TWI237640B

TWI237640B - Methods and peptide fragments for peptide synthesis

Info

Publication number: TWI237640B
Application number: TW089113543A
Authority: TW
Inventors: Brian Bray; Marc Andersen; Paul E Friedrich; Myung-Chol Kang
Original assignee: Trimeris Inc
Priority date: 1999-07-07
Filing date: 2000-08-05
Publication date: 2005-08-11
Also published as: DK1372686T3; ES2236043T3; WO2001034635A9; ATE288278T1; PT1372686E; US6767993B2; JP2003530311A; CN1450906A; KR20020038676A; WO2001034635A3; WO2001034635A2; MXPA02000021A; US6469136B1; EP1372686A4; BR0012249A; DE60017955T2; US20030125516A1; EP1372686A2; CN1267449C; EP1372686B1

Description

1237640 A7 B7 五、發明說明（） 1.度左 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本發明首先係關於合成肽（尤其文中稱為T-1249(SEQ ID NO: 1 )及似T-1249肽）之方法。此種方法採用固相及液相合成程序以合成並組合可產生該重要肽之特定肽片段組。本發明進一步係關於可作為合成該重要肽（例如，Τ-1249)之中間物之個別肽片段。本發明又進一步關於可以一起使用以產生全長Τ-1249及似Τ-1249肽之此種肽中間物片段組。本發明又進一步關於肽（尤其，Τ-1249及似Τ-1249肽）及可作為合成該主題肽之中間物之該個別肽片段之純化方法。最近，正確認許多肽具有可抑制與湊合異常有關問題之能力，且，重要的是，亦具有效抗病毒活性。見，例如，美國專利第5,464,933號；第5,656,480號；PCT公告號w〇 94/2892〇 ; W0 96/19495。由於這些肽可廣泛作為，例如，治療劑，所以需要一種能夠大量合成之方法。雖然現在有多種合成肽之技術（見，例如，Mergler等人， 1988，Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler 等人，1988, Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber等人.（eds)，’’Peptides，經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

Chemictry and Biology，ESCOM，Leiden，1992，525-526 ;及 Riniker等人，1993，Tetrahedron Letters 49:9307-9320 )，但是，並不能採用現有技術以大規模洽乎經濟的方式製造可輕易純化之肽（例如，T-1249 )。 3 .發明簡述

本發明首先係關於合成肽（尤其，文中稱為T-1249 ( SEQ -4 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1237640 五經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 發明說明（2 ) 圯N〇:l )及似T-1249肽）之方法。此種方法採用固相及液相合成程序以合成並組合可產生該重要肽之特定肽片段組。通常，本發明方法包括在固體載體上合成T-1249或似T-1249肽之特定側鏈保護肽片段中間物，在溶液中偶合該保護片段以形成經保護T-1249或似T-1249肽，繼而使該侧鏈進行脱除保護作用，產生該最終T-1249或似T-1249肽。本發明方法一項較佳具體實例包括具有如SEQ ID NO: 1所述之胺基酸序列之T-1249肽合成方法。本發明進一步係關於可作爲合成該重要肽（例如，T-1249 )之中間物之個別肽片段。本發明該肽片段包括（但不限於）此等具有如下表1中所述之胺基酸序列之肽片段：表1 肽號碼胺基酸序列 T-1249之對應號碼胺基酸序列 (SE〇. EDNO.l) 1 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2) 1-12 2 EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:3) 13-26 3 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:4) 27-38 4 QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO: 5) 27-39 5 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:6) 13-39 6 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:7) 1-26 7 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO: 8) 13-38 本發明又進一步關於可作爲合成該重要肽之中間物之肽片段特定組。根據本發明該肽片段組包括如下表2中命名 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） . ·%裝 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1111111! 1237640 A7 B7 ^_______ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製發明說明（3 之1 -6 表2 族胺基酸序列

1 WQEWEQKITALL EQAQIQQEKNEYEL QKLDKWASLWEW 2 WQEWEQKITALL EQAQIQQEKNEYEL QKLDKWASLWEWF 3 WQEWEQKITALL T-1249之對應號碼胺基酸順序 rSEO. TD no： η (SEQIDN0:2) M2 (SEQIDN0:3) 13-26 (SEQIDN0:4) 27-38 (SEQEDN0:2) M2 (SEQIDN0:3) 13-26 (SEQIDN0:5) 27-39 (SEQIDN0:2) 1-12 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQIDN0:6) 13-39 4 WQEWEQKITALL (SEQIDN0:2) 1-12 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQIDN0:8) 13-38 5 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQIDN0:7) 1-26 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:4) 27-38 6 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQIDNO:7) 1-26 QKLDKWASLWEWF (SEQIDNO:5) 27-39 本發明部份係根據該發明者意外發現固相與液相合成反應之某些組合首次可以以高物料通過量及高產率大規模地製造高純度T-1249及似T-1249肽。特定言之，根據本發明之方法，T-1249及似T-1249肽可以以一或多千克之規模合成。頃發現經由選擇本發明該特定T-1249肽片段以進行固相合成，可利用該固相技術之高效率偶合作用，而不需要 -6 -

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 1237640 A7 五、發明說明（4 ) 使用在固相合成法中通常需要之3_，仁或甚至孓倍過量胺基酸及試劑。在固相合成本發明該肽片段時，本發明方法使用約〇· 5倍過量（約1 · 5當量）胺基酸。胺基酸及試劑使用量減少使本發明方法適於大規模合成τ_1249及似τ_1249 肽0 此外，本發明者頃意外地發現可以以每克固相樹脂之約 > 0.5¾莫耳之填充量，在該固相中合成某些肽片段。一般而。在固相肤合成法中所獲得之每克樹脂之0.25至〇 35 毫莫耳範圍内，該填充量可明顯增強物料通過量。而且，本發明者已發現使用超酸敏性樹脂，在該固相中合成精選肽片&可產生非常高純度之肽片段。並不需要使用層析技術以純化根據本發明產生之該肽片段；在使用前，僅使該片段進行沉澱及/或研磨步驟即可，或當自該樹脂直接獲得時，即可使用。使用超酸敏性樹脂可以使本發明該合成，經保護肽自該樹脂分開，且不會同時移除該側鏈保護基團。如此可減少雜質，並可以以高純度及高產率合成含 10個胺基酸或更多之肽。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製根據本發明方法，在液相中合成之τ_1249及似τ·1249肽經由根據本發明產生之該高純度肽片段進行偶合所得到之 3 4貝分佈由未經偶合之片段組成，且包含比根據習用技術（致兔_，完全爲固相合成法）合成之11249及似τ_ΐ249肽還明顯低量之密切相關之缺失類似物。因此，根據本發明產生之Τ-1249及似Τ-1249肽比此等根據習用技術製成者更容易純化得多。特定言之，根據本發明方法製成之丁_1249 - 7- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱) ----- 1237640 Α7 Β7 五、發明說明（5 可以在單程層析法中輕易地純化至〉90%純度。例如，根據本發明方法，使用5英寸管柱，可以純化400克或更多之 T-1249。反之，使用習用固相合成法（spps)製成之丁_1^9 很難純化，需要使用多程層析法。以實例説明，—般而言，經由SPPS製成之T-1249進行純化，自8英寸管柱可得到10克或更少之純化物質。下文第9節所提供之實例説明此種τ-1249全長肽之組合合成法。經由本發明方法可以以丨千克（或更多）之規模製造該T-1249及似T-1249肽。本發明者亦已意外發現肽，例如，T-1249及其它以τ 1249肽，以及文中所述之某些肽片段可以使用高容量材料純化，因爲經液相合成後，該Τ-1249之純度高。因此，本發明又進一步關於肽（尤其，Τ-1249及似Τ-1249肽）及可作爲合成該主題肽之中間物之個別肽片段之純化方法。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁：>

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 8 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 1237640 A7 B7 五、發明說明（1 2 3 ) 3.1定義文中使用之該胺基酸標誌爲習用標誌，且該標誌如下：常見的胺基酸縮寫胺基酸一個字母符號一般縮寫丙胺酸 A Ala 天冬醯胺 N Asn 天冬胺酸 D Asp 麩胺醯胺 Q Gin 麩胺酸 E Glu 異亮胺酸 I He 亮胺酸 L Leu 賴胺酸 K Lys 苯基丙胺酸 F Phe 絲胺酸 S Ser 蘇胺酸 T Thr 色胺酸 W Trp 赂胺酸 Y Tyr 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製裝·--- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1 .附圖簡述圖1 ·· T-1249片段方法。本圖描述遵照下文第8節及第9 節提供之實例之合成全長T-1249之流程，其係首先以如以上表2所示之第1組中間物肽片段進行反應，該圖並描述本發明方法之一項非限制具體實例。 2 .發明詳述 5.1全長肽本發明係關於可以使用以合成已知爲T-1249肽之方法，肽片段，肽片段組。T-1249是一種39個胺基酸殘基多肽，其序列係衍生自HIV-1，HIV-2及SIV gp41病毒多肽序列。 3 -9- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公釐） 1237640 A7 B7 五、發明說明（）疋狀之以聚合物為主之填料。例如，在該載非矽石柱式填料中’具有廣泛pH範圍（其包括pH值大於7 )之柱式填料為由Tosohaas(Montgomeryville，PA)銷售之產品。可以根據本技蟄中皆已熱知之標準技術在低，中或高壓層析法中操作填充此種材料之管柱。下文第9節所提供之實例說明經由下文第5.2節中所述之肽中間物之偶合反應成功合成τ_1249肽之方法。 5,2肽中間物本發明包括（但不限於）具有上文表1中列示之特定胺基酉父序列之丁-1249及似丁-1249肽片段中間物。及表2中列示之該肽片段中間物組。可以使用此種肽中間物（尤其在如表2 中所示之肽片段中間物組中）以製造丁·丨249及似Τ-1249肽。表1或表2中所列示肽片段之該胺基酸殘基中任一或多個該側鏈可經標準保護基團〔例如，第三-丁基（t_Bu)，三苯甲基（trt)及第三-丁基氧羰基（B〇c)〕保護。該第三-丁基為胺基酸殘基Tyr(Y)，Thr(T)，Ser(S)，Glu(E)及 Asp(D)之較佳側鏈保護基團；該三苯甲基為胺基酸殘基Gln(Q)及Asn(N) 之較佳側鏈保護基團；而該第三-丁基氧羰基為胺基酸殘基 Lys(K)及Trp(W)之較佳側鏈保護基團。本發明該肽片段之Gln(Q)殘基較佳經三苯甲基（trt)保護。然而，若需要本發明任何該肽片段在有機溶劑中之溶解性降低’則可以自該片段之任一或多個麩酸胺酸殘基去除該三苯甲基保護基團。本發明各肽片段之Asn(N)殘基較佳經保護。此外，該 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ^--------1--------- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237640 Α7 Β7 五、發明說明（9

Trp(W)殘基較佳經第三-丁基氧羰基保護。根據上文表1中所列示肽式1 - 5之經保護肽片段包括（但不限於）下表3中所列示之各化合物。表3 肽號碼式 T-1249之對應號碼胺基酸序列 (SEQ. ED NO: 1) 1 Ac-WQEWEQKITALL-COOH (SE〇 ID NO:2) 1-12 2 FMOC-EQAQIQQEKNEYEL-COOH (SE〇 ID NO:3) 13-26 3 FMOC-QKLDKWASLWEW-COOH (SE〇 ID NO:4) 27-38 4a FMOC-QKLDKWASLWEWF-NH2 (SEQ ID NO:5) 27-39 4b NH2-QKLDKWASLWEWF-NH2 (SE〇IDNO:5) 27-39 5a FMOC-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 (SEQIDNO:6) 13-39 5b NH2-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2 (SEQIDNO:6) 13-39 以上表3中所列示該肽之胺基酸殘基中任一或多個側鏈可經如上述標準側鏈保護基團（例如，tBu，trt及Boc)保護。合成表3之肽之代表性方法在下文第7及第8節中有説明，其係採用下文第5.3節中所述之通用技術。 5.3 .肽合成法如上述，較佳使用固相合成技術製成本發明部份該個別肽片段，且較佳使用一種固相與液相合成技術之組合方法製成本發明其它肽，該合成方法可製造如文中所述之T - 1249或似T-1249肽。然而，可知可經由本技藝中皆已熟知之技術合成或製備本發明該肽片段。見，例如，Creighton， 1983, Proteins : Structures and Molecular Principles, W. H. -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

請先閱讀背面之注意事 I裝本. 頁 I

訂暑 I I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237640 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（10)

Freeman and Co.，NY，該資料完整併於本文供參考。或者可以以不同方法合成本發明該肽，致使連接該肽之胺基酸殘基之一或多個键爲非肽鍵。可以採用熟悉本技莪者所熟知之反應形成這些其它非肽键，且其可包括（但不限於）例如，亞胺键’酯鍵，gf肼鍵，半卡巴月井 (Semicarbazide)键，及偶氮键。在本發明又另一種具體實例中，可以合成具有其它化學基團存在於其胺基及/或叛基末端處（因此，可增強，例如，該肽之安定性，反應性及/或溶解性）之含上述序列之 T-1249及似T-1249肽。可添加，例如，疏水基團（例如，字氧談基’—甲版基奈㈣酸基’乙酿基或第三-丁基氧羰美) 至該胺基末端。同樣，可以將乙酿基或9 -苐基甲氧基_窥基置於違肤之胺基末端處。（見上述，1249之"X "修飾某團）。此外，可以添加該疏水基團（第三-丁基氧羰基，或酿胺基）至該肽之叛基末端。同樣，可以將對-硝基爷基醋或芊基酯基團放在該肽之羧基末端處。（見如上，τ_1249之 ’· Z "修飾基團）。導入此種修飾基團之技術爲熟悉本技藝者所熟知。再者，可以合成T-1249及似T-1249肽，致使其立體構形改變，例如，可以使用該肽之一或多個胺基酸殘基之D _異構物而非該常用L -異構物。又另外，本發明該肽之至少一個該胺基酸殘基可經由該已熟知非天然產生之胺基酸殘基中之一種取代。例如這些變更可增加本發明該肽之安定性，反應性及/或溶解性。 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） '' ' 裝------ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) — — — — — — — — — 1237640 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 11 五、發明說明（）可以合成任一種可額外具有一種巨分子載劑基團共價連接至胺基及/或羧基末端處之該T-1249或似T-1249肽。此種巨分子載劑基團可包括，例如，脂類-脂肪酸共軛物，聚乙二醇，醣類或額外肽。上述該T-1249之該π X π修飾基團因此可另外表示任一種與肽之該羧基末端共價連接之任一種上述巨分子載劑基團，較佳為一種額外肽基團。同樣，上述Τ-1249之該π Ζ ”修飾基團可另外數示任一種上述該巨分子載劑基團。較佳使用標準FMOC規定，經由固相肽合成法（SPPS)合成本發明該肽片段。具，例如，Carpino等人,1970，J. Am. Chen. Soc. 92(19): 5748-5749; Carpino 等人，1972，J. Org. Chem. 37(22): 3404-3409。在一項較佳具體實例中，係在超酸敏性固體載劑上進行本發明該肽片段之固相合成法，該超酸敏性固體載劑包括（但不限於）2 -氯三苯甲基氯樹脂（具，例如，Barlos 等人,1989, Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946)及 4 -羥甲基-3 -甲氧基苯氧基丁酸樹脂（見，例如，Seiber， 1987，Tetrahedron Letters 28(49^:6147-6150，及 Richter等人， 1994, Tetrahedron Letters 35(27):4705-4706)。該 2 -氯三苯甲基氯及4 -羥甲基-3 -甲氧基苯氧基丁酸樹脂皆可購自 Calbiochem-Novabiochem Corp (San Diego, CA) 0 通常，可以在固相肽合成法中採用之製造及樹脂填充之非限制程序在文中有描述。此外，下文第6節中所提供之各實例係描述典型的樹脂製法。可經由，例如，以下技術進行樹脂充填步驟：將該樹脂 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） I裝·-------訂---------. (請先閱讀背面之注意事項^填寫本頁)

1237640 五、發明說明（12) (較佳爲超酸敏性樹脂，例如，2 -氯三苯甲基樹脂）裝入該反應室内。以氯化溶劑〔例如，二氯甲烷（DCM)〕洗務該樹脂。排出該床上之洗務液，然後添加〇· 5 - 1 ·5當量胺基酸〔具有0.2至0.5過量二異丙基乙胺（DIEA)〕之約8 _ 10體積二氯乙烷（DCE)溶液。該胺基酸之N -末端較佳經Fm〇cs 護，且若需要或適合時，該胺基酸之側鏈應該經保護。以氮氣泡攪拌該混合物2 - 24小時。應該注意，爲了使該2 -氯三苯甲基樹脂適當膨脹，需要使用氯化溶劑，例如，DCM或DCE。經揽拌後，排出該床上之溶液，並經DCM洗條。該樹脂上之活性部位經9 : 1 MeOH:DIEA溶液封端約20- 30分鐘。排出該床上之溶液’經DCM洗滌4次，並經氮滌洗氣乾燥，得到該填料樹脂。

Fmoc爲該胺基酸N -末端之較佳保護基團。根據所填充胺基酸之種類’其側鏈可或可不被保護。例如，當填充色胺酸（Trp)時，其側鏈應該經Boc保護。然而，並不需要保護亮胺酸（Leu)之側鏈。麩胺酸（Glu)，天冬胺酸（Asp)，蘇胺酸（Thr)及絲胺酸（Ser)較佳經保護呈第三_ 丁醚或第三-丁酉旨型式’且色胺酸（Trp)及賴胺酸（LyS)經保護呈第三-丁氧基故基胺基甲酸醯（Boc)型式。該天冬醯胺（Asn)及麩醯胺酸（Gin)之醯胺側鏈可或可不被三苯甲基保護。填充該樹脂及肽合成中所使用之該經Fniocs護胺基（若需，可具有或可不具有側鏈保護基團）可得自多家賣廠（其包括Senn或Genzyme)。上述程序之另一項替代方法爲所購 -15- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 13. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237640 A7 B7 五、發明說明（得之該樹脂已填充該適合胺基酸。下文第6節提供之各實例係描述典型的樹脂製法。可根據，例如’以下非限制技術進行固相肽合成技術：添加該填充樹脂至該反應室内，並經溶劑（較佳為約1〇體積二氯甲烷DCM)調理，並經氮氣攪動或攪拌約15分鐘使該樹脂粒膨脹。需要DCM使該2-氯三苯甲基樹脂適當膨脹。當該樹脂膨脹時，該反應室内之樹脂體積會增加3 _ 6件，且該活性部位顯露，變得更容易反應。該樹脂膨脹後，自該反應室排出該溶劑。經由使該樹脂與六氫峨淀之N-甲基_2-吡咯啶酮 (NMP)20%溶液2整份各反應約1〇分鐘，自該末端胺或該樹脂移除該Fmoc( 9 -苐基-甲氧基羰基）保護基團。各整份所需六氫吡啶之NMP 20%溶液之體積取決於欲進行反應之規模。然後以多份NMP(約10體積）洗滌該樹脂.5-7次以移除該

Fmoc副產物（亦即，二苯并富烯及其六氫吡啶加合物）及殘留六氫P比淀。可以使用氯醌試驗以測定殘留吡啶之移除是否完成。該氯醌試驗溶液之製法為添加一滴氯醌之甲苯飽和溶液至約 1毫升丙酮中。可添加一滴該NMP洗液至該氯醌試驗溶液中以進订試驗。藍色或紫色為第二胺之陽性指示，其表示仍有殘留六氫吡啶。重覆該NMP洗滌步驟，直到不再發現藍色或紫色為止。同時’使欲依序添加至該樹脂中之該後續胺基酸之羧基末端經活化以進行反應。各胺基酸之胺末端應該經]?1110()保 -16- 本紙張尺度^用^5^家標準（CNS)A4·^格⑵㈡97公爱） —-

1237640 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（14 ) 護。根據欲添加之胺基酸種類，其側鍵可或可不被保護。該 Tyr(Y)，Thr(T)，Sei*(S)，Glu(E)及 Asp(P)之側鏈較佳經 t_ Bu保護，該Gln(Q)及Asn(N)之側鏈較佳經trt保護，該LyS(K) 及Trp(W)之側鏈較佳經Boc保護。該Leu或lie之側鏈並不需要被保護。该胺基故之活化方法如下。於室溫下使該經Fmoc保護之胺基酸（1.5當量），1 -羥基苯幷三唑水合物（H〇BT) ( 1.5當量），及二異丙基-乙胺（DIEA) ( 1·5當量）溶解在極性，非質子性溶劑〔例如，Ν -甲基吡咯啶酮（ΝΜΡ)，二甲基曱醯胺 (DMF)或二甲基乙醯胺（DMAC)〕（約7.5體積）中。使該溶液冷卻至0 - 5。(：，然後添加鄰-苯幷三唑_ 1 -基-ν，Ν，Ν，Ν’ ·四甲基糖醛鏘六氟磷酸酯（HBTU)或鄰-苯幷三唑-1-基-四甲基四氟硼酸酯（TBTU) (1.5當量），繼而攪拌5 - 15分鐘使其溶解。重要的是於0 - 5 °C下進行活化作用以使該胺基酸之消旋作用減至最低。該HBTU爲最後一個添加至該冷溶液中之試劑，因爲在其不存在的情況下，不能進行活化作用及消旋作用。將該活化胺基酸溶液填充至該已排出之樹脂内，以 DCM(約2·5體積）洗滌。需注意該胺基酸之活化作用係在 ΝΜΡ中進行，因爲HBTU不溶於DCM中。然而，於此時，添

加DCM至該反應中以維持該樹脂粒之適當膨脹。於20- 30°C 下以N2汽泡攪拌該反應約1小時。如下述進行定性水合茚三酮試驗以監測偶合反應是否完成。爲了使用該定性水合茚三自同試驗以檢查該反應’可取出 -17- ___ 紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） --------^ _________— (請先閱讀背面之注意事項#|填寫本頁) ;€ 1237640 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（15 ) 2 - 20笔克該樹脂試樣，並經甲醇洗乾淨。添加3滴酚之乙醇76%溶液，4或5滴KCN之吡啶0.2毫莫耳濃度溶液，及3 滴水合莽三嗣之乙醇〇·28莫耳濃度溶液至該試樣中。使該試樣經乙醇稀釋至約〇·5毫升體積，並於約7yC下，放入熱磚内5 - 10分鐘。藍色或紫色爲游離態胺存在之陽性指示，其表7^孩反應尚未完全。該試樣可以再經稀釋至約3毫升體積’以更容易評估該濃縮試樣中顏色變化之程度。一小時後’若發現其爲陽性水合茚三酮試驗，再持續進行該偶合反應一小時。3小時後，若發現其爲陽性水合茚三酮試驗’則排出該樹脂，在約1〇體積NMP中洗滌一次，並使用0.5 - 1當量活化胺基酸重覆該偶合反應。在偶合循環之間，若該樹脂必需貯存一夜，可以排出該樹脂床，並於氮氣層下經NMP覆蓋。或者，可以流掉該床之液體’於氮氣層下貯存，然後在進行下一次偶合循前經 DCM洗務調理。若在分裂前，該已完成片段必需貯存一夜，則該樹脂應該經IPA洗滌，使其不含NMP,因爲在NMp 中會產生明顯Fmoc脱除保護作用。該偶合反應被判定已完成後，排出該樹脂，並經3整份 (約10體積）NMP洗滌，重複該循環以進行後續該肽片段之基體（亦即，胺基酸）。進行該最終偶合反應後，先後以4 整份（約10體積）NMP，先2整份（約1〇體積）DCM及2整份IPA 洗滌該樹脂。該樹脂結合肽可以經氮清洗乾燥或在烘箱内乾燥。可以根據例如，以下非限制技術切除並離析經由固相合 -18- 本纸張尺度適用中關家標準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） ' ---

1237640 A7 B7 五、發明說明（16 ) 成技術合成之肽：可以使用熟悉本技藝者所熟知之技術切除該樹脂之肽。例如，可以使用三氟醋酸（TFA)之DCM 1 % 或2 %溶液或（TFA)之DCm 1 %及2 %溶液組合以切除該肽。亦可以使用醋酸（HOAC)，鹽酸（HC1)或甲酸以切除該肽。分裂步驟所需之特定分裂劑，溶劑及時間取決於欲切除之該特定肽。分裂後，使該分裂部份進行標準加工程序以離析該肽。一般而言，係利用眞空濃縮該已化合分裂部份，繼而經極性或極性非質子性溶劑（例如，乙醇（Et〇H)，甲醇（MeOH)，異丙醇（IPA)，丙醇，乙腈（ACN)，二甲基甲醯胺（DMF)，NMD，DMAC，DCM等等）重組，接著經抗溶劑 (例如，水或己烷）沉澱或晶化，然後經由眞空過濾收集。或者’茲肽經離析後，可以使用溶劑或水研磨該產物。下文第7.1 - 7.6節中提供之各實例提供如表1，2及/或3 中顯示之肽中間物之固相合成法。經濟部智慧財產局員工消費合作社印製爲了合成全長T-1249肽，可以一起偶合上文表1之該肽中間物以產生該T_1249肽。例如，可以一起偶合上文表2中列π之該肽中間物組以產生τ_1249全長肽。自中間物肽片丰又合成全長Τ-1249之代表性實例提供在下文第9節中，且在圖1中有圖解表示。在某些具體實例中，可以遵照合成Τ-1249之3片段方式。J片&方式’’合成法係指一種丁_1249合成法流程，其係首先以所合成之3種乙1249中間物肽片段開始反應，並使用固相與液相合成技術，使其偶合成一種全長τ-1249肽。上又表2中所示之第}，2，3及4組中間物肽片段代表較佳 _____________ - 19 _ 紙張尺度適用中國國豕“準（CNS)A4規格（210 X 297公爱） "' 1237640 A7 —-___B7__ 五、發明說明（17 ) 組。圖1描述採用表2第1組肽中間物以合成全長T - 1249之典型3片段方式。就該組而言，需注意胺基酸殘基39(該Τ-ΐ 249致基 1 - 末端胺基酸殘基）係在該片段偶合反應進行中個別導入。圖1中所示該Τ-1249合成法流程圖之完整圖示在第9· 1節中提供之實例中有説明。可以採用熟悉本技藝者所熟知之液相肽合成技術以合成本發明該肽中間物片段。第8節中所提供各實例係描述合成表1，2，及/或3中所列示肽中間物之典型液相肽合成法。例如，具有廣泛pH範圍（其包括於高或低ρΗ下之ρΗ安定性値）之該非載矽石之管柱填料係由T〇s〇haas (Montgomery ville，PA)銷售〇 6 ·實例：樹脂合成法 61特胺-基酸填充至2-CTCM樹脂上之較佳實例古法經濟部智慧財產局員工消費合作社印製添加空氣敏感性2 -氯三苯甲基氯樹脂（Senn Chemicals， Lot A 3573，1當量，12.0毫莫耳，10.0克）至25〇亳升圓底燒瓶内，並立即經FmocLeuOH ( 1.0當量，12毫莫耳，4 24克）及一異丙基乙胺（5當量，60.0毫莫耳，5.20毫升）之 DCM(10體積，100毫升）之製備溶液處理。覆蓋該漿體，並攪拌3小時。經由過濾移除該溶劑，並以dcmc 5體積，5〇 *升）洗滌該樹脂。經由具9 : 1 MeOH: DIEA ( 5體積，5 0毫升DIEA及45毫升MeOH)之樹脂處理3〇分鐘使該樹脂上殘留之活性部位經封端。移除該溶劑，並以3 χ 5體積洗滌該樹脂。使該樹脂乾燥至恆重，得到13·2克填充樹脂，其每克具有0.98毫莫耳FmocLeuOH計算填充量。 -20-

1237640 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（18 ) 亦可以使用該方法將FmocTrp(Boc) 0H填充至2-CTC樹脂上。如文中所述，第6.2 - 6.3節爲氯三苯甲基氯樹脂經可以與文中所述該肽及肽中間物之固相合成法一起使用之胺基酸取代之實例。可以經由固相合成法（SPPS)使用下文第6.2及 6.3節中所述之填充程序合成本發明全部該肽及肽片段。 6.2 Fmoc-Τϊρ (Boc)-2-氯三苯甲基樹脂之製法材質：分子量當量毫莫耳 A 毫升 2-氣三苯甲基氯樹脂 — 1.0 25 25 — Fmoc-Trp(Boc)-OH — 526.60 1.5 37.5 19.7 二異丙基乙胺〇DIEA) 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4 二氣乙烷(DCE) — — — 250 二氣甲烷(DCM) — — — 6X250 9:1 甲醇:DIEA 程序： -- 一 200 將2-氯三苯甲基氯樹脂（25克，1當量）裝入500毫升肽室内，並經250毫升DCM洗滌。流出該床之液體，並添加該 Fmoc- Trp(Boc) OH( 1.5 當量）及該 DffiA( 1.7 當量）之 10 體積 DCE溶液。氮氣泡攪拌該混合物2小時。排洩該床之液體，並經250毫升DCM洗滌。使該樹脂上之活性部位經200毫升之9 : 1 MeOH:DIEA溶液封端20分鐘。排洩該床之液體，經4 X 250毫升DCM洗滌，並經氮清洗乾燥，得到34.3克填充樹脂。經由切除該樹脂之Fmoc-胺基酸進行HPLC定量分析，並對照標準値驗定。該材質經HPLC分析顯示該樹脂之填充量 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）裝---- (請先閱讀背面之注意事項^填寫本頁)

I ·111111. 1237640 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（19) 爲0.68毫莫耳/克。管柱：Phenomenox Jupiter C18; 300埃；5微米流速：1毫升/分鐘偵測：於260毫微米處之UV 流動相：A : 0.1%TFA水溶液 B : 0.1%TFA之乙腈溶液 65%B等濃度溶離液 A7 B7 滯留時間：約14分鐘 6.3 Fmoc-Leu-2-氯三苯甲基樹月旨之製>去材質：分子量當量毫莫耳盖毫升 2-氯三苯甲基氣樹脂 — 1.0 250 250 — FmocLeuOH 353.42 1.5 375 132.5 — 二異丙基乙胺(DDEA) 129.25 1.7 425 55 75 二氯乙烷(DCE) — — — — 2000 二氣甲烷(DCM) — — — — 6 X 1500 9:1 甲醇:DEEA 程序： 1500 將該樹脂裝入3升肽室内，並經1.5 DCM洗滌。排洩該床之液體，並添加該FmocLeuOH( 1.5當量）及該DIEA( 1.7當量）之8體積DCE溶液。以氮氣泡攪拌該混合物2小時。排洩該床之液體，並經1.5升DCM洗滌。使該樹脂上之活性部位經1.5升之9 : 1 MeOH:DIEA溶液封端30分鐘。排洩該床之液體，經4 X 1.5升DCM洗滌，並經氮清洗乾燥，得到345克填充樹脂。經由切除該樹脂之Fmoc-胺基酸進行HPLC定量分析，並 - 22- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部智慧財產局員工消費合作社印製對照標準値驗定。該材質經HPLC分析顯示該樹脂之填充量爲0.72毫莫耳/克。管柱：Phenomenox Jupiter C18; 300埃；5微米流速：1毫升/分鐘偵測：於260毫微米處之UV 流動相：A : 0.1%TFA水溶液 B : 0.1 %TFA之乙月膏溶液 65 % B等濃度溶離液滯留時間：約8分鐘 7·實例：肽之固相合成法在下文第7· 1 - 7.6節中提供如表1，2，及/或3中所列示肽中間物之該固相合成法實例。 7·1里相肽合成法（SPPS)之較佳方法；通用程戽將FmocLeu-樹脂（1當量）裝入SPPS室内。在5 %六氫外匕呢DCM(7.5當量）中以氮滌氣調理該樹脂ι5-3〇分鐘。排戌該溶劑，並以六氫吡啶之NMP( 5體積）2 X 20%溶液處理樹脂30分鐘以移除該Fmoc保護基團。經第二次2〇%六氫吡咬 /NMP處理後，使該樹脂經5 _ 7 x NMp( 5體體）洗滌以進行陰性氯醌試驗。同時，使後續胺基酸（I.5當量），HOBT( I·5當量）及 DIEA( 1.5當量）在3 : 1 NMP/DCM( 1 0體積）中化合，並於室溫下使其完全溶解，然後冷卻至〇 °C。添加HBTU，攪拌該落液10- 15分鐘以溶解該固體，然後將其添加至該樹脂内。於鼠氣氣下經攪拌攪動該懸浮液3小時。以水合節三酉同 -23- 本紙張尺度過用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐）裝------ (請先閱讀背面之注意事項#(填寫本頁)

I * 111111 · 4 1237640 A7 五、發明說明（21 經濟部智慧財產局消費合作社印製

疋性試驗監測偶合反應之完成。3小時後，若該反應未完成（陽性水合茚三酮試驗持續），應該排洩該反應器之溶液’並使用活化胺基酸（〇·5當量）之新溶液進行再偶合反應。通常，再偶合3〇分鐘至1小時後，獲得陰性水合茚三酉同試驗。使該片段中之剩下胺基酸重覆進行該偶合循環。一旦該片段建立時，該洗液中該溶劑之使用體積需要增加 5體積以上。就AcAA1_12〇H而言，經醋酸酐封端之方法爲在3 : 1 NMP/DCM( 1 0體積）中先後以吡啶（5當量）及醋酸肝 (5當量）處理去Fmoc(HAAl-12-樹脂）。經最終偶合後，先後以3 X 5 - 8體積NMP及2 X 1〇體積DCM洗滌該樹脂，並於 40°C下在眞空烘箱内乾燥至恆重。 7·2 除樹脂之該肽之輕祛古法以下方法描述切除該樹脂之肽AcAA1_ 12〇h之方法。然而’可以使用相同方法切除本發明其它肽片段。方法A :使用HOAC 利用氮氣攪動1.5小時，以Ac〇H/ME〇H/DCM (5: i :4， 20¾¾，20¾升）處理該樹脂（丨克，〇 37〇毫莫耳），並將該溶液移至圓底燒瓶内，經攪摔，並經水（2〇體積）處理。濃鈿（旋轉瘵發，40°C浴）所形成白色漿體，移除DCM，並經由過濾收集該產物。乾燒至恆重，得到87A%純度之〇·69克 (74%)AcAA1_120H。如上述方法第二處理該樹脂，得到較不純材g (83區域％) I額外〇〇8克（8 5%) AcAA1_ 12〇h，其建議所要反應時間爲稍> 15小時。方法B :使用TFA 裝------ (請先閱讀背面之注意事項^填寫本頁)

I 訂--------- -24 Ϊ237640 A7 B7 五、發明說明（22) 以TFA之DCM 1 %溶液5 - 6 X 1.7體積各洗滌該樹脂（1 wt，20克）3 - 5分鐘。將該1 %TFA/DCM洗液收集在含吡啶 (與该洗液中之TFA量1 : 1體積比）之燒瓶内。化合含該產物之洗液（600毫升，30體積），並經由蒸餾移除該DCM至最低壺體積（〜1 / 3該原有體積）。調整該眞空以維持壺溫度於 15- 25°C。添加乙醇（6 . 5體積），並持續進行蒸餾，直到移除該DCM爲止（經由該餾出物溫度之增加以進行測定）。再調整該眞空以維持壺溫度於15- 20°C。該最終壺體積應該爲一 8 - 9體體。使該溶液冷卻至5 - 10°C，並以30分鐘添加水 (6.5體積）以沉澱該AcAA1-120H。經由眞空過濾收集該固體，並經水（2 - 3體積）洗條。於〇 - 5 °C下攪;掉該漿體30分鐘，經由眞空過濾收集固體，並乾燥至恆重以90%產率及 84區域％(A%)純度得到 16.80 克 AcAAl-120H。 7.3 AcAAl-120H再加工之較佳方法於65°C下在70毫升甲醇（23.3體積）中使AcAAl-120H (257-21-1，3·00克）經攪拌加熱3小時。冷卻至室溫，並攪拌一夜。經吸濾並在眞空烘箱（40°C )中乾燥至恆重，得到90A% 之 2.43 克（81%)。 HPLC 條件:Vydac C8, cat. No. 208TP54, 5 u，300 A，0.9毫升 / 分鐘 ’ 280¾ 微米。A:0.1% TFA/水，B:8〇% i_pr〇H/20% 乙腈及0.1 % TFA之混合物。60- 80% B/30分鐘。一般試樣製法：使1毫克溶解在0· 10毫升NMP中，經丨毫升乙腈稀釋。將20微升注入20微升槽内。 7.4 FmocAA13-260H之SPPS，及自該樹脂反除之步骤 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）

請先閱讀背面之注意事靈裝頁I 一 I I 訂經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237640 A7 B7 五、發明說明（23 ) 如上述進行FmocAA13-26之SPPS，並首先以1.02毫莫耳/ 克填充6.5克FmocLeuOResin開始反應。可使用切除方法A或 B( 169/ 137，60%產率，85A%)。 7.5 FmocAA13-260H之較佳再加工程序於 78°C 下使 FmocAA13-26OH(3.60 克，85A%)在 15毫升（5 體積）乙腈中加熱。使該漿體經額外溶劑處理，直到該固體溶解爲止（總共0.6毫升）。使該溶液冷卻至室溫，並攪拌 7小時。經吸濾，並乾燥至恆重，得到95A%之2.6克 (72% ) FmocAA13-260H。 HPLC 條件:Vydac C8, cat. No. 208TP54, 5 u，300 A，0.9毫升 / 分鐘，280毫微米。A:0.1% TFA/水，B:80% I-PrOH/20% 乙腈及0.1 % TFA之混合物。60- 80% B/30分鐘。一般試樣製法：使1毫克溶解在0.10毫升NMP中，經1毫升乙腈稀釋。將20微升注入20微升槽内。 7.6 FmocAA27-380H之SPPS，及自該樹脂切除之步驟如上述進行FmocAA27-380H之SPPS，並首先以0.75毫莫經濟部智慧財產局員工消費合作社印製耳/克填充10克FmocTrp(Boc)OR開始反應。使用切除方法 B( 169/ 120/l，78%產率，87.9A%)。條件:Vydac C8, cat. No. 208TP54, 5 u，300 A，0.9毫升 / 分鐘，280毫微米。A:0.1% TFA/水，B:80% I-PrOH/20% 乙腈及0.1 % TFA之混合物。60- 80% Β/30分鐘。一般試樣製法：使1毫克溶解在0.10毫升ΝΜΡ中，經1毫升乙腈稀釋。將20微升注入20微升槽中。 8 .實例：肽片段之液相合成法本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237640 A7 B7 五、發明說明（24) 在下文第8.1-8.4節中提供如表1，2，及/或3中列示肽中間物之該液相合成法。 8.1經由使HPheNHb與Fmoc-AA27-380H進行液相偶合以製備片段Fmoc-AA27-39-NH2之方法可以在DIEA與苯基丙胺酸醯胺存在下，分別使用HBTU 或TBTU及HOBT或HOAT使該FmocAA27-380H之羧基末端轉化成一種活性HOBT或HOAT酯以製成FmocAA27-39NH2。該反應係於0至25°C下在極性，非質子性溶劑（例如，DMF或 NMP)中進行。於該反應完成時，添加醇或水可混溶溶液劑以沉澱 FmocAA27-39NH2。實例: 使？111〇〇八八27-38011( 169- 120- 1，5.40克，1.98毫莫耳， 1.00 當量），HPheNH2 (Bachem，0.390克，2.38 毫莫耳，1.20 當量），Η0ΒΤ·Η20 (0.330克，2.16毫莫耳，1.10當量）溶解在ΝΜΡ( 54毫升，10體積）中，經DIEA( 0.16毫升，0.921毫莫耳，1.10當量）處理，並於室溫下攪拌，直到溶解爲止（約 30分鐘）。使用冰浴（内部溫度=2 _ 3 °C )使該溶液冷卻，並以一份添加HBTU(0.827克，2.18毫莫耳，1.10當量），攪拌 1小時，然後攪拌一夜。可經由TLC(uv，10% MEOH/DCM， SM mid Rf，上述產物）監測該反應。添加甲醇（54毫升，10 體積），然後以1小時一滴滴添加水（54毫升，10體積），形成自由流動之固體，使其再攪拌2小時，然後經由過濾收集。以1 : 1水/甲醇（2 X 25毫升）洗滌液濾餅。於4(TC下在眞空烘箱内乾燥一夜，得到81A%之5.30克 --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項^填寫本頁)

I 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1237640 a7 B7 五、發明說明（25 ) 39NH2。HPLC分析亦顯示含< 〇 . 2 %起始物質？111〇〇八八27-380H。ES pos=2871 (NM+)，ES neg=2869 (Μ- 1 )。平均分子量 = 2870 〇 HPLC 條件:Vydac C8, cat. No· 208TP54, 5 U，300 A，0.9毫升 / 分鐘，280毫微米。A:0.1% TFA/水，B:80% I-PrOH/20% 乙腈及0.1% TFA。60- 80% B/30分鐘。一般試樣製法：使 1毫克溶於0.10毫升NMP中，經1毫升乙腈稀釋。將20微升注入20微升槽中。 8.2經由移除FMOC基團以製備片段HAA27-39NH2之方法使用驗（例如，六氫p此淀或碳酸_)在有機溶劑（例如， DCM，DMF，NMP，甲基第三-丁醚（MTBE)，己烷，或其混合物）中移除FmocAA27- 39NH2之該Fmoc保護基團0 實例: 在40毫升（10體積）MTBE及10毫升（2.5體積）庚烷中使 FmocAA27-390H (257_ 25-1，4.00 克，1.39 毫莫耳）成爲漿體，然後經六氫呲啶（0.75毫升，8.34毫莫耳，5.5當量）處理。攪拌該漿體12小時，於此起，剩下0.5 %起始物質（經 PHLC分析得知），並添加20毫升（5體積）庚烷。攪拌該自由流動的漿體1小時，然後經由吸濾離析，並經1 : 1 MTBE/ 庚烷3 X 7毫升（每一次洗滌2體積）洗滌，然後於40°C下在眞空烘箱中乾燥直到恆重，得到83A%純度之3.55克 (96% ) 257-40- 1。 gtPLC 條件:Vydac C8, cat· No. 208TP54, 5 u，300 A，0.9 毫升 / 分鐘，2 8 0 毫微米。A: 0.1% TFA/水，B: 80% I-PrOH/20% -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 x 297公S ) --------訂--------- (請先閱讀背面之注意事項#<填寫本頁)

I 1237640 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製五、發明說明（26 ) 乙腈及0.1 % TFA之混合物。60- 80% B/30分鐘。一般試樣製法：使1毫克溶於〇· 10毫升NMP中，經1毫升乙腈稀釋。將20微升注入20微升槽中。 8.3經由使片段Fmoc-AA13-260H及HAA27-39NH2進行液相偶合反應以製備片段Fmoc-AA13-39NH2方法在DIEA及HAA27-39NH2存在下，經由分別使用HBTU或 TBTU及HOBT或HOAT使該FmocAA13- 260H之羧基末端轉化成活性HOBT或HOAT酯以製成FmocAA13-39NH2。該反應係於0至25°C下在極性，非質子性溶劑（例如，DMF或NMP) 中進行。於該反應完成時，添加醇或水可混溶溶劑及/或水以沉澱 FmocAA13-39NH2。實例: 使 FmocAA13-260H( 257-41- 1，3.00 克，0.8417 毫莫耳，1 當量），ΗΑΑ27·39ΝΗ2(2.23 克，0.8417毫莫耳，1 當量）， ΗΟΒΤ水合物（0.135克，0.884毫莫耳，1.05當量）溶於 DMF( 25毫升，30分鐘）中，經冰浴冷卻，並先後經 DIEA(0.23毫升，1.33 毫莫耳，1.50當量）及HBTU( 0.335 克， 0.884毫莫耳，1.05當量）處理，並攪拌。1小時後，根據起始物質之損失（經HPLC分析得知），該反應完成90%，並使該反應溫熱至室溫。4小時後，添加額外HBTU( 0.150克， 0.395毫莫耳，0.5當量），並攪拌該反應一夜。添加甲醇 (50毫升），然後一滴滴添加水（5〇毫升），引起黏合，於環境溫度下攪拌6小時後，其固化成爲一種漿體。經由過滤收集該固體，經2 X 20毫升1 : 1 MeOH:水洗滌，並乾燥至 -29- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公爱）裝--------訂·---- (請先閱讀背面之注意事項翔填寫本頁)

I 1237640 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 27 五、發明說明（）恆重，得到 60A%純度之 5·18 克（99%)FmocAA13-39NH2° The Solid 5 A% each of acid and amine starting materials。 HPLC 條件:Vydac C8, cat· No· 208TP54, 5 u，300 A，0.9 毫升 / 分鐘，280毫微米。A : 〇·1 % TFA/ 水 ’ B : 80% I-PrOH/20% 乙月青及0.1% TFA之混合物。60- 80% B/30分鐘。一般試樣製法：使1毫克溶於〇.1〇毫升NMP中’經1毫升乙腈稀釋。將 20微升注入20微升槽中。 8.4經由移除Fmoc基團以製備片段HAA13- 39NHZ之方法在有機溶劑（例如，DCM ’ DMF ’ NMP ’ MTBE ’己燒’ 或其混合物）中使用鹼（例如，六氫呲啶或碳酸鉀）移除 FmocAA13-39NH2 之該 FMOC保護基團。實例：使 FmocAA13-390H(257-43-l，0.500 克，0.0810毫莫耳，1 當量）在9毫升（18體積）2:1MTBE/庚烷中漿化30分鐘，然後經六氫呲啶（40微升，0.404毫莫耳，5當量）處理。攪拌該漿體2小時。於此時，剩下40%起始物質（經HPLC分析得知）。添加額外MTBE( 3毫升，6體積）及六氫呲啶（20微升， 2.5當量）並攪拌該漿體直到剩下< 1 %起始物質為止（16小時）。使該反應漿體經吸濾，經25毫升1 : 1 MTBE/己烷洗滌，並乾燥至恆重，得到約60- 70A%之0.40克（90%)產物。 HPLC 條件：Vydac C85 cat· No· 208TP54, 5 u，300 A，0.9毫升 / 分鐘，280毫微米。A:0.1% TFA/水，B:80% I-PrOH/20% 乙腈及0.1% TFA之混合物。60- 80% B/30分鐘。一般試樣製法：使1毫克溶於0.10毫升NMP中，經1毫升乙腈稀釋。將 -30- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（21〇 X 297公釐） · 11 tai in tmmmm tmmB i 一口、I ·ϋ ·ϋ l_i an ai·— . (請先閱讀背面之注意事項却填寫本頁)

I 4 1237640 A7 B7 五、發明說明（28 20微升注入20微升槽中 9實例：合長T- 1249肽之合成方法 ji 在下文®RI9.2節中提供採用該肽中間物片段以製備全長7_ 1249^ 例在本節之實例説明可以使用固相與液相合成技術成功偶合物片段以製備全長T - 1249肽。 9.1使AcM^120H與HAA13_39NH2經由液相偶合以製備片段 AcAAl-39NH，之方法經濟部智慧財產局員工消費合作社印製文中所述之合成方法表示圖1所圖解該T-1249三片段方式之詳述。可以在DIEA及HAAB-39NH2存在下分別使用 HBTU或TBTU及HOBT或HOAT，使該AcAAl- 120H之羧基末端轉化成活性HOBT或HOAT酯以製成AcAA1-39NH2。於該反應完成時，添加醇或水可混溶溶劑及/或水以沉澱AcAAl-39NH2。實例：使 HAA13-39(257- 32- 2，0.409 克，0.0685 毫莫耳，1 當量），AcAAl-120H(25-21-l，0.174 克，0.0685 毫莫耳，1 當量）及HOBT水合物（0.013克，0.0822毫莫耳，1.20當量）溶於 DMF( 6.0毫升，12體積，30分鐘）中。使用冰浴使該溶液冷卻，並先後添加DIEA( 18微升，0.1028毫莫耳，1.5當量）與 HBTU(0.031克，0.0822毫莫耳，1.20當量）。於0 °C下攪拌4 小時後，一滴滴添加水（6毫升）。攪拌所形成漿體1小時，然後經由吸濾離析。於40°C下在眞空烘箱内乾燥一夜，得到約 50A% 之 0.545 克（94% ) 257- 33- 1。 31 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）裝---- (請先閱讀背面之注意事項為填寫本頁)

I 訂--------- 1237640 A7 B7 五、發明說明（29) 廷？LC 條件·· Vydac C8，cat. No. 208TP54，5 u，300 A，0.9毫升 / 分鐘，280 毫微米。A:01% TFa/水，B:80% l-pr〇H/2〇% 乙月目及0· 1% TFA之混合物。60-80% B/30分鐘。<一般試樣製法：使1毫克溶於〇·1〇毫升NMP中，經1毫升乙腈稀釋。將20微升注入20微升槽中。 9·2隹A c A A 1 - 39NH?經由侧鏈脱除保護作用以製備τ _ 1249側面之方法本節中提供之實例説明使用固相與液相合成技術使肽中間物片段成功偶合以製備TM249肽。特定言之，文中所述孩合成方法係表示圖i所示該τ-1249三片段方法之最終脱除保護作用步驟。較佳使用95/5三氟醋酸/水及至高5重量 /體積％碳陽離子清除劑（例如，丨，4 _二硫代蘇糖醇，乙二硫醇或胱胺酸）經由酸解移除acAA1_39NH2之該側鏈保護基團。經由添加醚（例如，MTBE，二乙醇或二異丙醚）可以自該脱除保護作用溶液沉澱該粗T-1249。實例: 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製以TFA..DTT··水（95:5:5)之1.5毫升新製備溶液處理 AcAA1_39NH2( 257-33-1，〇·120克）並於室溫下攪拌4小時。添加ΜΤΒΕ(約3毫升），並經由眞空過濾收集該沉澱物。在興空烘箱内使孩微細粉末乾燥一夜使該物質溶於含 1 %HOACt 3耄升50%乙腈/水溶液内，並使其靜置15小時，使該色胺酸之吲哚側鏈進行去羧基反應。直接分析該溶液並發現可以與眞τ-1249共洗提。經由HpLC分析大概純度爲60%。 ________ _ 32 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X -- 1237640 A7 _B7 五、發明說明（30 ) HPLC 條件:Vydac C8, cat. No. 208TP54, 5 u? 300 A? 0· 9 毫升 /分鐘，280毫微米。A:0.1% TFA/水，B:80% Ι-ΡιΌΗ/20% 乙腈及0.1% TFA之混合物。60_80% Β/30分鐘。一般試樣製法：使1毫克溶於0.10毫升ΝΜΡ中，經1毫升乙腈稀釋。將20微升注入20微升槽中。裝--------訂·--------. (請先閱讀背面之注意事項身填寫本頁) 4 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3 3 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） Β：：ι / - 7]..; 修

089113543 ^上各欄由本局填註）發明年月β 93. 7. ΐ 9 ^ C4 發明a 〇型名稱 -、發明三、申請人中文文姓名國籍住、居所國籍 ·——J23J64C公告本中文說明書替換頁(93年7月）專利説明書肽合成之方法及肽片段 "METHODS AND PEPTIDE FRAGMENTS FOR PEPTIDE SYNTHESIS” 1. 布來恩布瑞 2. 馬克安德森 3. 保羅E.福瑞德克 4. 康名德" 1.2.3.4.均美國 1. 美國北卡羅來納州葛拉漢市布洛威路1912號 2. 美國北卡羅來納州拉里市巴森路4108號 3. 美國北卡羅來納州阿佩克斯市威克福特普來斯路 4208號 4. 美國北卡羅來納州恰皮希爾市蘭丁路193號美商特雷米爾思公司美國住、居所美國北卡羅來納州德漢市大學路4727號 (事務所）代表人馬修A·米格羅姓名本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS) A4规格(21〇 X 297公釐)

裝

線

號專利申請案 u 文說明書替換頁(93年7月）五、發明説明（7 ) T-1249具有以下胺基酸序列： nh2-wqeweqkitalleqaqiqqekneyelqkldkwaslwewf-cooh 可知，除了 T-1249外，可以使用該方法，片段與片段組及採用以挑選本發明該片段與片段組之技術以合成似T- 1249片段。如文中使用，該名詞”似T-1249 ”係意指列示在國際專利公告號PCT/US99/11219( 1999年5月20日申請）中之任一種HIV或非HIV肽，該專利資料完整併於本文供參考。除了上述T-1249及該似T-1249肽外，可以使用本發明該方法，片段及片段組以合成具有修飾胺基及/或羧基末端之肽。舉T-1249為實例，此種肽可具有下式：

X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z 其中X表示胺基酸；選自包括芊氧羰基，二甲胺基莕磺醯基，及第三-丁基氧羰基之硫水基團；乙醯基；9 -蔡基甲氧基·羰基（FMOC);或選自包括脂類-脂肪酸共軛物，聚乙二醇，及醣類之巨分子載劑；且Z表示羧基；醯胺基；第三-丁基氧羰基；對-硝基芊基酯基團；或選自包括脂類- 脂肪酸共軛物，聚乙二醇，及醣類之巨分載劑。在一項較佳具體實例中，使用本發明方法以合成具有上式之肽，其中X為乙醯基，且Z為醯胺基。添加此種’’ X ’’及” Z ”基團之技術為熟悉本技藝者所熟知。在一項較佳方法中，可以使用任一種以非矽石為主之柱式填料（使充填容量增至最大）純化T-1249與似T-1249肽及中間物，該填料包括（但不限於）以锆為主之填料，聚苯乙烯，以聚丙烯酸為主之填料或其它於高與低pH範圍下呈安 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐)

Claims

123 7^09113543號專利申請案中文申請專利範圍替換本(93年7月） A8 B8 C8 D8 t 20 年月曰

κ、申請專利範圍

1. 一種合成下式肤： X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQIDNO:l)之方法，其包括： (a)使下式側鏈保護肽： EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO:6)，其中該胺基末端經脫除保護；與下式側鏈保護肽： X-WQEWEQKITALL-COOH (SEQ ID NO:2)反應，產生下式側鏈保護肽： X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID ΝΟ:1)，其中X為保護基團，乙醯基或巨分子載劑基團；且其中Z為保護基團，醯胺基，或巨分子載劑基團。 2 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中X係為一種選自由9-說稀·基甲氧基-羰基（Fmoc)，第三-丁基（t-Bu)，三苯甲基（trt)，第三-丁基氧羰基（Boc)，芊氧羰基，二甲胺基莕磺醯基及對-硝基芊基酯基團組成之群之保護基團。 3 .根據申請專利範圍第1項之方法，其中Z係為一種選自由9-氟埽基甲氧基-羰基（Fmoc)，第三-丁基（t-Bu)，三苯甲基（tn)，第三-丁基氧羰基（Boc)，芊氧羰基，二曱胺基莕磺醯基及對-硝基芊基酯基團組成之群之保護基團。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) 1237640 申請專利範圍 A8 B8 C8 D8 4 ·根據申請專利範圍第！項之方法，其中X係為一種選自由脂類-脂肪酸共軛物質，聚乙二醇及醣類組成之群之巨分子載劑基團。 5 ·根據申請專利範圍第i項之方法，其中Z係為一種選自由脂類-脂肪酸共軛物質，聚乙二醇及醣類組成之群之巨分子載劑基團。 6 .根據申請專利範圍第1項之方法，其進一步包括脫除下式側鏈保護肽： X-WQEWEQKITALLEQAQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO: 1)之側鏈保護基團。 7·根據申請專利範圍第1或6項之方法，其中X為一種乙醯基。 8 .根據申請專利範圍第7項之方法，其中z為一種酸胺基。 9·根據申請專利範圍第1或6項之方法，其中X為一種保護基團’且其中該方法尚包括將X改變成乙醯基之步驟。 1〇·根據申請專利範圍第9項之方法，其中z為一種酸胺基。 1 1 ·根據申請專利範圍第1項之方法，其中下式側鏈保護肽： X-WQEWEQKITALL-COOH (SEQ ID ΝΟ··2)係經由固相肽合成方法合成。 12·根據申請專利範圍第4項之方法，其中下式側鏈保護 -2- 本紙張尺度適用中國國家標準((；!]^8) Α4規格(210X297公釐) 1237640 έ88 C8 D8 六、申請專利範圍肽： EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO:6)之合成方法包括：使下式側鏈保護肽： QKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO:5)，其中該胺基末端經脫除保護；與下式側鏈保護肽： EQAQIQQEKNEYEL-COOH (SEQ ID NO:3)反應，產生下式側鏈保護肽： EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO:6)。 13. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中下式側鏈保護肽： QKLDKWASLWEWF-Z (SEQ ID NO:5)之合成方法包括：使下式側鏈保護肽： QKLDKWASLWEW-COOH (SEQ ID NO:4) 與苯基丙胺酸醯胺反應，產生下式側鏈保護肽： QKLDKWASLWEWF-Z(SEQIDNO:5)。 14. 根據申請專利範圍第12項之方法，其中下式側鏈保護肽： EQAQIQQEKNEYEL-COOH (SEQ ID NO:3)係經由固相肽合成方法合成。 15. 根據申請專利範圍第13項之方法，其中下式侧鏈保護肽： -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) A BCD 1237640 六、申請專利範圍 QKLDKWASLWEW-COOH (SEQ ID NO:4)係經由固相肽合成方法合成。 16. —種肽片段組，其係選自由下列組成之群： (a) WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)? EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:3)5 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:4); (b) WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)? EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:3), QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:5); (c) WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)5 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:6); (d) WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)5 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:8); (e) WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:7)5 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:4)，及 (f) WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:7)5 QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:5)。 17. 根據申請專利範圍第16項之肽片段組，其中該等肽片段中一或多個側鏈經由保護基團保護。 18. 根據申請專利範圍第17項之肽片段組，其中該保護基團係為選自由9 -葬基甲氧基-羰基（Fmoc)，第三-丁基(t-Bu)，三苯甲基（trt)，第三-丁基氧談基（Boc)，芊氧黢基，二甲胺基莕磺醯基及對-硝基芊基酯基團組成之 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐) _ A B c D 1237640 六、申請專利範圍群。 19. 根據申請專利範圍第16項之肽片段組，其中該組包括： WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2) ? EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:3) ?及 QKLDKWASLWEW(SEQIDNO:4)。 20. 根據申請專利範圍第16項之肽片段組，其中該組包括： WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2) 5 EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:3)，及 QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:5)。 21. 根據申請專利範圍第16項之肽片段組，其中該組包括： WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)，及 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:6) ° 22. 根據申請專利範圍第16項之肽片段組，其中該組包括： WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)，及 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:8)。 23. 根據申請專利範圍第16項之肽片段組，其中該組包括： WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:7)，及 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:4)。 24·根據申請專利範圍第16項之肽片段組，其中該組包括： WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID ΝΟ:7)，及 QKLDKWASLWEWF (SEQ ID ΝΟ:5)。 25. —種肽，其係選自由下列組成之群： WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)5 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐) A B c D 1237640 々、申請專利範圍 EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:3)? QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:4)? QKLDKWASLWEWF (SEQIDNO:5)， EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:6)? WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (SEQIDNO:7);及 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQIDNO:8)。 26·根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽中一或多個側鏈經由保護基團保護。 27·根據申請專利範圍第26項之肽，其中該保護基團係為選自由9 -第基甲氧基-黢基（Fmoc)，第三-丁基（t-Bu)，三苯甲基（trt)，第三-丁基氧羰基（Boc)，芊氧羰基，二甲胺基莕磺醯基及對-硝基苄基酯基團組成之群。 28·根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽為 WQEWEQKITALL (SEQ ID NO:2)。 29. 根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽為 EQAQIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:3)。 30. 根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽為 QKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:4)。 31. 根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽為 QKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:5)。 32. 根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽為 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO:6)。 33. 根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽為 WQEWEQKITALLEQAQIIQQEKNEYEL (SEQ ID NO:7)。 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 8 8 8 8 A BCD 1237640 六、申請專利範圍 34.根據申請專利範圍第25項之肽，其中該肽為 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (SEQ ID NO:8)。本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X 297公釐)