KR100631874B1 - 펩타이드의 합성 방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 먼저 T-1249라 칭하는 펩타이드 및 T-1249 형 펩타이드의 합성 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 방법은 목적하는 펩타이드를 수득하기 위해서 특정한 펩타이드 단편들의 그룹을 합성하고 결합시키는 고상 및 액상 합성 과정을 사용한다. 본 발명은 또한 목적하는 펩타이드(예: T-1249)의 합성에 중간체로서 작용하는 개별적인 펩타이드 단편들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전장의 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드를 제조하기 위해서 함께 사용될 수 있는 상기와 같은 펩타이드 중간체 단편 그룹들에 관한 것이다.
T-1249, 펩타이드, 합성 방법

Description

펩타이드의 합성 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR PEPTIDE SYNTHESIS}
1. 기술 분야
본 발명은 먼저 펩타이드, 특히 본 발명에서 T-1249(서열 식별 번호: 1)라 칭하는 펩타이드 및 T-1249 형 펩타이드의 합성 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 방법은 목적하는 펩타이드를 수득하기 위해서 특정한 펩타이드 단편들의 그룹을 합성하고 결합시키는 고상 및 액상 합성 과정을 사용한다. 본 발명은 또한 목적하는 펩타이드(예: T-1249)의 합성에 중간체로서 작용할 수 있는 개별적인 펩타이드 단편들에 관한 것이다. 본 발명은 또한 전장의 길이의 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드를 제조하기 위해서 함께 사용될 수 있는 상기와 같은 펩타이드 중간체 단편 그룹들에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 또한 펩타이드, 특히 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드, 및 본 발명의 펩타이드의 합성에 중간체로서 작용하는 개별적인 펩타이드 단편들의 정제 방법에 관한 것이다.
2. 배경 기술
최근들어 융합과 관련된 작용을 억제하거나 심지어 항바이러스 활성도 가지고 있는 것으로 보이는 다수의 펩타이드들이 확인되었으며, 미국 특허 제 5,464,933; 5,656,480 호; PCT 공보 WO 94/28920; WO 96/19495는 이들에 대해 개시하고 있다. 이들 펩타이드가 치료제 등으로서 널리 사용됨에 따라 이들의 대량 합성에 대한 요구가 대두되고 있다.
기존의 펩타이드 합성 기술들(문헌[Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters 29:4005-4008; Mergler et al., 1988, Tetrahedron Letters 29:4009-4012; Kamber et al., (eds), "Peptides, Chemistry and Biology, ESCOM, Leiden, 1992, 525-526; 및 Riniker et al., 1993, Tetrahedron Letters 49:9307-9320] 참조)은 현재 T-1249와 같이 용이하게 정제되는 펩타이드의 경제적인 대규모 생산에 이용할 수 있는 기술이 결여되어 있다.
3. 발명의 요약
본 발명은 먼저 펩타이드, 특히 본 발명에서 T-1249(서열 식별 번호: 1)라 칭하는 펩타이드 및 T-1249 형 펩타이드의 합성 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 방법은 목적하는 펩타이드를 수득하기 위해서 특정한 펩타이드 단편들의 그룹을 합성하고 결합시키는 고상 및 액상 합성 과정을 사용한다. 일반적으로, 본 발명의 방법은 T-1249 또는 T-1249 형 펩타이드의 특정한 측쇄가 보호된 펩타이드 단편 중간체를 고체 지지체 상에서 합성하고, 상기 보호된 단편을 용액 중에서 커플링시켜 보호된 T-1249 또는 T-1249 형 펩타이드를 제조한 다음, 상기 측쇄를 탈 보호시켜 최종 T-1249 또는 T-1249 형 펩타이드를 수득함을 포함한다. 본 발명 방법의 바람직한 구현예은 서열 식별 번호: 1로 나타내어지는 아미노산 서열을 갖는 T-1249 펩타이드의 합성을 포함한다.
본 발명은 또한 목적하는 펩타이드(예: T-1249)의 합성에 중간체로서 작용하는 개별적인 펩타이드 단편들에 관한 것이다. 본 발명의 펩타이드 단편들에는 하기 표 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 것들을 포함하되, 이들에 국한되는 것은 아니다:
펩타이드 번호 아미노산 서열 T-1249(서열식별번호:1)에 상응하는 아미노산 서열 번호
1 WQEWEQKITALL(서열식별번호:2) 1-12
2 EQAQIQQEKNEYEL(서열식별번호:3) 13-26
3 QKLDKWASLWEW(서열식별번호:4) 27-38
4 QKLDKWASLWEWF(서열식별번호:5) 27-39
5 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(서열식별번호:6) 13-39
6 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열식별번호:7) 1-26
7 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(서열식별번호:8) 13-38
본 발명은 또한 목적하는 펩타이드의 합성에 중간체로서 작용하는 특정한 펩타이드 단편 그룹들에 관한 것이다. 본 발명에 따른 펩타이드 단편 그룹들에는 하기 표 2에 나타낸 그룹 1 내지 6이 포함된다.




그룹 아미노산 서열 T-1249(서열식별번호:1)에 상응하는 아미노산 서열 번호
1 WQEWEQKITALL(서열식별번호:2) EQAQIQQEKNEYEL(서열식별번호:3) QKLDKWASLWEW(서열식별번호:4) 1-12 13-26 27-38
2 WQEWEQKITALL(서열식별번호:2) EQAQIQQEKNEYEL(서열식별번호:3) QKLDKWASLWEWF(서열식별번호:5) 1-12 13-26 27-39
3 WQEWEQKITALL(서열식별번호:2) EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(서열식별번호:6) 1-12 13-39
4 WQEWEQKITALL(서열식별번호:2) EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(서열식별번호:8) 1-12 13-38
5 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열식별번호:7) QKLDKWASLWEW(서열식별번호:4) 1-26 27-38
6 WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열식별번호:7) QKLDKWASLWEWF(서열식별번호:5) 1-26 27-39
본 발명은, 부분적으로는 고상 및 액상 합성 반응들의 조합에 의해 처음으로 고순도의 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드를 고효율과 고수율로 대량 제조할 수 있다는 것을 발견한 것에 기초를 두고 있다. 특히, 본 발명의 방법에 따라 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드를 1 ㎏ 이상의 규모로 합성할 수 있다. 본 발명의 특정한 T-1249 펩타이드 단편들을 고상 합성에 사용함으로써, 고상 합성에 통상적으로 요구되는 3-, 4- 또는 심지어 5-배 과잉의 아미노산과 시약들을 사용하지 않고서도 매우 효율적인 고상 기법들의 커플링을 이용할 수 있게 된다. 본 발명에서는에서는 펩타이드 단편들의 고상 합성에 단지 0.5 배 과잉(약 1.5 당량)의 아미노산을 사용하게 되며, 이러한 아미노산과 시약 양의 감소로 인하여 본 발명의 방법은 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드의 대규모 합성에 적합하게 된다.
또한, 본 발명자들은 놀랍게도 특정한 펩타이드 단편들을 고상 수지 g 당 약 >0.5 밀리몰의 적재로 고상 합성할 수 있음을 발견하였다. 이러한 적재(loading)는 고상 펩타이드 합성에서 전형적으로 달성되는 0.25 내지 0.35 밀리몰/수지 g의 적재 범위에 걸쳐 작업효율을 현저하게 증대시킨다. 더욱이, 본 발명자들은 선택된 펩타이드 단편들을 초 산 감수성 수지(super acid sensitive resin)를 사용하여 고상 합성하면 현저하게 높은 순도를 갖는 펩타이드 단편들이 생성됨을 발견하였다. 본 발명에 따라 제조된 펩타이드 단편들의 정제에는 크로마토그래피 기법이 필요하지 않으며; 상기 단편들을 사용 전에 단순히 침전 및/또는 분쇄시키거나, 또는 수지로부터 직접 수득한 대로 사용한다. 초 산 감수성 수지를 사용함으로써 본 발명에서 합성되고, 보호된 펩타이드는 상기 수지로부터 측쇄 보호 그룹을 동시에 제거하지 않고도 절단되게 되며, 이는 결과적으로 불순물을 감소시키고, 10 개 또는 그 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드를 고순도 및 고수율로 합성시키게 된다.
본 발명에 따라 제조된 고 순도 펩타이드 단편들의 커플링에 의해 본 발명의 방법에 따라 액상 합성된 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드의 불순물 프로파일은 커플링되지 않은 단편들로 이루어지며, 통상적인 단독 고상 합성에 의해 합성되는 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드보다 현저하게 낮은 수준의 밀접하게 관련된 결실 동족체(deletion analogues)들을 함유한다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드는 통상적인 기법에 따라 제조된 것들보다 정제가 훨씬 용이하다. 특히, 본 발명의 방법에 따라 제조된 T-1249는 1 회 통과 크로마토그래피에서 >90% 순도로 쉽게 정제될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 T-1249를 5 인치 컬럼을 사용하여 400 g 또는 그 이상의 양으로 정제할 수 있다. 반면에, 통상적인 고상 합성(SPPS)을 사용하여 제조된 T-1249는 정제가 매우 어려우며, 크로마토그래피를 수회 통과시켜야한다. 일례로, SPPS에 의해 제조된 T-1249의 정제는 전형적으로 8 인치 컬럼으로부터 정제된 물질을 10 g 또는 그 이하로 생성된다.
하기 섹션 9에 제시된 실시예들은 전장의 T-1249 펩타이드의 상기와 같은 조합적 합성을 보여주고 있다. 상기 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드 및 중간체는 본 발명의 방법에 의해 1 ㎏ 또는 그 이상의 규모로 제조될 수 있다.
본 발명의 발명자들은 또한 뜻밖에도 T-1249와 같은 펩타이드 및 다른 T-1249 형 펩타이드뿐만 아니라 본 원에 개시된 특정한 펩타이드 단편들을 액상 합성 후에 상기 T-1249의 고 순도로 인해 고 용량 물질을 사용하여 정제할 수 있음을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 또한 펩타이드, 특히 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드, 및 본 발명 펩타이드의 합성에 중간체로서 작용하는 개별적인 펩타이드 단편들의 정제 방법에 관한 것이다.
3.1 정의
본 원에 사용된 아미노산 표시는 통상적인 것이며 하기와 같다:
통상적인 아미노산 약어
아미노산 1 자 기호 통상적인 약어
알라닌 아스파라긴 아스파르트산 글루타민 글루탐산 이소류신 류신 라이신 페닐알라닌 세린 쓰레오닌 트립토판 티로신 A N D Q E I L K F S T W Y Ala Asn Asp Gln Glu Ile Leu Lys Phe Ser Thr Trp Tyr

4. 도면의 간단한 설명
도 1은 T-1249의 3 개의 단편 접근로이다. 본 도면은 중간체 펩타이드 단편 그룹 1(상기 표 2에 나타냄)로 시작하는 전장의 T-1249의 합성에 대한 하기 섹션 8 및 9에 나타낸 실시예에 따른 도식과, 본 발명 방법의 비 제한적인 구현예를 나타낸다.
5. 발명의 상세한 설명
5.1 전장의 펩타이드
본 발명은 T-1249로 공지된 펩타이드의 합성에 사용될 수 있는 방법, 펩타이드 단편, 펩타이드 단편 그룹에 관한 것이다. T-1249는 HIV-1, HIV-2 및 SIV gp41 바이러스 폴리펩타이드 서열로부터 유래된 서열을 갖는 39 개 아미노산 잔기 의 폴리펩타이드이다. T-1249는 하기의 아미노산 서열을 갖는다:
NH2-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-COOH
본 발명의 방법, 단편 및 단편 그룹, 및 단편 및 단편 그룹의 선택에 사용되는 기법을 사용하여 T-1249 이외에 T-1249 형 단편들을 합성할 수 있음을 이해할 것이다. 본 원에 사용된 "T-1249 형"이란 용어는 1999년 5월 20일자로 출원된 국제 공보 제 PCT/US99/11212 호(본 발명에 참고로 인용되어 있다)에 나열된 임의의 HIV 또는 비-HIV 펩타이드를 의미한다.
상술한 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드 이외에, 본 발명의 방법, 단편 및 단편 그룹들을 사용하여 변경된 아미노 및/또는 카르복실 말단부를 갖는 펩타이드를 합성할 수 있다. T-1249를 예로 들면, 상기 펩타이드는 하기 식으로 표현할 수 있다:
X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z
상기 식에서,
X는 아미노 그룹; 카보벤족실, 단실 및 T-부틸옥시카보닐로 이루어진 그룹 중에서 선택된 소수성 그룹; 아세틸 그룹; 9-플루오로에닐-메톡시-카보닐(FMOC) 그룹; 또는 지질-지방산 공액물, 폴리에틸렌 글리콜 및 탄수화물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 거대분자 담체 그룹을 나타내고;
Z는 카르복실 그룹; 아미도 그룹; T-부틸옥시카보닐 그룹; 파라-니트로벤질 에스테르 그룹; 또는 지질-지방산 공액물, 폴리에틸렌 글리콜 및 탄수화물로 이루어진 그 룹 중에서 선택된 거대분자 담체 그룹을 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 X가 아세틸 그룹이고 Z가 아미드 그룹인 상기 식의 펩타이드를 합성한다. 상기와 같은 "X" 및 "Z" 그룹의 첨가 기법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
바람직한 방법으로는, T-1249 및 T-1249 형 펩타이드 및 중간체를 임의의 비-실리카계 기재 컬럼 충전물(적재 용량의 최대화를 위해서), 예를 들어 비 제한적으로 지르코늄-기재 충전물, 폴리스티렌, 폴리아크릴, 또는 고 pH 및 저 pH 범위에서 적합한 다른 중합체 기재 충전물을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, pH 7 이상의 광범위한 pH 범위를 나타내는 비-실리카-적재된 컬럼 충전물이 토소하스(Tosohass, Montgomeryville, PA)에서 시판되고 있다. 상기와 같은 물질이 충전된 컬럼을 당해 분야에 널리 공지된 표준 기법에 따라 저압, 중간압 또는 고압 크로마토그래피에서 실행시킬 수 있다.
하기 섹션 9에 나타낸 실시예들은 하기 섹션 5.2에 개시된 펩타이드 중간체들의 커플링을 통한 T-1249 펩타이드의 성공적인 합성을 예시한다.
5.2 펩타이드 중간체
본 발명은 비 제한적으로 상기 표 1에 나타낸 특정한 아미노산 서열을 갖는 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드의 펩타이드 단편 중간체 및 표 2에 나타낸 펩타이드 단편 중간체 그룹을 포함한다. 이러한 펩타이드 중간체, 특히 하기 표 2에 나타낸 그룹의 펩타이드 중간체를 사용하여 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드를 제조할 수 있다.
표 1 또는 2에 나타낸 펩타이드 단편의 아미노산 잔기의 임의의 하나 또는 그 이상의 측쇄를 t-부틸(t-Bu), 트리틸(trt) 및 t-부틸옥시카보닐(Boc)과 같은 표준 보호 그룹으로 보호할 수 있다. t-Bu 그룹은 아미노산 잔기 Tyr(Y), Thr(T), Ser(S), Glu(E) 및 Asp(D)에 바람직한 측쇄 보호 그룹이고; trt 그룹은 아미노산 잔기 Gln(Q) 및 Asn(N)에 바람직한 측쇄 보호 그룹이며; Boc 그룹은 아미노산 잔기 Lys(K) 및 Trp(W)에 바람직한 측쇄 보호 그룹이다.
바람직하게는, 본 발명의 펩타이드 단편의 Gln(Q) 잔기를 트리틸(trt) 그룹으로 보호한다. 그러나, 본 발명의 임의의 펩타이드 단편들의 유기 용매에 대한 보다 낮은 용해도가 요구되는 경우, 상기 트리틸 보호 그룹을 상기 단편들의 임의의 하나 이상의 글루타민 잔기들로부터 제거할 수도 있다.
바람직하게는, 본 발명의 각 펩타이드 단편의 Asn(N) 잔기를 보호한다. 또한, Trp(W) 잔기를 Boc 그룹으로 보호하는 것이 바람직하다.
상기 표 1에 나타낸 펩타이드 식 1 내지 5에 따른 보호된 펩타이드 단편들에는 하기 표 3에 나타낸 화합물들이 포함되나, 이들에 제한되는 것은 아니다.
펩타이드 식 번호 식 T-1249(서열식별번호:1)의 상응하는 아미노산 서열 번호
1 Ac-WQEWEQKITALL-COOH(서열식별번호:2) 1-12
2 FMOC-EQAQIQQEKNEYEL-COOH(서열식별번호:3) 13-26
3 FMOC-QKLDKWASLWEW-COOH(서열식별번호:4) 27-38
4a FMOC-QKLDKWASLWEWF-NH2(서열식별번호:5) 27-39
4b NH2-QKLDKWASLWEWF-NH2(서열식별번호:5) 27-39
5a FMOC-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2(서열식별번호:6) 13-39
5b NH2-EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-NH2(서열식별번호:6) 13-39
상기 표 3에 나타낸 펩타이드의 아미노산 잔기의 임의의 하나 이상의 측쇄들은 상술한 바와 같이 tBu, trt 및 Boc와 같은 표준 측쇄 보호 그룹으로 보호할 수 있다. 표 3의 펩타이드의 전형적인 합성을 하기 섹션 5.3에 논의된 일반적인 기법을 사용하여 하기 섹션 7 및 8에 나타낸다.
5.3 펩타이드 합성
상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 개별적인 펩타이드 단편들 중 일부를 바람직하게는 고상 합성 기법을 사용하여 제조하는 한편, 본 발명의 다른 펩타이드들은 바람직하게는 고상 및 액상 합성 기법을 조합하여 제조하며, 상기 합성은 본 원에 개시된 T-1249 또는 T-1249 형 펩타이드를 최대로 생성시킨다. 그러나, 본 발명의 펩타이드 단편을 당해 분야에 널리 공지된 기법들에 의해 합성하거나 제조할 수도 있으며,이는 문헌[Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY](본 발명에 참고로 인용되어 있다) 등에 개시되어 있다.
한편으로 본 발명의 펩타이드를 상기 펩타이드의 아미노산 잔기들을 연결시 키는 하나 이상의 결합들이 비-펩타이드 결합이 되도록 합성할 수도 있다. 이러한 대안적인 비-펩타이드 결합은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 반응들을 사용하여 형성시킬 수 있으며, 이러한 예로는, 이미노, 에스테르, 하이드라지드, 세미카바지드 및 아조 결합 등을 들 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상술한 서열들을 포함하는 T-1249 및 T-1249 형 펩타이드는, 예를 들어 상기 펩타이드의 안정성, 반응성 및/또는 용해도를 증대시키기 위해서 그의 아미노 및/또는 카르복시 말단에 추가적인 화학 그룹들이 존재하도록 합성할 수도 있다. 예를 들어, 카보벤족실, 단실, 아세틸 또는 t-부틸옥시카보닐 그룹과 같은 소수성 그룹을 상기 펩타이드의 아미노 말단에 첨가할 수 있다. 마찬가지로, 아세틸 그룹 또는 9-플루오로에닐메톡시-카보닐 그룹을 상기 펩타이드의 아미노 말단에 놓을 수 있다(상술한 T-1249의 "X" 변경 참조). 또한, 소수성 그룹, t-부틸옥시카보닐 또는 아미도 그룹을 상기 펩타이드의 카복시 말단에 첨가할 수도 있다. 유사하게, 파라-니트로벤질 에스테르 또는 벤질 에스테르 그룹을 상기 펩타이드의 카복시 말단에 놓을 수도 있다(상술한 T-1249의 "Z" 변경 참조). 상기와 같은 변경의 도입 기법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다.
더욱이, T-1249 및 T-1249 형 펩타이드를 그의 입체 형태가 변경되도록 합성할 수도 있다. 예를 들어, 통상의 L-이성체 보다는, 상기 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기의 D-이성체를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명 펩타이드의 하나 이상의 아미노산 잔기들을 널리 공지된 비- 천연 아미노산 잔기들 중 하나로 치환시킬 수도 있다. 이와 같은 변경은 본 발명 펩타이드의 안정성, 반응성 및/또는 용해도를 증가시키는 작용을 할 수 있다.
임의의 T-1249 또는 T-1249 형 펩타이드를 그의 아미노 및/또는 카복시 말단에 공유 결합된 거대분자 담체 그룹을 추가로 갖도록 합성할 수도 있다. 이러한 거대분자 담체 그룹에는 예를 들어 지질-지방산 공액물, 폴리에틸렌 글리콜, 탄수화물 또는 추가적인 펩타이드가 포함될 수 있다. 따라서 상술한 T-1249의 "X" 변경은 펩타이드의 아미노 말단에 공유 결합된 임의의 상기 거대분자 담체 그룹을 또한 나타낼 수 있으며, 추가적인 펩타이드 그룹이 바람직하다. 마찬가지로, 상술한 T-1249의 "Z" 변경은 상술한 임의의 거대분자 담체 그룹을 또한 나타낼 수 있다.
바람직하기로는, 본 발명의 펩타이드 단편을 표준 FMOC 프로토콜을 사용하여 고상 펩타이드 합성(SPPS) 기법에 의해 합성하며, 이는 문헌[Carpino et al., 1970, J. Am. Chem. Soc. 92(19):5748-5749; Carpino et al., 1972, J. Org. Chem. 37(22):3404-3409] 등에 개시되어 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 펩타이드 단편의 고상 합성을 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(예를 들어 문헌[Barlos et al., 1989, Tetrahedron Letters 30(30):3943-3946] 참조) 및 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산 수지(예를 들어 문헌[Seiber, 1987, Tetrahedron Letters 28(49):6147-6150; 및 Richter et al., 1994, Tetrahedron Letters 35(27):4705-4705] 참조)(이들로 제한되는 것은 아니다)를 포함하는 초 산 감수성 고체 지지체 상에서 수행한다. 상기 2-클로로트리틸 클로라이드와 4-하 이드록시메틸-3-메톡시페녹시 부티르산 수지 모두 칼바이오켐-노바바이오켐 코포레이션(Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, CA)으로부터 구입할 수 있다.
고상 펩타이드 합성에 사용할 수 있는 수지의 일반적이고 비 제한적인 제조 및 적재 과정을 본 원에 개시한다. 또한, 하기 섹션 6에 제공된 실시예는 예시적인 수지의 제법을 개시한다.
수지 적재는 예를 들어 하기의 기법들을 통해 수행할 수 있다: 수지, 바람직하게는 2-클로로트리틸 수지와 같은 초 산 감수성 수지를 반응실에 충전시킨다. 상기 수지를 디클로로메탄(DCM)과 같은 염소화된 용매로 세척한다. 베드를 배수시키고 약 8 내지 10 부피의 디클로로에탄(DCE) 중의 0.5 내지 1.5 당량의 아미노산과 0.2 내지 0.5 과잉의 디이소프로필에틸아민(DIEA) 용액을 가한다. 상기 아미노산의 N-말단은 바람직하기로는 Fmoc로 보호해야 하며, 경우에 따라 상기 아미노산의 측쇄를 보호해야 한다. 상기 혼합물을 질소를 발포시키면서 2 내지 24 시간 동안 교반시킨다.
DCM 또는 DCE와 같은 염소화된 용매가 상기 2-클로로트리틸 수지를 적합하게 팽윤시키는데 바람직함을 주목해야 한다.
교반 후에, 상기 베드를 배수시키고 DCM으로 세척한다. 상기 수지 상의 활성 부위들을 9:1 MeOH:DIEA 용액으로 약 20 내지 30 분간 단부 캡핑시킨다. 상기 베드를 배수시키고, DCM으로 4 회 세척하고, 질소 퍼지에 의해 건조시켜 적재된 수지를 수득한다.
Fmoc는 아미노산의 N-말단에 바람직한 보호 그룹이다. 적재되는 아미노 산에 따라 그의 측쇄를 보호하거나 보호하지 않을 수도 있다. 예를 들어 트립토판(Trp)이 적재되는 경우, 그의 측쇄를 Boc로 보호해야 한다. 그러나, 류신(Leu)의 경우에는 측쇄를 보호할 필요가 없다. 바람직하기로는, 글루탐산(Glu), 아스파르트산(Asp), 쓰레오닌(Thr) 및 세린(Ser)은 t-부틸 에테르 또는 t-부틸 에스테르로 보호하고, 트립토판(Trp) 및 리신(Lys)은 t-부톡시카보닐 카바메이트(Boc)로 보호한다. 아스파라긴(Asn) 및 글루타민(Gln)의 아미드 측쇄는 트리틸 그룹으로 보호하거나 또는 보호하지 않을 수도 있다.
수지의 적재 및 펩타이드 합성에 사용되는 Fmoc-보호된 아미노산은 센(Senn) 또는 겐자임(Genzyme)을 포함한 여러 판매사로부터, 경우에 따라 측쇄 보호 그룹과 함께 또는 상기 없이 입수할 수 있다. 상기 과정에 대한 대안으로서, 적합한 아미노산이 이미 적재된 수지를 구입할 수도 있다.
하기 섹션 6에 제공된 실시예는 전형적인 수지 제법을 개시한다.
고상 펩타이드 합성 기법을 예를 들어 하기의 비 제한적인 기법들에 따라 수행할 수 있다: 적재된 수지를 반응실에 가하고 용매, 바람직하게는 염화 메틸렌(DCM; 바람직하게는 약 10 부피)으로 약 15 분간 질소 교반 하면서 컨디셔닝하여 수지 비이드를 팽윤시킨다. DCM은 2-클로로트리틸 수지의 적합한 팽윤에 필요하다. 수지 부피는 상기 비이드가 팽윤함에 따라 반응실에서 3 내지 6 배 증가하여 활성 부위들이 펼쳐져서 반응이 용이하게 될 것이다. 수지가 팽윤된 후에, 용매를 반응실로부터 배수시킨다.
말단 아민 또는 수지로부터의 Fmoc(9-플루오로에닐-메틸옥시카보닐) 보호 그 룹의 제거는 상기 수지를 N-메틸-2-피롤리디논(NMP) 중의 피페리딘 20% 용액 2회 분액으로 각각 약 10 분간 처리함으로써 수행할 수 있다. 각 분액에 요구되는 NMP 중의 20% 피페리딘 용액의 부피는 실행되는 반응의 규모에 따라 변할 것이다. 이어서 상기 수지를 NMP 분액들(약 10 부피)로 5 내지 7 회 세척하여 Fmoc 부산물(즉 디벤조풀벤 및 그의 피페리딘 부가물)과 잔류 피페리딘을 제거한다.
클로라닐 시험을 사용하여 잔류 피리딘의 제거가 완료되었는지를 측정할 수 있다. 상기 클로라닐 시험 용액은 톨루엔 중의 클로라닐 포화 용액 1 방울을 약 1 ㎖의 아세톤에 가함으로써 제조한다. NMP 세척물 1 방울을 상기 클로라닐 시험 용액에 가함으로써 상기 세척물을 시험할 수 있다. 청색 또는 자색은 2 차 아민이 존재함을 나타내는 것으로서, 이는 잔류 피페리딘이 여전히 존재함을 가리키며, 따라서 상기 청색 또는 자색이 더 이상 관찰되지 않을 때 까지 상기 NMP 세척을 반복한다.
한편, 서열상 상기 수지에 첨가되는 그 다음 순서의 아미노산을 그의 카복시 말단에서의 반응을 위해 활성화시킨다. 각각의 아미노산의 아민 말단을 Fmoc로 보호해야 한다. 첨가되는 아미노산에 따라, 그의 측쇄를 보호하거나 보호하지 않을 수도 있다. 바람직하게는, tyr(Y), Thr(T), Ser(S), Glu(E) 및 Asp(P)의 측쇄는 t-Bu로 보호하고, Gln(Q) 및 Asn(N)의 측쇄는 trt로 보호하며, Lys(K) 및 Trp(W)의 측쇄는 Boc로 보호한다. Leu 또는 Ile의 측쇄는 보호할 필요가 없다.
아미노산은 하기와 같이 활성화시킬 수 있다. Fmoc-보호된 아미노산(1.5 당량), 1-하이드록시벤조트리아졸 수화물(HOBT)(1.5 당량) 및 디이소프로필-에틸아 민(DIEA)(1.5 당량)을 극성의 비 양성자성 용매, 예를 들어 N-메틸 피롤리디논(NMP), 디메틸 포름아미드(DMF) 또는 디메틸 아세트아미드(DMAC)(약 7.5 부피)에 실온에서 용해시킨다. 상기 용액을 0 내지 5 ℃로 냉각시키고, 이어서 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸유로늄헥사플루오로포스페이트(HBTU) 또는 O-벤조트리아졸-1-일-테트라메틸테트라플루오로보레이트(TBTU)(1.5 당량)를 가한 다음 5 내지 15 분간 교반하여 용해시킨다. 활성화를 0 내지 5 ℃에서 수행하여 아미노산의 라세미화를 최소화시키는 것이 중요하다. HBTU는 냉 용액에 최종적으로 첨가되는 시약으로서 이 시약을 첨가하지 않으면 활성화와 라세미화가 일어나지 않는다.
활성화된 아미노산의 용액을 상기 배수된 수지에 충전시키고 DCM(대략 2.5 부피)으로 세척한다. HBTU가 DCM에 불용성이므로 아미노산의 활성화는 NMP에서 수행하게 된다. 그러나, DCM을 이 시점에서 상기 반응물에 첨가하여 수지 비이드의 적합한 팽윤을 유지시킨다. 상기 반응물을 20 내지 30 ℃에서 약 1 시간 동안 N2 발포 하에 교반시킨다. 커플링의 완료는 하기 개시하는 바와 같이 정성적인 닌하이드린 시험으로 점검할 수 있다.
정성적인 닌하이드린 시험을 사용하여 반응의 완료를 검사하기 위해서, 수지 2 내지 20 ㎎ 샘플을 회수하여 메탄올로 세척한다. 상기 샘플에 에탄올 중의 76% 페놀 용액 3 방울, 피리딘 중의 0.2 mM KCN 용액 4 또는 5 방울, 및 에탄올 중의 닌하이드린 0.28 M 용액 3 방울을 가한다. 상기 샘플을 약 0.5 ㎖의 에탄올 로 희석한 후 약 75 ℃의 5 내지 10 분간 열 블록에 넣어 가열한다. 청색 또는 자색이 나타나면 유리 아민이 존재하는 것으로서, 이는 반응이 아직 완료되지 않았음을 나타낸다. 상기 샘플을 약 3 ㎖의 부피로 추가로 희석하면 농축된 샘플에서의 색 변화 정도를 보다 쉽게 평가할 수 있다.
닌하이드린 시험이 1 시간 후에 양성으로 판명되면, 상기 커플링 반응을 추가로 1 시간 동안 속행시킨다. 상기 닌하이드린 시험이 3 시간 후에도 여전히 양성으로 판명되면, 상기 수지를 배수시키고, 대략 10 부피의 NMP로 1 회 세척하고, 0.5 내지 1 당량의 활성화된 아미노산을 사용하여 상기 커플링 반응을 반복 수행한다.
상기 수지를 커플링 주기들의 사이에 밤새 보관해야 하는 경우, 상기 수지를 배수시키고 질소 블랭킷(blanket) 하에서 NMP로 덮을 수도 있다. 또 다른 방법으로는, 베드를 배수시키고, 질소 블랭킷 하에서 보관하고, 이어서 다음 커플링 주기로 진행하기 전에 DCM 세척액으로 컨디셔닝할 수도 있다. 반응이 완료된 단편을 절단 전에 밤새 보관해야 하는 경우, 상당한 Fmoc 탈보호가 NMP에서 일어날 수 있기 때문에 상기 수지 베드는 NMP가 포함되지 않은 IPA로 세척해야 한다.
커플링이 완료된 것으로 판단되면, 수지를 배수시키고 3 회 분액(대략 10 부피)의 NMP로 세척한다. 상기 주기의 과정을 연속되는 펩타이드 단편의 머(mer)들(즉, 아미노산 들)에 대해 반복한다. 최종 커플링 반응에 이어서, 상기 수지를 4 회 분액(약 10 부피)의 NMP, 이어서 2 회 분액(대략 10 부피)의 DCM 및 IPA로 세척한다. 상기 수지 결합된 펩타이드는 질소 퍼지 또는 오븐으로 건조시킬 수 있다.
고상 합성 기법을 통해 합성된 펩타이드를 예를 들어 하기의 비 제한적인 기법에 따라 절단 및 단리시킬 수 있다: 펩타이드를 당해 분야에 널리 공지된 기법을 사용하여 상기 수지로부터 절단시킬 수 있다. 예를 들어 DCM 중의 1% 또는 2% 트리플루오로아세트산(TFA) 용액 또는 DCM 중의 1%와 2% TFA 용액의 배합물을 사용하여 상기 펩타이드를 절단시킬 수 있다. 또한, 아세트산(HOAC), 염산(HCl) 또는 포름산을 절단에 사용할 수도 있다. 절단에 필요한 절단 시약, 용매 및 시간은 절단되는 특정의 펩타이드에 따라 다르게 되며, 절단 후에, 절단 분획들에 대해 표준 후처리 과정을 수행하여 펩타이드를 분리시킨다. 전형적으로, 절단 분획들을 합한 후, 진공 하에서 농축시키고, 이어서 극성 비양성자성 또는 극성 비 양성자성 용매, 예를 들어 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 이소프로필 알콜(IPA), 아세톤, 아세토니트릴(ACN), 디메틸 포름아미드(DMF), NMD, DMAC, DCM 등으로 재조성한 다음, 항용매(antisolvent), 예를 들어 물 또는 헥산으로 침전 또는 결정화시키고 진공 여과에 의해 수거한다. 한편, 펩타이드를 분리시킨 후에 생성물을 유기 용매 또는 물로 분쇄시킬 수도 있다.
하기 섹션 7.1 내지 7.6에 제공된 실시예들은 표 1, 2 및/또는 3에 나타낸 펩타이드 중간체들의 고상 합성을 나타낸다.
전장의 T-1249 펩타이드 합성을 위해서, 상기 표 1의 펩타이드 중간체들을 함께 커플링시켜 T-1249 펩타이드를 수득할 수 있다. 예를 들어 상기 표 2에 나타낸 펩타이드 중간체 그룹들을 함께 커플링시켜 전장의 T-1249 펩타이드를 제조 할 수 있다. 중간체 펩타이드 단편들로부터의 전장의 T-1249의 합성에 대한 전형적인 예들을 하기 섹션 9에 제공하며 도 1에 도식적으로 나타낸다.
몇몇 구현예에서, T-1249의 합성을 위한 3 개의 단편 접근로는 다음과 같을 수 있다. "3 개의 단편 접근로" 합성이란 고상 및 액상 합성 기법을 사용하여 전장의 T-1249 펩타이드로 합성 및 커플링되는 3 개의 T-1249 중간체 펩타이드 단편들로 시작하는 T-1249 합성 도식을 지칭한다. 상기 표 2에 나타낸 중간체 펩타이드 단편 그룹 1, 2, 3 및 4는 바람직한 그룹을 나타낸다. 도 1은 표 2의 펩타이드 중간체 그룹 1을 사용하여 전장의 T-1249를 합성하는 전형적인 3 개의 단편 접근로를 나타낸다. 이 그룹에 대해서, 아미노산 잔기 39번(T-1249 카복시 1-말단 아미노산 잔기)을 단편 커플링 과정 동안 개별적으로 도입시킴을 주목해야 한다. 도 1에 나타낸 T-1249 합성 도식의 정점을 하기 섹션 9.1에 제공된 실시예에서 입증하였다.
당업자들에게 널리 공지된 액상 펩타이드 합성 기법을 본 발명의 펩타이드 중간체 단편들의 합성에 사용할 수 있다. 하기 섹션 8에 제공된 실시예는 표 1, 2 및/또는 3에 나타낸 펩타이드 중간체들의 전형적인 액상 펩타이드 합성을 개시한다. 예를 들어, 고 pH 또는 저 pH에서의 pH 안정성 값을 포함하는 광범위한 pH 범위를 나타내는 비-실리카 적재된 컬럼 충전물이 토소하스(Montgomeryville, PA)에서 시판되고 있다.
6. 수지 합성
6.1 2-CTC 수지 상으로의 아미노산 적재에 바람직한 전형적인 방법
공기 감수성 2-클로로트리틸클로라이드 수지(Senn Chemicals, Lot A 3573, 1 당량, 12.0 밀리몰, 10.0 g)를 250 ㎖ 환저 플라스크에 가하고 준비된 DCM(10 부피, 100 ㎖) 중의 FmocLeuOH(1.0 당량, 12 밀리몰, 4.24 g) 및 디이소프로필에틸아민(5 당량, 60.0 밀리몰, 5.20 ㎖) 용액으로 바로 처리한다. 상기 슬러리를 캡핑시키고 3 시간 동안 교반한다. 용매를 여과에 의해 제거하고 수지를 DCM(5 부피, 50 ㎖)으로 세척한다. 상기 수지 상의 나머지 활성 부위들을, 수지를 9:1의 MeOH:DIEA(5 부피, DIEA 5.0 ㎖ 및 MeOH 45 ㎖)로 30 분간 처리함으로써 단부-캡핑시킨다. 용매를 제거하고, 수지를 3 ×5 부피의 DCM으로 세척한다. 상기 수지를 항량 건조시켜 FmocLeuOH 0.98 밀리몰/g으로 산정 적재된 수지 13.2 g을 수득한다.
상기 방법을 또한 2-CTC 수지 상으로의 FmocTrp(Boc)OH의 적재에 사용할 수 있다.
클로로트리틸 클로라이드 수지를 본 원에 개시된 펩타이드 및 펩타이드 중간체의 고상 합성과 함께 사용될 수 있는 아미노산으로 치환시킨 예가 본 원, 섹션 6.2 및 6.3에 개시되어 있다. 본 발명의 펩타이드 및 펩타이드 단편 모두를 하기 섹션 6.2 및 6.3에 나타낸 적재 과정을 사용하여 고상 펩타이드 합성(SPPS)에 의해 합성할 수 있다.
6.2 Fmoc-Trp(Boc)-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질 MW 당량 밀리몰 g ㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지 -- 1.0 25 25 --
Fmoc-Trp(Boc)-OH -- 526.60 1.5 37.5 19.7
디이소프로필에틸 아민(DIEA) 129.25 1.7 42.5 5.5 7.4
디클로로에탄(DCE) -- -- -- -- 250
디클로로메탄(DCM) -- -- -- -- 6x250
9:1 메탄올:DIEA -- -- -- -- 200

과정:
2-클로로트리틸 클로라이드 수지(25 g, 1 당량)를 500 ㎖의 펩타이드 챔버에 충전시키고 250 ㎖의 DCM으로 세척하였다. 베드를 배수시키고 10 부피의 DCE 중의 Fmoc-Trp(Boc)-OH(1.5 당량) 및 DIEA(1.7 당량) 용액을 가하였다. 상기 혼합물을 질소 발포 하에 2 시간 동안 교반하였다.
상기 베드를 배수시키고, 250 ㎖의 DCM으로 세척하였다. 상기 수지 상의 활성 부위들을 200 ㎖의 9:1 MeOH:DIEA 용액으로 20 분간 단부-캡핑시켰다. 상기 베드를 배수시키고, 4 ×250 ㎖의 DCM으로 세척하고, 질소 퍼지로 건조시켜 적재된 수지 34.3 g을 수득하였다.
상기 Fmoc-아미노산을 상기 수지로부터 절단하고 표준치에 대비하여 분석함으로써 정량적인 HPLC 분석을 수행하였다. 상기 물질의 HPLC 분석은 0.68 밀리몰/g의 상기 수지의 적재를 나타내었다.
컬럼: 페노메녹스 주피터(Phenomenox Jupiter) C18; 300 Å; 5 μ
유속: 1 ㎖/분
검출: 260 ㎚에서 UV
이동상: A: 0.1% 수성 TFA; B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA; 65% B 평등
체류 시간: 대략 14 분
6.3 Fmoc-Leu-2-클로로트리틸 수지의 제조
물질 MW 당량 밀리몰 g ㎖
2-클로로트리틸클로라이드 수지 -- 1.0 250 250 --
FmocLeuOH 353.42 1.5 375 132.5 --
디이소프로필에틸 아민(DIEA) 129.25 1.7 425 55 75
디클로로에탄(DCE) -- -- -- -- 2000
디클로로메탄(DCM) -- -- -- -- 6x1500
9:1 메탄올:DIEA -- -- -- -- 1500
과정:
상기 수지를 3 ℓ의 펩타이드 챔버에 충전시키고 1.5 DCM으로 세척하였다. 베드를 배수시키고 8 부피의 DCE 중의 FmocLeuOH(1.5 당량) 및 DIEA(1.7 당량) 용액을 가하였다. 상기 혼합물을 질소 발포 하에 2 시간 동안 교반하였다.
상기 베드를 배수시키고, 1.5 ℓ의 DCM으로 세척하였다. 상기 수지 상의 활성 부위들을 1.5 ℓ의 9:1 MeOH:DIEA 용액으로 30 분간 단부-캡핑시켰다. 상기 베드를 배수시키고, 4 ×1.5 ℓ의 DCM으로 세척하고, 질소 퍼지로 건조시켜 적재된 수지 345 g을 수득하였다.
상기 Fmoc-아미노산을 상기 수지로부터 절단하고 표준치에 대비하여 분석함으로써 정량적인 HPLC 분석을 수행하였다. 상기 물질의 HPLC 분석은 0.72 밀리몰/g의 상기 수지의 적재를 나타내었다.
컬럼: 페노메녹스 주피터 C18; 300 Å; 5 μ
유속: 1 ㎖/분
검출: 260 ㎚에서 UV
이동상: A: 0.1% 수용성 TFA; B: 아세토니트릴 중의 0.1% TFA; 65% B 평등액
체류 시간: 약 8 분
7. 펩타이드의 고상 합성
하기 섹션 7.1 내지 7.6에 표 1, 2 및/또는 3에 나타낸 펩타이드 중간체들의 고상 합성 실시예들을 제공한다.
7.1 고상 펩타이드 합성(SPPS)에 바람직한 방법(일반적인 과정)
SPPS 챔버를 FmocLeu-수지(1 당량)로 충전시킨다. 상기 수지를 5% 피페리딘 DCM(7.5 부피)에서 질소 퍼지로 15 내지 30 분간 컨디셔닝한다. 용매를 배수시키고 상기 수지를 NMP(5 부피) 중의 2 ×20% 피페리딘으로 30 분간 처리하여 상기 Fmoc 보호 그룹을 제거한다. 두 번째 20% 피페리딘/NMP 처리 후에, 상기 수지를 음(-)의 클로라닐 시험을 위해 5 내지 7 ×NMP(5 부피)로 세척한다.
한편, 서열상 그 다음의 아미노산(1.5 당량), HOBT(1.5 당량) 및 DIEA(1.5 당량)를 3:1 NMP/DCM(10 부피) 중에서 합하여 실온에서 충분히 용해시키고 0 ℃로 냉각시킨다. HBTU를 가하고, 상기 용액을 10 내지 15 분간 교반하여 고체를 용해시킨 다음 상기 수지에 가한다. 상기 현탁액을 질소 분위기 하에서 1 내지 3 시간 동안 교반한다. 커플링의 완료를 정성적인 닌하이드린 시험으로 점검한다. 3 시간 후에 반응이 완료되지 않으면(닌하이드린 시험 결과가 계속 양성이면) 반응기를 배수시키고 새로운 활성화된 아미노산(0.5 당량) 용액으로 재 커플링을 수행해야 한다. 통상적으로는 30 분 내지 1 시간의 재 커플링 후에 닌하이 드린 음성 시험이 이루어진다. 상기 주기를 단편 중의 나머지 아미노산에 대해 반복한다. 단편이 축적됨에 따라, 세척에 사용되는 용매 부피를 5 부피로 증가시킬 필요가 있을 경우가 있다. 아세트산 무수물에 의한 AcAA1-12OH 단부 캡핑의 경우에 Fmoc 제거된 수지(HAA1-12-수지)를 피리딘(5 당량)에 이어서 3:1 NMP/DCM(10 부피) 중의 아세트산 무수물(5 당량)로 처리함으로써 수행하였다. 최종 커플링에 이어서, 상기 수지를 3 ×5-8 부피의 NMP에 이어 2 ×10 부피의 DCM으로 세척하고 40 ℃, 진공 오븐에서 항량 건조시킨다.
7.2 수지로부터 펩타이드의 절단에 바람직한 방법
하기의 방법들은 수지로부터 펩타이드 AcAA1-12OH를 절단함을 개시한다. 그러나, 동일한 방법을 본 발명의 다른 펩타이드 단편들의 제거에 사용할 수도 있다.
방법 A: HOAc의 사용
수지(1 g, 0.370 밀리몰)를 AcOH/MeOH/DCM(5:1:4, 20 부피, 20 ㎖)의 혼합물로 질소 교반하면서 1.5 시간 동안 처리하고, 상기 용액을 환저 플라스크로 옮겨 교반 후 물(20 부피)로 처리하였다. 생성된 백색 슬러리를 농축(회전증발기, 40 ℃ 욕)시켜 DCM을 제거하고 생성물을 여과에 의해 수거하였다. 항량 건조시켜 AcAA1-12OH 0.69 g(74%)을 87A% 순도로 수득하였다. 상기와 같은 수지의 2 차 처리로 AcAA1-12OH의 덜 순수한 물질(83 면적%)(목적하는 반응 시간이 1.5 시간보다 약간 더 걸림을 암시함) 0.08 g(8.5%)을 추가로 제공하였다.
방법 B: TFA의 사용
수지(1 중량, 20 g)를 DCM 중의 1% TFA 5-6 ×1.7 부피로 각각 3 내지 5 분간 세척한다. 상기 1% TFA/DCM 세척물을 피리딘 함유 플라스크에 수거한다(상기 세척물 중의 TFA와의 부피비 1:1). 세척물을 함유하는 생성물을 합하고(600 ㎖, 30 부피), DCM을 증류에 의해 최소 용기 부피(원래 부피의 ∼1/3)로 제거한다. 용기 온도가 15 내지 25 ℃를 진공을 유지하도록 조절한다. 에탄올(6.5 부피)을 가하고 DCM이 제거될 때까지(증류물의 온도 증가에 의해 결정됨) 증류를 계속한다. 다시 용기 온도가 15 내지 20 ℃를 유지하도록 진공을 조절한다. 최종 용기 부피는 ∼8 내지 9 부피이어야 한다. 상기 용액을 5 내지 10 ℃로 냉각시키고 물(6.5 부피)을 30 분에 걸쳐 가하여 AcAA1-12OH를 침전시킨다. 고체를 진공 여과에 의해 수거하고, 물(2 내지 3 부피)로 세척한다. 상기 슬러리를 0 내지 5 ℃에서 30 분간 교반하고, 고체를 진공 여과에 의해 수거하고 항량 건조시켜 AcAA1-12OH 16.80 g을 90% 수율 및 84 면적%(A%) 순도로 수득한다.
7.3 AcAA1-12OH의 재생에 바람직한 방법
메탄올 70 ㎖(23.3 부피) 중의 AcAA1-12OH(257-21-1, 3.00 g)를 65 ℃에서 3 시간 동안 교반하면서 가열하고, 실온으로 냉각시키고 밤새 교반한다. 흡입 여과 및 진공 오븐(40 ℃)에서 항량 건조시켜 2.43 g(81%, 90A%)을 수득하였다.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
7.4 FmocAA13-26OH의 SPPS 및 수지로부터의 절단
FmocAA13-26의 SPPS를 1.02 밀리몰/g으로 적재된 FmocLeuOResin 6.5 g으로 출발하여 상술한 바와 같이 수행하였다. 절단 방법 A 또는 B가 가능하다(169/137, 60% 수율, 85A%).
7.5 FmocAA13-26OH에 바람직한 재생 과정
FmocAA13-26OH(3.60 g, 85A%)를 78 ℃에서 아세토니트릴 15 ㎖(5 부피) 중에서 가열하였다. 상기 슬러리를 고체가 용해될 때까지(총 0.6 ㎖) 추가의 용매로 처리하였다. 상기 용액을 실온으로 냉각시키고 7 시간 동안 교반하였다. 흡입 여과 및 항량 건조시켜 FmocAA13-26OH 2.6 g(72%, 95A%)을 수득하였다.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
7.6 FmocAA27-38OH의 SPPS 및 수지로부터의 절단
FmocAA27-38OH의 SPPS를 0.75 밀리몰/g으로 적재된 FmocTrp(Boc)OR 10 g으로 출발하여 상술한 바와 같이 수행하였다. 절단 방법 B를 사용하였다(169/120/1, 78% 수율, 87.9A%).
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
8. 펩타이드 단편의 액상 합성
하기 섹션 8.1 내지 8.4는 표 1, 2 및/또는 3에 나타낸 펩타이드 중간체들의 액상 합성의 실시예이다.
8.1 Fmoc-AA27-38OH에 대한 HPheNH 2 의 액상 커플링에 의한 Fmoc-AA27-39-NH 2 단편의 제조
FmocAA27-38OH의 카르복실 말단을 DIEA 및 페닐알라닌 아미드의 존재 하에서 각각 HBTU 또는 TBTU 및 HOBT 또는 HOAT를 사용하여 활성화된 HOBT 또는 HOAT 에스테르로 전환시킴으로써 FmocAA27-39NH2를 제조할 수 있다. 상기 반응을 극성의 비양성자성 용매, 예를 들어 DMF 또는 NMP 중에서 0 내지 25 ℃에서 실행한다. 반응의 완료 시에, 알콜 또는 수 혼화성 용매 및/또는 물을 가하여 FmocAA27-39NH2를 침전시킨다.
실시예:
FmocAA27-38OH(169-120-1, 5.40 g, 1.98 밀리몰, 1.00 당량), HPheNH2(Bachem, 0.390 g, 2.38 밀리몰, 1.20 당량), HOBT·H2O(0.330 g, 2.16 밀리몰, 1.10 당량)를 NMP(54 ㎖, 10 부피)에 용해시키고, DIEA(0.16 ㎖, 0.921 밀리몰, 1.10)로 처리하고, 용해될 때까지(약 30 분) 실온에서 교반하였다. 상기 용액을 빙욕(ice bath)(내부 T=2 내지 3 ℃)을 사용하여 냉각시키고, HBTU(0.827 g, 2.18 밀리몰, 1.10 당량)를 한번에 가하고, 1 시간에 이어서 밤새 교반하였다. 상기 반응은 TLC(uv, 10% MeOH/DCM, SM mid Rf, 상기 제품)로 점검할 수 있다. 메탄올(54 ㎖, 10 부피)에 이어서 물(54 ㎖, 10 부피)을 1 시간에 걸처 적가하여 자유 흐름 고체를 형성시키고, 이를 추가로 2 시간 동안 교반한 다음 여과에 의해 수거하였다. 필터케이크를 1:1 물/메탄올(2 ×25 ㎖)로 세척하였다. 40 ℃, 진공 오븐에서 밤새 건조시켜 FmocAA27-39NH2 5.30 g(93%, 81A%)을 수득하였다. HPLC 분석은 또한 출발 물질인 FmocAA27-38OH가 0.2% 보다 적게 존재함이 나타났다. ES(양성)=2871(MH+), ES(음성)=2869(M-1). 평균 MW=2870.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
8.2 FMOC 그룹의 제거에 의한 HAA27-39NH 2 단편의 제조
Fmoc AA27-39NH2의 Fmoc 보호 그룹을 유기 용매, 예를 들어 DCM, DMF, NMP, 메틸 t-부틸 에테르(MTBE), 헥산 또는 이들의 혼합물 중에서 피페리딘 또는 탄산 칼륨과 같은 염기를 사용하여 제거한다.
실시예:
FmocAA27-39OH(257-25-1, 4.00 g, 1.39 밀리몰)를 MTBE 40 ㎖(10 부피) 및 헵탄 10 ㎖(2.5 부피)에 슬러리화시키고, 이어서 피페리딘(0.75 ㎖, 8.34 밀리몰, 5.5 당량)으로 처리하였다. 상기 슬러리를 12 시간 교반하고, 이 시점에서 0.5%의 출발 물질이 남았으며(HPLC) 헵탄 20 ㎖(5 부피)을 가하였다. 상기 자유 흐름 슬러리를 1 시간 교반하고, 이어서 흡입 여과에 의해 단리시키고, 1:1 MTBE/헵탄 3 ×7 ㎖(매 세척마다 2 부피)로 세척하고 40 ℃, 진공 오븐에서 항량 건조시켜 257-40-1 3.55 g(96%, 83A% 순도)을 수득하였다.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
8.3 Fmoc-AA13-26OH와 HAA27-39NH 2 의 액상 커플링에 의한 Fmoc-AA13-39-NH 2 단편의 제조
FmocAA13-26OH의 카르복실 말단을 DIEA 및 HAA27-39NH2의 존재 하에서 각각 HBTU 또는 TBTU 및 HOBT 또는 HOAT를 사용하여 활성화된 HOBT 또는 HOAT 에스테르로 전환시킴으로써 FmocAA13-39NH2를 제조한다. 상기 반응을 극성의 비양성자성 용매, 예를 들어 DMF 또는 NMP 중에서 0 내지 25 ℃에서 실행한다. 반응의 완료 시에, 알콜 또는 수 혼화성 용매 및/또는 물을 가하여 FmocAA13-39NH2를 침전시킨다.
실시예:
FmocAA13-26OH(257-41-1, 3.00 g, 0.8417 밀리몰, 1 당량), HAA27- 39NH2(2.23 g, 0.8417 밀리몰, 1 당량), HOBT 수화물(0.135 g, 0.884 밀리몰, 1.05 당량)을 DMF(25 ㎖, 30 분)에 용해시키고, 빙 욕으로 냉각시키고, DIEA(0.23 ㎖, 1.33 밀리몰, 1.50 당량)로 처리하고,이어서 HBTU(0.335 g, 0.884 밀리몰, 1.05 당량)를 가하고 교반하였다. 1 시간 후에 반응이 출발 물질의 손실(HPLC)을 근거로 90% 완료되었으며 상기를 실온으로 가온시켰다. 4 시간 후에 추가의 HBTU(0.150 g, 0.395 밀리몰, 0.5 당량)를 가하고, 반응물을 밤새 교반하였다. 메탄올(50 ㎖)에 이어서 물(50 ㎖)을 적가하여 검이 생성되며, 상기는 주변 온도에서 16 시간 교반 후에 슬러리로 고형화되었다. 상기 고체를 여과에 의해 수거하고, 1:1 물/메탄올(2 ×20 ㎖)로 세척하고, 항량 건조시켜 FmocAA13-39NH2 5.18 g(99%, 60A%)을 수득하였다. 고체는 산과 아민 출발 물질 각각의 5A%이었다.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
8.4 Fmoc 그룹의 제거에 의한 HAA13-39NH 2 단편의 제조
Fmoc AA13-39NH2의 Fmoc 보호 그룹을 유기 용매, 예를 들어 DCM, DMF, NMP, MTBE, 헥산 또는 이들의 혼합물 중에서 피페리딘 또는 탄산 칼륨과 같은 염기를 사용하여 제거한다.
실시예:
FmocAA13-39OH(257-43-1, 0.500 g, 0.0810 밀리몰, 1 당량)를 2:1 MTBE/헵탄 9 ㎖(18 부피)에 30 분간 슬러리화시키고, 이어서 피페리딘(40 ㎕, 0.404 밀리몰, 5 당량)으로 처리하였다. 상기 슬러리를 2 시간 교반하고, 이 시점에서 40%의 출발 물질이 남았다(HPLC). 추가의 MTBE(3 ㎖, 6 부피) 및 피페리딘(20 ㎕, 2.5 당량)을 가하고, 상기 슬러리를 <1% 출발 물질이 남을 때까지(16 시간) 교반하였다. 상기 반응 슬러리를 흡입 여과시키고, 1:1 MTBE/헵탄 2x5 ㎖로 세척하고 항량 건조시켜 0.40 g(90%, 약 60 내지 70A%)을 수득하였다.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
9. 전장의 T-1249 펩타이드의 합성
하기 섹션 9.1 내지 9.2는 펩타이드 중간체 단편들을 사용하여 전장의 T-1249 펩타이드를 제조하는 실시예이다.
본 섹션에 제공된 실시예는 펩타이드 중간체 단편들로부터 전장의 T-1249 펩타이드를 제조하는 고상 및 액상 합성 기법들의 성공적인 커플링을 예시한다.
9.1 AcAA1-12OH와 HAA13-39NH 2 의 액상 커플링에 의한 AcAA1-39NH 2 의 제조
본 원에 개시된 합성 경로는 도 1에 도식적으로 나타낸 3 개의 T-1249 단편 접근로의 정점을 나타낸다. AcAA1-12OH의 카르복실 말단을 DIEA 및 HAA13-39NH2 의 존재 하에서 각각 HBTU 또는 TBTU 및 HOBT 또는 HOAT를 사용하여 활성화된 HOBT 또는 HOAT 에스테르로 전환시킴으로써 AcAA1-39NH2를 제조할 수 있다. 반응의 완료 시에 알콜 또는 수 혼화성 용매 및/또는 물을 가하여 AcAA1-39NH2를 침전시킨다.
실시예:
HAA13-39(257-32-2, 0.409 g, 0.0685 밀리몰, 1 당량), AcAA1-12OH(257-21-1, 0.174 g, 0.0685 밀리몰, 1 당량) 및 HOBT 수화물(0.013 g, 0.0822 밀리몰, 1.20 당량)을 DMF(6.0 ㎖, 12 부피, 30 분)에 용해시켰다. 상기 용액을 빙 욕으로 냉각시키고 DIEA(18 ㎕, 0.1028 밀리몰, 1.5 당량)에 이어서 HBTU(0.031 g, 0.0822 밀리몰, 1.20 당량)를 가하였다. 0 ℃에서 4 시간 교반한 후에, 물(6 ㎖)을 적가하였다. 생성된 슬러리를 1 시간 교반한 다음 흡입 여과에 의해 단리시켰다. 40 ℃, 진공 오븐에서 밤새 건조시켜 257-33-1 0.545 g(94%, 약 50A%)을 수득하였다.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
9.2 AcAA1-39NH 2 의 측쇄 탈보호에 의한 T-1249의 제조
본 섹션에 제공된 실시예는 펩타이드 중간체 단편들로부터 T-1249 펩타이드 를 제조하기 위한 고상 및 액상 합성 기법의 성공적인 커플링을 예시한다. 특히, 여기에 개시된 합성 경로는 도 1에 나타낸 3 개의 T-1249 단편 접근로의 최종 탈보호 단계를 나타낸다. 바람직하게는, AcAA1-39NH2의 측쇄 보호 그룹을 95/5의 트리플루오로아세트산/물 및 5 중량/부피% 이하의 탄소양이온 소거제, 예를 들어 디티오쓰레이톨, 에탄 디티올 또는 시스틴을 사용하여 가산분해시킴으로써 제거한다. 조 T-1249를 MTBE, 디에틸 에테르 또는 디이소프로필 에테르와 같은 에테르의 첨가에 의해 탈보호 용액으로부터 침전시킨다.
실시예:
AcAA1-39NH2(257-33-1, 0.120 g)를 새로 제조된 TFA:DTT:물(95:5:5)의 용액 1.5 ㎖로 처리하고 실온에서 4 시간 동안 교반하였다. MTBE(대략 3 ㎖)를 가하고 침전물을 진공 여과에 의해 수거하였다. 미세 분말을 진공 오븐에서 밤새 건조시켰다. 상기 물질을 1% HOAc를 함유하는 50% 아세토니트릴/물 3 ㎖에 용해시키고 15 시간 동안 정치시켜 트립토판의 인돌 측쇄를 탈카르복실화시켰다. 상기 용액을 직접 분석하여 확실한 T-1249가 함께 용출됨을 발견하였다. 대략적인 순도는 PHLC에 의해 60%이었다.
HPLC 조건: Vydac C8, 목록 번호 208TP54, 5 μ, 300 Å, 0.9 ㎖/분, 280 ㎚. A: 0.1% TFA/물, B: 80% I-PrOH/20% 아세토니트릴과 0.1% TFA의 혼합물. 60 내지 80% B/30 분. 전형적인 샘플 제법: NMP 0.10 ㎖에 1 ㎎을 용해시키고, 아세토니트릴 1 ㎖로 희석한다. 20 ㎕를 20 ㎕ 루프에 주입한다.
<110> TRIMERIS, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR PEPTIDE SYNTHESIS <130> 7872-064 <150> US 09/349,205 <151> 1999-07-07 <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 1 Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 1 5 10 15 Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp 20 25 30 Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 35 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 2 Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 3 Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 4 Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 5 Gln Lys Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 27 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 6 Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys 1 5 10 15 Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe 20 25 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 7 Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln 1 5 10 15 Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu 20 25 <210> 8 <211> 26 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Peptide Fragments <400> 8 Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys 1 5 10 15 Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Glu Trp 20 25

Claims (34)

  1. (a) 아미노 말단은 탈보호된 식: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 6)의 측쇄 보호된 펩타이드를 식: X-WQEWEQKITALL-COOH(서열 식별 번호: 2)의 측쇄 보호된 펩타이드와 반응시켜 식: X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 1)(X는 보호 그룹, 아세틸 그룹 또는 거대분자 담체 그룹이고; Z는 보호 그룹, 아미도 그룹 또는 거대분자 담체 그룹이다)의 측쇄 보호된 펩타이드를 수득함을 포함하는
    식: X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 1)의 펩타이드의 합성 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, X가 9-플루오로에닐메톡시-카보닐(Fmoc), t-부틸(t-Bu), 트리틸(trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), 카보벤족실, 단실 및 파라-니트로벤질 에스테르 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 보호 그룹인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, Z가 9-플루오로에닐메톡시-카보닐(Fmoc), t-부틸(t-Bu), 트리틸(trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), 카보벤족실, 단실 및 파라-니트로벤질 에스테르 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 보호 그룹인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, X가 지질-지방산 공액물, 폴리에틸렌 글리콜 및 탄수화물로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 거대분자 담체 그룹인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, Z가 지질-지방산 공액물, 폴리에틸렌 글리콜 및 탄수화물로 이루어진 그룹 중에서 선택된 거대분자 담체 그룹인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 식: X-WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 1)의 측쇄 보호된 펩타이드의 측쇄 탈보호를 또한 포함하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서, X가 아세틸 그룹인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, Z가 아미도 그룹인 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 6 항에 있어서, X가 보호 그룹이고, X를 아세틸 그룹으로 변경시키는 단계를 또한 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, Z가 아미도 그룹인 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 식: X-WQEWEQKITALL-COOH(서열 식별 번호: 2)의 측쇄 보호된 펩타이드를 고상 펩타이드 합성에 의해 합성하는 방법.
  12. 제 4 항에 있어서, 아미노 말단은 탈보호된 식: QKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 5)의 측쇄 보호된 펩타이드를 식: EQAQIQQEKNEYEL-COOH(서열 식별 번호: 3)의 측쇄 보호된 펩타이드와 반응시켜 식: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 6)의 측쇄 보호된 펩타이드를 수득함을 포함하는 방법에 의해 식: EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 6)의 측쇄 보호된 펩타이드를 합성하는 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 식: QKLDKWASLWEW-COOH(서열 식별 번호: 4)의 측쇄 보호 된 펩타이드를 페닐알라닌 아미드와 반응시켜 식: QKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 5)의 측쇄 보호된 펩타이드를 수득함을 포함하는 방법에 의해 식: QKLDKWASLWEWF-Z(서열 식별 번호: 5)의 측쇄 보호된 펩타이드를 합성하는 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 식: EQAQIQQEKNEYEL-COOH(서열 식별 번호: 3)의 측쇄 보호된 펩타이드를 고상 펩타이드 합성에 의해 합성하는 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 식: WKLDKWASLWEW-COOH(서열 식별 번호: 4)의 측쇄 보호된 펩타이드를 고상 펩타이드 합성에 의해 합성하는 방법.
  16. (a) WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2),
    EQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:3),
    QKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:4);
    (b) WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2),
    EQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:3),
    QKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:5);
    (c) WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2),
    EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:6);
    (d) WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2),
    EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:8);
    (e) WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:7),
    QKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:4); 및
    (f) WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:7),
    QKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:5)
    로 이루어진 그룹 중에서 선택된 세트를 포함하는 펩타이드 단편 세트.
  17. 제 16 항에 있어서, 펩타이드 단편들의 측쇄들 중 하나 이상이 보호 그룹으로 보호된 펩타이드 단편 세트.
  18. 제 17 항에 있어서, 보호 그룹이 9-플루오로에닐메톡시-카보닐(Fmoc), t-부틸(t-Bu), 트리틸(trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), 카보벤족실, 단실 및 파라-니트로벤질 에스테르 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드 단편 세트.
  19. 제 16 항에 있어서, WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2), EQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:3) 및 QKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:4)를 포함하는 펩타이드 단편 세트.
  20. 제 16 항에 있어서, WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2), EQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:3) 및 QKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:5)를 포함하는 펩타이드 단편 세트.
  21. 제 16 항에 있어서, WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2) 및 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:6)를 포함하는 펩타이드 단편 세트.
  22. 제 16 항에 있어서, WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2) 및 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:8)를 포함하는 펩타이드 단편 세트.
  23. 제 16 항에 있어서, WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:7) 및 QKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:4)를 포함하는 펩타이드 단편 세트.
  24. 제 16 항에 있어서, WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:7) 및 QKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:5)를 포함하는 펩타이드 단편 세트.
  25. WQEWEQKITALL (서열 식별 번호:2), EQAQIQQEKNEYEL (서열 식별 번호:3), QKLDKWASLWEW (서열 식별 번호:4), QKLDKWASLWEWF (서열 식별 번호:5), EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (서열 식별 번호:6), WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL (서열 식별 번호:7) 및 EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW (서열 식별 번호:8) 로 이루어진 그룹 중에서 선택된 펩타이드.
  26. 제 25 항에 있어서, 펩타이드의 측쇄들 중 하나 이상이 보호 그룹으로 보호된 펩타이드.
  27. 제 26 항에 있어서, 보호 그룹이 9-플루오로에닐메톡시-카보닐(Fmoc), t-부틸(t-Bu), 트리틸(trt), t-부틸옥시카보닐(Boc), 카보벤족실, 단실 및 파라-니트로벤질 에스테르 그룹으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 펩타이드.
  28. 제 25 항에 있어서, WQEWEQKITALL(서열 식별 번호:2)인 펩타이드.
  29. 제 25 항에 있어서, EQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:3)인 펩타이드.
  30. 제 25 항에 있어서, QKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:4)인 펩타이드.
  31. 제 25 항에 있어서, QKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:5)인 펩타이드.
  32. 제 25 항에 있어서, EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF(서열 식별 번호:6)인 펩타이드.
  33. 제 25 항에 있어서, WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYEL(서열 식별 번호:7)인 펩타이드.
  34. 제 25 항에 있어서, EQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEW(서열 식별 번호:8)인 펩타이드.
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