WO2009145489A2 - 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 - Google Patents

세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 Download PDF

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amino acid
acid sequence
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이종민
박경호
동민탐
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주식회사 프로셀제약
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    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif

Definitions

  • the present invention is an endostatin recombinant protein fused to an angiogenic inhibitor endostatin (macromolecule transduction domain, MTD) having a cell permeability, polynucleotide encoding the cell-permeable endostatin recombinant protein nucleotides, wherein the cell permeable endostatin recombinant 'relates to an expression vector and the cell-permeable endostatin the cancer angiogenesis suppression activity enhanced anticancer pharmaceutical composition comprising a recombinant protein as an active ingredient of the protein.
  • MTD macromolecule transduction domain
  • Angiogenesis is the process by which new capillaries are formed from existing blood vessels and is essential for the growth and metastasis of solid tumors.
  • Pathogenic angiogenesis plays an important role in the progression of diseases such as cancer, diabetic retinopathy, psoriasis, rheumatoid arthritis and the like.
  • vascular endothelial cells remain stationary with relatively slow turnover.
  • the secretion of angiogenesis-stimulating factors in vivo increases and secretion of angiogenesis inhibitors.
  • the quantity should be turned on. Examples of these angiogenesis stimulating factors include bFGF, VEGF, and vascular permeability factors.
  • Angiogenesis inhibitors include angiostatin, endostatin, tumstatin, and cannes.
  • Statins (canstatin) aresten (arresten), thrombospondin and the like.
  • Endostatins are endogenous proteins that inhibit the proliferation, migration, penetration, and tube formation of vascular endothelial cells, and are molecular weight derived from type 18 collagen. 20 kDa polypeptide. Endostatin is cleaved in the protease-sensitive hinge region present in collagen by enzymes such as elastase, cathepsin and released from collagen and in the blood 20-35 cycles to a concentration of ng / m «. Endostatin binds to one specific integrin and inhibits phosphorylation of focal adhension kinase (FAK).
  • FAK focal adhension kinase
  • endostatin which indirectly affects cancer tissue by blocking blood supply to cancer tissue by inhibiting new blood vessel formation rather than directly affecting cancer tissue, has become an attractive target for the anticancer drug development market.
  • endostatin an angiogenesis inhibitor
  • Endostatin pharmacokinetics and drug administration methods that have a great effect on pharmacokinetics in vivo are considered as factors that hinder the success of endostatin clinical trials.
  • endostatin can be active in vivo: 1) it is expressed in soluble form from a bacterial expression system; 2) be able to be purified in large quantities; 3) can be injected directly into the experimental animal through the injection tool; 4) Non-continuous direct injection can be maintained at a fairly high concentration in vivo. Should be When these requirements are undermined, endostatin can play a crucial role in inducing apoptosis of cancer cells by inhibiting angiogenesis in cancer tissues.
  • macromolecules are fused with "Macromolecule Iransduction Domain” (MTD) and many other intracellular carriers, synthesized, expressed, purified in recombinant protein form, and then transferred into cells. It can be transported accurately and quickly to the location to effectively fulfill the various roles required (US Provisional Patent Application No. 60 / 877,060, PCT International Publication No. WO 2008/093982).
  • MTD Micromolecular delivery domain
  • the macromolecular delivery domain is fused to peptides, proteins, DNA, RNA, synthetic compounds and the like to enable the delivery of many impermeable materials that cannot enter the cell.
  • the present inventors have prepared a endostatin recombinant protein (CP-endostatin) that has been imparted cell permeability by fusing the macromolecule transfer domain to the angiogenesis inhibitor endostatin, and the recombinant protein is a large amount of blood vessels from outside the cell both in vitro and in vivo.
  • the present invention has been completed by confirming that the formation inhibitory factor endostatin can be effectively delivered into cells to inhibit the formation of microvessels, which can be usefully used in treating various cancers in humans. ⁇ Detailed Description of Invention ⁇
  • an object of the present invention is to provide a cell-permeable endostatin recombinant protein as an anticancer agent that can treat various cancers of humans by imparting cell permeability to angiogenesis inhibitor endostatin and introducing it into the cell with high efficiency.
  • the present invention provides a cell-permeable endostatin recombinant protein which is endowed with cell permeability by fusion of angiogenesis inhibitor factor endostatin and macromolecular transduction domain (MTD) to introduce endostatin into cells with high efficiency. to provide.
  • MTD macromolecular transduction domain
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the cell permeable endostatin recombinant protein.
  • the present invention provides an expression vector comprising the polynucleotide and a transformed bacterium transformed with the expression vector.
  • the present invention also provides a method for producing a cell permeable endostatin recombinant protein comprising culturing the transgenic bacteria.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer drugs with enhanced cancer angiogenesis inhibitory activity containing the cell permeable endostatin recombinant protein as an active ingredient.
  • the endostatin recombinant protein having cell permeability introduces angiogenesis inhibitor factor endostatin into the cells with high efficiency and maintains endostatin at high concentration in and around vascular endothelial cells present in tumor tissues, thereby migrating, proliferating and infiltrating vascular endothelial cells. And effectively inhibit tube formation and strongly block the formation of neovascularized microvascular vessels and thus exhibit excellent anticancer activity, and thus can be usefully used as anticancer agents for various cancers. [Brief Description of Drawings]
  • La shows the structure of the endostatin recombinant protein fused to the JO-56 and JO-73 MTDs designed in full-length form according to the present invention
  • Figure lb is JO-66, JO-71 designed in full-length form according to the present invention
  • JO-85 is JO-85
  • JO-18, JO-41, JO-135 and JO-159 MTDs show the structure of the endostatin recombinant protein fused, respectively.
  • Figure 2a is a result of amplifying the endostatin recombinant protein fused with the JO-56 and J073 MTDs designed in full-length form according to the present invention, respectively,
  • Figure 2b is amplified by PCR the endostatin recombinant protein fused to JO-66, JO-71, JO-85, JO-18, J 41, JO-135 and JO-159 MTDs, respectively, designed according to the present invention
  • Figure 3a is a schematic diagram showing the process of subcloning (PCR) amplification products in the pGEM-T Easy vector
  • 3b and 3c show that the PCR amplification products of the endostatin recombinant protein fused MTD in accordance with the present invention was subcloned into the pGEM-T Easy vector,
  • Figure 4a is a schematic diagram showing a process for producing a recombinant expression vector by cloning the endostatin recombinant fragment fused MTD in accordance with the present invention in the pET-28a (+) vector,
  • Figure 5a is a result of examining the expression of the cell permeable endostatin recombinant protein according to the present invention in various host cells
  • 5b is a result of examining the expression of the cell permeable endostatin recombinant protein according to the present invention in the presence (+) or absence (-) of the protein expression inducer IPTG
  • 6 is a result of purifying cell permeable endostatin recombinant protein expressed from bacteria transformed with the recombinant expression vector of the present invention
  • Figure 7a and 7b is a result of analyzing the cell permeability of the cell permeable endostatin recombinant protein according to the present invention (flow cytometry)
  • Figure 8 is a cell permeability of the cell permeable endostatin recombinant protein according to the invention mouse fibroblasts Observed with confocal laser scanning microscopy,
  • FIG. 11 is a result of investigating the effect of inhibiting migration of the cell permeable endostatin recombinant protein to human vascular endothelial cells by wound healing analysis.
  • 12a and 12b is a result of measuring the cell proliferation inhibitory effect of the cell permeable endostatin recombinant protein of the present invention on human vascular endothelial cells after a certain period of time,
  • 13a and 13b are the results of investigating the effect of inhibiting the formation of (tube formation) on human vascular endothelial cells of the cell permeable endostatin recombinant protein of the present invention
  • Figure 14a and 14b is a result of measuring the change in tumor size and weight every day while the cell-permeable endostatin recombinant protein of the present invention was treated subcutaneously for 21 days by subcutaneous injection,
  • the present invention provides a cell-permeable endostatin recombinant protein (CP-endostatin) and a plenucleotide encoding the cell-permeability endowed with fusion of the angiogenesis inhibitor endostatin and the macromolecular delivery domain (MTD) with high efficiency. do.
  • CP-endostatin cell-permeable endostatin recombinant protein
  • MTD macromolecular delivery domain
  • a feature of the present invention is the macromolecular delivery domain (hereinafter abbreviated as "MTD") specific for the angiogenesis inhibitor, endostatin, which is a macromolecule that is not readily introduced into cells using macromolecular intracellular delivery technology ( ⁇ ). By fusion to give cell permeability, endostatin is highly efficient delivery into cells. The macromolecular delivery domain can then be fused only to one end of endostatin or to both ends thereof. Intracellular delivery technology using MTD, a hydrophobic peptide derived from secreted protein, enables real-time quantitative regulation of endostatin concentrations in vivo, mediating delivery of endostatin to cancer tissue and into individual cancer cells Make it distributed.
  • MTD macromolecular delivery domain
  • This effect can effectively induce the binding of endostatin to integrin ⁇ 5 ⁇ 1, a specific receptor present on the surface of vascular endothelial cells by maintaining a high concentration of endostatin in and outside the vascular endothelial cells present in cancer tissues.
  • an endostatin recombinant protein having cell permeability was developed by fusing the endostatin to a peptide domain that enables the delivery of macromolecules into cells as a macromolecular delivery domain (MTD) that can be fused to angiogenesis inhibitor endostatin.
  • MTD macromolecular delivery domain
  • cell permeable endostatin recombinant protein refers to a covalent complex comprising a macromolecular transfer domain and an angiogenesis inhibitor endostatin, formed by genetic fusion or chemical bonding thereof.
  • genetic fusion is meant a linear covalent bond formed through the genetic expression of a DNA sequence encoding a protein.
  • Endostatin which binds to the specific integrin ( ⁇ 5 ⁇ 1) present on the surface of vascular endothelial cells and inhibits vascular endothelial cell proliferation, proliferation, invasion, tube formation, etc. It acts as an angiogenesis inhibitory protein.
  • the angiogenesis inhibitor endostatin is a polypeptide of molecular weight 20 kDa having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, which is a C-terminal domain of type 18 collagen cleaved by enzymatic treatment of alastase, cathepsin and the like (see FIG. La).
  • SEQ ID NO: 2 is a C-terminal domain of type 18 collagen cleaved by enzymatic treatment of alastase, cathepsin and the like (see FIG. La).
  • a polypeptide having cell permeability including an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 3 to 11 may be used.
  • Macromolecular delivery domains comprising any of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3-11 above may mediate the influx of biologically active molecules comprising polypeptides, protein domains, or full-length proteins into cells through cell membranes.
  • Cell permeable polypeptide The macromolecular delivery domain according to the present invention forms a helix in signal peptides consisting of three parts of the N-terminal region, the hydrophobic region and the C-terminal secreted protein cleavage site. It is designed to have a hydrophobic region that confers targeting activity.
  • These macromolecular delivery domains can directly penetrate the cell membrane without damaging the cells, thereby moving the target protein into the cells and exerting the desired function.
  • the macromolecular delivery domains having amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 3 to 11 that can be fused to the angiogenesis inhibitor endostatin according to the present invention are shown in Table 1 below.
  • angiogenesis inhibitor factor endostatin As a macromolecular delivery domain that can be fused to an angiogenesis inhibitor factor endostatin
  • JO-56 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 which is a peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B precursor derived from Cyclophilin B protein (Hereinafter abbreviated as 'MTE'); JO-73 MTD (hereinafter referred to as "MTD 2 ") having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 which is a sparze gene (spatzle (spz) gene) derived from Drosophila melanogasster CD yo;? / W7 «melanogaster Abbreviated);
  • JO-66 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, which is a secreted protein of Streptcw colicolor Strepptcw ⁇ c ⁇ coelicolor) A3 (2) (hereinafter, abbreviated as "MTD 3 ”) ;
  • JO-71 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 derived from Neuroplastin precursor (hereinafter abbreviated as "MTD 4 ");
  • JO-85 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 9 which is a peptide transport system secreted peptide binding protein derived from Streptomyces coelicolor (hereinafter abbreviated as “MTD 5 ”) ;
  • JO-18 MTD having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, a putative secreted protein derived from Streptomyces coelicolor A3 (2) (hereinafter abbreviated as “MTD 6 ”);
  • JO-41 MTD (hereinafter, abbreviated as “MTD 7 ”) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, which is an A3 (2) secreting protein derived from Streptomyces coelicolor;
  • JO-135 MTD having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, which is a secreted ATP / GTP binding protein derived from Stemtomyces coelicolor A3 (2) (hereinafter, “MTD 8 ”) Abbreviated);
  • MTD 9 One of JO-159 MTD (hereinafter abbreviated as “MTD 9 ”) having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, which is a Foldase protein prsA precursor, is used.
  • Endostatin recombinant protein having a cell permeability of the present invention is a macromolecular delivery domain of the nine kinds of MTD (JO-56: MTD ! , JO-73: MTD 2 , JO- 66: MTD 3, JO-71: MTD 4 , JO-85: MTD 5, JO-18: MTD 6, JO-41: MTD 7> JO-135: MTD 8; JO-159: MTD 9 ), either or both ends of the angiogenesis inhibitor endostatin And a histidine-tag (His-Tag) affinity domain fused to one end of the fusion construct for ease of purification.
  • MTD nine kinds of MTD
  • full-length forms are proposed as endostatin recombinant protein using JO-56 MTD and three full-length forms as endostatin recombinant protein using JO-73 MTD.
  • full length form refers to a form comprising all amino acids of amino acid sequence 1 to 184 as set forth in SEQ ID NO: 2 as the C-terminal domain of type 18 collagen.
  • Histidine-labeled covalently bound to the N-terminus of all the recombinant constructs.
  • HMiE has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14;
  • HEM Has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16;
  • HM 1 EM 1 has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
  • Histidine-labeled covalently bound to the N-terminus of all the recombinant constructs.
  • HM 2 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20;
  • HEM 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22; HM 2 EM 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.
  • each of the macromolecular delivery domains employs JO-66 MTD, JO-71 MTD, JO-85 MTD, JO-18 MTD, JO-41 MTD, JO-135 MTD and JO-159 MTD, respectively. Seven full-length forms are designed as endostatin recombinant proteins.
  • Histidine-labeled covalently linked to the N-terminus of all the recombinant constructs.
  • HM 3 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26;
  • HM 4 E has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28;
  • HM 5 E has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30;
  • HM 6 E has the amino acid sequence of SEQ ID 33, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID 32;
  • HM 7 E has the amino acid sequence of SEQ ID 35, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID 34;
  • HM 8 E has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36;
  • HM 9 E has the amino acid sequence of SEQ ID 39, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID 38.
  • endostatin recombinant protein HE is prepared in which only histitin label is fused without MTD fusion.
  • This control protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the present invention also provides a recombinant expression vector comprising a polynucleotide encoding the cell permeable endostatin recombinant protein and the transformed bacteria transformed with the recombinant expression vector.
  • a "recombinant expression vector” refers to a gene construct that is capable of expressing a target protein or target RNA in a suitable host cell and includes essential regulatory elements operably linked to express the gene insert.
  • operably linked refers to a functional linkage of a nucleic acid expression control sequence and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA of interest to perform a general function.
  • a promoter and a nucleic acid sequence encoding a protein or RNA may be operably linked to affect expression of the nucleic acid sequence encoding.
  • Operative linkage with recombinant expression vectors can be accomplished using genetic recombination techniques well known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation employs enzymes or the like generally known in the art.
  • Expression vectors usable in the present invention include, but are not limited to, plasmid vectors, cosmid vectors, bacteriophage vectors, viral vectors, and the like. Suitable expression vectors include expressions such as promoters, operators, initiation codons, termination codons, polyadenylation signals, and enhancers. In addition to the regulatory sequence, a variety of compounds may be prepared according to the purpose, including a signal sequence or a leader sequence for membrane targeting or secretion. The promoter of the expression vector may be constitutive or inducible. The expression vector also includes a selective marker for selecting a host cell containing the vector, and a replication origin if the expression vector is a replicable expression vector.
  • the recombinant expression vector of the present invention prepared as described above may be, for example, ⁇ , ⁇ .
  • the recombinant expression vector ⁇ , ⁇ is a full-length cell permeable endostatin recombinant protein according to the present invention at the Ndel restriction enzyme site in the multi cloning site (MCS) of pET-28a (+) vector (Novagen, Germany).
  • Recombinant protein in which JO-56 MTD is fused to the N-terminus of endostatin means a vector having a polynucleotide encoding !!! ⁇ .
  • His-Tag is expressed to artificially include six histidine-tags in the N-terminal region of the cell-permeable endostatin recombinant protein for the purpose of facilitating purification of the protein.
  • the polynucleotide of the present invention is cloned into the pET-28a (+) vector (Novagen, Germany) having the sequence.
  • the cell-permeable endostatin recombinant protein expressed from the recombinant expression vector is JO-56 MTD, JO-73 MTD, 50-66 MTD, JO-71 MTD, JO-85 MTD, JO- at one or both ends of the full-length endostatin.
  • 18 MTD, JO-41 MTD Any one of the JO-135 MTD and JO-159 MTD is fused and has a structure in which histidine-labels are linked to its N-terminal site.
  • the present invention also provides a transformed bacterium transformed with the recombinant expression vector.
  • the transforming bacterium of the present invention may preferably be Escherichia coli, and E. coli is a cell permeable recombinant protein HMjE in which the recombinant expression vector of the present invention, for example, JO-56 MTD is fused to the full-length endostatin N-terminus of the present invention.
  • the cell permeable endostatin recombinant protein can be expressed in large quantities.
  • Transformation transforms nucleic acids into host cells It is possible by any method of introduction and can be performed by transformation techniques known to those skilled in the art. Preferably, microprojectile bombardment, electroporation, calcium phosphate (CaP0 4 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, PEG-mediated fusion, microinjection microinjection and liposome-mediated methods, and the like, but are not limited to these.
  • HM 2 E, JO-66 MTD fused with ⁇ , ⁇ , JO-73 MTD fused to full length endostatin N-terminus prepared by the above method E. coli transformants ⁇ ⁇ / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ + ⁇ ⁇ , ⁇ , DH5a / obtained by transforming Escherichia coli DH5a with each of the recombinant expression vectors containing HM 3 E and HM 8 E fused with JO-135 MTD, respectively.
  • the present invention also provides a method for producing a cell-permeable endostatin recombinant protein comprising culturing the transformed bacteria under appropriate conditions to express a cell-permeable endostatin recombinant protein and recovering the expressed cell-permeable endostatin recombinant protein from the culture medium. do.
  • the production method is carried out by culturing the transformed bacteria under appropriate media and conditions such that the polynucleotide encoding the cell permeable endostatin recombinant protein of the present invention is expressed in the recombinant expression vector introduced into the transformed bacterium of the present invention.
  • Methods of culturing the transformed bacteria to express the recombinant protein are known in the art, and for example, seeded in a suitable medium in which the transformed bacteria can grow and cultured, and then inoculated in the medium for culture and suitable Expression of the protein can be induced by culturing in the presence of conditions such as isopropyl- (3-D-thiogalactoside, IPTG), which is a gene expression inducing agent. It is possible to recover substantially pure recombinant protein from the culture.
  • the term "substantially pure” It means that the recombinant protein of the invention and the sequence of the polynucleotide encoding the same does not substantially include other proteins derived from the host cell.
  • Recovery of the recombinant protein expressed in the transgenic bacteria can be carried out through a variety of separation and purification methods known in the art, and typically centrifuged cell lysate to remove cell debris, culture impurities, etc.
  • precipitation for example, salting out (ammonium sulfate precipitation and sodium phosphate precipitation), solvent precipitation (protein fraction precipitation using acetone, ethanol and the like) and the like can be carried out, dialysis, electrophoresis and various column chromatography. And the like.
  • recombinant proteins expressed in bacteria transformed with the recombinant expression vector may be classified into soluble fraction and insoluble fraction depending on the characteristics of the protein upon protein separation. If most of the expressed protein is in the soluble fraction, the protein can be isolated and purified without any difficulty according to the method described above. However, when most of the expressed protein is present in the form of insoluble fraction, that is, inclusion body, the protein is dissolved in the solution containing protein denaturant such as urea and surfactant as much as possible, followed by centrifugation and dialysis and electrolysis. Purification can be carried out by performing electrophoresis and various column chromatography.
  • the desalting and re-overlap The step may be performed dialysis and dilution using a solution containing no protein denaturant, or centrifugation using a filter.
  • the salt concentration in the solution used for purification is high, such desalting and re-overlapping may be performed.
  • a non-insoluble fraction such as Triton X-100 It is dissolved in a complete layer containing a warm surfactant, sonicated and centrifuged to obtain a precipitate. The obtained precipitate is dissolved in a solution containing denaturant urea and centrifuged to obtain a supernatant.
  • the recombinant protein of the present invention maximally dissolved from the soluble fraction using urea was purified using a histidine-binding purification kit, and then the purified protein was removed by salting and centrifugation using an amicon filter. By performing the re-overlap process, the recombinant protein of the present invention can be obtained.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for anticancer drugs, wherein the cancer angiogenesis inhibitory activity containing the cell-permeable endostatin recombinant protein as an active ingredient is enhanced.
  • the endostatin recombinant protein having cell permeability maintains a high concentration of endostatin in and around vascular endothelial cells present in tumor tissues, thereby binding endostatin to specific receptor integrin ⁇ 5 ⁇ 1 present on the surface of vascular endothelial cells. It can effectively induce and thereby inhibit the formation of micro-vessels in tumor tissues, it can be usefully used as an anticancer agent for various cancers.
  • composition containing the recombinant protein according to the present invention as an active ingredient may further include a pharmaceutically acceptable carrier, such as a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as a carrier for oral administration or a carrier for parenteral administration.
  • Carriers for oral administration include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • the recombinant protein according to the invention can be used in the form of intake tablets, buccal tablets, troches, capsules, elixirs, suspensions, syrups and wafers in combination with excipients.
  • carriers for parenteral administration include water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives.
  • Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chlorobutanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be used with reference to those described in the following references (em ⁇ gto / ⁇ Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
  • compositions according to the invention can be formulated in a variety of parenteral or oral dosage forms.
  • parenteral formulations are injectable formulations, preferably aqueous isotonic solutions or suspensions.
  • injectable formulations may be prepared according to techniques known in the art using suitable dispersing or wetting agents and suspending agents.
  • each component may be formulated for injection by dissolving in saline or serous solution.
  • oral dosage forms include, for example, tablets and voxel agents, and these formulations may contain diluents (e.g., lactose, dextrose, sucrose, manny, sorbobi, cellulose and / or glycine) in addition to the active ingredients.
  • diluents e.g., lactose, dextrose, sucrose, manny, sorbobi, cellulose and / or glycine
  • the tablets may include binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, tragacanth, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyridine, optionally starch, agar, alginic acid Or disintegrants, absorbents, colorants, flavors and / or sweeteners such as sodium salts thereof.
  • the formulations may be prepared by conventional mixing, granulating or coating methods.
  • compositions of the present invention may further comprise auxiliaries such as preservatives, hydrating agents, emulsifiers, salts for controlling osmotic pressure and / or laxatives and other therapeutically useful substances, and may be formulated according to conventional methods.
  • the route of administration of the composition according to the present invention may be administered to humans and animals orally or parenterally, such as intravenous, subcutaneous, intranasal or intraperitoneal. Oral administration also includes sublingual application.
  • Parenteral administration includes injections and drip methods such as subcutaneous injection, intramuscular injection, intravenous injection, direct tumor injection.
  • the total effective amount of the cell-permeable endostatin recombinant protein according to the present invention may be administered to a patient in a single dose, and the fractionated therapy in which multiple doses are administered for a long time may be administered by a treatment protocol.
  • the composition of the present invention can vary the content of the active ingredient according to the extent of the disease, but can be repeatedly administered several times a day at an effective dosage of 5 to 20 mg once administered once based on an adult.
  • the effective dose of the recombinant protein may be determined in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, sex, severity of the disease, diet and excretion, as well as the route and frequency of treatment of the drug. .
  • composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, route of administration and method of administration as long as the effect of the present invention is exhibited.
  • present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples in accordance with the gist of the present invention.
  • a recombinant construct was prepared in which histidine-labels were covalently bound to the N ′ terminus of all the recombinant constructs.
  • Recombinant constructs were prepared in which the histidine-labeled covalently bound to the N-terminus of all the recombinant constructs.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the forward and reverse primers for amplification of HMjE have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 42 and 41, respectively; HEM! Forward and reverse primers for amplification of have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 40 and 43, respectively; ⁇ , ⁇ ! The forward and reverse primers for the amplification of have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 42 and 43, respectively.
  • forward and reverse primers for the amplification of ⁇ 2 ⁇ have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 44 and 41, respectively; Forward and reverse primers for the amplification of ⁇ 2 have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 40 and 45, respectively; Forward and reverse primers for amplification of HM 2 EM 2 have nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 44 and 45, respectively.
  • the PCR reaction was performed with 100 ng of plasmid DNA cloned with human endostatin cDNA as a template, a final concentration of dNTP complex of 0.2 mM each, 1 ⁇ of each primer, 10x Taq complete solution 5 and Taq polymerase (Novagen, Germany) The solution containing was carried out as a final volume 50 ⁇ reaction solution.
  • PCR reaction conditions are first was repeated at 94 ° C 5 bungan 30 thermal denaturation (denaturing) during a 30 second banung in 30 sec at 94 ° C after Keane, 63 ° at C 30 sec and 72 ° C once, and finally 72 ° Amplified at C for 5 min. After the reaction, electrophoresis was performed on the 1.0% agarose gel to confirm the amplified product.
  • FIG. 3b shows that the recombinant fragments inserted into the pGEM-T Easy vector were separated by Ndel restriction enzyme (Enzynomics, Korea) and electrophoresed on agarose gel. From this, each recombinant fragment was correctly inserted into the vector. It was.
  • PGEM-T Easy vector into which the MTD-fused endostatin recombinant fragment was inserted was digested at 37 ° C for 1 hour using the restriction enzyme Ndel to obtain each recombinant fragment.
  • the expression vector pET-28 (+) a vector (Novagen, Germany) with histidine-tag and T7 promoter was cleaved under the same conditions as above using restriction enzyme Ndel.
  • the recombinant fragment and the cleaved pET-28a (+) vector were separated by electrophoresis and purified using a commercially available kit (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA).
  • T4 DNA ligase (Takara, Japan) was added to these mixtures, and after ligation at 16 ° C. for 12 hours, DH5a-sensitized cells were transformed to obtain recombinant protein expression vectors (FIG. 4a).
  • FIG. 4b shows that the recombinant fragment inserted into the pET-28a (+) vector was separated by Ndel restriction enzyme (Enzynomics, Korea) and electrophoresed on an agarose gel. From this, the endostatin recombinant fragment to which each MTD was fused was pET- It was confirmed that the 28 (+) a vector was correctly inserted.
  • the recombinant protein expression vectors thus obtained were named as pHM! E, ⁇ , ⁇ , pHM 2 E, pHEM 2 , and ⁇ , ⁇ , respectively.
  • the recombinant expression vectors pHM! E and pHM 2 E were referred to as E. coli DH5a.
  • the transgenic bacteria DHSa / pE ZS ⁇ + ⁇ HMiE and DH5a / pET-28a (+): HM 2 E obtained by transfection were deposited with KCTC at the BRC of Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology as of March 20, 2009. Deposited with 11485BP and KCTC 11486BP.
  • the full-length endostatin recombinant protein, HM! E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14;
  • HEMj has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16;
  • HM 1 EM 1 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18;
  • HM 2 E has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, which is encoded by a polynucleotide having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20;
  • HEM 2 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, which is SEQ ID NO:
  • HM 2 EM 2 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 25, which was encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 24.
  • endostatin recombinant protein HE was prepared in which only histitin label was fused without MTD fusion.
  • This control protein has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
  • the recombinant construct was covalently bound to histidine-labeled at the N-terminus of all the recombinant constructs.
  • PCR was performed in the same manner as in Example ⁇ 1-1> to prepare the recombinant construct.
  • the forward and reverse primers for amplification of HM 3 E have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 46 and 41, respectively;
  • Forward and reverse primers for amplification of HM 4 E have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 47 and 41, respectively;
  • Forward and reverse primers for amplification of HM 5 E have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 48 and 41, respectively;
  • the forward and reverse primers for the amplification of HM 6 E have the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 49 and 41, respectively;
  • the forward and reverse primers for the amplification of HM 7 E are respectively SEQ ID NO: Has a nucleotide sequence of 50 and 41;
  • Forward and reverse primers for amplification of HM 8 E have SEQ ID NOs: 51 and 41, respectively;
  • Each of the recombinant fragments amplified therefrom was inserted into the pGEM-T Easy vector in the same manner as in Example ⁇ 1-1> to obtain a subclone, and then, to the pET-28 (+) a vector. Insertion of each recombinant protein expression vector was obtained. Insertion of each recombinant fragment into the pGEM-T Easy vector and the pET-28 (+) a vector was confirmed in FIGS. 3C and 4C.
  • the recombinant protein expression vectors thus obtained were named as pHM 3 E, pHM 4 E, pHM 5 E, pHM 6 E, pHM 7 E, pHM 8 E and pHM 9 E, among them recombinant expression vectors pHM 3 E and pHM.
  • 8 E transformed bacteria DH5a / pET-28a is obtained by transformation of E. coli DH5a with (+): HM 3 E and DH5a / pET-28a (+) : Korea life the HM 8 E respectively March 20, 2009 date It was deposited with the KCTC 11487BP and KCTC 11488BP in the BRC of the Institute of Engineering.
  • the full-length endostatin recombinant protein fused with the JO-66 MTD, HM 3 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 27, which is added to a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 Coded by;
  • HM 4 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 29, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28;
  • HM 5 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 31, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30;
  • HM 6 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 33, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32;
  • the full-length endostatin recombinant protein ⁇ ⁇ ⁇ quality of the JO-41 MTD is fused with HM 7 E having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 35, which has a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34 Encoded by a polynucleotide;
  • HM 8 E As a full-length endostatin recombinant protein fused with JO-135 MTD, HM 8 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, which is encoded by a polynucleotide having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36 ;
  • HM 9 E As a full-length endostatin recombinant protein fused with JO-159 MTD, HM 9 E has an amino acid sequence of SEQ ID NO: 39, which is encoded by a polynucleotide having a base sequence of SEQ ID NO: 38. Confirmed.
  • the recombinant expression vector ⁇ , ⁇ , pHEM l5 ⁇ , pHM 2 E, pHEM 2 and pHE (control) prepared in Example ⁇ 1-1> were respectively isolated into the E. coli strains BL21 (DE3) and BL21 Gold (DE3).
  • BL21 CodonPlus (DE3) and BL21 Gold (DE3) pLysS were transformed by heat shock method and cultured in LB medium containing 50 / of kanamycin.
  • E. coli which was introduced with the recombinant protein gene, was then inoculated in 1 LB medium and incubated overnight at 37 ° C, which was then inoculated in 100 mi LB medium and cultured at 37 ° C until OD 600 reached 0.6.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -D-thiogalactoside
  • the cell lysate was centrifuged for 1 minute at 13,000 rpm of electrolyzed water per minute to separate and recover the soluble fraction and the insoluble fraction.
  • the soluble fraction and the insoluble fraction separated therefrom were subjected to SDS-PAGE to analyze protein expression characteristics and expression levels.
  • the culture solution 1 ⁇ was collected therefrom, and centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute at room temperature to remove the supernatant, and the cells were recovered.
  • the recovered cells were suspended in 2 ⁇ sample loading buffer (125 mM Tris-HCl, 20% glycerol, 2% ⁇ -mergatoethanol, 0.04% bromophenol blue, 4% SDS, ⁇ 6.8) and then 100 ° C.
  • the cells were disrupted by boiling for 5 minutes at.
  • the cell lysate was centrifuged at 13,000 rpm for 1 minute to separate and recover the soluble fraction and the insoluble fraction.
  • the BL21 CodonPlus (DE3) strain transformed with the recombinant expression vector pHE (control), ⁇ , ⁇ , ⁇ , pHMjEMu and pHM 2 E of the present invention were cultured in 1 L of LB medium as in Example 2 above. It was. The cells obtained by centrifugation of each culture were suspended in 20 lye complete layers (100 mM NaH 2 P0 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 8.0), being careful not to bubble. Cells were crushed at low temperature using an ultrasonic homogenizer equipped with a microtip. At this time, the processing time set the output of the apparatus to 28% of the maximum output, and repeated for 10 seconds after treatment for 30 seconds for 15 minutes.
  • the highly lysed inclusion body was centrifuged at 4 ° C. at 8,000 X g per minute for 10 minutes to remove the precipitate and dilute the supernatant.
  • the recovered supernatant was loaded onto Ni-NTA agarose resin imparted with Nitrilotriacetic acid agarose. At this time, Ni-NTA agarose was used after washing and equilibrating several times with a complete dissolved solution.
  • the supernatant was adsorbed onto the resin while slowly stirring with a shaker at 4 ° C. for at least 1 hour.
  • the reaction solution was removed by centrifuging the resin to which the inclusion body containing the recombinant protein was adsorbed at 1,000 rpm for 4 minutes at 4 ° C., and the resin was washed to remove the non-specific adsorbent.
  • Washing buffer 100 mM NaH 2 P0 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M urea, pH 6.3
  • Elution buffer in resin volume twice as large as elution buffer 100 mM NaH 2 P0 4 , 10 mM Tris-HCl, 8 M Utea, 500 mM imidazole, pH 4.5
  • the recombinant protein of the present invention purified from the insoluble fraction was denatured by 8 M urea, which is a potent denaturant, and was then re-overlapping as follows to convert it into an active form.
  • the purified recombinant protein was refolded buffer (0.55 M guanidine HC1, 0.44 M L-arginine, 50 mM tris-HC1, 150 mM NaCl 1 mM EDTA, 100 mM NDSB, 2 mM oxidized). Glutathione oxidized and 0.2 mM reduced glutathione reduced) were dialyzed at 4 ° C. for 48 hours to remove denaturant so that the recombinant protein was reactivated, i.e. redeposited.
  • the activated recombinant protein was then mixed with RPMI 1640 (Invitrogen, USA) and HBSS (Hank's Balanced Salt Solution), which are medium for cell culture, at a ratio of 7: 3, and 5% glycerol was added to prevent endostatin protein coagulation. And 0.1% CHAPS (Biosesang, Korea) were stirred for 9 hours at 4 ° C using a dialysis membrane (Snakeskin pleated, PIERCE) in a mixed solution. At this time, the mixture in the container was replaced with a new one every three hours.
  • the cell-type permeable endostatin recombinant protein obtained therefrom was labeled with fluorescence using FITC (fluorescein-5-isothiocyanate, Molecular Probe) to more clearly identify the effect of cell permeability.
  • FITC fluorescein-5-isothiocyanate, Molecular Probe
  • 2 to 20 FITC 1 ⁇ at a concentration of 333 mg / mi was used for the recombinant protein, and bound to light for 1 hour with shaking at phase.
  • Fluorescently labeled cell permeable endostatin recombinant protein was dialyzed in DMEM medium at 4 ° C. for 1 day to remove unlabeled FITC, and the recovered recombinant protein was analyzed by Bradford protein quantitation. It was. As a result, the concentration of each recombinant protein was measured to be about 1 / ⁇ .
  • Example 5 Cell Permeability Experiment
  • each protein at 10 ⁇ concentration was treated in RAW 264.7 cells (Korean Cell Line Bank, Korea) derived from macrophages of mouse and for 1 hour at 37 ° C. Incubated. At this time, RAW 264.7 cells were cultured in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and 5% penicillin / streptomycin 500 mg /.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cell permeable endostatin recombinant protein of the present invention first confirmed cell permeability by flow cytometry in Example ⁇ 5-1> with NID3T3 cells derived from fibroblasts of mouse together with the endostatin control protein unfused with MTD Cell Line Bank, Korea) was treated with a concentration of 10 ⁇ and incubated for 1 hour at 37 ° C and observed by confocal laser scanning microscopy (confocal laser scanning microscopy).
  • the NIH3T3 cells used were cultivated in DMEM medium containing 10% FBS and 5% penicillin / streptomycin 500 mg / i of the total amount of the medium, and 10 ⁇ mounting medium was used to preserve the fluorescent label of the recombinant protein.
  • the cell-permeable endostatin recombinant protein according to the present invention has confirmed the cell permeability of the cells cultured in Example ⁇ 5-2> tissue
  • the following experiment was performed to confirm whether the cell permeability even in the state.
  • HCT-116 cells Korean Cell Line Bank, Korea
  • a human colon cancer cell line were used in the right leg of the mouse at a concentration of lxlO 7 cells / i using a syringe (omnican, Germany, B.BRAUN).
  • a syringe omnican, Germany, B.BRAUN.
  • mice Intraperitoneal injection 2 hours later each group of mice was regenerated and liver, kidney, spleen, lung, heart, brain and tumor tissues were extracted from them, the tissues were sealed with OCT compounds and frozen and then microtome (microtome) was used to cut to 14 mm thick tissue sections were placed on the slides and observed under confocal laser scanning microscopy, in which a 10 ⁇ mounting medium was slid to preserve the fluorescent label of the recombinant protein. Dot on It was observed 15 minutes after the dropwise addition.
  • microtome microtome
  • Example 6 Intracellular Function of Cell Permeable Endostatin Recombinant Protein
  • human umbilical vein endothelial cells (Bio4You, Korea) were prepared using Ml 99 medium (L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM HEPES, 10 unit / m £ heparin, 20 ng / m ⁇ bFGF, heat inactivated fetal bovine serum 20%, streptomycin / penicillin 1%) and cultured in an rc incubator fed 5% co 2 using a 2% gelatin-plated culture dish It was.
  • Ml 99 medium L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM HEPES, 10 unit / m £ heparin, 20 ng / m ⁇ bFGF, heat inactivated fetal bovine serum 20%, streptomycin / penicillin 16%
  • Ml 99 medium L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM
  • HUVECs were washed with PBS (phosphate-buffered saline) and the cell permeable endostatin recombinant protein HM ! E, HEM l5 HMiEMi, HM 2 E and control protein HE were treated for 4 hours at 10 ⁇ M and 15 ⁇ M concentrations, respectively. After removing the protein, HUVECs were washed with PBS and incubated in a 37 ° C. incubator fed with 5% CO 2 for 8 hours.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • Cell lysates obtained from the cultured HUVECs were lysed on ice for 30 min using 100 ⁇ lyes complete solution (20 mM HEPES, pH 7.2, 1% Triton-X100, 10% glycerol). (Cell lysate) was centrifuged at 12,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C. The supernatant was removed therefrom and the protein contained in the lysate was quantified by Bradford protein quantification and stored at -80 ° C until use.
  • anti-13-catenin antibody (92 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany), anti-c-Myc antibody (anti-c- Myc antibody, 67 kDa, Santa Cruze Biotechnology , Germany), anti-letin Dl antibody, 37 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany, anti-STAT3 antibody, 79 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany, anti- VEGF antibody (anti-VEGF antibody, 45 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany), anti-phospho-ERKl / 2 antibody, Thr 185/202, 44.42 kDa, Abeam Cambridge, USA), and anti-phospho-MEK1 / 2 antibody (anti-phospho-MEKl / 2 antibody, Ser 217/221, 45 kDa, Cell Signaling, Boston, USA) were used as primary antibodies and goat anti Goat anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, Germany) and goat anti-rabbit IgG-HRP (
  • Human vascular endothelial cells were cultured on M199 medium (L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM HEPES, 10 unit / heparin, 20 ng / m ⁇ bFGF, thermally inactivated). 20% fetal calf serum, strapomycin / penicillin 1%) and incubated in a 37 ° C. incubator fed 5% CO ⁇ using a 2% gelatin-plated culture dish. Two M199 medium per well was added to the 6-well plate and the cells cultured above were inoculated therein and then incubated at 37 ° C for 1 day.
  • M199 medium L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM HEPES, 10 unit / heparin, 20 ng / m ⁇ bFGF, thermally inactivated. 20% fetal calf serum, strapomycin / penicillin 1%) and incuba
  • Each well was treated with a cell permeable recombinant protein HM 2 E and a control protein HE at a concentration of 10 ⁇ M, and then cultured in a serum-free medium for 1 hour. After incubation, the cells were washed twice with PBS, and then scraped off the cells in the center of the well with a 10 ⁇ pipette tip. 1 M199 medium was added to the well plates and incubated for 24 hours in a 37 ° C. incubator fed with 5% CO 2 . After incubation, the degree of migration of HUVECs was observed using an optical microscope.
  • Human vascular endothelial cells were cultured in Ml 99 medium (L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM HEPES, 10 unit / m ⁇ heparin, 20 ng / ml bFGF, heat inactivated fetal bovine serum). 20%, streptomycin / penicillin 1%) and cultured in a 37 ° C. incubator with 5% C0 2 using a 2% gelatin-plated culture dish. Two M199 medium per well was added to the 6-well plate and the cells cultured above were inoculated therein and then incubated at 37 ° C for 1 day.
  • Ml 99 medium L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM HEPES, 10 unit / m ⁇ heparin, 20 ng / ml bFGF, heat inactivated fetal bovine serum. 20%, streptomycin / penicillin
  • a cell permeable recombinant protein HM 2 E and a control protein HE were treated with a cell permeable recombinant protein HM 2 E and a control protein HE at a concentration of 10 ⁇ M, and then cultured in a serum-free medium for 1 hour. Add 1 Ml 99 medium to the well plate and add 5% C0 2 Incubated for 0, 24 and 48 hours in a 37 ° C incubator supplied. After incubation, the degree of proliferation of HUVECs was observed using an optical microscope. As a result, as shown in Figs. 12a and 12b, the proliferation of human vascular endothelial cells in the cytocephalic endostatin recombinant protein (HM 2 E) treatment group compared to the untreated group and the control protein (HE) group without MTD fusion. It was confirmed that this was suppressed.
  • HM 2 E cytocephalic endostatin recombinant protein
  • Human vascular endothelial cells were cultured in Ml 99 medium (L-glutamine 300 mg / L, 2.2 g / L NaHC0 3 , 25 mM HEPES, 10 unit / m ⁇ heparin, 20 ng / ⁇ bFGF, heat inactivated fetal bovine serum) 20%, streptomycin / penicillin 1%), and cultured in a 37 ° C incubator fed with 5% C0 2 using a 2% gelatin-plated culture dish.
  • the cultured cells were suspended in conventional (M199?) Medium containing 0.1% BSA, and 500 ⁇ M199 medium per well was added to a BD Matrigel TM Matrix 12-well plate, followed by the cell suspension.
  • mice (Balb / c nu / nu mice, Central Lab. Animal Inc., Korea) who lacked immunity were divided into 3 groups of 6 rats.
  • Subcutaneous injection using a syringe such as the human colon cancer cell line, HCT1 16 cells (Korean Cell Line Bank, Korea) on the left part ⁇ ⁇ ⁇ concentration of ⁇ 7 cells / ⁇ of the mouse (subcutaneous injection).
  • the cell permeable endostatin recombinant protein HM 2 E (group 3) of 0.5 ngl ⁇ concentration was measured from the day when the tumor size (width 2 ⁇ length xO.52) was measured from 50 to 60 ⁇ 3 . 200; ug by subcutaneous injection for 21 days.
  • the endostatin protein HE (group 2) without carrier (Group 1) and MTD fusion were injected subcutaneously for 21 days at 400 ⁇ .
  • changes in tumor size and weight of each group of mice were measured daily, and the results are shown in FIGS. 14A and 14B.
  • mice treated with the cell permeable endostatin recombinant protein HM 2 E (group 3) was significantly inhibited in growth compared to the control group (groups 1 and 2), During the experimental period, the body weight of the mice showed no significant change in both the control group and the cell-permeable endostatin recombinant protein treatment group.
  • Example 7 Analysis of immunohistochemical changes after administration of cell permeable endostatin recombinant protein
  • Immunohistochemistry staining was performed using the mouse animal model of Example 6 to confirm histological changes in tumor tissue after administration of the cell permeable endostatin recombinant protein. Specifically, as in Example 6 above, 3 groups (6 animals in each group) Mice were treated with cell permeable endostatin recombinant protein (HM 2 E) and control and HE protein for 21 days with subcutaneous injection, and tumor tissues were isolated and extracted. Each extracted tumor tissue was fixed with formalin and washed, and then paraffin blocks were prepared using paraffin dissolved at 62 ° C. in an embedding center.
  • HM 2 E cell permeable endostatin recombinant protein
  • the prepared paraffin block was cut to a thickness of 5 / m using a microtome and attached to a slide, and then paraffin was removed by treating xylene three times for 5 minutes.
  • the tissue slides were then treated with 100%, 100%, 95%, 70% and 50% ethane sequentially for 3 minutes each to hydrate and washed in running water for 5 minutes.
  • tissue slides were treated with antigen expression solution and stored at 37 ° C. for 20 minutes. Subsequently, the tissue slides were washed with PBS for 5 minutes, treated with hydrogen peroxide blocking solution for 10 minutes, then washed with PBS three times for 5 minutes, and treated with a power blocking solution for 10 minutes. After washing with PBS for 5 minutes.
  • tissue sulfide was reacted with human vascular endothelial cell specific marker 4All (vesial endothelial cell specific marker, 4A11) at 25 ° C. for 30 minutes as a primary antibody, and washed three times for 5 minutes with PBS layer. After 30 minutes of reaction with goat anti-mouse IgG-HRP (Biogenex) as a secondary antibody, tissue slides were developed by applying DAB (diaminobenzidine tetrahydrochloride (Biogenex) staining reagent for 3 to 5 minutes. I was. Tissue slides were then washed with distilled water and counterstained with hematoxylin. Thereafter, the tissue slides were sequentially dehydrated with 95%, 95%, 100%, and 100% ethanol for 10 seconds, dehydrated, and subjected to two projections of 10 seconds with xylene, and then sealed and observed with an optical microscope.
  • human vascular endothelial cell specific marker 4All vesial endothelial cell specific marker

Abstract

본 발명은 혈관형성 억제인자(angiogenic inhibitor) 엔도스타틴(endostatin)에 거대분자 전달 도메인(macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 세포투과성을 갖는 엔도스타틴 재조합 단백질, 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 발현벡터, 및 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 혈관형성 억제활성이 강화된 항암제용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 엔도스타틴 재조합 단백질은 혈관 형성 억제인자 엔도스타틴을 세포 내로 고효율로 도입하여 종양 조직 내에 존재하는 혈관내피세포의 이동, 증식, 침투, 튜브 형성 등을 억제하고 신생 미세혈관의 형성을 차단함으로써 우수한 항암 활성을 나타내므로, 다양한 암에 대한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질， 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물
【기술분야】
본 발명은 혈관형성 억 제인자 (angiogenic inhibitor) 엔도스타틴 (endostatin)에 거 대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 세포투과성을 갖는 엔도스타틴 재조합 단백질, 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩 하는 폴리뉴클레오티드, 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 ' 단백질의 발현백터 및 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 혈관형성 억 제활성 이 강화된 항암제용 약학 조성물에 관한 것 이다.
【배경기술】
혈관형성 (Angiogenesis)은 이미 존재하는 혈관으로부터 새로운 모세 혈관이 형성되는 과정으로, 고형 종양 (solid tumor)의 성 장과 전이에 필수적 인 현상이다. 병원성의 혈관형성은 암, 당뇨망막병증, 건선, 류마티스 관절 염 등과 같은 질환의 진행에 중요한 역할을 한다. 일반적 인 조건 하에서 혈관내피세포 (vascular endothelial cells)는 상대적으로 느린 턴오버 (turnover)를 유지 한 체 정지상태로 존재한다. 이 러 한 정지상태의 혈관내피세포를 '활성 화된 전-혈관형성 (pro-angiogenic) 상태로 전환시 키 기 위 해서는 생체 내 혈관 형성 자극인자의 분비 량은 증가시 키고 혈관형성 억 제 인자의 분비 량은 감소 시 켜 야 한다. 이 러한 혈관형성 자극인자로는 bFGF, VEGF, 혈관 투과성 인 자 (vascular permeability factors) 등을 예로 들수 있고, 혈관형성 억 제인자로는 안지오스타틴 (angiostatin), 엔도스타틴 (endostatin), 팀스타틴 (tumstatin), 칸스타 틴 (canstatin), 아레스텐 (arresten), 트롬보스폰딘 (thrombospondin) 등을 예로 들 수 있다.
이들 증 엔도스타틴은 혈관내피세포의 증식 , 이동, 침투, 튜브형성 등을 저해하는 내생 단백질로서 , 타입 18 콜라겐 (collagen) 유래의 분자량 20 kDa의 폴리펩티드다. 엔도스타틴은 앨라스타제 (elastase), 카템신 (cathepsin) 등과 같은 효소에 의해 콜라겐에 존재하는 프로테아제-민감성 경첩부위 (protease-sensitive hinge region) 내에서 절단되어 콜라겐으로부터 방 출되고 혈액 내에서 20~35 ng/m«의 농도로 순환한다. 엔도스타틴은 하나의 특정한 인테그린에 결합하여 FAK(focal adhension kinase)의 인산화를 저해한 다. 인테그린에 결합한 엔도스타틴에 의해 FAK 인산화가 저해되면 그 하 류의 MAP 키나아제 경로가 차단되어 ERK1과 p38 MAP 키나아제 경로의 저해를 초래한다. 이러한 저해작용이 혈관내피세포의 이동을 차단한다. 최근 Wnt 신호전달 경로 (Wnt signalling pathway)의 잠정적인 억제인 자로서 엔도스타틴의 기능을 설명하기 위해 또 다른 가설이 제기되고 있다 (Hanai et al, JCB 158:529, 2002). Wnt신호전달은 세포의 증식, 분화, 운동성 및 형태형성 (morphogenesis)의 조절에 중요하다. 엔도스타틴은 새로운 GSK3-비의존성 기작 (GSK3-independent mechanism)을 경유하여 β-카테닌 (β- catenin) 안정성을 조절함으로써 Wnt 신호전달 경로를 제어한다. Wnt 신호 전달 경로에서 엔도스타틴의 이러한 효과는 혈관내피세포의 이동을 억제하 고 혈관혈성 억제활성과 관련된 세포주기의 S기로의 진입을 초래한다. 이 처럼 암조직에 직접적으로 영향을 미치기 보다는 새로운 혈관형성을 억제 하여 암조직 내로의 혈액 공급을 차단함으로써 암조직에 간접적으로 영향 을 미치는 엔도스타틴은 항암제 개발시장에 매력적인 표적이 되고 있다. 이에 인간을 대상으로 혈관형성 억제인자인 엔도스타틴을 이용하여 암을 치료하고자 하는 많은 임상적인 시도가 있었으나, 그 중 어떠한 경우도 유용한 긍정적인 결과를 달성하지 못하였다. 생체 내에서 엔도스타틴의 약물동태와 약효에 큰 영향을 미치는 약물투여 방법 등이 엔도스타틴을 이용한 임상실험의 성공을 방해하는 요인으로 간주되고 있다. 이전 연구결과에 따르면, 엔도스타틴이 생체 내에서 활성을 나타내기 위해서는: 1) 세균 발현시스템으로부터 수용성화된 형태로 발현되고; 2) 다량으로 정제될 수 있어야 하며; 3) 주입도구를 통해서 실험동물에 직접 주입될 수 있어야 하고; 4) 비연속 직접 주입법 (non- continues direct injection)으로 생체 내에서 상당히 높은 농도로 유지될 수 있어야 한다. 이러한 요건들이 층족될 때 엔도스타틴은 암조직 내에서 혈관형성을 억제함으로써 암세포의 세포사멸을 유도하는데 결정적인 작용을 할 수 있다.
한편, 합성화합물 또는 천연물의 작은 분자들 (small molecules)은 세포 내로 전달될 수 있으나/ 단백질, 펩티드, 핵산 같은 거대분자들 (macromolecules)은 세포 내로 전달될 수 없다. 이들은 분자량 500 이상의 거대분자로 살아있는 세포의 원형질막 (plasma membrane), 즉 이중 지질막 구조 (lipid bilayer structure)를 통과할 수 없음이 널리 알려져 있다. 이를 극복하기 위한 방법으로 "거대분자 세포 내 전달기술 (^Jacromolecule Intracellular Transduction Technology: MITT)"°1 개발되었는데 (Jo et al, Nat. Biotech. 19: 929-33, 2001), 이는 질병 치료성 거대분자의 생체 내 전달을 가능케 함으로써 기존의 의약품 개발 기술로는 불가능했던 펩티드, 단백질, 유전자 자체 등으로 바이오 신약물의 개발을 가능하게 한다. 이 기술에 따르면, 거대분자들은 "소수성 거대분자 전달 도메인 (Macromolecule Iransduction Domain, MTD)"과 다른 여러 가지 세포 내 운반체들과 융합되어 재조합 단백질 형태로 합성 또는 발현, 정제되고 세포 내로 전달된 후, 특정 위치로 정확하고 빠르게 운반되어 필요한 여러 가지 역할을 효과적으로 발휘할 수 있다 (US Provisional Patent Application No. 60/877,060, PCT International Publication No. WO 2008/093982). 이처럼 거대분자 전달 도메인 (MTD)은 펩티드, 단백질, DNA, RNA, 합성화합물 등과 융합되어 세포 내로 들어갈 수 없는 많은 블투과성 물질들의 전달을 가능케 한다.
이에 본 발명자들은 혈관형성 억제인자 엔도스타틴에 거대분자 전 달 도메인을 융합시켜 세포투과성을 부여한 엔도스타틴 재조합 단백질 (CP- endostatin)을 제조하고 이 재조합 단백질이 시험관 내 및 생체 내에서 모두 세포 외부로부터 대량의 혈관형성 억제인자 엔도스타틴을 세포 내로 효과 적으로 전달하여 미세혈관의 형성을 억제함으로써 인간의 다양한 암 치료 에 있어 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다. 【발명 의 상세한 설명】
【기술적 과제】
따라서 본 발명 의 목적은 혈관형성 억 제인자 엔도스타틴에 세포투과성을 부여하여 이를 세포 내로 고효율로 도입함으로써 인간의 다양한 암을 치료할 수 있는 항암제로서 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 제공하는 것 이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여 , 본 발명은 혈관형성 억제 인자 엔도스타틴과 거 대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)의 융합으로 세포투과성 이 부여되어 엔도스타틴을 세포 내로 고효율로 도입하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
아을러 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현백터 및 이 발현백터로 형 질전환된 형질전환 세균을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 형 질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 생산방법을 제공한다.
마지막으로 본 발명은 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 혈관형성 억 제활성 이 강화된 항암제용 약학 조성물을 제공한다.
【유리 한 효과】
본 발명 에 따른 세포투과성을 갖는 엔도스타틴 재조합 단백질은 혈관 형성 억제인자 엔도스타틴을 세포 내로 고효율로 도입하여 종양 조직 내에 존재하는 혈관내피세포 내외 에서 엔도스타틴을 고농도로 유지시 켜 혈관내피세포의 이동, 증식， 침투 및 튜브 형성을 효과적으로 억 제하고 신생 미세혈관의 형성을 강력히 차단하여 우수한 항암 활성을 나타내므로, 다양한 암에 대한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 la 는 본 발명에 따라 전장 형 태로 고안된 JO-56 및 JO-73 MTDs 가 각각 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질의 구조를 나타낸 것이고, 도 lb 는 본 발명에 따라 전장 형 태로 고안된 JO-66, JO-71, JO-85,
JO-18, JO-41, JO-135 및 JO-159 MTDs 가 각각 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질의 구조를 나타낸 것이고,
도 2a 는 본 발명에 따라 전장 형 태로 고안된 JO-56 및 J073 MTDs 가 각각 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질을 PCR 로 증폭한 결과이고,
도 2b 는 본 발명 에 따라 전장 형 태로 고안된 JO-66, JO-71, JO-85, JO-18, J으 41， JO-135 및 JO-159 MTDs 가 각각 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질을 PCR 로 증폭한 결과이고,
도 3a 는 pGEM-T Easy 백터 에 PCR 증폭산물을 서브클로닝 (subcloning)하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 3b 및 3c 는 각각 본 발명 에 따라 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질의 PCR 증폭산물이 pGEM-T Easy 백터 에 서브클로닝 되 었음을 나타낸 것 이고，
도 4a 는 본 발명 에 따라 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단편을 pET-28a (+) 백터 에 클로닝하여 재조합 발현백터를 제작하는 과정을 나타낸 모식도이고,
도 4b 및 4c 는 각각 본 발명 에 따라 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단편이 pET-28a (+) 백터 에 클로닝 되 었음을 나타낸 것 이고,
도 5a 는 본 발명 에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 발현을 다양한 숙주세포를 대상으로 조사한 결과이고,
도 5b 는 본 발명 에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 발현을 단백질 발현 유도제인 IPTG 의 존재 (+) 또는 부재 (-) 하에서 조사한 결과이고, 도 6 은 각각 본 발명의 재조합 발현백터가 형 질전환된 세균으로부터 발현된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 정제한 결과이고,
도 7a 및 7b 는 본 발명 에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포투과성을 유세포 분석 기 (flow cytometry)로 분석 한 결과이고, 도 8 은 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포투과성을 마우스 섬유아세포에서 동초점 레이저 주사 현미 경 (confocal laser scanning microscopy)으로 관찰한 결과이 고,
도 9 는 본 발명 에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포투과성을 다양한 마우스 조직에서 동초점 레이 저 주사 현미 경으로 관찰한 결과이고,
도 10 은 각각 본 발명의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포 내 기능을 웨스턴 블롯팅 (western blotting)으로 분석 한 결과이고,
도 11 은 본 발명 의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 인간 혈관내피세포에 대한 이동 억제효과를 상처 치유 (wound healing) 분석으로 조사한 결과이고,
도 12a 및 12b 는 본 발명 의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 인간 혈관내피세포에 대한 증식 억 제효과를 일정시간 경과 후 세포수를 측정하여 조사한 결과이고，
도 13a 및 13b 는 본 발명 의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 인간 혈관내피세포에 대한 류브 형성 (tube formation) 억 제효과를 조사한 결과이고,
도 14a 및 14b 는 각각 본 발명의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 종양이 형성된 마우스에 피하 주사로 21 일간 처 리하면서 매 일 종양 크기와 몸무게의 변화를 측정 한 결과이고,
도 15 는 본 발명의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질이 피하 주사로 투여된 마우스의 종양 조직에서 혈관형성 억 제정도를 면역조직학적 (Immunohistochemistry) 염 색으로 관찰한 결과이 다. 【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
본 발명은 혈관형성 억제인자 엔도스타틴과 거대분자 전달 도메인 (MTD)의 융합으로 세포투과성이 부여되어 엔도스타틴을 세포 내로 고효율로 도입하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 (CP-엔도스타틴) 및 이를 코딩하는 플리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명의 특징은 거대분자 세포 내 전달기술 (ΜΠ )을 이용하여 세포 내로의 도입이 용이하지 않은 거대분자인 혈관형성 억제인자 엔도스타틴에 특정한 거대분자 전달 도메인 (이하, "MTD" 로 약칭함)을 융합시켜 세포투과성을 부여함으로써 엔도스타틴을 세포 내로 고효율로 전달하는 것이다. 이때 거대분자 전달 도메인은 엔도스타틴의 한쪽 말단에만 융합되거나， 또는 그의 양쪽 말단 모두에 융합될 수 있다. 분비 단백질 (secreted protein) 유래 소수성 펩티드인 MTD 를 이용한 세포 내 전달기술은 생체 내 엔도스타틴 농도의 실시간 정량적 조절 (real-time quantitative regulation)을 가능케 하여 엔도스타틴의 암조직으로의 전달을 매개하고 개개의 암세포 내로 분포될 수 있게 만든다. 이러한 효과는 암조직 내에 존재하는 혈관내피세포 내외에서 엔도스타틴을 고농도로 유지시켜 혈관내피세포 표면에 존재하는 특이적 수용체인 인테그린 α5β1 에 대한 엔도스타틴의 결합을 효과적으로 유도할 수 있다. 이로 인해 종양 조직 내에서 혈관내피세포의 이동, 증식, 침투 및 류브 형성이 효과적으로 억제되고 신생 미세혈관의 형성이 강력히 차단되어 암 치료에 유리한 환경을 제공할 있다
본 발명에서는 혈관형성 억제인자 엔도스타틴에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인 (MTD)으로서 세포 내로 거대분자의 전달을 가능케 하는 펩티드 도메인에 상기 엔도스타틴을 융합하여 세포투과성을 갖는 엔도스타틴 재조합 단백질을 개발하였다.
본 발명에서 "세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질'' 이란 거대분자 전달 도메인과 혈관형성 억제인자 엔도스타틴을 포함하며, 이들의 유전적 융합이나 화학적 결합으로 형성된 공유결합 복합체를 의미한다. 여기서 "유전적 융합" 이란 단백질을 코딩하는 DNA 서열의 유전적 발현을 통해서 형성된 선형의 공유결합으로 이루어진 연결을 의미한다.
혈관내피세포의 표면에 존재하는 특이 인테그린 (α5β1)에 결합하여 혈관내피세포의 이등, 증식, 침투, 튜브 형성 등을 저해하는 엔도스타틴은 서열번호: 1 의 염기서열 및 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 신생 혈관형성 억제 단백질로 작용한다.
혈관형성 억제인자 엔도스타틴은 서열번호: 2 의 아미노산 서열을 갖는 분자량 20 kDa 의 폴리펩티드로서, 앨라스타제, 카텝신 등의 효소 처리에 의해 절단된 타입 18 콜라겐의 C-말단 도메인이다 (도 la 참조). 혈관형성 억제인자 엔도스타틴에 융합될 수 있는 거대분자 전달 도메인으로는 서열번호: 3 내지 11 로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 세포투과성을 갖는 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 상기 서열번호: 3 내지 11 로 기재되는 아미노산 서열 중의 어느 하나를 포함하는 거대분자 전달 도메인은 세포막을 관통하여 폴리펩티드, 단백질 도메인, 또는 전장 단백질을 포함하는 생물학적 활성 분자의 세포 내로의 유입을 매개할 수 있는 세포투과성 폴리펩티드다. 본 발명에 따른 거대분자 전달 도메인은 N- 말단 영역, 소수성 영역 및 C-말단의 분비 단백질 전달 부위 (secreted protein cleavage site)의 3 부분으로 이루어진 시그널 펩티드 (signal peptides)에서 헬릭스 (helix)를 형성해 세포막 표적 (targeting) 활성을 부여하는 소수성 영역을 갖도록 고안된 것이다. 이러한 거대분자 전달 도메인은 세포에 손상을 주지 않으면서 직접 세포막을 관통함으로써 표적 단백질을 세포 내로 이동시켜 목적하는 기능을 발휘하게 할 수 있다.
본 발명에 따라 혈관형성 억제인자 엔도스타틴에 융합될 수 있는 서열번호: 3 내지 11 로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 거대분자 전달 도메인을 하기 표 1에 나타내었다.
【표 1】
MTD 기원 아미노산서열 서열목록
Figure imgf000011_0001
본 발명의 바람직한 실시 양태에서는, 혈관형성 억 제 인자 엔도스타틴에 융합될 수 있는 거 대분자 전달 도메 인으로서
사이클로필린 B(Cyclophilin B) 단백질 유래 펩티 딜-프를릴 시스- 트랜스 아이소머라제 B 전구체 (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B precursor)인 서 열번호: 5 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-56 MTD (이하， ' 'MTE '로 약칭 함); 드로소필라 멜라노가스터 CD yo;?/w7« melanogaster) 유래 스파출 유전자 (spatzle (spz) gene)인 서 열번호: 8 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-73 MTD (이하， " MTD2"로 약칭함);
스트렙토마이세스 코앨리콜러 Streptcw^c^ coelicolor) A3(2) 유래 분비 단백질 (secreted protein)인 서 열번호: 6 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-66 MTD (이하 , "MTD3"으로 약칭함); 뉴로플라스틴 전구체 (Neuroplastin precursor) 유래 서 열번호: 7 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-71 MTD (이하 , "MTD4"로 약칭함);
스트렙토마이세스 코엘리콜러 유래 펩티드 전달 시스템 분비 펩티드 결합 단백질 (peptide transport system secreted peptide binding protein)인 서 열번호: 9 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-85 MTD (이하, "MTD5"으로 약칭함); 스트렙토마이세스 코엘리콜러 A3(2) 유래 추정 분비 단백질 (putative secreted protein)인 서 열번호: 3 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-18 MTD (이하, "MTD6"으로 약칭함);
스트렙토마이세스 코엘리콜러 유래 A3(2) 분비 단백질인 서 열번호: 4 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-41 MTD (이하 , "MTD7"으로 약칭 함);
스트템토마이세스 코엘리콜러 A3(2) 유래 분비 ATP/GTP 결합 단백질 (secreted ATP/GTP binding protein)인 서 열번호: 10 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-135 MTD (이하 , "MTD8"으로 약칭 함); 및
플데이즈 단백질 prsA 전구체 (Foldase protein prsA precursor)인 서 열번호: 11 의 아미노산 서 열을 갖는 JO-159 MTD (이하， "MTD9"로 약칭함) 중의 어느 하나를 사용한다.
본 발명의 세포투과성을 갖는 엔도스타틴 재조합 단백질은 거 대분자 전달 도메인으로 상기 9 종의 MTD(JO-56: MTD!, JO-73: MTD2, JO- 66: MTD3, JO-71 : MTD4, JO-85: MTD5, JO-18: MTD6, JO-41 : MTD7> JO-135: MTD8; JO-159: MTD9) 중의 어느 하나가 혈관형성 억제인자 엔도스타틴의 한쪽 또는 양쪽 말단에 융합되고, 이 융합 컨스트럭트의 한쪽 말단에 용이한 정제를 위해 히스티 딘 -표지 (histidine-tag, His-Tag) 친화성 도메인이 융합되 어 있는 구조를 가질 수 있다.
본 발명 의 일 실시 양태에서는， JO-56 MTD 를 이용한 엔도스타틴 재조합 단백질로서 3 개의 전장 형 태 (ftill-length forms)와 JO-73 MTD 를 이용한 엔도스타틴 재조합 단백질로서 3 개의 전장 형 태를 고안한다. 또한 나머지 7 종의 MTDs 에 대해서도 각각 1 개의 전장 형 태를 고안한다. 본 발명에서 용어 "전장 형태"는 타입 18 콜라겐의 C-말단 도메인으로서 서열번호: 2 로 기재되는 아미노산 서열 1 번부터 184 번까지의 아미노산 모두를 포함하는 형태를 의미한다.
도 la 를 참고로 하면， JO-56 MTD 가 융합된 본 발명에 따른 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질은
1) 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-56 MTD가 융합된 ΗΜ,Ε,
2) 그의 C-말단에 JO-56 MTD가 융합된 ΗΕΜι, 및
3) 그의 양 말단에 JO-56 MTD가융합된 HM!EM,으로，
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지가 공유적으로 결합되어 있다.
상기 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질에서, HMiE 는 서열번호: 15의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HEM!은 서열번호: 17 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 16의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM1EM1은 서열번호: 19의 아미노산서열을 가지며, 이는 서열번호: 18의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
또한, JO-73 MTD 가 융합된 본 발명에 따른 다른 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질은
1) 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-73 MTD가 융합된 HM2E,
2) 그의 C-말단에 JO-73 MTD가 융합된 HEM2, 및
3) 그의 양 말단에 JO-73MTD가 융합된 HM2EM2으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지가 공유적으로 결합되어 있다.
상기 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질에서, HM2E 는 서열번호: 21의 아미노산서열을 가지며, 이는 서열번호: 20의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HEM2은 서열번호: 23 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 22의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM2EM2은 서열번호: 25의 아미노산서열을 가지며， 이는 서열번호: 24의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본 발명의 다른 실시양태에서는, 거대분자 전달 도메인으로 JO-66 MTD, JO-71 MTD, JO-85 MTD, JO-18 MTD, JO-41 MTD, JO-135 MTD 및 JO- 159 MTD 를 각각 이용한 엔도스타틴 재조합 단백질로서 7 개의 전장 형태를 고안한다.
도 lb 를 참고로 하면, JO-66, JO-71, JO-85, JO-18, JO-41, JO-135 및 JO-159 MTDs 중의 어느 하나가 융합된 본 발명에 따른 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질은
1) 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-66MTD가융합된 HM3E,
2) 그의 N-말단에 JO-71 MTD가 융합된 HM4E,
3) 그의 N-말단에 JO-85 MTD가 융합된 HM5E,
4) 그의 N-말단에 JO-18MTD가융합된 HM6E,
5) 그의 N-말단에 JO-41 MTD가 융합된 HM7E,
6) 그의 N-말단에 JO-135MTD가융합된 HM8E, 및
7) 그의 N-말단에 JO-l59MTD가 융합된 HM9E로서,
상기 모든 재조합 컨스트력트의 N-말단에는 히스티딘-표지가 공유적으로 결합되어 있다.
상기 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질에서, HM3E 는 서열번호: 27의 아미노산서열을 가지며, 이는 서열번호: 26의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM4E 는 서열번호: 29 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 28의 염기서열을 갖는 플리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM5E 는 서열번호: 31 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 30의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM6E 는 서열번호: 33 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 32의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM7E 는 서열번호: 35 의 아미노산 서열을 가지며， 이는 서열번호: 34의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; HM8E 는 서열번호: 37 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 36의 염기서열을 갖는 플리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM9E 는 서열번호: 39 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 38의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
본 발명에서는 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지만이 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질 HE 를 제조한다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 13 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 12 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
또한 본 발명은 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 플리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터 및 이 재조합 발현백터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.
본 발명에서 "재조합 발현백터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA 를 발현할 수 있는 백터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 구조물을 말한다.
본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된 (operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절서열과 목적하는 단백질 또는 RNA 를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결 (functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현백터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 달성될 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에 사용가능한 발현백터는 플라스미드 백터, 코스미드 (cosmid) 백터, 박테리오파아지 백터, 바이러스 백터 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현백터는 프로모터 (promoter), 오퍼테이터 (operator), 개시코돈 (initiation codon), 종결코돈 (termination codon), 폴리아데닐화 신호 (polyadenylation signal), 인핸서 (enhancer)와 같은 발현 조절서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 (signal sequence) 또는 리더서열 (leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현백터의 프로모터는 구성적 (constitutive) 또는 유도성 (inducible)일 수 있다. 또한 발현백터는 백터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커 (selective marker)를 포함하고, 복제가 가능한 발현백터인 경우 복제 기원 (replication origin)을 포함한다.
이와 같이 제조된 본 발명의 재조합 발현백터는 예를 들면, ρΗΜ,Ε 일 수 있다. 상기 재조합 발현백터 ρΗΜ,Ε 는 pET-28a (+) 백터 (Novagen, Germany)의 다중 클로닝 부위 (multi cloning site, MCS) 중 Ndel 제한효소 부위에, 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질로서 전장의 엔도스타틴의 N-말단에 JO-56 MTD 가 융합된 재조합 단백질 ！！！^^를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 백터를 의미한다. 본 발명의 일 실시양태에서는, 단백질의 정제를 용이하게 할 목적으로 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 N-말단 부위에 인위적으로 6 개의 히스티딘 -표지 (histidine-tag)를 포함시켜 발현시키기 위하여， His-Tag 서열을 가지고 있는 pET-28a(+) 백터 (Novagen, Germany)에 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 클로닝한다.
상기 재조합 발현백터로부터 발현되는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질은 전장 형태의 엔도스타틴의 한쪽 또는 양쪽 말단에 JO-56 MTD, JO-73 MTD, 50-66 MTD, JO-71 MTD, JO-85 MTD, JO-18 MTD, JO-41 MTD: JO-135 MTD 및 JO-159 MTD 중의 어느 하나가 융합되고 그의 N-말단 부위에 히스티딘-표지가 연결된 구조를 갖는다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 발현백터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다. 본 발명의 형질전환 세균은 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 대장균을 본 발명의 재조합 발현백터, 예를 들면 본 발명에 따른 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-56 MTD 가 융합된 세포투과성 재조합 단백질 HMjE 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입된 재조합 발현백터 ρΗΜ,Ε 가 형질전환된 세균을 이용함으로써 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 대량으로 발현시킬 수 있다. 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떠한 방법에 의해서도 가능하며, 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법 (microprojectile bombardment), 전기층격 유전자 전달법 (electroporation), 인산칼슘 (CaP04) 침전, 염화칼슴 (CaCl2) 침전, PEG-매개 융합법 (PEG-mediated fusion), 미세주입법 (microinjection) 및 리포좀 매개법 (liposome-mediated method) 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는， 상기의 방법으로 제조된 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-56 MTD 가 융합된 ΗΜ,Ε, JO-73 MTD 가 융합된 HM2E, JO-66 MTD가 융합된 HM3E 및 JO-135 MTD가융합된 HM8E 각각을 포함하는 재조합 발현백터 각각으로 대장균 DH5a 를 형질전환시켜 수득된 대장균 형질전환체 Μ α/ρΕΤ^δ^+^ΉΜ,Ε, DH5a/pET-28a (+) :HM2E, DH5a/pET-28a(+):HM3E및 DH5a/pET-28a(+):HM8E를 2009년 3월 20일자로 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11485BP, KCTC 11486BP, KCTC 11487BP 및 KCTC 11488BP로 기탁하였다.
본 발명은 또한, 상기 형질전환 세균을 적절한 조건 하에서 배양하여 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 발현시키고, 발현된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 배양액으로부터 회수하는 것을 포함하는, 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 생산방법을 제공한다. 상기 생산방법은 본 발명의 형질전환 세균에 도입된 재조합 발현백터에서 본 발명의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 형질전환 세균을 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것에 의해 수행된다. 상기 형질전환 세균을 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 형질전환 세균이 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 후, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건, 예컨대 유전자 발현 유도제인 아이소프로필 -β-D-티오갈락토사이드 (isopropyl-(3-D- thiogalactoside, IPTG)의 존재 하에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배양이 완료되면, 상기 배양물로부터 실질적으로 순수한 재조합 단백질을 회수할 수 있다. 본 발명에서 용어 "실질적으로 순수한 "은 본 발명의 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클테오티드의 서열이 숙주세포로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.
상기 형질전환 세균에서 발현된 재조합 단백질의 회수는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며， 통상적으로 세포 조각 (cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석 (황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고， 투석, 전기영동 및 각종 칼럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔 -침투 크로마토그래피, HPLC, 역상 -HPLC, 친화성 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 병용하여 이용할 수 있다 (Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Sambrook등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990).
한편, 재조합 발현백터로 형질전환된 세균에서 발현된 재조합 단백질은 단백질 분리 시 단백질의 특성에 따라 용해성 분획 (soluble fraction)과 불용해성 분획 (insoluble fraction)으로 구분될 수 있다. 발현된 단백질의 대부분이 용해성 분획에 있을 경우에는 상기에 기술된 방법에 따라 별다른 어려움 없이 단백질을 분리 및 정제할 수 있다. 그러나 발현된 단백질의 대부분이 불용해성 분획, 즉, 봉입체 (inclusion body) 형태로 존재하는 경우에는, 우레아, 계면활성제 등의 단백질 변성제가 포함된 용액으로 최대한 단백질을 용해시킨 후 원심분리하여 투석, 전기영동 및 각종 칼럼 크로마토그래피 등을 수행함으로써 정제할 수 있다. 이때, 단백질 변성제가 포함된 용액에 의해 단백질의 구조가 변형되어 그 활성을 잃을 수 있으므로 불용해성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정 중에는 탈염 및 재증첩 (refolding) 단계가 필요하다. 즉, 상기 탈염 및 재중첩 단계는 단백질 변성제가 포함되지 않은 용액을 이용하여 투석 및 희석을 수행하거나 또는 필터를 이용하여 원심분리를 할 수 있다. 또한, 상기 용해성 분획으로부터 단백질을 정제하는 과정 중에도 정제 시 사용하는 용액 내의 염 농도가 높을 경우에는 이러한 탈염 및 재중첩 단계를 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서는, 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질이 봉입체 형태로서 불용해성 분획에 존재함을 확인하고, 불용해성 분획으로부터 이를 정제하기 위하여 불용해성 분획을 트리톤 X-100 과 같은 비이온성 계면활성제를 함유하는 완층액에 용해시킨 다음 초음파로 처리하고 원심분리하여 침전물을 수득한다. 상기 수득한 침전물을 변성제인 우레아가 포함되어 있는 용액에 용해시킨 후 원심 분리하여 상층액을 수득한다. 우레아를 이용하여 블용해성 분획으로부터 최대한 용해된 본 발명의 재조합 단백질은 히스티딘 -결합 정제 키트를 사용하여 정제하고, 이후 정제된 단백질은 아미콘 필터 등을 이용한 원심분리에 의해 염분의 제거 및 단백질 구조의 재중첩 과정을 수행함으로써 본 발명의 재조합 단백질을 수득할 수 있다.
아을러 본 발명은 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 암 혈관형성 억제활성이 강화된 항암제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 세포투과성을 갖는 엔도스타틴 재조합 단백질의 투여는 종양 조직 내에 존재하는 혈관내피세포 내외에서 엔도스타틴의 농도를 고농도로 유지시켜 혈관내피세포의 표면에 존재하는 특이적 수용체 인테그린 α5β1 에 대한 엔도스타틴의 결합을 효과적으로 유도하고, 그로 인해 종양 조직 내에서 미세혈관의 형성을 억제할 수 있으므로, 다양한 암에 대한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀를로스 유도체， 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함한다. 경구 투여용의 경우， 본 발명에 따른 재조합 단백질은 부형제와 흔합되어 섭취형 정제， 협측 정제, 트로키， 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽 및 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함하며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 사용할 수 있다 ( em^gto/^ Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 조성물은 다양한 비경구 또는 경구 투여 형태로 제형화될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것은 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완층액에 용해시켜 주사용으로 제형화할 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제， 갑셀제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제 (예: 락토스, 덱스트로스， 수크로스, 만니를, 솔비를, 셀를로스 및 /또는 글리신)와 활택제 (예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 /또는 폴리에틸렌 글리콜)를 포함할 수 있다. 상기 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴， 트라가칸스, 메틸셀를로스, 나트륨 카복시메틸셀를로스 및 /또는 폴리비닐피를리딘과 같은 결합제를 포함할 수 있으며， 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제 및 /또는 감미제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형은 통상적인 흔합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 방부제, 수화제, 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및 /또는 완층제와 같은 보조제와 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 제제화될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물의 투여 경로로는 경구적으로 또는 정맥내, 피하, 비강내 또는 복강내 등과 같은 비경구적으로 인간과 동물에게 투여될 수 있다. 경구 투여는 설하 적용도 포함한다. 비경구적 투여는 피하주사, 근육내 주사, 정맥 주사, 종양 직접 주사와 같은 주사법 및 점적법을 포함한다.
본 발명의 조성물에 있어서, 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수도 있다. 본 발명의 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나， 통상적으로 성인을 기준으로 1 회 투여 시 5 내지 20 mg의 유효 투여량으로 하루에 수차례 반복 투여될 수 있다. 그러나 상기 재조합 단백질의 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태， 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설을 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정될 수 있다. 따라서 이러한 점을 고려할 때 당해 기술 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 재조합 단백질의 항암제로서의 특정한 용도에 따른 유효 투여량을 적절히 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형， 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다. 이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다. 실시예 1: 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 (CP-엔도스타틴)의 제조 <1-1> JO-56 및 JO-73 MTDs 를 이용한 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 제조 JO-56 MTD(MTDj) 및 JO-73 MTD(MTD2)를 이용하여 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 제조하기 위하여 하기와 같이 6 개의 전장 형태를 고안하였다 (도 la).
구체적으로, JO-56 MTD(MTDi)7> 융합된 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서,
1) 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-56MTD가 융합된 HM!E;
2) 그의 C-말단에 JO-56MTD가 융합된 HEM!; 및
3) 그의 양 말단에 JO-56 MTD가 융합된 HM!EM!으로，
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 Nᅳ말단에는 히스티딘-표지가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트력트를 제조하였다.
또한, JO-73 MTD(MTD2)가 융합된 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서,
1) 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-73 MTD가 융합된 HM2E;
2) 그의 C-말단에 JO-73 MTD가 융합된 HEM2; 및
3) 그의 양 말단에 JO-73MTD가융합된 HM2EM2으로,
상기 모든 재조합 컨스트럭트의 N-말단에는 히스티딘-표지가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트력트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해, 이들 각각에 특이적으로 고안된 프라이머 쌍과 인간 엔도스타틴 cDNA 를 주형으로 사용하는 중합효소 연쇄반웅 (polymerase chain reaction: PCR)을 수행하였다. 이때 HMjE 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 42 및 41 의 염기서열을 가지고; HEM! 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 40 및 43 의 염기서열을 가지며; ΗΜ,ΕΜ! 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 42 및 43 의 염기서열을 갖는다.
또한， ΗΜ2Ε 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 44 및 41의 염기서열을 가지고; ΗΕΜ2의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 40 및 45 의 염기서열을 가지며; HM2EM2 의 증폭을 위 한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서 열번호: 44 및 45 의 염기서 열을 갖는다.
상기 PCR 반응은 주형으로 인간 엔도스타틴 cDNA 가 클로닝된 플라스미드 DNA 100 ng, 각 0.2 mM 의 최종 농도 dNTP 흔합물, 1 μΜ 의 각 프라이 머 , 10x Taq 완층액 5 및 Taq 중합효소 (Novagen, Germany) 1 ^를 포함하는 용액을 최종 부피 50 ^ 반응액으로 하여 수행하였다. PCR 반응 조건은 먼저 94°C에서 5 분간 열 변성 (denaturing)시 킨 후 94°C에서 30 초, 63 °C에서 30 초 및 72°C에서 30 초의 반웅을 30 회 반복하였고, 최종적으로 72 °C에서 5 분간 증폭하였다. 반응이 끝난 후 1.0% 아가로즈 겔에 전기 영동 (electrophoresis)을 수행하여 증폭된 생성물을 확인하였다.
도 2a 에 나타난 바와 같이 , 각각의 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단편이 목적하는 크기로 증폭되 었음을 확인하였다.
아가로즈 겔에서 증폭된 재조합 단편을 회수한 후 이들 각각을 상용의 키트 (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 이용하여 추출, 정제하였다. 추출한 단편을 pGEM-T Easy 백터 (Promega, USA)에 삽입한 후 (도 3a), 이 백터를 대장균 DH5a 감웅세포 (supercompetent cell)에 형 질전환시 켰다. 이를 100 Mg/ml 암피실린 (arapicillin)이 포함된 평판 LB 배지 상에서 배양하여 형 질전환된 대장균을 선별하고, 이를 다시 액체 LB 배지 에서 배양한 후, 이로부터 각각의 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단편이 삽입된 pGEM-T Easy 백터를 다량으로 수득하였다.
도 3b 는 pGEM-T Easy 백터 에 삽입 된 재조합 단편을 Ndel 제한효소 (Enzynomics, Korea)로 분리하여 아가로스 겔에 전기 영동한 것으로， 이로부터 각각의 재조합 단편이 상기 백터 에 올바르게 삽입 되 었음을 확인하였다.
상기 에서 각각의 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단편이 삽입 된 pGEM-T Easy 백터를 제한효소 Ndel 을 사용해 37°C에서 1 시 간 동안 절단 (digestion)하여 각각의 재조합 단편을 얻었다. 한편, 히스티 딘- 표지 (histidine-tag)와 T7 프로모터를 가진 발현백터 pET-28(+)a 백터 (Novagen, Germany)를 제한효소 Ndel 을 사용해 상기와 동일한 조건으로 절단하였다. 상기 재조합 단편과 절단된 pET-28a (+) 백터를 전기영동으로 분리하여 상용의 키트 (QIAquick Gel extraction kit; Qiagen, USA)를 사용하여 정제하였다. 이들의 흔합물에 T4 DNA 연결효소 (ligase; Takara, Japan)를 첨가하고 16°C 에서 12 시간 동안 라이게이션 (ligation) 시킨 후, DH5a 감응세포에 형질전환시켜 재조합 단백질 발현백터를 수득하였다 (도 4a).
도 4b 는 pET-28a(+) 백터에 삽입된 재조합 단편을 Ndel 제한효소 (Enzynomics, Korea)로 분리하여 아가로스 겔에 전기영동한 것으로, 이로부터 각각의 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단편이 pET-28(+)a 백터에 을바르게 삽입되었음을 확인하였다.
이렇게 수득된 재조합 단백질 발현백터를 각각 pHM!E, ρΗΕΜ,, ρΗΜιΕΜ,, pHM2E, pHEM2, 및 ρΗΜ,ΕΜ,로 명명하였고, 이들 중에서 재조합 발현백터 pHM!E 및 pHM2E 로 대장균 DH5a 를 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균 DHSa/pE ZS^+^HMiE 및 DH5a/pET-28a(+):HM2E를 2009년 3 월 20 일자로 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11485BP 및 KCTC 11486BP로 기탁하였다.
염기서열 분석 결과， 상기 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서, HM!E 는 서열번호: 15 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HEMj은 서열번호: 17 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 16의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM1EM1은 서열번호: 19의 아미노산 서열을 가지며， 이는 서열번호: 18의 염기서열을 갖는 플리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM2E 는 서열번호: 21 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 20의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HEM2은 서열번호: 23 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호:
22의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
HM2EM2은 서열번호: 25의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 24의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩됨을 확인하였다. 본 발명에서는 상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 대조군으로 MTD 가 융합되지 않고 히스티틴 표지만이 융합된엔도스타틴 재조합 단백질 HE 를 제조하였다. 이 대조군 단백질은 서열번호: 13 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 12 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.
<1-2> JO-66, JO-71, JO-85, JO-18, JO-41, JO-135 및 JO-159 MTDs를 이용한 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 제조
JO-66 (MTD3)3 JO-71 (MTD4), JO-85 (MTD5), JO-18 (MTD6), JO-41 (MTD7), JO-135 (MTDg), 및 JO-159 (MTD9) MTD 를 이용하여 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 제조하기 위하여 각각의 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질로서,
1) 전장의 엔도스타틴 N-말단에 JO-66MTD가 융합된 HM3E,
2) 그의 N-말단에 JO l MTD가 융합된 HM4E,
3) 그의 N-말단에 JO-85 MTD가 융합된 HM5E,
4) 그의 N-말단에 JO-18MTD가융합된 HM6E,
5) 그의 N-말단에 JO-41 MTD가융합된 HM7E,
6) 그의 N-말단에 Κ)-Π5 MTD가 융합된 HM8E, 및
7) 그의 N-말단에 JO-159MTD가융합된 HM9E로서 ,
상기 모든 재조합 컨스트력트의 N-말단에는 히스티딘-표지가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 컨스트릭트를 제조하였다.
상기 재조합 컨스트럭트의 제조를 위해 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 PCR 을 수행하였다. 이때 HM3E 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 46 및 41 의 염기서열을 가지고; HM4E 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 47 및 41 의 염기서열을 가지고; HM5E 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각서열번호: 48 및 41의 염기서열을 가지고; HM6E의 증폭을 위한 정방향 및 역방향프라이머는 각각 서열번호: 49 및 41 의 염기서열을 가지고; HM7E의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 50 및 41 의 염기서열을 가지고; HM8E 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 51 및 41 염기서열을 가지며; HM9E 의 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머는 각각 서열번호: 52 및 41의 염기서열을 가진다.
이로부터 증폭된 각각의 재조합 단편을 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법으로 pGEM-T Easy 백터에 삽입하여 서브클론 (subclone)을 확보한 후, 이를 다시 pET-28(+)a 백터에 삽입하여 각각의 재조합 단백질 발현백터를 수득하였다. pGEM-T Easy 백터 및 pET-28(+)a 백터로의 각각의 재조합 단편의 삽입은 도 3c 및 4c에서 확인하였다.
이렇게 수득된 재조합 단백질 발현백터를 각각 pHM3E, pHM4E, pHM5E, pHM6E, pHM7E, pHM8E 및 pHM9E 로 명명하였고, 이들 중에서 재조합 발현백터 pHM3E 및 pHM8E 로 대장균 DH5a 를 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균 DH5a/pET-28a(+):HM3E 및 DH5a/pET-28a(+):HM8E 를 각각 2009 년 3 월 20 일자로 한국생명공학연구원 내 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 11487BP 및 KCTC 11488BP로 기탁하였다.
염기서열 분석 결과, 상기 JO-66 MTD 가 융합된 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서, HM3E 는 서열번호: 27 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 26 의 염기서열을 갖는 폴리뉴클테오티드에 의해 코딩되고;
상기 JO-71 MTD 가 융합된 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서， HM4E 는 서열번호: 29 의 아미노산 서열을 가지며， 이는 서열번호: 28의 염기서열을 갖는 플리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
상기 JO-85 MTD 가 융합된 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서, HM5E 는 서열번호: 31 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 30의 염기서열을 갖는 플리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
상기 JO-18 MTD 가 융합된 전장 형태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서， HM6E 는 서열번호: 33 의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호 :32의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고; 상기 JO-41 MTD 가 융합된 전장 형 태의 엔도스타틴 재조합 단백 § § Ψ질 w、、 로서 , HM7E 는 서 열번호: 35 의 아미노산 서 열을 가지며 , 이는 서열번호: 34 의 염기서 열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고;
상기 JO-135 MTD 가 융합된 전장 형 태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서 , HM8E 는 서 열번호: 37 의 아미노산 서 열을 가지며， 이는 서 열번호: 36 의 염기서 열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩 되고;
상기 JO-159 MTD 가 융합된 전장 형 태의 엔도스타틴 재조합 단백질로서 , HM9E 는 서 열번호: 39 의 아미노산 서 열을 가지며 , 이는 서 열번호: 38 의 염 기서 열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩 됨을 확인하였다.
상기 실시 예 <1-1> 및 <1-2>에서 각각의 MTD 가 융합된 엔도스타틴 재조합 단편의 증폭을 위해 사용된 정방향 및 역 방향 프라이머 쌍을 하기 표 2 에 정 리하였다.
【표 2】
프라이머 서 열번호
40 CCG CAT ATG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG
41 CCG CAT ATG CTA CTT GGA GGC AGT CAT GAA GCT GTT
ΗΜ,Ε-5' CCG CAT ATG GTG CTG CTG GCG GCG GCG CTG ATT GCG CAC
42
(63nts) AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG
ΗΕΜ,-3' CCG CAT ATG CTA CGC AAT CAG CGC CGC CGC CAG CAG CAC
43
(63nts) CTT GGA GGC AGT CAT GAA GCT GTT
ΗΜ2Ε-5' CCG CAT ATG CCG GTG CTG CTG CTG CTG GCG CCG CAC AGC
44
(60nts) CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG
ΗΕΜ2-3' CCG CAT ATG CTA CGG CGC CAG CAG CAG CAG CAC CGG CTT
45
(60nts) GGA GGC AGT CAT GAA GCT GTT
ΗΜ3Ε-5' CCG CAT ATG GCG GCG GCG CTG GCG GCG ATT GCG GTG ATT
46
(66nts) CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG
ΗΜ4Ε-5' CCG CAT ATG GCG CTG GCG CTG CTG CTG CTG GTG CCG CAC
47
(63nts) AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG ΗΜ5Ε-5' CCG CAT ATG CTG CTG GCG GCG GCG GCG GCG CTG CTG CTG
48
(69nts) GCG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG
CCG CAT ATG GCG GCG CTG GCG CTG GGC GTG GCG GCG GCG
ΗΜ6Ε-5'
49 CCG GCG GCG GCG CCG GCG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG (84nts)
CCGGTG
ΗΜ7Ε-5' CCG CAT ATG GCG GCG GCG CTG CTG GCG GTG GCG CAC AGC
50
(60nts) CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG
ΗΜ8Ε-5' CCG CAT ATG GCG GCG GTG GCG CTG CCG GCG GCG GCG CCG
51
(66nts) CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG
ΗΜ9Ε-5' CCG CAT ATG ATT GCG ATT GCG GCG ATT CCG GCG ATT CTG GCG
52
(72nts) CTG CAC AGC CAC CGC GAC TTC CAG CCG GTG 실시 예 2: 재조합 단백질의 발현
<2-1> 최 적의 숙주균주 선발
세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 발현유도에 가장 적합한 숙주균주를 선발하기 위하여 , Lacl 프로모터를 갖는 대장균 BL21(DE3), BL21 Gold(DE3), BL21 CodonPlus(DE3) 및 BL21 Gold(DE3) pLysS(Stratagene, USA)를 대상으로 하기 실험을 수행하였다.
먼저, 상기 실시 예 <1-1>에서 제조된 재조합 발현백터 ρΗΜ,Ε, pHEMl5 ρΗΜιΕΜι, pHM2E, pHEM2 및 pHE (대조군) 각각을 상기 대장균 균주 BL21(DE3), BL21 Gold(DE3), BL21 CodonPlus(DE3) 및 BL21 Gold(DE3) pLysS 각각에 열 층격 (heat shock) 방법으로 형 질전환시 킨 후 50 / 의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 1 LB 배지에 접종하고 37°C에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 100 mi LB 배지 에 접종하고 37°C에서 OD600 이 0.6 에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 0.7 mM 의 아이소프로필 -β-D-티오갈락토사이드 (isopropyl-P-D-thiogalactoside, IPTG)를 첨가하고 37 °C 에서 3 시간 동안 추가로 배양하였다. 이로부터 배양액 1 ^을 채취 하여 상은에서 분당 회전수 13,000 rpm 으로 1 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 시료 로우딩 완층액 (2x sample loading buffer: 125 mM Tris-HCl, 20 % 글리세를， 2 % β-머갑토에탄올, 0.04% 브로모페놀 블루， 4% SDS, Η 6.8)에 현탁한 후 100°C.에서 5 분간 끓여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 분당 희전수 13,000 rpm으로 1분간 원심분리하여 용해성 분획과 불용해성 분획을 분리, 회수하였다. 이로부터 분리된 용해성 분획과 불용해성 분획 각각을 SDS- PAGE에 걸어 단백질 발현 특성과 발현량 정도를 분석하였다.
도 5a 에 나타난 바와 같이, 다양한 숙주균주를 대상으로 본 발명의 재조합 단백질의 발현을 조사한 결과, BL21 CodonPlus(DE3) 균주에서 가장 높은 발현량이 확인되어 이를 재조합 단백질의 발현을 위한 최적의 균주로 선택하였다.
<2-2> 재조합 단백질의 발현 유도
상기 실시예 <2-1>에서 최적의 균주로 확인된 대장균 BL21 CodonPlus(DE3)에 상기 실시예 <1-2>에서 제조된 재조합 발현백터 pHM3E, pHM4E, pHM5E, pHM6E, pHM7E, pHM8E 및 pHM9E 각각을 열 층격 방법으로 형질전환시킨 후 50 / 의 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 배양하였다. 이후 재조합 단백질 유전자가 도입된 대장균을 1 LB 배지에 접종하고 37°C에서 밤새도록 배양한 후, 이를 다시 100 LB 배지에 접종하고 37°C에서 OD600 이 0.6 에 도달할 때까지 배양하였다. 상기 배양액에 단백질 발현의 유도제로서 0.7 mM 의 IPTG 를 첨가하거나 (+) 첨가하지 않고 (-) 37°C에서 3 시간동안 추가로 배양하였다. 이로부터 배양액 1 ^을 채취하여 상온에서 분당 회전수 13,000 rpm 으로 1 분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 균체를 회수하였다. 회수한 균체를 2x 시료 로우딩 완충액 (125 mM Tris-HCl, 20 % 글리세를, 2 % β-머갑토에탄올, 0.04% 브로모페놀 블루, 4% SDS, ρΗ 6.8)에 현탁한 후 100°C에서 5 분간 끓여 세포를 파쇄하였다. 세포 파쇄물을 분당 회전수 13,000 rpm 으로 1 분간 원심분리하여 용해성 분획과 불용해성 분획을 분리, 회수하였다. 이로부터 분리된 용해성 분획과 불용해성 분획 각각을 SDS-PAGE 에 걸어 단백질 발현 특성과 발현량 정도를 분석하였다. 도 5b 에 나타난 바와 같이， 약 21 kDa 의 크기를 갖는 본 발명의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질은 봉입체 형태로 대부분 블용해성 분획에 포함되어 있으며， IPTG 무처리 배양액 (-)에 비해 IPTG 처리 배양액 (+)에서 목적 단백질의 발현이 현저히 증가됨을 확인하였다. 실시예 3: 재조합 단백질의 정제
본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질은 봉입체 형태로 블용해성 분획에 존재하므로 이를 정제하기 위하여 강력한 변성제로서 8M우레아 (urea)를 이용하였다.
먼저, 본 발명의 재조합 발현백터 pHE (대조군)， ρΗΜ,Ε, ρΗΕΜι, pHMjEMu 및 pHM2E 각각으로 형질전환된 BL21 CodonPlus(DE3) 균주를 상기 실시예 2 에서와 같이 1 L 의 LB 배지에 배양하였다. 각각의 배양액을 원심분리하여 수득한 균체를 20 의 용해 완층액 (100 mM NaH2P04, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아 , pH 8.0)에 기포가 생기지 않도록 주의하면서 현탁하고, 이를 마이크로팁 (microtip)이 장착된 초음파 균질기를 이용하여 저은에서 균체를 파쇄하였다. 이때, 처리시간은 장치의 출력을 최대출력의 28%로 설정하고, 15 분간 30초 처리 후 10 초 방치를 반복하였다. 층분히 용균된 봉입체를 4°C에서 분당 회전수 8,000 X g 로 10 분간 원심분리하여 침전물을 제거하고 상층액을 희수하였다. 회수된 상층액을 니트릴로트라이아세트산 아가로스 (nitrilotriacetic acid agarose)에 Ni 를 부여한 Ni-NTA 아가로스 레진에 로우딩하였다. 이때 Ni- NTA 아가로스는 미리 용해 완층액으로 여러 번 세척하여 평형화시킨 후 사용하였다. 상층액을 4°C에서 1 시간 이상 진탕기로 천천히 교반하면서 레진에 흡착시켰다. 재조합 단백질이 포함된 봉입체가 흡착된 레진을 4°C 의 분당 회전수 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 반응액을 제거하였고, 비특이적 흡착 물질을 제거하기 위해 레진을 세척 완층액 (washing buffer: 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우레아, pH 6.3)을 이용하여 5 회 세척하였다. 세척된 레진에 pH 4.0 의 산성 조건에서 레진 용적 2 배의 용출 완층액 (elution buffer: 100 mM NaH2P04, 10 mM Tris-HCl, 8 M 우테아, 500 mM 이미다졸, pH 4.5)을 로우딩하고 진탕기 에서 1 시간 동안 교반하여 단백질을 용출하였다. 용출된 단백질의 순도를 검정하기 위하여 12% SDS-PAGE 겔에서 전기 영동을 수행한 후 겔을 쿠마시 브릴리 언트 블루 R250(coomassie brilliant blue R250)으로 가볍 게 진탕하면서 염 색하고， 목적 단백질의 밴드가 명 확해질 때까지 탈색 액을 이용하여 탈색하였다.
그 결과, 도 6 에 나타난 바와 같이 , 마커 단백질의 영동 위 치와 비교하여 JO-56 MTD 및 JO-73 MTD 가 각각 융합된 모든 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질이 약 21 kDa 부위 에서 단일 밴드로 검출되 어 불용해성 분획으로부터 순수하게 정제되 었음을 확인하였다. 실시 예 4: 단백질의 활성 재생 및 형광 염색
상기 실시 예 3 에서와 같이 불용해성 분획으로부터 정제된 본 발명의 재조합 단백질은 강력 한 변성 제인 8 M 우레아에 의 해 변성되 었기 때문에 이를 활성 형 태로 전환시키기 위하여 하기와 같이 재중첩 과정을 수행하였다.
먼저 , 정 제된 재조합 단백질을 재중첩 완층액 (refolding buffer: 0.55 M 구아니딘 [Guanidine] HC1, 0.44 M L-아르기닌, 50 mM 트리스 -HC1, 150 mM NaCl 1 mM EDTA, 100 mM NDSB, 2 mM 산화형 글루타치온 [glutathione oxidized] 및 0.2 mM 환원형 글루타치온 [glutathione reduced])을 이용하여 4°C에서 48 시간 동안 투석하여 변성제를 제거함으로써 재조합 단백질이 재활성 , 즉 재증첩 되도록 하였다. 이후 활성화된 재조합 단백질을 세포 배양용 배지인 RPMI 1640(Invitrogen, USA)과 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)를 7:3 으로 흔합하고 여기에 엔도스타틴 단백질의 웅집현상을 막기 위해서 5% 글리세를 (glycerol)과 0.1% CHAPS(Biosesang, Korea)를 흔합한 용액에서 투석막 (Snakeskin pleated, PIERCE)을 사용하여 4 °C에서 9 시간 동안 교반하였다. 이때 3 시간 마다 용기 내 흔합액을 새 것으로 교환해 주었다. 이로부터 수득된 활성 형의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질은 이후 세포투과성의 효과를 보다 뚜렷하게 확인하기 위하여 FITC(fluorescein -5-isothiocyanate, Molecular Probe)를 이용하여 형광을 표지하였다. 2 내지 20 mg의 재조합 단백질에 대해 333 mg/mi 농도의 FITC 1 ^를 사용하며 , 빛을 피해 상은에서 1 시간 동안 진탕하면서 결합시 켰다. 형 광으로 표지된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질은 4°C 에서 1 일간 DMEM 배지에 대해 투석하여 표지되지 않은 FITC 를 제거 하였고, 이로부터 회수된 재조합 단백질은 브래드포드 (Bradford) 단백질 정량법으로 그 농도를 분석하였다. 그 결과 각각의 재조합 단백질의 농도는 약 1 /μί로 측정되 었다. 실시 예 5: 세포투과성 실험
<5-1> 유세포 분석 (flow cytometry)
세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포투과성을 검증하기 위하여 , 10 μΜ 농도의 각 단백질을 마우스의 대식세포에서 유래된 RAW 264.7 세포 (Korean Cell Line Bank, Korea)에 처 리하고, 37 °C에서 1 시간 동안 배양하였다. 이 때, RAW 264.7 세포는 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum: FBS) 및 5% 페니실린 /스트랩토마이신 (penicmin/streptomycin) 500 mg/ 을 함유하는 DMEM 배지 에서 배양하였다. 배양이 종결된 후, 단백질이 처 리 된 RAW 264.7 세포의 세포막에 노출되 어 있는 유리 FITC 를 제거하기 위해 트립신 /EDTA(T/E)를 처 리하고, 저온의 PBS 로 3 회 세척 한 후 FACS Calibur(Beckton-Dickinson)의 셀퀘스트 프로 소프트웨어 (CellQuest Pro Software) 프로그램을 이용하여 유세포 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 7a 및 7b 에 나타난 바와 같이 , JO-56 MTD(MTD0가 N- 말단 및 C-말단에 각각 융합된 엔도스타틴 재조합 단백질 (HM!E, ΗΕΜι)^ 경우에는, MTD 가 융합되지 않은 대조군에 비해 높은 세포투과성을 보였으며 , N-말단과 C-말단 모두에 JO-56 MTD 가 융합된 HM!EMi 은 대조군에 비해 거 의 세포투과성을 보이지 않았다. JO-73 MTD(MTD2)가 N- 말단에 융합된 HM2E 의 경우에는， MTD 가 융합되지 않은 대조군에 비해 보다 더 높은 수준으로 세포투과성을 나타내었다. 도 7a 및 7b 에서 회색의 곡면은 세포 단독, 검은색 곡선은 FITC 단독, 파랑색 곡선은 MTD 가 융합되지 않은 HE, 보라색 곡선은 MTD! 이 N-말단에 융합된 HMiE, 초록색 곡선은 상기 MTD 가 C-말단에 융합된 HEMl5 갈색 곡선은 상기 MTD 가 양 말단에 융합된 HMiEM!, 빨강색 곡선은 MTD2 가 N- 말단에 융합된 HM2E를 나타낸다. <5-2>동초점 레이저 주사현미경 관찰 I
상기 실시예 <5-1>에서 유세포 분석으로 1 차적으로 세포투과성이 확인된 본 발명의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 MTD 가 융합되지 않은 엔도스타틴 대조군 단백질과 함께 마우스의 섬유아세포에서 유래한 NIH3T3 세포 (Korean Cell Line Bank, Korea)에 10 μΜ 의 농도로 처리하고 37°C에서 1 시간 동안 배양한 후 동초점 레이저 주사 현미경 (confocal laser scanning microscopy)으로 관찰하였다. 사용된 NIH3T3 세포는 배지 총량의 10% FBS 와 5% 페니실린 /스트렙토마이신 500 mg/i 을 함유하는 DMEM 배지에서 배양하였으며, 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위해 10 ^의 증첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15 분 후에 관찰하였다. 상기 재조합 단백질이 처리된 세포는 MTD 의 세포 내 전달부위의 구별이 용이하도록 핵을 염색하는 PI(propidium iodide) 염색을 통해 핵으로의 전달 및 세포투과성 여부를 확인하였으며, 동초점 레이저 주사 현미경은 노르마스키 필터 (normaski filter)를 이용하여 세포의 원형， FITC 형광 및 PI 형광을 관찰하였다.
그 결과, 도 8 에 나타난 바와 같이, 유세포 분석의 상대적 세포투과성 결과에 비례하여 뚜렷한 FITC 형광 (연두색) 및 PI (붉은색)로 염색된 핵 내로의 단백질 전달이 관찰되었으며, 이와 같이 단백질의 세포 내 투과 여부를 직접 확인함으로써 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포투과성이 다시 입증되었다.
<5-3> 등초점 레이저 주사 현미경 관찰 Π
상기 실시예 <5-2>에서 배양된 세포를 대상으로 세포투과성이 확인된 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질이 조직 상태에서도 세포투과성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
이를 위해 주조직적합복합체 (major histocompatibility complex, MHC)에 대한 돌연변이로 면역력이 결핍된 7 주령의 누드마우스 (Balb/c nu/nu mice, Central Lab. Animal Inc., Korea)를 실험 동물로 사용하였다. 상기 마우스의 오른쪽 다리에 인간 결장암 세포주 (human colon cancer cell line)인 HCT-116 세포 (Korean Cell Line Bank, Korea)를 lxlO7 cells/i 의 농도로 주사기 (omnican, Germany, B.BRAUN)를 사용하여 피하 주사 (subcutaneous injection)하여 종양 형성을 유도하였다. 한편, JO-56 MTD(MTD0가 엔도스타틴의 N-말단에 융합된 HM!E, 그의 C-말단에 융합된 HEM!, 및 그의 양말단에 융합된 HM,EMl5 및 JO-73 MTD(MTD2)가 엔도스타틴의 N-말단에 융합된 HM2E, 및 MTD 가 융합되지 않은 HE (대조군)에 FITC 를 이용하여 형광을 표지하였다. 종양이 형성된 마우스에 FITC 로 표지된 상기 재조합 단백질 각각을 300 씩 복강 주사 (intraperitoneal injection)하였다. 2 시간 후 각 그룹 마우스를 회생시키고 이로부터 간, 신장, 비장, 폐, 심장, 뇌 및 종양 조직을 적출하였다. 적출된 조직을 OCT 화합물로 봉입하고 냉동시킨 후 마이크로톰 (microtome)을 이용하여 두께 14 卿로 박절하였다. 조직 절편을 슬라이드 위에 놓고 동초점 레이저 주사 현미경으로 관찰하였다. 이때, 재조합 단백질의 형광표지를 보존하기 위하여 10 ^의 증첩 배지 (mounting medium)를 슬라이드 위에 점적한 후 15분 후에 관찰하였다.
그 결과, 도 9 에 나타난 바와 같이, 상기 실시예 <5-1>에서 확인된 유세포의 상대적 세포투과성 결과에 비례하여 모든 조직에서 뚜렷한 FITC 형광 (연두색)으로 염색된 핵 내로의 단백질 전달이 관찰되었다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질은 세포투과성이 우수하여 목적하는 엔도스타틴 단백질을 효과적으로 조직 내에 전달할 수 있음을 알 수 있다. 실시예 6: 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포 내 기능
<5-1> 웨스턴 블릇팅 세포투과성 이 입증된 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 웨스턴 블롯팅 (western blotting) 분석을 수행하였다.
먼저 인간 혈관내피세포 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)(Bio4You, Korea)를 Ml 99 배지 (L-글루타민 300 mg/L, 2.2 g/L NaHC03, 25 mM HEPES, 10 unit/m£ 헤파린, 20 ng/m^ bFGF, 열 불활성화 우태아 혈청 20%, 스트렙토마이신 /페니실린 1%)에 접종하고, 2% 젤라틴이 도말된 배양 접 시를 사용하여 5% co2가 공급되는 rc 배양기 에서 배양하였다.
6-웰 플레이트에 한 웰당 2 in£의 M199 배지를 첨가하고 여기에 상기 에서 배양된 HUVEC를 접 종하여 37°C에서 1일간 배양한 후, 세포주기를 동일하게 만들기 위 해 다시 1일간 혈청 이 없는 조건에서 배양하였다. 배지를 제거 한 후 HUVEC를 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 HM!E, HEMl5 HMiEMi, HM2E와 대조군 단백질 HE를 각각 10 μΜ과 15 μΜ 농도로 4시 간 동안 처 리하였다. 단백질을 제거한 후 HUVEC를 PBS로 세척하고 8시간 동안 5% C02가 공급되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 배양된 HUVEC를 100 ^의 용해 완층액 (20 mM HEPES, pH 7.2, 1% 트리톤 -X100, 10% 글리세를)을 이용하여 얼음에서 30분간 용해 (lysis)시 키 고 이로부터 수득된 세포 용해물 (cell lysate)을 4°C에서 분당 회 전수 12,000 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 이로부터 상층액을 제거하고 브래드포드 단백질 정량법으로 용해물 용액에 들어 있는 단백질을 정 량하였으며 , 사용 전까지 - 80°C에 보관하였다.
웨스턴 블롯팅 분석을 위하여, 항 - -카테닌 항체 (anti-13 -catenin antibody, 92 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany), 항 -c-Myc 항체 (anti-c- Myc antibody, 67 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany), 항-入 이클린 Dl 항체 (anti-cyclin Dl antibody, 37 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany), 항- STAT3 항체 (anti-STAT3 antibody, 79 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany), 항 -VEGF 항체 (anti-VEGF antibody, 45 kDa, Santa Cruze Biotechnology, Germany), 항-포스포 -ERKl/2 항체 (anti-phospho-ERKl/2 antibody, Thr 185/202, 44.42 kDa, Abeam Cambridge, USA), 및 항-포스포 -MEK1/2 항체 (anti-phospho-MEKl/2 antibody, Ser 217/221, 45 kDa, Cell Signaling, Boston, USA)를 일차항체로 사용하였고, 염소 항-마우스 IgG-HRP(goat anti-mouse IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, Germany) 및 염소 항 -토끼 IgG-HRP(goat anti-rabbit IgG-HRP, Santa Cruz Biotechnology, Germany)를 이차항체로 사용하였다. 상기 에서 정량된 세포 용해물을 SDS-PAGE 겔에서 100 V로 전기 영동을 수행한 후, PVDF 막으로 100 V에서 1시간 동안 전사시켰다. 전사시 킨 막은 항체와의 비특이 적 흡착을 방지하기 위해 TBS-T 완충액 (10 mM 트리스 -CI, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% 트원 20)에 용해시 킨 5%(w/v) 분유 (powdered milk)로 1시 간 동안 블로킹 (blocking) 처 리를 한 후, 상기 일차항체 각각을 첨가하고 4°C에서 1일간 반웅시 켰다. 이 후 PVDF 막을 TBS-T 완층액으로 3회 세척 한 후 이차항체를 첨가하여 실온에서 1시 간 정도 반웅시켰다. 이후 PVDF 막을 TBS-T 완층액으로 3회 세척하였고, 화학발광 검출용 ECL(enhanced chemiluminescence, GE Healthcare Amersham UK) 시 약을 이용하여 항원을 검출하고 분석하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 , 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 (ΗΜ,Ε, ΗΕΜι, ΗΜιΕΜι, 및 HM2E)로 처 리된 인간 혈관내피세포에서는 기존의 재조합 엔도스타틴 (HE) 보다 세포증식 억 제 (cell proliferation inhibition)를 유발하는 β -카테닌, c-Myc 및 STAT3의 발현과 신혈관 생성을 유도하는 VEGF의 발현은 증가하는 반면, 세포 이동을 유도하는 p-ERK와 p-MEK의 발현은 감소함을 확인하였다.
<5-2> 인간 혈관내피세포에 대한 이동 억제효과
세포투과성 이 입증된 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여, 하기와 같이 상처 치유 분석 (wound healing assay)을 이용하여 재조합 단백질의 인간 혈관내피세포에 대한 이동 억 제효과를 조사하였다.
인간 혈관내피세포 (HUVEC)를 M199 배지 (L-글루타민 300 mg/L, 2.2 g/L NaHC03, 25 mM HEPES, 10 unit/ 헤파린, 20 ng/m^ bFGF, 열 블활성화 우태아 혈청 20%, 스트랩토마이신 /페니실린 1%)에 접종하고, 2% 젤라틴이 도말된 배양접시를 사용하여 5% CO^} 공급되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 2 의 M199 배지를 첨가하고 여기에 상기에서 배양된 세포를 접종한 후 37°C에서 1일간 배양하였다. 각 웰에 본 발명 에 따른 세포투과성 재조합 단백질 HM2E와 대조군 단백질 HE를 각각 10 μΜ 농도로 처 리한 후, 1시 간 동안 무혈청 배지 에서 배양하였다. 배양 후 세포를 PBS로 2회 세척 한 다음 10 ^ 피 펫 팁으로 웰의 중앙 부위에 있는 세포들을 긁어서 제거하였다. 상기 웰 플레이트에 1 M199 배지를 첨가하고 5% C02가 공급되는 37 °C 배양기 에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, HUVEC의 이동 (migration) 정도를 광학 현미 경을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 (HM2E) 처 리군에서 무처 리군 및 MTD가 융합되지 않은 대조군 단백질 (HE) 처 리군에 비해 인간 혈관내피세포의 이동이 억 제됨을 확인하였다.
<5-3> 인간 혈관내피세포에 대한 증식 억제효과
세포투과성 이 입증된 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 인간 혈관내피세포에 대한 세포 증식 (cell proliferation) 억 제효과를 조사하였다.
인간 혈관내피세포 (HUVEC)를 Ml 99 배지 (L-글루타민 300 mg/L, 2.2 g/L NaHC03, 25 mM HEPES, 10 unit/m^ 헤파린， 20 ng/ml bFGF, 열 불활성화 우태아 혈청 20%, 스트렙토마이신 /페니실린 1%)에 접종하고, 2% 젤라틴이 도말된 배양접시를 사용하여 5% C02가 공급되는 37°C 배양기에서 배양하였다. 6-웰 플레이트에 웰당 2 의 M199 배지를 첨가하고 여 기에 상기 에서 배양된 세포를 접종한 후 37°C 에서 1 일간 배양하였다. 각 웰에 본 발명 에 따른 세포투과성 재조합 단백질 HM2E와 대조군 단백질 HE를 각각 10 μΜ 농도로 처 리한 후, 1시간 동안 무혈청 배지에서 배양하였다. 상기 웰 플레이트에 1 Ml 99 배지를 첨가하고 5% C02가 공급되는 37°C 배양기에서 0, 24 및 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, HUVEC의 증식 (proliferation) 정도를 광학 현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과， 도 12a 및 12b에 나타난 바와 같이, 세포두과성 엔도스타틴 재조합 단백질 (HM2E) 처리군에서 무처리군 및 MTD가 융합되지 않은 대조군 단백질 (HE) 처리군에 비해 인간 혈관내피세포의 증식이 억제됨을 확인하였다.
<5-4> ¾간 혈관내피세포에 대한류브 형성 억제효과
세포투과성이 입증된 엔도스타틴 재조합 단백질의 세포 내 기능을 확인하기 위하여 하기와 같이 인간 혈관내피세포에 대한 류브 형성 (tube formation) 억제효과를 조사하였다.
인간 혈관내피세포 (HUVEC)를 Ml 99 배지 (L-글루타민 300 mg/L, 2.2 g/L NaHC03, 25 mM HEPES, 10 unit/m^ 헤파린, 20 ng/ιηί bFGF, 열 불활성화 우태아 혈청 20%, 스트렙토마이신 /페니실린 1%)에 접종하고, 2% 젤라틴이 도말된 배양접시를 사용하여 5% C02가 공급되는 37 °C 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포를 0.1% BSA가 포함된 기존 (M199?) 배지에 부유시키고, BD 마트리겔 매트릭스 (MatrigelTMMatrix) 12-웰 플레이트에 웰당 500 ^의 M199 배지를 첨가한 후, 여기에 상기 세포 부유액을 접종하였다. 이어서 각 웰에 본 발명에 따른 세포투과성 재조합 단백질 HM2E와 대조군 단백질 HE를 각각 2.5 μΜ 및 5 μΜ의 농도로 처리한 후, 24시간 동안 무 혈청 배지에서 배양하였다. 상기 웰 플레이트에 배양된 세포는 1% 파라포름알데하이드 (paraformaldehyde)를 함유한 HBSS 배지에서 고정시킨 후 10 μΜ 칼세인 (calcein) AM 형광 염색시료로 30분간 반웅시켰다. 배양 후 세포를 PBS로 세척한 다음 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 13a 및 13b에 나타난 바와 같이, 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 (HM2E) 처리군에서 무처리군 및 MTD가 융합되지 않은 대조군 단백질 (HE) 처리군에 비해 인간 혈관내피세포의 류브 형성이 억제됨을 확인하였다. 실시 예 6: 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 생체 내 기능
세포투과성 이 입증된 엔도스타틴 재조합 단백질의 생체 내 기능을 확인하기 위하여 , 하기와 같이 동물모델을 이용하여 혈관형성 억 제를 통한 항암효과를 검증하였다.
본 실험에서는 면역 력 이 결핍된 5주령 의 누드마우스 (Balb/c nu/nu mice, Central Lab. Animal Inc., Korea)를 각 그룹당 6마리씩 총 3 그룹으로 나누어 실험하였다. 상기 마우스의 등 상좌측 부위에 인간 결장암 세포주인 HCT1 16 세포 (Korean Cell Line Bank, Korea)를 Ι χΙ Ο7 cells/^의 농도로 주사기 (omnican, Germany, B.BRAUN)를 사용하여 피하 주사 (subcutaneous injection)하였다. 버니 어 캘리퍼 (vernier caliper)를 이용하여 종양 크기 (너비 2χ길이 xO.52)가 50 내지 60 麵 3으로 측정된 날부터 0.5 ngl≠ 농도의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 HM2E (그룹 3)을 각각 200 ； ug씩 21일 간 피하 주사 (subcutaneous injection)하였다. 대조군으로 담체 (그룹 1)와 MTD가 융합되지 않은 엔도스타틴 단백질 HE (그룹 2)를 각각 400 ^씩 21 일간 동일하게 피하 주사하였다. 21 일간 단백질을 처리하면서 매일 각 그룹 마우스의 종양 크기 와 몸무게의 변화를 측정하였고, 그 결과를 도 14a 및 14b에 나타내었다.
도 14a 및 14b에 나타난 바와 같이， 본 발명에 따른 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 HM2E이 처 리된 마우스 (그룹 3)의 종양 크기는 대조군 (그룹 1 및 2)에 비해 그 성 장이 현저히 억 제된 반면, 실험기 간 동안 마우스의 몸무게는 대조군과 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 처 리군 모두에서 유의미 한 변화를 나타내지 않았다. 실시 예 7: 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 투여 후 면역조직학적 변화 분석
세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질의 투여 후 종양 조직 내에서의 조직학적 변화를 확인하기 위해 상기 실시 예 6의 마우스 동물 모델을 이용하여 면역조직학적 (immunohistochemistry) 염 색을 수행하였다. 구체적으로, 상기 실시 예 6에서와 같이 3 그룹 (각 그룹당 6마리)의 마우스에 각각 피하주사로 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질 (HM2E)과, 대조군으로 담체 및 HE 단백질을 21일간 처리한 후 종양 조직을 분리, 적출하였다. 각각의 적출된 종양 조직을 포르말린으로 고정하고 세척한 후 포매 센터 (embedding center)에서 62°C에 녹인 파라핀을 이용하여 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록을 마이크로틈 (microtome)을 이용하여 두께 5 /m로 박절하여 슬라이드에 부착시킨 후 자일렌 (xylene)을 5분씩 3회 처리하여 파라핀을 제거하였다. 이어서 조직 슬라이드를 100%, 100%, 95%, 70% 및 50% 에탄을로 각각 3분씩 순차적으로 처리하여 함수시키고 흐르는 물에서 5분간 세척하였다. 조직에서의 항원 표출을 유도하기 위하여 조직 슬라이드를 항원 표출 용액으로 처리한 후 37°C에서 20분간 보관하였다. 이어서 조직 슬라이드를 PBS로 5분간 세척하고 과산화수소 블록킹 용액 (peroxide blocking solution)으로 10분간 처리한 후 다시 PBS로 5분간 3회 세척하고 파워 블록킹 용액 (power blocking solution)으로 10분간 처리하였다. 이 후 PBS로 5분간 세척하였다. 상기 조직 술라이드를 일차항체로 인간 혈관내피세포 특이적 표지인자 4All(vescular endothelial cell specific marker, 4A11)과 25°C에서 30분간 반웅시킨 후 PBS 완층액으로 5분간 3회 세척하였다. 그 후 염소 항- 마우스 IgG-HRP(goat anti-mouse IgG-HRP, Biogenex)를 이차항체로 하여 30분간 반응시킨 후 조직 슬라이드를 DAB(diaminobenzidine tetrahydrochloride, Biogenex) 염색시약을 3 내지 5분간 도포하여 발색시켰다. 이어서 조직 슬라이드를 증류수로 세척하고 헤마특실린 (hematoxylin)으로 대조 염색하였다. 그 후 조직 슬라이드를 95%， 95%, 100% 및 100% 에탄올로 10초씩 순차적으로 처리하여 탈수시키고 자일렌으로 10초씩 2회의 투영 과정을 거친 후 봉입하여 광학 현미경으로 관찰하였다.
그 결과， 도 15에 나타난 바와 같이, 담체와 대조군 단백질 (HE)을 처리한 마우스의 종양 조직에 비교하여 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단 백질 (HM2E)을 처리한 마우스의 종양 조직에서 미세혈관 형성이 억제됨을 확인하였다. 0-1 Form PCT/ROA34 (SAFE)
기탁된미생 *또는기타생 *학적
*질에관한표시사항 (PCT규칙 13의 ¾
W'l 우측에기재된바와같이작성되었다. PCT-SAFE [EASY mode]
버전 3.51.036.211 MT/FOP 20090101/0.20.5.15
0-2 국제충원번호
0.3 출원인또는대리인의서튜참조기호 FC292834
1 아래와같은표시는발명의상세한설명
증에기재된미생 *또는생물학적
*질에관련된것이다.
M 쪽 15
1.2 행 7
W 기탁표시
1-3-1 기탁기관명 KCTC한국생물자원센터
1-3-2 기탁기관주소 대한민국대전광역시 30S-806유성구과학로 111 1-3-3 기탁일자 2009년 03월 20일 (20.03.2009)
1-3-4 기탁번호 KCTC11485BP
1-5 표시사항이적용될지정국 모든지정국
2 아래와같은표시는발명의상세한설명
중에기재된미생 *또는생몰학적
«·질에관련된것이다.
2-1 쪽 15
2-2 행 7
U 기탁표시
2-3-1 기탁기관명 KCTC한국생물자원센터
2-3-2 기탁기관주소 대한민국대전광역시 30S-806유성구과학로 111
2-3-3 기탁일자 2009년 03월 20일 (20.03.2009)
2-3-4 기탁번호 KCTC 11486BP
2-5 표시사항이적용될지정국
모든지정국
3 아래와같온표시는발명의상세한설명
중에기재된미생물 Ϊ는생 *학적
물질에관련된것이다.
3-1 쪽 15
3-2 행 7
3-3 기탁표시
3-3-1 기탁기관명 KCTC한국생물자원센터
3-3-2 기탁기관주소 대한민국대전광역시 305-806유성구파학로 111 3-3-3 기탁일자 2009년 03월 20일 (20.03,2009)
3-3-4 기탁번호 KCTC 11487BP
3-5 표시사항이적용될지정국
모든지정국
대체응지 (규칙 제 26조) 아래와같은표시는발명의상서!한설명
중에기재된미생 *또는생물학적
*질에관련된것이다.
-1 쪽 15
-2 행 7
-3 기탁표시
-3-1 기탁기관명 KCTC한국생물자원센터
-3-2 기탁기관주소 대한민국대전광역시 30S-806유성구과학로 111-3-3 기탁일자 2009년 03월 20일 (20,03.2009)
-3-4 기탁번호 KCTC 11488BP
-5 표시사항이적용 ¾지정국 모든지정국
수리관청전용
국제출원서와함께이서식율
수리하였다.
네또는아니오
-4-1 승인사무관 국제사무국전용
-5 국제사무국 (IB)이이서식율수리하였다.
-5-1 승인사무관
대체응지 규칙 제 26조

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
혈관형성 억제인자 (angigenic inhibitor) 엔도스타틴 (endostatin) 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 거대분자 전달 도메인 (macromolecule transduction domain, MTD)이 융합되어 있는, 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질.
【청구항 2】
제 1항에 있어서,
상기 혈관형성 억제인자 엔도스타틴 단백질이 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장 형태 (ftill-length form)인 것을 특징으로 하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질.
【청구항 3]
제 1항에 있어서,
상기 거대분자 전달 도메인이 서열번호: 3 내지 11로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질.
【청구항 4]
제 3항에 있어서，
상기 거대분자 전달도메인이
서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 JO-56MTD;
서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 JO-73MTD;
서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 JO-66MTD;
서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 JO-71 MTD;
서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 JO-85MTD;
서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 JO-18MTD;
서열번호: 9의 아미노산 서열을 갖는 JO-41 MTD;
서열번호: 10의 아미노산서열을 갖는 JO-135MTD; 및
서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 JO-159 MTD로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질.
【청구항 5】
제 1항에 있어서,
상기 재조합 단백질의 한쪽 말단에 히스티딘 -표지 (histidine-tag) 친화성 도메인이 융합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질.
【청구항 6】
제 1항 내지 계 5항 증의 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 단백질이 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 단백질:
서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 JO-56MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 C-말단에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 JO-56MTD가융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 양 말단에 서열번호: 3의 아미노산 서열을 갖는 JO-56MTD가융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 JO-73MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 C-말단에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 JO-73MTD가융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 양 말단에 서열번호: 4의 아미노산 서열을 갖는 JO-73MTD가융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 5의 아미노산 서열을 갖는 JO-66MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 JO-71 MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 7의 아미노산 서열을 갖는 JO-85MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 8의 아미노산 서열을 갖는 JO-18MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 9의 아미노산서열을 갖는 JO-41MTD가 융합된 재조합 단백질; 서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 10의 아미노산 서열을 갖는 JO-135 MTD가 융합된 재조합 단백질; 및
서열번호: 2의 아미노산 서열을 갖는 전장의 엔도스타틴 N-말단에 서열번호: 11의 아미노산 서열을 갖는 JO-159 MTD가 융합된 재조합 단백질로서;
상기 모든 재조합 단백질의 N-말단에 히스티딘-표지가 공유적으로 결합되어 있는 재조합 단백질.
【청구항 7】
계 1항에 있어서,
상기 재조합 단백질이 서열번호: 15, 17, 19,21,23,25,27, 29,31,33,35, 37 및 39의 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질.
【청구항 8】
제 1항의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 9】
제 8항에 있어서,
상기 플리뉴클레오티드가서열번호: 14, 16, 18,20,22,24,26,28,30,32，
34, 36, 38 및 40의 염기서열로 구성된 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
【청구항 10】
제 8항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현백터.
【청구항 11]
제 10항에 있어서,
상기 재조합 발현백터가 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 발현백터:
JO-56 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 14의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHV E;
JO-56 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 16의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 ρΗΕΜ,;
JO-56 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 18의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM!EM,;
JO-73 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 20의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM2E;
JO-73 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 22의 염기서열을 갖는 플리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHEM2;
JO-73 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 24의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM2EM2;
JO-66 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 26의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM3E;
JO-71 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 28의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM4E;
JO-85 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 30의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM5E;
JO-18 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 32의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM6E;
JO-41 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 34의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM7E;
JO-135 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 36의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM8E; 및
JO-159 MTD가 융합된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 코딩하는 서열번호: 38의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 발현백터 pHM9E.
【청구항 12】
제 10항의 재조합 발현백터로 형질전환된 형질전환 세균.
【청구항 13]
제 12항에 있어서,
상기 형질전환 세균이 대장균 DHSa/pET^Sa ^HM!E^CTC 11485BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.
【청구항 14]
제 12항에 있어서,
상기 형질전환 세균이 대장균 DH5a/pET-28a(+):HM2E(KCTC
Π486ΒΡ)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.
【청구항 15]
제 12항에 있어서,
상기 형질전환 세균이 대장균 DH5a/pET-28a(+):HM3E(KCTC 11487BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.
【청구항 16]
제 12항에 있어서,
상기 형질전환 세균이 대장균 DH5a/pET-28a(+):HM8E(KCTC 11488BP)인 것을 특징으로 하는 형질전환 세균.
【청구항 17]
하기 단계를 포함하는 제 1항의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 생산하는 방법 :
1) 제 12항의 형 질전환 세균을 배양하여 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 발현시 키는 단계; 및
2) 발현된 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 배양액으로부터 회수하는 단계.
【청구항 18】
제 1항의 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질을 유효성분으로 함유하고 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 항암제용 약학 조성물. 【청구항 19】
제 18항에 있어서 ,
상기 세포투과성 엔도스타틴 재조합 단백질이 종양 조직 내에서 혈관내피세포의 이동, 증식， 침투 및 튜브 형성을 억제하고, 신생 미세혈관의 형성을 차단함으로써 항암 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103992400A (zh) * 2014-05-29 2014-08-20 江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂 重组人血管内皮抑素的复性液及其制备、使用方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117987505A (zh) * 2011-09-09 2024-05-07 清华大学 对atp结合位点进行突变的血管内皮抑制素突变体
EP2811281B1 (en) * 2012-01-31 2017-10-25 National Cancer Center Composition for aggregating biological sample, method for preparing paraffin block using same, and method for analysing paraffin blocks by microscopy
CN104407153B (zh) * 2014-12-03 2016-04-06 上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心 Map2k1作为诊断动脉导管闭合或开放的标志物

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008093982A1 (en) 2007-01-29 2008-08-07 Procell Therapeutics Inc. Novel macromolecule transduction domains and methods for identification and uses thereof

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2029273A1 (en) * 1989-12-04 1991-06-05 Christine L. Brakel Modified nucleotide compounds
US5854205A (en) * 1995-10-23 1998-12-29 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic compositions and methods
CN1202932A (zh) * 1995-10-23 1998-12-23 儿童医学中心公司 治疗用抗血管生成的组合物和方法
US6346510B1 (en) * 1995-10-23 2002-02-12 The Children's Medical Center Corporation Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions
US6174861B1 (en) * 1996-10-22 2001-01-16 The Children's Medical Center Corporation Methods of inhibiting angiogenesis via increasing in vivo concentrations of endostatin protein
IL136665A0 (en) 1997-12-08 2001-06-14 Beth Israel Hospital Mutants of endostatin, "em 1" having anti-angiogenic activity and methods of use thereof
US6797488B1 (en) * 1997-12-08 2004-09-28 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods of producing anti-angiogenic proteins
US6852691B1 (en) * 1997-12-08 2005-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Anti-angiogenic peptides and methods of use thereof
WO1999062944A2 (en) * 1998-06-03 1999-12-09 The Children's Medical Center Corporation Protein oligomer compositions comprising endostatin protein and methods of using the same
EP1501861A4 (en) * 2002-05-06 2007-06-20 Univ Texas TARGETED BINDING PROTEINS FOR THE ADMINISTRATION OF THERAPEUTIC OR DIAGNOSTIC REAGENTS
KR20050042082A (ko) * 2002-05-31 2005-05-04 시젠 피티와이 리미티드 막 투과 서열로부터 유도된 자가 융합 또는 자가 응집단백질
US7470667B2 (en) * 2002-12-05 2008-12-30 Medgenn (Hong Kong) Ltd Methods of treating cancer using a modified endostatin protein
US7078485B2 (en) * 2002-12-05 2006-07-18 Yantai Medgenn Ltd. N-terminal modified recombinant human endostatin and its production

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008093982A1 (en) 2007-01-29 2008-08-07 Procell Therapeutics Inc. Novel macromolecule transduction domains and methods for identification and uses thereof

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, MACK PUBLISHING COMPANY
DEUTSCHER, M.: "Guide to Protein Purification Methods Enzymology", vol. 182, 1990, ACADEMIC PRESS. INC.
HANAI ET AL., JCB, vol. 158, 2002, pages 529
JO ET AL., NAT. BIOTECH., vol. 19, 2001, pages 929 - 33
MANIATIS ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1982, COLD SPRING HARBOR LABORATORY
SAMBROOK ET AL.: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY PRESS
See also references of EP2270055A4

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103992400A (zh) * 2014-05-29 2014-08-20 江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂 重组人血管内皮抑素的复性液及其制备、使用方法
CN103992400B (zh) * 2014-05-29 2017-01-04 江苏吴中医药集团有限公司苏州中凯生物制药厂 重组人血管内皮抑素的复性液及其制备、使用方法

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