JP2002544124A - 抗血管新生活性を示すエンドスタチン由来のポリペプチド - Google Patents

抗血管新生活性を示すエンドスタチン由来のポリペプチド

Info

Publication number
JP2002544124A
JP2002544124A JP2000612335A JP2000612335A JP2002544124A JP 2002544124 A JP2002544124 A JP 2002544124A JP 2000612335 A JP2000612335 A JP 2000612335A JP 2000612335 A JP2000612335 A JP 2000612335A JP 2002544124 A JP2002544124 A JP 2002544124A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
endostatin
angiogenesis
sequence
following formula
angiogenic activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000612335A
Other languages
English (en)
Inventor
チレッミ，フランチェスコ
フランチェスカト，ピエランジェロ
ジッチェ，マリナ
Original Assignee
ユニーバーシタ’ デグリ ストゥディ ディ ミラノ
ユニバーシタ’ デグリ ストゥディ ディ フィレンツェ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニーバーシタ’ デグリ ストゥディ ディ ミラノ, ユニバーシタ’ デグリ ストゥディ ディ フィレンツェ filed Critical ユニーバーシタ’ デグリ ストゥディ ディ ミラノ
Publication of JP2002544124A publication Critical patent/JP2002544124A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

(57)【要約】 エンドスタチンの配列に一致する配列またはエンドスタチンの配列に相同な配列を持ち、血管新生に対して阻害活性を有するポリペプチドは、血管新生依存性腫瘍の処置に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】
本発明は抗血管新生活性を持つポリペプチドに関する。
【０００１】 ［技術的背景］ 血管新生、すなわち既存の血管からの新しい毛細管の伸長は、腫瘍の成長およ
び転移を含む生理学的および病理学的状態にとって不可欠である（1〜3）。血管
新生は内皮細胞の増殖、遊走および分化、細胞外マトリックスの分解、微細管形
成および新しい毛細管分枝の発芽を含む複雑な多段階過程である（3、4）。
【０００２】 エンドスタチンは、インビトロで内皮増殖を特異的に阻害し、インビボで血管
新生および腫瘍成長を強力に阻害するコラーゲンＸＶＩＩＩの22kDa C-末端断片
(end fragmente)である（5）。大腸菌で発現させたリフォールディングしていな
い沈殿タンパク質を全身投与すると、マウスにおける実験腫瘍の退縮が起こった
（5、6）。本発明者らは、線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2）および血管内皮増殖
因子（VEGF）によって誘導される微小血管内皮細胞の増殖および遊走を、大腸菌
発現系によって産生されるヒト完全長エンドスタチンが遮断できることを報告し
た（7）。
【０００３】 大量のエンドスタチンを製造することは困難だろう。したがって、エンドスタ
チンとの配列相同性を有し、生物学的活性を持つ、エンドスタチンより小さい分
子を利用できることは、有益であり得る。
【０００４】 本発明は、エンドスタチンの配列に一致する配列またはエンドスタチンの配列
に相同な配列を持つ10〜60アミノ酸残基からなり、血管新生阻害活性を有し、血
管新生依存性腫瘍の処置に有用なポリペプチドに関する。
【０００５】 また、本発明は前記ポリペプチドの製造方法に関する。 さらに、本発明は１つ若しくは複数の前記ポリペプチドを含有する医薬製剤に
関する。
【０００６】 エンドスタチンはJ．FolkmanとM．O'Reilly（EP 0 857 210）によって単離さ
れた抗血管新生活性を有するタンパク質である。 本発明に従って製造されるポリペプチドの例を以下に挙げる。 （Ｉ）ノナトリアコンタペプチド：
【０００７】
【化５】 （ＩＩ）ペンタコンタペプチド：
【０００８】
【化６】 （ＩＩＩ）ペンタテトラコンタペプチド：
【０００９】
【化７】 （ＩＶ）ペンタコンタペプチド：
【００１０】
【化８】 これらのポリペプチドは内皮細胞の増殖および遊走に対するインビトロ阻害試
験で顕著な抗血管新生活性を有する（16）。特にノナトリアコンタペプチドＩは
エンドスタチンと等効力であることが判明した。
【００１１】 本発明のポリペプチドの製造方法はペプチド合成に使用される以下の一般的方
法および反応に基づく。 アミノ酸のアミノ基は、9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc）、tert-
ブトキシカルボニル（Boc）、ベンジルオキシカルボニル（Z）、トリチル（Trt
）基およびペプチド化学で一般に使用される他の基を使って保護することができ
る。
【００１２】 カルボキシル基はtert-ブチルエステル、ベンジルエステル、p-メトキシベン
ジルエステルとして保護するか、前記目的に通常使用される他の方法で保護する
ことができる。
【００１３】 これらの保護基は実施例で詳しく説明するように、状況に応じて例えばトリフ
ルオロ酢酸、無水フッ化水素酸、ピペリジン等で処理するなど、文献既知の方法
に従って除去できる。
【００１４】 アミノ酸は、ペンタフルオロフェニルエステル（OPfp）、3-ヒドロキシ-4-オ
キソ-3,4-ジヒドロ-1,2,3-ベンゾトリアジンエステル（ODhbT）などの活性エス
テルを使用するか、六フッ化リン酸ベンゾトリアゾール-1-イルオキシトリスピ
ロリジノホスホニウム（PyBop）、四フッ化ホウ酸2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-
イル-1,1,3,3-テトラメチル)ウロニウム（TBTU）などのカルボキシ活性化剤およ
びこのタイプの反応に通常使用される他の活性化剤を使用して、縮合することが
できる。
【００１５】 本発明に記載するポリペプチドの精製も、例えば逆相HPLC、ゲル濾過、イオン
交換クロマトグラフィーおよび分取電気泳動などといった既知のタンパク質化学
技術に従って行なうことができる。
【００１６】 例えば、本発明の方法は、固相ペプチド合成法と、Novabiochem社（英国ノッ
ティンガム）の自動合成装置「Biolynx plusモデル4170」を使って、以下のよう
に行なうことができる（17）。
【００１７】 アミノ酸中のα-アミノ基の保護は9-フルオレニルメトキシカルボニル（Fmoc
）を使って行なわれる。アミノ酸側鎖の官能基は次の保護基を使って保護する：
アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニンおよびチロシンにはtert-
ブチル；リジンおよびトリプトファンにはtert-ブトキシカルボニル；ヒスチジ
ンにはトリチル；アルギニンには2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン
-5-スルホニル；ポリペプチドＩのシステインおよびポリペプチドＩＶの第3シス
テインにはtert-ブチル；ポリペプチドＩＶの他の2つのシステインにはトリチル
。
【００１８】 一般に、合成はポリスチレンマトリックスにグラフトされたポリエチレンオキ
シドを4-ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸残基で官能化してなる樹脂にエステル
結合によって取り付けられたC末端Fmoc-アミノ酸から出発して段階的に行なわれ
る（18）。Fmocはピペリジンのジメチルホルムアミド（DMF）溶液を使って除去
される。一般に縮合反応にはFmocアミノ酸のペンタフルオロフェニルエステルが
使用される。セリンおよびスレオニンの場合はODhbtエステルを使用することが
好ましく、一方、アルギニンおよびヒスチジンの場合はカルボキシル基をジイソ
プロピルエチルアミンの存在下にPyBopで活性化し、反応時間を3時間とした。反
応収率を最大にするために、5等量過剰のFmoc-アミノ酸を使用する。脱保護反応
と縮合反応の時間は合成装置が自動的に決定するので、技術者がアシル化時間を
選択するのはPyBopによる活性化の場合だけになるだろう。
【００１９】 ペプチドは、5％アニソールおよび1％エタンジチオールの存在下にトリフルオ
ロ酢酸を使って酸分解することにより、全ての保護基を除去すると同時に、樹脂
から切り離される。
【００２０】 得られた粗製ポリペプチドは、Source（商標）15 RPC（Pharmacia Biotech AB
、スウェーデン・ウプサラ）を充填したカラム（250×10mm）を用いる逆相セミ
分取HPLCによって精製される。ポリペプチドは、0.1％TFA水溶液中0％から60％
へのアセトニトリルの直線勾配によって5ml/分の流速で溶出し、226nmで検出す
る。1回あたり10〜15mgの生成物を負荷する。
【００２１】 主要画分を集め、凍結乾燥する。 精製したポリペプチドはアミノ酸分析とFinnigan Mat LCQ装置を使ったエレク
トロスプレー質量分析によって特徴づける。
【００２２】 また、本発明は、適切な希釈剤または担体と混合された本発明のポリペプチド
またはその無毒性塩を含む医薬組成物に関する。
【００２３】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をさらに説明するが、下記の実施例は本発明を
限定するものではない。
【００２４】 ［実施例１］
【００２５】
【化９】 500mg（0.1ミリモル）のFmoc-Ala-樹脂を20mlのDMFに懸濁し、2時間後に反応
カラムに充填した。
【００２６】 次いで、そのFmoc-アミノ酸樹脂に以下の処理を施した：ａ）DMFで洗浄、ｂ）
20％ピペリジン/DMF溶液で処理することによってFmocを除去、ｃ）DMFで洗浄、
ｄ）触媒としてのN-ヒドロキシベンゾトリアゾール（5等量）の存在下に、反応
時間を自動でモニターするための陰イオン色素（Novachrome、Calbiochem-Novab
iochem AG、スイス・ラウフェルフィンゲン）を添加して、適切なFmoc-アミノ酸
活性エステル（5等量）と縮合した。
【００２７】 Fmoc-Arg(Pbf)およびFmoc-His(Trt)の場合に限り、色素を添加せずにPyBopを
用いてカルボキシルを活性化した。 適切なFmoc-アミノ酸を使ってこの操作サイクルを38回繰返し、最終的に、保
護された樹脂-ノナトリアコンタペプチドを得た。次にその生成物を焼結ガラス
漏斗に入れ、DMF、tert-アミルアルコール、酢酸、tert-アミルアルコール、塩
化メチレンおよびエチルエーテルで順次洗浄した。減圧乾燥の後、保護された樹
脂-ノナトリアコンタペプチド760mgを得た。
【００２８】 ［実施例２］
【００２９】
【化１０】 保護された樹脂-ノナトリアコンタペプチド760mgを141mlのTFAに懸濁し、7.5m
lのアニソールおよび1.5mlのエタンジチオールを加え、その混合物を時々撹拌し
ながら2時間反応させた。減圧濾過後、樹脂をTFA（50ml×2）で洗浄した。ろ液
に乾燥エチルエーテルを加えてポリペプチドを沈殿させた。生成物をろ過し、乾
燥エチルエーテルで繰返し洗浄し、最終的にKOH上で減圧乾燥した。
【００３０】 ノナトリアコンタペプチドＩをセミ分取HPLCで上述のように精製して195mgの
純粋なノナトリアコンタペプチドを得た。［α］−43.0°（ｃ＝0.5，水）。質
量スペクトル：分子ピーク（M＋1）＝4376Da。アミノ酸分析：Asp＝3.1（3）；T
hr＝1.98（2）；Ser＝0.99（1）；Glu＝5.2（5）；Pro＝1.8（2）；Gly＝3.95（
4）；Ala＝3.98（4）；Cys＝1.1（1）；Val＝1.97（2）；Met＝0.96（1）；Ile
＝1.2（2）；Leu＝4.2（4）；Phe＝2.98（3）；His＝3.1（3）；Arg＝2.96（3）
。
【００３１】 ［実施例３］
【００３２】
【化１１】 770mg（0.1ミリモル）のFmoc-Gly-樹脂を30mlのDMFに懸濁し、2時間後に反応
カラムに充填した。次に、各段階に適切なFmoc-アミノ酸を用いて、実施例1に記
載の操作を49回繰返した。
【００３３】 この合成でもFmoc-Arg(Pbf）カルボキシル基およびFmoc-His(Trt)カルボキシ
ル基はPyBopで活性化し、Fmoc-Ser(tBu)およびFmoc-Thr(tBu)のカルボキシル基
はDhbtエステルで活性化したが、他のFmoc-アミノ酸にはいずれもPfpエステルを
使用した。全てのアミノ酸を取り付けた後、実施例1に記載のように生成物を洗
浄し、減圧乾燥した。1200mgの保護された樹脂-ペンタコンタペプチドを得た。
【００３４】 ［実施例４］
【００３５】
【化１２】 1200mgの保護された樹脂-ペンタコンタペプチドを188mlのTFA、10mlのアニソ
ールおよび2mlのエタンジチオールで処理した。次に、実施例2に記載の手順に従
った。140mgの純粋なペンタコンタペプチドを得た。
【００３６】 ［α］−12.5°（ｃ＝0.04，水）。質量スペクトル：分子ピーク（M＋1）＝55
14 Da。アミノ酸分析：Asp＝4.89（5）；Thr＝1.02（1）；Ser＝8.91（9）；Glu
＝1.97（2）；Pro＝2.1（2）；Gly＝3.91（4）；Ala＝1.97（2）；Val＝4.88（5
）；Ile＝2.0（2）；Leu＝6.87（7）；Tyr＝1.11（1）；Phe＝3.2（3）；Lys＝0
.97（1）；Arg＝4.88（5）；Trp＝0.96（1）。
【００３７】 ［実施例５］
【００３８】
【化１３】 555mg（0.1ミリモル）のFmoc-Tyr(tBu)-樹脂を25mlのDMFに懸濁し、2時間後に
それらを反応カラムに充填した。次に、適切に活性化されたFmoc-アミノ酸を各
段階に使用して、前記の配列に示した順序で、実施例1に記載の操作サイクルを4
4回繰返した。このようにして製造した保護された樹脂-ペンタテトラコンタペプ
チドを通常の溶媒（実施例1参照）で洗浄し、減圧乾燥した。
【００３９】 収量：808mg ［実施例６］
【００４０】
【化１４】 7.5mlのアニソールおよび1.5mlのエタンジチオールを予め加えておいた141ml
のTFAに、888mgの保護された樹脂-ペンタテトラコンタペプチドを懸濁した。次
に、実施例2に記載の手順に従って98mgの純粋なペンタテトラコンタペプチドＩ
ＩＩを得た。
【００４１】 ［α］−60.5°（ｃ＝0.06，水）。質量スペクトル：分子ピーク（M＋1）＝51
25Da。アミノ酸分析：Asp＝3.04（3）；Ser＝5.88（6）；Glu＝4.91（5）；Pro
＝3.93（4）；Gly＝5.05（5）；Ala＝2.07（2）；Val＝2.89（3）；Met＝0.91（
1）；Ile＝0.95（1）；Leu＝1.93（2）；Tyr＝0.93（1）；Phe＝2.11（2）；Lys
＝0.97（1）；His＝1.89（2）；Arg＝4.84（5）；Trp＝2.03（2）。
【００４２】 ［実施例７］
【００４３】
【化１５】 770mg（0.1ミリモル）のFmoc-Lys(Boc)-樹脂を30mlのDMFに懸濁し、2時間後に
反応カラムに充填した。前記の配列に示した順序で、そのそれぞれに実施例1に
記載の操作サイクルを使用して、他の全てのFmoc-アミノ酸を取り付けた。1340m
gの保護された樹脂-ペンタコンタペプチドを得た。
【００４４】 ［実施例８］
【００４５】
【化１６】 188mgのTFA、10mlのアニソールおよび2mlのエタンジチオールの混合物で、134
0mgの保護された樹脂-ペンタコンタペプチドを処理した。次に、実施例2に記載
の操作サイクルを繰返して342mgのペンタコンタペプチドＩＶを得た。
【００４６】 前記のペプチド335mgを300mlの75％メタノールに溶解し、75％メタノール80ml
に溶解したヨウ素25mgを撹拌しながら滴下した。その混合物を室温で3時間反応
させた後、10％アスコルビン酸溶液をヨウ素が完全に脱色するまで加えた。減圧
下でメタノールを完全に留去し、残った水溶液を凍結乾燥した。得られた粗製ペ
プチドをセミ分取HPLCにより、前記の条件で最終的に精製した。67mgの純粋なペ
ンタコンタペプチドを得た。
【００４７】 ［α］−14.5°（ｃ＝0.2，酢酸80％）。 質量スペクトル：分子ピーク（M＋1）＝5502Da。アミノ酸分析：Asp＝2.03（2
）；Thr＝5.87（6）；Ser＝7.79（8）；Glu＝6.03（6）；Gly＝2.87（3）；Ala
＝4.04（4）；Cys＝2.86（3）；Val＝0.97（1）；Met＝0.89（1）；Ile＝2.11（
2）；Leu＝4.92（5）；Tyr＝1.05（1）；Phe＝2.11（2）；Lys＝1.93（2）；His
＝1.04（1）；Arg＝1.87（2）；Trp＝0.93（1）。
【００４８】 下記の実験例に本発明ポリペプチドの生物学的活性を例示する。 ［薬理学的アッセイ］ （細胞株および培養条件） 冠状細静脈内皮細胞（CVEC）は先行文献に記載されているように単離し培養し
た（8）。
【００４９】 BALB/cマウス大動脈内皮22106細胞（MAE）は先行文献に記載されているように
生育した（9）。 ウシ大動脈平滑筋細胞（BASM）は先行文献に記載されているように単離し生育
した（10）。
【００５０】 線維芽細胞NIH-3T3およびA-431細胞はアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン（メリーランド州ロックビル）から入手し、生産者の説明書に従って生育した
。
【００５１】 （細胞毒性） ペプチドの細胞毒作用はトリパンブルー排除法によって調べた（11）。 （遊走アッセイ） 細胞遊走は、先行文献に記載されているように48ウェルマイクロケモタキシス
チャンバー（NeuroProbe、Biomap、イタリア・ミラノ）を使用しポリカーボネー
トフィルターでアッセイした（12、13）。
【００５２】 （ゼラチンザイモグラフィー） 先行文献に記載されているように、試験化合物に24時間ばく露した細胞から得
た調整培地を、1mg/mlのゼラチンを含有するSDS-PAGEでの電気泳動にかけた（14
）。ゼラチナーゼ活性をバンドの定量的デンシトメトリーによって評価した。
【００５３】 （増殖試験） 先行文献に報告されているように、細胞増殖を総細胞数によって定量した（12
、13）。
【００５４】 （in vitro 血管発芽） マウス大動脈リングからの血管発芽を、Brownら（15）が記載している方法に
従い、これにわずかな変更を加えて、三次元フィブリンゲル調製物中でアッセイ
した。新たに形成された構造の定量的評価を3日目に行なった。血管新芽によっ
て覆われた領域を顕微鏡的単位（0.21mm2）で定量した。
【００５５】 （in vivo 血管新生：ウサギ角膜アッセイ） 先行文献に記載されているようにアルビノウサギの角膜で血管新生を調べた（
11、12、13）。
【００５６】 ［結果］ （培養細胞に対する細胞毒効力） 内皮細胞株および非内皮細胞株（後者は腫瘍および非新生支質細胞株を含む）
を使用した。細胞毒性を評価するために、全ての細胞懸濁液を37℃で30分間、10
および300ng/mlのペプチドにばく露した。トリパンブルー排除試験では細胞死の
有意な増加は検出されなかった。
【００５７】 （内皮細胞遊走に対する効力） 48ウェルマイクロケモタキシスチャンバーで細胞遊走を評価した。全てのペプ
チドが、FGF-2およびVEGFによって誘発される遊走を阻害し、濃度によって異な
る効力を示した。10ng/mlの濃度で各断片が発揮する阻害作用の一例を図1A〜Bに
示す。驚いたことに、本エンドスタチンペプチドは非刺激細胞の内皮細胞遊走を
誘導することができた。
【００５８】 （金属プロテアーゼ活性に対する効力） ゼラチンザイモグラフィーでは、本エンドスタチンペプチドで処理した内皮細
胞の調整培地に、基礎金属プロテアーゼ活性および刺激金属プロテアーゼ活性の
変化は検出されなかった。
【００５９】 （細胞増殖に対する効力） 48時間処理後の細胞の総数を数えることによって細胞増殖を定量した。後毛細
血管細静脈から単離した内皮細胞を使用して、血管新生に対する作用を試験した
。1〜1000ng/mlの濃度で試験した場合、本エンドスタチン断片は増殖を阻害しな
かったが、10〜1000ng/mlの濃度で試験した場合、本末端断片（end fragments）
はFGF-2およびVEGFによって誘導される細胞成長を阻害することができた。この
作用はFGF-2が誘導する成長に対して、より顕著だった。興味深いことに、断片
ＩＶが最も強力に内皮細胞増殖を阻害した（図1C〜D）。試験した全ての内皮細
胞株で同様の作用が得られた（図1E参照）。
【００６０】 内皮に対するペプチドの選択性を、血管および非血管由来の非内皮細胞株なら
びに様々な供給源（マウスおよびヒト）から得た腫瘍細胞で評価した。非内皮細
胞はエンドスタチンペプチドによる影響を受けなかった（図2参照）。
【００６１】 （in vitro 血管新生に対する効力） 3Dフィブリンゲル中で培養した血管リングにおける毛細血管様構造の形成を使
ってインビトロ血管新生を調べた。断片ＩおよびＩＶは、毛細血管の自発的成長
ならびにFGF-2およびVEGFによって誘導される成長を阻害した。一例として濃度1
00ng/mlの各断片の作用を示す（図3A）。
【００６２】 （in vivo 血管新生に対する効力） インビボでのエンドスタチン断片の血管新生抑制作用を、無血管ウサギ角膜ア
ッセイで評価した。VEGFは角膜支質の新生血管形成を効率よく持続的に誘導した
。エンドスタチン断片の存在下でVEGFを試験した場合、血管新生の阻害が一貫し
て起こった。断片ＩおよびＩＶが200ng/ペレットで発揮する作用の一例を図3Bに
示す。単独の薬剤として試験した場合、これらのペプチドは目立った炎症誘発性
を示さなかった。
【００６３】 （組換え完全長エンドスタチンとの比較） エンドスタチン断片の作用を、M．Rehn博士（ラホーヤ癌研究センター；米国
ラホーヤ）によって製造された組換えヒト完全長エンドスタチンと比較した。
【００６４】 驚いたことに、エンドスタチンペプチドは、VEGFによって誘導される血管新生
を完全長エンドスタチンより効率よく阻害した（図3B参照）。 ［結論］ 試験したペプチドはインビトロおよびインビボで強力かつ直接的な抗血管新生
作用を発揮する。本ペプチドは血管新生因子によって誘導される内皮細胞の成長
および遊走を選択的に阻害することによって作用する。エンドスタチンペプチド
は、完全長エンドスタチンより効率よくインビボ血管新生を阻害した。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 内皮細胞の遊走（A、B）および増殖（C〜E）に対するエンドスタチン断片の作
用。 A，B：NeuroProbeマイクロケモタキシスチャンバーの下側の区画に入っている
血管新生因子（それぞれ20ng/ml）に、断片（10ng/ml）を加えた。インキュベー
ションを4時間行ない、遊走した細胞を顕微鏡で盲試験的に計数した。データは
、計数した総細胞数/ウェルとして表す。数値はそれぞれ三重に測定した6回の実
験の平均±SEMである。 C〜E：内皮細胞増殖に対するエンドスタチン断片の作用。内皮細胞（C、DはCV
EC、EはMAE）増殖をFGF-2およびVEGF（それぞれ20ng/ml）で刺激した。データは
、試験物質と共に48時間インキュベートした後に計数した細胞数/ウェルとして
表す。数値はCVECおよびMAEに関してそれぞれ6回および2回行なった実験（それ
ぞれ三重に測定）の平均±SEMである。 *FGF-2およびVEGF単独に対してP＜0.05（スチューデントのt検定）。
【図２】 非内皮細胞株に対するエンドスタチン断片の作用。ウシ大動脈平滑筋細胞（BA
SM、上図）、マウス線維芽細胞（NIH-3T3、中図）および腫瘍細胞（A431、下図
）の増殖を図2に示すように評価した。細胞成長を5％FCSで刺激した。断片を300
ng/mlの濃度で評価した。数値はそれぞれ三重に測定した2回の実験の平均±SEM
である。
【図３】 インビトロ血管新生（A）およびインビボ血管新生（B）に対するエンドスタチ
ン断片の作用。 A：マウス大動脈リングからのインビトロでの血管発芽を、FGF-2（10ng/ml）
によって誘導した。断片ＩおよびＩＶを100μg/mlの濃度で使用した。データは
刺激の3日後に細管様構造で占められている平均面積として報告する。数値はそ
れぞれ三重に測定した2回の実験のうち一方の代表的実験の平均である。 B：無血管ウサギ角膜モデルにおけるインビボ血管新生に対するエンドスタチ
ン断片の作用。エンドスタチン断片（200ng）または完全長エンドスタチン（3μ
g）をVEGF（200ng）と一緒に同じペレット調製物に組み込んだ。その血管新生活
性をVEGF単独の場合と比較した。データを経時的（日数）な血管新生スコアとし
て表す。データは5つの移植片の平均値である。
【参考文献】
1．Folkman J「癌疾患、血管疾患、リューマチ性疾患および他の疾患における
血管新生」Nature Medicine 1995；1:27-31． 2．Hanahan DおよびFolkman J「腫瘍形成中の血管新生スイッチのパターンお
よび出現機序」Cell 1996；86:353-364． 3．Folkman J「血管新生に関する研究の臨床的応用」N Engl J Med 1995；333
:1757-1763.2． 4．Risau W「血管新生の機序」Nature 1997；386:671-674． 5．0'Really MSら「エンドスタチン：血管新生および腫瘍成長の内因性阻害剤
」Cell 1997；88:277-285． 6．Boehm Tら「実験癌の抗血管新生療法は薬剤耐性の獲得を誘導しない」Natu
re 1997；390:404-407． 7．Taddei Lら「インビトロ血管新生に対する完全長ヒトエンドスタチンの阻
害作用」Biochem Biophys Res Commun 1999；263:340-345． 8．Schelling MEら「ウシ心臓由来の細静脈内皮細胞」Am J Physiol 1988，25
4，H1211-H1217． 9．Gualandris Aら「マウス内皮細胞における塩基性線維芽細胞増殖因子の過
剰発現：血管新生および血管増殖性疾患のオートクラインモデル」Cell Growth
Differ，1996，7:147-160． 10．Catalioto RMら「ラット血管平滑筋細胞でアンジオテンシンＩＩが誘導す
るプロスタグランジン放出およびDNA合成におけるカルシウムの役割」J．cardio
vascular Pharmacol．1996，27：195−200． 11．Presta Mら「プリン類似体6-メチルメルカプトプリンリボースは血管新生
過程の初期相および後期相を阻害する」Cancer Res．1999，59(10):2417-2424． 12．Ziche Mら「一酸化窒素はサブスタンスPによって促進されるインビボでの
血管新生ならびにインビトロでの内皮細胞の成長および遊走を媒介する」J Clin
Invest 1994；94，2036-2044． 13．Ziche Mら「一酸化窒素シンターゼは血管内皮増殖因子が誘導する血管新
生の下流に位置するが、塩基性線維芽細胞増殖因子が誘導する血管新生の下流に
は位置しない」J．Clin．Invest．1997；99，2625-2634． 14．Qian Xら「トロンボスポンジン-1は内皮細胞におけるマトリックスメタロ
プロテイナーゼ-9のアップレギュレーションによりインビトロで血管新生を調節
する」Exp Cell Res 1997，235，403-412． 15．Brown KJら「ヒト血管新生に関する新しいインビトロアッセイ」Lab．Inv
est．1996，75(4):539-555． 16．J．Folkman，0.C．HaudenschildおよびB.R．Zetter，Proc．Natl．Acad．
Sci．USA 76，5217，1979；M．Ziche，L．Morbidelli，S．DonniniおよびF．Led
da，J．Cardiovasc．Pharmacol.，26（Suppl．3），S284，1995． 17．A．DrylandおよびR.C．Sheppard，J．Chem．Soc.，Perkin 1，125，1986
． 18．E．Bayer，Angew．Chem.，103，117，1991．
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フランチェスカト，ピエランジェロ イタリア，ミラノ Ｉ−20122，７，ヴィ ア フェスタ デル ペルドノ (72)発明者 ジッチェ，マリナ イタリア，フィレンツェ Ｉ−50121，４， ピアッザ サン マルコ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA07 AA19 BA01 BA08 BA17 BA18 BA19 BA20 BA23 CA59 DA01 MA02 NA14 ZB212 ZB262 4H045 AA10 AA20 AA30 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 BA20 CA40 EA28 FA34 FA40 FA44 GA25

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 エンドスタチンの配列に一致する配列またはエンドスタチンの配列に相同な配
    列を持つ10〜60アミノ酸からなり、抗血管新生活性を有するポリペプチド。
  2. 【請求項２】 以下の式 【化１】 で表される配列を有するノナトリアコンタペプチドＩである、請求項１に記載の
    ポリペプチド。
  3. 【請求項３】 以下の式 【化２】 で表される配列を有するペンタコンタペプチドＩＩである請求項１に記載のポリ
    ペプチド。
  4. 【請求項４】 以下の式 【化３】 で表される配列を有するペンタテトラコンタペプチドＩＩＩである請求項１に記
    載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】 以下の式 【化４】 で表される配列を有するペンタコンタペプチドＩＶである請求項１に記載のペリ
    ペプチド。
  6. 【請求項６】 固相合成による、請求項１〜５に記載のポリペプチドの製造方法。
  7. 【請求項７】 自動合成装置を使用する、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 請求項１〜５に記載の何れか１つ若しくは複数のポリペプチドからなる抗血管
    新生活性を有する医薬製剤。
  9. 【請求項９】 活性成分として請求項１〜５に記載の１つ若しくは複数のポリペプチドを、必
    用に応じて他の活性成分と共に含有する、抗血管新生活性を有する医薬製剤。
  10. 【請求項１０】 抗血管新生活性を有する医薬を製造するための請求項１〜５に記載のポリペプ
    チドの使用。
JP2000612335A 1999-04-15 2000-04-11 抗血管新生活性を示すエンドスタチン由来のポリペプチド Pending JP2002544124A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT1999MI000777A IT1312077B1 (it) 1999-04-15 1999-04-15 Polipeptidi ad attivita' antiangiogenica.
IT99A000777 1999-04-15
PCT/EP2000/003236 WO2000063249A1 (en) 1999-04-15 2000-04-11 Polypeptides derived from endostatin exhibiting antiangiogenic activity

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2002544124A true JP2002544124A (ja) 2002-12-24

Family

ID=11382727

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000612335A Pending JP2002544124A (ja) 1999-04-15 2000-04-11 抗血管新生活性を示すエンドスタチン由来のポリペプチド

Country Status (8)

Country Link
US (1) US6921749B1 (ja)
EP (1) EP1169351A1 (ja)
JP (1) JP2002544124A (ja)
AU (1) AU4547300A (ja)
CA (1) CA2369961A1 (ja)
IT (1) IT1312077B1 (ja)
MX (1) MXPA01010302A (ja)
WO (1) WO2000063249A1 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1401480B1 (en) * 2001-02-22 2012-11-28 Novartis AG Viral vectors encoding endostatin in the treatment of ocular neovascularization
ITMI20010394A1 (it) * 2001-02-27 2002-08-27 Univ Degli Studi Milano Peptidi ad attivita' antiangiogenica
JP2007529410A (ja) 2003-08-29 2007-10-25 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 子宮内膜症を治療又は防止するためのペプチド
US7524811B2 (en) 2003-08-29 2009-04-28 Children's Medical Center Corporation Anti-angiogenic peptides from the N-terminus of endostatin
ITMI20040364A1 (it) * 2004-02-27 2004-05-27 Francesco Chillemi Peptidi ad attivita' antiangiogenica e antitumorale
CN110078811B (zh) * 2018-01-25 2022-02-11 中国医学科学院医药生物技术研究所 一种具有抗肿瘤活性的多肽imb-p1及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE69629826T2 (de) 1995-10-23 2004-07-01 Children's Medical Center Corp., Boston Therapeutische antiangiogenische zusammensetzungen und verfahren
KR20010015867A (ko) 1997-12-08 2001-02-26 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터 항-혈관형성 활성을 지니고 있는, 엔도스타틴의 변이체인＂ｅｍ 1＂ 및 이것을 사용하는 방법
AU3199999A (en) 1998-03-24 1999-10-18 Children's Medical Center Corporation Endostatin derived peptides with anti-angiogenic and anti-cancer activity
BR0010017A (pt) * 1999-04-28 2002-06-11 Univ Texas Composições e processos para o tratamento de câncer por inibição seletiva de vegf

Also Published As

Publication number Publication date
AU4547300A (en) 2000-11-02
US6921749B1 (en) 2005-07-26
WO2000063249A1 (en) 2000-10-26
CA2369961A1 (en) 2000-10-26
MXPA01010302A (es) 2002-09-18
EP1169351A1 (en) 2002-01-09
IT1312077B1 (it) 2002-04-04
ITMI990777A1 (it) 2000-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU696764B2 (en) Vascular endothelial growth factor 2
US5633147A (en) Transforming growth factor αH1
AU697535B2 (en) Haemopoietic maturation factor
US5656587A (en) Promotion of cell proliferation by use of transforming growth factor beta (TGF-β)
EP2552470B1 (en) Peptides for promoting angiogenesis and an use thereof
JPH06504064A (ja) 血管形成ペプチド
JP5360738B2 (ja) 細胞増殖促進活性を有するペプチド
EP1940872B9 (en) Peptides exhibiting efficacies of improvement in skin conditions or treatment of periodental diseases
JPH06502538A (ja) 上皮細胞成長因子（ｅｇｆ）との相同性をもつヘパリン結合性マイトジェン
US5104977A (en) Purified transforming growth factor beta
KR20140120018A (ko) 상처치료, 신생혈관유도 및 발모효능을 증식시키는 펩타이드 및 이의 용도
EP0359338B1 (en) Peptide compounds
US6921749B1 (en) Polypeptides derived from endostatin exhibiting antiangiogenic activity
WO2006029487A2 (en) Platelet factor 4 variant 1 (pf4var1) related inhibitors of angiogenesis
US6255452B1 (en) Epidermal growth factor inhibitor
WO1990011084A1 (en) Endothelial cell growth factor, isolation and expression
WO2022148289A1 (zh) 一类用于修复皮肤损伤或黏膜损伤的多肽及其应用
JP5752782B2 (ja) 血管新生促進用ペプチド及びその使用
US20040073007A1 (en) Antiangiogenic peptides
JPH07196527A (ja) ペプチドまたはその誘導体と、細胞増殖賦活化剤
JPH0782172A (ja) 創傷治療剤
WO1992013874A2 (en) Angiogenic peptides
WO2008050161A2 (en) Peptides for activation of angiogenesis, pharmaceutical compounds containing same and use of these compounds
EP1152011A1 (en) Peptides inhibiting vascular endothelial cell migration
WO2005085286A2 (en) Peptides with antiangiogenic and antitumor activities