KR20010015867A

KR20010015867A - 항-혈관형성 활성을 지니고 있는, 엔도스타틴의 변이체인＂ｅｍ 1＂ 및 이것을 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20010015867A
Application number: KR1020007006248A
Authority: KR
Inventors: 비카스 피. 슈카트메
Original assignee: 베쓰 이스라엘 디코니스 메디칼 센터
Priority date: 1997-12-08
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2001-02-26
Also published as: AU1718099A; CA2313705A1; AU742866B2; EP1037983A1; JP2001526031A; AU753889B2; KR20010015868A; EP1037985A1; WO1999029878A3; ATE319840T1; AU749904B2; WO1999029856A1; WO1999029855A1; AU1808899A; EP1038011A2; EP1038011B1; CA2312287A1; CN1284130A; JP2001526040A; IL136668A0

Abstract

본 발명은 야생형 엔도스타틴과 유사하거나 이 보다 우수한 항-혈관형성 활성을 지니고 있는, "EM 1"으로 고안된 엔도스타틴의 신규한 변이에 관한 것이다. 본 발명은 펩티드의 C-말단에서 항-혈관형성 특성을 갖는 아미노산 서열 SYIVLCIE를 포함하는 단리된 항-혈관형성 펩티드의 발견에 관한 것이다. 고안된 "EM 1" 단백질은, 변이가 변이된 엔도스타틴 단백질(예를 들어, NSFMTSFSK)의 C-말단으로부터 9개의 연속 아미노산의 결실을 포함하는 변이된 엔도스타틴 단백질을 포함하였다. EM 1은 아미노산 서열 SYIVLCIE에서 말단화된다. 또한, 본 발명은 발현 서열에 작동적으로 연결된 EM 1을 암호화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하여, 숙주 세포는 이러한 구성물로 형질전환된다. EM 1에 대한 항체 또한 기재되어 있다. 또한, 본 발명은 EM 1을 생성시키는 방법, EM 1을 함유하는 융합 단백질 및 EM 1을 포함하는 조성물 또는 이것의 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에는 또한 EM 1을 암호화하는 폴리펩티드를 생성시키는 방법이 기재되어 있다.

Description

항-혈관형성 활성을 지니고 있는, 엔도스타틴의 변이체인 ＂ＥＭ 1＂ 및 이것을 사용하는 방법 {MUTANTS OF ENDOSTATIN, ＂EM 1＂ HAVING ANTI-ANGIOGENIC ACTIVITY AND METHODS OF USE THEREOF}

전이성 암을 예후한다는 것이 여전히 꽤 만족스럽지는 못하다. 방사선 치료요법과 화학요법이 지속적으로 개발됨에도 불구하고, 과거 수 십년 동안에는, 치료받은 환자가 장기간 생존할 가능성이 극히 최소한의 수준으로만 증가된 것으로 나타났다. 전이성 암에 이용될 수 있는 중요한 치료 옵션이 결여되었다는 것은 새로운 치료 요법의 개발에 초점을 맞추어야 할 필요가 있다는 것을 역설하고 있다. 이와 관련하여, 고형 종양의 종양 혈관계를 표적으로 하는 치료법이 몇몇 동물 모델 시스템에서 놀랄만한 결과를 나타낸 것으로 최근 밝혀졌다[참조: Baillie et al. (1995) Br. J. Cancer 72:257-67; Bicknell, R. (1994) Ann. Oncol. 5(Suppl) 4:45-50; Fan et al. (1995) Trends Pharmacol. Sci. 16:57-66; Thorpe, P.E. and Burrows, F.J. (1995) Breast Cancer Res. Treat. 36:237-51; Burrows, F.J. and Thorpe, P.E. (1994) Pharmacol. Ther. 64:155-74]. 예를 들면, 누드 마우스 모델에서는, 야생형 VHL 유전자를 RCC 종양 세포주인 786-0 세포에 도입한 결과, 종양 성장이 억제되었고[참조: Iliopoulos et al. (1995) Nat. Med. 1:822-26] 안지오제네시스(angiogenesis)가 억제되었다.

수 ㎣가 넘는 고형 종양의 성장은 새로운 혈관형성에 따라 좌우된다[참조: Folkman, J. (1971) N. Engl. J. Med. 285:1182-86]. 수 많은 연구 결과, 1차 종양과 전이성 성장 모두가 안지오제네시스-의존성인 것으로 밝혀졌다[참조: Folkman, J. (1971) N. Engl. J. Med. 285:1182-86; Folkman, J. (1972) Ann. Surg. 175:409-16; Folkman, J. and Shing, Y. (1992) J. Biol. Chem. 267:10931-34; Folkman, J. (1996) Sci. Am. 275:150-54]. 수 많은 안지오제네시스 억제제가 동정되었다. 혈소판 인자-4[참조: Maione et al. (1990) Science 247:77-79; Gupta et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 92:7799-7803], 인터페론 α, 인터페론-유도성 단백질-10, 및 PEX[참조: Angiolillo et al. (1995) J. Exp. Med. 182:155-62; Strieter et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:51-57; Brooks et al. (1998) Cell 92:391-400] 등과 같은 특정 억제제는 "종양 연관된" 것이 아닌 반면, 기타 두 가지 억제제인 안지오스타틴 및 엔도스타틴은 "종양-연관된" 것이다[참조: O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315-28; O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277-85]. 매트릭스 메탈로엘라스타제를 상향 조절하는 종양-침윤성 마크로파아지에 의해 생성된 안지오제네시스의 강력한 내인성 억제제인 안지오스타틴은 광범위한 1차 및 전이성 종양의 성장을 억제시킨다[참조: Lannutti et al. (1997) Cancer Res. 57:5277-80; O'Reilly et al. (1994) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:471-82; O'Reilly, M.S., (1997) Exs. 79:273-94; Sim et al. (1997) Cancer Res. 57:1329-34; Wu et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 236:651-54].

최근에, 오렐리(O'Reilly) 등[(1997) Cell 88:277-85]은 쥐의 혈관내피종 세포주(EOMA)로부터 안지오제네시스 억제제인 엔도스타틴을 분리하였다. 탐지할 만한 종양을 지니고 있지 않은 만성 신부전증 환자에게서 사람 엔도스타틴의 특정 단편의 순환 수준이 탐지된 바 있으나, 이러한 단편은 결실을 나타내며 항-혈관형성 활성을 지니고 있지 않다[참조: Standker et al. (1997) FEBS Lett. 420:129-33]. 엔도스타틴의 아미노 말단 서열은 콜라겐 XVIII의 카복시 말단 부분에 상응한다. 엔도스타틴은 내피 증식과 안지오제네시스의 특이적 억제제이다. 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli)에서 발현된 재폴딩되지 않은 침전 단백질을 체내 투여하면, 이종이식 모델에서 루이스(Lewis) 폐 암종, T241 섬유육종, B16 흑색종 및 EOMA[O'Reilly et al. (1997) Cell 88:277-85] 세포의 성장 퇴행이 야기된다. 더우기, 연구된 3가지 종양 유형에서 어떠한 약물 내성도 인지되지 않았다. 엔도스타틴을 반복해서 투여한 결과, 종양 휴지 상태(tumor dormancy)를 가져온 것으로 보고되었다[참조: Boehm et al. (1997) Nature 390:404-407].

이들 연구 결과는 암 치료에 대한 새로운 방법을 제시하고 있으며 화학요법시 종종 관찰되는 약물 내성을 극복하기 위한 놀라운 방법을 제시하고 있다. 그러나, 이들 모든 연구에서는, 재폴딩되지 않은 침전 형태의 억제제 단백질이 현탁액의 형태로 종양-보유 동물에게 투여된다. 또한, 종양 퇴행을 유도하고 종양 휴지 상태를 야기시키기 위해서는 다량의 단백질이 요구된다. 문헌[참조: Kerbel (1997) Nature 390:335-36]에 지적된 바와 같이, 이들 단백질의 경구 약물 등가물이 필요하다. 이들 단백질의 재조합 형태가 가용성 형태로 이용 가능한 경우에는 기전적 연구가 진행될 수 있을 것이다. 더우기, 가용성 단백질을 생체내 조건하에서 이의 효능을 연구하기 전에 이러한 단백질을 사용하여 시험관내에서 초기 시험을 수행할 수 있다. 게다가, 이들 단백질에 의해 제시된 큰 기대에도 불구하고, 시험할 단백질을 충분히 생성시키기가 어렵고 이들의 항-혈관형성 특성에 관한 일관되지 못한 시험 결과로 인해 이들 단백질의 임상 효능을 평가하는 것이 좌절되었다고 보고된 바 있다[참조: King, R.T. (1998) Wall Street J., page 1 Nov. 12; Leff, D.N. (1998) BioWorld Today 9:1, Oct. 20]. 현 시점에서는, 신뢰할 만한 시험관내 및 생체내 특성을 지니고 있는 가용성 형태의 항-혈관형성 단백질을 다량으로 제조하는 방법이 절실히 요구된다.

발명의 개요

본원에는 신규한 엔도스타틴의 변이체가 기재되어 있으며, "EM 1"로 명명된 이들 중의 하나가 야생형 엔도스타틴과 유사하거나 이 보다 우수한 항-혈관형성 활성을 지니고 있다.

본 발명은 단리된 항-혈관형성 펩티드의 발견에 관한 것이며, 여기서 상기 펩티드의 C-말단은 항-혈관형성 특성을 지니고 있는 아미노산 서열 SYIVLCIE을 포함한다. "EM 1"로 명명된 단백질은 변이된 엔도스타틴 단백질을 포함하며, 이러한 변이에는 변이된 엔도스타틴 단백질의 C-말단으로부터 9개의 연속된 아미노산(예를 들어, NSFMTSFSK)의 결실이 포함된다. EM 1은 아미노산 서열 SYIVLCIE에서 종결된다. 본 발명은 또한, 발현 서열에 작동적으로 연결된, EM 1을 암호화하는 단리된 폴리누클레오티드, 및 이러한 작제물로 형질전환된 숙주 세포를 포함한다. EM 1에 대한 항체가 또한 기재되어 있다.

본 발명은 또한, EM 1의 제조 방법, EM 1을 함유하는 융합 단백질, 및 EM 1 또는 이의 융합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본원에는 또한, EM 1을 암호화하는 폴리펩티드의 제조 방법이 기재되어 있다.

또한, 본 발명은 암을 포함한 많은 질병과 질환 상태에서 일어나는 안지오제네시스를 특히 억제하기 위하여, EM 1을 포함하는 조성물을 포유류 조직과 접촉시키는 것을 포함하여, 이러한 포유류 조직에서 혈관형성 활성을 억제시키는 방법을 포함한다.

본원에는 또한, 아포프토시스(apoptosis)를 유도하기 위한 EM 1의 용도, 또는 아포프토시스를 방지하기 위한 EM 1의 항체가 기재되어 있다. 본원에는 추가로, 유전자 치료 방법에 있어서의 EM 1의 용도가 기재되어 있다. 표적된 세포는 어떠한 포유류 세포, 특히 임파구, 혈액 세포, TIL 세포, 골수 세포, 혈관 세포, 종양 세포, 간 세포, 근육 세포 및 섬유아세포일 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 엔도스타틴 누클레오티드 서열(서열 번호: 1)의 다이아 그램이다. EM 1을 암호화하는 폴리누클레오티드는 누클레오티드 525개 전체의 폴리누클레오티드 서열을 포함한다. EM 2를 암호화하는 폴리누클레오티드는 누클레오티드 501개 전체의 폴리누클레오티드 서열을 포함한다.

도 2는 도 1의 핵산 서열의 해독 서열(서열 번호: 2)의 다이아그램이다. EM 1은 아미노산 175개 전체의 아미노산 서열을 포함한다. EM 2는 아미노산 167개 전체의 아미노산 서열을 포함한다.

도 3은 Ni-NTA 칼럼으로부터의 용출 결과를 도시하는 그래프이다. 분획 번호가 x-축을 따라 제시되고, 각 분획에 대한 280nm에서의 흡광도()가 좌측 y-축에 제시되어 있다. 각 분획에 대해, 융출 완충액의 pH()가 우측 y-축에 제시되어 있다.

도 4는 진핵성 발현 시스템으로부터 생성된 단백질의 12% 비-환원성 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 크기(kDa)가 좌측에 제시되고, 첫 번째 레인이 크기 마아커를 함유하고 있다. 레인 2는 미정제 단백질을 함유하고, 레인 3 및 4는 pH 6.3에서 용출된 분획 7 및 8로부터의 샘플을 함유하고 있다. 레인 5 및 6은 pH 4.0에서 용출된 분획 21 및 22로부터의 샘플을 함유하고 있다. 레인 7은 DTT로 환원된 분획 22로부터의 샘플을 함유하고 있다.

도 5는 헤파린-아가로즈 칼럼으르 사용하여 효모에서 발현된 가용성 마우스 엔도스타틴의 정제를 도시한 그래프이다. 분획 번호가 x-축을 따라 제시되고, 각 분획에 대한 280nm에서의 흡광도()가 좌측 y-축에 제시되어 있으며, 각 분획을 용출시키는데 사용된 NaCl의 농도()가 우측 y-축에 제시되어 있다.

도 6은 헤파린-아가로즈 칼럼으로부터 정제된 재조합 가용성 마우스 엔도스타틴의 12% 비-환원성 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 크기(kDa)가 좌측에 제시되고, 첫 번째 레인이 크기 마아커를 함유하고 있다. 레인 2는 미정제 단백질을 함유하고, 레인 3은 결합되지 않은 단백질을 함유하며, 레인 4는 세척액을 함유하고, 레인 5 및 6은 0.3ml NaCl로 모두 용출시킨 분획 9 및 10 각각으로부터의 샘플을 함유하고 있다. 레인 7 및 8은 0.6M NaCl로 모두 용출시킨 분획 21 및 22 각각으로부터의 샘플을 함유하고 있다.

도 7은 Ni-NTA 칼럼을 사용하여 효모에서 발현된 가용성 His.엔도스타틴의 용출 프로필을 도시하는 그래프이다. 분획 번호가 x-축을 따라 제시되고, 각 분획에 대한 280nm에서의 흡광도()가 좌측 y-축에 제시되어 있으며, 각 분획을 용출시키는데 사용된 이미다졸의 농도(mM)()가 우측 y-축에 제시되어 있다.

도 8은 효모에서 발현된 가용성 His.엔도스타틴의 선택된 분획의 12% 비-환원성 SDS-PAGE 겔을 도시한 것이다. 크기(kDa)가 좌측에 제시되고, 첫 번째 레인이 크기 마아커를 함유하고 있다. 레인 2는 미정제 단백질을 함유하고, 레인 3은 병류물(즉, 결합되지 않은 단백질)을 함유하며, 레인 4는 세척액을 함유한다. 레인 5는 10mM 이미다졸로 용출시킨 분획 9의 샘플을 함유하고 있다. 레인 6 및 7은 50mM 이미다졸로 용출시킨 분획 35 및 36 각각으로부터의 샘플을 함유하고 있고, 레인 8 및 9은 100mM 이미다졸로 용출시킨 분획 53 및 54 각각으로부터의 샘플을 함유하고 있다.

도 9는 세균 및 효모로부터 발현된 재조합 마우스 엔도스타틴의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 레인 1은 세균적으로-발현된 His.엔도스타틴을 함유하고, 레인 2는 효모에서 발현된 엔도스타틴을 함유하며, 레인 3은 효모-생산된 His.엔도스타틴을 함유하고 있다.

도 10은 내피 세포 증식 검정 결과를 도시하는 그래프이다. 효모로부터 발현된 정제된 마우스 엔도스타틴을 대상으로 하여, C-PAE 세포에서 (메틸-³H) 티미딘 혼입을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 엔도스타틴의 농도(100ng 내지 10000ng)가 x-축에 제시되고,³H-티미딘의 혼입량이 y-축에 제시되어 있다. 효모-유도된 가용성 엔도스타틴의 혼입량() 및 효모-유도된 가용성 His.엔도스타틴의 혼입량()은 엔도스타틴의 농도가 증가함에 따라 꾸준히 감소되었다.

도 11은 비-내피 세포에 대한 재조합 마우스 엔도스타틴의 효과를 도시하는 바 차트이다. 흰색 바는 786-0 세포를 지칭하고, 검은색 바는 A₄₉₈세포를 지칭한다. 이들 모두는 2% 혈청 중의 bFGF(3ng/ml)로 자극된 신장암 세포주이다.

도 12A 및 12B는 자극인자로서 bFGF(25ng/ml)를 사용하여 가용성 마우스 엔도스타틴에 의한 내피 세포(ECV304) 이동 억제를 나타내는 한 쌍의 사진이다. 도 12A는 대조군(+ bFGF, 엔도스타틴 무함유)에서의 이동된 내피 세포를 도시한 것이고, 도 12B는 bFGF와 엔도스타틴(20㎍/ml)으로 처리된 이동된 내피 세포를 도시한 것이다.

도 13은 상이한 농도의 엔도스타틴을 이용한 내피 세포 이동 억제를 도시하는 바 차트이다. 상대적인 세포 이동이 y-축에 제시되어 있고, 처리(대조군, 25ng/ml bFGF, 및 20, 10, 5, 2.5 및 1㎍/ml의 엔도스타틴)이 x-축에 제시되어 있다.

도 14A, 14B 및 14C는 엔도스타틴의 존재하에서 VEGF(250ng/펠릿)에 의해 매개된 혈관형성 반응의 억제를 도시하는 현미경사진이다. 도 14A는 네거티브 대조군이고, 도 14B는 포지티브 대조군(VEGF)이며, 도 14C는 엔도스타틴 + VEGF의 효과를 도시한 것이다.

도 15A 및 15B는 CAM 검정에서 엔도스타틴(20, 10, 5, 1 및 0㎍/메쉬)에 의한 VEGF(가장 높은 패널) 및 bFGF(가장 낮은 패널) 매개된 혈관형성 반응의 억제를 도시하는 한 쌍의 바 차트이다. 양 차트는 엔도스타틴 농도 증가에 반응하여 안지오제네시스 억제가 꾸준히 증가하는 것을 도시하고 있다.

도 16은 내피 증식 검정에서 폴리클로날 항혈청에 의한 마우스 엔도스타틴의 억제 효과의 중화를 도시하는 바 차트이다.³H-티미딘의 혼입량이 y-축에 제시되어 있고, 처리(대조군, 10㎍ 엔도스타틴, 10㎍ 엔도스타틴 + 항혈청, 5㎍ 엔도스타틴, 5㎍ 엔도스타틴 + 항혈청, 예비-면역 혈청, 엔도스타틴 항혈청 및 엔도스타틴 IgG)가 x-축에 제시되어 있다.

도 17A 및 17B는 폴리클로날 항혈청에 의한 엔도스타틴 억제 활성의 중화를 입증해주는, CAM 검정 결과를 도시하는 한 쌍의 사진이다. 도 17A는 VEGF 및 엔도스타틴(10㎍/펠릿)의 효과를 도시한 것이고, 도 17B는 엔도스타틴(10㎍/펠릿) + 폴리클로날 항혈청 + VEGF의 효과를 도시한 것이다.

도 18은 재조합 엔도스타틴으로의 전신 치료에 의한 786-0 종양 성장의 억제를 도시한 그래프이다. 치료 후의 시간(일)은 x-축에 제시되어 있고, 종양 용적(㎣)이 y-축에 제시되어 있다. 엔도스타틴의 복강내 주사는 1일(화살표)에 시작하여 10mg/kg/일로 제공된다. 각 시점은 각 그룹에서 5마리 마우스의 평균치를 나타내고, 오차 바는 S.E.M을 나타낸다. 처리는 대조군 PBS(), 효모로부터의 엔도스타틴(), 효모로부터의 His.엔도스타틴(×) 및 세균으로부터의 His.엔도스타틴()이다.

도 19A 내지 도 19E는 재조합 엔도스타틴으로 처리된 786-0 종양의 사진 셋트이다. 처리 주기 끝에, 대조군으로부터의 종양과 처리된 그룹으로부터의 종양을 해부용 현미경 하에서 총체적으로 검사한다. 도 19A 및 19B는 대조군 종양이고, 도 19C는 효모-유도된 엔도스타틴으로 처리된 종양을 도시한 것이며, 도 19D는 세균으로부터의 His.엔도스타틴의 효과를 도시한 것이고, 도 19E는 효모로부터의 His.엔도스타틴으로 처리된 종양을 도시한 것이다.

도 20은 무감각 누드 마우스 786-0 종양에 대한 엔도스타틴 변이체의 효과를 도시하는 그래프이다. 치료 후의 시간(일)은 x-축에 제시되어 있고, 종양 용적이 y-축에 제시되어 있다. 각 시점은 각 그룹에서 5마리 마우스의 평균치를 나타낸다. 처리는 대조군 PBS(), 세균으로부터의 야생형 His.엔도스타틴(점선,), 세균으로부터의 EM 1(△), 및 세균으로부터의 EM 1(실선, ◆)이다. EM 1과 EM 2 모두는 N-말단 His.태그를 함유하고 있다. 복강내 주사는 1일(화살표)째 시작한다.

도 21은 엔도스타틴 처리로 인한 증가된 카스파제 3 활성을 도시하는 바 그래프이다. 405nm에서의 흡광도가 y-축에 제시되어 있고, 처리(대조군, TNF-α(10mg/ml), 엔도스타틴(10㎍/ml))이 x-축에 제시되어 있다. 각 처리에 대한 한 쌍의 바는 억제제 DEVD-fmk의 존재하(흰색 바) 또는 부재하(검은색 바)에서의 A₄₀₅판독치를 나타낸다.

도 22는 비-내피 세포에서의 카스파제 3 활성을 도시하는 바 그래프이다. 405nm에서의 흡광도가 y-축에 제시되어 있고, x-축은 NIH3T3 및 H9c2(2-1)-근원세포에 대한 처리(대조군, 대조군 + DEVD, 엔도스타틴(10㎍/ml), 엔도스타틴(10㎍/ml) + DEVD)가 각각 제시되어 있다.

도 23은 TUNEL 검정에 의해 결정된 바와 같이, 아폽토시스의 정량적 결정을 도시하는 바 그래프이다. 처리가 x-축에 제시되어 있고, 이는 엔도스타틴-처리된 유착 세포, 엔도스타틴-처리된 현탁 세포, 대조군 유착 세포, 및 TNF-α-처리된 유착 세포이다. 아포프토성 세포의 비율(%)이 y-축에 제시되어 있다.

도 24A 및 24B는 각각, Bcl-2 단백질 수준에 대한 C-PAE 세포 융해물의 웨스턴 블롯 분석, 및 Bax 발현 수준에 대한 총 세포 융해물을 탐지하는 면역블롯이다. C-PAE 세포는 지시된 주기(0, 12, 24, 28시간) 동안 엔도스타틴으로 처리되지 않거나(-) 엔도스타틴(10㎍/ml)(+)으로 처리된 것이다. 액틴 프로빙이 또한 제시되어 있다.

도 25A, 25B, 25C 및 25D는 Bax 단백질 수준에 대한 비-내피 세포 융해물의 두 가지 웨스턴 블롯 분석(도 25A 및 25B)과 두 가지 면역블롯(도 25C 및 25D) 셋트이다. 세포는 지시된 주기(0, 12, 24, 28, 32시간) 동안 엔도스타틴으로 처리되지 않거나(-) 엔도스타틴(10㎍/ml)(+)으로 처리된 것이다. 액틴 프로빙이 또한 제시되어 있다. 도 25A: NIH3T3 세포 융해물; 도 25B: IMR-90 세포 융해물; 도 25C: C-PAE 세포 융해물; 도 25D: NIH3T3 세포 융해물.

도 26A-B는 각종 항-혈관형성 단백질을 클로닝 및 발현하는데 사용된, 작제물, 프라이머, 클로닝 부위 및 벡터를 도시한 차트이다. 발현된 단백질의 아미노산 서열이 또한 제시되어 있다.

광범위한 질환이 바람직하지 못한 안지오제네시스에서 비롯된 것이다. 달리 언급하면, 많은 질환 및 바람직하지 못한 상태가, 특정 시간에 또는 특정한 조직에서 몇몇 상태 하의 모세혈관의 성장과 연장을 중지시키는 것이 가능할 경우에는 예방되거나 경감될 수 있다. 몇몇 항-혈관형성 단백질(예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴)이 밝혀졌지만, (1) 이들의 특성을 적절히 시험할 수 있도록 하기에 충분한 양의 단백질을 생성시키는 능력, 및 (2) 이들 단백질에 기인된 항-혈관형성 특성의 재생성에 관한 문제점이 보고되었다.

본 발명은 본원에서 EMs로서 지칭된 엔도스타틴 변이체를 포괄한다. 구체적으로는, "EM 1"과 "EM 2"로 명명된 두 가지의 엔도스타틴 변이체를 포괄한다. 이들 변이체를 대상으로 하여, 완전한 엔도스타틴에 대하여 시험한다. 이들 변이체는 극히 상이한 활성을 나타내었다. 예상치 못하게, 하나의 변이체("EM 1")는 완전한 엔도스타틴와 마찬가지로 수행되거나 이 보다 우수하게 수행되는 반면, 다른 변이체("EM 2")는 항-혈관형성 활성을 상실한 것으로 나타났다. 누드 마우스 모델에 있어서, 신장 세포 암(RCC)의 성장이 EM 1을 20mg/체중 kg의 비율로 전신 투여함으로써 억제되었다. 이러한 종양 성장의 억제는 야생형 엔도스타틴을 이용하여 획득된 억제에 필적한다. EM 1과 EM 2 간의 활성 차이는 이들 간에 단지 8개의 아미노산 잔기 만이 상이할 경우에도 놀라운 것이다. EM 1은 점차적으로 더욱 더 작은 펩티드가 체중을 기준으로 하여 보다 강력하고 조직을 보다 잘 침투시킬 수 있다는 점에서 혈관형성 질환 치료에 있어서 이점을 제공해준다.

본 발명에서는, 신규한 항-혈관형성 단백질인 EM 1, 및 엔도스타틴의 결실 변이체 뿐만 아니라 이의 단편, 유도체, 융합 단백질 및 항체가 기재되어 있다. 이들의 제조 방법이 또한 기재되어 있다. 본 발명에는 또한, EM 1을 포함하는 치료학적 조성물, 및 이들 조성물을 이용하는 방법이 기재되어 있다. EM 1을 암호화하는 폴리누클레오티드가 또한 기재되어 있으며, 이들 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포가 기재되어 있다. 생물학적 활성 성분으로서 EM 1를 함유하는 조성물 뿐만 아니라 안지오제네시스를 특징으로 하는 질환 및 질병을 치료하는데 있어서와 같이 포유류 조직에서 혈관형성 활성을 억제시키기 위한 EM 1의 사용 방법이 기재되어 있다. 본 발명에는 안지오제네시스에 의해 매개되거나 이와 연관되는 질환 및 질병을 탐지 및 치료하기 위한 조성물 및 방법이 포함된다. 또한, 본 발명에는 특정 세포 또는 조직에서 아포프토시스를 유도하기 위한 EM 1의 용도, 및 특정 세포 또는 조직에서 아포프토시스를 억제하기 위한 EM 1에 대한 항체가 포함된다.

구체적으로 언급하면, EM 1은 마지막 9개의 아미노산 잔기가 결실된, 엔도스타틴의 결실 변이체이다. EM 1은 콜라겐 유형 XVII 분자의 일부로서 천연 상에 존재하지만, 이는 재조합적으로 제조될 수 있는데, 예를 들면, EM 1 단백질(도 2, 서열 2)을 암호화하는 폴리누클레오티드 서열(도 1, 서열 1)을, 예를 들어, 다음 표 1에 열거된 전방 및 후방 프라이머를 사용하여 증폭시킬 수 있다. 이러한 증폭에 사용된 주형 핵산은 어떠한 포유류로부터의 것일 수 있다. 또한, 포유류 EM 1, 이의 단편, 변이체, 유도체 또는 융합 단백질이 본 발명에 포괄된다.

표 1. 항-혈관형성 단백질을 증폭시키는데 사용된 작제물 및 프라이머 서열

이어서, 이로써 생성된 증폭 생성물을 적합한 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다. 용어 "프라이머"는 표적 누클레오티드 서열에 상보적이고 이러한 표적 누클레오티드 서열과 하이브리드화하는데 사용된 특이적 올리고누클레오티드 서열을 의미하고, 이는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사효소에 의해 촉매된 누클레오티드 중합 반응에 대한 개시 지점으로서 작용한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "EM 1"은 마지막 9개의 아미노산 잔기(즉, NSFMTSFSK)가 결실된, 엔도스타틴의 결실 변이체를 지칭하고, 이 용어는 서열 의 아미노산 서열의 단편, 변이체, 동족체, 유사체 및 대립유전자성 변이체를 포함한다. EM 1이 본래 마우스 핵산으로부터 클로닝된 것이긴 하지만, 이는 표준 검정에서 본래 유형의 엔도스타틴(즉, 변이되지 않은 엔도스타틴) 보다 더 우수하게 수행된다. 따라서, 용어 EM 1은 본원에 기재된 바와 같은 EM 1과 실질적으로 유사한 모든 포유류 서열 뿐만 아니라 이러한 포유류 EM 1 아미노산 서열의 포유류 EM 1 단편, 변이체, 동족체, 유사체 및 대립유전자성 변이체를 포함한다. 또한, 구체적으로 언급하면, 사람 엔도스타틴 변이체, 보다 구체적으로 언급하면, EM 1의 사람 결실 변이체 등가물이 본 발명에 포괄된다.

본 발명이 내피 억제 활성(예를 들면, 안지오제네시스를 총칭적으로 억제하고, 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자, 안지오제네시스-연관된 인자 또는 기타 공지된 성장 인자의 존재하에서 배양물 중의 소의 모세관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제하기 위한 조성물의 능력)을 지니고 있는 EM 1의 모든 유도체를 포괄하는 것으로 인지되어야 한다. 본 발명에는 완전한 EM 1 단백질, 이러한 EM 1 단백질의 유도체 및 EM 1 단백질의 생물학적-활성 단편이 포함된다. 이들에는 아미노산 치환체를 갖거나 아미노산 작용성 그룹에 부착된 기타 분자 또는 당을 갖는 EM 1 활성을 지닌 단백질이 포하마된다. 본 발명에는 또한, EM 1 및 EM 1 수용체를 암호화하는 유전자, 및 이들 유전자에 의해 발현되는 단백질이 포함된다.

본 발명은 또한, EM 1을 암호화하는 단리된 폴리누클레오티드를 포함하는 조성물 뿐만 아니라 이러한 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 및 EM 1 및 이의 단편, 변이체, 동족체, 유사체 및 대립유전자성 변이체의 제조 방법을 포괄한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 핵산 조각을 삽입 또는 클로닝시킬 수 있는 캐리어를 의미하고, 이러한 캐리어는 핵산 조각을 숙주 세포 내로 운반시키는 작용을 한다. 이러한 벡터는 이와 같이 운반된 핵산 조각의 복제 및/또는 발현을 야기시킬 수 있다. 벡터의 예로는 예를 들어, 플라스미드, 박테리오파아지, 또는 포유류, 식물 또는 곤충 바이러스로부터 유도된 핵산 분자, 또는 비-바이러스성 벡터, 예를 들어, 리간드-핵산 접합체, 리포좀 또는 지질-핵산 복합체가 있다. 상기와 같이 운반된 핵산 분자가 발현 조절 서열에 효과적으로 연결되어 상기 운반된 핵산을 발현시킬 수 있는 발현 벡터를 형성하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 핵산의 운반을 일반적으로 "형질전환"이라 지칭하고, 이는 삽입에 사용된 방법에 상관없이, 특정 숙주 세포 내로의 외인성 폴리누클레오티드의 삽입을 지칭한다. 예를 들면, 직접적인 흡수, 형질도입 또는 f-매팅이 포함된다. 이러한 외인성 폴리누클레오티드는 비-통합 벡터, 예를 들면, 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 또 다르게는 숙주 지놈(genome) 내로 통합될 수 있다. "작동적으로 연결된"이란 기재된 성분들이 이들이 의도된 방식으로 기능할 수 있도록 해주는 관계에 있는 상황을 지칭하는데, 예를 들면, 암호화 서열에 "작동적으로 연결된" 조절 서열은 암호화 서열의 발현이 이러한 조절 서열과 부합되는 조건하에서 달성되는 방식으로 연결되어 있다. "암호화 서열"은 적당한 조절 서열의 조절(예를 들면, 이러한 서열에 작동적으로 연결된) 하에 놓여진 경우에, mRNA 내로 전사되고 폴리펩티드로 해독되는 폴리누클레오티드 서열이다. 이러한 암호화 서열의 경계는 5'-말단에서의 해독 출발 코돈과 3'-말단에서의 해독 정지 코돈에 의해 결정된다. 이러한 경계는 천연적으로 존재할 수 있거나, 또는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 폴리누클레오티드 서열 내로 도입되거나 이에 가할 수 있다. 암호화 서열로는 mRNA, cDNA 및 재조합 폴리누클레오티드 서열이 있지만, 이에 제한되지는 않는다.

클로닝된 폴리누클레오티드가 클로닝될 수 있는 벡터를 선택할 수 있는데, 이는 이러한 벡터가 원핵성 유기체에서 작용할 수 있기 때문이거나, 또 다르게는 진핵성 유기체에서 작용할 수 있기 때문이다. EM 1 단백질을 암호화하는 폴리누클레오티드의 클로닝과, 이러한 폴리누클레오티드로부터 상기 단백질을 발현시키는 것 모두를 허용해주는 벡터의 두 가지 예가 세균 및 효모에서의 상기 단백질의 발현을 각각 허용해주는 pET28(a) 벡터(Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 및 변형된 pPICZαA 벡터(InVitrogen, San Diego, California, USA)이다.

특정한 폴리누클레오티드가 적합한 벡터 내로 일단 클로닝되면, 이를 적당한 숙주 세포 내로 형질전환시킬 수 있다. "숙주 세포"란 벡터를 통하여 운반된 핵산의 수용체이거나 수용체로서 사용될 수 있는 세포를 의미한다. 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성, 포유류, 식물 또는 곤충일 수 있으며, 단일 세포로서 존재하거나, 집합체, 예를 들면, 배양물로서 존재하거나, 또는 조직 배양물 또는 조직 또는 유기체 중에 존재할 수 있다. 숙주 세포는 또한, 다세포 유기체, 예를 들면, 포유류로부터의 정상적인 조직 또는 병이 든 조직으로부터 유도된 것일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 숙주 세포는 핵산으로 형질전환되는 본래의 세포 뿐만 아니라 상기 핵산을 여전히 함유하고 있는 상기 세포의 자손을 포함한다.

한 가지 양태에 있어서, 항-혈관형성 단백질을 암호화하는 단리된 폴리누클레오티드는 특정 펩티드를 암호화하는 폴리누클레오티드 링커를 부가적으로 포함한다. 이러한 링커는 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있고, 예를 들면, 상기 링커는 하나 이상의 부가 아미노산을 암호화하는 하나 이상의 부가 코돈을 포함할 수 있다. 전형적으로, 이러한 링커는 1 내지 약 20개 또는 30개 아미노산을 포함한다. 항-혈관형성 단백질의 아미노 또는 카복시 말단에서 하나 이상의 부가 아미노산 잔기를 갖는 항-혈관형성 단백질을 발현시켜 주는 항-혈관형성 단백질을 암호화하는 폴리누클레오티드와 같이, 상기 폴리누클레오티드 링커를 해독시킨다. 항-혈관형성 단백질에 부착된 몇몇 링커가 도 26에 예시되어 있다. 중요하게는, 부가의 아미노산 또는 아미노산들이 항-혈관형성 단백질의 활성을 상쇄시키지 않는다.

선택된 폴리누클레오티드를 벡터 내로 삽입시킨 후, 이 벡터를 적당한 진핵성 균주 내로 형질전환시키고, 이 균주를 생물학적 활성의 항-혈관형성 단백질의 생성에 적합한 배양 조건 하에서 배양(예를 들면, 유지)시킴으로써, 생물학적 활성의 항-혈관형성 단백질, 또는 이의 변이체, 유도체, 단편 또는 융합 단백질을 생성시킨다. 한 양태에 있어서, 본 발명은 항-혈관형성 단백질을 암호화하는 폴리누클레오티드를 벡터 pET17b 또는 pET28a 내로 클로닝시킨 다음, 이를 세균 내로 형질전환시키는 것을 포함한다. 이어서, 이러한 세균성 숙주 균주는 항-혈관형성 단백질을 발현시킨다. 전형적으로, 이러한 항-혈관형성 단백질은 배양액 1리터 당 약 10 내지 20mg 이상의 양으로 생성된다.

본 발명의 또 다른 양태에 있어서, 진핵성 벡터는 효모 벡터를 포함한다. 본원에 기재된 바와 같이, 한 가지 방법은 다중 클로닝 부위를 함유하고 있는 pPICzα 플라스미드를 이용한다. 이러한 다중 클로닝 부위를를 다중 클로닝 부위인 His.태그 모티브 내로 삽입한다. 부가적으로, 상기 벡터를 변형시켜 NdeI 부위 또는 기타 적합한 제한 부위를 가할 수 있다. 이러한 부위는 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있다. 본 양태에 의해 생성된 항-혈관형성 단백질은 하나 이상의 히스티딘, 전형적으로 약 5 내지 20개 히스티딘을 포함하는 히스티딘 태그 모티브(His.태그)를 포함한다. 놀랍게도, 이러한 His.태그가 항-혈관형성 활성을 상쇄시키지 않는다.

본 양태에 있어서, 바람직한 효모 발현 시스템은 피치아 파스토레스(Pichia pastores)이다. 다시 언급하면, 생물학적 활성의 단백질은 전형적으로 배양 매질(액) 1리터 당 약 10 내지 20mg의 농도로 생성된다.

EM 1을 제조하는 한 가지 방법은, 예를 들면, 서열 1의 폴리누클레오티드를 증폭시키고, 이를 발현 벡터, 예를 들어, pET28(a), pPICZαA 또는 몇몇 기타 발현 벡터 내로 클로닝시키며, 서열 1의 폴리누클레오티드를 함유하는 벡터를 상기 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드를 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 형질전환시키고, 이와 같이 형질전환된 숙주 세포를 상기 단백질 발현에 적합한 배양 조건 하에서 배양시킨 다음, 상기 배양물로부터 상기 단백질을 추출 및 정제시키는 것이다. 총칭적으로 항-혈관형성 단백질, 특히 EM 1을 제조하는 방법의 예가 다음 실시예에 제공되며 또한, 슈카트메, 비카스 피 (Sukhatme, Vikas P.)의 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 "항-혈관형성 단백질의 제조 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허원 제XX/XXX,XXX호 에 제공되어 있다. EM 1 단백질은 또한, 형질전환성 동물의 생성물로서, 예를 들면, 형질전환성 카우(cow), 고우트(goat), 쉽(sheep) 또는 피그의 유즙 성분으로서, 또는 예를 들면, 옥수수 중의 전분 분자와 배합되거나 연결된 형질전환성 식물 생성물로서 발현될 수 있다.

EM 1은 통상적으로 공지된 화학 합성법에 의해 제조할 수 있다. 합성법에 의해 본 발명의 단백질을 작제하는 방법은 당해 분야의 숙련인에게 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합적으로 생성된 EM 1을 이용하여 1차, 2차 또는 3차 구조적 및/또는 형태적 특징을 공유하게 함으로써 합성적으로 작제된 EM 1 단백질 서열은 생물학적 활성을 포함한, 이들과 공통의 생물학적 특성을 보유할 수 있다. 따라서, 합성적으로 작제된 EM 1 단백질 서열은 치료학적 화합물을 스크리닝하고 항체 개발을 위한 면역학적 방법에 있어서, 예를 들어, 재조합적으로 제조되고 정제된 EM 1 단백질에 대한 생물학적 활성 또는 면역학적 대체물로서 이용될 수 있다.

EM 1 단백질은 표준 검정에서 결정되고 다음 실시예에 제공되는 바와 같이 안지오제네시스를 억제하는데 유용하다. EM 1은 기타 세포 유형, 예를 들면, IMR-90 세포 또는 IC-21 세포의 성장을 억제시키지는 않는다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "안지오제네시스"는 새로운 혈관이 특정 조직이나 기관 내로 발생되는 것을 의미하며, 내피 세포 증식과 관련이 있다. 정상적인 생리학적 조건 하에서는, 사람이나 동물에게서 극히 특정한 제한된 상황 하에서만 안지오제네시스가 진행된다. 예를 들면, 안지오제네시스는 통상적으로 상처 치유, 태아 및 배아성 발육, 및 황체, 자궁내막 및 태반의 형성시 관찰된다. 용어 "내피"는 장막강, 림프관 및 혈관을 정렬시키는 평편한 상피 세포 박층을 의미한다. 따라서, "항-혈관형성 활성"은 혈관의 성장을 억제시키는 특정 조성물의 능력을 지칭한다. 혈관의 성장은 복잡한 일련의 사건이고, 이에는 개개의 내피 세포 아래에 놓여 있는 기저막의 국재화된 파쇄, 이들 세포의 증식, 상기 세포가 미래의 혈관 위치로의 이동, 새로운 혈관 막을 형성하도록 세포를 재구성, 내피 세포 증식의 중지, 및 혈관주위세포 및 새로운 혈관벽을 지지해주는 기타 세포의 혼입이 포함된다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같은 "항-혈관형성 활성"에는 이들 단계 중의 어떠한 것 또는 단계 모두의 중단이 포함되며, 이로써 새로운 혈관의 형성이 억제되는 최종 결과를 가져다 준다.

항-혈관형성 활성에는 안지오제네시스를 총칭적으로 억제하고, 예를 들어, 섬유아세포 성장 인자, 안지오제네시스-연관된 인자 또는 기타 공지된 성장 인자의 존재하에서 배양물 중의 소의 모세혈관 내피 세포의 성장 또는 이동을 억제하기 위한 조성물의 능력을 지칭하는 내피 억제 활성이 포함될 수 있다. "성장 인자"는 세포의 성장, 재생 또는 합성 활성을 자극하는 조성물이다. "안지오제네시스-연관된 인자"는 안지오제네시스를 억제시키거나 증진시키는 인자이다. 안지오제네시스-연관된 인자의 한 예는 안지오제네시스 증진제인 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)와 같은 혈관형성 성장 인자이다. 안지오제네시스-연관된 인자의 또 다른 예가, 예를 들어, 안지오스타틴[참조: 미국 특허 제5,801,012호, 제5,837,682호, 제5,733,876호, 제5,776,704호, 제5,639,725호, 제5,792,845호, WO 96/35774, WO 95/29242, WO 96/41194, WO 97/23500] 또는 엔도스타틴[참조: WO 97/15666] 등의 안지오제네시스 억제 인자이다.

"실질적으로 동일한 생물학적 활성" 또는 "실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성"이란 특정 조성물이 항-혈관형성 활성을 지니고 있고 표준 검정에서 결정된 바와 같이 EM 1와 유사하게 행동한다는 것을 의미한다. "표준 검정"에는 항-혈관형성 활성, 세포 주기 체포 및 아포프토시스를 평가하기 위한 분자 생물학 분야에서 사용된 프로토콜이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 검정에는 내피 세포 증식, 내피 세포 이동, 세포 주기 분석 및 내피 세포 튜브 형성의 검정, 예를 들면, 아포프토성 세포 형태학 또는 아넥신(Annexin) V-FITC 검정에 의한 아포프토시스의 탐지, 융모요막(CAM) 검정, 및 누드 마우스에서의 신장암 종양 성장의 억제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 검정이 다음 실시예, 및 1997년 12월 8일자로 출원된 미국 특허원 제60/067,888호, 1998년 4월 22일자로 출원된 미국 특허원 제60/082,663호, 1998년 11월 16일자로 출원된 미국 특허원 제60/108,536호, 및 슈카트메, 비카스 피에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 "레스틴 및 이의 사용 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허원 제XX/XXX,XXX호 및 슈카트메, 비카스 피에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 "항-혈관형성 단백질의 제조 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허원 제XX/XXX,XXX호에 제공되어 있다(이들의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다). 이러한 방법은 또한, 문헌[참조: Dhanabal et al. (1998) ("Endostatin Induces Endothelial Cell Apoptosis,", J. Biol. Chem., submitted), and Dhanabal et al. (1999) ("Cloning, Expression and in vitro Activity of Human Endostatin," Cancer Res., in press)]에 포함되어 있다. 본원에 기재된 검정들 중의 한 가지에서 특정 변이체의 ED₅₀를 평가하는 것이 활성을 비교하는데 유용한 방법이다.

본원에 사용된 바와 같은 "ED₅₀"은 특정 조성물의 부재하에서 관찰된 생물학 적 효과에 비해, 이러한 생물학적 효과를 절반으로 감소시키는 상기 조성물의 양에 대한 약어이다.

본원에는 또한, EM 1의 단편, 변이체, 동족체 및 유사체가 기재되어 있다. EM 1의 "단편"은 EM 1 폴리펩티드의 25개 이상의 연속된 아미노산을 포함하는, EM 1 분자 보다 더 짧은 아미노산 서열을 지칭한다. 이러한 변이체는 완전하거나 부분적인 링커 서열에 상응하는 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기를 클로닝하는 방법으로부터 유도된 부가의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 이러한 부가의 아미노산 잔기를 갖거나 갖지 않는 상기 변이체가 천연 또는 완전한 길이의 참조 폴리펩티드 버전과 실질적으로 동일한 생물학적 활성을 지녀야만 한다는 것이 본 발명에 포괄되어야 한다.

EM 1의 "변이체"란 등가의 참조 EM 1 폴리펩티드의 아미노산 서열에 비해 아미노산 서열에 있어서의 모든 변화를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 변화는 자발적으로 일어날 수 있거나, 또는 사람에 의한 조작, 화학적 에너지(예를 들어, X-선), 기타 형태의 화학적 변이유발, 유전 공학적 처리, 또는 교미 또는 기타 형태의 유전 정보의 교환 결과로서 일어날 수 있다. 변이에는, 예를 들어, 염기 교환, 결실, 삽입, 전환, 전위 또는 복제가 포함된다. 변이체 형태의 EM 1은 등가의 참조 EM 1 폴리펩티드에 비해 증가되거나 저하된 항-혈관형성 활성을 나타낼 수 있으며, 이러한 변이체는 예를 들어, 완전하거나 부분적인 링커 서열에 상응하는 아미노산 서열 또는 아미노산 잔기를 클로닝하는 방법으로부터 유도된 부가의 아미노산을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

EM 1의 "유사체"란 완전한 EM 1 분자 또는 이의 단편 또는 대립유전자성 변이체와 실질적으로 유사하고 실질적으로 동일하거나 우수한 생물학적 활성을 지니고 있는 천연이 아닌 분자를 의미한다. 이러한 유사체에는 생물학적 활성의 EM 1의 유도체(예를 들어, 앞서 정의된 바와 같은 화학적 유도체) 뿐만 아니라 이의 단편, 변이체, 동족체 및 대립유전자성 변이체가 포함되며, 이러한 유도체는 변형되지 않은 EM 1 폴리펩티드, 이의 단편, 변이체, 동족체 또는 대립유전자성 변이체와 정성적으로 유사한 효능제 또는 길항제 효과를 나타낸다.

EM 1의 "대립유전자"란 참조 EM 1 폴리펩티드의 폴리펩티드 서열에 비해 천연의 서열 변이를 함유하는 폴리펩티드 서열을 의미한다. EM 1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리누클레오티드의 "대립유전자"란 참조 EM 1 폴리펩티드를 암호화하는 참조 폴리누클레오티드 서열에 비해 서열 변이를 함유하는 폴리누클레오티드를 의미하고, 여기서 EM 1 폴리펩티드를 암호화하는 폴리누클레오티드의 대립유전자는 대립유전자 형태의 상기 EM 1 폴리펩티드를 암호화한다.

소정의 폴리펩티드가 EM 1의 단편, 변이체, 유사체 또는 대립유전자성 변이체일 수 있거나, 또는 이는 이들 중의 둘 이상일 수 있는데, 예를 들면, 특정 폴리펩티드는 EM 1 폴리펩티드의 유사체와 변이체 둘 다일 수 있다. 예를 들면, 보다 단축된 버전의 EM 1 분자(예를 들면, EM 1의 단편)이 실험실 내에서 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 단편을 당해 분야에 공지된 수단을 통하여 변이시키는 경우, EM 1의 단편이자 변이체인 특정 분자가 생성된다. 또 다른 예에서는, EM 1의 변이체가 생성될 수 있는데, 이는 몇몇 포유류 개개인에게서 EM 1의 대립유전자로서 존재하는 것으로 나중에 밝혀졌다. 따라서, 이러한 변이체 EM 1 분자는 EM 1의 변이체이자 대립유전자성 변이체일 것이다. 이와 같은 단편, 변이체, 대립유전자성 변이체 및 유사체의 조합이 본 발명에 포괄된다.

EM 1과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는 EM 1을 암호화하는 폴리누클레오티드와 실질적으로 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리누클레오티드가 본 발명에 또한 포괄된다. "실질적으로 동일한 서열"이란 참조 서열, 예를 들면, 또 다른 핵산 또는 폴리펩티드와 약 70% 이상의 서열 동질율, 전형적으로 참조 서열과 약 80% 이상의 서열 동질율, 바람직하게는 참조 서열과 약 90% 이상의 서열 동질율, 더욱 바람직하게는 참조 서열과 약 95% 이상의 서열 동질율, 가장 바람직하게는 참조 서열과 약 97% 이상의 서열 동질율을 나타내는 핵산 또는 폴리펩티드를 의미한다. 서열에 대한 비교 길이는 일반적으로 약 75개 이상의 누클레오티드 염기 또는 25개 아미노산, 더욱 바람직하게는 약 150개 이상의 누클레오티드 염기 또는 50개 아미노산, 가장 바람직하게는 약 243 내지 264개의 누클레오티드 염기 또는 81 내지 88개 아미노산일 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 "폴리펩티드"는 아미노산의 분자 쇄를 지시하고 특정한 길이의 상기 생성물을 지칭하지는 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의 내에 포함된다. 이러한 용어는 또한, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등과 같은 발현-후 변형이 가해진 폴리펩티드를 포괄한다. EM 1은 일반적으로, 엔도스타틴과 70% 미만의 아미노산 서열 동질율을 나타낸다.

본원에서 사용된 바와 같은 "서열 동질율"이란 두 중합체성 분자, 예를 들면, 두 폴리누클레오티드 또는 두 폴리펩티드 간의 아단위 서열 유사율을 지칭한다. 이들 두 분자 모두에서의 아단위 위치가 동일한 단량체성 아단위로써 채워지는 경우, 예를 들면, 두 펩티드 각각에서의 특정 위치가 세린으로 채워지는 경우에는, 이들이 상기 위치에서 동일하다. 두 서열간의 동질율은 매칭 또는 동일한 위치의 수와 직접적인 함수 관계인데, 예를 들어, 두 펩티드 또는 화합물 서열 중에서의 절반의 위치(예를 들어, 길이가 10 아단위인 중합체 중의 5개 위치)가 동일한 경우에는, 두 서열이 50% 동일한 것이고; 위치의 90%, 예를 들면, 10개 중의 9개가 매치되는 경우에는, 두 서열이 90% 서열 동질율을 나타내는 것이다. 예로써, 아미노산 서열 VRGLQP과 HAFLQP는 6개 위치 중에 3개를 공통적으로 지니고 있으므로, 50% 서열 동질율을 나타내는 반면, 서열 VRGLQP와 AFLPQ는 5개 위치 중에 3개를 공통적으로 지니고 있으므로, 60% 서열 동질율을 나타낸다. 두 서열 간의 동질율은 매칭되거나 동일한 위치의 수와 직접적인 함수 관계이다. 따라서, 참조 서열의 특정 부분이 특정한 펩티드에서 결실된 경우, 이와 같이 결실된 부분은 서열 동질율을 산정하는데 고려되지 않는데, 예를 들면, VRGLQP와 VRGLP가 6개 위치 중에 5개를 공통적으로 지니고 있으므로 83.3% 서열 동질율을 나타낸다.

동질율은 종종 서열 분석 소프트웨어, 예를 들면, BLASTN 또는 BLASTP(http://www.ncbi.nlm.gov/BLAST/에서 입수 가능함)를 사용하여 측정한다. BLASTN(누클레오티드 서열에 대함)에 의해 두 서열을 비교하기 위한 생략성 파라미터(예를 들면, 서로에 대하여 두 서열을 "Balst"-ing함, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/b12.html)는 매치=1, 미스매치에 대한 패널티=-2, 오픈 갭=5, 및 연장 갭=2에 대해 보수한다. 단백질 서열에 대해서는 BLASTP를 사용하는 경우, 생략성 파라미터를 매치=0, 미스매치에 대한 패널티=0, 오픈 갭=11 및 연장 갭=1에 대해 보수한다.

두 서열이 서열 상동성을 나타내는 경우, 이는 두 서열이 단지 보존적 치환물(대체물)에 의해서만 서로 상이하다는 것을 의미한다. 폴리펩티드 서열의 경우, 이러한 보존적 치환물은 동일한 부류의 또 다른 아미노산에 대한 서열 중의 소정의 위치에서의 하나의 아미노산의 치환물(예를 들어, 소수성, 전하, pK 또는 기타 형태적 또는 화학적 성질의 특징을 공유하는 아미노산, 예를 들면, 루이신을 대체하는 발린, 라이신을 대체하는 아르기닌)로 이루어지거나, 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성을 파괴시키는 정도로 폴리펩티드의 형태 또는 폴딩을 변형시키지 않는 서열 위치에 국재된, 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환물, 결실물 또는 삽입물로써 이루어진다. "보존적 치환물"의 예로는 또 다른 잔기를 대체하는 이소루이신, 발린, 루이신 또는 메티오닌 등의 하나의 비-극성(소수성) 잔기 치환물; 아르기닌과 라이신, 글루타민과 아스파라긴, 글리신과 세린과 같이, 또 다른 잔기를 대체하는 하나의 극성(친수성) 잔기 치환물; 또 다른 잔기를 대체하는 라이신, 아르기닌 또는 히스티닌 등의 하나의 염기성 잔기 치환물; 또는 또 다른 잔기를 대체하는 아스파르트산 또는 글루탐산 등의 하나의 산성 잔기 치환물이 있거나; 또는 상기 폴리펩티드가 필수적인 생물학적 활성을 나타내는 경우에만, 비-유도체화 잔기 대신 화학적으로 유도체화된 잔기를 사용할 수 있다. 서열 상동성을 나타내는 두 서열을 "서열 동족체"로 칭할 수 있다.

폴리펩티드에 대한 상동성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어(예를 들면, 서열 분석 소프트웨어 패키지; the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)를 사용하여 측정한다. 단백질 분석 소프트웨어는 상동율을 각종 치환물, 결실물 및 기타 변형물에 할당함으로써 유사한 서열을 매치시킨다. 보존적 치환물에는 전형적으로, 다음 그룹 내의 치환물이 포함된다: 글리신, 알라닌, 발린, 이소루이신, 루이신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌, 라이신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신.

또한, 본 발명에는 EM 1의 화학적 유도체가 포괄된다. "화학적 유도체"는 작용성 측쇄 그룹의 반응에 의해 화학적으로 유도체화된 하나 이상의 잔기를 갖는 피검 대상 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 유도체화 잔기로는, 예를 들어, 자유 아미노 그룹이 유도체화되어 아민 하이드로클로라이드, p-톨루엔 설포닐 그룹, 카보벤족시 그룹, t-부틸옥시카보닐 그룹, 클로로아세틸 그룹 또는 포밀 그룹을 형성하는 분자가 있다. 자유 카복실 그룹을 유도체화하여 염, 메틸 및 에틸 에스테르 또는 기타 유형의 에스테르 또는 하이드라지드를 형성할 수 있다. 자유 하이드록실 그룹을 유도체화하여 O-아실 또는 O-알킬 유도체를 형성할 수 있다. 히스티딘의 이미다졸 질소를 유도체화하여 N-임벤질히스티딘을 형성할 수 있다. 또한, 화학적 유도체로서, 20개 표준 아미노산의 하나 이상의 천연 아미노산 유도체를 함유하는 펩티드가 포함된다. 예를 들면, 프롤린이 4-하이드록시프롤린으로 대체될 수 있고; 라이신이 5-하이드록시라이신으로 대체될 수 있으며; 히스티딘이 3-메틸히스티딘으로 대체될 수 있고; 세린이 호모세린으로 대체될 수 있으며; 라이신이 오르니틴으로 대체될 수 있다.

EM 1을 암호화하는 폴리누클레오티드를 단리된 DNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 클로닝할 수 있다. 본원에서 "단리된"으로서 지칭된 핵산 또는 폴리펩티드는 추가의 프로세싱을 진행할 수 있는, 이들이 수득되는(예를 들면, 핵산 혼합물 또는 세포 중의 존재물로서) 생물학적 공급원 물질을 거의 함유하고 있지 않는(즉, 이들 물질로부터 분리 제거된) 핵산 또는 폴리펩티드이다. "단리된" 핵산 또는 폴리펩티드에는 본질적으로 순수한 핵산 또는 폴리펩티드, 화학적 합성이나 화학적 방법 또는 생물학적 방법의 조합에 의해 생성된 핵산 또는 폴리펩티드, 및 재조합적으로 제조된 핵산 또는 폴리펩티드가 분리되는 것을 포함한, 본원에 기재된 방법, 유사한 방법 또는 기타 적합한 방법에 의해 수득된 핵산 또는 폴리펩티드가 포함된다. 따라서, 단리된 폴리펩티드는 통상적으로 결합되는 기타 단백질, 탄수화물, 지질 및 기타 세포상 성분을 비교적 함유하지 않는 폴리펩티드를 의미한다. 단리된 핵산은 핵산이 유도되는 유기체의 천연 지놈에서 바로 인접한 둘 다의 핵산과 바로 인접하여 있지 않다(즉, 이들 핵산 둘 다와 공유적으로 연결되어 있다). 따라서, 상기 용어에는, 예를 들면, 특정 벡터(예를 들면, 자가성 복제 바이러스 또는 플라스미드) 내로 혼입되는 핵산, 또는 화학적 방법이나 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성된 핵산 단편과 같은 기타 핵산과 독립적으로 별개의 분자로서 존재하는 핵산이 포함된다.

본 발명의 폴리누클레오티드 및 단백질을 또한 사용하여 기타 항-혈관형성 단백질을 분리시키는 프로브를 고안할 수 있다. 특별한 방법이 야코브(Jacobs) 등의 미국 특허 제5,837,490호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다)에 제시되어 있다. 올리고누클레오티드 프로브의 고안은 바람직하게는 이들 파라미터를 따라야 한다: (a) 존재할 경우, 가장 적은 수의 불명료한 염기("N's")를 갖는 서열 영역으로 고안해야 하고; (b) T_m이 대략 80℃(각 A 또는 T에 대해서는 2℃로 가정하고 각 G 또는 C에 대해서는 4℃로 가정함)가 되도록 고안해야 한다.

올리고누클레오티드는 바람직하게는, 올리고누클레오티드를 표지시키는데 통상적으로 이용되는 기술을 사용하여 g-³²P ATP(특이 활성 6000Ci/mmole) 및 T4 폴리누클레오티드 키나제로 표지시켜야 한다. 기타 표지화 기술을 이용할 수도 있다. 혼입되지 않은 표지는 바람직하게는, 겔 여과 크로마토그래피 또는 기타 정립된 방법에 의해 제거해야 한다. 프로브 내로 혼입된 방사능의 양은 신틸레이션 계수기에서 정량적으로 측정해야 한다. 바람직하게는, 생성된 프로브의 특이 활성은 대략 4 x 10⁶dpm/pmole이어야 한다. 완전한 길이의 클론의 풀을 함유하는 세균성 배양물을 바람직하게는 해동시켜야 하고 모액 100㎕를 사용하여 앰피실린을 100㎍/ml으로 함유하는 멸균성 L-브로쓰 25ml를 함유하는 멸균성 배양 플라스크를 접종한다. 이러한 배양물은 바람직하게는, 37℃에서 포화되도록 성장시켜야 하고, 이와 같이 포화된 배양물을 바람직하게는 신선한 L-브로쓰에서 희석시켜야 한다. 등취량의 이들 희석액을 바람직하게는 도말하여, 37℃에서 밤새 성장시킬 때 150mm 페트리 디쉬 중에서 앰피실린 100㎍/ml와 한천 1.5%를 함유하는 L-브로쓰를 함유하는 고형의 세균학적 배지 상에서 대략 5000개의 별개의 잘 단리된 콜로니를 생성시킬 희석율과 용량을 결정해야 한다. 별개의 잘 단리된 콜로니를 수득하기 위한 기타 공지된 방법을 이용할 수도 있다.

이어서, 표준 콜로니 하이브리드화 과정을 이용하여 상기 콜로니를 니트로셀룰로즈 필터로 옮기고, 융해시키며, 변성시킨 다음, 이들을 베이킹시킨다. 고도로 엄격한 조건은, 예를 들면, 적어도 65℃에서의 1 x SSC, 또는 42℃에서의 1 x SSC 및 50% 포름아미드 정도로 엄격한 조건이다. 중간 정도로 엄격한 조건은 적어도 65℃에서의 4 x SSC, 또는 42℃에서의 4 x SSC 및 50% 포름아미드 정도로 엄격한 조건이다. 적게 엄격한 조건은 적어도 50℃에서의 4 x SSC, 또는 40℃에서의 6 x SSC 및 50% 포름아미드 정도로 엄격한 조건이다.

이어서, 상기 필터를 바람직하게는, 0.5% SDS, 효모 RNA 100㎍/ml ALC 10mM EDTA(150mm 필터당 대략 10ml)를 함유하는 6 x SSC(20x 모액은 175.3g NaCl/l, 88.2g Na 시트레이트/l이고, NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조정됨)에서 온화하게 진탕시키면서 1시간 동안 65℃에서 배양한다. 바람직하게는, 이어서 상기 프로브를 1 x 10⁶dpm/ml 이상의 농도로 하이브리드화 혼합물에 가한다. 이어서, 상기 필터를 바람직하게는 밤새 온화하게 진탕시키면서 65℃에서 배양한다. 이어서, 상기 필터를 바람직하게는 진탕시키지 않고 실온에서 2x SSC/0.5% SDS 500ml에서 세척한 다음, 15분 동안 온화하게 진탕시키면서 실온에서 2x SSC/0.1% SDS 500ml에서 세척시킨다. 65℃에서 30분 내지 1시간 동안 0.1x SSC/0.5% SDS로 세 번째 세척하는 것의 임의 공정이다. 이어서, 필터를 바람직하게는 건조시키고, 포지티브를 X-선 필름 상에서 가시화하기에 충분한 시간 동안 자동방사선 사진술을 적용한다. 기타 공지된 하이브리드화 방법을 이용할 수도 있다. 이어서, 포지티브 콜로니를 골라 내고, 배양액에서 성장시킨 다음, 표준 과정을 이용하여 플라스미드 DNA를 분리시킨다. 이어서, 상기 클론을 제한 분석, 하이브리드화 분석 또는 DNA 서열화에 의해 확인할 수 있다.

본 발명은 또한, EM 1, 이의 단편, 변이체, 동족체, 유사체 및 대립유전자성 변이체를 포함하는 융합 단백질 및 키메릭 단백질을 포함한다. 융합 또는 키메릭 단백질은 단일 단백질의 다중체, 예를 들면, EM 1의 반복체 또는 아포미그렌(apomigren)의 반복체로 이루어질 수 있거나, 또는 융합 및 키메릭 단백질은 여러 개의 단백질, 예를 들면, EM 1과 아포미그렌으로 구성될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 둘 이상의 공지된 항-혈관형성 단백질(예를 들면, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 레스틴 또는 아포미그렌, 또는 이들의 생물학적 활성 단편)의 조합물; 표적화제와 조합된 항-혈관형성 단백질(예를 들면, 표피 성장 인자(EGF) 또는 RGD 펩티드와 조합된 엔도스타틴); 또는 면역글로불린 분자와 조합된 항-혈관형성 단백질(예를 들면,엔도스타틴과, 구체적으로 Fc 부분이 제거된 IgG). 본원에서 사용된 바와 같이, "레스틴"은 약 170개 내지 약 200개의 아미노산 잔기를 포함하는 단백질이고, 사람 유형 XV 콜라겐의 α1 쇄의 NC10 영역의 C-말단과 70% 이상의 서열 동질율을 나타낸다. 본원에서 사용된 바와 같은 "아포미그렌"은 레스틴의 단편이고, 사람 유형 XV 콜라겐의 α1 쇄의 NC10 영역의 C-말단에 상응하는 마지막 80 내지 90개의 인접한 아미노산을 포함한다. 당해 융합 및 키메릭 단백질에는 또한, EM 1, 이의 단편, 변이체, 동족체, 유사체 및 대립유전자성 변이체, 및 기타 항-혈관형성 단백질, 예를 들면, 엔도스타틴 또는 안지오스타틴이 포함될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "융합 단백질"은 예를 들어, 화학치료제를 운반하기 위한 부가의 성분을 포괄할 수 있는데, 여기서 이러한 화학치료제를 암호화하는 폴리누클레오티드가 항-혈관형성 단백질을 암호화하는 폴리누클레오티드에 연결되어 있다. 융합 단백질은 또한, 항-혈관형성 단백질의 다중체, 예를 들면, 엔도스타틴의 이량체 또는 삼량체를 포괄할 수 있다. 이러한 융합 단백질은 해독-후 변영을 통하여 함께 연결될 수 있거나(예를 들면, 화학적으로 연결됨), 또는 완전한 융합 단백질을 재조합적으로 만들 수 있다.

또한, 본 발명에는, 생물학적 성분으로서, 포유류 조직에서의 안지오제네시스를 억제시키거나 증진시키기 위한 EM 1 뿐만 아니라 이의 단편, 변이체, 동족체, 유사체 및 대립유전자성 변이체를 함유하는 조성물; 및 혈관형성 활성 또는 이의 결여를 특징으로 하거나 이와 연관된 질환 및 질병을 진단, 예후 및 치료하는데 있어서의 상기 조성물의 용도가 포함된다. 이러한 방법은 경구, 국소, 주사, 이식, 서방출 또는 기타 전달 방법에 의해 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명은 혈관형성 활성과 연관되는 질환 또는 질병을 치료하기 위한, 조성물 중의 생물학적 활성제로서 EM 1, 및 이의 단편, 변이체, 동족체, 유사체, 대립유전자성 변이체 및 융합 및 키메릭 단백질의 용도를 포함한다. 이러한 질환의 치료 방법은 병에 걸린 조직을 EM 1, 이의 단편, 변이체, 동족체, 유사체 또는 대립유전자성 변이체를 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명은 치료학적 유효량의 EM 1 또는 이의 생물학적 활성 단편; 항-혈관형성 활성을 보유하고 있는 EM 1 단편의 조합물; 또는 EM 1 효능제 또는 길항제를 사용하여 안지오제네시스 매개된 질환을 치료하는 방법을 포함한다. 안지오제네시스 매개된 질환으로는 암, 고형 종양, 혈액-기인된 종양(예: 백혈병), 종양 전이, 양성 종양(예: 혈관종, 음향 신경종, 신경섬유종, 트라코마 및 화농성 육아종), 류미티스성 관절염, 건선, 눈의 혈관형성 질환(예: 당뇨병성 망막증, 조숙 망막증, 퇴화성 반점, 각막 이식 거부, 신생맥관성 녹내장, 수정체뒤의 섬유증식증, 피부조홍), 오슬러-웹버(Osler-Webber) 증후군, 심근 안지오제네시스, 플라크 신생맥관형성, 모세관확장증, 혈우병환자 관절, 섬유성 혈관종 및 외상 육아가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. EM 1은 내피 세포의 과도하거나 비정상적인 자극으로 인한 질환을 치료하는데 유용하다. 이들 질환으로는 장 유착증, 크론병(Crohn's disease), 아테롬성 동맥경화증, 공피증 및 비대성 반흔(즉, 해족증)이 있지만, 이에 제한되지는 않는다. EM 1은 배아 이식에 요구되는 맥관형성을 예방함으로써 산아조절제로서 사용될 수 있다. EM 1은 고양이 할퀴기 질환(Rochele minalia quintosa) 및 궤양(Heliobacter pylori)과 같이 병리학적 결과로서 안지오제네시스를 나타내는 질환 치료에 유용하다. EM 1은 또한, 예를 들어, 지방 조직에서의 모세혈관형성을 억제함으로써, 이의 팽창을 방지하여, 투석 이식 맥관성 발작 협착증 및 비만을 예방하는데 사용할 수 있다. EM 1은 또한, 국재화된(예를 들면, 비-전이된) 질환을 치료하는데 사용할 수 있다. "암"은 비정상적인 세포내 발육의 신생물성 성장, 과형성 또는 증식성 성장, 또는 병리학적 성태를 의미하며, 이에는 고형 종양, 비-고형 종양, 및 예를 들어, 백혈병에서 관찰되는 바와 같은 비정상적인 모든 세포내 증식이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "암"은 또한, 안지오제네시스-의존적 암 및 종양, 즉 이들의 성장(용적 및/또는 덩어리 팽창)을 위해서는 이들에게 혈액을 공급해주는 혈관의 수와 밀도 증가를 필요로 하는 종양을 의미한다. "퇴행"은 종양 덩어리와 크기의 감소를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료학적 유효량"은 의미있는 환자 이득, 즉 관련된 의학적 질환의 치료, 치유, 예방 또는 경감, 또는 이러한 질환의 치료, 치유, 예방 또는 경감율 증가를 나타내기에 충분한 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총 량을 의미한다. 조합물로 적용되는 경우, 상기 용어는 일련으로 또는 동시에 조합하여 투여되는지의 여부에 상관없이, 치료학적 효과를 가져다 주는 활성 성분의 조합 량을 지칭한다.

또 다른 한편, 예를 들어, 상처 치유 또는 경색-후 심장 조직에서 안지오제네시스 증가가 요망되는 경우에는, EM 1 단백질에 대한 항체 또는 항혈청을 사용하여 국재화된 본래의 항-혈관형성 단백질 및 프로세스를 차단시킴으로써, 조직의 위축을 억제시키도록 새로운 혈관의 형성을 증가시킬 수 있다.

EM 1을 질환 치료를 위한 기타 조성물 및 과정과 함께 사용할 수 있다. 예를 들면, 특정 종양은 통상적으로 수술하거나, 방사선처리하거나, 화학요법을 이용하거나, 또는 EM 1과 함께 면역치료한 다음, EM 1을 연속적으로 환자에게 투여하여 미소전이물의 휴지 상태를 연장시키고 모든 잔류성 1차 종양의 성장을 안정화 및 억제시킬 수 있다. EM 1, EM 1 단편, EM 1 항혈청, EM 1 수용체 효능제, EM 1 수용체 길항제 또는 이들의 조합물을 기타 항-혈관형성 화합물 또는 단백질, 또는 기타 항-혈관형성 단백질(예: 안지오스타틴, 엔도스타틴, 레스틴, 아포미그렌)의 단편, 항혈청, 수용체 효능제, 수용체 길항제와 조합할 수 있다. 부가적으로, EM 1, EM 1 단편, EM 1 항혈청, EM 1 수용체 효능제, EM 1 수용체 길항제 또는 이들의 조합물을 약제학적으로 허용되는 부형제, 및 임의의 서방출 매트릭스, 예를 들면, 생분해 가능한 중합체와 조합하여 치료학적 조성물을 형성한다. 본 발명의 조성물은 또한, 기타 항-혈관형성 단백질 또는 화학적 화합물, 예를 들어, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 레스틴 및 아포미그렌(이들 모두는 슈카트메, 비카스 피에 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 "레스틴 및 이의 사용 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허원 제XX/XXX,XXX호에 기재되어 있으며, 이러한 특허원의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다), 및 이의 변이체, 단편 및 유사체를 함유할 수 있다. 당해 조성물은 화학치료제 또는 방사선 치료제와 같이, 단백질의 활성을 증진시키거나, 이의 활성을 부여하거나, 또는 치료에 사용하게 해주는 기타 제제를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 부가의 인자 및/또는 제제가 본 발명의 단백질과의 상승 효과를 창출하거나, 또는 부작용을 최소화하기 위하여 당해 조성물에 포함될 수 있다. 부가적으로, 본 발명에 따르는 조성물의 투여는 기타 치료제와 동시에 이루어질 수 있는데, 예를 들면, 화학요법 또는 방사선 치료 섭생과 연계하여 투여할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 단백질을 포함하는 조성물을 포유류 조직과 접촉시킴으로써 이러한 포유류 조직에서의 안지오제네시스를 억제하는 방법을 포함한다. "접촉시키는 것"이란 국부적 투여 뿐만 아니라, 당해 조성물을 조직 또는 조직의 세포 내로 도입하는 전달 방식을 의미한다.

서방출 또는 지속적인 방출 전달 시스템의 사용이 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 시스템은 수술이 어렵거나 불가능한 상황, 예를 들어, 환자가 노쇄하였거나 질환 자체에 의해 쇠약해닌 경우, 또는 위험-이익 분석이 치료 보다는 조절을 지시하는 경우에 상당히 바람직하다.

본원에서 사용된 바와 같은 서방출 매트릭스는 효소적 또는 산/염기 가수분해, 또는 해리에 의해 분해 가능한 물질, 통상적으로 중합체로 만들어진 매트릭스이다. 일단 체내에 삽입되면, 이러한 매트릭스는 효소와 체액에 의해 작용된다. 서방출 매트릭스는 바람직하게는, 리포좀, 폴리락티드(폴리락트산), 폴리글리콜라이드(글리콜산의 중합체), 폴리락티드 코-글리콜라이드(락트산과 글리콜산의 공중합체), 폴리삭카라이드, 폴리(오르토) 에스테르, 폴리단백질, 하이알루론산, 콜라겐, 콘드로이틴 설페이트, 카복실산, 지방산, 인지질, 폴리삭카라이드, 핵산, 폴리아미노산, 아미노산(예: 페닐알라닌, 티로신, 이소루이신), 폴리누클레오티드, 폴리비닐 프로필렌, 폴리비닐피롤리돈 및 실리콘 등의 생물학적 적합성 물질 중에서 선택한다. 바람직한 생분해 가능한 매트릭스는 폴리락티드, 폴리글리콜라이드, 또는 폴리락티드 코-글리콜라이드(락트산과 글리콜산의 공중합체) 중의 어느 하나의 매트릭스이다.

본 발명의 안지오제네시스-조절성 치료학적 조성물은 고형, 액상 또는 에어로졸일 수 있으며, 공지된 어떠한 투여 경로에 의해 투여할 수 있다. 고형 조성물의 예로는 환제, 크림 및 내이식성 투여 단위가 있다. 환제는 경구 투여할 수 있고, 크림은 국부적으로 투여할 수 있다. 내이식성 투여 단위는 국소적으로, 예를 들면, 종양 부위에 투여할 수 있거나, 안지오제네시스-조절성 조성물을, 예를 들어, 피하적으로 체내 방출시키기 위해 내이식시킬 수 있다. 액상 조성물의 예로는 피하, 정맥내, 관절내 주사용으로 조정된 제형, 및 국소 및 안내 투여용 제형이 있다. 에어로졸 제형의 예로는 폐에 투여하기 위한 흡입제 제형이 있다.

상기 언급된 항-혈관형성 활성을 지니고 있는 EM 1 단백질 및 단백질 단편은 당해 분야의 숙련인에게 공지된 제형 방법을 사용하여 약제학적으로 허용되는 제형 중에 분리되고 실질적으로 정제된 단백질 및 단백질 단편으로서 제공될 수 있다. 이들 제형은 표준 경로로 투여할 수 있다. 일반적으로 배합물을 국부, 경피, 복강내, 두개내, 대뇌실내, 뇌내, 질내, 자궁내, 경구, 직장 또는 비경구(예: 정맥내, 척수내, 피하 또는 근육내) 경로로 투여할 수 있다. 또한, EM 1은 당해 화합물의 서방출을 허용해주는 생분해 가능한 중합체 내로 혼입할 수 있으며, 이러한 중합체는 EM 1이 체내에 서서히 방출되도록 약물 전달이 요망되는, 예를 들어, 종양 또는 이식된 부위 근처에 이식되어진다. 삼투압 미니펌프를 사용하여, 고농도의 EM 1가 캐뉼라를 통하여 관심있는 부위에 조절된 방식으로 전달되도록 해줄 수 있는데, 예를 들면, 상기 종양에 대한 맥관내 공급물 또는 전이성 성장물 내로 직접적으로 전달한다. 생분해 가능한 중합체 및 이의 용도가, 예를 들면, 문헌[참조: Brem et al. (1991) (J. Neurosurg. 74:441-446); 이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다]에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 예를 들어, 단위 용량을 주사함으로써 정맥내 투여할 수 있다. 본 발명의 치료학적 조성물과 관련하여 사용되는 경우의 용어 "단위 용량"은 특정 피검자에 대한 단일 투여량으로서 적합한 생리학적으로 별개의 단위를 지칭하고, 각 단위는 요구되는 희석제, 즉 담체 또는 비히클과 함께 목적하는 치료학적 효과를 야기시키도록 산정된 활성 물질의 예정량을 함유하고 있다.

본 발명에 따르는 조성물의 투여 방식으로는 정맥내, 근육내, 복강내, 흉골내, 피하 및 관절내 주사 및 주입이 있다. 비경구 주사용 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 멸균성 수성 또는 비-수성 용제, 분산제, 현탁제 또는 유제 뿐만 아니라 사용하기 직전에 멸균성 주사용 용제 또는 분산제로 재구성하기 위한 멸균성 산제를 포함한다. 적합한 수성 및 비-수성 담체, 희석제, 용매 또는 비히클의 예로는 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 카복시메틸셀룰로즈 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일(예: 올리브유) 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들면, 에틸 올레에이트가 있다. 예를 들면, 레시틴과 같은 피복재를 사용하고, 분산제의 경우 목적하는 입자 크기를 유지하며 계면활성제를 사용함으로써 적당한 유동성을 유지할 수 있다. 이들 조성물은 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제 등의 보조제를 함유할 수도 있다. 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 각종 항균제 및 항진균제를 혼입시킴으로써 미생물의 작용을 방지시킬 수 있다. 당, 염화나트륨 등의 등장성 제제를 포함하는 것이 바람직할 수도 있다. 흡수를 지연시키는, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴 등의 제제를 혼입시킴으로써 주사용 약제학적 형태의 흡수를 연장시킬 수 있다. 약물의 마이크로캡슐 매트릭스를 폴리락티드-폴리글리콜리드, 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물) 등의 생분해 가능한 중합체에 형성시킴으로써 주사용 데포 형태를 만든다. 중합체에 대한 약물의 비율과 이용된 특정한 중합체의 성질에 따라서, 약물 방출 속도를 조절할 수 있다. 데포 주사용 제형은 또한, 약물을 체 조직과 부합되는 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 포획시킴으로써 제조한다. 이러한 주사용 제형은, 예를 들어, 세균성-보존 필터를 통하여 여과시키거나, 또는 사용하기 직전에 멸균수 또는 기타 멸균성 주사용 매질에 용해되거나 분산시킬 수 있는 멸균성 고형 조성물의 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균시킬 수 있다.

본 발명의 치료학적 조성물은 이에, 예를 들면, 무기 또는 유기 산으로부터 유도될 수 있는 성분들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함할 수 있다. "약제학적으로 허용되는 염"이란 철저한 의학적 판단하에서 해로운 독성, 자극, 알레르기성 반응 등을 유발시키지 않으면서 사람과 하등 동물의 조직과 접촉해서 사용하는데 적합하고 합리적인 이점/위험비로 균형 잡힌 염을 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 염은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌[참조: S.M.Berge et al., J.Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1 et seq.]에는 약제학적으로 허용되는 염이 상세히 기재되어 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는, 예를 들어, 염산 또는 인산 등의 무기산, 또는 아세트산, 타르타르산, 만델산 등의 유기 산과 형성되는 산 부가염(폴리펩티드의 아미노 그룹과 형성됨)이 있다. 자유 카복실 그룹과 형성되는 염은, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화철 등의 무기 염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 이러한 염은 본 발명의 화합물을 최종적으로 분리 및 정제하는 동안에 동일계 반응내에서 제조할 수 있거나, 또는 자유 염기 작용기를 적합한 유기 산과 반응시킴으로써 별도로 제조할 수 있다. 대표적인 산 부가염으로는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 시트레이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠설포네이트, 바이설페이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포설포네이트, 디글루코네이트, 글리세로포스페이트, 헤미설페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 푸마레이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시메탄설포네이트(이세티오네이트), 락테이트, 말레에이트, 메탄설포네이트, 니코티네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 석시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 포스페이트, 글루타메이트, 바이카보네이트, p-톨루엔설포네이트 및 운데카노에이트가 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 염기성 질소 함유 그룹을 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드 등의 저급 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸, 디부틸 및 디아밀 설페이트 등의 디알킬 설페이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드 등의 장쇄 할라이드; 벤질 및 펜에틸 브로마이드 등의 아릴알킬 할라이드 등의 제제와 4급화시킬 수 있다. 이로써 물 또는 오일-가용성 또는 분산성 생성물이 수득된다. 약제학적으로 허용되는 산 부가 염을 형성하는데 이용될 수 있는 산의 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산 및 인산 등의 무기 산, 및 옥살산, 말레산, 석신산 및 시트르산 등의 유기 산이 있다.

본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는", "생리학적으로 허용되는" 및 이의 문법상 다양한 표현들은 이들이 조성물, 담체, 희석제 및 시약에 지칭되는 경우에, 상호교환적으로 사용되며, 상기 물질이 구토, 현기증, 배탈 등의 바람직하지 못한 생리학적 효과를 최소한도로 하면서 포유동물에게 투여할 수 있다는 것을 나타낸다. 이에 용해되거나 분산된 활성 성분을 함유하는 약리학적 조성물의 제조는 당해 분야에 널리 인식되거 있고, 제형에 따라 제한될 필요는 없다. 전형적으로, 이러한 조성물은 액상 용제 또는 현탁제와 같은 주사용제로서 제조되지만, 사용 이전에 액체 중의, 용제 또는 현탁제에 적합한 고형 형태로 제조할 수도 있다. 이 제제를 또한 유화시킬 수도 있다.

활성 성분은 약제학적으로 허용되고 이러한 활성 성분과 부합되는 부형제와 본원에 기재된 치료학적 방법에 사용하기에 적합한 양으로 혼합할 수 있다. 적합한 부형제의 예를 들면, 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 배합물이 있다. 또한, 경우에 따라, 당해 조성물은 활성 성분의 효능을 증진시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 등의 보조 물질을 미량 함유할 수 있다.

본 발명의 EM 1 폴리펩티드는 또한, 프로드럭을 포함하는 조성물에 포함될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "프로드럭"은, 예를 들면, 혈액 중에서 효소적 가수분해에 의해 생체내에서 신속하게 변환되어 모 화합물을 생성시키는 화합물을 지칭한다. 이에 대한 철저한 논의가 본원에 참조 문헌으로 삽입된 문헌[참조: T.Higuchi and V.Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol.14 of thd A.C.S. Symposium Series, Edward B.Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987]에 제공되어 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용되는 프로드럭"은 (1) 철저한 의학적 판단하에서 해로운 독성, 자극, 알레르기성 반응 등을 유발시키지 않으면서 사람과 동물의 조직과 접촉해서 사용하는데 적합하고 합리적인 이점 대 위험비로 균형 잡히며 의도하는 목적에 효과적이고; (2) 가능한 경우, 모 화합물의 쯔비터이온 형태를 지칭한다.

본 발명의 EM 1의 투여량은 치료받고자 하는 질환 상태 또는 질병과 사람 또는 동물의 체중 및 상태 및 화합물의 투여 경로에 따라서 좌우될 것이다. 사람 또는 동물을 치료하는 경우에는, EM 1 단백질 또는 아포미그렌 단백질 약 10mg/체중 kg 내지 약 20mg/체중 kg을 투여할 수 있다. 조합 치료법, 예를 들면, 본 발명의 EM 1을 방사선 치료, 화학요법 또는 면역치료법과 조합하는 경우에는, 투여량을, 예를 들어, 약 0.1mg/체중 kg 내지 약 0.2mg/체중 kg으로 감소시킬 수 있다. 특정한 동물 또는 사람에서의 EM 1의 반감기에 따라서, EM 1을 1일 수 회 내지 1주 1회로 투여할 수 있다. 본 발명의 사람과 가축 모두에 적용할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 본 발명의 방법은 동시에 또는 장기간에 걸쳐 1회 뿐만 아니라 수회 투여하는 것을 고려하고 있다. 또한, EM 1은 기타 형태의 치료법, 예를 들어, 화학요법, 방사선 치료 또는 면역치료법과 연계하여 투여할 수 있다.

당해 EM 1 제형에는 경구, 직장, 안과(초자체내 또는 방내 포함), 비내, 국부(볼 및 설하 포함), 자궁내, 질내 또는 비경구(피하, 복강내, 근육내, 정맥내, 피내, 두개내, 기관내 및 경막외 포함) 투여에 적합한 것들이 포함된다. EM 1 제형은 편리하게 단위 투여량 형태로 존재할 수 있고 통상적인 약제학적 기술에 의해 제조될 수 있다. 이러한 기술에는 활성 성분과 약제학적 담체(들) 또는 부형제(들)을 혼합하는 단계이 포함된다. 일반적으로, 이러한 제형은 활성 성분을 액상 담체 또는 미세하게 나눠진 고형 담체 또는 둘 다와 균일하고도 친밀하게 혼합한 다음, 필요에 따라, 생성물의 외형을 만듦으로써 제조한다.

비경구 투여에 적합한 제형에는 이러한 제형이 의도하는 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 해주는 용질, 산화방지제, 완충제 및 제균제를 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균성 주사 용제; 및 현탁화제 및 점증제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균성 현탁제가 포함된다. 상기 제형은 단일-용량 또는 수회분 용량 용기, 예를 들면, 밀봉된 앰풀 및 바이알에 존재할 수 있고, 사용 직전에 멸균성 액상 담체, 예를 들어, 주사용수의 첨가 만을 요구하는 동결 건조된 조건 하에 저장할 수 있다. 즉석의 주사 용제 및 현탁제는 앞서 언급된 종류의 멸균성 산제, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다.

치료학적 유효량의 본 발명에 따르는 단백질을 경구 투여하는 경우, 본 발명의 EM 1 단백질은 정제, 캅셀제, 산제, 용제 또는 엘릭서제의 형태일 것이다. 정제 형태로 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 젤라딘과 같은 고형 담체 또는 보조제를 부가적으로 함유할 수 있다. 정제, 캅셀제 및 산제는 본 발명의 단백질을 약 5 내지 95%, 바람직하게는 약 25 내지 90% 함유한다. 액상 형태로 투여되는 경우, 물, 석유, 동물 또는 식물 기원의 오일, 예를 들면, 땅콩유, 광유, 대두유 또는 참깨유, 또는 합성 오일 등의 액상 담체를 가할 수 있다. 액상 형태의 약제학적 조성물은 생리학적 식염수, 덱스트로즈 또는 기타 삭카라이드 용액, 또는 글리콜, 예를 들면, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 도는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액상 형태로 투여되는 경우, 당해 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질을 약 0.5 내지 90%, 바람직하게는 약 1 내지 50% 함유한다.

치료학적 유효량의 본 발명의 단백질을 정맥내, 피부 또는 피하 주사함으로써 투여하는 경우, 본 발명의 단백질은 피로겐-무함유의 비경구적으로 허용되는 수성 용제의 형태일 것이다. pH, 등장성, 안정성 등과 관련하여, 비경구적으로 허용되는 단백질 용제의 제조는 당해 분야의 기술 범위 내이다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사용으로 바람직한 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 이외에, 등장성 비히클, 예를 들면, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로즈 주사액, 덱스트로즈와 염화나트륨 주사액, 락테이트화 링거 주사액, 또는 당해 분야에 공지된 바와 같은 기타 비히클을 함유해야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한, 안정화제, 방부제, 완충제, 산화방지제, 또는 당해 분야의 숙련인에게 공지된 기타 첨가제를 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 본 발명의 단백질의 양은 치료받고자 하는 질환의 종류 및 중증도, 및 환자에게 수행된 이전 치료의 종류에 좌우될 것이다. 궁극적으로, 담당의가 각각의 개개 환자를 치료하기 위한 본 발명의 단백질의 양을 결정할 것이다. 초기에는, 담당의가 본 발명의 단백질을 저용량 투여한 다음, 환자의 반응을 관찰할 것이다. 이러한 환자에 대한 최적의 치료학적 효과가 획득될 때까지 본 발명의 단백질을 보다 많은 용량으로 투여할 수 있으며, 최적의 효과가 획득되면, 투여량을 더 이상 늘리지 않는다.

본 발명의 약제학적 조성물을 이용한 정맥내 치료 기간은 치료받고자 하는 질환의 중증도, 및 각각의 개개 환자의 상태 및 잠재적인 특이체질 반응에 따라서 좌우될 것이다. 본 발명의 단백질의 각 투여 기간은 지속적으로 정맥내 투여하는 경우에는 12 내지 24시간일 것이다. 궁극적으로, 담당의는 본 발명의 약제학적 조성물을 이용하는 적절한 정맥내 치료 기간을 결정할 것이다.

바람직한 단위 투여 제형은 투여된 성분의 1일 용량 또는 단위, 1일 아-용량, 또는 이의 적당한 분획을 함유하는 것이다. 특히 상기 언급된 성분들 이외에, 본 발명의 제형은 문제의 제형 유형과 관련하여 당해 분야에서 통상적인 기타 제제를 포함할 수 있다는 것을 인지해야 한다. 임의로, 세포독성제를 EM 1 단백질 또는 이의 생물학적 작용성 단백질 단편에 혼입하거나 이들과 배합하여 환자에게 이중 치료를 제공할 수 있다.

당해 치료학적 조성물은 또한, 수의학적으로 적용하는데 유용하다. 사람 이외에, 특히 가축 및 순종 말이 본 발명의 단백질을 이용한 상기 치료에 요망되는 환자이다.

리신과 같은 세포독성제를 EM 1, 및 고친화성 EM 1 단백질 단편에 연결시킴으로써 EM 1를 연결시키는 세포를 파괴시키기 위한 도구를 제공한다. 이들 세포는 미소전이물 및 1차 종양을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 많은 위치에서 발견될 수 있다. 세포독성제에 연결된 단백질은, 목적하는 위치로의 전달을 최대화하도록 고안된 방식으로 주입된다. 예를 들면, 리신-연결된 고친화성 EM 1 단편은 캐뉼라를 통하여 표적 부위를 지지하는 혈관 내로 전달하거나 또는 표적에 직접적으로 전달한다. 이러한 제제는 또한, 주입용 캐뉼라와 커플링된 삼투압 펌프를 통하여 조절된 방식으로 전달된다. EM 1 길항제의 조합물을 안지오제네시스의 자극인자와 함께 투여하여 조직의 맥관형성을 증가시킬 수 있다. 이러한 치료학적 섭생은 전이성 암을 파괴시키는데 유효한 수단을 제공해준다.

부가의 치료 방법으로는 세포독성제에 연결된 EM 1, EM 1 단편, EM 1 유사체, EM 1 항혈청, 또는 EM 1 수용체 효능제 및 길항제를 투여하는 방법이 있다. EM 1이 사람 또는 동물 기원일 수 있다는 것을 인지해야 한다. EM 1은 또한, 화학적 반응이나 발현 시스템과 연계하는 재조합 기술에 의해 합성적으로 제조할 수 있다. EM 1은 또한, 단리된 플라스미노겐 또는 플라스민을 효소적으로 절단하여 항-혈관형성 활성을 지니고 있는 단배질을 생성시킴으로써 제조할 수 있다. EM 1은 또한, 플라스미노겐을 EM 1으로 절단시키는 내인성 효소의 작용을 모사하는 화합물에 의해 제조될 수 있다. EM 1 생성은 또한, 플라스미노겐 절단 효소의 활성에 영향을 미치는 화합물에 의해 조절될 수 있다.

본 발명은 또한 유전자 치료를 포괄함으로써, EM 1, 또는 이의 변이체, 단편 또는 융합 단백질을 암호화하는 폴리누클레오티드를 환자에 도입하여 조절시킨다. 유전자 치료로서 언급된, 유전자 생성물 단백질의 발현을 위해 세포에 DNA를 전이 또는 전달시키는 각종 방법이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있는 문헌[참조: Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N.Yang(1992) Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356]에 기재되어 있다. 유전자 치료는 DNA 서열을 생체외 또는 생체내 치료에 사용하기 위한 체강 세포 또는 발아 세포주 내로 혼입시키는 것을 포괄한다. 유전자 치료는 유전자를 대체하고, 정상적이거나 비정상적인 유전자 기능을 증대시키며, 감염성 질환과 기타 병리 상태를 물리치는 기능을 한다.

유전자 치료를 이용하여 이들 의학적 질환을 치료하는 방법에는 결함있는 유전자를 동정한 다음 특정의 기능성 유전자를 가하여 결합있는 유전자의 기능을 대체하거나 약간의 기능성 유전자를 증대시키는 것과 같은 치료학적 방법; 또는 질환 상태를 치료하거나 치료 섭생에 보다 더 민감하게 반응하는 조직 또는 기관으로 만드는 생성물 단백질에 대한 유전자를 가하는 것과 예방학적 방법이 포함된다. 예방학적 방법의 한 예로서, EM 1과 같은 유전자를 환자에 투여한 다음, 안지오제네시스가 일어나는 것을 방지하거나; 또는 종양 세포가 방사선에 보다 더 민감해지도록 만드는 유전자를 삽입한 다음 종양에 방사선을 주입하여 종양 세포의 사멸을 증가시키는 것이 있다.

EM 1 DNA 또는 EM 1 조절 서열을 전이시키는 많은 프로토콜이 본 발명에 계획되어 있다. EM 1과 특이적으로 결합되는 것으로 통상 발견되는 것 이외의 프로모터 서열, 또는 EM 1 단백질의 생성을 증가시키는 기타 서열을 형질감염시키는 것이 또한 유전자 치료법으로서 계획되어 있다. 이러한 기술의 한 예가 세포 중의 에리트로포이에틴 유전자 상에서 작동하는 "유전적 스위치"를 삽입하기 위해 동종의 재조합을 이용하는 공급처[Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Mass]에서 발견되었다[참조: Genetic Engineering News, Apr. 15, 1994]. 이러한 "유전자 스위치"는 EM 1(또는 EM 1 수용체)를 정상적으로 발현하지 않는 세포에서 EM 1(또는 EM 1 수용체)를 활성화시키는데 이용될 수 있다.

유전자 치료에 대한 유전자 전이 방법은 다음 3가지의 광범위한 범주에 속한다: 물리적(예: 전기천공, 직접적인 유전자 전이 및 입자 충격), 화학적(예: 지질계 담체, 또는 기타 비-바이러스성 벡터) 및 생물학적(예: 바이러스-유도된 벡터 및 수용체 흡수). 예를 들면, DNA로 피복된 리포좀을 포함하는 비-바이러스성 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 리포좀/DNA 복합체는 환자에게 직접적으로 정맥내 주사할 수 있다. 리포좀/DNA 복합체는 이들이 DNA를 마크로파아지와 쿠퍼(Kupffer) 세포에 전달하는 경우에 간에 농축된다. 이들 세포는 장기간 생존하므로 상기와 같이 전달된 DNA를 장기간 발현시켜 준다. 부가적으로, 벡터 또는 유전자의 "노출된" DNA는 치료학적 DNA를 표적에 전달하기 위해 목적하는 기관, 조직 또는 종양에 직접적으로 주사할 수 있다.

유전자 치료 방법론은 전달 부위로써 기술될 수도 있다. 유전자를 전달하는 기본적인 방법으로는 생체외 유전자 전이, 생체내 유전자 전이, 및 시험관내 유전자 전이가 있다. 생체외 유전자 전이에서는, 환자로부터 세포를 위한 다음 세포 배양물에서 성장시킨다. DNA를 상기 세포 내로 형질감염시키고, 이와 같이 형질감염된 세포를 수적으로 확창시킨 다음, 환자에 재이식한다. 시험관내 유전자 전이에서는, 형질전환된 세포가 특정한 환자로부터의 특정한 세포가 아니라, 조직 배양 세포와 같은 배양물에서 성장하는 세포이다. 이들 "실험실 세포"를 형질감염시키고, 이와 같이 형질감염된 세포를 선별하고 이를 환자에 이식하거나 기타 사용을 이해 수적으로 확장시킨다.

생체내 유전자 전이는 세포가 환자 내에 있는 경우에 이러한 환자의 세포 내로 DNA를 도입하는 것을 포함한다. 방법에는 감염되지 않은 바이러스를 사용한 바이러스적으로 매개된 유전자 전이를 이용하여 유전자를 환자에 전달하거나 노출된 DNA를 환자 중의 특정 부위에 주사한 다음, 상기 DNA를 유전자 생성물 단백질이 발현되는 세포의 비율로써 취한다. 부가적으로, "유전자 건(gun)"의 사용과 같이, 본원에 기재된 기타 방법을 EM 1 DNA 또는 EM 1 조절 서열의 시험관내 삽입을 위해 사용할 수 있다.

유전자 치료의 화학적 방법은 DNA를 세포막 내로 가로질러 전달하기 위한, 반드시 리포좀일 필요는 없는 지질계 화합물을 이용할 수 있다. 네거티브 하전된 DNA와 결합되는 지질계 포지티브 이온인 리포펙틴 또는 사이토펙틴이, 세포막을 가로지를 수 있고 세포 내부에 DNA를 제공할 수 있는 복합체를 만든다. 또 다른 화학적 방방법은 특이적 리간드를 세포 표면 수용체에 연결시키고 이의 외피를 형성한 다음, 세포막을 가로질러 수송하는 것을 포함하는, 수용체-이용 세포이물흡수 작용을 이용한다. 상기 리간드가 DNA에 결합되고 완전한 복합체가 세포 내로 수송된다. 상기 리간드 유전자 복합체를 혈류 내로 주사한 다음, 수용체를 갖는 표적 세포가 리간드와 특이적으로 결합되어 리간드-DNA 복합체를 세포 내로 수송할 것이다.

많은 유전자 치료 방법은 유전자를 세포 내로 삽입시키기 위한 바이러스성 벡터를 이용한다. 예를 들면, 변형된 레트로바이러스 벡터가 생체외 방법에서 사용되어 유전자를 말초 및 종양-침윤성 임파구, 간세포, 상피 세포, 근세포 또는 기타 체강 세포 내로 도입한다. 이어서, 이와 같이 변형된 세포를 환자에게 도입하여 삽입된 DNA로부터 유전자 생성물을 제공한다.

바이러스성 벡터를 사용하여, 유전자를 생체내 프로토콜을 이용하여 세포 내로 삽입시킨다. 외래 유전자의 조직-특이적 발현을 지시하기 위하여, 조직-특이적인 것으로 공지되어 있는 시스-작용성 조절 요소를 사용할 수 있다. 또 다르게는, DNA 또는 바이러스성 벡터를 생체내에서 특이한 해부학적 부위에 동일 반응계에서 전달함으로써 이를 달성할 수 있다. 예를 들면, 생체내에서 혈관으로의 유전자 전이는 시험관내 형질도입된 내피 세포를 동맥 벽 상의 선택된 부위에 이식시킴으로써 달성한다. 상기 바이러스는 상기 유전자 생성물을 또한 발현시키는 주변 세포를 감염시켰다. 바이러스성 벡터를, 예를 들면, 카테터에 의해 생체내 부위에 직접적으로 전달함으로써, 단지 특정 영역만이 상기 바이러스에 의해 감염되도록 하고, 장기간 부위 특이적 유전자 발현을 제공해준다. 레트로바이러스 벡터를 이용한 생체내 유전자 전이는, 변형된 바이러스를 기관과 통하는 혈관 내로 주입함으로써 포유류 조직과 간 조직에서 입증되었다.

유전자 치료 프로토콜에 사용되어 온 바이러성 벡터로는 레트로바이러스; 폴리오바이러스 또는 신드비스와 같은 기타 RNA 바이러스; 아데노바이러스; 아데노-연관 바이러스; 헤르페스 바이러스; SV 40; 백시니아; 및 기타 DNA 바이러스가 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 복제-결함있는 쥐의 레트로바이러스성 벡터가 가장 광범위하게 이용되고 있는 유전자 전이 벡터이다. 쥐의 백혈병 레트로바이러스는 핵 코어 단백질 및 폴리머라제(pol) 효소와 복합체를 형성하고, 단백질 코어(gag)에 의해 싸여져 있으며 숙주 범위를 결정하는 당단백질 외막(env)으로 둘러 싸여 있는 단일쇄 RNA로 구성된다. 레트로바이러스의 지놈 구조에는 5' 및 3' 장 말단 반복물(LTR)로 둘러 싸여진 gag, pol 및 env 유전자가 포함된다. 레트로바이러스성 벡터 시스템은, 바이러스성 구조 단백질이 패키징 세포주에서 트랜스로 제공된다면, 5' 및 3' LTRs와 패키징 시그날을 함유하는 최소 벡터가 벡터를 패키징, 감염 및 표적 세포 내로의 통합을 허용해 주기에 충분하다는 사실을 활용하고 있다. 유전자 전이를 위한 레트로바이러스성 벡터의 기본적인 이점으로는 대부분의 세포 유형에서의 효과적인 감염 및 발현, 표적 세포 염색체성 DNA로의 정확한 단일 복사 벡터 통합, 및 레트로바이러스성 지놈의 조작 용이성이 있다.

아데노바이러스는 코어 단백질과 복합체를 형성하고 캡시드 단백질로 둘어 싸여 있는 선형의 이중쇄 DNA로 구성된다. 분자 바이러스학의 진보로 인해, 신규한 유전적 서열을 생체내에서 표적 세포 내로 형질도입할 수 있는 벡터를 생성시키는 이들 유기체의 생태를 활용하는 능력을 가져왔다. 아데노바이러스성 벡터는 유전자 생성물 단백질을 고수준으로 발현할 것이다. 아데노바이러스성 벡터는 바이러스 역가치가 낮은 경우일 지라도, 높은 감염 효율을 나타낸다. 부가적으로, 이러한 바이러스는 생산자 세포주의 주입이 필요하지 않을 정도로 세포 무함유 비리온으로 완전히 감염성이다. 아데노바이러스성 벡터에 대한 또 다른 잠재적인 이점은 이종 유전자를 생체내에서 장기간 발현시킬 수 있는 능력이다.

DNA 전달의 기계적 방법에는 리포좀 등의 퓨소제닉 지질 소포 또는 막 융합용 기타 소포, 리포펙틴 등의 양이온성 지질을 혼입시키는 DNA의 지질 입자, DNA의 폴리라이신-매개된 전이, DNA의 직접적인 주입, 예를 들면, DNA를 발아 또는 체강 세포 내로 미소주입, 공기식으로 운반된 DNA-피복된 입자, 예를 들면, "유전자 건"에 사용된 골드 입자, 및 인산칼슘 형질감염 등의 무기 화학적 접근이 포함된다. 입자-매개된 유전자 전이 방법이 먼저 식물 조직을 형질전환시키는데 사용되었다. 입자 충격 장치 또는 "유전자 건"을 사용하여, 원동력을 발생시켜 DNA-피복된 고밀도 입자(예: 골드 또는 텅스텐)를 표적 기관, 조직 또는 세포의 침투를 허용해주는 고속으로 가속화시킨다. 입자 충격을 시험관내 시스템에서 사용하거나 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용하여 DNA를 세포, 조직 또는 기관 내로 도입할 수 있다. 또 다른 방법인 리간드-매개된 유전자 치료는 DNA를 특정한 리간드와 복합체를 형성시켜 리간드-DNA 접합체르 형성시키고, DNA가 특이적 세포 또는 조직을 지시하도록 하는 것을 포함한다.

플라스미드 DNA를 근육 세포 내로 주입하면, 형질감염되고 마아커 유전자를 지속적으로 발현시키는 세포가 높은 비율(%)로 생성된다는 사실이 밝혀졌다. 이러한 플라스미드의 DNA를 상기 세포의 지놈 내로 통합시키거나 통합시키지 않을 수 있다. 상기와 같이 형질감염된 DNA를 비-통합시키게 되면, 세포내 또는 미토콘드리아 지놈에서 변이성 삽입, 결실 또는 변형시킬 염려 없이 장기간 동안 종말에 분화된 비-증식성 조직에서 유전자 생성물 단백질을 형질감염 및 발현시킬 수 있을 것이다. 반드시 영구적이지는 않지만 장기간 동안 치료학적 유전자를 특정 세포 내로 전이시키면, 유전적 질환에 대한 치료 또는 예방적 치료를 제공할 수 있다. 이러한 DNA를 주기적으로 재주입하여 수용자 세포의 지놈에서 어떠한 변이도 발생되지 않으면서 유전자 생성물을 수준을 유지시킬 수 있다. 외인성 DNA를 비-통합시키면, 각종 유전자 생성물을 발현하는 작제물 모두를 포함하는 하나의 세포 내에 몇몇 상이한 외인성 DNA 작제물이 존해할 수 있게 해준다.

유전자 전이를 위한 전기천공은 세포 또는 조직이 전기천공-매개된 유전자 전이에 더 민감하게 반응하도록 만드는 전류를 이용하고 있다. 소정의 전기장 강도를 지닌 간단한 전기 임펄스를 사용하여, DNA 분자가 세포 내로 침투될 수 있는 방식으로 막의 투과성을 증가시킨다. 이러한 기술은 시험관내 시스템에서 사용하거나 생체외 또는 생체내 기술과 함께 사용하여 DNA를 세포, 조직 또는 기관 내로 도입할 수 있다.

생체내에서 캐리어 매개된 유전자 전이를 이용하여 외래 유전자를 세포 내로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 캐리어-DNA 복합체를 편리하게는 체액 또는 혈류 내로 도입한 다음, 체내의 표적 기관 또는 조직에 대해 부위-특이적으로 지시한다. 리포좀과 폴리양이온, 예를 들면, 폴리라이신, 리포펙틴 또는 사이토펙틴 모두를 사용할 수 있다. 세포 특이적이거나 기관 특이적인 리포좀을 성장시킴으로써, 이러한 리포좀에 의해 운반된 외래 유전자가 표적 세포에 의해 취해지도록 할 것이다. 특정 세포 상의 특이적 수용체를 표적으로 하는 면역리포좀을 주입하는 방법이, 상기 DNA를 수용체 보유 세포 내로 삽입하는 편리한 방법으로서 이용될 수 있다. 사용되어 온 또 다른 캐리어 시스템은 DNA를 생체내 유전자 전이를 위해 간세포에 운반하기 위한 아시알로-당단백질/폴리라이신 접합체 시스템이다.

이와 같이 형질감염된 DNA는, 이 DNA가 수용자 세포에 운반된 다음 세포질 또는 핵질에서 잔류하도록 기타 종류의 캐리어와 복합체를 형성할 수 있다. DNA를 구체적으로 유전공학적으로 처리된 소포 복합체 중의 캐리어 핵 단백질과 커플링시킨 다음 상기 핵에 적접적으로 운반한다.

EM 1의 유전자 조절은 EM 1 유전자와 결합되거나, 또는 EM 1 유전자 또는 이의 상응하는 RNA 전사체와 연관된 영역을 제어하여 전사 또는 해독 속도를 변형시키는 화합물을 투여함으로써 달성할 수 있다. 부가적으로, EM 1을 암호화하는 DNA 서열로 형질감염된 세포를 환자에게 투여하여 EM 1의 생체내 공급원을 제공할 수 있다. 예를 들면, EM 1을 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 벡터로 세포를 형질감염시킬 수 있다. 이와 같이 형질감염된 세포는 환자의 정상 조직, 환자의 병이든 조직으로부터 유도된 세포이거나, 또는 환자가 아닌 것으로부터 유도된 세포일 수 있다.

예를 들면, 특정 환자로부터 제거시킨 종양 세포를 본 발명의 EM 1 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 형질감염시킨 다음, 상기 환자에 재도입할 수 있다. 이와 같이 형질감염된 종양 세포는 환자에게서 종양의 성장을 억제시키는 수준으로 EM 1을 생성시킨다. 환자는 사람이거나 사람이 아닌 동물일 수 있다. 세포를 또한, 비-벡터에 의해 형질감염시키거나, 또는 전기천공, 이온천공 또는 "유전자 건"과 같이 당해 분야에 공지된 물리적 또는 화학적 방법에 의해 형질감염시킬 수 있다. 부가적으로, EM 1 DNA를 캐리어의 도움없이 환자에게 직접적으로 주입할 수 있다. 특히, EM 1 DNA는 피부, 근육 또는 혈액에 주입할 수 있다.

EM 1을 특정 환자 내로 형질감염시키기 위한 유전자 치료 프로토콜은 EM 1 DNA를 세포의 지놈, 미니염색체 내로 철저히 통합시키거나, 또는 상기 세포의 세포질 또는 핵질에서 별개의 복제성 또는 비-복제성 DNA로서 철저히 통합시킬 수 있다. EM 1 발현은 장기간 지속될 수 있거나 주기적으로 재주입되어 세포, 조직 또는 기관 중에 EM 1 단백질을 목적하는 수준 또는 예정된 혈액 수준으로 유지할 수 있다.

또한, 본 발명은 신규한 항-혈관형성 단백질을 시험하는데 사용될 수 있고, 항혈관형성 활성이나 이의 결여를 특징으로 하거나 이와 연관된 질환 및 질병을 진단, 예후 또는 치료하는데 사용될 수 있는 항체 및 항혈청을 포괄한다. 이러한 항체 및 항혈청은 또한, 경우에 따라, 예를 들면, 경색-후 심장 근육에서 안지오제네시스를 상향 조절하는데 사용될 수 있고, EM 1 단백질에 대한 항체 또는 항혈청은 국재화된 본래의 항-혈관형성 단백질 및 프로세스를 차단시키고, 새로운 혈관형성을 증가시키며 심장 조직의 위축을 억제시키는데 사용될 수 있다.

이러한 항체 및 항혈청을 약제학적으로 허용되는 조성물 및 담체와 결합시켜 진단, 예후 또는 치료용 조성물을 형성시킬 수 있다. 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 면역글로불린 분자 집단 및/또는 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항체 결합 부위 또는 파라토프(paratope)를 함유하는 분자를 지칭한다.

EM 1을 특이적으로 결합시키는 항체를 이용하는 수동 항체 치료를 이용하여, 재생, 발육, 및 상처 치유 및 조직 복구와 같은 혈관형성-의존적 과정을 조절할 수 있다. 또한, EM 1 항체의 Fab 영역으로 지시된 항혈청을 투여하여 EM 1을 결합시ㅣ는 내인성 EM 1 항혈청의 능력을 차단시킬 수 있다.

본 발명의 EM 1를 또한 사용하여 상기 억제제 및 이의 수용체에 특이적인 항체를 생성시킬 수 있다. 이러한 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. EM 1 또는 EM 1 수용체와 특이적으로 결합되는 이들 항체를 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지된 진단 방법과 키트에 사용하여 체액 또는 조직 중에서의 EM 1 또는 EM 1 수용체를 탐지하거나 정량화할 수 있다. 이들 시험 결과를 이용하여, 암과 기타 혈관형성 매개된 질환의 발발 또는 재발을 진단하거나 예견할 수 있다.

본 발명은 또한, 혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 진단하거나 예후하는데 있어서, EM 1, EM 1에 대한 항체, 및 EM 1 및/또는 이의 항체를 포함하는 조성물의 용도를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "예후 방법"은 질환, 특히 안지오제네시스 의존적 질환이 있는 것으로 진단된 사람 또는 동물의 질환 진행 상태를 예견할 수 있게 해주는 방법을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "진단 방법"은 사람 또는 동물에서 안지오제네시스 의존적 질환의 존재 여부 또는 유형을 결정할 수 있게 해주는 방법을 의미한다.

EM 1을 진단 방법과 키트에 사용하여 EM 1을 결합할 수 있는 항체를 탐지하고 정량화할 수 있다. 이들 키트는 동일 반응계에서 1차 종양에 의해 분비된 EM 1의 존재하에서 미소전이물의 확산을 지시해주는 순환성 EM 1 항체의 탐지를 허용해줄 것이다. 이러한 순환성 항-EM 1 항체를 지니고 있는 환자는 다발성 종양과 암이 더 잘 진행될 수 있으며 치료 후나 병의 차도 기간에 암이 더 잘 재발할 수 있다. 이들 항-EM 1 항체의 Fab 단편이 항원으로서 사용되어 항-EM 1 항체를 중화시키는데 사용될 수 있는 항-EM 1 Fab-단편 항혈청을 생성시킬 수 있다. 이러한 방법은 항-EM 1 항체에 의한 순환성 EM 1의 제거를 저하시킴으로써, 순환성 EM 1 수준을 효과적으로 상승시킬 것이다.

본 발명은 또한, EM 1에 특이적인 수용체의 분리를 포함한다. 조직에 대한 고친화성 결합을 보유하고 있는 단백질 단편을 사용하여 친화성 칼럼 상에서 EM 1 수용체를 분리할 수 있다. EM 1 수용체의 분리 및 정제는 EM 1 작용 기전을 밝혀내기 위한 기본적인 단계이다. EM 1 수용체의 분리와 EM 1 효능제 및 길항제의 동정으로, 생물학적 활성에 대한 최종 경로인 EM 1 수용체의 활성을 조절하기 위한 약물의 개발이 촉진될 것이다. 이러한 수용체를 분리함으로써, 동일계 반응 및 용액 하이브리드화 기술을 사용하여 누클레오티드 프로브의 작제가 상기 수용체의 국재화 및 합성을 모니터할 수 있게 한다. 추가로, EM 1 수용체에 대한 유전자를 분리하고, 발현 벡터 내로 혼입하며, 환자의 종양 세포와 같은 세포 내로 형질감염시켜 EM 1을 결합시키고 국소적 안지오제네시스를 억제시키는 세포 유형, 조직 또는 종양의 능력을 증가시킬 수 있다.

EM 1 단백질을 이용하여 배양된 종양 세포로부터 EM 1 수용체를 분리하기 위한 친화성 칼럼을 개발할 수 있다. EM 1 수용체의 분리 및 정제에 이어 아미노산 서열화를 수행한다. 이러한 정보를 이용하여, EM 1 수용체를 암호화하는 유전자(들)을 동정 및 분리할 수 있다. 이어서, 클로닝된 핵산 서열을, 상기 수용체를 발현할 수 있는 벡터 내로 삽입하기 위해 발생시킨다. 이들 기술은 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있다. EM 1 수용체를 암호화하는 핵산 서열(들)을 종양 세포 내로 형질감염시키고 이와 같이 형질감염된 종양 세포에 의해 상기 수용체를 발현시키게 되면, 내인성 또는 외인성 EM 1에 대한 이들 세포의 반응성이 향상되어 전이성 성장율이 감소된다.

본 발명의 안지오제네시스 억제성 단백질을 표준 미소화학 수단으로 합성하고 HPLC 및 질량 분광법으로 순도를 검사할 수 있다. 단백질 합성법, HPLC 정제법 및 질량 분광법은 당해 분야의 숙련인에게 통상 공지되어 있다. EM 1 단백질과 EM 1 수용체 단백질은 또한 재조합 이. 콜라이(E. coli) 또는 효모 발현 시스템에서 생성한 다음, 칼럼 크로마토그래피로 정제한다.

다음을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 몇몇 적용 분야에 사용하기 위한, 본래의 EM 1 분자의 상이한 단백질 단편을 합성할 수 있다: 특이적 항혈청 발생을 위한 항원으로서; EM 1 결합 부위에서 활성인 효능제 및 길항제로서, EM 1을 결합시키는 세포를 표적하여 사멸하기 위한 세포독성제와 연결될 단백질로서, 또는 이러한 세포독성제와 함께 사용하기 위한 단백질로서 적용된다. 이들 단백질을 포함하는 아미노산 서열은 분자의 외부 영역 상에서의 이들의 위치를 기준으로 하여 선별되며, 항혈청에 대한 결합이 용이하다. EM 1의 아미노 및 카복실 말단 뿐만 아니라 상기 분자의 중간 영역은 합성하고자 하는 단편들 중에서 별개로 제시된다.

EM 1의 합성 단백질 단편은 다양한 용도를 지니고 있다. EM 1 수용체와 고특이성과 갈망으로 결합되는 단백질을 방사선표지시키고, 자동방사선 사진술과 막 결합 기술을 이용하여 결합 부위를 가시화하고 정량화하기 위해 이를 이용한다. 본 출원은 중요한 진단 및 탐색 도구를 제공한다. EM 1 수용체의 결합성 성질에 관한 지식이 상기 수용체와 연결된 형질도입 기전에 대한 조사를 촉진시켜 준다.

표준 방법을 사용하여, EM 1 및 EM 1-유도된 단백질을 다른 분자에 커플링시킬 수 있다. EM 1의 아미노 말단과 카복실 말단 모두는 티로신과 라이신 잔기를 함유하며, 많은 기술, 예를 들면, 통상적인 기술을 이용한 방사선 표지화(티로신 잔기-클로르아민 T, 요오도겐, 락토퍼옥시다제; 라이신 잔기-볼튼-헌터(Bolton-Hunter) 시약)를 사용하여, 동위원소 이용하거나 동위원소가 아닌 것을 이용하여 표지시킨다. 이들 커플링 기술은 당해 분야의 숙련인에게 널리 공지되어 있다. 또 다르게는, 티로신 또는 라이신을, 이들 잔기를 갖지 않는 단편에 가하여 상기 단백질 상의 반응성 아미노 및 하이드록실 그룹의 표지화를 촉진시킨다. 커플링 기술은 아미노, 설프하이드랄, 카복실, 아미드, 페놀 및 이미다졸을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 아미노산 상에서 이용 가능한 작용성 그룹을 기준으로 하여 선택한다. 이들 커플링을 수행하는데 사용된 각종 시약으로는 글루타르알데히드, 디아조화 벤지딘, 카보디이미드 및 p-벤조퀴논이 있다.

EM 1 단백질을 동위원소, 효소, 캐리어 단백질, 세포독성제, 형광성 분자, 화학발광체, 생물학적 발광체 및 각종 용도용의 기타 화합물에 화학적으로 커플링시킨다. 특이적 반응에 적당한 상이한 기술을 이용하여, 커플링 반응의 효능을 결정한다. 예를 들면, 특이 활성이 높은 클로르아민 T 및 Na¹²⁵I를 사용하여, EM 1 단백질을¹²⁵I로 방사선표지시킨다. 나트륨 메타바이설파이트를 사용하여 상기 반응을 종결시키고, 혼합물을 1회용 칼럼 상에서 탈염시킨다. 이와 같이 표지된 단백질을 칼럼으로부터 용출시키고 분획을 수집한다. 각 분획으로부터 등취량을 제거하고 방사능을 감마 계수기로 측정한다. 이러한 방식으로, 반응되지 않은 Na¹²⁵I를 상기와 같이 표지된 EM 1 단백질로부터 분리시킨다. 가장 높은 특이 방사능을 지니고 있는 단백질 분획을, EM 1 항혈청에 결합하는 능력에 관한 분석과 같은 후속 사용을 위해 저장한다.

또한, EM 1 단백질을 수명이 짧은 동위원소로 표지시키면, 포지트론 방출 단층촬영법 또는 기타 현대식 방사선사진 기술을 사용하여 생체내에서 수용체 결합 부위를 가시화하여 EM 1 결합성 부위를 갖는 종양을 국재시킬 수 있다.

이들 합성된 단백질 내에서의 아미노산의 계통적 치환으로 인해, 이의 수용체에 대한 EM 1 결합을 증진시키거나 감소시키는, EM 1 수용체에 대한 고친화성 단백질 효능제 및 길항제가 생성된다. 이러한 효능제를 사용하여 미소전이물의 성장을 억제시킴으로써, 암의 확산을 제한할 수 있다. EM 1에 대한 길항제는 EM 1의 억제 효과를 차단시키고 안지오제네시스를 증진시키기 위하여, 부적절한 맥관형성 상황에 적용된다. 예를 들면, 이러한 처리는 당뇨병 환자의 상처 치유를 증진시키는 치료학적 효과를 지닐 수 있다.

본 발명의 EM 1 단백질은 또한, 영양원 또는 영양 보충물로서 사용될 수 있다. 이러한 용도에는 단백질 또는 아미노산 보충물로서의 용도, 탄소원으로서의 용도, 질소원으로서의 용도 및 탄수화물 공급원으로서의 용도가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 경우, 본 발명의 EM 1 단백질을 특정한 유기체의 식품에 가하거나, 또는 산제, 환제, 용제, 현탁제 또는 캅셀제의 형태와 같이, 별개의 고형 또는 액상 제제로서 투여할 수 있다. 미생물의 경우, 본 발명의 단백질 또는 폴리누클레오티드를, 이러한 미생물을 배양시키는 배지에 가할 수 있다.

본 발명은 다음 실시예로써 예시되지만, 이들 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 인식되어서는 안된다. 이와는 달리, 본원의 명세서 판독 후, 본 발명의 요지 및/또는 첨부된 청구의 범위를 벗어나지 않고서도 당해 분야의 숙련인 스스로가 제안할 수 있는 각종의 기타 양태, 변형 및 이의 등가 수준에 대한 방책이 제시될 수 있다는 것을 명백히 인지해야 한다.

실시예 1: 세포 및 세포주

신장의 암종 클리어 세포주인 세포주 786-0(ATCC No. CRL-1932); 소의 폐동맥 동맥성 내피 세포주인 C-PAE(ATCC No. CCL-209); 및 사람의 내피 세포주인 ECV304(ATCC No. CRL-1998)을 모두 ATCC(American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, 20110-2209, USA)로부터 수득하였다. 이들 세포주를 10% 송아지 태내 혈청, 페니실린 100U/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml 및 2mM L-글루타민으로 보충된, DMEM(786-0 및 C-PAE) 또는 M199(ECV304)에서 유지시켰다. 마우스 엔도스타틴 pBACPak 8에 대한 cDNA 클론이 공급자(B.R. Olsen, Department of Cellular Biology, Harvard Medical School, Boston)에 의해 기꺼이 제공되었다. 원핵성 발현 벡터 pET17b는 노바겐(Novagen; Madison, Wisconsin, USA)로부터 구입하였다. 효모 발현 시스템, 피챠 파스토리스(Pichia pastoris)(pPICZαA)는 비트로젠(Vitrogen; San Diego, California, USA)로부터 구입하였다. 제한 효소 및 벤트(Vent) DNA 폴리머라제는 뉴 잉글랜드 바이오랩(New England Biolabs; Beverly, Massachusetts, USA)로부터 구입하였다.

실시예 2: 마우스 엔도스타틴 및 변이체의 원핵성 시스템으로의 클로닝 및 발현

마우스 엔도스타틴을 암호화하는 유전자를 pBACPak 8 플라스미드로부터 증폭시키고 초기에 pET 발현 시스템에서 발현시켰다. 마우스 콜라겐 XVIII의 카복시 말단 부분을 암호화하는 서열을 벤트 DNA 폴리머라제를 이용한 증폭 공정에 의해 증폭시키는데, 이때 엔도스타틴 pBACPak 8 벡터를 주형으로서 사용하였다. 사용된 프라이머는 5'-GGC ATA TGC ATA CTC ATC AGG ACT TT-3'(서열 번호: 3) 및 5'-AAC TCG AGA TTT GGA GAA AGA GGT-3'이다. 다음 파라미터를 사용하여 증폭을 30주기 동안 수행하였다: 변성을 위해서는 94℃에서, 어닐링을 위해서는 60℃에서 연장을 위해서는 72℃에서 각각 1분 동안 수행함. 이와 같이 증폭된 DNA 단편(555bp)을 QIAQUICK 정제 키트를 사용하여 정제하고, NdeI 및 XhoI(이들 제한 부위는 상기 프라이머에 밑줄쳐져 있다)로 분해한 다음, 발현 벡터 pET17bhis에 연결시켰다[참조: Dhanabal et al. (1995) J. Immunol. Methods. 182:165-175]. 숙주 균주 HMS174(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)를 사용하여 초기 형질전환을 수행하였다. 포지티브 클론을 양 쇄 상에서 서열화하였다. 목적하는 클론을 발현을 위해 최종적으로 BL21(DE3)(Novagen, Madison, Wisconsin, USA) 내로 형질전환시켰다. pET 시스템에서의 재조합 단백질의 발현을 제조업자(Novagen, Madison, Wisconsin, USA)에 의해 권고된 바와 같이 수행하였다.

Ni-NTA 아가로즈 칼럼을 사용하여 재조합 단백질을 정제시켰다. 봉입체에 존재하는 단백질을 8M 우레아에서 가용화시키고 문헌[참조: O'Reilly et al. (1997)(Cell 88:277-285)]에 기재된 바와 같은 변성 조건하에서 정제하였다. 그 결과가 도 1에 제시되어 있으며, 이는 용출된 분획의 280nm에서의 흡광도()를 도시하는 그래프이다. 또한, 용출 완충액의 pH()가 플롯팅되어 있다. 도 1은 분획 7 내지 8 주위에 작은 피크를 나타내고, 분획 21 내지 22 주변에 가파른 피크를 나타내며, 분획 35 주변에 또 다른 작은 피크를 나타낸다.

선택된 분획 10ml 샘플을 SDS-PAGE 분석한 결과, 비-환원성 조건하에서 22 내지 24kDa에서 별개의 밴드가 나타났다. 그 결과가 도 2에 제시되어 있으며, 이는 분획 7 및 8(각각 레인 3 및 4)에 대해서는 22 내지 24kDa 밴드를 나타내고, 또한 분획 21 및 22(각각 레인 5 및 6)에 대해서도 22 내지 24kDa 밴드를 나타낸다. 또한, 46 및 69kDa의 보다 고분자량 복합체가 관찰되기도 하는데, DTT로의 환원시 22 내지 24kDa에서 별개의 밴드(도 2의 레인 7)가 나타났다. 상이한 pH 용출물(pH 4.2 및 3.0)에서의 피크를 모으고 이를 증가 농도의 우레아에 대하여 투석한 다음, PBS 완충액(pH 7.4)에서 최종 분석을 수행하며, 이때 대부분의 단백질이 용액으로부터 침전되었다. 유사한 시스템으로부터 발현된 재폴딩되지 않은 침전된 단백질이 생체내에서 생물학적 활성을 나타냈기 때문에, "단백질 재폴딩"에 대한 정확한 과정이 문헌[참조: O'Reilly et al. (1997)(Cell 88:277-285)]에 기재되어 있는 바와 같다. 이와 같이 침전된 단백질을, BCA 검정(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)에 의해 측정되고(적합한 블랭크를 이용하여 우레아에 가용화된) 소량으로 -70℃에서 저정된 단백질의 농도를 이용하여, 단지 생체내 실험용의 현탁액 형태로 사용하였다. 마우스와 사람 엔도스타틴이 C-말단에서 보존되기 때문에, 두개의 작은 결실이 이루어진다. 9 또는 17개 아미노산이 엔도스타틴의 C-말단으로부터 결실되도록 프라이머를 고안하면, 각각 EM 1 및 EM 2로 명명된 2개의 변이체가 생성된다. EM 1의 경우, 시스테인 잔기 4개 모두는 본래대로 남아 있다. EM 2의 경우에는, 대부분의 C-말단 시스테인이 결실되었다. EM 1 변이체에 대한 상단 프라이머는 5'-TTC CAT ATG CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG GCA-3'(서열 번호: 7)이고, 하단 프라이머는 5'-TTA GCG GCC GCC TAC TCA ATG CAG AGG ACG ATG TA-3'(서열 번호: 8)이다. EM 2 변이체에 대한 상단 프라이머는 5'-TTC CAT ATG CAT ACT CAT CAG GAC TTT CAG CCA-3'(서열 번호: 9)이고, 하단 프라이머는 5'-TTA GCAG GCC GCC TAG TTG TGG CAG CTC GCA GCT TTC TG-3'(서열 번호: 10)이다.

증폭된 DNA 단편(EM 1에 대해서는 528bp이고, EM 2에 대해서는 504bp이다)을 정제하고, NdeI 및 NotI로 분해하며, 예비절제된 pET28(a) 발현 벡터에 연결시켰다. 나머지 프로토콜을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. 세균성 펠릿의 도입 조건 및 프로세싱은 문헌[참조: O'Reilly et al. (1997)(Cell 88:277-285)]에 기재되어 있는 바와 같다. QIA 발현 매뉴얼(Qiagen, Hilden, Germany)에 기재된 바와 같이 8M 우레아의 존재하에서 Ni-NTA 칼럼을 사용하여 재조합 단백질의 정제를 수행하였다. 간략하게 언급하면, 세균성 펠릿을 실온에서 1시간 동안 평형 완충액(8M 우레아, 10mM 트리스 및 100mM 인산나트륨 완충액, pH 8.0)에서 가용화시켰다. 현탁액을 3 내지 4회 초음파처리하고, 10,000xg으로 원심분리시킨 다음 가용성 분획을 상기 완충액으로 예비-평형시킨 Ni-NTA 칼럼 상에 10 내지 20ml/hr의 유속으로 부하하였다. 이 칼럼을 평형 완충액으로 광범위하게 세척하였다. 결합된 단백질을, 8.0에서 6.3으로 pH를 낮춘 다음 4.2, 및 최종적으로 3.0으로 낮춤으로써 용출시켰다. 엔도스타틴 변이체를 이용하는 생체내 실험의 경우, 칼럼과 결합되는 비-특이적 단백질을 평형 완충 세척액으로 제거한 다음, 10mM 및 25mM 이미다졸 세척액으로 제거하였다. 결합된 단백질을 0.2M 아세트산을 함유하는 평형 완충액에서 용출시켰다. 정제된 분획을 SDS-PAGE로 분석하고, 정제된 엔도스타틴을 함유하는 분획(야생형 엔도스타틴의 경우에는 pH 4.2 및 3.0 및 엔도스타틴 변이체의 경우에는 0.2M 아세트산을 함유하는 평형 완충액)을 모으고 서서히 재폴딩시켰다. 4℃에서 PBS(pH 7.4)에 대한 최종 투석을 수행하였다. 투석 동안에 단백질이 용액으로부터 침전되었다. 이를 추가로 농축시키고 소량으로 -70℃에서 저장하였다. 단백질의 농도를 BAC 검정(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)으로 결정하였다.

실시예 3: 피치아 파스토리스에서의 마우스 엔도스타틴의 발현

메탄올친화성 효모 균주인 피치아 파스토리스는 고등 진핵성 발현 시스템의 많은 이점을 지니고 있다: (a) 알파 인자 시그날 서열이 매질로의 발현된 단백질의 분비를 촉진시키고, (b) 효모 균주(GS115)가 정제 공정을 추가로 간단하게 만드는 내인성 숙주 단백질을 극히 저수준으로 분비하며, (c) 내독소 오염이 부각되지 않고, (d) 글리코실화가 발생될 수 있다. 포유류 엔도스타틴 및 이의 변이체 및 단편을 발현시키기 위해 pPICZαA 벡터를 선별하는데, 이는 상기 시스템이 슈카트메, 비카스 피의 의해 1998년 12월 8일자로 출원된 "항-혈관형성 단백질의 제조 방법"이란 발명의 명칭의 미국 특허원 제XX/XXX,XXX호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있다)에 상세히 기재되어 있는 바와 같이, 우수한 생물학적 활성을 지니고 있는 항-혈관형성 단백질을 고역가로 생성시키기 때문이다. 이러한 발현 시스템을 사용하는 경우, 포유류 엔도스타틴이 가용성 단백질(kDA)로서 발현되는 것으로 밝혀졌는데, 도입 후 2일째에 발현의 피크 수준이 인지되었다.

상기 언급된 마우스 엔도스타틴을 함유하고 있는, pET17bhis 작제물의 주형 상에서 벤트 DNA 폴리머라제를 사용하는 증폭 공정에 의해, 마우스 엔도스타틴을 암호화하는 서열을 추가로 변형시켰다. 사용된 상단 프라이머는 5'-GGG AAT TCC ATA CTC ATC AGG ACT TT-3'(서열 번호: 11)이고, 하단 프라이머는 5'-AAG CGG CCG CCT ATT TGG AGA AAG AGG T-3'(서열 번호: 12). EcoRI 및 NotI 제한 부위를 함유하는 증폭된 단편을 예비분해된 효모 발현 벡터 내로 아클로닝시켰다. pPICZαA 벡터는 항생제 선별을 위하여 제오신(Zeocin) 마아커와 함께 알파 인자 분비 시그날 서열을 수반하고 있다. 초기 형질전환을 톱 10' 숙주 균주(InVitrogen, San Diego, California, USA)에서 수행하였다. 이로써 생성된 클론을 삽입체의 존재하에서 스크리닝하고 포지티브 클론을 서열화하였다. 이어서, 상기 플라스미드를 SacI로 선형화시키고 효모 숙주 균주 GS115(InVitrogen, San Diego, California, USA) 내로의 동종 재조합을 위해 사용하였다. 피치아 발현 매뉴얼에 기재된 바와 같이 염화리튬 방법에 의해 형질전환을 수행하였다. 제오신 100μmg/ml를 함유하는 YPD 플레이트 상에 도말함으로써 재조합체를 선별하였다. YPD/제오신 플레이트 상에서 성장하는 클론을 대상으로 하여 발현을 시험하였다.

초기 스크리닝을 사용하여 높은 발현도를 나타내는 효모 클론을 동정하였다. 2리터 정류 진탕기 플라스크에서 마우스 엔도스타틴을 대규모로 발현시켰다. 밤새 배양물(A₆₀₀; 2-6)을 사용하여 2리터 플라스크를 접종하고, 이때 완충된 글리세롤 매질 500ml를 부가하였다. A₆₀₀가 16 내지 20이 될 때까지(2일) 세포를 30℃에서 250rpm으로 성장시켰다. 연속적으로, 세포를 10분 동안 5000rpm으로 원심분리시키고, 효모를 완충된 메탄올 유도 매질 300 내지 400ml에 재현탁시켰다. 분비된 재조합 단백질을 함유하는 상등액을 도입한 지 2일, 3일 및 4일째 수거하였다. 최종 수거 후, 세포 무함유 상등액을 즉시 처리하였다.

실시예 4: 헤파린-아가로스 크로마토그래피를 통한 마우스 엔도스타틴의 정제

문헌[참조: O'Reilly et al. (1997)(Cell 88:277-285)]의 데이터를 기준으로 하여, 헤파린-아가로즈 칼럼을 정제를 위해 사용하였다. 재조합 단백질을 함유하는 조 상등액을 황산암모늄 침전에 의해 농축시켰다(70%). 침전된 단백질을 150mM NaCl를 함유하는 10mM 트리스 완충액 pH 7.4에 용해시키고, 6 내지 8시간 간격으로 3번 변화시키면서 4℃에서 밤새 투석시켰다. 이와 같이 투석된 샘플을 아미콘 농축기(YM10)를 이용하여 한외여과시킴으로써 추가로 농축시켰다. 1회용 폴리프렙 칼럼(BioRad, Hercules, California, USA)를 헤파린-아가로즈 수지로 팩킹하고 10mM 트리스, 150mM NaCl, pH 7.4로 평형시켰다. 농축된 샘플을 연동 펌프를 사용하여 20ml/hr의 유속으로 상기 칼럼 상에 부하하였다. 이 칼럼을, A₂₈₀가 0.001을 초과할 때까지 평형 완충액으로 세척하였다. 결합된 단백질을 용출시켰다(2ml 분획을 0.3M, 0.6M, 1M 및 2M NaCl로 점차적으로 구배시킴). 0.6M 내지 1M의 피크 분획을 모으고 PBS, pH 7.4에 대하여 투석하였다. BCA 검정(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)에 의해 단백질 농도를 측정하였다. 정제 공정을 냉방에서 4℃하에 수행하였다. 피치아 시스템으로부터 발현된 재조합체 가용성 엔도스타틴을 시험관내 검정에 사용하였다.

도 3 및 4는 정제된 단백질의 용출 프로필과 SDS-PAGE 분석을 각각 도시한 것이다. 도 3은 분획 번호(x-축), 280nm에서의 흡광도에 대한 플롯팅()(좌측 y-축) 및 각 분획을 용출하기 위해 사용된 NaCl의 농도에 대한 플롯팅()(우측 y-축)을 도시하고 있다. NaCl의 농도를 증가시키면서 2개의 별개의 피크를 수득하였다. 0.3M NaCl에서의 첫 번째 피크는 0.6M NaCl에서의 주 피크와 비교해서 작다. 대부분의 엔도스타틴 단백질은 병류 분획에서의 단백질의 결여로 나타난 바와 같이 칼럼에 결합되어 있다(도 4, 레인 4). 재조합 단백질이 단단하게 결합되었고 저염 트리스 완충액을 사용하여 세척하여 기타 효모 유도된 단백질을 제거하였다. 0.3M NaCl 분획으로부터 용출된 단백질은 미량의 엔도스타틴을 함유하고 있지만, 기타 숙주 유도된 고분자량 단백질로 오염되어 있다. 정제된 단백질이 20kDa로 이동하였고, 환원시 22kDa로 이동하였다. 0.6M 및 1M NaCl에서 용출된 단백질 분획을 모으고, 농축시킨 다음, PBS(pH 7.4)에 대하여 투석하였다. 정제된 단백질을, 슈퍼로즈 12(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, New Jersey, USA) 크기 분리용 칼럼을 사용하여 FPLC에 의해 추가로 분리시켰다. 이러한 칼럼으로부터의 용출 프로필은 단일 피크를 나타낸다. 선택된 분획으로부터의 10ml 분취량을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분석하고 그 결과가 표 4에 제시되어 있다. SDS-PAGE 분석 결과, 엔도스타틴에 상응한느 22 내지 24kDA의 단일 별개의 밴드가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 발현 수준은 배양액 1리터 당 15 내지 20mg인 것으로 추정되었다.

재조합 단백질의 성상을 추가로 확인하기 위하여, N-말단 미소서열화를 7주기 동안 수행하였다. 효모 알파 인자 시그날 펩티드가 프로세싱되고 알라닌에서 절단된 것으로 나타났다. 시그날 펩티드 절단 후의 정제된 단백질의 첫 번째 7개 잔기(EFHTHQD)는 엔도스타틴 단백질의 공개된 서열과 정확하게 부합되었으며, 여기서 첫 번째 2개 잔기(EF)는 링커 서열로부터 유도된 것이다.

실시예 5: His.엔도스타틴의 피치아 발현 시스템으로의 클로닝 및 발현

pET17bhis 발현 벡터에서 마우스 엔도스타틴 작제물의 암호화 영역은 10개 히스티딘 잔기의 His.태그 다음에 존재하였다. His.태그 서열을 포함한 상기 암호화 영역을 EcoRI 및 NotI 부위로의 증폭을 통하여 pPICZαA 벡터 내로 왕복시켰다. 선형화 및 효모 숙주 균주 GS115 내로의 재조합을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다. 세포-무함유 매질을 70% 황산암모늄으로 침전시켰다. 침전된 단백질을 300mM NaCl을 함유하는 50mM 인산나트륨 완충액(pH 8.0)에 용해시키고 6 내지 8시간 간격으로 3회 변화시키면서 4℃하에 동일한 완충액에서 투석시켰다. QIA 발현 매뉴얼(Qiagen, Hilden, Germany)에 기재된 바와 같이, His.엔도스타틴 재조합 단백질의 정제를 위해 Ni-NTA 칼럼을 사용하였다. 결합된 단백질을 이미다졸의 단계별 구배(10mM, 25mM, 50mM, 및 100mM)로 용출시켰다. 50mM 내지 100mM 이미다졸 용출액의 피크 분획을 모으고 PBS 완충액, pH 7.4에 대해 투석하였다.

그 결과가 도 5 및 6에 도시되어 있다. 도 5는 분획 번호(x-축), 280nm에서의 흡광도에 대한 플롯팅()(좌측 y-축) 및 각 분획을 용출하기 위해 사용된 이미다졸 농도에 대한 플롯팅()(우측 y-축)을 도시하고 있다. 몇몇 흡광도 피크가 관찰되었는데, 첫 번째가 가장 크고, 그 다음이 3개의 보다 작은 피크이다. Ni-NTA 칼럼으로부터의 His.엔도스타틴의 용출 프로필은 재조합 단백질이 단단하게 결합되었다는 것을 나타낸다. 배양 상등액 중의 효모-유도된 숙주 단백질은 칼럼과 결합되지 않았으며 세척 동안에 제거되었다. 결합된 단백질을 이미다졸의 단계별 구배에 의해 용출시켰다. 비-특이적으로 결합된 숙주 유도된 단백질이 10mM 이미다졸의 첨가로 용출되었다(도 5). 25mM 이미다졸에서, 작은 분획의 재조합 단백질이 고분자량 단백질과 함께 용출되었다. 50mM 및 100mM 이미다졸로 최종 용출시키면, 독특한 피크가 나타났다. SDS-PAGE 분석이 도 6에 도시되어 있다. 병류 분획(레인 3)은 어떠한 엔도스타틴도 함유하지 않았는데, 이는 대부분의 단백질이 상기 칼럼에 결합되었다는 것을 지시해준다. 이미다졸의 농도를 10mM 및 25mM로 증가시키면, 비-특이적 단백질이 용출된다. 정제된 재조합 His.엔도스타틴은 50mM 이미다졸 중에서 22 내지 24kDa에 상응하는 단일 밴드로서 이동하였다. 분자량이 22kDa인 단백질은 44 내지 46kDa에 상응하는 소량의 단백질과 함께 100mM에서 나타났다. 정제된 단백질의 농도를 BCA 방법으로 결정하였다. 발현 수준은 배양액 1리터당 15mg인 것으로 평가되었다.

실시예 6: 재조합 효모 엔도스타틴의 성상 확인 및 폴리클로날 항체 발생 및 웨스턴 블롯 분석

효모에서 생성된 마우스 재조합 엔도스타틴에 대한 폴리클로날 항혈청은, 래빗트를 피치아 발현 시스템으로부터 유도된 정제 단백질 10㎍으로 면역시킴으로써 생성시켰다. 세균 및 효모 시스템으로부터 발현된 재조합 엔도스타틴을 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리시켰다. 이 단백질을 반-건조 트랜스퍼(Trans-blot, BioRad, Hercules, California, USA)에 의해 PVDF 막에 옮겼다. 1차 항혈청을 5% 비-지방 분유를 함유하는 1x TBS 완충액 중에서 1:4000으로 희석시켰다. 고우트 항-래빗트 IgG/HRP 접합체를 2차 항체로서 사용하였다(1:5000). 화학발광체(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)에 의해 면역반응성을 탐지하였다.

세균성 및 효모 발현 시스템으로부터 발현된 정제 엔도스타틴을 환원성 및 비-환원성 조건 하에서 수행하였다. 도 7은 엔도스타틴에 상응하는 면역반응성 밴드를 도시한 것이다. 웨스턴 블롯으로부터 평가된 단백질의 크기는 22 내지 24kDa의 범위이다. 또한, 효모 및 세균으로부터의 재조합 His.엔도스타틴을 펜타 His.모노클로날 항체(Qiagen, Hilden, Germany)로 프로빙하였다. 모노클로날 항체는 His.엔도스타틴을 이용한 경우에만 양성 반응을 나타낸 반면, 본래의 엔도스타틴은 어떠한 면역반응성도 나타내지 못하였다. 이 데이타는 재조합 단백질 내에 His.태그가 존재하는 것을 확인시켜 준다. 항혈청은 사람 또는 마우스 안지오스타틴에 대한 어떠한 교차 반응성도 나타내지 않았는데, 이는 어느 정도의 면역반응성이 엔도스타틴에 특이적이라는 사실을 입증시켜 준다. EM 1 및 EM 2을 사용한 경우에 또한, 폴리클로날 항체의 면역반응성이 관찰되었다.

실시예 7: 내피 증식 검정

소의 폐동맥 동맥성 내피 세포(C-PAE)를 사용하여, 효모 시스템에서 생성된 엔도스타틴의 항-증식 효과를 시험하였다. 초기 실험은 상이한 내피 세포 유형 및 각종 파라미터("단식" 기간, 혈청 농도, 유사분열성 자극인자(예: VEGF 대 bFGF)의 농도 및 유형)를 이용하여 수행하였다. C-PAE 세포는 가장 재생 가능한 반응을 제공해준다.

C-PAE 세포를, 2% PBS를 함유하는 0.5ml DMEM 중의 웰당 12,500개 세포로, 피브로넥틴(10㎍/ml)으로 피복된 24-웰 플레이트에 도말하였다. 37℃에서 24시간 배양한 후, 재조합 마우스 엔도스타틴을 함유하거나 함유하지 않은 bFGF(R&D systems, Minneapolis, Minnesota, USA) 3ng/ml를 함유하는 2% PBS 및 신선한 DMEM으로 상기 배지를 대체하였다. 상기 세포를 24시간 동안³H-티미딘 1μCi로 펄싱하였다. 배지를 탈기시키고, 세포를 PBS로 3회 세척한 다음, 1.5N NaOH(웰당 100㎕)을 가함으로써 가용화시키고 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 액체 신틸레이션 계수기를 사용하여 세포-결합된 방사능을 결정하였다. 이 실험을 동일한 조건하에서 5회 반복하면, 매회 유사한 결과가 수득된다.

bFGF 유도된 증식의 용량 의존적 억제를 관찰하였다. 그 결과가 도 8에 도시되어 있는데, 이는 x-축을 따라 효모-유도된 가용성 엔도스타틴의 농도()와 효모-유도된 가용성 His.엔도스타틴의 농도가 플롯팅되어 있고 y-축을 따라³H-티미딘의 혼입량이 플롯팅되어 있는 그래프이다. 일반적으로, 혼입량은 엔도스타틴의 농도가 증가함에 따라 꾸준히 감소된다. 엔도스타틴의 농도를 증가시키면(0.1㎍/ml에서 10㎍/ml로 증가) 억제 범위(대조군의 30 내지 94%)가 관찰되며, ED₅₀값은 600 내지 700ng/ml의 범위이다. 도 8의 그래프에서 도시된 바와 같이, 효모로부터의 His.엔도스타틴을 상기 검정에서 시험하는 경우에는 C-PAE 세포에 대한 유사한 억제 효과가 관찰되었다.³H-티미딘의 혼입량은 효모-유도된 가용성 엔도스타틴() 및 효모-유도된 가용성 His.엔도스타틴()의 농도가 증가함에 따라 꾸준히 감소되었다.

재조합 단백질은 도 9에 도시된 바와 같이, 0.5㎍/ml 내지 10㎍/ml 범위의 농도에서 신장 세포 암종 세포(786-0 및 A498)의 증식을 억제하지 못하였다. 도 9는 786-0 세포(흰색 바) 및 A498 세포(검은색 바)에서의³H-티미딘의 혼입량을 도시하는 바 차트이다. 재조합 엔도스타틴은 또한 IMR90 및 NIH3TF 섬유아세포에 대한 어떠한 효과도 나타내지 못하였다.

실시예 8: 내피 세포 이동 검정

C-PAE 세포는 bFGF 및 VEGF에 반응하여 이동하지 않기 때문에, 자극인자로서 bFGF를 사용하여 상이한 농도의 엔도스타틴를 갖는 ECV304 세포를 사용하였다. bFGF에 대한 ECV304 세포의 이동을 차단시키는 재조합 엔도스타틴의 능력을 결정하기 위하여, 폴리카보네이트 막(25x80mm PVD 자유, 8μ공극, Poretics Corp., Livermore, California, USA)을 갖는 12-웰 보이든(Boyden) 화학주성 챔버(Neuro-Probe, Inc., Cabin John, Maryland, USA)를 사용하여 이동 검정을 수행하였다. 37℃에서 밤새 0.5% 젤라틴, 1mM CaCl₂및 150mM NaCl를 함유하는 용액으로 상기 챔버를 피복시킴으로써, 이러한 챔버에 대한 성장 인자의 비-특이적 결합을 방지하였다. ECV304 세포를 5ng/ml DiI(1,1'-디옥타데실-3,3,3',3'-테트라메틸인도카보시아닌 퍼클로레이트 DiIC18, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)를 함유하는 10% PBS에서 성장시키고, 0.5% BSA를 함유하는 PBS로 세척하였다. 트립신 처리한 후, 상기 세포를 코울터-계수기 Z1(Luton, U.K.)를 사용하여 계수하고, 0.5% PBS를 함유하는 배지 199(Life Technologies, Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland, USA)에서 300,000세포/ml로 희석시켰다. 하단 챔버를 25ng/ml bFGF를 함유하는 배지 199로 채운다. 상단 챔버에 상이한 농도의 재조합 엔도스타틴으로 15,000세포/웰로 시딩하였다. 세포를 37℃에서 4시간 동안 이동시켰다. 이때, 상기 막의 상단 표면 상의 세포를 세포 스크랩터로 제거하고, 이와 같이 이동된 하단 표면 상의 세포를 3% 포름알데히드에 고정시키며, PBS에서 세척하였다. 디지탈 카메라를 사용하여 550nM에서 형광 현미경을 이용하여 상기와 같이 고정된 막의 영상을 수득하고, 각 막 상의 세포수는 OPTIMAS(버젼 6.0) 소프트웨어(Media Cybernetics, L.P., Silver Spring, MD, USA)를 사용하여 결정하였다.

엔도스타틴을 첨가하면, 도 10A 및 10B, 및 도 11에 도시된 바와 같이 이동이 용량-의존적으로 억제되었다. 도 10A 및 10B는 자극인자로서 bFGF(25ng/ml)를 사용하여 가용성 마우스 엔도스타틴에 의한 내피 세포(ECV304) 이동의 억제를 도시하는 현미경 사진이다. 도 10A는 대조군(+ bFGF, 엔도스타틴 무함유)에서의 이동된 내피 세포를 도시한 것이고, 도 10B는 bFGF와 엔도스타틴(20㎍/ml)으로 처리된 이동된 내피 세포를 도시한 것이다.

도 11은 상이한 농도의 엔도스타틴을 이용한 내피 세포 이동 억제를 도시하는 바 차트이다. 상대적인 세포 이동이 y-축에 제시되어 있고, 처리(대조군, 25ng/ml bFGF, 및 20, 10, 5, 2.5 및 1㎍/ml의 엔도스타틴)이 x-축에 제시되어 있다. 각 처리를 2회 수행하였다. 각 웰에서, 이동된 세포의 수를 3개의 상이한 영역에서 계수하고 평균치를 수득하였다. 각 값을 대표적인 실험으로부터 평균을 내고 오차 바는 표준 편차를 나타낸다. 1㎍/ml 미만의 농도에서는, 이동의 최저한도의 억제가 인지된 반면, 10㎍/ml에서는, 내피 세포 이동의 60%가 억제된 것으로 관찰되었다. 이들 연구는 세포 이동에 대한 엔도스타틴의 효과를 나타내는 최초의 것이다. 내피 세포가 아닌 2개의 세포주의 이동에 대한 엔도스타틴의 작용을 또한 평가하였다. 내부 수질 수집성 관 신장 세포(IMCD)에 대해서는 어떠한 효과도 관찰되지 않았으며, IC-21 마크로파아지 전구체 세포주에서는 약간의 효과(5㎍/ml에서는 15% 및 20㎍/ml에서는 50%)가 인지되었는데, 이는 고농도에서는 엔도스타틴이 몇몇 세포 유형에서 세포 이동을 차단할 수 있다는 것을 제안하고 있다.

실시예 9: 융모요막(CAM) 검정

생체내에서 bFGF 유도된 안지오제네시스를 차단시키는 마우스 엔도스타틴의 능력을, 융모요막(CAM) 검정을 사용하여 시험하였다. 수정된 백색 레그혼(Leghorn) 계란(SPAFAS, Inc., Norwich Connecticut, USA)을 100㎟ 페트리 디쉬 상에 개방시키고 38℃하의 흡습 인큐베이터에서 11일 까지 성장시켰다. 비트로겐(Collagen Biomaterials, Palo Alto, Callifornia, USA)를 0.73mg/ml의 농도로 함유하는 펠릿에 비히클 단독; VEGF(250ng/펠릿), VEGF(250ng/펠릿) 및 엔도스타틴(20 내지 0.5㎍/펠릿), bFGF(50ng/펠릿), 또는 bFGF(50ng/펠릿) 및 엔도스타틴으로 보충하였다. 이 펠릿을 37℃에서 2시간 동안 중합시켰다. 이 펠릿을 나일로 메수 상에 놓아두고 CAM의 말단 부분으로 향하게 하였다. 배아를 인큐베이터에 다시 24시간 동안 놓아둔다. 콜라겐 메쉬 상의 새로운 모세혈관의 침입은 FITC-덱스트란을 치킨 배아 순환계에 주사함으로써 평가하였다. 실험이 끝날 무렵, 상기 메쉬를 해부하고 문헌[참조: Iruela-Arispe et al. (1997)(Thromb. Haemost. 78:672-677)]의 방법에 따라서 프로그램 NIH 이미지 v1.59를 사용하여 맥관성 밀도를 평가하였다. 검정을 3회 수행하고 4가지의 독립적인 실험을 수행하였다.

엔도스타틴은 도 12 및 13에 도시된 바와 같이, bFGF와 VEGF 모두에 의해 매개된 혈관형성 반응을 억제할 수 있었다. 도 12는 비히클 단독(도 12A), VEGF 단독(250ng/펠릿, 도 12B) 및 VEGF 및 엔도스타틴(도 12C)에 대한 맥관성 밀도를 도시하는 3가지 현미경사진 셋트이다. 도 13A 및 13B는 억제가 용량 의존적이라는 것을 나타낸다. 도 13A는 VEGF에 반응하여 혈관형성 억제에 대해 플롯팅된(y-축) 재조합 단백질의 농도(x-축)를 도시한 바 차트이다. 도 13B는 bFGF에 반응하여 혈관형성 억제에 대해 플롯팅된(y-축) 재조합 단백질의 농도(x-축)를 도시한 바 차트이다. 계수치 모두를 네거티브 대조군으로 표준을 맞추었다. 양 차트는 엔도스타틴 농도 증가에 따라 안지오제네시스 억제를 꾸준히 증가시킨다는 것을 나타냈다. 모두 20㎍/메쉬에서, VEGF 반응을 차단시키는 것은 bFGF 반응을 억제(39%)시키는 것 보다 더 효과적이다(47%).

실시예 10: 엔도스타틴의 억제 효과의 중화

내피 증식과 CAM 검정을 이용하는 중화 연구에 의해, 엔도스타틴의 억제 효과의 특이성을 입증하였다. 내피 증식 검성에서는, 엔도스타틴을 실온에서 1시간 동안 정제된 항체(IgF) 상의 과량의 폴리클로날 항혈청과 함께 예비-배양한 다음, 3㎍/ml bFGF의 존재하에서 C-PAE 세포에 가하였다. 예비-면역 혈청을 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 또한, 정제된 IgF 및 엔도스타틴 항체 단독을 또한 대조군으로서 사용하였다. 1μCi/웰³H-티미딘을 24시간 동안 가함으로써 DNA 합성을 측정하고, 세포-결합된 방사능을 상기 언급된 바와 같이 측정하였다. CAM 검정의 경우에는, 엔도스타틴(10㎍)과 항혈청(50㎍)을, 펠릿을 만들기 이전에 4℃에서 회전시키면서 밤새 예비-배양하였다. 이들 실험에 대한 대조군은 IgG 단독 및 예비-면역 혈청 단독을 포함하였다. 두 검정에서의 혈관형성 반응에 관한 평가는 상기 지시된 바와 같이 결정하였다.

도 14는 내피 증식 검정에서 폴리클로날 항혈청에 의해 마우스 엔도스타틴의 억제 효과의 중화를 도시하는 바 차트이다.³H-티미딘의 혼입량이 y-축에 제시되어 있고, 처리(대조군, 10㎍ 엔도스타틴, 10㎍ 엔도스타틴 + 항혈청, 5㎍ 엔도스타틴, 5㎍ 엔도스타틴 + 항혈청, 예비-면역 혈청, 엔도스타틴 항혈청 및 엔도스타틴 IgG)가 x-축에 제시되어 있다. 각 값은 3회 배양물로부터의 평균치이고 오차 바는 표준 편차를 나타낸다. 도 15는 CAM 검정 결과를 도시하는 한 쌍의 현미경사진이다. 도 15A는 VEGF 및 엔도스타틴(10㎍)의 효과를 도시한 것이고, 도 15B는 VEGF, 엔도스타틴(10㎍), 및 폴리클로날 항혈청(50㎍)의 효과를 도시한 것이다. 도 14와 15 모두는 엔도스타틴의 억제 효과가 특이적 항혈청과의 배양에 의해 억제될 수 있다는 것을 입증해준다. 항-엔도스타틴 항혈청은 상기 억제 효과를 95% 정도 차단하였다. 예비-면역 혈청과 엔도스타틴 항체는 유사한 효과를 나타내지 못하였으며, 정상적인 래빗트 IgG도 유사한 효과를 나타내지 못하였다.

실시예 11: 누드 마우스 모델에서 1차 786-0 RCC 종양의 억제

6 내지 8주생의 수컷 누드 마우스의 우측 옆구리에 100ml 용량 중의 2백개의 786-0 세포를 피하 주사하였다. 이식한지 대략 2주 후에 종양이 나타났다. 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 측정하고 종양 용적을 다음 표준식을 이용하여 산정하였다:

종양 용적 = ab²x 0.52(여기서, a는 종양의 길이이고, b는 종양의 너비이다)[참조: O'Reilly et al. (1994) Cell 79:315-328]. 종양 용적은 350 내지 400㎣의 범위이다. 동물을 무작위로 추출하고 각 그룹을 이러한 그룹 내에서 필적하는 종양 크기를 갖는 5마리 마우스로 구성하였다. 재조합 엔도스타틴(세균 또는 효모 버전)을 이용하여 치료를 시작하는데, 여기서 각 마우스에게 재조합 단백질을 1일 10mg/체중 kg을 투여하며, 10일 동안 복강내 주사를 통하여 투여하였다. 대조군 동물에게는 매일 PBS를 투여하였다. 모든 그룹에서의 종양 크기를 격일로 측정하고 종양 용적을 산정하였다. 이 치료를 10일째 되는 날에 종결하고 동물을 희생시켜 각 마우스로부터의 종양을 제거하여 10% 완충 포르말린에 고정시켰다.

그 결과가 도 16, 17 및 18에 도시되어 있다. 도 16은 재조합 엔도스타틴으로의 전신 치료에 의한 786-0 종양 성장의 억제를 도시한 그래프이다. 치료 후의 시간(일)은 x-축에 제시되어 있고, 종양 용적(㎣)이 y-축에 제시되어 있다. 엔도스타틴의 복강내 주사는 1일(화살표)에 시작하여 10mg/kg/일로 제공되었다. 각 시점은 각 그룹에서 5마리 마우스의 평균치를 나타내고, 오차 바는 S.E.M을 나타낸다. 처리는 대조군 PBS(), 효모로부터의 엔도스타틴(), 효모로부터의 His.엔도스타틴(×) 및 세균으로부터의 His.엔도스타틴()이다. 처리한지 5일째 되는 날에, 대조군(963㎣)과 처리된 종양 간의 차이가 나타났다. 효모 엔도스타틴-처리된 종양은 405㎣이고, 세균적으로-생성된 엔도스타틴-처리된 종양은 442㎣이며, His.엔도스타틴-처리된 종양은 462㎣이다.

도 17A 내지 도 17E는 재조합 엔도스타틴으로 처리된 786-0 종양의 사진 셋트이다. 도 17A 및 17B는 대조군 종양이고, 도 17C는 효모-유도된 엔도스타틴으로 처리된 종양을 도시한 것이며, 도 17D는 세균으로부터의 His.엔도스타틴의 효과를 도시한 것이고, 도 17E는 효모로부터의 His.엔도스타틴으로 처리된 종양을 도시한 것이다. 처리 주기 끝에, 대조군으로부터의 종양과 처리된 그룹으로부터의 종양을 해부용 현미경 하에서 총체적으로 검사하였다. 대조군 그룹으로부터의 종양이 일반적으로 더 크고 더 고도로 맥관화되었다. 종양 용적 2.5배 감소가, 처리한지 5일째 되는 날에 대조군 종양과 처리된 종양 간에 관찰되었다(도 16 및 17). 종양 성장이 처리 그룹 모두에서 억제되었고, 대조군 그룹에 비교해서 보다 느린 성장율이 관찰되었다. 10㎍/kg의 용량의 세균-유도된(His.태그) 또는 효모-유도된(His.태그를 갖거나 갖지 않은) 엔도스타틴 모두는 동등하게 잘 작용하였다. 처리한지 10일째 되는 날, 대조군 동물의 종양 용적은 1490㎣인 반면, 처리된 그룹의 종양 용적은 480 내지 570㎣(p 값 < 0.005)의 범위이다. 엔도스타틴 투여는 종양 성장을 완전하게 억제하지는 못하였는데, 종양 성장을 느리게 하고 처리 기간 동안에 용적이 최소 수준으로만 증가되었다.

실시예 12: 이. 콜라이에서 발생된 2개의 밀접하게 관련된 C-말단 엔도스타틴 변이체는 RCC에서 현저하게 상이한 생체내 활성을 나타낸다

상기 실시예 1에서의 원핵성 시스템에서 생성된 변이체 EM 1 및 EM 2 및 엔도스타틴을 이용한 두번째 실험 셋트에서 상기 언급된 RCC 종양 모델을 사용하였다. 1일 투여량은 복강내 주사되는 단백질 20mg/체중 kg이다. 초기 종양 용적은 150 내지 200㎣이다. 또한 pET28(a) 벡터에서 생성된 야생형 엔도스타틴을 포지티브 대조군으로서 실험을 위해 20mg/체중 kg 투여하고, PBS를 네거티브 대조군으로서 투여하였다.

그 결과가 도 18에 제시되어 있으며, 이에는 치료 후의 시간(일)이 x-축에 제시되어 있고, 종양 용적이 y-축에 제시되어 있다. 각 시점은 각 그룹에서 5마리 마우스의 평균치를 나타낸다. 처리는 대조군 PBS(), 세균으로부터의 야생형 His.엔도스타틴(점선,), 세균으로부터의 EM 1(대시선, △), 및 세균으로부터의 EM 1(실선, ◆)이다. 복강내 주사는 1일(화살표)째 시작하였다. 처리한지 9일 후에, 그룹 간의 차이가 명백해진다(도 18). 처리한지 11일째에, 대조군 그룹에서의 종양 용적(397㎣)이 두 처리 그룹, 즉 엔도스타틴(182㎣) 또는 EM 1(259㎣)의 것보다 대략 2배이다. 그러나, 동일자로, EM 2-처리된 그룹의 종양 용적(389㎣)은 대조군 그룹의 것(397㎣)과 유사하다. 유의성은 EM 2와 엔도스타틴 그룹 간에는 90% 신뢰도이고 엔도스타틴과 대조군 그룹 간에는 95% 신뢰도이다. 각 그룹에서 11일째의 가장 큰 종양과 가장 작은 종양 크기값이 떨어지게 되면, 신뢰도가 EM 2와 EM 1간 및 EM 2와 엔도스타틴 간에 95%로 증가되었다. 따라서, EM 1 단백질은 엔도스타틴의 본래의 생물학적 활성을 보유하고 있는 반면, 8개의 아미노산이 추가로 결실된 EM 2는 그렇지 못하였다. 또한, 엔도스티틴으로 처리된 그룹에서 5마리 마우스 중의 2마리 및 EM 1 그룹에서 5마리 중의 1마리는 처리가 끝날 무렵에 탐지할 만한 어떠한 종양도 갖고 있지 않았다.

실시예 13: 아넥신 V - FITC 검정

포스피티딜세린(PS)에 대한 친화도가 높은 칼슘 의존적 인지질 결합 단백질인 아넥신 V를 이용하여 초기 단계 아포프토시스를 탐지하였다. 아포프토시스의 개시 후, 대부분의 세포 유형은 내부 표면으로부터의 막 인지질 포스파티딜세린(PS)를 외부로 전위시켰다. PS와 천연적으로 결합되는 38kDa 단백질인 아넥신 V의 FITC 접합체로 염색함으로써 PS를 탐지할 수 있다. PCD 동안, PS 외부 이행은 전형적으로, 막 브레브 형성과 DNA 단편화에 앞섰다.

간략하게 언급하면, 200,000개 세포를, 2% PBS와 3ng/ml의 bFGF를 함유하는 DMEM 중의 피브로넥틴-피복된 6-웰 플레이트 상으로 도말하였다. 상이한 농도의 재조합 마우스 엔도스타틴을 각 웰에 가하고, 세포를 수거한 다음, 처리한지 18시간 후에 프로세싱하였다. 연구 기간 동안, 엔도스타틴 10㎍/ml를 가하고 세포를 3, 4, 6, 12 및 18시간 후에 프로세싱하였다. 사람 재조합 TNF-α(40ng/ml)를 포지티브 대조군으로서 사용하였다. 상기 세포를 PBS에 세척하고, 결합성 완충액(10mM HEPES/NaOH, pH 7.4, 140mM NaCl, 2.5mM CaCl₂)에 재현탁시켰다. 아넥신 V - FITC를 100ng/ml의 최종 농도로 가하고, 세포를 암실에서 10분 동안 배양한 다음, PBS에서 다시 세척하고 결합성 완충액 300ml에 재현탁시켰다. 프로피듐 요오다이드(PI) 10㎕를 유동 혈구계산 분석 이전에 각 샘플에 가하였다. 벡톤 디킨슨(Becton Dickinson) FACStar + 유동 혈구계산기를 사용하여 상기 세포를 분석하였다. 전자식 보상을 이용하여 블리드-드로우(bleed-through) 형광체를 제거하였다. 각 샘플에서, 최소 10,000개 세포를 계수하고, 리스트모드(listmode)에 저장하였다. 표준 세포 퀘스트 소프트웨어(Becton-Dickinson)를 사용하여 데이타 분석을 수행하였다. 네거티브 대조군이 1% 미만의 실증성을 허용하도록 사분원 셋팅을 설정하였다. 엔도스타틴을 비-내피 세포(NIH3T3 및 786-0)에 10㎍/ml으로 가하고, 세포를 프로세싱하며 상기 언급된 바와 같이 분석하였다.

10㎍/ml의 엔도스타틴은 아넥신 형광 세기에 있어서 독특한 변화를 나타내었다. 대조군 처리된 세포와 엔도스타틴 처리된 세포 간의 평균 형광 세기 차이는 5 및 10㎍/ml에서 유의적이었다(p=0.01). 형광 세기의 변화는 10㎍/ml의 엔도스타틴과 포지티브 대조군 TNF-α(40ng/ml)에 대해 유사하였다. 0.1㎍/ml 미만의 엔도스타틴 농도는 어떠한 중요한 아넥신 V 실증성을 나타내지 못하였다. 엔도스타틴이 PS의 외부이행을 유발시키는 가장 초기 시점을 연구하기 위하여, 본 발명자들은 시간에 따른 실험을 수행하였다(도 2B). 엔도스타틴의 효과는 처리한지 12시간 후에 유의적이었다(p=0.01). 6시간 전의 시점은 대조군 샘플과 처리된 샘플 간의 차이를 전혀 나타내지 않았다.

형광성 전자현미경(Nikon)을 이용하여 FACS 분석된 샘플을 형태학적 검사한 결과, 세포질에서는 어떠한 염색도 나타내지 않으면서 아넥신 V 염색이 12시간에 세포막에 국재된 것으로 나타났다. 이러한 기간 동안, 대다수의 세포는 PI에 대해 네거티브인데,이는 아포프토시스의 초기 단계를 암시하고 있다. 아넥신 V로 막 염색시키는 것 이외에, 노출 시간을 증가시키면(24 내지 36시간), 몇몇 세포가 PI에 대해 포지티브로 전환되었는데, 이는 아포프토시스의 보다 진행된 단계와 일치하였다.

연구된 기타 2개의 내피 세포주인 BAE 및 BCE에서 유사한 수준의 아넥신 V 염색이 관찰되었다. 본 발명자들은 또한, 이들 3가지 소의 내피 세포주에 대한 사람 엔도스타틴의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 이들 세포에 가해진 사람 엔도스타틴의 존재하에서는 아넥신 V 염색을 탐지하지 못한 반면, 사람 내피 세포주(HUVE 및 HMVE-L)을 사용한 경우에는, 아넥신 V 형광성의 현저한 변화가 나타난다는 것을 발견하였다. 이들 데이타는 아포프토시스가 아넥신 V 염색으로 평가한 바와 같이, 마우스 및 사람 엔도스타틴에 반응하여 다양한 내피 세포에서 발생된다는 것을 지시하고 있다.

비-내피 세포에 관해서, 786-0 및 NIH3T3 세포는 어떠한 독특한 아넥신 실증성을 나타내지 못하였다. 또한, 기타 비-내피 세포(IMR-90, A10 및 H9c2(2-1)-근원세포)를 스크리닝하면 엔도스타틴의 어떠한 효과도 발견되지 않았다. 이들 결과를 기준으로 하면, 엔도스타틴의 작용은 내피 세포에 대해 선택적인 것으로 여겨진다.

실시예 14: 카스파제 3 검정

카스파제 3(CPP32)은 포유류 세포의 아포프토시스 동안 초기에 활성화된 세포내 프로테아제이고 특이적 구조, 조절 및 DNA 복구 단백질을 분해시킴으로써 세포상 파쇄를 개시시켰다. 이러한 프로테아제 활성을, 표지된 기질(DEVD-pNA)로부터 절단 후에 발색단(p-니트로아닐리드)을 탐지함으로써 분광측정법으로 측정하였다.

본 검정을 75-㎠ 조직 배양 플라스크 또는 피브로넥틴-피복된 6-웰 플레이트에서 수행하였다. 이러한 6-웰 플레이트에 0.5 내지 1 x 10⁶세포/웰을 시딩하고, 상기 플라스크에 2 x 10⁶세포를 시딩하였다. 세포를 10% FBS 함유 DMEM에서 밤새 유지시켰다. 다음 날, 오래된 배지를 신선한 배지(2% FBS)로 대체시키고, 세포를 37℃에서 밤새 배양하였다. 단식시킨 후, 세포를 DMEM(2% FBS) 중의 bFGF(3ng/ml)로 자극시켰다. bFGF와 함께, 효모 엔도스타틴(10㎍/ml 최종 농도)을 가하고 세포를 24시간 동안 성장시켰다. 대조용 플레이트에 대해서는, PBS 완충액만을 가하였다. 포지티브 대조군으로서, TNF-αFMF 20ng/ml의 농도로 사용하였다. 24시간 후, 상등액 세포를 원심분리시킨 다음 수집하였다. 상기 웰(플라스크)을 트립신 처리하여 부착된 세포를 수집하고 상등액 세포와 합하였다. 세포를 계수하고 융해 완충액(Clontech, Palo Alto, California, USA)에 4 x 10⁷세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 나머지 프로토콜을 제조업자의 지시(Clontech, Palo Alto, California, USA)에 따라서 수행하였다. 카스파제 3의 특이적 억제제인 DEVD-fmk를 사용하여 상기 제조업자에 의해 제안된 바와 같이 특이성을 확인하였다. 마이크로플레이트 판독기(BioRad, Hercules, California, USA)에서 405nm하의 흡광도를 측정하였다. 유도된 샘플(효모 덴도스타틴 또는 TNF-α)의 결과를 유도되지 않은 대조군의 결과와 비교함으로써 프로테아제 활성(카스파제 3)의 증가율(배)을 결정하였다. 유사하게, 비-내피 세포(NIH3T3 및 H9c2(2-1)-근원세포)를 사용하고 상기와 같이 분석하였다.

카스파제 3 활성 증가를 추구하기 위하여, 엔도스타틴 10㎍/ml을 사용하여 실험 과정을 먼저 수행하였다. 2, 4, 8 및 14시간에는 처리된 샘플과 대조군 샘플 간에 어떠한 카스파제 3 활성 차이가 없다. 그러나, 엔도스타틴으로 처리한지 24시간 후에는 카스파제 활성이 대조군에 비해 상승하였다. 엔도스타틴 및 TNF-α(포지티브 대조군) 처리된 샘플의 카스파제 활성이 도 21에 제시되어 있다. 대조군과 비교해 보면, 엔도스타틴 처리된 세포는 24시간 후에 카스파제 3 활성이 1.8배 증가한 반면, TNF-α는 필적하는(1.75배) 증가를 제공하였다. 이 검정을 5회 이상 반복하면 유사한 결과가 수득된다. 카스파제 3의 특이적 억제제(DEVD-fmk)를 동일한 샘플에 포함시키는 경우, 프로테아제 활성은 기선(검은색 박스를 상응하는 흰색 박스와 비교함)에 있는데, 이는 측정된 활성 증가가 카스파제 3에 대해 특이적이라는 것을 지시해준다. 도 22는 NIH3T3 세포의 경우에는, 최저한도의 카스파제-3 활성 증가만이 관찰되는 반면, 근원세포에서는 처리된 배양물과 대조군 배양물 간에는 어떠한 카스파제-3 수준 차이가 나타나지 않았다.

실시예 15: TUNEL 염색의 현미경-이용 탐지

핵상 DNA가 분획화되는 것이 아포프토성 세포의 핵에서 일어나는 독특한 변화 중의 하나이다. TUNEL(말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개된 dUTP 닉-말단-표지화) 검정을 엔도스타틴, TNF-α처리된 및 대조군 세포 상에서 수행하였다. 유착 세포의 경우, C-PAE 세포를 피브로넥틴 피복된 Lab-Tek 챔버 슬라이드 상에 5,000세포/웰의 밀도로 시딩하고 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지 0.4ml에서 성장시켰다. 2일 후, 오래된 배지를 탈기시키고 2% FBS를 함유하는 신선한 DMEM를 가하며, 밤새 세포에게의 영양 공급을 중단하였다. 다음 날, 3ng/ml bFGF를 함유하는 새로운 배지(2% FBS 함유) 0.36ml를 효모 엔도스타틴(10㎍/ml) 또는 TNF-α(20ng/ml)와 함께 가하였다. 대조군 샘플의 경우, bFGF(3ng/ml)를 함유하는 신선한 배지(2% FBS)를 가하였다. 유도한 후(24시간), 상기 슬라이드를 PBS로 2회 세척하고, 이어서 4℃에서 25분 동안 신선한 4% 포름알데히드/PBS에서 고정시켰다. 이 슬라이드를 PBS에서 세척하고, 세포를 얼음 상에서 5분 동안 0.2% 트리톤 X-100/PBS에 침투시킨 다음, 각 실온에서 5분 동안 신선한 PBS로 2회 세척하며, TUNEL 검정을 다음에 기재되는 바와 같이 수행하였다.

사용된 프로피듐 요오다이드(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)의 최종 농도가 1㎍/ml인 것을 제외하고는, 아포알레트(ApoAlert) DNA 분획화 검정 키트 사용자 매뉴얼(Clontech, Palo Alto, California, USA)에 기재된 바와 같이 TUNEL 검정을 수행하였다. 이러한 검정 후, 색이 바래는 것을 방지하기 위한 용액 방울을 가하고 슬라이드의 처리된 부분을 청정한 매니큐어로 밀봉시킨 모서리를 갖는 유리 커버슬립으로 덮었다. 그린(520nm) 및 레드 형광체(>620)에 대한 이중 필터 세트를 사용하여 형광성 현미경으로 슬라이드를 즉시 관찰하였다. 영상을 디지탈 현미경(Nikon Microphot-SA)를 사용하여 포착하고 SPOT 소프트웨어 버전 1.1.02를 사용하여 프로세싱하였다. 포지티브 대조군(TNF-α)의 경우에는, 5 랜덤 필드를 선택하고, 샘플의 경우에는, 15 랜덤 필드를 선택하였다. 이어서, 필드당 그린과 레드 세포의 수를 계수하고, 소정의 필드에서 레드 세포 수로 나눠진 그린의 비율(%)을 결정하였다. 이어서, 상이한 필드의 평균치(S.E.M. 포함)를 산정하였다.

현탁액 중의 세포에 대해서는, 부유 세포를 4℃에서 10분 동안 300xg으로 원심분리시킴으로써 수집하였다. 오래된 배지를 흡기시키고, 세포를 PBS(pH 7.4) 500ml에 재현탁시켰다. 세포를 다시 원심분리시키고, PBS를 제거하며, 펠릿을 신선한 PBS 75ml에 재현탁시켰다. 재현탁된 세포를 깨끗한 슬라이드를 사용하여 폴리-L-리신 피복된 슬라이드(Jersey lab 공급) 상으로 확산시켰다. 상기 슬라이드를 4℃에서 25분 동안 신선한 4% 포름알데히드/PBS에 침수시킴으로써 상기 세포를 고정시켰다. 나머지 프로토콜을 상기 언급된 바와 같이 수행하였다.

효소 TdT의 존재하에서는, 엔도스타틴과 TNF-α처리된 슬라이드 모두가 그린-형광성 하에서 수 많은 포지티브 세포를 나타낸 반면, 대조군에서는 어떠한 포지티브 세포도 관찰되지 않았다. 효소가 존재하지 않는 경우에는, 엔도스타틴 처리된 슬라이드가 배경 세포 형광성을 나타내었다.

몇몇 필드에서의 아포프토성 세포의 수를 계수하고, 아포프토성 세포의 비율(%)(필드당 레드 세포의 수로 나눠진 그린 세포)을 도 23에 플롯팅하는데, 이는 바 그래프이다. 대조군 세포에서의 아포프토시스율은 1.24%이다. 엔도스타틴 처리된 세포에서는, 현탁액 세포에서 아포프토시스율의 30배 증가(38.3%)가 관찰된 반면, 부착된 세포에서는 15배 증가(19.4%)가 관찰되었다. TNF-α의 경우, 아포프토시스율은 6.4%이다. 이와는 대조적으로, 안지오스타틴 처리된 BCE(소의 부신 피질 모세관 내피) 세포 중의 TUNEL-포지티브의 비율(%)은 대조군 세포(1.2%)와 비교해서 1.6배 증가된 2%인데, 이는 엔도스타틴이 안지오스타틴 보다 더 강력한 아포프트성 제제라는 것을 제안하고 있다.

실시예 16: 웨스턴 블롯 분석에 의한 Bcl-2 및 Bax 발현

C-PAE 세포(1 x 10⁶)를, 3ng/ml bFGF를 함유하는 2% FBS의 존재하에서 피브로넥틴(10㎍/ml)으로 예비피복시킨 10cm 페트리 디쉬에 시딩하였다. 엔도스타틴을 10㎍/ml으로 가하고, 세포를 처리한지 12, 24 및 28시간 후에 수거하였다. 세포를 PBS 완충액(pH 7.4)에서 3회 세척하고, 이 세포를 신선하게 가해진 완전한 프로테아제 억제제 정제(Boerhinager Mannheim), 100mg/ml 페파블록(Pefabloc), 1mg/ml 펩스타틴을 함유하는 1x EBC 완충액(50mM 트리스-HCl, pH 8.0, 120mM NaCl, 1% Nonidet P-40) 1ml에 재현탁시켰다. 완전한 세포 융해물 중의 단백질 농도를 BCA 방법에 의해 측정하였다. 완전한 세포 추출물 30mg을 4 내지 15% 구배 폴리아크릴아미드 겔 상으로 부하하였다. 반-건조 트랜스블롯 장치(BioRad, Hercules, California, USA)를 사용하여 옮겼다. 상기 막을 5% 비-지방 분유를 함유하는 세척 완충액(1 x TBS)에서 차단시켰다. 사람 Bcl-2(N-19)에 대해 지시된 고우트 항체{sc-492-G}를 공급처[Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, California, USA)]로부터 구입하였다. Bax(B-9)에 대한 친화성 정제된 마우스 폴리클로날 항체{sc7490} 및 Bcl-XS/L에 대한 친화성 정제된 마우스 폴리클로날 항체{sc1690}은 동일한 제조업자로부터 구입하였다. 폴리클로날 항-액틴 항체(Sigma, St. Louis, Missouri, USA)를 사용하여 단백질 부하에 대한 표준을 맞추었다. 2차 항체는 호스래디쉬 퍼옥시다제와 접합된 항-고우트, 마우스 및 래빗트 면역글로불린이다(Amersham Corp., Arlington Heights, Illinois, USA)이다. 증진된 화학발광 시약(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA)를 이용하여 면역반응성을 탐지하였다. 영상을 평편한 베드 스캐너(Scan-Jet 4C)를 사용하여 스캐닝하고 NIH 이미지 1.61 소프트웨어에 의해 정량화하였다. Bcl-2 시그날을 각 실험 내에서의 액틴의 것으로 나눔으로써 표준화를 수행하였다.

Bcl-2 및 Bcl-X_L과 같은 항-아포프토성 막은 PCD가 수 많은 자극인자에 반응하는 것을 방지시켰다. 달리 말하면, Bax 및 Bak와 같은 프로-아포프토성 단백질은 세포 사멸을 가속화시킬 수 있고, 특정 경우에는, 이들이 부가의 시그날과 독립적인 아포프토시스를 유발시키기에 충분하다. 엔도스타틴 처리된 및 대조군 C-PAE 세포의 완전한 세포 추출물을 대상으로 하여, Bcl-2 및 Bax 발현 수준을 시험하였다. 성장 억제된 C-PAE 세포에서는, Bcl-2 발현이 높았다. 이는 28시간 까지는 비교적 일정하지만, 엔도스타틴 처리된 세포는 도 24A에 도시된 바와 같이, Bcl-2에서 현저한 감소를 나타냈다. 밀도 측정 결과, 대조군과 비교한 Bcl-2의 수준은 처리한지 12, 24 및 28시간 후에 각각 1.2, 1.5 및 3배 정도 감소되었는데, 이때 액틴 수준이 표준화 대조군으로서 사용되었다. 이와는 달리, Bax 발현은 대조군과 처리된 배양물 간에 유사하였다(도 24B).

NIH3T3과 IMR-90 세포 모두에서는 Bcl-2 단백질이 탐지되지 않았다. Bax 발현 수준은 도 25A 및 25B에 도시된 바와 같이, 이들 세포주에서 엔도스타틴 처리에 의해 전혀 영향을 받지 않았다. C-PAE 세포에서는, 초기 시점(12시간)에, Bcl-XL 수준이 2배 정도 감소된 반면, NIH3T3 세포에서는 이의 발현이 변화되지 않았다(도 25C 및 25D). 흥미롭게도, 본 발명자들은 C-PAE에서 보다 많은 프로-아포프토성 형태의 Bcl-X만을 탐지한 반면, NIH3T3에서는 보다 작거나 보다 많은 형태를 탐지하였다.

이러한 발견들은 엔도스타틴이, Bcl-2 발현을 변형시킴으로써 이의 조절 활성을 발휘하였다는 것을 제안하고 있다. 흥미롭게도, VEGF가 내피 세포에서 Bcl-2 수준을 증대시키는 것으로 밝혀졌다. 엔도스타틴이 VEGF의 증식 효과를 길항시키기 때문에, Bcl-2가 조절 지점 중의 하나인 것으로 여겨진다. 최근의 연구는 Bcl-2 단백질이 Bax, Bcl XS, Bik 및 Bad 등의 기타 단백질과 결합되어, 궁극적으로 세포 생존을 증진시킨다고 지시하고 있다[참조: Newton, K, and Strasser, A. (1998) Curr. Opin. Genet. Dev. 8:68-75; Jacobson, M.D. (1997) Curr. Biol. 7:R277-81]. 또 다른 Bcl-2 유사체인 Bax의 기능은 수수께끼 같은 채로 남아있다. Bax와의 이종이량체 형성을 통한 Bcl-2 및 Bcl-X_L기능, 및 Bax의 과발현은 아포프토시스를 가속화시켰다. 최근에, FGF-2가 Bcl-2 의존적 및 독립적인 기전에 의해 내피 세포 아포프토시스를 억제한 것으로 나타났다. 본 발명자들은 엔도스타틴 처리된 배양물에서 Bcl-2(및 Bcl-X_L) 발현 차이를 발견하였지만, Bax 수준에서는 어떠한 차이도 발견하지 못하였다. Bcl-2가 T 세포에 대해 밝혀진 바와 같아. Bax와 독립적으로 작용할 수 있다.

등가

본 발명이 이의 바람직한 양태를 참조로 하여 특정하게 제시되고 기재되긴 하였지만, 당해 분야의 숙련인은 첨부된 청구의 범위에 의해 규정된 바와 같은 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않고 형태 및 상세한 내역에 있어서의 각종 변화가 일어날 수 있다는 것을 인지할 것이다.

Claims

단리된 펩티드의 C-말단이 아미노산 서열 SYIVLCIE를 포함하는 단리된 항-혈관형성 펩티드.
변이가 엔도스타틴 단백질의 C-말단으로부터 9개의 연속적인 아미노산 결실을 포함하는 변이된 엔도스타틴 단백질을 포함하며, 항-혈관형성 활성을 지니고 있는 단리된 EM 1.
제 2 항에 있어서, 단리된 EM 1의 C-말단이 아미노산 서열 SYIVLCIE를 포함함을 특징으로 하는 단리된 EM 1.
제 2 항에 있어서, 결실된 9개의 연속적인 아미노산이 아미노산 서열 NSFMTSFSK를 포함함을 특징으로 하는 단리된 EM 1.
(a) 서열번호: 의 누클레오티드 서열; (b) 서열번호: 의 누클레오티드 서열에 상보적인 서열 ; 및 (c) 엄격한 조건하에 서열 번호: 의 누클레오티드 서열에 하이브리드화되는 서열을 포함하는 제 1 항의 단리된 폴리누클레오티드.
서열 번호: 7과 서열 번호: 8의 프라이머에 의해 증폭된 누클레오티드 서열을 포함하는, 단리된 폴리누클레오티드.
폴리누클레오티드가 발현 조절 서열에 작용가능하게 연결됨을 특징으로 하는, 제 3 항의 단리된 폴리누클레오티드.
제 7 항의 폴리누클레오티드로 형질전환된 숙주 세포.
제 8 항에 있어서, 세포가 박테리아, 효모, 포유동물 세포, 곤충 또는 식물 세포를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 숙주 세포.
(a) 제 3 항의 폴리누클레오티드로 형질전환된 숙주 세포의 배양물을 증식시키고,

(b) 배양물로부터 단백질을 정제하는 것을 포함하여 제 3 항의 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 단백질을 생성시키는 방법으로서, 숙주 세포가 박테리아, 효모, 포유동물, 곤충 또는 식물 세포를 포함하는 군으로부터 선택되는, 제 3 항의 폴리누클레오티드에 의해 암호화된 단백질을 생성시키는 방법.
두개 이상의 단백질 분자 및 추가로, 제 3 항의 EM 1을 포함하는 융합 단백질.
제 11 항에 있어서, 레스틴, 엔도스타틴, 안지오스타틴, 아포미그렌 또는 EM 1을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 분자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 융합 단백질.
생물학적으로 활성인 성분으로서 제 3항의 EM 1을 포함하는 조성물.
약제학적으로 양립가능한 담체와 제 23항의 조성물.
생물학적으로 활성인 성분으로서 제 11항의 융합 단백질을 포함하는 조성물.
생물학적으로 활성인 성분으로서 제 12항의 융합 단백질을 포함하는 조성물.
포유동물 조직을 제 3항의 EM 1을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, 포유동물 조직에서 혈관형성 활성을 억제시키는 방법.
혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 앓는 환자에게 제 17항의 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 질환 치료에 제 17항의 조성물을 사용하는 방법.
제 18 항에 있어서, 질환이 안지오제네시스 의존성 암, 양성 종양, 류마티스성 관절염, 건선, 눈의 안지오제네시스 질환, 오슬러-웹버(Osler-Webber) 증후군, 심근 안지오제네시스, 플라크 신생맥관형성, 모세관확장증, 혈우병 관절증, 섬유성 혈관종, 외상 육아, 장 유착증, 아테롬성 동맥경화증, 공피증, 비대성 반흔, 고양이 할퀴기 질환, 헬리오박터 필로리(Heliobacter pylori) 궤양, 투석 이식편 맥관성 발작 협착증, 불임 및 비만을 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 19 항에 있어서, 질환이 암임을 특징으로 하는 방법.
제 20 항에 있어서, 질환이 신장암임을 특징으로 하는 방법.
세포 또는 조직을 제 3항의 단리된 EM 1을 포함하는 조성물과 접촉시키는 것을 포함하여, 세포 또는 조직에서 아폽토시스를 유발시키기 위해 제 3항의 단리된 EM 1을 포함하는 조성물을 사용하는 방법.
혈관형성 활성을 특징으로 하는 질환을 앓는 환자에게 제 13 항 내지 제 16 항중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 질환을 치료하기 위해 제 13 항 내지 제 16 항중 어느 한 항의 조성물을 사용하는 방법.
제 23 항에 있어서, 질환이 암임을 특징으로 하는 방법.
제 24 항에 있어서, 질환이 신장암임을 특징으로 하는 방법.
EM 1을 포함하는 아미노산 서열을 암호화하는 폴리누클레오티드가 삽입되도록 생체외에서 처리된 포유동물 세포를 사람 체내에 도입시키고, 포유동물내에서 치료적 유효량의 EM 1 단백질을 발현시키는 것을 포함하여, 포유동물에게 EM 1 단백질을 제공하는 방법.
제 26 항에 있어서, 세포가 림프구임을 특징으로 하는 방법.
제 27 항에 있어서, 림프구가 T-림프구 및 B-림프구를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에있어서, 세포가 혈액 세포, TIL 세포, 골수 세포, 맥관 세포, 종양 세포, 간 세포, 근육 세포, 섬유아세포를 포함하는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제 26 항에 있어서, 폴리누클레오티드가 바이러스 벡터에 의해 세포내로 삽입됨을 특징으로 하는 방법.
(a) 누클레오티드 1 내지 누클레오티드 525의 서열 번호: 1(ⅰ) 및 아미노산 1 내지 아미노산 175의 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 단리된 폴리누클레오티드(ⅱ)로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열에 적당히 엄격한 조건하에 하이브리드화되는 하나 이상의 폴리누클레오티드 프로브를 제조하는 단계;

(b) 포유동물 DNA에 프로브(들)를 하이브리드화시키는 단계; 및

(c) 프로브(들)로 검출되는 DNA 폴리누클레오티드를 단리시키는 단계를 포함하여, 단리된 폴리누클레오티드를 생성시키는 방법으로서, 단리된 폴리누클레오티드의 누클레오티드 서열이 누클레오티드 1 내지 누클레오티드 525의 서열 번호: 1의 누클레오티드 서열에 상응하는 방법.
제 31 항의 방법에 따라 생성된 단리된 폴리누클레오티드.
제 32 항의 폴리누클레오티드를 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
제 2 항의 엔도스타틴의 단리된 항-혈관형성 변이 단편에 대한 항체.
제 2 항의 EM 1의 단리된 변이체, 유도체, 유사체 또는 동족체.