocAA13-39OH (257-43-1, 0,500 g, 0,0810 mmol, 1 Äq.) wurde in 9 ml (18 Vol.) 2:1 MTBE/Heptan für 30 Minuten verschlämmt und dann mit Piperidin (40 μl, 0,404 mmol, 5 Äq.) behandelt. Der Schlamm wurde 2 Stunden gerührt, zu welchem Zeitpunkt 40% des Ausgangsmaterials verblieben (HPLC). Zusätzliches MTBE (3 ml, 6 Vol.) und Piperidin (20 μl, 2,5 Äq.) wurden hinzugefügt und der Schlamm wurde gerührt bis < 1% Ausgangsmaterialien verblieben (16 Stunden). Der Reaktionsschlamm wurde saugfiltriert, gewaschen mit 2 × 5 ml of 1:1 MTBE/Heptan und auf ein konstantes Gewicht getrocknet, was 0,40 g (90%) mit einer Reinheit von 60–70 A% lieferte.
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
9. BEISPIEL: Synthese von T-1249-Peptiden voller Länge
In den Abschnitten 9.1–9.2 hierin unten werden Beispiele der Nutzung der Peptidzwischenfragmente vorgestellt, um T-1249-Peptide voller Länge zu erzeugen.
Die in diesem Abschnitt vorgestellten Beispiele zeigen das erfolgreiche Koppeln der Festphasen- und Lösungsphasensynthesetechniken, um ein T-1249-Peptid voller Länge aus Peptidzwischenfragmenten herzustellen.
9.1 Zubereitung des Fragmentes AcAA1-39NH₂ durch Lösungsphasenkoppeln von AcAA1-12OH mit HAA13-39NH₂
Der hier beschriebene Syntheseweg repräsentiert die Anhäufung der in 1 schematisch dargestellten T-1249-Drei-Fragment-Ansätze. AcAA1-39NH₂ kann durch Umwandeln des Carboxyterminus von AcAA1-12OH zu einem aktivierten HOBT- oder HOAT-Ester unter Verwendung von HBTU oder TBTU bzw. HOBT oder HOAT zubereitet werden. Nach Abschluss der Reaktion werden Alkohol oder ein mit Wasser vermischbares Lösungsmittel und/oder Wasser hinzugefügt, um AcAA1-39NH₂ auszufällen.
Beispiel:
HAA13-39 (257-32-2, 0,409 g, 0,0685 mmol, 1 Äq.), AcAA1-12OH (257-21-1, 0,174 g, 0,0685 mmol, 1 Äq.) und HOBT-Hydrat (0,013 g, 0,0822 mmol, 1,20 Äq.) wurden in DMF (6,0 ml, 12 Vol., 30 Min.) gelöst. Die Lösung wurde mit einem Eisbad und DIEA (18 μl, 0,1028 mmol, 1,5 Äq.), gefolgt von HBTU (0,031 g, 0,0822 mmol, 1,20 Äq.) abgekühlt. Nach 4-stündigem Rühren bei 0°C wurde Wasser (6 ml) tropfenweise hinzugefügt. Der resultierende Schlamm wurde 1 Stunde geführt und wurde dann durch Saugfiltration isoliert. Trocknen über Nacht in einem Vakuumofen bei 40°C ergab 0,545 g (94%) an 257-33-1 mit einer Reinheit von ca. 50 A%.
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 A, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
9.2 Zubereitung von Neben-T-1249 durch Seitenkettendeprotektionierung von AcAA1-39NH₂
Das in diesem Abschnitt vorgestellte Beispiel zeigt das erfolgreiche Koppeln von Fest- und Flüssigphasensynthesetechniken, um ein T-1249-Peptid aus Peptidzwischenfragmenten zu erzeugen. Insbesondere stellt der hier beschriebene Syntheseweg den End-Deprotektionierungsschritt des in 1 gezeigten T-1249-Drei-Fragment-Ansatzes dar. Vorzugsweise werden die Seitenkettenschutzgruppen von AcAA1-39NH₂ durch Säurehydrolyse unter Verwendung von 95/5 Trifluoressigsäure/Wasser und bis zu 5 Gew.-%/Vol.-% eines Carbokationfängers, wie Dithiothreitol, Ethandithiol oder Cystin. Das rohe T-1249 wird aus der Deprotektionierungslösung durch Zugabe eines Ethers wie MTBE, Diethylether oder Diisopropylether gefällt.
Beispiel:
AcAA1-39NH₂ (257-33-1, 0,120 g) wurde mit 1,5 ml einer frisch zubereiteten Lösung aus TFA:DTT:Wasser (95:5:5) behandelt und bei Raumtemperatur für 4 Stunden gerührt. MTBE (annähernd 3 ml) wurde hinzugefügt und das Präzipitat wurde durch Saugfiltration gesammelt. Das feine Pulver wurde im Vakuumofen über Nacht getrocknet. Dieses Material wurde in 3 ml 50% Acetonitril/Wasser, enthaltend 1% HOAc, gelöst und es wurde ihm ermöglicht, für 15 Stunden zu stehen, um die Decarboxylierung der Indolseitenkette der Tryptophangruppen zu ermöglichen. Die Lösung wurde direkt analysiert und wurde als mit echtem T-1249 co-eluierend gefunden. Die annähernde Reinheit betrug 60% durch HPLC.
HPLC-Bedingungen: Vydac C8, Katalog Nr. 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0,9 ml/Min., 280 nm. A: 0,1% TFA/Wasser, B: eine Mischung aus 80% I-PrOH/20% Acetonitril und 0,1% TFA. 60–80% B/30 Min. Typische Probenzubereitung: Löse 1 mg in 0,10 ml NMP, verdünne mit 1 ml Acetonitril. Injiziere 20 μl in eine 20 μl-Schleife.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Synthese eines Peptids der Formel: X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 1), Umfassend: (a) das Umsetzen eines seitenkettengeschützten Peptids der Formel: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 6), worin der Aminoterminus entschützt ist, mit einem seitenkettengeschützten Peptid der Formel: X-WQEWEQKITALL-COOH (SEQ ID NR. 2) zum Erhalt eines seitenkettengeschützten Peptids der Formel: X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 1); worin X eine Schutzgruppe, eine Acetylgruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe ist und worin Z eine Schutzgruppe, eine Amidogruppe oder eine makromolekulare Trägergruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin X eine Schutzgruppe darstellt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 9-Fluoroenylmethoxycarbonyl (Fmoc), t-Butyl (t-Bu), Trityl (trt), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Carbobenzoxyl, Dansyl und einer Paranitrobenzylestergruppe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Z eine Schutzgruppe darstellt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 9-Fluoroenylmethoxycarbonyl (Fmoc), t-Butyl (t-Bu), Trityl (trt), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Carbobenzoxyl, Dansyl und einer Paranitrobenzylestergruppe.
Verfahren nach Anspruch 1, worin X eine makromolekulare Trägergruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipid/Fettsäurekonjugaten, Polyethylenglykol und Kohlenhydraten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Z eine makromolekulare Trägergruppe ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipid/Fettsäurekonjugaten, Polyethylenglykol und Kohlenhydraten.
Verfahren nach Anspruch 1, das zusätzlich das Entschützen der Seitenketten des seitenkettengeschützten Peptids der Formel umfasst: X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 1).
Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, worin X eine Acetylgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 7, worin Z eine Amidogruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 6, worin X eine Schutzgruppe ist und worin das Verfahren weiter den Schritt des Modifizierens von X in eine Acetylgruppe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin Z eine Amidogruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das seitenkettengeschütztete Peptid der Formel: X-WQEWEQKITALL-COOH (SEQ ID NR. 2) mittels Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das seitenkettengeschützte Peptid der Formel: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 6) über ein Verfahren synthetisiert wird, umfassend: das Umsetzen eines seitenkettengeschützten Peptids der Formel: QKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 5) worin der Aminoterminus entschützt ist, mit einem seitenkettengeschützten Peptid der Formel: EQAQIQQEKNEYEL-COOH (SEQ ID NR. 3), um ein seitenkettengeschütztes Peptid der Formel zu erhalten: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 6).
Verfahren nach Anspruch 12, worin das seitenkettengeschützte Pepid der Formel: QKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 5) über ein Verfahren synthetisiert wird, umfassend: das Umsetzen eines seitenkettengeschütztens Peptids der Formel: QKLDKWASLWEW-COOH (SEQ ID NR. 4) mit Phenylalaninamid, um das seitenkettengeschützte Peptid der Formel zu erhalten: QKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NR. 5).
Verfahren nach Anspruch 12, worin das seitenkettengeschützte Peptid der Formel: EQAQIQQEKNEYEL-COOH (SEQ ID NR. 3) mittels Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 13, worin das seitenkettengeschützte Peptid der Formel: QKLDKWASLWEW-COOH (SEQ ID NR. 4) mittels Festphasen-Peptidsynthese synthetisiert wird.
Satz an Peptidfragmenten, umfassend einen Satz, ausgewählt aus der Gruppe: (a) WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 3), QKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 4); (b) WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 3), QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 5); (c) WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 6); (d) WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 8); (e) WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 7), QKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 4); und (f) WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 7), QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 5).
Satz an Peptidfragmenten gemäß Anspruch 16, worin eine oder mehrere der Seitenketten der Peptidfragmente mit einer Schutzgruppe geschützt ist bzw. sind.
Satz an Peptidfragmenten gemäß Anspruch 17, worin die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 9-Fluoroenylmethoxycarbonyl (Fmoc), t-Butyl (t-Bu), Trityl (trt), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Carbobenzoxyl, Dansyl und einer Paranitrobenrylestergruppe.
Satz an Peptidfragmenten nach Anspruch 16, worin der Satz umfasst: WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 3), und QKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 4).
Satz an Peptidfragmenten nach Anspruch 16, worin der Satz umfasst: WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO. 3), und QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 5).
Satz an Peptidfragmenten nach Anspruch 16, worin der Satz umfasst: WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), und EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 6).
Satz an Peptidfragmenten nach Anspruch 16, worin der Satz umfasst: WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), und EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 8).
Satz an Peptidfragmenten nach Anspruch 16, worin der Satz umfasst: WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 7), und QKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 4).
Satz an Peptidfragmenten nach Anspruch 16, worin der Satz umfasst: WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 7), und QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 5).
Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2), EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 3), QKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 4), QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 5), EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 6), WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 7), und EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 8).
Peptid gemäß Anspruch 25, worin eine oder mehrere der Seitenketten des Peptids mit einer Schutzgruppe geschützt ist bzw. sind.
Satz an Peptidfragmenten gemäß Anspruch 26, worin die Schutzgruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 9-Fluoroenylmethoxycarbonyl (Fmoc), t-Butyl (t-Bu), Trityl (trt), t-Butyloxycarbonyl (Boc), Carbobenzoxyl, Dansyl und einer Paranitrobenzylestergruppe.
Peptid nach Anspruch 25, worin das Peptid ist WQEWEQKITALL (SEQ ID NR. 2).
Peptid nach Anspruch 25, worin das Peptid ist EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 3).
Peptid nach Anspruch 25, worin das Peptid ist QKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 4).
Peptid nach Anspruch 25, worin das Peptid ist QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 5).
Peptid nach Anspruch 25, worin das Peptid ist EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NR. 6).
Peptid nach Anspruch 25, worin das Peptid ist WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NR. 7).
Peptid nach Anspruch 25, worin das Peptid ist EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NR. 8).