ITMI990777A1 - Polipeptidi ad attivita' antiangiogenica - Google Patents

Polipeptidi ad attivita' antiangiogenica Download PDF

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Description

Descrizione dell'invenzione industriale avente per titolo:
"POLIPEPTIDI AD ATTIVITÀ' ANTIANGIOGENICA”
La presente invenzione ha per oggetto polipeptidi comprendenti da dieci a sessanta ammino acidi con sequenza corrispondente od omologa a quella dell’endostatina, dotati di attività inibitrice dell’angiogenesi, utili nel trattamento di tumori angiogenesi-dipendenti.
Altro oggetto dell'invenzione è un procedimento per la preparazione dei suddetti polipeptidi..
Un ulteriore oggetto dell'invenzione è costituito da formulazioni farmaceutiche contenenti uno o più dei suddetti polipeptidi .
L'endostatina è una proteina dotata di attività antiangiogenica, isolata da J. Folkman e M. O'Reilly (EP 0 857 210).
Esempi dei polipeptidi preparati secondo l'invenzione sono i seguenti.
Questi polipeptidi presentano una notevole attività antiangiogenica nei test in vitro della inibizione della proliferazione e della migrazione di cellule endoteliali (J. Folkman, 0. C. Haudenschild e B.R. Zetter, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76, 5217, 1979. M. Ziche, L. Morbidelli, S. Donnini e F. Ledda, J. Cardiovasc. Pharmacol., 26 (Suppl. 3), S284, 1995). In particolare, il nonatriacontapeptide I risulta equipotente rispetto all'endostatina.
Il procedimento per la preparazione dei polipeptidi, oggetto della presente invenzione, si basa sui seguenti metodi e reazioni generali impiegati nella sintesi dei peptidi.
La protezione dei gruppi amminici degli animino acidi può venir realizzata mediante l'impiego dei raggruppamenti 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc), terz-butilossicarbonile (Boc), benzilossicarbonile (Z), tritile (Trt) ed altri comunemente usati nella chimica dei peptidi.
Per la protezione del gruppo carbossilico possono essere impiegati il terz-butil estere, il benzil estere, il p-metossibenzil estere ed altri comunemente utilizzati per tali scopi.
La rimozione di questi gruppi protettivi, che verrà illustrata in dettaglio negli esempi, può essere effettuata secondo i procedimenti noti in letteratura, quali, secondo i casi, il trattamento con acido trifluoroacetico, con acido fluoridrico anidro, con piperidina ed altri.
Per la condensazione degli animino acidi possono essere utilizzati gli esteri attivi come il pentafluorofenil estere (OPfp), il 3-idrossi-4-oxo-3,4-diidro-1,2,3-benzotriazina estere (ODhbT), oppure gli attivatori del carbossile come il benzotriazolo-1-ile-ossi-tris-pirrolidino-fosfonio esafluorofosfato (PyBop), il 2-(1H-benzotriazolo-1-ile-1,1,3,3-tetrametil uronio tetrafluoroborato (TBTU) e gli altri attivatori comunemente usati per questo tipo di reazioni.
Anche la purificazione dei polipeptidi descritti nella presente invenzione viene effettuata secondo le note tecniche della chimica delle proteine, come l'HPLC in fase inversa, la gel filtrazione, la cromatografia a scambio ionico e l'elettroforesi preparativa.
Ad esempio, il procedimento della presente invenzione può essere effettuato come segue, impiegando il metodo di sintesi dei peptidi in fase solida e utilizzando il sintetizzatore automatico Biolynx plus, mod. 4170 della Novabiochem (Nottingham, Gran Bretagna) (A. Dryland e R. C. Sheppard, J. Chem. Soc., Perkin 1, 125, 1986).
La protezione dei gruppi amminici in a degli animino acidi viene realizzata mediante l'impiego del 9-fluorenilmetossicarbonile (Fmoc). I gruppi funzionali delle catene laterali degli ammino acidi vengono protetti usando i seguenti gruppi protettivi: terz-butile per l'acido aspartico, l'acido glutammico, la serina, la treonina e la tirosina; terz-butossicarbonile per la lisina e il triptofano; tritile per l'istidina; 2,2,4,6,7-pentametil-diidro-benzofurano-5-solfonile per l'arginina; terz-butile per la cisteina del polipeptide I e la terza cisteina del polipeptide IV; tritile per le altre due cisteine del polipeptide IV.
La sintesi viene condotta in maniera graduale partendo dal Fmocammino acido C-terminale, ancorato tramite un legame estereo ad una resina, costituita da polietilenossido unito ad una matrice polistirenica e funzionalizzata tramite un residuo dell'acido 4-idrossimetil-fenossiacetico (E. Bayer, Angew. Chem., 103. 117, 1991). Per la rimozione del Fmoc viene usata una soluzione di piperidina in dimetilformammide (DMF). Per le reazioni di condensazione vengono generalmente impiegati i pentafluorofenil esteri dei Fmoc-ammino acidi. Nel caso della serina e della treonina è stato preferito l'impiego dei ODhbt esteri, mentre nel caso dell'arginina e dell'istidina il gruppo carbossilico è stato attivato tramite il PyBop in presenza di diisopropiletilammina, con tempi di reazione di tre ore. Per garantire i rendimenti di reazione i più alti possibili, si usa in ciascun caso un eccesso di cinque equivalenti di Fmoc-ammino acido. I tempi delle reazioni di deprotezione e di condensazione sono determinati automaticamente dal sintetizzatore; solo nel caso dell'attivazione con PyBop è l'operatore che sceglie i tempi di acilazione.
Per staccare il peptide dal supporto solido e rimuovere contemporaneamente tutti i gruppi protettivi si esegue un'acidolisi con acido trifluoroacetico in presenza del 5% di anisolo e dell' 1 % di etanditiolo.
I polipeptidi grezzi così ottenuti vengono purificati mediante HPLC semipreparativa in fase inversa, utilizzando una colonna (250 x 10 mm) riempita con Source TM 15 RPC (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Svezia). I polipeptidi sono eluiti con un gradiente lineare dallo 0% al 60% di acetonitrile in TFA acquoso allo 0,1%, ad una velocità di flusso di 5 ml/min e rilevamento a 226 nm; vengono caricati 10-15 mg di prodotto per corsa.
Le frazioni principali vengono raccolte e liofilizzate.
I polipeptidi purificati sono caratterizzati mediante analisi degli ammino acidi e spettrometria di massa electrospray con un apparecchio Finnigan Mat mod. LCQ.
Sono comprese nella presente invenzione anche le composizioni farmaceutiche comprendenti i polipeptidi in questione oppure un loro sale non tossico, in miscela con un opportuno diluente o veicolo.
Gli esempi che seguono servono ad illustrare l'invenzione senza tuttavia limitarla.
Esempio 1
500 mg (0,1 mmoli) di Fmoc- Ala-resina sono sospesi in 20 ml di DMF e dopo 2 ore introdotti nella colonna di reazione.
L'Fmoc-ammino acido-resina viene quindi sottoposto ai seguenti trattamenti', a) lavaggi con DMF; b) rimozione del Fmoc mediane trattamento con una soluzione al 20% di piperidina in DMF; c) lavaggi con DMF; d) condensazione con l'appropriato Fmoc-amino acido estere attivo (5 equivalenti) in presenza di N-idrossi-benzotriazolo (5 equivalènti) come catalizzatore, con l'aggiunta di un colorante anionico (Novachrome, Calbiochem-Novabiochem AG, Laufelfmgen, Svizzera) per il' monitoraggio automatico del tempo della reazione.
Solo nel caso della Fmoc-Arg(Pbf) e della Fmoc-His(Trt) l’attivazione del carbossile viene effettuata con il PyBop, senza aggiunta di colorante.
Questo ciclo di operazioni viene ripetuto trentotto volte con l'appropriato Fmoc-ammino acido in modo da ottenere alla fine il nonatriacontapeptide-resina protetto. Il prodotto viene quindi posto in un imbuto di vetro sinterizzato e lavato nell'ordine con DMF, alcol terz-amilico, acido acetico, alcol terz-amilico, cloruro di metilene ed etere etilico. Dopo essiccamento sotto vuoto, si ottengono 760 mg di nonatriacontapeptide-resina protetto.
Esempio 2
His-Thr-His-Gln-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Thr-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys(tBu)-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala (nonatriacontapeptide I).
760 mg di nonatriacontapeptide-resina protetto vengono sospesi in 141 ml di TFA ed aggiunti 7,5 ml di anisolo e 1,5 ml di etanditiolo e si lascia reagire per 2 ore con occasionale agitazione. Dopo filtrazione sotto vuoto, la resina viene lavata con TFA (2 x 50 mi). Il filtrato viene addizionato di etere etilico anidro per far precipitare il polipeptide. Si filtra il prodotto, si lava più volte con etere etilico anidro ed infine si essicca sotto vuoto su KOH.
Il nonatriacontapeptide I viene purificato mediante HPLC semipreparativa come descritto precedentemente, ottenendo 195 mg di nonatriacontapeptide puro, [a] -43,0°(c = 0,5, acqua). Spettro di massa: picco molecolare (M+1) = 4376 Da.
Analisi degli ammino acidi: Asp = 3,1(3); Thr = 1,98(2); Ser = 0,99(1); Glu = 5,2(5); Pro = 1,8(2); Gly = 3,95(4); Ala = 3,98(4); Cys = 1,1(1); Val = 1,97(2); Met - 0,96(1); Ile = 1,2(2); Leu - 4,2(4); Phe = 2,98(3); His = 3,1(3); Arg = 2,96(3).
Esempio 3
Val-Gly-Leu-Ser(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Ala-Phe-Leu-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Leu-Gln-Asp(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ile-Val-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-GIy-Ser(tBu)-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys(Boc)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-Leu-Ser(tBu)-Pro-Ser(tBu)-Trp(Boc)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Leu-Phe-Ser(tBu)-Gly-resina.
770 mg (0,1 mmoli) di Fmoc-Gly-resina vengono sospesi in 30 ml di DMF e dopo due ore introdotti nella colonna di reazione. Le operazioni descritte nell'esempio 1 sono quindi ripetute per quarantanove volte, utilizzando ad ogni ciclo rFmoc-ammino acido appropriato.
Anche in questa sintesi per l'attivazione dei gruppi carbossilici della Fmoc-Arg(Pbf) e della Fmoc-His(Trt) viene impiegato il PyBop, per quelli della Fmoc-Ser(tBu) e della Fmoc-Thr(tBu) il Dhbt estere, mentre per tutti gli altri Fmoc-ammino acidi è usato il Pfp estere. Dopo aver assemblato tutti gli ammino acidi, il prodotto viene lavato come detto neH'esempio 1, ed essiccato sotto vuoto. Si ottengono 1200 mg di pentacontapeptide-resina protetto.
Esempio 4
Val-Gly-Leu-Ser-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Gly-Ser-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Trp-Asp-Ser-Leu-Phe-Ser-Gly (pentacontapeptide II).
1200 mg di pentacontapeptide-resina protetto sono trattati con 188 ml di TFA, con 10 ml di anisolo e con 2 ml di etanditiolo. Quindi si procede come descrito nell'esempio 2. Si ottengono 140 mg di pentacontapeptide puro.
[et] -12,5°(c=0,04, acqua). Spettro di massa: picco molecolare (M+1) = 5514 Da.
Analisi degli ammino acidi: Asp = 4,89(5); Thr = 1,02(1); Ser = 8,91(9); Glu = 1,97(2); Pro = 2,1(2); Gly = 3,91(4); Ala = 1,97(2); Val = 4,88(5); Ile = 2,0(2); Leu = 6,87(7); Tyr = 1,11(1); Phe = 3,2(3); Lys = 0,97(1); Arg = 4,88(5); Trp = 0,96(1).
Esempio 5
Ser(tBu)-Gln-Gly-Gln-Val-Gln-Pro-Gly-Ala-Arg(Pbf)-Ile-Phe-Ser(tBu)-Phe-Asp(OtBu)-Gly-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)- Vai-Leu- Arg(Pbf)-His(Trt)-Pro- Ala-Trp(Boc)-Pro-Gln-Lys(Boc)-Ser(tBu)-Val-Trp(Boc)-His(Trt)-Gly-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Pro-Ser(tBu)-Gly-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Leu-Met-Glu(OtBu)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-resina.
555 mg (0,1 mmoli) di Fmoc-Tyr(tBu)-resina sono sospesi in 25 ml di DMF e dopo 2 ore introdotti nella colonna di reazione. Quindi viene ripetuto per quarantaquattro volte il ciclo delle operazioni descritto nell'esempio 1, impiegando ad ogni ciclo l'appropriato Fmoc-ammino acido opportunamente attivato, nell'ordine indicato dalla sequenza sopra riportata. Il pentatetracontapeptide-resina protetto, preparato in questo modo, viene lavato con i soliti solventi (vedere esempio 1) ed essiccato sotto vuoto.
Resa: 808 mg.
Esempio 6
Ser-Gln-Gly-Gln-Val-Gln-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Arg-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Ala-Trp-Pro-Gln-Lys-Sèr-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Ser-Gly-Arg-Arg-Leu-Met-Glu-Ser-Tyr (pentatetracontapeptide III).
888 mg di pentatetracontapeptide-resina protetto sono sospesi in 141 mi di TFA a cui erano stati aggiunti 7,5 ml di anisolo e 1,5 ml di etanditiolo. Indi si segue la procedura indicata nell'esempio 2 e si ottengono 98 mg di pentatetracontapeptide. Ili puro.
[a] -60,5°(c=0,06, acqua). Spettro di massa: picco molecolare (M+1) = 5125 Da.
Analisi degli ammino acidi: Asp = 3,04(3); Ser = 5,88(6); Glu = 4,91(5); Pro = 3,93(4); Gly = 5,05(5); Ala = 2,07(2); Val = 2,89(3); Met = 0,91(1); Ile = 0,95(1); Leu = 1,93(2); Tyr = 0,93(1); Phe = 2,11(2); Lys = 0,97(1); His = 1,89(2); Arg = 4,84(5); Trp = 2,03(2).
Esempio 7
Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Gly-Ala-Thr(tBu)-Gly-Gln-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Leu-Leu-Ser(tBu)-Gly-Arg(Pbf)-Leu-Leu-Glu(OtBu)-Gln-Lys(Boc)-Ala-Ala-Ser(tBu)-Cys(Trt)-His(Trt)-Asn-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Ile-Val-Leu-Cys(tBu)-Ile-Glu(OtBu)-Asn-Ser(tBu)-Phe-Met-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Lys(Boc)-resina.
770 mg (0,1 mmoli) di Fmoc-Lys(Boc)-resina sono sospesi in 30 ml di DMF e dopo 2 ore introdotti nella colonna di reazione. Tutti gli altri Fmocammino acidi vengono assemblati nell'ordine indicato nella succitata sequenza, utilizzando per ciascuno il ciclo di operazioni riportate nell'esempio 1. Si ottengono 1340 mg di pentacontapeptide-resina protetto.
Esempio 8
Cys- Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu-Thr-Thr-Gly-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-SerSer-Leu-Leu-Ser-Gly-Arg-Leu-Leu-Glu-Gln-Lys-Ala-Ala-Ser-Cys-His-Asn-Ser-Tyr-Ile-Val-Leu-Cys(tBu)-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ser-Phe-Ser-Lys (pentacontapeptide IV).
1340 mg di pentacontapeptide-resina protetto vengono trattati con una miscela di 188 ml di TFA, 10 ml di anisolo e 2 ml di etanditiolo. Quindi si procede come descritto all'esempio 2, ottenendo 342 mg di pentacontapeptide IV.
335 mg di tale peptide sono disciolti in 300 ml di metanolo al 75% e quindi aggiunta goccia a goccia e sotto agitazione una soluzione di 25 mg di iodio in 80 ml di metanolo al 75%. Dopo aver fatto reagire la miscela per 3 ore a temperatura ambiente, si aggiunge una soluzione di acido ascorbico al 10% fino a completa decolorazione dello iodio. Il metanolo è evaporato completamente sotto vuoto e la soluzione acquosa che rimane viene liofilizzata. Il peptide grezzo così ottenuto viene infine purificato mediante HPLC semipreparativa, nelle condizioni descritte precedentemente. Si ottengono 67 mg di pentacontapeptide puro.
[a] -14,5°(c=0,2, acido acetico 80%).
Spettro di massa: picco molecolare (M+1) = 5502 Da.
Analisi degli ammino acidi: Asp = 2,03(2); Thr = 5,87(6); Ser = 7,79(8); Glu = 6,03(6); Gly = 2,87(3); Ala = 4,04(4); Cys = 2,86(3); Val = 0,97(1); Met = 0,89(1); Ile = 2,11(2); Leu = 4,92(5); Tyr = 1,05(1); Phe = 2,11(2); Lys = 1,93(2); His = 1,04(1); Arg = 1,87(2); Trp = 0,93(1).

Claims (10)

  1. RIVENDICAZIONI 1 . Polipeptidi comprendenti da dieci a sessanta ammino acidi con sequenza corrispondente od omologa a quella dell'endostatina, dotati di attività antiangiogenica.
  2. 2. Come polipeptide secondo la rivendicazione 1, il nonatriacontapeptide I, di sequenza His-Thr-His-Gln-Asp-Phe-Gln-Pro-Val-Leu-His-Leu-Val-Ala-Leu-Asn-Thr-Pro-Leu-Ser-Gly-Gly-Met-Arg-Gly-Ile-Arg-Gly-Ala-Asp-Phe-Gln-Cys(tBu)-Phe-Gln-Gln-Ala-Arg-Ala.
  3. 3. Come polipeptide secondo la rivendicazione 1, il pentacontapeptide II, di sequenza Val-Gly-Leu-Ser-Gly-Thr-Phe-Arg-Ala-Phe-Leu-Ser-Ser-Arg-Leu-Gln-Asp-Leu-Tyr-Ser-Ile-Val-Arg-Arg-Ala-Asp-Arg-Gly-Ser-Val-Pro-Ile-Val-Asn-Leu-Lys-Asp-Glu-Val-Leu-Ser-Pro-Ser-Trp-Asp-Ser-Leu-Phe-Ser-GIy.
  4. 4. Come polipeptide secondo la rivendicazione 1 , il pentatetracontapeptide III, di sequenza Ser-Gln-Gly-Gln-Val-Gln-Pro-Gly-Ala-Arg-Ile-Phe-Ser-Phe-Asp-Gly-Arg-Asp-Val-Leu-Arg-His-Pro-Ala-Trp-Pro-Gln-Lys-Ser-Val-Trp-His-Gly-Ser-Asp-Pro-Ser-Gly-Arg-Arg-Leu-Met-Glu-Ser-Tyr.
  5. 5. Come polipeptide secondo la rivendicazione 1, il pentacontapeptide IV, di sequenza Cys-Glu-Thr-Trp-Arg-Thr-Glu.-Thr-Thr-Gly-Ala-Thr-Gly-Gln-Ala-Ser-Ser-Leu-Leu-Ser-Gly-Arg-Leu-Leu-Glu-Gln-Lys-Ala-Ala-Ser-Cys-His-Asn-Ser-Tyr-Ile-Val-Leu-Cys(tBu)-Ile-Glu-Asn-Ser-Phe-Met-Thr-Ser-Phe-Ser-Lys.
  6. 6. Procedimento per la preparazione dei polipeptidi secondo le rivendicazioni 1-5 mediante sintesi in fase solida.
  7. 7. Procedimento secondo la rivendicazione 6, caratterizzata dal fatto che s'impiega un sintetizzatore automatico.
  8. 8. Formulazioni farmaceutiche ad attività antiangiogenica, costituite da uno o più polipeptidi secondo le rivendicazioni 1-5.
  9. 9. Formulazioni farmaceutiche ad attività antiangiogenica, contenenti in qualità di principio attivo uno o più polipeptidi secondo le rivendicazioni 1-5, eventualmente in associazione con altri principi attivi.
  10. 10. Uso dei polipeptidi secondo le rivendicazioni 1-5 per la produzione di farmaci ad attività antiangiogenica.
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