CN116655765A - 一种芋螺毒素的液相合成方法 - Google Patents

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CN116655765A CN202310720319.0A CN202310720319A CN116655765A CN 116655765 A CN116655765 A CN 116655765A CN 202310720319 A CN202310720319 A CN 202310720319A CN 116655765 A CN116655765 A CN 116655765A
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Abstract

本申请提供一种芋螺毒素的液相合成方法，其以2,6‑二(十八烷氧基)苯甲醇为载体，包括以Fmoc‑Cys(MeBzl)‑OH为起始氨基酸经活化后与载体酯化缩合形成Fmoc‑Cys(MeBzl)‑shs；脱除Fmoc保护基后与活化后的Fmoc‑Cys(Acm)‑OH缩合，继续脱除Fmoc保护基后与其他Fmoc‑氨基酸相继缩合得到带保护的shs‑芋螺毒素线性肽，其中，Cys3、Cys15以Trt基团保护，Cys4以Acm基团保护，以及Cys10以MeBzl基团保护；裂解该带保护的shs‑芋螺毒素线性肽，并依次脱除Cys的保护基Trt、Acm和MeBzl，每次脱除保护基后进行氧化反应以制备芋螺毒素。

Description

一种芋螺毒素的液相合成方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及一种芋螺毒素的液相合成方法。
背景技术
在整个说明书中对现有技术的任何讨论都不应被视为承认这些现有技术是广为人知的，或构成本领域公知常识的一部分。
芋螺毒素是来源于海洋芋螺的一种生物活性多肽，因此又名芋螺多肽。世界范围内共有500多种芋螺，每种芋螺可以产生上千种活性多肽，并且不同的芋螺产生的活性多肽也各不相同，因此芋螺多肽可能有上百万种之多，是一个具有很高研究价值的生物多肽库。
芋螺毒素种类繁多，根据其N端部分高度保守的信号肽序列和二硫键骨架可以将芋螺多肽分为若干超家族，主要有A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P、S等。根据芋螺多肽的作用的受体和生理活性可以划分为若干个亚家族，通过在芋螺毒素名称前用希腊字母加破折号来表示，主要有α-，μ-，ψ-，ω-，σ-，γ-，δ-等。大多数芋螺毒素富含二硫键具有特定的分子结构能选择性地作用于细胞膜上特异的离子通道或受体等因而具有多种生物学效应。
目前国内外已有关于芋螺毒素的制备方法，中国专利CN 110894225 B采用固相方法得到线性保护肽，在液相中环化，酸解去保护，但是固相合成为非均相反应，所以需要消耗至少两倍当量的氨基酸原料，以及需要大量的溶剂对树脂进行洗涤，因此严重地影响了产品总收率，目前的产率仅有10％，并且大幅度增加了产品的生产成本。此外反应过程中无法通过TLC法检测判断反应是否完全及是否产生杂质。
发明内容
本发明提供了2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇在合成芋螺毒素中的应用，同时提供了以2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇为载体液相法合成芋螺毒素的方法。本发明首次采用液相法合成芋螺多肽，减少了原料及溶剂的消耗，极大的降低了芋螺毒素的合成成本，为工业化生产提供参考。以及，本发明以2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇为载体采用液相法合成芋螺毒素，在合成的过程中，减少了氨基酸的用量和溶剂的消耗量，从而极大的降低了生产成本，并且本发明所用的原料简单易得，成本低，合成步骤操作简单，分离方便、副产物少且收率高，易于实现。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，提供了2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇在合成芋螺毒素中的应用。
在本发明的一些实施方式中，2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇作为载体参与芋螺毒素的合成。在本发明的一些实施方式中，所述合成芋螺毒素采用液相合成法。
本发明所述的2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇可连接至氨基酸或多肽的C端，与氨基酸或多肽的碳端缩合成酯，其中接入氨基酸或多肽的基团以shs表示，shs的接入可以提高多肽在有机溶剂中的溶解度和液相多肽合成过程中的反应性。并且，在多肽合成完成后，可以通过裂解的方法轻易地去除shs基团。此外，shs基团的存在还可以通过增强多肽的疏水性，改善多肽的沉淀和纯化。
在本发明的一些实施方式中，所述芋螺毒素为μ-CnIIIC。
μ-CnIIIC属于M超家族，由22个氨基酸组成，富含正电荷，具有三对二硫键，是一种非常有效、具有选择性和持久性的钠通道拮抗剂，可以特异性地阻断钠离子通道，使钠离子内流受阻，导致肌肉动作电位不能形成，表情肌得以放松，从而可以有效地预防和减少皱纹，因此在美容方面具有巨大的应用价值。其中，μ-CnIIIC的分子式为：C92H145N35O28S6，分子量为2375.7，化学结构如下：
其中，在该结构中，三个二硫键的连接方式为Cys3-Cys15、Cys4-Cys21和Cys10-Cys22。结构中每个氨基酸字母分别表示：
Z：L-焦谷氨酸(pyroglutamic acid，Pyr)；G：甘氨酸(glycine，Gly)；C：半胱氨酸(cysteine，Cys)；N：天冬氨酸(asparagine，Asn)；P：脯氨酸(proline，Pro)；K：赖氨酸(lysine，Lys)；S：丝氨酸(serine，Ser)；W：色氨酸(tryptophan，Trp)；R：精氨酸(arginine，Arg)；D：天冬酰胺(aspartic acid，Asp)；H：组氨酸(histidine，His)；A：丙氨酸(alanine，Ala)。
在本发明的第二方面，提供了一种液相法合成芋螺毒素的方法，所述方法采用2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇作为载体，所述方法包括：
以Fmoc-Cys(MeBzl)-OH为起始氨基酸经活化后与载体2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇进行酯化反应缩合形成Fmoc-Cys(MeBzl)-shs；
脱除Fmoc保护基生成NH2-Cys(MeBzl)-shs；
NH2-Cys(MeBzl)-shs与活化后的Fmoc-Cys(Acm)-OH缩合生成Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs；
脱除Fmoc保护基后继续依次缩合其他Fmoc-氨基酸，并在每次缩合后脱除Fmoc保护基制备得到带保护的shs-芋螺毒素线性肽；其中，Cys3、Cys15以Trt保护基保护，Cys4、Cys21以Acm保护基保护，以及Cys10、Cys22以MeBzl保护基保护；
裂解带保护的shs-芋螺毒素线性肽制备带保护的芋螺毒素线性肽；
依次脱除带保护的芋螺毒素线性肽中Cys的保护基Trt、Acm和MeBzl，并在每次脱除保护基后进行氧化反应以制备芋螺毒素。
在本发明的一些实施方式中，所述芋螺毒素为μ-CnIIIC。
在本发明的一些实施方式中，脱除Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs的Fmoc保护基后依次缩合的Fmoc-氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pyr-OH。
在本发明中涉及的保护基的名称及缩写如下所示：
Trt：三苯甲基；Acm：乙酰氨基甲基；MeBzl：甲基苄基；Fmoc：9-芴基甲氧基羰基；Boc：叔丁基氧基羰基；Pbf：二苯基甲基；Otbu：叔丁基氧基；tbu：叔丁基。
在本发明的一些实施方式中，所述带保护的shs-芋螺毒素线性肽的结构为：shs-Cys(MeBzl)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-His(Trt)-Asp(Otbu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(MeBzl)-Gly-Lys(Boc)-Pro-Gly-Asn(Otbu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Gly-Pyr。
在本发明的一些实施方式中，裂解带保护的shs-芋螺毒素线性肽制备带保护的芋螺毒素线性肽的方法包括：使带保护的shs-芋螺毒素线性肽发生酯交换反应生产酰胺并回收载体2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇；具体地，在一些实施方式中，所述方法可以包括：将带保护的shs-芋螺毒素线性肽以甲醇溶解后加入一水合氢氧化锂并通入氨气反应，反应结束即产生带保护的芋螺毒素线性肽。进一步地，将反应液减压浓缩并加入至不良溶剂(比如甲基叔丁基醚)中沉淀，收集沉淀并干燥即可获得带保护的芋螺毒素线性肽，同时，回收滤液减压浓缩后干燥即可回收得到载体2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇，回收率高于57％。
在本发明的一些实施方式中，所述带保护的芋螺毒素线性肽的结构为：NH2CO-Cys(MeBzl)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-His(Trt)-Asp(Otbu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(MeBzl)-Gly-Lys(Boc)-Pro-Gly-Asn(Otbu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Gly-Pyr。
在本发明的一些实施方式中，所述依次脱除带保护的芋螺毒素线性肽中Cys的保护基Trt、Acm和MeBzl，并在每次脱除保护基后进行氧化反应以制备芋螺毒素的方法包括：
将带保护的芋螺毒素线性肽与苯酚、硫代苯甲醚、乙二硫醇和三氟乙酸混合以脱除Cys的保护基Trt，脱除Cys的保护基Trt后获取固体产物并溶解于异丙醇和水的混合溶液中，调节溶液pH至碱性，在空气中进行第一次氧化反应，反应结束后获取第一次氧化反应后的固体产物；在本发明的实施方式中，在该条件下可实现Trt保护基与其他侧链保护基Pbf、Otbu、Boc、tbu的脱除；
将第一次氧化反应后的固体产物溶解于异丙醇、水和盐酸的混合溶液中，并加入碘溶液以以脱除Cys的保护基Acm并进行第二次氧化反应，反应结束后获取第二次氧化反应后的固体产物；
将第二次氧化反应后的固体产物溶解于三氟乙酸、二苯基亚砜和苯甲醚的混合溶液中脱除MeBzl保护基并进行第三次氧化反应以制备芋螺毒素。
在本发明的一些实施方式中，三氟乙酸、苯酚、硫代苯甲醚、乙二硫醇、水的体积比为(76-93)：(3-8)：(2-6)：(1-4)：(2-6)，优选为80:5:3:2:3。
在本发明的一些实施方式中，异丙醇、水和盐酸的混合溶液中，异丙醇、水和盐酸的体积比为(75-85):(10-15):(5-10)，优选为80:12.5:7.5。
在本发明的一些实施方式中，三氟乙酸、二苯基亚砜的混合溶液中，三氟乙酸、二苯基亚砜的体积比为3％-8％，优选为6％。
在本发明的一些实施方式中，氨基酸的活化体系为N,N'-二异丙基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶(DIC/DMAP)或N,N'-二异丙基碳二亚胺和1-羟基苯并三唑(DIC/HoBt)。
在本发明的一些实施方式中，脱除Fmoc保护基采用六氢吡啶溶液；
在本发明的一些实施方式中，所述六氢吡啶溶液为六氢吡啶(PIP)和四氢呋喃(THF)的混合溶液，其中，六氢吡啶的浓度为20％。
在本发明的一些实施方式中，可采用TLC法检测反应。
在本发明的实施方式中，获取固体产物的方式一般为干燥，在本发明的一些实施方式中为冷冻干燥。比如，在一些实施方式中，在脱除Cys的Trt保护基时，可以将反应液过滤浓缩，并投入不良溶剂(例如甲基叔丁基醚)中，得到白色固体后冷冻干燥。
在本发明的一些实施方式中，本发明提供了纯化芋螺毒素的方法，包括：第三次氧化反应结束后，过滤浓缩反应液并加入不良溶剂(比如甲基叔丁基醚)中沉淀，离心并洗涤后冷冻干燥，经HPLC纯化即得芋螺毒素。
本发明上述实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
相较于现有技术，本发明的优势包括：
本发明首次采用液相法合成芋螺多肽，减少了原料及溶剂的消耗，极大的降低了芋螺毒素的合成成本，为工业化生产提供参考。以及，本发明采用液相法合成芋螺毒素，在合成的过程中，减少了氨基酸的用量和溶剂的消耗量，从而极大的降低了生产成本。同时，本发明所用的原料简单易得，成本低，合成步骤操作简单，分离方便、副产物少且收率高，易于实现。
本发明以2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇作为液相合成芋螺多肽的载体，合成该化合物所需原料均为大宗化工品，价格很低，适应于工业化生产，具有极高的商业化价值，并且良好的溶解度。在本发明中，2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇的使用可以提高多肽的溶解度和稳定性，减少多肽的聚集和降解；并且可以避免使用固相载体和有机溶剂，既能降低环境污染和成本，也可以实现多肽的连续生产和规模化生产，提高生产效率和质量控制；并且该载体的使用可以提供更多的连接位点，并且不再受固相载体的机械强度、溶胀性以及负载能力的限制，可以合成采用固相法或传统液相合成法难以合成的更长的多肽。载体结构的差异(比如，苯环上的羟基位置和烷氧基的碳链长度)会影响载体的性质，比如，发明人在研究过程中发现，羟基越靠近烷氧基，疏水载体的亲脂性越强，可溶性越差；烷氧基的碳链越长，疏水载体的亲脂性越强，可溶性越差；2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇具有对称的结构和合适的碳链结构，其相较于其他载体或相同种类但不同结构的化合物(比如具有更长或更短的烷氧基碳链和/或不同的烷氧基碳链的位置)更适合于μ-CnIIIC的合成，所述更适合的表现包括：更节约溶剂、使多肽具有更好的溶解性能、更好的稳定性、带来更高的反应速率、更高的收率和易脱除性。
μ-芋螺毒素具有三对二硫键，含多对二硫键且长肽链的多肽的合成一直是多肽合成领域难度较大的领域，本发明以Trt保护基对Cys3、Cys15进行保护，以Acm保护基对Cys4、Cys21进行保护，以及以MeBzl保护基对Cys10、Cys22进行保护，并依次脱除Trt、Acm和MeBzl保护基进行氧化折叠，从而可选择性的形成三对定向二硫键；Trt保护基与其它侧链保护剂脱除条件相同，因此在本发明中Trt保护基被首先脱除，然后再依次脱除Acm和MeBzl保护基，如果更换顺序，其他侧链保护基的存在会导致空间位阻过大，难以有效形成二硫键，以及如果先脱除MeBzl保护基时，芋螺毒素的产率很低且产物复杂。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1：示出了本发明一种实施方式中的μ-CnIIIC线性肽的合成示意图。
图2：示出了本发明一种实施方式中的μ-CnIIIC氧化折叠示意图。
图3：示出了本发明的一种实施方式中的μ-CnIIIC的质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。下述实施例中的每步可重复多次以实现备料，重复备料的过程不再赘述。
实施例1
2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇的合成
在2L圆底烧瓶中加入15.41g(100mmol,1.0eq)2,6-二羟基苯甲酸用600mL DMF溶解，将60.68g(210mmol,2.1eq)1-氯十八烷、2.59g(10mmol,0.1eq)四丁基氢氧化铵(TBAH)和8.41g(120mmol,1.2eq)氢氧化钙加入反应体系中，采用氮气保护，在室温条件下反应12小时，TLC检测反应完全。反应完成后，加入600mL乙醇和11.35g(300mmol,3.0eq)硼氢化钠，经氮气保护，在室温条件下反应3小时，TLC检测反应完全。反应完成后，向反应液中加入300mL纯化水淬灭，然后将反应液缓慢释放到1000mL纯化水中，瞬间产生大量气泡和白色固体。抽滤得白色固体，用200mL甲醇洗涤、打浆，抽滤并烘干得白色固体2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇，称重63.42g，收率为98.31％。
芋螺毒素(μ-CnIIIC)的合成
(1)在200mL圆底烧瓶中加入6.46g(10mmol,1.0eq)2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇用100mL二氯甲烷(DCM)搅拌溶解，称取6.51g(15mmol,1.5eq)Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、2.11g(5mmol,1.5eq)DIC、2.44g(20mmol,2.0eq)DMAP溶解于20mL二氯甲烷活化五分钟，然后加入反应体系中，经氮气保护在室温条件下反应3小时，TLC检测反应完全。反应完成后，经减压浓缩，得灰白色固体并用150mL乙腈溶解，抽滤，得灰白色固体产物(Fmoc-Cys(MeBzl)-shs)，烘干，称重10.50g，收率为97.57％。
(2)称取步骤(1)产物(Fmoc-Cys(MeBzl)-shs)10.75g(10mmol,1.0eq)，用100mL四氢呋喃(THF)溶解于200mL圆底烧瓶中，称取3.41g(40mmol,4.0eq)六氢吡啶脱Fmoc，采用氮气保护，在室温条件下反应2小时，TLC检测反应完全。反应完成后，减压浓缩，得土黄色固体。用150mL乙腈溶解产物，抽滤并检测滤液pH，若pH大于7，继续用乙腈洗涤，将滤液洗涤到中性。烘干，称重得8.16g固体产物NH2-Cys(MeBzl)-shs，收率为95.62％。
(3)在200mL圆底烧瓶中加入步骤(2)产物NH2-Cys(MeBzl)-shs 8.53g(10mmol,1.0eq)，用100mL四氢呋喃将其搅拌溶解。量取20mL四氢呋喃将4.98g(12mmol,1.2eq)Fmoc-Cys(Acm)-OH溶解，然后依次加入1.62g(12mmol,1.2eq)HoBt、1.51g(12mmol,1.2eq)DIC，搅拌活化3分钟，加入到反应液中。采用氮气保护，在25℃反应条件下反应4小时，TLC检测反应完全。反应完成后，减压浓缩，得橙黄色固体，用150mL乙腈洗涤，打浆，抽滤，得灰白色固体Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs，烘干，称重11.96g，收率为95.72％。
(4)量取100mL四氢呋喃将步骤(3)的产物Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs称取12.50g(10mmol,1.0eq)溶于200mL圆底烧瓶，加入3.41g(40mmol,4eq)六氢吡啶脱除Fmoc，氮气保护，25℃条件下反应2小时，TLC检测反应完全。减压浓缩，得橙黄色固体，用150mL乙腈溶解，打浆，抽滤，测滤液pH若pH大于7，继续用乙腈洗涤，将滤液洗涤到中性。烘干，称重9.84g，收率为95.78％。
(5)接下来依次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pyr-OH，连接方法、用量和后处理与步骤(3)中连Fmoc-Cys(Acm)-OH一致，得带保护的shs-线性肽，烘干，称重22.84g，收率为53.24％。
(6)在500mL圆底烧瓶中，称取17.56g(4mmol,1.0eq)带保护的shs-线性肽用200mL甲醇溶解，加入1.68g(16mmol,4.0eq)一水合氢氧化锂，通入氨气、室温条件下反应4小时，TLC检测反应完全，减压浓缩，得灰白色黏稠液体。缓慢倒入到400mL甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌反应2小时，抽滤得白色固体，烘干，终产物带保护的线性肽称重9.57g，收率为65.37％，回收滤液，减压浓缩得白色固体即为2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇，烘干、称重1.49g，回收率57.45％。
(7)称取带保护的线性肽18.31g(5mmol,1.0eq)置于200mL圆底烧瓶中，加入100mL洗脱剂混合物三氟乙酸、苯酚、硫代苯甲醚、乙二硫醇、水(体积比80:5:3:2:3)在室温下搅拌反应3小时。反应完成后，对反应液进行抽滤，滤液减压浓缩得灰白色黏稠液体，缓慢倒入150mL甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌2小时。抽滤得到白色固体，冷冻干燥。将产物用异丙醇和水混合液100mL溶解，用氢氧化钠调节pH到8.5，并在空气中摇动使其持续氧化反应12小时。通过HPLC和MS监测氧化反应，并通过碘乙酰胺(IAA)衍生化确认第一个桥的形成。反应完成后将产物冷冻干燥；在圆底烧瓶中将上述产物溶解于100mL异丙醇、水、盐酸混合液(体积比80:12.5:7.5)。向溶液中加入10mL的碘溶液(10mM)，在室温下搅拌反应4小时，并通过HPLC和MS监测氧化反应。通过碘乙酰胺(IAA)衍生化实验确定第二个二硫键的形成。然后逐滴加入20mL抗坏血酸来终止反应，使反应体系澄清。冷冻干燥反应混合物；将产物溶解在100mL 6％ TFA(二苯基亚砜)的混合溶液中，在室温条件下搅拌反应4小时。通过HPLC和MS监测氧化反应，碘乙酰胺(IAA)衍生化确定二硫键的形成。反应完成后抽滤取滤液，旋蒸浓缩，加入100mL甲基叔丁基醚沉淀，离心,冷冻干燥并经HPLC纯化，称重得到μ-CnIIIC产物3.83g，收率为32.24％。μ-CnIIIC的质谱图如图3所示。
实施例2
2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇的合成
在3L圆底烧瓶中加入30.82g(200mmol,1.0eq)2,6-二羟基苯甲酸用1L DMF溶解，将121.36g(420mmol,2.1eq)1-氯十八烷、5.18g(20mmol,0.1eq)TBAH和16.82g(240mmol,1.2eq)氢氧化钙加入反应体系中，采用氮气保护，在室温条件下反应12小时，TLC检测反应完全。反应完成后，加入1.2L乙醇和22.70g(600mmol,3.0eq)硼氢化钠，经氮气保护，在室温条件下反应3小时，TLC检测反应完全。反应完成后，向反应液中加入400mL纯化水淬灭，然后将反应液缓慢释放到2L纯化水中，瞬间产生大量气泡和白色固体。抽滤得白色固体，用300mL甲醇洗涤、打浆，抽滤并烘干得白色固体2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇，称重124.4g，收率为96.43％。
芋螺毒素(μ-CnIIIC)的合成
(1)在500mL圆底烧瓶中加入12.92g(20mmol,1.0eq)2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇用200mL二氯甲烷搅拌溶解，称取13.02g(30mmol,1.5eq)Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、4.22g(10mmol,1.5eq)DIC、4.88g(40mmol,2.0eq)DMAP溶解于50mL二氯甲烷活化五分钟，然后加入反应体系中，经氮气保护在室温条件下反应2.5小时，TLC检测反应完全。反应完成后，经减压浓缩，得灰白色固体并用200mL乙腈溶解，抽滤，得灰白色固体产物Fmoc-Cys(MeBzl)-shs，烘干，称重10.35g，收率为96.21％。
(2)称取步骤(1)产物(Fmoc-Cys(MeBzl)-shs)21.50g(20mmol,1.0eq)，用200mL四氢呋喃溶解于500mL圆底烧瓶中，称取6.82g(80mmol,4.0eq)六氢吡啶脱Fmoc，采用氮气保护，在室温条件下反应2小时，TLC检测反应完全。反应完成后，减压浓缩，得土黄色固体。用200mL乙腈溶解产物，抽滤并检测滤液pH，若pH大于7，继续用乙腈洗涤，将滤液洗涤到中性。烘干，称重得16.51g固体产物NH2-Cys(MeBzl)-shs，收率为96.71％。
(3)在500mL圆底烧瓶中加入步骤(2)产物NH2-Cys(MeBzl)-shs 17.06g(20mmol,1.0eq)，用200mL四氢呋喃将其搅拌溶解。量取50mL四氢呋喃将9.96g(24mmol,1.2eq)Fmoc-Cys(Acm)-OH溶解，然后依次加入3.24g(24mmol,1.2eq)HoBt、3.02g(24mmol,1.2eq)DIC，搅拌活化3分钟，加入到反应液中。采用氮气保护，在30℃反应条件下反应6小时，TLC检测反应完全。反应完成后，减压浓缩，得橙黄色固体，用200mL乙腈洗涤，打浆，抽滤，得灰白色固体Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs，烘干，称重23.64g，收率为94.58％。
(4)量取200mL四氢呋喃将步骤(3)的产物Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs称取25.00g(20mmol,1.0eq)溶于500mL圆底烧瓶，加入6.82g(80mmol,4eq)六氢吡啶脱除Fmoc，氮气保护，30条件下反应3小时，TLC检测反应完全。减压浓缩，得橙黄色固体，用200mL乙腈溶解，打浆，抽滤，测滤液pH若pH大于7，继续用乙腈洗涤，将滤液洗涤到中性，烘干，称重19.48g，收率为94.76％。
(5)接下来依次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pyr-OH，连接方法、用量和后处理与步骤(3)中连Fmoc-Cys(Acm)-OH一致，得带保护的shs-线性肽，烘干，称重44.34g，收率为51.67％。
(6)在500mL圆底烧瓶中，称取17.56g(4mmol,1.0eq)带保护的shs-线性肽用200mL甲醇溶解，加入1.68g(16mmol,4.0eq)一水合氢氧化锂，通入氨气、室温条件下反应4小时，TLC检测反应完全，减压浓缩，得灰白色黏稠液体。缓慢倒入到500mL甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌反应2小时，抽滤得白色固体，烘干，终产物带保护的线性肽称重8.61g，收率为58.75％，回收滤液，减压浓缩得白色固体即为2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇，烘干、称重1.31g，回收率50.34％。
(7)称取带保护的线性肽36.62g(10mmol,1.0eq)置于500mL圆底烧瓶中，加入300mL洗脱剂混合物三氟乙酸、苯酚、硫代苯甲醚、乙二硫醇、水(体积比80:5:3:2:3)在室温下搅拌反应3小时。反应完成后，对反应液进行抽滤，滤液减压浓缩得灰白色黏稠液体，缓慢倒入300mL甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌2.5小时。抽滤得到白色固体，冷冻干燥。将产物用异丙醇和水混合液300mL溶解，用氢氧化钠调节pH到8.5，并在空气中摇动使其持续氧化反应12小时。通过HPLC和MS监测氧化反应，并通过碘乙酰胺(IAA)衍生化确认第一个桥的形成。反应完成后将产物冷冻干燥；在圆底烧瓶中将上述产物溶解于100mL异丙醇、水、盐酸混合液(体积比80:12.5:7.5)。向溶液中加入30mL的碘溶液(10mM)，在室温下搅拌反应4小时，并通过HPLC和MS监测氧化反应。通过碘乙酰胺(IAA)衍生化实验确定第二个二硫键的形成。然后逐滴加入70mL抗坏血酸来终止反应，使反应体系澄清。冷冻干燥反应混合物；将产物溶解在300mL 6％ TFA(二苯基亚砜)的混合溶液中，在室温条件下搅拌反应4小时。通过HPLC和MS监测氧化反应，碘乙酰胺(IAA)衍生化确定二硫键的形成。反应完成后抽滤取滤液，旋蒸浓缩，加入300mL甲基叔丁基醚沉淀，离心,冷冻干燥并经HPLC纯化，称重得到μ-CnIIIC产物6.76g，收率为28.45％。
实施例3
2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇的合成
在5L圆底烧瓶中加入30.82g(200mmol,1.0eq)2,6-二羟基苯甲酸用1.5L DMF胺溶解，将121.36g(420mmol,2.1eq)1-氯十八烷、5.18g(20mmol,0.1eq)TBAH和16.82g(240mmol,1.2eq)氢氧化钙加入反应体系中，采用氮气保护，在室温条件下反应12小时，TLC检测反应完全。反应完成后，加入1.5L乙醇和22.70g(600mmol,3.0eq)硼氢化钠，经氮气保护，在室温条件下反应4小时，TLC检测反应完全。反应完成后，向反应液中加入400mL纯化水淬灭，然后将反应液缓慢释放到2L纯化水中，瞬间产生大量气泡和白色固体。抽滤得白色固体，用400mL甲醇洗涤、打浆，抽滤并烘干得白色固体2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇，称重123.44g，收率为95.67％。
芋螺毒素(μ-CnIIIC)的合成
(1)在1L圆底烧瓶中加入25.84g(40mmol,1.0eq)2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇用600mL二氯甲烷搅拌溶解，称取26.04g(60mmol,1.5eq)Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、8.44g(20mmol,1.5eq)DIC、9.76g(80mmol,2.0eq)DMAP溶解于50mL二氯甲烷活化五分钟，然后加入反应体系中，经氮气保护在室温条件下反应3.5小时，TLC检测反应完全。反应完成后，经减压浓缩，得灰白色固体并用500mL乙腈溶解，抽滤，得灰白色固体产物Fmoc-Cys(MeBzl)-shs，烘干，称重41.06g，收率为95.43％。
(2)称取步骤(1)产物(Fmoc-Cys(MeBzl)-shs)43.00g(40mmol,1.0eq)，用600mL四氢呋喃溶解于1L圆底烧瓶中，称取13.64g(160mmol,4.0eq)六氢吡啶脱Fmoc，采用氮气保护，在室温条件下反应3小时，TLC检测反应完全。反应完成后，减压浓缩，得土黄色固体。用500mL乙腈溶解产物，抽滤并检测滤液pH，若pH大于7，继续用乙腈洗涤，将滤液洗涤到中性。烘干，称重得32.28g固体产物NH2-Cys(MeBzl)-shs，收率为94.56％。
(3)在1L圆底烧瓶中加入步骤(2)产物NH2-Cys(MeBzl)-shs 34.12g(40mmol,1.0eq)，用600mL四氢呋喃将其搅拌溶解。量取100mL四氢呋喃将19.92g(48mmol,1.2eq)Fmoc-Cys(Acm)-OH溶解，然后依次加入6.48g(48mmol,1.2eq)HoBt、6.04g(48mmol,1.2eq)DIC，搅拌活化5分钟，加入到反应液中。采用氮气保护，在25℃反应条件下反应5小时，TLC检测反应完全。反应完成后，减压浓缩，得橙黄色固体，用500mL乙腈洗涤，打浆，抽滤，得灰白色固体Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs，烘干，称重46.26g，收率为92.53％。
(4)量取600mL四氢呋喃将步骤(3)的产物Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs称取50.00g(40mmol,1.0eq)溶于1L圆底烧瓶，加入13.64g(160mmol,4eq)六氢吡啶脱除Fmoc，氮气保护，35℃条件下反应3小时，TLC检测反应完全。减压浓缩，得橙黄色固体，用500mL乙腈溶解，打浆，抽滤，测滤液pH若pH大于7，继续用乙腈洗涤，将滤液洗涤到中性。烘干，称重38.59g，收率为93.87％。
(5)接下来依次连接Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pyr-OH，连接方法、用量和后处理与步骤(3)中国连Fmoc-Cys(Acm)-OH一致，得带保护的shs-线性肽，烘干，称重82.14g，收率为47.86％。
(6)在500mL圆底烧瓶中，称取17.56g(4mmol,1.0eq)带保护的shs-线性肽用200mL甲醇溶解，加入1.68g(16mmol,4.0eq)一水合氢氧化锂，通入氨气、室温条件下反应4小时，TLC检测反应完全，减压浓缩，得灰白色黏稠液体。缓慢倒入到400mL甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌反应2小时，抽滤得白色固体，烘干，终产物带保护的线性肽称重9.26g，收率为63.21％，回收滤液，减压浓缩得白色固体即为2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇，烘干、称重1.60g，回收率61.78％。
(7)称取带保护的线性肽73.24g(20mmol,1.0eq)置于1L圆底烧瓶中，加入600mL洗脱剂混合物三氟乙酸、苯酚、硫代苯甲醚、乙二硫醇、水(体积比80:5:3:2:3)在室温下搅拌反应3小时。反应完成后，对反应液进行抽滤，滤液减压浓缩得灰白色黏稠液体，缓慢倒入到甲基叔丁基醚中，瞬间有大量白色固体析出，搅拌2小时。抽滤得到白色固体，冷冻干燥。将产物用异丙醇和水混合液600mL溶解，用氢氧化钠调节PH到8.5，并在空气中摇动使其持续氧化反应12小时。通过HPLC和MS监测氧化反应，并通过碘乙酰胺(IAA)衍生化确认第一个桥的形成。反应完成后将产物冷冻干燥；在圆底烧瓶中将上述产物溶解于600mL异丙醇、水、盐酸混合液(体积比80:12.5:7.5)。向溶液中加入100mL的碘溶液(10mM)，在室温下搅拌反应4小时，并通过HPLC和MS监测氧化反应。通过碘乙酰胺(IAA)衍生化实验确定第二个二硫键的形成。然后逐滴加入80mL抗坏血酸来终止反应，使反应体系澄清。冷冻干燥反应混合物；将产物溶解在600mL 6％ TFA(二苯基亚砜)的混合溶液中，在室温条件下搅拌反应4小时。通过HPLC和MS监测氧化反应，碘乙酰胺(IAA)衍生化确定二硫键的形成。反应完成后抽滤取滤液，旋蒸浓缩，加入1L甲基叔丁基醚沉淀，离心,冷冻干燥并经HPLC纯化，称重得到μ-CnIIIC产物11.67g，收率为24.56％。
此外，本发明还尝试更换其他载体以液相方法合成芋螺多肽，包括在2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇的基础上更换其苯环上羟基的位置和/或缩短或延长其烷氧基的碳链长度，但结果在反应速率和收率上很不理想。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇在合成芋螺毒素中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，在合成芋螺毒素时，2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇作为载体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述合成芋螺毒素时采用的方法为液相合成法。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述芋螺毒素为μ-CnIIIC。
5.一种液相法合成芋螺毒素的方法，其特征在于，所述芋螺毒素为μ-CnIIIC，所述方法采用2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇作为载体，所述方法包括：
以Fmoc-Cys(MeBzl)-OH为起始氨基酸经活化后与载体2,6-二(十八烷氧基)苯甲醇进行酯化反应缩合形成Fmoc-Cys(MeBzl)-shs，其中，shs表示
脱除Fmoc-Cys(MeBzl)-shs中的Fmoc保护基生成NH2-Cys(MeBzl)-shs；
NH2-Cys(MeBzl)-shs与活化后的Fmoc-Cys(Acm)-OH缩合生成Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs；
脱除Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs中的Fmoc保护基后继续依次缩合其他Fmoc-氨基酸，并在每次缩合后脱除Fmoc保护基制备得到带保护的shs-芋螺毒素线性肽；其中，Cys3、Cys15以Trt保护基保护，Cys4、Cys21以Acm保护基保护，以及Cys10、Cys22以MeBzl保护基保护；
裂解带保护的shs-芋螺毒素线性肽制备带保护的芋螺毒素线性肽；
依次脱除带保护的芋螺毒素线性肽中Cys的保护基Trt、Acm和MeBzl，并在每次脱除保护基后进行氧化反应以制备芋螺毒素。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，脱除Fmoc-Cys(Acm)-Cys(MeBzl)-shs的Fmoc保护基后依次缩合的Fmoc-氨基酸为：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Asp(Otbu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Ser(tbu)-OH、Fmoc-Cys(MeBzl)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Asn(Otbu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Pyr-OH。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述带保护的shs-芋螺毒素线性肽为：shs-Cys(MeBzl)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-His(Trt)-Asp(Otbu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(MeBzl)-Gly-Lys(Boc)-Pro-Gly-Asn(Otbu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Gly-Pyr。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述带保护的shs-芋螺毒素线性肽为：NH2CO-Cys(MeBzl)-Cys(Acm)-Arg(Pbf)-Ala-His(Trt)-Asp(Otbu)-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Ser(tbu)-Ser(tbu)-Cys(MeBzl)-Gly-Lys(Boc)-Pro-Gly-Asn(Otbu)-Cys(Acm)-Cys(Trt)-Gly-Pyr。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述依次脱除带保护的芋螺毒素线性肽中Cys的保护基Trt、Acm和MeBzl，并在每次脱除保护基后进行氧化反应以制备芋螺毒素的方法包括：
将带保护的芋螺毒素线性肽与苯酚、硫代苯甲醚、乙二硫醇和三氟乙酸混合以脱除Cys的保护基Trt，脱除Cys的保护基Trt后获取固体产物并溶解于异丙醇和水的混合溶液中，调节溶液pH至碱性，在空气中进行第一次氧化反应，反应结束后获取第一次氧化反应后的固体产物；
将第一次氧化反应后的固体产物溶解于异丙醇、水和盐酸的混合溶液中，并加入碘溶液以以脱除Cys的保护基Acm并进行第二次氧化反应，反应结束后获取第二次氧化反应后的固体产物；
将第二次氧化反应后的固体产物溶解于三氟乙酸、二苯基亚砜和苯甲醚的混合溶液中脱除MeBzl保护基并进行第三次氧化反应以制备芋螺毒素。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，三氟乙酸、苯酚、硫代苯甲醚、乙二硫醇、水的体积比为(76-93)：(3-8)：(2-6)：(1-4)：(2-6)，优选为80:5:3:2:3；
优选地，异丙醇、水和盐酸的混合溶液中，异丙醇、水和盐酸的体积比为(75-85):(10-15):(5-10)，优选为80:12.5:7.5；
优选地，三氟乙酸、二苯基亚砜的混合溶液中，三氟乙酸、二苯基亚砜甲醚的体积比为3％-8％，优选为6％。
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